KR20220164810A - 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자위에 녹인이 있는 미생물 - Google Patents

아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자위에 녹인이 있는 미생물 Download PDF

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Abstract

아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자위에 DNA의 녹인을 포함하는 유전자 조작된 미생물이 본원에 제공된다. 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자를 하나 이상의 천연 또는 비천연 효소를 코딩하는 DNA로 대체하면 발효 안정성 및 기체성 기질로부터 천연 및 비천연 생성물의 증가된 생산을 비롯한 특정 이점이 부여된다.

Description

아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자위에 녹인이 있는 미생물
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2020년 6월 6일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제63/035,739호의 이익을 주장하며, 이의 전문은 참조에 의해 본원에 포함된다.
정부 지원
본 개시내용은 미국 에너지국(Department of Energy)이 부여한 협력 조약 No. DE-EE0007566 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 개시내용에 대하여 특정 권리를 갖는다.
기술분야
본 출원은 유전자 조작된 미생물 및 이산화탄소(CO2), 일산화탄소(CO) 및/또는 수소(H2)를 포함하는 기질로부터 생성물의 발효 생산을 위한 미생물의 용도에 관한 것이다.
임박한 기후 변화를 완화하려면 석탄 및 석유와 같은 화석 연료를 태울 때 발생하는 것과 같은 온실 가스(GHG) 배출량을 크게 줄여야 한다. 연료 및 화학 물질의 지속 가능한 공급원은 현재 화석 탄소에 대한 의존도를 크게 대체하기에 충분하지 않지만 가스 발효는 최근 CO, CO2, 및/또는 H2와 같은 가스의 지속 가능한 연료 및 화학 물질로의 생물학적 고정을 위한 대안 플랫폼으로 등장했다. 특히, 가스 발효 기술은 기체화된 탄소질 물질(예를 들어, 도시 고형 폐기물 또는 농업 폐기물) 또는 공업 폐가스(예를 들어, 제철소 또는 정유 공장)를 비롯한 광범위한 공급원료를 이용하여 에탄올, 제트 연료 및 기타 다양한 제품을 생성할 수 있다. 가스 발효만으로도 원유 사용의 30%를 대체하고, 전 세계 CO2 배출량을 10% 줄일 수 있지만, 임의의 파괴적인 기술과 마찬가지로, 이러한 잠재력이 완전히 달성되기 전에 많은 기술적 문제들이 극복되어야 한다.
특히, 기체성 기질로부터 천연 및 비천연 생성물의 생산을 위해 개선된 안정성을 갖는 추가적인 미생물에 대한 요구가 남아 있다.
도 1은 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자(ΔbudA) 및 1차-2차 알코올 탈수소효소 유전자(ΔsecAdh)가 파괴된 미생물의 발효를 나타내는 그래프 세트이다. 상단 패널은 대사산물 생산(에탄올 및 아세테이트)을 도시한다. 하단 패널은 기체 소비 및 생산(CO, CO2 및 H2)을 도시한다.
도 2는 플라스미드 상의 아세톤 경로(thlA, ctfAB, adc)의 발현을 갖는 ΔbudAΔsecAdh 미생물의 발효를 나타내는 그래프 세트이다. 아세톤 경로는 Pfer 프로모터의 제어 하에 있다. 상단 패널은 대사산물 생산(에탄올, 아세테이트, 및 아세톤)을 도시한다. 하단 패널은 기체 소비 및 생산(CO, CO2 및 H2)을 도시한다.
도 3은 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자(budA)위에 아세톤 경로(thlA, ctfAB, adc)의 녹인(Knock-in)을 갖는 ΔsecAdh 미생물의 발효를 도시하는 그래프 세트이다. 아세톤 경로는 PbudA 프로모터 및 Pfer 프로모터의 제어 하에 있다. 상단 패널은 대사산물 생산(에탄올, 아세테이트, 아세톤 아세톤)을 도시한다. 하단 패널은 기체 소비 및 생산(CO, CO2 및 H2)을 도시한다.
도 4는 이관능성 알데하이드-알코올 탈수소효소(adhE1+adhE2) 유전자위와 관능성 1차-2차 알코올 탈수소효소(secAdh) 유전자에서 아세톤 경로(thlA, ctfAB, adc)의 녹인을 갖는 미생물의 발효를 도시하는 그래프 세트이다. 1차-2차 알코올 탈수소효소(secAdh)는 아세톤을 이소프로판올로 전환시켜 이 균주가 아세톤이 아닌 이소프로판올을 생산하도록 한다. 아세톤 경로는 PadhE1/E2 및 Pfer 프로모터의 제어 하에 있다. 상단 패널은 대사산물 생산(에탄올, 아세테이트, 아세톤, 및 이소프로판올)을 도시한다. 하단 패널은 기체 소비 및 생산(CO, CO2 및 H2)을 도시한다.
아세토락테이트 탈카복실화효소는 2,3-부탄디올(2,3-BDO)의 형성을 위한 핵심 단계이고(문헌[
Figure pct00001
, Appl Env Microbiol, 80: 3394-3405, 2014]) 이 효소를 녹아웃시키는 것은 2,3-BDO 생산을 없애는 것으로 입증되었다(국제공개 WO 2013/115659호). 아세톤과 같은 다른 이종 생성물로 플럭스를 전달하기 위해 아세토락테이트 탈카복실화효소의 녹아웃은 이러한 이종 생성물의 생산을 증가시킬 것으로 예상된다.
그러나, 본 발명자들은 이것이 반드시 그렇지는 않다는 것을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자위에서 이종 생성물의 생산을 담당하는 유전자의 녹인이 안정한 발효 및 높은 생성물 역가를 달성하기 위한 열쇠임을 발견하였다.
아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자위에 DNA의 녹인을 포함하는 유전자 조작된 미생물이 제공된다. 일 실시형태에서, DNA는 전체적으로 또는 부분적으로 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자의 코딩 영역을 대체한다. 일 실시형태에서, DNA는 아세토락테이트 탈카복실화효소 프로모터를 대체하지 않는다.
일 실시형태에서, 아세토락테이트 탈카복실화효소는 EC 4.1.1.5에 의해 정의된 활성, 즉, (S)-2-하이드록시-2-메틸-3-옥소부타노에이트 ←→ (R)-2-아세토인 + CO2를 갖는다. 일 실시형태에서, 아세토락테이트 탈카복실화효소는 budA이다. 일 실시형태에서, budA는 SEQ ID NO: 3을 포함한다.
녹인이 수행된 후, 미생물은 전형적으로 미생물이 아세토락테이트 탈카복실화효소를 발현하고 2,3-부탄디올과 같은 생성물을 생산하지 않도록 작용성 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자를 갖지 않을 것이다.
일 실시형태에서, 녹인 DNA는 하나 이상의 효소를 코딩한다. 일 실시형태에서, 이들 효소(들)는 미생물에 고유하지 않으며, 즉 미생물에 자연적으로 존재하지 않는다. 일 실시형태에서, 이들 효소(들)는 미생물에 고유하며, 즉 미생물에 자연적으로 존재하고, 단순히 효소(들)의 다른 사본을 미생물의 게놈에 추가한다.
일 실시형태에서, 녹인 DNA에 의해 코딩되는 효소(들)는 아세토락테이트 탈카복실화효소 프로모터, 예를 들어, PbudA의 제어 하에 있다. 일 실시형태에서, DNA는 Pfer 프로모터와 같은 프로모터를 포함한다. 일 실시형태에서, 효소(들)는 아세토락테이트 탈카복실화효소 프로모터 및 적어도 하나의 다른 프로모터 둘 모두의 제어 하에 있다. 일 실시형태에서, 효소(들)는 PbudA 및 Pfer 둘 모두의 제어 하에 있다.
일 실시형태에서, 아세톤 경로는 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자위에 녹인된다. 아세톤 경로는 티올라제, CoA 전이효소, 및 탈카복실화효소를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 탈카복실화효소는 아세토아세테이트 탈카복실화효소 또는 알파-케토이소발레레이트 탈카복실화효소이다. 예를 들어, 아세톤 경로는 thlA, ctfAB, 및 adc 또는 thlA, ctfAB, 및 kivd를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, secAdh와 같은 1차-2차 알코올 탈수소효소가 아세톤을 이소프로판올로 전환할 것이다. 이 효소를 코딩하는 유전자에 교란적 돌연변이(예를 들어, 녹아웃 돌연변이)의 도입은 아세톤을 생성하는 반면 이 효소의 발현은 이소프로판올을 생성한다. 따라서, 숙주 미생물의 유전적 배경에 따라 아세톤 경로의 도입은 아세톤 또는 이소프로판올을 생성한다. 아세톤 및 이소프로판올을 생산하기 위한 미생물 조작은 국제공개 WO 2012/115527호에 기재되어 있다. 1차-2차 알코올 탈수소효소 활성을 녹아웃하기 위한 미생물 조작은 국제공개 WO 2015/085015호에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 미생물은 아세톤 경로를 포함하고 또한 1차-2차 알코올 탈수소효소 유전자에 교란적 돌연변이를 포함하여 미생물이 아세톤을 생산하게 한다. 일 실시형태에서, 미생물은 아세톤 경로를 포함하고 또한 기능성 1차-2차 알코올 탈수소효소를 포함하여 미생물이 이소프로판올을 생산하게 한다.
사실, 녹인 DNA는 본질적으로 임의의 효소 또는 효소 경로를 코딩할 수 있다. 예를 들어, 녹인 DNA에 의해 코딩된 효소(들)은 1-부탄올, 부티레이트, 부텐, 부타디엔, 메틸 에틸 케톤, 에틸렌, 아세톤, 이소프로판올, 지질, 3-하이드록시프로피오네이트, 테르펜, 이소프렌, 지방산, 2-부탄올, 1,2-프로판디올, 1-프로판올, 1-헥산올, 1-옥탄올, 코리스메이트 유래 생성물, 3-하이드록시부티레이트, 1,3-부탄디올, 2-하이드록시이소부티레이트 또는 2-하이드록시이소부티르산, 이소부틸렌, 아디프산, 1,3-헥산디올, 3-메틸-2-부탄올, 2-부텐-1-올, 이소발레레이트, 이소아밀 알코올 또는 모노에틸렌 글리콜의 생산을 가능하게 할 수 있다.
일 실시형태에서, 미생물은 C1-고정 미생물이다. 일 실시형태에서, 미생물은 우드-륭달 미생물이다. 일 실시형태에서, 미생물은 박테리아이다. 일 실시형태에서, 미생물은 아세토박테리움(Acetobacterium), 알칼리바쿨룸(Alkalibaculum), 블라우티아(Blautia), 부티리박테리움(Butyribacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 유박테리움(Eubacterium), 무렐라(Moorella), 옥소박터(Oxobacter), 스포로무사(Sporomusa) 및 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter)로부터 선택되는 속의 구성원이다.
기체성 기질의 존재 하에 미생물을 배양하는 것을 포함하는 생성물의 제조 방법이 추가로 제공된다. 일 실시형태에서, 기체성 기질은 CO, CO2를 포함하는 C1-탄소원 및/또는 H2를 포함한다. 일 실시형태에서, 기체성 기질은 신가스(syngas) 또는 산업 폐기 가스를 포함한다. 일 실시형태에서, 생성물은 1-부탄올, 부티레이트, 부텐, 부타디엔, 메틸 에틸 케톤, 에틸렌, 아세톤, 이소프로판올, 지질, 3-하이드록시프로피오네이트, 테르펜, 이소프렌, 지방산, 2-부탄올, 1,2-프로판디올, 1-프로판올, 1-헥산올, 1-옥탄올, 코리스메이트 유래 생성물, 3-하이드록시부티레이트, 1,3-부탄디올, 2-하이드록시이소부티레이트 또는 2-하이드록시이소부티르산, 이소부틸렌, 아디프산, 1,3-헥산디올, 3-메틸-2-부탄올, 2-부텐-1-올, 이소발레레이트, 이소아밀 알코올 또는 모노에틸렌 글리콜이다.
정의 및 배경
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 전반에 걸쳐 사용되는 하기 용어는 하기와 같이 정의된다:
용어 "발효"는 기질에서 화학적 변화를 일으키는 대사 과정으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 발효 공정은 하나 이상의 기질을 수용하고 하나 이상의 미생물의 이용을 통해 하나 이상의 생성물을 생산한다. 용어 "발효", "가스 발효" 등은 가스화에 의해 생성된 신가스와 같은 하나 이상의 기질을 수용하고 하나 이상의 C1-고정 미생물의 이용을 통해 하나 이상의 생성물을 생산하는 공정으로 해석되어야 한다. 바람직하게는, 발효 공정은 하나 이상의 생물반응기의 사용을 포함한다. 발효 공정은 "배치" 또는 "연속"으로 기술될 수 있다. "배치 발효"는 생물반응기가 미생물과 함께 원료, 예를 들어 탄소 공급원으로 충진되며, 발효가 완결될 때까지 생성물이 생물반응기에 남아 있는 발효 공정을 기술하기 위해 사용된다. "배치" 공정에서는 발효가 완결된 후 생성물을 추출하고, 다음 "배치"가 시작되기 전에 생물반응기를 세척한다. "연속 발효"는 발효 공정이 더 오랜 시간 동안 연장되고 발효 도중 생성물 및/또는 대사산물을 추출하는 발효 공정을 기술하기 위해 사용된다. 바람직하게는 발효 공정은 연속식이다.
용어 "비-천연 발생"은 미생물에 관하여 사용되는 경우, 미생물이 기준 종의 야생형 균주를 포함한 기준 종의 천연 발생 균주에서 발견되지 않는 유전적 변형을 적어도 하나 가짐을 의미한다. 비-천연 발생 미생물은 전형적으로 실험실 또는 연구 시설에서 개발된다.
용어 "유전적 변형," "유전적 변경," 또는 "유전적 조작"은 광범위하게는 인간에 의한 미생물의 게놈 또는 핵산의 조작을 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "유전적으로 변형된," "유전적으로 변경된," 또는 "유전자 조작된"은 이러한 유전적 변형, 유전적 변경 또는 유전적 조작을 함유하는 미생물을 지칭한다. 이들 용어는 실험실-발생된 미생물을 천연-발생 미생물로부터 구별하는 데 사용될 수 있다. 유전적 변형의 방법은 예를 들어 이종성 유전자 발현, 유전자 또는 프로모터 삽입 또는 결실, 핵산 돌연변이, 변경된 유전자 발현 또는 불활성화, 효소 조작, 지향 진화(directed evolution), 지식-기초 설계, 무작위 돌연변이발생 방법, 유전자 셔플링, 및 코돈 최적화를 포함한다.
클로스트리디아와 같은 미생물의 대사 공학은 에탄올과 같은 자연적인 대사산물 이외의 많은 중요한 연료 및 화학 분자를 생산하는 능력을 엄청나게 확장할 수 있다. 그러나, 최근까지, 클로스트리디아는 유전적으로 다루기 힘든 것으로 간주되었고, 따라서 일반적으로는 광범위한 대사 공학 노력에 한계가 있었다. 최근 몇 년 동안 하기를 포함하는 클로스트리디아에 대한 게놈 공학을 위한 여러 다른 방법이 개발되었다: 인트론 기반 방법(ClosTron)(문헌[Kuehne, Strain Eng: Methods and Protocols, 389-407, 2011]), 대립유전자 교환 방법(ACE)(문헌[Heap, Nucl Acids Res, 40: e59, 2012; Ng, PLoS One, 8: e56051, 2013]), 삼중 교차(문헌[Liew, Frontiers Microbiol, 7: 694, 2016]), I-SceI를 통해 매개된 방법(문헌[Zhang, Journal Microbiol Methods, 108: 49-60, 2015]), MazF(문헌[Al-Hinai, Appl Environ Microbiol, 78: 8112-8121, 2012]), 또는 기타(문헌[Argyros, Appl Environ Microbiol, 77: 8288-8294, 2011]), Cre-Lox(문헌[Ueki, mBio, 5: e01636-01614, 2014]), 및 CRISPR/Cas9(문헌[Nagaraju, Biotechnol Biofuels, 9: 219, 2016)]. 그러나, 느리고 힘든 사이클링 시간과 종 간의 이러한 유전 기술의 이전 가능성에 대한 제한으로 인해 몇 가지 이상의 유전적 변화를 반복적으로 도입하는 것은 매우 어려운 도전 과제로 여전히 남아 있다. 추가로, 클로스트리디아의 C1 대사가 C1 흡수, 전환, 및 생성물 합성을 향한 탄소/에너지/산화환원 흐름을 최대화할 변형을 확실하게 예측할 만큼 아직 충분히 이해되지 않는다. 따라서, 클로스트리디아에 표적 경로를 도입하는 것은 여전히 지루하고 시간이 많이 걸리는 과정으로 남아 있다.
"재조합"은 핵산, 단백질 또는 미생물이 유전적 변형, 조작 또는 재조합의 생성물임을 나타낸다. 일반적으로, 용어 "재조합"은 다수의 공급원, 예컨대 둘 이상의 상이한 균주 또는 종의 미생물로부터 유래되는 유전적 물질을 함유하거나 이에 의해 코딩되는 핵산, 단백질 또는 미생물을 지칭한다.
"야생형"은 이것이 자연에서 발생하며 돌연변이체 또는 변이체 형태로부터 구분되는 바와 같이 유기체, 균주, 유전자 또는 특징의 전형적인 형태를 지칭한다.
"내인성"은 본 개시내용의 미생물이 유래되는 야생형 또는 모 미생물에 존재하거나 발현되는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 내인성 유전자는 본 개시내용의 미생물이 유래되는 야생형 또는 모 미생물에 천연적으로 존재하는 유전자이다. 일 실시형태에서, 내인성 유전자의 발현은 외인성 조절 요소, 예컨대 외인성 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
"외인성"은 본 개시내용의 미생물의 외부에서 기원하는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 외인성 유전자 또는 효소는 인공적으로 또는 재조합적으로 생성되고 본 개시내용의 미생물에 도입되거나 발현될 수 있다. 외인성 유전자 또는 효소는 또한 이종성 미생물로부터 단리되고 본 개시내용의 미생물에 도입되거나 발현될 수 있다. 외인성 핵산은 본 개시내용의 미생물의 게놈 내로 통합되거나 본 개시내용의 미생물에서 염색체-외 상태, 예를 들어 플라스미드에 잔류하도록 적응될 수 있다.
"이종성"은 본 개시내용의 미생물이 유래하는 야생형 또는 모 미생물 내에 존재하지 않는 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 이종성 유전자 또는 효소는 상이한 균주 또는 종으로부터 유래되고 본 개시내용의 미생물 내에 도입 또는 발현될 수 있다. 이종성 유전자 또는 효소는 이것이 상이한 균주 또는 종에서 발생하는 형태로 본 개시내용의 미생물 내에 도입 또는 발현될 수 있다. 대안적으로, 이종성 유전자 또는 효소는 일부 방식으로 예를 들어 본 개시내용의 미생물에서의 발현을 위해 이를 코돈-최적화함으로써 또는 기능을 변경시키기 위해, 예컨대 효소 활성의 방향을 역전시키거나 기질 특이성을 변경시키기 위해 이를 조작함으로써 변형될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드," "뉴클레오티드," "뉴클레오티드 서열," "핵산," 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 이들은 임의의 길이의 뉴클레오티드(데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드)의 중합체성 형태, 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 기지의(known) 또는 미지의(unknown) 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자위(유전자위들), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 후에 주어질 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 간섭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예컨대 mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 전사되는 과정, 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩티드는 통틀어 "유전자 생성물"로 지칭될 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드," 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되어, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 중합체는 비-아미노산에 의해 간섭될 수 있다. 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체를 포함하며; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 기타 조작, 예컨대 표지 성분과의 접합을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘 모두를 포함한 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 펩티도모방체를 포함한다.
"효소 활성," 또는 간단히 "활성"은 광범위하게는 비제한적으로 반응을 촉매하기 위한 효소의 활성, 효소의 양 또는 효소의 유용성을 포함한 효소적 활성을 지칭한다. 이에, 효소 활성을 "증가시키는" 것은 반응을 촉매화하기 위해 효소의 활성을 증가시키거나, 효소의 양을 증가시키거나, 효소의 유용성을 증가시키는 것을 포함한다. 유사하게는, 효소 활성을 "저하시키는" 것은 반응을 촉매화하기 위해 효소의 활성을 저하시키거나, 효소의 양을 저하시키거나, 효소의 유용성을 저하시키는 것을 포함한다.
"돌연변이화된"은, 본 개시내용의 미생물이 유래되는 야생형 또는 모 미생물과 비교하여 본 개시내용의 미생물에서 변형되었던 핵산 또는 단백질을 지칭한다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 효소를 코딩하는 유전자에서 결실, 삽입 또는 치환일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이는 효소에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환일 수 있다.
특히, "교란적 돌연변이"는 유전자 또는 효소의 발현 또는 활성을 감소 또는 제거하는(즉, "파괴하는") 변이이다. 교란적 돌연변이는 유전자 또는 효소를 부분적으로 불활성화시키거나, 완전히 불활성화시키거나 결실시킬 수 있다. 교란적 돌연변이는 효소에 의해 생산되는 생성물의 생합성을 감소시키거나, 예방하거나 차단하는 임의의 돌연변이일 수 있다. 교란적 돌연변이는 녹아웃(knockout, KO) 돌연변이일 수 있다. 교란은 또한 유전자, 단백질 또는 효소의 발현 또는 활성을 감소시키지만 전적으로 삭제하지는 않는 녹다운(knock-down, KD) 돌연변이일 수 있다. KO는 일반적으로 제품 수율을 높이는 데 효과적이지만, 특히 비-성장 결합 제품의 경우, 이점보다 더 큰 성장 결함 또는 유전적 불안정성의 불이익이 수반되는 경우가 있다. 교란적 돌연변이는 예를 들어, 효소를 코딩하는 유전자에서의 돌연변이, 효소를 코딩하는 유전자의 발현에 관여하는 유전적 조절 요소에서의 돌연변이, 효소의 활성을 감소시키거나 저해하는 단백질을 생성하는 핵산의 도입, 또는 효소의 발현을 저해하는 핵산(예를 들어, 안티센스 RNA, siRNA, CRISPR) 또는 단백질의 도입을 포함할 수 있다. 교란적 돌연변이는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 도입될 수 있다.
교란적 돌연변이의 도입은, 표적 생성물을 생산하지 않거나 표적 생성물을 실질적으로 생성하지 않거나, 본 개시내용의 미생물이 유래되는 모 미생물과 비교하여 표적 생성물을 감소된 양으로 생성하는 본 개시내용의 미생물을 초래한다. 예를 들어, 본 개시내용의 미생물은 표적 생성물을 생산하지 않거나, 모 미생물보다 적어도 약 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 적은 표적 생성물을 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 미생물은 약 0.001, 0.01, 0.10, 0.30, 0.50 또는 1.0 g/L 미만의 표적 생성물을 생산할 수 있다.
"녹인"은 유전자위에 있는 DNA를 치환하거나 유전자위에 새로운 DNA를 삽입하는 유전공학적 방법을 지칭한다. 종종, 녹인은 유전자를 하나 이상의 다른 유전자로 대체한다. 예를 들어, 아세토락테이트 탈카복실화효소(budA) 유전자는 전체적으로 또는 부분적으로 하나 이상의 상이한 유전자로 대체될 수 있다. 일 실시형태에서, 유전자의 코딩 영역만 대체된다. 일 실시형태에서, 유전자에 대한 전체 오페론은 임의의 프로모터 영역을 포함하여 대체된다.
"코돈 최적화"는 특정 균주 또는 종에서 핵산의 최적화된 또는 개선된 번역을 위한 핵산, 예컨대 유전자의 돌연변이를 지칭한다. 코돈 최적화는 더 신속한 번역 속도 또는 더 높은 번역 정확도를 야기할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 유전자는 클로스트리디움, 특히 클로스트리디움 오토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이, 또는 클로스트리디움 라그스달레이에서 발현에 대해 최적화된 코돈이다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 유전자는 DSMZ 기탁 번호 DSM23693 하에 기탁된 클로스트리디움 오토에타노게눔 LZ1561에서 발현에 대해 최적화된 코돈이다.
"과발현된"은 본 개시내용의 미생물이 유래되는 야생형 또는 모 미생물과 비교하여 본 개시내용의 미생물에서 핵산 또는 단백질의 발현의 증가를 지칭한다. 과발현은 유전자 복사 수, 유전자 전사 속도, 유전자 번역 속도 또는 효소 분해 속도를 변형시키는 것을 포함한 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다.
용어 "변이체"는 핵산 및 단백질의 서열이 기준 핵산 및 단백질의 서열, 예컨대 선행 기술에 개시되거나 본원에 예시된 기준 핵산 및 단백질의 서열로부터 달라진 핵산 및 단백질을 포함한다. 본 개시내용은 기준 핵산 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 변이체 핵산 또는 단백질을 사용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 변이체 단백질은 기준 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나 실질적으로 동일한 반응을 촉매화할 수 있다. 변이체 유전자는 기준 유전자와 동일한 단백질 또는 실질적으로 동일한 단백질을 코딩할 수 있다. 변이체 프로모터는 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 기준 프로모터와 실질적으로 동일한 능력을 가질 수 있다.
그러나 핵산 또는 단백질은 본원에서 "기능적으로 동등한 변이체"로 지칭될 수 있다. 예로써, 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 대립유전자 변이체, 유전자 절편, 돌연변이 유전자, 다형성 등을 포함할 수 있다. 다른 미생물로부터의 상동성 유전자 또한 기능적으로 등가인 변이체의 예이다. 이들은 종, 예컨대 클로스트리디움 아세토부틸리쿰, 클로스트리디움 베이예린키이 또는 클로스트리디움 륭달리이 내의 상동성 유전자를 포함하고, 이들의 세부사항은 웹사이트, 예컨대 Genbank 또는 NCBI 상에서 공개적으로 입수 가능하다. 기능적으로 등가인 변이체는 또한 핵산의 서열이 특정 미생물에 대한 코돈 최적화의 결과 달라지는 핵산을 포함한다. 핵산의 기능적으로 등가인 변이체는 바람직하게는 기준 핵산과 적어도 대략 70%, 대략 80%, 대략 85%, 대략 90%, 대략 95%, 대략 98% 또는 그 이상의 핵산 서열 동일성(상동성 퍼센트)을 가질 것이다. 단백질의 기능적으로 등가인 변이체는 바람직하게는, 기준 단백질과 적어도 대략 70%, 대략 80%, 대략 85%, 대략 90%, 대략 95%, 대략 98% 또는 그 이상의 아미노산 동일성(상동성 퍼센트)을 가질 것이다. 변이체 핵산 또는 단백질의 기능적 등가성은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
핵산은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 본 개시내용의 미생물에 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 노출 핵산으로서 전달될 수 있거나, 하나 이상의 작용제, 예컨대 리포솜으로 제형화될 수 있다. 핵산은 적절하다면 DNA, RNA, cDNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 제한 저해제는 특정한 실시형태에서 사용될 수 있다. 추가의 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 코스미드 및 인공 염색체를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 핵산은 플라스미드를 사용하여 본 개시내용의 미생물에 전달될 수 있다. 예로서, 형질전환(형질도입 또는 형질감염을 포함함)은 전기천공, 초음파처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개 형질전환, 화학적 또는 천연 적격(competence), 원생동물 형질전환, 프로파지(prophage) 유도 또는 접합에 의해 달성될 수 있다. 활성 제한 효소 시스템을 갖는 특정한 실시형태에서, 핵산을 미생물 내로 도입하기 전에 핵산을 메틸화하는 것이 필요할 수 있다.
추가로, 핵산은 특정 핵산을 증가시키거나 아니면 이의 발현을 제어하기 위해, 프로모터와 같은 조절 요소를 포함하도록 설계될 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터 또는 유도적 프로모터일 수 있다. 이상적으로, 프로모터는 우드 륭달 경로 프로모터, 페레독신 프로모터, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 프로모터, Rnf 복합 오페론 프로모터, ATP 합성효소 오페론 프로모터, 또는 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터이다.
"미생물"은 현미경적 유기체, 특히, 박테리아, 고세균, 바이러스 또는 진균류이다. 본 개시내용의 미생물은 통상적으로 박테리아이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "미생물"에 대한 언급은 "박테리아"를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
"모 미생물(parental microorganism)"은 본 개시내용의 미생물을 생성하는데 사용되는 미생물이다. 상기 모 미생물은 자연 발생 미생물(즉, 야생형 미생물) 또는 사전에 변형되었던 미생물(즉, 돌연변이 또는 재조합 미생물)일 수 있다. 본 개시내용의 미생물은 모 미생물에서 발현되지 않거나 과발현되지 않은 하나 이상의 효소를 발현하거나 과발현하도록 변형될 수 있다. 유사하게, 본 개시내용의 미생물은 모 미생물이 함유하지 않은 하나 이상의 유전자를 함유하도록 변형될 수 있다. 본 개시내용의 미생물은 또한 모 미생물에서 발현된 하나 이상의 효소를 발현하지 않거나 더 적은 양으로 발현하도록 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 모 미생물은 클로스트리디움 오토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이, 또는 클로스트리디움 라그스달레이이다. 바람직한 실시형태에서, 모 미생물은 클로스트리디움 오토에타노게눔 LZ1561이고, 이것은 부다페스트 조약의 조건에 따라 2010년 6월 7일에 독일 브라운슈바이크 D-38124 인호펜슈트라쎄 7B에 소재하는 독일 생물 자원센터(DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁되고 수탁 번호 DSM23693가 부여되었다. 이 균주는 국제공개 WO 2012/015317호로 공개된 국제출원 PCT/NZ2011/000144호에 기술되어 있다.
용어 "~로부터 유래된"은 핵산, 단백질, 또는 미생물이 상이한(예를 들어, 모 또는 야생형) 핵산, 단백질 또는 미생물로부터 변형되거나 또는 적응되어 새로운 핵산, 단백질, 또는 미생물을 생성하는 것을 나타낸다. 이러한 변형 또는 적응은 전형적으로는 핵산 또는 유전자의 삽입, 결실, 돌연변이 또는 치환을 포함한다. 일반적으로, 본 개시내용의 미생물은 모 미생물로부터 유래된다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 클로스트리디움 오토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이, 또는 클로스트리디움 라그스달레이로부터 유래된다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 DSMZ 수탁 번호 DSM23693으로 기탁된 클로스트리디움 오토에타노게눔 LZ1561로부터 유래된다.
본 개시내용의 미생물은 기능적 특징에 기초하여 추가로 분류될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 미생물은 C1-고정 미생물, 혐기성 생물, 아세토겐, 에탄올로겐, 일산화탄소 영양 생물 및/또는 메탄영양체일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있다. 표 1은 미생물의 대표적인 목록을 제공하고, 이들의 기능적인 특징을 식별한다.
[표 1]
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"우드-륭달"은 예를 들어 문헌[Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008]에 기술된 바와 같은 탄소 고정의 우드-륭달 경로를 지칭한다. "우드-륭달 미생물"은 예상대로 우드-륭달 경로를 함유하는 미생물을 지칭한다. 일반적으로, 본 개시내용의 미생물은 본연의 우드-륭달 경로를 함유한다. 본원에서, 우드-륭달 경로는 천연의, 비변형된 우드-륭달 경로일 수 있거나, 우드-륭달 경로는 이 경로가 CO, CO2, 및/또는 H2를 아세틸-CoA로 전환하는 작용을 여전히 하는 한 어느 정도의 유전적 변형(예를 들어, 과발현, 이종성 발현, 녹아웃 등)을 갖는 우드-륭달 경로일 수 있다.
"C1"은 1-탄소 분자, 예를 들어, CO, CO2, CH4 또는 CH3OH를 지칭한다. "C1-옥시게네이트"는 적어도 하나의 산소 원자를 또한 포함하는 1-탄소 분자, 예를 들어, CO, CO2 또는 CH3OH를 지칭한다. "C1-탄소 공급원"은 본 개시내용의 미생물에 대한 부분 또는 단독 탄소 공급원으로서 작용하는 1개의 탄소-분자를 지칭한다. 예를 들어, C1-탄소 공급원은 CO, CO2, CH4, CH3OH 또는 CH2O2 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, C1-탄소 공급원은 CO 및 CO2 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. "C1-고정 미생물"은 C1 탄소 공급원으로부터 하나 이상의 생성물을 생산하는 능력을 갖는 미생물이다. 전형적으로, 본 개시내용의 미생물은 C1-고정 박테리아이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 C1-고정 미생물로부터 유래된다.
"혐기성 생물"은 성장을 위해 산소를 필요로 하지 않는 미생물이다. 혐기성 생물은 산소가 특정 임계치를 초과하여 존재하는 경우 부정적으로 반응하거나 심지어 사멸할 수도 있다. 그러나, 일부 혐기성 생물은 낮은 수준의 산소(예를 들어, 0.000001% 내지 5% 산소)를 견딜 수 있다. 통상적으로, 본 개시내용의 미생물은 혐기성 생물이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 혐기성 생물로부터 유래된다.
"아세토겐"은 에너지 보존, 및 아세틸-CoA 및 아세틸-CoA 유래 생성물, 예를 들어 아세테이트의 합성을 위한 이의 주요 기전으로서 우드-륭달 경로를 사용하는 절대적 혐기성 박테리아이다(문헌[Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008]). 특히, 아세토겐은 (1) CO2로부터 아세틸-CoA의 환원적 합성을 위한 기전, (2) 말단 전자-수용, 에너지 보존 과정, (3) 세포 탄소의 합성에서 CO2의 고정(동화)을 위한 기전으로서 우드-륭달 경로를 사용한다(문헌[Drake, Acetogenic Prokaryotes, In: The Prokaryotes, 3rd edition, p. 354, New York, NY, 2006]). 모든 자연 발생 아세토겐은 C1-고정, 혐기성, 독립 영양 생물, 및 비-메탄 영양 생물이다. 통상적으로, 본 개시내용의 미생물은 아세토겐이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 아세토겐으로부터 유래된다.
"에탄올로겐"은 에탄올을 생성하거나 생성할 수 있는 미생물이다. 통상적으로, 본 개시내용의 미생물은 에탄올로겐이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 에탄올로겐으로부터 유래된다.
"독립 영양 생물"은 유기 탄소의 부재 하에 성장할 수 있는 미생물이다. 대신에, 독립 영양 생물은 무기 탄소 공급원, 예를 들어 CO 및/또는 CO2를 사용한다. 통상적으로, 본 개시내용의 미생물은 독립 영양 생물이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 자가영양 생물로부터 유래된다.
"일산화탄소 영양 생물"은 탄소 및 에너지의 단독 공급원으로서 CO를 이용할 수 있는 미생물이다. 통상적으로, 본 개시내용의 미생물은 일산화탄소 영양 생물이다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 일산화탄소 영양 생물로부터 유래된다.
"메탄 영양 생물"은 탄소 및 에너지의 유일한 공급원으로서 메탄을 이용할 수 있는 미생물이다. 특정한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 메탄 영양 생물이거나 메탄 영양 생물로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 메탄 영양 생물이 아니거나 메탄 영양 생물로부터 유래되지 않는다.
보다 광범위하게는, 본 개시내용의 미생물은 표 1에서 식별된 임의의 속 또는 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미생물은 아세토박테리움, 알칼리바쿨룸, 블라우티아, 부티리박테리움, 클로스트리디움, 유박테리움, 무렐라, 옥소박테르, 스포로무사, 및 써모아나에로박터로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 구성원일 수 있다. 특히, 미생물은 아세토박테리움 우디이, 알칼리바쿨룸 박키이, 블라우티아 프로덕타, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 클로스트리디움 아세티쿰, 클로스트리디움 오토에타노게눔, 클로스트리디움 카르복시디보란스, 클로스트리디움 코스카티이, 클로스트리디움 드라케이, 클로스트리디움 포르미코아세티쿰, 클로스트리디움 륭달리이, 클로스트리디움 마그눔, 클로스트리디움 라그스달레이, 클로스트리디움 스카톨로게네스, 유박테리움 리모숨, 무렐라 테르마우토트로피카, 무렐라 테르모아세티카, 옥소박터 펜니기이, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스패로이데스, 및 테르모아내로박터 키부이로 이루어진 군으로부터 선택되는 모 박테리아로부터 유래될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 개시내용의 미생물은 클로스트리디움 오토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 및 클로스트리디움 라그스달레이 종을 포함하는 클로스트리디아의 클러스터로부터 유래된다. 이들 종은 문헌[Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994](클로스트리디움 오토에타노게눔), 문헌[Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232-236, 1993](클로스트리디움 륭달리이) 및 Huhnke의 국제공개 WO 2008/028055호(클로스트리디움 라그스달레이)에 의해 처음으로 보고되고 특성화되었다.
이들 3개 종은 많은 유사성을 갖는다. 특히, 이들 종은 모두 클로스트리디움 속의 C1 고정, 혐기성, 아세토겐성, 에탄올로겐성, 및 일산화탄소영양성 구성원이다. 이들 종은 유사한 유전자형 및 표현형, 및 에너지 보존 및 발효 대사 방식을 갖는다. 더욱이, 이들 종은, 99% 초과로 동일한 16S rRNA DNA를 갖는 클로스트리디움 rRNA 상동 그룹 I 내에 군집지어지며, 약 22 내지 30 몰%의 DNA G + C 함량을 가지며, 그람 양성이며, 유사한 형태 및 크기를 갖고 (0.5 내지 0.7 x 3 내지 5 μm 사이의 대수 성장 세포), 중온성이며 (30 내지 37℃에서 최적 성장), 약 4 내지 7.5의 유사한 pH 범위를 가지고 (최적 pH 약 5.5 내지 6를 가짐), 시토크롬이 없고, Rnf 복합체를 통해 에너지를 보존한다. 또한, 카르복실산으로부터 이들의 상응하는 알코올로의 환원이 이들 종에서 나타났다(문헌[Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012]). 중요하게는, 이들 종은 또한 모두 특정 조건 하에 CO-함유 가스 상에서 강한 독립영양 성장을 보여주며, 에탄올 및 아세테이트(또는 아세트산)를 주 발효 생성물로서 생산하고, 소량의 2,3-부탄디올 및 락트산을 생성한다.
그러나, 이들 3개 종은 또한 많은 차이를 갖는다. 이들 종은 상이한 공급원들로부터 단리되었다: 토끼 소화관으로부터의 클로스트리디움 오토에타노게눔, 양계장 폐기물로부터 클로스트리디움 륭달리이, 및 담수 침강물로부터의 클로스트리디움 라그스달레이. 이들 종은 다양한 당(예를 들어, 람노스, 아라비노스), 산(예를 들어, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들어, 아르기닌, 히스티딘), 및 다른 기질(예를 들어, 베타인, 부탄올)의 사용 면에서 상이하다. 더욱이, 이들 종은 특정 비타민(예를 들어, 티아민, 비오틴)에 대한 영양요구성 면에서 상이하다. 이들 종은 우드-륭달 경로 유전자 및 단백질의 핵산 및 아미노산 서열에서 차이를 갖지만, 이들 유전자 및 단백질의 일반적인 구성 및 수는 모든 종들에서 동일한 것으로 밝혀졌다(문헌[Kφpke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011]).
따라서, 요약하자면, 클로스트리디움 오토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 또는 클로스트리디움 라그스달레이의 특징들 중 많은 것들은 해당 종에 특이적이지 않으며, 그보다는 클로스트리디움 속의 C1 고정, 혐기성, 아세토겐성, 에탄올로겐성, 및 일산화탄소영양성 구성원의 이 클러스터에 대한 일반적인 특징이다. 그러나, 이들 종은 실제로 구별되기 때문에, 이들 종 중 하나의 유전자 변형 또는 조작은 이들 종 중 다른 것에서 동일한 효과를 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 성장, 성능 또는 생성물 생성에서의 차이가 관찰될 수 있다.
본 개시내용의 미생물은 또한, 클로스트리디움 오토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 또는 클로스트리디움 라그스달레이의 단리물 또는 돌연변이체로부터 유래될 수 있다. 클로스트리디움 오토에타노게눔의 단리물 및 돌연변이체는 JA1-1(DSM10061)(문헌[Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994]), LZ1560(DSM19630)(국제공개 WO 2009/064200) 및 LZ1561(DSM23693)(국제공개 WO 2012/015317)을 포함한다. 클로스트리디움 륭달리이의 단리물 및 돌연변이체는 ATCC 49587(문헌[Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993]), PETCT(DSM13528, ATCC 55383), ERI-2(ATCC 55380)(미국 특허 US 5,593,886호), C-01(ATCC 55988)(미국 특허 US 6,368,819호), O-52(ATCC 55989)(미국 특허 US 6,368,819호), 및 OTA-1(문헌[Tirado-Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, PhD thesis, North Carolina State University, 2010])을 포함한다. 클로스트리디움 라그스달레이의 단리물 및 돌연변이체는 PI 1(ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826)(국제공개 WO 2008/028055)을 포함한다.
"기질"은 본 개시내용의 미생물에 대한 탄소 및/또는 에너지 공급원을 지칭한다. 통상적으로, 기질은 기체성이며, C1-탄소 공급원, 예를 들어 CO, CO2, 및/또는 CH4를 포함한다. 바람직하게는, 기질은 CO 또는 CO + CO2의 C1-탄소 공급원을 포함한다. 기질은 다른 비-탄소 성분, 예를 들어, H2, N2 또는 전자를 추가로 포함할 수 있다.
상기 기질은 일반적으로 적어도 일부 양의 CO, 예를 들어 약 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 몰%의 CO를 포함한다. 기질은 일정 범위의 CO, 예를 들어 약 20 내지 80, 30 내지 70, 또는 40 내지 60 몰%의 CO를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 기질은 약 40 내지 70 몰%의 CO(예를 들어, 제철소 또는 용광로 가스), 약 20 내지 30 몰%의 CO(예를 들어, 순산소로(basic oxygen furnace) 가스), 또는 약 15 내지 45 몰%의 CO(예를 들어, 합성 가스)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 기질은 비교적 소량의 CO, 예를 들어 약 1 내지 10 또는 1 내지 20 몰%의 CO를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 미생물은 통상적으로 기질 내 적어도 일부의 CO를 생성물로 전환시킨다. 일부 실시형태에서, 기질은 CO를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는다(1 몰% 미만).
기질은 일정량의 H2를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기질은 약 1, 2, 5, 10, 15, 20, 또는 30 몰%의 H2를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 비교적 많은 양의 H2, 예를 들어 약 60, 70, 80, 또는 90 몰% H2를 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 기질은 H2를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는다(1 몰% 미만).
기질은 일정량의 CO2를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기질은 약 1 내지 80 또는 1 내지 30 몰%의 CO2를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 약 20, 15, 10 또는 5 몰% 미만의 CO2를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 기질은 CO2를 포함하지 않거나 CO2를 실질적으로 포함하지 않는다(1 몰% 미만).
기질은 통상적으로 기체성이긴 하지만, 기질은 대안적인 형태로도 제공될 수 있다. 예를 들어, 기질은 마이크로버블 분산액 생성기(microbubble dispersion generator)를 사용하여 CO-함유 가스로 포화된 액체에 용해될 수 있다. 추가의 예로서, 기질은 고체 지지체에 흡착될 수 있다.
기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 산업 공정의 부산물로서 또는 일부 다른 공급원, 예를 들어 자동차 배기 매연 또는 바이오매스 가스화로부터 수득되는 폐가스일 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 산업 공정은 제강 제조 등의 철금속 제품 제조, 비철금속 제품 제조, 석유 정제, 석탄 가스화, 전력 생산, 카본블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산, 코크스 제조로 이루어진 군에서 선택된다. 이러한 실시형태에서, 기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 대기 중으로 배출되기 전에 임의의 편리한 방법을 사용하여 산업 공정으로부터 포집할 수 있다.
기질 및/또는 C1-탄소 공급원은 신가스, 예컨대 석탄 또는 정제 잔류물의 가스화, 바이오매스 또는 리그노셀룰로오스성 물질의 가스화, 또는 천연 가스의 개질(reforming)에 의해 수득되는 신가스일 수 있다. 다른 실시형태에서, 신가스는 도시 고체 폐기물 또는 산업 고체 폐기물의 가스화로부터 수득될 수 있다.
기질의 조성은 반응의 효율 및/또는 비용에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 산소(O2)의 존재는 혐기성 발효 공정의 효율을 감소시킬 수 있다. 기질의 조성에 따라, 임의의 원치 않는 불순물, 예를 들어 독소, 원치 않는 성분, 또는 먼지 입자를 제거하고/하거나 바람직한 성분의 농도를 증가시키기 위해 상기 기질을 처리하거나 스크럽하거나 여과하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 실시형태에서, 발효는 당, 전분, 리그닌, 셀룰로오스 또는 헤미셀룰로오스와 같은 탄수화물 기질의 부재 하에 수행된다.
본 개시내용의 미생물은 상기 가스 스트림으로 배양되어 하나 이상의 생성물을 생산할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 미생물은 에탄올(국제공개 WO 2007/117157호), 아세테이트(국제공개 WO 2007/117157호), 1-부탄올(국제공개 WO 2008/115080호, WO 2012/053905호, 및 WO 2017/066498호), 부티레이트(국제공개 WO 2008/115080호), 2,3-부탄디올(국제공개 WO 2009/151342호 및 WO 2016/094334호), 락테이트(국제공개 WO 2011/112103호), 부텐(국제공개 WO 2012/024522호), 부타디엔(국제공개 WO 2012/024522호), 메틸 에틸 케톤(2-부탄온)(국제공개 WO 2012/024522호 및 WO 2013/185123호), 에틸렌(국제공개 WO 2012/026833호), 아세톤(국제공개 WO 2012/115527호), 이소프로판올(국제공개 WO 2012/115527호), 지질(국제공개 WO 2013/036147호), 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP)(국제공개 WO 2013/180581호), 이소프렌을 포함하는 테르펜(국제공개 WO 2013/180584호), 지방산(국제공개 WO 2013/191567호), 2-부탄올(국제공개 WO 2013/185123호), 1,2-프로판디올(국제공개 WO 2014/036152호), 1-프로판올(국제공개 WO 2017/066498호), 1-헥산올(국제공개 WO 2017/066498호), 1-옥탄올(국제공개 WO 2017/066498호), 코리스메이트 유래 생성물(국제공개 WO 2016/191625호), 3-하이드록시부티레이트(국제공개 WO 2017/066498호), 1,3-부탄디올(국제공개 WO 2017/066498호), 2-하이드록시이소부티레이트 또는 2-하이드록시이소부티르산(국제공개 WO 2017/066498호), 이소부틸렌(국제공개 WO 2017/066498호), 아디프산(국제공개 WO 2017/066498호), 1,3 헥산디올(국제공개 WO 2017/066498호), 3-메틸-2-부탄올(국제공개 WO 2017/066498호), 2-부텐-1-올(국제공개 WO 2017/066498호), 이소발레레이트(국제공개 WO 2017/066498호), 이소아밀 알코올(국제공개 WO 2017/066498호), 및 모노에틸렌 글리콜(국제공개 WO 2019/126400호)을 생성할 수 있거나 이를 생성하도록 조작될 수 있다. 특정 실시형태에서, 미생물 바이오매스 자체는 생성물로 간주될 수 있다. 이러한 생성물은 디젤, 제트 연료 및/또는 가솔린 중 적어도 하나의 성분을 제조하도록 추가로 전환될 수 있다. 추가로, 미생물 바이오매스는 추가로 처리되어 단세포 단백질(SCP)을 생산할 수 있다.
"천연 생성물"은 유전적으로 비변형된 미생물에 의해 생산되는 생성물이다. 예를 들어, 에탄올, 아세테이트 및 2,3-부탄디올은 클로스트리디움 오토에타노게눔, 클로스트리디움 륭달리이 및 클로스트리디움 라그스달레이의 천연 생성물이다. "비-천연 생성물"은 유전적으로 변형된 미생물에 의해 생성되지만, 유전적으로 변형된 미생물이 유래되는 유전적으로 변형되지 않은 미생물에 의해서는 생성되지 않는 생성물이다.
"선택성"은 표적 생성물의 생성량 대 미생물에 의해 생성된 모든 발효 생성물의 생성량의 비를 지칭한다. 본 개시내용의 미생물은 특정 선택성 또는 최소 선택성으로 생성물을 생산하도록 조작될 수 있다. 일 실시형태에서, 표적 생성물은 본 개시내용의 미생물에 의해 생성된 전체 발효 생성물의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50% 또는 75%를 차지한다. 일 실시형태에서, 표적 생성물은 본 개시내용의 미생물에 의해 생성되는 모든 발효 생성물 중 적어도 약 10%를 차지하여, 본 개시내용의 미생물이 적어도 10%의 표적 생성물에 대한 선택성을 갖도록 한다. 다른 실시형태에서, 표적 생성물은 본 개시내용의 미생물에 의해 생성되는 모든 발효 생성물 중 적어도 약 30%를 차지하여, 본 개시내용의 미생물이 적어도 30%의 표적 생성물에 대한 선택성을 갖도록 한다.
통상적으로, 배양은 생물반응기에서 수행된다. 용어 "생물반응기"는 하나 이상의 용기, 탑, 또는 배관 구성으로 이루어진 배양/발효 장치, 예를 들어 연속 교반식 탱크 반응기(CSTR: continuous stirred tank reactor), 고정화 세포 반응기(ICR: immobilized cell reactor), 살수층 반응기(TBR: trickle bed reactor), 버블 컬럼(bubble column), 가스 리프트 발효조(gas lift fermenter), 정적 혼합기(static mixer), 또는 기액 접촉에 적합한 다른 용기 또는 다른 장치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 생물반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 배양/발효 반응기를 포함할 수 있다. 기질은 이들 반응기 중 하나 또는 둘 모두에 제공될 수 있다. 본원에서, 용어 "배양" 및 "발효"는 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 배양/발효 공정의 성장 단계 및 생성물 생합성 단계 둘 모두를 포함한다.
배양물은 일반적으로 상기 미생물이 성장하도록 하기에 충분한 영양분, 비타민 및/또는 미네랄을 함유하는 수성 배양 배지에서 유지된다. 바람직하게는, 수성 배양 배지는 혐기성 미생물 성장 배지, 예를 들어 최소 혐기성 미생물 성장 배지이다. 적합한 배지는 당업계에 널리 공지되어 있다.
상기 배양/발효는 바람직하게는 상기 표적 생성물의 생산을 위한 적절한 조건 하에서 수행되어야 한다. 통상적으로, 배양/발효는 혐기성 조건 하에 수행된다. 고려해야 할 반응 조건은 압력(또는 분압), 온도, 가스 유량, 액체 유량, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, 교반 속도(연속 교반식 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종원 수준, 액상 중의 가스를 제한하지 않는 최대 가스 기질 농도, 및 생성물 억제를 피하기 위한 최대 생성물 농도를 포함한다.
일 실시형태는 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자위에 DNA의 녹인을 포함하는 유전자 조작된 미생물이다.
일 실시형태에 있어서, DNA가 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자의 코딩 영역을 대체하는 미생물.
일 실시형태에 있어서, DNA가 아세토락테이트 탈카복실화효소 프로모터를 대체하지 않는 미생물.
일 실시형태에 있어서, 2,3-부탄디올을 생성하지 않는 미생물.
일 실시형태에 있어서, DNA가 하나 이상의 효소를 코딩하는 미생물.
일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 효소가 미생물에 고유하지 않은 미생물.
일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 효소가 미생물에 고유한 미생물.
일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 효소가 아세토락테이트 탈카복실화효소 프로모터의 제어 하에 있는 미생물.
일 실시형태에 있어서, DNA가 프로모터를 포함하는 미생물.
일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 효소가 아세토락테이트 탈카복실화효소 프로모터 및 적어도 하나의 다른 프로모터 둘 모두의 제어 하에 있는 미생물.
일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 효소가 티올라제, CoA 트랜스퍼라제, 및 아세토아세테이트 탈카복실화효소 또는 알파-케토이소발레레이트 탈카복실화효소로부터 선택된 탈카복실화효소를 포함하는 미생물.
일 실시형태에 있어서, 아세톤 및 이소프로판올 중 하나 이상을 생성하는 미생물.
일 실시형태에 있어서, 1차-2차 알코올 탈수소효소 유전자에 교란적 돌연변이를 추가로 포함하는 미생물.
일 실시형태에 있어서, 하나 이상의 효소가 1-부탄올, 부티레이트, 부텐, 부타디엔, 메틸 에틸 케톤, 에틸렌, 아세톤, 이소프로판올, 지질, 3-하이드록시프로피오네이트, 테르펜, 이소프렌, 지방산, 2-부탄올, 1,2-프로판디올, 1-프로판올, 1-헥산올, 1-옥탄올, 코리스메이트 유래 생성물, 3-하이드록시부티레이트, 1,3-부탄디올, 2-하이드록시이소부티레이트 또는 2-하이드록시이소부티르산, 이소부틸렌, 아디프산, 1,3-헥산디올, 3-메틸-2-부탄올, 2-부텐-1-올, 이소발레레이트, 이소아밀 알코올 또는 모노에틸렌 글리콜의 생산을 가능하게 하는 미생물.
일 실시형태에 있어서, C1-고정 미생물인 미생물.
일 실시형태에서, 우드-륭달 미생물인 미생물.
일 실시형태에 있어서, 박테리아인 미생물.
일 실시형태에 있어서, 아세토박테리움(Acetobacterium), 알칼리바쿨룸(Alkalibaculum), 블라우티아(Blautia), 부티리박테리움(Butyribacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 유박테리움(Eubacterium), 무렐라(Moorella), 옥소박터(Oxobacter), 스포로무사(Sporomusa) 및 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter)로부터 선택되는 속의 구성원인 미생물.
일 실시형태는 기체성 기질의 존재 하에 제1항의 미생물을 배양하는 것을 포함하는 생성물의 제조 방법이다.
일 실시형태에 있어서, 기체성 기질이 CO, CO2를 포함하는 C1-탄소원 및/또는 H2를 포함하는 방법.
일 실시형태에 있어서, 기체성 기질이 신가스 또는 산업 폐기 가스를 포함하는 방법.
일 실시형태에 있어서, 생성물이 1-부탄올, 부티레이트, 부텐, 부타디엔, 메틸 에틸 케톤, 에틸렌, 아세톤, 이소프로판올, 지질, 3-하이드록시프로피오네이트, 테르펜, 이소프렌, 지방산, 2-부탄올, 1,2-프로판디올, 1-프로판올, 1-헥산올, 1-옥탄올, 코리스메이트 유래 생성물, 3-하이드록시부티레이트, 1,3-부탄디올, 2-하이드록시이소부티레이트 또는 2-하이드록시이소부티르산, 이소부틸렌, 아디프산, 1,3-헥산디올, 3-메틸-2-부탄올, 2-부텐-1-올, 이소발레레이트, 이소아밀 알코올 또는 모노에틸렌 글리콜인 방법.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용을 추가로 예시하지만, 당연하게도, 본 발명의 범위를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
실시예 1
이 예는 ΔbudAΔsecAdh 미생물을 설명한다.
아세토락테이트 탈카복실화효소는 2,3-부탄디올(2,3-BDO)의 형성을 위한 핵심 단계이고(문헌[Kφpke, Appl Env Microbiol, 80: 3394-3405, 2014]) 이 효소를 녹아웃시키는 것은 2,3-BDO 생산을 없애는 것으로 입증되었다(국제공개 WO 2013/115659호). 아세톤과 같은 다른 이종 생성물로 플럭스를 전달하기 위해, 각 budA 유전자의 녹아웃이 생산을 개선할 것으로 예측되었다.
1차-2차 알코올 탈수소효소(secAdh) 유전자 녹아웃(ΔsecAdh)(국제공개 WO 2015/085015호)을 이미 포함하여 ΔbudAΔsecAdh 균주를 생성한 C. 오토에타노게눔 균주에서 budA의 녹아웃. budA의 녹아웃은 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다(국제공개 WO 2013/115659호).
단일 콜로니를 단리하고 새로운 적절한 선택 플레이트에 다시 스트리킹한 다음 이중 교차 이벤트에 대해 스크리닝하였다. 정확한 크기의 PCR 생성물이 있는 확인된 이중 교차 이벤트는 플라스미드 손실을 보장하기 위해 다시 스트리킹되었다. 정확한 콜로니를 액체 배지에 집어넣고 냉동 스톡을 준비했다. 유전자형은 전체 게놈 시퀀싱을 통해 확인되었고 표현형은 성장 연구와 연속 교반 탱크 반응기(CSTR) 실행을 통해 확인되었다. 도 1에서 보는 바와 같이, 대사산물 생산과 가스 소비/생산의 진동이 관찰되었다.
실시예 2
이 실시예는 플라스미드로부터 아세톤 경로(thlA, ctfAB, adc)를 발현하는 ΔbudAΔsecAdh 미생물을 설명한다.
실시예 1의 ΔbudAΔsecAdh 미생물을 아세톤 경로(thlA, ctfAB, adc)를 함유하는 플라스미드를 도입하도록 추가로 변형시켰다. 이 균주는 동일한 경로와 동일한 성장 조건 하에서 budA의 녹아웃이 없는 모 ΔsecAdh 균주보다 아세톤을 덜 생산했다. 이는 budA의 녹아웃이 탄소 플럭스를 2,3-BDO에서 아세톤 및/또는 에탄올과 같은 다른 대사산물로 리디렉션할 것으로 예상되었기 때문에 놀라운 일이다.
또한, 이 균주는 가스 믹스: 50% CO, 10% H2, 30% CO2, 나머지 N2가 있는 CSTR에서 잘 성장하지 않거나 안정적인 아세톤 생산을 나타내지 않았다(도 2). 다시, 진동 패턴이 성장 동안 관찰되었다: 생산의 피크와 골, 아세테이트 및 CO2 생산의 골 및 피크와 조화를 이루는 CO 및 수소 흡수.
실시예 3
이 실시예는 아세토락테이트 탈카복실화효소(budA) 유전자위에 아세톤 경로(thlA, ctfAB, adc)의 녹인을 갖는 ΔsecAdh 미생물을 설명한다.
budA 유전자위에서의 아세톤 경로 녹인을 위한 KI/KO 플라스미드는 budA KO 플라스미드를 백본으로 사용하여 구축되었으며 아세톤 경로는 budA KO 플라스미드의 5' 및 3' budA KO 상동성 아암 사이에 삽입되었다. 아세톤 경로는 Pfer 프로모터의 제어 하에 thlA, ctfAB 및 adc를 포함하였다. GeneArt Seamless Cloning 및 Assembly Kit(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 완전한 KI/KO 플라스미드를 조립하였다. 정확한 KI/KO 플라스미드를 PCR 스크리닝하고 시퀀싱으로 확인하였다.
KI 돌연변이체를 수득하는 과정은 앞서 budA KO 균주를 구성할 때 설명한 것과 동일하였으며 budA 유전자위에 아세톤 경로가 도입된 ΔbudAΔsecAdh 균주를 생성하였다. PCR 스크리닝을 수행하고, 정확한 크기의 PCR 생성물을 갖는 콜로니를 성장시키고, 게놈 DNA를 단리하고, 유전자형을 확인하기 위해 전체 게놈 DNA 시퀀싱을 수행하였다.
균주는 가스 믹스: 50% CO, 10% H2, 30% CO2, 나머지 N2가 있는 CSTR에서 성장되었다. 균주는 잘 성장하였고 높은 수준의 아세톤을 생산하였다(도 3).
실시예 4
이 비교 실시예는 작용성 1차-2차 알코올 탈수소효소(secAdh) 및 이작용성 알데하이드-알코올 탈수소효소(adhE1+adhE2) 유전자위에 아세톤 경로(thlA, ctfAB, adc)의 녹인을 갖는 미생물을 설명한다. 1차-2차 알코올 탈수소효소(secAdh)는 아세톤을 이소프로판올로 전환시켜 이 균주가 아세톤이 아닌 이소프로판올을 생산하도록 한다.
아세톤 경로는 상기 기재된 것과 유사한 단계로 adhE1+adhE2 유전자위에 삽입되었다. 상동성 아암은 PCR을 통해 증폭되었고 유전자형은 시퀀싱을 통해 확인되었다.
균주는 CSTR에서 잘 성장하지 않았고 이소프로판올 또는 에탄올을 잘 생산하지 않았다(도 4). 반응기에서 에탄올과 이소프로판올을 생산하기에 충분한 세포 바이오매스를 얻는 데 약 6일이 걸렸다. 발효는 실험의 2주 과정 동안 안정하지 않았다. 따라서 adhE1+adhE2 유전자위에서의 녹인은 budA 유전자위에서의 녹인과 동일한 이점을 제공하지 않는다.
실시예 5
이 실시예는 budA 유전자위에서의 다른 유전자 또는 경로의 통합을 설명한다.
우드-륭달 미생물은 이미 1-부탄올(국제공개 WO 2008/115080호, 국제공개 WO 2012/053905호, 및 국제공개 WO 2017/066498호), 부티레이트(국제공개 WO 2008/115080호), 부텐(국제공개 WO 2012/024522호), 부타디엔(국제공개 WO 2012/024522호), 메틸 에틸 케톤(2-부탄온)(국제공개 WO 2012/024522호 및 국제공개 WO 2013/185123호), 에틸렌(국제공개 WO 2012/026833호), 아세톤(국제공개 WO 2012/115527호), 이소프로판올(국제공개 WO 2012/115527호), 지질(국제공개 WO 2013/036147호), 3-하이드록시프로피오네이트(3-HP)(국제공개 WO 2013/180581호), 이소프렌을 포함하는 테르펜(국제공개 WO 2013/180584호), 지방산(국제공개 WO 2013/191567호), 2-부탄올(국제공개 WO 2013/185123호), 1,2-프로판디올(국제공개 WO 2014/036152호), 1-프로판올(국제공개 WO 2017/066498호), 1-헥산올(국제공개 WO 2017/066498호), 1-옥탄올(국제공개 WO 2017/066498호), 코리스메이트 유래 생성물(국제공개 WO 2016/191625호), 3-하이드록시부티레이트(국제공개 WO 2017/066498호), 1,3-부탄디올(국제공개 WO 2017/066498호), 2-하이드록시이소부티레이트 또는 2-하이드록시이소부티르산(국제공개 WO 2017/066498호), 이소부틸렌(국제공개 WO 2017/066498호), 아디프산(국제공개 WO 2017/066498호), 1,3-헥산디올(국제공개 WO 2017/066498호), 3-메틸-2-부탄올(국제공개 WO 2017/066498호), 2-부텐-1-올(국제공개 WO 2017/066498호), 이소발레레이트(국제공개 WO 2017/066498호), 이소아밀 알코올(국제공개 WO 2017/066498호), 및 모노에틸렌 글리콜(국제공개 WO 2019/126400호)을 포함하는 다양한 외래 생성물을 생산하도록 조작되었다. 이러한 유전자 또는 경로 중 어느 것이든 budA 유전자위에서 녹인되어 성능이 개선된 균주를 생성할 수 있다.
일 실시형태에서, 녹인 DNA는 예를 들어, thlA 및 hbd를 포함하는 3-하이드록시부티레이트 경로를 코딩한다. 일 실시형태에서, 녹인 DNA는 예를 들어 thlA, ctfAB 및 hbd를 포함하는 대안적인 3-하이드록시부티레이트 경로를 코딩한다. 일 실시형태에서, 녹인 DNA는 예를 들어 thlA, hbd, bcd 및 etfAB를 포함하는 부탄올 경로를 코딩한다. 일 실시형태에서, 녹인 DNA는 예를 들어 thlA, HMGS 및 HMGR을 포함하는 메발로네이트 경로를 포함한다. 이러한 경로는 하나 이상의 프로모터, 예를 들어 PbudA 및/또는 Pfer의 제어 하에 있을 수 있다.
본원에서 인용되는 공보, 특허 출원 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은, 각각의 참고문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참고로 포함되는 것으로 표시되고 본원에서 전문이 기재된 것과 동일한 정도로 본원에서 참고로 포함된다. 본원에서 인용된 종래 기술은 그러한 종래 기술이 어떠한 국가에서도 해당 분야의 일반적이고도 공통적인 지식의 일부를 형성하는 것임을 인정하는 것이 아니며, 그렇게 간주해서도 안 된다.
본 개시내용을 기술하는 문맥에서 사용된 단수(a, an), 정관사(the) 및 기타 유사한 지시사는 (특히, 하기 청구항의 문맥에서) 본원에 달리 명시되지 않거나 문맥상 명확하게 상충되지 않는 한, 단수와 복수를 모두 가리키는 것으로 해석해야 한다. 용어 "포함하는(comprising, including)", "갖는(having)", 및 "함유하는(containing)"은, 달리 언급되지 않는 한, 개방형 용어(즉, "포함하지만, 이에 제한되지는 않는"의 의미)로 해석되어야 한다. 용어 "본질적으로 이루어진"은 조성, 공정, 또는 방법의 범위를 명시된 물질 또는 단계로 제한하거나, 또는 조성, 공정, 또는 방법의 기본적이고 새로운 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 어느 하나, 둘 모두, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은, 달리 명시되지 않는 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의 ±20%를 의미한다.
본원에서 값의 범위의 언급은 달리 본원에 표시되지 않는 한 범위 내에 해당하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 단순한 방법으로 제공하도록 단지 의도되고, 각각의 별개의 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서로 인용된다. 예를 들어, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 정수 범위, 크기 범위, 또는 두께 범위는, 달리 지시되지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수의 값 및 적절한 경우 이의 분수(예를 들어, 정수의 1/10 및 정수의 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 기술되는 모든 방법은, 본원에서 달리 명시되거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공되는 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "~ 와 같은")의 사용은 본 발명을 보다 잘 예시하기 위한 것일 뿐이며, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 본 발명의 실행에 필수적인 것으로 청구되지 않은 임의의 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 개시내용의 바람직한 실시형태가 본원에서 기술된다. 이러한 바람직한 실시형태의 변형은 전술한 설명을 읽었을 때 당업자에게 자명해질 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 이러한 변형을 적합하게 사용할 것으로 예상하며, 본 발명자들은 본 개시내용이 본원에서 구체적으로 기술된 것과는 다르게 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 개시내용은 준거법에 의해 허용되는 한, 본원에 첨부된 청구범위에 언급된 기술 요지의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 또한, 본 발명의 모든 가능한 변형에서의 전술된 요소들의 임의의 조합은, 본원에서 달리 명시되거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한, 본 개시내용에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> LanzaTech, Inc. <120> MICROORGANISM WITH KNOCK-IN AT ACETOLACTATE DECARBOXYLASE GENE LOCUS <130> LT163WO1 <150> 63/035,739 <151> 2020-06-06 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 160 <212> DNA <213> Artificial Sequences <220> <223> Region containing PbudA promoter, Clostridium autoethanogenum <400> 1 aatcatatat tgtaattatt tttaattatg ttggcaaaat tgaaattgtc actgaaacac 60 ctctaaatgt tttaaataca tatgtttaat tattgtgaca gattctaata gtagaaagta 120 gaaatttgct atgttataat gacatagagg tgaatgtaat 160 <210> 2 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequences <220> <223> Pfer promoter, Clostridium autoethanogenum <400> 2 gctcactatc tgcggaacct gcctccttat ctgataaaaa atattcgctg catctttgac 60 ttgttatttt ctttcaaatg cctaaaatta tcttttaaaa ttataacaaa tgtgataaaa 120 tacaggggat gaaaacatta tctaaaaatt aaggaggtgt tacat 165 <210> 3 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequences <220> <223> budA, Clostridium autoethanogenum <400> 3 atggatgatg aggtgaaagt cccaaaccat atatatcaaa tgtctacaat 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cctctagctg tatccccatg tacatcagat 120 atacatacgg tttttgaagg agcacttggt aatagggaaa atatgatttt aggccatgaa 180 gctgtaggtg aaatagccga agttggcagc gaagttaaag attttaaagt tggcgataga 240 gttatcgtac catgcacaac acctgactgg agatctttag aagtccaagc tggttttcag 300 cagcattcaa acggtatgct tgcaggatgg aagttttcca attttaaaga tggtgtattt 360 gcagattact ttcatgtaaa cgatgcagat atgaatcttg ccatactccc agatgaaata 420 cctttagaaa gtgcagttat gatgacagac atgatgacta ctggttttca tggagcagaa 480 cttgcagaca taaaaatggg ctccagcgtt gtagtaattg gtataggagc tgttggatta 540 atgggaatag ccggttccaa acttcgagga gcaggcagaa ttatcggtgt tggaagcaga 600 cctgtttgtg ttgaaacagc taaattttat ggagcaactg atattgtaaa ttataaaaat 660 ggtgatatag ttgaacaaat catggactta actcatggta aaggtgtaga ccgtgtaatc 720 atggcaggcg gtggtgctga aacactagca caagcagtaa ctatggttaa acctggcggc 780 gtaatttcta acatcaacta ccatggaagc ggtgatactt taccaatacc tcgtgttcaa 840 tggggctgcg gcatggctca caaaactata agaggaggat tatgccccgg cggacgtctt 900 agaatggaaa tgctaagaga tcttgttcta tataaacgtg ttgatttgag taaacttgtt 960 actcatgtat ttgatggtgc agaaaatatt gaaaaggccc ttttgcttat gaaaaataag 1020 ccaaaagatt taattaaatc agtagttaca ttctaa 1056 <210> 5 <211> 2613 <212> DNA <213> Artificial Sequences <220> <223> adhE1, Clostridium autoethanogenum <400> 5 atgaaagtta caaacgtaga agaactaatg aaaagactag aagaaataaa ggatgctcaa 60 aagaaatttg ctacatatac tcaagaacaa gtggatgaaa tttttagaca agcagctatg 120 gcagctaata gtgctagaat agaactagct aaaatggcag tagaagaaag cggaatggga 180 attgtagaag acaaggttat taaaaatcac tttgcttcag aatatatata taacaaatat 240 aaggatgaaa aaacctgtgg agttttagag agagatgcag gctttggtat agttagaatt 300 gcggaacctg taggagttat tgcagcagta gttccaacaa ctaatccaac atctacagca 360 atatttaaat cactaatagc tttaaaaact agaaatggta taattttttc accccatcca 420 agggcaaaga aatcaactat tgcagcagct aaaatagtac ttgacgctgc agttaaagct 480 ggtgctcctg aaggaattat aggatggata gatgaacctt ccattgaact ttcacaggtg 540 gtaatgggag aagcaaattt aattcttgca actggtggtc cgggtatggt taaggctgcc 600 tattcttcag gcaaacctgc tgtgggagtt ggtccaggta 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ttaggggtat gccactctat ggcacataaa ttgggagcac agcaccacat accacatgga 2220 attgccaatg cacttatgat agatgaagtt ataaaattca atgctgtaga ggctccaagg 2280 aaacaagcgg catttccaca atataaatat ccaaatgtta aaagaagata tgctagaata 2340 gctgattacc taaatttagg tggaagtaca gatgatgaaa aagtacaatt gctaataaat 2400 gctatagatg acttaaaaac taagttaaat attccaaaga ctattaaaga agcaggagtt 2460 tcagaagata aattctatgc tactttagat acaatgtcag aactggcttt tgatgatcaa 2520 tgtacaggag ctaatccacg atatccacta ataggagaaa taaaacaaat gtatataaat 2580 gcatttgata caccaaaggc aactgtggag aagaaaacaa gaaagaaaaa gtaa 2634 <210> 7 <211> 5398 <212> DNA <213> Artificial Sequences <220> <223> adhE1+adhE2 including intergeneric region, Clostridium autoethanogenum <400> 7 atgaaagtta caaacgtaga agaactaatg aaaagactag aagaaataaa ggatgctcaa 60 aagaaatttg ctacatatac tcaagaacaa gtggatgaaa tttttagaca agcagctatg 120 gcagctaata gtgctagaat agaactagct aaaatggcag tagaagaaag cggaatggga 180 attgtagaag acaaggttat taaaaatcac tttgcttcag aatatatata taacaaatat 240 aaggatgaaa aaacctgtgg agttttagag agagatgcag gctttggtat agttagaatt 300 gcggaacctg taggagttat tgcagcagta gttccaacaa ctaatccaac atctacagca 360 atatttaaat cactaatagc tttaaaaact agaaatggta taattttttc accccatcca 420 agggcaaaga aatcaactat tgcagcagct aaaatagtac ttgacgctgc agttaaagct 480 ggtgctcctg aaggaattat aggatggata gatgaacctt ccattgaact ttcacaggtg 540 gtaatgggag aagcaaattt aattcttgca actggtggtc cgggtatggt taaggctgcc 600 tattcttcag gcaaacctgc tgtgggagtt ggtccaggta acacacctgc tgtaattgat 660 gaaagtgccg acattaaaat ggcagtaaat tcaatattac tatcaaaaac ttttgataat 720 ggtatgattt gtgcctcaga gcagtcagta atagttttag actcaatata tgaggaagtt 780 aaaaaagaat ttgcttatag gggtgcttat atattaagta aggatgaaac agataaggtt 840 ggaaaaataa ttttaaaaaa tggagcctta aatgcaggta ttgtaggaca acctgctttt 900 aaaatagcac agctggcagg agtggatgta ccagaaaaag ctaaagtact tataggagag 960 gtagaatcgg tagaacttga agaaccattt tctcatgaaa agttatctcc agttttagct 1020 atgtacaggg caagaaattt tgaggatgcc attgcaaaaa ctgataaact ggttagggca 1080 ggtggatttg gacatacatc ttcattgtat ataaatccaa tgacagaaaa agcaaaagta 1140 gaaaaattta gtactatgat gaaaacatca agaactataa ttaacacacc ttcatcccaa 1200 ggtggtatag gtgatatata taactttaaa ctagctcctt ctttgacatt aggctgcggt 1260 tcctgggggg gaaattctgt atccgaaaat gttgggccta aacatttatt aaacataaaa 1320 agtgttgctg agaggagaga aaatatgctt tggtttagag tacctgaaaa ggtttatttc 1380 aaatatggta gtcttggagt tgcattaaaa gagttaaaag ttatgaataa gaagaaagta 1440 tttatagtaa cagataaagt tctttatcaa ttaggttatg tggacaaagt tacaaaagtt 1500 cttgaggaac taaaaatttc ctataaggta tttacagatg tagaaccaga tccaaccctt 1560 gctacagcta aaaaaggtgc agcagaactg ctttcctatg aaccggatac aattatatca 1620 gttggtggtg gttcagcaat ggatgcagct aagatcatgt gggtaatgta tgagcatcca 1680 gaagtaaaat ttgaagattt agctatgaga tttatggata taagaaagag agtatatgtt 1740 ttccctaaga tgggagaaaa ggcaatgatg atttcagtag caacatccgc aggaacaggg 1800 tcggaagtta ctccatttgc agtaatcact gatgaaaaaa caggagctaa atatccatta 1860 gctgattatg aactaactcc agacatggct atagttgatg cagaacttat gatgggaatg 1920 ccaagaggac ttacagcagc ttcgggtata gatgcattaa cccatgcact ggaggcgtat 1980 gtgtcaataa tggctacaga atttaccaat ggattagccc ttgaagcagt aaagttgata 2040 tttgaatatt taccaaaagc ttatacagaa ggtacaacta atgtaaaggc aagagaaaag 2100 atggctcatg cttcatgtat tgcaggtatg gcctttgcaa atgcattttt aggggtatgc 2160 cactctatgg cacataaatt gggagcacag catcacatac cacatggaat tgccaatgca 2220 cttatgatag atgaagttat aaaattcaat gctgtagatg atccaataaa acaagctgca 2280 tttccccaat acgagtatcc aaatgctagg tatagatatg ctcagatagc tgattgtctg 2340 aacttgggag gaaatacaga agaggaaaag gtacaactat taataaatgc tatagatgat 2400 ttaaaagcta agttaaatat tccagaaact ataaaagaag caggagtttc agaagataaa 2460 ttctatgcta ctttagataa aatgtcagaa ttagcttttg atgatcagtg tacaggagct 2520 aatccaagat atccactgat aagtgaaata aaacaaatgt atataaatgt ttttgataaa 2580 accgaaccaa ttgtagaaga tgaagaaaag taattattaa ataaaaatgg tgttcaaata 2640 aaatttgaac accattttta tttttaagga gtaaatatga ataataataa catagaaaca 2700 aacaataaaa atgagaaatt tgtttatatt taacagcata aaaaataaga aagaggtgtc 2760 attaatgaag gtaactaagg taactaacgt tgaagaatta atgaaaaagt tagatgaagt 2820 aacggctgct caaaagaaat tttctagcta tactcaagaa caagtggatg aaattttcag 2880 gcaggcagct atggcagcca atagtgctag aatagactta gctaaaatgg cagtggaaga 2940 aagcggaatg ggaattgtag aagacaaggt cattaaaaat cattttgttg cagaatatat 3000 atataacaaa tataagggtg aaaagacctg cggagttctg gaacaagatg aaggctttgg 3060 tatggttaga attgcagaac ctgtaggagt tattgcagca gtagttccaa caactaatcc 3120 aacatctaca gcaatattta aatcactaat agctttaaaa actagaaatg gtatagtttt 3180 ttcaccacat ccaagggcaa aaaaatcaac tattgcagca gctaagatag tacttgatgc 3240 agcagttaaa gctggtgccc ctgaaggaat tataggctgg atagatgaac cttctattga 3300 actttcacag gtggtaatga aagaagcaga tctaattctt gcaactggtg gaccaggtat 3360 ggttaaggct gcctattctt caggaaagcc tgctatagga gttggtccag gtaatacacc 3420 tgctgtaatt gatgaaagtg ccgacattaa aatggcagta aattcaatac tactttcaaa 3480 aacttttgat aatggtatga tttgtgcttc agagcagtca gtaatagttg caagctcaat 3540 atacgatgaa gtcaagaaag agtttgcaga tagaggagca tatatattaa gtaaggatga 3600 aacagataag gttggaaaaa caatcatgat taatggagct ttaaatgctg gaattgtagg 3660 gcaaagtgcc tttaaaatag ctcagatggc gggagtcagt gtaccggaag atgctaaaat 3720 acttatagga gaagttaaat cggtagaacc tgaagaagag ccctttgctc atgaaaagct 3780 gtctccagtt ctagccatgt acaaagcaaa agattttgat gaagcacttc taaaggctgg 3840 aagattagtt gaacgaggtg gaatagggca tacatctgta ttgtatgtaa attcgatgac 3900 ggaaaaagta aaagtagaaa agttcagaga aactatgaag accggtagaa cattgataaa 3960 tatgccttca gcgcaaggcg ctataggaga tatatataac tttaaactag ctccttcttt 4020 gacattaggc tgtggttcct ggggaggaaa ctctgtatca gaaaatgttg gacctaaaca 4080 tttgttaaac ataaagagtg ttgctgagag gagagaaaat atgctttggt ttagagtacc 4140 tgaaaaggtt tatttcaaat atggcagcct tggagttgca ctaaaagaac tgagaattat 4200 ggagaagaaa aaggcgttta tagtaacgga taaagttctt tatcaattag gttatgtaga 4260 taaaattaca aagaacctcg atgaattaag agtttcatat aaaatattta cagatgtaga 4320 accagatcca acccttgcta cagctaaaaa aggtgcagca gaactgcttt cctatgaacc 4380 agatacaatt atagcagttg gtggtggttc ggcaatggat gctgccaaga tcatgtgggt 4440 aatgtatgag catccagaag taagatttga agatttggcc atgagattta tggatataag 4500 aaagagagta tatgtttttc ctaagatggg agaaaaggca atgatgattt cagtagcaac 4560 atccgcagga acagggtcag aagttactcc atttgcagta attacggacg aaagaacagg 4620 agctaaatat cctctggctg attatgaatt aactccaaac atggctatag ttgatgcaga 4680 acttatgatg ggaatgccaa aggggctaac agcagcttca ggtatagatg cgttgactca 4740 tgcactggag gcctatgtgt caataatggc ttcagaatat accaacggat tggctcttga 4800 agcaacaaga ttagtattca aatatttgcc aatagcttat acagaaggta caattaatgt 4860 aaaggcaaga gaaaaaatgg ctcatgcttc atgtattgca ggtatggcct ttgccaatgc 4920 atttttaggg gtatgccact ctatggcaca taaattggga gcacagcacc acataccaca 4980 tggaattgcc aatgcactta tgatagatga agttataaaa ttcaatgctg tagaggctcc 5040 aaggaaacaa gcggcatttc cacaatataa atatccaaat gttaaaagaa gatatgctag 5100 aatagctgat tacctaaatt taggtggaag tacagatgat gaaaaagtac aattgctaat 5160 aaatgctata gatgacttaa aaactaagtt aaatattcca aagactatta aagaagcagg 5220 agtttcagaa gataaattct atgctacttt agatacaatg tcagaactgg cttttgatga 5280 tcaatgtaca ggagctaatc cacgatatcc actaatagga gaaataaaac aaatgtatat 5340 aaatgcattt gatacaccaa aggcaactgt ggagaagaaa acaagaaaga aaaagtaa 5398 <210> 8 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial Sequences <220> <223> Region containing PadhE1/E2 promoter, Clostridium autoethanogenum <400> 8 atatccacta aaaaaataaa attataataa aaaatacaaa aaaataattg acaatatata 60 aataattatg cataattata tcatgataac aattagttaa gcataattac atatatatga 120 acataatatg acatcttaga agcatatctt tcgttagtaa taatataatt tcctttagaa 180 gaaaatgatt tatttaaaat aaatagtgta atgtttttta taatttcaaa aagttcccca 240 atttagcata ctaggcatga taaaaatagc ttgaataagt gcttgctatt atttattgat 300 acatagagaa tttcactctt tgcattttat ctaacatcaa ggggtttatt tgtcacaaat 360 tatgtaaaaa taaaacaaag atgtaagaaa atcctatgat ataaattttg taaacataat 420 aaattagctt tgataagatt ggaagaatga tagttactac ttagaactgc taaaaattag 480 gaaagaggtg tcgctaatta 500

Claims (22)

  1. 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자위에 DNA의 녹인(knock-in)을 포함하는 유전자 조작된 미생물.
  2. 제1항에 있어서, DNA가 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자의 코딩 영역을 대체하는, 미생물.
  3. 제1항에 있어서, DNA가 아세토락테이트 탈카복실화효소 프로모터를 대체하지 않는, 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 2,3-부탄디올을 생성하지 않는, 미생물.
  5. 제1항에 있어서, DNA가 하나 이상의 효소를 코딩하는, 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 하나 이상의 효소가 미생물에 고유하지 않은, 미생물.
  7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 효소가 미생물에 고유한, 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 하나 이상의 효소가 아세토락테이트 탈카복실화효소 프로모터의 제어 하에 있는, 미생물.
  9. 제1항에 있어서, DNA가 프로모터를 포함하는, 미생물.
  10. 제5항에 있어서, 하나 이상의 효소가 아세토락테이트 탈카복실화효소 프로모터 및 적어도 하나의 다른 프로모터 둘 모두의 제어 하에 있는, 미생물.
  11. 제1항에 있어서, 하나 이상의 효소가 티올라제, CoA 트랜스퍼라제, 및 아세토아세테이트 탈카복실화효소 또는 알파-케토이소발레레이트 탈카복실화효소로부터 선택된 탈카복실화효소를 포함하는, 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 아세톤 및 이소프로판올 중 하나 이상을 생성하는, 미생물.
  13. 제11항에 있어서, 1차-2차 알코올 탈수소효소 유전자에 교란적 돌연변이를 추가로 포함하는, 미생물.
  14. 제5항에 있어서, 하나 이상의 효소가 1-부탄올, 부티레이트, 부텐, 부타디엔, 메틸 에틸 케톤, 에틸렌, 아세톤, 이소프로판올, 지질, 3-하이드록시프로피오네이트, 테르펜, 이소프렌, 지방산, 2-부탄올, 1,2-프로판디올, 1-프로판올, 1-헥산올, 1-옥탄올, 코리스메이트 유래 생성물, 3-하이드록시부티레이트, 1,3-부탄디올, 2-하이드록시이소부티레이트 또는 2-하이드록시이소부티르산, 이소부틸렌, 아디프산, 1,3-헥산디올, 3-메틸-2-부탄올, 2-부텐-1-올, 이소발레레이트, 이소아밀 알코올 또는 모노에틸렌 글리콜의 생산을 가능하게 하는, 미생물.
  15. 제1항에 있어서, C1-고정 미생물인 미생물.
  16. 제1항에 있어서, 우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 미생물인 미생물.
  17. 제1항에 있어서, 박테리아인 미생물.
  18. 제1항에 있어서, 아세토박테리움(Acetobacterium), 알칼리바쿨룸(Alkalibaculum), 블라우티아(Blautia), 부티리박테리움(Butyribacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 유박테리움(Eubacterium), 무렐라(Moorella), 옥소박터(Oxobacter), 스포로무사(Sporomusa) 및 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter)로부터 선택되는 속의 구성원인 미생물.
  19. 기체성 기질의 존재 하에 제1항의 미생물을 배양하는 것을 포함하는 생성물의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 기체성 기질이 CO, CO2를 포함하는 C1-탄소원 및/또는 H2를 포함하는, 제조 방법.
  21. 제19항에 있어서, 기체성 기질은 신가스(syngas) 또는 산업 폐기 가스를 포함하는, 제조 방법.
  22. 제19항에 있어서, 생성물이 1-부탄올, 부티레이트, 부텐, 부타디엔, 메틸 에틸 케톤, 에틸렌, 아세톤, 이소프로판올, 지질, 3-하이드록시프로피오네이트, 테르펜, 이소프렌, 지방산, 2-부탄올, 1,2-프로판디올, 1-프로판올, 1-헥산올, 1-옥탄올, 코리스메이트 유래 생성물, 3-하이드록시부티레이트, 1,3-부탄디올, 2-하이드록시이소부티레이트 또는 2-하이드록시이소부티르산, 이소부틸렌, 아디프산, 1,3-헥산디올, 3-메틸-2-부탄올, 2-부텐-1-올, 이소발레레이트, 이소아밀 알코올 또는 모노에틸렌 글리콜인, 제조 방법.
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