TWI797569B - 用於生產脂質的醱酵方法 - Google Patents
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Abstract
本揭示案提供了用於使用兩階段醱酵方法由氣態受質生產脂質產物的方法及系統。該方法包括向容納培養物或一種或多種微生物的第一生物反應器提供包括CO、CO2
或H2
或其混合物的氣態受質，以及使該受質醱酵以產生乙酸鹽。接著向第二生物反應器提供來自該第一生物反應器的該乙酸鹽，其中該乙酸鹽用作受質以便藉由一種或多種微藻醱酵為脂質。將來自該第二生物反應器的尾氣再循環至該第一生物反應器。
Description
本揭示案係關於一種包括用於由氣態原料生產一種或多種脂質產物的兩階段系統的方法。
全球能源危機已使得人們愈來愈多地關注生產燃料的替代方法。運輸用生物燃料係有吸引力的汽油替代品，並且由於低濃度混合而迅速滲透到燃料市場。生物質源生物燃料生產已成為增加替代性能源生產及減少溫室氣體排放的主要方法。由生物質生產生物燃料實現能源獨立已經表明促進農村地區的發展並促進可持續的經濟發展。
第一代液體生物燃料利用碳水化合物原料，如澱粉、蔗糖、玉米、菜籽、大豆、棕櫚及植物油。第一代原料提出了許多重大挑戰。此等碳水化合物原料的成本受到其作為人類食品或動物飼料之價值的影響，而用於產生乙醇的產生澱粉或蔗糖作物的栽培並非在所有地區均經濟上可持續。持續使用此等原料作為生物燃料的來源將不可避免地給耕地及水資源造成巨大壓力。因此，所關注的係開發用於將低成本及/或更豐富碳資源轉化為燃料的技術。
第二代生物燃料係由纖維素及藻類產生的生物燃料。由於藻類的快速生長速率以及藻類消耗二氧化碳並產生氧氣的能力，因此選擇藻類來產生脂質。
活動性增加的一個領域係脂質的微生物合成，包括生物燃料生產所需的原材料。大量研究已證明在不同的受質（如工業甘油、乙酸、污水污泥、乳清滲透物、甘蔗糖蜜及稻草水解物）上使用產油酵母能夠積累脂質。同樣，此等第二代生物燃料技術由於高生產成本以及與原料運輸及儲存相關的成本而遇到了問題。
已認識到催化製程可以用於將由CO、CO2
或氫氣（H2
）組成的氣體轉化為各種燃料及化學品。可替代地，可以使用微生物將此等氣體轉化為燃料及化學品。儘管通常比熱化學過程慢，但是生物學過程比催化過程具有若干優點，包含更高的特異性、更高的產率、更低的能源成本及更大的抗中毒性。
已證明藉由一氧化碳及/或氫氣及二氧化碳的厭氧醱酵來產生乙酸、乙酸鹽及其他產物，如乙醇。參見例如Balch等人, (1977) 《國際系統與進化微生物學雜誌（International Journal of Systemic Bacteriology）》, 27:355-361；Vega等人, (1989) 《生物技術與生物工程（Biotech. Bioeng.）》, 34:785-793；Klasson等人 (1990)《生物技術與應用生物化學（Appl.Biochem.Biotech.）》, 24/25: 1等。
已證明產乙酸細菌，如來自醋桿菌屬（Acetobacterium
）、穆爾氏菌屬（Moorella
）、梭菌屬（Clostridium
）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus
）、醋桿菌屬、優桿菌屬（Eubacterium
）、丁酸桿菌屬（Butyribacterium
）、產醋桿菌屬（Oxobacter
）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina
）、甲烷八疊球菌屬及脫硫桿菌屬（Desulfobacterium
）利用包括H2
、CO2
及/或CO的受質並且藉由伍德-隆達爾（Wood-Ljungdahl）途徑將此等氣態受質轉化為乙酸、乙醇及其他醱酵產物，其中乙醯輔酶A合成酶係關鍵酶。例如，楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii
）之由氣體產生乙酸鹽及乙醇的各種菌株描述於WO 00/68407、EP 117309、US專利第5,173,429號、第5,593,886號及第6,368,819號、WO 98/00558及WO 02/08438中。亦已知細菌自產乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum sp
）由氣體產生乙酸鹽及乙醇（Abrini等人, 《微生物學檔案（Archives of Microbiology）》 161, 第345-351頁 (1994)）。
伍氏醋酸桿菌（Acetobacterium woodii
），一種在約30℃的溫度下生長良好的嚴格厭氧的無芽孢形成微生物已表明由H2
及CO2
產生乙酸鹽。Balch等人首先揭示了藉由氫氣厭氧氧化及二氧化碳還原而生長的伍氏醋酸桿菌。Buschorn等人表明藉由在葡萄糖上的伍氏醋酸桿菌產生並利用乙醇。在高達20 mM的葡萄糖/果糖濃度下執行伍氏醋酸桿菌的醱酵。Buschorn等人發現，當葡萄糖濃度增加至40 mM時，在伍氏醋酸桿菌進入靜止生長期時，幾乎一半的受質保留，並且乙醇作為另外的醱酵產物出現。Balch等人發現，根據以下化學計量，藉由伍氏醋酸桿菌使H2
及CO2
醱酵而偵測到的唯一主要產物係乙酸鹽：4H2
+ 2CO2
-＞ CH3
COOH + H2
O。
本揭示案提供一種醱酵方法及系統，其藉由合併第二生物反應器（其中乙酸鹽係用於產生脂質的受質）來利用乙酸鹽的產生。本揭示案藉由將未消耗的CO2
自第二生物反應器再循環回至第一生物反應器，同時自循環中移除O2
來進一步提供增強的效率。
本揭示案的一個實施例係關於一種用於由CO2
及H2
產生至少一種脂質產物的方法，該方法包括：將至少CO2
及H2
接收於第一生物反應器中，該第一生物反應器容納至少一種第一微生物於第一液體營養素培養基中的培養物，以及使該氣態受質醱酵以在第一醱酵液中產生乙酸鹽產物；將該第一醱酵液的至少一部分送入第二生物反應器，該第二生物反應器容納至少一種第二微生物於第二液體營養素培養基中的培養物，其中該第二微生物與該第一微生物不同並且選自柵藻屬（Scenedesmus
）、破囊壺菌屬（Thraustochytrium
）、日本壺菌屬（Japonochytrium
）、橙壺菌屬（Aplanochytrium
）、玲眼蝶屬（Elina
）及迷宮藻屬（Labyrinthula
），並且使該乙酸鹽產物醱酵以在第二醱酵液中產生至少一種脂質產物；自該第二生物反應器中獲得至少包括CO2
及O2
的尾氣；以及自該尾氣中分離出至少一部分O2
並且將該尾氣剩餘部分的至少一部分再循環至該第一生物反應器。
該第一生物反應器中之乙酸鹽的生產速率可為至少10公克/公升/天。該第一生物反應器中之第一微生物中的至少一種第一微生物可為醋桿菌屬、穆爾氏菌屬、梭菌屬、火球菌屬（Pyrococcus
）、優桿菌屬、脫硫桿菌屬、氧化碳嗜熱菌屬（Carboxydothermus
）、產醋菌屬（Acetogenium
）、厭氧醋菌屬（Acetoanaerobium
）、丁酸桿菌屬、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus
）、瘤胃球菌屬、產醋桿菌屬、甲烷八疊球菌屬或其任何組合。該第一生物反應器中之第一微生物中的至少一種第一微生物可為伍氏醋酸桿菌。該第二生物反應器中之第二微生物中的至少一種第二微生物可為破囊壺菌屬。該方法可以進一步包括由該至少一種脂質產物生產至少一種選自以下的三級產物：氫化衍生的可再生柴油（HDRD）、脂肪酸甲酯（FAME）、脂肪酸乙酯（FAEE）及生物柴油。該方法可以進一步包括限制該第二生物反應器中之該第二液體營養素培養基中的至少一種營養素以增加脂質產生。受限營養素可為氮。至少一種脂質產物可為多不飽和脂肪酸。該多不飽和脂肪酸可為ω-3脂肪酸。該ω-3脂肪酸可為α-亞麻酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）及二十二碳六烯酸（DHA）中的一種或多種。自該尾氣中分離該O2
的至少一部分可使用變壓吸附或用鹼性溶液洗滌來實現。該方法可以進一步包括將來自自該尾氣中分離之至少一部分O2
的O2
再循環至該第二生物反應器。該方法可以進一步包括自該第一生物反應器中回收包括CO2
及H2
的氣態流以及將該氣態流再循環至該第一生物反應器。該方法可以進一步包括將該第二醱酵液的至少一部分再循環至該第一生物反應器。該方法可以進一步包括在將該第一醱酵液的至少一部分送入該第二生物反應器之前，自該第一醱酵液中移除該第一微生物，並且將該第一微生物再循環至該第一生物反應器。該方法可以進一步包括自該第二醱酵液中移除該第二微生物，並且將該第二微生物再循環至該第二生物反應器。該方法可以進一步包括在移除該第二微生物之後，將該第二醱酵液的剩餘部分送入該第一生物反應器。該方法可以進一步包括使用水電解槽產生該H2
。該方法可以進一步包括使用水電解槽產生O2，並且將電解槽產生的該O2引入該第二生物反應器。
在一個實施例中，該氣態受質係來自工業製程的廢氣或排氣。在一個實施例中，廢氣選自包括以下之群組：來自氫氣廠的尾氣、焦爐煤氣、伴生石油氣、天然氣、催化重整氣、石腦油裂解廢氣、煉油廠燃料氣、甲醇廠尾氣、氨廠尾氣及石灰窯氣體。
本揭示案亦可包含本申請的說明書中單獨或共同提及或指示的部分、要素以及特徵，其呈所述部分、要素或特徵中的兩個或更多個任何組合或全部組合的形式，並且在本文提到之具有本揭示案所涉及領域中之已知等效物的具體整體的情況下，此類已知等效物被視為就像單獨地闡述一樣而併入本文。
本揭示案總體上係關於一種藉由首先使含有CO及/或CO2
以及H2
的氣態受質醱酵產生乙酸/乙酸鹽，隨後進行二次醱酵來生產脂質的方法，其中乙酸鹽被轉化為脂質。本文所使用的「酸」包含羧酸與締合的羧酸根陰離子，如存在於本文所描述醱酵液中的游離乙酸及乙酸鹽的混合物。醱酵液中分子酸與羧酸根的比例取決於系統的pH。術語「乙酸鹽」既單獨地包含乙酸鹽，又包含分子或游離乙酸與乙酸鹽的混合物，如存在於如本文可能描述之醱酵液中之乙酸鹽及游離乙酸的混合物。醱酵液中分子乙酸與乙酸鹽的比例取決於系統的pH。本文所使用的「脂質」包含脂肪酸、糖脂（glycolipid）、鞘脂、糖脂（saccharolipid）、聚酮化合物、固醇脂質及戊二烯醇脂質。在一個實施例中，該脂質可為多不飽和脂肪酸，如ω-3脂肪酸（亦稱為ω-3脂肪酸或n
-3脂肪酸）。該ω-3脂肪酸可為α-亞麻酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）及二十二碳六烯酸（DHA）中的一種或多種。
滲透物——穿過分離器並且未被分離器保留的基本上可溶的培養液成分。滲透物通常將含有可溶的醱酵產物、副產物及營養液。
稀釋速率——生物反應器中培養液的替代速率。稀釋速率以每天被營養素培養基替代的培養液的生物反應器體積數來測量。
第一醱酵的受質是指本揭示案的微生物的碳源及/或能量來源。對於至少一種微生物，受質可為氣態的並且包括C1碳源，如CO、CO2
及/或CH4
。在一個實施例中，受質包括CO或CO + CO2
的C1碳源。受質可以進一步包括其他非碳組分，如H2
、N2
或電子。
在具體實施例中，受質可以包括至少一定量的CO，如約1 mol%、2 mol%、5 mol%、10 mol%、20 mol%、30 mol%、40 mol%、50 mol%、60 mol%、70 mol%、80 mol%、90 mol%或100 mol%的CO。在其他實施例中，受質可以包括一定範圍的CO，如約20-80 mol%、30-70 mol%或40-60 mol%的CO。受質可以包括約40-70 mol%的CO（例如，鋼廠或高爐煤氣）、約20-30 mol%的CO（例如，鹼性氧氣爐氣）或約15-45 mol%的CO（例如，合成氣）。在一些實施例中，受質可以包括相對低量的CO，如約1-10 mol%或1-20 mol%的CO。本揭示案的微生物通常將受質中的CO的至少一部分轉化為產物。在一些實施例中，受質不包括或基本上不包括（＜ 1 mol%）CO。
在一些實施例中，受質可以包括一定量的H2
。例如，受質可以包括約1 mol%、2 mol%、5 mol%、10 mol%、15 mol%、20 mol%或30 mol%的H2
。在特定實施例中，氫氣的存在使得醱酵方法的總體效率提高。在一些實施例中，受質可以包括相對較高量的H2
，如約60 mol%、70 mol%、80 mol%或90 mol%的H2
。在另外的實施例中，受質不包括或基本上不包括（＜1 mol%）H2
。
在一些實施例中，受質可以包括一定量的CO2
。例如，受質可以包括約1-80 mol%或1-30 mol%的CO2
。在一些實施例中，受質可以包括小於約20 mol%、15 mol%、10 mol%或5 mol%的CO2
。在另一個實施例中，受質不包括或基本上不包括（＜ 1 mol%）CO2
。通常，當受質包括CO2
時，受質亦包括H2
。
儘管受質通常是氣態的，但是受質也可以替代形式提供。例如，可以使用微泡分散產生器將受質溶解於用含有CO、含有CO2及/或含有H2之氣體飽和的液體中。藉由另外的實例，受質可以吸附至固體載體上。
受質及/或C1碳源可為作為工業製程的副產物或自如汽車排氣或生物質氣化等某種其他來源獲得的廢氣。在某些實施例中，工業製程選自由以下組成之群組：如鋼廠製造等黑色金屬產品製造、有色金屬產品製造、石油精煉、煤氣化、電力生產、炭黑生產、氨生產、甲醇生產及焦炭生產。在此等實施例中，受質及/或C1碳源在被排放到大氣中之前可以使用任何便利的方法從工業製程中捕獲。
受質及/或C1碳源可為合成氣，如藉由氣化煤或精煉殘留物、氣化生物質或木質纖維素物質或重整天然氣而獲得的合成氣。在另一實施例中，可以從城市固體廢物或工業固體廢物的氣化中獲得合成氣。
受質的組成可能對反應的效率及/或成本有重大影響。例如，氧氣（O2
）的存在可能會降低厭氧醱酵方法的效率。根據受質的組成，可能期望處理、洗滌或過濾該受質以移除任何不期望的雜質（如毒素、不期望的組分或灰塵顆粒）及/或增加令人期望的組分的濃度。
在一些實施例中，受質可為合成氣，並且可以改善合成氣的組成以提供期望的或最優的H2
:CO:CO2
比率。可以藉由調節饋入氣化過程的原料來改善合成氣的組成。期望的H2
:CO:CO2
比率取決於醱酵方法的期望醱酵產物。舉例而言，若期望的產物為乙醇，則最佳H2
: CO: CO2
比率將為：
，其中
以滿足乙醇產生的化學計量
。
在存在氫氣的情況下操作醱酵方法具有減少藉由醱酵方法產生之CO2
的量的增加的益處。例如，包括最低H2
的氣態受質通常將藉由以下化學計量產生乙醇及CO2
：[6 CO + 3 H2
O à C2
H5
OH + 4 CO2
]。隨著C1固定細菌利用之氫氣的量增加，所產生CO2
的量減少，[例如，2 CO + 4 H2
à C2
H5
OH + H2
O]。
當CO為乙醇產生的唯一碳源及能量來源時，碳的一部分損失為CO2
，如下：
6 CO + 3 H2
O à C2
H5
OH + 4 CO2
（ΔGº = -224.90 kJ/mol乙醇）
隨著受質中可用的H2
量增加，所產生CO2
的量減少。以2:1（H2
: CO）的化學計量比率，完全避免CO2
產生。
5 CO + 1 H2
+ 2 H2
O à 1 C2
H5
OH + 3 CO2
（ΔGº = -204.80 kJ/mol乙醇）
4 CO + 2 H2
+ 1 H2
O à 1 C2
H5
OH + 2 CO2
（ΔGº = -184.70 kJ/mol乙醇）
3 CO + 3 H2
à 1 C2
H5
OH + 1 CO2
（ΔGº = -164.60 kJ/mol乙醇）
培養液滲出——從生物反應器中移除之未送入分離器之醱酵液的部分。
分離器——適用於接收來自生物反應器的醱酵液並使培養液通過過濾器以產生滲餘物及滲透物的模組。過濾器可為膜，例如錯流膜或中空纖維膜。
在該方法的第一階段中，包括CO2
及H2
或包括CO及視情況H2
的氣態受質厭氧醱酵以產生至少一種酸。在該方法的第二階段中，將來自第一階段的該至少一種酸引入含有至少一種第二微生物之培養物的第二生物反應器。第二微生物可為至少一種微藻。藉由第二微生物將該至少一種酸有氧轉化以產生一種或多種脂質產物。本文所使用的醱酵、醱酵方法或醱酵反應及類似的術語旨在涵蓋該方法的生長期與產物生物合成期。如本文進一步描述，在一些實施例中，生物反應器可以包括第一生長反應器及第二醱酵反應器。如此，向醱酵反應添加金屬或組合物應被理解為包含向此等反應器中的任一或兩個反應器中添加。在生物反應器中發現的組分的混合物（包含培養物及營養素培養基）被稱為培養液或醱酵液。存在於醱酵液中的微生物培養物被稱為培養液培養物，並且培養液培養物密度是指醱酵液中微生物細胞的密度。
該方法包含：在含有液體營養素培養基（如添加至含有適用於微生物培養物的生長的營養素及其他組分的醱酵液的溶液）的初級生物反應器中培養至少一株能夠由含有CO、CO2
或H2
或其任何混合物的氣態受質產生乙酸鹽的厭氧產乙酸細菌；以及向初級生物反應器供應氣態受質。醱酵方法產生乙酸鹽。將在初級生物反應器中產生的乙酸鹽引入含有至少一種微藻的培養物的次級生物反應器中，該微藻能夠由含乙酸鹽的受質產生脂質。
該至少一株能夠由含有CO、CO2
或H2
或其混合物的氣態受質產生乙酸鹽的厭氧產乙酸細菌來自由以下組成之群組：醋桿菌屬、穆爾氏菌屬、梭菌屬、火球菌屬、優桿菌屬、脫硫桿菌屬、氧化碳嗜熱菌屬、產醋菌屬、厭氧醋菌屬、丁酸桿菌屬、消化鏈球菌屬、瘤胃球菌屬、產醋桿菌屬及甲烷八疊球菌屬。
生物反應器或醱酵槽包含由一個或多個容器及/或塔或管路佈置組成的醱酵裝置，該醱酵裝置包含連續攪拌釜反應器（CSTR）、固定細胞反應器（ICR）、滴流床反應器（TBR）、移動床生物膜反應器（MBBR）、鼓泡塔、氣升式醱酵罐、如中空纖維膜生物反應器（HFMBR）等膜反應器、靜態混合器或適於氣體-液體接觸的其他容器或其他裝置。
初級生物反應器可為與次級生物反應器串聯或並聯連接的一個或多個反應器。初級生物反應器中進行厭氧醱酵，以由氣態受質產生酸。該一個或多個初級生物反應器的酸產物的至少一部分用作一個或多個次級生物反應器中的受質。類似地，次級生物反應器可以涵蓋可以與一個或多個初級生物反應器串聯或並聯連接的任何數量的另外的生物反應器。此等次級生物反應器中的任何一個或多個次級生物反應器也可以連接到另外的分離器。
雖然以下描述關注本揭示案的某些實施例，但是如本揭示案所涉及領域的普通技術人員在考慮本揭示案時所知，本揭示案可以適於產生其他醇及/或酸以及使用其他受質。同樣，雖然特別提到了使用產乙酸微生物執行的醱酵，但是本揭示案還適用於可以在可以用於產生可用產物（包含但不限於其他酸（包含其對應共軛鹼）及醇）的相同或不同的方法中使用的其他微生物。 利用氣態受質進行醱酵 .
本揭示案的一個實施例包含由包括含有CO及視情況H2
之工業煙道氣的氣態受質產生乙酸/乙酸鹽及乙醇。一種此類型的氣流係來自鋼鐵生產廠的尾氣，其通常含有20-70% CO。此類氣流可以進一步包括CO2
。由處理任何基於碳的原料（如石油、煤及生物質）產生類似的流。本揭示案的另一個實施例包含由包括CO2
的氣態受質產生乙酸/乙酸鹽。H2
可為氣態受質的一部分或可以添加至氣態受質。本揭示案亦可適用於產生替代酸的反應。
用於由氣態受質產生乙酸鹽及其他醇的方法已知。示例性方法包含例如在WO2007/117157、WO2008/115080、US 6,340,581、US 6,136,577、US 5,593,886、US 5,807,722及US 5,821,111中描述的彼等方法，該等文獻中的每個文獻以全文引用的方式併入本文。
已知若干種厭氧菌能夠執行將CO醱酵成乙醇及乙酸/乙酸鹽或將CO2
及H2
醱酵成乙酸/乙酸鹽，並且適於在本揭示案的方法中使用。產乙酸菌可以藉由伍德-隆達爾途徑將如H2
、CO2
及CO等氣態受質轉化為包含乙酸、乙醇及其他醱酵產物的產物。適於在本揭示案中使用的此類細菌的實例包含梭菌屬的彼等實例，如楊氏梭菌的菌株，包含WO 00/68407、EP 117309、US專利第5,173,429號、第5,593,886號及第6,368,819號、WO 98/00558及WO 02/08438中描述的彼等菌株，以及自產乙醇梭菌屬（Abrini等人, 《微生物學檔案》 161: 第345-351頁）。其他合適的細菌包含穆爾氏菌屬的彼等細菌，包含穆爾氏菌HUC22-1（Sakai等人, 《生物技術快報（Biotechnology Letters
）》 29: 第1607-1612頁），以及氧化碳嗜熱菌屬的彼等細菌（Svetlichny, V.A.、Sokolova, T.G.等人 (1991), 《系統及應用微生物學（Systematic and Applied Microbiology
）》 14: 254-260）。此等出版物中的每個出版物的揭示內容均藉由引用完全併入本文。另外，本領域的技術人員可以選擇其他產乙酸厭氧菌以在本揭示案的方法中使用。還應理解，兩種或更多種細菌的混合培養物可以用於本揭示案的方法中。
適於在本揭示案中使用的一種示例性微生物係自產乙醇梭菌屬，其可自德國微生物及細胞培養物保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ）購得並且具有DSMZ寄存號DSMZ 10061的標識特徵。
本揭示案具有支持由包括CO2
及H2
之氣態受質產生乙酸鹽的另外的適用性。已經表明伍氏醋酸桿菌藉由使包括CO2
及H2
的氣態受質醱酵產生乙酸鹽。Buschhorn等人證明瞭伍氏醋酸桿菌在磷酸鹽受限的葡萄糖醱酵中產生乙醇的能力。適於在本揭示案中使用的一種示例性微生物是具有在德國生物材料資源中心（DSMZ）處在標識寄存號DSM 1030下保藏之菌株的標識特徵的伍氏醋酸桿菌。
其他合適的細菌包含穆爾氏菌屬的彼等細菌，包含穆爾氏菌HUC22-1（Sakai等人, 《生物技術快報》 29: 第1607-1612頁），以及氧化碳嗜熱菌屬的彼等細菌（Svetlichny, V.A.、Sokolova, T.G.等人 (1991), 《系統及應用微生物學》 14: 254-260）。另外的實例包含熱醋穆爾氏菌（Morella thermoacetica
）、熱自養穆爾氏菌（Moorella thermoautotrophica
）、長身貝瘤胃球菌（Ruminococcus productus
）、伍氏醋酸桿菌、黏液優桿菌（Eubacterium limosum
）、食甲基丁酸桿菌（Butyribacterium methylotrophicum
）、芬妮產醋桿菌（Oxobacter pfennigii
）、巴氏甲烷八疊球菌（Methanosarcina barkeri
）、乙酸甲烷八疊球菌（Methanosarcina acetivorans
）、庫氏脫硫桿菌屬（Desulfotomaculum kuznetsovii
）（Sipma等人《生物技術關鍵評論（Critical Reviews in Biotechnology）》 2006 第26卷.第41-65頁）。另外，應當理解，如本領域的技術人員將理解的，其他產乙酸厭氧菌可以適用於本揭示案。還應當理解，本揭示案可以應用於兩種或更多種細菌的混合培養物。
可以使用本領域已知的用於使用厭氧菌來培養及醱酵受質的任何數量的方法來執行在本揭示案之方法中使用的細菌的培養。在以下「實例」部分中提供了示例性技術。在某些實施例中，將本揭示案的細菌培養物在水性培養基中保持。較佳地，水性培養基係最低厭氧微生物生長培養基。合適的培養基是本領域已知的並且例如描述於：美國專利第5,173,429號及第5,593,886號並且WO 02/08438，以及Klasson等人[(1992).合成氣生物轉化為液體或氣態燃料（Bioconversion of Synthesis Gas into Liquid or Gaseous Fuels）.《酶及微生物技術（Enz.Microb.Technol.）》14:602-608.]、Najafpour及Younesi [(2006).使用楊氏梭菌的批量培養物自廢氣中進行的乙醇及乙酸鹽合成（Ethanol and acetate synthesis from waste gas using batch culture ofClostridium ljungdahlii
）.《酶及微生物技術》，第38卷，第1-2期，第223-228頁]以及Lewis等人[(2002).將生物質產生的發生爐煤氣連接轉化為乙醇（Making the connection-conversion of biomass-generated producer gas to ethanol）.生物能源摘要（Abst.Bioenergy）, 第2091-2094頁]。在本揭示案的特定實施例中，最低厭氧微生物生長培養基如下文在實例部分中所描述。藉由另外的實例，可以利用使用醱酵用之氣態受質通常在以下揭示內容中描述的彼等方法：WO98/00558、M. Demler及D.Weuster-Botz (2010).對藉由伍氏醋酸桿菌進行氫營養產生乙酸進行反應工程化分析（Reaction Engineering Analysis of Hydrogenotrophic Production of Acetic Acid byAcetobacterium
woodii）.《生物技術與生物工程（Biotechnology and Bioengineering）》2010；D.R. Martin、A. Misra及H. L. Drake (1985).藉由熱醋酸梭狀芽胞桿菌（Clostridium thermoaceticum
）的葡萄糖受限的培養物將一氧化碳異化為乙酸（Dissimilation of Carbon Monoxide to Acetic Acid by Glucose-Limited Cultures ofClostridium thermoaceticum
）.《應用及環境微生物學（Applied and Environmental Microbiology）》，第49卷，第6期，第1412-1417頁。通常，在如連續攪拌釜反應器（CTSR）、鼓泡塔反應器（BCR）或滴流床反應器（TBR）等任何合適的生物反應器中執行醱酵。同樣，在本揭示案的一些實施例中，生物反應器可以包括其中培養微生物的第一生長反應器及將醱酵液從生長反應器饋入其中以及產生大部分醱酵產物（乙醇及乙酸鹽）的第二醱酵反應器。 原料
用於醱酵的碳源可為包括視情況結合氫的一氧化碳的氣態受質，或包括視情況結合氫的CO2
或其任何組合的氣態受質。例如，氣態受質可為作為工業製程的副產物或自如氣化等某種其他來源獲得的CO及視情況含有H2
或含有CO2
及H2
的廢氣。
如上所述，用於醱酵反應的碳源係含有CO或CO2
或兩者的氣態受質。氣態受質可為工業製程的副產物或自如汽車排氣或氣化等某種其他來源獲得之含有CO或CO2
的廢氣。在一些實施例中，工業製程可以選自如鋼廠等黑色金屬產品製造、有色金屬產品製造、石油精煉製程、煤氣化、電力生產、炭黑生產、氨生產、甲醇生產及焦炭製造。在此等實施例中，在將含有CO的氣體排放到大氣中之前，可以使用任何便利的方法自工業製程中捕獲含有CO的氣體。根據含有CO之氣態受質的組成，在將其引入醱酵之前，亦可能需要對其進行處理以移除任何不期望的雜質，如灰塵顆粒。例如，可以使用已知方法過濾或洗滌氣態受質。
另外，通常期望增加受質流的CO或CO2
濃度（或氣態受質中的分壓），並且因此提高其中CO或CO2
作為受質的醱酵反應的效率。氣態受質中CO或CO2
分壓的增加會增加向醱酵培養基的質量傳遞。用於饋料醱酵反應之氣流的組成可能對該反應的效率及/或成本具有重大影響。例如，O2
可以降低厭氧醱酵方法的效率。在醱酵之前或之後的醱酵方法之各階段中處理不想要的氣體或不必要氣體可能會增加此類階段的負擔（例如，在進入生物反應器之前壓縮氣流的情況下，可以使用不必要的能量來壓縮醱酵中不需要的氣體）。因此，可能期望處理受質流，特別是源自工業來源的受質流，以移除不想要的組分並增加期望組分的濃度。
藉由各種方法產生富氫氣流，所述各種製程包含烴的蒸汽重整，具體而言，天然氣的蒸汽重整。煤或烴的部分氧化亦為富氫氣體的來源。富氫氣體的其他來源包含水的電解、來自用於產生氯氣的電解電池以及來自各種精煉廠及化學流的副產物。
氣態受質可以進一步或替代地包括CO2
。具有高CO2
含量的氣流源自各種工業製程並且包含來自如天然氣或石油等烴之燃燒的排氣。此等製程包含水泥及石灰生產以及鋼鐵生產。 流的混合
在一些實施例中，工業廢物流可以與一種或多種另外的流混合以提高效率、酸及/或醇的產生及/或醱酵反應的總體碳捕獲。在工業廢物流具有高CO或CO2
含量但是包含最低或沒有H2
的情況下，可能期望在將混合流引入醱酵罐之前，使包括H2
的一個或多個流與工業廢物流混合。醱酵的總體效率、乙醇生產速率及/或總體碳捕獲將取決於混合流中CO及H2
或CO2
及H2
的化學計量。在一些實施例中，混合流可以基本上包括具有以下莫耳比的CO及H2
：至少1:2、至少1:4或至少1:6或至少1:8或至少1:10。在其他實施例中，混合流可以包括以下莫耳比的CO2
及H2
：至少1:4或至少1:6或至少1:8或至少1:10。
流的混合亦可具有另外的優點，如其中包括CO、CO2
或H2
的廢物流在本質上為間歇性的。例如，可以將包括CO及視情況H2
的間歇性廢物流與包括CO、CO2
及/或H2
的基本上連續流混合並且提供給醱酵罐。在一些實施例中，可以根據間歇流改變基本上連續流的組成及流速，以便使提供給醱酵罐的基本上連續之受質流保持組成及流速。
使兩種或更多種流混合以實現期望的組成可能涉及改變所有流的流速，或可以將流中的一個或多個流保持恆定，而改變一個或多個其他流以便將受質流「修剪」或最佳化到期望組合物。對於連續處理的流而言，很少需要或不需要進一步處理（如緩衝），並且可以將流直接提供給醱酵罐。然而，可能有必要為其中一個或多個間歇性可用及/或其中流連續可用但以可變速率使用及/或生產的流提供緩衝儲存裝置。
在混合之前監測流的組合物及流速是有利的。可以藉由改變組成流的比例以達到目標或期望的組合物來實現對混合流的組合物的控制。例如，基本負載氣流可能主要是CO，並且可以將包括高濃度的H2
的二次氣流混合以達到規定的H2
:CO比率。可以藉由本領域已知的任何方式監測混合流的組合物及流速。混合流的流速可以獨立於混合操作而控制；然而，必須將單獨組成流的抽出速率控制在限制範圍內。例如，從緩衝儲存裝置中連續抽取的間歇性產生的流必須以一定速率抽取，使得緩衝儲存裝置的容量既不會耗盡也不會充滿到容量。
在混合時，單獨的組成氣體將進入混合室，該混合室通常是小容器或管道的區段。在此類情況下，容器或管道可以設置有被佈置成促進單獨組分的湍流及快速均質化的靜態混合裝置，如擋板。若需要，則亦可提供混合流的緩衝儲存裝置，以保持向生物反應器提供基本上連續的受質流。
視情況可以將適於監測組成流之組成及流速並控制流以適當的比例混合以實現所需或期望混合的處理器併入系統。例如，可以視需要或可用方式提供特定組分，以最佳化乙酸鹽生產速率及/或總體碳捕獲的效率。
在本揭示案的某些實施例中，該系統適於連續監測至少兩個流的流速及組成，並將其組合以產生具有最佳組成的單一混合受質流，以及用於將最佳化受質流送入醱酵罐的構件。
藉由非限制性實例，本揭示案的實施例涉及利用來自鋼鐵生產過程的CO氣體。通常，此類流含有很少或不含H2
，並且可能期望將包括CO的流與包括H2
的流組合以實現更期望的CO：H2
比率。H2
通常在鋼廠在焦爐中大量產生。可以將來自焦爐之包括H2
的廢物流與包括CO的鋼廠廢物流混合，以達到期望的醱酵組成。
源自工業來源之受質流的組成可變。此外，源自工業來源之包括高CO濃度（例如，至少40% CO、至少50% CO或至少65% CO）的受質流通常具有低H2組分（如小於20%或小於10%或基本上為0%）。如此，特別期望微生物能夠藉由包括一定範圍之CO及H2 濃度
（特別是高CO濃度及低H2
濃度）之受質的厭氧醱酵來產生產物。本揭示案的細菌在醱酵包括CO（並且無H2
）的受質時具有令人驚訝的高生長速率及乙酸鹽產生速率。
藉由捕獲自本揭示案方法產生之含有CO的氣體或含有CO2
的氣體以及將該氣體用作本文所描述的醱酵方法的受質，可以將此類方法用於減少來自工業製程的總體大氣碳排放。
可替代地，在本揭示案的其他實施例中，含有CO的氣態受質可以來源於生物質的氣化。氣化製程涉及生物質在有限的空氣或氧氣供應中的部分燃燒。所得氣體通常主要包括CO及H2
，具有最小體積的CO2
、甲烷、乙烯及乙烷。例如，在如來自甘蔗的糖或來自玉米或穀物的澱粉等食品的萃取及處理期間獲得的生物質副產品，或林業工業產生的非食品生物質廢物可以被氣化以產生適於在本揭示案中使用的含有CO的氣體。
含有CO的氣態受質可以含有主要比例的CO。在特定實施例中，氣態受質包括以體積計至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約65%或至少約70%至約95% CO。氣態受質不必定含有任何氫氣。氣態受質視情況亦含有CO2
，如以體積計約1%至約30%，如約5%至約10% CO2
。 反應化學計量
已經證明厭氧細菌藉由乙醯輔酶A生化途徑由CO、CO2
及H2
產生乙醇及乙酸。用於藉由產乙酸微生物由包括CO的受質形成乙酸鹽的化學計量如下：
4CO + 2H2
O à CH3
COOH + 2CO2
並且在存在H2
的情況下：
4CO + 4H2
à 2CH3
COOH
亦已證明厭氧細菌可以由CO2
及H2
產生乙酸。藉由包含伍氏醋酸桿菌的產乙酸型細菌由包括CO2
及H2
的受質形成乙酸鹽的化學計量：
4H2
+ 2CO2
à CH3
COOH + 2H2
O
應當理解，為了使細菌生長及醱酵發生，除了含有CO、CO2
及/或H2
的受質氣體，亦需要將合適的液體營養素培養基饋入生物反應器。營養素培養基將含有足以允許所用微生物生長的維生素及礦物質。適於使用CO作為唯一碳源的乙醇進行醱酵的厭氧培養基係本領域已知的。例如，合適的培養基在US 5,173,429及US 5,593,886及WO 02/08438以及上文提到的其他出版物中有描述。
在適用於使CO或CO2
及H2
醱酵成乙酸鹽發生的條件下進行醱酵。要考慮的反應條件包含壓力、溫度、氣體流速、液體流速、培養基的pH、培養基的氧化還原電勢、攪拌速率（若使用連續攪拌釜反應器）、接種水準、確保液相中的CO或CO2
不會受到限制的最大氣體受質濃度以及避免產物抑制的最大產物濃度。
在一個實施例中，在約34℃至約37℃的溫度下執行醱酵。在一個實施例中，在約34℃的溫度下執行醱酵。發明人注意到，此溫度範圍可以有助於支持或提高醱酵的效率，包含例如維持或提高細菌的生長速率、延長細菌的生長期、維持或增加代謝產物（包含乙酸鹽）的產生、維持或增加CO或CO2
的吸收或消耗。
具體反應條件將部分取決於所使用的微生物。然而，通常，可以高於環境壓力的壓力執行醱酵。在增加的壓力下操作允許自氣相到液相的CO及/或CO2
轉移速率顯著增加，在所述速率下，所述氣體可以被微生物吸收作為碳源以產生乙酸鹽。此又意味著當將生物反應器保持在高壓而不是大氣壓下時，可以減少滯留時間，該滯留時間被定義為生物反應器中的液體體積除以輸入氣體流速。
同樣，由於給定的CO或CO2
及H2
到乙酸鹽轉化率部分取決於受質滯留時間且達到期望的滯留時間又決定生物反應器的所需體積，因此使用加壓系統可以大大減少生物反應器的體積，並且因此，醱酵設備的資金成本大大減少。 利用酸作為用於產生脂質之受質的微藻
本揭示案適用於支持由含有乙酸鹽的受質產生脂質。一種此類型的受質係源自藉由厭氧微生物醱酵對包括CO或CO2
及H2
或其混合物的氣態受質進行轉化的乙酸鹽。
已知許多微生物能夠執行將糖醱酵為脂質並且適於在本揭示案的方法中使用。為了易於理解，此等微生物將被稱為微藻。此類微藻的實例是裂殖壺菌屬（Schizochytrium
）或柵列藻屬（Scenedesmus
）的彼等實例。
已經示出微藻藉由包括乙酸鹽的受質的異養醱酵產生脂質（Huang, G、Chen, F.、Wei, D.、Zhang, X.、Chen, G.「藉由微藻生物技術生產生物柴油（Biodiesel production by microalgal biotechnology）」 《應用能源（Applied Energy）》, 第87(1)卷, 2010, 38-46；Ren, H.、Liu, B.、Ma, C.、Zhao, L.、Ren, N.「使用尼羅紅染色進行分離的新的富含脂質的微藻柵列藻菌株R-16：碳源及氮源以及初始pH對生物質及脂質產生的影響（effects carbon and nitrogen sources and initial pH on the biomass and lipid production）」.《生物燃料技術（Biotechnology for Biofuels
）》, 2013, 6(143)）。可以藉由氮限制來改善藉由微藻產生一種或多種脂質。例如，碳與氮的49:1比例對脂質的產生具有顯著影響。
適用於本揭示案方法中的微藻包含小球藻屬（Chlorella
）、衣藻屬（Chlamamydomonas
）、杜氏藻屬（Dunaliella
）、眼蟲屬（Euglena
）、隱胞子蟲屬（Parvum
）、綠藻屬（Tetraselmis
）、紫球藻屬（Porphyridium
）、
螺旋藻屬（Spirulina
）、聚球藻屬（Synechoccus
）、魚腥藻屬（Anabaena
）、裂殖壺菌屬、
葡萄球菌屬（Botyrococcus
）、墨角藻屬（Fucus
）、
擬小球藻屬（Parachlorella
）、假綠藻屬（Pseudochlorella
）、片球藻屬（Brateococcus
）、
原壁菌屬（Prototheca
）及柵列藻屬、
破囊壺菌屬、日本壺菌屬、橙壺菌屬、玲眼蝶屬及迷宮藻屬（Labyrinthuloide或Labyrinthulomyxa）。在一個實施例中，微藻是破囊壺菌屬的破囊壺菌。破囊壺菌可為破囊壺菌屬的任何物種，包含但不限於在Gupta, 《生物技術進展（Biotechnol Adv
）》 , 30: 1733-1745 (2012)或Gupta, 《生化工程雜誌（Biochem Eng J
）》, 78: 11-17 (2013)。
如本領域的技術人員將理解，其他微藻可以適用於本揭示案。本揭示案亦可應用於兩種或更多種微藻物種的混合培養物。可以使用本領域已知的任何數量的方法來執行本揭示案方法中使用的微藻的培養。如上文所討論的，轉化過程在任何合適的生物反應器中執行。在某些實施例中，微藻生物反應器將需要氧氣或空氣入口以使微藻生長。
次級生物反應器內含有的微藻能夠將乙酸鹽轉化為脂質，其中脂質積累在生物質的膜部分內。在脂質積累之後，可以將次級生物反應器的生物質送入萃取系統。萃取系統可以用於自微藻生物質的膜部分中萃取積累的脂質。可以使用本領域已知的任何數量的方法執行脂質萃取。
所產生的脂質可以進一步處理以提供化學品、燃料或燃料組分，例如藉由本領域已知的方式獲得的烴、氫化衍生的可再生柴油（HDRD）、脂肪酸甲酯（FAME）、脂肪酸乙酯（FAEE）及生物柴油。各種衍生物（如清潔及個人護理產品）使用如界面活性劑、脂肪醇及脂肪酸等組分，該脂質中的所有脂質都可以作為替代品提供。進一步地，各種油脂化學品可以由脂質生產。ω-3脂肪酸係α-亞麻酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）及二十二碳六烯酸（DHA）中的一種或多種。 培養基再循環
可以藉由將離開次級生物反應器的含有培養基之流再循環至至少一個初級反應器中來進一步提高本揭示案之醱酵方法的效率。離開次級生物反應器的含有培養基之流可能含有未使用的金屬、鹽及其他營養素組分。將含有培養基的出口流再循環至初級反應器降低了向初級反應器提供連續營養素培養基的成本。再循環具有減少連續醱酵方法的總體水需要量的其他益處。離開生物反應器的含有培養基之流可以在送入回初級反應器之前進行處理。
再循環含有培養基的流是另外有益的，因為該流有助於降低初級生物反應器中的pH控制成本。乙酸鹽產物的積累導致初級生物反應器中培養液的pH降低，此對於懸浮於培養基中的培養物有害。隨著乙酸鹽在初級生物反應器中的積累，必須向培養基中添加如NH3
或NaOH等鹼以增加初級生物反應器中的pH。藉由將培養液送入次級生物反應器並且接著將含有培養基的流再循環回到初級生物反應器，次級生物反應器的微藻消耗乙酸鹽並增加再循環至初級生物反應器的含有培養基之流的pH。隨著自次級生物反應器中的系統中移除乙酸鹽，減少或消除了對初級反應器的培養基進行pH調節的昂貴鹼的需要。
接著自次級生物反應器醱酵液中分離生物質，並且對生物質進行處理以回收一種或多種脂質產物。在分離生物質之後，接著可以將培養液的剩餘部分再循環至初級反應器。應移除生物質以使得生物質的量小於再循環流的20質量%（以每公升溶液乾細胞的公克數度量），或使得生物質的量小於再循環流的10質量%（以每公升溶液乾細胞的公克數度量），或使得生物質的量小於再循環流的質量5%（以每公升溶液乾細胞的公克數度量）。再循環流在送入初級反應器之前可以被進一步處理以移除可溶性蛋白質或其他不想要的組分。可以在返回初級反應器之前將另外的金屬及鹽添加至再循環流中，以提供期望組成的營養素。可以根據初級生物反應器的醱酵製程的需要監測及調節流的pH。
由於微藻在次級生物反應器中的生長需要氧氣，因此再循環回至初級生物反應器的任何培養基均需將氧氣基本上移除，因為存在於初級生物反應器中的氧氣對厭氧培養物有害。因此，離開次級生物反應器的培養液流可以在送入初級反應器之前通過氧氣洗滌器以移除氧氣。應移除氧氣直至小於再循環至初級生物反應器之流的5莫耳%、小於2莫耳%、小於0.5莫耳%或小於0.001莫耳%的量。 尾氣再循環
如上文所討論，在次級生物反應器中乙酸鹽向脂質的轉化形成CO2
。乙酸鹽形成脂質遵循始終引起CO2
共形成的化學計量轉化。一個實例包含：
27 CH3
CO2
H + 5 O2
→ 2 C18
H30
O2
+ 18 CO2
+ 24 H2
O
在此實例中，亞麻酸的形成表明，對於由乙酸鹽製成的脂質分子中每含有2個碳原子，1個碳原子就以CO2
的形式釋放，從而導致初始乙酸鹽饋料中含有的33%碳以CO2
的形式損失。可以藉由微生物產生其他脂肪酸，但所捕獲的碳與釋放的CO2
的比率仍大約相同。
本揭示案提供了將來自次級生物反應器的尾氣再循環至初級反應器，其中CO2
可以用作受質。然而，一個挑戰是次級生物反應器以需氧模式操作，而初級生物反應器以厭氧模式操作。因此，在將來自次級生物反應器的尾氣再循環至初級生物反應器之前，必須自含有CO2
的尾氣流中分離並移除存在於尾氣中的O2
。移除O2
的量應足以使得送入初級生物反應器的剩餘O2
不會超出容忍度而對初級生物反應器的操作產生不利影響。合適的分離技術包含變壓吸附（PSA）、膜分離、酸性氣體移除技術、使用溶劑吸附的CO2
溶劑（如胺、甲醇等）以及用鹼性溶液洗滌。分離步驟亦可涉及氮的分離。分離步驟可以涉及兩個或更多個串聯或並聯的分離階段。分離階段可以具有相同的技術或可以採用不同的技術。例如，可以採用串聯的兩個PSA單元。在一個實施例中，第一PSA可以用於移除CO2
，而第二PSA可以用於移除O2
並排出N2
。經分離的氧氣可以返回到次級生物反應器。
次級生物反應器可以在氧氣受限的模式下操作，以耗盡尾氣中未反應的O2
的量。可替代地，在期望在次級生物反應器中具有殘留O2
的實施例中，可以將尾氣噴射藉由由次級生物反應器連續饋料並再循環至次級生物反應器的又另一個容器。將「另一個」容器中的微生物控制在氧氣受限的條件下，以實現O2
的移除。
本揭示案提供的另一個優點是結合了在該方法中使用的環保產生的H2
。藉由兩種方式之一產生環保的H2
。第一種方式來自對藉由來自農業廢物及食品廢物的產甲烷細菌產生的生物源甲烷進行的蒸汽重整。第二種方式來自使用為醱酵方法的厭氧階段提供H2
並且在分離流中為醱酵方法的需氧階段提供純氧的水電解槽。由於初級生物反應器中需要H2
，並且次級生物反應器中需要O2
，因此可以使用水電解槽提供兩個醱酵階段所需的H2
及O2
，由此以最環保的方式由H2
及CO2
產生脂質，而無需添加大氣氮。
此外，選擇採用由水電解槽產生的O2
而不是例如空氣具有以下優點：沒有不必要的惰性氣體進入系統。這是很重要的，因為將在次級生物反應器中產生的包含CO2
之尾氣再循環至拳頭反應器，尾氣的惰性氣體部分會隨著時間在系統中積累。一些另外的機制將變得有必要，以移除積累的惰性氣體。純O2
作為饋料氣體亦可根據其分壓幫助改善O2
的質量傳遞。
本文參考附圖描述了本揭示案的方法及系統。圖1演示了由包括CO及H2
或CO2
及H2
的氣態流產生一種或多種液體的兩階段系統。該系統提供了初級生物反應器101，該初級生物反應器具有培養基入口102、進氣口103、分離器構件104、滲透物流出口107及滲出流出口108。初級生物反應器連接到次級生物反應器201，該次級生物反應器具有分離器205、滲透物流出口207及滲出流出口208。
在使用時，初級生物反應器101含有醱酵液，該醱酵液包括液體營養素培養基中的一種或多種產乙酸細菌之培養物。以連續或半連續的方式將培養基經由整個培養基入口102添加至生物反應器101。藉由進氣口103將氣態受質供應到生物反應器101。分離器構件是適用於藉由第一輸出導管104自生物反應器101接收培養液的至少一部分，並使該至少一部分通過被配置成自醱酵液（滲透物）的剩餘部分分離微生物細胞（滲餘物）的分離器105。藉由第一返回導管106將滲餘物的至少一部分返回到第一生物反應器，此確保了將培養液培養物的密度保持最佳水準。分離器105適用於藉由滲透物遞送導管107將滲透物的至少一部分送出生物反應器101。滲透物遞送導管107將無細胞的滲透物饋入次級生物反應器201。在本揭示案的某些實施例中，移除無細胞滲透物的至少一部分以進行產物萃取及/或將無細胞滲透物的至少一部分再循環至初級生物反應器，其中將無細胞滲透物流的剩餘部分饋入次級生物反應器201。提供培養液滲出輸出108以將來自初級生物反應器101的培養液直接饋入次級生物反應器202。在某些實施例中，在被饋入次級生物反應器之前，將培養液滲出物及滲透物組合。
次級生物反應器201含有液體營養素培養基中的一種以上微藻培養物。微藻作為具體實例使用，並且任何合適的微生物均可用於次級生物反應器201中。次級生物反應器201藉由培養液滲出輸出108及滲透物遞送導管107以連續或半連續的方式自初級生物反應器101接收培養液及/或滲透物。分離器205適用於藉由第一輸出導管204自次級生物反應器201接收培養液的至少一部分。分離器205被配置成自醱酵液的剩餘部分（滲透物）基本上分離微生物細胞（滲餘物）。藉由第二返回導管206將滲餘物的至少一部分返回到次級生物反應器201，此確保了將次級生物反應器201中的培養液培養物的密度保持最優水準。分離器205適用於藉由滲透物移除導管207將滲透物的至少一部分送出次級生物反應器201。提供培養液滲出輸出208以自次級生物反應器201直接移除培養液。可以使用已知方法處理兩個滲出輸出208以移除生物質用於脂質萃取。可以將基本上無生物質的滲出流及滲透物流組合以產生組合流。在本揭示案的某些態樣中，可以將組合流返回到初級反應器以補充連續添加的液體營養素培養基。在某些實施例中，可能期望進一步處理再循環流以移除二次醱酵的不期望的副產物。在某些實施例中，可以調節再循環流的pH並添加另外的維生素及/或金屬以補充流。
將來自次級生物反應器201的尾氣流210送入氧氣移除單元212以產生基本上不含氧氣的CO2
流。氧氣移除單元可為例如一個或多個PSA單元、膜分離單元、洗滌器、使用一種或多種溶劑的吸附或其任何組合。將基本上無氧的CO2
流送入管線216中並藉由進氣口103再循環至初級生物反應器101。基本上無氧意指該流包括小於約1 mol% O2
、小於約500 mol-ppm O2
或小於約100 mol-ppm O2
。可以藉由管線214將氧氣移除單元212自尾氣210中移除的O2
再循環至次級生物反應器201。
圖2演示了用於由包括CO及H2
或CO2
及H2
的氣態流產生脂質的簡化系統，其中將基本上不含乙酸鹽的培養基自次級生物反應器再循環至初級生物反應器。該系統包含初級厭氧生物反應器301，該初級厭氧生物反應器具有培養基入口302、進氣口303、含有乙酸鹽的經處理滲出流304、次級需氧生物反應器305、氧氣來源306、含有脂質及生物質的產物流307，以及乙酸鹽耗盡的再循環培養基流。
在使用時，初級生物反應器301含有醱酵液，該醱酵液包括液體營養素培養基中的一種或多種產乙酸細菌培養物。藉由培養基入口302向初級生物反應器301添加培養基。藉由進氣口303將包括任一CO及視情況H2
或CO2
及H2
或其混合物的氣態受質供應到初級生物反應器301，其中藉由細菌將氣體轉化為乙酸鹽。將初級生物反應器301的pH保持在2.5-5或3-4或6.5-7的範圍內，其中pH根據需要視情況藉由添加鹼進行部分控制。乙酸鹽產物以含水培養液流的形式離開初級生物反應器，使用已知方法對該含水培養液流進行處理以移除生物質。將所得的含有乙酸鹽的經處理滲出流304饋入次級需氧生物反應器305。在次級生物反應器305中，藉由例如微藻等微生物將經處理滲出流中的乙酸鹽轉化為脂質及非脂質生物質。藉由氧氣或空氣進氣口306將氧氣供應到需氧醱酵。藉由過濾自次級生物反應器305中移除含有脂質的微藻細胞，從而產生含有脂質及生物質的產物流307及滲透物流308。因為需氧醱酵消耗乙酸鹽，所以培養液的pH隨著乙酸鹽被消耗而增加，並且因此滲透物流308的pH名義上高於含乙酸鹽的培養液物流304的pH。維持次級生物反應器305的稀釋速率，使得滲透物流308的pH保持在例如以下範圍內：5-7；或7.0-7.5；或7.5-9；或10-11。將乙酸鹽耗盡的滲透物流308返回到初級生物反應器301。除了將組成初級生物反應器301培養基的大部分水、鹽、金屬及其他營養素再循環之外，相對於僅藉由向生物反應器培養基直接添加鹼來控制pH的系統，再循環的滲透物流308亦用於顯著降低醱酵pH控制的成本。
經由尾氣管線310移除次級生物反應器305中產生的尾氣並將其引導到氧氣分離單元312。氧氣分離單元可為例如一個或多個PSA單元、膜分離單元、洗滌器、使用一種或多種溶劑的吸附或其任何組合。自氧氣分離單元中的尾氣移除至少氧氣。接著經由管線314將基本上不含O2
的所得CO2
流引導到進氣口303並引入初級生物反應器301。可以藉由管線316將氧氣分離單元移除的O2
再循環至次級生物反應器305。圖2進一步展示了採用視情況存在之水電解槽的實施例。將水流320引入電解槽318中，其中藉由電解產生H2
流，並且經由管線322將H2
流引導到進氣口303並與上文所討論的氣態受質一起引入初級生物反應器301中。類似地，電解槽318產生O2
流，經由管線324將該流引導到次級生物反應器305的進氣口306。實例 材料及方法 培養基：
| 溶液 A | ||||
| NH4 Ac | 3.083 g | KCl | 0.15 g | |
| MgCl2 .6H2 O | 0.4 g | NaCl（任選） | 0.12 g | |
| CaCl2 .2H2 O | 0.294 g | 蒸餾水 | 直到1 L | |
| 溶液 B | ||||
| 生物素 | 20.0 mg | 鈣D-(*)-泛酸鹽 | 50.0 mg | |
| 葉酸 | 20.0 mg | 維生素B12 | 50.0 mg | |
| 吡哆醇HCl | 10.0 mg | p-氨基苯甲酸 | 50.0 mg | |
| 硫胺素HCl | 50.0 mg | 硫辛酸 | 50.0 mg | |
| 核黃素 | 50.0 mg | 蒸餾水 | 到1升 | |
| 煙酸 | 50.0 mg | |||
| 溶液 C | ||||
| 組分 /0.1 M 溶液（ aq ） | 量 /ml | 組分 /0.1 M 溶液（ aq ） | 量 /ml | |
| FeCl3 | 10 ml | Na2 MoO4 | 0.1 ml | |
| CoCl2 | 1 ml | ZnCl2 | 1 ml | |
| NiCl2 | 0.1 ml | Na2 WO4 | 0.1 ml | |
| H3 BO3 | 1 ml | 蒸餾水 | 到1升 | |
| 溶液 D | ||||
| 組分 | 濃度（ H2 O 中） | 組分 | 濃度（ H2 O 中） | |
| FeSO4 | 0.1 mol/L | Na2 MoO4 | 0.01 mol/L | |
| CoCl2 | 0.05mol/L | ZnCl2 | 0.01 mol/L | |
| NiCl2 | 0.05mol/L | H3 BO3 | 0.01 mol/L | |
| 溶液 E | ||||
| 培養基組分 | 量 | 培養基組分 | 量 | |
| MgCl2 .6H2 O | 0.5 g | 溶液B | 10 mL | |
| NaCl | 0.2 g | 溶液C | 10 mL | |
| CaCl2 | 0.2 g | 刃天青（2 mg/L原液） | 1 mL | |
| NaH2 PO4 | 2.04 g | FeCl3 | 1 ml | |
| NH4 Cl | 2.5 g | 半胱氨酸HCl一水合物 | 0.5 g | |
| 85% H3 PO4 | 0.05 ml | 蒸餾水 | 到1升 | |
| KCl | 0.15 g | |||
| 溶液 F | ||||
| 組分 | 量 | 組分 | 量 | |
| FeCl3 （0.1 M溶液） | 30 ml | Na2 S.9H2 0 | 2.8 g | |
| CoCl2 （0.1 M溶液） | 30 ml | 蒸餾水 | 到300 ml | |
| NiCl2 （0.1 M溶液） | 30 ml | |||
兩種類型的所用自產乙醇梭菌屬為寄存於德國生物材料資源中心（DSMZ）並且賦予寄存號DSM 19630及DSM 23693的彼等類型。DSM 23693係自產乙醇梭菌屬菌株DSM19630（德國DSMZ）藉由迭代選擇過程開發而成。
細菌：
伍氏醋酸桿菌獲自德國生物材料資源中心（DSMZ）。賦予細菌的寄存號為DSM 1030。
Na2
S 的製備
——向500ml燒瓶中裝載Na2
S（93.7 g，0.39 mol）及200ml H2
O。攪拌溶液直到鹽溶解，並在恆定的N2
流量下添加硫（25 g，0.1 mol）。在室溫下攪拌2小時後，將現在為澄清的紅棕色液體的「Na2
Sx
」溶液（相對於[Na]大約為4 M，並且相對於硫大約為5 M）轉移到N2
吹掃的用鋁箔包裹的血清瓶中。
製備 Cr （ II ）溶液
——將1 L三頸燒瓶安裝有氣密入口及出口，以允許在惰性氣體下工作並且隨後將期望的產物轉移到合適的儲存燒瓶。向燒瓶中裝載CrCl3
6H2
0（40 g，0.15 mol）、鋅顆粒[20目]（18.3 g，0.28 mol）、汞（13.55 g，1 mL，0.0676 mol）以及500 ml的蒸餾水。在用N2
沖洗一小時之後，將混合物溫熱到約80℃以開始反應。在恆定的N2
流量下攪拌兩小時後，將混合物冷卻到室溫並連續攪拌另外48小時，此時反應混合物已經返回深藍色溶液。將溶液轉移到N2
吹掃的血清瓶中並儲存在冰箱中以供未來使用。 採樣及分析程序：
在30天的期間內間隔地進行培養基樣品採樣
所有樣品均用於在600 nm建立吸光度（分光光度計）以及受質及產物的水準（GC或HPLC）。常規地使用HPLC來定量乙酸鹽的水準。
HPLC ：
HPLC系統Agilent 1100系列。移動相：0.0025 N硫酸。流量及壓力：0.800毫升/分鐘。柱：Alltech IOA；目錄號：9648, 150 x 6.5 mm，粒度5 µm。柱溫度：60℃。偵測器：折射率。偵測器溫度：45℃。
用於樣品製備的方法：
將400 µL樣品及50 µL 0.15 M ZnSO4
及50 µL 0.15 M Ba(OH)2
裝載到艾本德（Eppendorf）管中。將管在12,000 rpm，4℃下離心10分鐘。將200 µL上清液轉移到HPLC小瓶中，並且將5 µL注入HPLC儀器中。
頂空分析：
在具有兩個安裝的通道的Varian CP-4900微GC上執行測量。通道1是在70℃、200 kPa氬氣及4.2秒的反沖時間下運作的10 m分子篩柱，而通道2是在90℃、150 kPa氦氣且無反沖下運作的10 m PPQ柱。兩個通道的噴射器溫度均為70℃。運作時間設定為120秒，但是所關注的所有峰通常在100秒之前溶離。每小時藉由Gas-GC（Varian 4900 Micro-GC）自動分析醱酵罐的頂空。
細胞密度：
藉由在限定的醱酵液等分試樣中對細菌細胞進行計數來測定細胞密度。可替代地，在600 nm測量樣品的吸光度（分光光度計），並根據公開的程序藉由計算測定乾質量。實例 1 ： CO 在生物反應器中醱酵以產生乙酸鹽：
在血清瓶中使自產乙醇梭菌屬的甘油原液復蘇。在80℃下儲存的甘油原液緩慢解凍並使用注射器轉移到血清瓶中。此方法在厭氧室內執行。隨後將接種的血清瓶自厭氧室中移出，並使用含CO的氣體混合物（40% CO、3% H2
、21% CO2
、36% N2
）加壓到總共45 psi。接著將瓶子水平置放在溫度為37℃之培養箱內的振盪器上。在溫育兩天後並確認培養物生長之後，使用瓶子用5 mL的此培養物接種另一組八個含有氣體的血清瓶。如上所述將此等血清瓶溫育另一天，並且接著用於接種在10 L CSTR中製備的5 L液體培養基。將初始含有CO氣體流量設定為100毫升/分鐘，並且將攪拌速度設定為低200 rpm。當微生物開始消耗氣體時，攪拌且將氣體流量增加到400 rpm及550毫升/分鐘。在以分批模式生長兩天後，將醱酵罐以0.25公升/天的稀釋速率連續翻轉。每24小時，稀釋速率增加0.25公升/天到1公升/天的值。
代謝物及微生物生長可以參見圖3。反應器中攜帶之乙酸鹽的濃度介於大約10 g/L與超過20 g/L之間。稀釋速率為1.0。乙酸鹽的生產速率介於10公克/公升/天與超過20公克/公升/天之間。乙酸鹽與乙醇的比例在約5:1到約18:1之間變化。實例 2 ： CO2 及 H2 在生物反應器中醱酵以產生乙酸鹽：
使用Balch等人定義的方案（參見例如Balch等人, (1977) 《國際系統與進化微生物學雜誌》, 27:355-361）製備pH為6.5的培養基。用1500 ml的培養基填充三升反應器。藉由連續噴射N2
自培養基中移除氧氣。將氣體自N2
切換為60% H2
、20% CO2
及20% N2
的混合物持續30分鐘，之後進行接種。接種物（150 ml）來自饋有相同氣體混合物的連續伍氏醋酸桿菌培養物。在接種時將生物反應器保持在30℃下並以200 rpm進行攪拌。在接下來的批量生長期期間，攪拌逐漸增加到600 rpm。由於生物質增加，根據頂空中H2
/CO2
的下降，氣流以50毫升/分鐘遞增。為了補償所產生的乙酸，使用5 M NaOH將pH自動控制為7。在整個醱酵中，以0.2毫升/小時的速率將0.5 M的Na2S溶液泵入醱酵罐中。在1天後連續培養。為了獲得高生物質以及高的氣體消耗，需要將醱酵罐中的乙酸鹽濃度保持在20 g/L以下。此如下達成：以相對高的稀釋速率（D 1.7/天）運作醱酵罐，同時藉由孔徑為0.1 μm的聚碸膜過濾系統（GE醫療生命科學（GE healthcare）中空纖維膜）將微生物保留在醱酵罐中。連續培養物的培養基為不包含複合痕量金屬溶液的溶液A，該溶液施用自動注射泵以1.5毫升/小時的速率單獨饋入。在醱酵方法開始的至少前1天對培養基進行脫氣，並且在整個醱酵方法中連續脫氣。結果
在三十天的期間內，乙酸鹽的濃度為12.5 g/L。乙酸鹽的生產速率平均為每天21.8 g/L。
連續培養物中乙酸的最大濃度為17.76 g/L（296 mM）。實例 3 微藻乙酸鹽利用
最近已經證明，微藻可以利用乙酸鹽作為碳源來生產脂質。Ren等人已經表明，在包括乙酸鹽作為碳源的液體培養基中培養的柵列藻菌產生43.4%的總脂質含量並且最大生物質濃度為1.86 g L-1
（Ren, H., Liu, B., Ma, C., Zhao, L., Ren, N.「使用尼羅紅染色進行分離的新的富含脂質的微藻柵列藻菌株R-16：碳源及氮源以及初始pH對生物質及脂質產生的影響」.《生物燃料技術》, 2013, 6(143)）。
在本發明的系統中，將源自氣態受質的厭氧醱酵乙酸鹽饋入包括如柵列藻菌等微藻的CSTR。在25℃及pH為7的情況下在培養基中培養微藻。將攪拌設定為150 rpm。根據乙酸鹽濃度，如硝酸鈉等氮源亦應以0.1-1.0 g/L範圍存在於培養基中。一旦將培養基中的所有乙酸鹽均轉化為生物質，即可使用已知的萃取方法自生物質中萃取脂質。
本說明書中對任何先前技術的引用不是並且不應當認為是承認或以任何形式暗示該先前技術形成任何國家中所涉及領域中公共常識的一部分。
除上下文另有要求，否則貫穿本說明書及隨後的任何權利要求中，詞語「包括(comprise)」、「包括(comprising)」等應被解釋為包容性意義，而非排他性意義，亦即，「包含但不限於」的意義。
101:初級生物反應器
102:培養基入口
103:進氣口
104:分離器構件
105:分離器
106:第一返回導管
107:滲透物流出口
108:滲出流出口
201:次級生物反應器
204:第一輸出導管
205:分離器
206:第二返回導管
207:滲透物流出口
208:滲出流出口
210:尾氣流
212:氧氣移除單元
214:管線
301:初級厭氧生物反應器
302:培養基入口
303:進氣口
304:含有乙酸鹽的經處理滲出流
305:次級需氧生物反應器
306:氧氣來源
307:含有脂質及生物質的產物流
308:滲透物流
310:尾氣管線
312:氧氣分離單元
314:管線
316:管線
318:電解槽
320:水流
322:管線
324:管線
圖1係本揭示案之具有用於由CO及視情況存在之H2
或CO2
及H2
產生脂質之兩醱酵罐系統之一個實施例的圖，其中將基本上無氧的CO2
流自次級生物反應器再循環至初級生物反應器。
圖2係本揭示案之具有用於由CO及視情況存在之H2
或CO2
及H2
產生脂質之兩醱酵罐系統之一個實施例的圖，其中將基本上無氧的CO2
流自次級生物反應器再循環至初級生物反應器並且其中在初級生物反應器中使用的H2
及在次級生物反應器中使用的O2
係使用電解槽產生。
圖3係示出了在利用CO醱酵時之乙酸鹽濃度的圖。
Claims (18)
- 一種由CO2及H2生產至少一種脂質產物的方法，該方法包括：i.將水流送入電解槽以產生H2流及O2流；ii.將H2流與包括來自工業或氣化製程之CO2的氣流混合以產生具有至少1：4之CO2：H2比的氣態受質；iii.將包括CO2及H2的氣態受質接收於第一生物反應器中，該第一生物反應器容納至少一種厭氧產乙酸細菌於第一液體營養素培養基中的培養物，並且使該氣態受質醱酵以便在第一醱酵液中產生乙酸鹽產物；iv.將該第一醱酵液的至少一部分送入第二生物反應器，該第二生物反應器容納至少一種微藻於第二液體營養素培養基中的培養物，其中該微藻係選自柵藻屬(Scenedesmus)、破囊壺菌屬(Thraustochytrium)、日本壺菌屬(Japonochytrium)、橙壺菌屬(Aplanochytrium)、玲眼蝶屬(Elina)及迷宮藻屬(Labyrinthula)，並且使該乙酸鹽產物醱酵以便在第二醱酵液中產生至少一種脂質產物；v.將來自步驟i之O2流的至少一部分送入第二生物反應器；vi.自該第二生物反應器中獲得至少包括CO2及O2的尾氣；vii.將該尾氣送入第一分離階段以將該尾氣分離為包括CO2之流及包括O2之流，將該包括CO2之流的至少一部分再循環至該第一生物反應器；以及viii.將該包括O2之流送入第二分離階段以自該包括O2之流分離出N2及提供純化之O2流，該純化之O2流再循環至該第二生物反應器。
- 如請求項1之方法，其中該第一生物反應器中乙酸鹽的產生速率為至少10公克/公升/天。
- 如請求項1之方法，其中該厭氧產乙酸細菌的至少一者選自醋 桿菌屬(Acetobacterium)、穆爾氏菌屬(Moorella)、梭菌屬(Clostridium)、火球菌屬(Pyrococcus)、優桿菌屬(Eubacterium)、脫硫桿菌屬(Desulfobacterium)、氧化碳嗜熱菌屬(Carboxydothermus)、產醋菌屬(Acetogenium)、厭氧醋菌屬(Acetoanaerobium)、丁酸桿菌屬(Butyribacterium)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、產醋桿菌屬(Oxobacter)及甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)。
- 如請求項3之方法，其中該第一生物反應器中之厭氧產乙酸細菌的至少一者為伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii)。
- 如請求項1之方法，其中該第二生物反應器中之微藻的至少一者為破囊壺菌屬。
- 如請求項1之方法，其進一步包括由該至少一種脂質產物產生至少一種選自以下的三級產物：氫化衍生的可再生柴油、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯及生物柴油。
- 如請求項1之方法，其進一步包括限制該第二生物反應器中之該等第二液體營養素培養基中的至少一種營養素以增加脂質產生。
- 如請求項7之方法，其中該受限營養素為氮。
- 如請求項1之方法，其中該至少一種脂質產物為多不飽和脂肪酸。
- 如請求項9之方法，其中該多不飽和脂肪酸為ω-3脂肪酸。
- 如請求項10之方法，其中該ω-3脂肪酸為α-亞麻酸、二十碳五烯酸及二十二碳六烯酸中的一種或多種。
- 如請求項1之方法，其中該第一及/第二分離階段係使用變壓吸附、膜分離、用鹼性溶液洗滌、使用溶劑吸附或其任何組合來達成。
- 如請求項1之方法，其進一步包括回收來自該第一生物反應器 之包括CO2及H2的氣態流以及將該氣態流再循環至該第一生物反應器。
- 如請求項1之方法，其進一步包括將該第二醱酵液的至少一部分再循環至該第一生物反應器。
- 如請求項1之方法，其進一步包括自該第一醱酵液中移除該至少一種厭氧產乙酸細菌，隨後將該第一醱酵液的至少一部分送入該第二生物反應器並且將該至少一種厭氧產乙酸細菌再循環至該第一生物反應器。
- 如請求項1之方法，其進一步包括自該第二醱酵液中移除該至少一種微藻以及將該至少一種微藻再循環至該第二生物反應器。
- 如請求項16之方法，其進一步包括在移除該至少一種微藻之後，將該第二醱酵液的剩餘部分送入該第一生物反應器。
- 如請求項1之方法，其中該第二生物反應器以氧氣受限模式操作。
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