EA031093B1 - Рекомбинантный карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, способ его получения и способ получения продуктов с его использованием - Google Patents

Рекомбинантный карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, способ его получения и способ получения продуктов с его использованием Download PDF

Info

Publication number
EA031093B1
EA031093B1 EA201491418A EA201491418A EA031093B1 EA 031093 B1 EA031093 B1 EA 031093B1 EA 201491418 A EA201491418 A EA 201491418A EA 201491418 A EA201491418 A EA 201491418A EA 031093 B1 EA031093 B1 EA 031093B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
microorganism
butanediol
gene
acetolactate
Prior art date
Application number
EA201491418A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491418A1 (ru
Inventor
Михель Кёпке
Шилпа Нагараджу
Венди Чэнь
Original Assignee
Ланцатек Нью Зилэнд Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ланцатек Нью Зилэнд Лимитед filed Critical Ланцатек Нью Зилэнд Лимитед
Publication of EA201491418A1 publication Critical patent/EA201491418A1/ru
Publication of EA031093B1 publication Critical patent/EA031093B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/48—Tricarboxylic acids, e.g. citric acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/50—Polycarboxylic acids having keto groups, e.g. 2-ketoglutaric acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01004—R,R-butanediol dehydrogenase (1.1.1.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y202/00—Transferases transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C12Y202/01—Transketolases and transaldolases (2.2.1)
    • C12Y202/01006—Acetolactate synthase (2.2.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01005—Acetolactate decarboxylase (4.1.1.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к рекомбинантному карбоксидотрофному ацетогенному микроорганизму, продуцирующему сниженное количество 2,3-бутандиола или не продуцирующему 2,3-бутандиол при ферментации субстрата, содержащего монооксид углерода, который содержит по меньшей мере одну генетическую модификацию, нарушающую экспрессию или активность фермента, способного превращать пируват в ацетолактат, фермента, способного превращать ацетолактат в ацетоин, и/или фермента, способного превращать ацетоин в 2,3-бутандиол, в результате чего нарушается путь биосинтеза 2,3-бутандиола, и который получен из исходного микроорганизма, выбранного из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei и Clostridium coskatii. Также изобретение относится к способу получения такого микроорганизма и способу получения продуктов с его использованием.

Description

Изобретение относится к рекомбинантному карбоксидотрофному ацетогенному микроорганизму, продуцирующему сниженное количество 2,3-бутандиола или не продуцирующему 2,3-бутандиол при ферментации субстрата, содержащего монооксид углерода, который содержит по меньшей мере одну генетическую модификацию, нарушающую экспрессию или активность фермента, способного превращать пируват в ацетолактат, фермента, способного превращать ацетолактат в ацетоин, и/или фермента, способного превращать ацетоин в 2,3-бутандиол, в результате чего нарушается путь биосинтеза 2,3-бутандиола, и который получен из исходного микроорганизма, выбранного из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei и Clostridium coskatii. Также изобретение относится к способу получения такого микроорганизма и способу получения продуктов с его использованием.
Область техники
Настоящее изобретение относится к рекомбинантному карбоксидотрофному ацетогенному микроорганизму, продуцирующему сниженное количество 2,3-бутандиола или не продуцирующему 2,3бутандиол при ферментации субстрата, содержащего монооксид углерода, а также к способу получения такого микроорганизма и способу получения продуктов с его использованием.
Уровень техники
Известно, что ацетогенные микроорганизмы пригодны для получения топлива (например, этанола или бутанола) и других химических соединений путем ферментации субстратов, включая, например, монооксид углерода, диоксид углерода, водород и метанол. В природе многие из данных микроорганизмов вырабатывают по меньшей мере два продукта, если не больше. Однако, в том случае, когда микроорганизмы используются для получения продуктов, особенно в промышленном масштабе, не всегда является желательным, чтобы микроорганизмы вырабатывали большое количество продуктов. Например, выработка большого количества продуктов может наносить ущерб эффективности выработки и выходу продукта, представляющего особую ценность, так как побочные продукты могут отводить углерод из путей, вовлеченных в получение главного желательного продукта. Помимо этого побочные продукты могут являться токсичными по отношению к микроорганизму, получение большого количества продуктов может затруднять выделение и разделение желательных продуктов, и создавать сложности для контроля условий ферментации в пользу получения определенного продукта. Побочные продукты могут также являться потенциальным источником контаминации в ферментере, так как они могут представлять собой субстраты для нежелательных организмов.
В случае получения этанола путем микробиологической ферментации субстратов, содержащих монооксид углерода, в качестве побочного продукта, как правило, вырабатывается 2,3-бутандиол. Это может снижать выход и эффективность выработки этанола, а также вызывать другие проблемы, указанные выше.
Цель настоящего изобретения заключается в преодолении одного или более недостатков предшествующего уровня техники или по меньшей мере в обеспечении общества подходящей альтернативой.
Краткое описание изобретения
Изобретение, в частности, относится к новым, генетически модифицированным микроорганизмам, способным использовать монооксид углерода для получения одного или более продуктов и вырабатывать сниженное количество 2,3-будандиола, по сравнению с исходным микроорганизмом. Согласно одному варианту реализации изобретения генетически модифицированный микроорганизм по существу не вырабатывает 2,3-бутандиол, по сравнению с исходным микроорганизмом. Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения микроорганизм в качестве основного продукта вырабатывает этанол.
Согласно первому аспекту изобретения предложен рекомбинантный карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, продуцирующий сниженное количество 2,3-бутандиола или не продуцирующий
2,3-бутандиол при ферментации субстрата, содержащего монооксид углерода, причем указанный рекомбинантный микроорганизм содержит по меньшей мере одну генетическую модификацию, нарушающую экспрессию или активность фермента, способного превращать пируват в ацетолактат, фермента, способного превращать ацетолактат в ацетоин, и/или фермента, способного превращать ацетоин в 2,3бутандиол, в результате чего нарушается путь биосинтеза 2,3-бутандиола, причем указанный рекомбинантный микроорганизм получен из исходного микроорганизма, выбранного из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei и Clostridium coskatii.
Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения предложен такой карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, отличающийся тем, что способен продуцировать этанол.
Согласно одному варианту реализации изобретения такой микроорганизм способен продуцировать одно или более вещество, выбранное из формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина, ацетолактата, малата, фумарата, 2-оксоглутарата и цитрата.
Согласно одному варианту реализации изобретения такой микроорганизм способен продуцировать повышенное количество одного или более веществ, выбранных из этанола, формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина, ацетолактата, малата, фумарата, 2-оксоглутарата и цитрата, по сравнению с исходным микроорганизмом.
Согласно одному варианту реализации изобретения один или более ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат, представляет собой ацетолактатсинтазу (alsS).
Согласно одному варианту реализации изобретения один или более ферментов, способных превращать ацетолактат в ацетоин, представляет собой ацетолактатдекарбоксилазу (budA).
Согласно одному варианту реализации изобретения один или более ферментов, способных превращать ацетоин в 2,3-бутандиол, представляет собой фермент, выбранный из 2,3-бутандиолдегидрогеназы (2,3bdh), ацетоинредуктазы, алкогольдегидрогеназы.
Согласно одному варианту реализации изобретения генетическая модификация нарушает экспрессию или активность одного или более из следующих ферментов:
- 1 031093 ацетолактатсинтаза (alsS);
ацетолактатдекарбоксилаза (BudA);
2.3- бутандиолдегидрогеназа (2,3 bdh);
ацетоин редуктаза и алкогольдегидрогеназа.
Согласно одному варианту реализации изобретения генетическая модификация нарушает экспрессию или активность одного или более из ацетолактатсинтазы (alsS);
ацетолактатдекарбоксилазы (BudA) и
2.3- бутандиолдегидрогеназы (2,3 bdh).
Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения микроорганизм представляет собой Clostridium autoethanogenum DSM23693.
Согласно второму аспекту изобретения предложен способ получения рекомбинантного карбоксидотрофного ацетогенного микроорганизма, продуцирующего сниженное количество 2,3-бутандиола или не продуцирует 2,3-бутандиол при ферментации субстрата, содержащего монооксид углерода, при этом указанный способ включает генетическое модифицирование исходного микроорганизма, выбранного из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei и Clostridium coskatii, в результате чего происходит нарушение пути биосинтеза 2,3-бутандиола, причем указанное генетическое модифицирование нарушает экспрессию или активность фермента, способного превращать пируват в ацетолактат, фермента, способного превращать ацетолактат в ацетоин, и/или фермента, способного превращать ацетоин в 2,3-бутандиол.
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает введение в исходный микроорганизм одной или более генетических модификаций, которые нарушают один или более генов, кодирующих один или более ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат. Согласно одному варианту реализации изобретения одним или более ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат, является ацетолактатсинтаза (alsS).
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает введение в исходный микроорганизм одной или более генетических модификаций, которые нарушают один или более генов, кодирующих один или более ферментов, способных превращать ацетолактат в ацетоин. Согласно одному варианту реализации изобретения одним или более ферментов, способных превращать ацетолактат в ацетоин, является ацетолактдекарбоксилаза (budA).
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает введение в исходный микроорганизм одной или более генетических модификаций, которые нарушают один или более генов, кодирующих один или более ферментов, способных превращать ацетоин в 2,3-бутандиол. Согласно одному варианту реализации изобретения один или более ферментов, способных превращать ацетоин в 2,3бутандиол, выбрано из 2,3-бутандиолдегидрогеназы (2,3bdh), ацетоинредуктазы, алкогольдегидрогеназы.
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает введение в исходный микроорганизм одной или более генетических модификаций, которые нарушают комбинацию двух или более генов, кодирующих фермент, способный превращать пируват в ацетолактат, ацетолактат в ацетоин и/или ацетоин в 2,3-бутандиол.
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает введение в исходный микроорганизму одной или более модификаций, которые нарушают один или более генов, кодирующих один или более из: ацетолактатсинтазы (alaS), ацетолактадекарбоксилазы (BudA) и 2,3бутандиолдегидрогеназы (2,3 bdh).
Согласно третьему аспекту изобретения предложен способ получения одного или более продуктов, включающий ферментацию субстрата, содержащего монооксид углерода, микроорганизмом по любому из пп.1-6, причем указанный продукт выбран из группы, состоящей из этанола, формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина, ацетолактата, малата, фумарата, 2-оксоглутарата и цитрата.
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает следующие стадии:
(а) помещение субстрата, содержащего СО, в биореактор, содержащий культуру одного или более микроорганизмов согласно первому аспекту изобретения и/или полученных способом согласно второму аспекту изобретения; и (б) анаэробная ферментация культуры в биореакторе с получением одного или более из вышеупомянутых продуктов, предпочтительно этанола.
В предпочтительном варианте субстрат, содержащий СО, представляет собой газовый субстрат, содержащий СО. Согласно одному варианту реализации изобретения субстрат содержит промышленный отработанный газ. Согласно определенным вариантам реализации газ представляет собой отработанный газ со сталелитейного завода или синтез-газ.
Согласно одному варианту реализации субстрат в основном содержит большую долю СО, например, по меньшей мере примерно от 20 до примерно 100% СО по объему, от 20 до 70% СО по объему, от 30 до 60% СО по объему и от 40 до 55% СО по объему. В конкретных вариантах реализации изобретения
- 2 031093 субстрат содержит примерно 25%, или примерно 30%, или примерно 35%, или примерно 40%, или примерно 45%, или примерно 50% СО, или примерно 55% СО, или примерно 60% СО по объему.
Несмотря на то, что необязательно, чтобы субстрат содержал какое-либо количество водорода, присутствие Н2 не является неблагоприятным для образования продукта согласно способам настоящего изобретения. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения присутствие водорода приводит к улучшенной общей эффективности выработки спирта. Например, в конкретных вариантах реализации изобретения субстрат может содержать Н2:СО в соотношении, равном приблизительно 2:1 или 1:1, или 1:2. Согласно одному варианту реализации изобретения субстрат содержит примерно 30% или менее Н2 по объему, 20% или менее Н2 по объему, примерно 15% или менее Н2 по объему или примерно 10% или менее Н2 по объему. Согласно другим вариантам реализации изобретения субстратная фракция содержит низкие концентрации Н2, например, меньше, чем 5%, или меньше, чем 4%, или меньше, чем 3%, или меньше, чем 2%, или меньше, чем 1%, или по существу не содержит водорода. Субстрат может также содержать некоторое количество СО2, например, такое как от примерно 1 до примерно 80% СО2 по объему, или от 1% до примерно 30% СО2 по объему.
Согласно определенным вариантам реализации изобретения способы дополнительно включают стадию выделения одного или более продуктов из ферментативного бульона. Согласно одному варианту реализации изобретения этанол выделяют из ферментативного бульона. Согласно одному варианту реализации изобретения один или более продуктов выделяют из ферментативного бульона, включая формиат, лактат, пируват, сукцинат, валин, лейцин, изолейцин, ацетолактат, малат, фумарат, цитрат и 2оксоглутарат.
Также можно сказать, что изобретение в целом состоит из частей, элементов и признаков, посредством сслыки или прямо указанных в описании заявки, по отдельности или совместно, в любой или во всех комбинациях двух или более указанных частей, элементов или признаков, и при этом в настоящей заявке упоминаются конкретные целые числа, которые имеют известные эквиваленты в области, к которой относится настоящее изобретение, причем такие известные эквиваленты считаются включенными в настоящую заявку, как если бы они были изложены по отдельности.
Краткое описание чертежей
Данные и другие аспекты настоящего изобретения, которые необходимо учитывать во всех его новых аспектах, станут очевидными из следующего описания, которое приведено только в качестве примера, со ссылкой на сопровождающие фигуры, где на фиг. 1 показан метаболический путь от СО до 2,3-бутандиола у 2,3-бутандиол-вырабатывающих карбоксидотрофных ацетогенов (например, С. autoethanogenum DSM23693).
на фиг. 1б проиллюстрированы эффекты нокаутирования пути биосинтеза 2,3-бутандиола у 2,3бутандиол-вырабатывающих карбоксидотрофных ацетогенов с перераспределением потока углерода в сторону этанола, и показано получение из СО новых продуктов, например, сукцината, 2-оксоглутарата, формиата, валина, лейцина.
На фиг. 2 показан ген budA и его 5'- и 3'-фланкирующие области в геноме С. autoethanogenum DSM23693. Также указаны праймеры, использованные для амплификации с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция) и последующего клонирования фланкирующих фрагментов в плазмиду PMTL85141.
На фиг. 3 показана типичная плазмида pMTL85141-budA-ko, несущая 5'-и 3'-фрагменты ДНК, фланкирующие ген budA, разделенные геном lacZ, для нокаута гена budA у С. autoethanogenum DSM23693.
На фиг. 4 показана типичная, используемая в изобретении плазмида для метилирования.
На фиг. 5 показаны (А): графическое представление геномного участка С. autoethanogenum DSM23693 после нокаута гена budA и также указаны положение праймеров, используемых для скрининга мутантов с нокаутированным геном budA С. autoethanogenum DSM23693, и ожидаемый размер ПЦРпродуктов из дикого типа С. autoethanogenum DSM23693 и его соответствующего мутанта с нокаутированным геном budA. (Б) Изображение электрофореза в агарозном геле при ПЦР-скрининге мутантов с нокаутированным геном budA С. autoethanogenum DSM23693. Полосы 1 и 9 демонстрируют ДНК-маркер на 1 т.п.н. (тысяча пар нуклеотидов) GeneRuler™ 1 kb Plus. Полосы 2-6 демонстрируют ПЦРамплификацию целевого участка budA из геномной ДНК, выделенной из дикого типа С. autoethanogenum DSM23693 (+ve, 2,7 т.п.н.) и из шести потенциальных мутантов с нокаутированным геном budA С. autoethanogenum DSM23693 (1-6, 2,2 т.п.н.), с праймерами Og09 и Og12n Полосы 10-16 демонстрируют ПЦР с геномной ДНК, выделенной из дикого типа (+ve) С. autoethanogenum DSM23693 и шести потенциальных мутантов с нокаутированным геном budA С. autoethanogenum DSM23693, с праймерами Og44f и Og45r, специфичными к внутреннему участку гена budA размером 273 п.н. (пар нуклеотидов) (*).
Фиг. 6 - подтверждение с помощью ПЦР вставки RAM в гены budA и 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693 с использованием праймеров Og44f / Og45r и Og42f / Og43r.
На фиг. 7 показана скорость превращения ацетоина в бутандиол, осуществляемого при ферментации С. autoethanogenum DSM23693 и мутантом A2,3bdh ClosTron.
- 3 031093
Краткое описание перечня последовательностей
Данное описание изобретения сопровождается перечнем последовательностей, в котором перечислены следующие последовательности:
Seq. ID 1: нуклеотидная последовательность нуклеотидной последовательности гена budA С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 2: аминокислотная последовательность белка budA С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 3: нуклеотидная последовательность 5'-фланкирующей области гена budA С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 4: нуклеотидная последовательность 3'-фланкирующей последовательности гена budA.
Seq ID 5-8 и 10 и 11: описаны ниже в табл. 1 настоящей заявки.
Seq. ID 9: нуклеотидная последовательность челночного вектора-плазмиды pMTL85141 E. coliClostridium.
Seq. ID. 12: результат секвенирования нуклеотидной последовательности pMTL85141-budA-ko, демонстрирующий, что фланкирующие ДНК-фрагменты, обнаруженные в плазмиде, не содержат мутаций.
Seq ID 13: ген 16S pPHK C. autoethanogenum (Y18178, GI:7271109).
Seq ID 14: ген 16S pPHK колонии 1 потенциального трансформанта с нокаутом по budA С. autoethanogenum DSM23693: идентичность (93%).
Seq. ID 15: ген 16S pPHK колонии 2 потенциального трансформанта с нокаутом по budA С. autoethanogenum DSM23693: (94%).
Seq. ID 16: ген 16S pPHK колонии 3 потенциального трансформанта с нокаутом по budA С. autoethanogenum DSM23693: (95%).
Seq. ID 17: ген 16S pPHK колонии 4 потенциального трансформанта с нокаутом по budA С. autoethanogenum DSM23693: (93%).
Seq. ID 18: ген 16S pPHK колонии 5 потенциального трансформанта с нокаутом по budA С. autoethanogenum DSM23693: (94%).
Seq. ID 19: ген 16S pPHK колонии 6 потенциального трансформанта с нокаутом по budA С. autoethanogenum DSM23693: (92%).
Seq ID 20: результат секвенирования нуклеотидной последовательности ПЦР-продукта потенциального трансформанта с нокаутом по budA колонии 1 С. autoethanogenum DSM23693 с праймером Og09f. (92%).
Seq ID 21: результат секвенирования нуклеотидной последовательности ПЦР-продукта потенциального трансформанта с нокаутом по budA колонии 1 С. autoethanogenum DSM23693 с праймером Og12r. (92%).
Seq ID 22: результат секвенирования нуклеотидной последовательности ПЦР-продукта потенциального трансформанта с нокаутом по budA колонии 3 С. autoethanogenum DSM23693 с праймером Og12r. (92%).
Seq ID 23: результат секвенирования нуклеотидной последовательности ПЦР-продукта потенциального трансформанта с нокаутом по budA колонии 4 С. autoethanogenum DSM23693 с праймером Og12r. (92%).
Seq ID 24: результат секвенирования нуклеотидной последовательности ПЦР-продукта потенциального трансформанта с нокаутом по budA колонии 5 С. autoethanogenum DSM23693 с праймером Og12r.
Seq ID 25: результат секвенирования нуклеотидной последовательности ПЦР-продукта потенциального трансформанта с нокаутом по budA колонии 6 С. autoethanogenum DSM23693 с праймером Og09f.
Seq ID 26: результат секвенирования нуклеотидной последовательности целевого участка budA С. autoethanogenum DSM23693 из клона 6 с праймером Og12r:
Seq ID 27 и 28: описаны ниже в табл. 4 настоящей заявки.
Seq 29 и 30: описаны ниже в табл. 4 настоящей заявки.
SEQ ID 31: нуклеотидная последовательность нового гена метилтрансферазы, слитого с индуцибельным lac-промотором.
SEQ ID 32: последовательность белка новой метилтрансферазы.
SEQ ID 33: нуклеотидная последовательность плазмиды pGS20.
SEQ ID NO 34: аминокислотная последовательность новой алкогольдегидрогеназы из С. autoethanogeum, С. ljungdahlii и С. ragsdalei.
SEQ ID NO 35: нуклеотидная последовательность нового гена алкогольдегидрогеназы из С. autoethanogeum.
SEQ ID NO 36: нуклеотидная последовательность нового гена алкогольдегидрогеназы из С. ljungdahlii.
SEQ ID NO 37: нуклеотидная последовательность нового гена алкогольдегидрогеназы из С. ragsdalei.
Seq. ID. 38: нуклеотидная последовательность малик-энзима 1 С. Autoethanogenum.
- 4 031093
Seq. ID. 39: аминокислотная последовательность малик-энзима 1 С. autoethanogenum.
Seq. ID. 40: нуклеотидная последовательность малик-энзима 2 С. Autoethanogenum.
Seq. ID. 41: аминокислотная последовательность малик-энзима 2 С. Autoethanogenum.
Seq. ID. 42: нуклеотидная последовательность малатдегидрогеназы С. Autoethanogenum.
Seq. ID. 43: аминокислотная последовательность малатдегидрогеназы С. autoethanogenum.
Seq. ID. 44: нуклеотидная последовательность пируватфосфатдикиназы С. autoethanogenum.
Seq. ID. 45: аминокислотная последовательность пируватфосфатдикиназы С. autoethanogenum.
Seq. ID. 46: нуклеотидная последовательность пируваткарбоксилазы С. autoethanogenum.
Seq. ID. 47: аминокислотная последовательность пируваткарбоксилазы С. autoethanogenum.
Seq. ID. 48: нуклеотидная последовательность ФЕП-карбоксикиназы (фосфоенолпируваткарбоксикиназа) С. autoethanogenum.
Seq. ID. 49: аминокислотная последовательность ФЕП-карбоксикиназы С. Autoethanogenum.
Seq. ID. 50: нуклеотидная последовательность субъединицы А фумаратгидратазы С. autoethanogenum.
Seq. ID. 51: аминокислотная последовательность субъединицы А фумаратгидратазы С. autoethanogenum.
Seq. ID. 52: нуклеотидная последовательность субъединицы В фумаратгидратазы С. autoethanogenum.
Seq. ID. 53: аминокислотная последовательность субъединицы В фумаратгидратазы С. autoethanogenum.
Seq. ID. 54: нуклеотидная последовательность фумаратредуктазы 1 С. autoethanogenum.
Seq. ID. 55: аминокислотная последовательность фумаратредуктазы 1 С. autoethanogenum.
Seq. ID. 56: нуклеотидная последовательность фумаратредуктазы 2 С. autoethanogenum.
Seq. ID. 57: аминокислотная последовательность фумаратредуктазы 2 С. autoethanogenum.
Seq. ID. 58: нуклеотидная последовательность фумаратредуктазы 3 С. autoethanogenum.
Seq. ID. 59: аминокислотная последовательность фумаратредуктазы 3 С. autoethanogenum.
Seq. ID. 60: нуклеотидная последовательность малик-энзима 1 С. ragsdalei.
Seq. ID. 61: аминокислотная последовательность малик-энзима 1 С. ragsdalei.
Seq. ID. 62: нуклеотидная последовательность малатдегидрогеназы С. ragsdalei.
Seq. ID. 63: аминокислотная последовательность малатдегидрогеназы С. ragsdalei.
Seq. ID. 64: нуклеотидная последовательность пируватфосфатдикиназы С. ragsdalei.
Seq. ID. 65: аминокислотная последовательность пируватфосфатдикиназы of С. ragsdalei.
Seq. ID. 66: нуклеотидная последовательность пируваткарбоксилазы С. ragsdalei.
Seq. ID. 67: аминокислотная последовательность пируваткарбоксилазы С. ragsdalei
Seq. ID. 68: нуклеотидная последовательность ФЕП-карбоксикиназы С. ragsdalei.
Seq. ID. 69: аминокислотная последовательность ФЕП-карбоксикиназы С. ragsdalei.
Seq. ID. 70: нуклеотидная последовательность субъединицы А фумаратгидратазы С. ragsdalei.
Seq. ID. 71: аминокислотная последовательность субъединицы А фумаратгидратазы С. ragsdalei.
Seq. ID. 72: нуклеотидная последовательность субъединицы В фумаратгидратазы С. ragsdalei.
Seq. ID. 73: аминокислотная последовательность субъединицы В фумаратгидратазы С. ragsdalei.
Seq. ID. 74: нуклеотидная последовательность фумаратредуктазы 1 С. ragsdalei.
Seq. ID. 75: аминокислотная последовательность фумаратредуктазы 1 С. ragsdalei.
Seq. ID. 76: нуклеотидная последовательность фумаратредуктазы 2 С. ragsdalei.
Seq. ID. 77: аминокислотная последовательность фумаратредуктазы 2 С. ragsdalei.
Seq. ID 78: 5'-последовательность, расположенная выше гена budA, или гомологичное плечо гена budA Clostridium Ijungdahlii.
Seq. ID 79: 3'-последовательность, расположенная ниже гена budA, или гомологичное плечо гена budA Clostridium Ijungdahlii.
Seq. ID 80: 5'-последовательность, расположенная выше гена budA, или гомологичное плечо гена budA Clostridium ragsdalei.
Seq. ID 81: 3'-последователыность, расположенная ниже гена budA, или гомологичное плечо гена budA Clostridium ragsdalei.
Seq ID 82: нуклеотидная последовательность направляющего участка ClosTron в budA С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 83: нуклеотидная последовательность направляющего участка ClosTron в 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 84: олигонуклеотид Og42f, использованный для проведения скрининга мутантов A2,3bdh ClosTron.
Seq ID 85: олигонуклеотид Og43r, использованный для проведения скрининга мутантов A2,3bdh ClosTron.
Seq. ID 86: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S рРНК, амплифицированного из
- 5 031093 клона 2 A2,3bdh ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с использованием праймера fD1. Seq ID 87: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S рРНК, амплифицированного из клона 2 A2,3bdh ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с использованием праймера rP2.
Seq. ID 88: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S рРНК клона 4 A2,3bdh ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с использованием праймера fD1.
Seq ID 89: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S рРНК клона 4 A2,3bdh ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с использованием праймера rP2.
Seq. ID 90: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S рРНК клона 1 AbudA ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с использованием праймера fD1.
Seq ID 91: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S рРНК клона 1 AbudA ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с использованием праймера rP2.
Seq. ID 92: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S рРНК клона 3 AbudA ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с использованием праймера fD1.
Seq ID 93: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S рРНК клона 3 AbudA ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с использованием праймера rP2.
Seq ID 94: нуклеотидная последовательность 5'-гомологичного плеча гена 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 95: нуклеотидная последовательность 3'-гомологичного плеча гена 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 96 и 97: праймеры, использованные для амплификации 5'-гомологичного плеча гена 2,3bdh
С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 98 и 99: праймеры, использованные для амплификации 3'-гомологичного плеча гена 2,3bdh
С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 100 и 101: фланкирующие праймеры, которые можно применять для подтверждения нокаута гена 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 102: нуклеотидная последовательность 5'-гомологичного плеча гена SecAdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 103: нуклеотидная последовательность 3'-гомологичного плеча гена SecAdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 104 и 105: праймеры, использованные для амплификации 5'-гомологичного плеча гена 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 106 и 107: праймеры, использованные для амплификации 3'-гомологичного плеча гена 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 108 и 109: праймеры, которые можно применять для подтверждения нокаута гена SecAdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 110: нуклеотидная последовательность кассеты, направляющей интрон группы II, для гена SecAdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 111 и 112: фланкирующие праймеры, которые можно применять для подтверждения инсерционной инактивации гена SecAdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 113: нуклеотидная последовательность 5'-гомологичного плеча гена alsS С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 114: нуклеотидная последовательность 3'-гомологичного плеча гена alsS С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 115 и 116: последовательности праймеров, использованных для амплификации 5'гомологичного плеча гена alsS С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 117 и 118: последовательности праймеров, использованных для амплификации 3'гомологичного плеча гена alsS С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 119 и 120: последовательности фланкирующих праймеров, которые можно применять для подтверждения нокаута гена alsS С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 120: нуклеотидная последовательность 5'-гомологичного плеча гена ilvC С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 121: нуклеотидная последовательность 3'-гомологичного плеча гена ilvC С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 123 и 124: последовательности праймеров, использованных для амплификации 5'гомологичного плеча гена ilvC С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 125 и 126: последовательности праймеров, использованных для амплификации 3'гомологичного плеча гена ilvC С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 127 и 128: последовательности фланкирующих праймеров, которые можно применять для подтверждения нокаута гена ilvC С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 129: нуклеотидная последовательность 5'-гомологичного плеча гена ilvl С. autoethanogenum DSM23693.
- 6 031093
Seq ID 130: нуклеотидная последовательность 3'-гомологичного плеча гена ilvl С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 131 и 132: последовательности праймеров, использованных для амплификации 5'гомологичного плеча гена ilvl С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 133 и 134: последовательности праймеров, использованных для амплификации 3'гомологичного плеча гена ilvl С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 135 и 136: последовательности фланкирующих праймеров, которые можно применять для подтверждения нокаута гена ilvl С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 137: нуклеотидная последовательность 5'- гомологичного плеча гена ilvB С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 138: нуклеотидная последовательность 3'-гомологичного плеча гена ilvB С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 139 и 140: последовательности праймеров, использованных для амплификации 5'- гомологичного плеча гена ilvB С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 141 и 142: последовательности праймеров, использованных для амплификации 3'- гомологичного плеча гена ilvB С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 143 и 144: последовательности фланкирующих праймеров, которые можно применять для подтверждения нокаута гена ilvB С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 145: пример нуклеотидной последовательности, направляющей интрон группы II ClosTron, alsS.
Seq ID 146: пример нуклеотидной последовательности, направляющей интрон группы II ClosTron, ilvC.
Seq ID 147: пример нуклеотидной последовательности, направляющей интрон группы II ClosTron, ilvl.
Seq ID 148: пример нуклеотидной последовательности, направляющей интрон группы II ClosTron, ilvB.
Seq ID 149 и 150: олигонуклеотиды, которые можно применять для скрининга мутантов ClosTron no alsS.
Seq ID 151 и 152: олигонуклеотиды, которые можно применять для скрининга мутантов ClosTron no ilvC.
Seq ID 153 и 154: олигонуклеотиды, которые можно применять для скрининга мутантов ClosTron no ilvl.
Seq ID 155 и 156: олигонуклеотиды, которые можно применять для скрининга мутантов ClosTron no ilvB.
Для всех последовательностей использованы стандартные сокращения IUPAC (Международный союз теоретической и прикладной химии), см. http://en.m.wikipedia.org/wiki/Nucleic acid notation#section 1. В качестве примера:
А Аденозин
С Цитидин
G Гуанозин
Т Тимидин
W АилиТ
S С или G
М А или С
К G или Т
R АилиС
Y С или Т
В С, G или Т
D A, G или Т
Н А, С или Т
V А, С или G
N или - любое основание (не пробел). А, С, G, Т
- 7 031093
Подробное описание изобретения
Далее представлено описание настоящего изобретения, включающее его предпочтительные варианты реализации, данные в общих терминах. Изобретение дополнительно освещается в описании, представленном ниже в настоящей заявке под заголовком Примеры, в котором предложены экспериментальные данные, поддерживающие изобретение, конкретные примеры разных аспектов изобретения и средства реализации изобретения.
Согласно изобретению предложены микроорганизмы, способные вырабатывать один или более продуктов путем ферментации субстрата, содержащего СО. Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения предложены микроорганизмы, способные вырабатывать этанол или этанол и один или более других продуктов, путем ферментации субстрата, содержащего СО. Рекомбинантный микроорганизм вырабатывает по меньшей мере сниженное количество 2,3-бутандиола и/или его предшественника, по сравнению с исходным микроорганизмом. Согласно одному варианту реализации изобретения микроорганизм по существу не вырабатывает 2,3-бутандиол или его предшественника, по сравнению с исходным микроорганизмом.
С помощью исследований нокаута разных генов авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что в том случае, когда у карбоксидотрофного ацетогенного микроорганизма нарушается путь биосинтеза 2,3-бутандиола, данный микроорганизм способен вырабатывать повышенные уровни формиата, лактата, сукцината, 2-оксоглутарата, валина, лейцина, изолейцина и этанола, по сравнению с исходным микроорганизмом. Авторы настоящего изобретения также полагают, что микроорганизмы вырабатывают повышенные уровни пирувата и промежуточных соединений цикла ТКК (цикл трикарбоновых кислот): ацетолактата, малата, фумарата, цитрата, так данные соединения представляют собой предшественники выработки сукцината, 2-оксоглутарата и валина, лейцина и изолейцина. Это имеет ряд значительных преимуществ. Одним главным преимуществом является повышение эффективности выработки этанола, включая более высокие уровни выработанного этанола. Не желая быть связанными какой-либо определенной теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что повышенные уровни валина, лейцина, формиата, лактата и пирувата приводят к тому что, более данных химических соединений являются доступными для микроорганизмов с поддержанием выработки этанола. Помимо этого, ферментативные бульоны необходимо часто пополнять аминокислотами и другими химическими соединениями для обеспечения жизнеспособности и эффективности выработки микроорганизмов во время ферментации. Выработка валина, лейцина, формиата, лактата и пирувата рекомбинантным микроорганизмом согласно изобретению избавляет от необходимости дополнять ферментативный бульон данными химическими соединениями, что может приводить к сокращению издержек. Кроме того, снижение или исключение выработки 2,3-бутандиола у микроорганизмов согласно изобретению имеет преимущества. 2,3Бутандиол может быть токсичным по отношению к микроорганизмам и, таким образом, может оказывать отрицательное действие на ферментацию и рост. Снижение или исключение 2,3-бутандиола из ферментативного бульона также создает возможность для более легкого выделения этанола из бульона; обычно и этанол и 2,3-бутандиол выделяют совместно и затем разделяют на последующей стадии. 2,3-Бутандиол также представляет собой источник потенциальной микробной контаминации в ферментере, так как он представляет собой субстрат для многих нежелательных организмов. Помимо этого сукцинат, 2оксоглутарат, формиат, лактат, пируват, валин, лейцин и изолейцин имеют независимое экономическое значение, так как их можно использовать в целом ряде промышленных процессов и в качестве промежуточных соединений при получении получаемых из них химических продуктов.
Авторы настоящего изобретения впервые продемонстрировали разрушение или нокаут гена, не являющегося существенным, у карбоксидотрофного ацетогенного микроорганизма. Соответственно, согласно другому аспекту изобретения также предложены карбоксидотрофные ацетогенные микроорганизмы, у которых, по сравнению с исходным микроорганизмом, был нарушен один или более генов, не являющихся существенными, наряду со способами получения таких микроорганизмов и способами применения данных микроорганизмов. Несущественный ген представляет собой ген, который кодирует белок, не являющийся необходимым для выживания микроорганизма, так что микроорганизм может выживать без добавления белка. Примеры несущественных генов включают гены, кодирующие ацетолактатдекарбоксилазу и 2,3-битандиолдегидрогеназу. Специалисты смогут идентифицировать несущественные гены с использованием стандартных методик в данной области техники, включая методы генной инженерии с нарушением генов (как описано в настоящей заявке), наряду со стандартными анализами для исследования того, оказывают ли такие генетические модификации действие на выживаемость микроорганизмов.
Несмотря на то, что описание изобретения ниже в настоящей заявке фокусируется на нарушении пути биосинтеза 2,3-бутандиола в результате генетической модификации, следует учесть, что микроорганизмы согласно изобретению при желании могут также включать одну или более дополнительных генетических модификаций (включая повреждение одного или более несущественных генов, не ассоциированных с путем биосинтеза 2,3-бутандиола). В случае аспекта изобретения, связанного с нарушением несущественных генов, следует учесть, что охвачены генетические модификации в генах, кодирующих ферменты, отличные от тех, которые участвуют в пути 2,3-бутандиола.
- 8 031093
Помимо этого, в то время как ниже описание в настоящей заявке может фокусироваться на выработки и выделении этанола в качестве основного продукта, следует учесть, что изобретение можно применять для повышения уровня выработки одного или более продуктов, отличных от этанола или дополнительно к этанолу.
Определения
Термин ферментативный бульон, как используется в настоящей заявка, представляет собой культуральную среду, содержащую, по меньшей мере, питательную среду и бактериальные клетки.
Термин челночный микроорганизм, как используется в настоящей заявке, представляет собой микроорганизм, у которого экспрессируется фермент метилтрансфераза и который отличается от целевого микроорганизма.
Термин целевой микроорганизм, как используется в настоящей заявке, представляет собой микроорганизм, у которого экспрессируются гены, включенные в экспрессионную конструкцию/вектор, и который отличается от челночного микроорганизма.
Термин основной продукт ферментации предназначен для обозначения одного продукта ферментации, который вырабатывается в самой высокой концентрации и/или с самым высоким выходом.
Термины повышающаяся эффективность, повышенная эффективность и тому подобное, при использовании в связи с процессом ферментации, включают повышение одной или более скоростей роста микроорганизмов, катализирующих ферментацию, скорости роста и/или выработки продукта, объема желательного продукта (такого как спирты), вырабатываемого на объем потребляемого субстрата, скорости выработки или уровня выработки желательного продукта, и относительной доли желательного вырабатываемого продукта, по сравнению с другими продуктами ферментации, но не ограничиваются этим.
Следует понимать, что фраза субстрат, содержащий монооксид углерода и подобные термины включают любой субстрат, в котором монооксид углерода является доступным одному или более штаммам бактерий, например, для роста и/или ферментации.
Фраза газовый субстрат, содержащий монооксид углерода и подобные фразы и термины, включают любой газ, который содержит уровень монооксида углерода. В некоторых вариантах реализации изобретения субстрат содержит по меньшей мере от примерно 20 до примерно 100% СО по объему, от 20 до 70% СО по объему, от 30 до 60% СО по объему и от 40 до 55% СО по объему. В конкретных вариантах реализации изобретения субстрат содержит примерно 25%, или примерно 30%, или примерно 35%, или примерно 40%, или примерно 45%, или примерно 50% СО, или примерно 55% СО, или примерно 60% СО по объему.
Несмотря на то, что нет необходимости в том, чтобы субстрат содержал какое-либо количество водорода, присутствие Н2 не является неблагоприятным для образования продукта согласно способам согласно изобретению. В конкретных вариантах реализации изобретения присутствие водорода приводит к улучшенной общей эффективности выработки спирта. Например, в конкретных вариантах реализации субстрат может иметь отношение Н2:СО, равное приблизительно 2:1 или 1:1, или 1:2. Согласно одному варианту реализации субстрат содержит примерно 30% или менее Н2 по объему, 20% или менее Н2 по объему, примерно 15% или менее Н2 по объему или примерно 10% или менее Н2 по объему. Согласно другим вариантам реализации изобретения субстратная фракция содержит низкие концентрации Н2, например меньше чем 5%, или меньше чем 4%, или меньше чем 3%, или меньше чем 2%, или меньше чем 1%, или по существу не содержит водорода. Субстрат может также содержать некоторое количество СО2, например, такое, как от примерно 1 до примерно 80% СО2 по объему, или от 1 до примерно 30% СО2 по объему. Согласно одному варианту реализации изобретения субстрат содержит количество, меньшее или равное примерно 20% СО2 по объему. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения субстрат содержит количество, меньшее или равное примерно 15% СО2 по объему, меньшее или равное примерно 10% СО2 по объему, меньшее или равное примерно 5% СО2 по объему или по существу не содержит СО2.
Согласно описанию, которое следует далее, варианты реализации изобретения описаны в отношении доставки и ферментирования газового субстрата, содержащего СО. Однако следует учесть, что газовый субстрат может быть предложен в альтернативных формах. Например, газовый субстрат, содержащий СО, может быть предложен растворенным в жидкости. По существу, жидкость насыщена газом, содержащим монооксид углерода, и затем данную жидкость добавляют в биореактор. Этого можно достигнуть с применением стандартной методологии. В качестве примера, можно было бы использовать генератор дисперсии микропузырьков (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3/October, 2002). В качестве примера, газовый субстрат, содержащий СО, может быть адсорбирован на твердой подложке. Такие альтернативные способы охвачены с помощью термина субстрат, содержащий СО и тому подобное.
Согласно конкретным вариантам реализации изобретения СО-содержащий газовый субстрат представляет собой промышленный отходящий или отработанный газ. Следует понимать в широком смысле, что термин промышленные отработанные или отходящие газы, включает любые СО-содержащие газы, полученные в результате производственного процесса, и включает газы, полученные в результате производства продуктов на основе черных металлов, производства продуктов на основе цветных металлов,
- 9 031093 процессов переработки нефти, газификации угля, газификации биомассы, получения электрической энергии, получения сажи и производства кокса. Дополнительные примеры могут быть предложены по тексту настоящей заявки.
Если в контексте не указано иначе, фразы ферментация, процесс ферментации или реакция ферментации и тому подобное, как используются в настоящей заявке, предназначены для того, чтобы охватывать как фазу роста, так и фазу биосинтеза продукта процесса. Как будет описано далее в настоящей заявке, согласно некоторым вариантам реализации изобретения биореактор может содержать первый реактор для роста и второй реактор для ферментации. В связи с этим, следует понимать, что добавление металлов или композиций в реакцию ферментации включает добавление либо в один из двух, либо в оба данных реактора.
Термин биореактор включает устройство для ферментации, состоящее из одного или более сосудов и/или конструкций башенного типа или расположения трубопроводов, которое включает корпусный реактор с непрерывным перемешиванием (CSTR), реактор с иммобилизированными клетками (ICR), реактор со слоем со струйным течением жидкости (TBR), барботажную колонну, газлифтный ферментер, статический смеситель или другой сосуд или другое устройство, подходящее для контакта газ-жидкость. Как описано далее в настоящей заявке, согласно некоторым вариантам реализации изобретения биореактор может содержать первый реактор для роста и второй реактор для ферментации. В связи с этим при ссылке на добавление субстрата в биореактор или реакцию ферментации, под этим следует понимать добавление либо в один из двух, либо в оба данных реактора, где это уместно.
При использовании в отношении продуктов ферментации согласно изобретению фраза один или более продуктов и подобные фразы предназначены для того, чтобы включать, например, этанол, сукцинат, пируват, лактат, валин, формиат, изолейцин и лейцин. Согласно одному варианту реализации изобретения фраза один или более продуктов может также включать один или более из: ацетолактата, малата, фумарата, цитрата и 2-оксоглутарата. Следует учесть, что способы согласно изобретению применимы к способам, предназначенным для получения или выделения этанола (отдельно или в комбинации с другими продуктами) или получения и выделения продуктов, отличных от этанола.
Термин ацетат включает как отдельно ацетатную соль, так и смесь молекулярной или свободной уксусной кислоты и ацетатной соли, например смесь ацетатной соли и свободной уксусной кислоты, присутствующую в ферментативном бульоне, описанном в настоящей заявке. Отношение молекулярной уксусной кислоты к ацетату в ферментативном бульоне зависит от рН системы. Термины сукцинат, пируват, лактат, формиат, ацетолактат, малат, фумарат, цитрат и 2-оксоглутарат следует толковать аналогичным образом.
Если в контексте не указано иначе, ссылку на любое соединение настоящей заявки, которое может существовать в одной или более изомерных форм (например, в D-, L-, мезо-, S-, R-, цис- или трансформе), следует понимать в общем смысле, как включающую ссылку на любой один или более таких изомеров соединения. Например, следует понимать, что ссылка на ацетоин включает ссылку на один из двух или оба его D- и L-изомера.
Экзогенные нуклеиновые кислоты представляют собой нуклеиновые кислоты, которые получены вне микроорганизма, в который их вводят.
Экзогенные нуклеиновые кислоты могут происходить из любого соответствующего источника, включая микроорганизм, в который они должны быть введены, штаммы или виды организмов, которые отличаются от организма, в который они должны быть введены, но не ограничиваясь ими, или они могут быть искусственно или рекомбинантно созданы. Экзогенная нуклеиновая кислота может быть адаптирована для интеграции в геном микроорганизма, в который она должна быть введена, или к тому, чтобы оставаться в экстрахромосомном состоянии.
Путь биосинтеза 2,3-бутандиола представляет собой путь, состоящий из реакций, включающих превращение пирувата в ацетолактат, ацетолактата в ацетоин и ацетоина в 2,3-бутандиол.
Нарушение пути биосинтеза 2,3-бутандиола и подобные фразы, как используются в настоящей заявке, предназначены для обозначения того, что выработка 2,3-бутандиола снижена, или согласно одному варианту реализации по существу исключена.
Подразумевается, что термин предшественник 2,3-бутандиола охватывает ацетоин и ацетолактат.
Фермент способен превращать первое соединение или субстрат во второе соединение или продукт, в том случае, если в своей активной форме он может катализировать реакцию, в которой по меньшей мере часть первого соединения превращается во второе соединение.
Следует учитывать, что ссылка на алкогольдегидрогеназу включает алкогольдегидрогеназы, которые способны катализировать превращение кетонов (таких, как ацетоин) во вторичные спирты (такие, как 2,3-бутандиол) или наоборот. Такие алкогольдегидрогеназы включают вторичные алкогольдегидрогеназы и первичные алкогольдегидрогеназы. Вторичная алкогольдегидрогеназа представляет собой алкогольдегидрогеназу, которая может превращать кетоны (такие как ацетоин) во вторичные спирты (такие как 2,3-бутандиол) или наоборот. Первичная алкогольдегидрогеназа представляет собой алкогольдегидрогеназу, которая может превращать альдегиды в первичные спирты или наоборот; однако ряд первичных алкогольдегидрогеназ также способен катализировать превращение кетонов во вторичные
- 10 031093 спирты или наоборот. Данные алкогольдегидрогеназы могут также называться первично-вторичными алкогольдегидрогеназами. Соответственно согласно определенным вариантам реализации изобретения следует учитывать, что ссылка на 2,3-бутандиолдегидрогеназу» включает ссылку на 2,3бутандиолдегидрогеназы, которые могут относиться к категории первичных, вторичных или первичновторичных алкогольдегидрогеназ.
Следует понимать в широком смысле, что фраза генетическая модификация, которая нарушает» путь биосинтеза 2,3-бутандиола или экспрессию, или активность одного или более ферментов согласно изобретению включает любую генетическую модификацию, которая по меньшей мере снижает уровень биосинтеза 2,3-бутандиола, экспрессии или активность одного или более ферментов, или согласно одному варианту реализации изобретения по существу блокирует экспрессию или активность одного или более ферментов или по существу предотвращает продукцию 2,3-бутандиола. Следует учитывать, что фраза включает, например: модификацию гена, кодирующего один или более ферментов, включая модификацию генетического регуляторного элемента, вовлеченного в экспрессию гена; введение нуклеиновой кислоты, которая приводит в образованию белка, который снижает или ингибирует активность одного или более ферментов, или который снижает или предотвращает экспрессию одного или более ферментов; введение нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту, которая адаптирована для блокирования экспрессии гена (например, антисмысловая РНК, миРНК (малая интерферирующая РНК), CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами)); снижение уровня или ингибирование белка, который требуется для экспрессии или активности одного или более ферментов путем введения модификации в ген, кодирующий белок. Следует учесть, что белок, который требуется для экспрессии или активности одного или более ферментов, может действовать непосредственно на ген или один или более ферментов, или может действовать косвенно через другое соединение. Аналогичным образом, белок, который снижает или ингибирует активность или экспрессию одного или более ферментов, может действовать непосредственно на ген или один или более ферментов, или может действовать косвенно через другое соединение.
Термин генетическая модификация следует понимать в широком смысле, и предполагается, что он включает, например, введение микроорганизму одной или более экзогенных нуклеиновых кислот, введение мутации в сайт гена, добавление в геном или удаление из него одного или более нуклеотидов, замену одного или более нуклеотидов разными нуклеотидами, замену гена, удаление гена, добавление гена и тому подобное.
Исходный микроорганизм представляет собой микроорганизм, использованный для получения рекомбинантного микроорганизма согласно изобретению. Согласно одному варианту реализации исходный микроорганизм может представлять собой микроорганизм, который встречается в природе (то есть микроорганизм дикого типа) или микроорганизм, который был предварительно модифицирован (генетически модифицированный или рекомбинантный микроорганизм). Согласно вариантам реализации изобретения, связанным с микроорганизмами, которые вырабатывают сниженное количество 2,3бутандиола или по существу его не вырабатывают, исходный микроорганизм представляет собой микроорганизм, который включает функциональный путь 2,3-бутандиола (включая микроорганизмы, которые встречаются в природе или микроорганизмы, которые были предварительно модифицированы). Примеры исходных микроорганизмов, которые включают фуркциональный путь биосинтеза 2,3-бутандиола, включают Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium coskatii и родственные изоляты.
Функциональный путь биосинтеза 2,3-бутандиола представляет собой путь биосинтеза 2,3бутандиола, в котором микроорганизм может преворащать пируват в 2,3-бутандиол. Согалсно одному конкретному варианту реализации изобретения путь включает превращение пирувата в ацетолактат, ацетолактата в ацетоин и ацетоина в 2,3-бутандиол. Согласно одному конкретному варианту реализации превращение пирувата в ацетолактат катализируется ацетолактатсинтазой, превращение ацетолактата в ацетоин катализируется ацетолактатдекарбоксилазой и превращение ацетоина в 2,3-бутандиол катализируется 2,3-бутандиолдегидрогеназой или ацетоинредуктазой.
Следует понимать в широком смысле, что термины конструкции или векторы нуклеиновой кислоты и подобные термины включают любую нуклеиновую кислоту (включая ДНК и РНК), подходящую для применения в качестве средства для переноса генетического материала в клетку. Следует учитывать, что данные термины включают плазмиды, вирусы (включая бактериофаг), космиды и искусственные хромосомы. Конструкции или векторы могут включать один или более регуляторных элементов, точку начала репликации, сайт множественного клонирования и/или селектируемый маркер, наряду с другими элементами, сайтами и маркерами. Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения конструкции или векторы адаптированы для обеспечения повреждения гена, являющегося нативным для исходного микроорганизма. Согласно другому варианту реализации изобретения конструкции или векторы адаптированы для осуществления возможности экспрессии одного или более генов, кодируемых конструкцией или вектором. Конструкции или векторы нуклеиновой кислоты включают голые нуклеиновые кислоты, а также нуклеиновые кислоты, приготовленные с одним или более агентов для облегчения доставки в клетку (например, нуклеиновая кислота, конъюгированная с липосомой, организм, в ко
- 11 031093 тором содержится нуклеиновая кислота).
По всему объему данного описания изобретения типичная информация о последовательностях предоставлена для ферментов, применимых к изобретению (например, ацетолактатсинтаза, ацетолактатдекарбоксилаза, 2,3-бутандиолдегидрогеназа, ацетоинредуктаза). Данная информация предложена для идентификации типичных ферментов, применимых к изобретению, и для того, чтобы позволить специалисту реализовывать конкретные варианты реализации изобретения на практике без неоправданного экспериментирования. Следует учесть, что нуклеотидные и аминокислотные последовательности для ферментов могут отличаться от одного микроорганизма к другому. Соответственно изобретение не следует толковать, как ограничивающееся данными конкретными вариантами реализации, а скорее как распространяющееся на нарушение ферментов, имеющих разные последовательности, но которые способны катализировать превращение пирувата в ацетолактат, превращение ацетолактата в ацетоин и/или превращение ацетоина в 2,3-бутандиол. Типично, такие ферменты будут обладать по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью аминокислотной последовательности с ферментом, приведенным в настоящей заявке в качестве примера. Согласно конкретным вариантам реализации такие ферменты будут обладать по меньшей мере приблизительно 80, 85, 90, 95 или 99% идентичностью последовательности с ферментом, приведенным в настоящей заявке в качестве примера. На уровне нуклеиновой кислоты гены, кодирующие такие различные ферменты, будут обладать по меньшей мере приблизительно 75% гомологией последовательности с нуклеиновой кислотой, кодирующей фермент, приведенной в настоящей заявке в качестве примера. Согласно конкретным вариантам реализации такие нуклеиновые кислоты будут обладать по меньшей мере приблизительно 80, 85, 90, 95 или 99% гомологией последовательности с нуклеиновой кислотой, кодирующей фермент, приведенной в в настоящей заявке качестве примера.
Следует также учесть, что отличный фермент не обязательно должен иметь такой же уровень активности, как фермент, который конкретно приведен в настоящей заявке в качестве примера. Требуется лишь чтобы фермент имел некоторый уровень активности при катализе представляющего интерес превращения. Специалисты быстро оценят другие такие ферменты, в частности, с учетом информации, содержащейся в настоящей заявке. Используемые анализы ферментов при оценке активностей ферментов для пути 2,3-бутандиола включают, например, анализ на основе теста Фогеса-Проскауэра, описанный Speckman и Collins (Specificity of the Westerfeld Adaptation of the Voges-Proskauer Test, 1982, Appl. Environ. Microbiol. 44: 40-43) или Dulieu и Poncelet (Spectrophotometric assay of a-acetolactate decarboxylase, 1999, Enzy and Microbiol Technol, 25, 537-42).
Микроорганизмы
Как описано выше в настоящей заявке, согласно изобретению предложен рекомбинантный микроорганизм, способный использовать монооксид углерода для выработки одного или более продуктов (согласно одному конкретному варианту реализации, этанола в качестве основного продукта) и вырабатывать сниженное количество 2,3-бутандиола и/или его предшественника или по существу не вырабатывать 2,3-бутандиол и/или его предшественника, по сравнению с исходным микроорганизмом. Микроорганизм содержит одну или более генетических модификаций (по сравнению с исходным микроорганизмом), которые нарушают путь биосинтеза 2,3-бутандиола.
Как указано выше, согласно одному варианту реализации в качестве основного продукта микроорганизм вырабатывает этанол. Согласно одному варианту реализации микроорганизм также вырабатывает один или более из: формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина. Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения микроорганизм адаптирован для выработки повышенного количества одного или более из: этанола, формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина, по сравнению с исходным микроорганизмом. Согласно определенным вариантам реализации изобретения микроорганизм вырабатывает один или более из ацетолактата, малата, цинтрата, фумарата, 2-оксоглутарата. Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения микроорганизм адаптирован для получения повышенного количества одного или более из ацетолактата, малата, фумарата, 2-оксоглутарата.
Одна или более генетических модификаций предпочтительно нарушают экспрессию и/или активность одного или более ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат, ацетолактат в ацетоин, ацетоин в 2,3-бутандиол. Согласно определенным вариантам реализации изобретения одна или более генетических модификаций нарушают только превращение пирувата в ацетолактат, только превращение ацетолактата в ацетоин или только превращение ацетоина в 2,3-бутандиол. Согласно другим вариантам реализации изобретения одна или более генетических модификаций нарушают два или три из данных превращений.
Согласно одному варианту реализации один или более ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат, представляет собой ацетолактатсинтазу (alsS).
Активность ацетолактатсинтазы способна превращать пируват в ацетолактат и является существенной для выработки аминокислот с разветвленной цепью (включая валин, лейцин, изолейцин) (фиг. 1). Один или более ферментов, обладающих активностью ацетолактатсинтазы, могут экспрессироваться в исходном микроорганизме. Типичную аминокислотную последовательность из С. autoethanogenum (AEI90719.1, AEI90730.1, AEI90731.1, AEI90713.1, AEI90714.1), С. ljungdahlii (ADK15104.1,
- 12 031093
ADK15104.1, ADK15105.1, ADK15400.1, ADK15400.1) и С. ragsdalei (AEI90734.1, AEI90734.1, AEI90735.1, AEI90727.1, AEI90727.1) и соответствующие нуклеотидные последовательности из С. autoethanogenum (HQ876013.1, HQ876023.1, HQ876021.1), С. ljungdahlii (СР001666.1 - CLJU_c38920, CLJU_c32420, CLJU_c20420-30) и С. ragsdalei (HQ876014.1, HQ876024.1, HQ876022.1) могут быть получены из GenBank (генбанк). Однако, как ранее показано в настоящей заявке, последовательность гена, кодирующего такие ферменты, и аминокислотная последовательность ферментов могут варьировать от одного микроорганизма к другому.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения исходный микроорганизм может содержать более, чем один фермент, который способен превращать пируват в ацетолактат. В том случае, когда исходный микроорганизм содержит более, чем один фермент, который способен превращать пируват в ацетолактат, можно вводить одну или более генетических модификаций так, чтобы нарушалась экспрессия и/или активность двух или более данных ферментов. В том случае, когда у исходного микроорганизма присутствует больше, чем один фермент, нарушение более одного такого фермента может приводить к повышению выработки сукцината, одного или более промежуточных соединений цикла ТКК и/или этанола выше уровня, который может быть достигнут в случае, если нарушен только один фермент. Уровни выработки могут быть дополнительно повышены в результате нарушения каждого дополнительного фермента, присутствующего в исходном микроорганизме. Несмотря на то, что экспрессия и/или активность всех таких ферментов может обеспечивать некоторое преимущество в отношении выработки желательных продуктов, авторы настоящего изобретения не считают обязательным нарушать экспрессию и/или активность всех таких ферментов для получения пользы согласно изобретению.
Согласно одному варианту реализации изобретения нарушены по меньшей мере два, три, четыре или пять ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат.
Согласно вариантам реализации изобретения, в которых превращение пирувата в ацетолактат по существу или полностью блокировано, рост микроорганизма и ферментация, осуществляемая с его помощью, могут требовать добавления одной или более аминокислот, включая, например, валин, лейцин и изолейцин. Это может быть достигнуто любым способом, который обеспечивает доступность аминокислоты(т) для микроорганизма. В качестве примера в культуральную среду, среды для роста или ферментации, в культуру микроорганизмов и/или ферментативный бульон можно добавлять одну или более аминокислот. Согласно определенным вариантам реализации изобретения аминокислоту(ты) можно добавлять непосредственно в среды или бульон или добавлять в форме экстракта, например, дрожжевого экстракта.
Согласно одному варианту реализации изобретения один или более ферментов, способных превращать ацетолактат в ацетоин, представляет собой ацетолактатдекарбоксилазу (bubA).
Активность ацетолактатдекарбоксилазы способна превращать ацетолактат в ацетоин (фиг. 1). Один или более ферментов, обладающих активностью ацетолактатдекарбоксилазы, может экспрессироваться у исходного микроорганизма. Информацию о типичной аминокислотной (AEI90717.1, ADK13906.1, AEI90718.1) и нуклеотидной (HQ876011.1, СР001666.1 -CLJU_c08380, HQ876012.1) последовательностях для ацетолактатдекарбоксилазы из С. autoethanogeum, С. Ijungdahlii и С. ragsdalei можно получить из GenBank. Однако, как указано ранее в настоящей заявке, последовательность гена, кодирующего такие ферменты, и аминокислотная последовательность ферментов могут варьировать от одного микроорганизма к другому.
Согласно определенным вариантам реализации изобретения исходный микроорганизм может содержать больше чем один фермент, который способен превращать ацетолактат в ацетоин. Когда исходный микроорганизм содержит более чем один такой фермент, одну или более генетических модификаций можно вводить таким образом, чтобы была нарушена экспрессия и/или активность двух или более ферментов. В том случае, когда у исходного микроорганизма представлен более чем один фермент, нарушение более чем одного фермента может приводить к повышению выработки валина, лейцина, изолейцина, этанола, лактата, формиата и сукцината, и/или одного или более промежуточных соединений цикла ТКК выше уровня, которого можно достичь в том случае, когда нарушен только один фермент. Уровни выработки могут быть дополнительно повышены путем нарушения каждого дополнительного фермента, представленного у исходного микроорганизма. В то время как нарушение экспрессии и/или активности всех таких ферментов может предоставлять некоторое преимущество в отношении выработки желательных продуктов, авторы настоящего изобретения не считают необходимым нарушать экспрессию и/или активность всех таких ферментов для достижения положительного эффекта согласно изобретению.
Согласно одному варианту реализации изобретения один или более ферментов, способных превращать ацетоин в 2,3-бутандиол, выбраны из группы, включающей 2,3-бутандиолдегидрогеназу (2,3 bdh) и ацетоинредуктазу.
Активность 2,3-бутандиолдегидрогеназы способна превращать ацетоин в 2,3-бутандиол (фигура 1). Информацию о типичной аминокислотной (AEI90715.1, ADK15380.1, AEI90716.1) и нуклеотидной последовательности (HQ876009.1, СР001666.1 - CLJU_c23220, HQ876010.1) для 2,3-бутандиолдегидрогеназы из С. autoethanogeum, С. Ijungdahlii и С. ragsdalei можно получить из GenBank. Один или
- 13 031093 более ферментов, обладающих активностью ацетолактатсинтазы, может экспрессироваться в исходном микроорганизме. В качестве примера авторы настоящего изобретения обнаружили, что С. autoethanogenum, С. ragsdalei и С. Ljungdahlii содержат дополнительную первично-вторичную алкогольдегидрогеназу, способную превращать ацетоин в 2,3-бутандиол. Информация о типичной последовательности для данного фермента предложена в SEQ ID NO 34, 35, 36 и 37. Однако, как указано выше в настоящей заявке, последовательность гена, кодирующего такие ферменты, и аминокислотная последовательность ферментов может варьировать от одного микроорганизма к другому.
Согласно определенным вариантам реализации изобретения исходный микроорганизм может содержать более одного фермента, который способен превращать ацетоин в 2,3-бутандиол. Когда исходный микроорганизм содержит больше чем один такой фермент, можно вводить одну или более генетических модификаций таким образом, чтобы нарушалась экспрессия и/или активность двух или более ферментов. В случае, когда у исходного микроорганизма представлен больше, чем один такой фермент, нарушение более одного такого фермента может приводить к повышению выработки валина, лейцина, изолейцина, этенола, лактата, формиата и сукцината, и/или одного или более промежуточных соединений цикла ТКК выше уровня, который может быть достигнут, если нарушен только один фермент. Уровни выработки можно дополнительно повышать путем нарушения каждого дополнительного фермента, присутствующего у исходного микроорганизма. Несмотря на то, что нарушение экспрессии и/или активности всех таких ферментов может давать некоторое преимущество в отношении выработки желательных продуктов, авторы настоящего изобретения не считают необходимым нарушать экспрессию и/или активность всех таких ферментов для достижения поожительного эффекта согласно изобретению.
Согласно одному варианту реализации изобретения нарушены по меньшей мере два или три фермента, способных превращать ацетоин в 2,3-бутандиол.
Согласно одному варианту реализации изобретения микроорганизм выбран из группы ацетогенных карбоксидотрофных организмов, включающей виды Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Moorella thermoacetica, Sporomusa ovate, Butyribacterium methylotrophicum, Blautia producta, Eubacterium limosum, Thermoanaerobacter kiuvi.
Данные карбоксидотрофные ацетогены определяются способностью использовать и хемоавтотрофно расти на газовом одноуглеродном (С1) источнике, таком как монооксид углерода (СО) и диоксид углерода (СО2) с монооксидом углерода (СО) и/или водородом (Н2) в качестве источника энергии в анаэробных условиях с образованием ацетил-КоА, ацетата и других продуктов. Они имеют один и тот же общий путь ферментации, путь Вуда-Льюнгдаля или восстановительный путь ацетил-КоА, и определяются наличием набора ферментов, содержащего следующие: монооксид углерода-дегидрогеназа (CODH), гидрогеназа, формиатдегидрогеназа, формилтетрагидрофолатсинтетаза, метилентетрагидрофолатдегидрогеназа, формилтетрагидрофолатциклогидролаза, метилентетрагидрофолатредуктаза и монооксид углерода-дегидрогеназа/ацетил-КоА-синтаза (CODH/ACS), причем данная комбинация является характерной и уникальной для данного типа бактерий (Drake, Kusel, Matthies, Wood, & Ljungdahl, 2006). В отличие от хемогетеротрофного роста сахаросбраживающих бактерий, которые превращают субстрат в биомассу, вторичные метаболиты и пируват, из которых образуются продукты (либо через ацетил-КоА или прямо), у ацетогенов субстрат направляется прямо на ацетил-КоА, из которого образуются продукты, биомасса и вторичные метаболиты.
Согласно одному варианту реализации изобретения микроорганизм выбран из кластера карбоксидотрофных клостридий, содержащего виды С. autoethanogenum, С. Ijungdahlii и С. ragsdalei и родственные изоляты. Данные виды включают штаммы С. autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Naveau, & Nyns, 1994), С. autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) (WO/2009/064200), С autoethanogenum LBS1561 (DSM23693), С Ijungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Miller, & Yang, 1993), С Ijungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (патент США 5593886), С. Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988) (патент США 6368819), С. Ijungdahlii O-52 (ATCC 55989) (патент США 6368819) или С. ragsdalei P11T (АТСС ВАА-622) (WO 2008/028055) и родственные изоляты, такие как С. coskatii (патент США 2011/0229947) и их мутантные штаммы, такие как С. Ijungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo О. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium Ijungdahlii. PhD thesis, North Carolina State University, 2010), но не ограничиваются ими.
Данные штаммы образуют подкластер в пределах кластера I клостридиальной рРНК (Collins et al., 1994), характеризующийся по меньшей мере 99% идентичностью на уровне гена 16S рРНК, несмотря на принадлежность к разным видам, как определено экспериментами по ДНК-ДНК-реассоциации и ДНКфингерпринтингу (WO 2008/028055, патент США 2011/0229947).
Штаммы данного кластера определяются общими характеристиками, имея как похожий генотип, так и фенотип, и все они имеют общий путь сохранения энергии и метаболизма на основе ферментации. У штаммов данного кластера отсутствуют цитохромы, и они сохраняют энергию через Rnf-комплекс.
Все штаммы данного кластера имеют размер генома около 4,2 млн.п.н. (миллион пар нуклеотидов) (Kopke et al., 2010) и состав GC около 32 мол.% (Abrini et al., 1994; Kopke et al., 2010; Tanner et al., 1993) (WO 2008/028055; патент США 2011/0229947), и опероны консервативных основных существенных ге
- 14 031093 нов, кодирующих ферменты пути Вуда-Льюнгдаля (монооксид углерода-дегидрогеназа, формилтетрагидрофолатсинтетаза, метилентетрагидрофолатдегидрогеназа, формилтетрагидрофолатциклогидролаза, метилантетрагидрофолатредуктаза и монооксид углерода-дегидрогеназа/ацетил-КоА-синтаза), гидрогеназу, формиатдедирогеназу, Rnf-комплекс (rnfCDGEAB), пируват: ферредоксиноксидоредуктазу, альдегид:ферредоксиноксидоредуктазу (Kopke et al., 2010, 2011). Было обнаружено, что организация и число генов пути Вуда-Льюнгдаля, ответственных за поглощение газа, является одинаковой у всех видов, несмотря на различия в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях (Kopke et al., 2011).
Все штаммы имеют похожую морфологию и размер (клетки, находящиеся на логарифмической фазе роста, имеют размер между 0,5-0,7 х 3-5 мкм), являются мезофильными (оптимальная температура для роста составляет 30-37°С) и строгими анаэробами (Abrini et al., 1994; Tanner et al., 1993)(WO 2008/028055). Кроме того, все они имеют одинаковые основные филогенетические характеристики, такие как один и тот же диапазон рН (рН 4-7,5, с оптимальным исходным рН 5,5-6), сильный автотрофный рост на СО-содержащих газах с похожими скоростями роста и метаболический профиль с этанолом и уксусной кислотой в качестве основных конечных продуктов ферментации, с небольшими количествами 2,3бутандиола и молочной кислоты, образующимися в определенных условиях (Abrini et al., 1994; Kopke et al., 2011; Tanner et al., 1993)(WO 2008/028055). Продукцию индола наблюдали для всех видов. Однако виды отличаются по использованию в качестве субстрата разных Сахаров (например, рамнозы, арабинозы), кислот (например, глюконата, цитрата), аминокислот (например, аргинина, гистидина) или других субстратов (например, бетаина, бутанола). Было обнаружено, что некоторые виды являются ауксотрофными в отношении определенных витаминов (например, тиамина, биотина), в то время как другие не являются. В ряду данных микроорганизмов было показано восстановление карбоксильных кислот до их соответствующих спиртов (Perez, Richter, Loftus, & Angenent, 2012).
Вследствие этого описанные характеристики не являются специфичными по отношению к одному организму, такому как С. autoethanogenum или С. ljungdahlii, а скорее являются общими характеристиками для карбоксидотрофных, синтезирующих этанол клостридий. Таким образом, можно ожидать, что изобретение работает со всеми данными штаммами, хотя могут существовать различия в реализации.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения исходный микроорганизм выбран из группы, включающей Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei. Согласно одному варианту реализации изобретения группа также включает Clostridium coskatii. Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения исходный микроорганизм представляет собой Clostridium autoethanogenum DSM23693.
Исходные микроорганизмы можно модифицировать с получением микроорганизмов согласно изобретению, используя любое число известных методик трансформации и генной инженерии нуклеиновых кислот. Такие методики описаны, например, у Sambrook et al. (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). В качестве другого примера, можно использовать методологию, описанную ниже в настоящей заявке в разделе Примеры.
В качестве общего примера, в случае введения в ген мутации или другого нарушения или нокаутирования гена, для нарушения гена может быть сконструирована соответствующая конструкция или вектор нуклеиновой кислоты для интеграции в геном исходного микроорганизма. Такие конструкции типично будут содержать последовательности (плечи) нуклеиновых кислот, гомологичные участку в пределах гена или фланкирующему ген, подлежащий нарушению, что обеспечивает прохождение гомологичной рекомбинации, и введение мутации, вырезание участка нуклеиновой кислоты из гена или, наоборот, замену участка гена нуклеотидной последовательностью. Несмотря на то, что предпочтительным является, чтобы плечи в конструкциях обладали 100% комплементарностью по отношению к участку в геноме, на который они нацелены, это не является обязательным, при условии, что последовательность достаточно комплементарна для обеспечения нацеленной рекомбинации с интересующим участком гена. Типично, плечи будут иметь уровень гомологии, который обеспечит гибридизацию с участком-мишенью в жестких условиях, как определено у Sambrook et al. 1989.
Специалисты определят последовательности нуклеиновых кислот, достаточные для обеспечения нацеленной гомологичной комбинации и интеграции экзогенной нуклеиновой кислоты в геном исходного микроорганизма, учитывая доступную информацию о последовательностях для ферментов, вовлеченных в путь биосинтеза 2,3-бутандиола. Однако, в качестве примера, в случае budA, можно использовать фланкирующие гомологичные плечи, описанные в настоящей заявке (например, Seq ID 3, 4 и 78-81), или в случае С. Ljungdahlii, сконструированные на основе информации о нуклеотидной последовательности в Genbank (CP001666.1). В качестве другого примера, фланкирующие области генов, кодирующих ферменты, подлежащие нарушению, согласно изобретению можно определять на основе информации о геномных последовательностях из соответствующих микроорганизмов. В качестве конкретного примера, фланкирующую последовательность в C.ljundahlii можно определить на основе информации в CP001666.1GenBank.
В качестве другого общего примера, где в исходный микроорганизм вводят нуклеиновую кислоту для экспрессии белка или нуклеиновую кислоту, которая ингибирует экспрессию или активность фер
- 15 031093 мента в пути биосинтеза 2,3-бутандиола, или для экспрессии белка, который повышает экспрессию соединения, которое ингибирует экспрессию или активность фермента в пути биосинтеза 2,3-бутандиола, конструкцию будут конструировать таким образом, чтобы обеспечить экспрессию белка в микроорганизме. Типично, конструкция будет включать соответствующие регуляторные элементы, включая промотор. Можно использовать конститутивный или индуцибельный промоторы.
Когда в изобретении используется прямое нарушение гена путем введения мутации или тому подобное, конструкция или вектор, применяемые для трансформации исходного микроорганизма, будут адаптированы для интеграции в геном микроорганизма, как указано выше. В случае экспрессии белка или нуклеиновой кислоты, которая адаптирована для нарушения экспрессии или активности фермента в пути биосинтеза 2,3-бутандиола, или повышения экспрессии или активности ингибитора фермента, вовлеченного в данный путь, конструкции могут оставаться экстрахромосомными при трансформации исходного микроорганизма или могут быть адаптированы для интеграции в геном микроорганизма. Соответственно, используемые в изобертении конструкции могут содержать нуклеотидные последовательности, адаптированные для содействия интеграции (например, область, которая обеспечивает гомологичную рекомбинацию и нацеленную интеграцию в геном хозяина) или экспрессии и репликации экстрахромосомной конструкции (например, точка начала репликации, промотор и другие регуляторные последовательности).
Конструкции нуклеиновой кислоты, применяемые в изобретении, можно конструировать с использованием любого числа методик, являющихся стандартными в данной области техники. Например, можно использовать методики химического синтеза или генной инженерии. Такие методики описаны, например, у Sambrook et al. (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Другие типичные методики описаны в настоящей заявке ниже в разделе Примеры. По существу, отдельные гены, регуляторные элементы, гомологичные плечи и тому подобное будут функционально связаны один с другим, так чтобы они могли осуществлять свою желательную функцию. Подходящие векторы для применения в изобретении будут определены обычными специалистами в данной области техники. Однако в качестве примера могут быть подходящими следующие векторы: pMTL, pIMP, pJIR и плазмиды, приведенные ниже в настоящей заявке в качестве примера в разделе Примеры.
Следует учесть, что нуклеиновые кислоты, применяемые для получения микроорганизмов согласно изобретению, могут быть представлены в любой соответствующей форме, включая РНК, ДНК или кДНК (комплементарная ДНК), включая двухцепочечные и одноцепочечные нуклеиновые кислоты.
Одну или более экзогенных нуклеиновых кислот можно доставлять в исходный микроорганизм в виде голых нуклеиновых кислот или можно приготовить с одним или более агентов для облегчения процесса трансформации (например, нуклеиновая кислота, конъюгированная с липосомой, организм, в котором содержится нуклеиновая кислота). Одна или более нуклеиновых кислот может представлять собой ДНК, РНК или их комбинации, в зависимости от ситуации.
Микроорганизмы согласно изобретению можно получать из исходного микроорганизма и одной или более экзогенных нуклеиновых кислот с использованием любого числа методик, известных в данной области техники, для получения рекомбинантных микроорганизмов. Только в качестве примера, трансформация (включая трансдукцию или трансфекцию) может быть достигнута с помощью электропорации, конъюгации, индукции профага или химической и естественной компетентности. Подходящие методы трансформации описаны, например, в Sambrook J., Fritsch EF, Maniatis T.: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989.
В качестве другого примера можно использовать методы электропорации, описанные в Koepke et al. 2010, Рос. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 107: 13087-92; PCT/NZ2011/000203; WO 2012/053905; Straetz et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:1033-37; Mermelstein et al., 1992, Biotechnology, 10, 190-195; Jennert et al., 2000, Microbiology, 146: 3071-3080; Tyurin et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70: 883-890; В качестве другого примера, возможно использовать методы индукции профага, описанные в Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project Western Kentucky University. В качестве другого примера возможно использовать методы конъюгации, описанные в Herbert et al., 2003, FEMS Microbiol. Lett. 229: 103-110 или Williams et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 819-826.
Согласно определенным вариантам реализации, благодаря рестрикционным системам, которые активны в микроорганизме, подлежащем трансформации, необходимо метилировать нуклеиновую кислоту, подлежащую введению в микроорганизм. Это может быть выполнено с использованием множества методик, включая методики, описанные ниже и дополнительно приведенные в качестве примера в настоящей заявке ниже в разделе Примеры.
В качестве примера, согласно одному варианту реализации рекомбинантный микроорганизм согласно изобретению получают способом, который включает следующие стадии:
введение в челночный микроорганизм (i) конструкции/вектора, подлежащего введению в исходный микроорганизм, как описано в настоящей заявке, и (ii) конструкцию/вектор для метилирования, содержащий ген метилтрансферазы;
- 16 031093 экспрессия гена метилтрансферазы;
выделение одной или более конструкций/векторов из челночного микроорганизма и введение одной или более конструкций/векторов в целевой микроорганизм.
Согласно одному варианту реализации ген метилтрансферазы стадии Б экспрессируется конститутивно. Согласно другому варианту реализации экспрессию гена метилтрансферазы стадии Б индуцируют.
Челночный микроорганизм представляет собой микроорганизм, предпочтительно микроорганизм, негативный по отношению к рестрикции, который облегчает метилирование нуклеотидных последовательностей, которые составляют экспрессионную конструкцию/вектор. Согласно конкретному варианту реализации челночный микроорганизм представляет собой негативные по отношению к рестрикции Е. coli, Bacillus subtillis или Lactococcus lactis.
Конструкция/вектор для метилирования содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую метилтрансферазу.
При введении в челночный микроорганизм экспрессионной конструкции/вектора и конструкции/вектора для метилирования индуцируют ген метилтрансферазы, находящийся в конструкции/векторе для метилирования. Индукция может осуществляться с помощью любой подходящей промоторной системы, хотя согласно одному конкретному варианту реализации изобретения конструкция/вектор для метилирования содержит индуцибельный lac-промотор (например, как в SEQ ID NO 31) и индуцируется в результате добавления лактозы или ее аналога, более предпочтительно изопропил-13-Dтио-галактозида (IPTG). Другие подходящие промоторы включают систему ara, tet или Т7. Согласно другому варианту реализации изобретения промотор конструкции/вектора для метилирования представляет собой конститутивный промотор.
Согласно конкретному варианту реализации конструкция/вектор для метитилирования имеет точку начала репликации, специфичную для идентификации челночного микроорганизма, так чтобы любые гены, находящиеся в конструкции/векторе для метилирования, экспрессировались в челночном микроорганизме. Предпочтительно конструкция/вектор, подлежащие введению в исходный микроорганизм, имеют точку начала репликации, специфичную для идентификации микроорганизма.
Экспрессия фермента метилтрансферазы приводит к метилированию генов, находящихся в конструкции/векторе, подлежащем введению в исходный микроорганизм. Конструкцию/вектор можно затем выделять из челночного микроорганизма согласно любому из ряда известных способов. Только в качестве примера для выделения конструкции/вектора можно использовать методологию, описанную в разделе Примеры, описанном ниже в настоящей заявке.
Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения параллельно выделяют как конструкцию, так и вектор.
Конструкцию/вектор, сконструированные для исходного микроорганизма, можно вводить в микроорганизм с использованием любого числа известных способов. Однако, в качестве примера, можно использовать методологию, описанную ниже в настоящей заявке в разделе Примеры.
Предполагается, что ген метилтрансферазы можно вводить в челночный микроорганизм и сверхэкспрессировать. Таким образом, согласно одному варианту реализации изобретения полученный фермент метилтрансфераза можно собирать с применением известных способов и применять in vitro для метилирования конструкции, подлежащей введению в исходный микроорганизм. Конструкцию/вектор можно затем вводить в целевой (исходный) микроорганизм. Согласно другому варианту реализации ген метилтрансферазы вводят в геном челночного микроорганизма с последующим введением конструкции, сконструированной для исходного микроорганизма, в челночный микроорганизм, выделением одной или более конструкций/векторов из челночного микроорганизма и затем введением конструкции/вектора в целевой (исходный) микроорганизм.
Предполагается, что конструкцию/вектор, сконструированный для исходного микроорганизма, и конструкцию/вектор для метилирования, как определено выше, можно объединять для получения композиции материала. Такая композиция имеет особенную практическую ценность в преодолении барьерных механизмов по отношению к рестрикции для получения рекомбинантных микроорганизмов согласно изобретению.
Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения конструкция/вектор, описанные выше в настоящей заявке, представляют собой плазмиды.
Специалист определит ряд подходящих метилтрансфераз, используемых при получении микроорганизмов согласно изобретению. Однако в качестве примера можно применять метилтрансферазу фага ФТ1 Bacillus subtilis и метилтрансферазу, описанную ниже в настоящей заявке в разделе Примеры. Нуклеиновые кислоты, кодирующие подходящие метилтрансферазы, будут быстро оценены с учетом последовательности желательной метилтрансферазы и генетического кода. Согласно одному варианту реализации нуклеиновая кислота, кодирующая метилтрансферазу, описана ниже в настоящей заявке в разделе Примеры (например, нуклеиновая кислота SEQ ID NO. 31).
Любое число конструкций/векторов, адаптированных для обеспечения экспрессии гена метилтрансферазы, можно применять для получения конструкции/вектора для метилирования. Однако, в каче- 17 031093 стве примера, можно применять плазмиду, описанную ниже в настоящей заявке в разделе Примеры.
Из информации, содержащейся в настоящей заявке, следует учесть, что можно разрабатывать генетическую модификацию исходного микроорганизма для содействия выработки одного или более продуктов, превышающей продукцию одного или более других продуктов. Например, нарушение превращения пирувата в ацетолактат способствует выработке лактата, формиата, малата, фумарата, цитрата, сукцината и 2-оксоглутарата с превышением выработки валина, лейцина и изолейцина.
Способ получения
Согласно изобретению предложен способ получения одного или более продуктов путем микробной ферментации, включаяющий ферментацию субстрата, содержащего СО, с применением микроорганизма согласно изобретению. Согласно одному конкретному варианту реализации способ предназначен для получения этанола или одного или более других продуктов в результате микробной ферментации, включающий ферментацию субстрата, содержащего СО, с применением микроорганизма согласно изобретению. Способы согласно изобретению можно применять для снижения общего уровня эмиссии углерода в атмосферу, являющейся результатом производственного процесса.
Предпочтительно, ферментация включает стадии ферментации субстрата в биореакторе в анаэробных условиях с получением одного или более продуктов (согласно одному варианту реализации этанола или этанола и одного или более других продуктов) с применением рекомбинантного микроорганизма согласно изобретению.
Согласно одному варианту реализации способ включает следующие стадии:
(а) помещение субстрата, содержащего СО, в биореактор, содержащий культуру одного или более микроорганизмов согласно первому аспекту изобретения; и (б) анаэробная ферментация культуры в биореакторе, с получением одного или более продуктов (согласно одному варианту реализации изобретения, включая этанол).
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает следующие стадии:
i) захват СО-содержащего газа, образованного в результате производственного процесса, перед высвобождением газа в атмосферу;
ii) ферментация в анаэробных условиях СО-содержащего газа с образованием одного или более продуктов (согласно одному варианту реализации, включая этанол), осуществляемая культурой, содержащей один или более микроорганизмов согласно первому аспекту изобретения.
Согласно варианту реализации изобретения газовый субстрат, подвергающийся ферментации микроорганизмом, представляет собой газовый субстрат, содержащий СО. Газовый субстрат может представлять собой СО-содержащий отработанный газ, полученный в качестве побочного продукта производственного процесса или из какого-либо другого источника, например, из автомобильных выхлопных газов. Согласно некоторым вариантам реализации производственный процесс выбран из группы, состоящей из производства продуктов на основе черных металлов, например, сталелитейного завода, производства продуктов на основе цветных металлов, процессов переработки нефти, газификации угля, получения электрической энергии, получения сажи, получения аммиака, очистки природного газа, получения метанола и производства кокса. Согласно данным вариантам реализации СО-содержащий газ можно захватывать из производственного процесса перед тем, как он высвободится в атмосферу, используя любой удобный способ. СО может представлять собой компонент синтез-газа (газа, содержащего монооксид углерода и водород). СО, полученный из производственных процессов, обычно сжигают с получением СО2 и, вследствие этого, изобретение имеет конкретную практическую ценность, заключающуюся в снижении эмиссии парникового газа СО2 и получении бутанола для применения в качестве биотоплива. В зависимости от состава газового СО-содержащего субстрата, может быть также желательным его обрабатывать для удаления каких-либо нежелательных примесей, таких как частицы пыли, перед введением его в ферментацию. Например, газовый субстрат можно фильтровать или промывать с использованием известных способов.
Следует принимать во внимание, что для того, чтобы происходил рост бактерий и превращение СО в этанол (и/или другой(ие) продукт(ты)), помимо СО-содержащего субстратного газа в биореактор будет нужно подавать подходящую жидкую питательную среду. В биореактор субстрат и среды можно подавать непрерывно, партиями или в виде периодической ферментации с добавлением субстрата. Питательная среда будет содержать витамины и минеральные вещества, достаточные для обеспечения роста используемого микроорганизма. Анаэробные среды, подходящие для ферментации для получения этанола (или возможно одного или более других продуктов) с использованием СО, известны в данной области техники. Например, подходящие среды описаны у Biebel (Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2001) 27, 18-26). Субстрат и среды можно подавать в биореактор непрерывно, партиями или в виде периодической ферментации с добавлением субстрата. Согласно одному варианту реализации изобретения среды представляют собой среды, описанные ниже в данной заявке в разделе Примеры.
Ферментацию желательно проводить в соответствующих условиях для прохождения ферментации с получением из СО этанола (и/или другого(их) продукта(тов)). Условия реакции, которые следует рассматривать, включают давление, температуру, расход газа, расход жидкости, рН сред, окислительновосстановительный потенциал сред, скорость перемешивания (при использовании корпусного реактора с
- 18 031093 непрерывным перемешиванием), размер инокулята, максимальные концентрации газового субстрата для обеспечения того, чтобы СО в жидкой фазе не становился лимитирующим, и максимальные концентрации продукта для того, чтобы избежать ингибирования конечным продуктом.
Помимо этого часто желательно повышать концентрацию СО фракции субстрата (или парциальное давление СО в газовом субстрате) и, таким образом, повышать эффективность реакций ферментации, в случае, когда СО является субстратом. Работа при повышенных давлениях позволяет значительно повысить скорость переноса СО из газовой фазы в жидкую фазу, где он может поглощаться микроорганизмом в качестве источника углерода для выработки этанола (и/или другого(гих) продукта(ов)). Это, в свою очередь, означает, что время удерживания (определенное, как объем жидкости в биореакторе, деленный на расход газа на входе) может быть снижено, когда биореакторы поддерживают скорее при повышенном давлении, нежели при атмосферном давлении. Оптимальные условия реакции будут зависеть частично от конкретного микроорганизма согласно используемому изобретению.
Однако, в целом, предпочтительно, чтобы ферментацию проводили при давлении выше, чем давление окружающей среды. Также, так как при условии, что скорость превращения СО в этанол (и/или другой(гие) продукт(ты)) представляет собой частично функцию времени удерживания субстрата, и достижение желательного времени удерживания, в свою очередь, обуславливает требуемый объем биореактора, применение вытеснительных систем может значительно уменьшить требуемый объем реактора, и следовательно, капитальную стоимость оборудования для ферментации. Согласно примерам, данным в патенте США № 5593886, объем реактора можно уменьшать линейно пропорционально увеличениям рабочего давления реактора, то есть биореакторы, работающие при давлении 10 атм., должны иметь объем, составляющий лишь одну десятую от объема биореакторов, работающих при давлении 1 атм.
Польза проведения ферментации газ-этанол при повышенном давлении описана далее. Например, в WO 02/08438 описаны ферментации газ-этанол, проводимые при давлениях 30 фунт/кв. дюйм (давление водного столба, приборное) и 75 фунт/кв. дюйм, приводящие к выходам выработки этанола, равным 150 г/л/день и 369 г/л/день соответственно. Однако, было обнаружено, что в результате типичных ферментации, проведенных с использованием аналогичных сред и составов газа на входе при атмосферном давлении, получается в 10-20 раз меньше этанола на литр в день.
Также желательно, чтобы скорость введения СО-содержащего газового субстрата была такой, чтобы обеспечивать, чтобы концентрация СО в жидкой фазе не становилась лимитирующей. Это обусловлено тем, что следствием условий огрониченной концентрации СО может быть то, что продукт этанол будет потребляться культурой.
Состав газовых фракций, используемых для подачи в реакцию ферментации, может иметь значительное влияние на эффективность и/или стоимость реакции. Например, О2 может снижать эффективность анаэробного процесса ферментации. Обработка нежелательных или ненужных газов в несколько стадий процесса ферментации перед ферментацией или после нее может повышать нагрузку на такие стадии (например, в том случае, когда фракцию газа сжимают перед подачей в биореактор, ненужную энергию можно применять для сжатия газов, которые не требуются в ферментации). Соответственно, может быть желательным обрабатывать субстратные фракции, особенно субстратные фракции, полученные из промышленных источников, для удаления нежелательных компонентов и повышения концентрации желательных компонентов.
Согласно определенным вариантам реализации культуру бактерии согласно изобретению поддерживают в водной культуральной среде. В предпочтительном варианте, водная культуральная среда представляет собой минимальную анаэробную микробиологическую среду для роста. Подходящие среды известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 5173429 и 5593886 и WO 02/08438 и описаны ниже в настоящей заявке, в разделе Примеры.
Один или более продуктов, полученных способом согласно изобретению (согласно одному варианту реализации этанол или смешанная фракция спиртов, содержащая этанол и/или один или более других продуктов) можно выделять из ферментативного бульона способами, известными в данной области техники, такими как фракционная дистилляция или упаривание, испарение через полупроницаемую перегородку и экстрактивная ферментация, включая, например, экстракцию жидкости жидкостью. Побочные продукты, такие как кислоты, включая ацетат, можно также выделять из ферментативного бульона с использованием способов, известных в данной области техники. Например, можно использовать адсорбционную систему, включающую фильтр с активированным углем, или электродиализ. В качестве альтернативы, можно также использовать непрерывную отдувку газом.
Согласно определенным вариантам реализации изобретения этанол и/или один или более других продуктов выделяют из ферментативного бульона путем непрерывного удаления части бульона из биореактора, отделяя клетки микроорганизмов от бульона (удобно путем фильтрации) и выделяя один или более продуктов из бульона. Спирты можно выделять, например, путем дистилляции, а кислоты можно выделять, например, путем адсорбции на активированном угле. Отделенные клетки микроорганизмов предпочтительно возвращают в ферментативный биореактор. Бесклеточный фильтрат, оставшийся после удаления какого-либо спирта(тов) и кислоты(т) также предпочтительно возвращают в ферментативный биореактор. Дополнительные питательные элементы (такие как витамины В) можно добавлять в бескле
- 19 031093 точный фильтрат для восполнения питательной среды перед ее возвращением в биореактор.
Также, если рН бульона устанавливали, как описано выше, для усиления адсорбции уксусной кислоты на активированном угле, рН следует повторно устанавливать до рН, аналогичного рН бульона в ферментативном биореакторе, перед возвращением в биореактор.
Сукцинат можно выделять из ферментативного бульона с использованием ряда методик, таких как подкисление, электродиализ, в сочетании с ионообменной хроматографией (Song and Lee, 2006, Enzyme Microb Technol 39, 352-361), осаждение Са(ОН)2 в сочетании с фильтрацией и добавлением серной кислоты (Lee et al 2008, Appl Microbiol Biotechnol 79, 11-22) или экстракция посредством реакции с экстрагентами на основе аминов, такими как три-н-октиламин (Huhet al, 2006, Proc Biochem 41, 1461-1465). Для всех способов крайне важным является применение формы свободной кислоты, а не соли. В большинстве биотехнологических способов получения янтарной кислоты, однако, работают в нейтральном или слегка кислом диапазоне рН 6-7. Принимая во внимание рКа янтарной кислоты (рКа = 4,16 и 5,61), в данных условиях большинство находится в виде соли, а не в виде свободной кислоты. Известно, что С. autoethanogenum и карбоксидотрофные ацетогены, однако, выдерживают и растут в желательном низком диапазоне рН, рН 4-6.
Аминокислоты с разветвленной цепью, валин, лейцин и изолейцин, можно относительно легко выделять из ферментативного бульона путем концентрирования (например, обратный осмос) и кристаллизации или удаления биомассы (например, ультрафильтрация или центрифугирование), и ионообменной хроматографии (Ikeda, A., 2003, Amino Acid Production Processes, in R. Faurie and J. Thommel (eds.) Microbial production of L-amin acids, 1-35).
Лактат, формиат, 2-оксоглутарат и другие продукты можно выделять из ферментативного бульона любым известным способом. Однако, в качестве примера, в случае лактата, в традиционном способе ферментации получают осадок лактата кальция, который можно собирать и повторно подкислять. В качестве альтернативы, для отделения лактата можно привлекать мембранные методы, такие как электродиализ. Низкие концентрации лактата можно выделять из ферментативного бульона, применяя подходящий потенциал к селективной ионопроницаемой мембране. Другие подходящие методики включают нанофильтрацию, где одновалентные ионы могут селективно проходить через мембрану под давлением.
Следует принимать во внимание, что в некоторых ситуациях способ можно осуществлять для получения и выделения продуктов, отличных от этанола (например, одного или более продуктов, содержащих валин, лейцин, сукцинат, пируват, лактат и формиат). Соответственно, следует понимать, что изобретение включает способы получения одного или более из данных продуктов.
Примеры
Ниже изобретение более подробно описано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.
Пример 1. Удаление гена budA С. autoethanogenum путем гомологичной рекомбинации
Генетические модификации проводили, применяя плазмиду, содержащую 5'- и 3'-гомологичные плечи гена budA С. autoethanogenum DSM23693 (фиг. 1-2). Данную плазмиду метилировали in vivo с использованием новой метилтрансферазы, и затем ею трансформировали С. autoethanogenum DSM23693 (DSMZ, Германия). Нокаут гена budA демонстрировали ПЦР и путем ингибирования выработки 2,3бутандиола в штаммах С. autoethanogenum DSM23693 AbudA.
Конструирование экспрессионной плазмиды:
В данном изобретении использовали стандартные методики генной инженерии и молекулярного клонирования, и они описаны Sambrook et al., 1989 и Ausubel et al., 1987. Последовательности ДНК 5'фланкирующего гомологичного плеча, расположенного в направлении 5' (Seq. ID 3), и 3'-фланкирующего гомологичного плеча, расположенного в направлении 3' (Seq. ID 4), гена budA Clostridum autoethanogenum DSM23693 получали из NCBI (национальный центр биотехнологической информации).
Геномную ДНК из Clostridum autoethanogenum DSM23693 выделяли, используя набор Purelink Genomic DNA mini из Invitrogen, согласно инструкции от изготовителя.
5'-(Seq. ID. 3) и 3'-(Seq. ID. 4) фланкирующие гомологичные плечи амплифицировали с помощью ПЦР с олигонуклеотидами, приведенными в табл. 1, с использованием геномной ДНК Clostridum autoethanogenum DSM23693 в качестве матрицы, ДНК-полимеразы iProof High Fidelity (Bio-Rad Labratories) и следующей последовательности действий: первоначальная денатурация при 98°С в течение 30 с, за которой следуют 25 циклов с денатурацией (98°С в течение 10 с), отжигом (60°С в течение 15 с) и элонгацией (72°С в течение 30 с) перед стадией финальной элонгации (72°С в течение 7 мин).
- 20 031093
Таблица 1. Олигонуклеотиды для клонирования
Цель Название олигонукле отида Последовательность ДНК (от 5' к 3·) SEQJD NO.
5’-гомологичное плечо Og09f attcatcctg са g gTTT СТТ CACAGGА AAATATACTTCAG 5
5’-гомологичное плечо Од Юг gactg сд д ссдсАТТАС АТТ С ACCT С TATGTCATTATAAC 6
З’-гомологичное плечо Og11f atttgctag cACTAGACAGT GCT ААТ AACAATGTCTAG 7
З’-гомологичное плечо плазмида Од12г M13f atatggcgcgccTCATAAACCTGGAT AACATAAGC GTAAAACGACGGCCAG 8 Ю
плазмида M13r CAGGAAACAGCTATGACC 11
Амплифицированное 5'-фланкирующее гомологичное плечо (5'НА) гена budA размером 964 п.н. резали рестриктазами Sbf1 и Not1 и клонировали в челночный вектор pMTL 85141 Е. coli-Clostridium (Seq. ID 9; FJ797651.1; Nigel Minton, University of Nottingham; Heap et al., 2009) с использованием рестрикционных сайтов Sbfl и Notl и штамма XL1-Blue MRF' Kan E. coli (Stratagene). И созданную плазмиду pMTL85141-budA-5'HA, и ПЦР-продукт 3'-гомологичного плеча гена budA размером 977 п.н. резали Nhel и Ascl. Лигирование данных расщепленных фрагментов ДНК осуществляли в Е. coli XL1-Blue MRF' Kan (Stratagene), получая плазмиду pMTL85141-budA-ko. Вставку в полученной плазмиде pMTL85141-budAko (SEQ ID No. 12) полностью секвенировали, используя олигонуклеотиды, данные в табл. 1, и результаты секвенирования подтверждали, что как 5'-, так и 3'-гомологичные плечи не содержали мутаций.
Метилирование ДНК:
Гибридный ген метилтрансферазы, слитый с индуцибельным lac-промотором (SEQ ID No. 31), конструировали путем выравнивания генов метилтрансферазы из С. autoethanogenum, С. Ijungdahlii и С. ragsdalei, как описано в патентной заявке США 13/049263. Экспрессия метилтрансферазы приводит к образованию белка, имеющего последовательность SEQ ID No. 32. Гибридный ген метилтрансферазы химически синтезировали и клонировали в вектор pGS20 (ATG:biosynthetics GmbH, Merzhausen, Германия - SEQ ID No. 33), используюя EcoRI. Негативный по отношению к рестрикции штамм XL1-Blue MRF' Kan E. coli (Stratagene) дважды трансформировали полученной плазмидой для метилирования pGS20-метилтрансфераза и плазмидой pMTL85141-budA-ko. Метилирование in vivo индуцировали добавлением 1 мМ IPTG, и метилированные плазмиды выделяли с использованием набора Zymo mini prep (Zymo). Полученную композицию метилированной плазмиды использовали для трансформации С. autoethanogenum DSM23693.
Трансформация:
На протяжении всего эксперимента по трансформации С. autoethanogenum DSM23693 выращивали в среде YTF (табл. 2) в присутствии восстанавливающих агентов и с отработанным газом со сталелитейного завода при 30 фунт/кв. дюйм (собранным со сталелитейного завода Новой Зеландии в Glenbrook (Гленбрук), Н.З.; состав: 44% СО, 32% N2, 22% СО2, 2% Н2) при 37°С с использованием стандартных анаэробных методов, описанных Hungate (1969) и Wolfe (1971).
Таблица 2. Среда YTF
Компонент среды на л маточного раствора
Дрожжевой экстракт Юг
Триптон 16 г
- 21 031093
Для получения компетентных клеток 50 мл культуры С. autoethanogenum DSM23693 пересевали на свежую среду YTF в течение 5 дней подряд. Данные клетки использовали для инокуляции 50 мл YTF среды, содержащей 40 мМ DL-треонина при OD600 нм (оптическая плотность) 0,05. Когда культура достигала OD600 нм 0,5, клетки инкубировали на льду в течение 30 мин и затем переносили в анаэробную камеру и собирали при 4700 х g и 4ОС. Культуру дважды промывали ледяным буфером для электропорации (270 мМ сахарозы, 1 мМ MgCl2, 7 мМ фосфата натрия, рН 7,4) и, наконец, суспендировали в свежем буфере для электропорации объемом 600 мкл. Данную смесь переносили в заранее охлажденную кювету для электропорации с межэлектродным зазором 0,4 см, содержащую 2 мкг смеси метилированной плазмиды и 1 мкл ингибитора рестрикции 1 типа (Epicentre Biotechnologies), и сразу же генерировали импульс, используя систему для электропорации Gene pulser Xcell (Bio-Rad) со следующими устанавливаемыми параметрами: 2,5 кВ, 600 Ω и 25 мкФ. Достигали временных констант, равных 3,7-4,0 мс. Культуру переносили в 5 мл свежей среды YTF. За восстановлением клеток наблюдали при длине волны 600 нм с использованием спектрофотометра Spectronic Helios Epsilon (Thermo), оснащенного штативом для пробирок. После первоначального падения биомассы клетки снова начинали расти. Как только биомасса удваивалась относительно данного значения, примерно 200 мкл культуры распределяли по чашкам с агаризованной YTF и чашкам с агаризованной РЕТС, содержащим 5 г/л фруктозы (табл. 3) (обе среды содержали 1,2% агар Bacto™ (BD) и 15 мкг/мл тиамфеникола). После 3-4 дней инкубации с отработанным газом со сталелитейного завода при 30 фунт/кв. дюйм при 37ОС уже были отчетливо видны 500 колоний на чашку.
Таблица 3. Среда РЕТС (среда АТСС 1754; atcc.orq/Attacriments/2940.pdf)
Компонент среды Концентрация на 1,0 л среды
ΝΗ,ΟΙ 1 г
KCI 0,1 г
MgSO4.7H2O 0,2 г
NaCI 0,8 г
КН2РО4 0,1 г
CaCI2 0,02 г
Раствор микроэлементов 10 мл
Раствор витаминов Вулфа 10 мл
Дрожжевой экстракт 1 г
Резазурин (2 г/л маточного раствора) 0,5 мл
MES 2 г
Восстанавливающий агент 0,006-0,008 % (об./об.)
Дистиллированная вода Вплоть до 1 л, pH 5,5 (подведенный HCI)
- 22 031093
Раствор витаминов Вулфа на л маточного раствора
Биотин 2 мг
Фолиевая кислота 2 мг
Пиридоксина гидрохлорид 10 мг
Тиамин.HCI 5 мг
Рибофлавин 5 мг
Никотиновая кислота 5 мг
Кальций О-(+)-пантотенат 5 мг
Витамин Bi2 0,1 мг
п-аминобензойная кислота 5 мг
Тиоктовая кислота 5 мг
Дистиллированная вода до 1 л
Раствор микроэлементов на л маточного раствора
Нитрилотриуксусная кислота 2г
MnSO4.H2O 1 г
Fe (SO4)2(NH4)2.6H2O 0,8 г
CoCI2.6H2O 0,2 г
ZnSO4.7H2O 0,2 мг
CuCI2.2H2O 0,02 г
NaMoO4.2H2O 0,02 г
Na2SeO3 0,02 г
NiCI2.6H2O 0,02 г
Na2WO4.2H2O 0,02 г
Дистиллированная вода ДО 1 Л
Маточный раствор на 100 мл маточного
восстанавливающего агента раствора
NaOH 0,9 г
Цистеин.HCI 4 г
Na2S 4 г
Дистиллированная вода до 100 мл
Колонии пересевали штрихом на чашки со свежей агаризованной средой РЕТС, также содержащей 5 г/л фруктозы и 15 мкг/мл тиамфеникола. После 2 дней инкубации с газом со сталелитейного завода при 30 фунт/кв. дюйм при 37°С единичные колонии из данных чашек повторно пересевали штрихом на чашки со свежей неселективной агаризованной средой РЕТС, содержащей только 5 г/л фруктозы. Пересев штрихом на чашки с агаризованной средой РЕТС с 5 г/л фруктозы повторяли еще раз, и чашки инкубировали с газом со сталелитейного завода при 30 фунт/кв. дюйм при 37°С. Спустя 3 дня 6 единичных колоний, растущих на неселективной среде, вносили в качестве инокулята в 2 мл жидкой среды РЕТС, содержащей 5 г/л фруктозы. Когда культура подростала, ее последовательно доводили до 5 мл, 25 мл и затем до 50 мл среды РЕТС, содержащей 5 г/л фруктозы и газ со сталелитейного завода при 30 фунт/кв.
- 23 031093 дюйм в качестве источника углерода.
Подтверждение успешной трансформации:
С. autoethanogenum: для проверки идентичности шести клонов и переноса ДНК геномную ДНК выделяли из 6 колоний/клонов в жидкой среде РЕТС с использованием набора Purelink™ Genomic DNA mini (Invitrogen) согласно инструкции изготовителя. Данные геномные ДНК наряду с геномной С. autoethanogenum DSM23693 дикого типа использовали в качестве матрицы в ПЦР. ПЦР проводили с ДНКполимеразой iproof High Fidelity (Bio-Rad Labratories), праймерами, перечисленными в табл. 4, и следующей последовательностью действий: первоначальная денатурация при 98°С в течение 2 мин, за которой следуют 25 циклов с денатурацией (98°С в течение 10 с), отжигом (61°С в течение 15 с) и элонгацией (72°С в течение 90 с) перед стадией финальной элонгации (72°С в течение 7 мин). Геномную ДНК из С. autoethanogenum DSM23693 дикого типа использовали в качестве матрицы в контрольной ПЦР.
Таблица 4. Олигонуклеотиды для подтверждения плазмиды и видов с помощью ПЦР
Целевой участок Название олигонуклео тида Последовательность ДНК (от 5' до 3') Seq ID No.
Ген 16S рРНК fD1 CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCC TGGCTCAG 27
Ген 16S рРНК гР2 CCCGGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTG TTACGACTT 28
Гомологи чное плечо og09f attcatcctgcaggTTTCTTCACAGGAAAATATA CTTCAG 5
Гомологи чное плечо Og12r atatggcgcgccTCATAAACCTGGATAACATAA GC 8
Ген budA Og44f TTGCTGTAGTCACTGAACTGGAAAA 29
Ген budA Og45r AATCAGGACACCTAAATCCAACCAC 30
Для подтверждения идентичности 6 клонов ПЦР проводили с амплификацией гена 16S рРНК, используя праймеры fD1 (Seq. ID. 27) и rP2 (Seq. ID 28), и с использованием описанных выше условий для ПЦР. ПЦР-продукты очищали, используя набор Zymo Clean and Concentrator™ и секвенировали, используя праймер rP2 (Seq. ID 28). Последовательности всех 6 клонов (Seq. ID. 13-19) демонстрировали по меньшей мере 90% идентичность с геном 16S рРНК С. autoethanogenum (Seq. ID 15; Y18178, Gl:7271109).
ПЦР 6 анализируемых клонов с праймерами, специфичными к целевому участку budA, с использованием праймеров Og09f (Seq. ID. 5) и Og12r (Seq. ID. 8), приводила к амплификации ДНК-фрагмента размером 2,2 т.п.н. (тысяча пар нуклеотидов) у 5 из 6 клонов. ПЦР-продукт размером 2,7 т.п.н. амплифицировали с геномной ДНК С. autoethanogenum DSM23693 дикого типа. Идентичность ПЦР-продуктов размером 2,2 т.п.н. из клонов потенциальных нокаутов по budA подтверждали путем секвенирования (Seq ID 20-26) с праймерами, перечисленными в табл. 5, и последовательность гена budA в данных фрагментах не детектировали. ДНК-фрагмент lacZ замещал ген budA. Отсутствие гена budA в данных 6 клонах еще раз подтверждали ПЦР с праймерами Og44f (Seq. ID. 29) и Og45r (Seq. ID. 30), специфичными к внутреннему участку гена budA С. autoethanogenum DSM23693 размером 275 п.н., который амплифицировали только у С. autoethanogenum DSM23693 дикого типа.
Отсутствие выработки 2,3-бутандиола и увеличение выхода этанола:
Для того, чтобы показать отсутствие ацетоина и, как следствие, выработки 2,3-бутандиола с клоном 1 проводили эксперименты с бутылкой с сывороткой в трехкратной повторности с отработанным газом со сталелитейного завода (состав: 44% СО, 32% N2, 22% СО2 и 2% Н2; отобран со сталелитейного завода в Glenbrook, Новая Зеландия) и средой РЕТС, описанной выше. Немодифицированный штамм дикого типа С. autoethanogenum DSM23693 выращивали в таких же условиях, как контроль.
Анализ метаболитов проводили с помощью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), используя систему ВЭЖХ Agilent 1100 Series, оснащенную RID (рефрактометрический детектор), работающим при 35°С, и колонкой для определения органических кислот Alltech IOA-2000 (150 х 6,5 мм, размер частиц 5 мкм), хранящейся при 32°С. В качестве подвижной фазы использовали слегка подкисленную воду (0,005 М H2SO4) со скоростью потока 0,25 мл/мин. Для удаления белков и других клеточных остатков образцы объемом 400 мкл смешивали со 100 мкл 2% (мас./об.) 5-сульфосалициловой кислоты и центрифугировали при 14000 х g в течение 3 мин для отделения преципитированных осадков. 10 мкл супернатанта затем вводили в ВЭЖХ для анализов.
Результаты экспериментов с бутылкой с сывороткой с клоном 1 AbudA С. autoethanogenum
- 24 031093
DSM23693 и немодифицированным диким типом С. autoethanogenum DSM23693 показаны в табл. 5. Максимальная биомасса штамма AbudA С. autoethanogenum DSM23693 характеризовалась OD600hm 0,32, относительно более низкой, чем у немодифицированного дикого типа, который вырастал до OD600hm 0,58. По сравнению с диким типом 2,3-бутандиол не детектировали в культуре клона 1 AbudA С. autoethanogenum DSM23693, и выход этанола был значительно выше у клона 1 AbudA С. autoethanogenum DSM23693, чем у немодифицированного С. autoethanogenum DSM23693 (табл. 5).
Таблица 5.Метаболиты, вырабатываемые клоном 1 AbudA С. autoethanogenum DSM23693 и немодифицированным диким типом С. autoethanogenum DSM23693, в расчете на биомассу
Метаболит Среда Дикий тип AbudA
(г/л) Клон 1
Этанол 1,395 2,500
Уксусная 2,296 0,180
кислота
2,3-бутандиол 0,085 0,000
Молочная 0,020 0,197
кислота
Муравьиная 0,002 1,647
кислота
Янтарная 0,002 0,344
кислота
Выработка других метаболитов - лактата, формиата, сукцината, 2-оксиглутарата, валина, лейцина, изолейцина:
В то же время, неожиданно, несмотря на то, что немодифицированный С. autoethanogenum DSM23693 вырабатывал только 0,02 г/л молочной кислоты в качестве другого побочного продукта, AbudA С. autoethanogenum DSM23693 вырабатывал значительно более высокое количество молочной кислоты 0,07 г/л (0,197 г/л, отнесенное к биомассе), а также 0,53 г/л (1,647 г/л, отнесенное к биомассе) муравьиной кислоты и 0,13 г/л (0,344 г/л, отнесенное к биомассе) янтарной кислоты (табл. 5). Данное увеличение вероятно происходит в результате аккумуляции пирувата, раннего предшественника 2,3бутандиола (фиг. 1), из-за нокаута гена budA, который блокировал продукцию 2,3-бутандиола.
Продукцию сукцината и лактата AbudA С. autoethanogenum DSM23693 также подтверждали с помощью газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС). Для этого, примерно 2,5 мл культуры клона 1 AbudA С. autoethanogenum DSM23693, выращенного с отработанным газом со сталелитейного завода (состав: 44% СО, 32% N2, 22% СО2 и 2% Н2; собран со сталелитейного завода в Glenbrook, Новая Зеландия) при оптической плотности 0,32 центрифугировали, и супернатант фильтровали через 0,2 мкм фильтр (Smart KF, Aggio RB, Van Houtte JR, Villas-Boas SG, аналитическая платформа для метаболомного анализа микробных клеток с использованием дериватизации метилхлорформиата с последующей газовой хроматографией-масс-спектрометрией, Nat Protoc. 2010 Sep;5(10): 1709-29. 2010). Примерно 0,65 мл культуры дикого типа С. autoethanogenum DSM23693 и 2,5 мл холостой пробы со средой обрабатывали аналогичным образом. Образцы сушили сублимацией и анализировали ГХ-МС в трехкратной повторности в университете Auckland (Окленд). Как видно из табл. 6, интенсивность пика сигнала сукцината и лактата была выше у клона 1 AbudA С. autoethanogenum DSM23693, по сравнению с немодифицированным С. autoethanogenum DSM23693 и контрольной холостой пробой со средой. Результаты ГХ-МС по сукцинату и лактату согласуются с результатами ВЭЖХ.
Результаты ГХ-МС (табл. 6) не только подтвердили выработку лактата и сукцината у клона 1 AbudA С. autoethanogenum DSM23693, но также демонстрируют выработку 2-оксоглутарата, другого конечного продукта незамкнутого цикла ТКК помимо сукцината, и аминокислот с разветвленной цепью, валина, лейцина, изолейцина, которые образуются из пирувата и ацетолактата, предшественников 2,3бутандиола, которые вероятно будут находиться в повышенных количествах у штамма the AbudA С. autoethanogenum. Промежуточные соединения цикла ТКК, такие как малат, фумарат, цитрат, цис-аконитат, изоцитрат, не тестировали, но их уровни, вероятно, будут повышены, так как обнаружили, что вырабатываются конечные продукты сукцинат и 2-оксоглутарат (фиг. 16).
- 25 031093
Таблица 6. Анализ метаболитов клона 1 AbudA С. autoethanogenum DSM23693 (AbudA) и немодифицированного дикого типа С. autoethanogenum DSM23693 (дикий тип) с помощью ГХ-МС. Среду включали в анализы в качестве контроля. Значения, приведенные в таблице, соответствуют нормированной интенсивности пиков, полученной для каждой повторности (R). н.о. = не определено.
Метаболит Среда Среднее
Лактат 0,547053273 0,474988 0,431645 0,48
Сукцинат 1,036264929 0,960478 1,243932 1,08
2- Оксоглутарат н.о. н.о. н.о. 0,00
Валин 5,970408365 5,446962 5,937764 5,79
Лейцин 3,418425725 3,154261 3,237803 3,27
Изолейцин н.о. н.о. 0,607184 0,20
Метаболит Дикий тип Среднее
Лактат 0,801302932 0,691344 0,853559 0,78
Сукцинат 0,547053273 0,474988 0,431645 0,48
2- Оксоглутарат н.о. 0,003092 0,0028 0,00
Валин 0,018545724 0,011764 0,014182 0,01
Лейцин 0,0307755 0,024291 0,023099 0,03
Изолейцин 0,008136206 0,005305 0,00643 0,01
Метаболит Клон 1 AbudA (образец 1) Клон 1 AbudA (образец 2) среднее
Лактат 5,017350825 5,672474 5,237064 5,987887 5,138095 4,39521 5,24
Сукцинат 2,535447097 2,984226 2,516218 5,017351 5,672474 5,237064 3,99
2- Оксоглутарат 0,522265764 0,462277 н.о. 1,22281 0,021205 н.о. 0,37
Валин 11,13216958 9,419048 7,824351 10,08887 10,66202 9,192138 9,72
Лейцин 10,92981831 5,478571 4,497006 4,70419 11,36585 4,441235 6,90
Изолейцин 6,087638048 9,397619 0,895459 10,59162 2,912456 9,976735 6,64
Получение ацетоина и 2,3-бутандиола обычно связано с понижением кислотности, обусловленной сильной пировиноградной кислотой (Xiao, Z., and P. Xu. 2007. Acetoin metabolism in bacteria. Crit. Rev. Biochem. Microbiol. 33:127-140), которая может представлять серьезную угрозу для клетки в результате нарушения внутреннего рН и протонного градиента, необходимого для сохранения энергии. Как ацетоин, так и 2,3-бутандиол представляют собой соединения, характеризующиеся нейтральным рН. Выработка 2,3-бутандиола также служит в качестве стока электронов для разгрузки избыточных восстанавливающих эквивалентов, образующихся во время ферментационного процесса.
Не желая быть связанными какой-либо определенной теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что при нокаутировании выработки ацетоина и 2,3-бутандиола, клетка вынуждена находить другие способы снижения кислотности, обусловленной пировиноградной кислотой (pKa = 2,50), и разгрузки восстанавливающих эквивалентов и, таким образом, сдвигает свой метаболизм в сторону выработки других (новых) продуктов, таких как разветвленные аминокислоты, валин, лейцин или изолейцин, сукцинат (pKa1 = 4,20, pKa2 = 5,60), молочная кислота (pKa = 3,86) и муравьиная кислота (pKa = 3,77). Выработка янтарной кислоты также дает возможность разгружать 4 восстанавливающих эквивалента, в то время как 2 восстанавливающих эквивалента можно разгружать в результате выработки молочной кислоты.
Пример 2. Путь сукцината
Путь выработки сукцината описан на фиг. 16. Соответственные гены идентифицировали в Clostridium autoethanogenum, и демонстрировали ферментативную активность.
На первой стадии пируват превращается в малат, либо прямо при катализе малик-энзимом, либо через оксалоацетат, при катализе малатдегидрогеназой. Оксалоацетат (ОАА) может образовываться из пирувата в результате работы пируваткарбоксилазы, или через фосфоенолпируват (ФЕП) за двухстадийное превращение, катализируемое пируватфосфатдикиназой (PPDK) и ФЕП-карбоксикиназой (PCK). Далее
- 26 031093 малат превращается в сукцинат в двухстадийном процессе, катализируемом фумаратгидратазой и фумаратредуктазой. Соответствующие гены идентифицировали у С. autoethanogenum, а гомологичные гены присутствуют в других карбоксидотрофных ацетогенах, таких как С. ljungdahlii и С. ragsdalei (табл. 7).
Таблица 7. Гены и ферменты, которые идентифицированы, как вовлеченные в продукцию сукцината
С. autoethanogenum C. ljungdahlii C. ragsdalei
Малик-энзим 1 Seq. ID 38-39 CP001666.1 CLJU_c04160; ADK13498.1 Seq. ID 60-61
Малик-энзим 2 Seq. ID 40-41 CP001666.1 CLJU_c38460; ADK16871.1
Малатдегидрогеназа Seq. ID 42-43 CP001666.1 CLJU_c05920; ADK13674.1 Seq. ID 62-63
Пируватфосфатдикиназа (PPDK) Seq. ID 44-45 CP001666.1 CLJU_c08140; ADK13882.1 Seq. ID 64-65
Пируваткарбоксилаза (РУС) Seq. ID 46-47 CP001666.1 Cl .111 Г.373ЯП- ADK16765.1 Seq. ID 66-67
ФЕП-карбо кси киназа (РСК) Seq. ID 43-49 CP001666.1 CLJU_c06210; ADK13703.1 Seq. ID 68-69
Субъединица фумаратгидратазы А Seq. ID 50-51 CP001666.1 CLJU_c40600; ADK17084.1 Seq. ID 70-71
Субъединица фумаратгидратазы В Seq ID 52-53 CP001666.1 CLJU_c40590; ADK17083.1 Seq. ID 72-73
Фумаратредуктаза флавопротеин 1, Seq. ID 54-55 CP001666.1 CLJU_c22800; ADK15338.1 Seq. ID 74-75
Фумаратредуктаза 2, Seq. ID 56-57 CP001666.1 CLJU_c30250;
флавопротеин ADK16073.1
Фумаратредуктаза 3, флавопротеин Seq. ID 58-59 CP001666.1 CLJU_c08670; ADK13935.1 Seq. ID 76-77
Анализ ферментативной активности
Клетки (Clostridium autoethanogenum) собирали в экспоненциальную фазу анаэробного роста. Культуры (А600 - 0,45) осаждали при 8000 х g, 4°С в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали и осадок два раза промывали в промывочном буфере (0,1 М Трис-HCl (трис(гидроксиметил)аминометан), 10 мМ дитиотреитол (ДТТ), рН 6,5, 4°С). Наконец, осадок ресуспендировали в промывочном буфере, содержащем ингибитор протеаз, и смешивали с 1,44 г циркониевых шариков (набор Ambion RiboPure Bacteria). Пробирки охлаждали на льду в течение 5 мин перед измельчением содержимого на Vortex Mixer с адаптером для vortex (Vortex Genie 2, Scientific Industries, Inc.) за 5 циклов разбивки в течение 1 мин при 3200 об/мин, между которыми следовало выдерживание на льду в течение 1 мин. После лизиса образец центрифугировали (13000 х g, 4°С в течение 10 мин) и супернатант делили на аликвоты и хранили при -80°С до анализа.
Все анализы основывались на окислении NADH (восстановленный никотинамидадениндинуклеотид) в NAD (никотинамидадениндинуклеотид) (ε = 6,2 мМ-1 см-1) в аэробных условиях в кювете с длиной
- 27 031093 оптического пути 1 см. Активности ферментов получали в результате трех повторностей по меньшей мере двух независимых клеточных экстракций. Содержание белка экстрактов определяли с использованием коммерческого набора (Pierce® Microplate BCA Protein Assay Kit-Reducing Agent Compatible, Thermo Scientific). Одну единицу ферментативной активности определяли, как количество фермента, которое может превращать наномоль субстрата в продукт в минуту на мг общего белка.
Активность малатдегидрогеназы измеряли спектрофотометрически путем следующего окисления восстановленных пиридиннуклеотидов оксалоацетатом (ОАА) (Sridhar J. et al, 2000, Elucidation of enzymes in fermentation pathways used by Clostridium thermosuccinogenes growing on inulin. Appl. Environ. Microbiol. 66, 246-51). Реакционная смесь содержала следующее: 0,1 М Трис-HCl рН 6,5, 10 мМ ДТТ, 0,15 мМ NADH, 5 мМ фумарат, 0,3 мМ NADH и бесклеточный экстракт. Реакцию инициировали добавлением ОАА, и следили за ней при комнатной температуре. Удельную активность данного фермента в бесклеточных экстрактах Clostridium autoethanogenum измеряли, как 160 ± 17 нмоль мин-1 мг-1 белка. Данная активность была сравнима с малатдегидрогеназой, обнаруженной в Clostridium thermosuccinogenes, измеренной при 37°С (Sridhar J. et al., 2000, Elucidation of enzymes in fermentation pathways used by Clostridium thermosuccinogenes growing on inulin. Appl. Environ. Microbiol. 66, 246-51).
Активность фумаратредуктазы измеряли на основе превращения фумарата в сукцинат (Sridhar J. et al, 2000, Elucidation of enzymes in fermentation pathways used by Clostridium thermosuccinogenes growing on inulin. Appl. Environ. Microbiol. 66, 246-51). Реакционная смесь содержала следующее: 0,1 М Tris-Cl pH 6,5, 10 мМ ДТТ, 0,15 мМ NADH, 5 мМ фумарат и бесклеточный экстракт. Реакцию инициировали добавлением фумарата, и за ней следили при комнатной температуре. Удельную активность данного фермента в бесклеточных экстрактах Clostridium autoethanogenum измеряли, как 17,3 ± 1,3 нмоль мин-1 мг-1 белка.
Анализы подтвердили, что Clostridium autoethanogenum обладает малатдегидрогеназной активностью, фумаратредуктазой/сукцинатдегидрогеназой.
Как описано в настоящей заявке, согласно изобретению предложены микроорганизмы и способы, которые делают возможным получение этанола путем микробной ферментации субстратов, содержащих монооксид углерода. Согласно изобретению также предложено получение сукцината. Ранее не было сообщений о получении сукцината с помощью ацетогенов, тем более карбоксидотрофных ацетогенов. Возможность получать сукцинат с помощью микробной ферментации может иметь ряд преимуществ, по сравнению с современными нефтехимическими способами получения. Микроорганизмы также вырабатывают формиат и аминокислоты с разветвленной цепью, которые ранее не были описаны в качестве продуктов ферментации, осуществляемой ацетогенными микроорганизмами.
Сукцинат применяют в качестве массового платформенного химического соединения для получения целого ряда промышленных химикатов, включая 1,4-бутандиол, тетрагидрофуран, гаммабутиролактон, этилендиаминдисукцинат, диэтилсукцинат и адипиновую кислоту. Формиат используют при сохранении животного корма и в процессах дубления кожи, а также в качестве отбеливающего раствора в целлюлозно-бумажной промышленности. Аминокислоты с разветвленной цепью имеют целый ряд назначений в промышленной биотехнологии.
Микроорганизмы согласно изобретению также вырабатывают один или более других продуктов. Применение данных продуктов описано по тексту настоящей заявки.
Пример 3. Инсерционная инактивация генов, вовлеченных в биосинтез 2,3-БДО (2,3-бутандиол), у С. autoethanogenum DSM23693 на основе интронов группы II
Дизайн и конструирование конструкций ClosTron, нацеленных на ген budA и 2,3bdh:
Гены ацетолактатдекарбоксилазы (budA) и 2,3-бутандиолдегидрогеназы (2,3-bdh), вовлеченные в продукцию 2,3-бутандиола у C. autoethanogenum DSM23693, инактивировали с применением инструмента ClosTron для повреждения генов, опосредованного интроном группы II (Heap et al., 2010). Алгоритм Perutka, размещенный на ClosTron.com, применяли для идентификации участка-мишени для интрона группы II между основаниями 450/451 и 468/469 на смысловой нити генов budA и 2,3-bdh соответственно. Такой же алгоритм применяли для конструирования участков, направляющих интрон (Seq. ID. 82 и 83), которые коммерчески синтезировали в DNA2.0 и доставляли в векторе pMTL007C-E5. Итоговые векторы pMTL007C-E5-budA-450!451s и pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s содержат маркер ermB, активируемый ретротранспозицией (RAM), который придает устойчивость к антибиотику кларитромицину при вставке в место-мишень.
Плазмиды pMTL007C-E5-budA-450!451s и pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s вводили в С. autoethanogenum DSM23693 путем конъюгирования с донором, штаммом СА434 Е. coli в качестве донора. Вкратце, штамм-донор выращивали в течение ночи в среде LB с добавлением 25 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл спектиномицина. Клетки из 1,5 мл культуры собирали и промывали в фосфатно-солевом буферном растворе. Осадок из донорных клеток ресуспендировали в 200 мкл культуры реципиента С. autoethanogenum DSM23693, находящегося на экспоненциальной фазе роста. Смесь помещали на агаризованную среду РЕСТ с добавлением фруктозы и инкубировали при 37°С в сосуде с газом под давлением. Спустя 24 ч клетки соскребали и ресуспендировали в 500 мкл бульона РЕТС и распределяли по агаризованной среде РЕТС с добавлением 15 мкг/мл тиамфеникола (Sigma) и 10 мкг/мл триметоприма (Sigma).
- 28 031093
Проводили отбор трансконъюгантов С. autoethanogenum с использованием 15 мкг/мл тиамфеникола, и проводили противоотбор штамма СА434 Е. coli с использованием 10 мкг/мл триметоприма. Колонии наблюдали спустя 3 суток инкубации при 37°С в сосудах с газом под давлением.
Штрихи единичных колоний наносили последовательно сначала на среду РЕТС-MES, содержащую 15 мкг/мл тиамфеникола и 10 мкг/мл триметоприма с последующим нанесением на чашки с агаризованной средой РЕТС, содержащей 5 мкг/мл кларитромицина. Случайным образом проводили скрининг 4 колоний на плазмиду на предмет вставки интрона группы II с помощью ПЦР с использованием праймеров Og44f (Seq. ID. 29) и Og45r (Seq. ID. 30), фланкирующих место вставки интрона группы II в гене budA, и праймеров Og42f (Seq. ID. 84) и Og43r (Seq. ID. 85), фланкирующих место вставки интрона группы II в гене 2,3-bdh. Для ПЦР использовали набор Maxime PCR PreMix. 16S рДНК также амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров fD1 (Seq. ID. 27) и rP2 (Seq. ID.28) и набора Maxime PCR PreMix.
Подтверждение нарушения гена budA и 2,3bdh с использованием инструмента ClosTron для инсерционной инактивации на основе интрона группы II
Амплификация ПЦР-продуктов размерами 273 и 375 п.н. с праймерами Og44f/Og45r и Og42f/Of43r указывает на гены budA и 2,3-bdh немодифицированного дикого типа соответственно. Амплификация ПЦР-продуктов размером ~ 2 т.п.н. с использованием такого же набора праймеров указывает на вставку интрона группы II ClosTron в гены-мишени. В случае клонов с нацеливанием на ген budA, клоны 1 и 3 имели полосы ожидаемого размера. Клон 4, по-видимому, представляет собой смесь, как дикого типа, так и мутанта с нарушенным геном (фиг. 6). Все 4 клона с нацеливанием на ген 2,3-bdh , представляются позитивными по отношению к повреждению гена, как видно по амплификации ПЦР-продукта размером ~ 2 т.п.н. (фиг. 6). Данные результаты подтверждают нарушение генов budA и 2,3-bdh у С. autoethanogenum DSM23693.
ПЦР-продукт 16S рДНК клонов 2 A2,3bdh ClosTron (Seq ID. 86 и 87) и 4 (Seq ID. 88 и 89) и клонов 1 AbudA ClosTron (Seq ID. 90 и 91) и 3 (Seq ID. 92 и 93), как было подтверждено секвенированием, принадлежат к С. autoethanogenum DSM23693.
Таким образом, авторы настоящего изобретения продемонстрировали нарушение гена-мишени у ацетогенного С. autoethanogenum DSM23693 с использованием двух разных подходов - (i) нокаут гена в результате гомологичной рекомбинации и (ii) нарушение гена с применением инструмента для инсерционной инактивации на основе интрона группы II.
Исследование мутантов AbudA и A2,3bdhClosTron на предмет выработки 2,3-БДО
Метаболиты из мутантов AbudA и A2,3bdh, выращиваемых в бутылках с сывороткой, анализировали с помощью ВЭЖХ (как объяснено ранее). Мутант AbudA Clostron подобно нокаутному мутанту AbudA не вырабатывал 2,3-БДО (табл. 8). Нарушение гена budA двумя разными способами у С. autoethanogenum подтверждает роль гена budA в биосинтезе 2,3-БДО.
Таблица 8. Выработка метаболитов мутантами AbudA и A2,3bdh ClosTron
С. autoethanogenum DSM23693
Метаболиты AbudA Δ2.3 bdh
Клон 1 Клон 3 Клон 2 Клон 4
Этанол 0,09 0,08 0,37 0,23
Уксусная кислота 2,56 2,63 3,78 3,34
2-З-Бутандиол 0,0 0,0 0,01 0,01
Молочная кислота 0,0 0,0 0,0 0,0
Мутант A2,3bdh ClosTron еще вырабатывал 2,3-БДО (табл. 8), указывая на участие второго гена в превращении ацетоина в 2,3-БДО.
Yan et al показали, что вторичная алкогольдегидрогеназа из С. beijerinckii и трех других организмов может также превращать ацетоин в 2,3-БДО (Yan. Lee & Liao, 2009). Аналогичный ген вторичной алкогольдегидрогеназы (SecAdh) обнаружен у С. autothenogenum DSM23693 (Seq ID 34 и 35), С. Ijungdahlii (Seq ID 36) и С. ragsdalei (Seq ID 37).
При отсутствии гена 2,3-bdh у С. autoethanogenum DSM23693 SecAdh наиболее вероятно превращала бы ацетоин в 2,3-БДО.
Роль второй дегидрогеназы в превращении ацетоина в 2,3-БДО
Для исследования роли второго гена в превращении ацетоина в 2,3-БДО С. autoethanogenum DSM23693 дикого типа и мутанту A2,3bdh ClosTron в экспериментах по ферментации давали 10 г/л ацетоина.
Ферментация с диким типом и мутантом A2,3bdh ClosTron
Ферментации проводили в биореакторах объемом 1,5 л при 37°С и с СО-содержащим газом со сталелитейного завода в качестве единственного источника энергии и углерода, как описано ниже. Для рос
- 29 031093 та культуры применяли определенную среду, содержащуя на литр: MgCl, CaCl2 (0,5 мМ), KCl (2 мМ), Н3рО4 (5 мМ), Fe (100 мкМ), Ni, Zn (5 мкМ), Mn, В, W, Mo, Se (2 мкМ). Затем среду переносили в биореактор и автоклавировали при 121°С в течение 45 мин. После автоклавирования в среду добавляли тиамин, пантотенат (0,05 мг), биотин (0,02 мг) и ее восстанавливали 3 мМ цистеином-HCl. Для достижения анаэробных условий сосуд реактора продували азотом через 0,2 мкм фильтр. Перед инокуляцией газ меняли на СО-содержащий газ со сталелитейного завода, при непрерывной подаче в реактор. Состав подаваемого газа представлял собой: 2% Н2, 42% СО, 20% СО2, 36% N2. pH культуры поддерживали между 5 и 5,2. Газовый поток исходно устанавливали на уровне 80 мл/мин, с возрастанием до 200 мл/мин во время середины экспоненциальной фазы роста, в то время как встряхивание повышали с 200 об/мин до 350. Na2S подавали дозами в биореактор при 0,25 мл/ч. Когда OD600 достигала 0,5, биореактор переводили на непрерывный режим при скорости 1,0 мл/мин (скорость разбавления 0,96 д-1). Когда рост становился стабильным, в реактор вводили 10 г/л рацемической смеси ацетоина. Образцы сред отбирали для измерения биомассы и метаболитов с помощью ВЭЖХ.
Метаболиты анализировали ВЭЖХ регулярно до исчезновения ацетоина. С. autoethanogenum DSM23693 дикого типа превращал весь ацетоин в мезо-БДО и 2,3-БДО менее чем через 1 ч (фиг. 7). У мутанта A2,3bdh ClosTron скорость превращения ацетоина в мезо-БДО и 2,3-БДО была относительно низкой. Мутант A2,3bdh ClosTron снижал уровень ацетоина, составляющий 10 г/л, более чем через 2 ч. Данные результаты указывают на роль второй дегидрогеназы в компенсации нарушения гена 2,3bdh, хотя и при более низкой скорости.
Пример 4. Модифицированный штамм DSM23693 С. Autoethanogenum, вырабатывающий только ацетоин
Промышленное отделение ацетоина от этанола является технически более целесообразным, по сравнению с получаемым из него продуктом 2,3-БДО. Таким образом, желательно получать штамм С. autoethanogenum, вырабатывающий ацетоин, а не его восстановленную форму 2,3-БДО. Так как мутант A2,3bdh ClosTron еще вырабатывает 2,3-БДО, желательно получать штамм DSM23693 С. autoethanogenum, у которого нарушены оба гена 2,3bdh и SecAdh. Это может быть достигнуто двумя способами:
(а) гомологичной рекомбинацией и (б) безмаркерным нарушением гена с применением инструмента ClosTron, как объяснено в примере 1 и примере 3.
(а) штамм DSM23693 С. autoethanogenum с нокаутом двух генов A2,3bdh ASecAdh, полученный в результате гомологичной рекомбинации:
5'-(Seq. ID. 94) и 3'-(Seq. ID. 95) гомологичные плечи генов 2,3bdh размером -1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. autoethanogenum DSM23693. Для амплификации 5'- и 3'-гомологичных плеч использовали праймеры Og13f (Seq. ID. 96)/Og14r (Seq. ID. 97) и Og15f (Seq. ID. 98)/Og16r (Seq. ID. 99) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-2,3bdh-KO. Данную плазмиду вводили в С. autoethanogenum DSM23693, либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут 2,3bdh с использованием праймеров Og33f (Seq. ID.100) и Og34r (Seq. ID. 101), которые фланкируют гомологичные плечи 2,3bdh, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Плазмиду для нокаута гена SecAdh конструировали аналогичным образом. 5'-(Seq. ID. 102) и 3'(Seq. ID. 103) гомологичные плечи генов SecAdh размером -1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. autoethanogenum DSM23693. Для амплификации 5'- и 3'-гомологичных плеч использовали праймеры Sec5f (Seq. ID. 104)/Sec5r (Seq. ID. 105) и Sec3f (Seq. ID. 106)/Sec3r (Seq. ID. 107) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-SecAdh-KO. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут SecAdh с использованием для ПЦР праймеров SecOf (Seq. ID. 108) и SecOr (Seq. ID. 109), которые фланкируют гомологичные плечи гена SecAdh.
Достигнув у С. autoethanogenum DSM23693 нокаута или гена 2,3bdh, или гена SecAdh, у данных мутантов по одному гену оказывали направленной действие на второй ген, с применением либо плазмилы pMTL85151-2,3bdh-KO, либо плазмиды pMTL85151-SecAdh-KO. Плазмиду вводили в мутант с одним нокаутированным геном либо путем электропорации, либо путем конъюгации, как уже описано в примере 1 и 3. Проводили скрининг трансформантов на нокаут второго гена с использованием праймеров, фланкирующих гомологичные плечи соответствующих генов.
(б) Нарушение двух генов A2,3bdh ASecAdh с использованием ClosTron:
Кассету ermB RAM в конструкции с интроном группы II ClosTron фланкировали сайтами рекомбинации, распознаваемыми флиппазой (Frt). Путем введения рекомбиназы-флиппазы в мутант A2,3bdh ClosTron, либо путем конъюгации, либо путем электропорации, маркер ermB RAM размером -1,3 т.п.н. удаляли из генома мутанта и, таким образом, маркер ermB используют повторно. Фрагмент интрона группы II размером -0,8 т.п.н. оставлен в геноме. Этот факт подтверждали (i) тестированием его чувствительности к кларитромицину и (ii) с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими место вставки интрона группы II, Og42f (Seq. ID. 84) и Og43r (Seq. ID. 85) и секвенирования ПЦР-продукта. Получив му
- 30 031093 тант A2,3bdh ClosTron без маркера ermB RAM (A2,3bdh-ermB ClosTron), аналогичным образом оказывают направленное действие на ген SecAdh у мутанта, применяя инструмент ClosTron для инсерционной инактивации с помощью интрона группы II. В гене SecAdh идентифицировали место интронной вставки между основаниями 399 и 400 на смысловой нити, используя алгоритм Perutka, размещенный на ClosTron.com, и конструируют кассету, направляющую интрон (Seq. ID. 110). Кассету, направляющую интрон, коммерчески синтезировали в DNA2.0 и доставляли в векторе pMTL007C-E2 в виде pMTL007C-E5SecAdh-399!400s, который вводили в мутант A2,3bdh-ermB ClosTron либо путем конъюгации, либо электропорации. Последовательно проводили селекцию трансформантов на чашках с агаром с тиамфениколом и кларитромицином, и проводят скрининг с помощью ПЦР с праймерами SecCTf (Seq. ID. 111) и SecCTr (Seq. ID. 112), как объяснено ранее в примере 3.
Мутант С. autoethanogenum DSM23693 с нарушением двух генов A2,3bdh ASecAdh создавали, применяя либо метод гомологичной рекомбинации, либо с помощью инструмента ClosTron для инсерционной инактивации с использованием интрона группы II, как объяснено в приведенных выше абзацах.
Нарушение генов 2,3bdh и SecAdh и выработки ацетоина, других метаболитов и 2,3-БДО подтверждали проведением анализов ферментативной активности для превращения ацетоина в 2,3-БДО и также с помощью анализа продуктов, вырабатываемых мутантом, с помощью ВЭЖХ, как описано ранее.
Пример 5. Модифицированный штамм DSM23693 С. autoethanogenum, вырабатывающий сниженное количество 2,3-БДО или не вырабатывающий 2,3-БДО
Как показано на фиг. 1, ацетолактат представляет собой одно из промежуточных соединений в биосинтезе 2,3-БДО и также представляет собой предшественник для синтеза аминокислот с разветвленной цепью. Фермент ацетолактатсинтаза катализирует реакцию, ведущую к образованию ацетолактата из 2 молекул пирувата в качестве субстратов. Фермент ацетолактатсинтаза в целом классифицируют на две группы: (i) анаболическая ацетолактатсинтаза связана с генами, вовлеченными в синтез аминокислот с разветвленной цепью, таких как валин, изолейцин и лейцин, и (ii) катаболическая ацетолактатсинтаза связана с синтезом 2,3-БДО (alsS; аминокислота - AEI90719.1 и нуклеиновая кислота - HQ876013.1).
Геном С. autoethanogenum DSM23693 имеет 3 предпологаемых гена анаболической ацетолактатсинтазы, ilvC, ilvl и ilvB. Типичная аминокислотная последовательность из С. autoethanogenum (AEI90719.1, AEI90730.1, AEI90731.1, AEI90713.1, AEI90714.1), С. ljungdahlii (ADK15104.1, ADK15104.1,
ADK15105.1, ADK15400.1, ADK15400.1) и С. ragsdalei (AEI90734.1, AEI90734.1, AEI90735.1, AEI90727.1, AEI90727.1) и соответствующие нуклеотидные последовательности из С. autoethanogenum (HQ876013.1, HQ876023.1, HQ876021.1), С. ljungdahlii (CP001666.1 -CLJU_c38920, CLJU_c32420, CLJU_c20420-30) и С. ragsdalei (HQ876014.1, HQ876024.1, HQ876022.1) получены из GenBank.
Нарушение всех 4 генов ацетолактатсинтазы или любой комбинации данных 4 генов должно приводить к снижению в выработки ацетоина и 2,3-БДО. Для обеспечения роста данных мутантов в среду добавляля три аминокислоты с разветвленной цепью, валин, лейцин и изолейцин.
Как описано в примерах 1, 3 и 4, мутантов по одному гену С. autoethanogenum DSM23693, alsS, ilvC, ilvl и ilvB, можно получать либо путем гомологичной рекомбинации, либо применяя инструмент ClosTron для мутагенеза на основе интрона группы II.
Конструирование кассет для нокаутирования alsS, ilvC, ilvl и ilvB
Конструкции для нокаутирования генов alsS, ilvC, ilvl и ilvB сконструированы, как объяснено выше. 5'- (Seq. ID. 113) и 3'- (Seq. ID. 114) гомологичные плечи гена alsS размером ~1 т.п.н. амплифицируют с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. autoethanogenum DSM23693. Для амплификации 5'- и 3'гомологичных плеч использовали праймеры alsS5f (Seq. ID. 115)/alsS5r (Seq. ID. 116) и alsS3f (Seq. ID. 117)/alsS3r (Seq. ID. 118) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-alsS-KO. Данную плазмиду вводили в С. autoethanogenum DSM23693 либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут alsS с использованием праймеров alsSOf (Seq. ID. 119) и alsSOr (Seq. ID. 120), которые фланкируют гомологичные плечи alsS, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Для нокаутирования гена ilvC 5'-(Seq. ID. 121) и 3'-(Seq. ID. 122) гомологичные плечи гена ilvC размером ~1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. autoethanogenum DSM23693. Для амплификации 5'- и 3'-гомологичных плеч использовали праймеры ilvC5f (Seq. ID. 123)/ilvC5r (Seq. ID. 124) и ilvC3f (Seq. ID. 125)/ilvC3r (Seq. ID. 126) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151ilvC-KO. Данную плазмиду вводили в С. autoethanogenum DSM23693 либо путем конъюгации, либо электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут ilvC с использованием праймеров ilvCOf (Seq. ID. 127) и ilvCOr (Seq. ID. 128), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvC, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Для нокаутирования гена ilvl 5'- (Seq. ID. 129) и 3'- (Seq. ID. 130) гомологичные плечи гена ilvl размером ~1 т.п.н. амплифицируют с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. autoethanogenum
- 31 031093
DSM23693. Для амплификации 5'- и 3'-гомологичных плеч используют праймеры ilvl5f (Seq. ID. 131) / ilvl5r (Seq. ID. 132) и ilvl3f (Seq. ID. 133)/ilvl3r (Seq. ID. 134) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151 -ilvlKO. Данную плазмиду вводили в С. autoethanogenum DSM23693 либо путем конъюгации, либо электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом можно проводить скрининг трансформантов на нокаут ilvl с писпользованием праймеров ilvlOf (Seq. ID. 135) и ilvlOr (Seq. ID. 136), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvl, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Для нокаутирования гена ilvB 5'-(Seq. ID. 137) и 3'-(Seq. ID. 138) гомологичные плечи гена ilvB размером ~1 т.п.н. амплифицируют с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. autoethanogenum DSM23693. Для амплификации 5'- и 3'-гомологичных плеч использовали праймеры ilvB5f (Seq. ID. 139) / ilvB5r (Seq. ID. 140) и ilvB3f (Seq. ID. 141)/ilvB3r (Seq. ID. 142) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvBKO. Данную плазмиду вводили в С. autoethanogenum DSM23693 либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут ilvB, используя праймеры ilvBOf (Seq. ID. 143) и ilvBOr (Seq. ID. 144), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvB, для ПЦР и секвенирования ПЦР-продукта.
После получения мутантов с нокаутом одного гена последовательно оказывали направленное действие на другие 3 гена ацетолактатсинтазы для получения мутанта, характеризующегося удалением всех 4 генов ацетолактатсинтазы. Рост данных мутантов может быть ауксотрофным по отношению к аминокислотам с разветвленной цепью. Выработку или отсутствие выработки ацетоина, 2-3-БДО и других метаболитов в данных мутантах можно анализировать с помощью ВЭЖХ, как описано для приведенных выше примеров. Анализы ферментативной активности с пируватом в качестве субстрата и тиаминдифосфатом и флавинадениндинуклеотидом в качестве кофакторов можно проводить для подтверждения потери активности ацетолактатсинтазы у данных мутантов (Tittmann, Vyazmensky, Hubner, Barak & Chipman, 2005; Vinogradov et al, 2006).
Конструирование кассет ClosTron, направляющих интрон группы II, для генов alsS, ilvC, ilvl и ilvB
Гены alsS, ilvC, ilvl и ilvB С. autoethanogenum DSM23693 можно также нарушать или инактивировать с применением инструмента ClosTron для нарушения генов, опосредованного интроном группы II (Heap et al., 2010). Алгоритм Perutka, размещенный на ClosTron.com, применяют для идентификации сайта-мишени для интрона группы II между основаниями 303/ 304, 228/229, 975/976 и 157/158 на смысловой нити генов alsS, ilvC, ilvl и на антисмысловой нити гена ilvB соответственно. Можно также нацеливаться на другие сайты, идентифицированные с помощью алгоритма. Тот же алгоритм применяли для конструирования интрон-направляющих участков (alsS - Seq. ID.145; ilvC - Seq. ID.146; ilvl - Seq. ID.147 и ilvB - Seq. ID.148), которые можно коммерчески синтезировать в DNA2.0 и доставлять в векторе pMTL007CE2. Итоговые векторы, pMTL007C-E2-alsS-303!304s, pMTL007C-E2-ilvC-228!229s, pMTL007C-E2-ilvl975!976s и pMTL007C-E2-ilvB-157! 158a содержат маркер ermB, активируемый ретротранспозицией (RAM), который придает устойчивость к антибиотику кларитромицину при вставке в сайт-мишень. Данные плазмиды вводили в С. autoethanogenum DSM23693 либо путем конъюгации, либо электропорации. Проводили последовательную селекцию трансформантов на чашках с агаром с тиамфениколом и кларитромицином и скрининг с помощью ПЦР с использованием праймеров alsSCTf (Seq. ID. 149) и alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) и ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvlCTf (Seq. ID. 153) и ilvlCTr (Seq. ID. 154) и ilvBCTf (Seq. ID. 155) и ilvBCTr (Seq. ID. 156) для инактивации генов alsS, ilvC, ilvl и ilvB соответственно.
После получения мутантов ClosTron с одним нарушенным геном кассету ermB RAM удаляли из генома данных мутантов с применением плазмид pMTL, несущих ген флиппазы, которую вводили в мутант либо путем электропорации, либо путем конъюгации. Проводили скрининг полученных трансформантов на потерю кассеты ermB путем тестирования их чувствительности к кларитромицину и (ii) с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими место вставки интрона группы II, alsSCTf (Seq. ID. 149) и alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) и ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvlCTf (Seq. ID. 153) и ilvBICTr (Seq. ID. 154) и ilvBCTf (Seq. ID. 155) и ilvBCTr (Seq. ID. 156) в генах alsS, ilvC, ilvB1 и ilvB2 соответственно и путем дополнительного секвенирования данных ПЦР-продуктов.
После подтверждения потери кассеты ermB на мутанов ClosTron, подобно нокаутным, оказывают направленное действие для инактивации других генов ацетолактатсинтазы. Согласно одному варианту реализации изобретения данные мутанты ClosTron выращивают в присутствии аминокислот с разветвленной цепью. Продукцию или отсутствие выработки ацетоина, 2,3-БДО и других метаболитов в данных мутантах можно анализировать с помощью ВЭЖХ, как описано в привденных выше примерах. Анализы ферментативной активности с пируватом в качестве субстрата и тиаминдифосфатом и флавинадениндинуклеотидом в качестве кофакторов можно проводить для подтверждения потери активности ацетолак
- 32 031093 татсинтазы у данных мутантов (Tittman et al, 2005; Vinogradov et al, 2006).
Пример 6. Нарушение генов пути 2,3-БДО у С. Ijungdhalii и С. ragsdalei
Путь получения 2,3-БДО является консервативным среди ацетогенов, включая С. autoethanogenum, С. Ijungdahlii и С. ragsdalei. Гены alsS, ilvC, ilvl ilvB, budA, 2,3bdh и SecAdh у трех ацетогенов имеют высокую степень гомологии последовательностей. Следовательно, данные гены можно генетически модифицировать для повышения или снижения уровня выработки 2,3-БДО у данных трех ацетогенов. Описан способ генетической модификации С. Ijungdahlii путем электропорации (Kopke et al., 2010) (PCT/NZ2011/000203). Для С. ragsdalei любой специалист может применять способы электропорации и конъюгации, которые описаны выше для С. autoethanogenum.
Аминокислотные и нуклеотидные последовательности для генов alsS, ilvC, ilvB1, ilvB2, budA и 2,3bdh С. Ijungdahlii и С. ragsdalei могут быть получены из GenBank. Предложены нуклеотидные последовательности SecAdh С. Ijungdahlii (Seq. ID. 36) и С. ragsdalei (Seq. ID. 37).
Плазмиды для нокаутирования и плазмиды ClosTron, которые применяли для нарушения генов alsS, ilvC, ilvB1 ilvB2, budA, 2,3bdh и SecAdh путем гомологичной рекомбинации и инсерционной инактивации на основе интрона группы II ClosTron у С. Autoethanogenum, можно также применять для нарушения тех же генов С. Ijungdahlii и С. ragsdalei. Например, pMTL85141-budA-ko, pMTL007C-E5-budA-450!451s и pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s можно вводить в С. Ijungdahlii (объяснено ниже, в примере 6а) и С. ragsdalei (объяснено ниже, в примере 6б) или путем электропорации, или конъюгации, как описано выше для С. autoethanogenum в примере 1 и 3. Аналогичный скрининг мутантов и способы характеризации можно применять для С. Ijungdahlii и С. ragsdalei.
Пример 6а. Нарушение генов budA и 2,3bdh у С. Ljungdahlii с помощью гомологичной рекомбинации и инструмента для инсерционной инактивации на основе интрона группы II для достижения отсутствия выработки 2,3-БДО и ее снижения
Плазмиды pMTL85141-budA-ko вводили в С. Ijungdahlii путем электропорации (Koepke et al 2010). Проводили отбор трансформантов на чашках с агаризованной средой РЕТС, содержащей 15 мкг/мл тиамфеникола, и скрининг на нокаут budA с использованием праймеров Og44f (Seq. ID. 29) и Og45r (Seq. ID. 30).
Для нарушений генов budA и 2,3bdh у С. Ljungdahlii, с применением инструмента ClosTron для инсерционной инактивации на основе интрона группы II, плазмиды pMTL007C-E5-budA-450!451s и pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s вводят в С. Ijungdahlii путем конъюгации. Штрихи единичных колоний после конъюгации последовательно наносили сначала на агаризованную среду РЕТС, содержащую 15 мкг/мл тиамфеникола и 10 мкл/мл триметоприма, с последующим нанесением на чашки с агаризованной средой РЕТС, содержащей 5 мкг/мл кларитромицина. Скрининг колоний на плазмиду на предмет вставки интрона группы II проводили случайным образом с помощью ПЦР с использованием праймеров Og44f (Seq. ID. 29) и Og45r (Seq. ID. 30), фланкирующих место вставки интрона группы II в гене budA, и праймеров Og42f (Seq. ID. 84) и Og43r (Seq. ID. 85), фланкирующих место вставки интрона группы II в гене
2,3-bdh.
Мутантов с нокаутированными budA и 2,3bdh и мутантов по budA и 2,3bdh ClosTron С. Ijungdahlii, полученных выше, анализировали на предмет выработки 2,3-БДО и ацетоина с помощью ВЭЖХ и ферментации в биореакторах, как объяснено в примерах 1 и 3.
Пример 6б: Нарушение генов budA и 2,3bdh у C. ragsdalei путем гомологичной рекомбинации и инструмента для инсерционной инактивации на основе интрона группы II для достижения отсутствия выработки 2,3-БДО и ее снижения
Плазмиды pMTL85141-budA-ko вводили в C. ragsdalei путем электропорации, как описано выше для С. autoethaogenum или C. Ijungdahlii, либо путем электропорации, либо конъюгации. Отбор трансформантов проводили на чашках с агаризованной средой PETC, содержащей 15 мкг/мл тиамфеникола, и проводят скрининг на нокаут budA с использованием праймеров Og44f (Seq. ID. 29) и Og45r (Seq. ID. 30).
Для нарушений генов budA и 2,3bdh у C. ragsdalei с применением инструмента ClosTron для инсерционной инактивации на основе интрона группы II плазмиды pMTL007C-E5-budA-450!451s и pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s вводят в C. ragsdalei путем конъюгации. Штрихи единичных колоний после конъюгации последовательно наносили сначала на агаризованную среду РЕТС, содуржащую 15 мкг/мл тиамфеникола и 10 мкг/мл триметоприма, с последующим нанесением на чашки с агаризованный средой РЕТС, содержащей 5 мкг/мл кларитромицина. Скрининг колоний на плазмиду на вставку интрона группы II проводили случайным образом с помощью ПЦР с использованием праймеров Og44f (Seq. ID. 29) и Og45r (Seq. ID. 30), фланкирующих место вставки интрона группы II в гене budA, и праймеров Og42f (Seq. ID. 84) и Og43r (Seq. ID. 85), фланкирующих место вставки интрона группы II в гене 2,3-bdh.
Мутантов с нокаутированными budA and 2,3bdh и мутантов по budA и 2,3bdh ClosTron, полученных выше, анализировали на предмет выработки 2,3-БДО и ацетоина с помощью ВЭЖХ и ферментации в биореакторах, как объяснено в примерах 1 и 3.
Пример 7. Модифицированный С. Ijungdahlii, вырабатывающий только ацетоин
Как объяснено ранее, отделение ацетоина от этанола является технически более целесообразным, по сравнению с 2,3-БДО. Таким образом, желательно иметь штамм С. Ijungdahlii, вырабатывающий аце
- 33 031093 тоин, а не 2,3-БДО. Это может быть достигнуто путем удаления или нарушения как гена 2,3bdh, так и гена SecAdh, двумя способами, как объяснено в примере 6а: (а) гомологичной рекомбинацией и (б) безмаркерным нарушением гена с применением инструмента ClosTron.
(а) Штамм С. Ijungdahlii с нокаутом двух генов A2,3bdh ASecAdh, полученный в результате гомологичной рекомбинации:
5'-(Seq. ID. 94) и 3'- (Seq. ID. 95) гомологичные плечи генов 2,3bdh размером ~1 т.п.н. амплифицируют с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. Ijungdahlii. Для амплификации 5'- и 3'гомологичных плеч использовали праймеры Og13f (Seq. ID. 96)/Og14r (Seq. ID. 97) и Og15f (Seq. ID. 98)/Og16r (Seq. ID. 99) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-2,3bdh-KO. Данную плазмиду вводили в С. Ijungdahlii либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенном выше примере 6а. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут 2,3bdh с использованием праймеров Og33f (Seq. ID.100) и Og34r (Seq. ID.101), которые фланкируют гомологичные плечи 2,3bdh, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Плазмиду для нокаутирования гена SecAdh конструировали аналогичным образом. 5'- (Seq. ID. 102) и 3'- (Seq. ID. 103) гомологичные плечи генов SecAdh размером ~1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. Ijungdahlii. Для амплификации 5'- и 3'-гомологичных плеч использовали праймеры Sec5f (Seq. ID. 104)/Sec5r (Seq. ID. 105) и Sec3f (Seq. ID. 106)/Sec3r (Seq. ID. 107) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-SecAdh-KO. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут SecAdh с использованием для ПЦР праймеров SecOf (Seq. ID. 108) и SecOr (Seq. ID. 109), которые фланкируют гомологичные плечи гена SecAdh.
Сразу после получения нокаута либо гена 2,3bdh, либо гена SecAdh у С. ljungdahlii, у данных мутантов по одному гену оказывали направленное действие на второй ген с применением либо плазмиды pMTL85151-2,3bdh-KO, либо плазмиды pMTL85151-SecAdh-KO. В мутант с одним нокаутированным геном вводили плазмиду либо путем электропорации, либо путем конъюгации, как уже описано в примере 6а. Скрининг трансформантов на нокаут второго гена проводят с использованием праймеров, фланкирующих гомологичные плечи соответствующих генов.
(б) Нарушение двух генов A2,3bdh ASecAdh у С. ljungdahlii с применением ClosTron:
Кассета ermB RAM в конструкции с интроном группы II ClosTron фланкирована сайтами рекомбинации, распознаваемыми флиппазой (Frt). Путем введения рекомбиназы-флиппазы в мутант A2,3bdh ClosTron либо путем конъюгации, либо путем электропорации, маркер ermB RAM размером ~1,3 т.п.н. удаляют из генома мутанта и, таким образом, маркер ermB можно использовать повторно. Фрагмент интрона группы II размером ~0,8 т.п.н. останется в геноме. Этот факт подтверждали (i) тестированием его чувствительности в кларитромицину и (ii) с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими место вставки интрона группы II, Og42f (Seq. ID. 84) и Og43r (Seq. ID. 85), и секвенирования ПЦР-продукта. Сразу после получения мутанта A2,3bdh ClosTron без маркера ermB RAM (A2,3bdh-ermB ClosTron), подобным образом оказывали направленное действие на ген SecAdh у мутанта, применяя инструмент ClosTron для инсерционной инактивации с помощью интрона группы II. В гене SecAdh идентифицировали место интронной вставки между основаниями 399 и 400 на смысловой нити с применением алгоритма, размещенного на ClosTron.com, и кассету, направляющую интрон, коммерчески синтезировали в DNA2.0 и доставляли в векторе pMTL007C-E2 в виде pMTL007C-E5-SecAdh-399!400s, который вводили в мутант A2,3bdh-ermB ClosTron либо путем конъюгации, либо электропорации. Последовательно проводили селекцию трансформантов на чашках с агаром с тиамфениколом и кларитромицином, и проводят скрининг трансформантов с помощью ПЦР с праймерами SecCTf (Seq. ID. 111) и SecCTr (Seq. ID. 112), как объяснено выше в примере 6а.
Мутант с нарушением двух генов A2,3bdh ASecAdh С. ljungdahlii получали, применяя либо метод гомологичной рекомбинации, либо инструмент ClosTron для инсерционной инактивации на основе интрона группы II, как объяснено в приведенных выше абзацах.
Нарушение генов 2,3bdh and SecAdh и выработки метаболитов и 2,3-БДО подтверждали путем проведения анализов ферментативной активности в отношении превращения ацетоина в 2,3-БДО и также путем анализа продуктов, вырабатываемых мутантом, с помощью ВЭЖХ, как описано ранее.
Пример 8. Модифицированный штамм С. ljungdahlii, вырабатывающий сниженное количество 2,3БДО или не вырабатывающий 2,3-БДО
Как показано на фиг. 1, ацетолактат является одним из промежуточных соединений в биосинтезе
2,3-БДО и также представляет собой предшественник для синтеза аминокислот с разветвленной цепью. Фермент ацетолактатсинтаза катализирует реакцию, ведущую к образованию ацетолактата из 2 молекул пирувата в качестве субстратов. Фермент ацетолактатсинтаза в общем классифицируют на две группы: (i) анаболическая ацетолактатсинтаза связана с генами, участвующими в синтезе разветвленных аминокислот, таких как валин, изолейцин и лейцин, и (ii) катаболическая ацетолактатсинтаза связана с синтезем 2,3-БДО.
- 34 031093
Геном С. ljungdahlii имеет 3 предполагаемых гена анаболической ацетолактатсинтазы, ilvC, ilvl и ilvB, и 1 ген катаболической ацетолактатсинтазы, alsS. Типичная аминокислотная последовательность из С. ljungdahlii (ADK15104.1, ADK15104.1, ADK15105.1, ADK15400.1, ADK15400.1) и соответствующие нуклеотидные последовательности из С. ljungdahlii (CP001666.1, CLJU_c38920, CLJU_c32420, CLJU_c20420-30) получены из GenBank.
Нарушение всех 4 генов ацетолактатсинтазы или любой комбинации данных 4 генов будет приводить к снижению выработки ацетоина и 2,3-БДО. Для обеспечения роста данных мутантов в среду добавляют три аминокислоты с разветвленной цепью, валин, лейцин и изолейцин.
Как описано в примерах 6а и 7, мутанты С. ljungdahlii по одному гену alsS, ilvC, ilvl и ilvB могут быть получены либо путем гомологичной рекомбинации, либо применяя инструмент ClosTron для мутагенеза на основе интрона группы II.
Конструирование кассет для нокаутирования alsS, ilvC, ilvl и ilvB
Конструкции для нокаутирования генов alsS, ilvC, ilvl и ilvB конструировали, как объяснено выше.
5'- (Seq. ID. 113) и 3'- (Seq. ID. 114) гомологичные плечи гена alsS размером ~ 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. ljungdahlii. Для амплификации 5'- и 3'гомологичных плеч применяли праймеры alsS5f (Seq. ID. 115)/alsSr(Seq. ID. 116) и alsS3f (Seq. ID. 117)/alsS3r (Seq. ID. 118) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-alsS-KO. Данную плазмиду вводили в С. ljungdahlii либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут alsS, используя праймеры alsSOf (Seq. ID. 119) и alsSOr (Seq. ID. 120), которые фланкируют гомологичные плечи alsS, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта. Для нокаутирования гена ilvC 5'- (Seq. ID. 121) и 3'- (Seq. ID. 122) гомологичные плечи гена ilvC размером ~ 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. Ijungdahlii. Для амплификации 5'- и 3'-гомологичных плеч использовали праймеры ilvC5f (Seq. ID. 123)/ilvC5r (Seq. ID. 124) и ilvC3f (Seq. ID. 125) / ilvC3r (Seq. ID. 126) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между Sbf1/ Not1 and Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvC-KO. Данную плазмиду вводили в С. Ijungdahlii либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут ilvC с использованием праймеров ilvCOf (Seq. ID. 127) и ilvCOr (Seq. ID. 128), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvC, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Для нокаутирования гена ilvl 5'- (Seq. ID. 129) и 3'- (Seq. ID. 130) гомологичные плечи гена ilvl размером ~1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. Ijungdahlii. Для амплификации 5'- и 3'-гомологичных плеч используют праймеры ilvl5f (Seq. ID. 131)/Nvl5r (Seq. ID. 132) и iM3f (Seq. ID. 133) / Nvl3r (Seq. ID. 134) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтеми Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvl-KO. Данные плазмиды вводили в С. Ijungdahlii либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут ilvl с использованием праймеров ilvlOf (Seq. ID.135) и ilvlOr (Seq. ID. 136), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvl, для ПЦР и секвенирования ПЦР-продукта.
Для нокаутирования гена ilvB 5'- (Seq. ID. 137) и 3'- (Seq. ID. 138) гомологичные плечи гена ilvB размером ~ 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. Ijungdahlii. Для амплификации 5'- и 3'-гомологичных плеч использовали праймеры ilvB5f (Seq. ID. 139)/ilvB5r (Seq. ID. 140) и ilvB3f (Seq. ID. 141)/ilvB3r (Seq. ID. 142) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvB-KO. Данную плазмиду вводили в С. Ijungdahlii либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в вышеприведенных примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут ilvB с использованием праймеров ilvBOf (Seq. ID.143) и ilvBOr (Seq. ID. 144), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvB, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Сразу после получения мутантов с нокаутом одного гена, последовательно оказывали направленное действие на другие три гена ацетолактатсинтазы с получением мутанта, у которого все 4 гена ацетолактатсинтазы удалены. Рост данных мутантов может быть ауксотрофным по отношению к аминокислотам с разветвленной цепью. Продукцию или отсутствие выработки ацетоина, 2,3-БДО и других метаболитов у данных мутантов можно анализировать с помощью ВЭЖХ, как описано в предшествующих примерах. Анализы ферментативной активности с пируватом в качестве субстрата и тиаминдифосфатом и флавинадениндинуклеотидом в качестве кофакторов можно проводить для подтверждения потери активности ацетолактатсинтазы у данных мутантов (Tittmann, Vyazmensky, Hubner, Barak, & Chipman, 2005; Vinogradov et al., 2006).
Конструирование кассет, направляющих интрон группы II ClosTron, для генов alsS, ilvC, ilvl и ilv
Гены alsS, ilvC, ilvl и ilvB С. Ijungdahlii можно также нарушать или инактивировать, применяя ин
- 35 031093 струмент ClosTron для нарушения генов, опосредованного интроном группы II (Heap et al., 2010). Алгоритм Perutka, размещенный на ClosTron.com, применяли для идентификации сайта-мишени для интрона группы II между основаниями 303/ 304, 228/229, 975/976 и 157/158 на смысловой нити генов alsS, ilvC, ilvl и антисмысловой нити гена ilvB соответственно. На другие сайты, идентифицированные с помощью алгоритма, можно также нацеливаться. Тот же алгоритм применяют для конструирования участков, направляющих интрон (alsS - Seq. ID. 145; ilvC - Seq. ID. 146; ilvl - Seq. ID. 147 и ilvB - Seq. ID. 148), которые коммерчески синтезировали в DNA2.0 и доставляют в векторе pMTL007C-E2. Итоговые векторы pMTL007C-E2-alsS-303!304s, pMTL007C-E2-ilvC-228!229s, pMTL007C-E2-ilvl-975!976s и pMTL007C-E2ilvB-157!158a содержат маркер епиВ, активируемый ретротранспозицией (RAM), который придает устойчивость к антибиотику кларитромицину при вставке в сайт-мишень. Данные плазмиды вводили в С. Ijungdahlii любо путем конъюгации, либо электропорации. Проводили последовательную селекцию трансформантов на чашках с агаром с тиамфениколом и кларитромицином, и проводили скрининг трансформантов с помощью ПНР с использованием праймеров alsSCTf (Seq. ID. 149) и alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) и ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvlCTf (Seq. ID. 153) и ilvlCTr (Seq. ID. 154) и ilvBCTf (Seq. ID. 155) и ilvBCTr (Seq. ID. 156) для инактивации генов alsS, ilvC, ilvl и ilvB соответственно.
Сразу после получения мутантов ClosTron с одним нарушенным геном, кассету с епиВ RAM удаляли из генома данных мутантов с применением плазмид pMTL, несущих ген флиппазы, которые вводили в мутант либо путем электропорации, либо путем конъюгации. Проводили скрининг полученных трансформантов на потерю кассеты епиВ путем тестирования их чувствительности к кларитромицину и (ii) с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими сайт вставки интрона группы II, alsSCTf (Seq. ID. 149) и alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) и ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvlCTf (Seq. ID. 153) и ilvlCTr (Seq. ID. 154) и ilvBCTf (Seq. ID. 155) и ilvBCTr (Seq. ID. 156) в генах alsS, ilvC, ilvBl и ilvB2 соответственно и путем дополнительного секвенирования данных ПЦР-продуктов. После подтверждения потери кассеты епиВ, на мутанты ClosTron, подобно мутантам-нокаутам, последовательно оказывали направленное действие для инактивации других генов ацетолактатсинтазы. Согласно одному варианту реализации изобретения данных мутантов ClosTron выращивали в присутствии аминокислот с разветвленной цепью. Выработку или отсутствие выработки ацетоина, 2,3-БДО и других метаболитов у данных мутантов анализировали с помощью ВЭЖХ, как описано в предшествующих примерах и изучали проведением анализов ферментативной активности с пируватом в качестве субстрата и тиаминдифосфатом и флавинадениндинуклеотидом в качестве кофакторов, которые можно проводить для подтверждения потери активности ацетолактатсинтазы у данных мутантов (Tittmann et al., 2005; Vinogradov et al., 2006).
Пример 9: Модифицированный C. ragsdalei, вырабатывающий только ацетоин
Как объяснено ранее, отделение ацетоина от этанола является технически более целесообразным, по сравнению с 2,3-БДО. Таким образом, желательно иметь штамм С. ragsdalei, вырабатывающий ацетоин, а не 2,3-БДО. Данный штамм может быть получен удалением или нарушением как гена 2,3bdh, так и гена SecAdh, двумя способами, как объяснено в примере 66: (а) гомологической рекомбинацией и (б) безмаркерным нарушением генов с применением инструмента ClosTron.
(а) Штамм с нокаутом двух генов A2,3bdh ASecAdh С. ragsdalei, полученный в результате гомологичной рекомбинации:
5'- (Seq. ID. 94) и 3'- (Seq. ID. 95) гомологичные плечи генов 2,3bdh размером ~ 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. ragsdalei. Для амплификации 5'- и 3'гомологичных плеч использовали праймеры Ogl3f (Seq. ID. 96) / Ogl4r (Seq. ID. 97) и Ogl5f (Seq. ID. 98) / Ogl6r (Seq. ID. 99) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL 85151 между сайтами Sbfl/ Notl и Nhel/Ascl с получением pMTL85151-2,3bdh-KO. Данную плазмиду вводили в С. ragsdalei либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенном выше примере 66. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут 2,3bdh с использованием праймеров Og33f (Seq. Ш.100) и Og34r (Seq. ID.101), которые фланкируют гомологичные плечи 2,3bdh, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Плазмиду для нокаутирования гена SecAdh конструировали подобным образом. 5'-(Seq. Ш. 102) и 3'- (Seq. ID. 103) гомологичные плечи генов SecAdh размером - 1 т.п.н.
амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. ragsdalei. Для амплификации 5'- и 3'-гомологичных плеч использовали праймеры Sec5f (Seq. ID. 104) / Sec5r (Seq. ID. 105) и Sec3f (Seq. ID. 106) / Sec3r (Seq. ID. 107) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbfl/ Notl и Nhel/Ascl с получением pMTL85151-SecAdh-KO. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут SecAdh с использованием для ПЦР праймеров SecOf (Seq. ID. 108) и SecOr (Seq. ID. 109), которые фланкируют гомологичные плечи гена SecAdh.
Сразу после получения нокаута либо гена 2,3bdh, либо гена SecAdh, у С. ragsdalei, оказывали направленное действие на второй ген у данных мутантов по одному гену с применением либо плазмиды pMTL85151-2,3bdh-KO, либо плазмиды pMTL85151-SecAdh-KO. Плазмиду вводили в мутант с нокаутом
-36031093 одного гена либо путем электропорации, либо путем конъюгации, как уже описано в примере 6б. Проводили скрининг трансформантов на нокаут второго гена с использованием праймеров, фланкирующих гомологичные плечи соответствующих генов.
(б) Нарушение двух генов A2,3bdh ASecAdh у С. ragsdalei с применением ClosTron:
Кассету с ermB RAM в конструкции с интроном группы II ClosTron фланкировали сайтами рекомбинации, распознаваемыми флиппазой (Frt). Путем введения рекомбиназы-флиппазы в мутант A2,3bdh ClosTron либо путем конъюгации, либо путем электропорации, маркер ermB RAM размером -1,3 т.п.н удаляют из генома мутанта, и, таким образом, маркер ermB можно использовать повторно. Фрагмент интрона группы II размером -0,8 т.п.н. останется в геноме. Этот факт подтверждали (i) тестированием его чувствительности к кларитромицину и (ii) с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими место вставки интрона группы II, с праймерами Og42f (Seq. ID. 84) и Og43r (Seq. ID. 85) и секвенирования ПЦР-продукта. Сразу после получения мутанта A2,3bdh ClosTron без маркера ermB RAM (A2,3bdh-ermB ClosTron), подобным образом оказывали направленное действие на ген SecAdh у мутанта с применением инструмента ClosTron для инсерционной инактивации на основе интрона группы II. Место вставки интрона между основаниями 399 и 400 на смысловой нити в гене SecAdh идентифицировали с применением алгоритма Perutka, размещенного на ClosTron.com, и конструируют кассету, направляющую интрон (Seq. ID. 110). Кассету, направляющую интрон, коммерчески синтезировали в DNA2.0 и доставляли в векторе pMTL007C-E2 в виде pMTL007C-E5-SecAdh-399!400s, который вводили в мутант A2,3bdh-ermB ClosTron либо путем конъюгации, либо электропорации. Можно последовательно проводить селекцию тарнсформантов на чашках с агаром с тиамфениколом и кларитромицином и скрининг трансформантов с помощью ПЦР с праймерами SecCTf (Seq. ID. 111) и SecCTr (Seq. ID. 112), как объяснено ранее в примере 6б.
Мутанта С. ragsdalei с нарушением двух генов A2,3bdh ASecAdh получали, применяя либо метод гомологичной рекомбинации, либо инструмент ClosTron для инсерционной инактивации на основе интрона группы II, как объяснено в приведенном выше абзаце.
Нарушение генов 2,3bdh и SecAdh подтверждали проведением анализов ферментативной активности в отношении превращения ацетоина в 2,3-БДО, а также анализом метаболитов и 2,3-БДО, выработанных мутантом, с помощью ВЭЖХ, как описано ранее.
Пример 10: Модифицированный штамм С. ragsdalei, вырабатывающий сниженное количество 2,3БДО или не вырабатывающий его
Как показано на фиг. 1, ацетолактат является одним из промежуточных соединений в биосинтезе
2,3-БДО и также является предшественником для синтеза аминокислот с разветвленной цепью. Фермент ацетолактатсинтаза катализирует реакцию, ведущую к образованию ацетолактата из 2 молекул пирувата в качестве субстратов. Фермент ацетолактатсинтаза в общем классифицируют на две группы: (i) анаболическая ацетолактатсинтаза связана с генами, участвующими в синтезе аминокислот с разветвленной цепью, таких как валин, изолейцин и лейцин, и (ii) катаболическая ацетолактатсинтаза связана с синтезом 2,3-БДО.
Геном С. ragsdalei имеет 3 предпологаемых гена анаболической ацетолактатсинтазы ilvC, ilvl и ilvB и 1 ген катаболической ацетолактатсинтазы alsS. Типичная аминокислотная последовательность из С. ragsdalei (AEI90734.1, AEI90734.1, AEI90735.1, AEI90727.1, AEI90727.1) и соответствующие нуклеотидные последовательности (HQ876014.1, HQ876024.1, HQ876022.1) получены из GenBank.
Нарушение всех 4 генов ацетолактатсинтазы или любой комбинации данных 4 генов будет приводить к снижению выработки ацетоина и 2,3-БДО. Для обеспечения роста данных мутантов в среду добавляют три аминокислоты с разветвленной цепью, валин, лейцин и изолейцин.
Как описано в примерах 6б и 9, мутантов по одному гену alsS, ilvC, ilvl и ilvB С. ragsdalei можно получать либо путем гомологичной рекомбинации, либо применяя инструмент ClosTron для мутагенеза на основе интрона группы II.
Конструирование кассет для нокаутирования alsS, ilvC, ilvl и ilvB:
Конструкции для нокаутирования генов alsS, ilvC, ilvl и ilvB конструировали, как объяснено выше.
5'- (Seq. ID. 113) и 3'- (Seq. ID. 114) гомологичные плечи гена alsS размером - 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. ragsdalei. Для амплификации 5'- и 3'-гомологичных плеч использовали праймеры alsS5f (Seq. ID. 115) / alsSr (Seq. ID. 116) и alsS3f (Seq. ID. 117) / alsS3r (Seq. ID. 118) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151alsS-KO. Данную плазмиду вводили в С. ragsdalei либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут alsS с использованием праймеров alsSOf (Seq. ID. 119) и alsSOr (Seq. ID. 120), которые фланкируют гомологичные плечи alsS, для ПЦР и секвенирования данного ПЦРпродукта.
Для нокаутирования гена ilvC 5'- (Seq. ID. 121) и 3'- (Seq. ID. 122) гомологичные плечи гена ilvC размером - 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. ragsdalei. Для ам
- 37 031093 плификации 5'- и 3'-гомологичных плеч использовали праймеры ilvC5f (Seq. ID. 123) / ilvC5r (Seq. ID. 124) и ilvC3f (Seq. ID. 125) / ilvC3r (Seq. ID.
126) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvC-KO. Данную плазмиду вводили в С. ragsdalei либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут ilvC с использованием праймеров ilvCOf (Seq. ID.
127) и ilvCOr (Seq. ID. 128), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvC, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Для нокаутирования гена ilvl 5'- (Seq. ID. 129) и 3'- (Seq. ID. 130) гомологичные плечи гена ilvl размером ~ 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. ragsdalei. Для амплификации 5'- и 3'-гомологичных плеч использовали праймеры iM5f (Seq. ID. 131)/Nvl5r (Seq. ID. 132) и iM3f (Seq. ID. 133) / Nvl3r (Seq. ID. 134) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151 -ilvl-KO. Данную плазмиду вводили в С. ragsdalei либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут ilvl с использованием праймеров ilvlOf (Seq. ID. 135) и ilvlOr (Seq. ID. 136), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvl, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Для нокаутирования гена ilvB 5'- (Seq. ID. 137) и 3'- (Seq. ID. 138) гомологичные плечи гена ilvB размером ~ 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. ragsdalei. Для амплификации 5'- и 3'-гомологичных плеч использовали праймеры ilvB5f (Seq. ID. 139)/ilvB5r (Seq. ID. 140) и ilvB3f (Seq. ID. 141)/ilvB3r (Seq. ID. 142) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды pMTL85151 между сайтами Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvB-KO. Данную плазмиду вводили в С. ragsdalei либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут ilvB с использованием праймеров ilvBOf (Seq. ID.143) и ilvBOr (Seq. ID.144), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvB для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Сразу после получения нокаутных мутантов по одному гену, последовательно оказывали направленное действие на другие 3 гена ацетолактатсинтазы с получением мутанта, у которого удалены все 4 гена ацетолактатсинтазы. Рост данных мутантов может быть ауксотрофным в отношении аминокислот с разветвленной цепью. Продукцию или отсутствие выработки ацетоина, 2,3-БДО и других метаболитов в данных мутантах можно анализировать с помощью ВЭЖХ, как описано в предшествующих примерах. Для подтверждения потери активности ацетолактатсинтазы у данных мутантов можно проводить анализы ферментативной активности с пируватом в качестве субстрата и тиаминдифосфатом и флавинадениндинуклеотидом в качестве кофакторов (Tittmann, Vyazmensky, Hubner, Barak, & Chipman, 2005; Vinogradov et al., 2006).
Конструирование кассет, направляющих интрон группы II ClosTron, для генов alsS, ilvC, ilvl и ilvB:
Гены alsS, ilvC, ilvl и ilvB С. ragsdalei можно также нарушать или инактивировать, применяя инструмент ClosTron для нарушения генов, опосредованного интроном группы II (Heap et al., 2010). Алгоритм Perutka, размещенный на ClosTron.com, применяли для идентификации сайта-мишени для интрона группы II между основаниями 303/304, 228/229, 975/976 и 157/158 на смысловой нити генов alsS, ilvC, ilvl и антисмысловой нити гена ilvB соответственно. Можно также нацеливаться на другие сайты, идентифицированные с помощью алгоритма. Тот же алгоритм применяли для конструирования интроннаправляющих участков (alsS - Seq. ID.145; ilvC - Seq. ID.146; ilvl - Seq. ID.147 и ilvB - Seq. ID.148), которые коммерчески синтезировали в DNA2.0 и доставляли в векторе pMTL007C-E2. Итоговые векторы pMTL007C-E2-alsS-303!304s, pMTL007C-E2-ilvC-228!229s, pMTL007C-E2-ilvl-975!976s и pMTL007C-E2ilvB-157!158a содержат маркер ermB, активируемый ретротранспозицией (RAM), который придает устойчивость к антибиотику кларитромицину при вставке в сайт-мишень. Данные плазмиды вводили в С. ragsdalei либо путем конъюгации, либо электропорации. Последовательно проводили селекцию трансформантов на чашках с агаром с тиамфениколом и кларитромицином и скрининг трансформантов с помощью ПЦР с праймерами alsSCTf (Seq. ID. 149) и alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) и ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvlCTf (Seq. ID. 153) и ilvlCTr (Seq. ID. 154) и ilvBCTf (Seq. ID. 155) и ilvBCTr (Seq. ID. 156) для инактивации генов alsS, ilvC, ilvl и ilvB соответственно.
Сразу после получения мутантов ClosTron с одним разрушенным геном, кассету ermB RAM удаляли из генома данных мутантов, применяя плазмиды pMTL, несущие ген флиппазы, которых вводят в мутант либо путем электропорации, либо путем конъюгации.
Проводили скрининг полученных трансформантов на предмет потери кассеты ermB путем тестирования их чувствительности к кларитромицину и (ii) с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими место вставки интрона группы II, alsSCTf (Seq. ID. 149) и alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) и ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvlCTf (Seq. ID. 153) и ilvlCTr (Seq. ID. 154) и ilvBCTf (Seq. ID. 155) и ilvBCTr (Seq. ID. 156) в генах alsS, ilvC, ilvB и ilvB2 соответственно и путем дополнительного секвенирования данных ПЦР-продуктов.
- 38 031093
После подтверждения потери кассеты ermB на мутантов ClosTron, подобно нокаутным мутантам, последовательно оказывают направленное действие для инактивации других генов ацетолактатсинтазы. Согласно одному варианту реализации данных мутантов ClosTron выращивают в присутствии аминокислот с разветвленной цепью. Продукцию или отсутствие выработки ацетоина, 2,3-БДО и других метаболитов в данных мутантах анализируют с помощью ВЭЖХ, как описано в предыдущих примерах, и изучают путем проведения анализов ферментативной активности с пируватом в качестве субстрата и тиаминдифосфатом и флавинадениндинуклеотидом в качестве кофакторов, которые можно проводить для подтверждения потери активности ацетолактатсинтазы у данных мутантов (Tittmann et al., 2005; Vinogradov et al., 2006).
В настоящей заявке описано изобретение со ссылкой на определенные предпочтительные варианты реализации для того, чтобы позволить читателю использовать настоящее изобретение на практике без чрезмерного экспериментирования. Однако средний специалист в данной области техники быстро осознает, что многие компоненты и параметры могут быть изменены или модифицированы до определенной степени или заменены на известные эквиваленты без отступления от объема настоящего изобретения. Следует учесть, что такие модификации и эквиваленты включаны в настоящую заявку, как если бы они были изложены по отдельности. Названия, заголовки или тому подобное предложены для улучшения понимания данного документа читателем, и их не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Полные описания всех заявок, патентов и публикаций, процитированных выше и ниже, в случае необходимости, включены в настоящую заявку посредством ссылки. Однако ссылка на любые заявки, патенты и публикации в данном описании изобретения не является, и ее не следует воспринимать как признание или любую форму указания на то, что они составляют действующий уровень техники или образуют часть общего знания в любой стране мира.
По всему объему данного описания изобретения и следующей далее формулы изобретения, если в контексте не указано иное, слова содержит, содержащий и тому подобное следует истолковывать во включительном смысле, в отличие от исключительного смысла, то есть, в смысле включающий, но не ограничивающийся указанными.
- 39 031093
Источники:
Abrini, J, Naveau, H. & Nyns, E.J., 1994. Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Archives of microbiology, 161(4), pp.345-351. Available at:
http://www.springerlink.com/index/vl43151w30423660.pdf [Accessed September 4, 2011].
Collins, M. D., Lawson, P. A., Willems, A., Cordoba, J. J., Fernandez-Garayzabal, J., Garcia, P., Cai, J., et al. (1994). The phylogeny of the genus Clostridium: proposal of five new genera and eleven new species combinations. International journal of systematic bacteriology, 44(4), 812-26. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7981107
Drake, H. L., Kusel, K., Matthies, C., Wood, H. G., & Ljungdahl, L. G. (2006). Acetogenic Prokaryotes. In M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, & E. Stackebrandt (Eds ), The Prokaryotes (3rd Editio., pp. 354-420). New York, NY: Springer. doi:10.1007/0-387-307427
Корке, M., Mihalcea, C., Liew, F., Tizard, J. H., Ali, M. S„ Conolly, J. J., Al-Sinawi, B., et al. (2011). 2,3-Butanediol Production By Acetogenic Bacteria, an Alternative Route To Chemical Synthesis, Using Industrial Waste Gas. Applied and environmental microbiology, 77(15), 546775. doi: 10.1128/AEM.00355-11
Perez, J. M., Richter, H., Loftus, S. E., & Angenent, L. T. (2012). Biocatalytic reduction of short-chain carboxylic acids into their corresponding alcohols with syngas fermentation. Biotechnology and bioengineering, 1-30. doi:10.1002/bit.24786
Smart KF, Aggio RB, Van Houtte JR, Villas-Boas SG, Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry, Nat Protoc. 2010 Sep;5(10):1709-29. 2010
Tanner, R. S., Miller, L. M., & Yang, D. (1993). Clostridium ljungdahlii sp. nov., an acetogenic species in clostridial rRNA homology group I. International journal of systematic bacteriology, 43(2), 232. Retrieved from http://ijs.sgmjournals.Org/content/43/2/232.short
Heap, J. T„ Kuehne, S. a, Ehsaan, M., Cartman, S. T„ Cooksley, С. M., Scott, J. C., & Minton, N. P. (2010). The ClosTron: Mutagenesis in Clostridium refined and streamlined. Journal of microbiological methods, 80(1), 49-55. doi:10.1016/j.mimet.2009.10.018
Корке, M., Held, C., Hujer, S., Liesegang, H., Wiezer, A., Wollherr, A., Ehrenreich, A., et al. (2010). Clostridium ljungdahlii represents a microbial production platform based on syngas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(29), 13087-92. doi: 10.1073/pnas. 1004716107
Tittmann, K., Vyazmensky, M., Hubner, G., Barak, Z„ & Chipman, D. M. (2005). The carboligation reaction of acetohydroxyacid synthase II: steady-state intermediate distributions in wild type and mutants by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(3), 553-8. doi:10.1073/pnas.0408210101
Vinogradov, V., Vyazmensky, M., Engel, S., Belenky, I., Kaplun, A., Kryukov, O., Barak, Z., et al. (2006). Acetohydroxyacid synthase isozyme I from Escherichia coli has unique catalytic and regulatory properties. Biochimica et biophysica acta, 1760(3), 356-63. doi:10.1016/j.bbagen.2005.10.008
Yan, Y„ Lee, C.-С., & Liao, J. C. (2009). Enantioselective synthesis of pure (R,R)-2,3butanediol in Escherichia coli with stereospecific secondary alcohol dehydrogenases. Organic & biomolecular chemistry, 7(19), 3914-7. doi:10.1039/b913501d
- 40 031093
СПОСОБ ЕГО
Перечень последовательностей <110> Lanzatech New Zealand Limited
Koepke, Michael
Chen, Wendy Y
Nagaraju, Shilpa <120> РЕКОМБИНАНТНЫЙ КАРБОКСИДОТРОФНЫЙ АЦЕТОГЕННЫЙ МИКРООРГАНИЗМ, ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ <130>
<150>
<151>
<160>
<170>
<210>
<211>
<212>
<213>
<400>
LT74PCT
US 61/593269
2012-01-31
156
Патент в версии 3.5
719
ДНК
Clostridia autoethanogenum atggatgatg gtttcggggc ggtataggta aggactaaac gtagtcactg gatataagaa atggaaggta aagcctatgg tatgtggttg tttcatftca aggtgaaagt tgtatgatgg cttttaaagg ctgatggcag aactggaaaa aagaattgga aatttaatta ctgaagttgt gatttaggtg taaataaaga tttatgtaca tatggaagta cccaaaccat ctgtgrttca tctagatggt cgtatacgta ttataatact cagctttata tgtaaaaaca taaagatcag tcctgattat taagaaattt gaactgttct caagatagaa atatatcaaa ttatctaaac gaactaactc tgttccaaaa tataatattc aatgcgaagg gtttttataa
239
ПРТ Clostridium autoethanogenum gaaagcaaaa cgtactgttg cctatgtttg gttgaaggcc ggtggacata tgctttagga acgatgagat tgtctacaat ttcttaaaaa ttttaaatgg acgtatccgt aaaatcgtac atatatttta taaaacagaa aatataacgg ttaatgtccc taagtgaatt tggaacttcc aacaagtgtt aaatgcactt aggaaacttt aactttttat tccttttgct ttcttatgaa tgctttctat tatgccttat tgttgatgga tggatatcat ttccattgaa taaaaagaaa gaaaaataa 719
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660 <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
Met ASp ASp Glu val LyS val pro Asn His lie туг Gln Met Ser Thr
1 5 10 15
Ile ASH Ala Leu Val Ser Gly Leu Tyr Asp Gly cys val Ser Leu Ser
20 25 30
Lys Leu Leu LyS LyS Gly Asn phe Gly lie Gly Thr phe LyS Gly Leu
35 40 45
Asp Gly Glu Leu Thr Leu Leu Asn Gly Thr Phe Tyr Arg Thr Lys Pro
55 60
Asp Gly Ser Val Tyr Val cys Ser Lys Asn Val Ser Val Pro Phe Al a
65 70 75 80
val val Thr Glu Leu Glu Asn Tyr Asn Thr Tyr Asn ile Gln Asn Arg
85 90 95
Thr Ser Tyr Glu Asp Ile Arg Lys Glu Leu Asp Ser Phe Ile Glu Ser
- 41 031093
100 105 110
LyS ASn lie phe туг Ala Phe Tyr Met Glu Gly LyS Phe ASn Tyr val
115 120 125
LYS Thr Arg Thr Val Val LYS Gln Asn Met Pro Tyr Lys Pro Met Ala
130 135 140
Glu val val Lys ASp Gln pro Met Phe Glu туг ASn Gly val ASp Gly
145 150 155 160
Tyr Val val Gly Phe Arg Cys Pro Asp Tyr Val Glu Gly Leu Asn Val
165 170 175
pro Gly туг His Phe His phe lie ASn Lys Asp LyS Lys phe Gly Gly
180 185 190
His Ile Ser Glu Phe Ser lie Glu Asn Ala Lys Val Tyr Val Gln Asn
195 200 205
cys Ser Cys Phe Arg Met G1 u Leu Pro Lys Asn Glu Ser Phe Tyr ASn
210 215 220
Met Glu val Gln Asp Arg Asn Asp Glu ile Thr ser val Glu Lys
225 230 235
<210> 3 <211> 964 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 3 tttcttcaca ggaaaatata cttcagtaac aagatcttta ggaatggtga cttggtgggg 60 gtcagttaca tatacttcat atggtgggtt tgtaagttta tatccttcat tttctaccca 120 ttccctcaac ttagcatata cagagatgtt aattctgaat atgagcccct taaaacagac 180 ttcgcacaaa ggactccagg caagtatctt gttcccttta caatctcctt tatcggaatg 240 gcaagttctg tatcattgcc agaaggattg tattcagcgc tgtgataaat agttattggc 300 ttaccaagaa agtcaattac aaaaatatat ataaagaaag caaagctaca tatattaaag 360 catttaaggt aaaactaaaa atattataaa aatgaaatta ttttttctca tagctaaagt 420 tacataatac gaggaggatt tataatgaaa aaagtaatag gaattataag tattgtacta 480 tttgtactcg tagcacttca atcctgtgct gcaggagtag gaaatgcatt aagtaataac 540 aaagaagcta gtggatctgc tggattattt ttatctgtat gtatgcttat tgctggaata 600 atagcaataa tatcaaaata tagtaaaggt atgactataa cagctatagt attttatttg 660 ttagcttttg ttgtagggat tgctaatgtt gggcattttt cagatttgca aatttggtca 720 atcattaact tgatatttgc tggactattg atatttcatt tgcttaaaaa taagcaatta 780 tataatagca gtgggaaaaa gtagaatcat atattgtaat tatttttaat tatgttggca 840 aaattgaaat tgtcactgaa acacctctaa atgttttaaa tacatatgtt taattattgt 900 gacagattct aatagtagaa agtagaaatt tgctatgtta taatgacata gaggtgaatg 960 taat 964 <210> 4 <211> 977 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 4 actagacagt gctaataaca atgtctagtg ctttttatct tgctcaattt tttcattgag 60 ttcatttaag taagtccacc tgtccatctt ttcgtctagc tctttttcca gtgaattctt 120
- 42 031093
ttcggataag agatcttcaa gaagtgcata atcagatgaa gcagcttcca tttctatttt 180
cttttcagat atagattttt ctagatgttc aattacctca tctattttgt caaactccat 240
ttgttctgca taggtaaatt ttagaggctt ttctttttgc aacttatagt tgtttttagc 300
tgtatttttc ttagagctta ttttttcctc tgatattttt gcagttttgt gaaaatagga 360
atagtttcct gtatattgag tgattttacc gtttccttca aaagaaaata ttttatcaac 420
tgttttgtca aggaagtacc tgtcatgaga tacagctata acagctcctt caaaatcgtt 480
aatataatct tctaggattg taagtgtttc tatatccaga tcatttgttg gttcgtccag 540
caaaagtaca ttagggtaat tcatcagtat ttttagaaga tataatcttc ttcgttctcc 600
tcctgaaagt tttccaaggg gagtccattg aactgaaggt tcaaataaaa aattttcaag 660
tacagcagaa gcacttattt tttcacccga tgaagttgac gcatattctg atgtcccacg 720
tatgtattca attacccttt cgttcatatc catatcagaa attccctgag aatagtatcc 780
tatctttact gtttcaccta tatctatagt gccgctgtcc ggcagaattt tttgaactaa 840
aatattcata agagtggatt taccacttcc attaggtcca ataataccta ttctgtcatt 900
atttagtatg ttataagtga aatttttaat taatgtcttt tcaccaaaac ttttgcttat 960
gttatccagg tttatga 977
<210> 5
<211> 40
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<22О>
<223> Синтетический праймер <400> 5 attcatcctg caggtttctt cacaggaaaa tatacttcag 40 <210> 6 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> Синтетический праймер <400> 6 gactgcggcc gcattacatt cacctctatg tcattataac 40 <210> Ί <211> 38 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> Синтетический праймер <400> 7 atttgctagc actagacagt gctaataaca atgtctag 38 <210> 8 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 8
- 43 031093 atatggcgcg cctcataaac ctggataaca taagc 35 <210> 9 <211> 2963 <212> ДНК <213> Escherichia coli <400> 9
cctgcaggat aaaaaaattg tagataaatt ttataaaata gttttatcta caattttttt 60
atcaggaaac agctatgacc gcggccgctg tatccatatg accatgatta cgaattcgag 120
ctcggtaccc ggggatcctc tagagtcgac gtcacgcgtc catggagatc tcgaggcctg 180
cagacatgca agcttggcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg 240
cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga 300
agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcta 360
gcataaaaat aagaagcctg catttgcagg cttcttattt ttatggcgcg ccgcattcac 420
ttcttttcta tataaatatg agcgaagcga ataagcgtcg gaaaagcagc aaaaagtttc 480
ctttttgctg ttggagcatg ggggttcagg gggtgcagta tctgacgtca atgccgagcg 540
aaagcgagcc gaagggtagc atttacgtta gataaccccc tgatatgctc cgacgcttta 600
tatagaaaag aagattcaac taggtaaaat cttaatatag gttgagatga taaggtttat 660
aaggaatttg tttgttctaa tttttcactc attttgttct aatttctttt aacaaatgtt 720
cttttttttt tagaacagtt atgatatagt tagaatagtt taaaataagg agtgagaaaa 780
agatgaaaga aagatatgga acagtctata aaggctctca gaggctcata gacgaagaaa 840
gtggagaagt catagaggta gacaagttat accgtaaaca aacgtctggt aacttcgtaa 900
aggcatatat agtgcaatta ataagtatgt tagatatgat tggcggaaaa aaacttaaaa 960
tcgttaacta tatcctagat aatgtccact taagtaacaa tacaatgata gctacaacaa 1020
gagaaatagc aaaagctaca ggaacaagtc tacaaacagt aataacaaca cttaaaatct 1080
tagaagaagg aaatattata aaaagaaaaa ctggagtatt aatgttaaac cctgaactac 1140
taatgagagg cgacgaccaa aaacaaaaat acctcttact cgaatttggg aactttgagc 1200
aagaggcaaa tgaaatagat tgacctccca ataacaccac gtagttattg ggaggtcaat 1260
ctatgaaatg cgattaaggg ccggccagtg ggcaagttga aaaattcaca aaaatgtggt 1320
ataatatctt tgttcattag agcgataaac ttgaatttga gagggaactt agatggtatt 1380
tgaaaaaatt gataaaaata gttggaacag aaaagagtat tttgaccact actttgcaag 1440
tgtaccttgt acctacagca tgaccgttaa agtggatatc acacaaataa aggaaaaggg 1500
aatgaaacta tatcctgcaa tgctttatta tattgcaatg attgtaaacc gccattcaga 1560
gtttaggacg gcaatcaatc aagatggtga attggggata tatgatgaga tgataccaag 1620
ctatacaata tttcacaatg atactgaaac attttccagc ctttggactg agtgtaagtc 1680
tgactttaaa tcatttttag cagattatga aagtgatacg caacggtatg gaaacaatca 1740
tagaatggaa ggaaagccaa atgctccgga aaacattttt aatgtatcta tgataccgtg 1800
gtcaaccttc gatggcttta atctgaattt gcagaaagga tatgattatt tgattcctat 1860
ttttactatg gggaaatatt ataaagaaga taacaaaatt atacttcctt tggcaattca 1920
agttcatcac gcagtatgtg acggatttca catttgccgt tttgtaaacg aattgcagga 1980
attgataaat agttaacttc aggtttgtct gtaactaaaa acaagtattt aagcaaaaac 2040
atcgtagaaa tacggtgttt tttgttaccc taagtttaaa ctcctttttg ataatctcat 2100
gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 2160
caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 2220
accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 2280
ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt 2340
aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 2400
- 44 031093 accagtggct gttaccggat ggagcgaacg gcttcccgaa gctgccagtg aaggcgcagc acctacaccg gggagaaagg gcgataagtc ggtcgggctg aactgagata cggacaggta gtgtcttacc aacggggggt cctacagcgt tccggtaagc gggttggact tcgtgcacac gagctatgag ggcagggtcg caagacgata agcccagctt aaagcgccac gaacaggaga
2460
2520
2580
2640 gcgcacgagg ccacctctga aaacgccagc gttctttcct tgataccgct agagcgccca <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
gtaaaacgac ggccag 16 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
gagcttccag cttgagcgtc aacgcggcct gcgttatccc cgccgcagcc atacgcaggg ggggaaacgc gatttttgtg ttttacggtt ctgattctgt gaacgaccga ccc 2963 ctggtatctt atgctcgtca cctggccttt ggataaccgt gcgcagcgag
ДНК искусственная последовательность
Синтетический праймер
ДНК искусственная
Синтетический caggaaacag ctatgacc <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
4819
ДНК искусственная последовател ьность праймер последовател ьность tatagtcctg ggggggcgga tgctggcctt attaccgcct tcagtgagcg tcgggtttcg gcctatggaa ttgctcacat ttgagtgagc aggaagcgga
2700
2760
2820
2880
2940
Плазмида pMTL85141-budA-ko для нокаутирования гена budA 12 cctgcaggtt tcttcacagg aaaatatact tcagtaacaa gatctttagg aatggtgact60 tggtgggggt cagttacata tacttcatat ggtgggtttg taagtttata tccttcattt120 tctacccatt ccctcaactt agcatataca gagatgttaa ttctgaatat gagcccctta180 aaacagactt cgcacaaagg actccaggca agtatcttgt tccctttaca atctccttta240 tcggaatggc aagttctgta tcattgccag aaggattgta ttcagcgctg tgataaatag300 ttattggctt accaagaaag tcaattacaa aaatatatat aaagaaagca aagctacata360 tattaaagca tttaaggtaa aactaaaaat attataaaaa tgaaattatt ttttctcata420 gctaaagtta cataatacga ggaggattta taatgaaaaa agtaatagga attataagta480 ttgtactatt tgtactcgta gcacttcaat cctgtgctgc aggagtagga aatgcattaa540 gtaataacaa agaagctagt ggatctgctg gattattttt atctgtatgt atgcttattg600 ctggaataat agcaataata tcaaaatata gtaaaggtat gactataaca gctatagtat660
- 45 031093 tttatttgtt agcttttgtt gtagggattg ctaatgttgg gcatttttca gatttgcaaa 720 tttggtcaat cattaac-ttg atatttgctg gactattgat atttcatttg cttaaaaata 780 agcaattata taatagcagt gggaaaaagt agaatcatat attgtaatta tttttaatta 840 tgttggcaaa attgaaattg tcactgaaac acctctaaat gttttaaata catatgttta 900 attattgtga cagattctaa tagtagaaag tagaaatttg ctatgttata atgacataga 960 ggtgaatgta atgcggccgc tgtatccata tgaccatgat tacgaattcg agctcggtac 1020 ccggggatcc tctagagtcg acgtcacgcg tccatggaga tctcgaggcc tgcagacatg 1080 caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc 1140 aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc 1200 gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc tagcagtatt 1260 gatagaaaaa aacactagac agtgctaata acaatgtcta gtgcttttta tcttgctcaa 1320 ttttttcatt gagttcattt aagtaagtcc acctgtccat cttttcgtct agctcttttt 1380 ccagtgaatt cttttcggat aagagatctt caagaagtgc ataatcagat gaagcagctt 1440 ccatttctat tttcttttca gatatagatt tttctagatg ttcaattacc tcatctattt 1500 tgtcaaactc catttgttct gcataggtaa attttagagg cttttctttt tgcaacttat 1560 agttgttttt agctgtattt ttcttagagc ttattttttc ctctgatatt tttgcagttt 1620 tgtgaaaata ggaatagttt cctgtatatt gagtgatttt accgtttcct tcaaaagaaa 1680 atattttatc aactgttttg tcaaggaagt acctgtcatg agatacagct ataacagctc 1740 cttcaaaatc gttaatataa tcttctagga ttgtaagtgt ttctatatcc agatcatttg 1800 ttggttcgtc cagcaaaagt acattagggt aattcatcag tatttttaga agatataatc 1860 ttcttcgttc tcctcctgaa agttttccaa ggggagtcca ttgaactgaa ggttcaaata 1920 aaaaattttc aagtacagca gaagcactta ttttttcacc cgatgaagtt gacgcatatt 1980 ctgatgtccc acgtatgtat tcaattaccc tttcgttcat atccatatca gaaattccct 2040 gagaatagta tcctatcttt actgtttcac ctatatctat agtgccgctg tccggcagaa 2100 ttttttgaac taaaatattc ataagagtgg atttaccact tccattaggt ccaataatac 2160 ctattctgtc attatttagt atgttataag tgaaattttt aattaatgtc ttttcaccaa 2220 aacttttgct tatgttatcc aggtttatga cttttttacc ggcgcgccgc attcacttct 2280 tttctatata aatatgagcg aagcgaataa gcgtcggaaa agcagcaaaa agtttccttt 2340 ttgctgttgg agcatggggg ttcagggggt gcagtatctg acgtcaatgc cgagcgaaag 2400 cgagccgaag ggtagcattt acgttagata accccctgat atgctccgac gctttatata 2460 gaaaagaaga ttcaactagg taaaatctta atataggttg agatgataag gtttataagg 2520 aatttgtttg ttctaatttt tcactcattt tgttctaatt tcttttaaca aatgttcttt 2580 tttttttaga acagttatga tatagttaga atagtttaaa ataaggagtg agaaaaagat 2640 gaaagaaaga tatggaacag tctataaagg ctctcagagg ctcatagacg aagaaagtgg 2700 agaagtcata gaggtagaca agttataccg taaacaaacg tctggtaact tcgtaaaggc 2760 atatatagtg caattaataa gtatgttaga tatgattggc ggaaaaaaac ttaaaatcgt 2820 taactatatc ctagataatg tccacttaag taacaataca atgatagcta caacaagaga 2880 aatagcaaaa gctacaggaa caagtctaca aacagtaata acaacactta aaatcttaga 2940 agaaggaaat attataaaaa gaaaaactgg agtattaatg ttaaaccctg aactactaat 3000 gagaggcgac gaccaaaaac aaaaatacct cttactcgaa tttgggaact ttgagcaaga 3060 ggcaaatgaa atagattgac ctcccaataa caccacgtag ttattgggag gtcaatctat 3120 gaaatgcgat taagggccgg ccagtgggca agttgaaaaa ttcacaaaaa tgtggtataa 3180 tatctttgtt cattagagcg ataaacttga atttgagagg gaacttagat ggtatttgaa 3240 aaaattgata aaaatagttg gaacagaaaa gagtattttg accactactt tgcaagtgta 3300 ccttgtacct acagcatgac cgttaaagtg gatatcacac aaataaagga aaagggaatg 3360 aaactatatc ctgcaatgct ttattatatt gcaatgattg taaaccgcca ttcagagttt 3420
- 46 031093 aggacggcaa tcaatcaaga tggtgaattg gggatatatg atgagatgat accaagctat 3480 acaatatttc acaatgatac tgaaacattt tccagccttt ggactgagtg taagtctgac 3540 tttaaatcat ttttagcaga ttatgaaagt gatacgcaac ggtatggaaa caatcataga 3600 atggaaggaa agccaaatgc tccggaaaac atttttaatg tatctatgat accgtggtca 3660 accttcgatg gctttaatct gaatttgcag aaaggatatg attatttgat tcctattttt 3720 actatgggga aatattataa agaagataac aaaattatac ttcctttggc aattcaagtt 3780 catcacgcag tatgtgacgg atttcacatt tgccgttttg taaacgaatt gcaggaattg 3840 ataaatagtt aacttcaggt ttgtctgtaa ctaaaaacaa gtatttaagc aaaaacatcg 3900 tagaaatacg gtgttttttg ttaccctaag tttaaactcc tttttgataa tctcatgacc 3960 aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 4020 ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 4080 ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 4140 actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc 4200 caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 4260 gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 4320 ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 4380 cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 4440 cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 4500 acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 4560 ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 4620 gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 4680 tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat 4740 accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag 4800 cgcccaatac gcagggccc 4819 <210> 13 <211> 1460 <212> днк <213> Clostridium autoethanogenum <400> 13 ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgctta acacatgcaa gtcgagcgat gaagctcctt60 cgggagtgga ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctacct caaagagggg120 gatagcctcc cgaaagggag attaataccg cataataatc agttttcaca tggagactga180 tttaaaggag taatccgctt tgagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtagggtaa240 cggcctacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cattggaact300 gagagacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa360 gcctgatgca gcaacgccgc gtgagtgaag aaggttttcg gattgtaaag ctctgtcttt420 ggggacgata atgacggtac ccaaggagga agccacggct aactacgtgc cagcagccgc480 ggtaatacgt aggtggcgag cgttgtccgg aattactggg cgtaaagagt gcgtaggcgg540 atatttaagt gagatgtgaa atacccgggc ttaacccggg cactgcattt caaactggat600 atctagagtg cgggagagga gaatggaatt cctagtgtag cggtgaaatg cgtagagatt660 aggaagaaca ccagtggcga aggcgattct ctggaccgta actgacgctg aggcacgaaa720 gcgtgggtag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtacta780 ggtgtaggag gtatcgaccc cttctgtgcc gcagtaaaca caataagtac tccgcctggg840 aagtacgatc gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcagcggag900 catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttacctg gacttgacat accctgaata960 tcttagagat aagagaagcc cttcggggca gggatacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag1020
- 47 031093
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440 ctcgtgtcgt taacatttag gacgtcaaat agagagaagc aggctgaaac gtgaatacgt cgaagtccgt agtcgtaaca gagatgttag ttgagcactc catcatgccc aagaccgcaa tcgcctacat tcccgggcct agtctaactt aggtagccgt gttaagtcct tagcaagact cttatgtcca ggtggagcaa gaagttggag tgtacacacc aggaggacgc 1460 gcaacgagcg gccgcggtta gggcaacaca acctcaaaaa ttgctagtaa gcccgtcaca ggccgaaggt caacccctgt acgcggagga cgtgctacaa ctgcccccag tcgcgaatca ccatgagagc ggggttagta tgttagttgc aggtggggat tgggcagtac ttcggattgc gaatgtcgcg tggcaacacc attggggtga <210> 14 <211> 677 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 14 aagaacmttg gggtgagtma taataccgca agatggaccc gtagccgacc gggaggcagc gagtgaagaa aaggaggaag ttgtccggaa asccgggctt atgkaattcy gcgattckct <210> <2 lb <212> <213> <400>
720 saaaktccst cacgtgggta , taataatcag gcggcgcatt . tgagagggtg agtggggaat · ggttttcgga ccacggstaa ttactgggcg aaccygggyw taktgtascg i ggaccgt 677 asycstwmgc rrgaggggga gagaytgwtt tagggtaacg ttggaactga gggcgaaagc ctgtctttgg racsatggwg acctaccycr ttttcacatg agctagttgg atcggccaca attgcacaat ttgtaaagct ctacgkgcca scakccgcgg taaakastgc gtakgcggat ctgywtttca mactggatat gtgaartgcs takasattak
ДНК
Clostridium autoethanogenum kkagkrrmyy tagcctcccs taaaggagta gcctaccaag sagacggtcc ctgatgcagc ggacgataat taatacgtas atttaaktga ctakagtgcg gaasaacacc mgcrrysgac aaagggagat atccgctttg gcgackatgc asactcctac aacgccgcgt gacggtaccc gtggcgagcg satgtgaaat ggagaggasa mktggcgaak
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660 trarakkgak cyysgrtccc kkgrmswcst ggyarggtaa csgymwrcyw rgrysacgak60 gcgtmgycra cctgaraggg tgatcggcca cmttggaact gagagacggt ccaractcct120 acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa gcctgatgca gcaacgccgc180 gtgagtgaag aaggttttcg gattgtaaag ctctgtcttt ggggacgata atgacggtmc240 ccaaggagga agccacggct aactacgtgc cascagccgc ggtaatacgt aggtggcrag300 cgttgtccgg aattactggg cgtaaagagt gcgtaggcgg atatttaagt gagatgtgaa360 atacccgggc ttaacccggg cactgcwttt caaactggat atctakagtg cgggagagga420 gaatgkaatt cctagtgtag cggtgaaatg cgtakagatt aggaagaaca ccmgtggcga480 akgcgattct ctggaccgta actgayrctg akgcacgaag cgtggggtak cawacakgat540 tagatacyct ggtrstccac rccgtaaacg atgagtayta kgtgtakgag kwtcsacccc600 cttctgtgcc ssmmtaraca ymmyaaktac tcccgcckcr aagtmsawcg cmagatkaaa660 amtcrwmgsa rtkrwggggg ggcsgcmcta acatcgsast wrkwkkttsr attawarcaa720 <210> 16 <211> 960 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum
- 48 031093
<400> 16
taaaggagta atccgytttg agatggaccc gcggcgcatt agctwgttgg tagggtaacg 60
gcctaccmwg gcgackatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ttggaactga 120
gagacggtcc aractcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgaaagc 180
ctgatgcagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga ttgtaaagct ctgtctttgg 240
ggacgataat gacggtaccc aaggaggaag ccacggstaa ctacgtgcca scagccgcgg 300
taatacgtag gtggcgagcg ttgtccggaa ttactgggcg taaagagtgc gtaggcggat 360
atttaagtga gatgtgaaat acccgggctt aacccgggyw ctgcatttca aactggatat 420
ctagagtgcg ggagaggaga atggaattcc tagtgtagcg gtgaartgcg takagattak 480
gaagaacacc agtggcgaag gcgattctct ggaccgtrac tgacgctgag gcacgaaagc 540
gtgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccacrc cgtaaacgat gagtactakg 600
tgtaggaggt atcgacccct tctgtgccgc agtaaacaca ataagtacty ckcctgggaa 660
gtacgatcgc aagattaaaa ctcaasgaak tgacaggsgc ccgcacwagc akcgasyatg 720
tggtttattc gaagcacgcg aagaacctta cctggacttg acataccctg mwatctwtas 780
ataagagagc scttcgggtc aggatrcagt cgtgcatggt gtcgtcwgct cgtgtcrtga 840
gatgtagtar tctgcaacsa kcgyacyctg tggyagtgct acatgmtsag cmtctagcag 900
actgcgmgta sccgsagagy ggggatgacg tcgakcatca tgycctyagt cmcgyctacr 960
<210> 17
<211> 676
<212> днк
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 17
atttkggsar aktccgkakg caaggtgasc cgtargcttg gatccyggga akksryrgsw 60
grgtamcysk kgkstwrswt mccssgraga rggggawags ctcccgaaag ggagattamt 120
accgcataat aatcagtttt cacatggaga ctgatttaaa ggagtaatcc gctttgagat 180
ggacccgcgg cgcattagct agttggtagg gtaacggcct accaaggcga ckatgcgtag 240
ccgacctgag agggtgatcg gccacwttgg aactgagaga cggtccasac tcctacggga 300
ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gaaagcctga tgcagcaacg ccgcgtgagt 360
gaagaaggtt ttcggattgt aaagctctgt ctttggggac gataatgacg gtacccmasg 420
aggargccmc ggsyaactac gkgccwscmk ccgcggtaat acrtaggtgg cragcgttgt 480
ccggaattac tgggcgtaaa kagtgcgtak gcggatattt aaktgagatg tgaaryascc 540
gggcttaacc cgggcwctgy atttcwmayt ggatatctmk agtgcgggrg aggagaatgg 600
awgtyctakk gtamcsgtga artgcstaka satwmkgmas aacaycwstg gcgwarrcgr 660
ytcgswggac cgtawc 676
<210> 18
<211> 1040
<212> днк
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 18
tagsaaaktc ytakrcaatg gtarycstwa gcttgkatrm krmwmgrsgg acgggtgagt 60
aacmckkggg taamctacyt crragarggg gatagcctcc csaaagggag attaataccg 120
cataataatc agttttcaca tggagactga tttaaaggag taatccgctt tgagatggac 180
ccgcggcgca ttagctagtt ggtagggtaa cggcctacca aggcgackat gcgtagccga 240
cctgagaggg tgatcggcca cattggaact gagagacggt ccagactcct acgggaggca 300
- 49 031093
gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa gcctgatgca gcaacgccgc gtgagtgaag 360
aaggttttcg gattgtaaag ctctgtcttt ggggacgata atgacggtac ccaaggagga 420
rgccacggst aactacgkgc cascmkccgc ggtaatacgt asgtggcgag cgttgtccgg 480
aattactggg cgtaaagagt gcgtakgcgg atatttaagt gagatgtgaa atasccggsc 540
ttaacccggg cactgcattt camactggat atctakagtg cgggagagga saatgkratt 600
cctakkgtas cggtgaaatg cstatasatt akgaasaaca ccmktgkcga akgcgawtck 660
ctggaccrtr rctgacrcts akgcaygywa gcstsgstwk cwwrcmksat yatatacccy 720
ggkrgtcmcr wcrymwmcat sagtactakg tgtmkkaggt atckmcmcct yctytgcssc 780
mkwaraamaa yawkmwcytc csccysssgr rkwacaawcr mwakatkaat agwmatggsa 840
kkkamggssg gccsccswma catcysmkct rwtrktkwat ttcaykcamk ymmsmaamka 900
acctgkmytg rsmtasccyg cycysswwtw awctaagmam agcmtcscss tamgrgwkmr 960
gwsrygsstk ygytsrtggc tmtcgtcayy tmgsrymgar aratratwst awacsmwsms 1020
aamccmykyc ywycctkstk 1040
<210> 19 <211> 674 <212> днк <213> Clostridium autoethanogenum <400> 19 ggggrtakcc tgatttaaag taacggccta actgagagac aaagcctgat tttggggacg cgcggtaata cggatattta gatatctaka atyakgmaga maagcgwgss trkgtgtmsk <210> <211> <212> <213>
tcccsaawgg gagtaatccg ccaaggcgac ggtccaract gcagcaacgc at ratgacgg cgtaggtggc agtgagatgt gtgcgggaga acmccagtgk tagcaaasat asgt 674 garaytaatw ctttgagatg gatgcgtagc cctacgggag cgcgtgagtg tacccaagga gagcgttgtc gaaatasccg ggagwatkta cgaaggcgay gattagatay ccgcataata gacccgcggc cgacctgaga gcagcagtgg aagaaggttt ggaagccacg cggaattact gscttaaccc wttcctagtg tckstggacc mcyggtagwc
1226
ДНК
Clostridium autoethanogenum atcagttttc gcattagcta gggtgatcgg ggaatattgc tcggattgta gstaactacg gggcgtaaak gggcwctgca trscggtgaa ryractgamg mcamcrmmaa acatggagac gttggtaggg scacattgga acaatgggcg aagctctgtc tgccascakc agtgcgtarg tttcwaactg atgsgkasam ctsawgcwcg csatgagkac
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660 <400> 20 crgrwycttt mggatkgkwg acttgskggg ggtcagtwmc awatactkcm wawggwgggt 60 ttgtargttt atatccttca ttttctaccc attccctcra mtwakywwat wcaragatgt 120 taayyckraa tatgarcccc ttaaaacrga sttcsmacaa aggactccwg gyaakywtct 180 kgttcccttt acawtctcct twaysrraat ggmaakttct gyatcmttgc casawggatt 240 gwwttcascg ctkygwtaaa tagttattgg cttaccwmka aagtcmwtta caaaaatata 300 tataaagaaa gcaaagctac wkatwtyaaa ksattwaagg taaarmtaaa aatatwataa 360 aawwgaamtt attttttctc wtakstaawg ttacwtaata cgaggaggat ttataatgaa 420 aaaagtaata ggawttataa ryattgwmct atttgkactm ktagcacttc aatcctgtgc 480 kgcmkgakwa ggaartgymt yaagwaatra cmwwsawksw mgwgratctg cwggatwatt 540 tttatytkka tgkatgctka ttgctggaat aatakmmatr awaycawamy wwwktamagg 600 tatgacyata acagctatag katttwattt gttakctttt gttgyaggga twgctaaygw 660
- 50 031093
tgggcatttt wcagatttgc awatttgrtc aaycwttaac twgatatttg ctggactatw 720
gatatttcat ttrctkaama wtaagmaatt atatwatakc agtggraaaa agwakaatca 780
tatrttgtaa ttatttttaa ttatgtkrrc aamwytgawa ttgwcacwga waacayctct 840
aaatgtttwr aatacatatg tttmaktakt gtgacakatw ctaatastak aaagwagaar 900
wtygctatrw watratgaca tagwggtgaa tgtaatgcsg mckctgwryc catatsacca 960
tgatrcgaat tmsagctsgg tacscsggrk atcctctrga stcgwcgtya ckcgtccatg 1020
kagatmwcga gcctggmgac atgcagctta gcwckggtcg tcatkttacw cgtcgtsact 1080
rsgtaaaacc atgacgtmcc rctgtcgcat gcwgcacrtc yccrtatcgt cagctrcgta 1140
wcgcgacyag ccgatcgatc gcctgccwcg atgccractg atgcatgcct gmcakacggc 1200
aywacaagtc taggcattac tggcca 1226
<210> 21 <211> 1236 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum
<400> 21
twwttwwacm ttactaaata atgacagaat aggtattatt ggacctaatg gaagtggtaa 60
atccactctt atgaatattt tarttcaaaa aattctgccg gacagcggca ctatagatat 120
aggtgaaaca gtaaagatag gatactattc tcagggaatt tctgatatgg atatgaacga 180
aagggtaatt gaatacatac gtgggacatc rraatatgcg tcaacttcat cigggtgaaaa 240
aakaaktgct tctgctgtac ttgaaaattt tttatttgaa ccttcagttc aatggactcc 300
ccttggaaaa ctktcaggag gagaacgaar aagattatat cttctaaaaa tactgatgaa 360
ttaccctaat gtacttttgc tggacgaacc aacaaatgat ctggatatag aaacacttac 420
aatcctagaa gattatatta acgattttga aggagctgtt atagctgtat ctcatgacag 480
gtacttcctt gacaaaacag ttgataaaat attttctttt gaaggaaacg gtaaaatcac 540
tcaatataca ggaaactatt cctattttca caaaactgca aaaatatcag aggaaaaaat 600 aagctctaag aaaaatacag ctaaaaacaa ctatragttg caaaaagaaa agcctctaaa 660 atttacctat gcagaacaaa tggagtttga caaaatagat gaggtaattg aacatctaga 720 aaaatctata tctgaaaaga aaatagaaat ggaagctgct tcatctgatt atgcacttct 780 tgaagatctc ttatccgaaa agaattcact ggaaaaagag ctagacgaaa agatggacag 840 gtggacttac ttaatgaact caatgaaaaa attgagcaag ataaaagcac tagacattgt 900 tattagcact gtctagtgct agcgccattc gccattcatg ctgcgcaact gtgggaaggg 960 cgatcggtgc ggcctcttcg ctaytacgcc agctggcgaa gggatgtgct gcaagscgat 1020 aagttggtac gccaggtttc cagtcacgac gtagwaaacg acgtcagtgc tagctgcatg 1080 tctgcagctc gagattctca tggascgtka cgtcgacytr asgatcctgg tactrrctcg 1140 attcgtatcm tggwcawtgg atmgcggcgc atamctcccc tatgcattaa catgcaattc 1200 acgtctacta tagagtctgt tccaaaatra acgcgt 1236 <210> 22 <211> 1224 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 22 gawtttttcm acttttataa catactaaat aatgacagaa taggtattat tggacctaat ggaagtggta aatccactct tatgaatatt ttarttcaaa aaattctgcc ggacagcggc actatagata taggtgaaac agtaaagata ggatactatt ctcagggaat ttctgatatg gatatgaacg aaagggtaat tgaatacata cgtgggacat caraatatgc gtcaacttca tcgggtgaaa aaataagtgc ttctgctgta cttgaaaatt ttttatttga accttcagtt
120
180
240
300
- 51 031093 caatggactc atactgatga gaaacactta tctcatgaca ggtaaaatca gaggaaaaaa aagcctctaa gaacatctag tatgcacttc aagatggaca actagacatt ctgtgggagg ctgcaagcga cccttggaaa attaccctaa caatcctaga ggtacttcct ctcaatatac taagctctaa aatttaccta aaaaatctat ttgaagatct ggtggactta gttattagca cgatcggtgc ttagttgggt actttcagga tgtacttttg agattatatt tgacaaaaca aggaaactat gaaaaataca tgcagaacaa atctgaaaag cttatccgaa cttaaatgaa ctgtctagtg gggcctyttc aacsccaggc ggagaacgaa ctggacgaac aacgattttg gttgataaaa tcctattttc gctaaaaaca atggagtttg aaaatagaaa aagaattcac ctcaatgaaa ctagcgccat gctattacgc tttcccagtc raagattata caacaaatga aaggagctgt tattttcttt acaaaactgc actataagtt acaaaataga tggaagctgc tggaaaaaga aaattgagca tcgccattca cagctgcgaa mcgacgtgta tcttctaaaa tctggatata tatagctgta tgaaggaaac aaaaatatca gcaaaaagaa tgaggtaatt ttcatctgat gctagacgaa agataaaagc ggctgmgcaa aggggatgtg aacgacgcag
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080 tgcagctgca wcgagctcga aattcmcttt <210> <211> <212> <213> <400>
tgtctgcagc ttcgaatcat ctcattagaa tcgagatctc gcawtggatc aygt 1224 atgacgckac msggccgatc gtcgactcta tgmccctakg rgatccctgt cataacatgc
1140
1200
1120
ДНК
Clostridium autoethanogenum
grrammttkw aawttaaraa attkcactta tracatacta aataatgaca gartaggkat 60
tattggacct aatggaagtg gtaaatccac tcttatgaat attttarttc aaaaaattct 120
gccsgacagc ggcactmtwk atataggtga aacagtaaag ataggatact attctcaggg 180
aatttctgat atggatatga acgaaagggk aattgaatac atacktggga catcrraata 240
tgcgtcaact tcrtcgggtg aaaaaakaag tgcttctgct gtacttgaaa attttttatt 300
tgaaccttca gttcaatgga ctycccttgg aaaamtktca ggaggagaac raaraagatt 360
atatcttcta aaaatactga tgaattaccc taatgtactt ttgctggacg aaccaacaaa 420
tgatctggat atagaaacac ttacmatcct agaagattat attwacgatt ttgaaggagc 480
tgttatagct gtrtctcatg acaggtactt ccwtgacaar acagttgatr aaatattttc 540
ttttgaagga aacggtaaaa tcactcaata tacasgaaac tattcctatt ttcacrraac 600
tgcawaaata tcagaggaaa aaatwagctc taagaaaaat acagctaaaa caactatrag 660
ttgcaaaaag aawagcctct aaatttacct atgcagaaca aatggagttt gacaaaatag 720
atgaggtaay tgaacatcta gaaaatctat atctgaaaga aaatagaatg gaagctgctt 780
catctgatta tgcacttctt garatctctt atccgaaaas rattcmctgg aaaagagcta 840
gacgaaagat ggwcagkkga cttactwaat gactcatgaa aatgakcara tawagcmcta 900
gamttgttat tagcactgtc trkgstagcg ccatcgcatt cagctgmgca actgtgggac 960
ggcgatcgtk cggctcytcg ctattacgcc agctggcaag ggaktgcctg caggcatagt 1020
gttacscwgc ttccagtccm srtkaamgac gcakgccagc tgcatgtygc agcctggatc 1080
catggacgka gctcaacyta agaatccggt ccgrcactgt 1120
<210> 24
<211> 1210
<212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 24 traaaawttk tcactkkata acatactaaa taatgmcaga rtaggtatta ttggacctaa 60
- 52 031093
tggaagtggt aawtccactc ttatgaatat tttarttcaa aaaattctgc cggacagcgg 120
cacymtagat ataggtgaaa cagyaaagat aggatactat tctcagggaa tttctgatat 180
ggatatgaac saaagggkaa ttgaatacat mcktgggaca tcrraakatg cstcaacttc 240
rtcgggtgaa aaaakaaktg cttctgctgt acttgaaaat tttttatttg aaccttcagt 300
tcaatggact ccccttggaa aactktcarg aggagaacga araarattat atcttctaaa 360
aatactgatg aattacccta atgtactttt gctggacgaa ccaacaaatg atctggatat 420
agaaacactt acaatcctag aagattatat taacgatttt gaaggagctg ttatagctgt 480
rtctcatgac aggtacttcc ttgacaarac agttgataaa atattttctt ttgaaggaaa 540
cggtaaratc actcaatata caggaaacta ttcctatttt cacaaaactg cawaaatatc 600
agaggaaaaa ataagctcta agaaaaatac agctaaaaac aackatragt tgcaaaaaga 660
aaagcctcta aratttacct atgcagaaca aatggagttt gacaaaatag atgaggtaat 720
tgaacatcta gaaaaatcta tatctgaaaa gaaaatagaa atggaagctg cttcatctga 780
ttatgcactt cttgaagatc tcttatccga aaagaattca ctggaaaaag agctagacka 840
aaagatggac aggtggactt acttaaatga actcaatgaa raaattgagc aagataaaag 900
cactagacat tgttattagc actgtctagt gctagcgcca ttcgccattm agctgmgcac 960
tgtgggaagg cgatcggtgc gggctctcgc tatacgcagc tggcgaaggg gatgtgctgc 1020
agcgatagtg gtacgcakgt ttccagtcac gacgwgaaaa cgacgtcagt gcwagctgca 1080
kkctgcagct cgratctcat ggacgctkac gtcgayctra cgatcccwgt wckrctcgat 1140
cgtatcctgt cawtgatacc gggcgcatac atgccctagt cagttaacat gcaagtckac 1200
cttctcagtg 1210
<210> 25
<211> 1206
<212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 25
aamywaatwr ggwggggttt sycaakktta tatcsttcat kttctaccca ytccctcrac 60
twagcwwatw cararatgtt arttckraat atgagcccct taaaacrgac ttcscacaaa 120
ggactccwgg yaakywyctk gwtcccttta cawtctcctt waycgraakg gmaakktctg 180
yatcyttgcc agaaggattg wwttcagcgc tgygwtaaat agttattggc ttrccwmkaa 240
agtcaattac aaaaatatat ataaagaaag caaagctacw tatwtyamwk srttwaaggt 300
aaarmtaaaa atattataaa awtgaamttw ttttttctcw takctaaagt tacwtaatac 360
gaggaggatt wataatgaaa aaagtaatwg gaattataar yattgwmcww tttgtactmk 420
tagcacttca atcytgtgck gcakgakwwg gaartgymty awgwaatrac mwwsawkswa 480
gwgratctgc wggatwattt ttatytgkat gkatgctkat tgctggaata atagcaatra 540
waycawamyw wwktamaggt atswctataa cagctatagk atwtwatttg ttakcttttg 600
ttgyagggat wgctaaygwt gggcattttw cagattwgcm wmtttgrtca aycwttrmct 660
tgatatttgc tggactatwg atattkmatt trctkaamaw yaagcaatta tatwatakca 720
gwggraaaaa gtagaatcat atrttgtaat tatttttaat tatgttgrca amtytgawmy 780
trwcacwgaw acmcctmtaa atgttttram tacatrtgtt waaktwtkgt gacakatwct 840
aatagtakra agwagaarwt ygctatgtwa tratgacata gwggtgaatg taatgcggms 900
gctgwrtcca tatsaccatg atrcgamtyc gagctcggta csssggrgat sctctrgast 960
ckacgtcack cgtccatgka gatcwcgagg ctgcmgwcwg cagmtrcwct ggtmcgtcga 1020
tktaywcgtc gtgactrsga aaaccatgac gtmctrctay ggcatgcwgc artcyccgwt 1080
tckcagstag gtawagcgac akgcgatcsm aygcccttgc cacrttgcca tctgaatgyg 1140
- 53 031093
1232
ДНК
Clostridium autoethanogenum akgcctgaca kmcgkccmta cagctagcat gactgaattt gtgaca 1206 <210>
<211> <212>
<213> <400>
accymwaaat ttatgaatat cagtaaagat ttgaatacat cttctgctgt aactktcarg atgtactttt aagattatat ttgacaaaac caggaaacta agaaaaatac atgcagaaca tatctgaaaa tcttatccga acttawatga tgtstagtgc ggcctcttcg acgcaggwtw cytsrgatct tatcatgayr ttcwtataga <210>
<211> <212> <213>
aattgmcaga tttarttcaa aggatactat acktgggaca acttgaaaat aggagaacra gctggacgaa taacgatttt asttgataaa ttcctatttt agctaaaaac aatggagttt gaaaatagaa aaasaattca actcatgaaa tagcgccatt ctwytacgyc tcccagtcac catgtacgct atggatgmgc tckctcatag catgackcyt agaagacmct
1200 ataggtatta aaaattctgc tctcagggaa tcrraakatg tttttatttg araarattat ccaacaaatg gaaggagctg atattttctt cacaaaactg aactatragt gacaaartag atggaagctg ctggaaaaag aaatwgagca cgmcattcag akctggcraa kacgtagtam gacgtcgacy ggcgcataac ttgarcmccg ttggacctaa cggacagcgg tttctgatat cstcaacttc aaccttcagt atcttctaaa atctggatat ttatagctgt ttgaaggaaa caaaaatatc tgcwaaaaga atgaggtaat cttcatctga agctagacga gataaaagca ctgmgcacwg ggggatgtgc aygacgtcmg trrmggatcc tcccttatgc gg 1232 tggaagtggt cactmtagat ggatatgaac atcgggtgaa tcaatggact aatactgatg agaaacactt atctcatgac cggtwaaatc agaggaaaaa aaagcctcta tgaacatcta ttatgcactt aaagatggac ctagacattg ytgggaaggg wgcaagmcga trctagctgc cwggtacyga mttaacrttc aaatccactc ataggtgaaa gaaagggtaa aaaataaktg ccccttggaa aattacccta acaatcctag aggtacttcc actcaatata ataagctcta aaatttacct gaaaaatcta cttgaagatc aggtggactt ttattagcac cgatmgygck tagttgggta atgtctgcag gctcgattcg aattsacgtc
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
ДНК
Искусственная последовательность <22O>
<223> Синтетический праймер <400> 27 ccgaattcgt cgacaacaga gtttgatcct ggctcag 37 <210> 28 <211> 37 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 28 cccgggatcc aagcttacgg ctaccttgtt acgactt 37 <210> 29 <211> 25
- 54 031093 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 29 ttgctgtagt cactgaactg gaaaa 25 <210> 30 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 30 aatcaggaca cctaaatcca accac 25 <210> <211> <212>
<213>
<220> <223>
<400>
1940
ДНК искусственная последовательность новый ген метилтрансферазы, слитый с индуцибельным 1ас-промотором 31 gcggccgcgc ctttatgctt aaacacatat ttatcgaaga agatgcattt gcgaagaata cggaaatggc cgtttattaa aacgcaatta ccggctcgta gtttccgtgc tgtggaacag cattgaaacc ctataaacag ggcctttatg aatcattgac atgtgagtta tgttgtgtgg aatgcctata atctacaact tataaacaga aagattatga gttaaaaatc ccgagctgcg gctcactcat aattgtgagc tcgaatatgg tcattaaaaa aaagcaacat acggcaaaaa tgatcaacgt gtagcggcaa taggcacccc ggataacaat tgataaaaat gaacattgat gaagaaagag tggcgttgtg taacgatgtt tctgatttgc aggctttaca ttcacacagg atgaacagct gtggaagaaa attagcttta tacaccccgc attggcaatc aaatgttttc
120
180
240
300
360
420
480 tgtatctgaa atctgaaact ttgacgaaac gcgagaaaaa tgttcattgg tgctgcgcaa ttcagaagag acttctgcga tttacaagat tgattatttt acaagattga aaaagtgtaa tggacgaagt aagatatttg accgtgatat gcagccatat tgattgagaa tcgcatcttt ggaagacatc cgcgatcaaa tttccaggtt taatccgccg aatctacggc cctgaaatgt gagctgcagc cattgatttt tctggttcgt aaagaacgaa aaagtttagc ggagaaaaac ccatagctgt catcaatagc ccgtaagaat tgaaaccgag attaagaaca agctaccaca gtgctgaaaa aaagactttc tatatcggtc agcatctacc ctgaaggaag ggtaaagaac tacggcatcc acgaagaact aagaacaaat attagccaga attatcgaca caaggcatta cgtaagatcg gaagttatta tgtccgaatg ttgaggtgat tcgttcgcaa ttgatctgtt tggtggaaaa acaaaagcgt gcgacaaagg gtggcaaact tgcgtaaatt gcccgttcaa ggaacaataa tcctggatag aaagcattaa aaatcaaaga tcaccggttg aactgcgtct agggcgaaaa cgattaaata taacagcaaa caatctgttt tctgatcagc tattgatcgc ggacagcagc cgatatcagc ggtgtttgtg cctgatcgaa acgcgtgggt cattgaaatt cctgttcctg taacgatggc gaaaagcaag tgatcgcgcc gattaaaccg attcatcatc tatcgaacag aataacctga ggcttcgata aaccaattta aaatatgacg tacagctacg tattgtttct accagccgct aacacgagca atcgatccga attcgcccga gacaaaagcg tgggttttcg ttcattctga tttattgtgg tggattaaaa tatagcaacc tacaagaaac
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
- 55 031093
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920 gtctgatgga gccgtaaacc atcgttttgc agaaaaatgt agttttactt acaacctgat aaaagctgta aagataactg gcgccgcgaa ggaaatcttc actggataag gccgttcacc taagaccttc gaagctgtgc tgatttcttt ctaagaattc tgcaaaaagg gaagaaaaga ggtagctatt tatgagatcc gcgaaaaagc atcccgagca ggtctgacgg 1940 gcacgcgtaa aaattgtttt ttagcgcaga tgctgaatat tgggcgagaa tcgatttcgg ataaagaaat gtggtatgaa cccgtataaa catttatagc cctgaatagc tctgtacgag cggtgagaac tgagattgtg ctgcaatggg agctgtgaca ctggttctga ccgctgtacg tactatccga aatattgaga gagaagatca <210> 32 <211> 601 <212> ПРТ <213> Clostridium autoethanogenum <400> 32
Met Phe Pro Cys Asn Ala Tyr lie Glu Tyr Gly Asp Lys Asn Met Asn
1 5 10 15
Ser phe lie Glu ASp val G1 u Gin lie туг ASn Phe lie LyS Lys ASn
20 25 30
lie Asp val Glu G1U Lys Met His Phe lie G1U Th г Tyr Lys Gin Lys
35 40 45
Ser Asn Met Lys 50 Lys Glu lie Ser Phe Ser 55 Glu Glu 60 Tyr Tyr Lys Gin
LyS lie Met А5П Gly LyS А5П Gly val val Tyr Thr pro pro G1U Met
65 70 75 80
Al a Al a Phe Met Val Lys Asn Leu lie Asn Val Asn Asp Val lie Gly
85 90 95
Asn pro Phe lie LyS lie lie ASp pro Ser Cys Gly Ser Gly А5П Leu
100 105 110
lie Cys LYS Cys Phe Leu Tyr Leu Asn Arg lie Phe lie Lys Asn lie
115 120 125
Glu val lie ASn Ser Lys ASn ASn Leu ASn Leu Lys Leu Glu ASp lie
130 135 140
ser туг His lie val Arg Asn ASn Leu Phe Gly Phe Asp lie ASP Glu
145 150 155 160
Thr Al a lie Lys val Leu Lys He Asp Leu Phe Leu lie Ser Asn Gin
165 170 175
Phe ser Glu Lys Asn Phe Gin val Lys ASp Phe Leu val Glu Asn lie
180 185 190
ASp Arg Lys Tyr ASp val Phe lie Gly А5П Pro pro Tyr lie Gly His
195 200 205
Lys Ser Val Asp Ser Ser Tyr Ser Tyr Val Leu Arg Lys lie Tyr Gly
210 215 220
ser lie Tyr Arg ASp LyS Gly ASp lie ser Tyr Cys Phe Phe Gin LyS
225 230 235 240
Ser Leu Lys Cys Leu Lys Glu Gly Gly Lys Leu Val Phe Val Thr Ser
245 250 255
Arg Tyr phe cys G1 U ser Cys ser Gly LyS Glu Leu Arg Lys phe Leu
- 56 031093
260 265 270
lie G1 u Asn Thr Ser lie Tyr Lys Ile lie ASp Phe Tyr Gly Ile Arg
275 280 285
Pro Phe Lys Arg Val Gly Ile Asp Pro Met lie Ile Phe Leu Val Arg
290 295 300
Thr Lys ASn Trp Asn ASn ASn lie Glu lie lie Arg pro Asn Lys lie
305 310 315 320
Glu Lys Asn Glu Lys 325 Asn Lys Phe Leu Asp Ser Leu Phe Leu Asp Lys
330 335
Ser Glu Lys cys Lys Lys Phe Ser Ile Ser Gln Lys Ser Ile Asn Asn
340 345 350
Asp Gly Trp val Phe val Asp Glu val G1 u Lys ASn lie Ile ASp LYS
355 360 365
Ile Lys Glu Lys Ser Lys Phe Ile Leu Lys Asp lie cys His Ser cys
370 375 380
Gln Gly Ile lie Thr Gly Cys Asp Arg Al a Phe lie val Asp Arg ASp
385 390 395 400
Ile lie Asn Ser Arg Lys Ile Glu Leu Arg Leu lie Lys Pro Trp Ile
405 410 415
Lys Ser Ser His Ile Arg Lys А5П Glu val lie LyS Gly Glu LyS Phe
420 425 430
lie lie Tyr Ser Asn Leu lie Glu Asn Glu Thr Glu cys Pro Asn Al a
435 440 445
Ile Lys Tyr lie Glu Gln Tyr Lys Lys Arg Leu Met Glu Arg Arg G1 u
450 455 460
cys Lys Lys Gly Thr Arg Lys Trp Tyr Glu Leu Gin Trp Gly Arg Lys
465 470 475 480
pro Glu lie Phe Glu Glu Lys LyS lie val Phe pro Tyr Lys Ser cys
485 490 495
Asp Asn Arg Phe Ala Leu Asp Lys Gly Ser Tyr Phe Ser Ala Asp Ile
500 505 510
Tyr Ser Leu val Leu Lys Lys Asn val pro Phe Thr туг Glu lie Leu
515 520 525
Leu Asn lie Leu Asn Ser Pro Leu Tyr Glu Phe Tyr Phe Lys Thr Phe
530 535 540
Ala Lys Lys Leu Gly G1 u ASn Leu туг G1 u туг туг pro А5П Asn Leu
545 550 555 560
Met Lys Leu cys Ile Pro Ser lie Asp Phe Gly Gly Glu Asn Asn Ile
565 570 575
Glu Lys Lys Leu Tyr ASp Phe Phe Gly Leu Thr Asp Lys Glu lie G1 u
580 585 590
ile val Glu Lys lie Lys Asp Asn Cys 595 600 <210> 33
- 57 031093
2781
ДНК
Искусственная последовательность синтетическая плазмида <211>
<212> <213> <22O> <223> <400>
tttgccacct ccacccgtga gactcgtaat tagtctgcag gcagaaagtc ttggggctca atttctgcta cgctcggccc tctcgcggta tacacgacgg gcctcactga gatttaaaac atgaccaaaa tgatcttctt gccttgcagg tggcttggag gacttcaaga atgtctttcc aacggggggt caggcgtgga caggaacagg tgtcgggttt gagcctatgg gcatcttcca accgagcgta tgacgcaccg cagtgccaac gacgtctaag aggtgagcca acgactcact ccctttagtg aaaagcctcc ctcaaaggcg gagatggaat ttccggctgg tcattgcagc ggagtcaggc ttaagcattg ttcattttta tcccttaacg gagatcgttt gcggtttttc gagcgcagtc ctaactcctc aaaaggaata gtgagttgat atagggctcg agggttaatt gaccggaggc gtaatcagat agactggatg ctggtttatt actggggcca aactatggat gtaactgtca atttaaaagg tgagttttcg tggtctgcgc gaaggttctc accaaaactt taaatcaatt ttcagcaatt tgctacgtaa agtctagaga ggagtcacta ttttgactaa aaaaaaaatc tgcccgtgcc ttagttagtt attcgatatc agggttagtt aacttccctt gggttggact tcgtgcatac atgagacaaa agagcgcacg cgccaccact aaaaacggct ggaaatctcc gcgagtcagt gtgcagcctt atagtaagcc caagacgata agtccagctt cgcggccata agggagccgc gatttgagcg ttgccgcggc gccccgttcg gagcgaggaa ttttctcctg agtatacact gaggcggata gctgataaat gatggtaagc gaacgaaata gaccaagttt atctaggtga ttccactgag gtaatctctt tgagctacca gtcctttcag accagtggct gttaccggat ggagcgaact acagcggaat caggggaaac tcagatttcg cctctcactt taagccattt gcggaatata ccacatgaag ccgctagcgc cttagctttc aagttgcagg ctggagccgg cctcccgtat gacagatcgc actcatatat agatcctttt cgtcagaccc gctctgaaaa actctttgaa tttagcctta gctgccagtg aaggcgcagc gcctacccgg gacaccggta gcctggtatc tgatgcttgt ccctgttaag ccgctcgccg tcctgtatca cacttcactg tgaggtctgc gaagaaaggc agcccttagt acccgggaac agttagatta ggggttatca gctaaggatg accacttctg tgagcgtggg cgtagttatc tgagataggt actttagatt tgataatctc cttaataaga cgaaaaaacc ccgaggtaac accggcgcat gtgcttttgc ggtcggactg aactgagtgt aaccgaaagg tttatagtcc caggggggcg tatcttcctg cagtcgaacg catattctgc acaccctcat ctcgtgaaga
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620 aggtgttgct gccacggttg tgccacggaa agttcgattt agataaaaat gggtgtttac aagatcacta aatggagaaa acattttgag tattacggcc tcacattctt tgagctggtg aacgttttcg gactcatacc atgagagctt cggtctgcgt attcaacaaa atatcatcat tagaggttga ccgggcgtat aaaatcacgg gcatttcagt tttttaaaga gcccgcctga atctgggata tccctctgga aggcctgaat tgttgtaggt tgtcgggaag gccacgttgt gaacaataaa tcgggcacgt tttttgagtt gatataccac cagttgctca ccgtaaagaa tgaacgctca gtgttcaccc gtgaatacca cgccccatca ggaccagttg atgcgtgatc gtctcaaaat actgtctgct aagaggttcc atcgagattt cgttgatata atgtacctat aaataagcac cccggagttt ttgttacacc cgacgatttc tccagccaga gtgattttga tgatccttca ctctgatgtt tacataaaca aactttcacc tcaggagcta tcccaatggc aaccagaccg aagttttatc cgtatggcca gttttccatg cggcagtttc aagtgaggga acttttgctt actcagcaaa acattgcaca gtaatacaag ataatgaaat aggaagctaa atcgtaaaga ttcagctgga cggcctttat tgaaagacgg agcaaactga tccacatata
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
- 58 031093 ttcgcaagat gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat ttccctaaag ggtttattga 2460 gaatatgttt tttgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc accagttttg atttaaacgt 2520 ggccaatatg gacaacttct tcgcccccgt tttcacgatg ggcaaatatt atacgcaagg 2580 cgacaaggtg ctgatgccgc tggcgatcca ggttcatcat gccgtttgtg atggcttcca 2640 tgtcggccgc atgcttaatg aattacaaca gtactgtgat gagtggcagg gcggggcgta 2700 ataatactag ctccggcaaa aaaacgggca aggtgtcacc accctgccct ttttctttaa 2760 aaccgaaaag attacttcgc g 2781 <210> 34 <211> 351 <212> ПРТ <213> Clostridium autoethanogenum <400> 34
Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Gly Ile Asn Lys Leu Gly Trp Ile Glu
1 5 10 15
Lys Lys Asn pro val pro Gly Pro туг Asp Ala lie Val Hi s Pro Leu
20 25 30
Ala Val Ser Pro cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala
35 40 45
Leu Gly ASH Arg Glu А5П Met lie Leu Gly His G1 u Ala val Gly Glu
50 55 60
Ile Ala Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Val Gly Asp Arg
65 70 75 80
Val Ile Val Pro Cys 85 Thr Thr Pro Asp Trp 90 Arg Ser Leu Glu Val 95 Gin
Ala Gly phe Gln Gln Hi s Ser ASn Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe
100 105 110
Ser Asn Phe Lys Asp Gly Val Phe Ala Asp Tyr Phe His Val Asn Asp
115 120 125
Ala ASp Met ASn Leu Ala lie Leu pro ASp Glu Ile pro Leu Glu ser
130 135 140
Ala val Met Met Thr Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu
145 150 155 160
Leu Ala ASp lie Lys Met Gly Ser Ser val val val lie Gly lie Gly
165 170 175
Ala Val Gly Leu Met Gly lie Ala Gly Ser Lys Leu Arg Gly Ala Gly
180 185 190
Arg lie lie Gly val Gly Ser Arg pro val cys val Glu Thr Al a Lys
195 200 205
Phe Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asn Gly Asp Ile Val
210 215 220
Glu Gln Ile Met Asp Leu Thr His Gly Lys Gly val Asp Arg val lie
225 230 235 240
Met Ala Gly Gly Gly Ala Glu Thr Leu Ala Gln Ala Val Thr Met Val
245 250 255
Lys pro Gly Gly val Ile Ser ASn Ile Asn Tyr Hi s Gly Ser Gly Asp
260 265 270
- 59 031093
Thr Leu Pro Ile 275 Pro Arg Val Gln 280 Trp Gly Cys Gly Met 285 Ala His LYS
Thr lie Arg Gly Gly Leu Cys pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Met
290 295 300
Leu Arg Asp Leu Val Leu Tyr Lys Arg Val Asp Leu Ser Lys Leu val
305 310 315 320
Thr His val phe Asp Gly Ala Glu Asn ile Glu Lys Al a Leu Leu Leu
325 330 335
Met Lys ASH Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys ser val val Thr Phe
340 345 350
<210> 35 <211> 1056 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 35 atgaaaggtt gtgccaggtc atacatacgg gctgtaggtg gttatcgtac cagcattcaa gcagattact cctttagaaa cttgcagaca atgggaatag cctgtttgtg ggtgatatag atggcaggcg gtaatttcta tggggctgcg agaatggaaa actcatgtat ccaaaagatt ttgcaatgtt cttatgatgc tttttgaagg aaatagccga catgcacaac acggtatgct ttcatgtaaa gtgcagttat taaaaatggg ccggttccaa ttgaaacagc ttgaacaaat gtggtgctga acatcaacta gcatggctca tgctaagaga ttgatggtgc taattaaatc aggtattaac gattgtacat agcacttggt agttggcagc acctgactgg tgcaggatgg cgatgcagat gatgacagac ctccagcgtt acttcgagga taaattttat catggactta aacactagca ccatggaagc caaaactata tcttgttcta agaaaatatt agtagttaca aaattaggat < cctctagctg 1 aatagggaaa < gaagttaaag < agatctttag ; aagttttcca ; atgaatcttg , atgatgacta i gtagtaattg < gcaggcagaa 1 ggagcaactg ; actcatggta ; caagcagtaa i ggtgatactt 1 agaggaggat 1 tataaacgtg 1 gaaaaggccc 1 ttctaa 1056 ggattgaaaa tatccccatg atatgatttt attttaaagt aagtccaagc attttaaaga ccatactccc ctggttttca gtataggagc ttatcggtgt atattgtaaa aaggtgtaga ctatggttaa taccaatacc tatgccccgg ttgatttgag ttttgcttat gaaaaaccca tacatcagat aggccatgaa tggcgataga tggttttcag cggtgtattt agatgaaata tggagcagaa tgttggatta tggaagcaga ttataaaaat ccgtgtaatc acctggcggc tcgtgttcaa cggacgtctt taaacttgtt gaaaaataag
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020 <210> 36 <211> 1056 <212> ДНК <213> Clostridium ljungdahlii <400> 36 atgaaaggtt gtgccaggtc atacatacgg gctgtaggtg gttatcgtac cagcattcaa gcagattact cctttagaaa ttgcaatgtt cttatgatgc tttttgaagg aaatagccga catgcacaac acggtatgct ttcatgtaaa gtgcagttat aggtattaac gattgtacat agcacttggt agttggcagc acctgactgg tgcaggatgg cgatgcagat gatgacagac aaattaggat cctctagctg aatagggaaa gaagttaaag agatctttag aagttttcca atgaatcttg atgatgacta ggattgaaaa tatccccatg atatgatttt attttaaagt aagtccaagc attttaaaga ccatactccc ctggttttca gaaaaaccca tacatcagat aggccatgaa tggcgataga tggttttcag tggtgtattt agatgaaata tggagcagaa
120
180
240
300
360
420
480
- 60 031093
cttgcagaca taaaaatggg ctccagcgtt gtagtaattg gtataggagc tgttggatta 540
atgggaatag ccggttccaa acttcgagga gcaggcagaa ttatcggtgt tggaagcaga 600
cctgtttgtg ttgaaacagc taaattttat ggagcaactg atattgtaaa ttataaaaat 660
ggtgatatag ttgaacaaat catggactta actcatggta aaggtgtaga ccgtgtaatc 720
atggcaggcg gtggtgctga aacactagca caagcagtaa ctatggttaa acctggcggc 780
gtaatttcta acatcaacta ccatggaagc ggtgatactt taccaatacc tcgtgttcaa 840
tggggctgcg gcatggctca caaaactata agaggaggat tatgccccgg cggacgtctt 900
agaatggaaa tgctaagaga tcttgttcta tataaacgtg ttgatttgag taaacttgtt 960
actcatgtat ttgatggtgc agaaaatatt gaaaaggccc ttttgcttat gaaaaataag 1020
ccaaaagatt taattaaatc agtagttaca ttctaa 1056
<210> 37
<211> 1056
<212> днк
<213> Clostridium ragsdalei
<400> 37
atgaaaggtt ttgcaatgtt aggtattaac aagttaggat ggattgaaaa gaaaaaccca 60
gtaccaggtc cttatgatgc gattgtacat cctctagctg tatccccatg tacatcagat 120
atacatacgg tttttgaagg agcacttggt aatagggaaa atatgatttt aggtcacgaa 180
gctgtaggtg aaatagctga agttggcagt gaagttaaag attttaaagt tggcgataga 240
gttatcgtac catgcacaac acctgactgg agatccttag aagtccaagc tggttttcaa 300
cagcattcaa acggtatgct tgcaggatgg aagttttcca attttaaaga cggtgtattt 360
gcagattact ttcatgtaaa cgatgcagat atgaatcttg caatacttcc agatgaaata 420
cctttagaaa gtgcagttat gatgacagac atgatgacta ctggttttca tggggcagaa 480
cttgctgaca taaaaatggg ttccagtgtt gtcgtaattg gtataggagc tgttggatta 540
atgggaatag ccggttccaa acttcgagga gcaggtagaa ttatcggtgt tggaagcaga 600
cccgtttgtg ttgaaacagc taaattttat ggagcaactg atattgtaaa ttataaaaat 660
ggtgatatag ttgaacaaat aatggactta actcatggta aaggtgtaga ccgtgtaatc 720
atggcaggcg gtggtgctga aacactagca caagcagtaa ctatggttaa acctggcggc 780
gtaatttcta acatcaacta ccatggaagc ggtgatactt tgccaatacc tcgtgttcaa 840
tggggctgcg gcatggctca caaaactata agaggagggt tatgtcccgg cggacgtctt 900
agaatggaaa tgctaagaga ccttgttcta tataaacgtg ttgatttgag caaacttgtt 960
actcatgtat ttgatggtgc agaaaatatt gaaaaggccc ttttgcttat gaaaaataag 1020
ccaaaagatt taattaaatc agtagttaca ttctaa 1056
<210> 38
<211> 1230
<212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 38
atgaacaatt taaaggaaga agcattaaag tttcataaag aacatgaagg taaaatagca 60
cttaaaagta aagtatctgt taaaactaga gaggacctag gcttagcata tactccaggt 120
gttgctgaac catgtcttga aatcaacagg gactataata cgttatacga ttatacttct 180
aagggaaatt atgtagcagt agtaactaac ggcagtgcag ttttgggact tggaaatata 240
ggtgctgcag ctggcttacc tgtaatggaa ggtaaatcta ttctatttaa gacttttgca 300
ggagtagacg cttttcctat ttgtgttgac agcaaagatc ctgacaagat tgtagaaaca 360
- 61 031093 gtaaaattaa tgctttgaaa cagcacggaa aaaaaatttg gcaaaactgc atatcaaaag cctagtatga gtatctgctc atttttgcta gccagagtag tttcctggaa aaaatagctg tatgttatac aaggctgcca gaacatacta <210> <211> <212>
tagaatccac tagaagataa cagcagtagt aagacttaaa ttgtaagtag atagagaaaa taaaaggtgc ctggagtaat tggccaatcc ttggtacggg tatttagagg ctgcatgtgc cagatgcttt tagaaagtgg aaaagcttgt atttggagga attaaaaaag aactttagct agtaataata aggagttaaa tttaagtgct acttaaagat tactcctgaa taagcctgaa aagatcagat agcacttgat tatagcagac tgactcaaga agttgcaaga acaagcataa ataaacctag gtctgcaata gctatgataa aatggtgcag aacattattg gcaaaaaaag gtactaaaag atgataaaaa atctaccctg ttcccaaatc gtaagggcat ataataactg atagcaccaa agaactgaca 1230
409
ПРТ aagatataaa taccagtttt atgcacttaa gagctgcagg tatgcgatag acctagcaga aagctgatgt caatggctaa atgaagcaaa aaataaataa caaaaataaa aaaaagaact aggtagctta tcactcctga agcacctgag 420 tcatgacgac 480 aatagtaaac 540 tacagcaatt 600 aaaaggtgct 660 agttacaaat 720 attcataggt 780 agatcccctc 840 agctgcaggt 900 tgttcttgca 960 tgaagaaatg 1020 taatgaagat 1080 ttatgtagca 1140 aatggtagaa 1200 <213> Clostridium autoethanogenum <400> 39
Met 1 Asn Asn Leu Lys Glu 5 Glu Ala Leu Lys Phe 10 Hi s Lys Glu His 15 Glu
Gly LyS lie Ala Leu LyS Ser LyS val ser val Lys Thr Arg Glu ASp
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Tyr Thr Pro Gly Val Ala Glu Pro cys Leu Glu lie
35 40 45
ASn Arg ASp Tyr Asn Thr Leu Tyr Asp Tyr Thr Ser Lys Gly А5П Tyr
50 55 60
Val Ala Val Val Thr Asn Gly Ser Al a Val Leu Gly Leu Gly А5П Ile
65 70 75 80
Gly Ala Al a Ala Gly Leu 85 Pro Val Met Glu Gly Lys Ser lie Leu Phe
90 95
Lys Thr phe Ala Gly val ASp Ala phe pro ile Cys val ASp Ser Lys
100 105 110
Asp Pro Asp Lys Ile Val G1 U Thr Val Lys Leu Ile Glu Ser Thr Phe
115 120 125
Gly Gly il e ASn Leu G1 u ASp ile Lys Ala pro G1 u Cys phe Glu lie
130 135 140
Glu Asp Lys Leu Lys Lys Val cys Asn Ile Pro Val Phe His Asp Asp
145 150 155 160
Gln His Gly Thr Ala val val Thr Leu Ala Ala Met lie ASn Ala Leu
165 170 175
Lys Ile Val Asn Lys Lys Phe Glu Asp Leu Lys Val Ile lie Asn Gly
180 185 190
Ala Gly Al a Ala Gly Thr Al a Ile Al a Lys Leu Leu val Ser Arg Gly
195 200 205
- 62 031093
val LyS А5П 210 lie lie val Cys Asp Arg Lys Gly Ala ile ser Lys ASp
215 220
Arg Glu Asn Leu Ser Ala Al a Lys Lys Asp Leu Ala Glu Val Thr Asn
225 230 235 240
pro ser Met lie LyS Gly Al a Leu Lys ASp val Leu Lys Glu Ala Asp
245 250 255
val Phe ile Gly val ser Ala Pro Gly val ile Thr Pro Glu Met Ile
260 265 270
LyS Thr Met Ala LyS Asp Pro Leu Ile Phe Ala Met Ala ASn pro Lys
275 280 285
Pro Glu ile Tyr pro Asp G1 u Ala Lys Al a Ala Gly Ala Arg val val
290 295 300
Gly Thr Gly Arg ser ASp Phe pro А5П Gln lie ASn ASn val Leu Ala
305 310 315 320
Phe Pro Gly Ile Phe Arg Gly Ala Leu Asp Val Arg Ala Ser Lys Ile
325 330 335
ASn G1 u Glu Met LyS lie Al a Ala Al a Cys Ala lie Ala ASp ile lie
340 345 350
Thr Glu LyS Glu Leu ASn G1 u ASp Tyr val lie Pro ASp Ala Phe ASp
355 360 365
Ser Arg ile Ala pro LyS val Ala Tyr Tyr val Ala LyS Ala Ala lie
370 375 380
Glu ser Gly val Ala Arg Arg Thr Asp Ile Thr Pro G1U Mei val Glu
385 390 395 400
G1 u Hi s Thr Lys Lys Leu val Gln Al a
405 <210> 40 <211> 1230 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 40 atgaatctaa gagaaactgc attaaaattt cacaaagaca acgaaggtaa aattgcacta60 aaatgcaagg tgccggttaa aaacaaagaa gacctaacgt tagcatatac acctggagtt120 gcagaacctt gcttagaaat taataaaaat ccagaatgca tttatgacta tacatcaaaa180 gggaattggg tagctgttgt aacaaatggt acagctgttc ttggccttgg aaatataggt240 gcaggtgcag gacttcctgt tatggaggga aaatccgttt tatttaaaac ttttgctgga300 gtagatgcat ttccaatatg tctggaaagc aaggatatca atgaaattgt agcagctgta360 aaacttatgg aaccaacttt tggaggaata aatctagagg acatcaaagc tccagaatgc420 tttgaaattg aatcaaagct taaagaagtt tgtaacatcc ctgtatttca tgacgatcaa480 catggaacgg cagttgtttc atcagcctgt cttataaatg cattaaagat agtaaataaa540 aaatttgaag acttaaaaat tgttgtaaat ggagcaggag cagcaggaac tgccattaca600 aaacttttaa taaagatggg aacaaaaaat gtaatacttt gcgacactaa aggtgctata660 tacaagagaa gaccaattgg aatgaataag tttaaggatg aaatggcaga aataacaaat720 cctaatcttc agaaaggaac tcttgctgat gttttaaaag gtgcagatgt atttttagga780 gtatctgcag ctaattgtgt aactgaagaa atggtaaagt ccatgaataa agattcaata840
- 63 031093 attatggcaa tggcaaatcc aaatccagaa atacttcctg atttagctat aaaagctgga 900 gctaaagtgg tatgtacagg aaggtcggat tttccaaatc aggttaacaa tgtacttgct 960 tttccaggaa tatttagggg agctttagat gtaagggcaa gtgaaataaa tgatgagatg 1020 aaaatagctg cagcatatgc aatagcagaa cttgtaagtg aagaagaatt gaaaccagac 1080 tatataatac ctaatgcttt tgacttgaga atagccccaa aagtagccgc atacgtagca 1140 aaagctgcta ttgatacagg tgttgcgagg aaaaaggatg tcactccaga gatggttgaa 1200 aaacatacta agactttgct tggaatctaa 1230 <210> 41 <211> 409 <212> ПРТ <213> Clostridium autoethanogenum <400> 41
Met ASn Leu Arg Glu Thr Al a Leu Lys Phe His Lys Asp ASn Glu Gly
1 5 10 15
Lys lie Ala Leu Lys cys Lys Val Pro Val Lys Asn Lys Glu Asp Leu
20 25 30
Thr Leu Ala Tyr Thr pro Gly val Ala Glu pro Cys Leu Glu Ile ASn
35 40 45
Lys Asn Pro Glu Cys Ile Tyr Asp Tyr Thr Ser Lys Gly Asn Trp Val
50 55 60
Ala val val Thr Asn Gly Thr Al a val Leu Gly Leu Gly Asn lie Gly
65 70 75 80
Ala Gly Ala Gly Leu Pro Val Met Glu Gly Lys Ser Val Leu Phe Lys
85 90 95
Thr Phe Ala Gly val ASp Ala phe pro ile Cys Leu Glu Ser Lys ASp
100 105 110
Ile Asn Glu Ile Val Ala Ala Val Lys Leu Met Glu Pro Thr Phe Gly
115 120 125
Gly Ile Asn Leu Glu Asp lie Lys Ala pro Glu Cys Phe Glu lie Glu
130 135 140
Ser Lys Leu Lys Glu Val Cys Asn Ile Pro Val Phe His Asp Asp Gln
145 150 155 160
Hi s Gly Thr Ala val val ser ser Ala Cys Leu Ile ASH Ala Leu LyS
165 170 175
lie val Asn Lys Lys phe Glu Asp Leu Lys lie val val Asn Gly Ala
180 185 190
Gly Ala Ala Gly Thr Ala lie Thr Lys Leu Leu ile Lys Met Gly Thr
195 200 205
Lys Asn Val Ile Leu Cys Asp Thr Lys Gly Ala Ile Tyr Lys Arg Arg
210 215 220
pro lie Gly Met Asn Lys Phe Lys Asp Glu Met Ala Glu Ile Thr Asn
225 230 235 240
Pro Asn Leu Gln Lys Gly Thr Leu Ala Asp Val Leu Lys Gly Ala Asp
245 250 255
- 64 031093
Val Phe Leu Gly 260 Val Ser Ala Ala Asn Cys Val 265 Thr Glu Glu 270 Met Val
Lys Ser Met ASn Lys Asp Ser lie ile Met Ala Met Ala Asn Pro Asn
275 280 285
Pro Glu Ile Leu Pro Asp Leu Ala Ile Lys Ala Gly Ala Lys Val Val
290 295 300
Cys Thr Gly Arg ser ASp Phe pro ASn Gln val ASn ASn val Leu Ala
305 310 315 320
Phe Pro Gly lie Phe Arg Gly Ala Leu Asp Val Arg Ala Ser Glu Ile
325 330 335
ASH ASp Glu Met Lys lie Ala Ala Ala Tyr Ala lie Ala Glu Leu val
340 345 350
Ser Glu Glu Glu Leu Lys Pro Asp Tyr Ile Ile Pro Asn Al a Phe Asp
355 360 365
Leu Arg lie Al a pro Lys val Ala Ala Tyr val Ala Lys Al a Al a lie
370 375 380
Asp Thr Gly val Ala Arg Lys Lys Asp val Thr pro Glu Met val Glu
385 390 395 400
Lys Hi s Thr Lys Thr Leu Leu Gly Ile
405 <210> 42 <211> 1098 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 42 atgtcataca ccaaagttaa atatgaagat ataaaaaagc tgtgtaattt ggtctttgag 60 aaatttggat tcaaccggga agatagtgaa accataacta gcgttttgct tttatcagat 120 ctatatggaa ttgaatccca tggtattcaa aggctggtaa agtactacag tgaaataaaa 180 agtggtctta taaatatcaa ttctaaaata aaaatagtaa aggaaacacc tgtatctgca 240 acaatagatg gcatgggcgg tatgggacag ctaattggta aaaaagctat gaatctggca 300 attaaaaaag ctaaaacttc aggaatgagt atggtagtgg ttagaaattc aaatcactat 360 ggtattgcag gctactatgc caaaatggct gaggaggaag gacttcttgg aatttcaatg 420 accaactctc cagctgtaat ggtaccaacc tttggaaaag atgctatgct tggcacaaat 480 cctattgcca tatcttttcc agctaaaccc tacccatttt taatggatat ggctactagc 540 gtagttacta ggggaaaaat tgaagtttat aacaaaaggc atgaacctct tccccttggt 600 ctagctttaa atagtgatgg tgaagatact acagatccct tagatgtact tcttaatgta 660 cgaaaaaatt ctggaggagg actgcttcct cttggaggat caaaagaatc aactggagga 720 cataaaggtt atggatttgc acttgcagtt gaaatgttta cagcaatttt atctggagga 780 tttactgcaa ataaagttag cttagatagg gaaaatggat ctggaacatg tcattatttc 840 tttgcagtgg attatggtat atttggggat aaacaatcca ttgaagagaa cttttccagc 900 tacctaaatg aacttagaaa ttcaaagaaa gcaaaaggcg ccacaagaat atatactcat 960 ggtgagaaag aagtagaatc ctataaggat aaaatgaaaa atggaattcc agtaaacgac 1020 actactctta aagaaatata cgacatatgt gactacttta gcataaaagc tagtgactat 1080 gtaactaaag tagtataa 1098 <210> 43 <211> 365
- 65 031093 <212> ПРТ <213> Clostridium autoethanogenum <400> 43
Met ser туг Thr Lys val Lys туг Glu Asp ile Lys Lys Leu cys Asn
1 5 10 15
Leu val phe Glu LyS phe Gly Phe Asn Arg Glu Asp Ser Glu Thr lie
20 25 30
Thr ser Val Leu Leu Leu Ser Asp Leu Tyr Gly Ile Glu Ser His Gly
35 40 45
lie Gln Arg Leu val Lys туг туг Ser G1 u lie Lys Ser Gly Leu lie
50 55 60
Asn Ile Asn Ser Lys lie Lys Ile val Lys Glu Thr Pro Val Ser Ala
65 70 75 80
Thr lie Asp Gly Met Gly Gly Met Gly G1 n Leu lie Gly Lys Lys Al a
85 90 95
Met Asn Leu Ala Ile Lys Lys Ala Lys Thr Ser Gly Met Ser Met Val
100 105 110
val val Arg Asn Ser Asn His Tyr Gly lie Ala Gly Tyr Tyr Ala Lys
115 120 125
Met Ala Glu Glu Glu Gly Leu Leu Gly Ile Ser Met Thr Asn Ser Pro
130 135 140
Ala val Met val pro Thr phe Gly Lys Asp Ala Met Leu Gly Thr ASn
145 150 155 160
Pro Ile Ala Ile Ser Phe Pro Ala Lys Pro Tyr Pro Phe Leu Met Asp
165 170 175
Met Ala Thr Ser Val Val Thr Arg Gly 185 Lys lie Glu val Tyr 190 Asn Lys
180
Arg His Glu pro Leu pro Leu Gly Leu Ala Leu ASn Ser ASp Gly Glu
195 200 205
Asp Thr Thr Asp Pro Leu Asp Val Leu Leu Asn Val Arg Lys Asn Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Leu Leu Pro Leu Gly Gly Ser Lys Glu Ser Thr Gly Gly
225 230 235 240
His Lys Gly Tyr Gly Phe Ala Leu Ala val Glu Met Phe Thr Ala lie
245 250 255
Leu Ser Gly Gly Phe Thr Al a Asn Lys val Ser Leu Asp Arg Glu Asn
260 265 270
Gly Ser Gly Thr Cys His Tyr Phe Phe Ala Val Asp Tyr Gly lie Phe
275 280 285
Gly Asp Lys Gln Ser lie Glu Glu Asn Phe Ser Ser Tyr Leu Asn Glu
290 295 300
Leu Arg Asn ser Lys Lys Ala Lys Gly Ala Thr Arg Ile Tyr Thr His
305 310 315 320
Gly Glu Lys Glu val Glu Ser Tyr Lys Asp Lys Met Lys Asn Gly lie
325 330 335
Pro Val Asn Asp Thr Thr Leu Lys Glu Ile Tyr Asp lie cys Asp Tyr
- 66 031093
340
345
355
360
365
2640
ДНК
Clostridium autoethanogen
350 <213>
<400>
cttggaggca ggatttacta
tcttgcagaa ggcatgtacc
tccattgtta tatattaaat agggagctaa tatccacaga tagatcaaat
atgaccaatc aaatattatg cttaaaaatg gtttcagtaa ttaggattaa ttggcatacc aagatggtaa cgttcccggt atctatatcg
atgatgatac tgtaatagga
120
180
240
300
360 cttaaaaagt atgttttcag gtaaaaaatg ataatccaga cctaaagaac gcaataattt caatcaatgg aatccatcta gatgtagttg gaatgttatt caggatatgg aagagaacag actaaagaag aactttgaca ccaggagcag caaggtgaaa gcagcttctg gcaagaggta gaaaagcttt ggaagtactg gattttggaa gcagatacac tgtagaacag gtttcaaaaa aaagatttta gatccaccac gaaatgggag cctatgatgg caaacaaggg gttccagaaa gtagttgtga gtaggaacta tgacaggaaa atgtagttat ctaaaggagt gatttaagga aattaattca atagaaggtt tatttggaaa caggagaaaa caggaataag ctcaatttat agttcactat ctcaagctgc aggccatact gtgatgaatt cttgtggtaa aggtaatact aaggaatact tgggaacatg tcaaaagatt gaaatgtata tcttcatggg caagagatgc agcatatgtt cggaagagca ttggaatata ttcatgaatt taagttttca ggcatagagg ctattataga ttatgatacc gggtagcaga tgatagaaat tgaaagattt gggaattgaa aaaatacgat tatttataaa gtcagttact aaacgacata tatgggagaa gtccatattt aacacctcaa gagtatagca agaacaggga acttagaata taaagttgag gaaacgggca gatatatttt tgtaaggcta tacagttaga ctgtgtagct agataaggtt tggagagcct atgggctgac aaaccaggct ctttgatgaa gaggagaaaa tgaggcaatg cttacctact agaactaaaa atgcaggctt agcagctata tcttgtagga tgaaataata tccaagagca gcgtatgatt aagagagaat acagatttag aaagaagtaa gcagtattca tcaggtgatt acttcaggaa ggtgaatatc cctataacaa aataagcttg aaattgtatt gcagtaaata cctaaacagc gttgtaatag acagcagatg gagacttctc ggaggcatga ggatgtggtg tacaaagaag ataaagactg aatataagaa attagctttg gatagaatac gctttagata gaaggaaaac gaaactgagg gatactatag actgtttcat gatgttaaaa gaaataaaag caaaaagagg gctattacag cttatagaag ttgaagatgt atgagtccga aggaagactt gatcttggga ggggaactgc ctggagttgc tcataaatgc agctaaaaga aaaatcatta tccttcagac tggtagatga tcgatacact caaatggact atgctaagaa cagaagatat catctcatgc atcttatcgt gggattacat tagcaccaga aattgggagt gtgccgaagg cagaaatgag aattactacc ctgtcacaat atatagagtc attctctaca atccagaaat agagaaaagg aattaaaata gaatcaattt ctgatgaaat atttattcaa attggatgat tttaaagaat tcctcaagat aaatcctaga agtaaatgtt atttactaga tcaaggagag agaccttcca taaagatatg aagaaacggt aggtctcatc attgcatcca tcctgcatca acatcatgat agaaggaatg agctgttgta aagtgaaaag atctttagat aatatcagga tagaacaaat aataggactt ggaaatgata aagacaaaag tagatttttg tttagccaag tgaatttaat agctgaaatg gtatgatata tgttaaagac aaaatatgaa agctaaagaa
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
- 67 031093 gctgagttct tctcatttgg aactaatgat ttaactcaaa tgacttttgg attttcaaga 2340 gatgatgcag gtaaattttt gaatgattat tatgataaaa aagtatatga gtttgatcca 2400 ttccaaaggt tagatcaagt tggagtagga aaacttgtag agactgctgt aaaattaggt 2460 aaaaagacta gacctgacat tcatcttgga atatgtggag aacatggagg agatccatct 2520 tctgtagagt ttttccacaa tgtaggactt gactatgtat cttgttcacc atttagggta 2580 cctgtggcaa gacttgctgc agctcaggct cagataaaga atccaagacc aatcaaataa 2640 <210> 45 <211> 879 <212> ПРТ <213> Clostridium autoethanogenum <400> 45
Met Asn Gly LyS LyS Tyr val Tyr Leu Phe ASn G1 u Gly ASn Ala Gly
1 5 10 15
Met Arg Asn Leu Leu Gly Gly Lys Gly Ala Asn Leu Ala Glu Met Thr
20 25 30
Asn Leu Gly lie pro val pro Gly Gly Phe Thr lie Ser Thr G1 u Ala
35 40 45
cys Thr Lys Tyr туг Glu Asp Gly Lys ser lie ser Gin Gin val lie
50 55 60
Asp G1 n lie Tyr ASp Ala Leu Lys ASn val G1 u Glu Thr Thr Gly Lys
65 70 75 80
Lys Phe Gly Ser lie Glu Asn Pro Leu Leu Val Ser Val Arg Ser Gly
85 90 95
Ala Arg val Ser Met pro Gly Met Met ASp Thr lie Leu ASn Leu Gly
100 105 110
Leu Asn Asp Asp Thr Val He Gly Leu Lys Lys Leu Thr Gly Asn Glu
115 120 125
Arg phe Ala туг ASp Ser туг Arg Arg Phe lie G1 n мет phe Ser Asp
130 135 140
Val Val Met Gly lie Glu Lys Arg Glu Phe Glu Asp Val Leu Asp Asp
145 150 155 160
val Lys Asn Al a Lys Gly val Lys Tyr ASp Thr ASp Leu Asp G1 u Ser
165 170 175
Asp Leu Lys Asn lie He Gin Arg Phe Lys Asp He Tyr Lys Lys Glu
180 185 190
val Lys Glu ASp phe pro Gin ASp pro LyS Glu G1 n Leu lie Gin Ser
195 200 205
val Thr Ala val phe Arg Ser тгр Glu ASn pro Arg Ala lie lie туг
210 215 220
Arg Arg Leu Asn Asp lie Ser Gly Asp Trp Gly Thr Ala Val Asn Val
225 230 235 240
Gin Ser Met val Phe Gly Asn Met Gly Glu Thr Ser Gly Thr Gly val
245 250 255
Ala Phe Thr Arg Asn pro Ser Thr Gly Glu Lys Ser He Phe Gly Glu
260 265 270
туг Leu lie ASn Ala Gin Gly Glu ASp val val Ala Gly lie Arg Thr
275 280 285
Pro Gin Pro lie Thr Lys Leu Lys Glu Asp Leu Pro Glu cys Tyr Ser
290 295 300
Gl η Phe Met Ser lie Ala Asn Lys Leu Glu Asn Hi s Tyr Lys ASp Met
305 310 315 320
Gin Asp Met Glu Phe Thr lie Glu Gin Gly Lys Leu Tyr phe Leu Gin
32 5 330 335
Thr Arg Asn Gly Lys Arg Thr Al a Gl n Ala Al a Leu Arg lie Al a val
340 345 350
Asn Met Val Asp Glu Gly Leu lie Thr Lys Glu Gl u Ala He Leu Lys
35! 360 365
val Glu pro Lys Gin Leu ASp Thr Leu Leu His pro ASn phe ASp Ser
370 375 380
Asp Glu Leu Lys Arg Ala Val Val He Ala Asn Gly Leu Pro Al a Ser
385 390 395 400
pro Gly Ala Al a Cys Gly Lys lie Tyr Phe Thr Al a ASP ASp Al a Lys
405 410 415
Lys His His Asp Gin Gly Glu Lys Val lie Leu Val Arg Leu Glu Thr
420 42 5 430
Ser pro Glu ASp lie Glu Gly Met Ala Ala Ser Gl u Gly lie Leu Thr
435 440 445
Val Arg Gly Gly Met Thr Ser His Ala Ala Val Val Ala Arg Gly Met
450 455 460
Gly Thr Cys Cys val Ala Gly Cys Gly ASp Leu lie val Ser Glu LyS
465 470 475 480
Glu Lys Leu phe Lys Arg 485 Leu Asp Lys val 490 Tyr Lys Glu Gly Asp 495 туг
lie Ser Leu Asp Gly Ser Thr Gly Asn Val Tyr Gly Glu Pro lie Lys
500 505 510
Thr val Ala Pro Glu lie Ser Gly ASp Phe Gly lie Phe Met Gly Trp
515 520 52 5
Ala Asp Asn He Arg Lys Leu Gly Val Arg Thr Asn Ala Asp Thr Pro
530 535 540
Arg ASp Ala ASn Gin Ala lie Ser Phe Gly Ala Gl u Gly lie Gly Leu
545 550 555 560
cys Arg Thr Glu His Met Phe Phe Asp Glu Asp Arg He Pro Glu Met
565 570 575
Arg Glu Met lie val Ser Lys Thr Glu Glu Gin Arg Arg Lys Ala Leu
580 585 590
Asp Lys Leu Leu Pro Arg Gin Lys Lys Asp Phe lie Gly lie Tyr Glu
595 600 605
Ala Met Glu Gly Lys Pro val Thr lie Arg Phe Leu ASp Pro pro Leu
610 615 620
His Glu Phe Leu Pro Thr Glu Thr Glu Asp He Gl u Ser Leu Ala Lys
- 69 031093
625 630 635 640
G1 u Met Gly val Ser Phe G1 n Glu Leu Lys Asp Thr ile Asp Ser Leu
645 650 655
His Glu Phe Asn Pro Met Met Gly His Arg Gly cys Arg Leu Thr Val
660 665 670
Ser Tyr pro Glu ile Al a Glu Met G1 n Thr Arg Al a lie lie Glu Ala
675 680 685
Al a Ile Asp Val Lys Lys Arg Lys Gly Tyr Asp Ile Val Pro Glu Ile
690 695 700
Met lie Pro Leu val Gly Glu lie Lys G1 u Leu Lys Tyr val Lys Asp
705 710 715 720
Val Val Val Arg Val Ala Asp Glu lie Ile Gln Lys Glu Gly lie ASIl
725 730 735
Leu LyS туг Glu val Gly Thr Met lie Glu lie pro Arg Ala Ala lie
740 745 750
Thr Ala ASp Glu lie Al a Lys Glu Al a Glu Phe Phe Ser Phe Gly Thr
755 760 765
Asn Asp Leu Thr Gln Met Thr Phe Gly Phe Ser Arg Asp Asp Ala Gly
770 775 780
LyS phe Leu ASH ASp Tyr Tyr ASp LyS LyS val Tyr Glu Phe ASp pro
785 790 795 800
phe Gln Arg Leu Asp Gln val Gly val Gly LYS Leu val Glu Thr Ala
805 810 815
val Lys Leu Gly LyS LyS Thr Arg pro ASp lie His Leu Gly lie Cys
820 825 830
Gly Glu His Gly Gly Asp Pro Ser Ser Val Glu Phe Phe His Asn Val
835 840 845
Gly Leu ASp туг val Ser Cys Ser pro Phe Arg val pro val Ala Arg
850 855 860
Leu Ala Al a Ala Gln Al a Gln Ile Lys Asn Pro Arg Pro Ile Lys
865 870 875
<210> 46 <211> 3447 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 46 atggattact ataagaatat gaggataaga aagggacctg aatgtagatg aagtgtaaag ggtgataaga gttcaagaag cctgttatga gaaaaagatc tgttaaagag tcagagcatg gatctctttt tagaagcata caatacatcc aagcaggtat taaaatctaa ctataaagac ttaaagcagc tcatagaatc gtttaagagg caaagaattg cagaactaaa tttggatatt gggttatgga tgaatttata aattgttgca agaagaagaa tgacggtggc ctataacagt gttcttgtag ggaataacta gctgatgaat gatgaaataa ttcctatcag ggacctacat caaaaggctg gctttaaaat ggcggcagag gctaaaaatg cgaatagagg ctgtagcaat cctatatgat tagatatagc aaaatcctga cagatatgat gagtaccaac ttgctaactt gaatgagaat aatctagaaa agaaatagcc atattcaaat agggaaaaat tttgaagaaa attggcaaaa ggagatgctt aataccagga ctgtggatat agtaagggaa agcttttggt
120
180
240
300
360
420
480
540
600
- 70 031093 tcagaaaaaa cttggagata agacatcaaa caaatatgtg ttggagtttt tatacattga agtacggcaa aggttataga aagatgcttt tagttgacaa aaaatatatt tattgttcat atttacacca aaaaattgcg aaatgaaaat gaaaatccaa ctatatgaaa tctttagccc agaactgtag cactatttta aacacataga gagattgttc tctcagaaga gatatacaag tagagatgaa ggtgcaggta catacagaga aaaaagacaa tgcaggtacc tactagaatt
660
720
780
840
900 caggtagaac cttattgcag atagagttaa tttgcgccag cttgatggag gtaaaaactg ataaatgaga agtcatgaaa ttatttgata aaagtagtaa gtagaagaaa ggattagttg gacgctcatc aaagcccaat tttgatgtag gaaaaggttc aagaactatc gatgtattta cagacattaa gatgacaagg aaaactggag gcttataaac catgatacta atagctgata atagcagcag aaaatatcta aagtcaagta aaacctcagg aagagagtta ggagatctgg ggtaagaatt cctatgggag aagggaagac actaaaaaat acactgtaac aagggcattc aaggatatgc atacaggaag gaaatggatt tatcttggtc ctgttatatc agtttataaa taaaaccaaa atgagactcg atattaaatt attggataaa agtcacttat cagctttggc cgtatagatt ctaatatact ctgataatgt gaatatttga aagaaggaaa aggataaata cacagattct ttgtaaaagc caggtaatgg ctgcattcaa cacttaaaaa actactggga ctgcagaaat ttgaaagttt ataaaatgct ctatatttat taactttccc gatttccaaa caggagaatt ataagagaaa tgaaatggtt acttgattct aatacaatgc aatagatatg tacaggtgca aagaactttt aggggtaaag aggtgaatgt attagataaa tggaaagaag gagtggaaca atcacaagat ggcaactagg aaacgatctt tttaaatgaa attccagatg tattagagaa ttcactaaac gatagctgaa tacgcttcag tggaataaag acttaagaat tgtggcaaca tagtatgtct tacaaataga agatgtaaga atacaagtat tgggttggga tggaaatata gatacaaaat agattctaca agaacttcaa tttgccacca atttgaaaat acaggaatag aaggaaatag agaattacta tatagaactg gtaataagtc gaagatgcta acaaatgcag gatactaatt gaaatgagtg aagaaattta aagcaaatac aagcttctta gtgagaacta ttctccatgg tctccttggg ctcataagag tttataaaac tggcttaaag gcatgcatgt tactatataa gatatgtctg gaaatctcta gtacttatgg gggcttacta gatactaagt cctatatata gagataccag gatcgttttg attaaagtaa gatttggatg atttctttct aaaatagttc gaagattttg aaagaactct atatagttca gaataaaatc cagaagatcc gttctggatt cttattatga taagaaaggc actttataat ttattgaaga tacttaaatt atatacctat ttgatacaaa ttacagatac gagatttgct aaatgtgggg aaagacttga gagctaatgc aatcttcaac gaatgaaagt gctatacagg acttagctaa ctttgttaaa ttccaataca ctgctgatgc gccagccagc tagatgcaga gtcagtttga gaggccagta aagatgtaaa ctccttcttc aaaagaatat tcaagggaat taaagggaga gcaagataga tgagttatgc agatcaaata tcaagatgat tttaaataat tggtataaga tagcttactg aataaggtct aaaagtgtta taatccagat tataggaaat tgtaccaaaa aggagcagat tactatgaga taagatagca aggagcaact aaaacttaga agtaggatat ttcaggcatt tgctatagat agatgtatta agaaatagag gccatattct tcttcatact aggacttgat tttgaattca taatcttcaa gtcgggactt ttcaaactta agaaatgtat aaaaatggta ttatgaaaaa gatgggtcag ggaaccttta agatcattta tatgtatcct
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2760
2820
2880
2940 gatgtatttg agtgaaacat ggaaaaagtt ttcttagtgt ttctctggat aaaattacct tcttctatgg tatttgtaca ttgaggttaa caggaataaa taaattcata acttgcagaa attactagag tggtattaag agaaaattca gatgaatatg ggagaacttt attacaaaag agagacataa tgtgttatgg gtgatctcag gtgaagttga ttgacgatga ggataaaaga cagatgaaga cagaatggaa aataggagaa aggatataga taacttggct taatgaaaaa
3000
3060
3120
3180
3240
- 71 031093 gaaataggat caagtatacc tggaaacatt gttaaagtac ttgtaaaacc aggagataaa 3300 gtagaagagg gccagagctt aattgtaata gaagctatga aaatggaaac aaatgtttca 3360 gctgctgaag caggagtaat tgatggagta tttgtaaaag aaggccagag agttaaaact 3420 ggagaacttt taattaaatt aaagtaa 3447 <210> 47 <211> 1148 <212> ПРТ <213> Clostridium autoethanogenum <400> 47
Met Asp Tyr Leu Leu Lys Arg Phe Lys Arg Val Leu Val Ala Asn Arg
1 5 10 15
Gly Glu lie Ala lie Arg lie Phe Arg Ala cys Lys Glu Leu Gly lie
20 25 30
Thr Thr Val Ala Ile Tyr Ser Asn Glu Asp Lys Arg Ser Leu Phe Arg
35 40 45
Thr Lys Ala Asp Glu ser туг Met ile Gly Lys Asn Lys Gly pro val
50 55 60
Glu Ala Tyr Leu Asp Ile ASp Glu Ile lie ASp Ile Ala Leu Lys Lys
65 70 75 80
Asn val ASp Ala lie His pro Gly туг Gly phe Leu Ser Glu ASn pro
85 90 95
Glu Leu Ala Lys Lys cys Lys G1U Ala Gly Ile Glu Phe Ile Gly Pro
100 105 110
Thr Ser ASp Met Met Glu Met Leu Gly ASp Lys lie Lys Ser LyS ile
115 120 125
Val Ala Gln Lys Ala Gly Val Pro Thr lie Pro Gly Val Gln Glu Ala
130 135 140
lie Lys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Lys Phe Ala Asn Phe Cys Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Val Met Ile Lys Ala Ala Asp Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Arg
165 170 175
Ile Val Arg Glu Glu 180 Lys Asp Leu Ile Glu Ser Tyr Asn Ser Ala Lys
185 190
ASn Glu Ser Arg Lys Ala phe Gly Ser Glu LyS lie туг lie Glu Lys
195 200 205
Tyr Ile Glu Asn Pro Lys His Ile Glu Val Gln val Leu Gly Asp Lys
210 215 220
туг Gly Asn ile val His Leu Tyr Glu Arg ASp Cys Ser lie Gln Arg
225 230 235 240
Arg His Gln Lys val ile Glu Phe Thr Pro ser Leu Ala Leu Ser Glu
245 250 255
G1 u LyS Arg Gln G1 n lie Cys G1 u ASp Ala Leu Lys lie Ala Arg Thr
260 265 270
Val Gly Tyr Thr Ser Ala Gly Thr Leu Glu Phe Leu Val Asp Lys Asn
275 280 285
Glu ASn His Tyr phe lie Glu Met Asn Thr Arg lie Gln val Glu His
- 72 031093
290 295 300
Thr val Thr Glu Met val Thr Gly lie ASp lie val Gin ASp Gin lie
305 310 315 320
Leu lie Al a Glu Gly His Ser Leu Asp Ser Lys Glu He Gly He Lys
325 330 335
Ser Gin Asp Asp lie Glu Leu Lys Gly Tyr Ala He Gin Cys Arg He
340 345 350
Thr Thr Glu Asp Pro Leu Asn Asn Phe Ala Pro Asp Thr Gly Arg He
355 360 365
Asp Met Tyr Arg Thr Gly Ser Gly Phe Gly He Arg Leu ASp Gly Gly
370 375 380
Asn Gly Phe Thr Gly Ala val lie Ser Pro Tyr Tyr Asp Ser Leu Leu
385 390 395 400
val Lys Thr val Ser тгр Ser Arg Thr phe Glu ASp Ala lie Arg LyS
405 410 415
Ala lie Arg Ser He Asn Glu Thr val He Ser Gly Val Lys Thr Asn
420 425 430
Ala Asp Phe He He Lys val Leu Ser His Glu Lys Phe lie Lys Gly
435 440 445
Glu Cys Asp Thr 450 Asn Phe lie Glu Asp 455 ASn РГО Asp Leu 460 Phe Asp He
Lys Pro Lys Leu Asp Lys Glu Met Ser val Leu Lys Phe lie Gly Asn
465 470 475 480
LyS val val Asn Glu Thr Arg Gly LyS Lys LyS LyS phe ASn lie pro
485 490 495
He Val Pro Lys Val Glu Glu Asn He Lys Leu Ser Gly Thr Lys Gin
500 505 510
He Leu Asp Thr Lys Gly Ala Asp Gly Leu val Asp тгр He Lys Ser
515 520 525
Gin Asp Lys Leu Leu lie Thr Asp Thr Thr Met Arg Asp Ala His Gin
530 535 540
Ser Leu Met Ala Thr Arg val Arg Thr Arg ASp Leu Leu Lys lie Ala
545 550 555 560
Lys Ala Gin Ser Ala Leu Ala Asn Asp Leu Phe Ser Met Glu Met Trp
565 570 575
Gly Gly Al a Thr Phe Asp val Ala Tyr Arg Phe Leu Asn Glu Ser pro
580 585 590
Trp Glu Arg Leu Glu Lys Leu Arg Glu Lys Val Pro Asn lie Leu Phe
595 600 605
Gin Met Leu lie Arg Gly Ala ASn Ala val Gly туг LyS ASn туг pro
610 615 620
ASp Asn val lie Arg Glu Phe He Lys Gin Ser Ser Thr Ser Gly He
625 630 635 640
Asp val Phe Arg He Phe Asp Ser Leu Asn тгр Leu Lys Gly Met Lys
645 650 655
Val Ala lie Asp Gin Thr Leu Lys Glu Gly Lys lie Ala Glu Ala cys
- 73 031093
660 665 670
Met cys Tyr Thr Gly Asp Val Leu Asp Asp Lys Glu Asp Lys Tyr Thr
675 680 685
Leu Gln туг туг ile ASn Leu Ala LyS Glu lie G1 u LyS Thr Gly Ala
690 695 700
Gln ile Leu Gly lie Lys ASp Met ser Ala Leu Leu Lys pro туг ser
705 710 715 720
Ala Tyr Lys Leu Val 725 Lys Ala Leu Lys Asn Glu Ile 730 Ser Ile Pro 735 Ile
His Leu His Thr His ASp Thr Thr Gly ASn Gly val Ala Thr val Leu
740 745 750
Met Ala Ala ASp Ala Gly Leu ASp lie Ala ASp Thr Ala phe Asn ser
755 760 765
Met Ser Gly Leu Thr Ser Gin pro Ala Leu Asn ser lie Al a Ala Ala
770 775 780
Leu Lys ASn Thr ASn Arg Asp Thr Lys Leu Asp Al a Asp Asn Leu Gln
785 790 795 800
Lys ile Ser ASn Tyr Trp Glu ASp val Arg Pro lie Tyr Ser Gln Phe
805 810 815
Glu Ser Gly Leu Lys Ser Ser Thr Ala Glu Ile Tyr Lys Tyr Glu Ile
820 82 5 830
pro Gly Gly Gln Tyr Ser ASn Leu Lys pro Gln val Glu Ser phe Gly
835 840 845
Leu Gly Asp Arg Phe Glu Asp Val Lys Glu Met Tyr Lys Arg Val Asn
850 855 860
Lys Met Leu Gly ASn lie lie Lys val Thr pro Ser Ser Lys Met val
865 870 875 880
Gly Asp Leu Ala lie Phe Met lie Gln Asn Asp Leu Asp Glu Lys Asn
885 890 895
lie туг Glu Lys Gly Lys ASn Leu Thr phe pro Asp Ser Thr lie Ser
900 905 910
Phe Phe Lys Gly Met Met Gly Gln Pro Met Gly Gly Phe Pro Lys Glu
915 920 925
Leu G1 n Lys lie val Leu Lys Gly Glu Glu pro Leu Lys Gly Arg pro
930 935 940
Gly Glu phe Leu Pro Pro Glu ASp phe Gly Lys ile Glu ASp His Leu
945 950 955 960
Thr Lys Lys Tyr Lys Arg Lys phe Glu ASn Lys G1 u Leu Leu Ser туг
965 970 975
Ala Met Tyr Pro Asp Val Phe Glu Asn Tyr Leu Lys Phe Ile Asp Glu
980 985 990
туг Gly Asp Leu ser Arg Met Glu ser G1U Thr phe phe туг Gly Leu
995 1000 1005
Ala Glu Gly Glu Leu Cys Glu val Glu lie Gly G1 u Gly Lys Ser
- 74 031093
1010 1015 1020
Leu Phe val Gin Leu Leu Glu ile Thr Lys val Asp Asp G1 u Gly
1025 1030 1035
Tyr Arg Phe Leu Val Phe Glu Val Asn Gly Ile Lys Arg Asp Ile
1040 1045 1050
Arg ile Lys ASp Asn Leu Ala Phe Ser Gly Ser Gly lie Lys Glu
1055 1060 1065
Asn Ser Cys Val Met Ala Asp Glu Asp Asn Glu Lys Glu lie Gly
1070 1075 1080
Ser Ser lie pro Gly ASn lie val Lys val Leu val Lys pro Gly
1085 1090 1095
Asp Lys Val Glu Glu Gly Gln Ser Leu ile Val Ile Glu Ala Met
1100 1105 1110
Lys Met Glu Thr Asn val Ser Ala Ala Glu Ala Gly val lie Asp
1115 1120 1125
Gly val Phe Val Lys Glu Gly Gln Arg Val Lys Thr Gly Glu Leu
1130 113 5 1140
Leu Ile Lys 1145 Leu Lys
<210> 48 <211> 1524 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 48 atgtataaaa atttatcacc atcagaatta acggaatttt caattaaaag aggagaagga 60 tttttatcaa ataagggagc tcttatgatt aatactggaa agtacacagg aagatctcct 120 aaagatagat ttatagttaa tcaagaaagc attaggaaca aaataaactg gggaaatgta 180 aatctttcta tagaagaaga tatttttaat aaaatgtatg ataagatttt aaattatata 240 agtgataaag atatttttgt gtttgatgga tttgttggag ctttaaaaaa atataccctt 300 cctataagag taatatgcga aagggcatcc caggcgttgt ttgcaaatca attgtttaga 360 agaccaacgg aggaggattt aaagtgtttt actcctgaat ttaatattat atcggcacct 420 ggatttaagg ctaagggcaa agaagacggt ttaaattcag atgcctttat tttagtaaat 480 ttcgataaaa aaattatatt aataggtgga accagttact cgggagaaat aaaaaaatca 540 gtattttcag taatgaactt cttgcttcca caaaaaggag tcatgcctat gcactgttct 600 gctaatatag gacaagataa taaaacttgc ttattttttg gattgtcagg aacaggaaaa 660 actactttat cagcagatgg tgaaagaaga ctgattggtg atgacgaaca tggatggtct 720 aatgaaggtg tatttaattt tgagggtgga tgttatgcta aaactataag acttgataag 780 gaaaaggaaa gtcagatata caatgccata aaatttggaa ctgtagttga aaatgtagtg 840 gcagatggga atagagtacc tgattataat gatgctagat atactgaaaa tacaagggca 900 gcatatccta taaattatat agataatata gaagaaagtg gtgtaggagg aaatccagag 960 actataatat ttttaaccgc agatgctttt ggtgtaatgc cacctatatc aaggctttct 1020 aaagaagcag caatgtatca ctttatgtct ggatatacta gcaagatagc tggaactgaa 1080 agaggaataa ttgaacctca agctactttt tcctcttgct ttggtgaacc gtttatgtta 1140 atgaatcctg ctgtctatgc aaaattgtta ggcgaaagaa tagacaagta taacactcag 1200 gtatatttag tgaatactgg atggctatct ggaggatatg gaaatggaga tagaataaaa 1260 ctttcctata caagggctat gattagagaa gctttgaaag ggaagttcaa ggatgttgaa 1320
- 75 031093 tttgtggaac gaaatattaa aagctggcgc gcaaaagctg <210> <211> <212>
atcctgtatt atcctagaaa tgaagtttag gacctgaagc taaagtaatg tatatgggaa taaaaacttt ttaa 1524 atgcctaaaa gataaagaag gagaagttta gatgtccagg catatgatga aagatgtttc tgtacctgat gacagcgaga cgaagatata
1380
1440
1500
507
ПРТ <213> Clostridium autoethanogenum <400> 49
Met туг Lys Asn Leu Ser pro Ser Glu Leu Thr Glu phe Ser lie LyS
1 5 10 15
Arg Gly Glu Gly Phe Leu ser Asn Lys Gly Ala Leu Met Ile Asn Thr
20 25 30
Gly Lys Tyr Thr Gly Arg Ser pro Lys Asp Arg Phe lie val Asn Gln
35 40 45
Glu Ser Ile Arg Asn Lys Ile Asn Trp Gly Asn Val Asn Leu Ser Ile
50 55 60
G1 u G1 u ASp lie Phe Asn Lys Met Tyr ASp Lys lie Leu Asn Tyr lie
65 70 75 80
Ser Asp Lys Asp Ile Phe Val Phe Asp Gly Phe Val Gly Ala Leu Lys
85 90 95
Lys Tyr Thr Leu Pro Ile Arg Val Ile 105 Cys Glu Arg Ala Ser 110 Gln Ala
100
Leu Phe Ala Asn Gln Leu Phe Arg Arg pro Thr Glu Glu Asp Leu Lys
115 120 125
cys Phe Thr pro Glu phe Asn ile lie ser Ala pro Gly phe LYS Ala
130 135 140
Lys Gly Lys Glu Asp Gly Leu Asn Ser ASp Ala Phe ile Leu val Asn
145 150 155 160
Phe Asp Lys Lys Ile Ile Leu lie Gly Gly Thr Ser Tyr Ser Gly Glu
165 170 175
lie Lys Lys Ser val phe Ser val Met ASn Phe Leu Leu pro Gln Lys
180 185 190
Gly Val Met Pro Met His cys Ser Ala Asn Ile Gly Gln Asp Asn Lys
195 200 205
Thr cys Leu Phe Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser
210 215 220
Ala Asp Gly Glu Arg Arg Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Gly Trp Ser
225 230 235 240
Asn G1 u Gly val phe Asn Phe Glu Gly Gly Cys туг Al a Lys Thr lie
245 250 255
Arg Leu ASp Lys Glu Lys G1 u Ser Gln Ile Tyr Asn Ala Ile Lys Phe
260 265 270
Gly Thr val val Glu ASn val val Ala ASp Gly ASn Arg val pro ASp
275 280 285
Tyr Asn Asp Ala Arg туг Thr Glu Asn Thr Arg Ala Ala Tyr Pro lie
- 76 031093
290 295 300
ASF! Tyr lie ASp ASn lie Glu Glu Ser Gly val Gly Gly ASn pro Glu
305 310 315 320
Thr Ile Ile Phe Leu Thr Ala Asp Ala Phe Gly Val Met Pro Pro Ile
325 330 335
Ser Arg Leu Ser Lys Glu Ala Ala Met туг His Phe Met Ser Gly туг
340 345 350
Thr Ser Lys Ile Ala Gly Thr Glu Arg Gly Ile Ile Glu Pro Gln Ala
355 360 365
Thr Phe Ser 370 Ser Cys Phe Gly Glu 375 Pro Phe Met Leu 380 Met Asn Pro Ala
val Tyr Ala LyS Leu Leu Gly Glu Arg lie ASp LyS туг Asn Thr Gln
385 390 395 400
Val Tyr Leu Val Asn Thr Gly Trp Leu Ser Gly Gly Tyr Gly Asn Gly
405 410 415
Asp Arg lie Lys Leu Ser Tyr Thr Arg Ala Met ile Arg Glu Al a Leu
420 425 430
Lys Gly Lys phe LYS Asp val Glu phe val Glu Hi s pro val phe Lys
435 440 445
val Met Met Pro LyS Arg Cys pro Gly val pro Asp Glu lie Leu ASn
450 455 460
DrA Λ rri ASH ll e Tr-IA G1 u G1 u Al a Λ c r. G1 U Th Г Al a Λ rri
г и ГА· у ' H Asp ' у' ГА· у
465 470 475 480
Lys Leu Ala Leu LyS Phe Ser LyS ASn Phe Glu LyS Phe LyS ASp val
485 490 495
Ser Glu Asp Ile Ala Lys Ala Gly Pro Glu Ala
500 505
843
ДНК
Clostridium autoethanogenum <210> <211> <212> <213> <400>
atgagagaag aattattatc tggcctactg gaagatgtgc gatgttcata tatgtagaag aaggacaata aaagtggctc gcagatggtc aatccatgtc aatcttgcaa tcagatttag ctagggggaa tagatgtatc tttcggagga caaaagacat ctatgtgtca tagtaggagg ggtatttaag ctcctgcagt ctaaaggatt ttaagggtgt ctcctatggt agaaagctct aaaatgaact agactacagc cactataact tgttaagaaa tttaggtaaa agatacagga aagtttagaa aaaatctgta aatatattat tggatcagaa taaagatttt tgtaggagta tgtaagacca tttagacaaa tcttgcagta aaagctgtta aagataaaag atacttgaaa atggcttgtg gacgcaataa gtctctgatc gaaatagttc aatatgagtc gtaataaaag ggtataggag ttatctgaaa ataaatctcc aatatagaaa gaaatctctg aatgtgaaga atatagatat tatttataac ataagggagt ctataaatag caggagataa agataaaaat tagtaaagga gaacttttga gaaataaaaa ttggtatagg cttatcctac tatagatgcc ggacgaaaaa atctaaaaat aattggccag aggccagggg agttaatact acttaacata gcttaaacca cgcaggacca caaggctgca taagttttat acctcaagga ccatatagca
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
- 77 031093 ggattacctg tagccgtaaa tataaattgt cacgttacaa gacataagga aatagaattg 840 taa 843 <210> 51 <211> 280 <212> ПРТ <213> Clostridium autoethanogenum <400> 51
Met Arg Glu val ASp val ser Thr lie Thr LyS Ala val Arg ASn Leu
1 5 10 15
cys Ile Asp Al a Asn Tyr Tyr Leu Ser Glu Asp Val Lys Lys Lys Ile
20 25 30
LyS Glu Cys Glu Glu ASp Glu Lys тгр pro Thr Ala LyS ASp lie Leu
35 40 45
Gly Lys Ile Leu Glu Asn Ile Asp lie Ser Lys Asn Glu Asp Val Pro
50 55 60
Met Cys Gln ASp Thr Gly Met Ala Cys val phe lie Thr ile Gly Gln
65 70 75 80
Asp val His Ile val Gly Gly ser Leu Glu ASp Ala Ile Asn Lys Gly
85 90 95
val Gly Gln Gly Tyr val Glu Gly туг Leu Arg Lys Ser val val Ser
100 105 110
Asp pro lie Asn Arg val Asn Thr Lys Asp Asn Thr pro Al a val lie
115 120 125
Tyr Tyr Glu lie Val Pro Gly Asp Lys Leu Asn lie Lys Val Al a Pro
130 135 140
Lys Gly Phe Gly Ser Glu Asn Met Ser G1 n ile Lys Met Leu Lys pro
145 150 155 160
Ala Asp Gly Leu Lys Gly Val Lys Asp Phe Val lie Lys Val Val Lys
165 170 175
Asp Ala Gly pro ASn Pro cys Pro pro Met val val Gly val Gly lie
180 185 190
Gly Gly Thr Phe ASp Lys Ala Ala Asn Leu Ala Lys Lys Ala Leu Val
195 200 205
Arg pro Leu Ser Glu Arg Asn Lys ASn Lys phe Tyr Ser ASp Leu Glu
210 215 220
Asn Glu Leu Leu ASp Lys lie Asn Leu Leu Gly ile Gly pro Gln Gly
22 5 230 235 240
Leu Gly Gly Lys Thr Thr Ala Leu Ala Val Asn Ile Glu Thr Tyr pro
245 250 255
Thr His ile Ala Gly Leu pro val Ala val Asn lie Asn Cys His val
260 265 270
Thr Arg His Lys Glu Ile Glu Leu
275 280
<210> 52
- 78 031093 <211> 573 <212> днк <213> Clostridium autoethanogenum <4СЮ> 52 atgtatatgg aaaaaaagat aactactccg ttaacggaag aaaaggttaa aactttaaaa60 gcaggggata gtgttttaat atcagggaca atatatactg ctagagatgc tgctcataag120 agattagttg aattattaga tgaaggtaaa tcacttccta taaatgtaaa agatgaaata180 atatattacg caggaccaag tcctgcaaaa ccaggccatg taataggttc agcaggacca240 acaagtagtt atagaatgga tccatttgca ccaagactgc ttgatatagg tttaaaggga300 atgataggaa aaggccttcg ttcaaaagaa gttatagaat ccatgaagaa aaataaagct360 gtttactttg ctgcaatagg cggggctgca gcacttgtag caaaatccat aaagaaagca420 gaagtagtag cttatgaaga tttggattct gaagctataa gaaaattaga agtaaaagac480 ttacctgtaa ttgtagtaat agattcagag ggcaataatt tatatgaatc aggacgaaaa540 gagtacttgg actctgtgga ccagtctaag tag 573 <210> 53 <211> 190 <212> ПРТ <213> Clostridium autoethanogenum <400> 53
Met Tyr Met Glu Lys Lys Ile Thr Thr Pro Leu Thr Glu Glu Lys Val
1 5 10 15
Lys Thr Leu Lys Ala Gly Asp Ser val Leu lie Ser Gly Thr Ile туг
20 25 30
Thr Al a Arg Asp Al a Al a Hi s Lys Arg Leu Val Glu Leu Leu Asp Glu
35 40 45
Gly Lys Ser Leu Pro ile Asn val LyS Asp Glu lie ile Tyr Tyr Al a
50 55 60
Gly Pro ser Pro Ala Lys Pro Gly His Val Ile Gly ser Ala Gly Pro
65 70 75 80
Thr Ser Ser Tyr Arg Met Asp Pro Phe Ala Pro Arg Leu Leu Asp Ile
85 90 95
Gly Leu Lys Gly Met ile Gly LyS Gly Leu Arg ser Lys Glu val ile
100 105 110
Glu ser Met Lys Lys Asn Lys Ala Val Tyr Phe Ala Ala Ile Gly Gly
115 120 125
Ala Ala Ala Leu val Ala LyS Ser ile Lys Lys Ala Glu val val Ala
130 135 140
Tyr Glu ASp Leu Asp ser G1 u Ala Ile Arg Lys Leu Glu val Lys ASp
145 150 155 160
Leu pro val ile val val ile ASp ser Glu Gly Asn Asn Leu туг Glu
165 170 175
ser Gly Arg Lys Glu Tyr Leu Asp ser Val Asp Gln ser LYS
180 185 190
<210> 54 <211> 1797 <212> ДНК
- 79 031093 <213> Clostridium autoethanogenum <400> 54 atgcaaatag ataagataat tgatactgac atattagttg ttggaggttc tggagcagga60 tcaatggcag ctgtaacagc tgcgagaaaa ggagcaaaag tactacttgc agtaaaaggg120 aagcttggaa aaagcggaaa tgccattatg gcaggggcag gattttctat ggatggagaa180 acagcatatt ataaatatgg actcaaggaa gcagatccta aaaatacaaa gggaaaatta240 tttgaacaaa ttgtaaaaca gtctttttat ttaagtgatc aaaatatggt tgagcagttt300 gtaagtgatt gtgatgagtg ctgctgggaa cttaaacagt ggattgaaaa agcaggacac360 aaggttgtat tttttggaga agaaggatat ataagctcgg gtaaagctgt gggagttggc420 tgccgatatg gagtttcaaa agcaggtggt attgatgtta tagaagattt tatagcagtg480 gatattttaa tggaagataa aaaagctgta ggtgcagtgg gcatagaagt atatacagga540 aaaattattg aaatcagatc aaagtcagtt attttagcta ctggcggata tcagccttat600 tcctttaaat gtactgtttc cgatatgact ggcgatggaa tggctatggc ataccgtgca660 ggagccaagc ttgcagatat ggaattttta ttatatatac cagcagttgc cctttcacca720 tcagtatata aaggttcaat ttatcccttc ttacactcca gtatgttaat gcctattgtt780 aaaaatggta agggagaatc aattttagat aatatacctg aaaatttact taaaatggcc840 aaggaaagtg aaatgggaaa gcttatattt acgtattatt atggagatca aattgcaaga900 ggaaaaggaa ctccaaatgg aggagtatat tttgattatt ccaatgtacc ttttgatatt960 tatgaaaaag ctttaaaaaa agctgaacca ttaatgaaca tatggtatag aaaaggattc1020 tatcaaggaa acaacttgga tacttttgtt gaaaatatta gaaagggcat tccatgggaa1080 gtaggtattg gcagtgaata cagcatgggc ggcattgaag tagacgaaaa tatgtacact1140 ggagtaccag gactttatgc agctggtgag actacaagtg gtgtatttgg agctatgagg1200 gttgcagatg gacttattga aatgcttgta cagggttata gagcagcatt gtccgcttgc1260 aaatatatac aaaatgtaaa tgagccaagt atgaaaaata ccaatattga tagtataatt1320 aaagatattt tttcacctct tgaaagaaaa gaaggagtta gtcctataaa aatacacaga1380 aatatagaaa aaacggctga tgttggattc aactttagaa gaaatgaaga gggacttaca1440 aaagctttag atgaaatttt aaaaatacac aaatatgaca taagcgcaat gagtactaaa1500 agtaaaaata gagtttataa ctatgaatgg atagaatcag tacaggctcg aaatctttta1560 acttgtacag aagcaggtgt aagagctgcc cttatgagaa aggaaagtag gggtacacac1620 atacgtgatg attatgaatt tgtagataat gataactggc ttttaaggat tatgagttcg1680 aaaggtgaag acgaaaccat gaaattatca accagaaagc ctaaagtaac aacaatggaa1740 cttccaggtg gtaaaaataa gaatattcct gattatatgc tttcaatgtt aaagtaa 1797 <210> 55 <211> 598 <212> ПРТ <213> Clostridium autoethanogenum <400> 55
Met Gln lie Asp Lys Ile lie Asp Thr Asp lie Leu val Val Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ala Gly Ser Met Ala Ala val Thr Ala Ala Arg Lys Gly Ala
20 25 30
LYS Val Leu Leu Ala Val Lys Gly Lys Leu Gly Lys Ser Gly Asn Ala
35 40 45
lie Met Ala Gly Ala Gly Phe Ser Met ASp Gly G1 u Thr Ala Tyr туг
50 55 60
Lys Tyr Gly Leu Lys Glu Ala Asp Pro Lys Asn Thr Lys Gly Lys Leu
- 80 031093
65 70
Phe Glu Gln lie val Lys G1 n Ser
85
Val Glu Gln Phe Val Ser Asp cys
100
Gln тгр lie Glu Lys Ala Gly His
115 120
Gly туг ile Ser Ser Gly Lys Ala
130 135
Val Ser Lys Al a Gly Gly Ile Asp
145 150
Asp lie Leu Met Glu ASp Lys Lys
165
Val Tyr Thr Gly Lys lie Ile Glu
180
Ala Thr Gly Gly Tyr G1 n pro Tyr
195 200
Met Thr Gly Asp Gly Met Ala Met
210 215
Ala ASp Met Glu Phe Leu Leu Tyr
225 230
Ser Val Tyr Lys Gly Ser Ile Tyr
245
Met pro lie val Lys Asn Gly Lys
260
Pro Glu Asn Leu Leu Lys Met Ala
275 280
lie Phe Thr Tyr туг Tyr Gly ASp
290 295
Pro Asn Gly Gly Val Tyr Phe Asp
305 310
Tyr Glu Lys Al a Leu Lys Lys Al a
32 5
Arg Lys Gly Phe Tyr Gln Gly Asn
340
lie Arg LyS Gly lie pro тгр Glu
355 360
Met Gly Gly Ile Glu Val Asp Glu
370 375
Leu Tyr Ala Al a Gly Glu Thr Thr
385 390
val Ala ASp Gly Leu lie Glu Met
405
Leu Ser Ala cys Lys Tyr Ile Gln
75 80
Phe Tyr Leu Ser ASP G1 n Asn Met
90 95
Asp Glu cys cys Trp Glu Leu Lys
105 no
Lys val val phe Phe Gly Glu Glu
125
val Gly val Gly Cys Arg Tyr Gly
140
Val Ile Glu Asp Phe Ile Ala Val
155 160
Ala val Gly Al a val Gly lie Glu
170 175
Ile Arg Ser Lys Ser Val Ile Leu
185 190
Ser Phe Lys cys Thr val Ser Asp
205
Ala Tyr Arg Ala Gly Ala Lys Leu
220
lie pro Ala val Ala Leu Ser pro
235 240
Pro Phe Leu Hi s Ser Ser Met Leu
250 255
Gly Glu Ser lie Leu Asp Asn lie
265 270
Lys Glu Ser G1 u Met Gly Lys Leu
285
Gln lie Ala Arg Gly Lys Gly Thr
300
Tyr Ser Asn Val Pro Phe Asp Ile
315 320
Glu pro Leu Met ASn lie Trp Tyr
330 335
Asn Leu Asp Thr Phe Val Glu Asn
345 350
val Gly lie Gly Ser Glu туг Ser
365
Asn Met Tyr Thr Gly Val Pro Gly
380
Ser Gly val Phe Gly Al a Met Arg
395 400
Leu val Gln Gly Tyr Arg Ala Ala
410 415
Asn Val Asn G1 u Pro Ser Met Lys
- 81 031093
420 425 430
ASH! Thr ASO ile Asp Ser lie lie Lys ASp ile phe Ser pro Leu G1 u
435 440 445
Arg Lys Glu Gly val ser Pro lie Lys He His Arg А5П Ile Glu Lys
450 455 460
Thr Ala ASp val Gly Phe ASn Phe Arg Arg ASn G1 u Glu Gly Leu Thr
465 470 475 480
Lys Ala Leu Asp G1U lie Leu Lys He His Lys туг ASp Ile Ser Ala
485 490 495
Met ser Thr Lys ser Lys Asn Arg val Tyr ASn Tyr Glu Trp lie G1 u
500 505 510
ser val Gln Ala Arg ASn Leu Leu Thr cys Thr Glu Ala Gly val Arg
515
520
525
530
535
540
Tyr Glu Phe Val Asp Asn Asp Asn Trp Leu Leu Arg Ile Met Ser Ser
545 550 555 560
565
570
575
Thr Thr Met Glu Leu Pro Gly Gly Lys Asn 585 Lys Asn Ile Pro 590
580
Met Leu ser Met Leu LyS
595
<210>
<213>
<400>
2781
ДНК
Clostridium autoethanogenum
atgctaacta ataatactga ggcacttata ttggcagaaa agattggaaa agaagctgca 60 ctatcatgtt tacagggaat gtatgattat ggcacaagtc ctatgaaagt tttagatatg 120 ataaaggaaa aacctaattg taaagttata gttggagcac taaacaattc ggatacagat 180 ggaatgctta atattttggc aaaaacaaat ccagctggac ttgcagcagg tctttcagta 240 ttagcaaagg catcaggagc agaagaggcc ctattagaac ttcgtaatac ggataatgaa 300 gctgaattat tagccagtgc aaaaacagca ggagtaaaac ttagagtaga agtaggtgaa 360 ctagttgatg taagggcaca taaagagcat attattttta atttagaaac tttagccgga 420 attgccgata aaattacggg cacagcacca ggaattatta tagcagtaga tgaagatgta 480 cctaaggaag ttaaattcgg tacaaaactt gtggattttt tagacacagc taaggttaaa 540 tcggttatga ttaaccacca tttttataga ttagatgtat taaataatgg cattataaag 600 gaaaactcct atggaagtgg tgttattcat ataatttacg aaaatgattg catagtagaa 660 aaaacaaaaa aagaactaga aaatcttaga aagcaaagct gtggaaaatg tactttttgc 720 cgtgaaggat tatatcagct tgatgttata tttgatgaca tgataaaagg cagatcagag 780 aaagaggatc ttgctatggt agaagagtta acaagtgcaa tgaaattttc atgtaattgc 840 tcattaggaa aatgctcagg agaaccagca gcaagtgcaa taacagaatt taaattagaa 900 gtagagcagc atataaagaa gaggggatgt cctgctggcc agtgtttagc ctttacaaat 960 atatacgtag atcctagaaa atgcaaaggt tgtggaaaat gcttggaagt ttgtccagag 1020 gattgtattg aagcaaaaaa gggctatatt tccatgattg acgaatttga ttgcactaaa 1080
- 82 031093 tgcggcatat cctaaacttc gtatagatga ctacaaaact acagagaaga aaaaaagata actattatga gcagcagcta acaacaggtg aaagataact cattatcgtg gaatggttac gcggcaactt ggaatggcaa acaccagtgg agtgaaggta ggcaataaca ccatttatgg atgaaatatg ttactagatg atgaatgaag ggcaattatg ccagatattt aaaaacggca ataataaagc aaaagatgga ttacagctgg gagcagcaaa ttaacaatat tagatgagga aggatatggg ggcatatagt aaataatgac tttctttaat atattattga agaatatgat ttcctggaat gagaaaatat cagtgctgcg gagatatggg cttactgcat ttgatattgt atgtcccaat aacaagagta caatttaaaa atctgagaaa aacagatatt agagaacaat catgggtatg aagtgtagca tttagttcag agtagaattt taagccggaa agaacgtgca aaaggaaaat agtcagggca aaaatctgaa aacaggtgat tgaggcaatt tcagccaaat aaatactaca aatgcaattg aaaggaagta agacacagaa atatcagaga ataatcgcag ttaaaatcta ggaccacttg gaagcccttg acatacftta tatggatgaa tcatccagca gcaggagcat aatggagtta aaagaacttg ggaagaatat aaagctgtta tttggtttga ggcttgaaaa tatcagcttc cttttaatta tttactggaa ggaattttaa gatgctttcc ttaaggtaaa aaaatataac ctaagcttgt ttaaaaagtc caggaggccc ttctttttga gaatagatac acatgcatat ataagagtgc ttcgctattt ttggaccacg gaacaaaaat gtggtgttaa ttgttgcaac caattggaga tgatgtggga ctgataattt atcaacttgg atgccattgc aacattataa ttgcagttga tggcaaaacc agaagaggac tattccactt aaaggagggt agcaggactg aaaatctagt taaaattcag gaaatatact agaaacaatt taaagaatca tgcagctagt cctattggaa agcacaagat tggtggtttt agattatttc agcaggtgca aaactggttt tgatcgtttt aatgcagccg aaagaatggt tggagagatt
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340 gctaaggcag gctaaaaaac gcctgtgaaa actggaaagg ggtgttcgta ctttatagcg cctggtaaca gagtatattg <210> <211> <212>
tagaacaagg ttaatattga cgggagtaga gaaaatattt tcaataaata ctggtactga gcatgggatt aagaagtata ttatgaatca tgctgaaaaa cactaaattc agttggaaaa ttgtgaagtt tgctaataca tgcaattaat a 2781 tattttgaag ttacaagata cataaaaaac ttctaccttg ttagatgaaa atttatggag tcaggacgta cacgaacagt ctattgatga aggcatatct gagcttatgg gctttaatcc acagctataa tggctggaga agaagagctt atataatgaa ccatcctatc aacaattggt aattgaggga ttttactctt aagtgccgca
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2760
926
ПРТ <213> Clostridium autoethanogenum <400> 57
Met Leu Thr А5П Asn Thr Glu Ala Leu ile Leu Ala Glu LyS lie Gly
1 5 10 15
Lys Glu Ala Ala Leu ser Cys Leu Gln Gly Met Tyr Asp Tyr Gly Thr
20 25 30
Ser pro Met Lys val Leu Asp Met ile Lys G1 u Lys pro Asn Cys Lys
35 40 45
val Ile val Gly Ala Leu Asn Asn Ser ASp Thr ASp Gly Met Leu Asn
50 55 60
lie Leu Ala Lys Thr Asn pro Ala Gly Leu Ala Al a Gly Leu ser val
65 70 75 80
Leu Ala Lys Ala Ser Gly Ala Glu Glu Ala Leu Leu Glu Leu Arg Asn
85 90 95
- 83 031093
Thr Asp Asn Glu Ala 100 Glu Leu Leu Ala Ser 105 Ala Lys Thr Ala 110 Gly Val
Lys Leu Arg val Glu val Gly G1 u Leu val Asp val Arg Al a His Lys
115 120 125
Glu His Ile Ile Phe Asn Leu Glu Thr Leu Ala Gly Ile Ala Asp Lys
130 135 140
lie Thr Gly Thr Ala pro Gly lie lie lie Al a val Asp G1 u Asp val
145 150 155 160
Pro Lys Glu Val Lys Phe Gly Thr Lys Leu Val Asp Phe Leu Asp Thr
165 170 175
Ala Lys Val LYS 180 Ser Val Met lie Asn 185 His His Phe Tyr Arg 190 Leu Asp
val Leu ASn Asn Gly lie lie Lys Glu ASn Ser туг Gly Ser Gly val
195 200 205
lie His ile lie туг Glu Asn Asp cys lie val Glu Lys Thr Lys Lys
210 215 220
Glu Leu Glu Asn Leu Arg Lys G1 n Ser cys Gly Lys cys Thr Phe cys
225 230 235 240
Arg Glu Gly Leu Tyr Gln Leu ASp val ile phe Asp Asp Met ile Lys
245 250 255
Gly Arg Ser Glu Lys Glu Asp Leu Ala Met Val Glu Glu Leu Thr Ser
260 265 270
Ala Met Lys phe Ser cys Asn cys Ser Leu Gly Lys cys Ser Gly Glu
275 280 285
Pro Ala Ala Ser Ala lie Thr Glu Phe Lys Leu Glu Val Glu Gln His
290 295 300
lie LYS Lys Arg Gly Cys pro Ala Gly Gln Cys Leu Ala phe Thr ASn
305 310 315 320
Ile Tyr Val Asp Pro Arg Lys cys Lys Gly cys Gly Lys cys Leu Glu
325 330 335
val Cys pro Glu ASp cys ile Glu Ala Lys Lys Gly туг lie Ser Met
340 345 350
lie Asp Glu Phe Asp cys Thr Lys cys Gly Ile cys Ile Asp Glu cys
355 360 365
pro ASn ASn Ala lie val Lys val ASn Gly Lys Thr pro LYS Leu pro
370 375 380
Thr Lys Leu Thr Arg val Lys Gly Ser Lys Asn Ile Thr Glu Glu Asp
385 390 395 400
Thr Glu Lys Lys Lys Arg His Asn Leu Lys Arg His Arg Thr Lys Leu
405 410 415
Val Ile Pro Leu Lys Lys Asp Asn Asn Lys Al a Ser Glu Lys lie Ser
420 425 430
Glu Ile Lys Lys Ser Lys Glu Gly Thr lie Met Lys Lys Met Glu Thr
435 440 445
- 84 031093
Asp lie lie lie Ala Ala Gly Gly pro Ala Gly Leu Ala Ala Ala lie
450 455 460
Thr Al a Gly Glu Asn Asn Leu Lys Ser lie Leu Phe Glu Lys Ser Ser
465 470 475 480
Thr Thr Gly Gly Ala Ala Asn Met Gly Met Gly pro Leu Gly lie ASp
485 490 495
Thr Lys lie Gin Lys Asp Asn Phe Asn Asn He Ser Val Ala Glu Ala
500 505 510
Leu ASp Met His Met Lys туг Thr His Tyr Arg val ASp Glu ASp Leu
515 520 525
Val Gin Thr Tyr Phe Asn Lys Ser Ala Glu Thr He Glu Trp Leu Gin
530 535 540
ASp Met Gly val Glu Phe Al a Gly Ala Phe Arg туг Phe Lys Glu Ser
545 550 555 560
Ala Ala Thr Trp His lie val Lys Pro Glu ASn Gly val lie Gly Pro
565 570 575
Arg Al a Ala Ser Gly Met Al a Lys lie Met Thr Glu Arg Ala Lys Glu
580 585 590
Leu Gly Thr Lys lie Leu Leu Glu Thr pro val val ser Leu lie LYS
595 600 605
Glu Asn Gly Arg lie Cys Gly val Lys Al a Gin Asp Ser Glu Gly Asn
610 615 620
lie lie Glu Val Arg Ala Lys Ala val lie Val Ala Thr Gly Gly Phe
625 630 635 640
Gly ASn ASn Lys Asn Met lie Lys Ser Glu phe Gly Leu Thr lie Gly
645 650 655
Glu Asp Tyr Phe Pro Phe Met Val Pro Gly lie Thr Gly Asp Gly Leu
660 665 670
LyS Met Met Trp Glu Ala Gly Ala Met Lys Tyr Gly Glu ASH lie Glu
675 680 685
Ala lie Tyr Gin Leu Pro Asp Asn Leu Asn Trp Phe Leu Leu Asp Ala
690 695 700
val Leu Arg Gin pro ASn Leu Leu lie Asn Gin Leu Gly ASp Arg phe
705 710 715 720
Met Asn Glu Gly Asp 725 Met Gly Asn Thr Thr 730 Phe Thr Gly ASn Ala 735 lie
Ala Met Gin Pro Gly Asn Tyr Ala Tyr cys He Met Asp Glu Gly He
740 745 750
Leu Lys His Tyr Lys LyS Asn Gly pro ASp lie Phe ASp lie val His
755 760 765
Pro Al a Asp Ala Phe Leu Al a Val Asp Gly Glu He Al a Lys Ala Val
770 775 780
Glu Gin Gly туг Glu ser туг Phe Glu Ala Arg Thr val Glu Glu Leu
785 790 795 800
Ala Lys Lys Leu Asn He Asp Ala Glu Lys Leu Gin Asp Thr He Asp
- 85 031093
805 810 815
Glu Tyr Asn Glu Ala Cys Glu Thr Gly val ASp Thr Lys Phe His Lys
820 825 830
LYS Gln Ala Tyr Leu His Pro Ile Thr Gly LYS Gly Lys Tyr Leu Val
835 840 845
Gly Lys Phe Tyr Leu Gly Ala Tyr Gly Thr lie Gly Gly val Arg lie
850 855 860
Asn Lys Tyr cys Glu val Leu Asp Glu Ser Phe Asn Pro Ile Glu Gly
865 870 875 880
Leu Tyr ser Ala Gly Thr ASp Ala Asn Thr lie Tyr Gly ASp Ser туг
885 890 895
Asn Phe Thr Leu Pro Gly Asn Ser Met Gly Phe Ala lie Asn Ser Gly
900 905 910
Arg Met Ala Gly Glu Ser Ala Ala Glu Tyr lie Glu Glu val
915 920 925
<210> 58 <211> 1461 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 58 atgagagaat ttgaaacaga tgtagttgtt gttggtggag gagcatcagg gctagctgca 60 gcagttactg ctgcagaaaa tggtgcaaaa gtaatggtgc ttgaaaaagc taatactaca 120 ggtggatgtg ctaatatggc aatggggcct ctaggtgttg aaacaagaat gcaaagagaa 180 agacttatag atatctctgt agatagagct tttaataagt tcatggaata ttctcactgg 240 agatcagatg caagattgat aagaagatat ttggagcagt cagcaggaac tattgaatgg 300 ttagaaaata tgggagtaga attcgcatta ccttcaaagt attttccagc ttcagaagca 360 acctggcata ttgttaaacc taaaacaggg aaaccgggac ttcgtgcagc tgctactatg 420 attaaaatta tgacagaaag agcagaagaa ttaggcgtta aaatattatt agaaacacct 480 gtaaaaagta ttattaaaga tcaaggagaa gtaattggcg taacagctag tgataaagat 540 ggtgaattag aagtatatgc tggagcagtt atcatcggta caggtggatt tggtgataat 600 ccagacttta ttaagaagta tgttggactt gaatggggaa aagatttgtt ctcatataga 660 attcctggat taactggaga tggaatccag atggcttggg atgctggtgc ttcaaaagat 720 tttatgacta tggaaatggt attttttgct cctaacactg gtggatatgc tcctatagag 780 ttacctttcc gtcaacctaa tctcttagtt aacctggacg gtgaaagatt tataaatgaa 840 gaagttatag aaaatcctgt atttaccgca aatgctattg aaaaacaaaa aagaaaaatt 900 gcatattcta taatagatga agaactaatc aagcattatg aagaaaaggg cttagatctt 960 ataaatgtgg ttacttctag tatggatatg agttatttta gacaagaaga agaagaagct 1020 aagaaaaatg gaagtgatgt attatttatt gctgattcta tagaagagtt agctgaaaaa 1080 actggcattg atgcagaaaa cttaaaaaat accattgata cttataattc ttattgtgat 1140 tcaaaagatg agttattcca taaaaatcct aaatacttat taccaattaa aggctctaaa 1200 tattacgcat taaaacttgg tttaagtgca tatggaagtg ctggcggtat aaaaataaac 1260 tataatactg aagttcttaa tgatgattta aatgttataa agggacttta tgctgctgga 1320 actgatgcta attcactata taatcctgat tatgcttttg tactacctgg aaattcccta 1380 ggttttgctt tgaacagcgg aagaatagca gggtctagcg ctgttgaata tattaaagca 1440 aatcttatgg aagaacaata a 1461 <210> 59
- 86 031093 <211> 486 <212> ПРТ <213> Clostridium autoethanogenum <400> 59
Met 1 Arg Glu phe Glu 5 Thr Asp val val val 10 val Gly Gly Gly Ala 15 Ser
Gly Leu Ala Ala Ala Val Thr Ala Ala Glu Asn Gly Ala Lys Val Met
20 25 30
val Leu Glu Lys Ala Asn Thr Thr Gly Gly Cys Ala ASn Met Ala Met
35 40 45
Gly Pro Leu Gly Val Glu Thr Arg Met Gin Arg Glu Arg Leu lie Asp
50 55 60
lie ser val ASp Arg Ala phe ASn Lys Phe Met Glu туг ser His тгр
65 70 75 80
Arg ser Asp Ala Arg Leu lie Arg Arg Tyr Leu Glu Gin Ser Ala Gly Ser LyS
Thr lie Glu Lys Tyr Phe Trp 100 pro 85 Leu Ala 90 Glu Asn Met Gly Val Glu Phe Ala Leu 110 95 Pro pro
ser G1 u Ala 120 105 Thr тгр
His lie val 125 LyS
115
Thr Gly Lys pro Gly Leu Arg Ala Ala Ala Thr Met lie LyS lie Met
130 135 140
Thr Glu Arg Ala Glu Glu Leu Gly Val Lys He Leu Leu Glu Thr Pro
145 150 155 160
val Lys Ser lie lie Lys Asp Gin Gly G1 u val lie Gly val Thr Ala
165 170 175
Ser Asp Lys Asp Gly Glu Leu Glu Val Tyr Ala Gly Ala Val lie lie
180 185 190
Gly Thr Gly Gly phe Gly Asp ASn pro ASp Phe lie Lys Lys туг val
195 200 205
Gly Leu Glu Trp Gly Lys Asp Leu Phe Ser Tyr Arg He Pro Gly Leu
210 215 220
Thr Gly ASp Gly lie Gin Met Ala Trp ASp Ala Gly Ala Ser LYS ASp
225 230 235 240
Phe Met Thr Met Glu Met Val Phe Phe Ala Pro Asn Thr Gly Gly Tyr
245 250 255
Al a pro lie Glu Leu pro phe Arg Gin Pro Asn Leu Leu val Asn Leu
260 265 270
ASp Gly Glu Arg Phe lie Asn Glu Glu val lie Glu Asn Pro val Phe
275 280 285
Thr Ala Asn Ala lie G1 u Lys Gin Lys Arg Lys lie Ala Tyr Ser lie
290 295 300
lie Asp Glu Glu Leu lie Lys His Tyr Glu Glu Lys Gly Leu Asp Leu
305 310 315 320
lie Asn val val Thr Ser Ser Met ASp Met Ser Tyr phe Arg Gin Glu
- 87 031093
Glu
Glu
Glu
325
Ala Lys
340
Lys
Asn
Gly
Ser
345
330
Asp
Val
Leu
Phe
Ile
350
335
Ala
Asp
Ser Ile Glu Glu Leu Ala Glu Lys 360 Thr Gly Ile Asp Al a 365 Glu Asn Leu
355
Lys Asn Thr lie ASp Thr Tyr ASn Ser Tyr Cys ASp Ser Lys Asp Glu
370 375 380
Leu Phe His LYS Asn Pro Lys Tyr Leu Leu Pro Ile Lys Gly Ser Lys
385 390 395 400
Tyr туг Ala Leu LyS Leu Gly Leu Ser Ala Tyr Gly Ser Ala Gly Gly
405 410 415
Ile Lys lie Asn Tyr Asn Thr Glu Val Leu Asn Asp Asp Leu Asn Val
420
430 lie
Al a
Al a
Ala
Leu
Asn
Leu
Asn
425
Thr
Lys
Tyr
Asp
Tyr
Ser
445
Gly
440
Gly
435
Pro Asp Tyr Ala Phe Val Leu Pro Gly Asn Ser Leu Gly Phe Ala Leu
450 455 460
ASn Ser Gly Arg lie Ala Gly Ser Ser Ala val Glu туг lie Lys Ala
465 470 475 480
Asn Leu Met Glu Glu Gln
485
1230
ДНК
Clostridium ragsdalei <210> <211> <212> <213> <400>
atgaacaatt cttaaaagta gttgctgaac aagggaaatt ggtgctgcag ggagtagacg gtaaaattaa tgctttgaaa caacacggaa aaaaaatttg gcaaagctgc atatcaaaag cctagcatgg taaaagaaga aagtagctgt catgtcttga atgtagcagt ctggcttgcc cttttcctat tagaatccac tagaagataa cagcagtagt aagacttaaa ttgtaagtag atagagaaaa taaaaggtgc agcattaaag taaaacaaga aatcaacaaa agtaactaac tgtaatggaa ttgtgttgac atttggagga attaaaaaag aactttagct agtaataata aggagttaaa tttaagtgct gcttaaagat tttcataaag gaggatctgg aactataatg ggcagtgcag ggtaaatcta agcaaagatc ataaacctag gtctgcaata gctatgataa aatggtgcag aacattattg gcaaaaaaag gtactaaaag aacatgaagg gtttagcata ccctatacga ttttgggact ttctatttaa ctgacaagat aagatataaa taccagtttt acgcgcttaa gagctgcagg tatgcgatag acctggcaga aagctgatgt taaaatagaa tactccaggt ttatacttct tggaaatata gacttttgca tgtagaaaca agcccctgaa tcatgacgac aatagtaaac tacagcaatc aaaaggtgct aattacaaat atttataggt
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780 gtatctgctc atttttgcta gccagagtag ttccctggaa aaaatagctg ctggagtaat tggccaatcc ttggtacagg tatttagagg ctgcatgtgc tactcctgaa taaacctgaa aagatcggat agcacttgat tatagcagat atgataaaaa atctaccctg tttccaaatc gtaagagcat ataataactg caatggataa atgaagcaaa aaataaataa caaaaataaa aaaaagaact agatcccctc agctgcaggt tgttcttgca cgaagaaatg taatgaagat
840
900
960
1020
1080
- 88 031093 tatgttatac cagatgcttt cgactcaaga atagcaccaa aggtagctta ctatgtagca 1140 aaagctgcca tagaaagtgg agttgcaaga agaactgaca tcactcctga aatggtagaa 1200 gaacatacta aaaagcttgt acaagcataa 1230 <210> 61 <211> 409 <212> ПРТ <213> Clostridium ragsdalei <400> 61
Met 1 Asn Asn Leu Lys 5 Glu Glu Ala Leu Lys Phe 10 His Lys Glu His 15 Glu
Gly Lys lie Glu Leu Lys set LyS val Ala val Lys Thr Arg Glu ASp
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Tyr Thr Pro Gly Val Al a Glu Pro cys Leu Glu lie
35 40 45
Asn Lys ASn туг ASn Ala Leu Tyr ASp туг Thr Ser LyS Gly ASP туг
50 55 60
Val Al a Val Val Thr Asn Gly Ser Ala Val Leu Gly Leu Gly А5П Ile
65 70 75 80
Gly Ala Ala Ala Gly Leu pro val Met Glu Gly Lys Ser lie Leu phe
85 90 95
Lys Thr Phe Ala Gly Val Asp Ala Phe Pro Ile cys Val Asp Ser Lys
100 105 110
ASp pro ASp Lys ile val G1 u Thr val LYS Leu ile Glu Ser Thr phe
115 120 125
Gly Gly Ile Asn Leu Glu Asp Ile Lys Al a Pro Glu cys Phe Glu Ile
130 135 140
Glu ASp LYS Leu Lys LYS val Cys ASn lie pro val phe His ASp Asp
145 150 155 160
Gln His Gly Thr Al a Val Val Thr Leu Al a Ala Met Ile Asn Ala Leu
165 170 175
Lys Ile Val Asn 180 Lys Lys Phe Glu Asp Leu 185 Lys Val Ile Ile 190 Asn Gly
Ala Gly Ala Ala Gly Thr Ala lie Ala Lys Leu Leu val Ser Arg Gly
195 200 205
Val Lys Asn Ile lie Val cys Asp Arg Lys Gly Al a Ile Ser Lys Asp
210 215 220
Arg Glu ASn Leu ser Ala Ala LyS Lys ASp Leu Ala Glu lie Thr Asn
225 230 235 240
Pro Ser Met Val Lys Gly Ala Leu Lys Asp Val Leu Lys Glu Ala Asp
245 250 255
val Phe lie Gly val ser Ala pro Gly val lie Thr pro Glu Met ile
260 265 270
Lys Thr Met Asp Lys Asp Pro Leu Ile Phe Ala Met Ala Asn Pro Lys
275 280 285
pro G1 u Ile Tyr Pro Asp Glu Ala Lys Al a Ala Gly Al a Arg val val
290 295 300
- 89 031093
Gly Thr Gly Arg Ser ASp phe pro ASn G1 n lie ASn ASn val Leu Al a
305 310 315 320
Phe Pro Gly Ile Phe Arg Gly Ala Leu Asp Val Arg Ala Ser Lys Ile
325 330 335
Asn G1 u Glu Met Lys lie Al a Ala Ala Cys Ala lie Al a Asp ile lie
340 345 350
Thr Glu Lys Glu Leu Asn Glu Asp Tyr Val Ile Pro Asp Ala Phe Asp
355 360 365
Ser Arg ile Ala pro Lys val Ala Tyr Tyr val Ala Lys Ala Ala lie
370 375 380
Glu Ser Gly Val Al a Arg Arg Thr Asp Ile Thr Pro Glu Met Val Glu
385 390 395 400
Glu His Thr LyS Lys Leu val Gln Ala
405
<210>
<211>
<212>
<213>
<400>
atgtcataca
1098
ДНК
Clostridium ragsdalei ccaaggttaa gtatgaagat ataaaaaagt tgtgtaattt ggtttttgag
aaatttggat tcaaccagga agatagtaaa accataacta gcgttttgct tttatcagat 120
ctatatggaa ttgaatcaca tggtatccaa aggctagtca aatactacag tgaaataaaa 180
agtggcctta taaatatcaa ttctaaaatg aaaatagtaa aggaaacacc tgtatctgca 240
acaatagatg gcatgggagg tatgggacaa ctaattggta aaaaagccat gaatctggca 300
attaaaaaag ctaaaacttc aggaatgggt atggtagtag ttagaaattc aaatcactat 360
ggtattgcag gctactatgc caaaatggct gaggaggaag gacttcttgg aatttcaatg 420
accaattctc cagctgtaat ggtaccaacc tttggaaaag atgctatgct tggtacaaat 480
cctattgcca tatcttttcc agctaaaccc tacccatttt taatggatat ggctactagc 540
gtagttacca gaggaaaaat tgaagtttat aacaaaaggc atgaacctct tccacttggt 600
ctcgctttaa atagtgacgg tgaagatact acagatcccc tagatgtact tcttaatgta 660
cgaaaaaatt ctggaggagg cctgcttcct cttggaggat caaaagaatc aactggagga 720
cataaaggtt atggatttgc acttgcagtt gaaatgttta cagcaatttt gtctggagga 780
tttactgcaa ataaagttag cttagataga gaaaatggat ctggaacatg tcattatttc 840
tttgcagtgg attatggtat atttggggat aaacaatcca ttgaagagaa cttttccagt 900
tacctaaatg aacttagaaa ttcaaaaaaa gcaaaaggcg ccacaagaat atatactcat 960
ggtgagaaag aagtagaatc ctataaggat aaaatggaaa atggaattcc agtaaatgag 1020
actactctta aagaaatata cgacatatgt gactacttta atataaaagc tagtgattat 1080
gtaactaaag taatataa 1098
<210> 63
<211> 365
<212> ПРТ
<213> Clostridium ragsdalei
<400> 63
Met Ser Tyr Thr Lys Val Lys Tyr Glu Asp Ile Lys Lys Leu Cys Asn
1 5 10 15
Leu val Phe Glu Lys Phe Gly Phe Asn Gln Glu Asp Ser Lys Thr lie
- 90 031093
20 25 30
Thr Ser val Leu Leu Leu Ser Asp Leu Tyr Gly lie Glu Ser His Gly
35 40 45
Ile Gln Arg Leu val Lys Tyr Tyr Ser Glu Ile Lys Ser Gly Leu Ile
50 55 60
ASn lie ASn Ser LyS Met LyS lie val Lys Glu Thr pro val Ser Ala
65 70 75 80
Thr Ile Asp Gly Met Gly Gly Met Gly Gln Leu Ile Gly Lys Lys Ala
85 90 95
Met Asn Leu Ala 100 lie Lys Lys Ala Lys Thr Ser Gly Met Gly Met Val
105 110
val val Arg ASn Ser ASn His Tyr Gly ile Ala Gly Tyr Tyr Ala Lys
115 120 125
Met Ala Glu G1U Glu Gly Leu Leu Gly lie Ser Met Thr Asn Ser Pro
130 135 140
Ala val Met val pro Thr Phe Gly Lys Asp Ala Met Leu Gly Thr Asn
145 150 155 160
Pro Ile Ala Ile Ser Phe Pro Ala Lys Pro Tyr Pro Phe Leu Met Asp
165 170 175
Met Ala Thr Ser val val Thr Arg Gly Lys lie Glu val Tyr Asn Lys
180 185 190
Arg His Glu Pro Leu Pro Leu Gly Leu Al a Leu Asn Ser Asp Gly Glu
195 200 205
ASp Thr Thr ASp pro Leu ASp val Leu Leu Asn val Arg Lys Asn Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Leu Leu Pro Leu Gly Gly Ser Lys Glu Ser Thr Gly Gly
225 230 235 240
His Lys Gly туг Gly Phe Ala Leu Ala val Glu Met phe Thr Ala lie
245 250 255
Leu Ser Gly Gly Phe Thr Ala Asn Lys Val Ser Leu Asp Arg Glu Asn
260 265 270
Gly Ser Gly Thr Cys His Tyr phe Phe Ala val ASp Tyr Gly ile phe
275 280 285
Gly ASp Lys Gln Ser Ile Glu Glu Asn Phe Ser Ser Tyr Leu Asn Glu
290 295 300
Leu Arg Asn Ser Lys Lys Ala Lys Gly Al a Thr Arg ile туг Thr His
305 310 315 320
Gly Glu Lys Glu val Glu Ser Tyr Lys Asp Lys Met Glu Asn Gly lie
325 330 335
pro val Asn Glu Thr Thr Leu Lys Glu lie Tyr Asp lie Cys Asp туг
340 345 350
Phe Asn Ile Lys Ala Ser Asp Tyr Val Thr Lys Val Ile
355 360 365
<210> 64
2634
ДНК
Clostridium ragsdalei <211>
<212> <213>
<400>
atgaatggta cttggaggca ggatttacta cagcaagtta aagtttggaa atgccaggaa cttaaaaagc atgttttcag gtaaaaaatg ataatccaga cctaaggaac gcaataattt caatcaatgg aacccatcta gatgtagttg aaatgttatt caggatatgg aagagaacag actaaagaag aactttgaca ccaggagcag caaggtgaaa gcagcttctg gcaagaggta gaaaagcttt ggaagtactg gattttggaa gcagatacac tgtagaacag gtttcaaaaa aaagatttta agaagtacgt agggagctaa tatccacaga tagatcaaat gtatagagaa tgatggatac taacaggaaa atgtagttat ctaaaggagt aatttaaaga agttaattca acagaaggtt tatttggaaa caggggaaaa cagggataag ctcaatttat agtttactat ctcaggctgc aggccatact gtgatgaatt cttgtggtaa aggtaatact aaggaatact tgggaacatg tcaaaagatt gaaatgttta tcttcatggg caagagatgc agcatatgtt cggaagagca ttggaatata ttatcttttc tcttgcagaa ggcatgtacc ttatgatgca tccactgtta tatattaaat tgaaagattt gggaattgaa aaaatacgat tatttacaaa gtcagttact aaacgatata tatgggagag gtccatattt aacacctcaa aatgaaggaa atgaccaatc aaatattatg cttaaaaatg gtttcagtaa ttgggattaa gcgtatgatt aagagagaat acagatttag aaagaagtaa gcagtgttta tcaggtgatt acttcaggaa ggtgaatatc cctataacaa gagtatagcg agagcagggg acttagaata taaagttgag gaaacgggca gatatatttt tgtaaggtta tacagttaga ctgtgtagct agataaggtt tggagagcct atgggctgat aaaccaggct cttcgatgaa gagaagaaaa tgaggcaatg aataaactcg aaattatatt gcagtaaata cctaaacagc gctgtaatag acagcagatg gagacttccc ggaggtatga ggatgtggtg tataaagaag ataaagactg aatataagaa attagttttg gatagaatac gctttagata gaaggaaaac atgctggcat ttggcatacc aagatggtaa tggaagagac ggtcaggagc atgatgatac cttatagaag ttgaagatgt atgaatccga aggaagactt gatcttggga ggggaactgc caggagttgc tcataaacgc agctaaaaga aaaatcatta tccttcagac tggtagatga ttgacacact caaatggact atgctaagaa cagaagatat catctcatgc atcttatagt gagattacat tagcaccaga aattaggagt gtgccgaagg cagaaatgag aattgctacc ctgtcacaat gagaaattta cgttcctggt atccatatca aacaggaaaa cagagtttct tgtaatagga atttattcaa gctggatgac tttaaaggat tcctcaagat aaaccctaga agtaaatgtt atttactaga tcaaggagag agaccttcca taaagatatg gagaaacggt aggtctcatc attgcatcca tcctgcatca acatcatgat agaaggaatg agctgttgta aagtgaaaag atctttagat aatatcggga tagaaccaat aataggactt agaaatgata aagacaaaag tagatttttg
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860 gatccaccac ttcatgaatt cttacctact gaaactgagg atatagaggc tttagcaaag 1920 gaagtgggag taagttttca agaattgaaa gatactatag attctctaca tgaatttaat 1980 cctatgatgg gacatagagg atgcaggctt actgtttcat atccagaaat agctgaaatg 2040 caaacaaggg ctattataga agcagctata gatgttaaga agagaaaagg gtatgatata 2100 gttccagaaa ttatgatacc tcttgtagga gaagtaaaag aattaaaata tgttaaagat 2160 gtagttgtaa aggtagcaga tgaaataata caaaaagagg gagtcaattt aaaatatgaa 2220 gtaggaacta tgatagaaat tccaagagcg gctattacag ctgatgaaat agcaaaagaa 2280 gctgagttct tctcatttgg aactaatgat ttaactcaaa tgacttttgg attttcaaga 2340 gatgatgcag gtaaattttt aaatgattat tatgataaaa aagtatatga gtttgatcca 2400 ttccaaaagt tagatcagat tggagtagga aaacttgtag agactgctgt aaaattaggt 2460 aaaaagacta gacctgacat tcatcttgga atatgtggag aacatggagg ggatccatct 2520
- 92 031093 tctgtagaat ttttccacaa tgtaggactt gactatgtat cttgttcacc atttagggta 2580 cctgtggcaa gacttgctgc agctcaagct caaataaaga atccaagaaa gtaa 2634 <210> 65 <211> 877 <212> ПРТ <213> Clostridium ragsdalei <400> 65
Met Asn Gly Lys Lys Tyr val Tyr Leu Phe Asn Glu Gly Asn Al a Gly
1 5 10 15
Met Arg Asn Leu Leu Gly Gly Lys Gly Ala Asn Leu Ala Glu Met Thr
20 25 30
Asn Leu Gly ile pro val pro Gly Gly Phe Thr Ile ser Thr Glu Ala
35 40 45
cys Thr Lys Tyr Tyr Glu Asp Gly Lys Ser lie Ser Gln Gln Val He
50 55 60
ASp Gln lie Tyr ASp Ala Leu LYS А5П val Glu Glu Thr Thr Gly Lys
65 70 75 80
Lys Phe Gly ser lie Glu Asn Pro Leu Leu val Ser val Arg ser Gly
85 90 95
Ala Arg val Ser Met pro Gly Met Met ASp Thr Ile Leu Asn Leu Gly
100 105 110
Leu Asn Asp Asp Thr Val lie Gly Leu Lys Lys Leu Thr Gly Asn Glu
115 120 125
Arg phe Ala Tyr ASp Ser туг Arg Arg phe lie Gln Met phe Ser Asp
130 135 140
val val Met Gly lie Glu Lys Arg Glu phe Glu Asp val Leu ASp ASp
145 150 155 160
Val Lys Asn Ala Lys Gly Val Lys Tyr Asp Thr Asp Leu Asp Glu Ser
165 170 175
Asp Leu Lys ASp lie ile Gln Lys phe Lys ASp ile туг Lys LyS Glu
180 185 190
Val Lys Glu Asp Phe Pro Gln Asp Pro Lys Glu Gln Leu Ile Gln Ser
195 200 205
val Thr Ala val phe Arg Ser Trp Glu ASn pro Arg Ala lie ile туг
210 215 220
Arg Arg Leu Asn Asp Ile Ser Gly Asp Trp Gly Thr Ala Val Asn Val
225 230 235 240
Gln Ser Met val phe Gly Asn Met Gly Glu Thr Ser Gly Thr Gly val
245 250 255
Ala phe Thr Arg ASn Pro ser Thr Gly Glu Lys ser lie Phe Gly Glu
260 265 270
туг Leu ile ASn Ala Gln Gly Glu ASp val val Ala Gly ile Arg Thr
275 280 285
pro Gln Pro lie Thr Lys Leu Lys G1U Asp Leu pro Lys cys туг ser
290 295 300
Gln Phe Met Ser lie Ala ASn Lys Leu Glu Asn His Tyr Lys ASp Met
305 310 315 320
Gln Asp Met Glu Phe Thr Ile Glu Gln Gly Lys Leu Tyr Phe Leu Gln
325 330 335
Thr Arg ASn Gly LyS Arg Thr Ala Gln Ala Ala Leu Arg lie Ala val
340 345 350
Asn Met Val Asp Glu Gly Leu lie Thr Lys Glu G1 u Ala Ile Leu Lys
355 360 365
val Glu pro Lys Gln Leu Asp Thr Leu Leu His pro Asn Phe Asp Ser
370 375 380
Asp Glu Leu LYS Arg Ala Ala Val Ile Ala Asn Gly Leu Pro Ala Ser
385 390 395 400
pro Gly Ala Ala Cys Gly Lys lie Tyr Phe Thr Ala ASp ASp Ala LyS
405 410 415
Lys His His Asp 420 Gln Gly Glu Lys val 42 5 lie Leu val Arg Leu 430 G1 u Thr
Ser Pro Glu Asp Ile Glu Gly Met Ala Ala Ser G1 u Gly Ile Leu Thr
435 440 445
val Arg Gly Gly Met Thr Ser His Ala Ala val val Ala Arg Gly Met
450 455 460
Gly Thr cys cys Val Ala Gly cys Gly Asp Leu Ile Val Ser Glu Lys
465 470 475 480
Glu Lys Leu Phe Lys Arg Leu ASp Lys val Tyr Lys Glu Gly ASp туг
485 490 495
Ile Ser Leu Asp Gly Ser Thr Gly Asn Val Tyr Gly Glu Pro Ile Lys
SOO 505 510
Thr val Ala pro Glu lie Ser Gly ASp phe Gly lie phe Met Gly Trp
515 520 52 5
Ala Asp Asn ile Arg Lys Leu Gly val Arg Thr Asn Ala Asp Thr pro
530 535 540
Arg ASp Ala ASn Gln Ala lie ser Phe Gly Ala G1 u Gly lie Gly Leu
545 550 555 560
cys Arg Thr Glu His Met Phe Phe Asp Glu Asp Arg Ile Pro Glu Met
565 570 575
Arg Glu Met ile val Ser Lys Thr Glu Glu Gln Arg Arg Lys Al a Leu
580 585 590
Asp Lys Leu Leu Pro Arg Gln Lys Lys Asp Phe Ile Gly Ile Tyr Glu
595 600 605
Ala Met Glu Gly Lys pro val Thr lie Arg phe Leu ASp pro pro Leu
610 615 620
His Glu Phe Leu Pro Thr Glu Thr Glu Asp lie G1 u Ala Leu Al a Lys
625 630 635 640
Glu val Gly val Ser Phe G1 n G1 u Leu Lys ASp Thr lie Asp Ser Leu
645 650 655
His Glu Phe Asn Pro Met Met Gly His Arg Gly Cys Arg Leu Thr Val
660 665 670
Ser туг pro Glu lie Ala Glu Met Gln Thr Arg Ala lie lie Glu Ala
- 94 031093
675 680 685
Al a Ile Asp Val Lys Lys Arg Lys Gly Tyr Asp Ile Val Pro Glu Ile
690 695 700
Met ile pro Leu val Gly G1 u val LYS Glu Leu Lys Tyr val Lys ASp
705 710 715 720
Val Val Val Lys Val Ala Asp Glu lie Ile Gln Lys Glu Gly val Asn
725 730 735
Leu Lys туг Glu val Gly Thr Met lie Glu lie pro Arg Ala Ala ile
740 745 750
Thr Al a Asp Glu Ile Ala Lys Glu Al a Glu Phe Phe Ser Phe Gly Thr
755 760 765
ASn ASp Leu Thr G1 n Met Thr phe Gly Phe Ser Arg ASp ASp Ala Gly
770 775 780
Lys Phe Leu Asn Asp Tyr Tyr Asp Lys Lys val Tyr Glu Phe Asp Pro
785 790 795 800
Phe G1 n Lys Leu Asp Gln ile Gly val Gly Lys Leu val Glu Thr Al a
805 810 815
val Lys Leu Gly Lys LYS Thr Arg pro ASp ile His Leu Gly lie cys
820 825 830
Gly G1 u His Gly Gly ASp pro Ser Ser val Glu Phe Phe His ASn val
835 840 845
Gly Leu Asp Tyr Val Ser Cys Ser Pro Phe Arg Val Pro Val Ala Arg
850 855 860
Leu Al a Ala Ala Gln Ala G1 n lie Lys Asn pro Arg Lys
865 870 875
<210> 66 <211> 3447 <212> ДНК <213> Clostridium ragsdalei <400> 66 atggcgtact tgttaaagag gtttaagagg gttcttgtag cgaatagagg agaaatagcc 60 ataagaatat tcagagcatg taaagaattg ggaataacta ctgtagcagt atattcaaat 120 gaggataaga gatctctttt cagaactaaa gctgatgaat cctatatgat agggaaaaat 180 aagggacctg tagaagcata tttagatatt gatgaaataa tagatatagc tttgaagaaa 240 aatgtagatg caatacatcc gggttatgga tttctatcag aaaatcctga attggcaaaa 300 aagtgtaaag aagcaggtat tgaatttata ggacctacat cagatatgat ggagatgctt 360 ggtgataaga gttcaagagg cctgtcatga gaaaaagatc tcagaaaaaa ctcggagata agacatcaaa caaatatgtg taaaatctaa ctataaagac ttaaagcagc tcgtagaatc tatatattga agtacggcaa aggtgataga aagatgcttt gattgttgca agaagaagaa tgatggcggt ctacaacagt aaaatatatt tattgtccat atttacacca aaaaattgca caaaaggctg gctttaaaat ggcggcagag gctaaaaacg gaaagtccaa ctgtatgaaa tctttagccc agaactgtag gggttccaac ttgctaagtt gaatgagaat aatccagaaa aacacataga gagattgttc tctcagaaga gatatacaag aataccagga ctgtggatat agtaagggaa agcttttggt ggtgcaggta tatacagagg aaaaagacaa tgcaggtacc
420
480
540
600
660
720
780
840
- 95 031093 ttggagtttt caggtagaac cttattgcag atagagttaa tttgcaccag cttgatggag gtaaaaactg ataaatgaga agtcatgaaa ttatttgata aaagtagtaa gtagaagaaa ggattagttg gatgcccatc aaagcacaat tttgatgtag gaaaaggttc aagaactatc gatgtattta cagacattaa gatgacaagg aaaactggag gcttataaac catgatacta atagctgata atagcagcag tggttgataa atactgtaac aagggcattc aaggatatgc atacaggaag ggaatggatt tatcttggtc ctgttatatc agtttataaa taaaaccaaa atgagactcg atattaaatt attggataaa agtcgcttat cagtattgac cttatagatt ctaatatact ctgataatgt gagtatttga aagaaggaaa aagataaata cacagattct ttgtaaaagc caggtaatgg ctgcattcaa cacttaaaaa aaacggaaat tgaaatggtt acttgattct aatacaatgc aatagatatg tacaggcgca aagaactttt aggagtaaag aggtgaatgt actagataaa tggaaagaag gagtggaacg atcacaagat ggcaactagg aaacgatctt tttaaatgaa attccagatg tattagagaa tgctttaaac aatagctgaa tacacttcag tggaataaag acttaagaat tgtggcaaca tagtatgtct tacacctaga cactatttca acaggaatag aaggaaatag agaattacga tatagaactg gtaataagtc gaagatgcca acaaatgcag gatactaatt gagatgagtg aagaaattta aagcagatac aagcttctta gtgagaacta ttctccatgg tctccttggg ctcataagag tttataaaac tggcttaaag gcatgtatgt tactatgtaa gatatgtctg gaggtatcta gtactcatgg gggcttacta gatactaagt tagagatgaa atatagttca gaataaaatc cagaagatcc gttctggatt ctcattatga taagaaaggc actttataat ttattgaaga tacttaaatt atatacctat ttgataccaa ttacagatac gagatttgct aaatgtgggg aaagactaga gagct aatgc aatctgcagc gaatggaagt gctatacagg acttagctaa ccctattaaa ttccaataca ctgccgatgc gccagccagc tagatgcaga tactagaatt agatcaaata tcaagatgat tttaaataat tggtataaga tagtttgcta aataaggtct aaaagtgtta taatccagat tataggaaat tgtaccaaaa aggagcagat tactatgaga taagatagca aggagcaact aaaacttaga agtaggatat ttcaggtatt ttctatagat agatgtatta agaaatagag gccatattct tcttcatact aggacttgat tttgaattca taatcttcaa
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400 aaaatatcta aagtcgagta aaacctcagg aagagagtta ggagacctgg ggtaagagct cctatgggag acggtaagac actaaaaaat gatgtatatg agtgaaacat ggaaagagtt ttcttagtat ttctctggat gaaataggat gtagaagagg gctgctgaag ggagaacttt <210> 67 <211> 1148 actattggga ctgcagaaat ttgaaagttt ataaaatgct ctatattcat taactttccc gattcccaaa caggagaact ataagagaga aaggttatct tcttctatgg tatttgtaca ttgaggtaaa caggaataaa caagtatacc gccagagctt caggagtaat taattagatt agatgtaagg atacaagtat tgggttgggg tggcaacata gatacaaaat agattctaca ggaacttcaa tttaccacca atttaataat taaattctta acttgcggaa gttattagag tggtattaag agaaaattca tggaaacatt aattgtaata tgatggagta aaaatag 3447 cctatataca gagataccag gatcgttttg attaaagtaa gatttagatg atttcttact aaagtagttt gaagattttg aaagaactta agtgaatatg ggagaacttt attacaaaag agagacataa tgtgttatgg gttaaagtac gaagctatga tttgtaaaag gtcagtttga gaggtcaata aagatgtaaa ctccttcttc aaaagaatat ttaagggaat taaagggaga ccaaaataaa taagctatgc gtgatcttag gtgaagttga ttgatgatga ggataaaaga cagatgaaga ttgtaaaacc aaatggaaac aaggccagag gtcaggactt ttcaaactta ggaaatgtat aaaaatggta ttatgaaaaa gatgggtcag agaacctttt agagtattta tatgtatcct cagaatggaa aataggagaa aggatacaga taacttggct tgatgaaaaa aggagataaa aaatgtttca agttaaaact
2460
2520
2580
2640
2700
2760
2820
2880
2940
3000
3060
3120
3180
3240
3300
3360
3420
- 96 031093 <212> ПРТ <213> Clostridium ragsdalei <400> 67
Met Ala Tyr Leu Leu LyS Arg phe Lys Arg val Leu val Ala ASn Arg
1 5 10 15
Gly Glu Ile Ala Ile Arg Ile Phe Arg Ala Cys Lys Glu Leu Gly Ile
20 25 30
Thr Thr val Ala val туг Ser ASn Glu Asp Lys Arg Ser Leu phe Arg
35 40 45
Thr Lys Ala Asp G1U ser Tyr Met Ile Gly Lys Asn Lys Gly pro val
50 55 60
Glu Ala Tyr Leu ASp lie ASp Glu lie lie ASp lie Ala Leu Lys Lys
65 70 75 80
Asn Val Asp Ala lie His Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn Pro
85 90 95
Glu Leu Ala Lys Lys Cys Lys Glu Ala Gly 105 Ile Glu Phe Ile 110 Gly Pro
100
Thr Ser Asp Met Met Glu Met Leu Gly Asp Lys Ile Lys Ser Lys Ile
115 120 125
val Ala Gln Lys Ala Gly val Pro Thr lie pro Gly val Gln G1U Ala
130 135 140
lie Lys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Lys phe Ala Lys Phe cys Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Val Met Ile Lys Ala Ala Asp Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Arg
165 170 175
ile val Arg Glu Glu Lys ASp Leu val Glu ser Tyr Asn ser Ala Lys
180 185 190
Asn Glu Ser Arg Lys Ala Phe Gly Ser Glu Lys Ile Tyr Ile Glu Lys
195 200 205
туг ile Glu Ser pro Lys His ile Glu val Gln val Leu Gly ASp Lys
210 215 220
Tyr Gly Asn Ile Val His Leu Tyr Glu Arg Asp cys Ser Ile Gln Arg
225 230 235 240
Arg His Gln Lys val lie Glu phe Thr pro Ser Leu Ala Leu Ser Glu
245 250 255
Glu Lys Arg Gln Gln Ile Cys Glu Asp Ala Leu Lys Ile Al a Arg Thr
260 265 270
val Gly Tyr Thr Ser Ala Gly Thr Leu Glu Phe Leu val ASp Lys Asn
275 280 285
Gly Asn His Tyr phe Ile Glu Met Asn Thr Arg Ile Gln val Glu His
290 295 300
Thr val Thr Glu Met val Thr Gly Ile Asp Ile val Gln Asp Gln lie
305 310 315 320
Leu Ile Ala Glu Gly His Ser Leu Asp ser Lys Glu Ile Gly ile Lys
325 330 335
ser Gln ASp ASp Ile Glu Leu Lys Gly Tyr Ala lie Gln Cys Arg lie
340 345 350
Thr Thr Glu Asp Pro Leu Asn Asn Phe Ala Pro Asp Thr Gly Arg Ile
355 360 365
Asp Met Tyr Arg Thr Gly ser Gly 375 Phe Gly Ile Arg Leu 380 Asp Gly Gly
370
Asn Gly phe Thr Gly Ala val ile ser pro His туг ASp Ser Leu Leu
385 390 395 400
val Lys Thr Val Ser Trp Ser Arg Thr Phe Glu Asp Ala Ile Arg Lys
405 410 415
Ala ile Arg ser ile Asn Glu Thr val lie ser Gly val LyS Thr Asn
420 425 430
Ala Asp Phe Ile Ile Lys Val Leu Ser Hi s Glu Lys Phe Ile Lys Gly
435 440 445
Glu Cys ASp Thr А5П Phe lie Glu ASp А5П pro ASp Leu Phe ASp ile
450 455 460
Lys Pro LYS Leu Asp Lys Glu Met Ser val Leu Lys Phe Ile Gly Asn
465 470 475 480
Lys val val ASn Glu Thr Arg Gly Lys LyS LyS Lys phe ASn lie pro
485 490 495
lie Val Pro Lys Val Glu Glu Asn Ile Lys Leu Ser Gly Thr Lys Gln
500 505 510
lie Leu ASp Thr LYS Gly Ala Asp Gly Leu val ASp Trp Ile Lys Ser
515 520 525
Gin Asp Lys Leu Leu Ile Thr Asp Thr Thr Met Arg Asp Ala His Gln
530 535 540
Ser Leu Met Ala Thr Arg val Arg Thr Arg ASp Leu Leu LyS ile Ala
545 550 555 560
Lys Ala Gln Ser Val Leu Thr Asn Asp Leu Phe Ser Met G1U Met Trp
565 570 575
Gly Gly Ala Thr Phe ASp val Ala Tyr Arg phe Leu ASn Glu Ser pro
580 585 590
Trp Glu Arg Leu Glu Lys Leu Arg Glu Lys val Pro Asn Ile Leu Phe
595 600 605
Gln Met Leu lie Arg Gly Al a ASn Ala val Gly Tyr LyS ASn Tyr pro
610 615 620
Asp Asn Val Ile Arg Glu Phe lie Lys Gln Ser Al a Ala Ser Gly lie
625 630 635 640
Asp Val Phe Arg Val Phe Asp Ala Leu Asn Trp Leu Lys Gly Met Glu
645 650 655
val ser lie ASp Gln Thr Leu Lys Glu Gly Lys lie Ala G1 u Al a Cys
660 665 670
Met Cys Tyr Thr Gly Asp Val Leu Asp Asp Lys Glu Asp Lys Tyr Thr
675 680 685
Leu G1 n Tyr Tyr val Asn Leu Ala Lys Glu ile G1 u LYS Thr Gly Ala
- 98 031093
690 695 700
Gln lie Leu Gly lie Lys ASp Met Ser Ala Leu Leu LyS pro Tyr Ser
705 710 715 720
Ala Tyr Lys Leu Val Lys Ala Leu Lys Asn Glu Val Ser Ile Pro Ile
725 730 735
His Leu His Thr His ASp Thr Thr Gly ASn Gly val Ala Thr val Leu
740 745 750
Met Ala Ala Asp Ala Gly Leu Asp lie Ala Asp Thr Ala Phe Asn Ser
755 760 765
Met ser Gly Leu Thr ser G1 n pro Ala Leu А5П ser ile Ala Ala Ala
770 775 780
Leu Lys Asn Thr Pro Arg Asp Thr Lys Leu Asp Ala Asp Asn Leu Gln
785 790 795 800
Lys lie ser А5П Tyr Trp G1 u ASp val Arg pro lie туг ser Gln Phe
805 810 815
Glu Ser Gly Leu Lys Ser Ser Thr Ala Glu Ile Tyr Lys Tyr Glu lie
820 825 830
pro Gly Gly Gln туг Ser ASn Leu Lys pro Gln val G1 u Ser Phe Gly
835 840 845
Leu Gly Asp Arg Phe Glu Asp Val Lys Glu Met Tyr Lys Arg Val Asn
850 855 860
Lys Met Leu Gly Asn lie ile Lys val Thr pro Ser Ser Lys Met val
865 870 875 880
Gly Asp Leu Ala lie Phe Met lie Gln Asn Asp Leu Asp Glu Lys Asn
885 890 895
lie Tyr G1 u Lys Gly Lys Ser Leu Thr Phe pro Asp Ser Thr lie Ser
900 905 910
туг Phe Lys Gly Met Met Gly Gln pro Met Gly Gly phe 925 pro Lys Glu
915 920
Leu Gln Lys Val Val Leu Lys Gly Glu Glu Pro Phe Thr Val Arg Pro
930 935 940
Gly Glu Leu Leu pro pro G1 u ASp phe Ala Lys ile Lys Glu туг Leu
945 950 95 5 960
Thr Lys Lys Tyr Lys Arg Glu Phe Asn Asn Lys Glu Leu lie Ser Tyr
965 970 975
Ala Met Tyr pro ASp val Tyr Glu Gly туг Leu Lys Phe Leu Ser Glu
980 985 990
Tyr Gly Asp Leu ser Arg Met Glu ser Glu Thr Phe Phe туг Gly Leu
995 1000 1005
Ala Glu Gly Glu Leu cys Glu val Glu ile Gly Glu Gly Lys Ser
1010 1015 1020
Leu Phe Val Gln Leu Leu Glu lie Thr Lys Val Asp Asp Glu Gly
1025 1030 1035
Tyr Arg phe Leu val phe G1 u val Asn Gly lie Lys Arg ASp ile
1040 1045 1050
Arg Ile Lys Asp Asn Leu Ala Phe Ser Gly Ser Gly Ile Lys Glu
- 99 031093
1055 1060 1065
ASn Ser Cys val Met Ala Asp Glu ASp ASp Glu Lys Glu lie Gly
1070 1075 1080
ser ser lie Pro Gly ASn lie val LYS val Leu val Lys Pro Gly
1085 1090 1095
Asp Lys val Glu Glu Gly Gln Ser Leu lie val Ile Glu Ala Met
1100 1105 1110
Lys Met Glu Thr Asn Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly Val Ile Asp
1115 1120 1125
Gly val Phe val LyS Glu Gly Gln Arg val Lys Thr Gly Glu Leu
1130 1135 1140
Leu Ile Arg 1145 Leu Lys
<210>
<211>
<212>
<213>
1506
ДНК
Clostridium ragsdalei <400> ttgaatatta ttttcaatta ggaaagtata aacaaaataa tatgataaga ggagctttaa , ttgtttgcaa ; gaatttaata · tcagatgcct tactcgggag . ggggtcatgc i tttgggttgt ggtgatgacg , gctaaaacta · ggaactgtag aggtatactg . agcggtgtag i atgccaccta accagcaaga tgctttggtg . agaatagaca . tatggaaatg i aaaggaaaat acaagatgtc gaagcgtatg ; ttttaa 1506 <210> 69 <211> 501 ataaatatag aaaggggaga caggaagatc actggggaaa ttttaaatta aaaaatatac atcaattgtt ttatatcggt ttattttagt aaataaaaaa ctatgcactg caggaacagg aacatggatg taaggcttga ttgaaaatgt aaaatacaag gaggaaatcc tatcaagact tagctggaac aaccttttat agtataacac gagatagaat tcaaagatgt caggtgtacc atgagacagc aaatatgtat aggattttta tcctaaagat tgtaaatctt tataagtgat ccttcctata tagaaggcca acctggattt aaattttgat atcagtattt ttctgctaat aaaaaccact gtctaatgaa taaggaaaag agtggcagat ggcagcatat agagactata ttctaaagaa tgaaagagga gttaatgaat ccaggtatat aaaactttcc tgattttgtg tgatgaaata gagaaagctg aaaaatttat tcaaataagg agatttatag tctatagaag aaagacattt agagtaatat acggaggagg aaagctaagg aaaaaaatta tcagtaatga ataggacaag ttatcagcag ggtgtattta gaaagccaga gagaataggg cctataaatt atatttttaa gcagcaatgt ataattgaac cctgctgtct ttagtgaata tatacaagaa gaacatcctg ttaaacccta gcaatgaagt caccatcgga gagctcttat ttaatcaaga aagatatttt ttgtgtttga gcgaaagagc atttaaagtg ggaaagagga tattaatagg actttttgct acaataaaac atggtgaaag attttgaggg tatacaatgc tacctgatta atatagataa ctgcagatgc atcactttat ctcaagctac atgcaaagct ctggatggct ctatgattag tgtttaaagt gaaatacatg ttagtaaaaa attaacggaa gattaatact aagcattagg taataaaatg tggatttgtt atcccaggcg ttttactcct cggtttaaat gggaaccagt tccacaaaaa ttgcttattt aagattaatt tggatgttat cataaaattt taatgatggt tatagaagaa ttttggtgta gtctggatat tttttcctct gttaggcgaa atctggagga agaagctttg aatgatgcct gcaagataaa ctttgagaag
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
- 100 031093 <212> ПРТ <213> Clostridium ragsdalei <400> 69
Met Asn lie Asn Lys Tyr Arg Asn Met Tyr Lys Asn Leu Ser Pro Ser
1 5 10 15
Glu Leu Thr Glu Phe Ser lie Lys Arg Gly Glu Gly Phe Leu Ser Asn
20 25 30
Lys Gly Ala 35 Leu Met lie Asn Thr Gly 40 Lys Tyr Thr Gly 45 Arg Ser Pro
LyS ASp Arg Phe lie val ASn Gin Glu ser lie Arg ASn Lys lie ASn
50 55 60
Trp Gly Asn Val Asn Leu Ser lie Glu Glu Asp He Phe Asn Lys Met
65 70 75 80
Tyr ASp LyS lie Leu ASn Tyr lie Ser ASp Lys ASp lie Phe val phe
85 90 95
ASp Gly Phe val Gly Ala Leu Lys Lys Tyr Thr Leu pro lie Arg val
100 105 110
lie cys Glu Arg Al a Ser Gin Ala Leu phe Ala Asn Gl n Leu phe Arg
115 120 125
Arg Pro Thr Glu Glu Asp Leu Lys Cys Phe Thr Pro Glu Phe Asn lie
130 135 140
lie Ser val pro Gly phe LYS Ala Lys Gly Lys Glu Asp Gly Leu ASn
145 150 155 160
Ser Asp Ala Phe lie Leu Val Asn Phe Asp Lys Lys He lie Leu He
165 170 175
Gly Gly Thr Ser Tyr Ser Gly Glu lie Lys Lys Ser val phe Ser val
180 185 190
Met Asn Phe Leu Leu Pro Gin Lys Gly Val Met Pro Met His Cys Ser
195 200 205
Al a Asn lie Gly Gl n ASp Asn Lys Thr Cys Leu phe phe Gly Leu Ser
210 215 220
Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser Ala Asp Gly Glu Arg Arg Leu He
225 230 235 240
Gly Asp ASp Glu His Gly тгр Ser ASn Glu Gly val phe Asn phe Glu
245 250 255
Gly Gly cys Tyr Ala Lys Thr lie Arg Leu Asp Lys Glu Lys Glu ser
260 265 270
Gl n lie туг ASn Al a lie Lys phe Gly Thr val val Gl u ASn val val
275 280 285
Ala ASp Glu ASn Arg val pro ASp Tyr Asn Asp Gly Arg туг Thr Glu
290 295 300
Asn Thr Arg Ala Ala туг Pro lie ASH туг lie Asp Asn lie Glu Glu
305 310 315 320
Ser Gly val Gly Gly ASn pro Glu Thr lie lie Phe Leu Thr Ala ASp
- 101 031093
325 330 335
Ala Phe Gly val Met Pro Pro Ile Ser Arg Leu Ser Lys Glu Ala Ala
340 345 350
Met Tyr His Phe Met Ser Gly Tyr Thr Ser Lys Ile Ala Gly Thr Glu
355 360 365
Arg Gly Ile Ile Glu Pro Gln Al a Thr Phe Ser Ser Cys Phe Gly Glu
370 375 380
Pro Phe Met Leu Met Asn Pro Al a Val Tyr Ala Lys Leu Leu Gly Glu
385 390 395 400
Arg Ile Asp Lys туг ASn Thr Gln val Tyr Leu val Asn Thr Gly Trp
405 410 415
Leu Ser Gly Gly Tyr Gly Asn Gly Asp Arg Ile Lys Leu Ser Tyr Thr
420 425 430
Arg Thr Met Ile Arg Glu Ala Leu Lys Gly Lys Phe Lys ASp val ASp
435 440 445
Phe Val Glu His Pro Val Phe Lys Val Met Met Pro Thr Arg cys Pro
450 455 460
Gly val pro ASp Glu Ile Leu ASn Pro Arg Asn Thr Trp Gln ASp LyS
465 470 475 480
Glu Ala Tyr Asp Glu Thr Ala Arg Lys Leu Ala Met Lys Phe Ser Lys
485 490 495
Asn Phe Glu Lys Phe
500 <210> 70 <211> 843 <212> ДНК <213> Clostridium ragsdalei <400> 70 atgagagaag tagatgtatc cactataaca aaagctgtta gaaatctctg tatagatgcc60 aattattatc tttcggagga tgttaagaaa aagataaaag aatgtgaaga ggacgaaaaa120 tggcctactg caaaagacat tttaggtaaa atacttgaaa atatagatat atctaaaaat180 gaagatgtgc ctatgtgtca ggatacagga atggcttgtg tatttgtaac aattggccag240 gatgttcata tagtaggagg aagtttagaa gacgcaataa ataagggagt aagtcaggga300 tatgtagaag ggtatttaag aaagtctgta gtctctgatc ctataaatag agttaatact360 aaggataata ctcctgcagt aatatattat gaaatagttc caggagataa acttaacata420 aaagtggctc ctaaaggatt tggatcagaa aatatgagcc agataaaaat gcttaaacca480 gcagatggac ttaagggtgt taaagatttc gtaataaaag tagtaaagga cgcaggacca540 aatccatgtc ctcctatggt tgtaggagta ggtataggag gaacttttga caaggctgca600 aatcttgcaa agaaagctct tgtaagacca ttatctgaaa gaaataaaaa taagttttat660 tcagatttag aaaatgaact tttagacaaa ataaatttcc taggtatagg acctcaagga720 ctagggggaa agactacagc tcttgcagta aatatagaaa cttatcctac gcatatagca780 ggattacctg tagccgtaaa tataaattgc catgttacaa gacataagga aatagaattg840 taa 843 <210> 71 <211> 280 <212> ПРТ
- 102 031093 <213> Clostridium ragsdalei <400> 71
Met Arg Glu val Asp val Ser Thr
1 5
cys ile Asp Ala 20 Asn туг Tyr Leu
Lys Glu cys 35 Glu Glu ASp G1 U LyS 40
Gly Lys 50 lie Leu Glu ASn ile 55 ASp
Met 65 Cys Gln Asp Thr Gly 70 Met Ala
Asp Val His Ile Val 85 Gly Gly Ser
val Ser Gln Gly 100 Tyr val G1 u Gly
Asp Pro Ile 115 Asn Arg Val Asn Thr 120
Tyr Tyr 130 Glu ile val pro Gly 13 5 ASp
Lys 145 Gly Phe Gly ser Glu 150 А5П Met
Al a Asp Gly Leu Lys 165 Gly Val Lys
Asp Ala Gly Pro 180 Asn Pro Cys Pro
Gly Gly Thr 195 Phe Asp Lys Al a Ala 200
Arg Pro 210 Leu Ser G1 u Arg Asn 215 LyS
Asn 225 Glu Leu Leu Asp Lys 230 Ile Asn
Leu Gly Gly LyS Thr 245 Thr Ala Leu
Thr ΗΊΞ lie Ala 260 Gly Leu Pro val
Thr Arg His 275 Lys Glu lie G1 U Leu 280
<210> 72 <211> 574 <212> днк
Ile Thr 10 Lys Ala val Arg Asn 15 Leu
Ser 25 Glu ASp val Lys Lys 30 Lys ile
Trp pro Thr Ala Lys 45 ASp lie Leu
ile ser Lys АЗЛ 60 Glu ASp val Pro
Cys val Phe 75 val Thr lie Gly Gln 80
Leu Glu 90 Asp Al a Ile Asn Lys 95 Gly
Tyr 105 Leu Arg Lys Ser Val 110 val Ser
Lys Asp Asn Thr Pro 125 Ala Val Ile
Lys Leu Asn lie 140 Lys val Ala pro
ser Gln ile 155 LYS Met Leu Lys Pro 160
Asp Phe 170 Val lie Lys Val Val 175 Lys
Pro 185 Met val val Gly val 190 Gly lie
Asn Leu Ala Lys Lys 205 Ala Leu Val
Asn Lys Phe Tyr 220 Ser Asp Leu G1 u
Phe Leu Gly 235 Ile Gly Pro Gln Gly 240
Ala val 250 ASH lie Glu Thr туг 255 Pro
Ala 265 val ASn lie Asn cys 270 His val
<213> Clostridium ragsdalei <400> 72 atgtatatgg aaaaaaagat aactactccg agcaggggat agtgttttaa tatcagggac gagattggtc gagttattag atgaaggtaa ttaacggaag waaaaggtta aaactttaaa 60 aatatatact gctagagatg ctgctcataa 120 atctcttcct atagatgtaa aagatgcaat 180
- 103 031093 aatatattac aacaagtagt aatgatagga tgtttacttt agaagtagta tttacctgta agagtacttg gcaggaccaa tatagaatgg aaaggccttc gctgcaatag gcttatgaag attgtagtaa gactctgtgg gtcctgcaaa acccatttgc gttcaaaaga gcggggctgc atttggattc tagattcaga gccagtctaa accaggccat accaagactg agttatagaa agcacttgta tgaagctata gggcaataat gtaa 574 gtaataggtt cttgatatag tccatgaaga gcaaaatcca agaaaattag ttatatgaat cagctggacc ggttaaaagg aaaatggagc taaagaaagc aagtaaaaga caggacgaaa
240
300
360
420
480
540 <210> 73 <211> 190 <212> ПРТ <213> Clostridium ragsdalei <400> 73
Met туг Met Glu LyS Lys lie Thr Thr pro Leu Thr Glu Glu LyS val
1 5 10 15
Lys Thr Leu Lys Ala Gly Asp Ser Val Leu Ile Ser Gly Thr Ile Tyr
20 25 30
Thr Ala Arg ASp Ala Ala His LyS Arg Leu val G1 u Leu Leu ASp Glu
35 40 45
Gly Lys Ser Leu Pro Ile Asp Val Lys Asp Ala Ile Ile Tyr Tyr Ala
50 55 60
Gly pro Ser pro Ala LyS pro Gly His val lie Gly Ser Ala Gly pro
65 70 75 80
Thr Ser Ser Tyr Arg Met Asp Pro Phe Ala Pro Arg Leu Leu ASp Ile
85 90 95
Gly Leu Lys Gly мет lie Gly Lys Gly Leu Arg Ser Lys Glu val lie
100 105 110
Glu Ser Met Lys Lys Asn Gly Ala Val Tyr Phe Ala Ala Ile Gly Gly
115 120 125
Ala Ala Ala Leu val Ala Lys Ser lie Lys Lys Al a Glu val val Ala
130 135 140
Tyr Glu Asp Leu Asp Ser Glu Ala Ile Arg Lys Leu Glu Val Lys Asp
145 150 155 160
Leu pro val lie val val lie Asp Ser Glu Gly Asn ASn Leu Tyr Glu
165 170 175
Ser Gly Arg Lys Glu Tyr Leu Asp Ser Val Gly Gln Ser Lys
180 185 190
<210> 74 <211> 1797 <212> ДНК <213> Clostridium ragsdalei <400> 74 atgcaaatag ataagataat tgatactgac atattagttg ttggaggctc tggagcaggg 60 tcaatggcag ctgtaacagc tgctgaaaaa ggagcaaaag tactgcttgc attaaaagga 120 aagcttggga aaagtggtaa tgctattatg gcaggagcag gattttctat ggatggagaa 180 actgcatatt ataaatatgg actcaaggaa gcagatccta gaaatacgaa ggaaaaatta 240 tttgaacaaa ttgtaaagca gtctttttat ctaagtgatc aaaatatggt tgagcagttt 300
- 104 031093 gttaatgatt gtggtgaatg ctgctggaaa cttaaacagt ggattgaaaa agcaggacat360 aaggttgcat tctttggaga agaaggatat ataacatcag gtaaagctgt tgcagatgga420 tgccgatatg gagtttctga ggcaggcagc attgatgtta tacaagattt tatggttgca480 gatgttttga tggaagatgg aagagctgta ggtgcagttg gaatagatat atattcagga540 gagattattg aaattagatc aaagtcagtt attttagcta ctggcggata tcagccctat600 tcctttaaat gcactgtttc cgatatgact ggcgatggaa tggctatggc gtaccgtgca660 ggagtcaagc ttgcagatat ggaattttta ttatatatac cagcagttgc cctttcacca720 tcagtatata aaggttcaat ttatcctttc ttacattcca gtatgcttat gcccattgtt780 aaaaatggca aaggagaatc aattttagac aatatacctg aaactttact taaaatggcc840 aaggaaagtg aaatgggaaa gcttatattt acgtattatt atggagatca aattgcaaaa900 ggaaaagcaa ctccaaatgg aggagtatat tttgattatt ccaatgtacc ttttgatatt960 tatgaaaaag ccttaaaaaa atctgagcca ttaatgaaca tgtggtatag aaaaggattc1020 tatcaaggaa acaacttgga tacttttgtt gaaaatataa gaaagggcat tccatgggaa1080 gtaggtattg gctcagaata cagcatgggt ggcattgaag tagacgaaaa tatgtacact1140 ggagtaccag gactttatgc agctggtgag actacaagtg gtgtatttgg agctatgagg1200 gttgcagacg gacttattga aatgcttgta catggttata gagcagcatt gtccgcttgc1260 aaatatatac aaaatgtaaa tgagccaagt atgaaaaata ctaatattga tagtataatt1320 aaagatattt tttcacctct tgaaagaaaa gaagggataa gtcctataaa aatacacaga1380 aatatagaaa agacagctga tgctggattc aactttagaa gaaatgaaga gggacttaca1440 aaagctttag atgatatttt aaaaatacac aaatatgaca taagcgcaat gagtactaaa1500 agtaaaaata gagtttataa ctatgaatgg atagaatcag tacaggttcg aaatctttta1560 acttgcacag aagcaggtgt aagagctgcc cttatgagaa aagaaagtag gggtacacat1620 atacgtgatg attatgaatt tgtagataat gataactggc rtttaaggat tatgagttta1680 aaaagtgaag acggaactat gaaattatca accagaaagc ctaaagtaac aacaatggaa1740 ctcccaaatg gtaaaaataa gaatattcct gattatatgc tttcaatgtt aaagtaa 1797 <210> 75 <211> 598 <212> ПРТ <213> Clostridium ragsdalei <400> 75
мег Gin lie Asp Lys lie lie ASp Thr ASp lie Leu val val Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ala Gly Ser Met Ala Ala Val Thr Al a Al a Glu Lys Gly Ala
20 25 30
LyS val Leu Leu Ala Leu Lys Gly LyS Leu Gly Lys ser Gly ASn Ala
35 40 45
lie Met Ala Gly Ala Gly Phe ser Met Asp Gly G1 u Thr Ala Tyr туг
50 55 60
Lys Tyr Gly Leu Lys Glu Ala ASp Pro Arg ASH Thr Lys Glu Lys Leu
65 70 75 80
Phe Glu Gin lie val LyS Gin ser Phe туг Leu ser ASp Gin ASn Met
85 90 95
val Glu Gin phe val ASH ASp cys Gly Glu cys cys Trp Lys Leu Lys
100 105 110
105 031093
Gln тгр lie Glu Lys Ala Gly His Lys 120 val Ala Phe phe 12 5 Gly Glu Glu
115
Gly Tyr Ile Thr Ser Gly Lys Al a Val Ala Asp Gly Cys Arg Tyr Gly
130 135 140
val ser Glu Ala Gly ser lie ASp val lie Gln ASp Phe Met val Ala
145 150 155 160
Asp val Leu Met Glu ASp Gly Arg Ala val Gly Ala val Gly lie Asp
165 170 175
ile туг Ser Gly Glu lie ile Glu lie Arg Ser Lys Ser val lie Leu
180 185 190
Ala Thr Gly Gly Tyr Gln pro Tyr Ser Phe Lys cys Thr Val Ser Asp
195 200 205
Met Thr Gly ASp Gly Met Al a Met Ala Tyr Arg Al a Gly val Lys Leu
210 215 220
Ala Asp Met Glu phe Leu Leu туг ile pro Ala val Ala Leu ser Pro
225 230 235 240
Ser val туг Lys Gly Ser lie туг pro phe Leu Hi s Ser Ser Met Leu
245 250 255
Met Pro Ile Val Lys Asn Gly Lys Gly Glu Ser Ile Leu Asp Asn Ile
260 265 270
pro Glu Thr Leu Leu LyS Met Al a Lys Glu ser Glu Met Gly Lys Leu
275 280 285
ile phe Thr туг Tyr туг Gly Asp Gln lie Ala Lys Gly Lys Ala Thr
290 295 300
pro А5П Gly Gly val туг phe ASp туг Ser Asn val pro Phe ASp lie
305 310 315 320
Tyr Glu LYS Ala Leu LYS Lys Ser Glu Pro Leu Met Asn Met Trp Tyr
325 330 335
Arg Lys Gly Phe Tyr Gln Gly Asn Asn Leu Asp Thr Phe Val 350 Glu Asn
340 345
lie Arg LYS Gly lie pro тгр Glu val Gly lie Gly Ser Glu туг Ser
355 360 365
Met Gly Gly Ile Glu val Asp Glu Asn Met Tyr Thr Gly Val Pro Gly
370 375 380
Leu туг Ala Ala Gly Glu Thr Thr Ser Gly val Phe Gly Al a Met Arg
385 390 395 400
Val Ala Asp Gly Leu Ile Glu Met Leu Val His Gly Tyr Arg Al a Ala
405 410 415
Leu Ser Ala Cys LyS Tyr ile Gln Asn val ASn G1 u pro Ser Met Lys
420 425 430
Asn Thr Asn Ile Asp Ser Ile lie Lys Asp He Phe Ser Pro Leu Glu
435 440 445
Arg Lys Glu Gly ile Ser Pro lie Lys lie Hi s Arg ASn lie G1 u Lys
450 455 460
Thr Ala ASp Ala Gly Phe Asn Phe Arg Arg ASn Glu Glu Gly Leu Thr
- 106 031093
465 470 475 480
Lys Al a Leu Asp Asp lie Leu Lys lie His Lys Tyr Asp lie Ser Al a
485 490 495
Met Ser Thr LYS Ser LyS А5П Arg val Tyr ASn Tyr Glu тгр ile Glu
500 505 510
Ser Val Gln Val Arg Asn Leu Leu Thr cys Thr Glu Al a Gly Val Arg
515 520 525
Ala Ala Leu Met Arg Lys G1 u Ser Arg Gly Thr His ile Arg Asp Asp
530 535 540
Tyr Glu Phe Val Asp Asn Asp Asn Trp Leu Leu Arg Ile Met Ser Leu
545 550 555 560
Lys Ser G1 u Asp Gly Thr Met Lys Leu Ser Thr Arg Lys Pro Lys val
565 570 575
Thr Thr Met Glu Leu Pro Asn Gly Lys Asn Lys Asn Ile pro Asp туг
580 585 590
Met Leu Ser Met Leu Lys
595
912
ДНК
Clostridium ragsdalei <210> <211> <212> <213> <400>
atgagagagt gcagttactg ggtggatgtg aggcttatag agatcagatg ttagaaaata acttggcata attaaaatca gtaaagagta ggtgaattag ccagatttta attcctggat tttatgacta ttacccttcc gaagttatag catattctat ttgaaacaga ctgctgaaaa ctaatatggc atatatctgt caagattgat tgggagtaga ttgttaaacc tgacagaaag ttattaaaga aagtatatgc ttaagaagta taactggaga tggaaatggt gtcaacctaa aaaatcctgt aa 912 tgttgttgtt tggtgcaaaa aatgggccct agatagagca aagaagatat attcgcatta taaaactgga agcagaagaa tcaaggagag tggagcagtt tgttggactt tggaatccag attctttgct ccttttagtt atttaccgca gttggaggag gtaatggtgc ctaggtgttg tttaataagt ttagagcagt ccttcaaaat aaaccaggac ttaggcgtta ataattggcg atcatcggta gaatggggaa atggcttggg cctaacactg aacctggatg aatgctattg gagcatcagg ttgaaaaagc aaacaagaat tcatggaata cagcaggaac attttccagc tccgtgcagc aaatattatt gcttgctgca taatactaca taacagctag caggcggatt aagatttgtt atgctggcgc gtggatatgc gtgaaagatt aaaaacaaaa gcaaagagaa ttctcactgg tattgaatgg ttcagaagca tgctactatg agaaacacct cgataaagat tggtgataat ctcatataga ttcaaaagat tcctatagag tataaatgaa aagaaagttg
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900 <210> 77 <211> 303 <212> ПРТ <213> Clostridium ragsdalei <400> 77
Met Arg Glu Phe Glu Thr Asp Val Val Val Val Gly Gly Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Leu Al a Ala Ala val Thr Ala Ala Glu Asn Gly Ala Lys val Met
- 107 031093
val Leu Glu Lys Ala Asn Thr Thr
35 40
Gly Pro Leu Gly Val Glu Thr Arg
50 55
lie Ser val ASp Arg Ala Phe Asn
65 70
Arg Ser ASp Ala Arg Leu lie Arg
85
Thr Ile Glu Trp Leu Glu Asn Met
100
Lys туг phe pro Ala Ser Glu Ala
115 120
Thr Gly Lys Pro Gly Leu Arg Ala
130 135
Thr Glu Arg Al a Glu Glu Leu Gly
145 150
Val Lys Ser Ile lie Lys Asp Gln
165
Ser ASp LyS ASp Gly Glu Leu Glu
180
Gly Thr Gly Gly Phe Gly Asp Asn
195 200
Gly Leu Glu Trp Gly Lys ASp Leu
210 215
Thr Gly Asp Gly Ile Gln Met Ala
225 230
Phe Met Thr Met Glu Met val Phe
245
Ala Pro Ile Glu Leu Pro Phe Arg
260
ASp Gly Glu Arg Phe lie Asn Glu
275 280
Thr Ala Asn Ala Ile Glu LYS Gln
25 30
Gly Gly Cys Ala Asn Met Ala Met
45
Met Gln Arg Glu Arg Leu ile Asp
60
Lys Phe Met Glu Tyr Ser His Trp
75 80
Arg Tyr Leu G1 u Gln Ser Ala Gly
90 95
Gly Val Glu Phe Ala Leu Pro Ser
105 110
Thr Trp His lie val Lys pro Lys
125
Ala Ala Thr Met Ile Lys He Met
140
val Lys lie Leu Leu Glu Thr pro
155 160
Gly Glu lie Ile Gly Val Thr Ala
170 175
val туг Ala Gly Ala val ile lie
185 190
Pro Asp Phe Ile Lys LYS Tyr Val
205
Phe Ser Tyr Arg lie pro Gly Leu
220
Trp Asp Ala Gly Ala Ser Lys Asp
235 240
Phe Ala Pro Asn Thr Gly Gly Tyr
250 255
Gln Pro Asn Leu Leu val Asn Leu
265 270
Glu val ile G1 u Asn pro val Phe
285
Lys Arg Lys Leu His ile Leu
300
290 295 <210> 78 <211> 962 <212> ДНК <213> Clostridium ljungdahlii <400> 78 tttcttcaca ggaaaatata cttcagtaac gtcagttaca tatacttcat atggtgggtt ttccctcaac ttagcatata cagatgttaa cgcacaaagg actccaggca agtatcttgt aagatcttta ggaatggtga cttggtgggg 60 tgtaagttta tatccttcat tttctaccca 120 ttctgaatat gagcccctta aaacagactt 180 tccctttaca atctccttta tcggaatggc 240
- 108 031093 aagttctgta tcattgccag aaggattgta ttcagcgctg tgataaatag accaagaaag tcaattacaa aaatatatat aaagaaagca aagctacata tttaaggtaa aactaaaaat attataaaaa tgaaattatt ttttctcata cataatacga ggaggattta taatgaaaaa agtaatagga attataagta tgtactcgta gcacttcaat cctgtgctgc aggagtagga aatgcattaa agaagctagt ggatctgctg gattattttt atctgtatgt atgcttattg agcaataata tcaaaatata gtaaaggtat gactataaca gctatagtat agcttttgtt gtagggattg ctaatgttgg gcatttttca gatttgcaaa cattaacttg atatttgctg gactattgat atttcatttg cttaaaaata taatagcagt gggaaaaagt agaatcatat attgtaatta tttttaatta attgaaattg tcactgaaac acctctaaat gttttaaata catatgttta cagattctaa tagtagaaag tagaaatttg ctatgttata atgacataga at 962 ttattggctt 300 tattaaagca 360 gctaaagtta 420 ttgtactatt 480 gtaataacaa 540 ctggaataat 600 tttatttgtt 660 tttggtcaat 720 agcaattata 780 tgttggcaaa 840 attattgtga 900 ggtgaatgta 960 <210> 79 <211> 977 <212> ДНК <213> Clostridium ljungdahlii <400> 79 actagacagt gctaataaca atgtctagtg ctttttatct tgctcaattt ttcatttaag taagtccacc tgtccatctt ttcgtctagc tctttttcca ttcggataag agatcttcaa gaagtgcata atcagatgaa gcagcttcca cttttcagat atagattttt ctagatgttc aattacctca tctattttgt ttgttctgca taggtaaatt ttagaggctt ttctttttgc aacttatagt tgtatttttc ttagagctta ttttttcctc tgatattttt gcagttttgt atagtttcct gtatattgag tgattttacc gtttccttca aaagaaaata tgttttgtca aggaagtacc tgtcatgaga tacagctata acagctcctt aatataatct tctaggattg taagtgtttc tatatccaga tcatttgttg caaaagtaca ttagggtaat tcatcaatat ttttagaaga tataatcttc tcctgaaagt tttccaaggg gagtccattg aactgaaggt tcaaataaaa tacagcagaa gcacttattt tttcacccga tgaagttgac gcatattctg tatgtattca attacccttt cgttcatatc catatcagaa attccctgag tatctttact gtttcaccta tatctatagt gccgctgtcc ggcagaattt aatattcata agagtggatt taccacttcc attaggtcca ataataccta atttagtatg ttataagtga aatttttaat taatgtcttt tcaccaaaac gttatccagg tttatga 977 <210>
<211>
<212>
<213>
<400>
tttcttcaca tttcattgag 60 gtgaattctt 120 tttctatttt 180 caaactccat 240 tgtttttagc 300 gaaaatagga 360 ttttatcaac 420 caaaatcgtt 480 gttcgtccag 540 ttcgttctcc 600 aattttcaag 660 atgtcccacg 720 aatagtatcc 780 tttgaactaa 840 ttctgtcatt 900 ttttgcttat 960
962
ДНК
Clostridium ragsdalei gtcagttaca ttccctcaac cgcacaaagg aagttctgta accaagaaag ggaaaatata tatacttcat ttagcatata actccaggca tcattgccag tcaattacaa cttcagtaac atggtgggtt cagatgttaa agtatcttgt aaggattgta aaatatatat aagatcttta tgtaagttta ttctgaatat tccctttaca ttcagcgctg aaagaaagca ggaatggtga tatccttcat gagcccctta atctccttta tgataaatag aagctacata cttggtgggg tttctaccca aaacagactt tcggaatggc ttattggctt tattaaagca
120
180
240
300
360
- 109 031093
tttaaggtaa aactaaaaat attataaaaa tgaaattatt ttttctcata gctaaagtta 420
cataatacga ggaggattta taatgaaaaa agtaatagga attataagta ttgtactatt 480
tgtactcgta gcacttcaat cctgtgctgc aggagtagga aatgcattaa gtaataacaa 540
agaagctagt ggatctgctg gattattttt atctgtatgt atgcttattg ctggaataat 600
agcaataata tcaaaatata gtaaaggtat gactataaca gctatagtat tttatttgtt 660
agcttttgtt gtagggattg ctaatgttgg gcatttttca gatttgcaaa tttggtcaat 720
cattaacttg atatttgctg gactattgat atttcatttg cttaaaaata agcaattata 780
taatagcagt gggaaaaagt agaatcatat attgtaatta tttttaatta tgttggcaaa 840
attgaaattg tcactgaaac acctctaaat gttttaaata catatgttta attattgtga 900
cagattctaa tagtagaaag tagaaatttg ctatgttata atgacataga ggtgaatgta 960
at 962 <210> 81 <211> 975 <212> ДНК <213> Clostridium ragsdalei
<400> 81
ctagacagtg ttaataacaa tgtctagtgt ttttctcttg ttcaattttt tcattgagtt 60
catttaggta agtccacctg tccatctttt cttctaattc tttttccagt gaattctttt 120
cagataagag atcttcaaga agtgcataat cagatgaagc agcttccatt tctattttct 180
tttcagatat agatttttct agattttcaa ttacctcatc tattttgtca aactccattt 240
gttctgcata ggtaaatttt aaaggctttt ctttttgcaa cctataattg tttttagctg 300
tattgttctt agtggttatt ttttcttgtg gtatttttgc agtttcgtga aaatgggagt 360
agtttcctgt atattgagcg attttaccat ttccttcaaa agaaaatatt ttatcaactg 420
ttttgtcaag gaagtatctg tcatgggata cagctataac agttccttca aaatcattaa 480
tataatcctc taggattgta agtgtttcta tatccagatc atttgttggt tcgtccagta 540
aaagtacatt aggataattc atcagtattt ttagaaggta taatcttctt cgttcccctc 600
ctgaaagttt cagcagaagc tgtattcaat tttttactgt tattcataag ttagtacgtt tatccaggtt <210> <211> <212> <213> <400>
aaaaaagctt aagtagttta cgaaagctga ggtacgactg agtttctaat aaggtaagtt <210> 83 tccaagggga acttattttt taccctttcg ttcacctata agtggattta ataagtgaaa tatga 975 gtccattgaa tcacccgatg ttcatatcca tctatagtac ccacttccat tttttaatta ctgaaggttc aagttgaggc tatcagaaat cgctgtccgg taggtccaat atgttttttc aaatagaaaa atattctgat tccctgagaa cagaattttt aatacctatt ttttcaagta gtcccacgta tagtatccta tgagttaaaa ctatcattat accaaaactt ttgcttatgt
660
720
780
840
900
960
353
ДНК
Clostridium autoethanogenum ataattatcc aggtactact tacgggaaca agtcgcaatg ttcgatttta aggctgatcg ttagttaacg ctgtaagata gagcacggtt ttaatcagat actcgataga acttatctgt atcaggtgcg acacagaaaa ggaaagcgat ataaggtata ggaaagtgtc tatcaccaca cccagatagg cagccaacct gagttaccta agttgtgttt tgaaacctct tttgtacaat gtgttaagtc aaccgaaaag aagacaatcg actgaacgca agtacaaaga ctg 353
120
180
240
300 <211> 353
- 110 031093 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 83 aaaaaagctt aagtagttta cgaaagctga ggtacgactg agtttctaat aaggtaagtt <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
ctgcacctaa aaccaaagca gtatt 25 <210> <211>
ataattatcc aggtactact tacgggaaca agtcgcaatg ttcgattagt aggctcaacg ttagcactcg ctgtaagata gagcacggtt ttaatcagat gctcgataga acttatctgt ttgaggtgcg acacagaaaa ggaaagcgat ataaggtata ggaaagtgtc tatcaccaca cccagatagg cagccaacct gagttaccta agttgtgttt tgaaacctct tttgtacaat gtgttaagtc aaccgaaaag aagacaatcg actgaacgca agtacaaaga ctg 353
120
180
240
300
ДНК
Искусственная последовательность
Синтетический праймер <212> днк <213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 85 atcctttaag caagagtact gcacc 25 <210> 86 <211> 520 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 86 ccggatwgka ysctrwgmgw gmarrcytwa saymtksgmk gcttggatcc cgggawtmgk rgrwggkwsy ckgtksktgs scctcccgaa agggaratta mtacsgcata ataatcagtt aaggagtaat ccsctttgag atggacccgc ggcgcattag ctaccaaggc gacratgcgt agcckacctg agagggtgat gacggtccmg actyctacgg gaggcakcag kggggaatwt gatgcarcaa csccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatt acgataatga cggtwcckwa ggaggaagcc mcsgstaact atacgtyggt ggmgagygtt gtyyggaatm wckwgkykta <210> 87 <211> 639 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 87 gggrraystr amyscwgycr wrmmymmssm tmssskkmrw gttgtcgacr aattcgamwr awccrggatc aaactctgtt ycsssrcsag mtccygggra ttcwcatgga ctagttggta cggccmcmtt tgcacaatgg gtaaagctwt acgtgyywgc 520 gkagccgtaa gagggggatw gactgattta gggtaacggc ggaactgaga gcgaaagcct gtctttgggg mkcckcggta
120
180
240
300
360
420
480 ckragmcrgr gtcgamsaat wtcaarctct kcsgrkwaac
120
- 111 031093
swaktyacmr cymcrttkts attcrmkatt actagcaact ccaacttcwt gtaggcgagt 180
ttcagcctgc aatccgaact gggggcagtt tttgaggttt gctccacctt gcggtcttgc 240
ttctctctgt actgcccatt gtarcacgtg kgttgccctg racataaggg gcatgatgat 300
ttwacstcwt ccccaccttc ytccgcgtta accmcggcag tcttgctara rtgctcaact 360
aaatgttakc aactaacamc aggggttgck ctckttgcag gacttaacct aacwtctcac 420
gacacgagct gacracaacc atgcaccacc tgtatycctg ccccgaaggg yttctcttat 480
ctctaarata ttmagggtat gtcmwgtcca ggwawggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa 540
accacatgct ccgctgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttt aatmttgcga 600
tcgtacttcc caggcggagt acttattgtg tttactgcg 639
<210> 88
<211> 1028
<212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 88
ccgatwgwaa ysctsgmrgc asrsytwasa ymtksarkyc sysrcaaggk agccgtaagc 60
ttggatcccg ggaaccgsrg aaggkasccs krgsktgsmt mccgggraga gggggatagc 120
cwcccsaaag ggagawtmmy rssrcataat awtcagtttt cacwtggaga ctgwtttaaa 180
ggaktaatcc gctttgagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtagg gtaacggcct 240
accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacattgg aactgagaga 300
cggyccarac tcctacggga ggcakcagtg gggaatattg cacaatgggc gaaagcctga 360
tgcagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggtt ttcggattgt aaagctctgt ctttggggac 420
gataatgacg gtacccaagg aggaagccac ggstaactac gkgccascag ccgcggtaat 480
acgtaggtgg cgagcgttgt ccggaattac tggkcgtaaa gagtgcgtag gcggatattt 540
aagtgasatg tgaaataccc gggcttaacy cgggcactgc wtttyaaact ggatatctar 600
agtgcgggag aggakaatgg aattcctwkt gtagcggrtg aaatgcgtak agattaggaa 660
gaacaccagt ggcgaargcg attctctgga ccrtaactga crctgaggya cgaaagcrtg 720
ggtagcaakm aggattagat accctggkta gwccacrccg taaacratga ktactakktg 780
twggaggtwt caccccttyt ktgccrsmkt aaacacaata aktactccsc cckggraagt 840
ackatygcaa gawttaaaac tcaaaggrwt tgaygggggs cccgcycaag yagcggaagc 900
atgtggkttw wttycaakca mtsckaykaa ccttwcctkg rayttkrwmt wmccmgcaww 960
cytwataawt aaagaakccc ttysgkgymr gggwawmmgg gkkggtgyat gkktkgtygt 1020
ywatmycg 1028
<210> 89
<211> 716
<212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 89
gggtaygtsa ayswgyyatr mrysyskmtm rwskkmrwck ragmcrgrat caarctctgt 60
tgtckacraa ttcggmkrak ccrggatcaa actctgttgk cgacsaattc sgrkgaaccy 120
rkwymcmrck mcrttstsat ycrckaytac tagcaactcc aacttcatgt aggcgagttt 180
cagcctgcaa tccgaactgg gggcagtttt tgaggtttgc tccmccttgc ggtcttgctt 240
ctctctgtac tgcccattgt ascacgtgtg ttgccctgga cataaggggc atgatgattt 300
gacgtcatcc ccaccttcct ccgcgttaac cgcggcagtc ttgctagagt gctcaactaa 360
atgttagcaa ctaacaacag gggttgcgct cgttgcagga cttaacctaa catctcacga 420
cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tatccctgyc ccraagggyt tctcttatct 480
ctaagatawt cagggtatkt yaagtccagg waaggttctt cscrttgytt csaattaaac 540
- 112 031093 cacatgctcc gctgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagttttaa tcttgcgatc 600 gtacttccya ggcggagtac twattgtgtt tactgyggca sasaarrggt cgatacctcc 660 tacacctagt actcatcgtt tackgmgtgy actaccaggr watstaatwc tgtttg 716 <210> 90 <211> 556 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 90 ccggatwkaw awsctmsmgg cwrrcytwas aymtksgmky csyrrcaagg kagccgtaag60 cttggatccc gggawscgkr gswggkagcc skwksktgsm tccysggrrg agggggrwws120 ccwcccgrrr gggagaytmm yrssgsataa taatcakttt tcwcatggar actgatttaa180 aggagtaatc csctttgaga tggacccscg gcgcattakc tagkkggtag ggtaacggyc240 taccaaggcg acrktgcgta gccgacctga ragggtgatc ggscacattg kaactgagag300 amggtccara ctcytacggg aygyagcart ggggaatatt gmacaatggg cgaaagccmg360 atgcagcaac gccscgtgag tgaagaaggt tttcggattg twaarytctg tctttgggga420 mgataatgac kgtacccaag gasyaagccw cggstaacta cgtgccagya kyckcggtaa480 tamktaggtg gcgagcgttg tccggaatta cygggmgtaa agartgcgta rgcggatatt540 tarkgakatg tgaaat 556 <210> 91 <211> 478 <212> днк <213> Clostridium autoethanogenum <400> 91 gggwayytsa mkcwgycrwr maykyrgwta rcskkmrwck ragmcrgrat caarctctgt 60 tgtckacraa ttcgakwrar ccrggatcaa actctgttgt csacmaattc sgmkraawcm 120 rgwyymmact myrttstsaw ycamtwytac tagcaactcc aacttcwtgt akgcgagttt 180 cagcctgcaa tccraactgg gggcagtttt tgaggtttgc tccmccttgc ggtcttgctt 240 ctcyctgtac tgcccattgt agcmcgtgtg ttgcwctggw mataaggggc atgatgattt 300 gacgtcatcc ccaccttcct ccgcgtkaac cgcggsagtc ttgcyagagw gytcaaytaa 360 atgttrscra cwaacaacag gggttgcgct cgttgcagga cmtaamctaa yatctcayga 420 camgagctga cgamaayyat gcaccaccty tatccctgwc yckaagggct tctyttat 478 <210> 92 <211> 561 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 92 ccgawwrgka aygstmwsmr wgcwrrsktw asaymsksam kycskrrcaa ggkagccgta60 agcttggatc ccgggawycg krgraggkas ycskkksktr sawmyykggr ararggggat120 wsccwcccgr awggmarawt amtascrcat aataatcagt tttcmcatgg agactgattt180 awaggagtaa tccgctttga gatggacccg cggcgcwtta gcwagttggt agggtaacgg240 cctaccaagg cgacgatgcg takccsacct gasagggtga tcggccacat tggaactgar300 agacggtcca ractcctacg ggaggyakca gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc360 tgatgcakca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcsgat tgyaaagctc tgtctttggg420 gacgataatg acggwaccca aggaggaarc cacggctrac tacgtgccws csgycgyggt480
- 113 031093 aatacrtagg tggkkagcgt tgtccggaat tyctyggckt yttaagtgas atstgaaama c 561 <210> <211> <212> <213> <400>
362
ДНК
Clostridium autoethanogenum aatgagtgcg wargcggatm
540
agggwaaysk maakgawgat matrmatgas katarcskka awckragmcr ggatcaarct 60
ctgttgtcga craattcgmk wrakccagga tcaaactctg ttgtcgacma attcsgmwra 120
accwaktcmm crckmcrttc tgatyrkmkw ctactagcaa ctccaacttc atgtaggcga 180
gtttcakcct gsaatccgaa ytgggggyag tttttgaggt tyyctccayc ttgcggtctt 240
gcttctytct gtactgccca ttgtakcacg tgtgttgccc tggacataag gggcatgatg 300
atttgacgtc atccccawct tyctccgmgt waaccgcggc agtyttycta rartgctyaa 360
yt 362
<210> 94
<211> 1160
<212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 94
agtggcactg gaaaagaact cttagctcaa tctattcaca attatagtga aagatgtgaa 60
ggcccttttg tagctataaa ttgtagttct atacctagag aacttgtaga aagtgagctt 120
tttggttatg aaaaaggagc ttttacggga gctttaaagc aaggaaagcc tggaaagttt 180
gaattagcag atggaggaac tatttttttg gatgaagtag gagagcttcc tcttgatata 240
cagtcaaagc ttttaagggt tcttgataat aataaaatta caagagttgg aggaacttat 300
gaaaaacagc taaatgtaag gataatagga gctacaaaca gggtgctcaa ggatgaaatt 360
aaaaagaaaa atttcagaag tgacctttat tatagattga gtgtgatgaa tataaaaact 420
gtcccactta gggaaagaaa agaagatata gagcttttaa ttaaatattt tatggaagaa 480
ttgaattcta aaagtttgtg taagaagaaa gtagtggaaa aagcatacat agaaaagatt 540
aaagcttatg attggcctgg aaatgttaga gaacttagaa atgtaataga gagggattac 600
tatttaagtg aggataagat ggcccctttg gattatttag aaaaagaagt ttatgaaaaa 660
aatgtctcct ctgatccagt aaatattagt gtgcttccaa tggatgtttt agaaaaagaa 720
aacattgaaa atgcacttaa aaagtgtaag ggaaatatat taaaagctgc aaaatcttta 780
aatatcagta gatctaccat gtatagaaaa atgaaaaagt atggaataaa aagtgtgtca 840
aaatgaccag aaaagagtaa gattctcaaa ataggacact aagtatgtgt cataatggca 900
catagtgatt ttaaatgtct ttttaacagg tttcttgttt ttggtatggc ttttgcttat 960
aaaatatagt gaatatatta acaggtatat gtaaatttta atattgccat actattataa 1020
aaaaggagag ataattatga aagctgtatt gtggtatgat aaaaaagatg taagagtaga 1080
ggaaattgag gaacctaagg taaaagaaaa tgctgtaaaa attaaagtga aatggtgtgg 1140
tatatgtggt tctgacttgc 1160
<210> 95 <211> 834 <212> днк <213> Clostridium autoethanogenum <400> 95 tattgaggag gccaaaaatg agctttaaga aaaatgtata cgatacaatg agggaactaa 60 tatctgtgcc aagcatatct ggtacaaaag aagagtgtgc ggcagcagaa aaaatatatg 120
- 114 031093 aaaaaatttt ggaaatacct tattttaagg acaatcctga aaatctagga atagagcaaa180 ttgaagatga tcctttagga agaagctttg tatgggcagt agtaaatgga aatgaaaatt240 caccaaattc gtttatactt tcaggtcatt tggatgtagt tggagtagaa gaatttggac300 atttaaaatc tatggctttt gatgtagatg aatgtactaa aagaatctca gaattgaatt360 tagatgaaga tgctatggag gattttaaat caggagattg gatatttgga aggggaactg420 cagacatgaa gtttggagtg gccctcaata tggaactttt aagagaattc agtaaagaga480 gaaactttaa gggaaactta ttacttttag tagttcctgg tgaagagagt aattccgaag540 gaatgattgc tgcagctcca tttcttctta aattaaagga agagaggaag tacaattact600 gtggtatgat aatatcagag ccaagtatac ctgaaagagg agaaaaagaa ggcaagagat660 tatatatagg tagtgtaggt aaaattatgc ctttattttt ttgtgtggga aaagaaactc720 atgtagggga atctttaaga ggattgaatc caaatttgct agtttcagag ataaacaaat780 taatggaatg taatccagat ctctcagata gcgtttatga tactgtgact ccac 834 <210> 96 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> Синтетический праймер <400> 96 attcatcctg caggagtggc actggaaaag aactcttag 39 <210> 97 <211> 37 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> Синтетический праймер <400> 97 gactgcggcc gcgcaagtca gaaccacata taccaca 37 <210> 98 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> Синтетический праймер <400> 98 atatgctagc tattgaggag gccaaaaatg agctt 35 <210> 99 <211> 37 <212> днк <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 99 gactggcgcg ccgtggagtc acagtatcat aaacgct 37 <210> 100 <211> 25
- 115 031093 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 100 aatggcaggg cagataattg taatg 25 <210> 101 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 101 aaggcattct gagccagttc tttta 25 <210> 102 <211> 1062 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 102
acagttaaaa agcatatcta acagtccttc cactgtacta attcaaggcg aaagcggtac 60
aggtaaagaa cttattgcgc agtccatcca caatgacagc agcagaaaaa ataacagctt 120
tatagcaata aattgcggtg ccatacccaa aaatttaata gaaagtgaat tattcggata 180
tgaagatgga tcattcacag gtgcaaaaca tggagggcgt gcaggaaaat ttgaacttgc 240
aaatggtggt actttatttt tagatgaaat tggggaaatg cctttagata tgcaagtaaa 300
tcttttaaga gttctccaag aaaactgtat tacaagaata ggcgggaaca gatgtgtaaa 360
aatagatata agaatcattg cagctactaa taaaaatttg agggaagaaa tacataaagg 420
aacttttcgc gaagatttat actatagact aaatgtaata cctatatatg taccaccact 480
gcgggaaaga gatatggata ttaaaatact gataaactat tttttaaaga taaaagcttt 540
taaacttaaa aaacctattc caatagtaag acctgatata tatcaaaagc tcttaaatta 600
taattggccc ggaaatgtaa gagaattgga aaattgtatt gaaaatatcg taaatatgaa 660
tggaaataca tctttcaact tcgaaaatag tatttcagta aatacgcaaa ctagtccttg 720
tactacaaaa tttaaatatg atatgtattc attaaaagag ttggaaaaag aagcaataac 780
aaattgtatg agtaattgca atggtaacat tgcaaaagct tctaaaattc tgggaataaa 840
tagaagtact ttgtatacaa aaataaaaaa atatcaaatt aatttttctt aaagtgtatg 900
taaacacaac tttgttgtaa aaagcaacat tattttctta aaaaatgttg ctttttacag 960
catttttcaa ttatatatat taaccttata aagtcctacc cccctaaatt caaccttttc 1020
atgataaaaa acatactggc acaacatttg cttatatatt ta 1062
<210> 103
<211> 823
<212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 103
cgtattttta attgcgaact taagatttaa ttaatatcta ctatgagtaa gtcaacatat 60
atacctaaat tatgataaaa ttatatatta taatttcaaa ataaacataa ctataataat 120
acactaagat aaagctattt atctgatggc tacctactgt aacactccct cttctatcaa 180
agtgagagat aacagtagct acgcccctag ataattcatc taaacttagt gggagaaaca 240
- 116 031093 aaactctaaa ctaagtaaga catagtgaaa ataccaaaac aacgatatta tcaggtttct aaagatattg caaagtgcag tcaggcaaag cataacgaac <210> <211> <212> <213> <22O> <223>
gagaaagcga ttcattgata tagtcagtag ctaaacgaac taaaaatagc cattatatct taatggagca gtacaaatgc aacattttat ttcactttaa taaaaaggaa gtctcttaat acttagtcgc aaaaccattt cacagacaaa ggcaaaggct agcaggaact aaatactttt aaggaaatat aatcggatgt atcaaagatt ggtaatctaa agatgcatta aaagaattgg atggaaatac aatggaattg ggaatagcag gctatttttg cagatttata ctaactttaa tgagatatct taatgtttaa aataccatat acaacttaat tttatgattt tattaactat aaggtattga aaaatttgtc cctgctctgc ctg 823 gcttctccca accatttact agaaaaaggt aaaagaaaac tttaagtgga cataggtgac tctgagtgaa agttcaactt atctgtcata
300
360
420
480
540
600
660
720
780
104
ДНК
Искусственная последовательность
Синтетический праймер
104 <400>
attcatcctg caggacagtt aaaaagcata tctaacagt 39 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
gactgcggcc gctaaatata taagcaaatg ttgtgcc 37 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
atatgctagc gtatttttaa ttgcgaactt aaga 34 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
gactggcgcg ccagttaaag ttagacatcc gattat 36 <210>
<211>
<212>
<213>
105
ДНК искусственная последовательность
Синтетический праймер
105
106
ДНК искусственная последовательность
Синтетический праймер
106
107
ДНК искусственная последовательность
Синтетический праймер
107
108
ДНК искусственная последовательность
- 117 031093 <220>
<223> Синтетический праймер <400> 108 ttggaatttt agctgtagat aacaa 25 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
taagtgattt tcaatggact ttact 25 <210>
<211>
<212>
<213>
109
ДНК
Искусственная последовательность
Синтетический праймер 109
110
344
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
<400>
Кассета, направляющая интрон
110 aagcttataa agtttaaggt agctgatacg cgactgagtc tctaatttcg taagttagca <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
tgattttagg ccatgaagct gtagg 25 <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>
catgatttgt tcaactatat cacc 24 <210> <211> <212> <213> <400>
111 ttatccttag actactctgt ggaacagagc gcaatgttaa attatatctc agattgactt atatcaatct aagataacac acggttggaa tcagatataa gatagaggaa atctgttatc tgtgcgccca agaaaacagc agcgatgagt ggtataagtt agtgtctgaa accacatttg
ДНК искусственная последовательность
Синтетический праймер
111
112
ДНК искусственная последовательность
Синтетический праймер
112 gatagggtgt caacctaacc tacctaaaga gtgtttactg acctctagta taca 344 taagtcaagt gaaaagcgaa caatcgggta aacgcaagtt caaagaaagg
120
180
240
300
113 1005
ДНК
Clostridium autoethanogenum ИЗ
- 118 031093
catatgcact tttaggtaaa taagcatgct tccctgcttc cacagataaa tctggagata 60
atccaagcat aaccaagtct ttttttggac tttgtgaatt tttcaaaata ccgtaaaaaa 120
ctgaattaaa ttttgtatct acaccacaag agctatcaat tttacaatat actcctttta 180
cataaaaaat taacgttaga gtagtaataa caagaaatat attagtttta ttaaaaattt 240
gttttctatc aattttcact atccttagca taataagaac tacaagtggc aattcaacaa 300
aacattgggc tttagctcca agaaacaaaa tggacgagat aaatataaat aaaaattttt 360
tataagacct atcttctcta tgttttaaaa agtaaataat acttgaaata aacaaaagaa 420
aacctacaat catcattggt tctccataaa ggctgttaaa ccatacaata tagtttccat 480
ctactaatat tattatagat aatatactaa aaaaaactgc tgcagctata tttttaaaat 540
gaatacagct aaagcatata tataatcctg tcatatacaa aattaagtaa ataaaagcta 600
aaattctagt gtcaaaataa ttataaccaa ttaccttaca taataatttt ccaaatgtaa 660
taggataaat catgcttgta gttggaataa ttcctaaaag ccttgaaaaa ctggttggaa 720
gcattttata ttcagttaca acatacttaa accagtgagc tgaatctttc cctttggcat 780
ctgttaaacc agtagctttc attactcttt caaaatctcc ttgatctgct atacctggca 840
taggaggata aaaaagtata aataaagctg ctatgaaagc tcctaggata ctaataattg 900
gtatatatct acataaactt gaattttccc taagagacca cctattttct ttcatatttt 960
agtaataact ctcccctttc ctgggactta tccaaaaata taaca 1005
<210> 114 <211> 959 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum
<400> 114
attacaagtg agcatactta tgtttcatat ttttctaaat ataaccttga taccaatgta 60
atctttatta gaaaatacgg cactggagag ccaagtgata caatggtaga agcaatttgt 120
aaggatataa aagatattac ttataaaaga gtaattgcta ttggcggcgg aagtgtcctt 180
gacgtttcaa aattgtttgc attaaagaaa gtctcgccag tacttgattt atttgatcac 240
aaattagaat ttgtaaaaga taaggaattg atcctaattc caacaacttg cggaacaggc 300
agtgaagtaa ctaatatttc tattcttgaa ttgaagtcaa gacatacaaa attaggtctt 360
gctatagatg aactatatgc agattttgct gttatgattc cagaacttct agagaattta 420
ccctttaaat tttttgcaac tagttccatt gatgccttga ttcattccat tgaatccagt 480
gtttcaccaa aagctacaag ctatacagaa atgttttcct ataaagcaat ggaaatgatc 540
ttaaaaggat atcaggagat ttcaaaaaat ggcccagacg ccaggttttc cttgttagat 600
aaatttttac ttgcaagcaa ttatgctgga attgcatttg gcaatgcagg gtgtggtgca 660
gtacatgcta tgagttatcc tttaggtgct aattaccatg ttcctcatgg agaagcaaat 720
tatcaaatgt tcattggagt atttaaaacc tattatcgtt taaaaccaca aggtaaaatt 780
acaaaactaa ataaattctt agcatccatt ttaaactgca aagaaaatga agtttacatt 840
aaaatagaag agttattaaa tgtattgatt cctaaaaaac aattacgtga gtatggggta 900
aaagaaaaag aattaaagga atttacacaa agtgttatga ctaaacaagg tcgtttaat 959
<210> 115 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 115 attcatcctg caggcatatg cacttttagg taaataagc 39
- 119 031093 <210> 116 <211> 37 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический пептид <400> 116 gactgcggcc gctgttatat ttttggataa gtcccag 37 <210> 117 <211> 35 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> синтетический праймер <400> 117 atatgctagc attacaagtg agcatactta tgttt 35 <210> 118 <211> 37 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> Синтетический праймер <400> 118 gactggcgcg ccattaaacg accttgttta gtcataa 37 <210> 119 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 119 agaattttgc aagttttata ttgct 25 <210> 120 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 120 aagtcaagct ctaactttga aatat 25 <210> 121 <211> 1041 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 121 tacatacaca cactaaattt ttcgataaaa taaatttaaa aacaaataaa cttaaaatag 60
- 120 031093
agtataaaaa aaacagacat acaccccaat ggggcgaagg tctgtcgctg taccacccaa 120
attattactc gtatatataa cggctgtgcc ggcataactt actttatata aagttcagtc 180
tgcaacttag gagtgatttt caacaactgt agcttatggg ttcccaccaa atccccattc 240
tctgaaagca tatttttgtt tactcttctc cgtcatcgtt tttttatttg cactaactat 300
actataaaaa aatatgtatg tcaacaattt ttttgaaata tataattaac tctataaaga 360
aatcctaaat aaaaaatcaa ggtacaattc aaatattttt acaatcttca gctcggttaa 420
atattttgat aagcctaagc aataaattct aaaaagctaa aagtttaaat tgagtatttg 480
cttttataaa attatgaaaa atatttttta cggtaatata atgtaagaaa aacataatgc 540
aataaaaaaa taaaaaaatt ttaaaaaaac tattgacatt attctcataa ggtattatta 600
tcgtcacata cactaaatat tgataaagta aatttcaaaa acaaataaat ttttcaaagt 660
gatttaaaac caattaggtt tattttagtt ttaataaaat aaatgatatt tattagtcat 720
atccatgggg gttatttcta attgatattt tgaattggta caattgtaga gtacaaagac 780
aatgataggg aagagtaaat aggaagtatt ttttagagag tgagattttg gtgaaaactc 840
ataaatatga ctattgaagg tagccttgga gtcgtgagct gaaactaagt aggctttacc 900
ggtaaaaccg ttattacttt gagtaaaaaa ttgggtggta ccgcgcgacc aaacttctcg 960
ccccaagcag agaatgttgg ttgttttttt atacaaaaaa ttagtggtaa ttgctcaaat 1020
gctggttctt aaaattgaaa t 1041
<210> 122
<211> 1016
<212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 122
agattcattg attaaattgg ggtaatattt taacagtata tcaataagaa aatacttatg 60
aataacgctt atgaataagg gggcttatca tttagcggat gacttaaatt tacaggagaa 120
gtaggggagg tacttttccc cactaattcc tgtaatgtaa atatctatct ttttaggggc 180
aaaataatta taggtagata ttacttgtaa ataaaaaagg gcttataaat ataaattttt 240
ttataaaatg tgcgaaaatt attacgaaat tatatatagg tattataaaa actatgatgg 300
agaagagtaa atagtggagt atttttagag aattgggata aggtgaaaac ccatgaatac 360
gaaacttttg aaaatcactc ctaagttaca agctgaaatt agtaagctgt gtcggtatta 420
ccgttattag aattagaaaa aagttgggtg gtaccgcaaa gcttcttgcc ctaggcaggc 480
ggttattttt ttacaaaaaa tttccagatt taaggaggat actaaaaatg aaaagtgatt 540
cagtaaaaaa ggggattaag gcagctccag caagagcact tatgtatgga atgggatata 600
caaaagagga aattgaaaga cctcttatag gaatagtaaa ttcacaaaac gaaatagttg 660
caggtcacat gcatttagat gaaatagcaa aagctgcaaa acttggagta gcaatgtctg 720
ggggtactcc tatagagttt cctgctattg cagtttgcga tggaattgca atgggtcatg 780
ttggaatgaa gtattctctt gcttcaagag aactaatagc agattcaatt gaagctatgg 840
caacagctca tggttttgac ggattggtac tcatacctaa ctgtgacaaa attgtacctg 900
gaatgcttat ggcagctgca agacttaata taccagctgt tgtagtaagt ggaggaccta 960
tgagggcagg taagctaaat aacaaagcac ttgattttag cacttgtatt gaaaag 1016
<210> 123
<211> 39
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<22О>
- 121 031093
124
ДНК искусственная последовательность <223> Синтетический праймер <400> 123 attcatcctg caggtacata cacacactaa atttttcga 39 <210>
<211>
<212>
<213>
<22O>
<223>
<400>
gactgcggcc gcatttcaat tttaagaacc agcattt 37 <210>
<211>
<212>
<213>
<22O>
<223>
<400>
atatgctagc agattcattg attaaattgg ggtaa 35 <210>
<211>
<212>
<213>
<22O>
<223>
<400>
gactggcgcg ccttttcaat acaagtgcta aaatca 36 <210>
<211>
<212>
<213>
<22O>
<223>
<400>
tgagagttag tatttactct caact 25 <210>
<211>
Синтетический праймер
124
125
ДНК искусственная последовательность
Синтетический праймер
125
126
ДНК искусственная последовательность
Синтетический праймер
126
127
ДНК искусственная последовательность
Синтетический праймер
127
128
ДНК
Искусственная последовательность
Синтетический праймер
128
129
978
ДНК <212>
<213>
<22O>
<223>
<400>
ttctttacac aatccattac ataca 25 <210>
<211>
<212>
- 122 031093 <213> Clostridium autoethanogenum <400> 129
taaggctata tttggcaatg aaataaataa aggcgatgta attgtaataa gatatgaagg 60
accaaaaggc ggacctggaa tgagagaaat gctttcacca acttctgcta tagcaggtat 120
gggtttagat aaagatgtag cacttttaac agatggaaga ttctcaggag ctacaagagg 180
ggcatctata ggccatgtgt caccagaagc tatggaaggt ggactaatag gacttgtaga 240
agaaggagat actatatttg tagatattac aaataaaaaa ttagagctaa aagtaagtga 300
ggaagaactt gaaaagagaa gaaagaacta tgtaaagcct gaacctaaga taaaaacagg 360
atatttatca agatatgcaa aattggttac ttctgcaaat acaggtgcag ttcttaaata 420
attggagttt cttaatgtac ttttaatttg taaatatact caactttcaa ctaaaaatat 480
ttcatatatg tgaaagttga gtaaatatat tatttaataa aaattcagaa taaactattg 540
acatttaagt tgttttatag taacatatac tcatatttaa ataataaaag ctttgacagg 600
gactattaaa tatgatgtat attttaaagc gagtgggatc tggtgtaaac ccataaatat 660
ttcatattga aactcaccct tgagctgtaa gctgaaatta tagtaagctg tgccggtgtg 720
aatcgttatt gaattaagta ataaaattgg gtggtaccgc gaacagactt ctcgcctcaa 780
gagaaaggct gtttttttgt gctaattttt aacctaaaat tacctatatt aattactttg 840
aattataaat atttagtgtg tatcaagttt aaatttgatt taagtaattt aatttttaga 900
aactatttat aaatgtaaat tagaaagtat aaaatacgta ttaatatatg aaagctttga 960
aagggataag tagatatt 978
<210> 130
<211> 1002
<212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 130
aagttataga tgaaatgcca taagggtggt atgaaaatta aatttagagg agggacacag 60
acatggacaa tacaatatta ttgagtaaga tatcccaggg cttaatggaa tgctgtaaat 120
caaaaaattt ttcaagagta aataaattaa ctgtgaatgt aaatgaaaac agcaatatta 180
attcttgtaa tctttatgag tatcttaaaa attttaataa aggcatagta gatgaatcta 240
cagaaattaa aattgaaatt gaagatttgc cggatcaagt tgtaatcata agcagcatag 300
aaggtgatat atcacaagag tgcatataaa gtatgtataa ggtttccaca cgaaaaatca 360
aggaaatggg tatagatttg gtttttacac aaatctatac ccattcccac taagcaagat 420
taaatttctt tctaatcata ttaactaata cttttgctgt atcatcaact ccgccgaaca 480
ggctgctgtt aattaagatg tctttgtaaa gtacattatc actgtatgac tttgcataac 540
ttaggctgta tagctgacgc gcttcatcaa cttctttaat caacttatca gcttcatctg 600
gctttatatg aagtatattg atacaatttt cctttcgtat ctcataggga gcatagataa 660
atatgctgaa atgatttgaa tggtttctta aaatatagtc agaacacctt cctacaaata 720
tacaggatga tttatctgcc agatcacaga tgattttctt ttgggcttca aatatttctt 780
cttgtgtctt ttctgaacta gttcctagtg gaaatttcat ttttttgtat tcatttttat 840
ctatttcttc tccactgtca atagtagata caggcaaatt catctttttt gcagcttctt 900
caacgatatc cctgtcgtaa tattcaacgc ctaacaattc agccattttt ttagcaatgg 960
gacgtcccag actcccgaat tgacgggaaa tagttattac at 1002
<210> 131
<211> 39
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<22О>
- 123 031093 <223> Синтетический праймер <400> 131 attcatcctg caggtaaggc tatatttggc aatgaaata 39 <210> 132 <211> 37 <212> днк <213> искусственная последовательность <22О>
<223> Синтетический праймер <400> 132 gactgcggcc gcaatatcta cttatccctt tcaaagc 37 <210> 133 <211> 35 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> Синтетический праймер <400> 133 atatgctagc aagttataga tgaaatgcca taagg 35 <210> 134 <211> 37 <212> днк <213> искусственная последовательность <22О>
<223> Синтетический праймер <400> 134 gactggcgcg ccatgtaata actatttccc gtcaatt 37 <210> 135 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> Синтетический праймер <400> 135 ataaatgaag atgcacttac tgtta 25 <210> 136 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> Синтетический праймер <400> 136 aaaatttctc cattttacga tecta 25 <210> 137 <211> 1115 <212> ДНК
- 124 031093 <213> Clostridium autoethanogenum <400> 137 agtaaatatt ataattttac gagattttgt ttctatgtag agtatgaaaa gcagttgttt ataagttttg ggaatttcag atccctttgt tatattaaaa ctcttagtag ggacaactgc ataggtgcta aaatcctatg ggaattttaa gccaaaggct gtaaattcct acgcgtaaag tttataattt acttacctct attttttgct gtagaatgaa tgagatcgtt acgccatatg gtggattaat ttactataac atgctaaaga taggtttttt tatcatcttt taggcgttat attttgtaaa tatgcactat ttatgttctt atataacctg tgttagagaa aaagcttatg tttctcttta ctgtgtaaat cacaaaattt tgggaggttg atgtgatatt atgtgactac taatttaata tctctaaacg gcttccgctg attaaagaga ttataacact ttctatagca ttatataatg cgatatactt taatatagca atataaagta taattttatc aggaaaaaaa tatatttata taacaattat aaatacttat atggatacct tatgattatg gtaaaaaaag ctctgtttac <210> <211> <212> <213> <400>
atctaagtcc tatacttagt tttttttaca
138
956 cttaaaacgt tcttctacta aaaagaaatg aatctgatat cttgttacta atagctgcag cctggtatat ggctatataa gctggtattt aggaattgtt ataatgaaat tctcaatacc ataaatgtat tttaaattaa atattgctta agaataattg tactgttata gggtcaaaca agccg 1115
ДНК
Clostridium autoethanogenum
138 cccttttatt tatatattaa tcaattattt aatataaaag attttttact caactccagg tttgaaatct taattacact atagcttttt aaaaaatcag tacttgcaaa taagtccaac tcaagaaagc atgatctagg taaatgctgc cagctattat <210> <211> <212> <213>
tagactaaaa cttatttact accaaacttc taattcaatt gtgavtttca ttcaccaatt ttcacattta taaattttta accatataaa atcttcatcg aacaagccat acaagctgcc tctatccggt tagtgtacct catagttata aatagattgc tagctaagtt tcccctctgg aacggctctg ctagctaata acttttccct gtatatattt gaaaataaat catggtctga ttcataacac actgcaaatc atagcaaaaa tctctttttc atattagtta atgccaacaa ttgttatttt agaattacac ggcgagaagt ccggtataac atttatgagc atcctcattt taataatact tcaaaaatat taagcagaaa tatgactatt tcaccaaagt caggtgtaac ttaaaactat gttctgaaac gtaaagtact
139
ДНК
Искусственная последовательность ccgctgtttt gtggcatact tatttggacc taagacctat tgcctgcact atattgcttt ttgcatatca ttagtaccgg ttattaagaa taattgcaat tatttactcc aggctcttct gcttatttca aatgtcccca tatcaaataa tttcacatac cttttatatt ttggtccgcg ttacttatat tttcacctaa ttactatcta atcttatttt acatgaatac ttattttgct cccatataca taccttttgc cggtgaaaat aactgatgca aacacttatt ttttacaggt aaaagcttaa ttacattaaa aaagaggtgt gggggtaaaa tgttgccgtc cactatgaga attatatggg gggtggatac tatatggaga ctttggattg tactacttta acttatgtta aagcatggta tggtatatct tgctctcatt tatgactata aggtagggta ttttttattt tataataatt ttatttattc atatttatat gtaccaccca ttcagttaaa cctcattctc attttcaatt ttaaatgtca ctaggttgtt gcatcttgtg aagtatatta agattatata ggaactttaa gatactatta ggtgtaaatc gtatgg 956
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
- 125 031093 <220>
<223> Синтетический праймер <400> 139 attcatcctg caggagtaaa tattacgcgt aaagtgtta 39 <210> 140 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 140 gactgcggcc gcggctatat cagatttagt agaaga 36
141
ДНК
Искусственная последовательность
Синтетический праймер
141
142
ДНК
Искусственная последовательность <210>
<211>
<212>
<213>
<22О>
<223>
<400>
atatgctagc atctaagtcc cccttttatt tatat 35 <210>
<211>
<212>
<213>
<22O>
<223>
<400>
gactggcgcg ccatacacct gtaaaaagta cttta 35 <210>
<211>
<212>
<213>
<22O>
<223>
<400>
atgctggtat atcaaatgtt ttagt 25 <210>
<211>
<212>
<213>
<22O>
<223>
<400>
Синтетический праймер
142
143
ДНК
Искусственная последовательность
Синтетический праймер
143
144
ДНК
Искусственная последовательность
Синтетический праймер
144 attgcagtat cagctatatt aacag 25 <210> 145 <211> 353
- 126 031093 <212> ДНК <213> Clostridium autoethanogenum <400> 145 aaaaaagctt aagtagttta cgaaagctga ggtacgactg agtttctaat aaggtaagtt <210>
ataattatcc aggtactact tacgggaaca agtcgcaatg ttcgattcca aaccggagcg ttagatggcg ctgtaagata gagcacggtt ttaatcagat tctcgataga acttatctgt ctccggtgcg acacagaaaa ggaaagcgat ataaggtata ggaaagtgtc tatcaccaca cccagatagg cagccaacct gagttaccta agttgtgttt tgaaacctct tttgtacaat gtgttaagtc aaccgaaaag aagacaatcg actgaacgca agtacaaaga ctg 353
120
180
240
300
146
353
ДНК
Clostridium autoethanogenum
146 <211> <212> <213> <400>
aaaaaagctt aagtagttta cgaaagctga ggtacgactg agtttctaat aaggtaagtt <210> <211> <212> <213> <400>
aaaaaagctt aagtagttta cgaaagctga ggtacgactg agtttctaat aaggtaagtt <210> <211> <212> <213> <400>
aaaaaagctt aagtagttta cgaaagctga ggtacgactg agtttctaat aaggtaagtt <210> <211> <212> <213>
ataattatcc aggtactact tacgggaaca agtcgcaatg ttcgatttta atctgcttgg
147
353
ДНК
Clostridium autoethanogenum
147 ataattatcc aggtactact tacgggaaca agtcgcaatg ttcgattaca atccgataag
148
353
ДНК
Clostridium autoethanogenum
148 ttagttaacc ctgtaagata gagcacggtt ttaatcagat actcgataga acttatctgt ttaagtgtct ctgtaagata gagcacggtt ttaatcagat cttcgataga acttatctgt aagcagtgcg acacagaaaa ggaaagcgat ataaggtata ggaaagtgtc tatcaccaca tatcggtgcg acacagaaaa ggaaagcgat ataaggtata ggaaagtgtc tatcaccaca cccagatagg cagccaacct gagttaccta agttgtgttt tgaaacctct tttgtacaat cccagatagg cagccaacct gagttaccta agttgtgttt tgaaacctct tttgtacaat gtgttaagtc aaccgaaaag aagacaatcg actgaacgca agtacaaaga ctg 353
120
180
240
300 gtgttaagtc aaccgaaaag aagacaatcg actgaacgca agtacaaaga ctg 353
120
180
240
300 ataattatcc aggtactact tacgggaaca agtcgcaatg ttcggtttca aaggggctgg ttacatgacc ctgtaagata gagcacggtt ttaatcagat tgtcgataga acttatctgt agcccgtgcg acacagaaaa ggaaagcgat ataaggtata ggaaagtgtc tatcaccaca cccagatagg cagccaacct gagttaccta agttgtgttt tgaaacctct tttgtacaat gtgttaagtc aaccgaaaag aagacaatcg actgaacgca agtacaaaga ctg 353
120
180
240
300
149
ДНК
Искусственная последовательность
- 127 031093 <220>
<223> синтетический праймер <400> 149 cacaacccgt catgagcaag gtgc 24 <210> 150 <211> 19 <212> днк <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 150 tgtaattact aaatcagcc 19 <210> 151 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 151 ggaagtcagg gacatgcaca tgct 24 <210> 152 <211> 25 <212> днк <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 152 cattttcagg agcatatcca gcttc 25 <210> 153 <211> 25 <212> днк <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 153 gtgcaggtgg cggagttata ctggc 25 <210> 154 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 154 ccatagttcc gaggcctcca g 21 <210> 155 <211> 23 <212> днк <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 155 ggagctgaag tactattaaa atg 23 <210> 156 <211> 22 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> Синтетический праймер <400> 156 ctacttcagc tgattgtacg tc 22
- 128 031093

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Рекомбинантный карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, продуцирующий сниженное количество 2,3-бутандиола или не продуцирующий 2,3-бутандиол при ферментации субстрата, содержащего монооксид углерода, причем указанный рекомбинантный микроорганизм содержит по меньшей мере одну генетическую модификацию, нарушающую экспрессию или активность фермента, способного превращать пируват в ацетолактат, фермента, способного превращать ацетолактат в ацетоин, и/или фермента, способного превращать ацетоин в 2,3-бутандиол, в результате чего нарушается путь биосинтеза 2,3-бутандиола, причем указанный рекомбинантный микроорганизм получен из исходного микроорганизма, выбранного из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei и Clostridium coskatii.
  2. 2. Рекомбинантный микроорганизм по п.1, отличающийся тем, что способен продуцировать этанол.
  3. 3. Рекомбинантный микроорганизм по п.1, отличающийся тем, что способен продуцировать одно или более вещество, выбранное из формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина, ацетолактата, малата, фумарата, 2-оксоглутарата и цитрата.
  4. 4. Рекомбинантный микроорганизм по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что способен продуцировать повышенное количество одного или более веществ, выбранных из этанола, формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина, ацетолактата, малата, фумарата, 2-оксоглутарата и цитрата по сравнению с исходным микроорганизмом.
  5. 5. Рекомбинантный микроорганизм по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что указанный фермент, способный превращать пируват в ацетолактат, представляет собой ацетолактатсинтазу; указанный фермент, способный превращать ацетолактат в ацетоин, представляет собой ацетолактатдекарбоксилазу; и указанный фермент, способный превращать ацетоин в 2,3-бутандиол, представляет собой фермент, выбранный из 2,3-бутандиолдегидрогеназы, ацетоинредуктазы и алкогольдегидрогеназы.
  6. 6. Рекомбинантный микроорганизм по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что указанный исходный микроорганизм представляет собой Clostridium autoethanogenum DSM23693.
  7. 7. Способ получения рекомбинантного карбоксидотрофного ацетогенного микроорганизма, продуцирующего сниженное количество 2,3-бутандиола или не продуцирующего 2,3-бутандиол при ферментации субстрата, содержащего монооксид углерода, включающий генетическое модифицирование исходного микроорганизма, выбранного из Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei и Clostridium coskatii, в результате чего происходит нарушение пути биосинтеза 2,3-бутандиола, причем указанное генетическое модифицирование нарушает экспрессию или активность фермента, способного превращать пируват в ацетолактат, фермента, способного превращать ацетолактат в ацетоин, и/или фермента, способного превращать ацетоин в 2,3-бутандиол.
  8. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный микроорганизм способен продуцировать этанол.
  9. 9. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что указанный фермент, способный превращать пируват в ацетолактат, представляет собой ацетолактатсинтазу, указанный фермент, способный превращать ацетолактат в ацетоин, представляет собой ацетолактатдекарбоксилазу и указанный фермент, способный превращать ацетоин в 2,3-бутандиол, представляет собой фермент, выбранный из 2,3бутандиолдегидрогеназы, ацетоинредуктазы и алкогольдегидрогеназы.
  10. 10. Способ получения одного или более продуктов, включающий ферментацию субстрата, содержащего монооксид углерода, микроорганизмом по любому из пп.1-6, причем указанный продукт выбран из этанола, формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина, ацетолактата, малата, фумарата, 2-оксоглутарата и цитрата.
  11. 11. Способ по п.10, включающий следующие стадии:
    (а) помещение субстрата, содержащего монооксид углерода, в биореактор, содержащий культуру микроорганизма по любому из пп.1-6;
    (б) ферментацию культуры в анаэробных условиях в биореакторе с получением одного или более продуктов и (в) выделение одного или более продуктов из ферментативного бульона; причем субстрат содержит по меньшей мере от примерно 20 до примерно 100% монооксида углерода по объему.
  12. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный продукт представляет собой этанол.
  13. 13. Способ по п.11, отличающийся тем, что субстрат, содержащий монооксид углерода, получают промышленным способом.
    - 129 031093
    Ацетат,
    Путь ВудаЛьюнгдаля
    СО
    I со,
    I формиат
    Лактатдегидрогеназа (IdhA)
    Лактат <
    I ВСАА-путь I МегалакгатI______ синтаза (alsS)
    Валин, <---Ацетолактат
    Леицин
    Ацетолактдекарбоксилаза (budA) / у s-co, Ацетоин
    2,3-бутандиол дегидрогеназа / (2,3bdh)
    2,3-Бутандиол
    Путь 2,3-бута нд иола
EA201491418A 2012-01-31 2013-01-31 Рекомбинантный карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, способ его получения и способ получения продуктов с его использованием EA031093B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261593269P 2012-01-31 2012-01-31
PCT/NZ2013/000012 WO2013115659A2 (en) 2012-01-31 2013-01-31 Recombinant microorganisms and methods of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491418A1 EA201491418A1 (ru) 2015-02-27
EA031093B1 true EA031093B1 (ru) 2018-11-30

Family

ID=48905994

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491418A EA031093B1 (ru) 2012-01-31 2013-01-31 Рекомбинантный карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, способ его получения и способ получения продуктов с его использованием

Country Status (13)

Country Link
US (2) US9057071B2 (ru)
EP (1) EP2710117B1 (ru)
JP (2) JP6512825B2 (ru)
KR (1) KR101511639B1 (ru)
CN (1) CN104395455B (ru)
AU (1) AU2013215706B2 (ru)
BR (1) BR112014018844B1 (ru)
CA (1) CA2862790C (ru)
EA (1) EA031093B1 (ru)
ES (1) ES2583203T3 (ru)
MY (1) MY165103A (ru)
WO (1) WO2013115659A2 (ru)
ZA (1) ZA201405858B (ru)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA031093B1 (ru) * 2012-01-31 2018-11-30 Ланцатек Нью Зилэнд Лимитед Рекомбинантный карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, способ его получения и способ получения продуктов с его использованием
CA2924976C (en) * 2013-09-22 2018-05-15 Lanzatech New Zealand Limited Methods for increasing the production of products derived from acetolactate
BR112016012634A2 (pt) * 2013-12-03 2017-09-26 Lanzatech New Zealand Ltd bactéria carboxidotrófica acetogênica recombinante, e, métodos para produzir acetona e mek
CN106133132A (zh) * 2014-01-30 2016-11-16 朗泽科技新西兰有限公司 重组微生物和其使用方法
PT3180421T (pt) * 2014-08-11 2019-06-07 Lanzatech New Zealand Ltd Bactéria geneticamente manipulada com atividade de monóxido de carbono desidrogenase (codh) diminuída
US10590406B2 (en) * 2014-12-08 2020-03-17 Lanzatech New Zealand Limited Recombinant microorganisms exhibiting increased flux through a fermentation pathway
KR20180038462A (ko) * 2015-09-02 2018-04-16 세키스이가가쿠 고교가부시키가이샤 재조합 세포, 재조합 세포의 제조 방법, 및 1,4-부탄디올의 생산 방법
KR20210037002A (ko) 2015-10-13 2021-04-05 란자테크 뉴질랜드 리미티드 에너지-생성 발효 경로를 포함하는 유전자 조작된 박테리아
CN108603178A (zh) * 2016-01-06 2018-09-28 株式会社西化学 Co水合酶以及使用其产生甲酸的方法
US11162115B2 (en) 2017-06-30 2021-11-02 Inv Nylon Chemicals Americas, Llc Methods, synthetic hosts and reagents for the biosynthesis of hydrocarbons
US11634733B2 (en) 2017-06-30 2023-04-25 Inv Nylon Chemicals Americas, Llc Methods, materials, synthetic hosts and reagents for the biosynthesis of hydrocarbons and derivatives thereof
US11505809B2 (en) * 2017-09-28 2022-11-22 Inv Nylon Chemicals Americas Llc Organisms and biosynthetic processes for hydrocarbon synthesis
WO2019147743A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
EP3931341A4 (en) * 2019-02-25 2023-03-29 Northwestern University PLATFORMS FOR THE ACELLULAR SYNTHESIS OF PROTEINS DERIVED FROM CLOSTRIDIA
CN111089914A (zh) * 2019-11-07 2020-05-01 河北首朗新能源科技有限公司 微生物发酵生产乙醇中代谢物的高效液相检测方法
CN111154683B (zh) * 2020-01-19 2022-05-13 南京工业大学 一种食甲基丁酸杆菌的优化培养方法及其应用
CN111220762A (zh) * 2020-03-24 2020-06-02 河北首朗新能源科技有限公司 一种乙醇梭菌蛋白中有机物的含量的检测方法及应用
MY197253A (en) * 2020-06-06 2023-06-08 Lanzatech Inc Microorganism with knock-in at acetolactate decarboxylase gene locus
CA3193192A1 (en) * 2020-09-25 2022-03-31 Lanzatech, Inc. Recombinant microorganisms and uses therefor
CN113234653B (zh) * 2021-04-22 2022-10-04 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种提高合成气发酵产乙醇含量的突变株和利用突变株的应用
US20240117393A1 (en) 2022-09-30 2024-04-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080293101A1 (en) * 2006-07-27 2008-11-27 Peters Matthew W Engineered microorganisms for increasing product yield in biotransformations, related methods and systems
WO2009113878A1 (en) * 2008-03-12 2009-09-17 Lanzatech New Zealand Limited Microbial alcohol production process
WO2010121849A1 (de) * 2009-04-23 2010-10-28 Evonik Degussa Gmbh Zellen und verfahren zur herstellung von aceton
US20100285548A1 (en) * 2007-10-08 2010-11-11 Agraferm Technologies Ag Process And Apparatus For The Microbial Production Of A Specific Product And Methane

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007005646A2 (en) * 2005-07-01 2007-01-11 The University Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant host cells and media for ethanol production
EP2217696B1 (en) * 2007-11-13 2015-09-16 Lanzatech New Zealand Limited Novel bacteria and methods of use thereof
WO2009151342A1 (en) * 2008-06-09 2009-12-17 Lanzatech New Zealand Limited Production of butanediol by anaerobic microbial fermentation
US8143037B2 (en) * 2010-03-19 2012-03-27 Coskata, Inc. Ethanologenic Clostridium species, Clostridium coskatii
JP5922657B2 (ja) * 2010-07-28 2016-05-24 ランザテク・ニュージーランド・リミテッド 新規細菌及びその使用方法
EA031093B1 (ru) * 2012-01-31 2018-11-30 Ланцатек Нью Зилэнд Лимитед Рекомбинантный карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, способ его получения и способ получения продуктов с его использованием

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080293101A1 (en) * 2006-07-27 2008-11-27 Peters Matthew W Engineered microorganisms for increasing product yield in biotransformations, related methods and systems
US20100285548A1 (en) * 2007-10-08 2010-11-11 Agraferm Technologies Ag Process And Apparatus For The Microbial Production Of A Specific Product And Methane
WO2009113878A1 (en) * 2008-03-12 2009-09-17 Lanzatech New Zealand Limited Microbial alcohol production process
WO2010121849A1 (de) * 2009-04-23 2010-10-28 Evonik Degussa Gmbh Zellen und verfahren zur herstellung von aceton

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABRINI, JAMAL et al., "Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide", Archives of Microbiology, April 1994, vol. 161, No. 4, pp 345-351. See age 345. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2710117B1 (en) 2016-04-27
JP2015505471A (ja) 2015-02-23
US20150299737A1 (en) 2015-10-22
WO2013115659A2 (en) 2013-08-08
US9297026B2 (en) 2016-03-29
US9057071B2 (en) 2015-06-16
BR112014018844A2 (pt) 2020-08-18
WO2013115659A3 (en) 2013-10-03
CN104395455A (zh) 2015-03-04
CN104395455B (zh) 2020-05-19
KR20130138866A (ko) 2013-12-19
ZA201405858B (en) 2016-08-31
EP2710117A4 (en) 2014-04-16
KR101511639B1 (ko) 2015-04-16
CA2862790C (en) 2016-09-27
JP6512825B2 (ja) 2019-05-15
MY165103A (en) 2018-02-28
CA2862790A1 (en) 2013-08-08
JP2019088292A (ja) 2019-06-13
EA201491418A1 (ru) 2015-02-27
ES2583203T3 (es) 2016-09-19
EP2710117A2 (en) 2014-03-26
AU2013215706B2 (en) 2014-03-27
JP6898365B2 (ja) 2021-07-07
US20140206901A1 (en) 2014-07-24
AU2013215706A1 (en) 2013-10-10
BR112014018844B1 (pt) 2022-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101511639B1 (ko) 재조합 미생물 및 이의 사용 방법
KR101640325B1 (ko) 재조합 미생물에 의한 일산화탄소로부터 부탄올의 제조
KR102015672B1 (ko) 재조합 미생물 및 이의 용도
DK2855662T3 (en) RECOMBINANT MICROORGANISMS AND APPLICATIONS THEREOF
KR102493197B1 (ko) 발효 경로를 통해 플럭스 증가를 나타내는 재조합 미생물
KR100760222B1 (ko) 유전자 증폭에 의해 증가된 리신 생산
RU2745157C1 (ru) Дрожжи, продуцирующие эктоин
JP2017523787A (ja) フィードバック抵抗性アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体及びそれを用いたｌ−バリンの生産方法
TW201233798A (en) Recombinant microorganisms and methods of use thereof
CN111936631A (zh) 用于生物产生乙二醇的微生物和方法
KR20210144816A (ko) 키메라 플라스미드 라이브러리의 구축 방법
KR102079274B1 (ko) 효소 변경된 대사 산물의 활성
CN114008197A (zh) 用于同时消耗木糖和葡萄糖以从第二代糖产生化学物质的代谢工程
CN114958627A (zh) 一株高产生育酚的重组裂殖壶菌工程菌的构建方法及应用
KR20110102752A (ko) Ｌ-아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
KR102308556B1 (ko) 변경된 일산화탄소 탈수소효소(codh) 활성을 가지는 유전자 조작된 박테리아
KR102208963B1 (ko) 신규한 아크릴산 생성 경로를 갖는 미생물 및 이를 이용한 아크릴산 생산 방법
KR20220140619A (ko) 가스성 기질로부터의 2-페닐에탄올의 발효 제조
JP2023540330A (ja) Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたｌ－シトルリンの生産方法
KR20230079454A (ko) 재조합 미생물 및 이에 대한 용도
KR20160111936A (ko) 부티르산에 대한 증가된 내성을 갖는 박테리아
KR20230156819A (ko) 아세토락테이트 탈카복실화효소 유전자위에 녹인이 있는 미생물
KR20150038857A (ko) 세포 표면 발현 기술을 이용한 gaba의 대량 생산방법

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG TJ TM