KR20240015166A - 에틸렌 글리콜의 생물학적 생성을 개선하기 위한 미생물 및 방법 - Google Patents

에틸렌 글리콜의 생물학적 생성을 개선하기 위한 미생물 및 방법 Download PDF

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마이클 코에프케
라스무스 오버가르드 옌센
알렉산더 폴 뮐러
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Abstract

본 개시는 에틸렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 전구체의 생물학적 생산을 개선하기 위한 유전자 조작된 미생물 및 방법을 제공한다. 본 개시의 미생물은 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트, 옥살로아세테이트, 구연산염, 말산염 및 글리신 중 하나 이상을 통해 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 전구체를 생성한다. 본 개시는 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜의 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 테레프탈레이트를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.

Description

에틸렌 글리콜의 생물학적 생성을 개선하기 위한 미생물 및 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2021년 8월 6일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/260,054호, 및 2021년 9월 14일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/261,185호의 이익을 주장하며, 이의 전문은 본원에 참조로서 포함된다.
기술분야
본 개시는 미생물 발효에 의한, 특히 기체(gaseous) 기질의 미생물 발효에 의한 에틸렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 전구체의 생성을 위한 유전자 조작된 미생물 및 방법에 관한 것이다.
모노에틸렌 글리콜(MEG)로도 알려진 에틸렌 글리콜은 미국에서 현재 330억 달러가 넘는 시장 가치를 가지고, 매우 다양한 산업적, 의료적 및 소비자 제품의 중요한 구성성분이다. 에틸렌 글리콜은 현재, 다량의 에너지 및 물을 필요로 하며 많은 바람직하지 못한 부산물을 발생시키고 석유화학 공급 원료에 의존하는 화학적 촉매작용 과정을 사용하여 생성된다. 지속 가능한 물질에 대한 요구는 일부 기술적 진보, 예컨대 사탕수수 유래의 에탄올로부터 에틸렌 글리콜의 촉매작용적 생성을 이끌었다.
에틸렌 글리콜 전구체는 또한, 상업적으로 가치가 있다. 예를 들어, 글리콜레이트는 피부 관리, 개인 생활(personal care), 염색, 태닝에서, 그리고 세정제로서 사용된다. 글리옥실레이트는 바닐린, 농약, 항생제, 알란토인 및 착화제(complexing agent)에 대한 중간체다.
그러나, 에틸렌 글리콜을 생물학적으로 생성할 수 있는 미생물은 알려져 있지 않고, 에틸렌 글리콜을 생성하기 위한 어떠한 완전한 생물학적 경로도 잘 확립되어 있지 않았다. 에틸렌 글리콜로의 일부 생물학적 경로는 문헌에서 당(sugar)으로부터 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Alkim 등의, Microb Cell Fact, 14: 127, 2015]는 대장균(E. coli)에서 (D)-자일로스로부터의 에틸렌 글리콜 생성을 실증하였으나, 높은 수율을 달성하기 위해서는 호기성 조건이 필요하였음을 주지하였다. 유사하게는, 문헌[Pereira 등의, Metab Eng, 34: 80-87, 2016]은 대장균에서 펜토스로부터의 에틸렌 글리콜 생성을 달성하였다. 펜토스로부터의 에틸렌 글리콜 생성에 대한 소수의 연구가 또한 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)에서 수행되긴 했지만, 일관되지 않은 결과를 보여주었다. 예를 들어, 문헌[Uranukul 등의, Metab Eng, 51: 20-31, 2018]을 참조한다. 　
가스 발효는 화학물질 및 연료로의 광범위한, 쉽게 입수 가능하며 저렴한 C1 공급 원료, 예컨대 산업적 폐가스(waste gas), 합성 가스(syngas) 또는 개질된(reformed) 메탄을 사용하는 경로를 제공한다. 가스 발효 대사가 당-발효 대사와 상당히 다르고, 상기 언급된 경로는 포도당신생합성(gluconeogenesis), 에너지 음성(negative) 과정을 통한 가스로부터 당 전구체의 생성을 필요로 하기 때문에 이들 경로의 사용은 실용적이지 않을 것이다. 현재까지, 기체 기질로부터 에틸렌 글리콜을 생성하기 위해 이용가능한 경로는 없다.
탐구적 활동에서, 문헌[Islam 등의, Metab Eng, 41: 173-181, 2017]은 화학정보학 툴(cheminformatics tool)을 사용하여 엠. 테르모아세티아(M. thermoacetia)에서 합성 가스로부터 에틸렌 글리콜을 생성하는 수백 개의 가상 경로를 예측하였다. 그러나, 많은 경로가 열역학적 또는 다른 제약으로 인해 실현 불가능하므로, 당업자라도 이들 경로를 가스 발효 유기체에 혼입하는 것은 가능하지 않다. 예를 들어, 거의 2,000 가지의 산소 또는 산소 라디칼-의존적 반응이 Islam 등에 포함되었으며, 이들은 엄격하게 혐기성인 시스템에서는 실현 가능하지 않을 것이다. 기지의(known) 반응을 갖는, Islam 등에 의해 유일하게 식별된 가상 경로는 포도당신생합성 또는 중간체로서 에탄올을 필요로 한다. 따라서, 기체 기질로부터 고수율의 에틸렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 전구체를 생성할 수 있는 유효하며(validated) 에너지적으로 선호할 만한 재조합형 생성 시스템에 대한 필요성이 남아 있다.
상기 배경기술에 대하여 본 개시는 선행 기술에 비해 특정 이점 및 진보를 제공한다.
본원에 개시된 본 개시가 구체적인 이점 또는 기능으로 제한되진 않지만, 본 개시는 기체 기질로부터 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 전구체를 생성할 수 있는 유전자 조작된 미생물을 제공한다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 미생물은 디올 탈수효소를 암호화하는 유전자에서 교란적 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 중간체를 통해 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜의 전구체를 생성한다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 상기 미생물은 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트, 옥살로아세테이트, 구연산염, 말산염 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중간체를 통해 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 전구체를 생성한다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 상기 미생물은 옥살로아세테이트를 구연산염으로 전환할 수 있는 이종 효소, 글리신을 글리옥실레이트로 전환할 수 있는 이종 효소, 이소-구연산염을 글리옥실레이트로 전환할 수 있는 이종 효소, 및 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환할 수 있는 이종 효소 중 하나 이상을 포함한다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 옥살로아세테이트를 구연산염으로 전환할 수 있는 이종 효소는 구연산염 [Si]-합성효소(synthase)[2.3.3.1], ATP 구연산염 합성효소[2.3.3.8]; 또는 구연산염(Re)-합성효소[2.3.3.3]이며; 글리신을 글리옥실레이트로 전환할 수 있는 이종 효소는 알라닌-글리옥실레이트 트랜스아미나제[2.6.1.44], 세린-글리옥실레이트 트랜스아미나제[2.6.1.45], 세린-피부르산염 트랜스아미나제[2.6.1.51], 글리신-옥살로아세테이트 트랜스아미나제[2.6.1.35], 글리신 트랜스아미나제[2.6.1.4], 글리신 탈수소효소[1.4.1.10], 알라닌 탈수소효소[1.4.1.1] 또는 글리신 탈수소효소[1.4.2.1]이며; 이소-구연산염을 글리옥실레이트로 전환할 수 있는 이종 효소는 이소구연산염 분해효소(lyase)[4.1.3.1]이고/이거나; 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환할 수 있는 이종 효소는 글리콜알데하이드 탈수소효소[1.2.1.21], 락트알데하이드 탈수소효소[1.2.1.22], 숙시네이트-세미알데하이드 탈수소효소[1.2.1.24], 2,5-디옥소발레레이트 탈수소효소[1.2.1.26], 알데하이드 탈수소효소[1.2.1.3/4/5], 베타인-알데하이드 탈수소효소[1.2.1.8] 또는 알데하이드 페레독신 옥시도리덕타제[1.2.7.5]이다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 이종 효소는 바실러스(Bacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 에스케리키아(Escherichia), 글루코노박터(Gluconobacter), 하이포미크로비움(Hyphomicrobium), 리시니바실러스(Lysinibacillus), 패니바실러스(Paenibacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 세디멘티콜라(Sedimenticola), 스포로사르치나(Sporosarcina), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 테르미티오바실러스(Thermithio), 테르모토가(Thermotoga) 및 제아(Zea)로 이루어진 군으로부터 선택된 속(genus)으로부터 유래된다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 하나 이상의 이종 효소는 미생물에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 미생물은 아세틸-CoA를 피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; 피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환할 수 있는 효소; 피부르산염을 말산염으로 전환할 수 있는 효소; 피부르산염을 포스페놀피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; 옥살로아세테이트를 시트릴-CoA로 전환할 수 있는 효소; 시트릴-CoA를 구연산염으로 전환할 수 있는 효소; 구연산염을 아코니테이트로 전환하고 아코니테이트를 이소-구연산염으로 전환할 수 있는 효소; 포스포에놀피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환할 수 있는 효소; 포스포에놀피부르산염을 2-포스포-D-글리세레이트로 전환할 수 있는 효소; 2-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포-D-글리세레이트로 전환할 수 있는 효소; 3-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포노옥시피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; 3-포스포노옥시피부르산염을 3-포스포-L-세린으로 전환할 수 있는 효소; 3-포스포-L-세린을 세린으로 전환할 수 있는 효소; 세린을 글리신으로 전환할 수 있는 효소; 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트를 글리신으로 전환할 수 있는 효소; 세린을 하이드록시피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; D-글리세레이트를 하이드록시피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; 말산염을 글리옥실레이트로 전환할 수 있는 효소; 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환할 수 있는 효소; 하이드록시피부르산염을 글리콜알데하이드로 전환할 수 있는 효소; 및/또는 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환할 수 있는 효소 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 미생물은 옥살로아세테이트를 구연산염으로 전환할 수 있는 이종 효소, 글리신을 글리옥실레이트로 전환할 수 있는 이종 효소, 및/또는 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환할 수 있는 이종 효소를 과발현한다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 미생물은 피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환할 수 있는 효소, 구연산염을 아코니테이트로 전환하고 아코니테이트를 이소-구연산염으로 전환할 수 있는 효소, 포스포에놀피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환할 수 있는 효소, 세린을 글리신으로 전환할 수 있는 효소, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트를 글리신으로 전환할 수 있는 효소, 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환할 수 있는 효소; 및/또는 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환할 수 있는 효소를 과발현한다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 미생물은 이소구연산염 탈수소효소, 글리세레이트 탈수소효소, 글리콜레이트 탈수소효소, 글리세레이트 탈수소효소, 글리콜레이트 탈수소효소, 알데하이드 페레독신 옥시도리덕타제 및 알데하이드 탈수소효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소에서 교란적 돌연변이(disruptive mutation)를 포함한다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 미생물은 아세토박테리움(Acetobacterium), 알칼리바쿨룸(Alkalibaculum), 블라우티아(Blautia), 부티리박테리움(Butyribacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 유박테리움(Eubacterium), 무렐라(Moorella), 옥소박터(Oxobacter), 스포로무사(Sporomusa) 및 테르모아내로박터(Thermoanaerobacter)로 이루어진 군으로부터 선택된 속의 구성원이다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 미생물은 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 박키이(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리디움 아우토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 코스카티이(Clostridium coskatii), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 마그눔(Clostridium magnum), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 쿠프리아비두스 네카토르 (Cupriavidus necator), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 무렐라 테르마우토트로피카(Moorella thermautotrophica), 무렐라 테르모아세티카(Moorella thermoacetica), 옥소박터 펜니기이(Oxobacter pfennigii), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스패로이데스(Sporomusa sphaeroides)및 테르모아내로박터 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)로 이루어진 군으로부터 선택된 부모 미생물로부터 유래된다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 및 클로스트리디움 라그스달레이로 이루어진 군으로부터 선택된 부모 미생물로부터 유래된다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 미생물은 고유한 우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 경로 또는 이종 우드-륭달 경로 또는 이종 우드-륭달 경로를 포함한다.
본원에 개시된 미생물의 일부 양태에서, 미생물은 글리옥실레이트 또는 글리콜레이트를 에틸렌 글리콜 전구체로서 생성한다.
본 개시는 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 전구체를 생성하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 미생물을 영양 배지에서 기질의 존재 하에 배양하고, 이에 의해 미생물이 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 전구체를 생성하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, 기질은 CO, CO2 및 H2 중 하나 이상을 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, 기질의 적어도 일부는 산업적 폐가스, 산업적 오프 가스, 또는 합성 가스이다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, 미생물은 글리옥실레이트 또는 글리콜레이트를 에틸렌 글리콜 전구체로서 생성한다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, 상기 방법은 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 전구체를 영양 배지로부터 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 양태에서, 미생물은 에탄올, 2,3-부탄디올 및 숙시네이트 중 하나 이상을 추가로 생성한다.
본 개시는 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 에틸렌 글리콜을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 부동제(antifreeze), 보존제, 탈수제 또는 드릴링액(drilling fluid)이다.
본 개시는 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 에틸렌 글리콜을 포함하는 중합체를 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 상기 중합체는 동종중합체 또는 공중합체이다. 일부 양태에서, 상기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)이다.
본 개시는 기체 기질로부터 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 생성물을 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 1) 모노에틸렌 글리콜, 테레프탈산(PTA), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 PET 성분을 형성하는 단계; 2) 적어도 하나의 PET 성분을 PET로 가공하는 단계; 3) PET를 중합하여 PET 수지를 형성하는 단계; 및 4) 상기 PET 수지를 PET 생성물로 가공하는 단계를 포함한다. 본 개시는 PTA가 화석 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 가스 발효로부터 직접 또는 간접적으로 유래될 수 있음을 제공한다. PET 생성물의 예는 US 2020/0048665A1에 개시된 것일 수 있으며, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
본 개시는 기체 기질로부터 PET 중합체를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 1) 테레프탈레이트 화합물을 포함하는 적어도 하나의 이산 화합물을 제공하는 단계; 2) 모노에틸렌 글리콜을 포함하는 적어도 하나의 디올 화합물을 제공하는 단계; 3) 이산 화합물과 디올 화합물의 혼합물을 공중합하여 이산 성분과 디올 성분을 포함하는 PET 중합체를 수득하는 단계를 포함한다.
본 개시는 본원에 기술된 중합체를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 섬유, 수지, 필름, 또는 플라스틱이다.
본 개시의 이들 및 다른 특징 및 장점은 첨부된 청구범위와 함께 하기의 상세한 설명으로부터 보다 완전히 이해될 것이다. 청구범위의 범위는 본 설명에 기술된 특징 및 장점에 대한 구체적인 논의에 의해서가 아니라 청구범위 내의 기재 내용에 의해 정의된다는 점에 유의한다.
본 개시의 도면의 하기의 상세한 설명은 하기의 도면과 함께 읽을 때 가장 잘 이해될 수 있으며, 도면에서 유사한 구조는 유사한 참조 숫자로 표시되고, 도면에서:
도 1은 CO, CO2 및/또는 H2를 포함하는 기체 기질로부터 에틸렌 글리콜, 글리콜레이트 및 글리옥실레이트의 생성을 위한 경로를 보여주는 반응식이다.
도 2a 내지 도 2e는 실시예 1 내지 4에서 사용되는 플라스미드의 지도(map)이다. 도 2a는 실시예 1에 기술된 바와 같은 발현 셔틀 벡터, pIPL12의 지도이다. 도 2b는 실시예 1에 기술된 바와 같은 비. 서브틸리스(B. subtilis) 구연산염 합성효소, 대장균 이소구연산염 분해효소 및 글로코노박터 옥시단스(G. oxydans) 글리콜알데하이드 탈수소효소를 포함하는 플라스미드 pMEG042의 지도이다. 도 2c는 실시예 2에 기술된 바와 같은 에스. 티오타우리니(S. thiotaurini) 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제 및 피. 플루오레센스(P. fluorescens) 알데하이드 탈수소효소를 포함하는 플라스미드 pMEG058의 지도이다. 도 2d는 실시예 3에 기술된 바와 같은 에스. 티오타우리니 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제 및 글로코노박터 옥시단스 알데하이드 탈수소효소를 포함하는 플라스미드 pMEG059의 지도이다. 도 2e는 실시예 4에 기술된 바와 같은 씨. 악시두리치(C. acidurici) 부류(class) V 아미노트랜스퍼라제 및 피. 플루오레센스 알데하이드 탈수소효소를 포함하는 플라스미드 pMEG061의 지도이다.
도 3a는 pMEG042(클론 1-3)를 발현하는 클로스트리듐 아우토에타노게눔 또는 클로스트리듐 아우토에타노게눔 야생형 (Neg Ctrl 1 또는 Neg Ctrl 2)의 바이오매스 수준(g 건조 세포 중량/L)을 보여준다. 도 3b는 독립영양적으로 성장하고 발현 벡터 pMEG042를 갖는 클로스트리듐 아우토에타노게눔에서 시간 경과에 따라 생성되는 에틸렌 글리콜을 야생형(Neg Ctrl 1 또는 Neg Ctrl 2)과 비교하여 보여준다. 도 3c는 독립영양적으로 성장하고 발현 벡터 pMEG042를 갖는 클로스트리듐 아우토에타노게눔에서 시간 경과에 따라 생성되는 글리콜레이트를 보여준다. 실시예 1을 참조한다.
도 4a는 pMEG058(클론 1-2)을 발현하는 클로스트리듐 아우토에타노게눔 또는 클로스트리듐 아우토에타노게눔 야생형(Neg Ctrl 1)의 바이오매스 수준(g 건조 세포 중량/L)을 보여준다. 도 4b는 독립영양적으로 성장하고 발현 벡터 pMEG058을 갖는 클로스트리듐 아우토에타노게눔에서 시간 경과에 따라 생성되는 에틸렌 글리콜을 야생형(Neg Ctrl 1)과 비교하여 보여준다. (실시예 2 참조)
도 5a는 pMEG059(클론 1-3)를 발현하는 클로스트리듐 아우토에타노게눔 또는 클로스트리듐 아우토에타노게눔 야생형 (Neg Ctrl)의 바이오매스 수준(g 건조 세포 중량/L)을 보여준다. 도 5b는 독립영양적으로 성장하고 발현 벡터 pMEG059를 갖는 클로스트리듐 아우토에타노게눔에서 시간 경과에 따라 생성되는 에틸렌 글리콜을 야생형 (Neg Ctrl)와 비교하여 보여준다. (실시예 3 참조)
도 6a는 pMEG061(클론 1)을 발현하는 클로스트리듐 아우토에타노게눔 또는 클로스트리듐 아우토에타노게눔 야생형 (Neg Ctrl)의 바이오매스 수준(g 건조 세포 중량/L)을 보여준다. 도 6b는 독립영양적으로 성장하고 발현 벡터 pMEG061을 갖는 클로스트리듐 아우토에타노게눔에서 시간 경과에 따라 생성되는 에틸렌 글리콜을 야생형 (Neg Ctrl)와 비교하여 보여준다. (실시예 4 참조)
도 7 은 클로스트리듐 아우토에타노게눔의 2개의 상이한 유전자형의 바이오매스 수준(g 건조 세포 중량/L)을 보여준다 (하나는 식별된 천연 디올 탈수소효소(염기)를 함유하는 유전자형이고, 다른 하나는 디올 탈수소효소 유전자가 결실된(KO) 유전자형임). 각각의 균주는 2개의 변이체, 즉 pMEG042 발현 벡터를 갖는 변이체, 및 벡터를 갖지 않는 변이체(음성 대조군)를 갖는다. 나타낸 값은 3의 기술적 재현의 평균으로부터 계산된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 8a는 클로스트리듐 아우토에타노게눔의 2개의 상이한 유전자형에서 시간 경과에 따라 생성된 MEG(mg/L)를 보여준다 (하나는 식별된 천연 디올 탈수소효소(염기)를 함유하는 유전자형이고, 다른 하나는 디올 탈수소효소 유전자가 결실된(KO) 유전자형임). 각각의 균주는 2개의 변이체, 즉 pMEG042 발현 벡터를 운반하는 변이체, 및 벡터를 운반하지 않는 변이체(음성 대조군)를 갖는다. 나타낸 값은 3회의 기술적 재현의 평균으로부터 계산된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도 8b는 클로스트리듐 아우토에타노게눔의 상이한 유전자형에서 시간 경과에 따라 생성된 MEG(mg/g 건조 세포 중량)를 보여준다 (하나는 식별된 고유 디올 탈수소효소(염기)를 함유하는 유전자형이고, 다른 하나는 디올 탈수소효소 유전자가 결실된(KO) 유전자형임). 각각의 균주는 2개의 변이체, 즉 pMEG042 발현 벡터를 갖는 변이체, 및 벡터를 갖지 않는 변이체(음성 대조군)를 갖는다. 나타낸 값은 3회의 기술적 재현의 평균으로부터 계산된다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
아래 구현예의 설명은 일반적인 용어로 제공된다. 본 개시는, 본 개시를 뒷받침하는 실험 데이터, 본 개시의 다양한 양태의 구체적인 예, 및 본 개시를 수행하는 수단을 제공하는, 아래의 "실시예"라는 제목 하에 주어진 개시로부터 추가로 설명된다.
본 발명자들은 놀랍게도, 디올 탈수효소를 암호화하는 유전자에서 교란적 돌연변이를 포함하고 CO 및/또는 CO2를 포함하는 기질을 발효시킴으로써, 일산화탄소 영양 아세트산 생성 미생물이 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜의 전구체를 생성하도록 이를 조작할 수 있었다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 전반에 걸쳐 사용되는 다음의 용어는 아래와 같이 정의된다:
본 개시는 에틸렌 글리콜의 생물학적 생성을 위한 미생물을 제공한다. "미생물"은 현미경적 유기체, 특히, 박테리아, 고세균, 바이러스 또는 진균류이다. 바람직한 구현예에서, 본 개시의 미생물은 박테리아이다.
용어 "비-천연 발생"은 미생물에 관하여 사용되는 경우, 미생물이 기준 종의 야생형 균주를 포함한 기준 종의 천연 발생 균주에서 발견되지 않는 적어도 하나의 유전적 변형을 가짐을 의미한다. 비-천연 발생 미생물은 전형적으로 실험실 또는 연구 시설에서 개발된다. 본 개시의 미생물은 비-천연 발생 미생물이다.
용어 "유전적 변형," "유전적 변경," 또는 "유전적 조작"은 광범위하게는 인간에 의한 미생물의 게놈 또는 핵산의 조작을 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "유전적으로 변형된," "유전적으로 변경된," 또는 "유전자 조작된"은 이러한 유전적 변형, 유전적 변경 또는 유전적 조작을 함유하는 미생물을 지칭한다. 이들 용어는 실험실-발생된 미생물을 천연-발생 미생물로부터 구별하는 데 사용될 수 있다. 유전적 변형의 방법은 예를 들어 이종 유전자 발현, 유전자 또는 프로모터 삽입 또는 결실, 핵산 돌연변이, 변경된 유전자 발현 또는 불활성화, 효소 조작, 지향 진화(directed evolution), 지식-기초 설계, 무작위 돌연변이발생 방법, 유전자 셔플링, 및 코돈 최적화를 포함한다. 본 개시의 미생물은 유전자 조작된다.
"재조합"은 핵산, 단백질 또는 미생물이 유전적 변형, 조작 또는 재조합의 생성물임을 나타낸다. 일반적으로, 용어 "재조합"은 다수의 공급원, 예컨대 둘 이상의 상이한 균주 또는 종의 미생물로부터 유래되는 유전적 물질을 함유하거나 이에 의해 암호화되는 핵산, 단백질 또는 미생물을 지칭한다. 본 개시의 미생물은 일반적으로, 재조합형이다.
"야생형"은 이것이 자연에서 발생하며 돌연변이체 또는 변이체 형태로부터 구분되는 바와 같이 유기체, 균주, 유전자 또는 특징의 전형적인 형태를 지칭한다.
"내인성"은 본 개시의 미생물이 유래되는 야생형 또는 부모 미생물에 존재하거나 발현되는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 내인성 유전자는 본 개시의 미생물이 유래되는 야생형 또는 부모 미생물에 천연적으로 존재하는 유전자이다. 일 구현예에서, 내인성 유전자의 발현은 외인성 조절 요소, 예컨대 외인성 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
"외인성"은 본 개시의 미생물의 외부에서 기원하는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 외인성 유전자 또는 효소는 인공적으로 또는 재조합적으로 생성되고 본 개시의 미생물에 도입되거나 발현될 수 있다. 외인성 유전자 또는 효소는 또한 이종 미생물로부터 단리되고 본 개시의 미생물에 도입되거나 발현될 수 있다. 외인성 핵산은 본 개시의 미생물의 게놈 내로 통합되거나 본 개시의 미생물에서 염색체-외 상태, 예를 들어 플라스미드에 잔류하도록 구성될 수 있다.
"이종"은 본 개시의 미생물이 유래하는 야생형 또는 부모 미생물 내에 존재하지 않는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 이종 유전자 또는 효소는 상이한 균주 또는 종으로부터 유래되고 본 개시의 미생물 내에 도입 또는 발현될 수 있다. 이종 유전자 또는 효소는 이것이 상이한 균주 또는 종에서 발생하는 형태로 본 개시의 미생물 내에 도입 또는 발현될 수 있다. 대안적으로, 이종 유전자 또는 효소는 일부 방식으로 예를 들어 본 개시의 미생물에서의 발현을 위해 이를 코돈-최적화함으로써 또는 기능을 변경시키기 위해, 예컨대 효소 활성의 방향을 역전시키거나 기질 특이성을 변경시키기 위해 이를 조작함으로써 변형될 수 있다.
특히, 본원에 기술된 미생물에서 발현되는 이종 핵산 또는 단백질은 바실러스, 클로스트리디움, 쿠프리아비두스, 에스케리키아, 글루코노박터, 하이포미크로비움, 리시니바실러스, 패니바실러스, 슈도모나스, 세디멘티콜라, 스포로사르치나, 스트렙토마이세스, 테르미티오바실러스, 테르모토가, 제아, 클레브시엘라(Klebsiella), 미코박테리움(Mycobacterium), 살모넬라(Salmonella), 미코박테로이데스(Mycobacteroides), 스타필로콕커스(Staphylococcus), 부르콜데리아(Burkholderia), 리스테리아(Listeria), 악시네토박터(Acinetobacter), 시겔라(Shigella), 네이쎄리아(Neisseria), 보르데텔라(Bordetella), 스트렙토콕커스(Streptococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 비브리오(Vibrio), 레지오넬라(Legionella), 잔토모나스(Xanthomonas), 세라티아(Serratia), 크로노박터(Cronobacter), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 헬리코박터(Helicobacter), 예르시니아(Yersinia), 쿠티박테리움(Cutibacterium), 프란치셀라(Francisella), 펙토박테리움(Pectobacterium), 아르코박터(Arcobacter), 락토바실러스, 쉐와넬라(Shewanella), 에르위니아(Erwinia), 술푸로스피릴룸(Sulfurospirillum), 펩토콕카세애(Peptococcaceae), 테르모콕커스(Thermococcus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피로콕커스(Pyrococcus), 글리신, 호모(Homo), 랄스토니아(Ralstonia), 브레비박테리움(Brevibacterium), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 제오바실러스(Geobacillus), 보스(bos), 갈루스(gallus), 아내로콕커스(Anaerococcus), 제노푸스(Xenopus), 암블리린쿠스(Amblyrhynchus), 라투스(rattus), 무스(mus), 수스(sus), 로도콕커스(Rhodococcus), 리조비움(Rhizobium), 메가스패라(Megasphaera), 메조리조비움(Mesorhizobium), 펩토콕커스(Peptococcus), 아그로박테리움(Agrobacterium), 캄필로박터(Campylobacter), 아세토박테리움, 알칼리바쿨룸, 블라우티아, 부티리박테리움, 유박테리움, 무렐라, 옥소박터, 스포로무사, 테르모아내로박터, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 패니바실러스, 픽티바실러스(Fictibacillus), 리시니바실러스, 오르니티니바실러스(Ornithinibacillus), 할로바실러스(Halobacillus), 쿠르티아(Kurthia), 렌티바실러스(Lentibacillus), 아녹시바실러스(Anoxybacillus), 솔리바실러스(Solibacillus), 비르기바실러스(Virgibacillus), 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus), 스포로사르치나,살리미크로비움(Salimicrobium), 스포로사르치나, 플란코콕커스(Planococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 테르매로박터(Thermaerobacter), 설포바실러스(Sulfobacillus) 또는 심비오박테리움(Symbiobacterium)으로부터 유래될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드," "뉴클레오티드," "뉴클레오티드 서열," "핵산," 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 이들은 임의의 길이의 뉴클레오티드(데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드)의 중합체성 형태, 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지되거나 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 암호화 또는 비-암호화 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자위(유전자위들), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 주어질 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 간섭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예컨대 mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 전사되는 과정, 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 암호화된 폴리펩티드는 통틀어 "유전자 생성물"로 지칭될 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드," 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되어, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 중합체는 비-아미노산에 의해 간섭될 수 있다. 상기 용어는 또한 하기에 의해 변형되었던 아미노산을 포괄한다: 예를 들어, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작, 예컨대 표지화 성분과의 컨쥬게이션. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘 모두를 포함한 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 펩티도모방체를 포함한다.
"효소 활성", 또는 간단히 "활성"은 광범위하게는 비제한적으로 반응을 촉매하기 위한 효소의 활성, 효소의 양 또는 효소의 유용성을 포함한 효소적 활성을 지칭한다. 이에, 효소 활성을 "증가시키는" 것은 반응을 촉매화하기 위해 효소의 활성을 증가시키거나, 효소의 양을 증가시키거나, 효소의 유용성을 증가시키는 것을 포함한다. 유사하게는, 효소 활성을 "저하시키는" 것은 반응을 촉매화하기 위해 효소의 활성을 저하시키거나, 효소의 양을 저하시키거나, 효소의 유용성을 저하시키는 것을 포함한다.
"돌연변이화된"은, 본 개시의 미생물이 유래되는 야생형 또는 부모 미생물과 비교하여 본 개시의 미생물에서의 변형된 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 일 구현예에서, 돌연변이는 효소를 암호화하는 유전자에서의 결실, 삽입 또는 치환일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이는 효소에서의 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환일 수 있다.
"교란된 유전자"는 유전자의 발현, 유전자의 조절 활성, 또는 암호화된 단백질 또는 효소의 활성을 감소시키거나 삭제하기 위해 일부 방식으로 변형되었던 유전자를 지칭한다. 교란은 유전자 또는 효소를 부분적으로 불활성화시키거나, 완전히 불활성화시키거나 결실시킬 수 있다. 교란은 유전자, 단백질 또는 효소의 발현 또는 활성을 완전히 삭제하는 녹아웃(KO; knockout) 돌연변이일 수 있다. 교란은 또한, 단백질 또는 효소의 발현 또는 활성을 감소시키지만 전적으로 삭제하지는 않는 녹다운(knock-down) 돌연변이일 수 있다. 교란은 또한, 효소에 의해 생성되는 생성물의 생합성을 감소시키거나, 예방하거나 차단하는 임의의 것일 수 있다. 교란은 예를 들어, 단백질 또는 효소를 암호화하는 유전자에서의 돌연변이, 효소를 암호화하는 유전자의 발현에 관여하는 유전적 조절 요소에서의 돌연변이, 효소의 활성을 감소시키거나 저해하는 단백질을 생성하는 핵산의 도입, 또는 단백질 또는 효소의 발현을 저해하는 핵산(예를 들어, 안티센스 RNA, RNAi, TALEN, siRNA, CRISPR, 또는 CRISPRi) 또는 단백질의 도입을 포함할 수 있다. 교란은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 도입될 수 있다. 본 개시의 목적을 위해, 교란은 천연 발생이 아니며, 실험실-발생일 수 있다.
"부모 미생물"은 본 개시내용의 미생물을 생성하는데 사용되는 미생물이다. 부모 미생물은 자연 발생 미생물(즉, 야생형 미생물) 또는 사전에 변형되었던 미생물(즉, 돌연변이 또는 재조합 미생물)일 수 있다. 본 개시의 미생물은 부모 미생물에서 발현되지 않거나 과발현되지 않은 하나 이상의 효소를 발현하거나 과발현하도록 변형될 수 있다. 유사하게, 본 개시의 미생물은 부모 미생물이 함유하지 않은 하나 이상의 유전자를 함유하도록 변형될 수 있다. 본 개시의 미생물은 또한 부모 미생물에서 발현된 하나 이상의 효소를 발현하지 않거나 더 적은 양으로 발현하도록 변형될 수 있다.
본 개시의 미생물은 본질적으로 임의의 부모 미생물로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 본 개시의 미생물은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 베이예린키이(Clostridium beijerinckii), 에스케리키아 콜라이 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군으로부터 선택된 부모 미생물로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서는, 미생물은 아세토박테리움 우디이,알칼리바쿨룸 박키이, 블라우티아 프로덕타, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 클로스트리디움 아세티쿰, 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 카르복시디보란스, 클로스트리디움 코스카티이, 클로스트리디움 드라케이, 클로스트리디움 포르미코아세티쿰, 클로스트리디움 륭달리이, 클로스트리디움 마그눔, 클로스트리디움 라그스달레이, 클로스트리디움 스카톨로게네스, 유박테리움 리모숨, 무렐라 테르마우토트로피카, 무렐라 테르모아세티카, 옥소박터 펜니기이, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스파에로이데스, 및 써모아나에로박터 키부이로 이루어진 군으로부터 선택된 부모 미생물로부터 유래된다. 바람직한 구현예에서, 부모 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 또는 클로스트리디움 라그스달레이이다. 특히 바람직한 구현예에서, 미생물은 클로스트리듐 아우토에타노게눔 LZ1561이고, 이것은 부다페스트 조약의 조건에 따라 2010년 6월 7일에 독일 브라운슈바이크 D-38124 인호펜슈트라쎄 7B에 소재하는 독일생물자원센터(DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 2010년 6월 7일에 기탁되고 수탁 번호 DSM23693가 부여되었다. 이 균주는 국제공개 WO 2012/015317호로 공개된 국제출원 PCT/NZ2011/000144호에 기술되어 있다.
용어 "~로부터 유래된"은 핵산, 단백질, 또는 미생물이 상이한(예를 들어, 모 또는 야생형) 핵산, 단백질 또는 미생물로부터 변형되거나 또는 적응되어 새로운 핵산, 단백질, 또는 미생물을 생성하는 것을 나타낸다. 이러한 변형 또는 적응은 전형적으로는 핵산 또는 유전자의 삽입, 결실, 돌연변이 또는 치환을 포함한다. 대체로, 본 개시의 미생물은 부모 미생물로부터 유래된다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이, 또는 클로스트리디움 라그스달레이로부터 유래된다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 DSMZ 수탁 번호 DSM23693으로 기탁된 클로스트리디움 아우토에타노게눔 LZ1561로부터 유래된다.
본 개시의 미생물은 기능적 특징에 기초하여 추가로 분류될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 미생물은 C1-고정 미생물, 혐기성 생물, 아세토겐, 에탄올로겐, 일산화탄소 영양 생물 및/또는 메탄영양체일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다.
표 1은 미생물의 대표적인 목록을 제공하고, 이들의 기능적인 특징을 식별한다.
1 아세토박테리움 우디이는 기체로부터가 아니라 프룩토오스로부터 에탄올을 생성할 수 있음.
2 클로스트리디움 마그눔이 CO 상에서 성장할 수 있는지 여부는 연구되지 않음.
3 Moorella thermoacetica, Moorella sp.의 1가지 균주 HUC22-1은 가스로부터 에탄올을 생성하는 것으로 보고되었다.
4 스포로무사 오바타가 CO 상에서 성장할 수 있는지는 조사되지 않음.
5 스포로무사 실바세티카가 CO 상에서 성장할 수 있는지는 조사되지 않음.
6 스포로무사 스파에로이데스가 CO 상에서 성장할 수 있는지는 조사되지 않음.
"우드-륭달"은 예를 들어 문헌[Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008]에 기술된 바와 같은 탄소 고정의 우드-륭달 경로를 지칭한다. 　 "우드-륭달 미생물"은 예상대로 우드-륭달 경로를 함유하는 미생물을 지칭한다. 종종, 본 개시내용의 미생물은 본연의 우드-륭달 경로를 함유한다. 본원에서, 우드-륭달 경로는 천연의, 비변형된 우드-륭달 경로일 수 있거나, 우드-륭달 경로는 이 경로가 CO, CO2, 및/또는 H2를 아세틸-CoA로 전환하는 작용을 여전히 하는 한 어느 정도의 유전적 변형(예를 들어, 과발현, 이종 발현, 녹아웃 등)을 갖는 우드-륭달 경로일 수 있다.
"C1"은 1-탄소 분자, 예를 들어, CO, CO2, CH4 또는 CH3OH를 지칭한다. "C1-옥시게네이트"는 적어도 하나의 산소 원자를 또한 포함하는 1-탄소 분자, 예를 들어, CO, CO2 또는 CH3OH를 지칭한다. "C1-탄소 공급원"은 본 개시내용의 미생물에 대한 부분 또는 단독 탄소 공급원으로서 작용하는 1개의 탄소-분자를 지칭한다. 예를 들어, C1-탄소 공급원은 CO, CO2, CH4, CH3OH, 또는 CH2O2 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, C1-탄소 공급원은 CO 및 CO2 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. "C1-고정 미생물"은 C1-탄소 공급원으로부터 하나 이상의 생성물을 생성하는 능력을 갖는 미생물이다. 종종, 본 개시내용의 미생물은 C1-고정 박테리아이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 C1-고정 미생물로부터 유래된다.
"혐기성 생물"은 성장을 위해 산소를 필요로 하지 않는 미생물이다. 혐기성 생물은 산소가 특정 임계치를 초과하여 존재하는 경우 부정적으로 반응하거나 심지어 사멸할 수도 있다. 그러나, 일부 혐기성 생물은 이따금 "미소산소(microoxic) 조건"으로 지칭되는 저수준의 산소(예를 들어 0.000001 내지 5% 산소)를 관용할 수 있다. 종종, 본 개시내용의 미생물은 혐기성 생물이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 혐기성 생물로부터 유래된다.
"아세토겐"은 에너지 보존, 및 아세틸-CoA 및 아세틸-CoA 유래 생성물, 예를 들어 아세테이트의 합성을 위한 이의 주요 기전으로서 우드-륭달 경로를 사용하는 절대적 혐기성 박테리아이다(문헌[Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008]). 특히, 아세토겐은 (1) CO2로부터 아세틸-CoA의 환원적 합성을 위한 메커니즘, (2) 말단 전자-수용, 에너지 보존 과정, (3) 세포 탄소의 합성에서 CO2의 고정(동화)을 위한 메커니즘으로서 우드-륭달 경로를 사용한다(문헌[Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 제3판, p. 354, New York, NY, 2006]). 모든 자연 발생 아세토겐은 C1-고정, 혐기성, 독립 영양 생물, 및 비-메탄 영양 생물이다. 종종, 본 개시의 미생물은 아세토겐이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 아세토겐으로부터 유래된다.
"에탄올로겐"은 에탄올을 생성하거나 생성할 수 있는 미생물이다. 종종, 본 개시의 미생물은 에탄올로겐이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 에탄올로겐으로부터 유래된다.
"독립 영양 생물"은 유기 탄소의 부재 하에 성장할 수 있는 미생물이다. 대신에, 독립 영양 생물은 무기 탄소 공급원, 예를 들어 CO 및/또는 CO2를 사용한다. 종종, 본 개시의 미생물은 독립 영양 생물이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 자가영양 생물로부터 유래된다.
"일산화탄소 영양 생물"은 탄소 및 에너지의 단독 공급원으로서 CO를 이용할 수 있는 미생물이다. 종종, 본 개시의 미생물은 일산화탄소 영양 생물이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 일산화탄소 영양 생물로부터 유래된다.
"메탄 영양 생물"은 탄소 및 에너지의 유일한 공급원으로서 메탄을 이용할 수 있는 미생물이다. 특정 구현예에서, 본 개시의 미생물은 메탄 영양 생물이거나 메탄 영양 생물로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 본 개시의 미생물은 메탄 영양 생물이 아니거나 메탄 영양 생물로부터 유래되지 않는다.
바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 및 클로스트리디움 라그스달레이 종을 포함하는 클로스트리디아의 클러스터로부터 유래된다. 이들 종을 먼저 보고하고, Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994 (Clostridium autoethanogenum ), Tanner, Int J System Bacteriol , 43: 232-236, 1993 (Clostridium ljungdahlii ), 및 Huhnke, WO 2008/028055 (Clostridium ragsdalei ).
이들 3개 종은 많은 유사성을 갖는다. 특히, 이들 종은 모두 클로스트리디움 속의 C1 고정, 혐기성, 아세토겐성, 에탄올로겐성, 및 일산화탄소영양성 구성원이다. 이들 종은 유사한 유전자형 및 표현형, 및 에너지 보존 및 발효 대사 방식을 갖는다. 더욱이, 이들 종은, 99% 초과로 동일한 16S rRNA DNA를 갖는 클로스트리디움 rRNA 상동 그룹 I 내에 군집지어지며, 약 22 내지 30 몰%의 DNA G + C 함량을 가지며, 그람 양성이며, 유사한 형태 및 크기를 갖고 (0.5 내지 0.7 x 3 내지 5 μm 사이의 대수 성장 세포), 중온성이며 (30 내지 37℃에서 최적 성장), 약 4 내지 7.5의 유사한 pH 범위를 가지고 (최적 pH 약 5.5 내지 6를 가짐), 시토크롬이 없고, Rnf 복합체를 통해 에너지를 보존한다. 또한, 카르복실산으로부터 이들의 상응하는 알코올로의 환원이 이들 종에서 나타났다(문헌[Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012]). 중요하게는, 이들 종은 또한 모두 특정 조건 하에 CO-함유 가스 상에서 강한 독립영양 성장을 보여주며, 에탄올 및 아세테이트(또는 아세트산)를 주 발효 생성물로서 생성하고, 소량의 2,3-부탄디올 및 락트산을 생성한다.
그러나, 이들 3개 종은 또한 많은 차이를 갖는다. 이들 종은 다음의 상이한 공급원으로부터 단리되었다: 토끼 소화관으로부터의 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 양계장 폐기물로부터 클로스트리디움 륭달리이, 및 담수 침강물로부터의 클로스트리디움 라그스달레이. 이들 종은 다양한 당(예를 들어, 람노스, 아라비노스), 산(예를 들어, 글루코네이트, 구연산염), 아미노산(예를 들어, 아르기닌, 히스티딘), 및 다른 기질(예를 들어, 베타인, 부탄올)의 사용 면에서 상이하다. 더욱이, 이들 종은 특정 비타민(예를 들어, 티아민, 비오틴)에 대한 영양요구성 면에서 상이하다. 이들 종은 우드-륭달 경로 유전자 및 단백질의 핵산 및 아미노산 서열에서 차이를 갖지만, 이들 유전자 및 단백질의 일반적인 구성 및 수는 모든 종들에서 동일한 것으로 밝혀졌다(문헌[Kφpke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011]).
따라서, 요약하자면, 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 또는 클로스트리디움 라그스달레이의 특징들 중 많은 것들은 해당 종에 특이적이지 않으며, 그보다는 클로스트리디움 속의 C1 고정, 혐기성, 아세토겐성, 에탄올로겐성, 및 일산화탄소영양성 구성원의 이 클러스터에 대한 일반적인 특징이다. 그러나, 이들 종은 실제로 구별되기 때문에, 이들 종 중 하나의 유전자 변형 또는 조작은 이들 종 중 다른 것에서 동일한 효과를 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 성장, 성능 또는 생성물 생성에서의 차이가 관찰될 수 있다.
본 개시내용의 미생물은 또한, 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 또는 클로스트리디움 라그스달레이의 단리물 또는 돌연변이체로부터 유래될 수 있다. 클로스티리디움 아우토에타노게눔의 분리주 및 돌연변이는 JA1-1(DSM10061) (문헌[Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994]), LBS1560(DSM19630)(WO 2009/064200), 및 LZ1561(DSM23693)(WO 2012/015317)을 포함한다. 클로스트리디움 륭달리이의 단리물 및 돌연변이체는 ATCC 49587(문헌[Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993]), PETCT(DSM13528, ATCC 55383), ERI-2(ATCC 55380)(미국 특허 US 5,593,886호), C-01(ATCC 55988)(미국 특허 US 6,368,819호), O-52(ATCC 55989)(미국 특허 US 6,368,819호), 및 OTA-1(문헌[Tirado-Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010])을 포함한다. 클로스트리디움 라그스달레이의 단리물 및 돌연변이체는 PI 1(ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826)(국제공개 WO 2008/028055)을 포함한다.
그러나, 상기에 기술된 바와 같이, 본 개시의 미생물은 또한, 본질적으로 임의의 부모 미생물, 예컨대 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 클로스트리디움 베이예린키이, 에스케리키아 콜라이 및 사카로마이세스 세레비지애로 이루어진 군으로부터 선택된 부모 미생물로부터 유래될 수 있다.
본 개시는 본 개시의 미생물을 기질의 존재 하에 배양하여 상기 미생물이 에틸렌 글리콜을 생성하는 단계를 포함하는 에틸렌 글리콜, 글리옥실레이트, 및 글리콜레이트를 생성하는 방법뿐만 아니라 에틸렌 글리콜, 글리옥실레이트, 및 글리콜레이트를 생성할 수 있는 미생물을 제공한다.
본 개시의 미생물은 아세틸-CoA, 예컨대 우드-륭달 경로에 의해 생성되는 아세틸-CoA를 피부르산염으로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 1). 이러한 효소는 피부르산염 합성효소(PFOR)[1.2.7.1] 또는 ATP:피부르산염, 오르토포스페이트 포스포트랜스퍼라제[1.2.7.1]일 수 있다. 일부 구현예에서, 아세틸-CoA를 피부르산염으로 전환하는 효소는 내인성 효소이다.
본 개시의 미생물은 피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 2). 이 효소는 피부르산염:이산화탄소 리가제(ligase)[ADP-형성][6.4.1.1]일 수 있다. 일부 구현예에서, 피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환하는 효소는 내인성 효소이다. 일부 구현예에서, 피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환하는 효소는 과발현된다.
본 개시의 미생물은 옥살로아세테이트를 시트릴-CoA로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 3). 이 효소는 시트릴-CoA 분해효소[4.1.3.34]일 수 있다. 일부 구현예에서, 옥살로아세테이트를 시트릴-CoA로 전환하는 효소는 내인성 효소이다.
본 개시의 미생물은 시트릴-CoA를 구연산염으로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 4). 이 효소는 구연산염-CoA 트랜스퍼라제[2.8.3.10]일 수 있다. 일부 구현예에서, 시트릴-CoA를 구연산염으로 전환하는 효소는 내인성 효소이다.
본 개시의 미생물은 옥살로아세테이트를 구연산염으로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 5). 이 효소는 구연산염 [Si]-합성효소[2.3.3.1], ATP 구연산염 합성효소[2.3.3.8], 또는 구연산염(Re)-합성효소[2.3.3.3]일 수 있다. 일부 구현예에서, 옥살로아세테이트를 구연산염으로 전환하는 효소는 내인성 효소이다. 다른 구현예에서, 옥살로아세테이트를 구연산염으로 전환하는 효소는 이종 효소이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 2로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 1로 제시된 뉴클레오티 서열을 포함하도록, 고초균유래의 구연산염 합성효소 1[EC 2.3.3.16]을 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 4로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 3으로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 씨. 클루이베리(C. kluyveri) 유래의 구연산염(Re)-합성효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 6으로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 5로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 클로스트리디움 종 유래의 구연산염(Si)-합성효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 8로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 7로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 고초균 유래의 구연산염 합성효소 2를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 옥살로아세테이트를 구연산염으로 전환하는 효소는 과발현된다.
본 개시의 미생물은 구연산염을 아코니테이트로 전환하고 아코니테이트를 이소-구연산염으로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 6). 이 효소는 아코니테이트 하이드라타제[4.2.1.3]일 수 있다. 일부 구현예에서, 구연산염을 아코니테이트로 전환하고 아코니테이트를 이소-구연산염으로 전환하는 효소는 내인성 효소이다. 일부 구현예에서, 구연산염을 아코니테이트로 전환하고 아코니테이트를 이소-구연산염으로 전환하는 효소는 과발현된다.
본 개시의 미생물은 이소구연산염을 글리옥실레이트로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 7). 이 효소는 이소구연산염 분해효소[4.1.3.1]일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 10으로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 9로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 옥수수(Z. mays) 유래의 이소구연산염 분해효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 12로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 11로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 대장균 유래의 이소구연산염 분해효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서
본 개시의 미생물은 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 8). 이 효소는 글리세레이트 탈수소효소[1.1.1.29], 글리옥실레이트 리덕타제[1.1.1.26/79], 또는 글리콜레이트 탈수소효소[1.1.99.14]일 수 있다. 일부 구현예에서, 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환하는 효소는 내인성 효소이다. 일부 구현예에서, 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환하는 효소는 과발현된다.
본 개시의 미생물은 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 9). 이 효소는 글리콜알데하이드 탈수소효소[1.2.1.21], 락트알데하이드 탈수소효소[1.2.1.22], 숙시네이트-세미알데하이드 탈수소효소[1.2.1.24], 2,5-디옥소발레레이트 탈수소효소[1.2.1.26], 알데하이드 탈수소효소[1.2.1.3/4/5], 베타인-알데하이드 탈수소효소[1.2.1.8], 또는 알데하이드 페레독신 옥시도리덕타제[1.2.7.5]일 수 있다. 일부 구현예에서, 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소는 내인성 효소이다. 다른 구현예에서, 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소는 이종 효소이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 50으로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 49로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 대장균 유래의 감마-아미노부티르알데하이드 탈수소효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 52로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 51로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 대장균 유래의 알데하이드 탈수소효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 54로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 53으로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 대장균 유래의 NADP-의존적 숙시네이트-세미알데하이드 탈수소효소 I을 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 56으로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 55로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 글로코노박터 옥시단스 유래의 락트알데하이드 탈수소효소/글리콜알데하이드 탈수소효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 58 또는 서열번호 60으로 제시된 아미노산 서열을 각각 암호화하는 서열번호 57 또는 서열번호 59로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 슈도모나스 플루오레센스 유래의 알데하이드 탈수소효소 A를 포함한다. 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소의 부가적인 비제한적인 예는 GenBank 수탁 번호 WP_003202098, WP_003182567, ACT39044, ACT39074, WP_041112005, 및 ACT40170에서 찾을 수 있다. 일부 구현예에서, 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소는 과발현된다.
본 개시의 미생물은 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 10). 이 효소는 락트알데하이드 리덕타제[1.1.1.77], 알코올 탈수소효소[1.1.1.1], 알코올 탈수소효소(NADP+)[1.1.1.2], 글리세롤 탈수소효소[1.1.1.72], 글리세롤-3-포스페이트 탈수소효소[1.1.1.8], 또는 알데하이드 리덕타제[1.1.1.21]일 수 있다. 일부 구현예에서, 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환하는 효소는 내인성 효소이다. 일부 구현예에서, 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환하는 내인성 효소는 과발현된다. 다른 구현예에서, 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환하는 효소는 이종 효소이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 62로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 61로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 클로스트리듐 사카로페르부틸아세토니쿰(C. saccharoperbutylacetonicum) 유래의 락트알데하이드 환원효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 64로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 63으로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 클로스트디듐 륭달리이 유래의 락트알데하이드 환원효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 66으로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 65로 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록, 대장균 유래의 락트알데하이드 환원효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 68로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 67로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 클로스트리듐 베이예린키이 유래의 락트알데하이드 환원효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 이종 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환하는 효소는 과발현된다.
본 개시의 미생물은 피부르산염을 말산염으로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 11). 이 효소는 말산염 탈수소효소[1.1.1.37], 말산염 탈수소효소(옥살로아세테이트-탈카르복실화)[1.1.1.38], 말산염 탈수소효소(탈카르복실화)[1.1.1.39], 말산염 탈수소효소(옥살로아세테이트-탈카르복실화)(NADP+)[1.1.1.40], 말산염 탈수소효소(NADP+)[1.1.1.82], D-말산염 탈수소효소(탈카르복실화)[1.1.1.83], 디메틸말산염 탈수소효소[1.1.1.84], 3-이소프로필말산염 탈수소효소[1.1.1.85], 말산염 탈수소효소[NAD(P)+][1.1.1.299], 또는 말산염 탈수소효소(퀴논)[1.1.5.4]일 수 있다. 일부 구현예에서, 피부르산염을 말산염으로 전환하는 효소는 내인성 효소이다. 다른 구현예에서, 피부르산염을 말산염으로 전환하는 효소는 이종 효소이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 24로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 23으로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 클로스트리듐 아우토에타노게눔 유래의 말산염 탈수소효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 26으로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 25로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 클로스트리듐 아우토에타노게눔 유래의 NAD-의존적 말산(malic) 효소를 포함한다. 　
본 개시의 미생물은 말산염을 글리옥실레이트로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 12). 이 효소는 말산염 합성효소[2.3.3.9] 또는 이소구연산염 분해효소[4.1.3.1]일 수 있다. 일부 구현예에서, 말산염을 글리옥실레이트로 전환하는 효소는 이종 효소이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 28 또는 서열번호 34로 제시된 아미노산 서열을 각각 암호화하는 서열번호 27 또는 서열번호 33으로 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록, 스포로사르치나 종 유래의 말산염 합성효소 G를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 30 또는 서열번호 36으로 제시된 아미노산 서열을 각각 암호화하는 서열번호 29 또는 서열번호 35로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 바실러스 종 유래의 말산염 합성효소 G를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 32로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 31로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 에스. 코엘리콜로르(S. coelicolor) 유래의 말산염 합성효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 38로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 37로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 비피도박테리움 인판티스(B. infantis) 유래의 말산염 합성효소 G를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 40으로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 39로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 클로스트리듐 코클레아리움(C. cochlearium) 유래의 말산염 합성효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 42로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 41로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 비피도박테리움 메가테리움(B. megaterium) 유래의 말산염 합성효소 G를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 44로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 43으로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 패니바실러스 종 유래의 말산염 합성효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 46으로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 45로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 리시니바실러스 종 유래의 말산염 합성효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 48로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 47로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 비피도박테리움 세레우스(B. cereus) 유래의 말산염 합성효소를 포함한다. 　
본 개시의 미생물은 피부르산염을 포스포에놀피부르산염으로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 13). 이 효소는 피부르산염 키나제[2.7.1.40], 피부르산염, 포스페이트 디키나제(dikinase)[2.7.9.1], 또는 피부르산염, 물(water) 디키나제[2.7.9.2]일 수 있다. 일부 구현예에서, 피부르산염을 포스포에놀피부르산염으로 전환하는 효소는 내인성 효소이다.
본 개시의 미생물은 포스포에놀피부르산염을 2-포스포-D-글리세레이트로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 14). 이 효소는 포스포피부르산염 하이드라타제(hydratase)[4.2.1.11]일 수 있다. 일부 구현예에서, 포스포에놀피부르산염을 2-포스포-D-글리세레이트로 전환하는 효소는 내인성 효소이다.
본 개시의 미생물은 2-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포-D-글리세레이트로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 15). 이 효소는 포스포글리세레이트 뮤타제(mutase)[5.4.2.11/12]일 수 있다. 일부 구현예에서, 2-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포-D-글리세레이트로 전환하는 효소는 내인성 효소이다.
본 개시의 미생물은 3-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포노옥시피부르산염으로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 16). 이 효소는 포스포글리세레이트 탈수소효소[1.1.1.95]일 수 있다. 일부 구현예에서, 3-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포노옥시피부르산염으로 전환하는 효소는 내인성 효소이다.
본 개시의 미생물은 3-포스포노옥시피부르산염을 3-포스포-L-세린으로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 17). 이 효소는 포스포세린 트랜스아미나제[2.6.1.52]일 수 있다. 일부 구현예에서, 3-포스포노옥시피부르산염을 3-포스포-L-세린으로 전환하는 효소는 내인성 효소이다.
본 개시의 미생물은 3-포스포-L-세린을 세린으로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 18). 이 효소는 포스포세린 포스파타제[3.1.3.3]일 수 있다. 일부 구현예에서, 3-포스포-L-세린을 세린으로 전환하는 효소는 내인성 효소이다.
본 개시의 미생물은 세린을 글리신으로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 19). 이 효소는 글리신 하이드록시메틸트랜스퍼라제[2.1.2.1]일 수 있다. 일부 구현예에서, 세린을 글리신으로 전환하는 효소는 내인성 효소이다. 일부 구현예에서, 세린을 글리신으로 전환하는 효소는 과발현된다.
본 개시의 미생물은 글리신을 글리옥실레이트로 전환시키는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 20). 이 효소는 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제/트랜스아미나제[2.6.1.44], 세린-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제/트랜스아미나제[2.6.1.45], 세린-피부르산염 아미노트랜스퍼라제/트랜스아미나제[2.6.1.51], 글리신-옥살로아세테이트 아미노트랜스퍼라제/트랜스아미나제[2.6.1.35], 글리신 트랜스아미나제[2.6.1.4], 글리신 탈수소효소[1.4.1.10], 알라닌 탈수소효소[1.4.1.1], 또는 글리신 탈수소효소[1.4.2.1]일 수 있다. 일부 구현예에서, 글리신을 글리옥실레이트로 전환시키는 효소는 내인성 효소이다. 다른 구현예에서, 글리신을 글리옥실레이트로 전환시키는 효소는 이종 효소이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 아미노전이효소미생물이 서열번호 14로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 13으로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 하이포마이크로비움 메틸로보룸(H. methylovorum) 유래의 세린-글리옥실레이트 아미노전이효소를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 아미노전이효소미생물이 서열번호 16으로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 15로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 에스 티오타우리니 유래의 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 상기 미생물이 서열번호 18로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 17로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 티. 테피다리우스(T. tepidarius) 유래의 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 20으로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 19로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록, 씨. 악시두리치 유래의 부류 V 아미노트랜스퍼라제를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은, 미생물이 서열번호 22로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 21로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 티. 마르티마(T. maritima) 유래의 세린-피부르산염 아미노트랜스퍼라제를 포함한다. 　 일부 구현예에서, 글리신을 글리옥실레이트로 전환시키는 효소는 과발현된다.
본 개시의 미생물은 세린을 하이드록시피부르산염으로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 21). 이 효소는 세린-피부르산염 트랜스아미나제[2.6.1.51], 세린-글리옥실레이트 트랜스아미나제[2.6.1.45], 알라닌 탈수소효소[1.4.1.1], L-아미노산 탈수소효소[1.4.1.5], 세린 2-탈수소효소[1.4.1.7], 알라닌 트랜스아미나제[2.6.1.2], 글루타민-피부르산염 트랜스아미나제[2.6.1.15], D-아미노산 트랜스아미나제[2.6.1.21], 알라닌-글리옥실레이트 트랜스아미나제[2.6.1.44], 또는 세린-피부르산염 트랜스아미나제[2.6.1.51]일 수 있다. 일부 구현예에서, 세린을 하이드록시피부르산염으로 전환하는 효소는 내인성 효소이다. 다른 구현예에서, 세린을 하이드록시피부르산염으로 전환하는 효소는 이종 효소이다. 세린을 하이드록시피부르산염으로 전환할 수 있는 효소의 비제한적인 예는 GenBank 기탁 번호 WP_009989311 및 NP_511062.1에서 찾을 수 있다. 일부 구현예에서, 세린을 하이드록시피부르산염으로 전환하는 효소는 과발현된다.
본 개시의 미생물은 하이드록시피부르산염을 글리콜알데하이드로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 22). 이 효소는 하이드록시피부르산염 데카르복실라제[4.1.1.40] 또는 피부르산염 데카르복실라제[4.1.1.1]일 수 있다. 이 효소는 또한, 임의의 다른 데카르복실라제[4.1.1.-]일 수 있다. 일부 구현예에서, 하이드록시피부르산염을 글리콜알데하이드로 전환하는 효소는 이종 효소이다. 하이드록시피부르산염을 글리콜알데하이드로 전환할 수 있는 효소의 비제한적인 예는 GenBank 기탁 번호 CCG28866, SVF98953, PA0096, CAA54522, KRU13460 및 KLA26356에서 찾을 수 있다.
본 개시의 미생물은 D-글리세레이트를 하이드록시피부르산염으로 전환하는 효소를 포함할 수 있다(도 1의 반응 23). 이 효소는 글리옥실레이트 리덕타제[EC 1.1.1.26], 글리세레이트 탈수소효소[EC 1.1.1.29], 또는 하이드록시피부르산염 리덕타제[EC 1.1.1.81]일 수 있다. 일부 구현예에서, D-글리세레이트를 하이드록시피부르산염으로 전환하는 효소는 이종 효소이다. D-글리세레이트를 하이드록시피부르산염으로 전환할 수 있는 효소의 비제한적인 예는 GenBank 기탁 번호 SUK16841, RPK22618, KPA02240, AGW90762, CAC11987, Q9CA90 및 Q9UBQ7에서 찾을 수 있다.
본 개시의 미생물은 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트를 글리신으로 변환하는 효소의 복합체(도 1의 반응 24)를 포함할 수 있다. 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트는 우드-륭달 경로의 환원성 분지의 보조 인자이며 아세틸-CoA의 생성에서 스캐폴드로서 작용한다. 이 복합체는 글리신 탈수소효소[1.4.4.2], 디하이드로리포일 탈수소효소[1.8.1.4], 및 아미노메틸트랜스퍼라제(글리신 합성효소)[2.1.2.10]를 포함하는 글리신 절단 시스템일 수 있다. 일부 구현예에서, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트를 글리신으로 전환하는 복합체의 효소는 내인성 효소이다. 일부 구현예에서, 글리신 절단 시스템의 효소는 과발현된다.
본 개시의 미생물은 포스포에놀피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 25)를 포함할 수 있다. 이 효소는 포스포에놀피부르산염 카르복시키나제(ATP)[4.1.1.49] 또는 (GTP)[4.1.1.32]일 수 있다. 일부 구현예에서, 포스포에놀피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환하는 효소는 내인성 효소이다. 다른 구현예에서, 포스포에놀피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환하는 효소는 이종 효소이다. 일부 구현예에서, 포스포에놀피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환하는 효소는 과발현된다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA를 피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 1), 피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 2), 옥살로아세테이트를 구연산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 5), 구연산염을 아코니테이트로 전환하고 아코니테이트를 이소-구연산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 6), 이소구연산염을 글리옥실레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 7), 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 8), 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소(도 1의 반응 9), 및 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환하는 효소(도 1의 반응 10)를 포함하는 미생물은 에틸렌 글리콜을 생성한다. 비제한적인 예에서, 옥살로아세테이트를 구연산염으로 전환하는 효소는 고초균으 유래의 구연산염 합성효소(서열번호: 1-2)일 수 있다. 비제한적인 예에서, 이소-구연산염을 글리옥실레이트로 전환하는 효소는 대장균 유래의 이소구연산염 분해효소(서열번호: 11-12)일 수 있다. 비제한적인 예에서, 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소는 글로코노박터 옥시단스 유래의 글리콜알데하이드 탈수소효소(서열번호: 55-56) 또는 피. 플루오레센스 유래의 알데하이드 탈수소효소(서열번호: 57-58)일 수 있다. 도 1에 제시된 바와 같이 반응 2, 5, 6, 8, 9, 및 10을 촉매화하는 하나 이상의 효소는 과발현될 수 있다. 예를 들어, 실시예 1 및 도 3b를 참조한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA를 피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 1), 피부르산염을 포스포에놀피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 13), 포스포에놀피부르산염을 2-포스포-D-글리세레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 14), 2-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포-D-글리세레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 15), 3-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포노옥시피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 16), 3-포스포노옥시피부르산염을 3-포스포-L-세린으로 전환하는 효소(도 1의 반응 17), 3-포스포-L-세린을 세린으로 전환하는 효소(도 1의 반응 18), 세린을 글리신으로 전환하는 효소(도 1의 반응 19), 글리신을 글리옥실레이트로 전환시키는 효소(도 1의 반응 20), 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 8), 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소(도 1의 반응 9), 및 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환하는 효소(도 1의 반응 10)를 포함하는 미생물은 에틸렌 글리콜을 생성한다. 비제한적인 예에서, 글리신을 글리옥실레이트로 전환시키는 효소는 에스. 티오타우리니로부터의 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제(서열번호: 15-16) 또는 씨. 악시두리치로부터의 부류 V 아미노트랜스퍼라제(서열번호: 19-20)일 수 있다. 비제한적인 예에서, 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소는 글로코노박터 옥시단스로부터의 글리콜알데하이드 탈수소효소(서열번호: 55-56) 또는 피. 플루오레센스로부터의 알데하이드 탈수소효소(서열번호: 57-58)일 수 있다. 도 1에 제시된 바와 같이 반응 19, 20, 8, 9 및 10을 촉매화하는 하나 이상의 효소는 과발현될 수 있다. 예를 들어, 실시예 2 내지 4 및 도 4b, 5b 및 6b를 참조한다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA를 피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 1), 피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 2), 옥살로아세테이트를 시트릴-CoA로 전환하는 효소(도 1의 반응 3), 시트릴-CoA를 구연산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 4), 구연산염을 아코니테이트로 전환하고 아코니테이트를 이소-구연산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 6), 이소구연산염을 글리옥실레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 7), 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 8), 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소(도 1의 반응 9), 및 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환하는 효소(도 1의 반응 10)를 포함하는 미생물은 에틸렌 글리콜을 생성한다. 비제한적인 예에서, 이소-구연산염을 글리옥실레이트로 전환하는 효소는 대장균 유래의 이소구연산염 분해효소(서열번호: 11-12)일 수 있다. 비제한적인 예에서, 이소-구연산염을 글리옥실레이트로 전환하는 효소는 대장균 유래의 이소구연산염 분해효소(서열번호: 11-12)일 수 있다. 비제한적인 예에서, 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소는 글로코노박터 옥시단스로부터의 글리콜알데하이드 탈수소효소(서열번호: 55-56) 또는 피. 플루오레센스로부터의 알데하이드 탈수소효소(서열번호: 57-58)일 수 있다. 도 1에 제시된 바와 같이 반응 2, 6, 8, 9 및 10을 촉매화하는 하나 이상의 효소는 과발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA를 피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 1), 피부르산염을 말산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 11), 말산염을 글리옥실레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 12), 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 8), 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소(도 1의 반응 9), 및 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환하는 효소(도 1의 반응 10)를 포함하는 미생물은 에틸렌 글리콜을 생성한다. 비제한적인 예에서, 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소는 글로코노박터 옥시단스로부터의 글리콜알데하이드 탈수소효소(서열번호: 55-56) 또는 피. 플루오레센스로부터의 알데하이드 탈수소효소(서열번호: 57-58)일 수 있다. 도 1에 제시된 바와 같이 반응 8, 9 및 10을 촉매화하는 하나 이상의 효소는 과발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트를 글리신으로 전환시키는 효소(도 1의 반응 24), 글리신을 글리옥실레이트로 전환시키는 효소(도 1의 반응 20), 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 8), 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소(도 1의 반응 9), 및 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환하는 효소(도 1의 반응 10)의 복합체를 포함하는 미생물은 에틸렌 글리콜을 생성한다. 비제한적인 예에서, 글리신을 글리옥실레이트로 전환시키는 효소는 에스. 티오타우리니로부터의 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제(서열번호: 15-16) 또는 씨. 악시두리치로부터의 부류 V 아미노트랜스퍼라제(서열번호: 19-20)일 수 있다. 비제한적인 예에서, 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소는 글로코노박터 옥시단스로부터의 글리콜알데하이드 탈수소효소(서열번호: 55-56) 또는 피. 플루오레센스로부터의 알데하이드 탈수소효소(서열번호: 57-58)일 수 있다. 도 1에 제시된 바와 같이 반응 8, 9, 10, 20 및 24를 촉매화하는 하나 이상의 효소는 과발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA를 피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 1), 피부르산염을 포스포에놀피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 13), 포스포에놀피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 25), 옥살로아세테이트를 시트릴-CoA로 전환하는 효소(도 1의 반응 3), 시트릴-CoA를 구연산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 4), 구연산염을 아코니테이트로 전환하고 아코니테이트를 이소-구연산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 6), 이소구연산염을 글리옥실레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 7), 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 8), 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소(도 1의 반응 9), 및 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환하는 효소(도 1의 반응 10)를 포함하는 미생물은 에틸렌 글리콜을 생성한다. 비제한적인 예에서, 이소-구연산염을 글리옥실레이트로 전환하는 효소는 대장균 유래의 이소구연산염 분해효소(서열번호: 11-12)일 수 있다. 비제한적인 예에서, 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소는 글로코노박터 옥시단스로부터의 글리콜알데하이드 탈수소효소(서열번호: 55-56) 또는 피. 플루오레센스로부터의 알데하이드 탈수소효소(서열번호: 57-58)일 수 있다. 도 1에 제시된 바와 같이 반응 2, 6, 8, 9, 10 및 25를 촉매화하는 하나 이상의 효소는 과발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA를 피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 1), 피부르산염을 포스포에놀피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 13), 포스포에놀피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 25), 옥살로아세테이트를 구연산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 5), 구연산염을 아코니테이트로 전환하고 아코니테이트를 이소-구연산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 6), 이소구연산염을 글리옥실레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 7), 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 8), 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소(도 1의 반응 9), 및 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환하는 효소(도 1의 반응 10)를 포함하는 미생물은 에틸렌 글리콜을 생성한다. 비제한적인 예에서, 옥살로아세테이트를 구연산염으로 전환하는 효소는 고초균으로부터의 구연산염 합성효소(서열번호: 1-2)일 수 있다. 비제한적인 예에서, 이소-구연산염을 글리옥실레이트로 전환하는 효소는 대장균 유래의 이소구연산염 분해효소(서열번호: 11-12)일 수 있다. 비제한적인 예에서, 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환하는 효소는 글로코노박터 옥시단스로부터의 글리콜알데하이드 탈수소효소(서열번호: 55-56) 또는 피. 플루오레센스로부터의 알데하이드 탈수소효소(서열번호: 57-58)일 수 있다. 도 1에 제시된 바와 같이 반응 5, 6, 8, 9, 10 및 25를 촉매화하는 하나 이상의 효소는 과발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 아세틸-CoA를 피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 1), 피부르산염을 포스포에놀피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 13), 포스포에놀피부르산염을 2-포스포-D-글리세레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 14), 2-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포-D-글리세레이트로 전환하는 효소(도 1의 반응 15), 3-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포노옥시피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 16), 3-포스포노옥시피부르산염을 3-포스포-L-세린으로 전환하는 효소(도 1의 반응 17), 3-포스포-L-세린을 세린으로 전환하는 효소(도 1의 반응 18), 세린을 하이드록시피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 21), 하이드록시피부르산염을 글리콜알데하이드로 전환하는 효소(도 1의 반응 22), 및 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환하는 효소(도 1의 반응 10)를 포함하는 미생물은 에틸렌 글리콜을 생성한다. 글리콜알데하이드로부터 에틸렌 글리콜로의 전환을 촉매화하는 효소는 과발현될 수 있다.
일부 구현예에서, D-글리세레이트를 하이드록시피부르산염으로 전환하는 효소(도 1의 반응 23), 하이드록시피부르산염을 글리콜알데하이드로 전환하는 효소(도 1의 반응 22), 및 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환하는 효소(도 1의 반응 10)를 포함하는 미생물은 에틸렌 글리콜을 생성한다. 글리콜알데하이드로부터 에틸렌 글리콜로의 전환을 촉매화하는 효소는 과발현될 수 있다.
본 개시의 효소는 본 개시의 미생물에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. "코돈 최적화"는 특정 균주 또는 종에서 핵산의 최적화된 또는 개선된 번역을 위한 핵산, 예컨대 유전자의 돌연변이를 지칭한다. 코돈 최적화는 더 신속한 번역 속도 또는 더 높은 번역 정확도를 야기할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 개시의 유전자는 본 개시의 미생물에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 코돈 최적화가 기저(underlying) 유전자 서열을 지칭하긴 하지만, 코돈 최적화는 종종 향상된 번역, 따라서 향상된 효소 발현을 초래한다. 이에, 본 개시의 효소 또한, 코돈 최적화되는 것으로 기재될 수 있다.
본 개시의 하나 이상의 효소는 과발현될 수 있다. "과발현된"은 본 개시내용의 미생물이 유래되는 야생형 또는 부모 미생물과 비교하여 본 개시내용의 미생물에서 핵산 또는 단백질의 발현의 증가를 지칭한다. 과발현은 유전자 복사 수, 유전자 전사 속도, 유전자 번역 속도 또는 효소 분해 속도를 변형시키는 것을 포함한 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 도 1의 반응 2, 5, 6, 8, 9, 10, 19, 20, 24 또는 25를 촉매화하는 효소 중 하나 이상이 과발현될 수 있다.
본 개시의 효소는 교란적 돌연변이를 포함할 수 있다. "교란적 돌연변이"는, 유전자 또는 효소의 발현 또는 활성을 감소시키거나 없애는(즉, "교란시키는") 돌연변이를 지칭한다. 교란적 돌연변이는 유전자 또는 효소를 부분적으로 불활성화시키거나, 완전히 불활성화시키거나 결실시킬 수 있다. 교란적 돌연변이는 녹아웃(knockout, KO) 돌연변이일 수 있다. 교란적 돌연변이는 효소에 의해 생성되는 생성물의 생합성을 감소시키거나, 예방하거나 차단하는 임의의 돌연변이일 수 있다. 교란적 돌연변이는 예를 들어, 효소를 암호화하는 유전자에서의 돌연변이, 효소를 암호화하는 유전자의 발현에 관여하는 유전적 조절 요소에서의 돌연변이, 효소의 활성을 감소시키거나 저해하는 단백질을 생성하는 핵산의 도입, 또는 효소의 발현을 저해하는 핵산(예를 들어, 안티센스 RNA, siRNA, CRISPR) 또는 단백질의 도입을 포함할 수 있다. 교란적 돌연변이는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 도입될 수 있다.
일 구현예에서, 본 개시의 미생물은 디올 탈수효소를 암호화하는 유전자에서 교란적 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은 이소구연산염 탈수소효소[1.1.1.41]에서 교란적 돌연변이를 포함한다. 이소구연산염 탈수소효소는 이소-구연산염을 2-옥소글루타레이트로 전환한다. 예컨대 이소구연산염 탈수소효소의 결실에 의한 상기 이소구연산염 탈수소효소의 교란은 이소-구연산염의 수준을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은 글리세레이트 탈수소효소[1.1.1.29]에서 교란적 돌연변이를 포함한다. 글리세레이트 탈수소효소는 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환한다. 예컨대 이소구연산염 탈수소효소의 결실에 의한 글리세레이트 탈수소효소의 교란은 글리옥실레이트의 수준을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은 글리콜레이트 탈수소효소[1.1.99.14]에서 교란적 돌연변이를 포함한다. 글리콜레이트 탈수소효소는 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환한다. 예컨대 글리콜레이트 탈수소효소의 결실에 의한 글리콜레이트 탈수소효소의 교란은 글리옥실레이트의 수준을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은 알데하이드 페레독신 옥시도리덕타제[1.2.7.5]에서 교란적 돌연변이를 포함한다. 알데하이드 페레독신 옥시도리덕타제는 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환한다. 예컨대 알데하이드 페레독신 옥시도리덕타제의 결실에 의한 알데하이드 페레독신 옥시도리덕타제의 교란은 글리콜레이트의 수준을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 본 개시의 미생물은 알데하이드 탈수소효소[1.2.1.3/1.2.3.4/1.2.3.5]에서 교란적 돌연변이를 포함한다. 알데하이드 탈수소효소는 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환한다.. 예컨대 알데하이드 탈수소효소의 결실에 의한 알데하이드 탈수소효소의 교란은 글리콜레이트의 수준을 증가시킨다.
교란적 돌연변이의 도입은, 표적 생성물을 생성하지 않거나 표적 생성물을 실질적으로 생성하지 않거나, 본 개시내용의 미생물이 유래되는 부모 미생물과 비교하여 표적 생성물을 감소된 양으로 생성하는 본 개시내용의 미생물을 초래한다. 예를 들어, 본 개시내용의 미생물은 표적 생성물을 생성하지 않거나, 부모 미생물보다 적어도 약 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 적은 표적 생성물을 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 미생물은 약 0.001, 0.01, 0.10, 0.30, 0.50 또는 1.0 g/L 미만의 표적 생성물을 생성할 수 있다.
효소에 대한 예시적인 서열 및 공급원이 본원에 제공되긴 하지만, 본 개시는 이들 서열 및 공급원으로 제한되는 것이 아니며 - 본 개시는 변이체를 또한 포괄한다. 용어 "변이체"는 핵산 및 단백질의 서열이 기준 핵산 및 단백질의 서열, 예컨대 선행 기술에 개시되거나 본원에 예시된 기준 핵산 및 단백질의 서열로부터 달라진 핵산 및 단백질을 포함한다. 본 개시내용은 기준 핵산 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 변이체 핵산 또는 단백질을 사용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 변이체 단백질은 기준 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 실질적으로 동일한 반응을 촉매화할 수 있다. 변이체 유전자는 기준 유전자와 동일한 단백질 또는 실질적으로 동일한 단백질을 암호화할 수 있다. 변이체 프로모터는 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 기준 프로모터와 실질적으로 동일한 능력을 가질 수 있다.
그러나 핵산 또는 단백질은 본원에서 "기능적으로 동등한 변이체"로 지칭될 수 있다. 예로써, 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 대립유전자 변이체, 유전자 절편, 돌연변이 유전자, 다형성 등을 포함할 수 있다. 다른 미생물로부터의 상동성 유전자 또한 기능적으로 등가인 변이체의 예이다. 이들은 종, 예컨대 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 클로스트리디움 베이예린키이 또는 클로스트리디움 륭달리이 내의 상동성 유전자를 포함하고, 이들의 세부사항은 웹사이트, 예컨대 Genbank 또는 NCBI 상에서 공개적으로 입수 가능하다. 기능적으로 등가인 변이체는 또한 핵산의 서열이 특정 미생물에 대한 코돈 최적화의 결과 달라지는 핵산을 포함한다. 핵산의 기능적으로 등가인 변이체는 바람직하게는 기준 핵산과 적어도 대략 70%, 대략 80%, 대략 85%, 대략 90%, 대략 95%, 대략 98% 또는 그 이상의 핵산 서열 동일성(상동성 퍼센트)을 가질 것이다. 단백질의 기능적으로 등가인 변이체는 바람직하게는, 기준 단백질과 적어도 대략 70%, 대략 80%, 대략 85%, 대략 90%, 대략 95%, 대략 98% 또는 그 이상의 아미노산 동일성(상동성 퍼센트)을 가질 것이다. 변이체 핵산 또는 단백질의 기능적 등가성은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
"상보성"은 전통적인 왓슨-크릭 또는 다른 비-전통적인 유형에 의해 또 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 지칭한다. 상보성 백분율은, 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기쌍 형성)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내 잔기의 퍼센트를 나타낸다(예를 들어, 10개 중 5, 6, 7, 8, 9, 10개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보적임). "완벽하게 상보적인"은, 핵산 서열의 모든 인접 잔기들이 제2 핵산 서열 내의 동일한 수의 인접 잔기들과 수소 결합을 형성할 것임을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "실질적으로 상보적인"은, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 뉴클레오티드들의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%. 97%, 98%, 99% 또는 100%인 상보성도를 지칭하거나, 엄격한 조건 하에 혼성화하는 2개의 핵산들을 지칭한다.
"혼성화"는, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여, 뉴클레오티드 잔기의 염기들 사이에서 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기쌍 형성, 후그스타인(Hoogstein) 결합에 의해, 또는 임의의 다른 서열 특이적인 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가-혼성화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 보다 고비용의 과정에서 일 단계, 예컨대 PCR의 개시, 또는 효소에 의한 폴리뉴클레오티드의 절단을 구축할 수 있다. 주어진 서열과 혼성화할 수 있는 서열은 주어진 서열의 "보체"로서 지칭된다.
핵산은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 본 개시내용의 미생물에 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 노출 핵산으로서 전달될 수 있거나, 하나 이상의 작용제, 예컨대 리포솜으로 제형화될 수 있다. 핵산은 적절하다면 DNA, RNA, cDNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 제한 억제제는 특정한 구현예에서 사용될 수 있다. 추가의 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 코스미드 및 인공 염색체를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 핵산은 플라스미드를 사용하여 본 개시내용의 미생물에 전달될 수 있다. 예로서, 형질전환(형질도입 또는 형질감염을 포함함)은 전기천공, 초음파처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환, 화학적 또는 천연 적격, 원생동물 형질전환, 프로파지 유도 또는 접합에 의해 달성될 수 있다. 활성 제한 효소 시스템을 갖는 특정 구현예에서, 핵산을 미생물 내로 도입하기 전에 핵산을 메틸화하는 것이 필요할 수 있다.
추가로, 핵산은 특정 핵산을 증가시키거나 아니면 이의 발현을 제어하기 위해, 프로모터와 같은 조절 요소를 포함하도록 설계될 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도적 프로모터일 수 있다. 이상적으로, 프로모터는 우드-륭달 경로 프로모터, 페레독신 프로모터, 피부르산염:페레독신 옥시도환원효소 프로모터, Rnf 복합체 오페론 프로모터, ATP 합성효소 오페론 프로모터, 또는 포스포트랜스아세틸라아제/아세테이트 키나아제 오페론 프로모터이다.
본 개시는 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 경우에 본원에서 구체적으로 예시된 서열과 상이한 서열을 갖는 핵산을 사용하여 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 경우, 이는 암호화된 단백질 또는 펩티드가 실질적으로 동일한 기능을 갖는다는 것을 의미한다. 프로모터 서열을 나타내는 핵산 서열의 경우, 변이체 서열은 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 능력을 가질 것이다. 이러한 핵산은 본원에서 "기능적으로 동등한 변이체"로 지칭될 수 있다. 예로써, 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 대립유전자 변이체, 유전자 절편, 돌연변이(결실, 삽입, 뉴클레오티드 치환 등)을 포함하는 유전자, 및/또는 다형성 등을 포함할 수 있다. 다른 미생물 유래의 상동성 유전자는 또한 본원에서 구체적으로 예시된 서열의 기능적으로 동등한 변이체의 예로서 간주될 수 있다.
여기에는 클로스트리디움 륭달리이, 클로로플렉스 오란티아쿠스, 메탈로스파에라 및 설폴로버스 종과 같은 종에서의 상동성 유전자가 포함되며, 그 세부 사항은 Genbank 또는 NCBI와 같은 웹사이트에서 공개적으로 이용할 수 있다. 문구 "기능적으로 등가인 변이체"는 또한 핵산의 서열이 특정 유기체에 대한 코돈 최적화의 결과로서 달라지는 핵산을 포함한다. 본원에서 핵산의 "기능적으로 동등한 변이체"는 바람직하게는 식별된 핵산과 적어도 약 70%, 바람직하게는 약 80%, 보다 바람직하게는 약 85%, 바람직하게는 약 90%, 바람직하게는 약 95% 이상의 핵산 서열 동일성을 가질 것이다.
본 개시는 본원에서 구체적으로 예시된 아미노산 서열과 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드를 사용하여 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 변이체는 본원에서 "기능적으로 동등한 변이체"로 지칭될 수 있다. 단백질 또는 펩티드의 기능적으로 동등한 변이체는, 식별된 단백질 또는 펩티드와 적어도 40%, 바람직하게는 50%, 바람직하게는 60%, 바람직하게는 70%, 바람직하게는 75%, 바람직하게는 80%, 바람직하게는 85%, 바람직하게는 90%, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 동일성을 공유하고 관심 펩티드 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 갖는 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 이러한 변이체는 단백질 또는 펩티드의 단편의 범위 내에 있으며, 여기서 단편은 폴리펩티드의 절단된 형태를 포함하되, 결실은 1 내지 5, 10, 15, 20, 25개의 아미노산일 수 있고, 폴리펩티드의 어느 하나의 말단에서 잔기 1 내지 25로부터 연장될 수 있으며, 여기서 결실은 영역 내의 임의의 길이일 수 있고; 또는 내부 위치에 있을 수 있다. 본원의 특이적 폴리펩티드의 기능적으로 동등한 변이체는 또한, 예를 들어 이전 단락에서 예시된 바와 같이, 다른 종의 박테리아에서 상동성 유전자에 의해 발현된 폴리펩티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시의 미생물은 재조합 미생물을 생성하기 위해 당업계에 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 부모 미생물 및 하나 이상의 외인성 핵산으로부터 제조될 수 있다. 단지 예로서, 형질전환(형질도입 또는 형질감염을 포함함)은 전기천공, 초음파처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환, 화학적 또는 천연 적격, 또는 접합에 의해 달성될 수 있다. 적절한 변환 기술은, 예를 들어 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: 분자 클로닝: A laboratory Manual, Cold Spring≡Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989년.
특정 구현예에서, 형질전환될 미생물에서 활성인 제한 시스템으로 인해, 미생물 내로 도입될 핵산을 메틸화할 필요가 있다. 이는, 후술하는 내용 및 이에 이어서 본원의 실시예 섹션에서 추가로 예시되는 내용에 포함하는 다양한 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 일 구현예에서, 본 개시의 재조합 미생물은 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다: (i) 본원에 기술된 바와 같은 발현 작제물/벡터의 셔틀 미생물 내로 도립하는 단계 및 (ii) 메틸전이효소 유전자를 포함하는 작제물/벡터의 메틸화; 메틸전이효소 유전자의 발현; 셔틀 미생물로부터 하나 이상의 작제물/벡터의 단리; 및, 하나 이상의 작제물/벡터를 목적 미생물 내로 도입하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 단계 B의 메틸전이효소 유전자는 구성적으로 발현된다. 또 다른 구현예에서, 단계 B의 메틸전이효소 유전자의 발현이 유도된다.
셔틀 미생물은 미생물, 바람직하게는 발현 작제물/벡터를 구성하는 핵산 서열의 메틸화를 용이하게 하는 제한 음성 미생물이다. 특정 구현예에서, 셔틀 미생물은 제한 음성 대장균, 바실루스 서브틸리스, 또는 락토코쿠스 락티스이다.
메틸화 작제물/벡터는 메틸전이효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
일단 발현 작제물/벡터 및 메틸화 작제물/벡터가 셔틀 미생물 내로 도입되면, 메틸화 작제물/벡터 상에 존재하는 메틸전이효소 유전자가 유도된다. 본 개시의 특정 일 구현예에서 메틸화 작제물/벡터는 유도성 lac 프로모터를 포함하고 락토오스 또는 이의 유사체, 보다 바람직하게는 이소프로필-β-D-티오-갈락토시드(IPTG)의 첨가에 의해 유도되지만, 유도는 임의의 적절한 프로모터 시스템에 의해 이루어질 수 있다. 다른 적절한 프로모터는 ara, tet, 또는 T7 시스템을 포함한다. 본 개시의 추가의 구현예에서, 메틸화 작제물/벡터 프로모터는 구성적 프로모터이다.
특정 구현예에서, 메틸화 작제물/벡터는, 메틸화 작제물/벡터 상에 존재하는 임의의 유전자가 셔틀 미생물에서 발현되도록 셔틀 미생물의 동일성에 특이적인 복제 기점을 갖는다. 바람직하게는, 발현 작제물/벡터는 목적 미생물의 식별에 특이적인 복제 기점을 가지기 때문에, 발현 작제물/벡터 상에 존재하는 임의의 유전자는 목적 미생물에서 발현된다.
메틸전이효소 효소의 발현은 발현 작제물/벡터 상에 존재하는 유전자의 메틸화를 초래한다. 그런 다음, 발현 작제물/벡터는 다수의 공지된 방법 중 어느 하나에 따라 셔틀 미생물로부터 단리될 수 있다. 단지 예로서, 후술하는 실시예 섹션에서 기술된 방법론은 발현 작제물/벡터를 단리하는데 사용될 수 있다.
특정 일 구현예에서, 작제물/벡터 둘 모두는 동시에 단리된다.
발현 작제물/벡터는 임의의 수의 공지된 방법을 사용하여 목적 미생물 내로 도입될 수 있다. 그러나, 예로서, 이하에서 실시예 섹션에 기술된 방법론이 사용될 수 있다. 발현 작제물/벡터가 메틸화되기 때문에, 발현 작제물/벡터 상에 존재하는 핵산 서열은 대상 미생물에 통합되고 성공적으로 발현될 수 있다.
메틸전이효소 유전자는 셔틀 미생물 내로 도입되고 과발현될 수 있는 것으로 예상된다. 따라서, 일 구현예에서, 생성된 메틸전이효소 효소는 공지된 방법을 사용하여 수집되고 발현 플라스미드를 메틸화하도록 시험관 내에서 사용될 수 있다. 그런 다음, 발현 작제물/벡터는 발현을 위해 목적 미생물 내로 도입될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 메틸전이효소 유전자가 셔틀 미생물의 게놈 내로 도입된 다음, 발현 작제물/벡터이 셔틀 미생물 내로 도입되고, 하나 이상의 작제물/벡터가 셔틀 미생물로부터 단리된 다음, 발현 작제물/벡터는 목적 미생물 내로 도입된다.
위에서 정의된 바와 같은 발현 작제물/벡터 및 메틸화 작제물/벡터가 조합되어 물질의 조성을 제공할 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 조성물은 본 개시의 재조합 미생물을 생성하기 위한 제한 장벽 메커니즘을 우회하는 데 특히 유용하다.
특정 일 구현예에서, 발현 작제물/벡터 및/또는 메틸화 작제물/벡터들은 플라스미드이다.
당업자는 본 개시의 미생물을 생성하는 데 사용되는 다수의 적절한 메틸전이효소가 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 예로서, 바실루스 서브틸리스 파지 ΦT1 메틸전이효소 및 이후 본원의 실시예에 기술된 메틸전이효소가 사용될 수 있다. 원하는 메틸전이효소의 서열 및 유전자 코드에 대한 적절한 메틸전이효소를 암호화하는 핵산이 용이하게 이해될 것이다.
메틸전이효소 유전자의 발현을 허용하도록 구성된 임의의 수의 작제물/벡터가 메틸화 작제물/벡터를 생성하는 데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 기질은 CO를 포함한다. 일 구현예에서, 기질은 CO2 및 CO를 포함한다. 다른 구현예에서, 기질은 CO2 및 H2를 포함한다. 다른 구현예에서, 기질은 CO2 및 CO 및 H2를 포함한다.
"기질"은 본 개시의 미생물에 대한 탄소 및/또는 에너지 공급원을 지칭한다. 종종, 기질은 기체이고, C1-탄소 공급원, 예를 들어, CO, CO2 및/또는 CH4를 포함한다. 바람직하게는, 기질은 CO 또는 CO + CO2의 C1-탄소 공급원을 포함한다. 기질은 다른 비-탄소 성분, 예를 들어, H2, N2 또는 전자를 추가로 포함할 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서, 기질은 탄수화물, 예컨대 당(sugar), 전분, 섬유, 리그닌, 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 탄수화물은 프룩토스, 갈락토스, 글루코스, 락토스, 말토스, 수크로스, 자일로스 또는 이들의 일부 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 기질은 (D)-자일로스를 포함하지 않는다(문헌[Alkim, Microb Cell Fact, 14: 127, 2015]). 일부 구현예에서, 기질은 펜토스, 예컨대 자일로스를 포함하지 않는다(문헌[Pereira, Metab Eng, 34: 80-87, 2016]). 일부 구현예에서, 기질은 기체 기질과 탄수화물 기질 둘 모두를 포함할 수 있다(혼합영양(mixotrophic) 발효). 기질은 다른 비-탄소 성분, 예를 들어, H2, N2 또는 전자를 추가로 포함할 수 있다.
기체 기질은 일반적으로, 적어도 일부 양의 CO, 예컨대 약 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 몰% CO를 포함한다. 기체 기질은 CO 범위, 예컨대 약 20 내지 80 몰%, 30 내지 70 몰% 또는 40 내지 60 몰% CO를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 기체 기질은 약 40 내지 70 몰% CO(예를 들어, 제철소 또는 용광로 가스), 약 20 내지 30 몰% CO(예를 들어, 기본적인(basic) 산소로(oxygen furnace) 가스), 또는 약 15 내지 45 몰% CO(예를 들어, 합성가스)를 포함한다. 일부 구현예에서, 기체 기질은 상대적으로 소량의 CO, 예컨대 약 1 내지 10 몰% 또는 1 내지 20 몰% CO를 포함할 수 있다. 본 개시의 미생물은 통상적으로 기체 기질 내 적어도 일부의 CO를 생성물로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 기체 기질은 CO를 포함하지 않거나 CO를 실질적으로(1 몰% 미만) 포함하지 않는다.
기체 기질은 일부 양의 H2를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기체 기질은 약 1, 2, 5, 10, 15, 20 또는 30 몰% H2를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 기체 기질은 상대적으로 다량의 H2, 예컨대 약 60, 70, 80 또는 90 몰% H2를 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 기체 기질은 H2를 포함하지 않거나 H2를 실질적으로(1 몰% 미만) 포함하지 않는다.
기체 기질은 일부 양의 CO2를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기체 기질은 약 1 내지 80 몰% 또는 1 내지 30 몰% CO2를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 기체 기질은 약 20, 15, 10 또는 5 몰% 미만의 CO2를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 기체 기질은 CO2를 포함하지 않거나 CO2를 실질적으로(1 몰% 미만) 포함하지 않는다.
기체 기질은 또한, 대안적인 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 기체 기질은 액체 내에 용해되거나 고체 지지체 상으로 흡착될 수 있다.
기체 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 산업적 과정의 부산물로서 또는 일부 다른 공급원으로부터, 예컨대 자동차 매연 또는 바이오매스 가스화로부터 수득되는 폐가스 또는 오프가스일 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 산업 공정은 제강 제조 등의 철금속 제품 제조, 비철금속 제품 제조, 석유 정제, 석탄 가스화, 전력 생성, 카본블랙 생성, 암모니아 생성, 메탄올 생성, 코크스 제조로 이루어진 군에서 선택된다. 이들 구현예에서, 기체 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은, 이것이 대기 중으로 배출되기 전에 임의의 편리한 방법을 사용하여 산업적 과정으로부터 포착될 수 있다.
기체 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 합성가스, 예컨대 석탄 또는 정제 잔류물(residue)의 가스화, 바이오매스 또는 리그노셀룰로스성 물질의 가스화, 또는 천연 가스의 개질(reforming)에 의해 수득되는 합성가스일 수 있다. 다른 구현예에서, 신가스는 도시 고체 폐기물 또는 산업 고체 폐기물의 가스화로부터 수득될 수 있다.
기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 산업 공정의 부산물로서 또는 또 다른 공급원, 예를 들어 자동차 배기 매연, 바이오가스, 매립지 가스, 직접 공기 포집, 또는 전기분해로부터 수득되는 폐가스일 수 있다. 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 열분해, 반탄화, 또는 가스화에 의해 생성되는 합성가스일 수 있다. 다시 말해, 폐기물 중 탄소는 열분해, 반탄화 또는 가스화에 의해 재순환되어 기질 및/또는 C1-탄소 공급원으로서 사용되는 합성가스를 생성할 수 있다. 기판 및/또는 C1-탄소 공급원은 메탄을 포함한 가스일 수 있다.
특정 구현예에서, 이러한 산업 공정은 철 금속 제품 제조, 예컨대, 철강 제조, 비철 제품 제조, 석유 정제, 전력 생성, 카본 블랙 생성, 제지 및 펄프 제조, 암모니아 생성, 메탄올 생성, 코크 제조, 석유화학 생성, 탄수화물 발효, 시멘트 제조, 호기성 소화, 혐기성 소화, 촉매 공정, 천연 가스 추출, 셀룰로오스 발효, 오일 추출, 지질 저류층의 산업적 처리, 천연 가스 석탄 및 석유와 같은 화석 자원 처리, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 산업 공정 내의 특정 처리 단계의 예는 촉매 재생, 유체 촉매 크래킹, 및 촉매 재생을 포함한다. 공기 분리 및 직접 공기 포획은 다른 적절한 산업 공정이다. 철강 및 철합금 제조에서의 특정한 예는 용광로 가스, 제강 전로 가스, 코크스 오븐 가스, 직접환원로 노상가스, 및 철 제련으로부터의 잔류 가스를 포함한다. 이러한 구현예에서, 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 대기 중으로 배출되기 전에 임의의 공지된 방법을 사용하여 해당 산업 공정으로부터 포집할 수 있다.
기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 합성가스로서 알려진 합성 가스일 수 있으며, 이는 개질, 부분 산화, 또는 가스화 공정으로부터 수득될 수 있다. 가스화 공정의 예는, 석탄의 가스화, 정제 잔류물의 가스화, 석유 코크의 가스화, 바이오매스의 가스화, 리노셀룰로오스 물질의 가스화, 폐목재의 가스화, 흑액(black liquor)의 가스화, 도시 고형 폐기물의 가스화, 도시 액체 폐기물의 가스화, 산업 고형 폐기물의 가스화, 산업 액체 폐기물의 가스화, 폐기물 유래 연료의 가스화, 하수물의 가스화, 하수 슬러지의 가스화, 폐수 처리로부터의 슬러지의 가스화, 바이오가스의 가스화를 포함한다. 개질 공정의 예는, 증기 메탄 개질, 증기 나프타 개질, 천연 가스 개질, 바이오가스 개질, 매립 가스 개질, 나프타 개질, 및 건식 메탄 개질을 포함한다. 부분 산화 공정의 예는, 열 및 촉매 부분 산화 공정, 천연 가스의 촉매 부분 산화, 탄화수소의 부분 산화를 포함한다. 도시 고형 폐기물의 예는, 타이어, 플라스틱, 및 신발, 의류 및 직물과 같은 섬유이다. 도시 고형 폐기물은 단순히 매립형 폐기물일 수 있다. 도시 고형 폐기물은 분류되거나 분류되지 않을 수 있다. 바이오매스의 예로는 리그노셀룰로오스 물질을 포함할 수 있으며, 미생물 바이오매스를 또한 포함할 수 있다. 리그노셀룰로오스 물질은 농업 폐기물 및 산림 폐기물을 포함할 수 있다.
기판 및/또는 C1-탄소 공급원은 메탄을 포함한 가스 스트림일 수 있다. 이러한 메탄 함유 가스는 파쇄, 오수 처리, 가축, 농업 및 지방자치 고형 폐기물 매립지와 같은 화석 메탄 방출로부터 수득될 수 있다. 또한, 메탄은 전기 또는 열을 생성하기 위해 연소될 수 있고, C1 부산물은 기판 또는 탄소 공급원으로서 사용될 수 있는 것으로 예상된다.
기체 기질의 조성물은 반응의 효율 및/또는 비용에 유의한 영향을 가질 수 있다. 예를 들어, 산소(O2)의 존재는 혐기성 발효 공정의 효율을 감소시킬 수 있다. 기질의 조성에 따라, 임의의 원치 않는 불순물, 예를 들어 독소, 원치 않는 성분, 또는 먼지 입자를 제거하고/하거나 바람직한 성분의 농도를 증가시키기 위해 기질을 처리하거나 스크럽하거나 여과하는 것이 바람직할 수 있다.
소정의 구현예에서, 발효는 탄수화물 기질, 예컨대 당, 전분, 섬유질, 리그닌, 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스의 부재 하에 수행된다.
일부 구현예에서, CO 및 H2로부터 에틸렌 글리콜(MEG)로의 전반적인 에너지론은 하기 제시된 바와 같이 글루코스로부터 에틸렌 글리콜로의 것들에 비해 바람직하며, 여기서, CO 및 H2에 대한 더 음성의 깁스 자유 에너지, ΔrG'm 값은 에틸렌 글리콜로의 더 큰 구동력을 나타낸다. 기질로서 글루코스 대 CO의 비교를 위한 전반적인 반응 델타 G의 계산은 평형 장치(equilibrator)(http://equilibrator.weizmann.ac.il/)를 사용하여 수행되었으며, 이는 생물학적 시스템에서 경로의 전반적인 실행 가능성 또는 경로에서의 개별적인 단계를 평가하는 표준 방법이다(문헌[Flamholz, E. Noor, A. Bar-Even, R. Milo (2012) eQuilibrator - the biochemical thermodynamics calculator Nucleic Acids Res 40:D770-5; Noor, A. Bar-Even, A. Flamholz, Y. Lubling, D. Davidi, R. Milo (2012) An integrated open framework for thermodynamics of reactions that combines accuracy and coverageBioinformatics 28:2037-2044; Noor, H.S. Haraldsdottir, R. Milo, R.M.T. Fleming (2013) Consistent Estimation of Gibbs Energy Using Component Contributions PLoS Comput Biol 9(7): e1003098; Noor, A. Bar-Even, A. Flamholz, E. Reznik, W. Liebermeister, R. Milo (2014) Pathway Thermodynamics Highlights Kinetic Obstacles in Central Metabolism PLoS Comput Biol 10(2):e1003483]). 계산은 하기와 같다:
글루코스(aq) + 3 NADH(aq) 3 MEG(aq) + 3 NAD+(aq) ΔrG'm -104 kJ/mol
6 CO(aq) + 3 H2(aq) + 6 NADH(aq) 3 MEG(aq) + 6 NAD+(aq) ΔrG'm -192 kJ/mol
생리학적 조건:
글루코스(aq) + 3 NADH(aq) 3 MEG(aq) + 3 NAD+(aq) ΔrG'm -70 kJ/mol
6 CO(aq) + 3 H2(aq) + 6 NADH(aq) 3 MEG(aq) + 6 NAD+(aq) ΔrG'm -295 kJ/mol
에틸렌 글리콜, 글리옥실레이트, 및/또는 글리콜레이트 외에도, 본 개시의 미생물은 하나 이상의 공동-생성물 생성물을 생성하도록 배양될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 미생물은 에탄올(국제공개 WO 2007/117157호), 아세테이트(국제공개 WO 2007/117157호), 1-부탄올(국제공개 WO 2008/115080호, WO 2012/053905호, 및 WO 2017/066498호), 부티레이트(국제공개 WO 2008/115080호), 2,3-부탄디올(국제공개 WO 2009/151342호 및 WO 2016/094334호), 락테이트(국제공개 WO 2011/112103호), 부텐(국제공개 WO 2012/024522호), 부타디엔(국제공개 WO 2012/024522호), 메틸 에틸 케톤(2-부타논)(국제공개 WO 2012/024522호 및 WO 2013/185123호), 에틸렌(국제공개 WO 2012/026833호), 아세톤(국제공개 WO 2012/115527호), 이소프로판올(국제공개 WO 2012/115527호), 지질(국제공개 WO 2013/036147호), 3-히드록시프로피오네이트(3-HP)(국제공개 WO 2013/180581호), 테르펜, 예를 들어 이소프렌(국제공개 WO 2013/180584호), 지방산(국제공개 WO 2013/191567호), 2-부탄올(국제공개 WO 2013/185123호), 1,2-프로판디올(국제공개 WO 2014/036152호), 1-프로판올(국제공개 WO 2017/066498호), 1-헥산올(국제공개 WO 2017/066498호), 1-옥탄올(국제공개 WO 2017/066498호), 코리스메이트-유래 생성물(국제공개 WO 2016/191625호), 3-히드록시부티레이트(국제공개 WO 2017/066498호), 1,3-부탄디올(국제공개 WO 2017/066498호), 2-히드록시이소부티레이트 또는 2-히드록시이소부티르산(국제공개 WO 2017/066498호), 이소부틸렌(국제공개 WO 2017/066498호), 아디프산(국제공개 WO 2017/066498호), 1,3 헥산디올(국제공개 WO 2017/066498호), 3-메틸-2-부탄올(국제공개 WO 2017/066498호), 2-부텐-1-올(국제공개 WO 2017/066498호), 이소발레레이트(국제공개 WO 2017/066498호), 이소아밀 알코올(국제공개 WO 2017/066498호), 및/또는 모노에틸렌 글리콜(국제공개 WO 2019/126400호)에 더불어 2-페닐에탄올을 생성할 수 있거나 이를 생성하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 에틸렌 글리콜 외에도, 본 개시의 미생물은 또한, 에탄올, 2,3-부탄디올 및/또는 숙시네이트를 생성한다. 특정 구현예에서, 미생물 바이오매스 자체가 생성물로 간주될 수 있다. 이러한 생성물은 디젤, 제트 연료 및/또는 가솔린 중 적어도 하나의 성분을 제조하도록 추가로 전환될 수 있다. 특정 구현예에서, 2-페닐에탄올은 프레이그런스, 에센셜 오일, 향미료, 및 비누의 성분으로서 사용될 수 있다. 또한, 미생물 바이오매스는 임의의 방법 또는 당업계에 공지된 방법의 조합에 의해 단일 세포 단백질(SCP)을 생성하도록 추가로 가공될 수 있다. 본 개시의 미생물은 하나 이상의 표적 생성물 이외에 또한 에탄올, 아세테이트 및/또는 2,3-부탄디올을 생성할 수 있다.
"천연 생성물"은 유전적으로 비변형된 미생물에 의해 생성되는 생성물이다. 예를 들어, 에탄올, 아세테이트 및 2,3-부탄디올은 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 및 클로스트리디움 라그스달레이의 천연 생성물이다. "비-천연 생성물"은 유전적으로 변형된 미생물에 의해 생성되지만, 유전적으로 변형된 미생물이 유래되는 유전적으로 변형되지 않은 미생물에 의해서는 생성되지 않는 생성물이다. 에틸렌 글리콜은 임의의 천연-발생 미생물에 의해 생성되는 것으로 알려져 있지 않아서, 이는 모든 미생물의 비(non)-본연의 생성물이다.
"선택성"은 표적 생성물의 생성량 대 미생물에 의해 생성된 모든 발효 생성물의 생성량의 비를 지칭한다. 본 개시내용의 미생물은 특정 선택성 또는 최소 선택성으로 생성물을 생성하도록 조작될 수 있다. 일 구현예에서, 표적 생성물, 예컨대 에틸렌 글리콜은 본 개시의 미생물에 의해 생성되는 모든 발효 생성물의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50% 또는 75%를 차지한다. 일 구현예에서, 에틸렌 글리콜은 본 개시의 미생물에 의해 생성되는 모든 발효 생성물들의 적어도 약 10%를 차지하여, 본 개시의 미생물은 적어도 10%의, 에틸렌 글리콜에 대한 선택도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 에틸렌 글리콜은 본 개시의 미생물에 의해 생성되는 모든 발효 생성물들의 적어도 약 30%를 차지하여, 본 개시의 미생물은 적어도 30%의, 에틸렌 글리콜에 대한 선택도를 갖는다.
하나 이상의 발효 생성물 중 적어도 하나는 배양에 의해 생성된 바이오매스일 수 있다. 적어도 일부의 미생물 바이오매스는 단세포 단백질(SCP)로 전환될 수 있다. 적어도 일부의 단세포 단백질은 동물 사료의 성분으로서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 개시는 미생물 바이오매스 및 적어도 하나의 부형제를 포함하는 동물 사료를 제공하며, 여기에서 미생물 바이오매스는 CO, CO2, 및 H2 중 하나 이상을 포함하는 기체 기질 상에서 성장된 미생물을 포함한다.
"단세포 단백질"(SCP)은 단백질이 풍부한 인간 및/또는 동물 사료에 사용될 수 있는 미생물 바이오매스를 지칭하며, 종종 대두박 또는 어분과 같은 통상적인 단백질 보충 공급원을 대체한다. 단세포 단백질 또는 다른 생성물을 생성하기 위해, 공정은 추가의 분리, 가공, 또는 처리 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 미생물 바이오매스를 멸균하는 단계, 미생물 바이오매스를 원심분리하는 단계, 및/또는 미생물 바이오매스를 건조하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 미생물 바이오매스는 분무 건조 또는 패들 건조를 사용하여 건조한다. 방법은 또한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 미생물 바이오매스의 핵산 함량을 감소시키는 단계를 포함할 수 있는데, 이는 핵산 함량이 높은 식이 섭취가 핵산 분해 생성물의 축적 및/또는 위장 장애를 초래할 수 있기 때문이다. 단세포 단백질은 가축 또는 애완동물과 같은 동물에게 먹이기에 적합할 수 있다. 특히, 동물 사료는 하나 이상의 육우, 젖소, 돼지, 양, 염소, 말, 노새, 당나귀, 사슴, 물소/들소, 라마, 알파카, 순록, 낙타, 들소, 가얄, 야크, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 뿔닭, 스쿼브/비둘기, 어류, 새우, 갑각류, 고양이, 개 및 설치류에게 먹이기에 적합할 수 있다. 동물 사료의 조성은 다양한 동물의 영양 요건에 맞게 조정될 수 있다. 또한, 공정은 미생물 바이오매스를 하나 이상의 부형제와 블렌딩하거나 또는 조합하는 단계를 포함할 수 있다.
"미생물 바이오매스"는 미생물 세포를 포함하는 생물학적 물질을 지칭한다. 예를 들어, 미생물 바이오매스는 박테리아, 고세균, 바이러스 또는 진균의 순수하거나 실질적으로 순수한 배양물을 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다. 발효 브로쓰로부터 처음 분리될 때, 미생물 바이오매스는 일반적으로 많은 양의 물을 포함한다. 이 물은 미생물 바이오매스를 건조 또는 가공함으로써 제거되거나 감소될 수 있다.
"부형제"는 동물 사료의 형태, 특성 또는 영양 함량을 향상시키거나 변경하도록 미생물 바이오매스에 첨가될 수 있는 임의의 물질을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 부형제는 탄수화물, 섬유, 지방, 단백질, 비타민, 미네랄, 물, 향료, 감미료, 항산화제, 효소, 보존제, 프로바이오틱 또는 항생제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 건초, 짚, 사일리지, 곡물, 오일 또는 지방, 또는 다른 식물성 물질일 수 있다. 부형제는 Chiba, 섹션 18에서 식별된 임의의 공급 성분일 수 있다: 식이 제형 및 공통 섭식 성분, 동물 영양 핸드북, 제3 개정판, 575-633p, 2014.
"바이오폴리머"는 살아있는 유기체의 세포에 의해 생성된 천연 중합체를 지칭한다. 소정의 구현예에서, 바이오폴리머는 PHA이다. 소정의 구현예에서, 바이오폴리머는 PHB이다.
"바이오플라스틱"은 재생 가능한 바이오매스 공급원으로부터 생성된 플라스틱 재료를 지칭한다. 바이오플라스틱은 식물성 지방 및 오일, 옥수수 전분, 짚, 우드칩, 톱밥, 또는 재활용 음식 쓰레기와 같은 재생 가능한 공급원으로부터 생성될 수 있다.
본원에서, 산(예를 들어, 아세트산 또는 2-하이드록시이소부티르산)에 대한 지칭은 또한, 상응하는 염(예를 들어, 아세테이트 또는 2-하이드록시이소부티레이트)을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
통상적으로, 배양은 바이오리액터에서 수행된다. 용어 "바이오리액터"는 하나 이상의 용기, 탑, 또는 배관 구성으로 이루어진 배양/발효 장치, 예를 들어 연속 교반식 탱크 반응기(CSTR: continuous stirred tank reactor), 고정화 세포 반응기(ICR: immobilized cell reactor), 살수층 반응기(TBR: trickle bed reactor), 버블 컬럼(bubble column), 가스 리프트 발효조(gas lift fermenter), 정적 혼합기(static mixer), 또는 기액 접촉에 적합한 다른 용기 또는 다른 장치를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이오리액터는 제1 성장 반응기 및 제2 배양/발효 반응기를 포함할 수 있다. 기질은 이들 반응기 중 하나 또는 둘 모두에 제공될 수 있다. 본원에서, 용어 "배양" 및 "발효"는 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 배양/발효 공정의 성장 단계 및 생성물 생합성 단계 둘 모두를 포함한다.
배양물은 일반적으로 미생물이 성장하도록 하기에 충분한 영양분, 비타민 및/또는 미네랄을 함유하는 수성 배양 배지에서 유지된다. 바람직하게는, 수성 배양 배지는 혐기성 미생물 성장 배지, 예를 들어 최소 혐기성 미생물 성장 배지이다. 적합한 배지는 당업계에 널리 공지되어 있다.
배양/발효는 바람직하게는, 에틸렌 글리콜의 생성을 위한 적절한 조건 하에 수행되어야 한다. 필요한 경우, 배양/발효는 혐기성 조건 하에 수행된다. 고려해야 할 반응 조건은 압력(또는 분압), 온도, 가스 유량, 액체 유량, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, 교반 속도(연속 교반식 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종원 수준, 액상 중의 가스를 제한하지 않는 최대 기체 기질 농도, 및 제품 억제를 회피하기 위한 최대 제품 농도를 포함한다. 특히, 기질의 도입 속도는 액체상 내 가스의 농도가 제한적으로 되지 않도록 보장하기 위해 제어될 수 있다.
상승된 압력에서 바이오리액터를 작동하면 가스 상태에서 액체 상태로의 가스 물질 전달 속도가 증가한다. 따라서, 대기압보다 높은 압력에서 배양/발효를 수행하는 것이 일반적으로 바람직하다. 또한, 주어진 가스 변환 속도가, 부분적으로는, 기질 체류 시간의 함수이며, 체류 시간에 따라 바이오리액터의 소요 부피가 달라지므로, 가압 시스템을 이용하면 바이오리액터에 필요한 부피를 크게 줄일 수 있고, 결과적으로 배양/발효 장비의 투자비를 줄일 수 있다. 이는, 결과적으로는, 바이오리액터의 액체 부피를 유입 가스 유량으로 나눈 값으로 정의되는 체류 시간이 바이오리액터가 대기압보다 높은 압력에서 유지될 때 감소될 수 있다는 것을 의미한다. 최적 반응 조건은 부분적으로는 사용되는 특정 미생물에 따라 달라질 것이다. 그러나, 일반적으로는, 대기압보다 높은 압력에서 발효를 진행하는 것이 바람직하다. 또한, 주어진 가스 전환 속도가 부분적으로는 기질 체류 시간의 함수이고 요망되는 체류 시간을 달성하는 것이 다시 말해 바이오리액터의 필요한 시간을 나타내기 때문에, 가압된 시스템의 사용은 필요한 바이오리액터의 부피, 결과적으로 발효 장비의 자본 비용을 크게 감소시킬 수 있다.
특정한 구현예에서, 발효는 광의 부재 하에, 또는 광합성 미생물의 에너지 요건을 충족시키기에 불충분한 양의 광의 존재 하에 수행된다. 특정한 구현예에서, 본 개시내용의 미생물은 비-광합성 미생물이다.
표적 생성물은, 예를 들어 분별 증류, 증발, 투과증발, 가스 스트리핑, 상 분리, 및 예를 들어 액-액 추출을 포함하는 추출 발효를 포함하는 당업계에 알려진 임의의 방법 또는 방법의 조합을 사용하여 발효 브로쓰로부터 분리하거나 정제할 수 있다. 특정 구현예에 있어서, 표적 생성물은 발효 브로쓰의 일부를 생물반응기로부터 연속적으로 제거하여 미생물 세포를 상기 브로쓰로부터 (편리하게는 여과에 의해) 분리하고 1종 이상의 표적 생성물을 상기 브로쓰로부터 회수함으로써 발효 브로쓰로부터 회수된다. 알코올 및/또는 아세톤은, 예를 들어, 증류에 의해 회수될 수 있다. 산은, 예를 들어, 활성탄 상에 흡착시킴으로써 회수될 수 있다. 분리된 미생물 세포는 바람직하게는 바이오리액터로 돌아간다. 대표적 생성물이 제거된 후 남은 무세포 투과액은 또한 바람직하게는 바이오리액터로 되돌아간다. 바이오리액터로 되돌려지기 전에, 추가 영양소(예를 들어, 비타민 B)가 배지를 보충하기 위해 무세포 투과액에 첨가될 수 있다. 정제 기술은 친화도 태그 정제(예: His, Twin-Strep, 및 FLAG), 비드 기반 시스템, 팁 기반 접근법, 및 대규모의 자동화된 정제를 위한 FPLC 시스템을 포함할 수 있다. 친화도 태그에 의존하지 않는 정제 방법(예를 들어, 염화, 이온 교환, 및 크기 배제)이 또한 개시된다.
본 개시의 방법은 에틸렌 글리콜을 발효 브로쓰(broth)로부터 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 에틸렌 글리콜은 예를 들어, 증류, 모사 이동상(simulated moving bed) 과정, 막 처리, 증발, 투과증발(pervaporation), 가스 탈리(gas stripping), 상분리, 이온 교환, 또는 예를 들어 액체-액체 추출을 포함한 추출 발효를 포함하는 당업계에 알려진 임의의 방법 또는 방법들의 조합을 사용하여 발효 브로쓰로부터 분리 또는 정제될 수 있다. 일 구현예에서, 에틸렌 글리콜은 역삼투 및/또는 투과증발을 사용하여 발효 브로쓰로부터 농축될 수 있다(US 5,552,023). 물은 증류에 의해 제거될 수 있고, 그 후에 하부(bottom)(높은 비율의 에틸렌 글리콜을 함유함)는 증류 또는 진공 증류에 의해 회수되어 고순도의 에틸렌 글리콜 스트림을 생성할 수 있다. 대안적으로, 역삼투 및/또는 투과증발에 의한 농축과 함께 또는 없이, 에틸렌 글리콜은 알데하이드(문헌[Atul, Chem Eng Sci, 59: 2881-2890, 2004])와의 반응성 증류 또는 탄화수소(US 2,218,234)를 사용한 공비 증류에 의해 추가로 정제될 수 있다. 또 다른 접근법에서, 에틸렌 글리콜은 (역삼투 및/또는 투과증발과 함께 또는 없이) 수용액으로부터 활성탄 또는 중합체 흡착제 상에 포획(trap)되고, 저비점 유기 용매를 사용하여 회수될 수 있다(문헌[Chinn, Recovery of Glycols, Sugars, and Related Multiple -OH Compounds from Dilute-Aqueous Solution by Regenerable Adsorption onto Activated Carbons, University of California Berkeley, 1999]). 그 후에, 에틸렌 글리콜은 유기 용매로부터 증류에 의해 회수될 수 있다. 소정의 구현예에서, 에틸렌 글리콜은 발효 브로쓰의 일부를 생물반응기로부터 연속적으로 제거하며 미생물 세포를 상기 브로쓰로부터 (편리하게는 여과에 의해) 분리하고 에틸렌 글리콜을 상기 브로쓰로부터 회수함으로써 발효 브로쓰로부터 회수된다. 공동-생성물, 예컨대 알코올 또는 산은 또한, 브로쓰로부터 분리 또는 정제될 수 있다. 알코올은, 예를 들어, 증류에 의해 회수될 수 있다. 산은, 예를 들어, 활성탄 상에 흡착시킴으로써 회수될 수 있다. 분리된 미생물 세포는 소정의 구현예에서 생물반응기로 되돌려질 수 있다. 표적 생성물이 제거된 후 잔류하는 세포-무함유 침투물 또한 바람직하게는 생물반응기로 전부 또는 일부 되돌려진다. 바이오리액터로 되돌려지기 전에, 추가 영양소(예를 들어, 비타민 B)가 배지를 보충하기 위해 무세포 투과액에 첨가될 수 있다.
수성 배지로부터 디올의 회수는 많은 방식으로 실증되어 왔다. 모사 이동상(SMB) 기술은 에탄올과 연관된 옥시게네이트의 수성 혼합물로부터 2,3-부탄디올을 회수하는 데 사용되어 왔다(미국 특허 제8,658.845호). 반응성 분리 또한, 효과적인 디올 회수에 대해 실증되어 왔다. 일부 구현예에서, 에틸렌 글리콜의 회수는 디올-함유 스트림과 알데하이드의 반응, 상기 디올의 분획화 및 재생, 농축된 디올 스트림을 회수하기 위한 최종 분획화에 의해 수행된다. 예를 들어, 미국 특허 제7,951,980호를 참조한다.
본 개시는 본원에 기술된 미생물에 의해 본 방법에 따라 생성된 에틸렌 글리콜을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 에틸렌 글리콜을 포함하는 조성물은 부동제, 보존제, 탈수제 또는 드릴링액일 수 있다.
본 개시는 또한, 본원에 기술된 미생물에 의해 본 방법에 따라 생성된 에틸렌 글리콜을 포함하는 중합체를 제공한다. 이러한 중합체는 예를 들어, 동종중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 공중합체, 예컨대 폴리에틸렌 테레프탈레이트일 수 있다. 이들 중합체의 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Herzberger등의, Chem Rev, 116(4): 2170-2243 (2016) 및 Xiao 등의, Ind Eng Chem Res. 54(22): 5862-5869 (2015)]를 참조한다. 　
본 개시는 본원에 기술된 미생물에 의해 본 방법에 따라 생성된 에틸렌 글리콜을 포함하는 중합체를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 예를 들어, 상기 조성물은 섬유, 수지, 필름 또는 플라스틱일 수 있다.
일 구현예는, 디올 탈수효소를 암호화하는 유전자에서의 교란적 돌연변이를 포함하는 기체 기질로부터 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜의 전구체를 생성할 수 있는 유전적으로 조작된 미생물에 관한 것이다.
일 구현예에 따른 미생물은 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트, 옥살로아세테이트, 구연산염, 말산염 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중간체를 통해 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 전구체를 생성한다.
구현예 중 어느 하나에서, 미생물은 다음 중 하나 이상을 포함하는 미생물:
a.옥살로아세테이트를 구연산염으로 변환할 수 있는 이종 효소를 암호화하는 핵산;
b.글리신 을 글리옥실레이트로 변환할 수 있는 이종 효소를 암호화하는 핵산;
c. 이소-구연산염을 글리옥실레이트로 변환할 수 있는 이종 효소를 암호화하는 핵산; 및
d.글리콜레이트 를 글리콜알데히드로 변환할 수 있는 이종 효소를 암호화하는 핵산을 포함한다.
일 구현예에 있어서,
a.옥살로아세테이트 를 구연산염으로 변환할 수 있는 이종 효소는 EC 번호 2.3.3.1을 갖는 구연산염 [Si]-합성효소, EC 번호 2.3.3.8을 갖는 ATP 구연산염 합성효소; 또는 EC 번호 2.3.3.3을 갖는 구연산염 (Re)-합성효소이고;
b.글리신 을 글리옥실레이트로 전환할 수 있는 이종 효소는 EC 번호 2.6.1.44를 갖는 알라닌-글리옥실레이트 트랜스아미나제, EC 번호 2.6.1.45를 갖는 세린-글리옥실레이트 트랜스아미나제, EC 번호 2.6.1.51의 세린-피부르산염 트랜스아미나제, EC 번호 2.6.1.35의 글리신-옥살로아세테이트 트랜스아미나제, EC 번호 2.6.1.4의 글리신 트랜스아미나제, EC 번호 1.4.1.10의 글리신 디하이드로게나제, EC 번호 1.4.1.1을 갖는 알라닌 탈수소효소, 또는 EC 번호 1.4.2.1을 갖는 글리신 탈수소효소이고;
c. 이소-구연산염을 글리옥실레이트로 전환할 수 있는 이종 효소는 EC 번호 4.1.3.1을 갖는 이소구연산염 분해효소(lyase)이며; 및/또는
d.글리콜레이트 를 글리콜알데히드로 변환할 수 있는 EC 번호 1.2.1.21을 갖는 글리콜알데히드 탈수소효소, EC 번호 1.2.1.22를 갖는 락트알데히드 탈수소효소, EC 번호 1.2.1.24를 갖는 숙시네이트-세미알데히드 탈수소효소, EC 번호 1.2.1.26을 갖는 2,5-디옥소발레레이트 탈수소효소, EC 번호 1.2.1.3/4/5를 갖는 알데히드 탈수소효소, EC 번호 1.2.1.8을 갖는 베타인-알데히드 탈수소효소, 또는 EC 번호 1.2.7.5를 갖는 알데히드 페레독신 산화환원효소이다.
제3항에 있어서, 하나 이상의 이종 효소는 바실러스(Bacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 에스케리키아(Escherichia), 글루코노박터(Gluconobacter), 하이포미크로비움(Hyphomicrobium), 리시니바실러스(Lysinibacillus), 패니바실러스(Paenibacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 세디멘티콜라(Sedimenticola), 스포로사르치나(Sporosarcina), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 테르미티오바실러스(Thermithio), 테르모토가(Thermotoga) ,쿠프리아비두스(Cupriavidus) 및 제아(Zea)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속(genus)으로부터 유래된다.
일 구현예에 따른 미생물은, 하나 이상의 이종 효소는 상기 미생물에서 발현을 위해 코돈-최적화 (codon-optimized)된다.
일 구현예에 따른 미생물은, 상기 미생물은 아세틸-CoA를 피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; 피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환할 수 있는 효소; 피부르산염을 말산염으로 전환할 수 있는 효소; 피부르산염을 포스페놀피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; 옥살로아세테이트를 시트릴-CoA로 전환할 수 있는 효소; 시트릴-CoA를 구연산염으로 전환할 수 있는 효소; 구연산염을 아코니테이트로 전환하고 아코니테이트를 이소-구연산염으로 전환할 수 있는 효소; 포스포에놀피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환할 수 있는 효소; 포스포에놀피부르산염을 2-포스포-D-글리세레이트로 전환할 수 있는 효소; 2-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포-D-글리세레이트로 전환할 수 있는 효소; 3-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포노옥시피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; 3-포스포노옥시피부르산염을 3-포스포-L-세린으로 전환할 수 있는 효소; 3-포스포-L-세린을 세린으로 전환할 수 있는 효소; 세린을 글리신으로 전환할 수 있는 효소; 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트를 글리신으로 전환할 수 있는 효소; 세린을 하이드록시피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; D-글리세레이트를 하이드록시피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; 말산염을 글리옥실레이트로 전환할 수 있는 효소; 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환할 수 있는 효소; 하이드록시피부르산염을 글리콜알데하이드로 전환할 수 있는 효소; 및 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환할 수 있는 효소 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
일 구현예에 있어서, 상기 미생물은 다음을 과발현하는 미생물:
a. 옥살로아세테이트를 구연산염으로 전환할 수 있는 이종 효소;
b. 글리신을 글리옥실레이트로 전환할 수 있는 이종 효소; 및/또는
c. 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환할 수 있는 이종 효소.
일 구현예에 있어서, 상기 미생물은 다음을 과발현하는 미생물:
a. 피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환할 수 있는 효소;
b. 구연산염을 아코니테이트로 전환하고 아코니테이트를 이소-구연산염으로 전환할 수 있는 효소;
c. 포스포에놀피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환할 수 있는 효소;
d. 세린을 글리신으로 전환할 수 있는 효소;
e. 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트를 글리신으로 전환할 수 있는 효소;
f. 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환할 수 있는 효소; 및/또는
g. 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환할 수 있는 효소.
상기 미생물은 이소구연산염 탈수소효소, 글리세레이트 탈수소효소, 글리콜레이트 탈수소효소, 글리세레이트 탈수소효소, 글리콜레이트 탈수소효소, 알데하이드 페레독신 옥시도리덕타제 및 알데하이드 탈수소효소 중 하나 이상에서 교란적 돌연변이(disruptive mutation)를 추가로 포함하는, 미생물.
일 구현예에 따른 미생물에서, 미생물은 아세토박테리움, 알칼리바쿨룸, 블라우티아, 부티리박테리움, 클로스트리디움, 쿠프리아비두스, 유박테리움, 무렐라, 옥소박터, 스포로무사 및 써모아나에로박터로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 구성원이다.
일 구현예에 따른 미생물에서, 상기 미생물은 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 박키이(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리디움 아우토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 코스카티이(Clostridium coskatii), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 마그눔(Clostridium magnum), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 쿠프리아비두스 네카토르 (Cupriavidus necator), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 무렐라 테르마우토트로피카(Moorella thermautotrophica), 무렐라 테르모아세티카(Moorella thermoacetica), 옥소박터 펜니기이(Oxobacter pfennigii), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스패로이데스(Sporomusa sphaeroides)및 테르모아내로박터 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)로 이루어진 군으로부터 선택된 부모 미생물로부터 유래되는, 미생물.
일 구현예에 따른 미생물에서, 상기 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 및 클로스트리디움 라그스달레이로 이루어진 군으로부터 선택된 부모 미생물로부터 유래된다.
일 구현예에 따른 미생물에서, 상기 미생물은 본연의(native) 또는 이종 우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 경로를 포함한다.
일 구현예에 따른 미생물에서, 상기 에틸렌 글리콜 전구체는 글리옥실레이트 또는 글리콜레이트이다.
또 다른 구현예는 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜의 전구체를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 기체 기질의 존재하에 영양 배지에서 제1항의 미생물을 배양하고, 이에 의해 미생물이 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜의 전구체를 생산하는 단계를 포함한다.
일 구현예의 방법은, 상기 기체 기질은 CO, CO2,및 H2 중 하나 이상을 포함한다.
일 구현예의 방법은, 상기 에틸렌 글리콜 전구체는 글리옥실레이트 또는 글리콜레이트이다.
일 구현예의 방법은, 상기 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 전구체를 영양 배지로부터 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예의 방법은, 미생물은 에탄올, 2,3-부탄디올 및 숙시네이트 중 하나 이상을 추가로 생성한다.
또 다른 구현예는 기체 기질로부터 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 생성물을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 1) 적어도 하나의 PET 성분을 형성하는 단계로서, 적어도 하나의 PET 성분은 모노에틸렌 글리콜(MEG), 테레프탈산(PTA), 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 단계; 2) 적어도 하나의 PET 성분을 PET로 가공하는 단계; 3) PET를 중합하여 PET 수지를 형성하는 단계; 및 4) PET 수지를 PET 생성물로 가공하는 단계를 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용을 추가로 예시하지만, 당연하게도, 본 개시의 범위를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
실시예 1: 클로스트리듐 아우토에타노게눔에서 CO 및/또는 CO 2 및 H 2 로부터 에틸렌 글리콜의 생성을 위해, 고초균 구연산염 합성효소, 대장균 이소구연산염 분해효소, 및 글로코노박터 옥시단스 글리콜알데하이드 탈수소효소를 포함하는 이종 발현 벡터의 작제
고초균으로부터의 구연산염 합성효소(citZ; 서열번호: 1-2), 대장균 유래의 이소구연산염 분해효소(icl; 서열번호: 11-12), 및 글로코노박터 옥시단스로부터의 글리콜알데하이드 탈수소효소(aldA1; 서열번호: 55-56)를 암호화하는 유전자를 클로스트리듐 아우토에타노게눔에서의 발현을 위해 코돈-적응시키고 합성하였다. 적응된 유전자를 표준 BsaI 골든 게이트 클로닝 키트(New England Biolabs, Ipswich, MA)를 사용하여 발현 셔틀 벡터 pIPL12에 클로닝했다. pIPL12는 대장균과 클로스트리듐 아우토에타노게눔 모두에 대한 복제 원점을 포함함으로써, 두 종 모두에서 복제 및 유지가 가능하고; pIPL12는 대부분의 클로스트리듐 강에서도 기능한다. pIPL12는 양성 선택을 위한 에리쓰로마이신/클라리스로마이신 저항성을 부여하는 23S rRNA(아데닌(2058)-N(6))-메틸트랜스퍼라제 Erm(B), 대장균 유래의 접합 전달을 위한 TraJ 및 이종 유전자의 발현을 위한 프로모터를 추가로 포함한다. 도 2a를 참조한다. pIPL12 내로의 citZ, icl, 및 aldA1의 클로닝 후 생성되는 발현 벡터는 본원에서 pMEG042로 지칭된다(도 2b).
pMEG042 발현 벡터를 작제하는 데 사용되는 올리고
서열 번호 명칭 서열
69 pIPL12-bb-F CACACCAGGTCTCAAACCATGGAGATCTCGAGGCCTG
70 pIPL12-bb-R CACACCAGGTCTCACATATGATAAGAAGACTCTTGGC
71 citZ_Bs1-F CACACCAGGTCTCACATATGACAGCAACAAGGGGCC
72 citZ_Bs1-R CACACCAGGTCTCAATTGTAACACCTCCTTAATTAGTTATGCTCTTTCTTCTATAGGTACAAATTTTTG
73 Icl_Ec-F CACACCAGGTCTCACAATGAAAACAAGAACTCAACAAATAG
74 Icl_Ec-R CACACCAGGTCTCAGTGTTCCTCCTATGTGTTCTTAAAATTGAGATTCTTCAGTTGAACCTG
75 aldA1_Go-F CACACCAGGTCTCAACACATATGACTGAAAAAAATAATTTATTCATAAATGGATC
76 aldA1_Go-R CACACCAGGTCTCAGGTTATGCATTTAGATATATTGTTTTTGTCTGTACG
pMEG042 작제물을 컨쥬게이션을 통해 클로스트리듐 아우토에타노게눔 내로 형질전환하였다. 발현 벡터를 우선, 표준 열 충격 형질전환을 사용하여 접합성 공여체 균주, 대장균 HB101+R702(CA434)(Williams 등 1990)(공여체) 내로 도입하였다. 공여체 세포를 37℃에서 1시간 동안 SOC 배지로 회수한 후, 100 μg/mL 스펙티노마이신(spectinomycin) 및 500 μg/mL 에리트로마이신을 포함하는 LB 배지 플레이트 상으로 평판배양하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 100 μg/mL 스펙티노마이신 및 500 μg/mL 에리트로마이신을 포함하는 5 mL LB 분취액을 몇몇 공여체 콜로니에 접종하고, 37℃에서 쉐이킹(shaking)하면서 대략 4시간 동안 또는 배양물이 시각적으로 빽빽(dense)하지만 아직까지는 정지기(stationary phase)에 도달하지 않았을 때까지 인큐베이션하였다. 1.5 mL의 기증자 배양물을 4000 rpm 및 20-25°C에서 2분간 원심분리하여 수집하고 상층액을 버렸다. 공여체 세포를 500 μL 멸균 PBS 완충제에서 부드럽게 재현탁시키고, 4000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, PBS 상층액을 폐기하였다.
펠렛을 혐기성 챔버 내로 도입하고, 클로스트리듐 아우토에타노게눔 배양물(수혜물)의 후기 지수성장기(late exponential phase) 동안 200 μL에서 부드럽게 재현탁시켰다. 클로스트리듐 아우토에타노게눔 DSM10061 및 DSM23693(DSM10061의 유도체)을 DSMZ로부터 공급받았다(독일 미생물 및 세포 배양물 컬렉션(The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures), 독일 38124 브라운슈바이크 인호펜스트라쎄 7 B 소재). 균주를 표준 혐기성 기법(Hungate 1969; Wolfe 1971)을 사용하여 pH 5.6에서 37℃에서 PETC 배지(미국 특허 제9,738,875호 참조)에서 성장시켰다.
컨쥬게이션 혼합물(공여체 세포와 수혜물 세포의 믹스(mix))을 PETC-MES + 프룩토스 한천 플레이트 상으로 스폿(spot)하고, 건조하였다. 스폿이 더 이상 시각적으로 젖어있지 않았을 때, 플레이트를 압력병(pressure jar) 내로 도입하고, 합성 가스(50% CO, 10% N2, 30% CO2, 10% H2)로 25 내지 30 psi까지 가압하고, 37℃에서 약 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 컨쥬게이션 혼합물을 10 μL 접종 루프를 사용한 부드러운 스크래핑(scraping)에 의해 플레이트로부터 제거하였다. 제거된 혼합물을 200-300 μL PETC 배지에 현탁시켰다. 컨쥬게이션 혼합물의 100 μL 분취액을 5 μg/mL 클래리스로마이신이 보충된 PETC 배지 한천 플레이트 상으로 평판배양하여, 플라스미드를 갖고 있는 형질전환체를 선별하였다.
pMEG042 플라스미드를 갖고 있는 클로스트리듐 아우토에타노게눔의 3개의 구별되는 콜로니를 5 μg/mL 클래리스로마이신과 함께 2 mL의 PETC-MES 배지에 접종하고, 50% CO, 10% N2, 30% CO2, 10% H2와 함께 37℃에서 100 rpm 오비탈 쉐이킹하면서 3일 동안 독립영양적으로 성장시켰다. 배양물을 혈청병(serum bottle)에서 5 μg/mL 클래리스로마이신과 함께 10 mL PETC-MES 배지에서 0.05의 OD600까지 희석시키고, 50% CO, 10% N2, 30% CO2, 10% H2와 함께 37℃에서 100 rpm 오비탈 쉐이킹하면서 20일 이하 동안 독립영양적으로 성장시켜, 매일 샘플링하여 바이오매스 및 대사물을 측정하였다(도 3a 및 도 3b). 하기 기술된 바와 같이, 에틸렌 글리콜의 생성을 가스 크로마토그래피 질량 분광법(GC-MS)을 사용하여 측정하고, 다른 대사물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 측정하였다.
에틸렌 글리콜 농도를 Agilent VF-WAXms 컬럼(15 m Υ 0.25 μm Υ 0.25 μm) 및 RSH 자동시료화기(autosampler)가 장착된 Thermo Scientific ISQ LT GCMS로 측정하였다. 200 μL의 브로쓰를 200 μL의 메탄올로 희석시킴으로써 시료를 제조하였다. 상기 시료를 보텍스(vortex)한 다음, 14,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하였고; 200 μL의 상층액을 인서트(insert)와 함께 유리 바이얼로 옮겼다. 샘플을 1.0 μL 주입, 5:1의 분할 비율, 및 240°C의 유입구 온도를 사용하여 분석을 위해 자동샘플러로 옮겼다. 크로마토그래피는 80℃의 오븐 프로그램으로 수행하였고, 0.5분 동안 10℃/분의 램프에서 150℃까지, 25℃/분의 램프에서 220℃까지, 3분 동안 최종 유지하였다. 컬럼 유속은 0.5분 유지와 함께 4.0 mL/분이었고, 그 후에 헬륨을 담체 가스로 사용하여 100 mL/분/분의 속도로 1.5 mL/분까지 하락하였다. MS 이온 공급원을 240℃로 설정된 전달 라인으로 260℃로 유지하였다. 정량화 피크로서 33.0 m/z 및 확인 피크로서 31.0 + 62.0 m/z를 사용하는 선형 외부 표준 교정을 사용하여 정량화를 수행하였다.
에탄올, 아세테이트, 2,3-부탄디올, 글리옥실레이트, 및 글리콜레이트 농도를 35℃에서 굴절률(RI) 검출과 함께 Agilent 1260 Infinity LC 상에서 HPLC에 의해 측정하였다. 　 시료를 80℃에서 5분 동안 가열한 후, 14,000 rpm에서 3분간의 원심분리에 의해 제조하였고; 상층액을 분석용 유리 바이얼로 옮겼다. 등용매(isocratic) 조건 하에 5 mM 황산 이동상을 사용하여 0.7 mL/분 및 35℃에서 Phenomenex RezexTM ROA-Organic Acid H+(8%) 컬럼(300 mm x 7.8 mm x 8 μm) 상으로 10 μL 주입과 함께 분리를 수행하였다.
대략 3일의 독립영양적 성장 후, 에틸렌 글리콜 전구체 글리콜레이트가 관찰되었고, 10일 후, 에틸렌 글리콜의 생성이 관찰되었다(도 3b). 독립영양적으로 성장하고 발현 벡터 pMEG042를 갖는 클로스트리듐 아우토에타노게눔에서 시간 경과에 따라 생성되는 글리콜레이트를 보여준다 (도 3c).
실시예 2: 클로스트리듐 아우토에타노게눔에서 CO 및/또는 CO 2 및 H 2 로부터 에틸렌 글리콜의 생성을 위한, 에스. 티오타우리니 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제 및 피. 플루오레센스 알데하이드 탈수소효소를 포함하는 이종 발현 벡터의 작제.
에스. 티오타우리니로부터의 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제(pucG; 서열번호: 15-16) 및 피. 플루오레센스로부터의 알데하이드 탈수소효소Q8r1-96(aldA1; 서열번호: 57-58)를 암호화하는 유전자를 클로스트리듐 아우토에타노게눔에서 발현을 위해 코돈-적응시키고 합성하였다. 코돈-적응된 유전자를 pIPL12 내로 클로닝하고(도 2a), 생성된 발현 벡터, pMEG058를 실시예 1에 기술된 바와 같이 클로스트리듐 아우토에타노게눔 내로 도입하였다. 도 2c를 참조한다.
pMEG058 발현 벡터를 작제하는 데 사용되는 올리고
서열 번호 명칭 서열
69 pIPL12-bb-F CACACCAGGTCTCAAACCATGGAGATCTCGAGGCCTG
70 pIPL12-bb-R CACACCAGGTCTCACATATGATAAGAAGACTCTTGGC
77 PucG_Sthi1-F CACACCAGGTCTCACATATGCAATTTAGGCCTTTTAATCCACCA
78 PucG_Sthi1-R CACACCAGGTCTCAGTGTTCCTCCTATGTGTTCTTATGCTTGCGCAAGTGCCT
79 aldA1_Pfq8-F CACACCAGGTCTCAACACATATGTCTTCAGTGCCTGTATTCCAG
80 aldA1_Pfq8-R CACACCAGGTCTCAGGTTAAGACTGGAGATATACTGCATGAG
실시예 1에 기술된 바와 같이, pMEG058 플라스미드를 갖고 있는 클로스트리듐 아우토에타노게눔의 2개의 구별되는 콜로니를 5 μg/mL 클래리스로마이신과 함께 2 mL의 PETC-MES 배지에 접종하고, 독립영양적으로 성장시켰다. 도 4a를 참조한다. 대략 3일의 독립영양적 성장 후, 글리콜레이트가 관찰되었고, 8일 후, 에틸렌 글리콜의 생성이 관찰되었다(도 4b).
실시예 3: 클로스트리듐 아우토에타노게눔에서 CO 및/또는 CO 2 및 H 2 로부터 에틸렌 글리콜의 생성을 위한, 에스. 티오타우리니 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제 및 글로코노박터 옥시단스 글리콜알데하이드 탈수소효소를 포함하는 이종 발현 벡터의 작제.
에스. 티오타우리니로부터의 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제(pucG; 서열번호: 15-16) 및 글로코노박터 옥시단스로부터의 글리콜알데하이드 탈수소효소(aldA1; 서열번호: 55-56)를 암호화하는 유전자를 클로스트리듐 아우토에타노게눔에서 발현을 위해 코돈-적응시키고 합성하였다. 코돈-적응된 유전자를 pIPL12 내로 클로닝하고(도 2a), 생성된 발현 벡터, pMEG059를 실시예 1에 기술된 바와 같이 클로스트리듐 아우토에타노게눔 내로 도입하였다. 도 2d를 참조한다.
pMEG059 발현 벡터를 작제하는 데 사용되는 올리고
서열 번호 명칭 서열
69 pIPL12-bb-F CACACCAGGTCTCAAACCATGGAGATCTCGAGGCCTG
70 pIPL12-bb-R CACACCAGGTCTCACATATGATAAGAAGACTCTTGGC
77 PucG_Sthi1-F CACACCAGGTCTCACATATGCAATTTAGGCCTTTTAATCCACCA
78 PucG_Sthi1-R CACACCAGGTCTCAGTGTTCCTCCTATGTGTTCTTATGCTTGCGCAAGTGCCT
75 aldA1_Go-F CACACCAGGTCTCAACACATATGACTGAAAAAAATAATTTATTCATAAATGGATC
76 aldA1_Go-R CACACCAGGTCTCAGGTTATGCATTTAGATATATTGTTTTTGTCTGTACG
실시예 1에 기술된 바와 같이, pMEG059 플라스미드를 갖고 있는 클로스트리듐 아우토에타노게눔의 2개의 구별되는 콜로니를 5 μg/mL 클래리스로마이신과 함께 2 mL의 PETC-MES 배지에 접종하고, 독립영양적으로 성장시켰다. 도 5a를 참조한다. 대략 3일의 독립영양적 성장 후, 글리콜레이트가 관찰되었고, 10일 후, 에틸렌 글리콜의 생성이 관찰되었다(도 5b).
실시예 4: 클로스트리듐 아우토에타노게눔에서 CO 및/또는 CO 2 및 H 2 로부터 에틸렌 글리콜의 생성을 위한, 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제 및 알데하이드 탈수소효소를 포함하는 이종 발현 벡터의 작제.
씨. 악시두리치로부터의 부류 V 아미노트랜스퍼라제(SgA; 서열번호: 19, 20)및 피. 플루오레센스로부터의 알데하이드 탈수소효소Q8r1-96(aldA1; 서열번호: 57-58)를 암호화하는 유전자를 클로스트리듐 아우토에타노게눔에서 발현을 위해 코돈-적응시키고 합성하였다. 코돈-적응된 유전자를 pIPL12 내로 클로닝하고(도 2a), 생성된 발현 벡터, pMEG061을 실시예 1에 기술된 바와 같이 클로스트리듐 아우토에타노게눔 내로 도입하였다. 도 2e를 참조한다.
pMEG061 발현 벡터를 작제하는 데 사용되는 올리고
서열 번호 명칭 서열
69 pIPL12-bb-F CACACCAGGTCTCAAACCATGGAGATCTCGAGGCCTG
70 pIPL12-bb-R CACACCAGGTCTCACATATGATAAGAAGACTCTTGGC
81 SgaA_Caci1-F CACACCAGGTCTCACATATGAGAACTCCATTTATTATGAC
82 SgaA_Caci1-R CACACCAGGTCTCAGTGTTCCTCCTATGTGTTCCTAATCTACAAAGTGCTTG
79 aldA1_Pfq8-F CACACCAGGTCTCAACACATATGTCTTCAGTGCCTGTATTCCAG
80 aldA1_Pfq8-R CACACCAGGTCTCAGGTTAAGACTGGAGATATACTGCATGAG
실시예 1에 기술된 바와 같이, pMEG061 플라스미드를 갖고 있는 클로스트리듐 아우토에타노게눔의 3개의 구별되는 콜로니를 5 μg/mL 클래리스로마이신과 함께 2 mL의 PETC-MES 배지에 접종하고, 독립영양적으로 성장시켰다. 도 6a를 참조한다. 대략 3일의 독립영양적 성장 후, 글리콜레이트가 관찰되었고, 16일 후, 에틸렌 글리콜의 생성이 관찰되었다(도 6b).
실시예 5: 에틸렌 글리콜로의 상이한 경로의 최대 수율의 모델링
문헌[Marcellin, Green Chem, 18: 3020-3028, 2016]에 기술된 것과 같은 클로스트리디움 아우토에타노게눔의 게놈-규모 대사 모델을 이용하여, 에틸렌 글리콜로의 상이한 경로의 최대 수율을 예측하였다. 이종 대사 반응을 야생형 클로스트리디움 아우토에타노게눔 모델 구조에 첨가하여, 비-본연의 화합물 생성 경로의 혼입을 나타내었다. 본원에 기술된 실험 작업에 사용된 모델이 클로스트리디움 아우토에타노게눔에 기초하긴 하지만, 그 결과는, 대사에서의 유사성을 고려한다면, 다른 우드-륭달 미생물에도 적용될 것으로 합리적으로 예상될 수 있다.
솔버 인터페이스(solver interface)로서 옵트랑(optlang) 버전 1.2.3(문헌[Jensen, Optlang: An Algebraic Modeling Language for Mathematical Optimization," The Journal of Open Source Software, 2, doi:10.21105/joss.00139, 2017]) 및 최적화 솔버(optimization solver)로서 Gurobi Optimizer 버전 7.0.2와 함께 코브라피(cobrapy) 버전 0.8.2(문헌[Ebrahim., COBRApy: COnstraints-Based Reconstruction and Analysis for Python, BMC Syst Biol, 7: 74, 2013])을 사용하는 제약-기초 컴퓨터 모델링(constraint-based computational modeling) 기법 유량 균형 분석(FBA; flux balance analysis) 및 대사 조정의 선형 최소화(LMOMA; linear minimization of metabolic adjustment)를 사용하여 에틸렌 글리콜 생성을 모사하였다(문헌[Maia, Proceedings of the Genetic and Evolutionary Computation Conference Companion on - GECCO '17, New York, New York, ACM Press, 1661-1668, 2017])
모델링은 본원의 실시예 1 내지 4에 기술된 경로에 의해 0.37 mol 에틸렌 글리콜/mol CO의 예측된 수율을 드러내었다. 이는　 포도당 생성을 필요로 하는 Islam 등(Metab Eng, 41: 173-181, 2017)이 설명한 가상 경로에 의한 예측 수율의 두 배 이상이며, 가장 높은 예측 수율은 ~0.44g/에틸렌글리콜/g/CO로 ~0.18 mol 에틸렌글리콜/mol CO에 해당한다.
실시예 6: 에틸렌 글리콜 생성 및 디올 탈수효소 녹아웃
클로스트리듐 아우토에타노게눔의 2개의 상이한 유전자형의 바이오매스 수준(g 건조 세포 중량/L): 식별된 천연 디올 탈수소효소(염기)를 함유하는 것, 및 디올 탈수소효소 유전자가 결실된 것(KO). 각각의 균주는 2개의 변이체, 즉 pMEG042 발현 벡터를 갖는 변이체, 및 벡터를 갖지 않는 변이체(음성 대조군)를 갖는다. 나타낸 값은 3개의 기술적 재현의 평균으로부터 계산된다. (도 7을 참조한다). 클로스트리듐 아우토에타노게눔의 2개의 상이한 유전자형에서 시간 경과에 따라 생성된 에틸렌 글리콜(mg/L): 식별된 천연 디올 탈수소효소(염기)를 함유하는 것, 및 디올 탈수소효소 유전자가 결실된 것(KO). 각각의 균주는 2개의 변이체, 즉 pMEG042 발현 벡터를 갖는 변이체, 및 벡터를 갖지 않는 변이체(음성 대조군)를 갖는다. 나타낸 값은 3개의 기술적 재현의 평균으로부터 계산된다. 도 8a를 참조한다. 클로스트리듐 아우토에타노게눔의 상이한 유전자형에서 시간 경과에 따라 생성된 에틸렌 글리콜(mg/L/g 건조 세포 중량): 식별된 천연 디올 탈수소효소(염기)를 함유하는 것, 및 디올 탈수소효소 유전자가 결실된 것(KO). 각각의 균주는 2개의 변이체, 즉 pMEG042 발현 벡터를 갖는 변이체, 및 벡터를 갖지 않는 변이체(음성 대조군)를 갖는다. 나타낸 값은 3개의 기술적 재현의 평균으로부터 계산된다. 도 8b를 참조한다.
본원에서 인용되는 공보, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은, 각각의 참고문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참고로 포함되는 것으로 표시되고 본원에서 전문이 기술된 것과 동일한 정도로 본원에서 참고로 포함된다. 본원에서 인용된 종래 기술은 해당 종래 기술이 어떠한 국가에서도 해당 분야의 일반적이고도 공통적인 지식의 일부를 형성하는 것임을 인정하는 것이 아니며, 그렇게 간주해서도 안 된다.
본 개시내용을 기술하는 문맥에서 사용된 단수(a, an), 정관사(the), 및 기타 유사한 지시사는 (특히, 하기 청구항의 문맥에서) 본원에 달리 명시되지 않거나 문맥상 명확하게 상충되지 않는 한, 단수와 복수를 모두 가리키는 것으로 해석해야 한다. 용어 "포함하는(comprising, including)", "갖는(having)", 및 "함유하는(containing)"은, 달리 언급되지 않는 한, 개방형 용어(즉, "포함하지만, 이에 제한되지는 않는"의 의미)로 해석되어야 한다. 용어 "본질적으로 이루어진"은 조성, 공정, 또는 방법의 범위를 명시된 물질 또는 단계로 제한하거나, 또는 조성, 공정, 또는 방법의 기본적이고 새로운 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 어느 하나, 둘 모두, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은, 달리 명시되지 않는 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의 ±20%를 의미한다.
본원에서 값의 범위의 언급은 달리 본원에 표시되지 않는 한 범위 내에 해당하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 단순한 방법으로 제공하도록 단지 의도되고, 각각의 별개의 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서로 인용된다. 예를 들어, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 정수 범위, 크기 범위, 또는 두께 범위는, 달리 지시되지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수의 값 및 적절한 경우 이의 분수(예를 들어, 정수의 1/10 및 정수의 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 기술되는 모든 방법은, 본원에서 달리 명시되거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공되는 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "~ 와 같은")의 사용은 본 개시를 보다 잘 예시하기 위한 것일 뿐이며, 달리 청구되지 않는 한, 본 개시의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 본 개시의 실행에 필수적인 것으로 청구되지 않은 임의의 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 개시내용의 바람직한 구현예가 본원에서 기술된다. 이러한 바람직한 구현예의 변형은 전술한 설명을 읽었을 때 당업자에게 자명해질 수 있다. 본 발명자들은, 당업자들이 이러한 변형을 적합하게 사용할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본 개시내용이 본원에서 구체적으로 기술된 것과는 다르게 실시될 수 있다는 것을 의도한다. 따라서, 본 개시내용은 준거법에 의해 허용되는 한, 본원에 첨부된 청구범위에 언급된 기술 요지의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 또한, 본 개시의 모든 가능한 변형에서의 전술된 요소들의 임의의 조합은, 본원에서 달리 명시되거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 본 개시내용에 포함된다.

Claims (20)

  1. 기체(gaseous) 기질로부터 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 전구체를 생성할 수 있는 유전자 조작된 미생물로, 디올 탈수효소를 암호화하는 유전자에서 교란적 돌연변이를 갖는, 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트, 옥살로아세테이트, 구연산염, 말산염, 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중간체를 통해 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 전구체를 생성하는, 미생물.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, 상기 미생물은 하기 중 하나 이상을 포함하는, 미생물:
    a. 옥살로아세테이트를 구연산염으로 변환할 수 있는 이종 효소를 암호화하는 핵산;
    b. 글리신 을 글리옥실레이트로 변환할 수 있는 이종 효소를 암호화하는 핵산;
    c. 이소-구연산염을 글리옥실레이트로 변환할 수 있는 이종 효소를 암호화하는 핵산; 및
    d. 글리콜레이트 를 글리콜알데히드로 변환할 수 있는 이종 효소를 암호화하는 핵산.
  4. 제3항에 있어서,
    a. 옥살로아세테이트를 구연산염으로 변환할 수 있는 이종 효소는 EC 번호 2.3.3.1을 갖는 구연산염 [Si]-합성효소, EC 번호 2.3.3.8을 갖는 ATP 구연산염 합성효소; 또는 EC 번호 2.3.3.3을 갖는 구연산염 (Re)-합성효소이고;
    b. 글리신을 글리옥실레이트로 전환할 수 있는 이종 효소는 EC 번호 2.6.1.44를 갖는 알라닌-글리옥실레이트 트랜스아미나제, EC 번호 2.6.1.45를 갖는 세린-글리옥실레이트 트랜스아미나제, EC 번호 2.6.1.51의 세린-피부르산염 트랜스아미나제, EC 번호 2.6.1.35의 글리신-옥살로아세테이트 트랜스아미나제, EC 번호 2.6.1.4의 글리신 트랜스아미나제, EC 번호 1.4.1.10의 글리신 디하이드로게나제, EC 번호 1.4.1.1을 갖는 알라닌 탈수소효소, 또는 EC 번호 1.4.2.1을 갖는 글리신 탈수소효소이고;
    c. 이소-구연산염을 글리옥실레이트로 전환할 수 있는 이종 효소는 EC 번호 4.1.3.1을 갖는 이소구연산염 분해효소(lyase)이며; 및/또는
    d. 글리콜레이트를 글리콜알데히드로 변환할 수 있는 이종 효소는 EC 번호 1.2.1.21을 갖는 글리콜알데히드 탈수소효소, EC 번호 1.2.1.22를 갖는 락트알데히드 탈수소효소,EC 번호 1.2.1.24를 갖는 숙시네이트-세미알데히드 탈수소효소, EC 번호 1.2.1.26을 갖는 2,5-디옥소발레레이트 탈수소효소,EC 번호 1.2.1.3/4/5를 갖는 알데히드 탈수소효소, EC 번호 1.2.1.8을 갖는 베타인-알데히드 탈수소효소, 또는 EC 번호 1.2.7.5를 갖는 알데히드 페레독신 산화환원효소인, 미생물.
  5. 제3항 또는 4항에 있어서, 하나 이상의 이종 효소는 바실러스(Bacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 에스케리키아(Escherichia), 글루코노박터(Gluconobacter), 하이포미크로비움(Hyphomicrobium), 리시니바실러스(Lysinibacillus), 패니바실러스(Paenibacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 세디멘티콜라(Sedimenticola), 스포로사르치나(Sporosarcina), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 테르미티오바실러스(Thermithio), 테르모토가(Thermotoga), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 및 제아(Zea)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속(genus)으로부터 유래되는, 미생물.
  6. 제3항 내지 5항에 있어서, 하나 이상의 이종 효소는 상기 미생물에서의 발현을 위해 코돈-최적화되는(codon-optimized), 미생물.
  7. 제1항 내지 제6항에 있어서, 상기 미생물은 아세틸-CoA를 피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; 피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환할 수 있는 효소; 피부르산염을 말산염으로 전환할 수 있는 효소; 피부르산염을 포스페놀피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; 옥살로아세테이트를 시트릴-CoA로 전환할 수 있는 효소; 시트릴-CoA를 구연산염으로 전환할 수 있는 효소; 구연산염을 아코니테이트로 및 아코니테이트를 이소-구연산염으로 전환할 수 있는 효소; 포스포에놀피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환할 수 있는 효소; 포스포에놀피부르산염을 2-포스포-D-글리세레이트로 전환할 수 있는 효소; 2-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포-D-글리세레이트로 전환할 수 있는 효소; 3-포스포-D-글리세레이트를 3-포스포노옥시피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; 3-포스포노옥시피부르산염을 3-포스포-L-세린으로 전환할 수 있는 효소; 3-포스포-L-세린을 세린으로 전환할 수 있는 효소; 세린을 글리신으로 전환할 수 있는 효소; 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트를 글리신으로 전환할 수 있는 효소; 세린을 하이드록시피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; D-글리세레이트를 하이드록시피부르산염으로 전환할 수 있는 효소; 말산염을 글리옥실레이트로 전환할 수 있는 효소; 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환할 수 있는 효소; 하이드록시피부르산염을 글리콜알데하이드로 전환할 수 있는 효소; 및 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환할 수 있는 효소 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 미생물.
  8. 제3항 내지 제7항에 있어서, 상기 미생물은 하기의 효소를 과발현하는, 미생물:
    a. 옥살로아세테이트를 구연산염으로 전환할 수 있는 이종 효소;
    b. 글리신을 글리옥실레이트로 전환할 수 있는 이종 효소; 및/또는
    c. 글리콜레이트를 글리콜알데하이드로 전환할 수 있는 이종 효소.
  9. 제7항에 있어서, 상기 미생물은 하기의 효소를 과발현하는, 미생물:
    a. 피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환할 수 있는 효소;
    b. 구연산염을 아코니테이트로 전환하고 아코니테이트를 이소-구연산염으로 전환할 수 있는 효소;
    c. 포스포에놀피부르산염을 옥살로아세테이트로 전환할 수 있는 효소;
    d. 세린을 글리신으로 전환할 수 있는 효소;
    e. 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트를 글리신으로 전환할 수 있는 효소;
    f. 글리옥실레이트를 글리콜레이트로 전환할 수 있는 효소; 및/또는
    g. 글리콜알데하이드를 에틸렌 글리콜로 전환할 수 있는 효소.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 이소구연산염 탈수소효소, 글리세레이트 탈수소효소, 글리콜레이트 탈수소효소, 글리세레이트 탈수소효소, 글리콜레이트 탈수소효소, 알데하이드 페레독신 옥시도리덕타제, 및 알데하이드 탈수소효소 중 하나 이상에서 교란적 돌연변이(disruptive mutation)를 추가로 포함하는, 미생물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 아세토박테리움, 알칼리바쿨룸, 블라우티아, 부티리박테리움, 클로스트리디움, 유박테리움, 무렐라, 옥소박터, 스포로무사, 및 써모아나에로박터로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 구성원인, 미생물.
  12. 제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 박키이(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리디움 아우토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리디움 코스카티이(Clostridium coskatii), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리디움포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 마그눔(Clostridium magnum), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei), 클로스트리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 무렐라 테르마우토트로피카(Moorella thermautotrophica), 무렐라 테르모아세티카(Moorella thermoacetica), 옥소박터 펜니기이(Oxobacter pfennigii), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스패로이데스(Sporomusa sphaeroides)및 테르모아내로박터 키부이(Thermoanaerobacter kivui)로 이루어진 군으로부터 선택된 부모 미생물로부터 유래되는, 미생물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한항에 있어서, 상기 미생물은 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이, 및 클로스트리디움 라그스달레이로 이루어진 군으로부터 선택된 부모 미생물로부터 유래되는, 미생물.
  14. 제1항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 고유한 우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 경로 또는 이종 우드-륭달 경로를 포함하는, 미생물.
  15. 제1항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에틸렌 글리콜 전구체는 글리옥실레이트 또는 글리콜레이트인, 미생물.
  16. 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 전구체를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 미생물을 영양 배지에서 기질의 존재 하에 배양하고, 이에 의해 미생물이 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 전구체를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 기체 기질은 CO, CO2, 및 H2 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 에틸렌 글리콜 전구체는 글리옥실레이트 또는 글리콜레이트인, 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜 전구체를 영양 배지로부터 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 에탄올, 2,3-부탄디올, 및 숙시네이트 중 하나 이상을 추가로 생성하는, 방법.
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Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2218234A (en) 1937-12-09 1940-10-15 Eastman Kodak Co Process for the recovery of ethylene glycol from aqueous solutions
US5593886A (en) 1992-10-30 1997-01-14 Gaddy; James L. Clostridium stain which produces acetic acid from waste gases
US5552023A (en) 1993-12-15 1996-09-03 Alliedsignal Inc. Recovery of spent deicing fluid
UA72220C2 (uk) 1998-09-08 2005-02-15 Байоенджініерінг Рісорсиз, Інк. Незмішувана з водою суміш розчинник/співрозчинник для екстрагування оцтової кислоти, спосіб одержання оцтової кислоти (варіанти), спосіб анаеробного мікробного бродіння для одержання оцтової кислоти (варіанти), модифікований розчинник та спосіб його одержання
NZ546496A (en) 2006-04-07 2008-09-26 Lanzatech New Zealand Ltd Gas treatment process
US7704723B2 (en) 2006-08-31 2010-04-27 The Board Of Regents For Oklahoma State University Isolation and characterization of novel clostridial species
NZ553984A (en) 2007-03-19 2009-07-31 Lanzatech New Zealand Ltd Alcohol production process
US20200048665A1 (en) 2007-10-28 2020-02-13 Lanzatech New Zealand Limited Carbon capture in fermentation
CN102876609A (zh) 2007-11-13 2013-01-16 兰扎泰克新西兰有限公司 新型菌及其使用方法
CA2712779C (en) 2008-01-22 2021-03-16 Genomatica, Inc. Methods and organisms for utilizing synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol
AU2009258344B2 (en) 2008-06-09 2013-11-07 Lanzatech Nz, Inc. Production of butanediol by anaerobic microbial fermentation
DE102008044440B4 (de) 2008-08-18 2011-03-03 Lurgi Zimmer Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Rückgewinnung von Ethylenglykol bei der Polyethylenterephthalatherstellung
US8039239B2 (en) 2008-12-16 2011-10-18 Coskata, Inc. Recombinant microorganisms having modified production of alcohols and acids
BR122017014535B1 (pt) 2009-01-26 2019-03-26 Xyleco, Inc. Método para produzir um éster de ácido carboxílico
US8445244B2 (en) 2010-02-23 2013-05-21 Genomatica, Inc. Methods for increasing product yields
US20120040421A1 (en) 2010-03-10 2012-02-16 Lanza Tech New Zealand Limited Acid production by fermentation
KR20130093481A (ko) 2010-04-13 2013-08-22 게노마티카 인코포레이티드 에틸렌 글리콜을 생산하기 위한 미생물 및 방법
CA2786903C (en) 2010-07-28 2015-01-20 Lanzatech New Zealand Limited Novel bacteria and methods of use thereof for producing ethanol and acetate
WO2012024522A2 (en) 2010-08-19 2012-02-23 Lanzatech New Zealand Limited A process for producing chemicals using microbial fermentation of substrates comprising carbon monoxide
WO2012026833A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Lanzatech New Zealand Limited Process for producing ethanol and ethylene via fermentation
US20110236941A1 (en) 2010-10-22 2011-09-29 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganism and methods of production thereof
US9410130B2 (en) 2011-02-25 2016-08-09 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and uses therefor
US9914947B2 (en) 2011-07-27 2018-03-13 Alliance For Sustainable Energy, Llc Biological production of organic compounds
CN109136291A (zh) 2011-09-08 2019-01-04 朗泽科技新西兰有限公司 一种发酵方法
KR101351879B1 (ko) 2012-02-06 2014-01-22 명지대학교 산학협력단 에탄―１，２―디올 생산 미생물 및 이를 이용한 에탄―１，２―디올 생산 방법
US8658845B2 (en) 2012-05-23 2014-02-25 Orochem Technologies, Inc. Process and adsorbent for separating ethanol and associated oxygenates from a biofermentation system
IN2014DN10168A (ko) 2012-05-30 2015-08-21 Lanzatech New Zealand Ltd
US20130323820A1 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and uses therefor
WO2013185123A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and uses therefor
US9347076B2 (en) 2012-06-21 2016-05-24 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms that make biodiesel
WO2014004625A1 (en) * 2012-06-26 2014-01-03 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing ethylene glycol using synthesis gas
WO2014036152A1 (en) * 2012-08-28 2014-03-06 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms and uses therefor
PT3230459T (pt) 2014-12-08 2020-12-18 Lanzatech New Zealand Ltd Microrganismos recombinantes que exibem fluxo aumentado através de uma via de fermentação
MY186542A (en) 2015-05-27 2021-07-26 Lanzatech New Zealand Ltd Genetically engineered microorganisms for the production of chorismate-derived products
WO2017059236A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 Massachusetts Institute Of Technology Microbial production of renewable glycolate
MX2018004642A (es) 2015-10-13 2019-04-15 Lanzatech New Zealand Ltd Bacteria diseñada por ingeniería genética que comprende una trayectoria de fermentación que genera energía.
US10774347B2 (en) 2016-03-09 2020-09-15 Braskem S.A. Microorganisms and methods for the co-production of ethylene glycol and three carbon compounds
WO2017161041A1 (en) * 2016-03-16 2017-09-21 William Marsh Rice University Microbial synthesis of isoprenoid precursors, isoprenoids and derivatives including prenylated aromatics compounds
US11535873B2 (en) * 2017-09-07 2022-12-27 The Governing Council Of The University Of Toronto Production of glycolate from ethylene glycol and related microbial engineering
BR112020008718A2 (pt) 2017-12-19 2020-11-24 Lanzatech, Inc. microrganismo geneticamente modificado, e, método de produção de etilenoglicol ou de um precursor de etilenoglicol.

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Publication number Publication date
CA3226685A1 (en) 2023-02-09
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