EA022710B1

EA022710B1 - Штамм бактерии clostridium autoethanogenum, способный продуцировать этанол и ацетат путем анаэробной ферментации субстрата, содержащего co

Info

Publication number: EA022710B1
Application number: EA201070608A
Authority: EA
Inventors: Шон Деннис СИМПСОН; Ричард Ллуэллин Сидни ФОРСТЕР; Пхуонг Лоан Тран; Мэттью Джеймс Роуэ; Айан Линдстранд Уорнер
Original assignee: Ланзатек Нью Зиленд Лимитед
Priority date: 2007-11-13
Filing date: 2008-11-13
Publication date: 2016-02-29
Also published as: EP2217696A2; CA2703622C; CN102876609A; KR20100110300A; EP2217696A4; CN101918538A; KR101375029B1; JP5600296B2; AU2008321615A1; EP2217696B1; EA201070608A1; CN101918538B; JP2011502533A; US8222013B2; HK1145406A1; WO2009064200A2; US20100311104A1; CA2703622A1; WO2009064200A3; BRPI0820556A2

Abstract

Изобретение относится к штамму LBS1560 бактерии Clostridium autoethanogenum, депонированному в DSMZ под номером DSM 19630, способному продуцировать этанол и ацетат путем анаэробной ферментации субстрата, содержащего СО.

Description

Настоящее изобретение в целом относится к области микробиологической ферментации газов. Конкретнее оно относится к новому классу бактерий с повышенной эффективностью в продукции этанола путем анаэробной ферментации субстратов, содержащих монооксид углерода (СО).

Уровень техники изобретения

Этанол стремительно становится основным водороднасыщенным жидким горючим для транспорта по всему миру. Мировое потребление этанола в 2005 году составило 12,2 миллиардов галлонов. Мировой рынок также спрогнозировал резкий рост в будущем промышленности, связанной с топливным этанолом, в связи с чем к этанолу возрос интерес в Европе, Японии, США и некоторых развивающихся странах.

Например, в США этанол используется для производства Е10, 10% смеси этанола с бензином. В смеси Е10 этанол выступает в качестве окислительного агента, повышая эффективность возгорания и снижая образование загрязняющих воздух веществ. В Бразилии на долю этанола приходится приблизительно 30% от потребляемого горючего, как в качестве окислительного агента, смешанного с бензином, так и в чистом виде в качестве горючего. Также в Европе загрязнение окружающей среды, связанное с выделением газов, вызывающих парниковый эффект, побудило Европейский союз принять решение об использовании рациональных топлив для транспортных средств, таких как этанол, получаемый из биомассы.

Подавляющее большинство продукции топливного этанола осуществляется с помощью процесса традиционной дрожжевой ферментации, использующего карбогидраты, получаемые из растительного сырья, такого как сахароза, экстрагируемая из сахарного тростника, или крахмал, экстрагируемый из зерновых культур как основной углеродный ресурс. Однако стоимость данного карбогидратного промышленного сырья находится под влиянием их ценности как человеческой пищи и животных кормов, в то время как наработка крахмала или сахарозасодержащего сырья с целью производства этанола не является рациональной с экономической точки зрения ни в одной из географических зон. Таким образом, разработка технологий производства топливного этанола из менее дорогостоящих и/или содержащих большее количество углерода ресурсов является важной задачей.

СО является основным свободным энергоемким побочным продуктом неполного окисления органических материалов, таких как уголь или нефть и нефтепродукты. Например, по имеющимся сведениям черная металлургия в Австралии ежегодно производит и выделяет в атмосферу более 500000 т СО.

Процесс катализа может быть использован для продукции из газов, состоящих, главным образом, из СО и/или СО и водорода (Н₂), топлива и химикатов. Микроорганизмы могут быть также использованы для конверсии этих газов в топливо и химические продукты.

Способность микроорганизмов расти на СО как источнике углерода была впервые выявлена в 1903 году. В дальнейшем было показано, что в основании этого лежит способность организмов использовать ацеткоэнзим А (ацетил КоА) биохимический путь афтотрофного роста (также известная как путь Льюнгдала-Вуда и монооксид углерода дегидрогеназный/ацетил КоА синтазный (СОЭН/АС8) путь). Было показано, что большое количество анаэробных организмов, включающих карбоксидотрофные, фотосинтезирующие, метаногенные и ацетогенные организмы метаболизируют СО до различных конечных продуктов, а именно СО₂, Н₂, метана, н-бутанола, ацетата и этанола. При использовании СО как единственного источника углерода все подобные организмы продуцируют, по меньшей мере, приблизительно два из перечисленных конечных продуктов.

Было показано, что анаэробные бактерии, такие как представители рода С1о8йтйшш, продуцируют этанол из СО, СО₂ и Н₂ посредством ацетил КоА биохимического пути. Например, в АО 00/68407, ЕР 117309, патентах США № 5173429, 5593886 и 6368819, АО 98/00558 и АО 02/08438 было описано, что различные штаммы С1о8йтйшт (щпдйаЫН продуцируют этанол из различных газов.

Также известно, что бактерия СйоЧпййнп аШосШаподспиш §р продуцирует этанол из газов (АЪпт е! а1., АтсЫуек о£ МюгоЪю1оду 161, рр. 345-351 (1994)).

Тем не менее, продукция этанола микроорганизмами путем ферментации газов всегда сопряжена с побочной продукцией ацетата и/или уксусной кислоты. Так как часть доступного углерода идет на продукцию ацетата/уксусной кислоты, а не на продукцию этанола, эффективность производства этанола при использовании данного ферментационного процесса может оказаться меньше ожидаемой. Также несмотря на то, что побочно вырабатываемые ацетат/уксусная кислота могут быть использованы для некоторых других целей, это может вызвать проблему удаления отходов. Ацетат/уксусная кислота конвертируется в метан микроорганизмами и таким образом может внести вклад в выброс газов, вызывающих парниковый эффект.

Микробиологическая ферментация СО в присутствии Н2 может привести к практически полному преобразованию углерода в спирт. Однако в отсутствие достаточного количества Н2 только часть СО преобразуется в спирт, в то время как другая значительная часть преобразуется в СО₂, как это показано в следующих уравнениях:

- 1 022710

6СО + ЗН₂О -> С₂Н₅ОН + 4СО₂12Н₂ + 4СО₂ -> 2С₂Н₅ОН + 6Н₂О

Продукция СО₂ отражает недостаточную эффективность переработки углерода, и в случае его выделения есть вероятность содействия выбросу газов, вызывающих парниковый эффект.

АО2007/117157 описывает процесс получения спирта, в частности этанола, путем анаэробной ферментации газов, содержащих монооксид углерода. В качестве побочного продукта ферментационного процесса образуется ацетат, который перерабатывается в водород и диоксид углерода, каждый из которых по отдельности или совместно может быть использован в процессе анаэробной ферментации.

АО2008/115080 описывает процесс продукции спирта(ов), происходящий в несколько ферментативных стадий. Побочные продукты анаэробной ферментации газа(ов) в первом биореакторе могут быть использованы для производства продуктов в следующем биореакторе. Более того, побочные продукты следующей стадии ферментации могут быть повторно использованы в первом реакторе для получения продуктов.

Таким образом, предоставление микроорганизмов, способных к ферментации подобных газов до этанола с большей эффективностью, то есть таких микроорганизмов, которые способны продуцировать большее количество этанола и/или продуцировать этанол с большим коэффициентом отношения этанола к ацетату на одном и том же субстрате, является целесообразной задачей.

При этом в известном уровне техники бактериальной ферментации СО-содержащих газов до этанола с высоким уровнем продукции этанола и/или высоким коэффициентом отношения этанола к ацетату обычно используются газовые субстраты, объемное содержание СО в которых составляет приблизительно 30-65% и приблизительно 20-30% для Н₂ (АО 00/68407).

Производственные отходящие СО-содержащие газы, потенциально являющиеся субстратами для микробиологического ферментационного производства этанола, могут содержать как большее количество СО, так и меньшее количество Н₂ или обладать обеими данными характеристиками одновременно. Таким образом, наличие доступных бактериальных штаммов, способных к эффективной ферментации газов, содержащих, к примеру, более 65% СО и менее 20% Н₂ по объему, могло бы быть очень полезным.

Целью настоящего изобретения является предоставление нового класса бактерии, способного преодолеть один или более недостатков существующего уровня техники производства этанола из СО-содержащих газов или, по крайней мере, расширить приемлемый выбор.

Краткое описание изобретения

Первым аспектом изобретения является предоставление биологически чистого изолята бактерии, способной продуцировать продукты, включающие этанол и необязательно ацетат, путем анаэробной ферментации субстрата, содержащего СО, при этом соотношение количества этанола к ацетату в получаемом продукте составляет по меньшей мере 1,0.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление биологически чистого изолята бактерии, способной продуцировать этанол и ацетат путем анаэробной ферментации в водном ферментационном бульоне, содержащем СО, в частности газовый субстрат, содержащий СО, включающий:

a) более чем приблизительно 65 об.% СО,

b) менее чем приблизительно 20 об.% Н₂ или

c) более чем приблизительно 65 об.% СО и менее чем приблизительно 20 об.% Н₂, где соотношение этанола к ацетату составляет приблизительно не менее чем 1,0.

В одном отдельном варианте реализации коэффициент отношения этанола к ацетату составляет не менее чем приблизительно 1,1, более предпочтительно не менее чем приблизительно 1,2, более предпочтительно не менее чем приблизительно 1,3 и наиболее предпочтительно не менее чем приблизительно 1,4.

В дополнительном варианте воплощения бактерия способна продуцировать этанол в концентрации не менее 2,0 г на 1 л ферментационного бульона.

В отдельном варианте реализации концентрация этанола составляет не менее чем приблизительно 2,1 г на 1 л ферментационного бульона, не менее чем приблизительно 2,2 г на 1 л ферментационного бульона, не менее чем приблизительно 2,3 г на 1 л ферментационного бульона, не менее чем приблизительно 2,4 г на 1 л ферментационного бульона, не менее чем приблизительно 2,5 г на 1 л ферментационного бульона, не менее чем приблизительно 2,6 г на 1 л ферментационного бульона, не менее чем приблизительно 2,7 г на 1 л ферментационного бульона, не менее чем приблизительно

2,8 г на 1л ферментационного бульона, не менее чем приблизительно 3,0 г на 1л ферментационного бульона, не менее чем приблизительно 3,2 г на 1л ферментационного бульона, не менее чем приблизительно 3,4 г на 1 л ферментационного бульона.

- 2 022710

В отдельном варианте реализации продуктивность бактерии составляет, по меньшей мере, приблизительно 1,2 г этанола на 1 л ферментационного бульона в день, по меньшей мере, приблизительно 1,6 г этанола на 1 л ферментационного бульона в день, по меньшей мере, приблизительно 1,8 г этанола на 1 л ферментационного бульона в день или, по меньшей мере, 2,0 г этанола на 1 л ферментационного бульона в день.

В конкретных вариантах воплощения относительная продуктивность по выработке этанола составляет, по меньшей мере, приблизительно 0,7 г/л/г бактериальных клеток в день, по меньшей мере, приблизительно 0,9 г/л/г бактериальных клеток в день, по меньшей мере, приблизительно 1,1 г/л/г бактериальных клеток в день, по меньшей мере, приблизительно 1,3 г/л/г бактериальных клеток в день.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление биологически чистого изолята бактерии, способной продуцировать продукты, включающие спирт и необязательно ацетат, путем анаэробной ферментации СО-содержащих субстратов с производительностью бактерии, равной, по меньшей мере, приблизительно 1,2 г этанола на 1л ферментационного бульона в день.

Дополнительным аспектом настоящего изобретения является предоставление биологически чистого изолята бактерии, способной продуцировать этанол путем анаэробной ферментации в водных культуральных средах, дополненных СО-содержащим субстратом, в частности газовым субстратом, содержащим СО и включающим:

a) более чем приблизительно 65 об.% СО,

b) менее чем приблизительно 20 об.% Н₂ или

c) более чем приблизительно 65 об.% СО и менее чем приблизительно 20 об.% Н₂, при концентрации этанола, равной, по меньшей мере, приблизительно 2,0 г этанола на 1 л ферментационного бульона.

В отдельном варианте реализации концентрация этанола составляет, по меньшей мере, приблизительно 2,1 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,2 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,3 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,4 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,5 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,6 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,7 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно

2,8 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 3,0 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 3,2 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 3,4 г этанола на 1 л ферментационного бульона.

В отдельном варианте реализации производительность бактерии составляет, по меньшей мере, приблизительно 1,2 г этанола/л ферментационного бульона/день, по меньшей мере, приблизительно 1,6 г/л/день, по меньшей мере, приблизительно 1,8 г/л/день или по меньшей мере 2,0 г/л/день.

В конкретном варианте воплощения относительная производительность этанола бактерией составляет, по меньшей мере, приблизительно 0,7 г/л/г бактериальных клеток/день, по меньшей мере, приблизительно 0,9 г/л/г бактериальных клеток/день, по меньшей мере, приблизительно 1,1 г/л/г бактериальных клеток/день или, по меньшей мере, приблизительно 1,3 г/л/г бактериальных клеток/день.

В одном из вариантов воплощения ацетат продуцируется как побочный продукт ферментационного процесса.

В отдельном варианте реализации этанол продуцируется с коэффициентом отношения этанола к ацетату, равным, по меньшей мере, приблизительно 1,0. В отдельном варианте реализации этанол продуцируется с коэффициентом отношения этанола к ацетату, равным, по меньшей мере, приблизительно 1,1, по меньшей мере, приблизительно 1,2, по меньшей мере, приблизительно 1,3 или более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 1,4.

Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление ацетогенной бактерии, в котором бактерия обладает одной или несколькими из следующих определенных характеристик:

способностью расти на минимальной среде в присутствии или в отсутствие дрожжевых экстрактов;

способностью к более быстрому росту с целью продукции этанола с более высоким отношением этанола к ацетату и/или с целью продукции более высоких концентраций этанола на средах без дрожжевого экстракта по сравнению со средами с дрожжевым экстрактом;

с низкой способностью к образованию спор или ее отсутствием;

грамположительная;

палочкообразная;

неподвижная.

В одном из вариантов воплощения бактерия дополнительно способна продуцировать этанол путем анаэробной ферментации в водных культуральных средах, дополненных СО-содержащим субстратом, включающим:

- 3 022710

a) более чем приблизительно 65 об.% СО,

b) менее чем приблизительно 20 об.% Н₂ или

c) более чем приблизительно 65 об.% СО и менее чем приблизительно 20 об.% Н₂, при концентрации этанола, составляющей, по меньшей мере, приблизительно 2,0 г этанола на 1 л ферментационного бульона, и/или коэффициенте отношения этанола к ацетату, равном, по меньшей мере, приблизительно 1,0.

В отдельном варианте реализации коэффициент отношения метанола к ацетату составляет, по меньшей мере, приблизительно 1,1, по меньшей мере, приблизительно 1,2, по меньшей мере, приблизительно 1,3 или более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 1,4.

В отдельном варианте реализации концентрация продуцируемого этанола составляет, по меньшей мере, приблизительно 2,1 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,2 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,3 г этанола на 1л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,4 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,5 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,6 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,7 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,8 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 3,0 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 3,2 г этанола на 1 л ферментационного бульона или, по меньшей мере, приблизительно 3,4 г этанола на 1 л ферментационного бульона.

В отдельном варианте реализации продуктивность бактерии составляет, по меньшей мере, приблизительно 1,2 г этанола/л ферментационного бульона/день, по меньшей мере, приблизительно 1,6 г/л/день, по меньшей мере, приблизительно 1,8 г/л/день или по меньшей мере 2,0 г/л/день.

В конкретном варианте воплощения относительная продуктивность бактерии по выработке этанола составляет, по меньшей мере, приблизительно 0,7 г/л/г бактериальных клеток/день, по меньшей мере, приблизительно 0,9 г/л/г бактериальных клеток/день, по меньшей мере, приблизительно 1,1 г/л/г бактериальных клеток/день или, по меньшей мере, приблизительно 1,3 г/л/г бактериальных клеток/день.

В одном из вариантов воплощения бактерия настоящего изобретения получена из С1о51пбшт аиЮе1Ьаподепит.

В отдельном варианте реализации бактерия обладает двумя или более и наиболее желательно всеми описанными характеристиками.

В отдельном варианте реализации бактерия обладает описанными характеристиками С1о51пб1ит аиЮе1Ьаподепит штамма ЬВ81560, депонированного в Ό8ΜΖ под номером доступа Ό8Μ19630. В конкретном варианте воплощения бактерия представляет собой С1о51пбшт аиЮеШаподепит, штамм ЬВ81560, депонированный в Ό8ΜΖ под номером доступа Ό8Μ19630.

В дополнительном аспекте изобретения предоставляется биологически чистый изолят С1о51пб1ит аиЮеШаподепит штамма ЬВ81560, депонированный в Ό8ΜΖ под номером доступа Ό8Μ19630.

В одном из вариантов воплощения субстрат содержит, по меньшей мере, приблизительно 70 об.% СО, по меньшей мере, приблизительно 75 об.% СО, по меньшей мере, приблизительно 80 об.% СО, по меньшей мере, приблизительно 85 об.% СО, по меньшей мере, приблизительно 90 об.% СО, по меньшей мере, приблизительно 95 об.% СО.

В дополнительном варианте воплощения субстрат содержит менее чем приблизительно 20 об.% Н₂. В отдельном варианте реализации субстрат содержит менее чем приблизительно 15 об.% Н₂, менее чем приблизительно 10 об.% Н₂, менее чем приблизительно 5 об.% Н₂, менее чем приблизительно 4 об.% Н₂, менее чем приблизительно 3 об.% Н₂, менее чем приблизительно 2 об.% Н₂, менее чем приблизительно 1 об.% Н₂ или, по существу, не содержит Н₂.

В дополнительном варианте воплощения субстрат содержит количество СО₂, менее чем или равное приблизительно 20 об.%. В отдельном варианте реализации субстрат содержит количество СО₂, менее чем или равное приблизительно 15 об.%, менее чем или равное приблизительно 10 об.% или менее чем или равное приблизительно 5 об.%.

В отдельном варианте реализации субстрат содержит, по меньшей мере, приблизительно 85 об.% СО и не более чем приблизительно 15 об.% СО₂, по меньшей мере, приблизительно 90 об.% СО и не более чем приблизительно 10 об.% СО₂ или приблизительно 95 об.% СО и приблизительно 5 об.% СО2.

В конкретном варианте воплощения водная культуральная среда представляет собой минимальную анаэробную микробиологическую питательную среду, которая выбирается из, как определено в настоящем документе, сред ΕΜ23 или ΕΜ33, которыми, тем не менее, не ограничивается список возможных сред.

В одном из вариантов воплощения среда не дополнена дрожжевым экстрактом.

- 4 022710

Дополнительным аспектом изобретения является предоставление способа производства одного или нескольких спиртов из СО-содержащего субстрата, включающего поддержание культуры одного или нескольких изолятов бактерий настоящего изобретения в присутствии субстрата и анаэробную ферментацию субстрата одним или несколькими изолятами бактерий до одного или нескольких спиртов.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ производства одного или нескольких спиртов, включающий ферментацию СО-содержащего субстрата с использованием одной или нескольких вышеописанных бактерий.

В одном из вариантов воплощения способ включает стадии:

a) снабжения биореактора, содержащего культуру вышеописанной бактерии, СО-содержащим субстратом; и

b) анаэробную ферментацию, осуществляемую данной культурой в биореакторе с целью производства одного или нескольких спиртов.

Дополнительным аспектом настоящего изобретения является предоставление способа снижения общего выброса углерода в атмосферу при производственном процессе, способ включает:

a) фиксацию СО-содержащих газов, продуцируемых в ходе производственного процесса, до их высвобождения в атмосферу;

b) анаэробную ферментацию СО-содержащих газов с целью производства одного или нескольких спиртов культурами, содержащими один или несколько изолятов бактерий настоящего изобретения.

В отдельном варианте реализации данного способа ацетат продуцируется как побочный продукт ферментационного процесса. Один или несколько продуцируемых спиртов включают этанол.

В отдельном варианте реализации данного способа бактерия культивируется в водной культуральной среде.

В отдельном варианте реализации данного способа ферментация субстрата производится в биореакторе.

В конкретном варианте реализации субстрат содержит менее чем приблизительно 15 об.% Н₂, а именно менее чем приблизительно 10 об.% Н₂ или, например, менее чем приблизительно 5 об.% Н2.

В отдельном варианте реализации субстрат включает более чем приблизительно 65 об.% СО, предпочтительно от приблизительно 70 об.% до приблизительно 95 об.% СО.

В одном из вариантов реализации субстрат включает объемную долю СО, равную, по меньшей мере, приблизительно 70%. В отдельном варианте реализации объемная доля СО в субстрате составляет, по меньшей мере, приблизительно 80%, по меньшей мере, приблизительно 85%, по меньшей мере, приблизительно 90% или, по меньшей мере, приблизительно 95%.

В одном из вариантов реализации объемная доля Н2 в субстрате составляет менее чем приблизительно 20%. В отдельном варианте реализации объемная доля Н₂ составляет менее чем приблизительно 15%, объемная доля Н₂ составляет менее чем приблизительно 10%, объемная доля Н₂ составляет менее чем приблизительно 5%, объемная доля Н₂ составляет менее чем приблизительно 4%, объемная доля Н₂ составляет менее чем приблизительно 3%, объемная доля Н₂ составляет менее чем приблизительно 2%, объемная доля Н₂ составляет менее чем приблизительно 1% или субстрат вообще не содержит Н₂.

В одном из вариантов реализации объемная доля СО2 в субстрате менее чем или равна приблизительно 20%. В отдельном варианте реализации объемная доля СО2 в субстрате менее чем или равна приблизительно 15%, объемная доля СО₂ менее чем или равна приблизительно 10% или объемная доля СО₂ менее чем или равна приблизительно 5%.

В отдельном варианте реализации СО-содержащий субстрат представлен газовым субстратом, содержащим СО.

В отдельном варианте воплощения изобретения газовый субстрат включает газ, полученный как побочный продукт в производственном процессе.

В отдельном варианте реализации производственный процесс выбирается из группы, состоящей из производства продуктов черной металлургической промышленности, неметаллургической промышленности, нефтеперерабатывающей промышленности, газификационной биомассы, газификации угля, производства электроэнергии, производства сажи, производства аммиака, производства метанола и производства кокса.

В одном из вариантов реализации газовый субстрат может содержать газ, вырабатываемый при сталелитейном производстве.

- 5 022710

В другом варианте реализации газовый субстрат может содержать автомобильные выхлопные газы.

В отдельном варианте реализации данного способа спирт выделяют из ферментационного бульона, где ферментационный бульон является водной культуральной средой, включающей бактериальные клетки и спирт.

В отдельном варианте реализации ацетат получается как побочный продукт ферментации.

В дополнительном варианте реализации спирт и ацетат выделяют из бульона.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ селекции одного или нескольких микроорганизмов, продуцирующих одну или несколько кислот, где способ включает культивирование микроорганизмов в питательной среде в биореакторе; добавление свежей среды со значением рН выше, чем в питательной среде, так чтобы значение рН в ферментационном бульоне поддерживалось практически неизменным; и перемешивание по крайней мере части питательной среды и микроорганизмов, так чтобы объем среды в биореакторе оставался практически неизменным.

В конкретном варианте реализации способ направлен на селекцию быстрорастущих микроорганизмов. В одном из вариантов реализации одна или несколько кислот включают ацетат.

Другой аспект настоящего изобретения предоставляет биологически чистый изолят бактерии, получаемый методом селекции. В одном из вариантов реализации изолят обладает низкой способностью к спорообразованию или не обладает ею вовсе.

Несмотря на то что настоящее изобретение подробно описано выше, оно не ограничивается вышеприведенным описанием и также включает варианты реализации, примеры которых приведены в последующем описании.

Краткое описание фигур

Настоящее изобретение будет описано подробно со ссылкой на прилагаемые фигуры, где: фиг. 1 - схематическое представление системы, приспособленной для отбора по признаку быстрого роста микроорганизмов. Обозначения: 1 - биореактор, 2 - ферментационный бульон; 3 - общеупотребляемая рН проба; 4 - насос; 5 - сосуд; 6 - датчик уровня; 7 - второй насос; 8 - контейнер/устройство, фиг. 2 демонстрирует продукцию этанола (прямоугольник) и ацетата (ромб), осуществляемую ΟοΑπύίιιιη аи1ое1йаподепит ЬВ81560. Концентрация биомассы отражена треугольными отметками на графике.

Подробное описание изобретения

В широком понимании один из аспектов настоящего изобретения относится к новой бактерии и биологически чистому изоляту бактерии с повышенной эффективностью анаэробного ферментационного процесса. В одном из аспектов бактерия способна продуцировать спирт, преимущественно этанол, из субстрата, включающего:

a) более чем приблизительно 65 об.% СО,

b) менее чем приблизительно 20 об.% Н₂ или

c) более чем приблизительно 65 об.% СО и менее чем приблизительно 20 об.% Н₂.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к процессу производства спирта, преимущественно этанола, путем анаэробной ферментации СО-содержащих субстратов бактериями настоящего изобретения.

Определения

Если не будет определено другое, следующие термины, использованные в данном описании, определяются следующим образом:

СО-содержащий субстрат и подобные термины должны пониматься как какие-либо субстраты, в которых, к примеру, монооксид углерода доступен для бактериального роста и/или ферментации. В отдельном варианте реализации настоящего изобретения СО-содержащий субстрат является газообразным. Подобные субстраты могут быть упомянуты в настоящем документе как газовые СО-содержащие субстраты и сходными терминами.

В следующем описании вариант реализации настоящего изобретения описывается в терминах предоставления и ферментации газовых СО-содержащих субстратов. Однако должно быть принято во внимание, что газовые субстраты могут предоставляться в альтернативных формах. К примеру, газовый СО-содержащий субстрат может предоставляться растворенным в жидкости. По сути насыщенный раствор монооксида углерода содержит газ, тогда как раствор добавляется в биореактор. Это может быть достигнуто при использовании стандартных методик. Например, может быть использован генератор микропузырьков (Неп8Ш8ак е! а1. 8са1е-ир о! ткгоЬиЬЫе Лкрегкюп депегаЮг 1ог аегоЫс ГегтеШаОоп; Лррйеб Вюсйет181гу апб Вю1есйпо1оду, ν.101, №3, осЮЬег. 2002). В следующем примере газовый СО-содержащий субстрат может быть абсорбирован на твердую подложку. Термин СО-содержащий субстрат может включать подобные альтернативные методы.

Термины повышающий эффективность, повышенная эффективность и схожие термины в случае их использования в контексте ферментационного процесса заключаются в повышении одного или нескольких параметров: скорости роста микроорганизмов, осуществляющих ферментатив- 6 022710 ный каталитический процесс, объема ожидаемого продукта (такого как спирт), продуцируемого на определенный объем потребляемого субстрата (такого как СО), концентрации ожидаемого продукта (такого как спирт), продуцируемого в культуральной среде, скорости продукции или уровня продукции ожидаемого продукта и связанного с этим уровнем соотношения продукции ожидаемого продукта по сравнению с другими побочными продуктами процесса ферментации.

Термин ацетат включает как ацетат в чистом виде, так и смесь молекулярной или свободной уксусной кислоты и ее соли, такую как смесь ацетата и свободной уксусной кислоты, присутствующую в ферментационном бульоне, как описано в данном документе. Отношение молекулярной уксусной кислоты к ацетату в ферментационном бульоне зависит от значения рН системы.

Термин биореактор включает ферментационный аппарат, состоящий из одного или нескольких сосудов и/или колонок или трубопроводов, которые включают проточный реактор с мешалкой (С8ТК), реактор с иммобилизированными клетками (1СК), реактор с орошаемым слоем (ТВК), барботажную колонку, газлифтный ферментер, статический смеситель или другие сосуды или другие аппараты, подходящие для газожидкостного контакта.

Бактерии настоящего изобретения или культуры их штаммов могут описываться как штамм или биологически чистая форма. Данные термины подразумевают, что бактерии отделены от их окружения или от одного или нескольких клеточных компонентов или компонентов, с которыми они могут быть ассоциированны при обнаружении в естественных или иных условиях. Термины изолят или биологически чистый не следует воспринимать в том смысле, что бактерии были очищены. Тем не менее, в одном из вариантов реализации бактериальные изоляты или культуры содержат преимущественно бактерии, относящиеся к настоящему изобретению.

Настоящее изобретение предоставляет биологически чистый изолят бактерии, способной продуцировать этанол и ацетат путем анаэробной ферментации в водном ферментационном бульоне, снабженном СО-содержащим субстратом, включающим:

a) более чем приблизительно 65 об.% СО,

b) менее чем приблизительно 20 об.% Н₂ или

c) более чем приблизительно 65 об.% СО и менее чем приблизительно 20 об.% Н₂, где коэффициент отношения этанола к ацетату составляет ,по меньшей мере, приблизительно 1,0. В одном из вариантов реализации бактерия получается на основе С. аиЮсШаподспит. как описано в других частях настоящего документа.

В отдельном варианте реализации коэффициент, равный отношению этанола к ацетату, составляет, по меньшей мере, приблизительно 1,1, или ,по меньшей мере, приблизительно 1,2, или ,по меньшей мере, приблизительно 1,3, или ,по меньшей мере, приблизительно 1,4.

В дополнительном варианте реализации бактерия является способной продуцировать этанол в концентрации, по меньшей мере, приблизительно 2,1 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,2 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,3 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,4 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,5 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,6 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,7 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,8 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 3,0 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 3,2 г этанола на 1 л ферментационного бульона или ,по меньшей мере, приблизительно 3,4 г этанола на 1 л ферментационного бульона.

Под продуктивностью выработки этанола подразумевается объемная продуктивность выработки этанола, вычисляемая как соотношение концентрации этанола и времени, которое необходимо для продукции данной концентрации в комплексной системе. Продуктивность также может быть вычислена для микробиологической ферментации в непрерывной системе. В отдельном варианте реализации настоящего изобретения продуктивность бактерий составляет по меньшей мере 1,2 г этанола/л ферментационного бульона/день, или по меньшей мере 1,6 г/л/день, или по меньшей мере

1,8 г/л/день, или по меньшей мере 2,0 г/л/день.

Индивидуальная продуктивность микробиологической культуры зависит от доли живых активных микроорганизмов в культуре. В отдельном варианте реализации настоящего изобретения индивидуальная продуктивность по выработке этанола составляет по меньшей мере 0,7 г/л/г бактериальных клеток/день, или по меньшей мере 0,9 г/л/г бактериальных клеток/день, или по меньшей мере 1,1 г/л/г бактериальных клеток/день, или по меньшей мере 1,3 г/л/г бактериальных клеток/день.

Настоящее изобретение также предоставляет биологически чистый изолят бактерии, способной продуцировать этанол путем анаэробной ферментации в водной культуральной среде, снабженной газовым СО-содержащим субстратом, включающим:

a) более чем приблизительно 65 об.% СО,

b) менее чем приблизительно 20 об.% Н₂ или

- 7 022710

с) более чем приблизительно 65 об.% СО и менее чем приблизительно 20 об.% Н₂, концентрацию этанола, составляющую по меньшей мере 2,0 г этанола на 1 л ферментационного бульона. В одном из вариантов реализации бактерия получается на основе С. ЛиЮсОитодспит. как описано в других частях настоящего документа.

В дополнительных вариантах реализации бактерия способна продуцировать этанол в концентрации, составляющей, по меньшей мере, приблизительно 2,1 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,2 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,3 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,4 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,5 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,6 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,7 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 2,8 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 3,0 г этанола на 1 л ферментационного бульона, по меньшей мере, приблизительно 3,2 г этанола на 1 л ферментационного бульона или ,по меньшей мере, приблизительно 3,4 г этанола на 1 л ферментационного бульона.

В отдельном варианте реализации настоящего изобретения продуктивность бактерии составляет по меньшей мере 1,2 г этанола/л ферментационного бульона/день, или по меньшей мере 1,6 г/л/день, или по меньшей мере 1,8 г/л/день, или по меньшей мере 2,0 г/л/день.

В конкретном варианте реализации настоящего изобретения индивидуальная продуктивность по выработке этанола составляет по меньшей мере 0,7 г/л/г бактериальных клеток/день, по меньшей мере 0,9 г/л/г бактериальных клеток/день, по меньшей мере 1,1 г/л/г бактериальных клеток/день или по меньшей мере 1,3 г/л/г бактериальных клеток/день.

Как правило, ацетат продуцируется в качестве побочного продукта ферментации. В одном из вариантов реализации этанол продуцируется в соотношении этанол/ацетат, равном, по меньшей мере, приблизительно 1,0. В отдельном варианте реализации соотношение этанол/ацетат составляет, по меньшей мере, приблизительно 1,1, или ,по меньшей мере, приблизительно 1,2, или ,по меньшей мере, приблизительно 1,3, или ,по меньшей мере, приблизительно 1,4.

Настоящее изобретение также предоставляет ацетогенную бактерию, обладающую одной или несколькими представленными далее и наблюдаемыми в экспериментальных условиях, описанных ниже, характеристиками: способностью к росту на минимальной среде в присутствии дрожжевого экстракта или при его отсутствии; способностью к более быстрому росту, продукции этанола с большим коэффициентом отношения этанола к ацетату и/или продукции больших концентраций этанола на среде без добавления дрожжевого экстракта по сравнению со средой, содержащей дрожжевой экстракт; слабой способностью к спорообразованию или отсутствием данной способности; грамположительную; палочкообразную; неподвижностью.

В одном из вариантов реализации бактерии практически лишены способности к спорообразованию. В одном из вариантов реализации практически ни у одной из бактериальных популяций в нижеописанных условиях не было обнаружено спор.

В одном из вариантов реализации ацетогенные бактерии дополнительно способны продуцировать этанол путем анаэробной ферментации в водной культуральной среде, обеспеченной СОсодержащим субстратом, включающим объемную долю СО более чем приблизительно 65%; объемную долю Н₂ менее чем приблизительно 20%; объемную долю СО более чем приблизительно 65% и объемную долю Н2 менее чем приблизительно 20%; концентрацию этанола, составляющую, по меньшей мере, приблизительно 2,0 г этанола на 1 л ферментационного бульона, и/или коэффициент отношения этанола к ацетату, составляющий, по меньшей мере, приблизительно 1,0.

Бактерии настоящего изобретения могут быть получены из ОоЧпбшт анЮсШаподспит.

Было удивительно обнаружить, что при конкретных вариантах реализации настоящего изобретения бактерии обладают слабовыраженной способностью к спорообразованию или вообще не обладают такой способностью. Это обеспечило непредвиденное преимущество среди других штаммов ОоЧпШа, включающих ОоЧпбшт анЮсШаподспит. Споруляция представляет собой неподвижную фазу, ограничивающую активность. Снижение или повышение способности к спорообразованию входит в число преимуществ. Например, единичная бактериальная клетка, находясь не в спорулированном состоянии, может только делиться и продуцировать метаболиты (такие как ацетат и/или этанол). Таким образом, временная шкала может быть распространена на деление и продукцию метаболитов, в случае если бактерии не находятся в состоянии спор. Потеря способности к споруляции может также служить дополнительным контролем однородности культуры, в которой вся живая популяция может быть приспособлена к росту и/или продукции метаболитов на продолжительный период. Более того, использование бактерий настоящего изобретения может повысить общую эффективность ферментационного процесса по производству продуктов, таких как ацетат и/или этанол.

В отдельном варианте реализации настоящего изобретения бактерии обладают двумя или желательно всеми вышеупомянутыми характеристиками. В некоторых вариантах реализации настоя- 8 022710 щего изобретения бактерии обладают описанными характеристиками С1ок1пбшт аЩоебишодегшт штамма БВ31560, депонированного в Ό8ΜΖ, Германия, в соответствии с Будапештским соглашением от 19 октября 2007 года с присвоенным номером доступа Ό3Μ19630. В отдельном варианте реализации бактерия представлена С1окйтбшт аи1оеНаиодешт штамм БВ81560, Ό8Μ19630,

Настоящее изобретение также относится к бактериям, получаемым из бактерий настоящего изобретения.

В отдельном варианте реализации бактерии настоящего изобретения способны продуцировать этанол в вышеописанных концентрациях и с вышеописанным значением коэффициента отношения этанола к ацетату при высоком содержании СО в газовом субстрате. Газовый субстрат может включать объемную долю СО более чем приблизительно 70%. В отдельном варианте реализации газовый субстрат включает объемную долю СО, составляющую, по меньшей мере, приблизительно 80%, объемную долю СО, составляющую, по меньшей мере, приблизительно 85%, объемную долю СО, составляющую, по меньшей мере, приблизительно 90%, или объемную долю СО, составляющую, по меньшей мере, приблизительно 95%.

Схожим образом, описанные концентрации этанола и отношения этанола к ацетату достижимы в конкретных вариантах реализации при низком содержании Н₂ в газовом субстрате или при его отсутствии. Г азовый субстрат может включать объемную долю Н₂ менее чем приблизительно 20%. В отдельном варианте реализации газовый субстрат включает объемную долю Н₂ менее чем приблизительно 15%, или газовый субстрат включает объемную долю Н₂ менее чем приблизительно 10%, газовый субстрат включает объемную долю Н₂ менее чем приблизительно 5%, газовый субстрат включает объемную долю Н₂ менее чем приблизительно 4%, газовый субстрат включает объемную долю Н₂ менее чем приблизительно 3%, газовый субстрат включает объемную долю Н₂ менее чем приблизительно 2%, газовый субстрат включает объемную долю Н2 менее чем приблизительно 1% или газовый субстрат не содержит Н₂.

В отдельном варианте реализации бактерии настоящего изобретения могут также продуцировать концентрации этанола и соотношения этанол/ацетат в случае добавления газового субстрата, содержащего сравнительно мало СО2. В одном из вариантов реализации газовый субстрат включает объемную долю СО₂, не превышающую или равную приблизительно 20%. В отдельном варианте реализации газовый субстрат включает объемную долю СО₂, не превышающую или равную приблизительно 15%, не превышающую или равную приблизительно 10% или не превышающую или равную приблизительно 5%.

В отдельном варианте реализации газовый субстрат включает объемную долю СО, равную приблизительно 85%, и объемную долю СО2, равную приблизительно 15%, или газовый субстрат включает объемную долю СО, составляющую, по меньшей мере, приблизительно 90%, и объемную долю СО2, не превышающую приблизительно 10%, или газовый субстрат включает объемную долю СО, равную приблизительно 95%, и объемную долю СО2, равную приблизительно 5%.

В отдельном варианте реализации культура поддерживается в водной культуральной среде. Предпочтительно, чтобы водная культуральная среда представляла собой минимальную анаэробную микробиологическую ростовую среду. Пригодные среды известны в соответствующей области техники и описаны, например, в патентах США № 5173429 и 5593886 и \УО 02/08438 и в К1аккои е! а1. [(1992). Вюсоиуег8юи о£ ЗутНек1К Сак т!о Ыцшб ог Сакеоик Рие1к. Εηζ. МюгоЪ. Тес1ио1. 14:602608.], Ыа]а£роиг аиб Уоииек! [(2006). ЕНаио1 аиб асеШЮ куиНеык £гот \\лк1е дак икшд Ъа1сН сиНиге о£ С1окйтбшт ЩиидбаЫи. Εηζуте аиб МюгоЫа1 Тес1ио1оду, ν. 38, 1ккие 1-2, р. 223-228] и ЬеМк е! а1. [(2002). Мактд Не соηиесйоη-соηνе^к^оη о£ Ъютакк-деиегНеб ргобисег дак !о еНаио1. АЪк!. Вюеиегду, р. 2091-2094]. В отдельном варианте реализации настоящего изобретения минимальной микробиологической ростовой средой является, как описано в настоящем документе, ЬМ23 или ЬМ33.

В отдельном варианте реализации среда добавляется с дополнительными компонентами, такими как аминокислоты и триптиказа, в то же время список компонентов не ограничивается приведенными. Предпочтительно чтобы среда использовалась без дополнительных компонентов.

В отдельном варианте реализации среда может быть дополнена дрожжевым экстрактом. В отдельном варианте реализации культура растет быстрее на среде, не содержащей дрожжевой экстракт, по сравнению со средой его содержащей. В дополнительном варианте реализации коэффициент отношения этанола к ацетату выше в том случае, когда среда добавляется без дрожжевого экстракта по сравнению с тем случаем, когда среда добавляется с дрожжевым экстрактом. В дополнительном варианте реализации концентрация этанола, продуцируемого на 1 л культуральной среды, выше в том случае, когда среда добавляется без дрожжевого экстракта, по сравнению с тем случаем, когда среда добавляется с дрожжевым экстрактом. В отдельном варианте реализации среда добавляется без дрожжевого экстракта.

Настоящее изобретение также предоставляет способ производства одного или нескольких спиртов из газовых субстратов, содержащих СО, где способ включает поддержание культуры одного или нескольких изолятов бактерии настоящего изобретения в присутствии газовых субстратов и анаэробную ферментацию газовых субстратов до одного или нескольких спиртов одним или не- 9 022710 сколькими изолятами бактерии.

Настоящее изобретение также предоставляет способ снижения общего выброса углерода в атмосферу при производственных процессах, где способ включает:

a) фиксацию СО-содержащих газов, продуцируемых в ходе производственного процесса, до их высвобождения в атмосферу,

b) анаэробную ферментацию СО-содержащих газов с целью производства одного или нескольких спиртов культурами, содержащими один или несколько изолятов бактерии.

В отдельном варианте реализации способа настоящего изобретения ацетат продуцируется как побочный продукт ферментации. Продуцируемым спиртом является этанол.

В отдельном варианте реализации культура поддерживается в водном ферментационном бульоне.

Процесс ферментации может быть реализован в любом подходящем биореакторе, таком как проточный реактор с мешалкой (СТ8К), пузырьковый колоночный реактор (ВСК) или реактор с орошаемым слоем (ТВК). Также в некоторых предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения биореактор может включать, во-первых, реактор роста, в котором происходит культивирование микроорганизмов, и, во-вторых, ферментационный реактор, в который из реактора роста вводится ферментационный бульон и в котором продуцируется большая часть продуктов ферментации (этанол и ацетат).

Как это описано выше, источником углерода для ферментационного процесса является газовый субстрат, содержащий СО. Газовый субстрат может представлять собой СО-содержащий отработанный газ, получаемый как побочный продукт производственного процесса или из некоторого другого источника, такого как автомобильные выхлопные газы. В отдельном варианте реализации производственный процесс выбирается из группы производства продуктов, состоящей из металлургической промышленности, такой как сталеплавильная промышленность, неметаллургической промышленности, нефтеперерабатывающей промышленности, газификации угля, производства электроэнергии, производства угля, производства аммиака, производства метанола и производства кокса. В данном варианте реализации СО-содержащий газ может быть получен из производственного процесса до его выделения в атмосферу при использовании подходящего метода. В зависимости от состава СО-содержащего субстрата он может также может быть очищен от любых нежелательных примесей, таких как частицы пыли, до его ферментации. Например, газовый субстрат может быть отфильтрован или очищен при использовании известных методов.

В добавление, часто является целесообразным увеличить концентрацию СО в потоке субстрата (или парциальное давление СО в газовом субстрате) и, таким образом, увеличить эффективность ферментативной реакции, в которой СО является субстратом. Увеличение парциального давления СО в газовом субстрате увеличивает массоперенос СО в ферментативную среду. Состав газового потока, используемого в качестве исходного сырья ферментативной реакции, может оказывать значительное влияние на эффективность и/или стоимость данной реакции. Например, О₂ может снизить эффективность анаэробного ферментационного процесса. Обработка нежелательных или ненужных газов на стадии ферментационного процесса до или после процесса ферментации может увеличить нагрузку на подобные стадии (например, в том случае когда газовый поток сжимается до ввода в биореактор, для сжатия газа, который не нужен в биореакторе, может быть использована излишняя энергия). Таким образом, обработка потока субстрата может оказаться полезной, особенно в случае потока субстрата, получаемого из производственного процесса, для удаления нежелательных компонентов и увеличения концентрации требуемых компонентов.

Поток субстрата, получаемый из индустриальных источников, как правило, обладает непостоянным составом. Более того, поток субстрата, получаемый из индустриальных источников, содержащий высокие концентрации СО (такие как, по меньшей мере, приблизительно 50% СО или, по меньшей мере, приблизительно 65% СО), как правило, обладает невысоким содержанием Н₂ (таким как менее чем приблизительно 20% или менее чем приблизительно 10 или 0%). В силу этого чрезвычайно важно, чтобы микроорганизмы были способны продуцировать продукты путем анаэробной ферментации субстратов, включающих различные концентрации СО и Н₂, в особенности высокие концентрации СО и низкие концентрации Н₂. Авторы протестировали С. аЩоеШаиодеиит (полученную из ΌδΜΖ под номером доступа ΌδΜ 10061) и отметили, что она не способна к росту и выработке продуктов на газовых субстратах, содержащих СО, но лишенных Н₂. Тем не менее, бактерии настоящего изобретения обладают удивительной способностью к росту и выработке продуктов (этанола и ацетата) путем ферментации субстратов, включающих СО (и не содержащих Н2).

Присутствие Н2 в потоке субстрата может вести к увеличению общей эффективности фиксации углерода и/или продуктивности выработки этанола. Например, в ^002/08438 описан процесс производства этанола при использовании газовых потоков различного состава. В \УО02/08438 описано добавление к культуре С. ЩиидйаЫп в биореактор потока субстрата, содержащего 63% Н₂, 32% СО и 5% СН₄ для реализации роста микроорганизмов и выработки этанола. Когда культура достигала уравновешенного состояния и рост микробов уже не был главной целью, поток субстрата заме- 10 022710 нялся на 15,8% Н₂, 36,5% СО, 38,4% Ν₂ и 9,3% СО₂, для того чтобы предоставить СО в небольшом избытке и увеличить продукцию этанола. В данном документе также описаны газовые потоки, содержащие более высокие и более низкие концентрации СО и Н₂.

Необходимо принять во внимание, что процесс, предложенный в настоящем изобретении и описанный в настоящем документе, может быть использован для снижения общего количества выделяемого в атмосферу в ходе производственного процесса углерода путем фиксации СОсодержащих газов, производимых в результате подобных процессов, и их использования в качестве субстрата для ферментационного процесса, описанного в настоящем документе.

В качестве альтернативы в других вариантах реализации настоящего изобретения СОсодержащие газовые субстраты могут служить источником для газификации биомасс. Процесс газификации включает неполное сгорание биомассы в узкой струе воздуха или кислорода. Получаемый газ обычно включает, главным образом, СО и Н₂ с минимальным количеством СО₂, метана, этилена и этана. Например, биомасса, получаемая как побочный продукт во время экстракции и обработки пищевых продуктов, при таких процессах как, например, получение сахара из сахарного тростника или крахмала из кукурузы или зерна, или непищевых биоотходов, образующихся в лесной промышленности, может быть газифицирована с целью получения СО-содержащего газа, пригодного для использования в настоящем изобретении.

Как правило, предпочтительно, чтобы СО-содержащие газовые субстраты содержали большое количество СО. В преимущественном варианте реализации газовые субстраты включают объемную долю СО, составляющую, по меньшей мере, приблизительно 65% или, по меньшей мере, от приблизительно 70% до приблизительно 95%. Наличие в газовой смеси водорода не является необходимым. Газовые субстраты также дополнительно содержат некоторое количество СО₂, как например, от приблизительно 1 об.% до приблизительно 30 об.% или, например, от приблизительно 5 об.% до приблизительно 10 об.%.

Следует принять во внимание, что для роста бактерий и осуществления процесса ферментации СО до этанола при добавлении СО-содержащего газового субстрата необходимо добавить в биореактор подходящую водную питательную среду. Питательная среда должна содержать достаточное для обеспечения роста используемых микроорганизмов количество витаминов и минералов. Анаэробная среда, подходящая для осуществления процесса ферментации СО как единственного источника углерода до этанола, известна в соответствующей области техники. Например, подходящая среда описана в патентах И8 № 5173429, 5593886 и \УО 02/08438, а также в других ранее рассмотренных в настоящем документе работах. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения среда представлена средой ЬМ23, как описано в примерах ниже.

Процесс ферментации следует проводить при условиях, подходящих для ферментации СО до этанола. Условия реакции, которые должны быть рассмотрены, включают давление, температуру, скорость газового потока, скорость потока жидкой среды, рН среды, окислительновосстановительный потенциал среды, скорость перемешивания (в случае использования проточного реактора с мешалкой), уровень инокулята, максимальную концентрацию газового субстрата, поддерживающую неограниченное количество СО в жидкой фазе, максимальную концентрацию продукта, не приводящую к ингибированию процесса выработки продукта.

Оптимальные условия реакции зависят от конкретного используемого микроорганизма настоящего изобретения. Тем не менее, в целом предпочтительно осуществлять ферментацию при давлении, превышающем атмосферное давление. Работа при повышенных давлениях позволяет в значительной мере повысить долю СО, переведенного из газовой фазы в жидкую, где он может быть использован микроорганизмами в качестве источника углерода для продукции этанола. Это, в свою очередь, обозначает, что время удержания (определяемое как объем жидкости в биореакторе, деленное на скорость подачи газа) может быть снижено в том случае, когда биореактор находится под высоким, а не под атмосферным давлением.

Кроме того, поскольку скорость преобразования СО до этанола отчасти зависит от времени удержания субстрата, для достижения желаемого времени удержания необходимо обеспечение определяемого этим временем объема биореактора, в то же время использование систем с повышенным давлением может значительно снизить требуемый объем биореактора и, следовательно, капитальные затраты, необходимые для обеспечения ферментативной системы. Согласно примерам, приведенным в патенте И8 № 5593886, величина возможного снижения объема реактора находится в линейной зависимости от величины, на которую увеличивается рабочее давление реактора, то есть при работе биореактора при 10 атм только десятая часть объема, затрачиваемого при работе при 1 атм.

Преимущества проведения ферментации газа до этанола при повышенных давлениях также было описано в других источниках. Например, в \УО 02/084 38 описан процесс ферментации газа до этанола, выполняемый при давлении 30 фунтов на кв. дюйм и 75 фунтов на кв. дюйм, обеспечивающий продуктивность выработки этанола, равную 150 г/л/день и 369 г/л/день соответственно. Тем не менее, было показано, что при проведении ферментации с использованием схожей среды и

- 11 022710 схожего газового состава при атмосферном давлении продукция этанола на 1 л ферментационного бульона в день снижается в 10-20 раз.

Кроме того, необходимо обеспечить такую скорость введения СО-содержащего газового субстрата, которая позволяла бы сохранять концентрацию СО в жидкой фазе неограниченной. Необходимость этого объясняется тем, что в СО-ограниченных условиях возможно потребление продуцируемого этанола культурой.

В отдельном варианте реализации ферментативный процесс согласно вышеописанному настоящему изобретению приводит к образованию ферментационного бульона, включающего этанол, а также бактериальные клетки в составе водной культуральной среды. В отдельном варианте реализации настоящего способа этанол выделяется из ферментационного бульона.

В отдельном варианте реализации выделение этанола включает непрерывное перемешивание порции бульона и выделение спирта из перемешиваемой части бульона.

В отдельном варианте реализации выделение этанола включает пропускание перемешиваемой части бульона через сепаратор с целью отделения бактериальных клеток от бульона и получения бесклеточного спиртосодержащего фильтрата, а также возвращения бактериальных клеток в биореактор.

В отдельном варианте реализации способ, предлагаемый настоящим изобретением, представляет собой непрерывный процесс.

В отдельном варианте реализации ацетат продуцируется как побочный продукт процесса ферментации.

В дополнительном варианте реализации этанол и ацетат выделяются из бульона.

В отдельном варианте реализации процесс выделения этанола и ацетата включает непрерывное перемешивание части бульона и выделение из перемешиваемой части бульона ацетата и этанола по отдельности.

В некоторых вариантах реализации процесс выделения этанола и ацетата включает пропускание перемешиваемой порции бульона, содержащей этанол и ацетат, через сепаратор с целью отделения бактериальных клеток от этанола и ацетата, получения бесклеточного этанол- и ацетатсодержащего фильтрата, а также возвращения бактериальных клеток в биореактор.

В вышеописанном варианте реализации процесс выделения этанола и ацетата предпочтительно включает, прежде всего, следующее за удалением ацетата из бесклеточного фильтрата удаление этанола из бесклеточного фильтрата. Бесклеточный фильтрат предпочтительно затем возвращается в биореактор.

Этанол является наиболее желаемым конечным продуктом процесса ферментации. Этанол может быть выделен из ферментационного бульона с помощью методов, известных в соответствующей области техники, таких как фракционная перегонка или выпаривание, и экстрактивной ферментации. Конечным продуктом очистки этанола от ферментационного бульона является азоотропическая смесь этанола и воды (а именно 95% этанола и 5% воды). Безводный этанол затем может быть получен при использовании технологии осушки этанола молекулярными фильтрами, которая также широко известна в соответствующей области техники. Процесс экстрактивной ферментации включает использование водорастворимого сольвента, являющегося низкотоксичным для организмов, осуществляющих процесс ферментации, для выделения этанола из разбавленного ферментационного бульона. Например, олеиловый спирт является растворителем, который может быть использован в этих типах экстракционных процессов. Олеиловый спирт, непрерывно добавляемый в ферментер, в котором данный растворитель способствует формированию слоя в верхней части ферментера, который непрерывно экстрагируется и загружается в центрифугу. Вода и клетки затем легко отделяются от олеилового спирта и возвращаются в ферментер, в то время как этанолсодержащий растворитель загружается в ячейку мгновенного испарения. Большая часть этанола испаряется и конденсируется, в то время как олеиловый спирт не испаряется и возвращается в ферментер для повторного использования.

Ацетат также может быть выделен из ферментационного бульона с помощью методов, известных в соответствующей области техники. Методы выделения ацетата подробно описаны в №02007/117157 и №02008/115080.

В конкретном варианте реализации настоящего изобретения этанол и ацетат выделяются из ферментационного бульона путем непрерывного перемешивания части бульона из ферментационного биореактора, отделения бактериальных клеток от бульона (условно путем фильтрации) и извлечения сначала этанола, а затем ацетата из бульона. Этанол, условно, может быть выделен путем перегонки, а ацетат может быть выделен путем адсорбции на активированном угле при использовании вышеописанных методов. Отделенные бактериальные клетки предпочтительно возвращаются в ферментативный биореактор. Бесклеточный фильтрат, оставшийся после выделения этанола и ацетата, также предпочтительно возвращается в ферментативный биореактор. Для пополнения фермен- 12 022710 тационного бульона дополнительные питательные вещества (такие как витамин В) могут быть добавлены в бесклеточный фильтрат до его возврата в биореактор. Также в случае вышеописанного изменения рН бульона для улучшения адсорбции уксусной кислоты активированным углем необходимо довести рН используемого бульона до величины рН бульона в ферментативном биореакторе до его возвращения в биореактор.

Стехиометрия реакции

Предполагаемый ход химической реакции ферментации СО до этанола (а) и уксусной кислоты (Ь) в процессе, предлагаемом настоящим изобретением, является следующим:

(a) 18СО + 9Н₂О -> ЗСН₃СН₂ОН + 12СО₂ (b) 12СО +6Н₂О -> ЗСНзСООН + 6СО₂

Далее, настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылками на следующие неограничивающие примеры.

Примеры

Среда.

Состав компонентов среды, используемой в следующих примерах, предоставлен в табл. 1 и 2.

Таблица 1. Состав среды для С. аи(ое(Ьапо§епит

Компонент среды	Концентрация на 1,0 литр среды (Ι.Μ17)	Концентрация на 1,0 литр среды (Ι.Μ23)	Концентрация на 1,0 литр среды (1.МЗЗ)
МдС1₂-6Н₂О	0,5 г	0,5 г	0,5 г
ЫаС1	0,2 г	0,2 г	0,2 г
СаС1₂	0,2 г	0,2 г	0,2 г
(ΝΗ₄)₂ΗΡΟ₄	2,0 г
ЮОмМ натриево-фосфатный буфер (рН 6,0)’		160 мл
ЫаН₂РО₄			2,04 г
ΝΗ₄ΟΙ		0,6 г	2,5 Г
85% Н₃РО₄	0,05 мл	0,05 мл
КС1	0,15 г	0,15 г	0,15 г
Раствор микроэлементов (1.506)	10 мл	10 мл	10 мл
Раствор витамина В (1.803)	10 мл	10 мл	10 мл
Резазурин (1000 мг/л исходного раствора)	1 мл	1 мл	2 мл
РеС1₃	0,0025 г	0,0025 г	0,01 г
Цистеин НС1 моногидрат	0,75 г	0,75 г	0,5 г
Агароза(необязательно)		15 г	15 г
Дистиллированная вода	До объема в 1 литр	До объема в 1 литр	До объема в 1 литр

*Смесь ЫаН₂РО₄ (13,2 г) и Ыа₂НРО₄-7Н₂О (1,1 г) в Н₂О (1 л).

Таблица 2. С. аи(ое(Ьаподепит состав растворов микроэлементов и витаминов

Состав раствора витамина В (1-503)	На 1 литр исходного раствора	Состав раствора микроэлементов (1.506)	На 1 литр исходного раствора
Биотин	20,0 мг	Нитрилтрехуксусная кислота	1,5 г
Фолиевая кислота	20,0 мг	Мд5О₄-7Н₂О	3,0 г
Пиридоксина гидрохлорид	10,0 мг	Μη5Ο₄·7Η₂Ο	0,5 г
Тиамин-НС1	50,0 мг	ЫаС1	1,0 г
Рибофлавин	50,0 мг	Ре5О₄-7Н₂О	0,1 г
Никотиновая кислота	50,0 мг	(Ρο5Ο₄)₂(ΝΗ₄)₂·6Η₂Ο	0,8 г
Кальций О-(*)-пантотенат	50,0 мг	СоС1₂-6Н₂О	0,2 г
Витамин В12	50,0 мг	ΖηδΟ₄·7Η₂Ο	0,2 г
пара-Аминобензойная кислота	50,0 мг	СиС1₂-2Н₂О	0,02 г
Липоевая кислота	50,0 мг	ΑΙΚ(5Ο₄)₂·12Η₂Ο	0,02 г
Дистиллированная вода	До объема в 1 литр	Н₃ВОз	0,30 г
ЫаМо0₄-2Н₂0	0,03 г
Ыа₂5еОз	0,02 г
МС1₂-6Н₂О	0,02 г
Νθ₂νΐ/Ο₄·6Η₂Ο	0,02 г
Дистиллированная вода	До объема в 1 литр

Среды ЬМ17, ЬМ23 и ЬМ33 были приготовлены, как и следует, при рН 5,5. Все ингредиенты, за исключением цистеина НСЬ, были смешаны в дистиллированной воде до конечного объема в 1 л. Данный раствор был лишен кислорода путем нагревания до кипения и охлаждения до комнатной температуры под непрерывной струей газа 95% СО, 5% СО₂. После охлаждения в раствор был добавлен цистеин НСЬ и рН раствора был доведен до 5,5; анаэробные условия поддерживались в течение всех экспериментов.

Анализ этанола и ацетата.

Анализ этанола и ацетата в следующих примерах был проведен при использовании газового хроматографа НР5890 серия II с применением пламенно-ионизационного детектора (РГО), съемного

- 13 022710 дезактивированного стекла, линейного устройства ввода пробы, связанных с ним регуляторов, газовых трубопроводов и резиновой прокладки инжектора с образцом автоинжектора НР7673А.

Разделение было проведено на капиллярной СС колонке ЕС1000-АШесй ЕС1000 30 мх0,25 ммх0,25 мкм.

Газовый хроматограф использован в режиме порционной подачи газа с общим потоком водорода, равным 50 мл/мин, с 5 мл очищенного потока (1:10), с давлением на выходе в колонку, равным 20 избыточным давлениям, приводящим к линейной скорости в 45 см/с. Температурная программа инициировалась с 60°С и удерживалась при таком значении 1 мин, после чего каждую минуту повышалась до 170°С с последующим понижением до 30°С. Общая протяженность сеанса составляла 4,65 мин. Температура инжектора составляла 180°С, детектора - 225°С.

Были использованы следующие реагенты: химически чистый пропан-1-ол - 8сйаг1аи АБ0437. Μίη а88ау СС 99,5%; чистый этанол - 8сйаг1аи ЕТ0015, Μίη а88ау СС99,9; 100%-я ледяная уксусная кислота - ΒΌΗ100015Ν, Μίη а88ау СС 99,8%; ортофосфорная кислота - ΒΌΗ294214φ, Μίη а88ау СС 99,0%; азот -ВОС Охуден Ргее - СС; водород - ВОС Охуден Ргее - СС как газ-носитель и ЕГО как горючее; 2его ап-ЕГО окислитель; деионизированная вода.

Плотность клеток.

Для определения плотности клеток в данных экспериментах был измерен коэффициент поглощения при 600 нм (спектрофотометрически) и сухая масса была рассчитана согласно опубликованным процедурам. Уровень метаболитов был охарактеризован при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии (НРЬ8) и в некоторых случаях газовой хроматографии (СС).

НРЬ8.

НРЬ8 система ЛдПеШ серии 1100. Подвижная фаза: 0,0025Ν серная кислота. Поток и давление: 0,800 мл/мин. Колонка: АШесй 1ОА; каталог # 9648, 150x6,5 мм, размер частиц 5 мкм. Температура колонки 60°С. Детектор: показатель преломления. Температура детектора 45°С.

Способ пробоподготовки для НРЬ8 был следующий: 400 мкл препарата и 50 мкл 0,15М 2п8О₄и 50 мкл 0,15 Ва(ОН)₂ помещали в пробирки Эппендорфа. Пробирки центрифугировали в течение 10 мин при 12000 об/мин, 4°С. 200 мкл супернатанта переносили во флакон для НРЬ8 и 5 мкл вводили в НРЬС аппарат.

Пример 1. Выделение нового изолята бактерии настоящего изобретения.

Новый штамм С1о8йтбшт аиΐоеΐЬаηодеηит ЬВ81560 был получен через специальную программу по селекции и культивированию микробиологических культур на основе родительской культуры С. аиΐоеΐЬаηодеηит (Ό8ΜΖ10061) за период в 18 месяцев.

Способы

Замороженный образец С. аиΐоеΐЬаηодеηит 10061 (полученный из Ό8ΜΖ) был вначале разморожен, а затем рассеян на среде ΕΜ23, приготовленной с 5 г/л дрожжевого экстракта в присутствии 95% СО и 5% СО₂. Данная культура не предназначена для роста на среде ΕΜ23, лишенной дрожжевого экстракта. С целью преодолеть зависимость культуры от дрожжевого экстракта за период в один месяц активно растущие микробиологические культуры, демонстрирующие способность к продукции наибольшего количества этанола и наибольшего соотношения этанол/ацетат, были неоднократно пересеяны на среду, содержащую все более и более пониженную концентрацию дрожжевого экстракта; всегда в присутствии 95% СО, 5% СО2 газа. После данных процедур были обнаружены культуры, способные к росту и продукции этанола и ацетата при отсутствии дрожжевого экстракта. Данный протокол по селекции направлен на дальнейшее определение и отбор культур, которые:

ί) обладают наибольшей скоростью роста;

ίί) продуцируют наибольшее количество этанола;

ίίί) продуцируют этанол с наибольшим показателем отношения количества этанола к количеству ацетата;

ίν) растут в водной среде при отсутствии дрожжевого экстракта.

Пример 1.1. Отбор по признаку наиболее быстрого роста.

С целью отбора наиболее быстрорастущих культур была использована способность микроорганизмов продуцировать уксусную кислоту как побочный продукт катаболизма во время периода роста при непрерывном газовом потоке 95% СО, 5% СО₂. Накопление уксусной кислоты в ростовой среде приводит к снижению рН. Так с целью подбора и предоставления давления, благоприятного для наиболее быстрого роста, были подобраны параметры разжижения культуры ферментером. Пример параметров представлен на фиг. 1, где культура микроорганизмов ферментируется в биореакторе 1. рН ферментационного бульона контролировался общеупотребляемой рН пробой 3. Отклонения рН от точки 5,5 вызывались приведением в действие насоса 4, сигнал от пробы зависел от насоса, дозированно выпускающего раствор основания или кислоты; в данном случае насос был соединен с сосудом 5, содержащим свежую анаэробную среду ΕΜ17 при рН 5,8. Таким образом, с ростом культуры и продукцией уксусной кислоты рН среды 2 начинал снижаться, вызывая приве- 14 022710 дение в действие насоса 4, вводящего среду с рН 5,8. Насос 4 дезактивировался сразу как рН среды становился равен 5,5 или выше. Уровень жидкости в реакторе 1 поддерживался при использовании датчика уровня 6, связанного со следующим насосом 7, поддерживающим уровень жидкости в биореакторе 1 на уровне, не превышающем заданный. Среда перекачивалась из биореактора 1 в контейнер/устройство 8. Таким образом, популяция растущей культуры разводилась таким образом, чтобы обеспечить оптимальный рост наиболее быстрорастущих микроорганизмов, наибольшую продукцию ацетата. Для этого все большее количество свежей среды добавлялось в ферментер для поддержания рН, оптимального для селекции наиболее быстрорастущих популяций, и количество жидкости поддерживалось на постоянном уровне. Ферментер был настроен в режиме непрерывного культивирования в течение нескольких месяцев с целью получения наиболее быстрорастущих культур. Каждые 14 дней аликвота культуры удалялась и выращивалась в 250 мл сывороточной емкости, содержащей 50 мл среды при давлении газа 95% СО, 5% СО₂, равного 35 фунтов на кв. дюйм, расположенного над средой. Были созданы препараты наиболее быстрорастущих культур, которые затем сохранялись в глицерине с целью сравнительного анализа их свойств со свойствами оригинального родительского штамма.

Результат.

Описанный выше процесс селекции и пересева в течение 18 месяцев привел к созданию нового штамма ГВ81560, демонстрирующего оптимальную реализацию каждой из вышеописанных характеристик ί)-ίν). Было обнаружено, что новый бактериальный штамм является грампозитивным (грампозитивная окраска), неподвижным, палочкообразным и обладает на удивление слабовыраженной способностью к спорообразованию или вообще не обладает данной способностью (как это далее описано в настоящем документе).

ЬВ8 был депонирован в Ό8ΜΖ, Германия, в соответствии с Будапештским соглашением от 19 октября 2007 года с присвоенным номером доступа Ό8Μ19630.

Пример 2. Культивирование и хранение БВ81560.

С. аиЮсШаподспиш ГВ81560 может быть культивирован при использовании следующих условий: рост на газе 95% СО (5% СО₂) при 35 фунтах на кв. дюйм в среде ЬМ23, при 37°С, рН 5,5, при перемешивании (частота перемешивания 200 об/мин) при анаэробных условиях. Рост может быть проконтролирован путем измерения светопоглощения при 600 нм и микроскопического анализа.

Для хранения культура ГВ81560, находящаяся в лог-фазе, в ЬМ 23+20% глицерина замораживается и хранится при -80°С.

Пример 3. Сравнение новой С. аи1ое1Наподепит БВ81560 с оригинальным родительским штаммом С. аи1ое1Напоцепит Ώ8ΜΖ10061.

Данный эксперимент демонстрирует улучшенную способность нового штамма ГВ81560 к анаэробной ферментации СО-содержащих газовых субстратов до этанола в сравнении с родительским штаммом С. аиЮсШаподспиш Ό8ΜΖ10061. Эксперимент также демонстрирует эффективность процесса ферментации СО-содержащего газа до этанола в присутствии высокого уровня СО и в отсутствие Н₂ новым штаммом ГВ81560.

Способы.

Были взяты замороженные образцы выбранной микробиологической культуры ГВ81560 и оригинальной родительской культуры Ό8ΜΖ10061, разморожены и использованы для засева герметичных 15 мл пробирок Хангейта, содержащих 5 мл минимальной водной анаэробной ростовой среды (ΓΜ23) как в присутствии, так и в отсутствие 0,1 вес/об.% дрожжевого экстракта (ΥΕ). Все пробирки Хангейта поддерживались в атмосфере газа 95% СО, 5% СО2. Для каждой из пробирок Хангейта в течение 7 дней контролировались скорость роста микроорганизмов, продукция этанола и ацетата.

Результаты.

Результаты представлены в табл. 3 ниже.

Таблица 3. Сравнение процесса ферментации штаммом ГВ81560 и родительским штаммом Ό8ΜΖ10061

Культура	Среда	Рост (г сухой массы)	Этанол (г/л)	Ацетат (г/л)	Соотношение этанол/ацетат
Ο5ΜΖ10061	1_М23 + ΥΕ	0,443	0,08	3,45	0,023
Ι.Β51560	ЬМ23 + ΥΕ	0,0963	0,19	2,07	0,09
ϋδΜΖ 10061	ΙΛΊ23	Роста нет	Нет данных	Нет данных	Нет данных
ЬВ31560	ЬМ23	0,563	2,74	1,95	1,41

ΥΕ-дрожжевой экстракт.

Данные, представленные в табл. 3, освещают некоторые воспроизводимые отличия между штаммом ГВ81560 и родительским штаммом Ό8ΜΖ10061, Ό8ΜΖ10061 не способен к росту на минимальной среде, лишенной дрожжевого экстракта, в то время как ГВ81560 способен к росту на

- 15 022710 среде как в присутствии, так и в отсутствие дрожжевого экстракта, однако оптимальный рост происходит на среде, лишенной дрожжевого экстракта. ЬВ31560, культивируемый на минимальной среде, превосходит Ό3ΜΖ10061, культивируемый на среде, содержащей дрожжевой экстракт, по таким параметрам, как скорость роста, продукция этанола и соотношение этанол/ацетат.

Пример 4. Способность БВ81560 к спорообразованию.

Для определения характера споруляции БВ31560 содержался в различных условиях, которые, как известно, приводят к образованию бактериями спор, в соответствии с описанной ниже методологией.

Недостаток питательных веществ: культура БВ31560 пребывала во взвешенном состоянии в дистиллированной воде.

Воздействие кислорода: стерильный воздух был введен в пространство над средой в пробирку Хангейта, содержащую 5 мл ростовой среды, затем пробирка была поставлена на мешалку и инкубировалась при 37°С.

Воздействие среды с низким рН (рН3): бактерии выращивались на ЬМ23 (рН5,5) до состояния высокой концентрации клеток, после чего среда заменялась на свежую ростовую среду рН3.

Воздействие кислорода и фруктозы как единственного источника углерода и энергии: водная среда, содержащая 5 г/л фруктозы и никаких восстанавливающих агентов (таких как цистеин-НС1) была насыщена кислородом, и высокие концентрации клеток были оставлены во взвешенном состоянии в данной среде на 2 дня.

Способность БВ31560 к спорообразованию была исследована путем проведения микроскопического исследования. Бактериальные образцы были покрашены кумасси голубым, который делает споры более заметными. БВ31560 был обнаружен во многих пробах. Споры не были обнаружены практически ни в одной из бактериальных популяций. Было отмечено, что в то время как споры все же были отмечены в ряде образцов, их количество оказалось значительно меньшим чем 0,1% от общей численности бактериальной популяции. Это явилось удивительным и неожиданным фактом, учитывая что как родительский штамм ОоЧпШа. так и близкие штаммы, как известно, являются спорообразующими. Отсутствие способности к спорообразованию предоставляет, как это описано в настоящем документе выше, ряд преимуществ.

Пример 5. Продукция этанола штаммом БВ81560.

Данный пример описывает непрерывную продукцию этанола штаммом БВ31560 в течение длительного периода. Фиг. 2 предоставляет обобщение данных, касающихся концентрации ацетата, этанола и биомассы за период продолжительностью в 2 недели.

Метод проведения.

1. 1 л анаэробной ферментативной среды ЬМ33 в 1 л СЗТК был рассеян с активно растущей культурой (Ό8ΜΖ19630) ОоЧпбшт аШосФаподспит (БВ31560) на уровне 5% (об./об.). В нижнюю часть камеры биореактора через распылитель с объемной скоростью потока, равной 19 мл/мин, вносился непрерывный поток газа, состоящего из 70% СО и 15% СО₂, 1% Н₂, 14% Ν₂. Изначальное значение рН ферментера было 5,5 и скорость перемешивания была установлена в 400 об/мин.

2. Для большинства из экспериментов концентрация уксусной кислоты в культуре поддерживалась ниже уровня в 4 г/л путем циклического использования клеток и системы обновления среды. Клетки были пропущены через мембранный фильтр с перекрестным течением УУа 200, фильтрат отбирался и клетки возвращались в контейнер биореактора. Фильтрат заменялся на свежую среду для обеспечения постоянного объема среды в биореакторе.

3. Культура непрерывно эксплуатировалась в течение 14 дней. Система циклического использования клеток удаляла 1-1,5 л водной питательной среды каждые 1-2 дня, не удаляя при этом бактерии из биореактора. Для поддерживания постоянного объема удаленная среда заменялась на свежую среду.

4. В течение первых четырех дней эксперимента рН ферментера увеличилось с 5,6 до 6,0.

Результаты.

Фаза быстрого роста ацетогенных бактерий (таких как С. аШосШаподспит), как правило, связана с продукцией большого количества ацетата в регулируемой среде ферментера. В данном эксперименте, в котором использовался новый штамм ЬВ81560, в течение фазы роста (дни 0-3) культура продуцировала по 0,3 г/л/день ацетата и 0,16 г/л/день этанола. В последующий период фазы роста (день 3-13) культура продуцировала в среднем по 1,03 г/л/день ацетата и в среднем по 1,4 г/л/день этанола. Общая продукция этанола за данный период составила 14 г/л. Результаты демонстрируют более низкий, чем ожидалось, уровень продукции ацетата и более высокий уровень продукции этанола.

Конкретные способы и составы, описанные в настоящем документе, являются типовыми образцами предпочтительных вариантов реализации, не ограничивая при этом возможные варианты применения настоящего изобретения. Другие цели, аспекты и варианты реализации будут ясны для специалистов в соответствующей области техники после рассмотрения данного описания и ограничены объемом и духом настоящего изобретения. Для специалистов в соответствующей области тех- 16 022710 ники должно быть очевидным, что настоящее изобретение позволяет вносить в него различные модификации и корректировки, ограниченные лишь теоретической областью применимости настоящего изобретения. Описанное в настоящем документе на примерах изобретение может быть применено на практике и при отсутствии какого-либо вещества или веществ, или наличие какого-либо ограничения или ограничений, не являющихся обязательными в настоящем описании. Так, в частности, в каждом примере, приведенном в настоящем документе в вариантах реализации или примерах, термины включает, содержит, вмещает и так далее приведены не для ограничения возможных вариантов. Более того, заголовки, подзаголовки и так далее приведены для лучшего понимания читающим настоящего документа и не должны восприниматься как ограничивающие по отношению к настоящему изобретению. В настоящем документе имеются ссылки на полное содержание приведенных приложений, патентов и публикаций.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Штамм ЕБ81560 бактерии С1оз1пШит аи1ое1Напо§епит, депонированный в ΏδΜΖ под номером ΏδΜ19630, способный продуцировать этанол и ацетат путем анаэробной ферментации субстрата, содержащего СО.
2. Штамм по п.1, где отношение этанола к ацетату составляет по меньшей мере 1,0.
3. Штамм по п.2, где отношение этанола к ацетату составляет по меньшей мере 1,2.
4. Штамм по п.1, обладающий продуктивностью этанола по меньшей мере 1,2 г этанола на 1 л ферментационного бульона в день.
5. Штамм по п.4, обладающий продуктивностью этанола по меньшей мере 2,0 г этанола на 1 л ферментационного бульона в день.
6. Штамм по п.1, где субстрат содержит более чем 65 об.% СО.