KR20100110300A - 신규 세균 및 이의 이용 방법 - Google Patents

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Abstract

일산화탄소를 포함하는 기질의 혐기성 발효에 의하여 에탄올 생성 효율이 개선된 신규한 세균을 기술하였다.

Description

신규 세균 및 이의 이용 방법 {NOVEL BACTERIA AND METHODS OF USE THEREOF}
본 발명은 일반적으로 기체의 미생물 발효 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 일산화탄소 (CO)를 포함하는 기질의 혐기성 발효에 의하여 에탄올 생산 효율이 개선된 신규한 세균에 관한 것이다.
에탄올은 전 세계적으로 급속히 주요한 수소 풍부 액체 전달 연료가 되고 있다. 2005년에 전 세계적인 에탄올의 소비는 122억 갤런으로 추정되었다. 유럽, 일본, 미국, 그리고 몇몇의 개발 도상 국가 내에서의 에탄올에 대한 관심 증가로 인하여, 연료 에탄올 산업의 세계적인 시장은 미래에 급격히 성장할 것으로 또한 예측되고 있다.
예를 들면, 미국에서는 에탄올이 E10, 가솔린 내의 10%의 에탄올 혼합물을 생산하는데 사용된다. E10 혼합물 내의 에탄올 성분은 산소 공급제로서 작용하고, 연소의 효능을 증진시키며 대기 오염 물질의 생산을 감소한다. 브라질에서는, 에탄올은 가솔린 내에 산소 공급제로서 혼합되며, 그리고 그 자체가 순수 연료로서 운송 수단 연료 수요의 대략 30%를 충족시키고 있다. 또한, 유럽에서는, 온실 가스 (Green House Gas; GHG) 배출 결과를 둘러싼 환경적 우려는 유럽 연합 (EU)이 구성 국가들에게 에탄올에서 유래된 바이오매스 등과 같은 지속 가능한 운송 수단 연료들의 소비에 대한 규정된 목표치를 설정하도록 하는 자극제가 되었다.
연료 에탄올의 대부분은 주요 탄소원으로서 사탕수수에서 추출한 수크로오스 또는 곡류 작물에서 추출한 녹말 등과 같은 탄수화물에서 유래한 작물을 사용하는 전통적인 효모계 발효 공정을 통하여 생산되었다. 그러나, 이러한 탄수화물 공급 원료의 비용은 식량 또는 동물 사료로서의 그것의 가치에 영향을 받으며, 에탄올 생산을 위한 녹말 또는 수크로오스 생산 작물의 재배는 모든 지형에서 경제적으로, 지속적으로 유지 가능한 것이 아니다. 따라서, 더 저렴한 비용 및/또는 연료 에탄올에 대한 더욱 풍부한 탄소원으로 전향하는 기술을 개발하고자 하는데 관심이 있다.
CO는 석탄 또는 오일과 오일 유래 산물 등의 유기 물질의 불완전 연소의 주요한, 무료의, 에너지가 풍부한 부산물이다. 예를 들면, 호주 내의 철강 산업은 매년 500,000톤의 CO를 생산하고 대기 중으로 방출한다고 보고되고 있다.
촉매 공정은 주로 CO 및/또는 CO와 수소 (H2)로 구성된 기체를 다양한 연료와 화학 물질들로 전환시키는데 사용될 수 있다. 미생물 또한, 이러한 기체를 연료들과 화학 물질들로 전환하는데 사용될 수 있다.
유일한 탄소원으로서 CO에서 생장하는 미생물의 능력이 1993년 처음으로 발견되었다. 이는 나중에 독립영양성 성장의 아세틸 코엔자임 A (아세틸 CoA) 생물기술 경로 (또한, 우즈-루운다힐 (Woods-Ljungdahl) 경로와 일산화탄소 탈수소효소/아세틸 CoA 신타아제 (CODH/ACS) 경로로도 알려짐)를 사용하는 생물체의 특성으로 밝혀졌다. 일산화탄소영양 생물체, 광합성 생물체, 메탄 생성 생물체 및 아세트산 생성 생물체를 포함하는 다수의 혐기성 생물체는 CO를 다양한 최종 산물, 즉 CO2, H2, 메탄, n-부탄올, 아세테이트 및 에탄올로 신진대사한다는 것이 밝혀졌다. CO를 유일한 탄소원으로 사용하는 동안, 그러한 생물체 모두는 이러한 최종 산물 중 최소한 2개를 생산한다.
클로스트리듐 (Clostridium) 속 등과 같은 혐기성 세균은 아세틸 CoA 생화학적 경로를 통하여 CO, CO2 및 H2로부터 에탄올을 생산한다는 것이 증명되었다. 예를 들면, 기체로부터 에탄올을 생산하는 다양한 클로스트리듐 정다할 (Clostridium ljungdahlii) 세균은 WO 00/68407, EP 117309, 미국 특허 제5,173,429호, 제5,593,886호, 제6,368,819호, WO 98/00558 및 WO 02/08438에 개시되어 있다. 또한, 클로스트리듐 오토에타노지눔 종 (Clostridium autoethanogenum sp) 세균도 기체로부터 에탄올을 생산한다고 알려져 있다 (Abrini et al., Archives of Microbiology 161, pp 345-351 (1994)).
그러나, 기체 발효에 의한 미생물의 에탄올 생산은 항상 아세테이트 및/또는 아세트산의 공동 생산과 관련된다. 이용 가능한 탄소의 일부는 에탄올보다는 아세테이트/아세트산으로 전환되기 때문에, 그러한 발효 공정을 이용한 에탄올의 생산 효율은 덜 바람직할 수 있다. 또한, 아세테이트/아세트산 부산물이 어딘가 다른 목적으로 사용될 수 있는 것이 아닌 한, 이는 폐기물 처리 문제를 야기할 수 있다. 아세테이트/아세트산은 미생물에 의하여 메탄으로 전환되므로 GHG 배출에 기여할 잠재성을 갖는다.
H2의 존재 하에서의 CO의 미생물 발효는 주로 알코올로의 완전한 탄소의 이송을 초래할 수 있다. 그러나, 충분한 H2가 없을 때에는 아래의 방정식에서 나타낸 바와 같이 CO의 일부가 알코올로 전환되고, 상당 부분은 CO2로 전환된다:
6CO + 3H2O → C2H5OH + 4CO2
12H2 + 4CO2 → 2C2H5OH + 6H2O
CO2의 생산은 전체적인 탄소 포집에서의 비능률을 나타내는 것이고, 만약 방출되는 경우, 온실 기체 방출에 기여할 가능성이 있다.
WO 2007/117157은 일산화탄소를 포함하는 기체의 혐기성 발효에 의하여 알코올, 특히 에탄올을 생산하는 공정에 대하여 기술하고 있다. 발효 공정의 부산물로서 생성된 아세테이트는 수소 기체와 이산화탄소 기체로 전환되고, 혐기성 발효 공정에 그 중 하나 또는 둘 다가 사용될 수 있다.
WO 2008/115080은 다수의 발효 단계에서의 알코올(들)의 생산 공정을 개시하고 있다. 첫 번째 바이오리액터 내에서의 혐기성 발효의 결과로 생성된 부산물은 두 번째 바이오리액터 내에서의 산물을 생산하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 두 번째 발효 단계에서의 부산물은 산물을 생산하기 위하여 첫 번째 바이오리액터로 재사용될 수 있다.
따라서, 증가된 효율로 그러한 기체를 에탄올로 발효 가능한 미생물을 제공하는 것이 유익한데, 이 미생물은 종래의 미생물에 비하여 동일한 기질로부터 더욱 많은 에탄올 및/또는 아세테이트에 대한 더 높은 비율의 에탄올을 생산할 수 있는 미생물이다.
또한, 고농도의 에탄올 및/또는 아세테이트에 비해 에탄올을 높은 비율로 생산하는 CO를 함유하는 기체의 에탄올로의 미생물 발효에 대한 종래 방법에서, 사용된 기체 기질은 일반적으로 약 30 내지 65 부피%의 CO 및 약 20 내지 30 부피%의 H2를 포함한다.
에탄올을 생산하는 미생물 발효를 위한 잠재적 기질인 CO를 함유하는 폐기물 기체는 고농도의 CO와 저농도의 H2 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 따라서, 예컨대 65 부피% 이상의 CO, 에탄올 대비 20 부피% 미만의 H2를 함유하는 기체의 효율적인 발효를 수행할 수 있는 유효한 미생물 균주를 갖는 것이 유리할 수 있다.
본 발명의 목적은 CO를 함유하는 기체 원료의 에탄올로의 전환에 있어서의 종래 한계들의 1가지 이상을 극복하는 새로운 종류의 균주를 제공하거나, 적어도 유용한 선택 가능성을 대중에게 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명의 첫 번째 측면은, CO를 포함하는 기질의 혐기성 발효에 의하여 에탄올과 임의로는 아세테이트를 함유하며, 아세테이트에 대하여 에탄올이 최소 1.0의 비율로 생성되는 산물을 생산할 수 있는 세균의 생물학적으로 순수한 분리균을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서는, CO를 포함하는 기질, 특히
(a) 약 65 부피% 이상의 CO
(b) 약 20 부피% 미만의 H2, 또는
(c) 약 65 부피% 이상의 CO와 약 20 부피% 미만의 H2
를 포함하는 CO를 함유하는 기체 기질이 공급된 수성 배지에서 혐기성 발효에 의하여 에탄올과 아세테이트를 생산할 수 있고, 아세테이트에 대한 에탄올의 비율이 최소 약 1.0인 세균의 생물학적으로 순수한 분리균을 제공한다.
하나의 구체적인 실시 상태에 있어서, 아세테이트에 대한 에탄올의 비율은 최소 약 1.1, 더 좋기로는 최소 약 1.2, 더욱 좋기로는 최소 약 1.3, 그리고 가장 좋기로는 최소 약 1.4이다.
또 다른 실시 상태에 있어서, 상기 세균은 최소 약 2.0g 에탄올/발효액 1L의 농도로 생산할 수 있다.
구체적인 실시 상태에 있어서, 상기 농도는 최소 약 2.1g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.2g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.3g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.4g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.5g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.6g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.7g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.8g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 3.0g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 3.2g 에탄올/발효액 1L, 또는 최소 약 3.4g 에탄올/발효액 1L이다.
구체적인 실시 상태에 있어서, 세균의 생산성은 최소 약 1.2g/발효액 1L/1일, 최소 약 1.6g/1L/1일, 최소 약 1.8g/1L/1일 또는 최소 약 2.0g/1L/1일이다.
특정 실시 상태에 있어서, 세균의 구체적인 에탄올 생산성은 최소 약 0.7g/1L/그램 세균 세포/1일, 최소 약 0.9g/1L/그램 세균 세포/일, 최소 약 1.1g/1L/그램 세균 세포/1일, 또는 최소 약 1.3g/1L/그램 세균 세포/1일이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CO를 포함하는 기질의 혐기성 발효에 의하여 알코올과 임의로는 아세테이트를 포함하는 산물들을 생산할 수 있고, 생산성이 최소 약 1.2g/발효액 1L/1일인 세균의 생물학적으로 순수한 분리균을 제공한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 CO를 함유하는 기질, 특히
(a) 약 65 부피% 이상의 CO,
(b) 약 20 부피% 미만의 H2, 또는
(c) 약 65 부피% 이상의 CO와 약 20 부피% 미만의 H2
를 포함하는 CO를 함유하는 기체 기질로 공급된 수성 배지에서 혐기성 발효에 의하여 발효액의 리터당 최소 약 2.0g의 에탄올 농도로 에탄올을 생산할 수 있는 세균의 생물학적으로 순수한 분리균을 제공한다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 농도는 최소 약 2.1g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.2g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.3g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.4g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.5g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.6g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.7g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.8g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 3.0g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 3.2g 에탄올/발효액 1L, 또는 최소 약 3.4g 에탄올/발효액 1L이다.
특정 실시 상태에 있어서, 세균의 생산성은 최소 약 1.2g/발효액 1L/1일, 최소 약 1.6g/1L/1일, 최소 약 1.8g/1L/1일 또는 최소 약 2.0g/1L/1일이다.
특정 실시 상태에 있어서, 세균의 특정 에탄올 생산성은 최소 약 0.7g/1L/그램 세균 세포/1일, 최소 약 0.9g/1L/그램 세균 세포/1일, 최소 약 1.1g/1L/그램 세균 세포/1일, 최소 약 1.3g/1L/그램 세균 세포/1일이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 아세테이트는 발효의 부산물로서 생성된다.
특정 실시 상태에 있어서, 에탄올은 아세테이트에 대하여 최소 약 1.0의 비율로 생산된다. 특정 실시 상태에 있어서, 아세테이트에 대한 에탄올의 비율은 최소 약 1.1, 최소 약 1.2, 최소 약 1.3 또는 더 구체적으로는 최소 약 1.4이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 아세트산 생성 세균을 제공하는데, 여기서 상기 세균은 아래에 정의된 특성들 중 1개 이상의 특성을 가진다:
● 효모 추출물이 존재 또는 부재하는 최소 배지 내에서 생장하는 능력;
● 효모 추출물이 존재하는 배지에 비하여 효모 추출물이 존재하지 않는 배지 내에서, 아세테이트에 대하여 에탄올을 더 높은 비율로 에탄올을 생산 및/또는 더 고농도의 에탄올을 생산하도록 더욱 급속하게 생장하는 능력;
● 포자를 거의 형성하지 않거나 포자를 형성하는 능력이 없음;
● 그람 양성;
● 막대형;
● 운동성이 없음.
하나의 실시 상태에 있어서, 상기 세균은
(a) 약 65 부피% 이상의 CO
(b) 약 20 부피% 미만의 H2, 또는
(c) 약 65 부피% 이상의 CO와 약 20 부피% 미만의 H2
을 포함하는 CO 함유 기질로 공급된 수성 배지 내에서 혐기성 발효에 의하여 최소 약 2.0g 에탄올/발효액 1L의 에탄올 농도 및/또는 아세테이트에 대하여 에탄올을 최소 약 1.0의 비율로, 에탄올을 추가적으로 생산할 수 있다.
특정 실시 상태에 있어서, 아세테이트에 대한 에탄올의 비율은 최소 약 1.1, 최소 약 1.2, 최소 약 1.3 또는 더욱 구체적으로는 최소 약 1.4이다.
특정 실시 상태에 있어서, 생성된 에탄올의 농도는 최소 약 2.1g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.2g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.3g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.4g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.5g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.6g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.7g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.8g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 3.0g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 3.2g 에탄올/발효액 1L, 또는 최소 약 3.4g의 에탄올/발효액 1L이다.
특정 실시 상태에 있어서, 세균의 생산성은 최소 약 1.2g/발효액 1L/1일, 최소 약 1.6g/1L/1일, 최소 약 1.8g/1L/1일 또는 최소 약 2.0g/1L/1일이다.
특정 실시 상태에 있어서, 세균의 특정 에탄올 생산성은 최소 약 0.7g/1L/그램 세균 세포/1일, 최소 약 0.9g/1L/그램 세균 세포/1일, 최소 약 1.1g/1L/그램 세균 세포/1일, 또는 최소 약 1.3g/1L/그램 세균 세포/1일이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 세균은 클로스트리듐 오토에타노지눔 (Clostridium autoethanogenum)에서 유래된다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 세균은 상기 정의한 특성들 중 2개 이상, 가장 좋기로는 모든 특성을 가진다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 세균은 기탁번호 DSM 19630으로 DSMZ에 기탁된 클로스트리듐 오토에타지눔 (Clostridium autoethanogenum) 균주 LBS1560의 정의된 특성들을 가진다. 하나의 실시 상태에 있어서, 상기 세균은 기탁번호 DSM 19630으로 DSMZ에 기탁된 클로스트리듐 오토에타지눔 (Clostridium autoethanogenum) 균주 LBS 1560이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 기탁번호 DSM 19630으로 DSMZ에 기탁된 클로스트리듐 오토에타지눔 (Clostridium autoethanogenum) 균주 LBS1560의 생물학적으로 순수한 분리균을 제공한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 최소 약 70 부피%의 CO, 최소 약 75 부피%의 CO, 최소 약 80 부피%의 CO, 최소 약 85 부피%의 CO, 최소 약 90 부피%의 CO, 또는 최소 약 95 부피%의 CO를 포함한다.
추가적인 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 약 20 부피% 미만의 H2를 포함한다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 약 15 부피% 미만의 H2, 약 10 부피% 미만의 H2, 약 5 부피% 미만의 H2, 약 4 부피% 미만의 H2, 약 3 부피% 미만의 H2, 약 2 부피% 미만의 H2, 약 1 부피% 미만의 H2를 포함하거나, 또는 실질적으로 H2를 포함하지 않는다.
추가적인 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 약 20 부피% 이하의 CO2를 포함한다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 약 15 부피% 이하의 CO2, 약 10 부피% 이하의 CO2, 약 5 부피% 이하의 CO2를 포함한다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 최소 약 85 부피%의 CO와 최대 약 15 부피%의 CO2, 최소 약 90 부피%의 CO와 최대 약 10 부피%의 CO2, 최소 약 95 부피%의 CO와 최대 약 5 부피%의 CO2를 포함한다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 수성 배지는 이에 제한되지 않지만 본 명세서에서 정의된 바와 같이 LM23 또는 LM33에서 선택된 최소 혐기성 미생물 생장 배지이다.
하나의 실시 상태에 있어서, 상기 배지에는 효모 추출물이 공급되지 않는다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 CO를 함유하는 기질로부터 1종 이상의 알코올을 생산하는 방법, 상기 기질의 존재 하에서 본 발명의 미생물 분리균의 1종 이상의 배양균을 유지하는 것을 포함하는 방법, 그리고 1종 이상의 미생물 분리균에 의한 1종 이상의 알코올로의 기질의 혐기성 발효를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에서 전술한 바와 같이 1종 이상의 균주를 사용하여 CO를 포함하는 기질을 발효하는 것을 포함하는 1종 이상의 알코올을 생산하기 위한 방법을 제공한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
(a) CO를 함유하는 기질을 본 명세서에서 전술한 세균의 배양물을 함유하는 바이오리액터에 제공하는 단계, 및
(b) 바이오리액터에서 배양균을 무산소 하에서 발효하여 1종 이상의 알코올을 생산하는 단계.
추가적인 측면에서, 본 발명은 산업적 공정으로부터의 대기 중 총 탄소 방출량을 감소시키기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 산업적 공정의 결과물로서 생성된 CO를 함유하는 기체를 대기로 방출되기 전에 포집하는 단계,
(b) 본 발명의 1종 이상의 미생물 분리균을 함유하는 배양균에 의하여 CO를 함유하는 기체의 혐기성 발효시켜 1종 이상의 알코올을 생산하는 단계.
상기 방법 측면들의 특정 실시 상태에 있어서, 아세테이트는 발효의 부산물로서 생성된다. 좋기로는, 1종 이상의 생성된 알코올은 에탄올을 포함한다.
상기 방법 측면들의 특정 실시 상태에 있어서, 상기 세균 또는 분리균은 수성 배지 내에서 유지된다.
상기 방법 측면들의 특정 실시 상태에 있어서, 기질의 발효는 바이오리액터 내에서 일어난다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 약 15 부피% 미만의 H2, 예컨대 약 10 부피% 미만의 H2, 예컨대 약 5 부피% 미만의 의 H2를 포함한다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 약 65 부피% 이상의 CO, 좋기로는 약 70 부피% 내지 약 95 부피%의 CO를 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 최소 약 70 부피%의 CO를 포함한다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 최소 약 80 부피%의 CO, 최소 약 85 부피%의 CO, 최소 약 90 부피%의 CO, 최소 약 95 부피%의 CO를 포함한다.
하나의 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 약 20 부피% 미만의 H2를 포함한다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 약 15 부피% 미만의 H2, 약 10 부피% 미만의 H2, 약 5 부피% 미만의 H2, 약 4 부피% 미만의 H2, 약 3 부피% 미만의 H2, 약 2 부피% 미만의 H2, 약 1 부피% 미만의 H2를 포함하거나, 또는 실질적으로 H2를 포함하지 않는다.
하나의 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 약 20 부피% 이하의 CO2를 포함한다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 약 15 부피% 이하의 CO2, 약 10 부피% 이하의 CO2, 약 5 부피% 이하의 CO2를 포함한다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 기질은 최소 약 85 부피%의 CO와 최대 약 15 부피%의 CO2, 최소 약 90 부피%의 CO와 최대 약 10 부피%의 CO2, 또는 최소 약 95 부피%의 CO와 최대 약 5 부피%의 CO2를 포함한다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 CO를 함유하는 기질은 CO를 함유하는 기체 기질이다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 기체 기질은 산업적 공정의 부산물로서 얻은 기체를 포함한다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 산업적 공정은 철 금속 제품 제조, 비철 제품 제조, 석유 정제, 바이오매스의 기화, 석탄의 기화, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크스 제조로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 실시 상태에 있어서, 상기 기체 기질은 철강 공장으로부터 얻은 기체를 포함할 수 있다.
또 다른 실시 상태에 있어서, 상기 기체 기질은 자동차 배기 가스를 포함할 수 있다.
상기 방법 측면의 특정 실시 상태에 있어서, 상기 알코올은 발효액으로부터 회수되는데, 상기 발효액은 세균 세포와 상기 알코올을 포함하는 수성 배지이다.
특정 실시 상태에 있어서, 아세테이트는 발효의 부산물로서 생성된다.
추가적인 실시 상태에 있어서, 알코올과 아세테이트는 배양액으로부터 회수된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 1개 이상의 산을 생산하는 1개 이상의 미생물의 선별 방법을 제공하는데, 상기 방법은 바이오리액터 내의 영양 배지 내에서 미생물을 배양하는 단계, 영양 배지 보다 pH가 더 높은 신선한 배지를 첨가하는 단계로, 상기 영양 배지는 실질적으로 일정한 pH를 유지하는 단계, 그리고 바이오리액터 내의 상기 배지를 실질적으로 일정한 부피로 유지시키도록 영양 배지와 미생물의 적어도 일부를 제거하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 방법은 빠르게 생장하는 미생물의 선별을 위한 것이다. 하나의 실시 상태에 있어서, 1개 이상의 산은 아세테이트를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 선별 방법에 의하여 생성된 세균의 생물학적으로 순수한 분리균을 제공한다. 하나의 실시 상태에 있어서, 상기 분리균은 포자를 거의 형성하지 않거나 포자를 형성할 수 없다.
비록, 본 발명은 대략적으로 상기에서 정의되었지만, 그에 한정되지 않으며 또한 실시예들을 제공하는 아래에 서술한 실시 상태를 포함한다.
본 발명은 이제 수반되는 도면들에 관하여 상세하게 기술할 것이다.
도 1은 빠른 미생물 생장을 선별하기 위하여 조정한 시스템을 도식으로 표현한 것이다.
도 2는 클로스트리듐 오토에타지눔 (Clostridium autoethanogenum) LBS1560에 의한 에탄올 (네모)과 아세테이트 (다이아몬드) 생산을 나타낸다. 바이오매스 농도는 세모 데이터 포인트로 나타냈다.
발명의 구체적인 설명
개괄적으로 말해서, 본 발명의 하나의 측면은 신규한 세균과 혐기성 발효 공정에서 증가된 효능을 갖는 세균의 생물학적으로 순수한 분리균에 관한 것이다. 하나의 측면에서, 상기 세균은
(a) 약 65 부피% 이상의 CO
(b) 약 20 부피% 미만의 H2, 또는
(c) 약 65 부피% 이상의 CO와 약 20 부피% 미만의 H2
를 포함하는 기질로부터 알코올, 좋기로는 에탄을 생산할 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 세균에 의하여 CO를 함유하는 기질의 혐기성 발효에 의하여 알코올, 좋기로는 에탄올을 생산하는 공정에 관한 것이다.
정의
별도로 언급하지 않는 한, 이 명세서에서 전체적으로 사용된 아래의 용어는 다음과 같이 정의된다:
"CO를 함유하는 기질" 및 그와 유사한 용어들은 예를 들면, 세균의 생장 및/또는 발효를 가능하게 하는 일산화탄소를 갖는 임의의 기질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, "CO를 함유하는 기질"은 기체이다. 그러한 기질들은 본 명세서에서 "CO를 함유하는 기체 기질" 및 그와 유사하게 언급될 수 있다.
아래의 서술에 있어서, 본 발명의 실시 상태는 "CO를 함유하는 기체 기질"의 운반과 발효에 관하여 기술하고 있다. 그러나, 기체 기질은 대안적인 형태로 제공될 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 예를 들면, CO 함유 기체 기질은 액체 내에서 용해되어 제공될 수 있다. 본질적으로, 액체는 기체를 함유하는 일산화탄소로 포화되고, 이어서 상기 액체는 바이오리액터에 첨가된다. 이는 표준 방법론을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 미세기포 분산 발생기 (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 / October , 2002)가 사용될 수 있다. 추가적인 예를 들면, CO 함유 기체 기질은 고체 지지체에 흡수될 수 있다. 그러한 대안적인 방법들은 "CO를 함유하는 기질"이라는 용어의 사용으로 포함될 수 있다.
"증가하는 효율", "증가된 효율" 등의 용어들은, 발효 공정과 관련하여 사용될 때, 이에 한정되는 것은 아니지만, 발효를 촉매하는 미생물의 생장률, 소비된 기질 (CO 등) 부피당 생성된 목적 산물 (알코올 등)의 부피, 배지 내에서 생성된 목적 산물 (알코올 등)의 농도, 목적 산물의 생산률 또는 생산 농도, 그리고 발효의 기타 부산물에 비하여 생성된 목적 산물의 상대 비율 중에서 1종 이상의 증가를 포함한다.
"아세테이트"라는 용어는 아세테이트 염 자체와 본 명세서에서 기술한 바와 같이 발효액 내에 존재하는 아세테이트 염과 해리 아세트산의 혼합물 등과 같은 분자 혼합물 또는 해리 아세트산과 아세테이트 염을 포함한다. 발효액 내의 아세테이트에 대한 분자 아세트산의 비율은 시스템의 pH에 따라 좌우된다.
"바이오리액터"라는 용어는 1개 이상의 용기 및/또는 타워 또는 배관으로 구성되는 발효 장치를 포함하는데, 이는 연속식 교반 탱크 반응기 (Continuous Stirred Tank Reactor; CSTR), 고정화 세포 반응기 (Immobilized Cell Reactor; ICR), 살수층 반응기 (Trickle Bed Reactor; TBR), 기포탑, 기체 부양 발효조, 고정식 혼합기, 또는 기체와 액체 접촉에 적합한 기타의 용기 또는 기타의 장치도 포함한다.
본 발명의 세균, 또는 그의 배양균 또는 분리균은 "분리된" 또는 "생물학적으로 순수한" 형태로 기술될 수 있다. 이들 용어는 상기 세균이 환경 또는 1개 이상의 구성 성분, 세포 또는 그 이외의 것으로부터 분리된 것을 의미하는 것을 의도하는데, 그들은 천연 또는 그와는 다른 곳에서 발견된 것과 연관될 수 있다. "분리된" 또는 "생물학적으로 순수한"이라는 용어는 균주가 정제된 정도를 나타내는 것으로 간주되어서는 안된다. 그러나, 하나의 실시 상태에 있어서, 상기 세균의 분리균 또는 배양균은 본 발명의 균주의 우위를 함유한다.
본 발명은,
(a) 약 65 부피% 이상의 CO
(b) 약 20 부피% 미만의 H2, 또는
(c) 약 65 부피% 이상의 CO와 약 20 부피% 미만의 H2
를 포함하는 CO를 함유하는 기체 기질이 공급된 수성 배지에서 혐기성 발효에 의하여 아세테이트에 대한 에탄올을 최소 약 1.0의 비율로 에탄올과 아세테이트를 생성할 수 있는 세균의 생물학적으로 순수한 분리균을 제공한다. 하나의 실시 상태에 있어서, 상기 세균은 본 명세서의 다른 곳에서 기술한 씨. 오토에타노지눔 (C. autoethanogenum)에서 유래된다.
특정 실시 상태에 있어서, 아세테이트에 대한 에탄올의 비율은 최소 약 1.1, 또는 최소 약 1.2, 또는 최소 약 1.3, 또는 최소 약 1.4이다.
추가적인 실시 상태에 있어서, 상기 세균은 최소 약 2.1g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.2g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.3g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.4g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.5g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.6g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.7g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.8g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 3.0g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 3.2g 에탄올/발효액 1L, 또는 최소 약 3.4g 에탄올/발효액 1L의 농도에서 에탄올을 생성할 수 있다.
에탄올 생산성은 에탄올의 부피 생산성으로, 에탄올 농도와 배치 시스템 내의 농도를 생성하는데 요구되는 시간의 비율로 계산된다. 생산성은 또한, 연속 시스템 내의 미생물 발효에 대하여 계산될 수도 있다. 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 상기 세균의 생산성은 최소 약 1.2g의 에탄올/발효액 1L/1일, 최소 약 1.6g/1L/1일, 최소 약 1.8g/1L/1일 또는 최소 약 2.0g/1L/1일이다.
미생물 배양균의 특정 생산성은 미생물 배양균 내에서 살아서 활동하는 미생물의 비율에 좌우된다. 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 특정 에탄올 생산성은 최소 약 0.7g/1L/그램 세균 세포/1일, 최소 약 0.9g/1L/그램 세균 세포/1일, 최소 약 1.1g/1L/그램 세균 세포/1일, 또는 최소 약 1.3g/1L/그램 세균 세포/1일이다.
또한, 본 발명은
(a) 약 65 부피% 이상의 CO
(b) 약 20 부피% 미만의 H2, 또는
(c) 약 65 부피% 이상의 CO와 약 20 부피% 미만의 H2
를 포함하는 CO 함유 기체 기질로 공급된 수성 배양 배지에서 혐기성 발효에 의하여 발효액 리터당 최소 2.0g 에탄올의 에탄올 농도로 에탄올을 생산할 수 있는 세균의 생물학적으로 순수한 분리균을 제공한다. 하나의 실시 상태에 있어서, 상기 세균은 본 명세서의 다른 곳에서 기술한 씨. 오토에타노지눔 (C. autoethanogenum)에서 유래된다.
추가적인 실시 상태에 있어서, 상기 세균은 최소 약 2.1g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.2g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.3g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.4g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.5g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.6g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.7g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 2.8g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 3.0g 에탄올/발효액 1L, 최소 약 3.2g 에탄올/발효액 1L, 또는 최소 약 3.4g 에탄올/발효액 1L의 농도에서 에탄올을 생성할 수 있다.
본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 상기 세균의 생산성은 최소 약 1.2g 에탄올/발효액 1L/1일, 최소 약 1.6g/L/일, 최소 약 1.8g/L/일 또는 최소 약 2.0g/L/일이다.
본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 특정 에탄올 생산성은 최소 약 0.7g/1L/그램 세균 세포/1일, 최소 약 0.9g/1L/그램 세균 세포/1일, 최소 약 1.1g/1L/그램 세균 세포/1일, 최소 약 1.3g/1L/그램 세균 세포/1일이다.
일반적으로 아세테이트는 발효의 부산물로서 생성된다. 하나의 실시 상태에 있어서, 상기 에탄올은 아세테이트에 대하여 최소 약 1.0의 비율로 생성된다. 특정 실시 상태에 있어서, 아세테이트에 대한 에탄올의 비율은 최소 약 1.1, 최소 약 1.2, 최소 약 1.3 또는 더 구체적으로는 최소 약 1.4이다.
또한, 본 발명은 실험 조건 하에서 관찰된 특성들을 아래에 기술한 하기 정의된 특성들 중 1가지 이상을 갖는 아세트산 생성 세균을 제공한다: 효모 추출물이 존재 또는 부재하는 최소 배지 내에서 생장하는 능력, 효모 추출물이 존재하지 않는 배지 내에서 더욱 빠르게 생장하고, 아세테이트에 비해 에탄올을 더 높은 비율로 생산하고/하거나 더 높은 농도로 에탄올을 생산하는 능력이 있으며, 포자를 형성하는 능력은 거의 또는 전혀 없고, 그람 양성이며, 막대형이고, 운동성이 없다.
하나의 실시 상태에 있어서, 상기 세균은 실질적으로 포자를 형성하는 능력이 없다. 하나의 실시 상태에 있어서, 실질적으로 이하에 기술한 조건 하에서 포자를 나타내는 세균 개체군은 없다.
하나의 실시 상태에 있어서, 아세트산 생성 세균은 약 65 부피% 이상의 CO, 약 20 부피% 미만의 H2, 또는 약 65 부피% 이상의 CO와 약 20 부피% 미만의 H2을 포함하는 CO를 함유하는 기질로 공급된 수성 배지 내에서 혐기성 발효에 의하여, 최소 약 2.0g 에탄올/발효액 1L의 에탄올 농도 및/또는 아세테이트에 대하여 최소 약 1.0의 에탄올 비율로 에탄올을 추가적으로 생성할 수 있다.
본 발명의 세균은 클로스트리듐 오토에타노지눔 (Clostridium autoethanogenum)에서 유래될 수 있다.
본 발명의 특정 실시 상태의 균주가 포자를 형성하는 능력이 거의 또는 전혀 없다는 관찰은 놀랍다. 이는 클로스트리듐 오토에타노지눔을 포함하는 클로스트리디아 (Clostridia)의 기타 균주들에 비해 예상하지 못한 이점을 제공한다. 포자 형성은 제한된 활성의 침체 단계이다. 포자를 형성하는 능력의 감소 또는 개선은 다수의 이점을 가진다. 예를 들면, 단일 세균 세포는 포자가 형성되지 않는 조건 하에 있는 동안에는 단지 분열과 대사 산물 (아세테이트 및/또는 에탄올 등) 생성할 수 있다.
따라서, 세균이 포자를 형성하지 않는 경우에는 분열과 대사 산물 생성 기간이 연장될 수 있다. 포자를 형성하는 능력의 결여로 인해, 전체 배양에 대한 추가적인 조절이 가능하여, 살아있는 모든 개체군의 생장 및/또는 대사 산물 생성을 장기간 촉진하도록 조정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세균을 사용함으로써 아세테이트 및/또는 에탄올 등의 산물을 생산하기 위한 발효 공정의 전체적인 효율을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 세균은 전술한 특성들 중 2가지 이상, 좋기로는 모든 특성을 갖는다. 본 발명의 몇몇 실시 상태에 있어서, 세균은 부다페스트 조약에 따라 2007년 10월 19일, 기탁번호 DSM 19630으로 독일, DSM에 기탁된 클로스트리듐 오토에타지눔 LBS 1560 균주의 정의된 특성들을 갖는다. 특정 실시 상태에 있어서는, 상기 세균은 클로스트리듐 오토에타지눔 균주 LBS 1560, DSM 19630이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 세균으로부터 유래한 세균과 관련이 있다.
특정 실시 상태에 있어서, 본 발명의 세균은 CO 농도가 높은 기체 기질에서 에탄올을 전술한 농도로, 그리고 전술한 아세테이트에 대한 에탄올의 비율로 생산할 수 있다. 기체 기질은 최소 약 70 부피%의 CO를 포함할 수 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 기체 기질은 최소 약 80 부피%의 CO, 최소 약 85 부피%의 CO, 최소 약 90 부피%의 CO 또는, 최소 약 95 부피%의 CO를 포함한다.
마찬가지로, 특정 실시 상태에서, H2의 농도가 낮거나 존재하지 않는 기체 기질에서, 에탄올을 전술한 농도로, 그리고 전술한 아세테이트에 대한 에탄올의 비율로 생산할 수 있다. 기체 기질은 약 20 부피% 미만의 H2를 포함할 수 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 기체 기질은 약 15 부피% 미만의 H2를 포함하거나, 상기 기체 기질은 약 10 부피% 미만의 H2를 포함하거나, 상기 기체 기질은 약 5 부피% 미만의 H2를 포함하거나, 상기 기체 기질은 약 4 부피% 미만의 H2를 포함하거나, 상기 기체 기질은 약 3 부피% 미만의 H2를 포함하거나, 상기 기체 기질은 약 2 부피% 미만의 H2를 포함하거나, 상기 기체 기질은 약 1 부피% 미만의 H2를 포함하거나, 또는 상기 기체 기질은 H2를 포함하지 않는다.
특정 실시 상태에 있어서, 본 발명의 세균은 또한, 비교적 CO2를 포함하지 않는 기체 기질이 공급될 때, 에탄올 농도들과 아세테이트에 대한 에탄올 비율들을 생산할 수 있다. 하나의 실시 상태에 있어서, 상기 기체 기질은 약 20 부피% 이하의 CO2를 포함한다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 기체 기질은 약 15 부피% 이하의 CO2를 포함하고, 또는 약 10 부피% 이하의 CO2, 또는 약 5 부피% 이하의 CO2를 포함한다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 기체 기질은 최소 약 85 부피%의 CO와 최대 약 15 부피%의 CO2를 포함하거나, 상기 기체 기질은 최소 약 90 부피%의 CO와 최대 약 10 부피%의 CO2를 포함하거나, 상기 기체 기질은 최소 약 95 부피%의 CO와 최대 약 5 부피%의 CO2를 포함한다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 배양균은 수성 배지 내에서 유지된다. 좋기로는, 상기 수성 배지는 최소 혐기성 미생물 생장 배지이다. 기술 분야에서 적절한 배지가 알려져 있는데, 예를 들면 미국 특허 제5,173,429호와 제5,593,887호 및 WO 02/08438, 그리고 클라쏜 (Klasson) 등 [(1992). Bioconversion of Sythesis Gas into Liquid of Gaseous Fuels. Enz. Microb. Technol. 14: 602-608.], 나자프포어 (Najafpour) 및 유네시 (Younesi) [(2006). Ethanol and acetate synthesis from waste gas using batch culture of Clostridium ljungdahlii. Enzyme and Microbial Technology, Volume 38, Issues 1-2, p. 223-228], 그리고 루이스 (Lewis) 등 [(2002). Making the connection-conversion of biomass-generated producer gas to ethanol. Abst. Bioenergy, p. 2091-2094]에 개시되어 있다. 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 최소 혐기성 미생물 생장 배지는 본 명세서에서 정의한 바와 같이 LM 23 또는 LM 33이다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 배지는 이에 한정되는 것은 아니지만 아미노산과 트립티케이스 (trypticase) 등으로 보충된다. 좋기로는, 상기 배지는 추가 성분들로 공급된다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 배지는 효모 추출물이 보충될 수 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 배양균은 배지가 효모 추출물로 보충될 때보다 효모 추출물로 보충되지 않을 때 더욱 급격히 생장한다. 추가적인 실시 상태에 있어서, 생성된 아세테이트에 대한 에탄올의 비율은 배지가 효모 추출물로 보충될 때보다 효모 추출물로 보충되지 않을 때 더 높다. 추가적인 실시 상태에 있어서, 배양 배지의 리터당 생성된 에탄올의 농도는 상기 배지가 효모 추출물로 보충될 때보다 효모 추출물로 보충되지 않을 때 더욱 높다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 배지는 효모 추출물로 공급되지 않는다.
또한, 본 발명은 CO를 포함하는 기체 기질로부터 1종 이상의 알코올을 생산하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 기체 기질의 존재 하에서 본 발명의 1종 이상의 세균 분리균의 배양균을 유지하는 것, 그리고 1종 이상의 균주 분리균에 의한 1종 이상의 알코올로의 기체 기질의 혐기성 발효 상기 기체 기질의 혐기성 발효를 포함한다.
또한, 본 발명은 산업적 공정으로부터 대기 중 총 탄소 방출량을 감소시키기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은
(a) 산업적 공정의 결과물로서 생성된 CO를 함유하는 기체를 대기로 방출되기 전에 포집하는 단계,
(b) 본 발명의 1종 이상의 세균 분리균을 함유하는 배양균에 의하여 CO를 함유하는 기체를 혐기성 발효시켜 1종 이상의 알코올을 생성하는 단계,
를 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시 상태에 있어서, 아세테이트는 발효의 부산물로서 생성된다. 생성된 알코올은 에탄올이다.
특정 실시 상태에 있어서, 배양균은 액체 영양 배지 내에서 유지된다.
상기 발효는, 연속식 교반 탱크 반응기 (Continuous Stirred Tank Reactor; CSTR), 기포탑 반응기 (bubble column reactor; BCR) 또는 살수층 반응기 (Trickle Bed Reactor; TBR) 등과 같은 임의의 적절한 바이오리액터 내에서 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 몇 가지 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 바이오리액터는 첫 번째로 미생물이 배양되는 생장 반응기를 포함할 수 있고, 두 번째로 생장 반응기에서 발효액이 공급되고 발효 산물 (에탄올과 아세테이트)의 대부분이 생성되는 발효 반응기를 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 발효 반응을 위한 탄소원은 CO를 함유하는 기체 기질이다. 상기 기체 기질은 산업적 공정 또는 자동차 배기 가스 등과 같은 기타 공급원의 부산물로 얻어지는 CO를 함유하는 폐기 기체일 수 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 산업적 공정은 철강 공장 등과 같은 철 금속 제품 제조, 비철 제품 제조, 석유 정제 공정, 석탄의 기화, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크스 제조로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 실시 상태에 있어서, 상기 CO를 함유하는 기체는 그것이 대기로 방출되기 전, 임의의 종래 방법을 사용하여 산업적 공정으로부터 포집할 수 있다. CO를 함유하는 기체 기질의 조성에 따라, 그를 발효에 도입하기 전에 먼지 입자 등과 같은 불필요한 불순물을 제거하기 위하여 처리하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 예를 들면, 상기 기체 기질은 종래 방법을 사용하여 정제하거나 문질러 씻을 수 있다.
또한, 기질 기류의 CO 농도 (또는 기체 기질 내의 CO 부분 압력)를 증가시켜셔, CO가 기질로 있는 발효 반응의 효율을 증가시키는 것이 종종 바람직하다. 기체 기질 내의 CO 부분 압력 증가는 CO 질량의 발효 배지로의 이송을 증가시킨다. 발효 반응에 공급하기 위하여 사용되는 기체 기류의 조성은 반응의 효율 및/또는 비용에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, O2는 혐기성 발효 공정의 효율을 감소시킬 수 있다. 발효 전 또는 발효 후의 발효 공정 단계들 중의 원하지 않거나 불필요한 공정은 그러한 단계들에 대한 부담을 증가시킬 수 있다 (예컨대, 바이오리액터로 들어가는 곳에서 기체 기류가 압축되거나, 발효 전 불필요한 에너지는 불필요한 기체를 압축하는데 사용될 수 있다). 따라서, 불필요한 성분들을 제거하고 바람직한 성분의 농도를 증가시키기 위하여 기질 기류, 특히 산업적 공정에서 유래한 기질 기류를 처리하는 것이 바람직할 수 있다.
산업적 공급원에서 유래한 기질 기류는 일반적으로 조성이 다양하다. 더욱이, 고농도의 CO (최소 50%의 CO 또는 최소 65%의 CO 등)를 포함하는 산업적 공급원에서 유래한 기질 기류는 종종 낮은 H2 성분 (20% 미만 또는 10% 미만 또는 0% 등)을 갖는다. 따라서, CO와 H2 농도들의 범위, 특히 고농도의 CO와 저농도의 H2를 포함하는 기질의 혐기성 발효에 의하여 산물을 생성할 수 있는 미생물이 특히 바람직하다. 본 발명자들은 씨. 오토에타노지눔 (기탁번호 DSM 10061로 DSMZ에서 얻음)을 시험하였고, 그것이 H2 성분이 없는 CO를 포함하는 기체 기질에서 생장할 수 없고 산물을 생성할 수 없다는 것에 주목한다. 그러나, 본 발명의 세균은 놀랍게도 CO를 포함하는 (그리고 H2가 없는) 기질의 발효에 의하여 생장하고 산물 (에탄올 및 아세테이트)을 생성하는 능력을 가진다.
기질 기류 내의 수소의 존재는 전체적인 탄소 포집 및/또는 에탄올 생산성의 효율을 개선시킬 수 있다. 예를 들면, WO 02/08438은 다양한 조성의 기체 기류를 사용한 에탄올의 생산을 기술하고 있다. WO 02/08438은 미생물 생장과 에탄올 생산을 증진시키기 위하여 바이오리액터 내에서 63%의 H2, 32%의 CO 및 5%의 CH4를 포함하는 기질 기류를 씨.정다힐 (C. ljungdahlii)의 배양균에 대하여 제공하는 것을 보고하고 있다. 상기 배양균이 안정 단계에 도달하고 미생물의 생장이 더 이상 주요 목적이 아닐 때, 상기 기질 기류는 약간의 과잉의 CO를 제공하고 에탄올 생산을 촉진하기 위하여 15.8%의 H2, 36.5%의 CO, 38.4%의 N2 및 9.3%의 CO2로 기질 기류를 전환시켰다. 또한, 이 문헌은 더 높고 더 낮은 CO와 H2 농도를 갖는 기체 기류를 기술하고 있다.
본 명세서에서 기술한 바와 같이 본 발명의 공정들은 그러한 공정들의 결과물로서 생성되는 CO를 함유하는 기체를 포집하고 이들을 본 명세서에 기술한 발효 공정을 위한 기질로서 사용함으로써 산업 공정으로부터의 대기 중 총 탄소 방출량을 감소시키는데 사용할 수 있다.
별법으로, 본 발명의 다른 실시 상태에 있어서, CO를 함유하는 기체 기질은 바이오매스의 기화로부터 얻을 수 있다. 기화 공정은 공기 또는 산소의 한정된 공급 내에서 바이오매스의 부분적인 연소를 포함한다. 그 결과 생성된 기체는 일반적으로는 주로 CO와 H2, 최소 부피의 CO2, 메탄, 에틸렌 및 에탄을 포함한다. 예를 들면, 사탕수수의 당, 또는 옥수수나 곡물의 녹말과 같은 식량, 또는 산림업에서 생성된 비식량 바이오매스의 추출과 공정 동안에 얻은 바이오매스 부산물은 본 발명에서 CO를 함유하는 기체를 생산하는데 사용하기 위하여 기화될 수 있다.
일반적으로, CO를 함유하는 기체 기질은 주로 CO를 함유하는 것이 좋다. 특정 실시 상태에 있어서, 상기 기체 기질은 최소 약 65 부피% 또는 최소 약 70 부피% 내지 95 부피%의 CO를 포함한다. 상기 기체 기질이 임의의 수소를 함유하는 것이 필수적인 것은 아니다. 또한, 상기 기체 기질은 약 1 부피% 내지 30 부피%, 약 5 부피% 내지 10 부피%의 CO2 등과 같이 임의로 약간의 CO2를 함유한다.
세균의 생장과 CO에서 에탄올로의 발효가 일어나도록 하기 위하여, CO를 함유하는 기체 기질뿐 아니라, 적절한 액체 영양 배지를 바이오리액터로 공급하는 것이 좋다. 영양 배지는 사용되는 미생물의 생장을 가능하게 하는 비타민과 무기물을 함유할 것이다. 유일한 탄소원으로서 CO를 사용하는 에탄올의 발효에 적절한 혐기성 배지는 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들면, 적절한 배지는 본 명세서에서 전술한 기타의 공개문헌과 같이 미국 특허 제5,173,429호와 제5,593,886호 그리고 WO 02/08438에 개시되어 있다. 본 발명의 하나의 실시 상태에 있어서, 본 명세서의 이후 실시예들에서 기술되어 있는 바와 같이 상기 배지는 LM23이다.
발효는 바람직하게는 CO에서 에탄올로의 발효가 일어나도록 적절한 조건 하에서 수행되어야 한다. 반응 조건은 압력, 온도, 기체 유동률, 액체 유동률, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, 교반 속도 (연속 교반 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종원 농도, CO가 액상 내에서 제한되지 않도록 보장하기 위한 최대 기체 기질 농도 및 산물 억제를 피하기 위한 최대 산물 농도를 포함하여 고려해야 한다.
최적 반응 조건들은 부분적으로는 본 발명에서 사용된 특정 미생물에 따라 좌우된다. 그러나, 일반적으로는, 주변 압력보다 더 높은 압력에서 발효를 수행하는 것이 좋다. 증가된 압력에서의 발효가 수행되면, 기상에서 액상으로의 CO 전환 비율이 현저히 증가되는데, CO는 바로 이 액상에서 미생물에 의해 에탄올 생산을 위한 탄소원으로서 흡수될 수 있다. 이는, 바이오리액터가 대기압보다 더 높은 압력에서 유지될 경우, 체류 시간 (바이오리액터 내의 액체 부피를 투입되는 기체 유동 속도로 나눈 값)이 단축될 수 있음을 의미한다.
또한, 주어진 CO로부터 에탄올로의 전환율은 부분적으로는 기질 보유 시간과 관계가 있고, 차례로 목적 보유 시간 달성은 바이오리액터의 필요 부피에 영향을 주기 때문에, 가압된 시스템의 이용은 필요한 바이오리액터의 부피와 결과적으로는 발효 장치의 자본비를 크게 감소시킬 수 있다. 미국 특허 제5,593,886호에 기재된 실시예에 따르면, 반응기 작동 압력의 증가를 위하여 원자로 부피는 선형 비율로 감소될 수 있는데, 즉, 바이오리액터는 1 대기압에서 작동되는 부피의 10분의 1 부피만을 필요로 하는 10 대기압에서 작동된다.
증가된 압력에서의 기체에서 에탄올로의 발효 수행의 장점은 다른 곳에서도 기술하고 있다. 예를 들면, WO 02/08438은 각각 150 g/l/일 및 369 g/l/일의 에탄올 생산성을 제공하는 30 pisg와 75 pisg의 압력 하에서 수행된 기체로부터의 에탄올의 발효를 개시하고 있다. 그러나, 유사한 배지와 투입 기체 조성을 사용하여 대기압에서 수행한 실시예 발효들의 경우에는 1일 1 리터당 에탄올의 생산이 10 내지 20배 적다는 것을 발견하였다.
또한, CO를 함유하는 기체 기질의 도입률은 예를 들어 액상 내의 CO의 농도가 제한되지 않도록 보장하는 것이 좋다. 왜냐하면, CO가 제한된 조건에서는 상기 에탄올 산물이 배양에 의하여 소비될 수 있기 때문이다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 기술한 본 발명에 따른 발효 공정은 수성 배지 내에서 세균 세포뿐 아니라 에탄올을 포함하는 발효액을 야기할 것이다. 상기 방법의 양호한 실시 상태에 있어서, 에탄올은 발효액으로부터 회수된다.
특정 실시 상태에 있어서, 에탄올의 회수는 연속적으로 배양액의 일부를 제거하고, 상기 제거된 배양액의 일부로부터 알코올을 회수하는 것을 포함한다.
특정 실시 상태에 있어서, 에탄올의 회수는 배양액에서 세균 세포를 분리하고 알코올을 함유하는 세포가 없는 투과물을 생산하기 위하여 에탄올을 함유하는 배양액에서 제거한 일부를 분리 유닛으로 통과시키는 단계, 그리고 상기 세균 세포를 바이오리액터로 회수하는 단계를 포함한다.
특정 실시 상태에 있어서, 본 발명의 방법은 연속 공정이다.
특정 실시 상태에 있어서, 아세테이트는 발효의 부산물로 생성된다.
추가의 실시 상태에 있어서, 에탄올과 아세테이트는 배양액으로부터 회수된다.
특정 실시 상태에 있어서, 에탄올과 아세테이트의 회수는 연속적으로 배양액의 일부를 제거하는 단계와, 에탄올과 아세테이트를 상기 제거한 배양액의 일부로부터 회수하는 단계를 포함한다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 에탄올과 아세테이트의 회수는
에탄올과 아세테이트로부터 세균을 분리하고,에탄올과 아세테이트를 함유하는 투과물을 생산하기 위하여 배양액에서 제거한 일부를 분리 유닛으로 통과시키는 단계와, 상기 세균 세포를 바이오리액터로 회수하는 단계를 포함한다.
상기 실시 상태에 있어서, 에탄올과 아세테이트의 회수는 좋기로는 세포가 없는 투과물로부터 세포가 없는 투과물로부터 아세테이트를 제거함으로써 세포가 없는 투과물로부터 에탄올을 먼저 제거하는 것을 포함한다. 좋기로는, 상기 세포가 없는 투과물은 이어서 바이오리액터로 회수된다.
특정 실시 상태에 있어서, 본 발명의 방법은 연속 공정이다.
에탄올이 발효의 바람직한 최종 산물인 것이 좋다. 에탄올은 분별 증류 또는 증발, 그리고 추출 발효 등과 같은 기술 분야에서 알려진 방법들에 의하여 발효액으로부터 회수될 수 있다. 발효액으로부터의 에탄올의 증류는 에탄올과 물의 공비 혼합물 (즉, 95%의 에탄올과 5%의 물)을 생산한다. 무수 에탄올은 기술 분야에서 또한 잘 알려진 분자체 탈수 기술의 사용으로 얻을 수 있다. 추출 발효 공정은 발효액을 희석하여 에탄올을 회수하기 위하여, 발효 미생물에 대한 유독성이 낮은 물과 혼화 가능한 용매를 사용하는 것을 포함한다. 예를 들면, 올레일 알코올이 이러한 종류의 추출 공정에서 사용될 수 있다. 올레일 알코올은 발효조로 연속적으로 도입되는데, 그 결과 이러한 용매는 연속적으로 추출되고 원심 분리기로 공급되는 발효조의 정부에서 층을 형성한다. 이어서, 물과 세포는 올레일 알코올로부터 손쉽게 분리되고, 에탄올로 가득한 용매가 플래쉬 증발 유닛 (flash vaporization unit)으로 공급되는 동안 발효조로 회수된다. 올레일 알코올은 비활성이고 발효에 재사용되기 위하여 회수되는 반면, 대부분의 에탄올은 기화되고 응축된다.
또한, 기술 분야에 알려진 방법들을 사용하여 아세테이트는 발효액으로부터 회수될 수 있다. 아세테이트의 회수 방법은 WO 2007/117157 및 WO 2008/115080에 상세히 개시되어 있다.
본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 에탄올과 아세테이트는 연속적으로 발효 바이오리액터로부터 배양액의 일부를 제거하고, 배양액으로부터 미생물 세포를 분리하고 (간편하게는 여과하여), 먼저 에탄올을, 이어서 아세테이트를 배양액으로부터 회수함으로써 발효액으로부터 회수된다. 전술한 방법을 사용하여, 상기 에탄올은 증류에 의하여 간편하게 회수될 수 있고, 상기 아세테이트는 활성탄에 흡착시켜서 회수할 수 있다. 분리된 미생물 세포는 좋기로는 발효 바이오리액터로 회수된다. 에탄올과 아세테이트를 제거한 후에 잔재하는 세포가 없는 투과물은 또한, 좋기로는 발효 바이오리액터로 회수된다. 바이오리액터로 회수되기 전, 영양 배지를 보충하기 위하여 세포가 없는 투과물에 추가 영양분 (비타민 B 등)들이 첨가될 수 있다. 또한, 활성탄에 대한 아세트산의 흡착을 향상시키기 위하여 전술한 바와 같이 배양액의 pH를 조정하는 경우, 바이오리액터로 회수하기 전에 상기 pH는 발효 바이오리액터 내의 배양액과 유사한 pH로 재조정되어야 한다.
반응 화학양론
어떠한 이론에도 얽매임 없이, 본 발명의 공정에서 CO의 에탄올 (a)과 아세트산 (b)으로의 발효를 위한 화학 반응은 아래와 같다고 생각된다:
(a) 18CO + 9H2O ＝＞ 3CH3CH2OH + 12CO2
(b) 12CO + 6H2O ＝＞ 3CH3COOH + 6CO2
본 발명은 이제 하기의 비제한적 실시예들과 관련하여 더욱 상세하게 기술될 것이다.
실시예
배지
하기의 실시예에서 사용된 배지 성분들의 조성은 표 1과 표 2에 제시하였다.
씨. 오토에타노지눔의 배지 조성
배지 성분
배지 1.0L당 농도 ( LM17 ) 배지 1.0L당 농도 ( LM23 ) 배지 1.0L당 농도 ( LM33 )
MgCl2.6H2O 0.5 g 0.5 g 0.5 g
NaCl 0.2 g 0.2 g 0.2 g
CaCl2 0.2 g 0.2 g 0.2 g
(NH4)2HPO4 2.0 g - -
100mM 인산 나트륨 버퍼 (pH 6.0)* - 160 ml -
NaH2PO4 - - 2.04 g
NH4Cl - 0.6 g 2.5 g
85% H3PO4 0.05 ml 0.05 ml -
KCl 0.15 g 0.15 g 0.15 g
미량 금속 용액 합성물 (LSO6) 10 mL 10 mL 10 mL
비타민 B 용액 합성물 ( LS03 ) 10 mL 10 mL 10 mL
레자주린 (1000 mg/L 스톡) 1 mL 1 mL 2 mL
FeCl3 0.0025 g 0.0025 g 0.01 g
시스테인 HCl 모노하이드레이트 0.75 g 0.75 g 0.5 g
아가로오스 (임의) 15 g 15 g
증류수 1 리터까지 1 리터까지 1 리터까지
* H2O (1L) 내의 NaH2PO4 (13.2g)와 Na2HPO2.7H2O (1.1g)의 결합체 NaH2PO4 (13.2g)
씨. 오토에타지눔 합성 무기물과 비타민 용액
비타민 B 용액 합성물 ( LS03 ) 저장 용액 L당 미량 금속 용액 합성물 ( LSO6 ) 저장 용액 L당
비오틴 20.0 mg 나이트릴로트라이아세트산 1.5 g
엽산 20.0 mg MgSO4.7H2O 3.0 g
염산 피리독신 10.0 mg MnSO4.H2O 0.5 g
티아민 . HCl 50.0 mg NaCl 1.0 g
리보플라빈 50.0 mg FeSO4.7H2O 0.1 g
니코틴산 50.0 mg Fe(SO4)2(NH4)2. 6H2O 0.8 g
칼슘 D-(*)-판토텐산 50.0 mg CoCl2. 6H2O 0.2 g
비타민 B12 50.0 mg ZnSO4.7H2O 0.2 g
p-아미노벤조산 50.0 mg CuCl2. 2H2O 0.02 g
치옥트산 50.0 mg AIK(SO4)2.12H2O 0.02 g
증류수 1 리터까지 H3BO3 0.30 g
NaMoO4.2H2O 0.03 g
Na2SeO3 0.02 g
NiCl2. 6H2O 0.02 g
Na2WO4.6H2O 0.02 g
증류수 1 리터까지
LM17, LM23 및 LM33 배지를 다음과 같이 pH 5.5에서 제조하였다. 시스테인 HCL을 제외한 모든 성분들을 dH2O에 혼합하여 총 1L 부피가 되게 하였다. 95% CO, 5% CO2 기체를 일정하게 흘려 보내면서 이 용액을 가열하여 끓인 다음, 실온으로 냉각하여 혐기성이 되게 하였다. 냉각된 후, 시스테인 HCL을 첨가하고, 상기 용액의 pH를 5.5로 조정하였다; 실험 전반에 걸쳐 혐기 상태를 유지하였다.
에탄올 및 아세테이트 측정
하기 실시예들에서의 에탄올과 아세테이트 측정은 기체 크로마토그래프 HP 5890 시리즈 Ⅱ를 사용하여 수행하였다-불꽃 이온화 검출기 (flame ionization detector; FID), 제거가능한 비활성 유리, 주입부 라이너, 관련 조절 장치, 가스 라인 및 시료 자기 주사기 HP 7673A를 구비한 셉타 (septa)를 이용. 분리는 모세관 GC 컬럼 EC1000-Alltech EC1000 30 m × 0.25 mm × 0.25 ㎛으로 수행하였다.
기체 크로마토그래프는 5 mL 퍼지류 (1: 10 분할)로 50 mL/분의 총 수소 흐름, 20 psig의 컬럼 헤드 압력으로 선속도 45 cm/초로 분할식으로 작동시켰다. 온도 프로그램은 60 ℃에서 개시하였고, 1분간 유지한 후에 분당 30℃로 170℃까지 증가시켰다. 총 4.65분의 실행 시간이 걸렸다. 주입 온도는 180℃였고, 검출기 온도는 225℃였다.
사용된 시약은 프로판-1-올-시약 등급-Scharlau AL0437, GC 99.5% Min assay; 무수 에탄올-Scharlau ET0015, GC 99.9% Min assay; 100%의 빙아세트산-BDH 100015N, GC 99.8% Min assay; 오르토인산-BDH 294214Q, GC 99.0% Min assay; 질소-BOC 활성 산소-GC 보조가스; 수소-BOC 활성 산소-GC 운반 기체와 FID 연료; 제로 에어-FID 산화제; 탈이온수.
세포 농도
이 실험에서 세포 농도를 측정하기 위하여, 시료의 빛 흡수력을 600 nm (분광 광도계)에서 측정하고, 건조 질량은 공개된 절차에 따라 계산하여 측정하였다. 대사 산물의 농도는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를, 경우에 따라서는 기체 크로마토그래피 (GC)를 사용하여 측정하였다.
HPLC
HPLC 시스템 애질런트 (Agilent) 1100 시리즈. 이동상: 0.0025N 황산. 유동 및 압력: 0.800 mL/분. 컬럼: Alltech IOA; 카다로그 #9648, 150 × 6.5 mm, 입자 크기 5 ㎛. 컬럼 온도: 60℃. 검출기: 굴절률. 검출기 온도: 45℃.
HPLC용 시료 조제 방법은 아래와 같다: 400μL의 시료, 50μL의 0.15M ZnSO4, 그리고 50μL 의 0.15M Ba(OH)2를 에펜돌프 튜브 (Eppendorf tube)에 적재하였다. 상기 튜브를 10분 동안, 4℃에서 12,000rpm으로 원심분리하였다. 200μL의 상청액을 HPLC 유리병 (vial)으로 옮기고, 5μL를 HPLC 기구 내로 주입하였다.
실시예 1: 본 발명의 신규한 세균 분리균의 생산
신규한 균주 클로스트리듐 오토에타노지눔 (Clostridium autoethanogenum) LBS1560을 선별용 프로그램과 18개월에 걸친 클로스트리듐 오토에타지눔 모 배양균 (DSMZ 10061)으로부터 미생물 배양균을 증식하여 생산하였다.
방법
먼저, 냉동된 클로스트리듐 오토에타노지눔 10061 (DSMZ로부터 수득)의 스톡 (stock)을 해동하고, 95%의 CO와 5%의 CO2의 존재 하에서 효모 추출물 리터당 5g으로 제조한 LM23 배지에 접종하는데 사용하였다. 이 배양균은 효모 추출물이 없는 LM23 배지에서는 생장할 수 없다. 몇 개월에 걸쳐서, 배양균의 효모 추출물에 대한 의존 문제를 극복하기 위한 노력으로, 에탄올을 최대량으로, 그리고 최고의 아세테이트에 대한 에탄올 비율로 생산하는 것으로 관찰된 활발히 생장하는 미생물 배양균을, 95%의 CO와 5%의 CO2의 헤드스페이스 기체 존재 하에서, 효모 추출물 농도가 점차 감소되도록 배지를 갈아가면서 반복적으로 계대 배양하였다. 이 기간 후, 효모 추출물의 부재에서도 생장하고 에탄올과 아세테이트를 생산하는 배양균을 관찰할 수 있었다. 이 선별 프로토콜은 다음의 배양균에 대한 추가적인 동정과 선별을 위하여 활발히 유지시켰다:
ⅰ) 가장 빠르게 생장,
ⅱ) 가장 많은 양의 에탄올을 생성,
ⅲ) 아세테이트에 비해 에탄올을 가장 높은 비율로 생산, 및
ⅳ) 액체 배지 내의 효모 추출물의 부재에서도 생장.
실시예 1.1: 생장이 빠른 배양균의 선별
빨리 생장하는 배양균을 선별하기 위하여, 95%의 CO와 5%의 CO2의 연속 기체류 하에서 생장 기간 동안 에너지 대사산물의 부산물로서 아세트산을 생산하는 특성이 있는 미생물을 이용하였다. 생장 배지 내의 아세트산의 축적은 공정의 pH를 낮추는 효과가 있다. 따라서, 가장 빨리 생장하는 개체군을 선별하도록 압력을 가하기 위하여 생장 의존 방식으로 배양균이 희석된 발효조 구성을 개발하였다. 하나의 모범적인 구성을 도 1에 나타냈는데, 여기서 미생물의 배양물은 바이오리액터 1에서 발효된다. 영양 배지 2의 pH는 통상적인 pH 프로브 3으로 모니터링하였다. 프로브의 신호는 염기 또는 산 용액을 투입하는 펌프로 전달되기 보다는, pH 판독값이 설정값인 5.5로부터 벗어날 경우, 펌프 4가 작동된다; 이 경우, 상기 펌프는 pH 5.8의 신선한 혐기성 LM17 배지를 함유하는 용기 5에 연결된다. 따라서, 상기 배양균이 생장함에 따라, 아세트산이 생성되어, 상기 배지 2의 pH가 저하되면 펌프 4가 활성화되어 pH 5.8의 배지가 도입된다. 일단, 배지의 pH가 5.5 이상으로 회복되면, 펌프 4는 비활성화된다. 반응기 1 내의 액체 농도는 바이오리액터 1의 액체 농도를 고정 농도 이하에서 유지하도록 작동하는 두 번째 펌프 7에 연결된 농도 프로브 6을 사용하여 유지된다. 바이오리액터 1에서 펌프질된 배지는 폐기함/폐기 수단 8로 이송된다. 따라서, 성장 배양균 개체군은 생장 연관 수단 내에서 희석되고, 더 빨리 개체군이 생장하고, 더 많은 아세테이트가 생산되고, 더욱 신선한 배지가 도입되는데, 궁극적으로는 가장 빠르게 생장하는 개체군을 선별하기 위하여 pH를 효율적으로 유지하도록 비교적 많은 양의 배지가 발효조 내로 도입되고, 고정된 농도로 용기의 액체 부피를 유지하기 위하여 이들은 세척하지 않는다. 빨리 생장하는 배양균을 분리하기 위하여 연속 배양균으로 한 번에 이 발효조 구성을 몇 개월 동안 유지하였다. 14일 마다, 배양균의 분액을 제거하고, 헤드 스페이스 내에서 50 ㎖의 배지와 35 psig의 95%의 CO, 5%의 CO2를 함유하는 250 ㎖의 혈청 용기 내에서 생장하도록 하였다. 활발히 생장하는 배양균을 제조하고, 원래의 배양균 스톡과의 비교 연구를 위하여 글리세롤 스톡으로서 저장하였다.
결과
상기 기술한 18개월에 걸친 선별 공정과 계대배양은, 상기 ⅰ) 내지 ⅳ)의 각각의 특성을 최적으로 수행하는 것으로 나타난 새로운 균주 LBS1560을 야기하였다. 신 균주는 그람 양성 (그람 양성으로 착색됨), 운동성 없으며, 막대형을 가지며, 놀랍게도 포자를 형성하는 능력이 거의 없음 (본 명세서의 이후에 추가로 기술할)이 나타났다.
LBS1560은 독일, DSMZ에 부다페스트 조약에 따라 2007년 10월 19일에 기탁하였고, 기탁번호 DSM 19630을 부여받았다.
실시예 2: LBS1560 의 배양 및 저장
클로스트리듐 오토에타노지눔 LBS1560은 아래 조건을 사용하여 배양할 수 있다:
혐기성 조건 하에서, 37℃, pH 5.5에서 교반 (200 rpm으로 교반)하면서 LM23 배지 내의 35 psig의 95% CO 기체 (5% CO2)에서 생장. 생장은 600 nm에서 OD를 측정하고 현미경 분석에 의하여 관찰될 수 있다.
저장을 위하여, LM23 + 20% 글리세롤 내에서 LBS1560의 대수기 배양균을 급속 냉동하고 -80℃에서 저장하였다.
실시예 3: 원래의 모균주 클로스트리듐 오토에타지눔 DSMZ 10061과 신 균주 클로스트리듐 오토에타지눔 LBS1560 의 비교
이 실험은, 모균주 클로스트리듐 오토에타지눔 DSMZ 10061과 비교하여 CO를 함유하는 기체 기질의 에탄올로의 혐기성 발효를 위한 신 균주 LBS1560의 개선된 효율성을 증명한다. 또한, 이 실험은 고농도의 CO의 존재와 H2의 부재하에서, 신 균주 LBS1560에 의한 CO를 함유하는 기체의 에탄올로의 효율적인 발효를 증명한다.
방법
선별된 미생물 배양균 LBS1560의 냉동 스톡, 그리고 원래의 모 배양균 DSMZ 10061을 준비하여 해동하였고, 0.1% (w/v)의 효모 추출물 (YE)이 존재 또는 부재 하는 5 ㎖의 최소 액체 혐기성 미생물 생장 배지 (LM 23)를 함유하는 15 ㎖의 밀봉된 훈게이트 (Hungate) 튜브에 주입하는데 사용하였다. 모든 훈게이트 튜브를 95%의 CO, 5%의 CO2의 기체 분위기 하에서 유지하였다. 각 훈게이트 튜브에 대하여, 미생물 생장, 에탄올과 아세테이트의 생산을 7일의 배양 기간에 걸쳐 관찰하였다.
결과
아래의 표 3에 결과를 제시하였다.
LBS1560 균주와 모균주 DSMZ 10061의 발효 비교
배양균 배지 생장 (g 건조 질량) 에탄올 (g/l) 아세테이트 (g/l) 에탄올: 아세테이트 비율
DSMZ 10061 LM 23 + YE 0.443 0.08 3.45 0.023
LBS 1560 LM 23 + YE 0.0963 0.19 2.07 0.09
DSMZ 10061 LM 23 생장이 없음 N/A N/A N/A
LBS 1560 LM 23 0.583 2.74 1.95 1.41
표 3에 제시한 데이타는 균주 LBS 1560과 모균주 DSMZ 10061 사이의 몇 가지 번식 차이를 강조한다. DSMZ 10061은 효모 추출물이 부족한 최소 배지 내에서는 생장할 수 없는 반면, LBS 1560은 효모 추출물이 존재 또는 부재한 배지 내에서 생장할 수 있고, 효모 추출물이 부족한 최소 배지에서는 최고로 생장하였다. 최소 배지에서 생장한 LBS 1560은, 효모 추출물을 함유하는 배지에서 생장한 DSMZ 10061보다 생장, 에탄올 생산, 아세테이트에 대한 에탄올의 비율의 면에서 더욱 우수하였다.
실시예 4: LBS 1560의 포자화 특성
포자화 특성을 동정하기 위하여, LBS 1560을 아래에 상세하게 기술한 방법론에 따라 미생물의 포자 형성을 유도하는 것으로 알려진 다양한 조건에 노출시켰다.
● 기아 배양 (Starvation): LBS 1560의 배양균을 살균한 증류수 내에서 부유시켰다.
● 산소에 대한 노출: 살균한 공기를 5 ㎖의 생장 배지를 함유하는 훈게이트 튜브의 헤드 스페이스 내로 주입하고, 이어서 상기 튜브를 교반기에 두고 37℃에서 배양하였다.
● 낮은 pH (pH 3) 배지에 노출: 높은 세포 농도가 되도록 미생물을 LM 23 (pH 5.5)에서 생장시켰고, 이어서 상기 배지를 신선한 생장 배지 pH 3으로 교환하였다.
● 탄소원 및 에너지원으로서의 프룩토오스 및 산소에 대한 노출: 5 g/L의 프룩토스를 포함하고, 환원제 (즉, 시스테인-HCl)는 없는 액체 배지를 산소로 포화시키고, 고농도의 세포를 이 배지 내에 2일간 부유시켰다.
포자를 형성하는 LBS 1560의 능력은 현미경 실험으로 측정하였다.
세균 시료를 포자 관찰을 가능하게 하는 코마시 블루로 염색하였다. LBS 1560은 수많은 경우들에 있어서 관찰되었다. 기본적으로 미생물 개체군 중 어느 것에서도 포자 형성이 관찰되지 않았다. 어떤 경우에는, 현미경 검사법에 의하여 분리된 포자가 관찰되었는데, 이는 전체 미생물 개체군의 0.1% 보다 상당히 적은 것으로 추정됨을 주의해야 한다. 클로스트리디아 (Clostridia)의 모균주와 관련 균주는 포자를 형성하는 것으로 알려져 있는 점을 볼 때, 이는 놀랍고도 예상치 못한 것이었다. 포자 형성의 불능은 본 명세서에서 전술한 바와 같이 본 발명의 세균의 이로운 점들을 제공한다.
실시예 5: LBS 1560에 의한 에탄올 생산
이 실험은 연장된 기간에 걸친 LBS 1560에 의한 연속적인 에탄올 생산을 기술한다. 도 2는 2주에 걸쳐 아세테이트, 에탄올 및 바이오매스의 농도들의 요약을 제공한다.
절차
1. 1 리터 용량의 CSTR 내에서 혐기성 LM33 발효 배지의 1 L 배지에 5% (v/v)의 농도에서 활발히 생장하는 클로스트리디움 오토에타노지눔 (LBS 1560) 배양균 (DSMZ 19630)을 접종하였다. 70%의 CO와 15%의 CO2, 1%의 H2, 14%의 N2 기체의 연속류를 19 ㎖/분의 부피 유량으로 분산 스파저 (sparger)를 통하여 발효조 용기의 바닥에 주입하였다. 발효조의 초기 pH를 5.5로 맞추고, 교반 속도를 400 rpm으로 조정하였다.
2. 실험의 대부분 동안, 배양균의 아세트산 농도는 세포 재순환과 배지 교환 시스템으로 4 g/L 미만으로 유지하였다. 상기 세포들은 교차 흐름 막 비바 (Viva) 200으로 이송하였고, 여액은 수집하였으며, 상기 세포들은 반응기 용기로 회수하였다. 상기 여액은 반응기 내부의 배지 부피를 일정하게 유지하기 위하여 신선한 배지로 대체하였다.
3. 상기 배양균은 최소 14일 동안 연속적으로 조절하였다. 세포 재순환 시스템은 바이오리액터로부터 세균을 제거함 없이, 1~2일 마다 1 내지 1.5 L의 액체 영양 배지를 제거하였다. 제거된 배지는 일정한 부피를 유지하기 위하여 신선한 배지로 교체하였다.
4. 발효조의 pH는 실험의 첫 4일 동안에 걸쳐 5.6에서 6.0으로 증가시켰다.
결과
아세트산 생성 세균 (클로스트리디움 오토에타노지눔 등)의 급격한 생장 단계는 일반적으로는 조절된 발효 환경 내에서의 높은 아세테이트 생산과 관련된다. 신 균주 LBS 1560을 이용하는 이 실험에서는, 생장 단계 (0 내지 3일) 동안, 배양균이 평균 0.3 g/L/일의 아세테이트와 0.16 g/L/일의 에탄올을 생산하였다. 그 다음의 생장 단계 (3 내지 13일)에는, 배양균이 평균 1.03 g/L/일의 아세테이트와 1.4 g/L/일의 에탄올을 생산하였다. 알코올 생산 기간 동안, 총 생성된 에탄올은 14 g/L이었다. 상기 결과는 예상 농도보다 낮은 아세테이트의 생산과 상당히 높은 에탄올 생산을 나타낸다.
본 명세서에 기술된 구체적인 방법들과 조성물들은 양호한 실시예들의 대표이고, 모범이며 본 발명의 범위에 있어서의 제한을 의도하지 않는다. 다른 목적, 측면 및 실시예들이 이 명세서를 고려하여 기술 분야의 숙련된 자들에게서 발견될 것이며, 본 발명의 범위와 정신 내의 것을 포함한다. 본 발명의 범위와 정신으로부터 벗어남 없이, 본 명세서에 기술된 본 발명에 대하여 제조될 수 있는 다양한 치환과 변경이 기술 분야의 숙련된 자들에게 손쉽게 분명할 수 있다. 본 명세서에서 실례로 기술된 본 발명은, 본 명세서에서 필수적인 것으로 구체적으로 기술되지 않은 임의의 요소나 요소들, 또는 제한이나 제한들의 부재 하에서 적절하게 행해질 수 있다. 따라서, 예를 들면, 본 명세서의 각 예에서, 본 발명의 구체예 또는 실시예에서, "구성하는", "포함하는", "함유하는" 등의 용어들은 확장적으로 해석되고, 제한되지 않는다. 더욱이, 제목, 주제, 또는 그 밖의 유사한 것들은 이 문서를 읽는이의 이해를 향상시키기 위하여 제공되는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
상기에서 기술된, 그리고 만약에 있다면 이하에서 기술되는 모든 출원, 특허와 공개 문헌의 전체 내용은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 그러나, 이 명세서 내의 임의의 출원, 특허 및 공개문헌들에 대한 언급은 유효한 종래 기술로 여겨지는 인지 또는 제안의 임의의 형태, 또는 전 세계 내의 임의의 나라 내에서의 일반적인 일반 상식의 일부로 여겨져서는 안된다.
데에스엠제트_도이체 잠룽 폰 (DSAM_DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH) DSM19630 20071019

Claims (32)

  1. CO를 포함하는 기질의 혐기성 발효에 의하여 아세테이트에 대하여 에탄올이 최소 1.0의 비율로 생성되도록 에탄올과 임의로 아세테이트를 함유하는 산물을 생산할 수 있는 세균의 생물학적으로 순수한 분리균.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비율은 최소 1.2인 생물학적으로 순수한 분리균.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세균의 생산성은 약 1.2g 이상의 에탄올/발효액 1L/1일인 것인 생물학적으로 순수한 분리균.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세균의 생산성은 약 2.0g 이상의 에탄올/발효액 1L/1일인 것인 생물학적으로 순수한 분리균.
  5. CO를 포함하는 기체 기질의 혐기성 발효에 의하여, 알코올과 임의로 아세테이트를 함유하는 산물을 생성할 수 있고, 그 생산성은 약 1.2g 이상의 에탄올/발효액 1L/1일인 세균의 생물학적으로 순수한 분리균.
  6. 제5항에 있어서, 상기 생산성은 약 1.2g 이상의 에탄올/발효액 1L/1일인 것인 생물학적으로 순수한 분리균.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 에탄올은 최소 약 1.0의 아세테이트에 대한 에탄올 비율로 생산되는 것인 생물학적으로 순수한 분리균.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세균은
    (a) 약 65 부피% 이상의 CO,
    (b) 약 20 부피% 미만의 H2, 또는
    (c) 약 65 부피% 이상의 CO와 약 20 부피% 미만의 H2,
    를 포함하는 CO를 함유하는 기질이 공급된 수성 배지 내에서 혐기성 발효에 의하여 에탄올과 아세테이트를 생산할 수 있는 것인 생물학적으로 순수한 분리균.
  9. 효모 추출물이 존재 또는 부재하는 최소 배지 내에서 생장하는 능력이 있고,효모 추출물이 존재하는 배지에 비하여 효모 추출물이 존재하지 않는 배지 내에서 더욱 빠르게 생장하고 아세테이트에 비해 에탄올을 더 높은 비율로 생산하고/하거나 더 높은 농도로 에탄올을 생산하는 능력이 있으며, 포자를 형성하는 능력은 거의 또는 전혀 없고, 그람 양성이며, 막대형이고 운동성이 없다는 특징들 중 하나 이상을 갖는 아세트산 생성 세균.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세균은 약 65 부피% 이상의 CO, 약 20 부피% 미만의 H2, 또는 약 65 부피% 이상의 CO와 약 20 부피% 미만의 H2를 포함하는 CO를 함유하는 기질이 공급된 수성 배지 내에서 혐기성 발효에 의하여 에탄올을 생산할 수 있고, 상기 세균의 생산성은 약 1.2g 이상의 에탄올/발효액 1L/1일이고/이거나 상기 세균은 아세테이트에 대한 에탄올의 비율이 약 1.0 이상이 되도록 에탄올을 생산할 수 있는 것인 세균.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세균은 클로스트리디움 오토에타노지눔 (Clostridium autoethanogenum)에서 유래된 것인 생물학적으로 순수한 분리균.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세균은 기탁번호 DSM 19630으로 DSMZ에 기탁된 클로스트리디움 오토에타노지눔 균주로 정의되는 특성들을 가지는 것인 세균.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세균은 기탁번호 DSM 19630으로 DSMZ에 기탁된 클로스트리디움 오토에타노지눔 균주인 것인 세균.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 기재된 세균을 1종 이상 이용하여 CO를 함유하는 기질을 발효시키는 것을 포함하는 1종 이상의 알코올을 생산하기 위한 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 방법은
    (a) 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 기재된 세균의 배양균을 함유하는 바이오리액터에 CO를 함유하는 기질을 제공하는 단계, 및
    (b) 상기 바이오리액터 내에서 배양균을 혐기적으로 발효시켜 1종 이상의 알코올을 생산하는 단계,
    를 포함하는 것인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 1종 이상의 알코올은 에탄올을 포함하고, 에탄올 생산성은 약 1.2g 이상의 에탄올/발효액 1L/1일이고/이거나 상기 에탄올은 최소 약 1.0의 아세테이트에 대한 에탄올의 비율로 에탄올이 생산되는 것인 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 CO를 포함하는 기질은 CO를 포함하는 기체 기질인 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 CO를 포함하는 기체 기질은 산업적 공정의 부산물로서 얻은 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 산업적 공정은 철 금속 제품 제조, 비철 제품 제조, 석유 정제, 바이오매스의 기화, 석탄의 기화, 전력 생산, 카본 블랙 생산, 암모니아 생산, 메탄올 생산 및 코크스 제조로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 기체 기질은 제강 공장에서 수득한 것인 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 기체 기질은 자동차 배기 가스를 포함하는 것인 방법.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 기질은 약 65 부피% 이상의 CO, 약 20 부피% 미만의 H2, 또는 약 65 부피% 이상의 CO와 약 20 부피% 미만의 H2를 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 기질은 최소 약 70 부피% 이상의 CO, 최소 약 75 부피% 이상의 CO, 최소 약 80 부피% 이상의 CO, 최소 약 85 부피% 이상의 CO, 최소 약 90 부피% 이상의 CO 또는 최소 약 95 부피% 이상의 CO를 포함하는 것인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 기질은 약 20 부피% 미만의 H2, 약 15 부피% 미만의 H2, 약 10 부피% 미만의 H2, 약 5 부피% 미만의 H2, 약 4 부피% 미만의 H2, 약 3 부피% 미만의 H2, 약 2 부피% 미만의 H2, 약 1 부피% 미만의 H2를 포함하거나 대체로 H2가 없는 것인 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 기질은 약 20 부피% 이하의 CO2, 약 15 부피% 이하의 CO2, 약 10 부피% 이하의 CO2, 또는 약 5 부피% 이하의 CO2를 포함하는 것인 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 기질은 최소 약 85 부피%의 CO와 최대 약 15 부피%의 CO2, 최소 약 90 부피%의 CO와 최대 약 10 부피%의 CO2, 또는 최소 약 95 부피%의 CO와 최대 약 5 부피%의 CO2를 포함하는 것인 방법.
  27. (a) 산업적 공정의 결과물로서 생성된 CO를 함유하는 기체를 대기로 방출되기 전에 포집하는 단계,
    (b) 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 하나 이상의 세균을 함유하는 배양균에 의하여 CO를 함유하는 기체를 혐기성 발효시켜 1종 이상의 알코올을 생산하는 단계,
    를 포함하는 산업적 공정으로부터의 대기 중 총 탄소 방출량을 감소시키기 위한 방법.
  28. 바이오리액터 내의 영양 배지에서 미생물을 배양하는 단계,
    영양 배지가 실질적으로 일정한 pH를 유지하도록 영양 배지보다 pH가 더 높은 신선한 배지를 첨가하는 단계, 및
    바이오리액터 내의 배지가 실질적으로 일정한 부피를 유지하도록 영양 배지와 미생물의 적어도 일부를 제거하는 단계,
    를 포함하는 1종 이상의 산을 생산하는 미생물을 1종 이상 선별하기 위한 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 방법은 빠르게 생장하는 미생물을 선별하기 위한 것인 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 1종 이상의 산은 아세테이트를 포함하는 것인 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 하나의 항의 방법에 의하여 생성된 세균의 생물학적으로 순수한 분리균.
  32. 제31항에 있어서, 상기 분리균은 포자를 형성하는 능력이 거의 또는 전혀 없는 것인 생물학적으로 순수한 분리균.
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