JP2023520257A - アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子座位でのノックインを有する微生物 - Google Patents
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Abstract
本明細書では、アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子座位でのＤＮＡのノックインを含む、遺伝子操作された微生物が提供される。１つ以上の天然又は非天然酵素をコードするＤＮＡとのアセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子の置き換えは、発酵安定性並びにガス状基質からの天然及び非天然生産物の生産の増加を含む、ある特定の利点を与える。【選択図】図１
Description
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年６月６日に出願された米国仮特許出願第６３／０３５，７３９号の利益を主張し、この全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年６月６日に出願された米国仮特許出願第６３／０３５，７３９号の利益を主張し、この全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
（政府の権利）
本開示は、米国エネルギー省によって授与された援助協定賞第ＤＥ－ＥＥ０００７５６６号の下、政府支援によって行われた。政府は、本開示においてある特定の権利を有する。
本開示は、米国エネルギー省によって授与された援助協定賞第ＤＥ－ＥＥ０００７５６６号の下、政府支援によって行われた。政府は、本開示においてある特定の権利を有する。
（発明の分野）
本出願は、一般に、遺伝子操作された微生物、並びに二酸化炭素（ＣＯ２）、一酸化炭素（ＣＯ）、及び／又は水素（Ｈ２）を含む基質からの生産物の発酵生産のためのそれらの微生物の使用に関する。
本出願は、一般に、遺伝子操作された微生物、並びに二酸化炭素（ＣＯ２）、一酸化炭素（ＣＯ）、及び／又は水素（Ｈ２）を含む基質からの生産物の発酵生産のためのそれらの微生物の使用に関する。
差し迫った気候変動の緩和は、石炭及び石油のような化石燃料の燃焼を通じて生産されるものなど、温室ガス（greenhouse gas、ＧＨＧ）の排出量の劇的な低減を必要とする。燃料及び化学物質の持続可能な資源は、現在、化石炭素への我々の依存性に著しく取り替わるには不十分であるが、ガス発酵が、ＣＯ、ＣＯ２、及び／又はＨ２などのそのようなガスの生物学的固定のための代替的なプラットフォームとして、持続可能な燃料及び化学物質に最近出現している。特に、ガス発酵技術は、ガス化炭素質物質（例えば、都市固形廃棄物又は農業廃棄物）又は産業廃棄物ガス（例えば、製鋼所又は油精製所から）を含む広範囲の原材料を利用して、エタノール、ジェット燃料、及び様々な他の製品を生産することができる。ガス発酵単独で、原油使用の３０％に取り替わり、世界的なＣＯ２を１０％低減することができるが、任意の破壊的技術と同様に、この可能性が完全に達成される前に多くの技術的課題を克服する必要がある。
特に、ガス状基質からの天然及び非天然生産物の生産のための、改善された安定性を有する追加の微生物が依然として必要とされている。
アセトラクテートデカルボキシラーゼは、２，３－ブタンジオール（２，３－ＢＤＯ）の形成のための重要なステップであり（Ｋｏｐｋｅ，Ａｐｐｌ Ｅｎｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，８０：３３９４－３４０５，２０１４）、この酵素をノックアウトすることは２，３－ＢＤＯ産生を止めることが実証されている（国際公開第２０１３／１１５６５９号）。アセトンなどの他の異種生産物に向かって流動を導くために、アセトラクテートデカルボキシラーゼのノックアウトにより、それらの異種生産物の生産が増加するであろうと予想される。
しかしながら、本発明者らは、これが必ずしもそうではないことを見出した。特に、本発明者らは、アセトラクテートデカルボキシラーゼ座位での異種生産物の生産に関与する遺伝子のノックインが、安定した発酵及び高い生産物力価を達成するために重要であることを発見した。
アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子座位でのＤＮＡのノックインを含む遺伝子操作された微生物が提供される。一実施形態では、ＤＮＡは、アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子のコード領域を、その全体で、又は部分的のいずれかで置き換える。一実施形態では、ＤＮＡは、アセトラクテートデカルボキシラーゼプロモータを置き換えない。
一実施形態では、アセトラクテートデカルボキシラーゼは、ＥＣ４．１．１．５、すなわち（Ｓ）－２－ヒドロキシ－２－メチル－３－オキソブタノエート←→（Ｒ）－２－アセトイン＋ＣＯ２によって定義される活性を有する。一実施形態では、アセトラクテートデカルボキシラーゼは、ｂｕｄＡである。一実施形態では、ｂｕｄＡは、配列番号３を含む。
ノックインが実施された後、微生物は、典型的には、微生物がアセトラクテートデカルボキシラーゼを発現し、２，３－ブタンジオールなどの生産物を生産しないように、官能性アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子を有しない。
一実施形態では、ノックインされたＤＮＡは、１つ以上の酵素をコードする。一実施形態では、これらの酵素は、微生物に対して非天然であり、すなわち、微生物中に天然に存在しない。一実施形態では、これらの酵素は、微生物に対して天然であり、すなわち微生物中に天然に存在し、単に酵素の別のコピーを微生物のゲノムに加える。
一実施形態では、ノックインされたＤＮＡによってコードされた酵素は、アセトラクテートデカルボキシラーゼプロモータ、例えば、ＰｂｕｄＡの制御下にある。一実施形態では、ＤＮＡは、Ｐｆｅｒプロモータなどのプロモータを含む。一実施形態では、酵素は、アセトラクテートデカルボキシラーゼプロモータ及び少なくとも１つの他のプロモータの両方の制御下にある。一実施形態では、酵素は、両方のＰｂｕｄＡ及びＰｆｅｒの制御下にある。
一実施形態では、アセトン経路は、アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子座位でノックインされる。アセトン経路は、チオラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、及びデカルボキシラーゼを含み得る。一実施形態では、デカルボキシラーゼは、アセトアセテートデカルボキシラーゼ又はアルファ－ケトイソバレレートデカルボキシラーゼである。例えば、アセトン経路は、ｔｈｌＡ、ｃｔｆＡＢ、及びａｄｃ又はｔｈｌＡ、ｃｔｆＡＢ、及びｋｉｖｄを含み得る。存在する場合、ｓｅｃＡｄｈなどの一級－二級アルコールデヒドロゲナーゼは、アセトンをイソプロパノールに変換する。この酵素をコードする遺伝子における破壊的変異（例えば、ノックアウト変異）の導入は、アセトンの生産をもたらし、一方、この酵素の発現は、イソプロパノールの生産をもたらすであろう。したがって、宿主微生物の遺伝的背景に応じて、アセトン経路の導入は、アセトン又はイソプロパノールのいずれかの生産をもたらすであろう。アセトン及びイソプロパノールを生産するための微生物の操作は、国際公開第２０１２／１１５５２７号に記載されている。一級－二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性をノックアウトするための微生物の操作は、国際公開第２０１５／０８５０１５号に記載されている。
一実施形態では、微生物は、アセトン経路を含み、微生物がアセトンを生産するように、一級－二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子における破壊的変異も含む。一実施形態では、微生物は、アセトン経路を含み、微生物がイソプロパノールを生産するように、官能的一級－二級アルコールデヒドロゲナーゼも含む。
実際、ノックインされたＤＮＡは、本質的に任意の酵素又は酵素経路をコードし得る。例えば、ノックインされたＤＮＡによってコードされた酵素は、１－ブタノール、ブチレート、ブテン、ブタジエン、メチルエチルケトン、エチレン、アセトン、イソプロパノール、脂質、３－ヒドロキシプロピオネート、テルペン、イソプレン、脂肪酸、２－ブタノール、１，２－プロパンジオール、１－プロパノール、１－ヘキサノール、１－オクタノール、コリスマート由来の生産物、３－ヒドロキシブチレート、１，３－ブタンジオール、２－ヒドロキシイソブチレート若しくは２－ヒドロキシイソブタン酸、イソブチレン、アジピン酸、１，３－ヘキサンジオール、３－メチル－２－ブタノール、２－ブテン－１－オール、イソバレレート、イソアミルアルコール、又はモノエチレングリコールの生産を可能にし得る。
一実施形態では、微生物は、Ｃ１固定微生物である。一実施形態では、微生物は、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物である。一実施形態では、微生物は、細菌である。一実施形態では、微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒから選択される属のメンバーである。
更に、ガス状基質の存在下で微生物を培養することを含む、生産物を生産する方法が提供される。一実施形態では、ガス状基質は、ＣＯ、ＣＯ２、及び／又はＨ２を含むＣ１炭素源を含む。一実施形態では、ガス状基質は、合成ガス又は産業廃棄物ガスを含む。一実施形態では、生産物は、１－ブタノール、ブチレート、ブテン、ブタジエン、メチルエチルケトン、エチレン、アセトン、イソプロパノール、脂質、３－ヒドロキシプロピオネート、テルペン、イソプレン、脂肪酸、２－ブタノール、１，２－プロパンジオール、１－プロパノール、１－ヘキサノール、１－オクタノール、コリスマート由来の生産物、３－ヒドロキシブチレート、１，３－ブタンジオール、２－ヒドロキシイソブチレート若しくは２－ヒドロキシイソブタン酸、イソブチレン、アジピン酸、１，３－ヘキサンジオール、３－メチル－２－ブタノール、２－ブテン－１－オール、イソバレレート、イソアミルアルコール、又はモノエチレングリコールである。
定義及び背景
別段の定めがない限り、本明細書全体で使用される以下の用語は、以下のように定義される。
別段の定めがない限り、本明細書全体で使用される以下の用語は、以下のように定義される。
「発酵」という用語は、基質中の化学変化を引き起こす代謝プロセスとして解釈されるべきである。例えば、発酵プロセスは、１つ以上の基質を受け取り、１つ以上の微生物の利用を通じて１つ以上の生産物を生産する。「発酵」、「ガス発酵」などの用語は、ガス化によって生産される合成ガスなどの１つ以上の基質を受け取り、１つ以上のＣ１固定微生物の利用を通じて１つ以上の生産物を生産するプロセスとして解釈されるべきである。好ましくは、発酵プロセスは、１つ以上のバイオリアクターの使用を含む。発酵プロセスは、「バッチ」又は「連続」のいずれかとして説明され得る。「バッチ発酵」は、バイオリアクターが微生物とともに、原料、すなわち炭素源で満たされ、発酵が完了するまで生産物がバイオリアクター内に留まる発酵プロセスを説明するために使用される。「バッチ」プロセスでは、発酵が完了した後、生産物が抽出され、バイオリアクターは、次の「バッチ」が始まる前に洗浄される。「連続発酵」は、発酵プロセスがより長期間にわたって延長され、発酵中に生成物及び／又は代謝産物が抽出される発酵プロセスを説明するために使用される。好ましくは、発酵プロセスは、連続的である。
微生物に関して使用されるとき、「非自然発生」という用語は、微生物が、言及される種の野生型株を含む言及される種の自然発生株において見られない少なくとも１つの遺伝子修飾を有することを意味することが意図される。非自然発生微生物は、典型的には、実験室又は研究施設で開発される。
「遺伝子修飾」、「遺伝子改変」、又は「遺伝子操作」という用語は、微生物のゲノム又は核酸の人の手による操作を広く指す。同様に、「遺伝子修飾された」、「遺伝子改変された」、又は「遺伝子操作された」という用語は、そのような遺伝子修飾、遺伝子改変、又は遺伝子操作を含む微生物を指す。これらの用語は、実験室で生成された微生物と自然発生の微生物を区別するために使用され得る。遺伝子修飾の方法は、例えば、異種遺伝子発現、遺伝子又はプロモータの挿入又は欠失、核酸変異、改変遺伝子発現又は不活性化、酵素工学、指向性進化、知識ベース設計、ランダム変異導入法、遺伝子シャフリング、及びコドン最適化を含む。
例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａなどの微生物の代謝工学は、エタノールなどの天然の代謝産物以外の多くの重要な燃料及び化学分子を生産する能力を大いに拡大することができる。しかしながら、最近までＣｌｏｓｔｒｉｄｉａは、遺伝的に扱いにくいとみなされたため、一般に、広範な代謝工学努力は立ち入られなかった。近年、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａについては、ゲノム操作のためのいくつかの異なる方法が開発され、これには、イントロンベースの方法（Ｋｕｅｈｎｅ，Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，３８９－４０７，２０１１）、対立遺伝子交換方法（ＡＣＥ）（Ｈｅａｐ，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，４０：ｅ５９，２０１２；Ｎｇ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８：ｅ５６０５１，２０１３）、トリプルクロス（Ｌｉｅｗ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７：６９４，２０１６）、Ｉ－ＳｃｅＩを介して媒介される方法（Ｚｈａｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０８：４９－６０，２０１５）、ＭａｚＦ（Ａｌ－Ｈｉｎａｉ，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７８：８１１２－８１２１，２０１２）、又はその他（Ａｒｇｙｒｏｓ，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７７：８２８８－８２９４，２０１１）、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ（Ｕｅｋｉ，ｍＢｉｏ，５：ｅ０１６３６－０１６１４，２０１４）、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｎａｇａｒａｊｕ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，９：２１９，２０１６）が含まれる。しかしながら、少数以上の遺伝的変化を繰り返し導入することは、遅い、骨の折れるサイクル時間、及び種にわたるこれらの遺伝学的技術の導入性に対する制限により、依然として非常に困難である。更に、我々は、Ｃ１取り込み、変換、及び生産物合成に向かう炭素／エネルギー／レドックスブローを最大にするであろう修飾を確実に予測するのに、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉａにおけるＣ１代謝をまだ十分に理解していない。したがって、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａにおける標的経路の導入は、単調で退屈な、時間がかかるプロセスのままである。
「組換え」は、核酸、タンパク質、又は微生物が、遺伝子修飾、操作、又は組換えの生成物であることを示す。一般に、「組換え」という用語は、微生物の２つ以上の異なる株又は種など、複数の源に由来する遺伝物質を含有するか、又はそれによってコードされる核酸、タンパク質、又は微生物を指す。
「野生型」は、変異体又はバリアント形態とは区別されるように天然に存在する、生物、株、遺伝子、又は特性の典型的な形態を指す。
「内在性」は、本開示の微生物が由来する野生型又は親微生物に存在又は発現される核酸又はタンパク質を指す。例えば、内在性遺伝子は、本開示の微生物が由来する野生型又は親微生物に天然に存在する遺伝子である。一実施形態では、内在性遺伝子の発現は、外来性プロモータなどの外来性調節エレメントによって制御され得る。
「外来性」は、本開示の微生物の外側に起源がある核酸又はタンパク質を指す。例えば、外来性遺伝子又は酵素は、人工的又は組換え的に作成され、本開示の微生物に導入されるか、又はそこに発現され得る。外来性遺伝子又は酵素はまた、異種微生物から単離され、本開示の微生物に導入されるか、又はそこに発現され得る。外来性核酸は、本開示の微生物のゲノムに組み入れるように、又は本開示の微生物、例えばプラスミドにおける染色体外の状態で留まるように適合され得る。
「異種」は、本開示の微生物が由来する野生型又は親微生物に存在しない核酸又はタンパク質を指す。例えば、異種遺伝子又は酵素は、異なる株又は種に由来し、本開示の微生物に導入されるか、又は発現され得る。異種遺伝子又は酵素は、異なる株又は種で生じる形態で、本開示の微生物に導入されるか、又はそこに発現され得る。代替的に、異種遺伝子又は酵素は、いくつかの方法で、例えば、本開示の微生物における発現のためにそれをコドン最適化することによって、又は機能を変化させるように、例えば酵素活性の方向を逆転させるように、若しくは基質特異性を変化させるように、それを操作することによって修飾され得る。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか、又はそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得て、既知又は未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析から定義される座位（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（short interfering RNA、ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（short-hairpin RNA、ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（micro-RNA、ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体などの１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの組織化の前又は後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは、重合の後、例えば標識構成要素との共役により、更に修飾され得る。
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡ若しくは他のＲＮＡ転写物へ）転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが、続いて、ペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質へ翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と称され得る。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、直鎖であっても分岐鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって割り込まれていてもよい。この用語はまた、修飾されたアミノ酸ポリマーを包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識成分との共役などの任意の他の操作がある。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン、Ｄ又はＬ光学異性体の両方、並びにアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含む天然及び／又は非天然若しくは合成アミノ酸を含む。
「酵素活性」又は単に「活性」は、広範には、酵素の活性、酵素の量、又は反応を触媒するための酵素の可用性を含むがこれらに限定されない、酵素的な活性を指す。したがって、酵素活性を「増加させること」は、酵素の活性を増大させること、酵素の量を増加させること、又は反応を触媒するための酵素の可用性を増加させることを含む。同様に、酵素活性を「低下させること」は、酵素の活性を低下させること、酵素の量を低下させること、又は反応を触媒するための酵素の可用性を低下させることを含む。
「変異した」は、本開示の微生物が由来する野生型又は親微生物と比較して、本開示の微生物において修飾されている核酸又はタンパク質を指す。一実施形態では、変異は、酵素をコードする遺伝子中の欠失、挿入、又は置換であってもよい。別の実施形態では、変異は、酵素中の１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換であってもよい。
具体的には、「破壊的変異」は、遺伝子又は酵素の発現又は活性を低減又は排除（すなわち「破壊する」）する変異である。破壊的変異は、遺伝子又は酵素を、部分的に不活性化し得るか、完全に不活性化し得るか、又は欠失し得る。破壊的変異は、酵素によって生成される生成物の生合成を低減、防止、又は阻害する任意の変異であり得る。破壊的変異は、ノックアウト（knockout、ＫＯ）変異であり得る。破壊はまた、遺伝子、タンパク質、又は酵素の発現又は活性を低減するが、完全に排除しないノックダウン（knockdown、ＫＤ）変異でもあり得る。ＫＯは、生産物の収率を高めるのに一般的に有効であるが、特に非増殖結合生産物について、利益を上回る増殖欠陥又は遺伝的不安定性の不利益をもたらす場合がある。破壊的変異は、例えば、酵素をコードする遺伝子における変異、酵素をコードする遺伝子の発現に関与する遺伝子調節エレメントにおける変異、酵素の活性を低下又は阻害するタンパク質を生成する核酸の導入、又は酵素の発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ）若しくはタンパク質の導入を含み得る。破壊的変異は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して導入されてもよい。
破壊的変異の導入は、本開示の微生物が由来する親微生物と比較して、標的生産物を生産しないか、又は生産物を実質的に生産しないか、又は標的生産物の量を減少させる、本開示の微生物をもたらす。例えば、本開示の微生物は、標的生産物を生産しないか、又は親微生物よりも、少なくとも約１％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは９５％少ない標的生産物を生産し得る。例えば、本開示の微生物は、約０．００１、０．０１、０．１０、０．３０、０．５０、又は１．０ｇ／Ｌ未満の生産物を生産し得る。
「ノックイン」は、遺伝子座位におけるＤＮＡの置換又は遺伝子座位における新しいＤＮＡの挿入を伴う遺伝子操作方法を指す。多くの場合、ノックインは、遺伝子を１つ以上の異なる遺伝子と置き換えるであろう。例えば、アセトラクテートデカルボキシラーゼ（ｂｕｄＡ）遺伝子は、１つ以上の異なる遺伝子と、全体的又は部分的に置き換えられ得る。一実施形態では、遺伝子のコード領域のみが置き換えられる。一実施形態では、任意のプロモータ領域を含む、遺伝子のオペロン全体が置き換えられる。
「コドン最適化」は、特定の株又は種における核酸の最適化又は改善された翻訳のための、遺伝子などの核酸の変異を指す。コドンの最適化により、より速い翻訳速度、又はより高い翻訳の精度を生じることができる。好ましい実施形態では、本開示の遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、又はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉでの発現のためにコドン最適化される。更に好ましい実施形態では、本開示の遺伝子は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３で寄託されている、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＺ１５６１での発現のためにコドン最適化される。
「過剰発現した」は、本開示の微生物が由来する野生型又は親微生物と比較して、本開示の微生物における核酸又はタンパク質の発現の増加を指す。過剰発現は、遺伝子コピー数、遺伝子転写速度、遺伝子翻訳速度、又は酵素分解速度の変更を含む、当該技術分野において既知の任意の手段によって達成することができる。
「バリアント」という用語は、核酸及びタンパク質の配列が、従来技術分野において開示されるか又は本明細書に例示される参照核酸及びタンパク質の配列などの、参照核酸及びタンパク質の配列から変化する、核酸及びタンパク質を含む。本開示は、参照核酸又はタンパク質と実質的に同じ機能を実行するバリアント核酸又はタンパク質を使用して実践され得る。例えば、バリアントタンパク質は、参照タンパク質と実質的に同じ機能を実行するか、又は実質的に同じ反応を触媒する場合がある。バリアント遺伝子は、参照遺伝子と同じ、又は実質的に同じタンパク質をコードしてもよい。バリアントプロモータは、参照プロモータと実質的に同じ、１つ以上の遺伝子の発現を促進するための能力を有してもよい。
そのような核酸又はタンパク質は、本明細書では「機能的に同等のバリアント」と称され得る。例として、核酸の機能的に同等のバリアントには、対立遺伝子バリアント、遺伝子の断片、変異した遺伝子、多型などが含まれ得る。他の微生物からの相同遺伝子も、機能的に同等なバリアントの例である。これらとしては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、又はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉなどの種の相同遺伝子が挙げられ、それらの詳細は、Ｇｅｎｂａｎｋ又はＮＣＢＩなどのウェブサイトで公開されており入手可能である。機能的に同等なバリアントとしてはまた、特定の微生物のコドン最適化の結果として配列が変化している核酸が挙げられる。核酸の機能的に同等なバリアントは、好ましくは、参照核酸と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、又はそれを超える核酸配列同一性（相同性パーセント）を有する。タンパク質の機能的に同等なバリアントは、好ましくは、参照タンパク質と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、又はそれを超えるアミノ酸同一性（相同性パーセント）を有する。バリアントの核酸又はタンパク質の機能的同等性は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して評価することができる。
核酸は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、本開示の微生物に送達され得る。例えば、核酸は、裸の核酸として送達されてもよく、リポソームなどの１つ以上の薬剤とともに配合されてもよい。核酸は、必要に応じて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はそれらの組み合わせであってもよい。ある特定の実施形態では、制限阻害剤を使用してもよい。追加のベクターには、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、及び人工染色体が含まれ得る。好ましい実施形態では、核酸は、プラスミドを使用して本開示の微生物に送達される。例として、形質転換（形質導入又はトランスフェクションを含む）は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、化学的又は自然のコンピテンス、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘発、又は共役によって達成され得る。活性制限酵素系を有するある特定の実施形態では、核酸を微生物に導入する前に核酸をメチル化する必要があり得る。
更に、核酸は、特定の核酸の発現を増加又は別の方法で制御するために、プロモータなどの調節エレメントを含むように設計されてもよい。プロモータは、構成的プロモータ又は誘導性プロモータであり得る。理想的には、プロモータは、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路プロモータ、ピルベート、フェレドキシンオキシドレダクターゼプロモータ、Ｒｎｆ複合体オペロンプロモータ、ＡＴＰシンターゼオペロンプロモータ、又はホスホトランスアセチラーゼ／アセテートキナーゼオペロンプロモータである。
「微生物」は、顕微鏡生物、特に細菌、古細菌、ウイルス、又は真菌である。本開示の微生物は、典型的には細菌である。本明細書で使用される場合、「微生物」の引用は、「細菌」を網羅するものと解釈されるべきである。
「親微生物」は、本開示の微生物を生成するために使用される微生物である。親微生物は、自然発生型の微生物（すなわち、野生型微生物）又は以前に修飾されたことのある微生物（すなわち、変異体又は組換え微生物）であり得る。本開示の微生物は、親微生物において発現又は過剰発現されなかった１つ以上の酵素を発現又は過剰発現するように修飾され得る。同様に、本開示の微生物は、親微生物によって含有されなかった１つ以上の遺伝子を含有するように修飾され得る。本開示の微生物は、親微生物において発現されたより少ない量の１つ以上の酵素を発現しないように、又は発現するようにも修飾され得る。一実施形態では、親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、又はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉである。好ましい実施形態では、親微生物は、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｂｅ ７Ｂ，Ｄ－３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに所在するＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）に、ブダペスト条約の条項下で、２０１０年６月７日に寄託され、受託番号ＤＳＭ２３６９３を付与された、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＺ１５６１である。この株は、国際公開第２０１２／０１５３１７号として公開されている国際特許出願第ＮＺ２０１１／０００１４４号に記載されている。
「から誘導される」という用語は、新しい核酸、タンパク質、又は微生物を生成するように、核酸、タンパク質、又は微生物が異なる（例えば、親又は野生型）核酸、タンパク質、又は微生物から修飾又は適合されることを示す。そのような修飾又は適合は、典型的には、核酸又は遺伝子の挿入、欠失、変異、又は置換を含む。一般に、本開示の微生物は、親微生物に由来する。一実施形態では、本発明の親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、又はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉに由来する。好ましい実施形態では、本開示の微生物は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３の下で寄託される、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＺ１５６１に由来する。
本開示の微生物は、官能的特性に基づいて更に分類され得る。例えば、本開示の微生物は、Ｃ１固定微生物、嫌気性生物、アセトゲン、エタノロゲン、カルボキシド栄養生物（carboxydotroph）、及び／又はメタン資化性菌（methanotroph）であり得るか、又はそれらに由来し得る。表１は、微生物の代表的なリストを提供し、微生物の機能特性を特定する。
「Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ」は、例えば、Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１７８４：１８７３－１８９８，２００８に記載される炭素固定のＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を指す。「Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物」は、予想通り、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む微生物を指す。一般に、本開示の微生物は、天然のＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含有する。本明細書において、ウッド－ユングダール経路は、天然の未修飾のウッド－ユングダール経路であり得るか、あるいはＣＯ、ＣＯ２、及び／又はＨ２をアセチル－ＣｏＡに変換するように依然として機能する限り、ある程度の遺伝子修飾（例えば、過剰発現、異種発現、ノックアウトなど）を有するウッド－ユングダール経路であり得る。
「Ｃ１」は、１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、又はＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１酸素化物」は、少なくとも１つの酸素原子も含む１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、又はＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１炭素源」は、本開示の微生物のための部分的又は唯一の炭素源として機能する１つの炭素分子を指す。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、ＣＨ３ＯＨ、又はＣＨ２Ｏ２のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、Ｃ１炭素源は、ＣＯ及びＣＯ２のうちの１方又は両方を含む。「Ｃ１固定微生物」は、Ｃ１炭素源から１つ以上の生産物を生産する能力を有する微生物である。典型的には、本開示の微生物は、Ｃ１固定細菌である。好ましい実施形態では、本開示の微生物は、表１で特定されるＣ１固定微生物に由来する。
「嫌気性生物」は、増殖のために酸素を必要としない微生物である。嫌気性生物は、酸素が特定の閾値を超えて存在する場合、負の反応を示し得るか、又は死滅し得る。しかしながら、いくつかの嫌気性生物は、低レベルの酸素（例えば、０．０００００１～５％の酸素）を許容可能である。典型的には、本開示の微生物は、嫌気性生物である。好ましい実施形態では、本開示の微生物は、表１で特定される嫌気性生物に由来する。
「アセトゲン」は、エネルギー節約のため、並びにアセテートなどのアセチル－ＣｏＡ及びアセチル－ＣｏＡ由来の生産物の合成のためのその主要機構としてＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を使用する、偏性嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１７８４：１８７３－１８９８，２００８）。特に、アセトゲンは、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を、（１）ＣＯ２からのアセチル－ＣｏＡの還元合成のための機構、（２）末端電子受容、エネルギー節約プロセス、（３）細胞炭素の合成におけるＣＯ２の固定（同化）のための機構として使用する（Ｄｒａｋｅ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．３５４，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）。全ての自然発生するアセトゲンは、Ｃ１固定、嫌気性、独立栄養性、及び非メタン資化性である。典型的には、本開示の微生物は、アセトゲンである。好ましい実施形態では、本開示の微生物は、表１で特定されるアセトゲンに由来する。
「エタノロゲン」は、エタノールを生成する、又は生成することが可能である微生物である。典型的には、本開示の微生物はエタノロゲンである。好ましい実施形態では、本開示の微生物は、表１で特定されるエタノロゲンに由来する。
「独立栄養生物」は、有機炭素の不在下でも増殖することが可能な微生物である。代わりに、独立栄養生物は、ＣＯ及び／又はＣＯ２などの無機炭素源を使用する。典型的には、本開示の微生物は、独立栄養生物である。好ましい実施形態では、本開示の微生物は、表１で特定される独立栄養生物に由来する。
「カルボキシド栄養生物」は、炭素及びエネルギーの唯一の供給源としてＣＯを利用することが可能な微生物である。典型的には、本開示の微生物は、カルボキシド栄養生物である。好ましい実施形態では、本開示の微生物は、表１で特定されるカルボキシド栄養生物に由来する。
「メタン資化性菌」は、炭素とエネルギーの唯一の供給源としてメタンを利用することが可能な微生物である。特定の実施形態では、本開示の微生物は、メタン資化性菌であるか、又はメタン資化性菌に由来する。他の実施形態では、本開示の微生物は、メタン資化性菌ではないか、又はメタン資化性菌に由来しない。
より広くは、本開示の微生物は、表１で特定される任意の属又は種に由来し得る。例えば、微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属のメンバーであり得る。特に、微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｖｕｉからなる群から選択される親細菌に由来し得る。
好ましい実施形態では、本開示の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ種、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ種を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのクラスターに由来する。これらの種は、Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５－３５１，１９９４（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２－２３６，１９９３（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、及びＨｕｈｎｋｅ，国際公開第２００８／０２８０５５号（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ）によって最初に報告され、特徴付けられた。
これらの３つの種は、多くの類似点を有する。特に、これらの種は全て、Ｃ１固定、嫌気性、アセトゲン性、エタノロゲン性、及びカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属メンバーである。これらの種は、同様の遺伝子型及び表現型並びにエネルギー節約及び発酵代謝のモードを有する。更に、これらの種は、９９％を超えて同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡを有するクロストリジウムｒＲＮＡ相同性群Ｉ内に群生し、約２２～３０ｍｏｌ％のＤＮＡ Ｇ＋Ｃ含有量を有し、グラム陽性であり、同様の形態及びサイズを有し（０．５～０．７×３～５μｍの対数成長細胞）、中温性であり（３０～３７℃で最適に成長する）、約４～７．５の同様のｐＨ範囲を有し（約５．５～６の最適ｐＨを有する）、シトクロムを欠いており、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを節約する。また、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの種において示されている（Ｐｅｒｅｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１０６６－１０７７，２０１２）。重要なことに、これらの種は全て、ＣＯを含有するガスで強い独立栄養増殖も示し、主な発酵生産物としてエタノール及びアセテート（又は酢酸）も生産し、ある特定の条件下で少量の２，３－ブタンジオール及び乳酸も生産する。
しかしながら、これら３つの種は、いくつかの違いも有する。これらの種は、ウサギの腸からのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、養鶏場の廃棄物からのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、及び淡水堆積物からのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉの、異なる源から単離された。これらの種は、様々な糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸、クエン酸）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、及び他の基質（例えば、べタイン、ブタノール）の利用において異なる。更に、これらの種は、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求性において異なる。これらの種は、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子及びタンパク質の核酸及びアミノ酸配列に違いを有するが、これらの遺伝子及びタンパク質の一般的な組織及び数は、全ての種で同じであることがわかっている（Ｋｏｐｋｅ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０－３２５，２０１１）。
したがって、要約すると、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、又はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉの特徴の多くは、その種に特有ではなく、むしろＣ１固定、嫌気性、アセトゲン性、エタノロゲン性、及びカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属のメンバーのこのクラスターの一般的な特徴である。しかしながら、これらの種は、実際は、全く異なるため、これらの種のうちの１つの遺伝子修飾又は操作は、これらの種のうちの別のものにおいては同一の効果がない場合がある。例えば、増殖、性能、又は生成物生成における違いが観察され得る。
本開示の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、又はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉの分離株又は変異体にも由来し得る。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの分離株及び変異体としては、ＪＡ１－１（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５－３５１，１９９４）、ＬＺ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（国際公開第２００９／０６４２００号）、及びＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）（国際公開第２０１２／０１５３１７号）が挙げられる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの分離株及び変異体としては、ＡＴＣＣ４９５８７（Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２－２３６，１９９３）、ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８、ＡＴＣＣ５５３８３）、ＥＲＩ－２（ＡＴＣＣ５５３８０）（米国特許第５，５９３，８８６号）、Ｃ－０１（ＡＴＣＣ５５９８８）（米国特許第６，３６８，８１９号）、Ｏ－５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（米国特許第６，３６８，８１９号）、及びＯＴＡ－１（Ｔｉｒａｄｏ－Ａｃｅｖｅｄｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇａｓ ｕｓｉｎｇ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ，ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）が挙げられる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉの分離株及び変異体としては、ＰＩ １（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－６２２、ＡＴＣＣ ＰＴＡ－７８２６）（国際公開第２００８／０２８０５５号）が挙げられる。
「基質」は、本開示の微生物のための炭素及び／又はエネルギー源を指す。一般に、基質は、ガス状であり、Ｃ１炭素源、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、及び／又はＣＨ４を含む。好ましくは、基質は、ＣＯ又はＣＯ＋ＣＯ２のＣ１炭素源を含む。基質は、Ｈ２、Ｎ２、又は電子などの他の非炭素構成要素を更に含み得る。
基質は、概して、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｏｌ％のＣＯなどの少なくともいくらかの量のＣＯを含む。基質は、約２０～８０、３０～７０、又は４０～６０ｍｏｌ％のＣＯなど、ある範囲のＣＯを含み得る。好ましくは、基質は、約４０～７０ｍｏｌ％のＣＯ（例えば、製鋼所又は高炉ガス）、約２０～３０ｍｏｌ％のＣＯ（例えば、塩基性酸素高炉ガス）、又は約１５～４５ｍｏｌ％のＣＯ（例えば、合成ガス）を含む。いくつかの実施形態では、基質は、約１～１０又は１～２０ｍｏｌ％のＣＯなどの比較的低い量のＣＯを含み得る。本開示の微生物は、典型的には、基質中のＣＯの少なくとも一部分を生産物に変換する。いくつかの実施形態では、基質は、ＣＯを含まないか、又は実質的に含まない（１モル％未満）。
基質は、いくらかの量のＨ２を含み得る。例えば、基質は、約１、２、５、１０、１５、２０、又は３０ｍｏｌ％のＨ２を含み得る。いくつかの実施形態では、基質は、約６０、７０、８０、又は９０ｍｏｌ％のＨ２などの比較的多量のＨ２を含み得る。更なる実施形態では、基質は、Ｈ２を含まないか、又は実質的に含まない（１モル％未満）。
基質は、いくらかの量のＣＯ２を含み得る。例えば、基質は、約１～８０又は１～３０ｍｏｌ％のＣＯ２を含み得る。いくつかの実施形態では、基質は、約２０、１５、１０、又は５ｍｏｌ％未満のＣＯ２を含み得る。別の実施形態では、基質は、ＣＯ２を含まないか、又は実質的に含まない（１モル％未満）。
基質は典型的にはガス状であるが、基質はまた、代替的な形態で提供されてもよい。例えば、基質は、マイクロバブル分散物発生装置を使用して、ＣＯ含有ガスで飽和した液体中に溶解されてもよい。更なる例として、基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。
基質及び／又はＣ１炭素源は、自動車の排出ガス又はバイオマスガス化からなど、産業プロセスの副産物として得られる、又は何らかの他の源からの廃ガスであってもよい。特定の実施形態では、産業プロセスは、製鋼所製造などの鉄金属生成物製造、非鉄金属生成物製造、石油精製、石炭ガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール生成、及びコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、基質及び／又はＣ１炭素源は、任意の簡便な方法を使用して、それが大気中に放出される前に産業プロセスから捕捉されてもよい。
基質及び／又はＣ１炭素源は、石炭若しくは精錬残渣のガス化、バイオマス若しくはリグノセルロース物質のガス化、又は天然ガスの改質によって得られる合成ガスなど、合成ガスであってもよい。別の実施形態では、合成ガスは、都市固形廃棄物又は産業固形廃棄物のガス化から得てもよい。
基質の組成は、反応の効率及び／又は費用に著しい影響を及ぼし得る。例えば、酸素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵プロセスの効率を低減させ得る。基質の組成に応じて、基質を処理、スクラブ、又は濾過して、毒素、望ましくない成分、又はちり粒子などのいかなる望ましくない不純物も除去すること、及び／又は所望の成分の濃度を増加させることが望ましくあり得る。
特定の実施形態では、発酵は、糖、デンプン、リグニン、セルロース、又はヘミセルロースなどの炭水化物基質の不在下で実施される。
本開示の微生物は、１つ以上の生産物を生産するようにガス流とともに培養され得る。例えば、本開示の微生物は、エタノール（国際公開第２００７／１１７１５７号）、アセテート（国際公開第２００７／１１７１５７号）、１－ブタノール（国際公開第２００８／１１５０８０号、国際公開第２０１２／０５３９０５号、及び国際公開第２０１７／０６６４９８号）、ブチレート（国際公開第２００８／１１５０８０号）、２，３－ブタンジオール（国際公開第２００９／１５１３４２号及び国際公開第２０１６／０９４３３４号）、ラクテート（国際公開第２０１１／１１２１０３号）、ブテン（国際公開第２０１２／０２４５２２号）、ブタジエン（国際公開第２０１２／０２４５２２号）、メチルエチルケトン（２－ブタノン）（国際公開第２０１２／０２４５２２号及び国際公開第２０１３／１８５１２３号）、エチレン（国際公開第２０１２／０２６８３３号）、アセトン（国際公開第２０１２／１１５５２７号）、イソプロパノール（国際公開第２０１２／１１５５２７号）、脂質（国際公開第２０１３／０３６１４７号）、３－ヒドロキシプロピオネート（３－ＨＰ）（国際公開第２０１３／１８０５８１号）、イソプレンを含むテルペン（国際公開第２０１３／１８０５８４号）、脂肪酸（国際公開第２０１３／１９１５６７号）、２－ブタノール（国際公開第２０１３／１８５１２３号）、１，２－プロパンジオール（国際公開第２０１４／０３６９１５２号）、１－プロパノール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、１－ヘキサノール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、１－オクタノール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、コリスマート由来の生産物（国際公開第２０１６／１９１６２５号）、３－ヒドロキシブチレート（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、１，３－ブタンジオール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、２－ヒドロキシイソブチレート又は２－ヒドロキシイソブチル酸（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、イソブチレン（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、アジピン酸（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、１，３－ヘキサンジオール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、３－メチル－２－ブタノール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、２－ブテン－１－オール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、イソバレレート（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、イソアミルアルコール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、及びモノエチレングリコール（国際公開第２０１９／１２６４００号）を生産することがきるか、又はこれらを生産するように操作することができる。特定の実施形態では、微生物バイオマス自体が生成物とみなされ得る。これらの生産物は、更に変換されて、ディーゼル、ジェット燃料、及び／又はガソリンのうちの少なくとも１つの成分を生産し得る。加えて、微生物バイオマスは更に処理されて、単細胞タンパク質（single cell protein、ＳＣＰ）を生成し得る。
「天然生成物」は、遺伝子修飾されていない微生物によって生成される生成物である。例えば、エタノール、アセテート、及び２，３－ブタンジオールは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉの天然生産物である。「非天然生成物」は、遺伝子組換えされた微生物によって生成されるが、遺伝子組換えされた微生物が由来する遺伝子組換えされていない微生物によって生成されない生成物である。
「選択性」は、微生物によって生成される全発酵生成物の生成に対する標的生成物の生成の比率を指す。本開示の微生物は、ある特定の選択性で、又は最小の選択性で生産物を生産するように操作され得る。一実施形態では、標的生産物は、本開示の微生物によって生産される全発酵生産物の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、又は７５％を占める。一実施形態では、標的生産物は、本開示の微生物が少なくとも１０％の標的生産物に対して選択性を有するように、本開示の微生物によって生産される全発酵生産物の少なくとも１０％を占める。別の実施形態では、標的生産物は、本開示の微生物が少なくとも３０％の標的生産物に対して選択性を有するように、本開示の微生物によって生産される全発酵生産物の少なくとも３０％を占める。
典型的には、培養は、バイオリアクター中で実施される。「バイオリアクター」という用語は、連続撹拌槽反応器（continuous stirred tank reactor、ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（immobilized cell reactor、ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（trickle bed reactor、ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、又はガス－液体接触に適した他の容器若しくは他のデバイスなどの１つ以上の容器、塔、又は配管配置からなる培養／発酵デバイスを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、第１の増殖反応器及び第２の培養／発酵反応器を含み得る。基質は、これらの反応器のうちの１つ又は両方に提供され得る。本明細書で使用する場合、「培養」及び「発酵」という用語は、同じ意味で使用される。これらの用語は、培養／発酵プロセスの増殖期及び生成物生合成期の両方を包含する。
培養物は概して、微生物の増殖を可能にするのに十分な栄養素、ビタミン、及び／又は無機物を含有する水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、最小嫌気性微生物増殖培地などの嫌気性微生物培地である。好適な培地は、当該技術分野において既知である。
培養／発酵は、望ましくは、標的生成物の生成に適切な条件下で実施されるべきである。典型的には、培養／発酵は、嫌気性条件下で実施される。考慮すべき反応条件は、圧力（又は分圧）、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のガスが制限的にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、及び生成物阻害を回避するための最大生成物濃度を含む。
一実施形態は、アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子座位でのＤＮＡのノックインを含む遺伝子操作された微生物である。
ＤＮＡが、アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子のコード領域を置き換える、実施形態の微生物。
ＤＮＡが、アセトラクテートデカルボキシラーゼプロモータを置き換えない、実施形態の微生物。
微生物が、２，３－ブタンジオールを生産しない、実施形態の微生物。
ＤＮＡが、１つ以上の酵素をコードする、実施形態の微生物。
１つ以上の酵素が、微生物に対して非天然である、実施形態の微生物。
１つ以上の酵素が、微生物に対して天然である、実施形態の微生物。
１つ以上の酵素が、アセトラクテートデカルボキシラーゼプロモータの制御下にある、実施形態の微生物。
ＤＮＡが、プロモータを含む、実施形態の微生物。
１つ以上の酵素が、アセトラクテートデカルボキシラーゼプロモータ及び少なくとも１つの他のプロモータの両方の制御下にある、実施形態の微生物。
１つ以上の酵素が、チオラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ又はアルファ－ケトイソバレレートデカルボキシラーゼから選択されるデカルボキシラーゼを含む、実施形態の微生物。
微生物が、アセトン及びイソプロパノールのうちの１つ以上を生産する、実施形態の微生物。
微生物が、一級－二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に破壊的変異を更に含む、実施形態の微生物。
１つ以上の酵素が、１－ブタノール、ブチレート、ブテン、ブタジエン、メチルエチルケトン、エチレン、アセトン、イソプロパノール、脂質、３－ヒドロキシプロピオネート、テルペン、イソプレン、脂肪酸、２－ブタノール、１，２－プロパンジオール、１－プロパノール、１－ヘキサノール、１－オクタノール、コリスマート由来の生産物、３－ヒドロキシブチレート、１，３－ブタンジオール、２－ヒドロキシイソブチレート若しくは２－ヒドロキシイソブタン酸、イソブチレン、アジピン酸、１，３－ヘキサンジオール、３－メチル－２－ブタノール、２－ブテン－１－オール、イソバレレート、イソアミルアルコール、又はモノエチレングリコールの生産を可能にする、実施形態の微生物。
微生物が、Ｃ１固定微生物である、実施形態の微生物。
微生物が、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物である、実施形態の微生物。
微生物が、細菌である、実施形態の微生物。
微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒから選択される属のメンバーである、実施形態の微生物。
一実施形態が、ガス状基質の存在下で請求項１に記載の微生物を培養することを含む、生産物を生産する方法である。
ガス状基質が、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２を含むＣ１炭素源を含む、実施形態の方法。
ガス状基質が、合成ガス又は産業廃棄物ガスを含む、実施形態の方法。
生産物が、１－ブタノール、ブチレート、ブテン、ブタジエン、メチルエチルケトン、エチレン、アセトン、イソプロパノール、脂質、３－ヒドロキシプロピオネート、テルペン、イソプレン、脂肪酸、２－ブタノール、１，２－プロパンジオール、１－プロパノール、１－ヘキサノール、１－オクタノール、コリスマート由来の生産物、３－ヒドロキシブチレート、１，３－ブタンジオール、２－ヒドロキシイソブチレート若しくは２－ヒドロキシイソブタン酸、イソブチレン、アジピン酸、１，３－ヘキサンジオール、３－メチル－２－ブタノール、２－ブテン－１－オール、イソバレレート、イソアミルアルコール、又はモノエチレングリコールである、実施形態の方法。
以下の実施例は、本開示を更に例示するが、当然のことながら、いかなる方法によってもその範囲を制限すると解釈されるべきではない。
（実施例１）
この実施例は、ΔｂｕｄＡΔｓｅｃＡｄｈ微生物を説明する。
この実施例は、ΔｂｕｄＡΔｓｅｃＡｄｈ微生物を説明する。
アセトラクテートデカルボキシラーゼは、２，３－ブタンジオール（２，３－ＢＤＯ）（Ｋｏｐｋｅ，Ａｐｐｌ Ｅｎｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，８０：３３９４－３４０５，２０１４）の形成のための重要なステップであり、この酵素をノックアウトすることは、２，３－ＢＤＯ産生を全滅させることが実証されている（国際公開第２０１３／１１５６５９号）。アセトンなどの他の異種生産物に向かって流動を導くために、それぞれのｂｕｄＡ遺伝子は、生産を改善することが予測された。
ΔｂｕｄＡΔｓｅｃＡｄｈを得るための、一級－二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ｓｅｃＡｄｈ）遺伝子（ΔｓｅｃＡｄｈ）をすでに含有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの株におけるｂｕｄＡのノックアウト（国際公開第２０１５／０８５０１５号）。ｂｕｄＡのノックアウトは、前述のように実施した（国際公開２０１３／１１５６５９号）。
単一コロニーを、単離し、新鮮な適切な選択プレートに再ストリークし、次いでダブルクロスオーバーイベントについてスクリーニングした。正確なサイズのＰＣＲ産物を有した、確認されたダブルクロスオーバーイベントを再び再ストリークして、プラスミド損失を確保した。正しいコロニーを液体培地に採取し、凍結ストックを調製した。遺伝子型を全ゲノム配列決定によって確認し、表現型を増殖研究及び連続撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）の実行を通じて確認した。図１に示されるように、代謝産物生産及びガス消費／生産の振動が観察された。
（実施例２）
この実施例は、プラスミドからアセトン経路（ｔｈｌＡ、ｃｔｆＡＢ、ａｄｃ）を発現するΔｂｕｄＡΔｓｅｃＡｄｈ微生物を説明する。
この実施例は、プラスミドからアセトン経路（ｔｈｌＡ、ｃｔｆＡＢ、ａｄｃ）を発現するΔｂｕｄＡΔｓｅｃＡｄｈ微生物を説明する。
実施例１のΔｂｕｄＡΔｓｅｃＡｄｈ微生物を更に修飾して、アセトン経路（ｔｈｌＡ、ｃｔｆＡＢ、ａｄｃ）を含有するプラスミドを導入した。この株は、同じ経路を伴い、同じ増殖条件下であるが、ｂｕｄＡのノックアウトを伴わない状態で、親ΔｓｅｃＡｄｈ株よりも少ないアセトンを生産した。ｂｕｄＡのノックアウトは、２，３－ＢＤＯからの炭素流動を、アセトン及び／又はエタノールなどの他の代謝産物に再方向付けるであろうと期待されるため、これは驚くべきことである。
更に、この株は、十分に増殖しないか、又は５０％のＣＯ、１０％のＨ２、３０％のＣＯ２、残りＮ２のガス混合物を用いてＣＳＴＲ中の安定したアセトン産生を実証した（図２）。再び、振動パターンは、増殖中に観察された：生産のピーク及びトラフ、トラフとの協調におけるＣＯ及び水素の取り込み、並びにアセテート及びＣＯ２生産のピーク。
（実施例３）
この実施例は、アセトラクテートデカルボキシラーゼ（ｂｕｄＡ）遺伝子座位でのアセトン経路（ｔｈｌＡ、ｃｔｆＡＢ、ａｄｃ）のノックインを有するΔｓｅｃＡｄｈ微生物を説明する。
この実施例は、アセトラクテートデカルボキシラーゼ（ｂｕｄＡ）遺伝子座位でのアセトン経路（ｔｈｌＡ、ｃｔｆＡＢ、ａｄｃ）のノックインを有するΔｓｅｃＡｄｈ微生物を説明する。
ｂｕｄＡ座位でのアセトン経路ノックインのためのＫＩ／ＫＯプラスミドを、ｂｕｄＡ ＫＯプラスミドを骨格として使用して構築し、アセトン経路を、ｂｕｄＡ ＫＯプラスミドの５’ｂｕｄＡ ＫＯ相同性アームと３’ｂｕｄＡ ＫＯ相同性アームとの間に挿入した。アセトン経路は、Ｐｆｅｒプロモータの制御下でｔｈｌＡ、ｃｔｆＡＢ、及びａｄｃを含有した。完全なＫＩ／ＫＯプラスミドを、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して組み立てた。正しいＫＩ／ＫＯプラスミドをＰＣＲスクリーニングし、配列決定によって確認した。
ＫＩ変異体を得るプロセスは、ｂｕｄＡ ＫＯ株の構築で説明したものと同じであり、ｂｕｄＡ座位で導入されたアセトン経路を有するΔｂｕｄＡΔｓｅｃＡｄｈ株を得た。ＰＣＲスクリーニングを実行し、正確なサイズのＰＣＲ産物を有するコロニーを増殖させ、ゲノムＤＮＡを単離し、遺伝子型を確認するために全ゲノムＤＮＡ配列決定に供した。
株を、５０％のＣＯ、１０％のＨ２、３０％のＣＯ２、残りＮ２のガス混合物を用いてＣＳＴＲ中で増殖させた。株は十分に成長し、高レベルのアセトンを生産した（図３）。
（実施例４）
この比較例は、官能性一級－二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ｓｅｃＡｄｈ）を有する微生物、及び二官能性アルデヒド－アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ１＋ａｄｈＥ２）遺伝子座位でのアセトン経路（ｔｈｌＡ、ｃｔｆＡＢ、ａｄｃ）のノックインを説明する。一級－二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ｓｅｃＡｄｈ）は、この株がアセトンではなくイソプロパノールを生産するように、アセトンをイソプロパノールに変換する。
この比較例は、官能性一級－二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ｓｅｃＡｄｈ）を有する微生物、及び二官能性アルデヒド－アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ１＋ａｄｈＥ２）遺伝子座位でのアセトン経路（ｔｈｌＡ、ｃｔｆＡＢ、ａｄｃ）のノックインを説明する。一級－二級アルコールデヒドロゲナーゼ（ｓｅｃＡｄｈ）は、この株がアセトンではなくイソプロパノールを生産するように、アセトンをイソプロパノールに変換する。
アセトン経路を、上記のものと同様のステップで、ａｄｈＥ１＋ａｄｈＥ２座位で挿入した。相同性アームを、ＰＣＲを介して増幅し、遺伝子型を配列決定によって確認した。
株は、ＣＳＴＲでは不十分に成長し、イソプロパノール又はエタノールウェルを十分に生産しなかった（図４）。エタノール及びイソプロパノールのかなりの生産のために十分な細胞バイオマスを有するのに、反応器内で約６日間かかった。発酵は、実験の２週間経過にわたって安定ではなかった。したがって、ａｄｈＥ１＋ａｄｈＥ２座位でのノックインは、ｂｕｄＡ遺伝子座でのノックインと同じ利益を与えない。
（実施例５）
この実施例は、ｂｕｄＡ座位での他の遺伝子又は経路の組み入れについて説明する。
この実施例は、ｂｕｄＡ座位での他の遺伝子又は経路の組み入れについて説明する。
Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物は、１－ブタノール（国際公開第２００８／１１５０８０号、国際公開第２０１２／０５３９０５号、及び国際公開第２０１７／０６６４９８号）、ブチレート（国際公開第２００８／１１５０８０号）、ブタン（国際公開第２０１２／０２４５２２号）、ブタジエン（国際公開第２０１２／０２４５２２号）、メチルエチルケトン（２－ブタノン）（国際公開第２０１２／０２４５２２号及び国際公開第２０１３／１８５１２３号）、エチレン（国際公開第２０１２／０２６８３３号）、アセトン（国際公開第２０１２／１１５５２７号）、イソプロパノール（国際公開第２０１２／１１５５２７号）、脂質（国際公開第２０１３／０３６１４７号）、３－ヒドロキシプロピオネート（３－ＨＰ）（国際公開第２０１３／１８０５８１号）、イソプレンを含むテルペン（国際公開第２０１３／１８０５８４号）、脂肪酸（国際公開第２０１３／１９１５６７号）、２－ブタノール（国際公開第２０１３／１８５１２３号）、１，２－プロパンジオール（国際公開第２０１４／０３６９１５２号）、１－プロパノール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、１－ヘキサノール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、１－オクタノール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、コリスマート由来の生産物（国際公開第２０１６／１９１６２５号）、３－ヒドロキシブチレート（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、１，３－ブタンジオール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、２－ヒドロキシイソブチレート又は２－ヒドロキシイソブチル酸（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、イソブチレン（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、アジピン酸（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、１，３－ヘキサンジオール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、３－メチル－２－ブタノール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、２－ブテン－１－オール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、イソバレレート（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、イソアミルアルコール（国際公開第２０１７／０６６４９８号）、及びモノエチレングリコール（国際公開第２０１９／１２６４００号）を含む、様々な非天然生産物を生産するように、すでに操作されている。これらの遺伝子又は経路のうちのいずれも、ｂｕｄＡ座位でノックインされて、改善された性能を有する株を得ることができる。
一実施形態では、ノックインＤＮＡは、例えば、ｔｈｌＡ及びｈｂｄを含む３－ヒドロキシブチレート経路をコードする。一実施形態では、ノックインＤＮＡは、例えば、ｔｈｌＡ、ｃｔｆＡＢ、及びｈｂｄを含む代替的な３－ヒドロキシブチレート経路をコードする。一実施形態では、ノックインＤＮＡは、例えば、ｔｈｌＡ、ｈｂｄ、ｂｃｄ、及びｅｔｆＡＢを含むブタノール経路をコードする。一実施形態では、ノックインＤＮＡは、例えば、ｔｈｌＡ、ＨＭＧＳ、及びＨＭＧＲを含むメバロナートを含む。これらの経路は、１つ以上のプロモータ、例えば、Ｐ－ｂｕｄＡ及び／又はＰｆｅｒの制御下にあり得る。
本明細書に列挙される公表文献、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、あたかも参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、その全体が本明細書中に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における任意の先行技術への言及は、その先行技術が任意の国の努力傾注分野において共通の一般知識の一部をなすという認識ではなく、そのように解釈されるべきではない。
本開示を説明する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の指示語の使用は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに相反することがない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるものとする。用語「備える（comprising）」、「有する」、「含む（including）」、及び「含有する（containing）」は、別段の断りのない限り、非限定的な用語（すなわち、「を含むがこれらに限定されない」ことを意味する）と解釈されるものとする。「から本質的になる」という用語は、組成物、プロセス、又は方法の範囲を、特定の材料、又はステップ、又は組成物、プロセス若しくは方法の基本的及び新規の特性に実質的に影響しないものに限定する。選択詞の使用（例えば、「又は」）は、選択詞のいずれか１つ、両方、又はこれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別段の指示がない限り、指示された範囲、値、又は構造の±２０％を意味する。
本明細書の値の範囲の記述は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る各個々の値を個々に言及する省略法としての役割を果たすことを単に意図し、各個々の値は、あたかも本明細書に個々に列挙されたかのように、本明細書中に組み込まれる。例えば、任意の濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲、整数範囲、サイズ範囲、又は厚さ範囲は、別段の指示がない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合、その分数（整数の１０分の１、及び１００ 分の１など）を含むと理解されるべきである。
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と別段明らかに相反することがない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる例又は例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良く解明することを単に意図し、別段の主張がない限り、本発明の範囲を制限しない。本明細書におけるいかなる言葉も、本開示の実践に不可欠な任意の請求されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。
本開示の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変化形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本開示が本明細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実践されることを意図する。したがって、本開示は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての修正物及び同等物を含む。更に、その全ての考えられる変化形における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と別段明らかに相反することがない限り、本開示によって包含される。
Claims (22)
- アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子座位でのＤＮＡのノックインを含む、遺伝子操作された微生物。
- 前記ＤＮＡが、前記アセトラクテートデカルボキシラーゼ遺伝子のコード領域を置き換える、請求項１に記載の微生物。
- 前記ＤＮＡが、アセトラクテートデカルボキシラーゼプロモータを置き換えない、請求項１に記載の微生物。
- 前記微生物が、２，３－ブタンジオールを生産しない、請求項１に記載の微生物。
- 前記ＤＮＡが、１つ以上の酵素をコードする、請求項１に記載の微生物。
- １つ以上の酵素が、前記微生物に対して非天然である、請求項１に記載の微生物。
- １つ以上の酵素が、前記微生物に対して天然である、請求項１に記載の微生物。
- １つ以上の酵素が、アセトラクテートデカルボキシラーゼプロモータの制御下にある、請求項１に記載の微生物。
- 前記ＤＮＡが、プロモータを含む、請求項１に記載の微生物。
- 前記１つ以上の酵素が、アセトラクテートデカルボキシラーゼプロモータ及び少なくとも１つの他のプロモータの両方の制御下にある、請求項５に記載の微生物。
- １つ以上の酵素が、チオラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ又はアルファ－ケトイソバレレートデカルボキシラーゼから選択されるデカルボキシラーゼを含む、請求項１に記載の微生物。
- 前記微生物が、アセトン及びイソプロパノールのうちの１つ以上を生産する、請求項１１に記載の微生物。
- 前記微生物が、一級－二級アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に破壊的変異を更に含む、請求項１１に記載の微生物。
- 前記１つ以上の酵素が、１－ブタノール、ブチレート、ブテン、ブタジエン、メチルエチルケトン、エチレン、アセトン、イソプロパノール、脂質、３－ヒドロキシプロピオネート、テルペン、イソプレン、脂肪酸、２－ブタノール、１，２－プロパンジオール、１－プロパノール、１－ヘキサノール、１－オクタノール、コリスマート由来の生産物、３－ヒドロキシブチレート、１，３－ブタンジオール、２－ヒドロキシイソブチレート若しくは２－ヒドロキシイソブタン酸、イソブチレン、アジピン酸、１，３－ヘキサンジオール、３－メチル－２－ブタノール、２－ブテン－１－オール、イソバレレート、イソアミルアルコール、又はモノエチレングリコールの生産を可能にする、請求項５に記載の微生物。
- 前記微生物が、Ｃ１固定微生物である、請求項１に記載の微生物。
- 前記微生物が、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ微生物である、請求項１に記載の微生物。
- 前記微生物が、細菌である、請求項１に記載の微生物。
- 前記微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、及びＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒから選択される属のメンバーである、請求項１に記載の微生物。
- ガス状基質の存在下で請求項１に記載の微生物を培養することを含む、生産物を生産する方法。
- 前記ガス状基質が、ＣＯ、ＣＯ２、及び／又はＨ２を含むＣ１炭素源を含む、請求項１９に記載の方法。
- 前記ガス状基質が、合成ガス又は産業廃棄物ガスを含む、請求項１９に記載の方法。
- 前記生産物が、１－ブタノール、ブチレート、ブテン、ブタジエン、メチルエチルケトン、エチレン、アセトン、イソプロパノール、脂質、３－ヒドロキシプロピオネート、テルペン、イソプレン、脂肪酸、２－ブタノール、１，２－プロパンジオール、１－プロパノール、１－ヘキサノール、１－オクタノール、コリスマート由来の生産物、３－ヒドロキシブチレート、１，３－ブタンジオール、２－ヒドロキシイソブチレート若しくは２－ヒドロキシイソブタン酸、イソブチレン、アジピン酸、１，３－ヘキサンジオール、３－メチル－２－ブタノール、２－ブテン－１－オール、イソバレレート、イソアミルアルコール、又はモノエチレングリコールである、請求項１９に記載の方法。
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