CN101918538B - 一种厌氧菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一类新型细菌，其在通过厌氧发酵含有一氧化碳的底物产生乙醇方面具有较高的效率。示例性细菌，Clostridium autoethanogenum，能够以至少1.0的比率生成乙醇和乙酸盐。

Description

一种厌氧菌及其用途
发明领域
本发明一般性地涉及气体微生物发酵的领域。更特别涉及一类新型细菌，该细菌在通过厌氧发酵含有一氧化碳(CO)的底物产生乙醇方面具有较高的效率。 
发明背景 
在世界范围内，乙醇正迅速成为一种重要的富氢液态运输燃料。2005年全球乙醇的消费量估计为122亿加仑。由于欧洲、日本、美国和一些发展中国家对乙醇兴趣的增加，全球燃料乙醇行业的市场预计在未来将会迅速扩大。 
例如，在美国，乙醇是用来生产E10，一种混入10％乙醇的汽油。E10混合物中的乙醇成分作为氧化剂能够提高燃烧效率并降低气体污染物的产生。在巴西，乙醇满足约30％的运输燃料需求，其既作为氧化剂混入汽油，本身又被当作一种纯燃料。在欧洲，对温室气体(GHG)排放引起的环境问题的担忧，促使欧洲联盟(EU)给成员国制定了强制性目标，要求应用可持续的交通运输燃料，比如生物质来源的乙醇。 
绝大多数燃料乙醇的生产是通过传统的基于酵母的发酵方法，其使用谷类作物产生的碳水化合物，如从甘蔗中提取的糖或从谷物中提取的淀粉作为主要的碳源。然而，这些碳水化合物原料的价格受其作为人类食品或动物饲料价格的影响，同时在所有地区种植产生淀粉或者糖的作物来生产 乙醇在经济上并非合理。因此，开发将更低成本和/或更充足的碳源转化为燃料乙醇的技术是件有意义的事情。 
CO是有机物质例如煤炭、油和油的衍生品不完全燃烧时产生的一种主要的、免费的、富含能量的副产品。例如，据报道澳大利亚的钢铁行业每年产生并排放到大气中的CO超过500,000吨。 
催化方法可用来使主要由CO和/或CO和氢气(H2)组成的气体转化为多种燃料和化学制品。微生物也可以用于将这些气体转化为燃料和化学制品。 
1903年，首次发现了微生物以CO作为唯一碳源生长的能力。这后来被鉴定为一种生物属性，即利用乙酰辅酶A(乙酰CoA)自养生长的生化途径(也称为Woods-Ljungdahl途径和一氧化碳脱氢酶/乙酰CoA合成酶(CODH/ACS)途径)。包括一氧化碳营养的、光合作用的、产甲烷的和产乙酸的有机体在内的数量众多的厌氧生物已显示可将CO代谢为多种最终产物，即CO2、H2、甲烷、正丁醇、乙酸盐和乙醇。当用CO作为唯一碳源时所有这些生物至少产生两种终产物。 
厌氧菌，如Clostridium属的菌，已被证明可经乙酰CoA的生化途径利用CO、CO2和H2产生乙醇。例如，多种利用气体产生乙醇的Clostridium ljungdahlii菌种已在WO 00/68407、EP 117309、以及美国专利号5,173,429、5,593,886、6,368,819、WO 98/00558和WO 02/0843中记载。已知细菌Clostridium autoethanogenum sp也可以用气体产生乙醇(Abrini等人，Archives of Microbiology 161，第345-351页(1994))。 
然而，微生物发酵气体产生乙醇的过程总是伴随着乙酸盐和/或乙酸的副产品产生。由于一些可利用的碳转化成乙酸盐/乙酸，而不是乙醇，使用 这种发酵方法生产乙醇的效率可能低于预期。此外，除非乙酸盐/乙酸这些副产品可用于一些其它目的，否则可能产生废弃物处理问题。乙酸盐/乙酸经微生物转化为甲烷，因此有增加温室气体排放的可能性。 
在H2存在的情况下，CO的微生物发酵可将碳基本上完全转化为醇类。然而，在缺乏足够H2时，一些CO转化为醇类，而很大一部分CO转换为CO2，如以下公式所示： 
6CO+3H2O→C2H5OH+4CO2
12H2+4CO2→2C2H5OH+6H2O 
CO2的产生代表总体碳捕获效率低下，如果排出，有增加温室气体排放的可能性。 
WO2007/117157描述了一种生产醇类尤其是乙醇的方法，该方法通过厌氧发酵含CO的气体来进行。乙酸盐作为发酵过程中的副产品可转化为氢气和二氧化碳，这两种气体或其中之一可以用于厌氧发酵过程。 
WO2008/115080描述了在发酵的多个阶段生产醇类的方法。在第一生物反应器中气体厌氧发酵产生的副产品可以用于在第二生物反应器中生产产品。此外，发酵第二阶段的副产品可以被循环到第一生物反应器中生产产品。 
因此，提供能以更高效率将这些气体发酵成乙醇的微生物将非常有益，也就是与现有技术微生物相比，所述微生物使用相同的底物，能够生产更多的乙醇，和/或得到更高的乙醇与乙酸盐的比率。 
此外，在将含CO的气体转化成乙醇的微生物发酵现有技术方法中，其产出高水平的乙醇和/或高的乙醇/乙酸盐比率，气态底物通常包含约30-65％体积的CO和约20-30％体积的H2(WO 00/68407)。 
作为微生物发酵产生乙醇的潜在底物，含CO的废气可能包含更高水平的CO和更低水平的H2或两者都包括。因此开发使用将含CO的气体有效地发酵为乙醇的菌株将十分有益，其中例如，所述气体包含大于65％体积的CO和或小于20％体积的H2。 
本发明目的在于提供一类新型细菌，所述细菌能够克服现有技术中将含CO的气态物转化为乙醇的一个或更多个局限，或者至少给公众提供一个有用的选择。 
发明概述 
本发明的第一方面在于提供一种生物纯的细菌分离物，所述细菌能通过厌氧发酵含CO的底物来产生含有乙醇和任选的乙酸盐的产物，其中所述产物以至少1.0比率的乙醇/乙酸盐来产生。 
本发明的另一方面在于提供一种生物纯的细菌分离物，所述细菌能够在供给含CO的底物，特别是含CO的气态底物的液态培养基中通过厌氧发酵产生乙醇和乙酸盐，所述含CO的气态底物包含： 
(a)大于约65％体积的CO， 
(b)小于约20％体积的H2，或 
(c)大于约65％体积的CO和小于约20％体积的H2，乙醇与乙酸盐的比率为至少约1.0。 
在一特定实施方案中，乙醇与乙酸盐的比率为至少约1.1、更优选至少约为1.2、更优选至少约为1.3、并且最优选至少约为1.4。 
在进一步的实施方案中，所述细菌能够以至少约2.0g乙醇每升发酵液的浓度来产生乙醇。 
在特定的实施方案中，所述浓度为至少约2.1g乙醇每升发酵液、至少约2.2g乙醇每升发酵液、至少约2.3g乙醇每升发酵液、至少约2.4g乙醇每升发酵液、至少约2.5g乙醇每升发酵液、至少约2.6g乙醇每升发酵液、至少约2.7g乙醇每升发酵液、至少约2.8g乙醇每升发酵液、至少约3.0g乙醇每升发酵液、至少约3.2g乙醇每升发酵液、或至少约3.4g乙醇每升发酵液。 
在特定的实施方案中，所述细菌的产率为至少约1.2g乙醇/L发酵液/天、至少约1.6g/L/天、至少约1.8g/L/天、或至少2.0g/L/天。 
在某些实施方案中，所述细菌的具体乙醇产率为至少约0.7g/L/g细菌细胞/天、至少约0.9g/L/g细菌细胞/天、至少约1.1g/L/g细菌细胞/天、或至少约1.3g/L/g细菌细胞/天。 
本发明的另一方面提供了一种生物纯的细菌分离物，所述细菌能通过厌氧发酵含CO的底物来产生含有醇类和任选的乙酸盐的产物，其中所述细菌的产率为至少约1.2g乙醇/L发酵液/天。 
本发明的另一方面提供了一种生物纯的细菌分离物，所述细菌能在供给含CO的底物，特别是含CO的气态底物的液态培养基中通过厌氧发酵来产生乙醇和乙酸盐，所述含CO的气态底物包含： 
(a)大于约65％体积的CO， 
(b)小于约20％体积的H2，或 
(c)大于约65％体积的CO和小于约20％体积的H2，其中乙醇的浓度为至少约2.0g醇每升发酵液。 
在特定的实施方案中，所述浓度为至少约2.1g乙醇每升发酵液、至少约2.2g乙醇每升发酵液、至少约2.3g乙醇每升发酵液、至少约2.4g乙醇 每升发酵液、至少约2.5g乙醇每升发酵液、至少约2.6g乙醇每升发酵液、至少约2.7g乙醇每升发酵液、至少约2.8g乙醇每升发酵液、至少约3.0g乙醇每升发酵液、至少约3.2g乙醇每升发酵液、或至少约3.4g乙醇每升发酵液。 
在特定的实施方案中，所述细菌的产率为至少约1.2g乙醇/L发酵液/天、至少约1.6g/L/天、至少约1.8g/L/天或至少2.0g/L/天。 
在某些实施方案中，所述细菌的特定乙醇产率为至少约0.7g/L/g细菌细胞/天、至少约0.9g/L/g细菌细胞/天、至少约1.1g/L/g细菌细胞/天、或至少约1.3g/L/g细菌细胞/天。 
在一实施方案中，乙酸盐作为发酵的副产品而产生。 
在一特定实施方案中，乙醇以乙醇与乙酸盐的比率至少约1.0的比率来产生。在特定的实施方案中，乙醇与乙酸盐的比率为至少约1.1、至少约1.2、至少约1.3或更特别地至少约1.4。 
另一方面，本发明提供了一种产乙酸菌，其中所述细菌具有一个或更多个以下限定特征： 
·无论是否存在酵母提取物都能在基本培养基中生长的能力； 
·与存在酵母提取物的培养基相比，在不存在酵母提取物的培养基中生长更快、产生更高比率的乙醇/乙酸盐、和/或产生更高浓度的乙醇的能力； 
·很少或没有形成孢子的能力； 
·革兰氏阳性； 
·棒状； 
·非运动性。 
在一实施方案中，所述细菌另外还能在供给含CO的底物的液态培养基中通过厌氧发酵产生乙醇，所述含CO的底物包含： 
(a)大于约65％体积的CO， 
(b)小于约20％体积的H2，或 
(c)大于约65％体积的CO和小于约20％体积的H2，乙醇浓度为至少约2.0克每升发酵液，和/或乙醇与乙酸盐的比率为至少约1.0。 
在特定的实施方案中，乙醇与乙酸盐的比率为至少约1.1、至少约1.2、至少约1.3或更特别的至少约1.4。 
在特定的实施方案中，乙醇以至少约2.1g乙醇每升发酵液、至少约2.2g乙醇每升发酵液、至少约2.3g乙醇每升发酵液、至少约2.4g乙醇每升发酵液、至少约2.5g乙醇每升发酵液、至少约2.6g乙醇每升发酵液、至少约2.7g乙醇每升发酵液、至少约2.8g乙醇每升发酵液、至少约3.0g乙醇每升发酵液、至少约3.2g乙醇每升发酵液、或至少约3.4g乙醇每升发酵液的浓度来产生。 
在特定的实施方案中，所述细菌的产率为至少约1.2g乙醇/L发酵液/天、至少约1.6g/L/天、至少约1.8g/L/天、或至少2.0g/L/天。 
在某些实施方案中，所述细菌的具体乙醇产率为至少约0.7g/L/g细菌细胞/天、至少约0.9g/L/g细菌细胞/天、至少约1.1g/L/g细菌细胞/天、或至少约1.3g/L/g细菌细胞/天。 
在一实施方案中，本发明的细菌来源于Clostridium autoethanogenum。 
在一特定的实施方案中，所述细菌具有两种或多种以及优选具有全部的上述限定特征。 
在特定的实施方案中，所述细菌具有保藏于DSMZ保藏号为DSM19630的Clostridium autoethanogenum LBS1560菌株的限定特征。在一实施方案中，所述细菌是保藏于DSMZ保藏号为DSM19630的Clostridium autoethanogenum菌株LBS 1560。 
另一方面，本发明提供了一种保藏于DSMZ保藏号为DSM19630的Clostridium autoethanogenum菌株LBS1560的生物纯的细菌分离物，。 
在一实施方案中，所述底物包含至少约70％体积的CO、至少约75％体积的CO、至少约80％体积的CO、至少约85％体积的CO、至少约90％体积的CO、或至少约95％体积的CO。 
在另一实施方案中，所述底物包含小于约20％体积的H2。在特定的实施方案中，所述底物包含小于15％体积的H2、小于10％体积的H2、小于5％体积的H2、小于4％体积的H2、小于3％体积的H2、小于2％体积的H2、小于体积1％的H2、或基本上不含有H2。 
在另一实施方案中，所述底物包含小于或等于约20％体积的CO2。在特定实施方案中，所述底物包含小于或等于约15％体积的CO2、或包含小于或等于约10％体积的CO2，或包含小于或等于约5％体积的CO2。 
在特定实施方案中，所述底物包含至少约85％体积的CO和至多约15％体积的CO2，至少约90％体积的CO和至多约10％体积的CO2，或约95％体积的CO和约5％体积的CO2。 
在某些实施方案中，所述液态培养基为厌氧微生物基本培养基，所述培养基选自但不限于这里描述的LM23或LM33。 
在一实施方案中，所述培养基未添加酵母提取物。 
在另一方面，本发明提供了一种从含CO的底物中产生一种或多种醇类的方法，所述方法包括在底物存在下，维持本发明的一种或多种细菌分离物的培养，以及通过一种或多种细菌分离物来厌氧发酵底物以产生一种或多种醇类。 
另一方面，本发明提供了一种产生一种或多种醇类的方法，所述方法包括采用本发明之前所述的一种或多种菌来发酵含CO的底物。 
在一实施方案中，所述方法包括以下步骤： 
(a)向含有上述细菌的培养物的生物反应器提供含CO的底物；和 
(b)厌氧发酵所述生物反应器中的所述培养物以产生一种或多种醇类。 
另一方面，本发明提供了减少工业过程中总大气碳排量的方法，所述方法包括： 
(a)在所述气体排放到大气之前，捕获工业生产中产生的含CO的气体； 
(b)通过含有本发明所述的一种或多种细菌分离物的培养物来厌氧发酵所述含CO的气体以产生一种或多种醇类。
在所述方法方面的某些实施方案中，乙酸盐作为发酵的副产品产出。产生的一种或多种醇类优选为乙醇。 
在所述方法方面的特定实施方案中，所述细菌或分离物维持在液态培养基中。 
在所述方法方面的特定实施方案中，所述底物的发酵在生物反应器中进行。 
在某些实施方案中，所述底物包含小于约15％体积的H2，例如小于约10％体积的H2，例如小于约5％体积的H2。 
在某些实施方案中，所述底物包含大于约65％体积的CO，优选为约70％到约95％体积的CO。 
在一实施方案中，所述底物包含至少约70％体积的CO。在一特定实施方案中，所述底物包含至少约80％体积的CO、至少约85％体积的CO、至少约90％体积的CO、或至少约95％体积的CO。 
在一实施方案中，所述底物包含小于约20％体积的H2。在特定的实施方案中，所述底物包含小于约15％体积的H2、小于约10％体积的H2、小于约5％体积的H2、小于约4％体积的H2、小于约3％体积的H2、小于约2％体积的H2、小于约1％体积的H2、或基本上不含有H2。 
在一实施方案中，所述底物含有小于或等于约20％体积的CO2。在特定实施方案中，所述底物含有小于或等于约15％体积的CO2，或小于或等于约10％体积的CO2，或小于或等于约5％体积的CO2。 
在某些实施方案中，所述底物含有至少约85％体积的CO和至多约15％体积的CO2，至少约90％体积的CO和至多约10％体积的CO2，或约95％体积的CO和约5％体积的CO2。 
在某些实施方案中，所述含CO的底物是含CO的气态底物。 
在某些实施方案中，所述气态底物包含作为工业生产副产品的气体。 
在某些实施方案中，所述工业过程选自：铁金属产品制造、有色金属产品制造、石油精炼处理、生物质气化、煤炭气化、电力生产、炭黑生产、合成氨生产、甲醇生产和焦炭生产。 
在一实施方案中，所述气态底物可包含从钢铁厂获得的气体。 
在另一实施方案中，所述气态底物可包含汽车排出的气体。 
在所述方法方面的某些实施方案中，所述乙醇回收自发酵液，所述发酵液是包含细菌细胞和乙醇的液态培养基。 
在某些实施方案中，乙酸盐作为发酵的副产品产出。 
在另外的实施方案中，所述乙醇和乙酸盐从发酵液中回收。 
另一方面，本发明提供了筛选一种或多种能够产生一种或多种酸类的微生物的方法，所述方法包括：在含有培养基的生物反应器中培养微生物；当培养基的pH值高于营养培养基时添加新鲜培养基，以使营养培养基维持在基本恒定的pH值；移走至少一部分营养培养基和微生物，以使生物反应器中的培养基保持基本恒定的体积。 
在特定的实施方案中，所述方法是用于筛选快速生长的微生物。在一实施方案中，所述一种和多种酸包括乙酸盐。 
另一方面，本发明提供了通过所述选择方法得到的生物纯的细菌分离物。在一实施方案中，所述细菌分离物很少或没有能力形成孢子。 
尽管如上所述对本发明进行了广泛的限定，但本发明不局限于此，本发明还包括下述实施例代表的实施方案。 
附图说明
本发明将参照附图来详细描述，其中： 
图1：是用来筛选微生物快速生长的系统的示意图； 
图2：显示了Clostridium autoethanogenum LBS1560的乙醇(正方形)和乙酸盐(菱形)的生产。生物质浓度用三角形数据点表示。 
发明详述 
在广义范围内，一方面本发明涉及在厌氧发酵过程中具有较高效率的一种新型细菌和一种生物纯的细菌分离物。一方面所述细菌能够从底物产生醇类，尤其是乙醇，所述底物包含： 
(a)大于约65％体积的CO， 
(b)小于约20％体积的H2，或 
(c)大于约65％体积的CO和小于约20％体积的H2。 
另一方面，本发明涉及一种生产醇类特别是乙醇的方法，所述方法通过本发明的细菌由厌氧发酵含CO的底物来进行。 
定义 
除非另有说明，本说明书全文中涉及的术语按如下所定义： 
“含CO的底物”和类似术语应当理解为包含其中例如一氧化碳可用于细菌的生长和/或发酵的任何一种底物。在本发明的具体实施方案中，“含CO的底物”是气态的。因此本发明中，这类底物是指“含CO的气态底物”以及其它类似物。 
在以下说明书中，本发明的实施方案是以提供和发酵“含CO的气态底物”的术语进行描述的。然而，应当理解气态底物可以以其它形式提供。例如，含CO的气态底物以溶解在液体中的方式来提供。实际上，液体先用含一氧化碳的气体饱和，然后将该液体加入到生物反应器中。这可以通过标准方法实现。举例来说，可以利用一种微泡分散生成器(Hensirisak等；Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation；Applied Biochemistry and Biotechnology，第101卷，第3期/2002年10月)。进一步举例来说，含CO的气态底物可吸附至固相载体上。这些可供选择的方法都包含在术语“含CO的底物”的应用中。 
当涉及到发酵过程的使用时，术语“提高效率”、“提高的效率”等，包括但不限于，增加以下的一个或多个：催化发酵的微生物的生长速率，每消耗一定体积的底物(比如CO)产生所期望的产物(比如醇类)的体积，在培养基中产生所期望的产物(比如醇类)的浓度，所期望产物的产率或生产水平，以及与其它发酵的副产物相比产生所期望产物的相对比率。 
术语“乙酸盐”既包括乙酸盐本身也包括分子的或游离的乙酸与乙酸盐的混合物，例如本发明描述的发酵液中存在的乙酸盐和游离乙酸的混合物。发酵液中乙酸与乙酸盐的分子比率取决于体系的pH值。 
术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔器或管路排列组成的发酵装置，其包括连续搅拌反应釜(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡装置、气浮发酵器、静态混合器，或其它容器或其它适合气-液接触的装置。 
本发明的细菌或其培养物或细菌分离物，可以被描述为是“分离的”或“生物纯的”的形式。这些术语是为了表示所述细菌已被从环境或(如果在自然界或其它情况下发现时，通常伴随的)一种或多种组分、细胞等中分离出来。术语“分离的”或“生物纯的”不应当被理解为细菌纯化的程度。然而，在一个实施方案中，细菌分离物或培养菌包含优势量的本发明的细菌。 
本发明提供了一种生物纯的细菌分离物，它能够在供给含CO的气态底物的液态培养基中通过厌氧发酵产生乙醇和乙酸盐，所述含CO的气态底物包含： 
(a)大于约65％体积的CO， 
(b)小于约20％体积的H2，或 
(c)大于约65％体积的CO和小于约20％体积的H2， 
其中，乙醇与乙酸盐的比率至少约为1.0。正如本发明其它部分描述的，在一实施方案中，所述细菌来自C.autoethanogenum。 
在某些实施方案中，乙醇与乙酸盐的比率至少约为1.1、或至少约1.2、或至少约1.3或至少约1.4。 
在进一步的实施方案中，所述细菌以至少约2.1g乙醇每升发酵液、至少约2.2g乙醇每升发酵液、至少约2.3g乙醇每升发酵液、至少约2.4g乙醇每升发酵液、至少约2.5g乙醇每升发酵液、至少约2.6g乙醇每升发酵液、至少约2.7g乙醇每升发酵液、至少约2.8g乙醇每升发酵液、至少约3.0g乙醇每升发酵液、至少约3.2g乙醇每升发酵液、至少约3.4g乙醇每升发酵液的浓度产生乙醇。 
乙醇的产率按乙醇的体积产率计算，即以乙醇的浓度和在批次系统中达到该浓度所需时间的比值来计算。还可以在连续系统中计算微生物发酵的产率。在本发明的特定实施方案中，所述细菌的产率为至少1.2g乙醇/L发酵液/天、或至少1.6g/L/天、或至少1.8g/L/天、或至少2.0g/L/天。 
微生物培养物的具体产率取决于微生物培养物中活性微生物的比例。在本发明特定实施方案中，乙醇的特定产率至少是0.7g/L/g细菌细胞/天、或至少0.9g/L/g细菌细胞/天、或至少1.1g/L/g细菌细胞/天、或至少1.3g/L/g细菌细胞/天。 
本发明还提供了一种生物纯的细菌分离物，它能够在供给含CO的气态底物的液态培养基中通过厌氧发酵来产生乙醇，所述含CO的气态底物包含： 
(a)体积大于65％的CO， 
(b)体积小于20％的H2，或 
(c)体积大于65％的CO和体积小于20％的H2， 
其中乙醇的浓度至少是2.0g乙醇每升发酵液。正如本发明描述的，在一实施方案中，所述细菌来自C.autoethanogenum。 
在进一步的实施方案中，所述细菌能以至少约2.1g乙醇每升发酵液、至少约2.2g乙醇每升发酵液、至少约2.3g乙醇每升发酵液、至少约2.4g乙醇每升发酵液、至少约2.5g乙醇每升发酵液、至少约2.6g乙醇每升发酵液、至少约2.7g乙醇每升发酵液、至少约2.8g乙醇每升发酵液、至少约3.0g乙醇每升发酵液、至少约3.2g乙醇每升发酵液、至少约3.4g乙醇每升发酵液的浓度产生乙醇。 
在本发明的特定实施方案中，所述细菌的产率为至少1.2g乙醇/L发酵液/天、或至少1.6g/L/天、或至少1.8g/L/天、或至少2.0g/L/天。 
在本发明的某些实施方案中，乙醇的具体产率为至少0.7g/L/g细菌细胞/天、或至少0.9g/L/g细菌细胞/天、或至少1.1g/L/g细菌细胞/天、或至少1.3g/L/g细菌细胞/天。 
典型地，乙酸盐是发酵的副产物。在一实施方案中，乙醇在乙醇与乙酸盐的比率为至少约1.0的比率下生产。在特定实施方案中，乙醇与乙酸盐的比率为至少约1.1、或至少约1.2、或至少约1.3、或至少约1.4。 
本发明还提供了一种产乙酸菌，其在如下描述的实验条件下观察时，具有一个或多个如下限定特征：无论是否存在酵母提取物都能在基本培养基中生长的能力；与存在酵母提取物的培养基相比，在不存在酵母提取物的培养基中生长更快，产生更高比率的乙醇/乙酸盐，和/或产生更高浓度的乙醇的能力；很少或没有形成孢子的能力；革兰氏阳性；棒状；非运动性。 
在一实施方案中，所述细菌基本上没有形成孢子的能力。在一实施方案中，在下文描述的条件下，基本上没有菌落形成孢子。 
在一实施方案中，产乙酸菌还能够在供给含CO的气态底物的液态培养基中通过厌氧发酵产生乙醇，所述含CO的气态底物包含：大于约65％体积的CO；小于约20％体积的H2；或大于约65％体积的CO和小于约20％体积的H2；其中乙醇的浓度至少是2.0g乙醇每升发酵液，和/或乙醇与乙酸盐的比率为至少约1.0。 
本发明的细菌可来自Clostridium.autoethanogenum。 
让人感到意外的是，观察到本发明的某些实施方案中的细菌具有很少或不具有形成孢子的能力。这相对于包括Clostridium autoethanogenum在内的Clostridia属其它菌株而言，提供了预料不到的好效果。孢子形成是有限活动的静止阶段。减少或改进形成孢子的能力有很多好处。例如，当处于不形成孢子的状态时，单一细菌细胞可以仅分裂和产生代谢物(例如乙酸盐和/或乙醇)。相应的，在细菌不形成孢子的情况下，分裂和代谢物产生的时间范围都可得到延长。形成孢子能力的缺失，也可对整个培养过程提供额外的控制，其中整个活性菌群可在更长时间内适合于促进生长和/或代谢物的产生。因此，使用本发明的细菌可以提高发酵过程中诸如乙酸盐和/或乙醇之类的产物产生的整体效率。 
在本发明的某些实施方案中，所述细菌具有两个或多个，以及更优选具有全部上述特性。在本发明的一些实施方案中，所述细菌具有Clostridium autoethanogenum菌株LBS1560的限定特征，上述菌株根据布达佩斯公约，于2007年10月19日保藏于德国DSMZ，其保藏号为DSM19630。在特定 的实施方案中，所述细菌是Clostridium autoethanogenum菌株LBS1560、DSM 19630。 
本发明还涉及从本发明菌株传代得到的细菌。 
在某些实施方案中，在提高气态底物中CO水平时，本发明的细菌能产生上述讨论的乙醇浓度以及乙醇与乙酸盐的比率。气态底物可包含至少约70％体积的CO。在某些实施方案中，气态底物包含至少约80％体积的CO、至少约85％体积的CO、至少约90％体积的CO、或至少约95％体积的CO。 
类似地，在某些实施方案中，在气态底物中H2水平低至没有的情况下，也可获得上述讨论的乙醇浓度以及乙醇与乙酸盐的比率。所述气态底物可包含小于约20％体积的H2。在特定实施方案中，所述气态底物包含小于约15％体积的H2、或所述气态底物包含小于约10％体积的H2、或所述气态底物包含小于约5％体积的H2、或所述气态底物包含小于约4％体积的H2、或所述气态底物包含小于约3％体积的H2、或所述气态底物包含小于约2％体积的H2、或所述气态底物包含小于约1％体积的H2、或所述气态底物不包含H2。 
在某些实施方案中，当供给含相对少的CO2的气态底物时，本发明的细菌也可以产生乙醇浓度以及乙醇与乙酸盐的比率。在一实施方案中，气态底物含有小于或等于约20％体积的CO2。在某些实施方案中，气态底物含有小于或等于约15％体积的CO2、或含有小于或等于约10％体积的CO2、或含有小于或等于约5％体积的CO2。 
在某些实施方案中，所述气态底物含有约85％体积的CO和约15％体积的CO2、或者气态底物含有至少约90％体积的CO和至多约10％体积的CO2、或者气态底物含有约95％体积的CO和体积约5％的CO2。 
在某些实施方案中，所述培养在液态培养基中进行。优选的液态培养基是厌氧微生物基本培养基。合适的培养基是本领域所熟知的，例如在美国专利号5,173,429和5,593,886以及WO02/08438中有描述，并且在Klasson等人[(1992).Bioconversion of Synthesis gas into Liquid or gaseous Fuels.Enz.Microb.Technol.14：602-608.]，Najafpour和Younesi[(2006).Ethanol and acetate synthesis from waste gas usin g batch culture of Clostridium ljun gdahlii.Enzyme and Microbial Technology，第38卷，1-2期，第223-228页]以及Lewis等人[(2002).Makin g the connection-conversion of biomass-generated producer gas to ethanol.Abst.Bioenergy，第2091-2094页]中都有描述。在本发明的特定实施方案中，厌氧微生物基本培养基是本发明定义的LM23或LM33。 
在某些实施方案中，所述培养基还添加了其它成分，例如但不限于氨基酸和胰蛋白酶解酪蛋白。优选的，培养基不添加其它的成分。 
在某些实施方案中，所述培养基还可添加酵母提取物。在某些实施方案中，与添加了酵母提取物的培养基相比，在未添加酵母提取物的培养基中培养物的生长速度更快。在进一步实施方案中，与添加了酵母提取物的培养基相比，在未添加酵母提取物的培养基中培养物产生的乙醇/乙酸盐的比率更高。在进一步实施方案中，与添加了酵母提取物的培养基相比，在未添加酵母提取物的培养基中培养物产生的每升培养基中乙醇的浓度更高。在特定实施方案中，培养基中不添加酵母提取物。 
本发明还提供了从含CO的气态底物中产生一种或多种醇类的方法，该方法包括在气态底物存在下，维持本发明一种或多种细菌分离物的培养， 以及通过一种或多种细菌分离物来厌氧发酵气态底物从而产生一种或多种醇类。 
本发明还提供一种减少工业过程中总大气碳排放量的方法，所述方法包括： 
(a)在所述气体排放到大气之前，捕获工业生产中产生的含CO的气体； 
(b)通过含有本发明所述的一种或多种细菌分离物的培养物来厌氧发酵含CO的气体以产生一种或多种醇类。
在本发明方法的某些实施方案中，乙酸盐作为发酵的副产物产生。产生的醇类是乙醇。 
在某些实施方案中，所述培养在液态营养培养基中进行。 
发酵可在任何合适的生物反应器中进行，例如连续搅拌反应釜(CTSR)、鼓泡塔反应器(BCR)、或滴流床反应器(TBR)。同时，在本发明的一些优选实施方案中，生物反应器可包括：第一，微生物在其中培养的生长反应器，以及第二，发酵反应器，向其中加入来自生长反应器的发酵液且在其中产生大多数发酵产物(乙醇和乙酸盐)。 
如上所述，发酵反应的碳源是含CO的气态底物。所述气态底物是含CO的废气，其来源于工业过程的副产物或其它来源例如机动车废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自：铁金属产品制造(比如钢铁厂)、有色金属产品制造、石油精炼处理、煤炭气化、电力生产、炭黑生产、合成氨生产、甲醇生产和焦炭生产。在这些实施方案中，在来自工业过程的含CO的气体被排放至大气中之前，采用任何简便的方法将其捕获。在将其导入发酵之前，根据含CO的气态底物的组成，理想地可以对其进行处理以除 去不期望的杂质，比如尘粒。例如，可以采用已知的方法过滤或洗涤气态底物。 
另外，通常希望增加底物气流中CO的浓度(或气态底物中CO的分压)，以增加以CO作为底物的发酵反应的效率。增加气态底物中CO的分压可使转移入发酵培养基中的CO的量增加。参与发酵反应的气流的组成对反应的效率和/或反应成本有显著影响。例如，O2可以减少厌氧发酵过程的效率。在发酵之前或之后，在发酵过程的各阶段处理不需要或不必要的气体增加了这些阶段的负担(比如，在进入生物反应器之前对气流进行加压，不必要的能量将被用于压缩那些在发酵反应中不需要的气体)。相应地，理想地可以处理底物流，特别是工业来源的底物流，以除去不需要的成分并增加目标组分的浓度。 
来源于工业来源的底物流在组成上通常是变化的。此外，来源于含有高浓度CO(比如至少50％或至少65％)工业来源的底物流，通常具有低含量的H2(比如小于20％或小于10％或0％)。像这样，非常理想的是微生物可通过厌氧发酵含有一定范围的CO和H2浓度(特别是高浓度的CO和低浓度的H2)的底物来产生产物。发明人试验了C.autoethanogenum(来源于DSMZ，其保藏号为DSM10061)，发现它在含CO且不含有H2的气态底物中不能生长和产生产物。然而，本发明的细菌具有在含CO(不含有H2)的底物中发酵，生长，产生产物(乙醇和乙酸盐)的令人惊奇的能力。 
底物流中氢气的存在可改善整个碳捕获效率和/或乙醇产率。例如WO02/08438中描述了使用各种组成的气流来产生乙醇。WO02/08438报道了在生物反应器中培养C.ljungdahlii时，所提供的含有63％H2，32％CO和5％CH4的底物流能促进微生物的生长和乙醇的产生。当培养物达到稳定 状态，微生物的生长不再是主要目标时，所述底物流转变为15.8％H2，36.5％CO，38.4％N2和9.3％CO2以提供稍过量的CO，从而促进乙醇的产生。这篇文献同时描述了更高浓度和更低浓度的CO和H2的气流。 
可以理解，本发明描述的方法可被用于减少工业过程产生的总大气碳排放，其通过捕获工业过程中产生含CO的气体并利用它们作为本发明所述的发酵过程的底物来实现。 
可选择地，在本发明的其它实施方案中，含CO的气态底物可来源于生物质气化。所述气化过程涉及在空气或氧气供应受限的环境中生物质的不完全燃烧。产物气一般主要包括CO和H2，以及少量体积的CO2、甲烷、乙烯和乙烷。例如，生物质副产物可被气化以产生适合在本发明中使用的含CO的气体，所述生物质副产物来源于食品(例如从甘蔗中提取的糖、或从玉米和谷物中提取的淀粉)或林业工业产生的非食用生物质废弃物的提取和加工。 
通常优选含CO的气态底物，其含有主要组分的CO。在特定实施方案中，所述气态底物含有至少约65％体积的CO，或至少约70％到约95％体积的CO。气态底物中并不是必需要含有氢气。气态底物也可选择的含有一些CO2，例如约1％到约30％的体积，例如约5％到约10％的CO2。 
可以理解，为了细菌的生长和CO-乙醇发酵过程发生，除了含CO的气态底物，生物反应器中还需要添加合适的液态营养培养基。营养培养基应包含足以允许微生物生长的维生素和矿物质。适合于以CO作为唯一碳源发酵产生乙醇的厌氧培养基是本领域公知的。例如，合适的培养基描述于美国专利号5,173,429、5,593,886和WO02/08438，及其它此前引用的文献中。在一本发明的实施方案中，在下述实施例中描述的培养基是LM23。 
发酵过程应当理想地在适合于CO-乙醇发酵发生的条件下进行。应当考虑的反应条件包括压力、温度、气流速度、液态流速度、培养基pH值、培养基电极电位、搅拌速率(如果使用连续搅拌反应釜)、接种水平、确保液相中的CO不成为限制性条件的最大气体底物浓度、以及避免产物抑制的最大产物浓度。 
最适宜的反应条件部分取决于本发明使用的特定微生物。然而，通常优选发酵在压力要高于环境压力的条件下进行。在压力增高的环境中操作，可以显著提高CO从气相转移到液相的比例，其中微生物在液相中利用CO作为碳源产生乙醇。这也意味着当生物反应器维持在高于大气压的压力条件下，滞留时间(定义为生物反应器中的液相体积除以输入的气流速度)减少。 
此外，由于给定的CO-乙醇转化率是底物滞留时间的部分函数，而实现预期滞留时间将决定生物反应器所需的体积，增压系统的使用可显著减少生物反应器所需的体积，并且相应的发酵装置的主要成本也大大降低。根据美国专利号5,593,886中描述的实施方案，反应器体积可按与反应器操作压力呈线性比例的方式减小，即，在10个大气压下操作的生物反应器仅需要在1个大气压下操作的生物反应器体积的十分之一体积。 
在加压的环境下进行气体-乙醇的发酵的好处，在其它文献中也有描述。例如，WO02/08438描述了在30psig和75psig压力进行气体-乙醇的发酵，其相应的乙醇产率分别为150g/l/天和369g/l/天。然而，在大气压下，以相似的培养基和输入气体组成进行的发酵实施例被发现每升每天的乙醇产量减少10-20倍。 
理想的，含CO的气态底物的导入速率为确保液相中的CO的浓度不会变成限制性条件的速率。这是由于CO限制性条件的后果将导致产生的乙醇被培养物消耗。 
在某些实施方案中，如上所述根据本发明的发酵方法将导致液态培养基中的发酵液中含有乙醇和细菌细胞。在本发明方法的优选实施方案中，乙醇从发酵液中回收。 
在某些实施方案中，回收乙醇的过程包括不断转移一部分发酵液，以及从转移走的发酵液部分中回收乙醇。 
在特定的实施方案中，回收乙醇的过程包括将转移走的含有乙醇的发酵液部分通过分离单元，从而将细菌细胞从发酵液中分离，以产生不含细胞的含醇过滤物，并将细菌细胞重新转移入生物反应器中。 
在某些实施方案中，本发明所述的方法是连续过程。 
在特定实施方案中，乙酸盐作为发酵的副产物产生。 
在进一步的实施方案中，乙醇和乙酸盐从发酵液中回收。 
在某些实施方案中，乙醇和乙酸盐的回收包括不断地转移一部分发酵液，以及从转移走的发酵液部分中分别回收乙醇和乙酸盐。 
在某些实施方案中，乙醇和乙酸盐的回收过程包括将含有乙醇和乙酸盐的的发酵液转移部分通过分离单元，从而将细菌细胞与乙醇和乙酸盐分离，已产生不含细胞的含有乙醇和乙酸盐的过滤物，并将细菌细胞重新转移入生物反应器。 
在上述实施方案中，乙醇和乙酸盐的回收过程优选包括首先从不含细胞的过滤物中回收乙醇，然后从不含细胞的过滤物中转移出乙酸盐。优选所述不含细胞的过滤液随后被重新转移入生物反应器。 
在某些实施方案中，本发明所述的方法是连续过程。 
乙醇是发酵过程优选的期望的终产物。可以采用本领域熟知的方法，例如分馏或蒸发，以及萃取发酵，将乙醇从发酵液中回收。从发酵液中蒸馏乙醇产生乙醇和水的共沸混合物(即，95％的乙醇和5％的水)。无水乙醇可随后通过分子筛乙醇脱水技术得到，这种技术同样是本领域所熟知的。萃取发酵方法涉及使用对发酵有机体毒性风险低的水互溶溶剂，从而从稀释的发酵液中回收乙醇。例如，油醇是一种可以用于这种提取方法的溶剂。油醇被不断地加入到发酵容器中，然后该溶剂上升在发酵容器的顶部形成液体层，该液体层经离心机连续提取和加料。水和细胞很容易的从油醇中分离并重新转移入发酵容器，同时将含有乙醇的溶剂加入到闪蒸单元。大部分乙醇被蒸发浓缩，而油醇不挥发，将其回收以重新用于发酵。 
乙酸盐也可以采用本领域熟知的方法从发酵液中回收。用于回收乙酸盐的方法在WO2007/117157和WO2008/115080中有详细描述。 
在本发明的某些实施方案中，乙醇和乙酸盐可以通过如下方式从发酵液中回收：不断地从发酵生物反应器中转移走一部分发酵液，从发酵液中分离微生物细胞(常规通过过滤)，然后先回收乙醇再回收乙酸盐。按照以上描述的方法，乙醇可以常规地通过蒸馏回收，乙酸盐可通过活化的活性炭吸附。分离的微生物细胞优选可重新转移入发酵生物反应器。剩下的不含细胞的过滤物在乙醇和乙酸盐被回收后也优选地可以重新转移入发酵生物反应器。在其重新转移入生物反应器之前，其它营养成分(比如维生素B)可以被加入到不含细胞的过滤物中以补充培养基的养分。而且，如果如上所述调整了发酵液的pH值从而加强活性炭对乙酸的吸附，则在发酵 液被重新转移入生物反应器之前，应当重新调整pH以使之与发酵生物反应器中发酵液的pH值相近。 
反应的化学计量(Reaction stoichiometry) 
不希望受任何理论的束缚的情况下，发明人认为本发明所述的CO发酵产生乙醇(a)和乙酸(b)的化学反应如下进行： 
(a)18CO+9H2O＝＞3CH3CH2OH+12CO2
(b)12CO+6H2O＝＞3CH3COOH+6CO2
本发明得以介由参考以下非限制性的实施例来详细阐述。 
实施例
培养基 
以下实施例中所用培养基组分的构成列于表1和表2中。 
表1.用于C.autoethano genum的培养基构成 
  培养基组分   每1.0L培养基中的  浓度(LM17)   每1.0L培养基中的  浓度(LM23)   每1.0L培养基中的  浓度(LM33)
  MgCl2·6H2O   0.5g   0.5g   0.5g
  NaCl   0.2g   0.2g   0.2g
  CaCl2   0.2g   0.2g   0.2g
  (NH4)2HPO4   2.0g   -   -
  100mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)*   -   160mL   -
  NaH2PO4   -   -   2.04g
  NH4Cl   -   0.6g   2.5g
  85％H3PO4   0.05mL   0.05mL   -
  KCl   0.15g   0.15g   0.15g
[0187] 
  复合微量金属溶液(LSO6)   10mL   10mL   10mL
  复合维生素B溶液(LS03)   10mL   10mL   10mL
  刃天青(1000mg/L储存液)   1mL   1mL   2mL
  FeCl3   0.0025g   0.0025g   0.01g
  盐酸半胱氨酸一水合物   0.75g   0.75g   0.5g
  琼脂糖(任选)     15g   15g
  蒸馏水   定容至1L   定容至1L   定容至1L
*将NaH2PO4(13.2g)和Na2HPO2·7H2O(1.1g)混合溶解于水中(1L)。 
表2.C.autoethanogenum复合矿物质和维生素溶液 
Figure BPA00001182203900261
Figure BPA00001182203900271
如下所述，LM17、LM23、LM33培养基制备成pH值5.5。除盐酸半胱氨酸外，所有成分均与蒸馏水混合至总体积为1L。通过加热至沸腾以除去溶液中的氧，然后在95％CO、5％CO2的恒定气流下使其冷却至室温。冷却后加入盐酸半胱氨酸并将溶液pH调整至5.5；整个实验过程保持厌氧环境。 
乙醇和乙酸盐的测定 
在以下实施例中，乙醇和乙酸盐的测定在HP 5890系列II气相色谱仪上进行——其配有氢火焰离子化检测器(FID)、可移除的去活化玻璃制进样口衬管、连接的调节器、气路、具有自动进样器HP 7673A的隔垫。色谱分离在毛细管气相色谱柱EC1000-Alltech EC1000(30m×0.25mm×0.25μm)上进行。 
气相色谱以分流模式操作，总氢气流为50mL/min，吹扫气流5mL(分流比1∶10)，使线速度为45cm/sec的20psig柱头压。温度程序最开始为60℃，保持1分钟，然后以每分钟30℃的速度升至170℃。总运行时间为4.65分钟，进样口温度为180℃，检测器温度为225℃。 
使用的试剂为：正丙醇-试剂级-Scharlau AL0437，Min实验GC99.5％；无水乙醇-Scharlau ET0015，Min实验GC 99.9％；100％冰醋酸-BDH 100015N，Min实验GC 99.8％；正磷酸-BDH 294214Q，Min实验GC 99.0％；N2-BOC无氧气相色谱尾吹气；H2-BOC无氧气相色谱载气和FID燃气；零空气-FID氧化剂；去离子水。 
细胞密度 
为了测定实验中的细胞密度，样品的吸光度在600nm(分光光度计)处测定，并根据已公开的方法通过计算来确定干重。代谢物水平通过高效液相色谱法(HPLC)测定，在某些情况下采用气相色谱(GC)测定。 
HPLC 
Agilent 1100系列HPLC系统。流动相：0.0025N硫酸。流速和压力：0.800mL/min。色谱柱：Alltech IOA，目录号#9648，150×6.5mm，粒子大小5μm。柱温：60℃。检测器：示差折光检测器。检测器温度：45℃。 
用于HPLC的样品按照如下方法制备：向Eppendorf管中加入400μL样品溶液、50μL的0.15M ZnSO4和50μL的0.15M Ba(OH)2，4℃下12,000rpm离心10分钟。取200μL上清液转移到HPLC样品瓶中，并将5μL进样至HPLC装置中。 
实施例1：制备本发明的一种新的细菌分离物 
新菌株Clostridium autoethanogenum LBS1560是通过对来自亲代C.autoethano genum(DSMZ 10061)培养物的微生物培养物进行18个月的专门筛选和繁殖过程来制备的。 
方法 
将C.autoethanogehum 10061的冷冻存储液(从DSMZ获得)解冻并接种于LM23培养基中，该培养基采用5g/L酵母提取物在95％CO、5％CO2的条件下制得。该培养物不能在缺乏酵母提取物的LM23培养基上生长。 在几个月的时间内，为克服培养物对酵母提取物的依赖，将那些观察到产乙醇量最大和乙醇/乙酸盐比率最高的活性生长微生物培养物重复接种到酵母提取物浓度逐渐减少的培养基中，上述实验始终在95％CO、5％CO2的顶空气体存在的条件下进行。经过这段时间后，可以在缺少酵母提取物的情况下观察到培养物生长并产生乙醇和乙酸盐。积极保持这个选择程序从而进一步确认并筛选如下培养物： 
i)生长最快； 
ii)产生最大量的乙醇； 
iii)产生最高比率的乙醇/乙酸盐； 
iv)在缺乏酵母提取物的液态培养基中生长。 
实施例1.1快速生长选择 
为筛选快速生长的培养物，利用了如下微生物：其倾向于在95％CO、5％CO2的持续气流中，产生乙酸作为能量代谢的副产物。生长培养基中乙酸的累积具有降低操作中的pH的效果。因此，开发了一种发酵装置，其能够以生长依赖的方式稀释培养物，以便导入能够筛选最快生长菌落的压力。图1显示了示例性装置，其中微生物培养物在生物反应器1中发酵。培养基2的pH值采用常规pH计3监测。pH值读数偏离设定点5.5将导致泵4激活，而不是从传感器来的信号被传递给加入碱或酸溶液的泵；在这种情况下，泵连接到装有pH5.8的新鲜厌氧培养基LM17的瓶5。这样，随着培养物的生长，生成乙酸，培养基2的pH值开始降低，导致泵4的激活，从而导入pH5.8的培养基。只有当pH恢复到5.5或更高时泵4才被去激活。生物反应器1的液面由连接到第二泵7的液面传感器6来维持，第二泵7 控制维持生物反应器1的液面位于或低于固定液面。从生物反应器1中泵出的培养基被转移至废液容器/桶8。因此，生长的培养物菌落以生长相关的模式被稀释，菌落生长越快，乙酸盐产生越多，越多的新鲜培养基被导入，直到最终相对大体积的培养基被加入到发酵液中以保持有效筛选生长速度最快的菌落的pH值，上述菌落由于容器中的液面维持一个固定的水平而不会被冲走。这个发酵装置每次维持数月的连续培养，以便筛选快速生长的培养物。每过14天，转移一份培养物至装有50mL培养基和35psig的95％CO、5％CO2顶空气的250mL血清瓶中。一旦制备得到活性生长的培养物，则以甘油储存液保存，以与原始培养物储存液进行比较。 
结果 
如上所述，经过为期18个月的筛选和传代程序，得到一个新的菌株LBS1560，其展现出上述i)至iv)特征的优异表现。上述新的菌株被观察到是革兰氏阳性(其革兰氏染色阳性)、非运动性、具有棒状形状、并令人惊讶地展现出很少或没有形成孢子的能力(如下文所述)。 
按照布达佩斯条约的规定，于2007年10月19日将LBS1560保藏于德国的DSMZ，其分配的保藏号为DSM 19630。 
实施例2：LBS1560的培养和储存 
C.autoethanogenum LBS1560可采用如下条件来培养：在LM23培养基中，95％CO(5％CO2)35psi气体，37℃，pH 5.5，在厌氧条件下振动(200rpm振摇)培养。可以通过测定600nm处的OD值和显微镜分析来监测生长情况。 
对于储存，选取对数生长期LBS1560的培养物，置于加入20％甘油的LM23培养基中，迅速冷冻然后储存在-80℃。 
实施例3：新的C.autoethanogenum LBS1560与原始亲代C.autoethanogenum DSM 10061菌株的区别 
本实验表明，与亲代菌株C.autoethanogenum DSMZ 10061相比，在厌氧发酵含CO的气态底物从而产生乙醇方面，新的菌株LBS1560的效率更高。这个实验还显示，在存在高水平CO且不存在H2的条件下，新的菌株LBS1560能有效地将含CO的气体厌氧发酵成为乙醇。 
方法 
取出微生物培养物LBS1560和亲代DSMZ 10061菌株培养物的冷冻储备液，将其解冻并接种至密封的15mL的Hungate管中，其中所述Hungate管中含添加或未添加0.1％(w/v)酵母提取物(YE)的5mL液态基本厌氧微生物生长培养基(LM23)。所有的Hungate管都保持在95％CO和5％CO2的气体环境中。对于每一个Hungate管，在为期7天的培养周期内监测微生物的生长、乙醇和乙酸盐的产生。 
结果 
实验结果列于如下表3中。 
表3.菌株LBS1560和亲代菌株DSMZ 10061的发酵比较 
Figure BPA00001182203900321
表3中的数据突出强调了菌株LBS1560和亲代菌株DSMZ 10061一些繁殖方面的差异。DSMZ 10061不能在缺乏酵母提取物的基本培养基中生长，而LBS1560在添加或未添加酵母提取物的培养基中均能生长，不过其在未添加酵母提取物的基本培养基中生长最好。在生长、乙醇产量、乙醇乙酸盐的比率方面，在基本培养基中生长的LBS1560的表现均好于在添加酵母提取物的培养基中生长的DSMZ 10061。 
实施例4：LBS1560的孢子形成特征 
为确定孢子形成特征，按照如下详细描述的方法将LBS1560暴露于各种已知的能诱导细菌中孢子形成的条件下。 
·饥饿：将LBS 1560培养物悬浮于无菌的蒸馏水。 
·暴露于氧气：将无菌空气注入到含有5mL生长培养物的Hungate管的顶部空间，随后将管置于摇床中于37℃下孵育。 
·暴露于低pH环境(pH 3)：将微生物置于LM23(pH 5.5)培养基中生长到高细胞浓度，随后将培养基换成新鲜的pH 3培养基。 
·暴露于氧气中并将果糖作为碳和能量来源：用氧气饱和含有5g/L的果糖且不含还原剂(如盐酸半胱氨酸)的液态培养基，并将高浓度的细胞悬浮于该培养基中2天。 
采用显微镜检查LBS1560形成孢子的能力。细菌样品用便于观察孢子的考马斯亮蓝染色。在多个视野中观察LBS1560。基本上没有菌落被观察到形成孢子。需要指出的是，尽管在显微镜的某些视野能观察到零散的孢子，但估计他们显著小于整个微生物菌落的0.1％。考虑到亲代已知菌株和相关的梭状芽孢杆菌菌株是形成孢子的，这非常令人惊讶和感到意外。无法形成孢子为本发明所述的菌株提供了如前所述的优点。 
实施例5：LBS1560产生乙醇 
本实施例描述了在一较长时期内利用LBS1560进行连续的乙醇生产。图2提供了在两周的时间内，乙酸盐、乙醇和生物质的浓度的总结。 
方法 
1.将活跃生长的Clostridium autoethanogenum(LBS1560)培养物(DSMZ 19630)接种于1L CSTR中的1L厌氧LM33发酵培养基中，接种水平为5％(v/v)。将连续气流(70％CO、15％CO2、1％H2、14％N2)通过喷洒器以19mL/分钟的体积流速导入发酵容器底部。发酵的初始pH值设为5.5并且搅拌速度调整为400rpm。 
2.对于实验的主要部分，通过细胞再循环和培养基更换系统，培养物中乙酸的浓度被保持在低于4g/L。将细胞通过错流膜Viva 200，收集滤液，并将细胞返回反应容器。用新鲜培养基更换滤液以保证反应器中培养基体积保持恒定。 
3.所述培养持续至少14天。细胞再循环系统每1-2天移走1-1.5L液态营养培养基，但不从生物反应器中移走细菌。用新鲜的培养基代替移走的培养基，从而保持体积恒定。 
4.在实验的最初4天，发酵液的pH值从5.6增加到6.0。 
结果 
在一个控制的发酵环境中，产乙酸菌(例如C.autoethanogenum)的快速生长阶段通常与高乙酸盐产量相关。在这个实验中采用新菌株LBS1560，在快速生长阶段(0-3天)培养物平均产生0.3g/L/天的乙酸盐和0.16g/L/天的乙醇。在随后的生长阶段(3-13天)，培养物平均产生1.03g/L/天的乙酸盐和1.4g/L/天的乙醇。在醇类生产期，产生的总乙醇量为14g/L。结果显示乙酸盐的产量比预期的要低，而乙醇的产量明显的比预期要高。 
本发明描述的具体方法和组合物是代表性的优选实施方式，其作为示例而不是对本发明的范围进行限制。本领域普通技术人员在理解本说明书的基础上将能够得出本发明的其它目的、方面和实施方式，它们均被包含在本发明的范围和主旨中。对于本领域普通技术人员来说，对本发明公开内容所作出的各种替换和修改都是显而易见的，没有超出本发明的范围。在这里描述的本发明在实践中可以缺少某个或某些要素或限制，这些因素和限制没有被特别作为必须部分在这里公开。例如，举例来说，在本发明中的实施方案或实施例中，术语“组成”、“包含”、“包括”等应该被宽泛的理解，没有限制。另外，标题、题目等是为帮助读者理解本文而提供的，其不应当理解为对本发明的限制。 
上下文中所有引用的申请、专利和出版物的全部公开内容在此作为参考被纳入本文。然而本说明书中对任何申请、专利和出版物的引用不是，也不应该被视为承认或提示它们在世界上任一国家构成有效的现有技术或形成公知常识。 

Claims (7)

1.一种Clostridium autoethanogenum菌株，其保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，保藏号为DSM19630。
2.权利要求1的菌株通过厌氧发酵含CO的底物来产生包括乙醇和乙酸盐的产物的用途。
3.权利要求2的用途，其中所述乙醇与乙酸盐的比例至少为1.0。
4.权利要求2的用途，其中所述菌株的乙醇生产率为至少1.2g乙醇/升发酵液/天。
5.权利要求2的用途，其中所述底物包含大于65％体积的CO。
6.权利要求2的用途，其中所述乙醇与乙酸盐的比例至少为1.2。
7.权利要求2的用途，其中所述菌株的乙醇生产率为至少2.0g乙醇/升发酵液/天。
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