KR20200052377A - Wood-ljungdahl 미생물에서의 폴리히드록시부티레이트의 생성 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기체 기질로부터 폴리히드록시부티레이트(PHB)의 생성을 위한 미생물과 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은, (a) 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환하는 효소, (b) 아세토아세틸-CoA를 3-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 효소, 및 (c) 3-히드록시부티릴-CoA 폴리히드록시부티레이트로 전환하는 효소를 포함하는 비-자연 발생적 Wood-Ljungdahl 미생물 및 그에 관련된 방법을 제공한다.

Description

WOOD-LJUNGDAHL 미생물에서의 폴리히드록시부티레이트의 생성

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2017년 10월 4일에 출원된 미국 특허 출원 제62/568,127호의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 인용되어 포함된다.

기술분야

본 발명은 유전자 조작된 미생물에 관한 것이고, 그리고 미생물 발효, 특히 기체 기질의 미생물 발효에 의한 폴리히드록시부티레이트(PHB)의 생성 방법에 관한 것이다.

석유-유래 플라스틱은 가벼움, 견고성, 내구성 및 분해에 대한 저항성으로 인해 현대 생활에 필수적이 되었다. 그러나, 석유-유래 플라스틱에 대한 의존으로 인해 원유 고갈, 오염, 및 매립지 쌓임을 포함한 심각한 문제들이 다수 발생했다. 플라스틱의 환경 영향을 감소시키기 위해, 종래의 석유-유래 폴리머를, 종래의 플라스틱과 유사한 물리화학적 특성을 갖는 바이오 폴리머, 예컨대 폴리락티드, 폴리사카라이드, 지방족 폴리에스테르 및 폴리히드록시알카노에이트로 대체하려는 노력이 진행 중이다(문헌[Anjum, Int J Biol Macromol, 89: 161-174, 2016]). 그러나, 이러한 바이오 폴리머 제조를 위한 미생물 및 방법은 여전히 거의 개발되지 않고 있다.

본 발명은 PHB를 생성할 수 있는 유전자 조작된 미생물을 제공한다. 특히, 본 발명은 (a) 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환하는 효소 (b) 아세토아세틸-CoA를 3-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 효소 및 (c) 3-히드록시부티릴-CoA를 PHB로 전환하는 효소를 포함하는, 비자연적으로 발생하는 Wood-Ljungdahl 미생물을 제공한다.

일 실시형태에서, 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환하는 효소는 아세틸-CoA C-아세틸 트랜스퍼라제(EC 2.3.1.9)이다. 예를 들어, 아세틸-CoA C-아세틸 트랜스퍼라제는 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 아에로모나스 히드로필리아(Aeromonas hydrophilia), 알칼리게네스 라투스(Alcaligenes latus), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 부르콜데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli, HaloferaxEscherichia coli), 할로페락스 메디테라네이(Haloferax mediterranei), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 만델리이(Pseudomonas mandelii), 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 또는 스트렙토마이시스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor)로부터 유래할 수 있다.

일 실시형태에서, 아세토아세틸-CoA를 3-히드록시부티릴-CoA로 전환시키는 효소는 아세토아세틸-CoA 리덕타제(EC 1.1.1.36) 또는 3-히드록시부티릴-CoA 디히드로게나제(EC1.1.1.157)이다. 예를 들어, 아세토아세틸-CoA 리덕타제는 아시네토박터 바우만니이, 아에로모나스 히드로필리아, 알칼리게네스 라투스, 아르트로스피라 플라텐시스, 바실러스 서브틸리스, 부르콜데리아 세파시아, 쿠프리아비두스 네카토르, 할로페락스 메디테라네이, 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 만델리이, 슈도모나스 올레오보란스, 슈도모나스 푸티다, 또는 스트렙토마이시스 코엘리콜로르로부터 유래할 수 있다. 다른 실시예에서, 3-히드록시부티릴-CoA 디히드로게나제는 클로스트리디움 베이제린키이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 또는 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri)로부터 유래할 수 있다.

일 실시형태에서, 3-히드록시부티릴-CoA를 폴리히드록시부티레이트로 전환시키는 효소는 폴리히드록시알카노에이트 신타제(EC 2.3.1.-)이다. 예를 들어, 폴리히드록시알카노에이트 신타제는 아시네토박터 바우만니이, 아에로모나스 카비아에, 아에로모나스 히드로필리아, 알칼리게네스 라투스, 아르트로스피라 플라텐시스, 바실러스 서브틸리스, 부르콜데리아 세파시아, 쿠프리아비두스 네카토르, 할로페락스 메디테라네이, 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 만델리이, 슈도모나스 올레오보란스, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 61-3, 로도스피릴룸 루브럼(Rhodospirillum rubrum), 또는 스트렙토마이시스 코엘리콜로르로부터 유래할 수 있다.

일 실시형태에서, 미생물은 아세토박테리움(Acetobacterium), 알칼리바쿨룸(Alkalibaculum), 블라우티아(Blautia), 부티리박테리움(Butyribacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 유박테리움(Eubacterium), 모오렐라(Moorella), 옥소박테르(Oxobacte), 스포로무사(Sporomusa), 및 테르모아나에로박테르(Thermoanaerobacter)로 구성된 군으로부터 선택되는 속의 구성원이다. 예를 들어, 미생물은 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 바치이(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로스티리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스티리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스티리디움 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스티리디움 코스카티이(Clostridium coskatii), 클로스티리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스티리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스티리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스티리디움 마그눔(Clostridium magnum), 클로스티리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스티리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 모오렐라 테르마우토트로피카(Moorella thermautotrophica), 모오렐라 테르모아세티카(Moorella thermoacetica), 옥소박테르 프펜니기이(Oxobacter pfennigii), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides), 및 테르모아나에로박테르 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)로 구성된 군으로부터 선택되는 부모 미생물로부터 유래할 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 미생물은 클로스티리디움 오토에타노게눔, 클로스티리디움 코스카티이, 클로스티리디움 륭달리이, 및 클로스티리디움 라그스달레이로 구성된 군으로부터 선택되는 부모 박테리아로부터 유래할 수 있다.

일 실시형태에서, 미생물은 CO, CO₂, 및 H₂ 중의 하나 이상을 포함하는 기체 기질을 소비한다. 다른 실시형태에서, 미생물은 혐기성이다. 또 다른 실시형태에서, 미생물은 PHB를 분해하는 능력이 없다.

본 발명은, 기체 기질의 존재 하에 본 발명의 미생물을 배양하는 것을 포함하는 PHB의 생성 방법을 추가로 제공한다. 예를 들어, 기체 기질은 CO, CO₂, 및 H₂ 중의 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 배양은 혐기성 조건 하에 실시된다. 다른 실시형태에서, 배양은 탄수화물 기질의 비존재 하에 실시된다. 또 다른 실시형태에서, 배양은 빛의 비존재 하에 실시된다.

본 발명의 이들 및 다른 특징 및 장점은 첨부된 청구범위와 함께 다음의 상세한 설명으로부터 보다 완전히 이해될 것이다. 청구범위의 범위는 본 설명에 기재된 특징 및 장점에 대한 구체적인 논의에 의해서가 아니라 청구범위 내의 기재 내용에 의해 정의된다는 점에 유의한다.

도 1은 폴리히드록시부티레이트(PHB) 생성까지의 효소 경로를 나타낸 도면이다.
도 2는 pPHB_01의 플라스미드 맵이다.
도 3은 PHB 생합성 경로(pPHB_01)를 갖는 플라스미드 또는 음성 대조군으로서의 빈(empty) 플라스미드(pMTL83157)를 운반하는 C. 오토에타노게눔 내의 PHB 생성을 보여주는 그래프이다. 박테리아는 탄소원으로서 CO 및 CO₂ 만을 갖는 압력-등급 보틀 내에서 혐기적으로 성장하였다. PHB의 수율(건조 세포 질량의 중량%로 표시)을 HPLC로 측정했다. 값은 생물학적 삼중(triplicates)의 평균에, 그 평균에 대한 표준 편차를 플러스 또는 마이너스하여 나타낸다. pMTL83157 (빈) 플라스미드를 포함하는 샘플에서 PHB가 검출되지 않았다.
도 4a 내지 도 4d는 다양한 성장 조건 하에서의 C. 오토에타노게눔의 성장을 나타내는 그래프이다. 박테리아는 빈 플라스미드(pMTL83157)나 PHB 합성 경로를 포함하는 플라스미드(pPHB_01)를 포함하였다. 각 플로트는 상이한 조건 집합을 나타낸다. 도 4a(조건 1)는 유일한 탄소원으로 50/18/3/29의 CO/CO₂/H₂/N₂를 포함하는 가스 혼합물을 사용하여 도 3에서 관찰된 데이터를 생성하는 데 사용되는 조건의 반복을 보여준다. 도 4b(조건 2)는 조건 1에서 새로운 기체 기질(50/30/10/10 CO/CO₂/H₂/N₂)인 것을 제외하고는 동일한 조건을 보여준다. 도 4c(조건 3)는 조건 2에서 배양시간이 연장된 것을 제외하고는 동일한 조건을 보여준다. 도 4d(조건 4)는 조건 3에서 기체 기질이 주기적으로 리프레쉬되는 것을 제외하고는 동일한 조건을 보여준다. 값은 생물학적 삼중의 평균에, 그 평균에 대한 표준 편차를 플러스 또는 마이너스하여 나타낸다.
도 5는, 도 4a 내지 4d와 관계하여 기술된 바와 같이, 조건 1 내지 4에서 C. 오토에타노게눔 내에서의 PHB 생성을 보여주는 그래프이다. 값은 생물학적 삼중의 평균에, 그 평균에 대한 표준 편차를 플러스 또는 마이너스하여 나타낸다. pMTL83157 (빈) 플라스미드를 포함하는 샘플에서 PHB가 검출되지 않았다.
도 6은 연속 발효에서 기체 탄소원으로부터 C. 오토에타노게눔 내에서의 PHB 생성을 보여주는 그래프이다. 박테리아는, PHB 합성 경로를 포함하는 플라스미드 pPHB_01과 콘쥬게이트되었다. PHB는 발효 완료 시 측정되었다. 기체 기질이 각각 50/20/20/10 CO/CO₂/H₂/Ar 또는 50/20/2/28 CO/CO₂/H₂/N₂의 혼합물의 일부로 20% 수소나 2% 수소를 포함했다. pH 5가 유지되었다. 값은 이중 발효의 평균에, 그 평균에 대한 표준 편차를 플러스 또는 마이너스하여 나타낸다.
도 7은 연속 발효에서 기체 탄소원으로부터 C. 오토에타노게눔 내에서의 PHB 생성을 보여주는 그래프이다. 박테리아는, PHB 합성 경로를 포함하는 플라스미드 pPHB_01과 콘쥬게이트되었다. PHB는 발효 완료 시 측정되었다. 기체 기질이 각각 50/20/20/10 CO/CO₂/H₂/Ar 또는 50/20/2/28 CO/CO₂/H₂/N₂의 혼합물의 일부로 20% 수소나 2% 수소를 포함했다. 20% 수소, 낮은 바이오매스는 다른 실행에 비하여 감소된 농도의 바이오매스를 가졌다. 20% 수소, 다양한 pH는 pH 6으로 시작하고 이어서 5.5로 감소되었다. 20% 수소, pH 6이 배양이 저하할 때까지 발효 실행의 전체에 걸쳐 유지되었다. 값은 이중 발효의 평균에, 그의 평균에 대한 표준 편차를 플러스 또는 마이너스하여 나타낸다.
도 8은 지놈-스케일의 대사 모델 재구성(GEM)을 사용한 모사에 대한 PHB 값을 보여주는 그래프이다. 실험적으로 검출된 PHB는 PHB 수율의 최대화를 사용하여, GEM에 의해 예측된 PHB의 수준과 비교되었다. PHB 수율의 최대화는 또한 2 mmol/gDCW/h의 NADH, NADPH, Fd_red, 또는 ATP의 흡수량(uptake)으로 시험되었다. 시험된 조건은 PHB20(대조군); PHBLowB(낮은 바이오매스) 및 PHBpH5.5(pH 5.5)이었다. ATP가 PHB를 가장 제한하는 것으로 나타났고(최대 PHB 값 달성), 다음으로 Fd_red, NADPH, 그리고 이어서 NADH이었다. 데이터는 2개의 생물학적 복제 케모스탓의 평균 ± 표준 오차를 나타낸다.

촉매 공정, 예컨대 피셔-트롭쉬 공정(Fischer-Tropsch process)을 사용하여 이산화탄소(CO₂), 일산화탄소(CO) 및/또는 수소(H₂)를 포함하는 가스, 예를 들어, 산업 폐가스 또는 합성 가스를 다양한 연료 및 화학 물질로 전환할 수 있다는 것이 오랫동안 인식되어 왔다. 그러나 최근에는, 가스 발효가 이러한 가스들의 생물학적 고정을 위한 대안적인 플랫폼으로 등장하였다. 특히, 아세트산 생성(acetogenic)(즉, Wood-Ljungdahl) 미생물이 CO, CO₂, 및/또는 H₂를 포함하는 가스를 에탄올 및 2,3-부탄디올과 같은 생성물로 전환시키는 것이 입증되었다. 이들 기체로부터 예컨대 PHB와 같은 보다 복잡한 폴리머 분자 생성의 바람직성은 잘 문헌화되어 있다(문헌[Drzyzga, J Chem Technol Biotechnol, 90: 1735-1751, 2015]). 그러나, Wood-Ljungdahl 경로는 생명의 열역학적 가장자리에서 동작하며(문헌[Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821, 2014]), 이는 Wood-Ljungdahl 미생물이 세포 성장과 유지를 위해 충분한 탄소를 축적하는 것을 어렵게 하며, 복잡한 탄소 생성물은 훨씬 더 적게 생성한다. 이들 대사의 과제는 탄수화물 또는 당 기질에 비하여 발효 배지 내의 기체 기질(예컨대 CO, CO₂, 및/또는 H₂)의 불충분한 용해에 의해 악화한다. 따라서, 특별히 과잉의 탄소를 저장하는 수단으로서 예컨대 로도스피릴룸 루브럼 및 쿠프리아비두스 네카토르와 같은 종에 의해 이들 폴리머가 천연적으로 생성되기 때문에, Wood-Ljungdahl 미생물이 PHB나 다른 폴리히드록시알카노에이트 류를 합성하기 위해 조작될 가능성은 낮을 것이다. 실제로, 최근까지, 아세트산 생성 미생물을 조작하여 CO, CO₂, 및/또는 H₂로부터 PHB를 생성하려는 시도들은 성공적이지 않았다(문헌[The European SYNPOL Project, Biopolymers from syngas fermentation, 2012-2017]).

그러나, 부지런한 연구와 엔지니어링 노력 이후 본 발명자들은 최초의 Wood-Ljungdahl 미생물 내에서의 PHB 합성을 달성하였다. 이는 재생 가능하고 지속 가능한 바이오 폴리머 생성으로 가는 여정 상에서 중요한 이정표를 나타낸다.

제1 양태에서, 본 발명은 PHB 생성 능력이 있는 Wood-Ljungdahl 미생물을 제공한다. 제2 양태에서, 본 발명은 상기한 Wood-Ljungdahl 미생물을 기체 기질의 존재 하에 배양함으로써 PHB를 생성하는 방법을 제공한다.

경로

Wood-Ljungdahl 미생물은 천연적으로 PHB를 생성하지 않기 때문에, Wood-Ljungdahl 미생물 내에서의 PHB 생성은 적어도 하나의 이종 효소의 도입을 필요로 한다. 본 발명의 미생물은 일반적으로 3개의 이종 효소, 즉 (a) 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환하는 효소, (b) 아세토아세틸-CoA를 3-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 효소, 및 (c) 3-히드록시부티릴-CoA를폴리히드록시부티레이트로 전환하는 효소를 포함한다. 이 경로는 도 1에 도시된다.

(1) 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 전환

아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 전환은 임의의 적합한 효소에 의해 촉매 작용을 받을 수 있다. 비록 이 반응에 대한 고유 활성이 특정 아세트산 생성 박테리아에 존재할 수 있으나, 이 반응에 촉매 작용하도록 이종(즉, 비-천연적(non-native)) 효소를 도입하는 것이 일반적으로 필요하다. 바람직한 일 실시형태에서, 효소는 아세틸-CoA C-아세틸 트랜스퍼라제(티올라제 또는 3-케토티올라제로도 알려짐)이고, 이는 EC 2.3.1.9(즉, 2 아세틸-CoA ↔ CoA + 아세토아세틸-CoA)에 의해 정의된 활성을 갖는다. 아세틸-CoA C-아세틸 트랜스퍼라제는 임의의 적합한 호스트 미생물, 예컨대 아시네토박터 바우만니이, 아에로모나스 히드로필리아, 알칼리게네스 라투스, 아르트로스피라 플라텐시스, 바실러스 서브틸리스, 부르콜데리아 세파시아, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 쿠프리아비두스 네카토르, 에스케리키아 콜라이, 할로페락스 메디테라네이, 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 만델리이, 슈도모나스 올레오보란스, 슈도모나스 푸티다, 또는 스트렙토마이시스 코엘리콜로르로부터 유래될 수 있다.

특히, 아세틸-CoA C-아세틸 트랜스퍼라제는 아시네토박터 바우만니이 PhaA(SCZ16966), 아에로모나스 히드로필리아 PhaA(WP_043162470), 알칼리게네스 라투스 PhaA(AAC83659), 아르트로스피라 플라텐시스 PhaA(WP_006617472), 바실러스 서브틸리스 PhaA(CUB52080), 부르콜데리아 세파시아 PhaA(WP_043187452), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ThlA(WP_0109661571), 쿠프리아비두스 네카토르 PhaA(WP_013956452.1), 쿠프리아비두스 네카토르 BktB(WP_011615089.1), 쿠프리아비두스 네카토르 phaA(WP_010810132.1), 에스케리키아 콜라이 AtoB(NP_416728.1), 할로페락스 메디테라네이 PhaA(WP_004059344), 슈도모나스 아에루기노사 PhaA(WP_038823536), 슈도모나스 플루오레센스 PhaA(WP_073525707), 슈도모나스 만델리이 PhaA(WP_019582144), 슈도모나스 올레오보란스 PhaA(WP_074859314), 슈도모나스 푸티다 PhaA(WP_058540218), 또는 스트렙토마이시스 코엘리콜로르 PhaA(WP_011030221)이거나 이들로부터 유래될 수 있다.

(2) 아세토아세틸-CoA의 3-히드록시부티릴-CoA로의 전환

아세토아세틸-CoA의 3-히드록시부티릴-CoA로의 전환은 임의의 적합한 효소에 의해 촉매 작용을 받을 수 있다. 비록 이 반응에 대한 고유 활성이 특정 아세트산 생성 박테리아에 존재할 수 있으나, 이 반응에 촉매 작용하도록 이종(즉, 비-천연적) 효소를 도입하는 것이 일반적으로 필요하다. 바람직한 일 실시형태에서, 효소는 아세토아세틸-CoA 리덕타제이며, 이는EC 1.1.1.36(즉, (R)-3-히드록시아실-CoA + NADP⁺ ↔ 3-옥소아실-CoA + NADPH + H⁺)에 의해 정의된 활성을 갖는다. 아세토아세틸-CoA 리덕타제는 임의의 적합한 호스트 미생물, 예컨대 아시네토박터 바우만니이, 아에로모나스 히드로필리아, 알칼리게네스 라투스, 아르트로스피라 플라텐시스, 바실러스 서브틸리스, 부르콜데리아 세파시아, 쿠프리아비두스 네카토르, 할로페락스 메디테라네이, 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 만델리이, 슈도모나스 올레오보란스, 슈도모나스 푸티다, 또는 스트렙토마이시스 코엘리콜로르로부터 유래될 수 있다. 특히, 아세토아세틸-CoA 리덕타제는 아시네토박터 바우만니이 PhaB(WP_095389464), 아에로모나스 히드로필리아 PhaB(WP_041216919), 알칼리게네스 라투스 PhaB(AAC83660), 아르트로스피라 플라텐시스 PhaB(WP_043469113), 바실러스 서브틸리스 PhaB(WP_070548955), 부르콜데리아 세파시아 PhaB(WP_059234032), 쿠프리아비두스 네카토르 PhaB(WP_010810131.1), 할로페락스 메디테라네이 PhaB(WP_004572392), 슈도모나스 아에루기노사 PhaB(WP_031690879), 슈도모나스 플루오레센스 PhaB(WP_030141425), 슈도모나스 만델리이 PhaB(WP_094467462), 슈도모나스 올레오보란스 PhaB(WP_074858624), 슈도모나스 푸티다 PhaB(BAB96554), 또는 스트렙토마이시스 코엘리콜로르 PhaB(WP_011027734)일 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 효소는 3-히드록시부티릴-CoA 디히드로게나제이며, 이는 EC 1.1.1.157(즉, (S)-3-히드록시부타노일-CoA + NADP⁺ = 3-아세토아세틸-CoA + NADPH + H⁺)에 의해 정의된 활성을 갖는다. 3-히드록시부티릴-CoA 디히드로게나제는 임의의 적합한 미생물, 예컨대 클로스트리디움 베이제린키이, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 또는 클로스트리디움 클루이베리이거나 이들로부터 유래될 수 있다. 특히, 3-히드록시부티릴-CoA 디히드로게나제는 클로스트리디움 베이제린키이 Hbd(WP_011967675.1), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 Hbd(NP_349314.1), 또는 클로스트리디움 클루이베리 Hbd1(WP_011989027.1)일 수 있다.

바람직하게는, 아세토아세틸-CoA를 3-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 효소는 (R)-특이적, 즉, (R)-3-히드록시부티릴-CoA를 생성하는 효소인데, 이는(R)-3-히드록시부티릴-CoA가PHB의 효소적 생성에 전형적인 기질이기 때문이다. 그러나, 경우에 따라서는, 아세토아세틸-CoA를 3-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 효소는 (S)-특이적, 즉, (S)-3-히드록시부티릴-CoA를 생성한다. 여하한 특정 이론에 구속되는 것을 원하지는 않으나, 본 발명자들은, 아세트산 생성 박테리아 내의 천연의 또는 도입된 에피머라제 활성이 (S)- 및 (R)-3-히드록시부티릴-CoA의 상호 전환을 허용하며, 그러한 (S)-3-히드록시부티릴-CoA는 (R)-3-히드록시부티릴-CoA로 전환될 수 있고, 이는 이어서 PHB로 전환될 수 있는 것으로 믿는다.

(3) 3-히드록시부티릴-CoA의 PHB로의 전환

3-히드록시부티릴-CoA의 PHB로의 전환은 임의의 적합한 효소에 의해 촉매 작용을 받을 수 있다. 비록 이 반응에 대한 고유 활성이 특정 아세트산 생성 박테리아에 존재할 수 있으나, 이 반응에 촉매 작용하도록 이종(즉, 비-천연적) 효소를 도입하는 것이 일반적으로 필요하다. 바람직한 일 실시형태에서, 효소는 폴리히드록시알카노에이트 신타제이며, 이는 EC 2.3.1.-, 예컨대 EC 2.3.1.B2(타입 I) (즉, 3-히드록시부티릴-CoA + [(R)-3-히드록시부타노에이트]_n = [(R)-3-히드록시부타노에이트]_n+1 + CoA), EC 2.3.1.B3(타입 II) (즉, 3-히드록시아실-CoA + [(R)-3-히드록시아실]_n = [(R)-3-히드록시아실]_n+1 + CoA), 또는 EC 2.3.1.B4(타입 III) (즉, 3-히드록시아실-CoA + [(R)-3-히드록시아실]_n = [(R)-3-히드록시아실]_n+1 + CoA)에 의해 정의된 활성을 갖는다. 이 효소는 또한 폴리히드록시알카노에이트 폴리머라제, 폴리히드록시부티레이트 신타제, 폴리히드록시부티레이트 폴리머라제 등으로 지칭될 수 있다. 폴리히드록시알카노에이트 신타제는 임의의 적합한 호스트 미생물, 예컨대 아시네토박터 바우만니이, 아에로모나스 카비아에, 아에로모나스 히드로필리아, 알칼리게네스 라투스, 아르트로스피라 플라텐시스, 바실러스 서브틸리스, 부르콜데리아 세파시아, 쿠프리아비두스 네카토르, 할로페락스 메디테라네이, 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 만델리이, 슈도모나스 올레오보란스, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 주 61-3, 로도스피릴룸 루브럼, 또는 스트렙토마이시스 코엘리콜로르로부터 유래될 수 있다. 특히, 폴리히드록시알카노에이트 신타제는 아시네토박터 바우만니이 PhaC(SCY71072), 아에로모나스 카비아에 PhaC(WP_045524574), 아에로모나스 히드로필리아 PhaC1(WP_017780191) 또는 PhaC2(AAV41872), 알칼리게네스 라투스 PhaC(WP_084267317), 아르트로스피라 플라텐시스 PhaC(WP_006617456), 바실러스 서브틸리스 PhaC(CUB58881), 부르콜데리아 세파시아 PhaC(WP_027784567), 쿠프리아비두스 네카토르 PhaC(WP_011615085 또는 WP_013956451.1), 할로페락스 메디테라네이 PhaC(WP_004056138), 슈도모나스 아에루기노사 PhaC1(WP_038823539) 또는 PhaC2(WP_025271419), 슈도모나스 플루오레센스 PhaC1(WP_057399292) 또는 PhaC2(WP_030141001), 슈도모나스 만델리이 PhaC1(WP_094467460) 또는 PhaC2(WP_010465951), 슈도모나스 올레오보란스 PhaC1(AAL17611) 또는 PhaC2(WP_037049875), 슈도모나스 푸티다 PhaC1(BAB96552) 또는 PhaC2(WP_029886362), 슈도모나스 주 61-3 PhaC1(BAA36198) 또는 PhaC2(BAA36202), 로도스피릴룸 루브럼 PhaC1(WP_011388028), PhaC2(WP_011390166), 또는 PhaC3(WP_011398569), 또는 스트렙토마이시스 코엘리콜로르 PhaC이거나 이들로부터 유래될 수 있다.

특정 실시형태에서, 하나 이상의 파괴적 변이가 하나 이상의 내인성 효소에 도입되어 도입된 이종 효소와의 경쟁을 감소하거나 제거할 수 있다. 특히, "파괴적 변이"는 유전자 또는 효소의 발현 또는 활성을 감소 또는 제거하는(즉, "파괴하는") 변이이다. 파괴적 변이는 부분적 불활성, 전체적 불활성, 또는 유전자나 효소의 삭제일 수 있다. 파괴적 변이는 녹아웃(KO) 변이일 수 있다. 파괴적 변이는 효소에 의해 생성되는 생성물의 생합성을 감소, 방해, 블로킹하는 임의의 변이일 수 있다. 파괴적 변이는, 예를 들어, 효소를 인코딩하는 유전자 내의 변이, 효소를 인코딩하는 유전자의 발현에 관련된 유전적 조절 인자 내의 변이, 효소의 활성을 감소 또는 저해하는 핵산의 도입, 또는 효소의 발현을 저해하는 핵산(예컨대 안티센스 RNA, siRNA, 가이드 RNA) 및/또는 단백질(예컨대 Cas 단백질)의 도입을 포함할 수 있다. 파괴적 변이는 공지의 임의의 방법을 사용하여 도입될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 미생물은 내인성 티오에스터라제 효소를 가질 수 있다. 3개의 추정의 티오에스터라제가 클로스티리디움 오토에타노게눔 내에 동정되었다: (1) "티오에스터라제 1"(AGY74947.1; 팔미토일-CoA 히드로라제로 주석됨), (2) "티오에스터라제 2"(AGY75747.1; 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스터라제로 주석됨), 및 (3) "티오에스터라제 3"(AGY75999.1; 추정 티오에스터라제로 주석됨). 3개의 추정의 티오에스터라제가 또한 클로스티리디움 륭달리이 내에 동정되었다: (1) "티오에스터라제 1"(ADK15695.1; 예측 아실-CoA 티오에스터라제 1로 주석됨), (2) "티오에스터라제 2"(ADK16655.1; 예측 티오에스터라제로 주석됨), 및 (3) "티오에스터라제 3"(ADK16959.1; 예측 티오에스터라제로 주석됨). 파괴적 변이는 임의의 이들 티오에스터라제 또는 임의의 기타 티오에스터라제에 영향을 줄 수 있고, 이는 본 발명의 미생물에 내인성일 수 있다.

미생물

"미생물"은 미세 유기체, 특히 박테리아, 고세균, 바이러스, 또는 진균이다. 본 발명의 미생물은 전형적으로 박테리아이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "미생물"의 열거는 "박테리아"를 포함하는 것으로 여겨져야 한다.

본 발명의 미생물은 비-자연적 발생의 것이다. 미생물을 참조로 사용될 때 용어"비-자연적 발생"은 미생물이, 참조된 종의 야생형 균주를 포함하여 참조된 종의 자연적 발생하는 종에서 발견되지 않는 적어도 하나의 유전적 변형을 가짐을 의도한다. 비자연적으로 발생하는 미생물은 전형적으로 실험실 또는 연구 시설에서 개발된다. 반대로, "야생형"은 자연에서 발생하는 유기체, 균주, 유전자, 또는 특질의 전형적 형태를 지칭한다.

용어 "유전적 변형", "유전적 변화", 또는 "유전적 조작"은 인간의 손에 의한 미생물의 지놈 또는 핵산의 조작을 광범위하게 지칭한다. 이와 같이, 용어 "유전적으로 변형된", "유전적으로 변화된", 또는 "유전적으로 조작된"은 그러한 유전적 변형, 유전적 변화, 또는 유전적 조작을 포함하는 미생물을 지칭한다. 이들 용어는 실험실-생성된 미생물을 자연적-발생 미생물과 구분하기 위해 사용될 수 있다. 유전적 변형의 방법은, 예를 들어, 이종 유전자 발현, 유전자 또는 프로모터 삽입 또는 결실, 핵산 변이, 변형된 유전자 발현 또는 불활성화, 효소 조작, 유도된 진화(directed evolution), 지식기반 설계, 무작위 변이 유발법, 유전자 셔플링, 및 코돈 최적화를 포함한다.

"재조합"은 핵산, 단백질, 또는 미생물이 유전적 변형, 조작, 또는 재조합의 생성물임을 나타낸다. 일반적으로, 용어 "재조합"은, 복수의 공급원, 예컨대 2개 이상의 미생물의 균주 또는 종으로부터 유래하는 유전 물질을 포함하거나 이에 의해 인코딩되는 핵산, 단백질, 또는 미생물을 지칭한다. 본 발명의 미생물은 전형적으로 재조합이다.

용어 "로부터 유래된"은 핵산, 단백질, 또는 미생물이 상이한(예컨대, 부모의 또는 야생형) 핵산, 단백질 또는 미생물로부터 변형 또는 적응되어, 신규 핵산, 단백질, 또는 미생물을 생성하도록 하는 것을 나타낸다. 그러한 변형이나 적응은 전형적으로 핵산이나 유전자의 삽입, 결실, 변이, 또는 치환을 포함한다. 일반적으로 본 발명의 미생물은 "부모 미생물"로부터 유래되고, 이는 본 발명의 미생물을 생성하기 위해 사용된 미생물이다. 부모 미생물은 자연적 발생 미생물(즉, 야생형 미생물) 또는 사전에 변형된(즉 변이 또는 재조합 미생물) 미생물일 수 있다. 본 발명의 미생물은 부모 미생물에서 발현 또는 과발현되지 않았던 하나 이상의 효소가 발현 또는 과발현되도록 변형될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 미생물은 부모 미생물에 포함되지 않았던 하나 이상의 유전자를 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, 본 발명의 미생물은 부모 미생물에서 발현되지 않았던 하나 이상의 효소가 발현되지 않거나 적은 양으로 발현하도록 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 미생물은, 클로스티리디움 오토에타노게눔, 클로스티리디움 륭달리이, 또는 클로스티리디움 라그스달레이으로 구성된 군에서 선택되는 부모 미생물로부터 유래된다. 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 미생물은, 부모 미생물 클로스티리디움 오토에타노게눔 LZ1561(2010년 6월 7일 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)(Inhoffenstraβ 7B, D-38124 독일 브라운슈비그 소재)에 기탁, 부다페스트조약의 조항에 기초하여 2010년 6월 7일 등록번호 DSM23693호 부여)로부터 유래된다. 이 균주는 국제 공개 WO 2012/015317호로 공개된 국제 특허 출원 PCT/NZ2011/000144호에 기재되어 있다.

본 발명의 미생물은 기능적 특성에 기초하여 추가로 분류될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 미생물은 Wood-Ljungdahl 미생물, a C1-고정 미생물, 혐기성 미생물, 아세토젠(acetogen), 에탄올로젠(ethanologen), 및/또는 카복시도트로프(carboxydotroph)이거나 이들로부터 유래될 수 있다. 표 1은 미생물의 대표적 목록을 제공하며, 그들의 기능적 특성을 나타낸다.

"Wood-Ljungdahl"은 예컨대 문헌[Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008]에 기술된 바와 같이 탄소 고정의 Wood-Ljungdahl 경로를 지칭한다. "Wood-Ljungdahl 미생물"은 예상대로, Wood-Ljungdahl 경로를 포함하는 미생물을 지칭한다. 일반적으로, 본 발명의 미생물천연의 Wood-Ljungdahl 경로를 포함한다. 본원에서, Wood-Ljungdahl 경로는, 천연의, 변형되지 않는 Wood-Ljungdahl 경로일 수 있거나, CO, CO₂, 및/또는 H₂를 아세틸-CoA로 전환하도록 기능하는 한, 약간의 정도로 유전적 변형(예컨대, 과발현, 이종 발현, 녹아웃, 등)을 갖는 Wood-Ljungdahl 경로일 수 있다.

"C1"은 1-탄소 분자, 예를 들어, CO, CO₂, 또는 CH₃OH를 지칭한다. "C1-옥시게네이트"는 적어도 한의 산소 원자를 또한 포함하는 1-탄소 분자, 예를 들어, CO, CO₂, 또는 CH₃OH를 지칭한다. "C1-탄소원"은 1 탄소-분자를 지칭하며, 이는 본 발명의 미생물의 부분적 또는 유일한 탄소원으로 기능한다. 예를 들어, C1-탄소원은 CO, CO₂, CH₃OH, 또는 CH₂O₂의 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, C1-탄소원은 CO 및 CO₂의 하나 또는 둘 다를 포함한다. "C1-고정 미생물"은 C1-탄소원으로부터의 하나 이상의 생성물을 생성하는 능력을 가지는 미생물이다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 C1-고정 박테리아이다. 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 표 1에서 확인되는 C1-고정 미생물로부터 유래된다. 본 발명의 목적을 위하여, 메탄(CH₄)이 C1-탄소원으로 고려될 수 있으나, 이는 본 발명의 박테리아가 메탄 대사 경로를 포함하도록 조작되었을 경우만이며, 예컨대 국제공개 WO 2016/138050호에 기재된 바와 같이, 아세트산 생성 박테리아는 천연적으로 메탄을 탄소원으로 사용하는 것이 불가능하기 때문이다.

"혐기성 미생물(anaerobe)"은 성장을 위해 산소를 필요로 하지 않는 미생물이다. 혐기성 미생물은 산소가 특정 역치 이상으로 존재하면 부정적으로 반응하거나 심지어 사멸한다. 그러나 일부 혐기성 미생물은 낮은 산소 수준(예컨대, 0.000001-5% 산소)를 견디는 능력이 있다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 혐기성 미생물이다. 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 표 1에 특정된 혐기성 미생물로부터 유래된다.

"아세토젠"은 절대혐기성 박테리아로서 Wood-Ljungdahl 경로를 에너지 보존과 아세틸-CoA 및 아세틸-CoA-유래의 생성물(예컨태 아세테이트)의 합성을 위한 주요 메카니즘으로 사용한다(문헌[Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008]). 아세토젠은 (1) CO₂로부터 아세틸-CoA의 환원 합성을 위한 메카니즘 (2) 말단 전자 수용, 에너지 보존 프로세스, (3) 세포 탄소의 합성에서의 CO₂ 의 고정(동화) 메카니즘으로서 Wood-Ljungdahl 경로를 사용한다(문헌[Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3^rd edition, p. 354, New York, NY, 2006]). 모든 천연 발생 아세토젠은 C1-고정, 혐기성, 독립영양, 그리고 비-메탄영양성(non-methanotrophic)이다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 아세토젠이다. 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 표 1에 특정된 아세토젠으로부터 유래된다.

"에탄올로젠"은 에탄올을 생성할 수 있는 미생물이다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 에탄올로젠이다. 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 표 1에 특정된 에탄올로젠으로부터 유래된다.

"독립영양 미생물"은 유기 탄소의 부재 하 성장이 가능한 미생물이다. 대신, 독립영양 미생물은 무기 탄소원, 예컨대 CO 및/또는 CO₂을 사용한다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 독립영양 미생물이다. 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 표 1에 특정된 독립영양 미생물로부터 유래된다.

"카복시도트로프"는 CO를 탄소 및 에너지의 유일한 공급원으로 사용할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 미생물은 카복시도트로프이다. 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 표 1에 특정된 카복시도트로프로부터 유래된다.

보다 광범위하게는, 본 발명의 미생물은 표 1에 특정된 속 또는 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미생물은 아세토박테리움, 알칼리바쿨룸, 블라우티아, 부티리박테리움, 클로스트리디움, 유박테리움, 모오렐라, 옥소박테르, 스포로무사, 및 테르모아나에로박테르로 구성된 군으로부터 선택되는 속의 구성원일 수 있다. 특히, 미생물은 아세토박테리움 우디이, 알칼리바쿨룸 바치이, 블라우티아 프로덕타, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 클로스티리디움 아세티쿰, 클로스티리디움 오토에타노게눔, 클로스티리디움 카복시디보란스, 클로스티리디움 코스카티이, 클로스티리디움 드라케이, 클로스티리디움 포르미코아세티쿰, 클로스티리디움 륭달리이, 클로스티리디움 마그눔, 클로스티리디움 라그스달레이, 클로스티리디움 스카톨로게네스, 유박테리움 리모숨, 모오렐라 테르마우토트로피카, 모오렐라 테르모아세티카, 옥소박테르 프펜니기이, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스파에로이데스, 및 테르모아나에로박테르 키우비로 구성된 군으로부터 선택되는 부모 박테리아로부터 유래될 수 있다.

바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 미생물은클로스티리디움 오토에타노게눔, 클로스티리디움 코스카티이, 클로스티리디움 륭달리이, 및 클로스티리디움 라그스달레이 종을 포함하는 클로스티리디아의 군집으로부터 유래된다.이들 종은 문헌[Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994(클로스티리디움 오토에타노게눔)], 문헌[Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232-236, 1993(클로스티리디움 륭달리이)], 및 문헌[Huhnke, WO 2008/028055(클로스티리디움 라그스달레이)]에 의해 처음으로 보고되고 특징지워졌다.

이들 종은 유사성이 많다. 특히, 이들 종은 모두 클로스트리디움 속의 C1-고정, 혐기성, 아세트산 생성, 에탄올 생성, 그리고 카복시도트로프 구성원이다. 이들 종은 유사한 유전자형과 표현형, 및 에너지 보존과 발효 대사 모드를 갖는다. 또한, 이 종들은 99 % 이상 동일한 16S rRNA DNA와 함께 클로스트리디움 rRNA 상동 그룹 I 내에 군집지어지며, 약 22 내지 30 몰%의 DNA G+C 함량을 가지고, 그람 양성이며, 유사한 형태와 크기를 가지고(0.5 내지 0.7 x 3 내지 5 μm 사이의 대수 성장 세포), 중온성이며(30 내지 37℃에서 최적 성장), 약 4 내지7.5의 유사한 pH 범위를 가지고, (최적 pH 약 5.5-6를 가짐), 시토크롬이 없고, Rnf 복합체를 경유하여 에너지를 보존한다. 또한, 이들 종에서는 카복시산의 그들의 대응 알코올로의 환원이 나타났다(문헌[Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012]). 중요하게, 이들 종은 또한 모두 CO-포함 기체 상에서 강한 독립영양성장을 나타냈고, 주요 발효 생성물로서 에탄올과 아세테이트를 생성하고, 특정 조건 하에서 적은 양의 2,3-부탄디올 및 락트산을 생성한다.

그러나, 이들 종은 또한 많은 상이함을 갖는다. 이들 종은 상이한 종들로부터 단리되었다: 토끼 내장 유래의 클로스티리디움 오토에타노게눔, 양계장 폐기물 유래의 클로스티리디움 륭달리이, 및 담수 퇴적물 유래의 클로스티리디움 라그스달레이 . 이들 종은 다양한 당(예컨대, 람노스, 아라비노스), 산(예컨대, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예컨대, 아르기닌, 히스티딘), 및 기타 기질(예컨대, 베타딘, 부탄올)의 사용에 있어 상이하다. 또한, 이들 종은 특정 비타민(예, 티아민, 바이오틴)에 대한 영양요구성이 상이하다. 이들 종은 Wood-Ljungdahl 경로 유전자 및 단백질의 핵산 및 아미노산 서열에 차이가 있지만, 이들 유전자 및 단백질의 일반적인 구성 및 수는 모든 종에서 동일하다는 것이 밝혀졌다(문헌[Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320 -325, 2011]).

따라서, 요약하자면, 클로스티리디움 오토에타노게눔, 클로스티리디움 코스카티이, 클로스티리디움 륭달리이, 또는 클로스티리디움 라그스달레이의 특성의 대다수는 그 종에 특화되지 않고, 오히려 클로스트리디움 속의 C1-고정, 혐기성, 아세트산 생성, 에탄올 생성, 및 카복시트로프 구성원에 대한 일반적 특성이다. 그러나, 이들 종은 실제로 구별되기 때문에, 이들 종 중 하나의 유전자 변형 또는 조작은 이들 종 중 다른 종에서 동일한 효과를 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 성장, 성능 또는 제품 생성의 차이가 관찰될 수 있다.

본 발명의 미생물은 또한 클로스티리디움 오토에타노게눔, 클로스티리디움 코스카티이, 클로스티리디움 륭달리이, 또는 클로스티리디움 라그스달레이의 분리주 또는 돌연변이로부터 유래될 수 있다.클로스티리디움 오토에타노게눔의 분리주 및 돌연변이는 JA1-1(DSM10061) (문헌[Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994]), LBS1560(DSM19630)(WO 2009/064200), 및 LZ1561(DSM23693)(WO 2012/015317)을 포함한다.클로스티리디움 륭달리이의 분리주 및 돌연변이는 ATCC 49587(문헌[Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993]), PETCT(DSM13528, ATCC 55383), ERI-2(ATCC 55380)(US 5,593,886), C-01(ATCC 55988)(US 6,368,819), O-52(ATCC 55989)(US 6,368,819), 및 OTA-1(문헌[Tirado-Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii PhD thesis, North Carolina State University, 2010])를 포함한다.클로스티리디움 라그스달레이의 분리주 및 돌연변이는 PI 1(ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826)(WO 2008/028055)을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 미생물은 광영양성 또는 광합성성이 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 메탄영양성이 아니다.

바람직하게는, 본 발명의 미생물은 알칼리제네스, 아조토박테르, 바실루스, 쿠프리아비두스(랄스토니아), 리조비움, 로도스피릴룸, 또는 슈도모나스 속의 구성원이 아니다. 특히, 본 발명의 미생물은 바람직하게는로도스피릴룸 루브럼, 바실루스 세레우스, 쿠프리아비두스 네카토르(이전에 랄스토니아 유트로파), 또는 슈도모나스 푸티다로부터 유래되지 않는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 미생물은 바람직하게는 에스케리키아 콜라이로부터 유래되지 않는다.

효소

"내인성" 또는 "천연"은, 본 발명의 미생물이 유래하는 야생형 또는 부모 미생물에 존재하거나 발현하는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 내인성 유전자 또는 단백질은 본 발명의 미생물이 유래하는 야생형 또는 부모 미생물 내에 존재하는 유전자 또는 단백질이다. 일 실시형태에서, 내인성 유전자의 발현은 외인성 조절 인자, 예컨대 외인성 프로모터에 의해 조절될 수 있다.

"외인성"은 본 발명의 미생물 외부에 기원하는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 외인성 유전자 또는 효소는 인공적 또는 재조합적으로 작성되거나 본 발명의 미생물 내에 도입 또는 발현될 수 있다. 외인성 유전자 또는 효소는 또한 이종 미생물로부터 단리되고 본 발명의 미생물 내에 도입 또는 발현될 수 있다. 외인성 핵산은 본 발명의 게놈 내에 통합되거나 본 발명의 미생물 내, 예컨대 플라스미드 내에서 염색체 외 상태(extra-chromosomal state)로 유지되도록 구성될 수 있다.

"이종"은 본 발명의 미생물이 유래하는 야생형 또는 부모 미생물 내에 존재하지 않는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 이종 유전자 또는 효소는 상이한 균주 또는 종으로부터 유래되고 본 발명의 미생물 내에 도입 또는 발현될 수 있다.

전형적으로, (a) 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환, (b) 아세토아세틸-CoA를 3-히드록시부티릴-CoA로 전환, 또는 (c) 3-히드록시부티릴-CoA를 PHB로 전환하는 적어도 하나의 효소는 박테리아에 대해 이종(즉, 비-천연적)이다. 예를 들어, 이들 효소의 하나, 둘, 또는 셋 모두는 박테리아에 대해 이종(즉, 비-천연적)일 수 있다. 그러나, 박테리아가 이들 단계의 하나 이상에 대해 천연적 효소 활성을 갖는 경우, 이들 스텝에 촉매 작용하도록 이종 효소를 도입할 필요는 없을 수 있다.

본원에서 사용된, "발현"은 폴리누클레오티드가 DNA 주형으로부터 전사되는 프로세스(예컨대 mRNA 또는 다른 RNA 전사체로의) 및/또는 전사된 mRNA가 그 후에 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 프로세스를 지칭한다.

"효소 활성" 또는 단순히 "활성"은 광의로 효소 활성을 지칭하며, 여기에는 소정의 반응에 촉매 작용하기 위한 효소의 활성, 효소의 양, 또는 효소의 가용성이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 따라서, "증가" 효소 활성은 소정의 반응에 촉매 작용하기 위한 효소의 활성 증가, 효소의 양 증가, 또는 효소의 가용성 증가를 포함한다. 유사하게, "감소" 효소 활성은 소정의 반응에 촉매 작용하기 위한 효소의 활성 감소, 효소의 양 감소, 또는 효소의 가용성 감소를 포함한다.

"코돈 최적화"는 특정 균주 또는 종 내에서의 최적화된 또는 향상된 번역을 위한 핵산, 예컨대 유전자의 돌연변이를 지칭한다. 코돈 최적화는 더 빠른 번역 속도나 더 높은 번역 정확성을 결과할 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 유전자는 클로스트리디움, 특히 클로스티리디움 오토에타노게눔, 클로스티리디움 코스카티이, 클로스티리디움 륭달리이, 또는 클로스티리디움 라그스달레이 내에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "코돈-최적화된" 및 "코돈-적응된(codon-adapted)"은 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

용어 "변이체"는, 참조 핵산 및 단백질의 서열, 예컨대 선행기술에 개시되거나 본원에 예시된 참조 핵산의 서열과 다른 핵산과 단백질을 포함한다. 본 발명은 참조 핵산 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 변이체 핵산 또는 단백질을 사용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 변이체 단백질은 참조 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 실질적으로 동일한 반응에 촉매 작용할 수 있다. 변이체 유전자는 참조 유전자와 동일 또는 실질적으로 동일한 단백질을 코딩할 수 있다. 변이체 프로모터는 참조 프로모터로서 적어도 하나의 유전자의 발현을 촉진하는 실질적으로 동일한 능력을 가질 수 있다.

그러나 핵산 또는 단백질은 본원에서 "기능적으로 동등한 변이체"로 지칭될 수 있다. 예로써, 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 대립유전자 변이체, 유전자 절편, 돌연변이 유전자, 다형성(polymorphism) 및 동등물을 포함할 수 있다. 다른 미생물의 동종 유전자는 또한 기능적으로 동등한 변이체의 예이다. 이들은 예컨대 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 클로스트리디움 베이제린키이, 또는 클로스티리디움 륭달리이와 같은 종 내의 동종 유전자를 포함할 수 있고, 상세한 것은 웹사이트, 예컨대 GenBank 또는 NCBI 상에서 공개적으로 입수 가능하다. 기능적으로 동등한 변이체는 또한 특정 미생물을 위한 코돈 최적화의 결과로서 서열이 변화하는 핵산을 포함할 수 있다. 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 바람직하게는 참조의 핵산과 적어도 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 또는 그 이상의 핵산 서열 동일성(상동성 백분율)을 가질 것이다. 단백질의 기능적으로 동등한 변이체는 바람직하게는 참조의 단백질과 적어도 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 또는 그 이상의 아미노산 동일성(상동성 백분율)을 가질 것이다.변이체 핵산 또는 단백질의 기능적 동등성은 공지의 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있을 것이다.

본원에 기재된 효소는 전형적으로 본 발명의 미생물 내로 도입된 핵산으로부터 발현된 것이다. 핵산은 공지의 임의의 방법을 사용하여 본 발명의 미생물로 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 네이키드 핵산으로서 전달될 수 있거나, 하나 이상의 작용제, 예컨대 리포좀으로 제형화될 수 있다. 핵산은 DNA, RNA, cDNA, 또는 필요에 따라 이들의 조합일 수 있다. 제한 저해제가 특정 실시형태 내에 사용될 수 있다. 추가적 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 및 인공적 염색체를 포함할 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 핵산은 플라스미드를 사용하여 본 발명의 미생물에 전달된다. 예를 들어, 형질전환(형질도입 또는 형질주입을 포함함)은 일렉트로포레이션, 초음파처리, 폴리에틸렌 글라이콜-매개된 형질전환, 화학적 또는 천연적 능력, 프로토플라스트 형질전환, 프로파지 유도, 또는 콘쥬게이션에 의해 달성될 수 있다. 활성 제한 효소를 갖는 특정 실시형태에서, 미생물 내로 핵산의 도입 전에 핵산을 메틸화하는 것이 필요할 수 있다.

더우기, 핵산은 조절 요소, 예컨대 프로모터를 포함하도록 설계되어 특정 핵산의 발현을 증가 또는 제어할 수 있다. 프로모터는 구성적(constitutive) 프로모터 또는 유도성(inducible) 프로모터일 수 있다. 이상적으로는, 프로모터는 Wood-Ljungdahl 경로 프로모터, 페레독신 프로모터, 피루베이트:레레독신 산화환원 효소 프로모터, RnF 복합 오페론 프로모터, ATP 신타제 오페론 프로모터, 또는 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터이다.

기질

"기질"은 본 발명의 미생물을 위한 탄소 및/또는 에너지원을 지칭한다. 전형적으로, 기질은 기체이고 C1-탄소원, 예를 들어, CO 및/또는 CO₂를 포함한다. 바람직하게는, 기질은 CO 또는 CO + CO₂의 C1-탄소원을 포함한다. 기질은 추가로 비-탄소 성분, 예컨대 H₂, N₂, 또는 전자(electron)를 포함할 수 있다.

기질은 일반적으로 적어도 어느 정도 양 CO, 예컨대 약 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 몰% CO를 포함할 수 있다. 기질은 범위의 CO, 예컨대 약 20-80, 30-70, 또는 40-60 몰% CO를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 기질은 약 40-70 몰% CO(예컨대, 제철소(steel mill) 또는 고로(blast furnace) 가스), 약 20-30 몰% CO(예컨대, 기본 산소로(basic oxygen furnace) 가스), 또는 약 15-45 몰% CO(예컨대, 합성 가스(syngas))를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기질은 상대적으로 낮은 양의 CO, 예컨대 약 1-10 또는 1-20 몰% CO를 포함할 수 있다. 본 발명의 미생물은 전형적으로 기질 내의 일부의 CO를 생성물로 전환한다. 일부 실시형태에서, 기질은 CO를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는다(< 1 몰%).

기질은 어느 정도 양의 H₂를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기질은 약 1, 2, 5, 10, 15, 20, 또는 30 몰% H₂를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 상대적으로 높은 양의 H₂, 예컨대 약 60, 70, 80, 또는 90 몰% H₂를 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 기질은 H₂를 포함하지 않거나, 실질적으로 포함하지 않는다(< 1 몰%).

기질은 어느 정도 양의 CO₂를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기질은 약 1 내지 80 또는 1 내지 30 몰% CO₂를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 약 20, 15, 10, 또는 5 몰% CO₂ 미만을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 기질은 CO₂를 포함하지 않거나, 실질적으로 포함하지 않는다(< 1 몰%).

특정 실시형태에서, PHB-생성 균주의 성장은, 20%의 H2 유사 합성 가스(50% CO, 20% CO₂, 20% H₂, 10% 아르곤)(각각 대조군 "PHB20" 및 "EP20"으로 명명함) 또는 2%의 H2 유사 제철소 발생 가스(steel mill off gas)(50% CO, 20% CO₂, 2% H₂, 28% 질소)(각각 대조군 "PHB2" 및 "EP2"로 명명함)를 가지는 기체 혼합물을 포함하는 2개의 다른 CO 및 CO₂를 사용하여 대조군("빈 플라스미드" 또는 "EP") 균주와 비교된다.

비록 기질이 전형적으로 기체이지만, 기질은 대체의 형태로도 제공될 수 있다. 예를 들어, 기질은 미세버블 분산 생성기를 사용하여 CO-포함 가스로 포화된 액체 내에 분산될 수 있다. 추가의 실시예로서, 기질은 고체 지지체 상에 흡착될 수 있다.

상기 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 산업 공정의 부산물로서, 또는 자동차 배기 가스 또는 바이오매스 기화와 같은 일부 다른 공급원으로부터 수득된 폐가스일 수 있다. 특정 실시형태에서, 산업 공정은 철 금속 제품 제조로 이루어진 그룹, 예컨대 제철소 제조, 비철 제품 제조, 석유 정제, 석탄 가스화, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크스 제조로부터 선택된다. 이들 실시형태에서, 상기 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 대기로 방출되기 전에 임의의 편리한 방법을 사용하여 상기 산업 공정으로부터 포획될 수 있다.

기질 및/또는 C1-탄소원은, 합성 가스, 예컨대 석탄 또는 정제 잔류물의 가스화, 바이오 매스 또는 리그노셀루로스 재료의 가스화, 또는 천연 가스의 개질에 의해 수득되는 합성 가스일 수 있다. 다른 실시형태에서, 합성 가스는 도시 고형 폐기물 또는 산업 고형 폐기물의 가스화로부터 수득될 수 있다.

기질의 조성은 반응의 효율 및/또는 비용에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 산소 (O₂)의 존재는 혐기성 발효 공정의 효율을 감소시킬 수 있다. 기질의 조성에 따라, 독소, 바람직하지 않은 성분, 또는 먼지 입자와 같은 임의의 원하지 않는 불순물을 제거하고 /하거나 바람직한 성분의 농도를 증가시키기 위해 기질을 처리, 세정 또는 여과하는 것이 바람직할 수 있다.

특정의 실시형태들에서, 발효 또는 배양은 당, 전분, 리그닌, 셀룰로오스 또는 헤미셀룰로오스와 같은 탄수화물 기질이 없는 상태에서 수행된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "PHBLowB"는 보다 낮은 정상-상태 바이오 매스 농도, 예컨대 3배 더 낮은 정상-상태 바이오 매스 농도를 갖는 실험을 지칭하기 위해 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "PHBpH5.5"는 pH 5.5에서 수행된 실험을 지칭하기 위해 사용된다. 도 8을 참조한다.

생성물

본 발명의 미생물은 배양되어 하나 이상의 생성물을 생성할 수 있다. 특히, 본 발명의 미생물은 PHB 또는 그 전구체, 예컨대 아세토아세틸-CoA 또는 3-히드록시부티릴-CoA를 생성할 수 있다.

PHB는 3-히드록시부티레이트 단량체의 중합체이다. 본 발명에 따라 생성된 PHB는 임의의 수의 3-히드록시부티레이트 단량체, 예를 들어, 약 10 내지 1,000,000 단량체를 포함할 수 있다. 추가의 실시예와 같이, PHB는 약 10 내지 100,000 단량체, 100 내지 100,000 단량체, 100 내지 10,000 단량체, 500 내지 5,000 단량체, 1,000 내지 10,000 단량체, 또는 5,000 내지 20,000 단량체를 포함할 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, PHB는 약 100 내지 12,000 단량체를 포함한다.

본 발명의 박테리아에 의해 생성된 PHB의 분자량은 약 1,000 내지 100,000,000 Da의 범위 내에 있을 수 있다. 예컨대, PHB의 분자량은 약 1,000 내지 10,000 Da, 10,000 내지 1,000,000 Da, 10,000 내지 10,000,000 Da, 또는 10,000,000 내지 100,000,000 Da일 수 있다. 바람직하게는, PHB의 분자량은 약 10,000 내지 1,000,000 Da, 예컨대 10,000 내지 100,000 Da, 10,000 내지 500,000 Da, 100,000 내지 500,000 Da, 300,000 내지 800,000 Da, 또는 500,000 내지 1,000,000 Da일 수 있다.

PHB 생성은 종종 건조 세포 중량의 백분율로 지칭된다. 본 발명의 미생물은 예를 들어, 0.005 내지 0.995 wt% PHB를 생성할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 약 0.01 wt%, 0.1 wt%, 0.5 wt%, 1 wt%, 1.5 wt%, 2 wt%, 3 wt%, 5 wt%, 10 wt%, 20 wt%, 30 wt%, 40 wt%, 50 wt%, 60 wt%, 70 wt%, 80 wt%, 90 wt%, 또는 95 wt% PHB를 생성한다.

PHB의 물리적 특성은 당업계에 널리 공지되어 있다. 대략적 근사치로서, PHB는 1497 내지 3500 MPa의 영률, 18 내지 43 MPa의 인장강도, 1.9 내지 45%의 파단 신장률, 60 내지 80%의 결정도, 162 내지 180℃의 용융온도, 45 내지 116℃의 결정화 온도, 및/또는 -1.2 내지 10℃의 유리전이온도를 갖는다.

추가로, 본 발명의 미생물은 또한 다른 생성물, 예컨대 에탄올(WO 2007/117157), 아세테이트(WO 2007/117157), 부탄올(WO 2008/115080 및 WO 2012/053905), 부티레이트(WO 2008/115080), 2,3-부탄디올(WO 2009/151342 및 WO 2016/094334), 락테이트(WO 2011/112103), 부텐(WO 2012/024522), 부탄디엔(WO 2012/024522), 메틸에틸케톤(2-부탄온)(WO 2012/024522 및 WO 2013/185123), 에틸렌(WO 2012/026833), 아세톤(WO 2012/115527), 이소프로판올(WO 2012/115527), 리피드(WO 2013/036147), 3-히드록시프로피오네이트(3-HP)(WO 2013/180581), 이스프렌(WO 2013/180584), 지방산(WO 2013/191567), 2-부탄올(WO 2013/185123), 1,2-프로판디올(WO 2014/036152), 1-프로판올(WO 2014/0369152), 및 코리스메이트-유도 생성물(WO 2016/191625)을 생성하거나 생성하도록 조작될 수 있다. 하나 이상의 표적 생성물에 추가로, 본 발명의 미생물은 또한 에탄올, 아세테이트, 및/또는2,3-부탄디올을 생성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 미생물 바이오 매스 자체는 생성물로 고려될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 미생물은 PHB를 분해하는 능력이 없다. PHB 및 기타 폴리히드록시알카노에이트를 천연적으로 생성하는 유기체는, 다른 영양소(예컨대, 질소 및 인)가 제한되고 탄소가 과량일 때 일반적으로 탄소 저장 물질로서 중합체를 합성한다. 이들 유기체는 이어서 제한 영양소가 보충되어 저장된 탄소에 접근할 때 중합체를 해중합/분해할 수 있다. PHB 생성의 최대화 목적을 위해, 비-천연적 생성자, 예컨대 본 발명의 미생물은 종종 생성된 중합체를 효소적으로 분해하는 능력이 없다는 이점을 갖는다. 이것은 본질적으로 탄소를 중합체 내에로 영구적으로 고정시키고(lock) 수율을 향상시킬 수 있다.

"선택성"이란 미생물에 의해 생성된 모든 발효 생성물의 생성에 대한 표적 생성물의 생성의 비율을 지칭한다. 본 발명의 미생물은 특정 선택도 또는 최소 선택성으로 생성물을 생성하도록 조작될 수 있다. 일 실시형태에서, 표적 생성물은 본 발명의 미생물에 의해 생성된 전체 발효 생성물의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 또는 75%를 점한다. 일 실시형태에서, 상기 표적 생성물은, 본 발명의 미생물이 상기 표적 생성물에 대해 적어도 10%의 선택성을 갖도록, 본 발명의 미생물에 의해 생성된 모든 발효 생성물의 적어도 10%를 차지한다. 다른 실시형태에서, 상기 표적 생성물은, 본 발명의 미생물이 상기 표적 생성물에 대해 적어도 30%의 선택성을 갖도록, 본 발명의 미생물에 의해 생성된 모든 발효 생성물의 적어도 30%를 차지한다.

발효

본 발명은, 기체 기질의 존재 하에 본 발명의 미생물의 배양과 그것에 의해 미생물이 PHB를 생성하는 것을 포함하는 PHB의 생산 방법을 추가로 제공한다. 기체 기질은 일반적으로 하나 이상의 CO, CO₂, 및 H₂를 포함한다.

전형적으로, 배양은 생물 반응기에서 수행된다. 용어 "생물 반응기"는, 하나 이상의 용기 및/또는 탑 또는 배관 장치, 예컨대 연속 교반 탱크 반응기(CSTR: continuous stirred tank reactor), 고정 세포 반응기(ICR: immobilized cell reactor), 살수층 반응기(TBR: trickle bed reactor), 버블 컬럼(bubble column), 가스 리프트 발효조(gas lift fermenter), 정적 혼합기(static mixer), 또는 가스-액체 접촉에 적합한 다른 용기 또는 다른 장치로 구성된 배양/발효 장치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물 반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 배양/발효 반응기를 포함할 수 있다. 기질은 이들 반응기의 하나 또는 둘 모두에 제공될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어"배양" 및 "발효"는 상호교환 가능하게 사용된다. 이들 용어는 배양/발효 공정의 성장 단계 및 생성물 생합성 단계를 모두 포함한다.

배양은 일반적으로 미생물의 성장을 허용하기에 충분한 영양소, 비타민, 및/또는 미네랄을 함유하는 수성 배양 배지에서 유지된다. 바람직하게는 수성 배양 배지는 혐기성 미생물 성장 배지, 예컨대 최소 혐기성 미생물 성장 배지이다. 적합한 배지는 당업계에 널리 공지되어 있다.

배양은 표적 생성물의 생성을 위한 적절한 조건 하에서 실시하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 배양은 혐기 조건 하에서 수행된다. 고려해야 할 반응 조건은 압력(또는 분압), 온도, 가스 유속, 액체 유속, 배지 pH, 배지 산화 환원 전위, 교반 속도(연속 교반 탱크 반응기를 이용하는 경우), 접종 수준, 액상 내의 가스가 제한적이 되지 않도록 보장하기 위한 최대 가스 기질 농도, 및 생성물 억제를 회피하기 위한 최대 생성물 농도를 포함한다.

고압에서 생물 반응기를 작동시키면 기상으로부터 액상으로의 가스 질량 이동 속도가 증가한다. 따라서, 대기압보다 높은 압력에서 배양을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 특정 가스 전환율은 부분적으로 기질 체류 시간의 함수이고 체류 시간은 생물 반응기의 필요한 부피를 좌우하기 때문에, 가압 시스템의 사용은 생물 반응기의 필요한 부피 및 결국에는 발효 장비의 자본 비용을 크게 감소시킬 수 있다. 이는, 결과적으로, 생물 반응기가 대기압 대신 고압으로 유지될 때, 생물 반응기 내의 액체 부피를 유입 가스 유량으로 나눈 값으로 정의된 체류 시간이 감소될 수 있다는 것을 의미한다. 최적 반응 조건은 사용된 특정 미생물에 의해 부분적으로 결정된다. 그러나, 일반적으로, 대기압보다 높은 압력에서 발효를 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 특정 기체 전환율은 부분적으로 기질 체류 시간의 함수이고 원하는 체류 시간의 달성이 결국 생물 반응기의 필요한 부피를 좌우하기 때문에, 가압 시스템의 사용은 생물 반응기의 필요한 부피 및 결국에는 발효 장비의 자본 비용을 크게 감소시킬 수 있다.

특정 실시형태에서, 발효는 광의 부재 또는 불충분한 양의 광 존재 하에서 수행되어 광합성 또는 광영양 미생물의 에너지 요건을 충족한다.

본 발명의 방법은 PHB의 분리 또는 정제를 추가로 포함할 수 있다. PHB는 당업계 공지의 임의의 방법을 사용하여 분리 또는 정제될 수 있다. 예를 들어, 세포는 침전(문헌[Chen, Appl Microbiol Biotechnol, 57: 50-55, 2001]) 또는 연속 분리(문헌[Elbahloul, Appl Environ Microbiol, 75: 643-651, 2009]; 문헌[Heinrich, AMB Express, 2: 59, 2012])(이어서 동결건조함)에 의해 수집될 수 있다. 동결건조 후, 중합체는 물질, 예컨대 에틸아세테이트(문헌[Chen, Appl Microbiol Biotechnol, 57: 50-55, 2001]), 아세톤(문헌[Elbahloul, Appl Environ Microbiol, 75: 643-651, 2009]), 또는 소듐히포클로라이트(문헌[Heinrich, AMB Express, 2: 59, 2012])로 세포로부터 제거될 수 있다. 중합체는 이어서 잔류/가용화 세포 매스로부터 제거될 수 있다. 폴리히드록시알카노에이트의 정체를 위한 많은 수의 대안적 공정이 공개되었고 개발되었으나 대규모 정제를 위해서는 아직 확립되지 않았다(문헌[Kunasundari, Express Polym Lett, 5, 620-634, 2011]).

실시예

하기의 실시예는 본 발명을 추가로 설명하지만, 당연히, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1

이 실시예는 PHB 합성이 가능한 Wood-Ljungdahl 미생물의 구축을 보여준다.

C. 네카토르(서열 번호: 1, 4, 및 7) 유래의 PHB 경로 유전자가, 천연적으로 PHB를 생성하지 않는 Wood-Ljungdahl 미생물인 C. 오토에타노게눔 에 도입되었다. 주목할 것은, 이들 종은 염색체 GC-함유량에 유의한 차이가 있다는 것이다. 특별히, C. 네카토르는 66% GC-함유량을 가지고(문헌[Pohlmann, Nat Biotechnol, 24: 1257-1262, 2006]) C. 오토에타노게눔은 단지 31% GC-함유량을 가진다(문헌[Brown, Biotechnol Biofuels, 7: 40, 2014]). 코돈 사용에 기초한 유전자 발현 이슈를 예측하자면, C. 네카토르 유래의 PHB 유전자의 서열은 코돈-적응되어 C. 오토에타노게눔에서의 단백질에 대해 더 높은 발현 프로파일에 보다 잘 적합하다. C. 네카토르에서와 동일한 단백질을 코딩하는 신규 서열(서열 번호: 3, 6, 및 9)을 갖는 유전자가 합성되고 발현 벡터 pMTL83157(서열 번호: 10) 내에 조립되었다. 이 플라스미드는 C. 오토에타노게눔로부터 취한 천연적 Wood-Ljungdahl 프로모터를 가져 유전자 전사를 유도하는 pMTL8000 시리즈(문헌[Heap, J Microbiol Methods, 78: 79-85, 2009])과 유사하다. 유전자는 프로모터의 다운스트림에 위치되어 C. 네카토르 게놈 내에 나타나도록 했다: phaC, phaA, 및 phaB. 항생물질 선택 마커, catP도 또한 사용되었다. 결과의 플라스미드는 pPHB_01(서열 번호: 11)로 명명되었다(도 2).

pPHB_01가, 다른 곳에 기재된 바와 같이(문헌[Mock, J Bacteriol, 197: 2965-2980, 2015]) E. 콜라이 HB101를 사용하여 박테리아 콘쥬게이션에 의해 C. 오토에타노게눔 내에 삽입되었다. 별도로, "빈" pMTL83157 플라스미드가 C. 오토에타노게눔 내에 삽입되어 음성 대조군으로 사용되었다. 이들 균주는 이어서 기체 기질로부터의 PHB 생성을 시험하기 위해 사용되었다.

바람직한 일 실시형태에서, 미생물은, 서열 번호: 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 효소를 포함하는 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환하는 효소, 서열 번호: 5에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 효소를 포함하는 아세토아세틸-CoA를 3-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 효소, 및/또는 서열 번호: 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 효소를 포함하는 3-히드록시부티릴-CoA를 폴리히드록시부티레이트로 전환하는 효소를 포함한다.

실시예 2

이 실시예는 쇼트 보틀(Schott bottle) 내에서의 PHB의 생성을 보여준다.

실시예 1에서 구축된 균주는 소형 배치로 성장되어PHB의 생성을 위해 시험되었다. 모든 작업은 엄격한 혐기 조건 하에서 수행되었다(문헌[Hungate, Methods in microbiology, pages 117-132, Academic Press, New York, NY, 1969]). 플라스미드 유지를 위한 티암페니콜 및 버퍼링을 위한 2-(N-모르로폴리노)에탄술폰산이 있는 개질된 PETC 배지(문헌[Kopke, Appl Environ Microbiol, 77: 5467-5475, 2011])를 포함하는 압력-규격화(pressure-rated) 쇼트 보틀을 균주(strain)로 접종하였고, CO, CO₂, H₂, 및 N₂(각각50, 18, 3, 29%에서)를 포함하는 기체를 보틀에 21 psi까지 가했다. 배양물을 37℃에서 회전 교반하여 성장시켰다.

배양이 정상기로 진입할 때까지 세포 성장을 정기적으로 모니터링하였다. 성장이 완료된 후, 세포를 더이상 혐기 조건 하에서 취급하지 않았다. 세포를 원심분리로 수집하고, 상청액을 버리고, -20℃에서 동결하고, 동결건조를 통해 건조하였다.

PHB 수율을 다른 곳에 기재된 바(문헌[Karr, Appl Environ Microbiol, 46, 1339-1344, 1983])와 유사한 방식으로, 고속 액체 크로마토그라피(HPLC)로 측정하였다. 약술하자면, 건조된 세포를 진한 황산으로 처리하고 가열하여 PHB를 크로톤산으로 전환하였다. 시료를 냉각하고, 희석하고, 여과하고, UV-Vis 검출기를 갖는 HPLC로 분석하여 크로톤산을 정량하였다. 초기 PHB 생성의 결과가 도 3에 요약되어 있고, 이는 Wood-Ljungdahl 미생물에서의 성공적인 ~1.15 wt%의 PHB 생성을 보여준다.

그러나, 중량의 90% 이상을 점하도록 PHB와 같은 중합체를 합성할 수 있는 네이티브 생성자, 예컨대 Cupriavidus 및 슈도모나스와 비교하여 낮은 수율을 고려해보면, Wood-Ljungdahl 미생물에서의 PHB 합성은 비 기체 기질 상에서 성장하는 천연적 생성자와 같이 단순한 것은 아닌 것으로 보인다. 특정 이론에 구애되고자 하지 않으며, 본 발명자는 Wood-Ljungdahl 미생물에서의 PHB 생성이 Wood-Ljungdahl 미생물과 천연적 PHB 생성자 간의 pH 선호도, 산소 필요성, 기질 활용 등을 극복하고자 코돈-적응이 필요할 수 있다.

C. 오토에타노게눔에서 기체 기질로부터 PHB 합성을 달성한 후, PHB 수율에 도움/개선할 수 있는 조건을 탐색하고자 한 노력으로 변경된 성장 조건으로 상기 기재된 작업을 반복하였다. 특히, 실험을 수행하여 상기 기재된 조건(조건 1, 도 4A)을 반복하고, 기체 조성을 50/30/10/10 CO/CO₂/H₂/N₂(조건 2, 도 4B)로 변경하고, 배양물의 배양을 정상기로 연장하고(조건 3, 도 4C), 보틀의 기체를 정기적으로 갱신하였다(조건 4, 도 4D). 도 4A 내지 4D에 보인 바와 같이, 모든 시험된 조건 하에서의 조작된 균주와 대조군 균주에 대해 성장은 둘 다 유사했다.

세포를 상기 기재된 바와 같이 수확하고 PHB 생성에 대해 분석하였다. 결과를 도 5에 나타냈으며, 조건 1 하에서 ~1.65 wt%의 PHB, 조건 2 하에서 ~1.50 wt%의 PHB, 조건 3 하에서~1.50 wt%의 PHB, 및 조건 4 하에서 ~0.85 wt%의 PHB 생성을 보인다.

실시예 3

이 실시예는 연속 배양에서 기체 기질로부터의 PHB 생성을 나타낸다.

실시예 1에서 구축된 균주를, 문헌[Valgepea, Cell Syst, 4: 505-515, 2017]에 기재된 바와 유사한 조건 하에 탄소의 주요 공급원으로서 기체를 사용하는 연속 발효 하에 시험하였다. 쇼트 보틀 내에서 수행된 실험과 유사하게, 연속 배양물을 혐기성으로 성장시키고 취급하였다. 쇼트 보틀과 달리, 배양물을 일정한 배지 공급으로 약 20일 동안 연속적인 방식으로 성장시켰다. 성장과 PHB 생성을 위해 2개의 상이한 기체 조성물을 사용하였다: 50/20/20/10 CO/CO₂/H₂/Ar 및 50/20/2/28 CO/CO₂/H₂/N₂. 기체 흡수량을 질량분석(MS)을 사용하여 모니터링하고 시료를 정기적으로 채취하여 액체 대사물을 HPLC로 정량하였다.

PHB는 연속 발효의 완료까지는 정량하지 않았다. 쇼트 보틀 실험과 유사하게, 세포를 원심분리로 수집하고, 동결하고, 동결건조에 의해 건조시켰다. 건조된 세포를 이어서 황산으로 처리하여 PHB에 대해 분석하고 가열하여 PHB를 크로톤산으로 전환하였다. 다음에 PHB 정량을 HPLC를 통해 수행하였다. 연속 발효에서의 PHB 생성의 결과를 도 6에 보인다. 특히, 20% 수소 기체 상에서 성장한 미생물은 ~0.45 wt%의 PHB를 생성하였고, 2% 수소 상에서 성장한 미생물은 ~0.25 wt%의 PHB를 생성하였다.

실시예 4

이 실시예는 증가된 PHB 생성을 위한 발효기 최적화를 나타낸다.

세포의 PHB 함유량을 증가시키고자 다양한 조건들이 연속 발효 내에서 시험되었다. 아세틸-CoA과 NADPH의 풀(pool)은 낮은 바이오 매스 농도에서 증가한다(문헌[Valgepea, Cell Syst., 4: 505-515, 2017]). 따라서, 증가된 수준의 아세틸-CoA와 NADPH 풀에서 정상 상태의 바이오 매스 수준이 낮을 수록 PHB가 높게 결과되는지를 시험하였다. CO의 흡수 속도와, 추가로, 발효기에서의 바이오 매스 농도를 낮추어 PHB로의 세포 자원의 흐름이 증가하는 것을 보였다(도 7).

PHB를 증가키시는 것으로 보이는 다른 요인은 pH이었다. 높은 pH일수록, 아세트산이 적게 확산될 것이고 양성자 구동력(PMF: proton motive force)을 분리할 것이다(문헌[Valgepea, Cell Syst., 4: 505-515, 2017]). 따라서, pH를 5 내지 5.5 또는 6으로 증가시키는 것이 PMF를 유지하기 위한 에너지를 덜 소비할 것인지 시험하였다. 추가의 이용가능한 에너지는, ATP 생성을 위해 필요한 아세테이트 생성을 감소시키는 것에 의해 추가의 ATP를 제공하여 PHB 생성을 지원할 것이다. pH를 5.0 내지 5.5 또는 6.0으로 변경하는 것은 증가된 PHB 생성을 초래한다(pH 5.5에서 ~12.5 배). pH 값 6.0은, C. 오토에타노게눔이 보다 산성인 pH에서 최적으로 성장하므로 유지하기 어렵다.

실시예 5

이 실시예는 대조군(빈 플라스미드) 균주와 비교하여, PHB 생성시의 전사 및 대사체군(metabolome) 수준에 대한 변화를 나타낸다.

RNA 서열화 유래의 전사체군(transcriptome)의 분석은 기 공개된 R-스크립트(문헌[Valgepea, Cell Syst., 4: 505-515, 2017])에 기초하되, 이하의 변형을 가진다: C. 오토에타노게눔 NCBI 참조 서열 CP006763.1 및 그것의 주석 첨부된 게놈(문헌[Brown, Biotechnol. Biofuels, 7: 40, 2014]에 기재됨)의 사용; 3개의 PHB 유전자(서열 번호: 3, 6, 9.)에 대한 누클레오티드 서열의 추가.

R에서 이용가능한 대사체군 패키지(Livera 및 Bowne, R 패키지, 2014)를 사용하여 세포내 대사체군 데이터의 통계적 분석을 수행했다. 이 스크립트는 대사체군 데이터를 정규화하고 선형 모델 피트로 통합한다(문헌[De Livera, Anal. Chem., 84: 10768-10776, 2012]). 세포내 대사물 농도를, 데이터를 스크립트로 임포트 하기 전에 바이오 매스 당(μmol/gDCW)으로 정규화하였다. 대사체군 데이터의 통계적 분석을 위해서 통상의 통계(즉 비 베이지안)을 사용하는 선형 모델 피트를 사용하였다(문헌[De Livera, Anal. Chem., 84: 10768-10776, 2012; De Livera, Metabolomics Tools for Natual Product Discovery, 2013]).

아르기닌이 공급되지 않았음에도, 아세토젠 내에 ATP를 공급하는 것으로 판명된 대체 경로인 아르기닌 디이미나제 경로에 대해 상향 조절(upregulation)이 관찰되었다(문헌[Valgepea, Metab. Eng. 41: 202-211, 2017])(q-값 <0.01): 아르기닌 디이미나제(CAETHG_3021, ~7 배); 오르니틴 카바모일 트랜스퍼라제(CAETHG_3022, ~6 배); 카바메이트 키나제(CAETHG_3025, ~3.3 배). 추가로, 아세토젠 내에서 에너지 저장 복합체의 일부인 Rnf 복합체를 코딩하는 3개의 유전자(문헌[Schuchmann 및 Muller, Nat. Rev. Microbiol. 12: 809-821, 2014])는 PHB 균주 내에서 ~2배의 증가를 보였다: (CAETHG_3231, q-값=0.02; CAETHG_3228, q-값=0.04 및 CAETHG_3230, q-값=0.03). 이들 관찰은 이종 생산에 의한 에너지 대사의 변화를 강조한다. 추가로, CO 디히드로게나제/아세틸-CoA 신타제(CAETHG_1610, ~1.4 배; CAETHG_1611, ~1.2 배)에 대해 코딩하는 Wood-Ljungdahl 경로(WLP)의 2개의 유전자 및 (FeFe)-히드로게나제(CAETHG_1691, ~2.5 배)를 코딩하는 유전자의 발현이 PHB 균주 내에서 상향 조절되었다. 이들 변화는 PHB 생성을 위한 아세틸-CoA 및 NADPH의 생성을 위해 필요한 증가를 반영할 수 있다(도 1).

대사체군 수준에서, PHB 균주는 EP에 비하여 보다 높은 세포내 NADH/NAD⁺ 비율을 가진다. 이는 PHB 발현 이후의 환원 상태에서의 잠재적 변화를 시사한다. 아세테이트의 생성, C. 오토에타노게눔 대사의 주요 천연적 부산물(문헌[Abrini, Arch. Microbiol., 161: 345-351, 1994; Marcellin, Green Chem., 18: 3020-3028, 2016])은 합성 가스 상에서 EP 균주에 비하여 감소되었다(p-값<0.01; 양측 등분산 t-검정). 제철소 발생 가스 상에서는 변화가 관찰되지 않았다.

실시예 6

이 실시예는 게놈-스케일 대사 모델 재구성(GEM)의 결과를 보여준다. 게놈-스케일 대사 모델 GEM iCLAU786(문헌[Valgepea, Cell Syst., 4: 505-515, 2017])이 PHB 경로의 부가와 함께 사용되었다. 상기 나열된 모든 조건에서의 합성 가스 상에서 성장된 PHB 균주에 대해 시뮬레이션을 수행하였다.

플럭스 시뮬레이션에 의해 보다 높은 PHB 조건(즉 "낮은 바이오 매스" 및 "pH5.5")에서 더 적은 CO₂가 소산되었음이(dissipated) 확인되었다. 추가로, 기 관찰된 바와 같이(문헌[Valgepea, Cell Syst., 4: 505-515, 2017]), 이들 시뮬레이션은, 전자-분지화(electron-bifurcating) 히드로게나제-포르메이트 디히드로게나제(HytA-E/FdhA) 효소 복합체의 포르메이트-H₂ 리아제 활성을 통해 H₂에 의해 CO₂가 포르메이트로 직접 환원되었음을 또한 보여주었다(문헌[Wang, J. Bacteriol., 195: 4373-4386, 2013]). 이는 전술의 효소 복합체를 사용하는 WLP에서 CO₂ 환원중에 리독스(redox)가 소비되지 않기 때문에 리독스-소비 포르메이트 디히드로게나제에 의한 CO₂의 환원에 장점을 제공한다. 또한 "낮은 바이오 매스" 및 "pH5.5" 실험에서, 환원된 페레독신의 총량을 균형잡는 것은, 대조군(PHB20)에 비교하여, AOR(알데히드 페레독신 옥시도리덕타제), Nfn 복합체, 또는 메틸렌 THF 리덕타제 분지 반응(bifurcating reaction)과 같은 일부 중요 반응에의 플럭스의 증가 또는 감소로 달성되는 것이 관찰되었다.

놀랍게도, "대조군" 조건(PHB20)은, 인 실리코에서, "PHBpH5.5" 조건에 비하여 보다 낮은 유지 ATP 비용(mmol/gDCW/h), 및 총 ATP 생성(mATP%)으로부터의 유지 ATP 비용을 가졌다.

또한 ATP, NADH, NADPH 또는 환원된 페레독신(Fd_red)이 PHB 생성을 제한하는지를 판단하고자 시뮬레이션을 실행하였다. 시뮬레이션은 ATP가 공급될 때, 시험된 모든 조건들(즉 "PHB20," "PHB 낮은 바이오 매스", 및 "PHBpH5.5") 내의 "제한" 후보물 중에서 PHB 생성(mmol/gDCW/h)가 최대치에 도달함을 보여주었다. 이 관찰은 아세토젠 대사가 ATP-제한적이라는 이해와 일치한다(문헌[Schuchmann 및 Muller, Nat. Rev. Microbiol. 12: 809-821, 2014]). 모델은 또한 ATP 제한에 이어서, PHB 생성이 Fd_red, NADPH, 그리고 이어서 NADH 가용성에 의해 제한됨을 보여주었다(도 8).

이 결과는 ATP 및 Fd_red가 아세토젠에서 높은 에너지 운반체로서의 중요성을 확인시켜준다. ATP는 동화작용과 세포 유지를 지원하기 때문에, Fd_red는 Rnf 에너지 보존 복합체에 필수적이고(문헌[Biegel, Cell. Mol. Life Sci. 68: 613-634, 2011]) Fd_red 만이 WLP의 카보닐 분지에서 CO₂의 CO으로의 환원을 위한 전자를 제공하는 것으로 알려져 있다(문헌[Schuchmann 및 Muller, Nat. Rev. Microbiol. 12: 809-821, 2014]).

본 명세서에 인용된, 공개문헌들, 특허 출원들 및 특허들을 포함한 모든 참고 문헌들은, 마치 각각의 참고 문헌이 원용에 의해 편입되도록 구체적으로 그리고 개별적으로 표기되고 전체로서 본 명세서에 기술된 것처럼, 원용에 의해 본 명세서에 편입된다. 본 명세서 내에서의 임의의 선행 기술에 대한 인용은, 그 선행 기술이 임의의 국가에서의 관련 분야의 일반적인 지식의 일부를 형성함을 인정하는 것이 아니며, 이와 같이 이해되지도 않아야 한다.

본 발명의 기재의 맥락에서(특히 하기 청구범위의 맥락에서) 단수 용어들 및 유사한 지시 대상의 사용은 본 명세서에 달리 명시되거나 맥락상 명확히 모순되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는(comprising, including)", "갖는", 및 "함유하는(containing)"은 달리 지시되지 않는 한, 개방형 용어(즉, "포함하나 이에 제한되지 않는"의 의미)로 해석되어야 한다. 용어 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"은 조성물, 공정, 또는 방법의 범위를 특정 물질 또는 단계로, 또는 조성물, 공정, 또는 방법의 기본 및 신규 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 대안(예컨대, "또는")의 사용은 대안의 하나, 둘 모두, 또는 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 달리 지시되지 않는 한 지시된 범위, 값, 또는 구조의 ±20%를 의미한다.

본 명세서에서의 값 범위의 언급은, 본 명세서에 달리 명시되지 않는 한, 단지, 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 나타내는 약식 방법으로서 작용하려는 것이며, 각각의 개별 값은 그것이 본 명세서에서 개별적으로 언급된 것과 마찬가지로 본 명세서 내에 편입된다. 예컨대, 임의의 농도 범위, 퍼센트 범위, 비율 범위, 정수 범위, 크기 범위, 또는 두께 범위는 달리 지시되지 않는 한 언급된 범위 내의 임의의 정수의 값, 및 적절한 경우, 이들의 분수(예컨대 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에 기재된 방법은 본 명세서에 달리 명시되지 않거나 맥락상 명확히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시 언어(예컨대, "예를 들어")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것이며, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범위에 제한을 부과하지 않는다. 본 명세서의 어떤 언어도 임의의 청구되지 않은 구성 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 명시하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태들이 본 명세서에 기재된다. 이들 바람직한 실시형태들의 변형은 전술한 기재를 읽었을 때 당업자에게 자명해질 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 이와 같은 변형을 적합하게 사용할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본 발명이 본 명세서에 구체적으로 기재된 바와 다르게 실시되도록 의도한다. 따라서, 본 발명은, 준거법에 의해 허용되는, 본 명세서에 첨부된 청구범위에 언급된 기술 요지의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 달리 명시하지 않거나 맥락상 명확히 모순되지 않는 한, 본 발명은 그의 모든 가능한 변형에서의 전술된 구성 요소의 임의의 조합을 포함한다.

SEQUENCE LISTING <110> LanzaTech, Inc. <120> PRODUCTION OF POLYHYDROXYBUTYRATE IN WOOD-LJUNGDAHL MICROORGANISMS <130> LT128WO1 <150> US 62/568,127 <151> 2017-10-04 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1179 <212> DNA <213> Cupriavidus necator <400> 1 atgactgacg ttgtcatcgt atccgccgcc cgcaccgcgg tcggcaagtt tggcggctcg 60 ctggccaaga tcccggcacc ggaactgggt gccgtggtca tcaaggccgc gctggagcgc 120 gccggcgtca agccggagca ggtgagcgaa gtcatcatgg gccaggtgct gaccgccggt 180 tcgggccaga accccgcacg ccaggccgcg atcaaggccg gcctgccggc gatggtgccg 240 gccatgacca tcaacaaggt gtgcggctcg ggcctgaagg ccgtgatgct ggccgccaac 300 gcgatcatgg cgggcgacgc cgagatcgtg gtggccggcg gccaggaaaa catgagcgcc 360 gccccgcacg tgctgccggg ctcgcgcgat ggtttccgca tgggcgatgc caagctggtc 420 gacaccatga tcgtcgacgg cctgtgggac gtgtacaacc agtaccacat gggcatcacc 480 gccgagaacg tggccaagga atacggcatc acacgcgagg cgcaggatga gttcgccgtc 540 ggctcgcaga acaaggccga agccgcgcag aaggccggca agtttgacga agagatcgtc 600 ccggtgctga tcccgcagcg caagggcgac 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60 Pro Ala Arg Gln Ala Ala Ile Lys Ala Gly Leu Pro Ala Met Val Pro 65 70 75 80 Ala Met Thr Ile Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Lys Ala Val Met 85 90 95 Leu Ala Ala Asn Ala Ile Met Ala Gly Asp Ala Glu Ile Val Val Ala 100 105 110 Gly Gly Gln Glu Asn Met Ser Ala Ala Pro His Val Leu Pro Gly Ser 115 120 125 Arg Asp Gly Phe Arg Met Gly Asp Ala Lys Leu Val Asp Thr Met Ile 130 135 140 Val Asp Gly Leu Trp Asp Val Tyr Asn Gln Tyr His Met Gly Ile Thr 145 150 155 160 Ala Glu Asn Val Ala Lys Glu Tyr Gly Ile Thr Arg Glu Ala Gln Asp 165 170 175 Glu Phe Ala Val Gly Ser Gln Asn Lys Ala Glu Ala Ala Gln Lys Ala 180 185 190 Gly Lys Phe Asp Glu Glu Ile Val Pro Val Leu Ile Pro Gln Arg Lys 195 200 205 Gly Asp Pro Val Ala Phe Lys Thr Asp Glu Phe Val Arg Gln Gly Ala 210 215 220 Thr Leu Asp Ser Met Ser Gly Leu Lys Pro Ala Phe Asp Lys Ala Gly 225 230 235 240 Thr Val Thr Ala Ala Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Gly Ala Ala Ala 245 250 255 Val Val Val Met Ser Ala Ala Lys Ala Lys Glu Leu Gly Leu Thr Pro 260 265 270 Leu 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ttctcgttaa attcacaaat 420 aatttattaa taatatcaat aaccaagatt atacttaaat ggatgtttat tttttaacac 480 ttttatagta aatatattta ttttatgtag taaaaaggtt ataattataa ttgtatttat 540 tacaattaat taaaataaaa atagggtttt aggtaaaatt aagttatttt aagaagtaat 600 tacaataaaa attgaagtta ttgctttaag gagggaatta ttcatatggc tacaggaaaa 660 ggagcagcag ctagtacaca ggaaggaaaa tcacaaccgt ttaaagttac accaggtcct 720 tttgacccag ccacctggtt agaatggtca cgccagtggc agggtactga gggaaatgga 780 catgcagcag caagtggcat tccaggattg gatgctcttg ctggggtaaa gatagctcca 840 gctcagcttg gagatataca acagagatat atgaaagatt tttcagctct ttggcaagcc 900 atggcagaag gaaaagcaga agcgacaggt ccacttcatg acagaagatt tgctggagat 960 gcttggagaa ctaatttgcc atatagattt gctgccgctt tttatctttt gaatgccaga 1020 gctttaactg agcttgcaga tgctgtagaa gctgatgcta aaacaagaca gagaataaga 1080 tttgctattt cccaatgggt tgatgctatg tcgccggcga attttttagc tacaaatcct 1140 gaggcacaga gattacttat tgagtccgga ggagaatcac taagggctgg agtgagaaat 1200 atgatggaag atttgaccag aggaaagatc tctcagacag acgaatctgc atttgaagta 1260 ggaaggaatg ttgcggtaac tgaaggtgct gttgtatttg aaaatgaata ttttcaatta 1320 ctacaatata aacctttgac agacaaggtg catgctagac ctcttcttat ggttccacct 1380 tgtataaata aatattatat tttagatctt cagcctgaat catctttagt aagacacgtt 1440 gtagaacaag gtcacacagt atttttagtt tcttggagaa atcctgacgc atctatggcc 1500 ggcagtacct gggatgatta tatagaacat gcagcaataa gggcaataga agttgctaga 1560 gatataagcg gtcaggacaa gattaatgta cttggatttt gtgtaggagg aactatagtt 1620 tcaacagcac tggcagtatt ggctgctaga ggagaacatc cagcagcatc ggtaacttta 1680 cttacaacac ttttagattt tgcagatact ggaatattag acgtatttgt tgatgaagga 1740 cacgtacaat taagagaggc aaccttgggt ggaggagctg gtgcaccctg tgctcttctt 1800 agagggttag aattagcaaa tacttttagt tttttacgac ctaatgactt agtttggaat 1860 tatgtagtgg ataattacct taaaggaaac acacctgtac cttttgattt attattttgg 1920 aatggagatg caaccaactt gcctggtcct tggtattgtt ggtatcttag acatacctac 1980 cttcaaaatg aattaaaagt tcctggcaaa ctcactgtat gcggtgtccc cgttgatttg 2040 gcttcaatag atgtaccaac ttatatatac ggaagtagag aggatcatat cgtaccttgg 2100 actgcggctt acgcttctac agcattgctg gctaataaat tgagatttgt attaggagct 2160 tctggtcaca tagctggagt aataaatcca ccagccaaaa ataaacgaag tcattggacc 2220 aatgatgcac ttcctgaatc tccacagcag tggcttgctg gtgcaataga acatcatggt 2280 tcatggtggc ccgactggac agcatggttg gcaggtcaag ccggtgctaa aagggctgcg 2340 ccagcaaact atggcaatgc aagatacagg gctatagaac cggctccagg aagatacgtt 2400 aaagcaaaat aagaattcga gctcggtacc aggaggatat taaaatgact gatgtagtaa 2460 tagtatctgc agcaagaacg gcagttggaa aatttggagg atctttggct aaaatacctg 2520 caccagaact aggggcagtg gttataaaag cagcactgga aagggccggc gtcaaaccag 2580 aacaggtttc agaagtaatt atgggacaag ttttaacagc tggatcaggt cagaatcctg 2640 caagacaagc agctattaaa gcaggacttc cagcaatggt gccagctatg accataaata 2700 aggtttgtgg cagtggatta aaggcagtaa tgttggcagc taatgcaata atggcaggtg 2760 atgcagaaat agttgtagca ggtggtcaag aaaatatgtc tgctgcacca catgtactgc 2820 cgggatctag ggatggtttt aggatgggag atgcaaaatt ggtggataca atgatagtag 2880 atggactttg ggatgtatac aatcagtatc acatgggaat tacagctgaa aatgttgcta 2940 aagaatatgg aataactaga gaagctcaag atgagtttgc agtaggttca caaaataagg 3000 ctgaagcagc acaaaaagcc ggaaaatttg atgaggaaat agttcctgta ttaataccac 3060 aaagaaaagg agatcctgta gcatttaaaa cagatgaatt tgtacgccag ggagctacat 3120 tggattcaat gtctggctta aaaccggcct ttgataaggc aggtactgta actgcagcta 3180 atgcaagtgg gttaaatgat ggagcagcag cagttgtggt aatgtcagca gctaaagcta 3240 aagagttggg tcttactcca cttgcaacta taaagagcta tgcaaatgca ggagtcgatc 3300 caaaggtcat gggcatgggt cctgttccag cgtctaaaag agcactaagt agagctgaat 3360 ggacaccaca agacctggat cttatggaaa taaatgaagc atttgctgcg caggcccttg 3420 ctgtccatca acaaatggga tgggatactt caaaagtaaa tgtgaatgga ggagctattg 3480 ccatagggca tcccattgga gccagtggat gccgcatttt agtaacttta cttcatgaga 3540 tgaaaagaag agatgcaaaa aaaggacttg ccagcttatg tataggtgga ggaatgggtg 3600 tagctttagc cgttgaaaga aaataaatca ttctgaattc gagctcggta ggaggtcaga 3660 atgacacaga gaatagctta tgtaactgga ggaatggggg gaattggcac ggcaatatgt 3720 cagagattag caaaggatgg ttttagagta gttgcgggtt gtggcccaaa 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ttcccaacag 4620 ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgctag cataaaaata agaagcctgc atttgcaggc 4680 ttcttatttt tatggcgcgc cgccattatt tttttgaaca attgacaatt catttcttat 4740 tttttattaa gtgatagtca aaaggcataa cagtgctgaa tagaaagaaa tttacagaaa 4800 agaaaattat agaatttagt atgattaatt atactcattt atgaatgttt aattgaatac 4860 aaaaaaaaat acttgttatg tattcaatta cgggttaaaa tatagacaag ttgaaaaatt 4920 taataaaaaa ataagtcctc agctcttata tattaagcta ccaacttagt atataagcca 4980 aaacttaaat gtgctaccaa cacatcaagc cgttagagaa ctctatctat agcaatattt 5040 caaatgtacc gacatacaag agaaacatta actatatata ttcaatttat gagattatct 5100 taacagatat aaatgtaaat tgcaataagt aagatttaga agtttatagc ctttgtgtat 5160 tggaagcagt acgcaaaggc ttttttattt gataaaaatt agaagtatat ttattttttc 5220 ataattaatt tatgaaaatg aaagggggtg agcaaagtga cagaggaaag cagtatctta 5280 tcaaataaca aggtattagc aatatcatta ttgactttag cagtaaacat tatgactttt 5340 atagtgcttg tagctaagta gtacgaaagg gggagcttta aaaagctcct tggaatacat 5400 agaattcata aattaattta tgaaaagaag ggcgtatatg aaaacttgta 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agcggaagag 7980 cgcccaatac gcagggcccc ctgcttcggg gtcattatag cgattttttc ggtatatcca 8040 tcctttttcg cacgatatac aggattttgc caaagggttc gtgtagactt tccttggtgt 8100 atccaacggc gtcagccggg caggataggt gaagtaggcc cacccgcgag cgggtgttcc 8160 ttcttcactg tcccttattc gcacctggcg gtgctcaacg ggaatcctgc tctgcgaggc 8220 tggccggcta ccgccggcgt aacagatgag ggcaagcgga tggctgatga aaccaagcca 8280 accaggaagg gcagcccacc tatcaaggtg tactgccttc cagacgaacg aagagcgatt 8340 gaggaaaagg cggcggcggc cggcatgagc ctgtcggcct acctgctggc cgtcggccag 8400 ggctacaaaa tcacgggcgt cgtggactat gagcacgtcc gcgagctggc ccgcatcaat 8460 ggcgacctgg gccgcctggg cggcctgctg aaactctggc tcaccgacga cccgcgcacg 8520 gcgcggttcg gtgatgccac gatcctcgcc ctgctggcga agatcgaaga gaagcaggac 8580 gagcttggca aggtcatgat gggcgtggtc cgcccgaggg cagagccatg acttttttag 8640 ccgctaaaac ggccgggggg tgcgcgtgat tgccaagcac gtccccatgc gctccatcaa 8700 gaagagcgac ttcgcggagc tggtgaagta catcaccgac gagcaaggca agaccgatcg 8760 ggccc 8765

Claims (20)

1. 비-자연 발생적 Wood-Ljungdahl 미생물로서,
   a. 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환하는 효소,
   b. 아세토아세틸-CoA를 3-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 효소, 및
   c. 3-히드록시부티릴-CoA를 폴리히드록시부티레이트로 전환하는 효소를 포함하는, 비-자연 발생적 Wood-Ljungdahl 미생물.
2. 제1항에 있어서, 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환하는 상기 효소는 아세틸-CoA C-아세틸 트랜스퍼라제(EC 2.3.1.9)인, 미생물.
3. 제2항에 있어서, 상기 아세틸-CoA C-아세틸 트랜스퍼라제는 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 아에로모나스 히드로필리아(Aeromonas hydrophilia), 알칼리게네스 라투스(Alcaligenes latus), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 부르콜데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 할로페락스 메디테라네이(Haloferax mediterranei), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 만델리이(Pseudomonas mandelii), 슈도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 또는 스트렙토마이시스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor)로부터 유래하는, 미생물.
4. 제1항에 있어서, 아세토아세틸-CoA를 3-히드록시부티릴-CoA로 전환하는 상기 효소는 아세토아세틸-CoA 리덕타제(EC 1.1.1.36) 또는3-히드록시부티릴-CoA 디히드로게나제(EC 1.1.1.157)인, 미생물.
5. 제4항에 있어서, 상기 아세토아세틸-CoA 리덕타제는 아시네토박터 바우만니이, 아에로모나스 히드로필리아, 알칼리게네스 라투스, 아르트로스피라 플라텐시스, 바실러스 서브틸리스, 부르콜데리아 세파시아, 쿠프리아비두스 네카토르, 할로페락스 메디테라네이, 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 만델리이, 슈도모나스 올레오보란스, 슈도모나스 푸티다, 또는 스트렙토마이시스 코엘리콜로르로부터 유래하는 미생물.
6. 제4항에 있어서, 상기 3-히드록시부티릴-CoA 디히드로게나제는 클로스트리디움 베이제린키이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(acetobutylicum), 또는 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri)로부터 유래하는 것인, 미생물.
7. 제1항에 있어서, 3-히드록시부티릴-CoA를 폴리히드록시부티레이트로 전환하는 상기 효소는 폴리히드록시알카노에이트 신타제 폴리히드록시알카노에이트 신타제(EC 2.3.1.-)인, 미생물.
8. 제7항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트 신타제는 아시네토박터 바우만니이, 아에로모나스 카비아에(Aeromonas caviae), 아에로모나스 히드로필리아, 알칼리게네스 라투스, 아르트로스피라 플라텐시스, 바실러스 서브틸리스, 부르콜데리아 세파시아, 쿠프리아비두스 네카토르, 할로페락스 메디테라네이, 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 만델리이, 슈도모나스 올레오보란스, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 61-3, 로도스피릴룸 루브럼(Rhodospirillum rubrum), 또는 스트렙토마이시스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor)로부터 유래하는 것인, 미생물.
9. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 아세토박테리움(Acetobacterium), 알칼리바쿨룸(Alkalibaculum), 블라우티아(Blautia), 부티리박테리움(Butyribacterium), 클로스트리디움, 유박테리움(Eubacterium), 모오렐라(Moorella), 옥소박테르(Oxobacter), 스포로무사(Sporomusa), 및 테르모아나에로박테르(Thermoanaerobacter)로 구성된 군으로부터 선택되는 속의 구성원인, 미생물.
10. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 바치이(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로스티리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스티리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스티리디움 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스티리디움 코스카티이(Clostridium coskatii), 클로스티리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스티리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스티리디움 르정륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스티리디움 마그눔(Clostridium magnum), 클로스티리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스티리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 모오렐라 테르마우토트로피카(Moorella thermautotrophica), 모오렐라 테르모아세티카(Moorella thermoacetica), 옥소박테르 프펜니기이(Oxobacter pfennigii), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides), 및 테르모아나에로박테르 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)로 구성된 군으로부터 선택되는 부모 미생물로부터 유래하는, 미생물.
11. 제10항에 있어서, 상기 미생물은 클로스티리디움 오토에타노게눔, 클로스티리디움 코스카티이, 클로스티리디움 륭달리이, 및 클로스티리디움 라그스달레이로 구성된 군으로부터 선택되는 부모 박테리아로부터 유래하는, 미생물.
12. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 CO, CO₂, 및 H₂의 하나 이상을 포함하는 기체 기질을 소비하는, 미생물.
13. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 혐기성인, 미생물.
14. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 폴리히드록시부티레이트를 분해하는 능력이 없는, 미생물.
15. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 광영양성, 광합성성, 또는 메탄영양성(methanotrophic)이 아닌, 미생물.
16. 폴리히드록시부티레이트를 생성하는 방법으로서, 제1항의 미생물을 기체 기질 존재 하에서 배양하는 단계를 포함하되, 상기 미생물은 폴리히드록시부티레이트를 생성하는, 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 기체 기질은 CO, CO₂, 및 H₂의 하나 이상을 포함하는, 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 배양은 혐기 조건 하에서 실시되는, 방법.
19. 제16항에 있어서, 상기 배양은 탄수화물 기질의 부재 중에 실시되는, 방법.
20. 제16항에 있어서, 상기 배양은 광의 부재 중에 실시되는, 방법.

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