BR112014018844B1 - Micro-organismo, e, método para a produção de um ou mais produtos - Google Patents

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Abstract

MICRO-ORGANISMO, E, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM OU MAIS PRODUTOS. A presente invenção refere-se a métodos para a produção de compostos químicos em particular, mas não exclusiva mente, o etanol, através de fermentação microbiana. São também descritos micro-organismos modificados geneticamente, capazes de usar o monóxido de carbono para produzir um ou mais produtos, em particular, mas não exclusivamente, o etanol como um produto principal, e produzir substancialmente nenhuma ou uma quantidade reduzida de 2,3-butanodiol e/ ou de um precursor do mesmo.

Description

CAMPO
[0001] A presente invenção refere-se a métodos para a produção de compostos químicos em particular, mas não exclusivamente, o etanol, através de fermentação microbiana, e micro-organismos modificados geneticamente para o uso em tais métodos.
FUNDAMENTO
[0002] Os micro-organismos acetogênicos são conhecidos como sendo úteis para a produção de combustíveis, por exemplo, o etanol ou o butanol) e de outros produtos químicos, através da fermentação de substratos, que incluem o monóxido de carbono, dióxido de carbono, hidrogênio e metanol, por exemplo. Muitos destes micro-organismos produzem naturalmente pelo menos dois, se não mais, produtos. No entanto, quando os micro-organismos estão sendo usados para a produção de produtos, de um modo particular em uma escala comercial, nem sempre é desejável que os micro-organismos produzam múltiplos produtos. Por eemplo, a produção de múltiplos produtos pode ocorrer à custa da eficiência de produção e do rendimento de valor particular, como subprodutos que desviam o carbono a partir das vias envolvidas na produção do produto desejado principal. De um modo adicional, os subprodutos podem ser tóxicos para o micro-organismo, a produção de múltiplos produtos pode tornar a recuperação e a separação dos produtos desejados difícil e pode ser ainda difícil controlar as condições de fermentação, de um modo a que a produção de um produto seja favorecida em relação a um outro. Os subprodutos podem ainda ser uma fonte potencial de contaminação em um fermentador, à medida que eles podem ser substratos para organismos indesejáveis.
[0003] No caso da produção de etanol através da fermentação microbiana de substratos, que compreendem o monóxido de carbono, 2,3- butano diol é produzido, de um modo típico, como um subproduto. Isto pode ainda reduzir a eficiência e o rendimento de produção de etanol, assim como causar outros problemas, tal como acima mencionado.
[0004] Constitui um objeto da invenção superar uma ou mais das desvantagens da técnica antecedente, ou pelo menos prover o público com uma escolha útil.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0005] A invenção refere-se ainda, inter alia, a novos microorganismos modificados geneticamente, capazes de usar o mon[óxido de carbono para produzir um ou mais produtos e para produzir uma quantidade reduzida de 2,3-butano diol e/ ou um precursor do mesmo, comparado a um micro-organismo parental. Em ainda uma forma de realização, o microorganismo geneticamente modificado não produze, de um modo substancial, 2,3- butano diol e/ ou um precursor do mesmo, comparado a um microorganismo parental. Em ainda uma forma de realização particular, o micro-organismo produz o etanol como o produto principal.
[0006] Em ainda um primeiro aspecto, a invenção provê um microorganismo acetogênico carboxidotrófico, que é adaptado para a produção de um ou mais produtos e uma quantidade reduzida ou substancialmente inexistente de 2,3-butano diol e/ ou de um precursor do mesmo, mediante a fermentação de um substrato, que compreende o monóxido de carbono, o micro-organismo compreendendo uma ou mais modificações genéticas, que rompem a via de biossíntese de 2,3-butano diol, comparado a um microorganismo parental.
[0007] Em ainda uma outra forma de realização particular, a invenção provê um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico, que é adaptado para produzir o etanol como o produto principal e uma quantidade reduzida ou substancialmente inexistente de 2,3- butano diol e/ ou de um precursor do mesmo, mediante a fermentação de um substrato, que compreende monóxido de carbono, o micro-organismo compreendendo uma ou mais modificações genéticas, que rompem a via de biossíntese de 2,3- butano diol, comparado a um micro-organismo parental.
[0008] Em ainda uma forma de realização, o micro-organismo é adaptado para produzir, de um modo adicional, um ou mais de formato, lactato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, acetolactato, malato, fumerato, 2-oxogluterato, citrato.
[0009] Em ainda uma outra forma de realização, o micro-organismo é adpatado para produzir uma quantidade aumentada de um ou mais de etanol, formato, lactato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, acetolactato, malato, fumerato, 2-oxogluterato, e citrato, comparado a um micro-organismo parental.
[00010] Em ainda uma forma de realização, micro-organismo compreende pelo menos uma modificação genética, que rompe a expressão e/ ou a atividade de uma ou mais enzimas capazes de converter o piruvato ao acetolactato.
[00011] Em ainda uma forma de realização, a uma ou mais enzimas, capazes de converter o piruvato para o acetolactato é uma acetolactato sintase (alsS).
[00012] Em ainda uma forma de realização, o micro-organismo compreende pelo menos uma modificação genética, que rompe a expressão e/ ou a atividade de um ou mais capazes de converter o acetolato para acetoína.
[00013] Em ainda uma forma de realização, a uma ou mais enzimas, capazes de converter o acetolato para acetoína são uma acetolactato descarboxilase (budA).
[00014] Em ainda uma forma de realização, o micro-organismo compreende pelo menos uma modificação genética, que rompe a expressão e/ ou a atividade de uma ou mais enzimas, capazes de converter a acetoína para 2,3-butano diol.
[00015] Em uma forma de realização, a uma ou mais enzima, capaz de converter a acetoína para 2,3-butano diol, é uma enzima selecionada a partir de 2,3-butano diol desidrogenase (2,3 bdh), uma acetína redutase, uma álcool desidrogenase primária: secundária.
[00016] Em uma outra forma de realização,o micro-organismo compreende pelo menos uma modificação genética, que rompe a expressão e/ ou a atividade de uma combinação de duas ou mais enzimas, capazes de converter o piruvato para acetolactato, o acetolactato para acetoína, e/ ou a acetoína para 2,3- butano diol.
[00017] Em ainda uma forma de realização, a modificação genética rompe a expressão e/ ou a atividade de uma ou mais de: Acetolactato sintase (alsS); Acetolactato descarboxilase (BudA); 2,3-Butano diol desidrogenase (2,3 bdh); Acetoína redutase; e, Álcool desidrogenase primária: secundária.
[00018] Em ainda uma forma de realização, a modificação genética rompe a expressão e/ ou a atividade de uma ou mais de: Acetolactato sintase (alsS); Acetolactato descarboxilase (BudA); e, 2,3-Butano diol desidrogenase (2,3 bdh).
[00019] Em uma outra forma de realização, a uma ou mais modificações genéticas rompem um ou mais dos genes, que codificam uma ou mais das enzimas acima. Em ainda uma forma de realização, a uma ou mais modificações genéticas rompem a atividade de um composto requerido para a expressão ou atividade de uma ou mais das enzimas acima. Em ainda uma forma de realização, a uma ou mais modificações genéticas aumentam a expressão ou a atividade de um ou mais compostos, que inibem a expressão ou a atividade de uma ou mais das enzimas acima.
[00020] Em ainda uma forma de realização particular, o microorganismo é selecionado a partir do grupo, que compreende Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, and Clostridium ragsdalei e isolados relacionados. Em ainda uma outra forma de realização, o grupo também compreende Clostridium coskatii.
[00021] Em ainda uma forma de realização particular, microorganismo é Clostridium autoethanogenum DSM23693.
[00022] Em ainda um segundo aspecto, a invenção provê um método para a produção de um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico, que é adaptado para produzir um ou mais produtos e uma quantidade reduzida ou substancialmente inexistente de 2,3-butano diol e/ ou um precursor do mesmo, a fermentação de um substrato, que compreende o monóxido de carbono, o método compreendendo modificar geneticamente um microorganismo parental acetogênico carboxidotrófico, de um modo a romper a via de biossíntese de 2,3-butano diol.
[00023] Em ainda uma forma de realização, o método resulta em uma produção aumentada de um ou mais produtos, comparados a um microorganismo parental.
[00024] Em ainda uma forma de realização particular, a invenção provê um método para a produção de um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico, que é adpatado para produzir o etanol como o produto principal e uma quantidade reduzida ou substancialmente inexistente de 2,3- butano diol e/ ou de um precursor do mesmo, mediante a fermentação de um substrato, que compreende o monóxido de carbono, o método compreendendo modificar geneticamente um micro-organismo parental acetogênico caroxidotrófico, de um modo a romper a via de biossíntese de 2,3- butano diol.
[00025] A invenção provê ainda um micro-organismo produzido através de um método do segundo aspecto.
[00026] Em ainda uma forma de realização, o método compreende introduzir, no micro-organismo parental, uma ou mais modificações genéticas, que rompem um ou mais genes que codificam uma ou mais enzimas, capazes de converter o piruvato a acetolactato. Em ainda uma forma de realização, a uma ou mais enzimas, capazes de converter o piruvato a um aceto lactato são uma acetolactato sintase (alsS).
[00027] Em ainda uma forma de realização, o método compreende introduzir, no micro-organismo parental, de uma ou mais modificações genéticas, que rompem um ou mais genes, que codificam uma ou mais enzimas, capazes de converter o acetolactato para acetoína. Em ainda uma forma de realização, a uma ou mais enzimas, capazes de converter o acetolactato para acetoína, são uma acetolactato decarboxilase (budA).
[00028] Em ainda uma forma de realização, o método compreende introduzir, no micro-organismo parental, uma ou mais modificações genéticas, que rompem um ou mais genes, que codificam uma ou mais enzimas capazes de converter acetoína para 2,3- butano diol. Em ainda uma outra forma de realização, a uma ou mais enzimas, capazes de converter a acetoína para 2,3- butano diol, são selecionadas a partir de uma 2,3- butano diol desidrogenase ( 2,3-bdh), uma acetoína redutase, uma álcool desidrogenase primária: secundária.
[00029] Em ainda uma forma de realização, o método compreende introduzir, no micro-organismo parental, uma ou mais modificações genéticas, que rompem uma combinação de dois ou mais dos genes, que codificam uma enzima, capaz de converter o piruvato para acetolactato, o acetolactato para acetoína e/ ou a acetoína para 2,3-butano diol.
[00030] Em ainda uma forma de realização, o método compreende introduzir, no micro-organismo parental, uma ou mais modificações genéticas, que rompem um ou mais dos genes, que codificam uma ou mais acetolactato sintase (alsS), acetolactato descarboxilase (budA) e 2,3- butano diol desidrogenase (2,3- bdh).
[00031] Em ainda uma forma de realização, o método compreende introduzir uma modificação genética, que rompe a atividade de um composto requerido para a expressão ou atividade de uma ou mais das enzimas acima.
[00032] Em ainda uma forma de realização, o método compreende introduzir uma modificação genética, que aumenta a expressão ou a atividade de um ou mais compostos, que inibem a expressão ou a atividade de uma ou mais das enzimas acima.
[00033] Em ainda um aspecto, a invenção provê um método para a produção de um ou mais produtos. Em ainda uma forma de realização, o método destina-se à produção de um ou mais de etanol,formato, lactato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, acetolactato, malato, fumerato, 2- oxogluterato, citrato.
[00034] Em ainda uma forma de realização particular, a invenção provê um método para a produção de um ou mais produtos (em uma forma de realização incluindo etanol e um ou mais produtos) através da fermentação microbiana, que compreende fermentar um substrato, que compreende CO, por meio do uso de um ou mais micro-organismos do primeiro aspecto da invenção e/ ou produzidos através do método do segundo aspecto da invenção. Em ainda uma forma de realização, o um ou mais outros produtos são selecionados a partir do grupo, que consiste de succinato, lactato, formato, valina, leucina, piruvato, isoleucina, acetolactato, malato, fumerato, 2- oxogluterato, citrato.
[00035] A invenção provê também um método para a redução das emissões de carbono atmosféricas totais a partir de um processo industrial.
[00036] Em ainda uma forma de realização, o método compreende os estágios de: (a) prover um substrato, que compreende CO, a um biorreator, que contém uma cultura de um ou mais micro-organismos do primeiro aspecto da invenção e/ ou produzido através de um método do segundo aspecto da invenção; e (b) fermentar, de um modo anaeróbico, a cultura do biorreator, de um modo a que sejam produzidos um ou mais dos produtos acima mencionados, de um modo preferido incluindo etanol.
[00037] Em ainda uma outra forma de realização, o método compreende os estágios de: (c) turar o gás contendo CO, produzido como um resultado do processo industrial, antes que o gás seja liberado ao interior da atmosfera; fermentar, de um modo anaeróbico, o gás contendo CO, de um modo a que sejam produzidos um ou mais dos produtos acima mencionados, de um modo preferido incluindo o etanol, através de uma cultura contendo um ou mais micro-organismos do primeiro aspecto da invenção e/ ou produzidos através do método do segundo aspecto da invenção.
[00038] Em ainda formas de realização particulares de aspectos do método, o micro-organismo é mantido em um meio de cultura aquoso.
[00039] Em ainda formas de realização particulares dos aspectos do método, a fermentação do substrato ocorre em um biorreator. Em algumas formas de realização dos aspectos do método, a fermentação do substrato acontece em um biorreator.
[00040] De um modo preferido, o substrato que compreende CO, é um substrato gasoso compreendendo CO. Em ainda uma forma de realização, o substrato compreende um gás de rejeito industrial. Em ainda certas formas de realização, o gás é um gás de rejeito de moinho de aço ou um gás de síntese.
[00041] Em ainda uma forma de realização, o substrato irá, de um modo típico, conter uma proporção principal de CO, tal que de pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% de CO, em volume, de a partir de 20% a 70% de CO, em volume, e de 30% a 60% de CO, em volume, e de 40% a 55% de CO, em volume. Em ainda formas de realização particulares, o substrato compreende de cerca de 25%, ou de cerca de 30%, ou cerca de 35%, ou cerca de 40%, ou cerca de 45%, ou cerca de 50% de CO, ou cerca de 55% de CO, ou cerca de 60% de CO, em volume.
[00042] Embora não seja necessário que o substrato contenha qualquer hidrogênio, a presença de H2 seria prejudicial à formação de produto, de acordo com os métodos da invenção. Em ainda formas de realização particulares, a presença de hidrogênio resulta em uma eficiência total melhorada da produção de álcool. Por exemplo, em ainda formas de realização particulares, o substrato pode ainda compreender uma razão de aproximadamente 2:1, ou de 1:1, ou uma razão de 1:2 de H2:CO. Em ainda uma forma de realização, o substrato compreende cerca de 30%, ou menos de H2 em volume, 20% ou menos, de H2 em volume, cerca de 15% ou menos de H2 em volume e cerca de 10% ou menos de H2 em volume. Em ainda outras formas de realização, a corrente do substrato compreende baixas concentrações de H2, por exemplo, menos do que 5%, ou menos do que 4%, ou menos do que 3%, ou menos do que 2%, ou menos do que 1%, ou está substancialmente livre de hidrogênio. O substrato pode ainda conter algum CO2, por exemplo, tal que cerca de 1 % a cerca de 80% de CO2, em volume, ou de 1% a cerca de 30% de CO2, em volume.
[00043] Em ainda certas formas de realização, os métodos compreendem ainda o estágio de recuperar o um ou mais produtos a partir do caldo de fermentação. Em ainda uma forma de realização, o etanol é recuperado a partir do caldo de fermentação. Em ainda uma outra forma de realização, um ou mais outros produtos são recuperados a partir do caldo de fermentação, incluindo o formato, lactato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, acetolactato, malato, fumerato, citrato e 2- oxogluterato.
[00044] Em ainda um quarto aspecto, a invenção provê um ou mais produtos, quando produzidos através de um método do terceiro aspecto. Em ainda uma forma de realização, o um ou mais produtos são selecionados a partir do grupo, que consiste de etanol, formato, lactato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, acetolactato, malato, fumerato, citrato e 2- oxogluterato. Em ainda uma forma de realização particular, o um ou mais produtos compreendem pelo menos etanol.
[00045] Em ainda um quinto aspecto, a invenção provê um microorganismo acetogênico carboxidotrófico, no qual um ou mais genes não essenciais foram rompidos, comparados a um micro-organismo parental.
[00046] Em ainda um sexto aspecto, a invenção provê um método de produção de um micro-organismo acetogênico carobxidotrófico, no qual um ou mais genes não essenciais foram rompidos, o método compreendendo modificar geneticamente um ou mais genes não essenciais em um microorganismo parental.
[00047] A invenção provê também micro-organismos produzidos através de métodos do sexto aspecto.
[00048] Em ainda uma forma de realização, o um ou mais genes não essenciais é um gene, que codifica uma enzima, que converte o acetolactato para acetoína e/ ou que codifica uma enzima, que converte a acetoína para 2,3-butano diol. Em ainda uma forma de realização, as enzimais são tais como aqui descritas.
[00049] Em ainda certas formas de realização, o micro-organismo é selecionado a partir do grupo, que compreende: Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium coskatii, Butyribacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Oxobacter pfennigii, and Thermoanaerobacter kiuvi.
[00050] Em ainda uma forma de realização particular, o microorganismo é selecionado a partir do grupo, que compreende: Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, e Clostridium ragsdalei. Em ainda uma outra forma de realização, o grupo também compreende Clostridium coskatii.
[00051] Em ainda uma forma de realização particular, o microorganismo é Clostridium autoethanogenum DSM23693.
[00052] Em um sétimo aspecto, a invenção provê um método para a produção de um ou mais produtos, através de fermentação microbiana, por meio do uso de um ou mais micro-organismos do quinto aspecto e/ ou produzidos através de um método do sexto aspecto.
[00053] Em uma outra forma de realização particular, a invenção provê um método para a produção de etanol e de um ou mais outros produtos, através da fermentação microbiana, que compreende fermentar um substrato, que compreende CO, por meio do uso de um ou mais micro-organismos do quinto aspecto e/ ou produzidos por um método de acordo com o sexto aspcto.
[00054] Em ainda uma outra forma de realização, o método compreende os estágios de: (a) prover um substrato, que compreende CO, a um biorreator contendo uma cultura de um ou mais micro-organismos de acordo com o quinto aspecto e/ ou produzidos por meio de um método de acordo com o sexto aspecto; e (b) fermentar, de um modo anaeróbico, a cultura no biorreator, de um modo a que sejam produzidos um ou mais produtos.
[00055] Em uma outra forma de realização, o método compreende os estágios de: a) ) capturar o gás contendo CO, produzido como um resutlado do processo industrial, antes que o gás seja liberado ao interior da atmosfera; b) fermentar, de um modo anaeróbico, o gás contendo CO, de um modo que sejam produzidos um ou mais produtos, por meio de uma cultura contendo um ou mais micro-organismos do quinto aspecto e/ ou produzidos através de um método de acordo com o sexto aspecto.
[00056] Em ainda uma forma de realização, o um ou mais produtos são como aqui descritos.
[00057] Em ainda uma forma de realização, o substrato compreendendo CO é aqui descrito.
[00058] A invenção pode ser também considerada como amplamnte consistindo nas partes, elementos e características referidos ou indicados no relatório do pedido, de um modo individual ou coletivo, em qualquer uma ou em todas as combinações de duas ou mais das referidas partes, elementos ou características, e em que os inteiros específicos são aqui mencionados, os quais possuem equivalentes conhecidos na técnica à qual a invenção pertence, tais equivalentes conhecidos sendo considerados como sendo aqui incorporados como se individualmente expostos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00059] Estes e outros aspectos da presente invenção, que devem ser considerados em todos os seus aspectos inovadores, tornar-se-ão evidentes a partir da descrição que se segue, que é apenas fornecida a título de exemplo, com referência às figuras anexas, nas quais: a Figura 1 mostra a via metabólica a partir de CO em acetógenos carboxidotróficos que produzem 2,3- butano diol ( por exemplo C. autoethanogenum DSM23693).
[00060] A Figura 1b ilustra os efeitos da eliminação da via de biossíntese de 2,3-butano diol em acetógenos carboxidotróficos, que produzem 2,3-butano diol, com a redistribuição do fluxo de carbono em relação a etanol e mostra a produção de alguns novos produtos, por exemplo, o succinato, 2- oxogluterato, formato, valina, e leucina a partir de CO.
[00061] A Figura 2 mostra o gene budA e as suas regiões de flanqueamento 5' e 3' no genoma C. autoethanogenum DSM23693. São também indicados os iniciadores usados para a amplificação de PCR e a clonagem subsequente dos fragmentos de flanqueamento no plasmídeo pMTL85141.
[00062] A Figura 3 mostra um plasmídeo pMTL85141-budA-ko exemplar, que abriga os fragmentos de DNA de flanqueamento do gene budA 5' e 3', separados por um gene lacZ para a aliminação do gene budA em C. autoethanogenum DSM23693.
[00063] A Figura 4 mostra um plasmídeo de metilação exemplar para o uso na invenção.
[00064] A Figura 5 mostra (A): uma apresentação gráfica da região genômica de C. autoethanogenum DSM23693 seguindo-se à eliminação do gene budA knockout e também indica a posição dos iniciadores usados para os testes de eliminação do gene budA C. autoethanogenum DSM23693 e o tamanho esperado para os produtos de PCR de tipo selvagem C. autoethanogenum DSM23693 e a eliminação correspondente do gene budA. (B) Uma imagem de eletroforese em gel de agarose de testes de PCR de eliminação do gene budA C. autoethanogenum DSM23693 budA gene knocnkouts. A trilha 1 e a 9 mostram o GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder. As trilhas 2-6 mostram a amplificação de PCR da região alvo de budA a partir de um DNA genômico, isolado a partir do tipo selvagem C. autoethanogenum DSM23693 (+ve, 2.7 kb) e seis eliminações do gene budA C. autoethanogenum DSM23693 potenciais (1-6, 2.2 kb) com os iniciadores Og09 e Og12r. As trilhas 10-16 mostram o PCR com o DNA genômico isolado a partir do tipo selvagem (+ve) C. autoethanogenum DSM23693 e seis eliminações do gene budA C. autoethanogenum DSM23693 potenciais com os iniciadores Og44f e Og45r specíficos para a região interna 273 bp do gene budA (*).
[00065] Figura 6: A confirmação por PCR da inserção de RAM nos genes budA e 2,3 bhd C. autoethanogenum DSM23693 usando os iniciadores Og44f / Og45r e Og42f / Og43r.
[00066] A Figura 7 mostra a taxa de conversão de acetoína para butano diol pelos mutantes C. autoethanogenum DSM23693 e Δ2,3bdh ClosTron na fermentação.
BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[00067] Este relatório é acompanhado por uma listagem de sequência, na qual as seguintes sequências estão relacionadas: Seq. ID 1: Sequência de nucleotídeo da sequência de nucleotídeo do gene budA C. autoethanogenum DSM23693. Seq. ID 2: Sequência de aminoácido da proteína budA C. autoethanogenum DSM23693. Seq. ID 3: Sequência de nucleotídeo da região de flanqueamento 5' do gene budA C. autoethanogenum DSM23693. Seq. ID 4: Sequência de nucleotídeo da sequência de flanqueamento 3’ do gene budA. Seq ID 5 a 8 e 10 e 11: São descritas na Tabela 1 a seguir. Seq. ID 9: Sequência de nucleotídeo dedo vetor de passagem E. coli-Clostridium - plasmídeo pMTL85141 Seq. ID. 12: Resultados da sequência de nucleotídeo de pMTL85141-budA-ko que demonstra que os fragmentos de DNA de flanqueamento encontrados no plasmídeo estavam livres de mutações. Seq ID 13: gene 16s rRNA de C. autoethanogenum (Y18178, GI:7271109) Seq ID 14: gene 16s rRNA da colônia 1 do transformante de eliminação de budA potencial de C. autoethanogenum DSM23693: (93%) identidade Seq. ID 15: gene 16s rRNA da colônia 2 do transformante de eliminação de budA potencial de C. autoethanogenum DSM23693: (94%) Seq. ID 16: gene 16s rRNA da colônia 3 do transformante de eliminação de budA potencial de C. autoethanogenum DSM23693: (95%) Seq. ID 17: gene 16s rRNA gene da colônia 4 do transformante de eliminação de budA potencial de C. autoethanogenum DSM23693: (93%). Seq. ID 18: gene 16s rRNA da colônia 5 do transformante de aliminação de budA potencial de C. autoethanogenum DSM23693: (94%). Seq. ID 19: gene 16s rRNA da colônia 6 do transformante de eliminação de budA potencial de C. autoethanogenum DSM23693: (92%). Seq ID 20. Resultado da sequenciação de nucleotídeo do produto de pCR da colônia 1 do transformante de eliminação de budA potencial de C. autoethanogenum DSM23693 com o iniciador Og09f. (92%) Seq ID 21. Resultado da sequenciação de nucleotídeo do produto de PCR da Colônia 1 do transformante de eliminação de budA potencial de C. autoethanogenum DSM23693 com o iniciador Og12r. (92%) Seq ID 22. Resultado de sequenciação de nucleotídeo do produto de PCR da ColÔnia 3 do transformante de aliminação de budA potencial de C. autoethanogenum DSM23693 com o iniciador Og12r. (92%) Seq ID 23. Resultado da sequenciação de nucleotídeo do produto de PCR da Colônia 4 do transformante de eliminação de budA potencial de C. autoethanogenum DSM23693 com o iniciador Og12r. (92%) Seq ID 24. Resultado da sequenciação de nucleotídeo do produto de PCR da Colônia 5 do transformante de eliminação de budA potencial de C. autoethanogenum DSM23693 com o iniciador Og12r. Seq ID 25. Resultado de sequenciação de nucleotídeo do produto de PCR da Colônia 6 do transformante de eliminação de budA potencial de C. autoethanogenum DSM23693 com o iniciador Og09f. Seq ID 26. Resultado da sequenciação de nucleotídeo da região alvo de budA C. autoethanogenum DSM23693 a partir do clone 6 com o iniciador Og12r. Seq ID 27 e 28: são descritas na Tabela 4 posteriormente. Seq 29 e 30: São descritas na Tabela 4 a seguir. SEQ ID 31: sequência de nucleotídeo do novo gene metil transferase com um promotor lac indutível. SEQ ID 32: sequência de proteína de uma nova metil transferase. SEQ ID 33: sequência de nucleotídeo do plasmídeo pGS20. SEQ_ID NO 34: Sequência de aminoácido de uma nova álcool desidrogenase de C. autoethanogeum, C. ljungdahlii e C. ragsdalei. SEQ_ID NO 35: Sequência de ácido nucleico do novo gene de álcool desidrogenase de C. autoethanogeum. SEQ_ID NO 36: Sequência do novo gene de álcool desidrogenase de C. ljungdahlii. SEQ_ID NO 37: Sequência de ácido nucleico do novo gene de álcool desidrogenase de C. ragsdalei. Seq. ID. 38: Sequência de nucleotídeo da enzima Málica 1 de C. autoethanogenum Seq. ID. 39: Sequência de aminoácido da enzima Málica 1 de C. autoethanogenum: Seq. ID. 40: Sequência de nucleotídeo da enzima Málica 2 de C. autoethanogenum Seq. ID. 41: Sequência de aminoácido da enzima Màlica 2 de C. autoethanogenum Seq. ID. 42: Sequência de nucleotídeo de Malato desidrogenase de C. autoethanogenum Seq. ID. 43: Sequência de aminoácido de Malato desidrogenase de C. autoethanogenum. Seq. ID. 44: Sequência de nucleotídeo de fosfato de Piruvato diquinase de C. autoethanogenum. Seq. ID. 45: Sequência de aminoácido de fosfato de Piruvato diquinase de C. autoethanogenum. Seq. ID. 46: Sequência de nucleotídeo de Piruvato carboxilase de C. autoethanogenum. Seq. ID. 47: Sequência de aminoácido de Piruvato carboxilase de C. autoethanogenum Seq. ID. 48: Sequência de nucleotídeo de PEP carboxiquinase de C. autoethanogenum. Seq. ID. 49: Sequência de aminoácido de PEP carboxiquinase de C. autoethanogenum Seq. ID. 50: Sequência de nucleotídeo da subunidade A de Fumarato hidratase de C. autoethanogenum Seq. ID. 51: Sequência de aminoácido da subunidade A de Fumarato hidratase de C. autoethanogenum. Seq. ID. 52: Sequência de nucleotídeo da subunidade B de Fumarato hidratase de C. autoethanogenum Seq. ID. 53: Sequência de aminoácido da subunidade B de Fumarato hidratase de C. autoethanogenum. Seq. ID. 54: Sequência de nucleotídeo de Fumarato redutase 1 de C. autoethanogenum Seq. ID. 55: Sequência de aminoácido de Fumarato redutase 1 de C. autoethanogenum. Seq. ID. 56: Sequência de nucleotídeo de Fumarato redutase 2 de C. autoethanogenum. Seq. ID. 57: Sequência de aminoácido de Fumarato redutase de C. autoethanogenum Seq. ID. 58: Sequência de nucleotídeo de Fumarato redutase 3 de C. autoethanogenum. Seq. ID. 59: Sequência de aminoácido de Fumarato redutase 3 de C. autoethanogenum Seq. ID. 60: Sequência de nucleotídeo da enzima Málica 1 de C. ragsdalei. Seq. ID. 61: Sequência de aminoácido da enzima Málica 1 de C. ragsdalei. Seq. ID. 62: Sequência de nucleotídeo de Malato desidrogenase de C. ragsdalei Seq. ID. 63: Sequência de aminoácido de Malato desidrogenase de C. ragsdalei. Seq. ID. 64: Sequência de nucleotídeo de Fosfato de Piruvato diquinase de C. ragsdalei. Seq. ID. 65: Sequência de aminoácido de Fosfato de Piruvato diquinase de C. ragsdalei. Seq. ID. 66: Sequência de nucleotídeo de Piruvato carboxilase de C. ragsdalei. Seq. ID. 67: Sequência de aminoácido de Piruvato carboxilase de C. ragsdalei Seq. ID. 68: Sequência de nucleotídeo de PEP carboxiquinase de C. ragsdalei. Seq. ID. 69: Sequência de aminoácido de PEP carboxiquinase de C. ragsdalei Seq. ID. 70: Sequência de nucleotídeo da subunidade A de Fumarato hidratase de C. ragsdalei Seq. ID. 71: Sequência de aminoácido da subunidade A de Fumarato hidratase de C. ragsdalei Seq. ID. 72: Sequência de nucleotídeo da subunidade B de Fumarato hidratase de C. ragsdalei. Seq. ID. 73: Sequência de aminoácido da subunidade B de Fumarato hidratase de C. ragsdalei Seq. ID. 74: Sequência de nucleotídeo de Fumarato redutase 1 de C. ragsdalei. Seq. ID. 75: Sequência de aminoácido de Fumarato redutase 1 de C. ragsdalei Seq. ID. 76: Sequência de nucleotídeo de Fumarato redutase 2 de C. ragsdalei Seq. ID. 77: Sequência de aminoácido de Fumarato redutase 2 de C. ragsdalei Seq. ID 78: Sequência a montante 5' ou braço de homologia do gene budA Clostridium ljungdahlii. Seq. ID 79: Sequência a jusante 3’ ou braço de homologia do gene budA Clostridium ljungdahlii. Seq. ID 80: Sequência a montante 5’ ou braço de homologia do gene budA Clostridium ragsdalei. Seq. ID 81: Sequência a jusante 3’ ou braço de homologia do gene budA Clostridium ragsdalei. Seq ID 82: Sequência de nucleotídeo da região alvo ClosTron no budA C. autoethanogenum DSM23693. Seq ID 83 Sequência de nucleotídeo da região alvo ClosTron targeting no 2,3 bdh C. autoethanogenum DSM23693. Seq ID 84: oligonucleotídeo Og42f usado para testes dos mutantes Δ2,3bdh ClosTron. Seq ID 85: oligonucleotídeo Og43r usado para varredura dos mutantes Δ2,3bdh ClosTron. Seq. ID 86: Sequência de nucleotídeo do produto de PCR 16s rRNA amplificado a partir de C. autoethanogenum DSM23693 Δ2, 3bdh ClosTron clone 2 obtido usando o iniciador fD1. Seq ID 87: Sequência de nucleotídeo do produto de PCR 16s rRNA amplificado a partir de C. autoethanogenum DSM23693 Δ2, 3bdh ClosTron clone 2 obtido usando o iniciador rP2. Seq. ID 88: Sequência de nucelotídeo do produto de PCR 16s rRNA de C. autoethanogenum DSM23693 Δ2,3bdh ClosTron clone 4 obtido usando o iniciador fD1. Seq ID 89: Sequência de nucleotídeo do produto de PCR 16s rRNA de C. autoethanogenum DSM23693 Δ2,3bdh ClosTron clone 4 obtido usando o iniciador rP2. Seq. ID 90: Sequência de nucleotídeo do produto de PCR 16s rRNA de C. autoethanogenum DSM23693 ΔbudA ClosTron clone 1 obtido usando o iniciador fD1. Seq ID 91: Sequência de nucleotídeo do produto de PCR 16s rRNA de C. autoethanogenum DSM23693 ΔbudA ClosTron clone 1 obtido usando o iniciador rP2. Seq. ID 92: Sequência de nucleotídeo do produto de PCR 16s rRNA PCR de C. autoethanogenum DSM23693 ΔbudA ClosTron clone 3 obtido usando o iniciador fD1. Seq ID e 93: Sequência de nucleotídeo do produto de PCR 16s rRNA de C. autoethanogenum DSM23693 ΔbudA ClosTron clone 3 obtido usando o iniciador rP2. Seq ID 94 Sequência de nucleotídeo do braço de homologia 5’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 2,3bdh. Seq ID 95: Sequência de nucleotídeo do braço de homologia 3’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 2,3bdh. Seq. ID 96 e 97: os iniciadores usados para amplificar o braço de homologia 5’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 2,3bdh. Seq. ID 98 e 99: os iniciadores usados para amplificar o braço de homologia 3' do gene C. autoethanogenum DSM23693 2,3bdh. Seq. ID 100 e 101: Iniciadores flanqueadores, que podem ser usados para confirmar a aliminação do gene C. autoethanogenum DSM23693 2,3bdh. Seq ID 102: Sequência de ácido nucleico do braço de homologia 5’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 SecAdh. Seq ID 103: Sequência de ácido nucleico do braçio de homologia 3’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 SecAdh. Seq. ID 104 e 105: iniciadores usados para amplificar o braço de homologia 5’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 2,3bdh. Seq. ID 106 e 107: iniciadores usados para amplificar o braço de homologia 3' do gene C. autoethanogenum DSM23693 2,3bdh. Seq. ID 108 e 109: iniciadores que podem ser usados pafra confirmar a eliminação do gene C. autoethanogenum DSM23693 SecAdh. Seq ID 110: sequência de nucleotídeo do cartucho alvo intron do grupo II para o gene C. autoethanogenum DSM23693 SecAdh. Seq. ID 111 e 112: iniciadores flanqueadores, que podem ser usados para confirmar a inativação insercional do gene C. autoethanogenum DSM23693 SecAdh. Seq ID 113: sequência de nucleotídeo do braço de homologia 5’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 alsS. Seq ID 114: sequência de nucleotídeo do braço de homologia 3’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 alsS. Seq. ID 115 e 116: sequências de iniciadores usados para amplificar o braço de homologia 5’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 alsS gene. Seq. ID 117 e 118: sequências de iniciadores usados para amplificar o braço de homologia 3’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 alsS. Seq. ID 119 e 120: sequências de iniciadores flanqueadores que podem ser usados para confirmar a eliminação do gene C. autoethanogenum DSM23693 alsS. Seq ID 120: sequência de nucleotídeo do braço de homologia 5’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvC. Seq ID 121: sequência de ácido nucleico do braço de homologia 3’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvC. Seq. ID 123 e 124: sequências de iniciadores usados para amplificar o braço de homologia 5’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvC. Seq. ID 125 e 126: sequências de iniciadores usados para amplificar o braço de homologia 3’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvC. Seq. ID 127 e 128: sequências de iniciadores flanqueadores que podem ser usados para confirmar a eliminação do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvC gene. Seq ID 129: sequência de nucleotídeo do braço de homologia 5’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvI. Seq ID 130: sequência de nucleotídeo do braço de homologia 3’ (Seq. ID 130) do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvI gene. Seq. ID 131 e 132: sequências de iniciadores usados para amplificar o braço de homologia 5’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvI. Seq. ID 133 e 134: sequências de iniciadores usados para amplificar o braço de homologia 3’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvI. Seq. ID 135 e 136: sequências de iniciadores flanqueadores que podem ser usados para confirmar a eliminação do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvI. Seq ID 137: sequência de nucleotídeo do braço de homologia 5’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvB. Seq ID 138: sequência de nucleotídeo do braço de homologia 3’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvB. Seq. ID 139 e 140: sequências de iniciadores usados para amplificar o braço de homologia 5’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvB. Seq. ID 141 e 142: sequências de iniciadores usados para amplificar o braço de homologia 3’ do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvB. Seq. ID 143 e 144: sequências de iniciadores flanqueadores que podem ser usados para confirmar a eliminação do gene C. autoethanogenum DSM23693 ilvB. Seq ID 145: exemplo da sequência de nucleotídeo alco do intron ClosTron de alsS. Seq ID 146: exemplo da sequência de nucleotídeo alvo do intron ClosTron de ilvC. Seq ID 147: exemplo da sequência de nucleotídeo alvo do intron ClosTron de ilvI. Seq ID 148: exemplo da sequência de nucleotídeo alvo do intron ClosTron de ilvB. Seq ID 149 e 150: oligonucleotídeos que podem ser usados para testar os mutantes alsS ClosTron. Seq ID 151 e 152: oligonucleotídeos que podem ser usados para testar os mutantes ilvC ClosTron. Seq ID 153 e 154: oligonucleotídeos que podem ser usados para testar os mutantes ilvI ClosTron. Seq ID 155 e 156: oligonucleotídeos que podem ser usados para testar os mutantes ilvB ClosTron.
[00068] Abreviações IUPAC padrão para serem suadas para todas as sequências, vide http://en.m.wikipedia.org/wiki/Nucleic acid notation#section 1. A título de exemplo: A Adenosina C Citidina G Guanosina T Timidina W A ou T S C ou G M A ou C K G ou T R A ou G Y C ou T B C, G ou T D A, G ou T H A, C ou T V A, C ou G N ou - Qualquer base ( não um intervalo), A, C, G, T
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00069] O que se segue constitui uma descrição da presente invenção, incluindo as formas de realização preferidas da mesma, fornecidas em termos gerais. A invenção é ainda elucidada a partir da exposição, fornecida sob o título “Exemplos” neste a seguir, que provê dados experimentais para o suporte da invenção, exemplos específicos de vários aspectos da invenção, e meios para que a invenção seja executada.
[00070] A invenção provê micro-organismos, capazes de produzir um ou mais produtos através da fermentação de um substrato, que compreende CO. Em ainda uma forma de realização particular, a presente invenção provê micro-organismos capazes de produzir etanol ou, etanol e um ou mais outros produtos, através da fermentação de um substrato, que compreende CO. O micro-organismo recombinante produz pelo menos uma quantidade reduzida de 2,3-butano diol e/ou de um preursor do mesmo, comparado a um microorganismo parental. Em ainda uma forma de realização, o micro-organismo não produz, de um modo substancial, qualquer 2,3- butano diol ou um precursor do mesmo, comparado a um micro-organismo parental.
[00071] Por meio de vários estudos de eliminação de gene, identificou- se, de um modo surpreendente, que a via de biossíntese de 2,3-butano diol é rompida em um micro-organismo acetogênico carobixidotrófico, o microorganismo sendo capaz de produzir níveis aumentados de formato, lactato,succinato, 2-oxo-gluterato, valina, leucina, isoleucina e etanol, quando comparado a um micro-organismo parental. Acredita-se também que os micro-organismos produzem níveis aumentados de piruvato e de compostos intermediários do ciclo de TCA, acetolactato, malato, fumarato, citrato, pois estes são precursores de succinato, 2-oxogluterato e da produção de valina, leucina e isoleucina. Isto apresenta um número de vantagens significativas. Uma vantagem primária consiste no aumento da eficiência da produção de etanol, que inclui níveis mais altos de etanol produzido. Sem desejarmos estar limitados a qualquer teoria particular, acredita-se que os níveis aumentados de valina, leucina, formato e piruvato resultam em que mais destas substâncias químicas estejam disponíveis para os micro-organismos para alimentar a produção de etanol. De um modo adicional, os caldos de fermentação precisam, de um modo frequente, ser suplementados com aminoácidos e com outras substâncias químicas, e um modo a que seja assegurada a viabilidade e a eficiência de produção dos micro-organismos durante a fermentação. A produção de valina, leucina, formato, lactato e piruvato por um microorganismo recombinante da invenção elimina a necessidade de suplementar o caldo de fermentação com estas substâncias químicas, o que pode resultar em uma economia de custos. Além disso, a redução ou a remoção da produção de 2,3-butano diol nos micro-organismos da invenção apresenta vantagens. O 2,3- butano diol pode ser tóxico para os micro-organismos e, deste modo, apresentar um efeito negativo sobre a fermentação e o crescimento. A redução ou a remoção de 2,3-butano diol a partir do caldo de fermentação também permite uma recuperação mais fácil do etanol a partir do caldo; de um modo típico, tanto o etanol como o 2,3-butano diol precisam ser recuperados juntos e então separados em um estágio subsequente. O 2,3-butano diol é também uma fonte para a contaminação microbiana potencial em um fermentador, pois ele é o substrato para muitos organismos indesejáveis. De um modo adicional, o succinato, 2-oxogluterato, formato, lactato, piruvato, valina, leucina e isoleucina possuem um valor econômico independente, pois eles podem ser usados em um número de processos comerciais e como compostos intermediários na produção de produtos químicos a jusante.
[00072] Demonstrou-se, pela primeira vez, a ruptura ou a eliminação de um gene não essencial em um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico. Deste modo, em ainda um outro aspecto, a invenção provê também micro-organismos acetogênicos carboxidotróficos, nos quais um ou mais genes essenciais foram rompidos, em comparação com um microorganismo parental, em conjunto com os métodos de produção de tais microorganismos e de uso destes micro-organismos. Um gene “não essencial” é aquele que codifica uma proteína, que não é necessária para a sobrevivência de um micro-organismo, de um modo tal que o micro-organismo pode sobreviver sem a suplementação da proteína. Exemplos de genes não essenciais incluem aqueles, que codificam a acetolactato decarboxilase e a 2,3-butano diol desidrogenase. Aqueles versados na técnica serão capazes de identificar os genes não essenciais por meio do uso de técnicas convencionais na técnica, incluindo as técnicas recombinantes para a ruptura de genes (tal como aqui descrito) em conjunto com ensaios convencionais para testar se tais modificações genéticas posuem um efeito sobre a sobrevivência dos micro-organismos.
[00073] Embora a descrição da invenção aqui a seguir esteja focalizada na ruptura da via de biossíntese de 2,3- butano diol através de modificação genética, deve ser ainda apreciado que os micro-organismos da invenção podem também incluir uma ou mais modificações genéticas adicionais, se desejado, (incluindo a ruptura de um ou mais genes não essenciais não associados com a via de biossítnese de 2,3-butano diol). No caso do aspecto da invenção, que se refere à ruptura de genes não essenciais, deve ser ainda apreciado que as modificações genéticas em genes, que codificam outras enzimas, diferentes da via de 2,3- butano diol, devem ser abrangidas.
[00074] De um modo adicional, embora a descrição a seguir possa ainda estar focalizada na produção e na recuperação de etanol como um produto principal, deve ser ainda apreciado que a invenção pode ser usada para aumentar o nível de produção de um ou mais produtos, diferentes do etanol, ou em adição ao etanol.
Definições
[00075] Tal como aqui referido, um “caldo de fermentação” é um meio de cultura, que compreende pelo menos um meio nutriente e células bacterianas.
[00076] Tal como aqui referido, um micro-organismo de passagem é um micro-organismo, no qual a enzima metil transferase é expressa e é distinto do micro-organismo de destinação.
[00077] Tal como aqui referido, um micro-organismo de destinação é um micro-organismo, no qual os genes incluídos em um construto/ vetor de expressão são expressados e é distinto do micro-organismo de passagem.
[00078] O termo “produto de fermentação principal” tem a intenção de compreender o produto de fermentação, que é produzido na concentração e/ ou rendimento mais alto.
[00079] Os termos “aumentando a eficiência”, “eficiência aumentada” e os similares, quando usados em relação a um processo de fermentação, incluem, mas não estão limitados a, aumentar um ou mais da taxa de micro-organismos de crescimento que catalisam a fermentação, a taxa de produção de produto e/ ou crescimento, o volume do produto desejado (tais que os alcoóis) produtos por volume de substrato consumido, a taxa de produção ou o nível de produção do produto desejado, e a proporção relativa do produto desejado, produzido em comparação com outros subprodutos da fermentação.
[00080] A frase “substrato que compreende monóxido de carbono” e os termos similares devem ser entendidos como incluindo qualquer substrato, no qual o monóxido de carbono esteja disponível para uma ou mais cepas de bactérias para o crescimento e / ou a fermentação, por exemplo.
[00081] A frase “substrato gasoso que compreende monóxido de carbono “e as frases e termos similares, incluem qualquer gás, que contenha um nível de monóxido de carbono. Em ainda certas formas de realização, o substrato contém pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% de CO, em volume, a partir de 20% a 70% de CO, em volume, e de 30% a 60% de CO, em volume, e de 40% a 55% de CO, em volume. Em ainda outras formas de realização particulares, o substrato compreende cerca de 25%, ou cerca de 30%, ou cerca de 35%, ou cerca de 40%, ou cerca de 45%, ou cerca de 50% de CO, ou cerca de 55% de CO, ou cerca de 60% de CO, em volume.
[00082] Embora não seja necessário que o substrato contenha qualquer hidrogênio, a presença de H2 não deve ser prejudicial à formação do produto, de acordo com os métodos da invenção. Em ainda formas de realização particulares, a presença de hidrogênio resulta em uma eficiência total melhorada da produção de álcool. Por exemplo, em formas de realização particulares, o substrato pode ainda compreende uma razão aprox. de 2:1, ou de 1:1, ou de 1:2 de H2:CO. Em ainda uma outra forma de realização, o substrato compreende cerca de 30%, ou menos, de H2 em volume, 20% ou menos de H2 em volume, cerca de 15% ou menos de H2 em volume ou cerca de 10% ou menos de H2 em volume. Em ainda outras formas de realização, a corrente do substrato compreende baixas concentrações de H2, por exemplo, de menos do que 5% ou menos do que 4%, ou ainda menos do que 3%, ou menos do que 2%, ou menos do que 1%, estão substancialmente isentos de hidrogênio O substrato pode também conter algum CO2 por exemplo, tal que de cerca de 1% a cerca de 80% de CO2 em volume, ou de 1% a cerca de 30% de CO2, em volume. Em ainda uma outra forma de realização, o substrato compreende menos do que ou igual a cerca de 20% de CO2,em volume. Em ainda outras formas de realização particulares, o substrato compreende menos do que ou igual a cerca de 15% de CO2 em volume, menos do que ou igual a cerca de 10% de CO2 em volume, menos do que ou igual a cerca de 5% de CO2, em volume, ou ainda substancialmente nenhum CO2.
[00083] Na descrição que se segue, as formas de realização da invenção são descritas em termos e distribuição e de fermentação de um “substrato gasoso contendo CO”. No entanto, deve ser ainda apreciado que o substrato gasoso pode ser provido em formas alternativas. Por exemplo, o substrato gasoso contendo CO pode ser ainda provido dissolvido em um líquido. De um modo essencial, um líquido é saturado com um monóxido de carbono contendo gás e então aquele líquido é adicionado ao biorreator. Isto pode ser então alcançado por meio do uso de metodologia convencional. A título de exemplo, um gerador de dispersão de microbolhas (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Number 3 /°Ctober, 2002) poderia ser usado. A título de um outro exemplo, o substrato gasoso contendo CO pode ser então adsorvido sobre um suporte sólido. Tais outros métodos alternativos são abrangidos através do uso do termo “substrato contendo CO” e dos similares.
[00084] Em ainda formas de realização particulares da invenção, o substrato gasoso contendo CO é um óleo industrial ou um gás de rejeito. “Rejeito industrial ou gases de exaustão” deve ser tomado, em um sentido amplo, de um modo a que sejam incluídos quaisquer gases, que compreendem o CO produzido através de um processo industrial e incluem os gases produzidos como um resultado da manufatura de produtos metálicos ferrosos, manufatura de produtos não ferrosos, processos de refino de petróleo, gaseificação de carvão, gaseificação de biomassa, produção de energia elétrica, produção de negro de fumo, e manufatura de coque. Ainda outros exemplos podem ser aqui providos em outros locais.
[00085] A não ser que o contexto o requeira de um outro modo, as frases “fermentação”, “processo de fermentação” ou “reação de fermentação” e os similares, tais como aqui usados, têm a intenção de abranger tanto a fase de crescimento como a fase de biossíntese do processo. Como será ainda aqui adicionalmente descrito, algumas formas de realização do biorreator podem ainda compreender um primeiro reator de crescimento e um segundo reator de fermentação. Como tais, a adição de metais ou de composição a uma reação de fermentação deveria ser então entendida como incluindo a adição a qualquer um ou a ambos destes reatores.
[00086] O termo “biorreator” inclui um dispositivo de fermentação, que consiste de um ou mais vasos e/ ou torres de um arranjo de tubulação, que inclui um Reator de Tanque Agitado Contínuo (CSTR), Reator de Célula Imobilizada (ICR), Reator de Leito de Gotejamento (TBR), Coluna de Borbulhamento, Fermentador de Levantamento de Gás, Misturador Estático, ou ainda um outro vaso ou dispositivo adequado para o contato gás-líquido. Tal como aqui adicionalmente descrito, em ainda algumas formas de realização, o biorreator pode ainda compreender um primeiro reator de crescimento e um segundo reator de fermentação. Como tal, quando com referência à adição do substrato ao biorreator ou à reação de fermentação, deve ser ainda entendido que está incluída a adição a qualquer um ou a ambos destes reatores, quando apropriado.
[00087] Quando usado em relação aos produtos de fermentação de acordo com a invenção “um ou mais produtos” e as frases similares são intencionados a incluir o etanol, succinato, piruvato, lactato, valina, formato, isoleucina, e leucina, por exemplo. Em ainda uma forma de realização, “um ou mais produtos” podem também incluir um ou mais de acetolactato, malato, fumarato, citrato, e 2- oxogluterato. Deve ser ainda apreciado que os métodos da invenção são aplicáveis a métodos destinados à produção e à recuperação de etanol ( de um modo isolado ou em combinação com outros produtos) ou a produção e a recuperação de produtos, outros que o etanol.
[00088] O termo “acetato” inclui tanto o sal de acetato isoladamente, como também uma mistura do ácido acético livre e do sal de acetato, tal que a mistura do sal de acetato e do ácido acético livre, presentes em um caldo de fermentação, tal como aqui descrito. A razão do ácido acético molecular para o acetato no caldo de fermentação depende do pH do sistema. Os termos succinato, piruvato, lactato, formato, acetolactato, malato, fumarato, citrato e 2-oxogluterato devem ser construídos de um modo similar.
[00089] A não ser que o contexto o requeira de um outro modo, a referência a qualquer composto neste, que pode existir em uma ou mais formas isoméricas (por exemplo, forma D, L, meso, S, R, cis or trans ) pode ser tomada de um modo a incluir genericamente qualquer um ou mais tais isômeros do composto. Por exemplo, a referência a “acetoína” deve ser ainda tomada de um modo a que seja incluída qualquer referência a qualquer um ou a ambos os isômeros D e L das mesmas.
[00090] “Ácidos nucleicos exógenos” são os ácidos nucleicos, que se originam exteriormente ao micro-organismo, no qual eles são introduzidos. Os ácidos nucleicos exógenos podem ser ainda derivados a partir de qualquer fonte apropriada, incluindo, mas não limitada a, micro-organismos, nos quais eles devem ser introduzidos, cepas ou espécies de organismos que diferem do organismo no qual eles devem ser introduzidos, ou eles podem ser ainda criados de um modo artifical ou recombinante. O ácido nucleico exógeno pode ser adaptado de um modo a que seja integrado no genoma do microorganismo, no qual ele deve ser introduzido, ou para permanecer em um estado extracromossômico.
[00091] A “via de biossíntese de 2,3-butano diol” é uma via de reações, que incluem a conversão de piruvato em acetolactato, acetolactato em acetoína, e acetoína em 2,3-butano diol.
[00092] Tal como aqui usado, “ a ruptura da via de biossítnese de 2,3- butano diol” e as frases similares, tem a invenção de compreender que a produção de 2,3- butano diol é reduzida, ou em ainda uma forma de realização, substancialemnte eliminada.
[00093] Um “precursor de 2,3-butano diol” tem a intenção de abranger acetoína e acetolactato.
[00094] Uma enzima é “capaz de converter” um primeiro composto ou substrato em um segundo composto ou produto, se, em sua forma ativa, ele puder catalisar uma reação, na qual pelo menos uma porção do primeiro composto é convertida no segundo composto.
[00095] A referência a “álcool desidrogenases” deve ser tomada de um modo a incluir as álcool desidrogenases, que são capazes de catalisar a conversão de cetonas (tal que a acetoína) para alcoóis secundários (tais que o 2,3-butano diol), ou vice-versa. Tais álcool desidrogenases incluem as álcool desidrogenases secundárias e as álcool desidrogenases primárias. Uma “ álcool desidrogenase secundária” é uma que pode converter as cetonas ( tais que a acetoína) a alcoóis secundários ( tais que 2,3-butano diol), ou vice- versa. Uma “álcool deidrogensase primária” é aquela, que pode converter aldeídos a alcoóis primários, ou vice-versa; no entanto,. Um número de álcool desidrogenases primárias pode ser também capaz de catalisar a conversão de cetonas e alcoóis secundários, ou vice-versa. Estas álcool desidrogenases podem ser também referidas como a “álcool desidrogenases primárias- secundárias”. Deste modo, em certas formas de realização da invenção, a referência a “2,3-butano diol desidrogenase” pode ser tomada como incluindo a referência a 2,3- butano diol desidrogenases, que podem ser categorizadas como álcool desidrogenases primárias, secundárias ou primário-secundárias.
[00096] Uma “modificação genética que rompe” a via de biossíntese de 2,3-butano diol ou a expressão ou atividade de uma ou mais enzimas de acordo com a invenção pode ser tomada amplamente como incluindo qualquer modificação genética, que pelo menos reduz a biossíntese de 2,3- butano diol, a expressão ou a atividade de uma ou mais enzimas ou que evita, de um modo substancial, a produção de 2,3-butano diol. A frase deve ser tomada como incluindo, por exemplo: a modificação de um gene que codifica uma ou mais enzimas, incluindo uma modificação em um elemento regulatório genético envolvido na expressão de um gene; introdução de um ácido nucleico, que produz uma proteína, que reduz ou inibe a atividade de uma ou mais das enzimas, ou que reduz ou evita a expressão de uma ou mais das enzimas; introdução de um ácido nucleico, que expressa um ácido nucleico, que é adaptado para bloquear a expressão de um gene ( por exemplo, RNA antissentido, SiRNA (RNA de pequena interferência), CRISPR (Repetições Palindrômicas de Curto Interespaçamento Regularmente Aglomeradas); redução ou inibição de uma proteína, que é requerida para a expressão ou atividade de uma ou mais das enzimas através da introdução de uma modificação em um gene que codifica a proteína. Deve ser ainda apreciado que uma proteína, que é requerida para a expressão ou a atividade de uma ou mais das enzimas pode agir diretamente sobre um gene ou uma ou mais enzimas, e pode ainda agir indiretamente através de um outro composto. De um modo similar, uma proteína, que reduz ou que inibe a atividade ou expressão de uma ou mais enzimas pode agir diretamente sobre o gene ou sobre a uma ou mais enzimas, ou pode agir indiretamente através de um outro composto.
[00097] Uma “modificação genética” deve ser tomada amplamente e tem a intenção de incluir, por exemplo, a introdução de um ou mais ácidos nucleicos exógenos em um micro-organismo, introduzindo uma mutação em um sítio genético, adicionando ou removendo a partir do genoma um ou mais nucleotídeos, a substituição do um ou mais nucleotídeos por diferentes nucleotídeos, a substituição de um gene, a remoção de um gene, a adição de um gene, e os similares.
[00098] Um “micro-organismo parental” é um micro-organismo usado para gerar um micro-organismo recombinante da invenção. Em ainda uma forma de realização, o micro-organismo parental pode ser um, que ocorra na natureza (isto é, um micro-organismo do tipo selvagem) ou um que tenha sido previamente modificado (um micro-organismo recombinante ou modificado geneticamente). Em ainda outras formas de realização da invenção, referentes a micro-organismos que produzem uma quantidade reduzida ou substancialmente nenhum 2,3- butano diol, o micro-organismo parental é aquele, que inclui uma via de 2,3-butano diol funcional (incluindo aquelas que ocorrem na natureza ou aquelas que foram previamente modificadas). Exemplos de micro-organismos parental, que incluem uma via de biossíntese de 2,3-butano diol funcional, incluem Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium coskatii e os siolados relacionados.
[00099] Uma via de biossíntese de 2,3- butano diol “funcional” é aquela, na qual o micro-organismo pode converter o piruvato para 2,3- butano diol. Em ainda uma forma de realização particular, a via inclui a conversão de piruvato para acetolactato, acetolactato para acetoína, e de acetoína para 2,3- butanediol “funcional”. Em ainda uma forma de realização particular, a conversão de piruvato para acetolactato é catalisada por uma acetolactato sintase, a conversão de acetolactato para acetoína é catalisada por uma acetolactato decarboxilase, e a conversão de acetoína para 2,3-butano diol é catalisada por uma 2,3- butano diol desidrogenase ou por uma acetoína redutase.
[000100] Os termos “construtos” ou “vetores” de ácido nucleico e os termos similares devem ser tomados amplamente, de um modo a incluir qualquer ácido nucleico (incluindo DNA e RNA) adequado para o uso como um veículo, de um modo a que o material genético seja transferido ao interior de uma célula. Os termos devem ser então tomados como incluindo plasmídeos, vírus (incluindo bacteriófagos), cosmídeos e cromossomas artificias. Os construtos ou vetores podem ainda incluir um ou mais elementos regulatórios, uma origem de replicação, um sítio de multiclonagem e/ ou um marcador selecionável, dentre outros elementos, sítios e marcadores. Em ainda uma outra forma de realização particular, os construtos ou vetores são ainda adaptados para permitir a ruptura de um gene nativo em um microorganismo parental. Em ainda uma outra forma de realização, os construtos ou vetores são adaptados para permitir a expressão de um ou mais genes codificados pelo construto ou vetor. Os construtos ou vetores de ácido nucleico incluem os ácidos nucleicos nus, assim como os ácidos nucleicos formulados com um ou mais agentes, de um modo a que seja facilitado o fornecimento a uma célula (por exemplo, ácido nucleico conjugado a lipossoma, um organismo, no qual o ácido nucleico está contido).
[000101] Em todo este relatório, é provida a informação da sequência exemplar para as enzimas aplicáveis à invenção (por exemplo, acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase, 2,3- butano diol desidrogenase, acetoína redutase). Esta informação é provida de um modo a que sejam identificadas as enzimas aplicáveis à invenção e de um modo a permitir com que uma pessoa versada na técnica possa praticar formas de realização específicas da invenção sem uma experimentação indevida. Deve ser ainda apreciado que as sequência de ácido nucleico e de aminoácido para as enzimas podem ainda diferir de um micro-organismo para o outro. Deste modo, a invenção não deve ser construída como sendo limitada a estas formas de realização específicas, mas de um modo preferido estendendo-se para a ruptura de enzimas tendo diferentes sequências, mas que são capazes de catalisar a conversão de piruvato para acetolactato, a conversão de acetolactato para acetoína, e/ ou a conversão de acetoína para 2,3-butano diol. De um modo típico, tais enzimas deverão ter pelo menos aproximadamente 75% de identificação de sequência de aminoácido com uma enzima aqui exemplificada. Em ainda outras formas de realização particulares, tais enzimas deverão ter aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identificação de sequência a uma enzima aqui exemplificada. No nível de ácido nucleico, os genes que codificam tais enzimas variantes deverão ter pelo menos aproximadamente uma homologia de 75% de sequência a um ácido nucleico que codifica uma enzima aqui exemplificada. Em ainda formas de realização particulares, tais ácidos nucleicos deverão ter, pelo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de homologia de sequência a um ácido nucleico, que codifica uma enzima aqui exemplificada.
[000102] Deve ser também apreciado que a enzima variante não precisa ter o mesmo nível de atividade que uma enzima aqui especificamente exemlificada. Tudo o que é requerido é que ela possa pelo menos algum nível de atividade na catalisação da conversão de interesse. As pessoas versadas na técnica irão prontamente apreciar outras tais enzimas, de um modo particular à luz da informação aqui contida. Os ensaios de enzima para o uso na avaliação das atividades de enzimas para a via de 2,3-butano diol incluem, por exemplo, o ensaio Voges-Proskauer testare descrito por Speckman and Collins (Specificity of the Westerfeld Adaptation of the Voges-Proskauer Test, 1982, Appl. Environ. Microbiol. 44: 40-43) ou Dulieu and Poncelet (Spectrophotometric assay of a-acetolactate decarboxylase, 1999, Enzy and Microbiol Technol, 25, 537-42).
Micro-organismos
[000103] Tal como aqui antes discutido, a invenção provê um microorganismo recombinante, capaz de usar o monóxido de carbono para produzir um ou mais produtos (em uma forma de realização particular, o etanol como o produto principal) e produzir uma quantidade reduzida ou substancialmente inexistente de 2,3-butano diol e/ ou de um precursor do mesmo, comparado a um micro-organismo parental. O micro-organismo compreende ainda uma ou mais modificações genéticas (comparadas a um micro-organismo parental) que rompe a via de biossíntese de 2,3-butano diol.
[000104] Tal como acima notado, em uma forma de realização, o microorganismo produz o etanol como o produto principal. Em ainda uma forma de realização, o micro-organismo também produz um ou mais de formato, lactato, piruvatyo, succinato, valina, leucina, isoleucina. Em ainda uma forma de realização particular, o micro-organismo é adpatado para produzir uma quantidade aumentada de um ou mais de etanol, formato, lactato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, comparada ao micro-organismo parental. EM ainda certas formas de realização, o micro-organismo produz um ou mais de acetolactato, malato, citrato, fumerato, 2-oxogluterato. Em ainda uma outra modalildade particular, o micro-organismo é adpatado de um modo a produzir uma quantidade aumentada de um ou mais de acetolactato, malato, fumerato, 2-oxogluterato.
[000105] A uma ou mais modificações genéticas rompem a expressão e/ ou a atividade de uma ou mais enzimas, capazes de converter o piruvato a acetolactato, acetolactato a acetoína, acetoína a 2,3- butano diol. Em ainda certas formas de realização, a uma ou mais modificações genéticas rompem a conversão de piruvato a acetolactato apenas, a conversão de acetolactato para acetoína apenas, ou a conversão de acetoína para 2,3- butano diol apenas. Em ainda outras forma de realização, a uma ou mais modificações genéticas comprem duas ou três destas conversões.
[000106] Em ainda uma forma de realização, a uma ou mais enzimas, capazes de converter o piruvato para acetolactato, são uma acetolactato sintase (alsS).
[000107] A atividade de acetolactato sintase é capaz de converter o piruvato para acetolactato e é essencial para a produção do aminoácido de cadeia ramificada (que inclui valina, leucina, isoleucina) ( Figura 1). Uma ou mais das enzimas tendo a atividade de acetolactato sintase podem ser expressas em um micro-organismo parental. A sequência de aminoácido exemplar a partir de C. autoethanogenum (AEI90719.1, AEI90730.1, AEI90731.1, AEI90713.1, AEI90714.1), C. ljungdahlii (ADK15104.1, ADK15104.1, ADK15105.1, ADK15400.1, ADK15400.1), e C. ragsdalei (AEI90734.1, AEI90734.1, AEI90735.1, AEI90727.1, AEI90727.1) e as sequências de ácido nucleico respectivas de C. autoethanogenum (HQ876013.1, HQ876023.1, HQ876021.1), C. ljungdahlii (CP001666.1 - CLJU_c38920, CLJU_c32420, CLJU_c20420-30), e C. ragsdalei (HQ876014.1, HQ876024.1, HQ876022.1) podem ser obtidas a partir do GenBank. No entanto, como aqui antes observado, a sequência do gene que codifica tais enzimas e a sequência de aminoácido das enzimas pode ainda variar de um micro-organismo para o outro.
[000108] Em ainda certas formas de realização, um micro-organismo parental pode ainda conter mais do que uma enzima, que seja capaz de converter o piruvato para acetolactato. Quando um micro-organismo parenteral contém mais do que uma enzima, que é capaz de converter o piruvato para o acetolactato, uma ou mais modificações genéticas podem ser introduzidas, de um modo que a expressão e/ ou a atividade de duas ou mais enzimas seja então rompida. Quando mais do que uma enzima está presente em um micro-organismo parental, a ruptura de mais do que uma tal enzima pode ainda ter o efeito de aumentar a produção de succinato, de um ou mais intermediários do ciclo de TCA e/ ou etanol acima do nível, que pode ser alcançada apenas de uma única enzima for rompida. Os níveis de produção podem ser ainda adicionalmente aumentados com a ruptura de cada enzima adicional, presente no micro-organismo parental. Embora a ruptura da expressão e/ou da atividade da atividade de todas tais enzimas possa prover alguma vantagem em termos da produção de produtos desejados, os inventores não julgam ser necessário romper a expressão e/ ou a atividade de todas tais enzimas, de um modo a que sejam obtidos os benefícios de acordo com a invenção.
[000109] Em ainda uma outra forma de realização, pelo menos duas, três, quatro ou cinco enzimas, capazes de converter piruvato para acetolactato, são rompidas.
[000110] Nas formas de realização da invenção, em que a conversão de piruvato para acetolactato é substancialmente ou completamente bloqueada, o crescimento de, e a fermentação pelo micro-organismo podem ainda requerer a suplementação com um ou mais ainoácidos, incluindo, por exemplo, valina, leucina e isoleucina. Isto pode ser ainda alcançado através de quaisquer meios, que tornem o(s) aminoácido(s) disponível (eis) para o microorganismo. A título de exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser então adicionados a uma cultura, caldo ou meio de fermentação, a uma cultura de micro-organismos, e/ ou a um caldo de fermentação. Em ainda certas formas de realização, o aminoácido (s) podem(m) ser adicionado(s) diretamente ao meio ou ao caldo, ou adicionado ainda sob a forma de um extrato, por exemplo de um extrato de levedura.
[000111] Em ainda uma forma de realização, a uma ou mais enzimas, capazes de converter o acetolactato para acetoína é uma acetolactato decarboxilase (BudA).
[000112] A atividade de acetolactato decarboxilase é capaz de converter o acetolactato para acetoína (Figura 1). Uma ou mais enzimas tendo a atividade de acetolactato decarboxilase podem ser expressas em um microorganismo parental. Os a informação de sequência dos aminoácidos exemplares (AEI90717.1, ADK13906.1, AEI90718.1) e do ácido nucleico (HQ876011.1, CP001666.1 - CLJU_c08380, HQ876012.1) para a acetolactato decarboxilase de C. autoethanogeum, C. ljungdahlii e C. ragsdalei pode ser obtida a partir do GenBank. No entanto, tal como aqui acima observado, a sequência do gene, que codifica tais enzimas, e a sequência de aminoácido das enzimas pode variar a partir de um micro-organismo para o outro.
[000113] Em ainda certas formas de realização, um micro-organismo parental pode conter mais do que uma enzima, que seja capaz de converter o acetolactato para acetoína. Quando um micro-organismo parental contiver mais do que uma tal enzima, uma ou mais modificações genéticas podem ser introduzidas, de um modo tal que a expressão e/ ou a atividade de duas ou mais enzimas seja então rompida. Quando mais do que uma tal enzima estiver presente em um micro-organismo parental, a ruptura de mais do que uma enzima pode ainda ter o efeito de aumentar a produção de valina, leucina, isoleucina, etanol, lactato, formato e succinato, e/ ou de um ou mais intermediários de ciclo de TCA a acima do nível que pode ser alcançado se apenas uma única enzima for rompida. Os níveis de produção podem ser ainda aumentados com a ruptura de cada enzima adicional, presente no microorganismo parental. Embora a ruptura da expressão e/ ou da atividade de todas tais enzimas possa ainda prover alguma vantagem em termos de produção dos produtos desejados, não julga-se ser necessário romper a expressão e/ ou a atividade de todas tais enzimas, de um modo a que sejam então obtidos os benefícios da invenção.
[000114] Em ainda uma forma de realização, a uma ou mais enzimas, capazes de converter a acetoína para 2,3- butano diol, é selecionada a partir do grupo, que compreende uma 2,3-butano diol desidrogenase (2,3- bdh) e uma cetoína redutase.
[000115] A atividade de 2,3-butano diol desidrogenase é capaz de converter a acetoína para 2,3- butano diol (Figura 1). A informação de sequência de aminoácido exemplar (AEI90715.1, ADK15380.1, AEI90716.1) e de ácido nucleico (HQ876009.1, CP001666.1 - CLJU_c23220, HQ876010.1) information para 2,3-butano diol desidrogenase de C. autoethanogeum, C. ljungdahlii e C. ragsdalei pode ser obtida a partir do GenBank. Uma ou mais enzimas tendo uma atividade de acetolactato sintase podem ser expressa em um micro-organismo parental. A título de exemplo, identificou-se que C. autoethanogenum, C. ragsdalei e C. ljungdahlii incluem uma álcool desidrogenase primária- secundária, capaz de converter a acetoína para 2,3-butano diol. A informação de sequência exemplar para esta enzima é provida na SEQ ID nos. 34, 35, 36, e 37. No entanto, tal como acima observado, a sequência do gene, que codifica tais enzimas e a sequência de aminoácido das enzimas pode ainda variar de um micro-organismo para o outro.
[000116] Em ainda certas formas de realização, um micro-organismo parental pode ainda conter mais do que uma enzima, capaz de converter a acetoína para 2,3- butano diol. Quando um micro-organismo parental contém mais do que uma tal enzima, uma ou mais modificações genéticas podem ser introduzidas, de um modo tal que a expressão e/ ou a atividade de duas ou mais das enzimas seja rompida. Quando mais do que uma tal enzima estiver presente em um micro-organismo parental, a ruptura de mais do que uma tal enzima pode ainda apresentar o efeito de aumentar a produção de valina, leucina, isoleucina, etanol, lactato, formato e succinato, e/ ou de um ou mais intermediários de ciclo de TCA a acima do nível, que pode ser alcançado se apenas uma única enzima for rompida. Os níveis de produção podem ser adicionalmente aumentados com a ruptura de cada enzima adicional, presente no micro-organismo parental. Embora a ruptura da expressão e/ ou da atividade de todas tais enzimas possa ainda prover alguma vantagem em termos de produção de produtos desejados, os inventores não julgam que seja necessário romper a expressão e/ ou a atividade de todas tais enzimas, de um modo a que sejam então obtidos os benefícios da invenção.
[000117] Em ainda uma outra forma de realização, pelo menos duas ou três enzimas, capazes de converter acetoína para 2,3- butano diol são rompidas.
[000118] Em ainda uma forma de realização, o micro-organismo é selecionado a partir do grupo de organismos carbocidotróficos acetogênicos, compreendendo as espécies Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Moorella thermoacetica, Sporomusa ovate, Butyribacterium methylotrophicum, Blautia producta, Eubacterium limosum, Thermoanaerobacter kiuvi.
[000119] Estes acetógenos carboxidotróficos são definidos por sua capacidade para utilizar e crescer quimioautrotroficamente em fontes de um carbono gasoso (C1), tais que o monóxido de carbono (CO) e dióxido de carbono (CO2) com monóxido de carbono (CO) e/ ou hidrogênio (H2) como uma fonte de energia, sob condições anaeróbicas, formando acetil- CoA, acetato e ainda outros produtos. Eles compartilham o mesmo modo de fermentação da via acetil-CoA redutiva ou Wood-Ljunfdahl, e são ainda definidos pela presença do conjunto de enzimas, que consite de Monóxido de carbono desidrogenase (CODH), Hidrogenase, Formato desidrogenase, Formil- etraidrofolato sintetase, Metileno- tetraidrofolato desidrogenase, Formil-tetraidrofolato cicloidrolase, Metileno- tetraidrofolato desidrogenase, Formil-tetraidrofolato cicloidrolase, Metileno-tetraidrofolato redutase, e monóxido de carbono- desidrogenase/ Acetil- CoA sintase ( CODH/ ACS), cuja combinação é característica e única para este tipo de bactérias (Drake, Küsel, Matthies, Wood, & Ljungdahl, 2006). Em contraste com o crescimento quimioeterotrófico de bactérias de fermentação de açúcar, que convertem o substrato em biomassa, os metabólitos secundários e o piruvato a partir do qual produtos são formados (ou através de actil-CoA ou diretamente em acetógenos o substrato forma canais diretamente em acetil-CoA, a partir dos quais produtos, biomassa e metabólitos secundários são então formados.
[000120] Em ainda uma forma de realização, o micro-organismo é selecionado a partir de um aglomerado de Clostridia carboxidotrófico, que compreende a espécies C. autoethanogenum, C. ljungdahlii, e “C. ragsdalei” e os siolados relacionados. Estes incluem, mas não estão limitados, às cepas C. autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Naveau, & Nyns, 1994), C. autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) (WO/2009/064200), C. autoethanogenum LBS1561 (DSM23693), C. ljungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Miller, & Yang, 1993), C. ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (patente US 5.593.886), C. ljungdahlii C-01 (ATCC 55988) (patente US 6.368.819), C. ljungdahlii O-52 (ATCC 55989) (patente US 6.368.819), ou “C. ragsdalei P11T“ (ATCC BAA-622) (WO 2008/028055), e os isolados relacionados, tais que “C. coskatii” (patente US US 2011/0229947), e as cepas mutantes dos mesmos, tais que C. ljungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. PhD thesis, North Carolina State University, 2010).
[000121] Estas cepas formam um subaglomerado dentro do aglometado de rRNAClostridial I (Collins et al., 1994), tendo pelo menos 99% de identidade no nível do gene rRNA 16S, embora sendo uma espécie distinta, tal como determinado através de reassociação de DNA-DNA e de experimentos de impressão digital de DNA (WO 2008/028055, patente US 2011/0229947).
[000122] As cepas deste aglomerados são definidas através de características comuns, tendo tanto um genótipo como um fenótipo similar, e elas todas compartilham o mesmo modo de conservação de energia e de metabolismo fermentativo. As cepas deste aglomerado carecem de citocromos e conservam a energia por meio de um complexo Rnf.
[000123] Todas as cepas deste aglomerado possuem um tamanho de genoma de cerca de 4.2 MBp (Kopke et al., 2010) e uma composição de CG de em torno de 32 mol % (Abrini et al., 1994; Kopke et al., 2010; Tanner et al., 1993) (WO 2008/028055; patente US 2011/0229947), e conservam os operons de gene chave essenciais, que codificam para as enzimas da via Wood-Ljungdahl (Monóxido de carbono deisdrogenase, Formil- tetraidrofolato sintetase, Metileno-tetraidrofolato desidrogenase, Formil- tetraidrofolato cicloidrolase, Metileno-tetraidrofolato redutase, e Monóxido de carbono desidrogenase/Acetil-CoA sintase), hidrogenase, formato desidrogenase, complexo Rnf (rnfCDGEAB), piruvati:ferredoxina oxidorredutase, aldeído:ferredoxina oxidorredutase (Kopke et al., 2010, 2011). A organização e o número de genes da via Wood-Ljungdahl, responsáveis pela absorção de gás, foram verificados ser os mesmos em todas as espécies, a despeito de diferenças nas sequências de amino ácido e de ácido nucleico (Kopke et al., 2011).
[000124] As cepas possuem todas uma morfologia e tamanho similares (células com crescimento logarítmico estão entre 0,5-0,7 x 3-5 μm), são mesofílicas (temperatura de crescimento ótimo entre 30-37 °C) e estritamente anaeróbicas (Abrini et al., 1994; Tanner et al., 1993)(WO 2008/028055). Além disso, elas todas compartilham as mesmas características filogenéticas principais, tal que a mesma faixa de pH (pH 4-7,5, com um pH inicial ótimo de 5,5-6), um crescimento autotrófico forte em gases contendo CO com taxas de crescimento similares, e um perfil metabólico e ácido acético como o produto final de fermentação principal, com pequenas quantidades de f 2,3- butano diol e de ácido láctico formadas sob certas condições (Abrini et al., 1994; Kopke et al., 2011; Tanner et al., 1993)(WO 2008/028055). A produção de indol foi ainda observada com todas as espécies. No entanto, as espécies se diferenciam na utilização do substrato de vários açúcares (por exemplo, ramnose, arabinose), ácidos (por exemplo. gluconato, citrato), aminoácidos (por exemplo arginina, histidina), ou outros substratos (por exemplo. betaina, butanol). Algumas das espécies foram ainda verificadas como sendo auxotróficas para certas vitaminas (por exemplo, tiamina, biotina) enquanto que várias outras não o foram. A redução dos ácidos carboxílicos a seus alcoóis correspondentes foi apresentada em uma faixa destes organismos (Perez, Richter, Loftus, & Angenent, 2012).
[000125] As características descritas são, deste modo, não específicas para um organismo, tal que C. autoethanogenum ou C. ljungdahlii, mas de um modo preferido, as características para Clostridia que sintetiza etanol, caroxidotrópico. Deste modo, pode ser ainda antecipado que a invenção trabalha por meio destas cepas, embora possam ainda existir diferenças em seu desempenho.
[000126] Em ainda certas formas de realização, o micro-organismo parental é selecionado a partir do grupo, que compreende Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, e Clostridium ragsdalei. Em ainda uma forma de realização, o grupo também compreende Clostridium coskatii. Em ainda uma outra forma de realização particular, o micro-organismo e origem é o Clostridium autoethanogenum DSM23693.
[000127] Os micro-organismos parental podem ser modificados para alcançar os micro-organismos da invenção por meio do uso de qualquer número de técnicas conhecidas de ácido nucleico recombinante e de transformação. Tais técnicas são descritas, por exemplo, em Sambrook et al, (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). A título de exemplo, a motodologia descrita na seção de exemplos a seguir pode ser usada.
[000128] A título de exemplo geral, no caso de introdução de uma mutação em um gene ou pela ruptura ou eliminação de um gene de um outro modo, um construto ou vetor de ácido nucleico apropriado pode ser designado para que seja integrado no micro-organismo parental, de um modo a que o gene seja rompido. Tais construtos irão, de um modo típico, incluir as sequências de ácido nucleico (braços) homólogas para uma região no interior de, ou que flanqueie o gene a ser rompido, o que permite com que a recombinação homóloga possa ocorrer, e a introdução de uma mutação,. A excisão de uma região do ácido nucleico a partir do gene, ou a substituição de uma região do gene com um ácido nucleico no contraste, pode então ocorrer. Embora seja preferido que os braços nos construtos possuam 100% de complementaridade para a região no genoma, para a qual eles são objetivados, isto não é necessário, contanto que a sequência seja suficientemente complementar, de um modo a que permita a recombinação objetivada com a região genética de interesse. De um modo típico, os braços deverão ter um nível de homologia que permitira a hibridização a uma região objetivada, sob condições rigorosas, tal como definido em Sambrook et al 1989.
[000129] Aqueles versados na técnica irão apreciar sequências de ácido nucleico suficientes para permitir a recombinação homóloga objetivada e a integração de um ácido nucleico exógeno ao interior do genoma de um microorganismo parental, tendo em consideração a informação de sequência disponível para as enzimas envolvidas na via de biossíntese de 2,3-butano diol. No entanto, a título de exemplo, as Seq ID 3, 4 e 78-81) C. ljungdahlii, designadas a partir da informação de sequência de ácido nucleico no (CP001666.1). "A título de exemplo adicional, as sequências flanqueadoras de enzimas, que codificam genes a serem rompidos de acordo com a invenção, podem ainda ser determinadas a partir da informação de sequência genômica de micro-organismos relevantes. A título ainda de um exemplo particular, as sequências de flanqueamento em C.ljundahlii podem ser determinadas a partir da informação no GenBank CP001666.1
[000130] A título de um outro exemplo geral, em que um ácido nucleico é introduzido no interior de um micro-organismo parental, de um modo a expressar uma proteína ou ácido nucleico, que inibe a expressão ou a atividade de uma enzima na via de biossíntese de 2,3- butano diol, ou para expressar uma proteína, que aumenta a expressão de um composto que inibe a expressão ou a atividade da enzima na via de biossíntese de 2,3-butano diol, o construto poderá ser designado, de um modo a que possa permitir a expressão da proteína no micro-organismo. De um modo típico, ele irá incluir os elementos regulatórios apropriados, incluindo um promotor. Promotores constitutivos ou indutíveis podem ser usados.
[000131] Quando a invenção emprega a ruptura direta de um gene através da introdução de uma mutação ou similar, o construto ou o vetor, usado para transformar o micro-organismo parental, será adaptado para ser integrado no interior do genoma do micro-organismo, tal como mencionado acima. No caso da expressão de uma proteína ou ácido nucleico, que está adaptado para romper a expressão ou a atividade de uma enzima na via de biossíntese de 2,3-butano diol, ou para aumentar a expressão ou a atividade de um inibidor de uma enzima envolvido na via, os construtos podem permanecer extracromossomiais mediante a transformação de um microorganismo parental ou podem ainda ser adaptados para a integração no interior do genoma do micro-organismo. Deste modo, os construtos de uso na invenção podem ainda incluir sequências de nucleotídeo, adaptadas para auxiliar a integração (por exemplo, uma região que permita a recombinação homóloga e a integração objetivada no interior do genoma hospedeiro) ou a expressão e a replicação de um construto extracromossomial (por exemplo, origem da replicação, promotor e outras sequências regulatórias).
[000132] Os construtos de ácido nucleico de uso na invenção podem ser construídos por meio do uso qualquer número de técnicas convencionais na técnica. Por exemplo, a síntese química ou as técnicas recombinantes podem ser usadas. Tais técnicas são descritas, por exemplo, em Sambrook et al (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Ainda outras técnicas exemplares adicionais são descritas na seção de Exemplos que se segue. De um modo essencial, os genes individuais, elementos regulatórios, braços homólogos e os similares estarão ligados, de um modo operável, um com o outro, de um modo a que possam executar a sua função desejada. Os vetores apropriados para o uso na invenção serão apreciados por aqueles de habilidade ordinária na técnica. No entanto, a título de exemplo, os vetores que se seguem podem ser adequados: pMTL, pIMP, pJIR e os plasmídeos exemplificados na seção de Exemplos que se segue.
[000133] Deverá ser ainda apreciado que os ácidos nucleicos de uso na geração dos micro-organismos da invenção podem estar em qualquer forma apropriada, incluindo RNA, DNA, ou cDNA, incluindo os ácidos nucleicos de filamento único e de filamento duplo.
[000134] O um ou mais ácidos nucleicos exógenos podem ser fornecidos a um micro-organismo parental como ácidos nucleicos nus ou podem ser formulados com um ou mais agentes, de um modo a que seja facilitado o processo de transformação (por exemplo, o ácido nucleico conjugado a lipossoma, um organismo no qual o ácido nucleico está contido). O um ou mais ácidos nucleicos podem ser DNA, RNA, ou ainda combinações dos mesmos, tal como apropriado.
[000135] Os micro-organismos da invenção podem ser preparados a partir de um micro-organismo parental e de um ou mais ácidos nucleicos exógenos, usando qualquer número de técnicas conhecidas na técnica para a produção de micro-organismos recombinantes. Apenas a título de exemplo, a transformação (incluindo a transdução ou a transfecção) podem ser alcançadas através de eletroporação, conjugação, indução de profago, ou competência química e natural. As técnicas de transformação adequadas são descritas, por exemplo, em Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989.
[000136] A título ainda de um outro exemplo, as técnicas de eletroporação descritas em: Koepke et al. 2010, Poc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 107: 13087-92;, PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905; Straetz et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:1033-37; Mermelstein et al., 1992, Biotechnology, 10, 190-195; Jennert et al., 2000, Microbiology, 146: 30713080; Tyurin et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70: 883-890; podem ser usadas. A título ainda de um outro exemplo, as técnicas de indução de profago, tais como descritas em Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project Western Kentucky University, podem ser usadas. Ainda a título de exemplo, os métodos de conjugação descritos em Herbert et al., 2003, FEMS Microbiol. Lett. 229: 103-110 ou Williams et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 819-826 poderiam ser empregados.
[000137] Em certas formas de realização, devido aos sistemas restritivos que estão ativos no micro-organismo a ser transformado, é necessário metilado para o ácido nucleico a ser introduzido no interior do microorganismo. Isto pode ser executado por meio do uso de uma variedade técnicas, incluindo aquelas descritas abaixo e adicionalmente exemplificado na seção de exemplos a seguir.
[000138] A título de exemplo, em ainda uma forma de realização, um micro-organismo recombinante da invenção é produzido através de um método, que compreende os estágios que se seguem: introdução no interior de um micro-organismo de passagem de (I) um construto/ vetor a ser introduzido no micro-organismo parental, tal como aqui descrito, que compreende um gene metil transferase; expressão do gene de metil transferase; isolamento de um ou mais construtos/ vetores do microorganismo de passagem; e, introdução do um ou mais construto/ vetor no interior de um micro-organismo de destinação.
[000139] Em ainda uma forma de realização, o gene de metil transferase do estágio B é expresso de um modo constitutivo. Em ainda uma outra forma de realização, a expressão do gene de metil transferase do estágio B é induzida.
[000140] O micro-organismo de passagem é um micro-organismo, de um modo preferido um micro-organismo negativo de restrição, que facilita a metilação das sequências de ácido nucleico, que constituem o construto/ vetor de expressão. Em ainda uma forma de realização particular, o microorganismo de passagem é E. coli, Bacillus subtillis, ou Lactococcus lactis negativo de restrição.
[000141] O construto/ vetor de metilação compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma metil transferase.
[000142] Uma vez que o construto/ vetor de expressão e o construto/ vetor de metilação sejam introduzidos no micro-organismo de passagem, o gene de metil transferase, presente no construto/ vetor de metilação, é induzido. A indução pode ser qualquer sistema de promotor adequado, embora, em uma forma de realização particular da invenção, o construto/ vetor de metilação compreenda um promotor lac indutível (por exemplo, como na SEQ ID NO 31) e é induzido por meio da adição de lactose ou de um análogo do mesmo, de um modo ainda mais preferido isopropil-β-D-tio- galactosídeo (IPTG). Outros promotores adequados incluem o ara, tet, ou o sistema T7. Em ainda uma forma de realização da invenção, a metilação do construto/ vetor de metilação é um promotor constitutivo.
[000143] Em ainda uma forma de realização particular, o construto/ vetor de metilação possui uma origem de replicação específica para a identidade do micro-organismo de passagem, de um modo a que quaisquer agentes, presentes no construto/ vetor de metilação sejam expressos no microorganismo de passagem. De um modo preferido, o construto/vetor a ser introduzido no micro-organismo parental, possui uma origem de replicação específica para a identidade do micro-organismo.
[000144] A expressão da enzima metil transferase resulta na metilação dos genes presentes no construto/vetor a ser introduzido em um microorganismo parental. O construto/ vetor pode ser então isolado a partir do micro-organismo de passagem, de acordo com um número de métodos conhecidos. Apenas a titulo de exemplo, a metodologia descrita na seção de Exemplos descrita a seguir pode ser usada para isolar o construto/ vetor.
[000145] Em ainda uma forma de realização particular, ambos o construto/vetor são concorrentemente isolados.
[000146] O construto/ vetor, destinado ao micro-organismo parental, pode ser introduzido no interior do micro-organismo usando qualquer número de métodos conhecidos. No entanto, a título de exemplo, a metodologia descrita na seção de Exemplos que se segue pode ser usada.
[000147] É considerado que o gene de metil transferase pode ser introduzido em um micro-organismo de passagem e superexpressado. Deste modo, em ainda uma forma de realização, a enzima metil transferase pode ser coletada por meio do uso de métodos conhecidos e ode ser então usada, in vitro, de um modo a metilar o construto a ser introduzido no micro-organismo parental. O construto/ vetor pode ser então introduzido no micro-organismo de destinação (parental). Em ainda uma outra forma de realização, o gene de metil transferase é então introduzido no genoma do micro-organismo de passagem, seguido pela introdução do construto, destinado ao microorganismo parental no micro-organismo de passagem, isolamento de um ou mais construtos/ vetores a partir do micro-organismo de passagem e então a introdução do construto/ vetor no interior do micro-organismo de destinação (parental).
[000148] Deve ser considerado que o construto/vetor, destinado ao micro-organismo parental e o construto/ vetor de metilação, tal como acima definido, podem ser combinados de um modo a que seja provida uma composição de matéria. Uma tal composição apresenta uma utilidade particular em evitar mecanismos de barreira de restrição, de um modo a produzir os micro-organismos recombinantes da invenção.
[000149] Em ainda uma forma de realização particular, o construto/ vetores aqui antes descritos são plasmídeos.
[000150] Aqueles versados na técnica irão apreciar um número de metil transferases adequadas de uso na produção dos micro-organismos da invenção. No entanto, a título de exemplo, o fago ΦT1 metil transferase Bacillus subtilis e a metil transferase descrita nos Exemplos aqui a seguir podem ser usados. Os ácidos nucleicos, que codificam as metil transferases adequadas, serão prontamente apreciados tendo em consideração a sequência da metil transferase desejada e o código genético. Em ainda uma forma de realização, o ácido nucleico, que codifica uma metil transferase é descrito nos Exemplos que se seguem (por exemplo o ácido nucleico da SEQ ID NO 31).
[000151] Qualquer número de construtos/vetores, adaptados para permitir a expressão de um gene de metil transferase, podem ser usados para gerar o construto/ vetor de metilação. No entanto, a título de exemplo, o plasmídeo descrito na seção de Exemplos que se segue pode ser usado.
[000152] A partir da informação aqui contida, deverá ser apreciado que é possível ajustar a modificação genética de um micro-organismo parental, de um modo a que seja favorecida a produção de um ou mais produtos, em relação a um ou mais outros produtos. Por exemplo, a ruptura da conversão do piruvato a acetolactato favorece a produção de lactato, formato, malato, fumarato, citrato, succinato e 2-oxogluterato em relação à produção de valina, leucina e isoleucina.
Método de , produção
[000153] A invenção provê um método para a produção de um ou mais produtos através da fermentação microbiana, que compreende fermentar um substrato, que compreende CO, por meio do uso de um micro-organismo da invenção. Em ainda uma forma de realização particular, o método destina-se à produção de etanol ou de um ou mais outros produtos através de fermentação microbiana, compreendendo fermentar um substrato, que compreende CO, por meio do uso de um micro-organismo da invenção. Os métodos da invenção podem ser usados para reduzir as emissões de carbono atmosféricas a partir de um processo industrial.
[000154] De um modo preferido, a fermentação compreende os estágios de fermentar, de um modo anaeróbico, um substrato em um biorreator, de um modo a que sejam produzidos o um ou mais produtos (em uma forma de realização particular, etanol, ou etanol e um ou mais outros produtos) por meio do uso de um micro-organismo recombinante da invenção.
[000155] Em ainda uma forma de realização, o método compreende os estágios de: (b) prover um substrato, que compreende CO, a um biorreator contendo uma cultura de um ou mais micro-organismos do primeiro aspecto da invenção; e (b) fermentar, de um modo anaeróbico, a cultura no biorreator, de um modo a produzir um ou mais produtos (em uma forma de realização incluindo o etanol).
[000156] Em ainda uma forma de realização, o método compreende os estágios de: i. capturar o gás contendo CO, produzido como um resultado do processo industrial, antes que o gás seja liberado ao interior da atmosfera; ii. a fermentação anaeróbica do gás contendo CO, de um modo a produzir um ou mais produtos (em uma forma de realização incluindo etanol) por meio de uma cultura contendo um ou mais micro-organismos do primeiro aspecto da invenção.
[000157] Em ainda uma forma de realização da invenção, o substrato gasoso, fermentado pelo micro-organismo, é um substrato gasoso contendo CO. O substrato gasoso pode ser um gás de rejeito contendo CO, obtido como um subproduto de um processo industrial, ou a partir de alguma outra fonte, tal que a partir de fumaças de exaustão de automóvel. Em ainda certas formas de realização, o processo industrial é ainda selecionado a partir do grupo, que consiste d da manufatura de produtos de metal ferroso, tais que um moinho de aço, da manufatura de produtos não ferrosos, de processos de refino de petróleo, da gaseificação de carvão, da produção de energia elétrica, da produção de negro de fumo, da produção de amônia, do refino de gás natural, da produção de metanol e da manufatura de coque. Nestas formas de realização, o gás contendo CO pode ser ainda capturado a partir do processo industrial, antes que ele seja emitido ao interior da atmosfera, por meio do uso de qualquer método conveniente. O CO pode ser um componente de gás de síntese (gás compreendendo monóxido de carbono e hidrogênio). O CO produzido a partir de processos industriais é normalmente queimado para produzir CO2 e, deste modo, a invenção possui uma utilidade particular no caso da redução de emissões de gás de estufa de CO2 e na produção de butanol para o uso como um biocombustível. Dependendo da composição do substrato contendo CO gasoso, pode ser ainda desejável tratá-lo, de um modo a que sejam removidas quaisquer impurezas indesejadas, tais que as partículas de pó, antes de sua introdução na fermentação. Por exemplo, o substrato gasoso pode ser ainda filtrado ou purificado por meio do uso de métodos conhecidos.
[000158] Deverá ser ainda apreciado que, para que ocorra o crescimento das bactérias e de CO-para-etanol (e/ ou outro(s) produto(s), em adição ao gás do substrato contendo CO, será necessário que um meio nutriente líquido adequado seja alimentado ao biorreator. O substrato e o meio podem ser alimentados ao biorreator em um modo alimentado a batelada, ou de batelada, contínuo. Um meio nutriente deverá conter vitaminas e minerais, suficientes para permitir o crescimento do micro-organismo usado. Meios anaeróbicos, adequados para a fermentação e para a produção de etanol (e opcionalmente um ou mais produtos), usando CO, são conhecidos na técnica. Por exemplo, os meios adequados são descritos em Biebel (Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2001) 27, 18-26). O substrato e o meio podem ser alimentados ao biorreator em um modo alimentado a batelada, ou de batelada, contínuo. Em ainda uma outra forma de realização da invenção, o meio é descrito na seção de Exemplos a seguir.
[000159] A fermentação deve, de um modo desejável, ser executada sob as condições apropriadas para que ocorra a fermentação de CO-para-etanol (e/ ou de outro(s) produto(s). As condições de reação, que deve ser consideradas, incluem a pressão, temperatura, taxa de fluxo de gás, taxa de fluxo de líquido, pH do meio, potencial de redox do meio, taxa de agitação (se for usado um reator de tanque agitado contínuo), nível de inóculo, concentrações de substrato de gás máximas de um modo a assegurar que o CO na fase líquida não se torne limitativo, e as concentrações de produto máximas para que seja evitada a inibição do produto.
[000160] De um modo adicional, é com frequência desejável aumentar a concentração de CO de uma corrente do substrato (ou a pressão parcial de CO em um substrato gasoso) e, deste modo, aumentar a eficiência das reações de fermentação, em que CO é um substrato. A operação em pressões aumentadas permite um aumento significativo na taxa de transferência de CO a partir da fase gasosa para a fase líquida, onde ela pode ser absorvida pelo microorganismo como uma fonte de carbono para a produção de etanol (e/ou de outro(s) produto(s)). Isto significa, por sua vez, que o período de tempo de retenção (definido como o volume de líquido no biorreator, dividido pela taxa de fluxo do gás de admissão) pode ser reduzida quando os biorreatores são mantidos em pressão elevada, preferivelmente do que em pressão atmosférica. As condições de reação ótimas irão depender parcialmente dos microorganismos particulares da invenção usados. No entanto, de um modo geral, é preferido que a fermentação seja executada em uma pressão mais alta do que a pressão ambiente. Além disso, como uma determinada taxa de conversão de CO-para-etanol (e/ ou de outro(s) produto(s)) é, em parte, uma função do tempo de retenção do substrato, e que o alcance de um período de retenção desejado, por sua vez, dita o volume requerido de um biorreator, o uso de sistemas pressurizados pode reduzir grandemente o volume do biorreator requerido, e, consequentemente, o custo de capital do equipamento de fermentação. De acordo com os exemplos fornecidos na patente US n° 5.593.886, o volume do reator pode ser então reduzido, em uma proporção linear para os aumentos na pressão operacional do reator, isto é, os biorreatores operados em 10 atmosferas de pressão necessitam apenas um décimo do volume daqueles operados em 1 atmosfera de pressão.
[000161] Os benefícios da condução de uma fermentação de gás-para- etanol em pressões elevadas já foi descrito em um outro local. Por exemplo, a WO 02 /08438 descreve as fermentações de gás-para-etanol executadas sob pressões de 30 psig (298,80 kPa) e de 75 psig (517,50 kPa), fornecendo produtividades de etanol de 150 g/l/dia e 369 g/l/dia respectivamente. No entanto, as fermentações exemplares executadas usando meios similares e as composições de gás de admissão em pressão atmosférica foram verificadas como produzindo entre 10 e 20 vezes menos etanol por litro por dia.
[000162] É também desejável que a taxa de introdução do substrato gasoso contendo CO seja tal, de um modo a que seja assegurado que a concentração de CO na fase líquida não se torne limitativa. Isto é devido a uma consequência de que as condições limitadas de CO podem ser tais que que o produto de etanol seja consumido pela cultura.
[000163] A composição das correntes gasosas, usadas para alimentar uma reação de fermentação, podem ter um impacto significativo sobre a eficiência e/ou os custos daquela reação. Por exemplo, o O2 pode reduzir a eficiência de um processo de fermentação anaeróbico. O processamento ou os gases desnecesssários em estágios de um processo de fermentação, antes ou após a fermentação, podem ainda aumentar a carga em tais estágios (por exemplo, em que a corrente gasosa é comprimida antes de ser introduzida em um biorreator, a energia desnecessária pode ser usada para comprimir os gases, que não são requeridos na fermentação). Deste modo, pode ser ainda desejável tratar as correntes de substrato, de um modo particular as correntes de substrato derivadas a partir de fontes industriais, de um modo a que sejam removidos os componentes indesejados e a que seja aumentada a concentração de componentes desejáveis.
[000164] Em ainda certas formas de realização, uma cultura de bactérias da invenção é mantida em um meio de cultura aquoso. De um modo preferido, o meio de cultura aquoso é um meio de crescimento microbiano anaeróbico mínimo. Os meios adequados são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, na patente US n°s. 5. 173. 429 e 5.593. 886 e na WO 02/ 08438, e tal como descrito na seção de Exemplos a seguir.
[000165] O um ou mais produtos, produzidos através de um método da invenção (em uma forma de realização etanol, ou uma corrente de álcool mista contendo etanol e/ ou um ou mais outros produtos) podem ser recuperados a partir de um caldo de fermentação através de métodos conhecidos na técnica, tais que a evaporação ou a destilação fracionária, a pervaporação, e a fermentação extrativa, incluindo, por exemplo, a extração de líquido-líquido. Os subprodutos, tais que os ácidos, incluindo o acetato, podem ser também recuperados a partir do caldo de fermentação por meio do uso de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um sistema de adsorção, que envolve um filtro de carvão ativado ou a eletrodiálise pode ser usado. De um modo alternativo, a extração de gás contínua pode ser também usada.
[000166] Em ainda certas formas de realização preferidas da invenção, o etanol e/ ou um ou mais outros produtos são recuperados a partir do caldo de fermentação através da remoção contínua de uma porção do caldo a partir do biorreator, separando as células microbianas a partir do caldo (de um modo conveniente através de filtração), e recuperando um ou mais produtos a partir do caldo. Os alcoóis podem ser ainda convenientemente recuperados, por exemplo, através de destilação, e os ácidos podem ser recuperados, por exemplo, através de adsorção sobre carvão ativado. As células microbianas separadas são retornadas, de um modo preferido, ao biorreator de fermentação. O permeado livre de células, que permanece após quaisquer álcoóis e ácidos terem sido removidos, é também, de um modo preferido, retornado ao biorreator de fermentação. Os nutrientes adicionais (tais que as vitaminas B) podem ser ainda adicionados ao permeado livre de células, de um modo a completar o meio nutriente, antes que ele seja então retornado ao biorreator.
[000167] Além disso, se o pH do caldo tiver sido ajustado, tal como acima descrito, de um modo a aumentar a adsorção de ácido acético para o carvão ativado, o pH deve ser então reajustado a um pH similar àquele do caldo no biorreator de fermentação, antes de ser retornado ao biorreator.
[000168] O succinato pode ser então recuperado a partir do caldo de fermentação por meio do uso de um número de técnicas, tais que a acidificação, a eletrodiálise acoplada com uma cromatografia de troca iônica (Song and Lee, 2006, Enzyme Microb Technol 39, 352-361), precipitação com Ca(OH) acoplada com a filtração e a adição de ácido sulfúrico (Lee et al 2008, Appl Microbiol Biotechnol 79, 11-22), ou a extração reativa com extraentes à base de amina, tais que tri-n-octil amina ( Huhet al., 2006, Proc Biochem 41, 1461-1465). Para todos os métodos, é crucial que haja a forma de ácido livre, e não o sal. A maioria dos processos de produção biotecnológicos para o ácido succínico operam, no entanto, em uma faixa neutra ou ligeiramente ácida de pH 6-7. Dado ao pKa do ácido succínico pKa = 4,16 and 5,61), a maior parte está presente como o sal e não como o ácido livre, sob estas condições. C. autoethanogenum e acetógenos carboxidotróficos, no entanto, são conhecidos como capazes de tolerar e de desenvolver uma faixa de pH desejável de um pH de 4-6.
[000169] Os aminoácidos de cadeia ramificada, valina, leucina e isoleucina podem ser então recuperados de um modo relativamente fácil a partir do caldo de fermentação, através da concentração (por exemplo,osmose reversa) e cristalização ou remoção da biomassa ( por exemplo, ultrafiltração ou centrifugação) e de cromatografia de troca iônica (Ikeda, A., 2003, Amino Acid Production Processes, in R. Faurie and J. Thommel (eds.) Microbial production of L-amin acids, 1-35).
[000170] Lacato, formato, 2-oxegluterato e ainda outros produtos podem ser recuperados a partir do caldo de fermentação através de qualquer método conhecido. No entanto, a título de exemplo, no caso do lactato, o processo de fermentação convencional produz o precipitado de lactato de cálcio, que pode ser coletado e reacidificado. De um modo alternativo, as técnicas de membrana, tais que a eletrodiálise, podem ser usadas para separar o lactato. As baixas concentrações de lactato podem ser então separadas a partir de um caldo de fermentação por meio da aplicação de um potencial adequado, por meio de uma membrana permeável a íon seletiva. Ainda outras técnicas adequadas ncluem a nanofiltração, em que os íons monovalentes podem passar, de um modo seletivo, através de uma membrana, sob pressão.
[000171] Deve ser ainda apreciado que, em algumas situações, o método pode ser executado para produzir e recuperar produtos, outros que o etanol (por exemplo, um ou mais produtos, que compreendem valina, leucina, succinato, piruvato, lactato e formato). Deste modo, a invenção deve ser ainda entendida como incluindo os métodos para a produção de um ou mais destes produtos.
Exemplos:
[000172] A invenção será gora descrita, de um modo mais detalhado, com referência aos exemplos não limitativos que se seguem.
Exemplo 1: Deleção do gene budA C. autoethanogenum através de recombinação homóloga
[000173] As modificações genéticas foram executadas por meio do uso de um plasmídeo contendo os braços de homologia 5’ e 3’ do gene budA de C. autoethanogenum DSM23693 (Fig. 1-2). Este plasmídeo foi metilado in vivo por meio do uso de uma nova metil transferase e então transformado no C. autoethanogenum DSM23693 (DSMZ, Germany). A eliminação do gene budA foi mostrada através de PCR e através da inibição da produção de 2,3- butano diol em cepas de C. autoethanogenum DSM23693 ΔbudA. Construção do plasmídeo de expressão:
[000174] Técnicas de DNA Recombinante e de clonagem molecular convencionais foram usadas nesta invenção e são descritas por Sambrook et al, 1989 and Ausubel et al, 1987. As sequências de DNA do braço de homologia flanqueador a montante 5’ (Seq. ID 3) e do braço de homologia flanqueador a jusante 3’ (Seq. ID 4) do gene budA Clostridum autoethanogenum DSM23693 budA foram obtidas a partir do do NCBI.
[000175] O DNA genômico de Clostridum autoethanogenum DSM23693 foi isolado usando um mini kit de DNA Genômico Purelink de Invitrogen, de acordo com as instruções do fabricante.
[000176] Os braços de homologia flanqueadores 5’ (Seq. ID. 3 ) e 3’ (Seq. ID. 4 ) foram amplificados através de PCR com oligonucleotídeos na Table 1 usando o DNA genômico Clostridum autoethanogenum DSM23693 como o gabarito, iProof High Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad Labratories) e o seguinte programa: desnaturação inicial a t 98°C durante 30 segundos, seguida por 25 cicles de desnaturação (98°C durante 10 segundos), recozimento (60°C durante 15 segundos) e alongamento (72°C durante 30 segundos), antes de um estágio deestensão final (72°C durante 7 minutos). Tabela 1: Oligonucleotídeos para a clonagem
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[000177] O braço de homologia flanqueador 5’ de 964 bp amplifiacdo (5’HA) do gene budA foi cortado com as enzimas de restrição Sbf1 e Not1 e clonado no vetor de passagem E. coli-Clostridium pMTL 85141 (Seq. ID 9; FJ797651.1; Nigel Minton, University of Nottingham; Heap et al., 2009) usando os sítios de restrição SbfI e NotI e a cepa E. coli XL1-Blue MRF’ Kan (Stratagene). O plasmídeo criado pMTL85141-budA-5’HA e o produto de PCR de 977 bp do braço de homologia 3’ do gene budA foram ambos cortados com NheI e AscI. Uma ligação destes fragmentos de DNA digeridos foi transformada no E. coli XL1-Blue MRF’ Kan (Stratagene) resultando no plasmídeo pMTL85141-budA-ko. A inserção no plasmídeo resultante pMTL85141-budA-ko (SEQ_ID No. 12) foi completamente sequenciada por meio do uso dos oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 1 e a sequenciação dos resultados confirmou que ambos os braços de homologia estavam livres de mutações
Metilação de DNA:
[000178] Um gene de metil transferase híbrido fundido a um promotor lac indutível (SEQ ID No. 31) foi designado, através de alinhamento dos genes de metil transferase de C. autoethanogenum, C. ljungdahlii, e C. ragsdalei, tal como descrito no Pedido de Patente US 13/049.263. A expressão de metil transferase resulta em uma proteína tendo a sequência SEQ ID No. 32). O gene de metil transferase híbrido foi sintetizado quimicamente e clonado no vetor pGS20 (ATG:biosynthetics GmbH, Merzhausen, Germany - SEQ ID No. 33) usando EcoRI. O plasmídeo de metilação resultante pGS20- methyltransferase foi duplamente transformado com o plasmídeo pMTL85141-budA-ko no negativo de restrição E. coli XL1-Blue MRF’ Kan (Stratagene). A metilação in vivo foi induzida através da adição de IPTG 1 mM, e os plasmídeoss metilados foram isolados usando o kit mini prep Zymo (Zymo). A composição de plasmídeo metilada resultante foi usada para a transformação de C. autoethanogenum DSM23693.
Transformação:
[000179] Durante o experimento de transformação completo, C. autoethanogenum DSM23693 foi desenvolvido em meio YTF (Tab. 2), na presença de agentes de redução, gás de rejeito de moinho de aço a 30 psi (207 kPa) (coletado de New Zealand Steel site em Glenbrook, NZ; composição: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2) a 37 °C usando técncias anaeróbicas convencionais descritas por Hungate (1969) e Wolfe (1971). Tabela 2: Meio YTF
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[000180] Para produzir células competentes, uma cultura de 50 ml de C. autoethanogenum DSM23693 foi subcultivada em meio YTF fresco durante 5 dias consecutivos. Estas células foram então usadas para inocular 50 ml de meio YTF contendo DL-treonina 40 mM em um OD600nm de 0,05. Quando a cultura alcançou um OD600nm de 0,5, as células foram incubadas em gelo durante 30 minutos e então transferidas ao interior de uma câmara anaeróbica e coletadas a 4.700 x g e a 4 °C. A cultura foi então lavada duas vezes com um tampão de eletroporação gelado (sacarose 270 mM, MgCl2 1 mM, fosfato de sódio 7 mM, pH 7,4) e finalmente suspensas em um volume de tampão de eletroporação fresco de 600 μl. Esta mistura foi então transferida a uma cubeta de eletroporação pré-resfriada com um intervalo de eletrodo de 0,4 cm contendo 2 μg da mistura de plasmídeo metilada e 1 μl de inibidor de restrição Tipo 1 (Epicentre Biotechnologies) e imediatamente pulsada usando um sistema de eletroporação Gene pulser Xcell electroporation system (BioRad) com os seguintes ajustes: 2,5 kV, 600 Q, e 25 μF. Constantes de tempo de 3,7-4,0 ms foram alcançadas. A cultura foi então transferida ao interior de 5 ml de meio YTF fresco. A regeneração das células foi monitorada em um comprimento de onda de 600 nm usando um Spectronic Helios Epsilon Spectrophotometer (Thermo) equipado com um retento de tubo. Após uma queda inicial na biomassa, as células começaram a crescer novamente. Uma vez que a biomassa havia sido duplicada a partir daquele ponto, cerca de 200 μl da cultura foram espalhados em placas de ágar-YTF e em placas de ágar PETC contendo 5 g/l de frutose (Tabela 3) ( ambas contendo 1,2 % de Bacto™ Agar (BD) e 15 μg/ml de Tiamfenicol). Após 3-4 dias de incubação com gás de moinho de aço a 30 psi (207 kPa) a 37 °C, 500 colônias por placa estavam claramente visíveis. Tabela 3: Meio de PETC (Meio ATCC 1754; atcc.org/Attachments/2940.pdf)
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[000181] As colônias foram aplicadas sobre placas de ágar PETC fresco, também contendo 5 g/L de frutose e 15 μg/ml de Tiamfenicol. Após 2 dias de incubação com gás de moinho de aço a 30 psi (207 kPa) a 37 °C, as colônias únicas destas placas foram novamente reaplicadas sobre placas de ágar PETC não seletivas frescas contendo apenas 5 g/l de frutose. A reaplicação sobre placas de ágar PETC com 5 g/l de frutose foi novamente repetida mais uma vez e as placas foram incubadas com gás de moinho de aço a 30 psi (207 kPa), a 37 °C. Após 3 dias, 6 colônias únicas, que foram desenvolvidas em meios não seletivos, foram então inoculadas em 2 ml de meio líquido de PETC contendo 5 g/l de frutose. Quando o crescimento ocorreu, a cultura foi sequencialmente graduada em 5 ml, 25 ml, e então em 50 ml de meio de PETC contendo 5 g/l de frutose e gás de moinho de aço a 30 psi ( 207 kPa) como uma fonte de carbono.
Conformação da transformação bem sucedida:
[000182] [0000187] C. autoethanogenum: De um modo a verificar a identidade de seis clones e do transfer de DNA, o DNA genômico foi isolado a partir de todas as 6 colônias/ clones em meio líquido de PETC usando um PurelinkTM Genomic DNA mini kit (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Este DNA genômico, junto com aquele do tipo selvagem de C. autoethanogenum DSM23693 foram usados como um gabarito em PCR. O PCR foi executado com iniciadores iproof High Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad Labratories), tal como relacionado na Tabela 4 e seguindo o programa: desnaturação inicial a 98°C durante 2 minutos, seguida por 25 ciclos de desnaturação (98°C durante 10 segundos), recozimento (61°C durante 15 segundos) e alongamento (72°C durante 90 segundos), antes de um estágio de extensão final (72°C durante 7 minutos). O DNA genômico do tipo selvagem de C. autoethanogenum DSM23693 foi usado como um gabarito no PCR de controle. Tabela 4: Oligonucleotídeos para a confirmação por PCR de plasmídeo e espéceis
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[000183] De um modo a confirmar a identidade dos 6 clones, o PCR foi executado contra o gene 16s rRNA usando os iniciadores fD1 (Seq. ID. 27) e rP2 (Seq. ID 28) e usando as condições de PCR, tal como descritas acima. Os produtos de PCR foram purificados usando o kit Zymo Clean and ConcentratorTM kit e sequenciados usando o iniciador rP2 (Seq. ID 28). As sequências de todos os 6 clones (Seq. ID. 13-19) mostraram pelo menos 90% de identidade contra o gene 16S rRNA de C. autoethanogenum (Seq. ID 15; Y18178, GI:7271109).
[000184] O PCR de 6 clones analisados com os iniciadores específicos para a região alvo budA usando os iniciadores Og09f (Seq. ID. 5) e Og12r (Seq. ID. 8) resultou na amplificação do fragmento de DNA de 2,2 kb de 5 de 6 clones. O produto de PCR de 2,7 kb foi amplificado com o DNA genômico do tipo selvagem C. autoethanogenum DSM23693. A identidade dos produtos de PCR de 2,2 kb dos clones de eliminação de budA potenciais foi confirmada através de sequenciação (Seq ID 20-26) com os iniciadores relacionados na Tabela 5 e nenhuma sequência do gene budA foi detectada nestes fragmentos. O fragmento de DNA lacZ foi substituído pelo gene budA. A ausência do gene budA gene nestes 6 clones foi novamente confirmada por PCR com os iniciadores Og44f (Seq. ID. 29) e Og45r (Seq. ID. 30) specíficos a região interna de 275 bp do gene budA C. autoethanogenum DSM23693, que foi amplificado apenas a partir de C. autoethanogenum DSM23693 de tipo selvagem.
[000185] Ausência da produção de 2,3 butano diol e aumento no rendimento de etanol:
[000186] De um modo a demonstrar a falta de acetoína e subsequentemente a produção de 2,3-butano diol, experimentos de garrafa de soro foram executados com o clone 1, em triplicatas, com gás de rejeito de moinho de aço (composição 44% de CO, 32% de N2, 22% de CO2, e 2% de H2; coletado a partir de um sítio de aço em in Glenbrook, New Zealand) e meio de PETC, tal como acima descrito. A cepa do tipo selvagem não modificada de C. autoethanogenum DSM23693 foi desenvolvida sob as mesmas condições como o controle.
[000187] A análise dos metabólitos foi executada por HPLC usando um sistema de HPLC Agilent Série 1100, equipado com um RID operado a 35 °C (Detetor de Índice Refrativo) e com uma coluna de ácido orgânico Alltech IOA-2000 (150 x 6.5 mm, tamanho de partícula 5 μm) mantida a 32 °C. Água ligeiramente acidificada foi usada (H2SO4 0,005 M) como a fase móvel, com uma taxa de fluxo de 0,25 ml/min. De um modo a remover as proteínas e os outros resíduos celulares, amostras de 400 μl foram misturadas com 100 μl de um ácido 5-sulfosalicílico a 2 % (p/v) e centrifugadas a 14.000 x g durante 3 minutos, de um modo a que os resíduos precipitados fossem separados.10 μl do sobrenadante foram então injetados no HPLC para análises.
[000188] Os resultados dos experimentos de garrafa de soro com o clone 1 ΔbudA C. autoethanogenum DSM23693 e com o tipo selvagem não modificado C. autoethanogenum DSM23693 são apresentados na Tabela 5. A biomassa máxima da cepa ΔbudA C. autoethanogenum DSM23693°Correu com um OD600nm de 0,32 relativamente mais baixo do que o tipo selvagem não modificado, que cresceu para um OD600nm de 0.58. Comparado com o tipo selvagem, nenhum 2,3-butano diol foi detectado na cultura do clone 1 ΔbudA C. autoethanogenum DSM23693, e o rendimento de etanol foi significativamente mais alto no clone 1 ΔbudA C. autoethanogenum DSM23693 do que no C. autoethanogenum DSM23693 não modificado (Tabela 5). Tabela 5: Metabólitos produzidos pelo clone 1 ΔbudA C. autoethanogenum DSM23693 e pelo tipo selvagem não modificado C. autoethanogenum DSM23693 em relação à biomassa Metabólito Meio Tipo Clone 1 (g/l) Selvagem ΔbudA Etanol 1,4 2,5 Ácido 2,3 0,18 acético 2,3-butano 0,09 0 diol Ácido láctico 0,02 0,2 Ácido 0 1,65 fórmico Ácido 0 0.,44 succínico
Produção de outros metabólitos - lactato, formato, succinato, 2-oxogluterato, valina, leucina, isoleucina:
[000189] Ao mesmo tempo, de um modo interessante, enquanto que o C. autoethanogenum DSM23693 não modificado produziu apenas 0,02 g de ácido láctico como o outro subproduto, o ΔbudA C. autoethanogenum DSM23693 produziu uma quantidade significativamente mais alta 0,07g/l (0,197 g/l normalizado para a biomassa) assim como 0,53 (1,647 g/l normalizado para a biomassa) de ácido fórmico e 0,13 g/l (0,344 g/l normalizado para a biomassa) de ácido succínico (Tabela 5). Este aumento é devido, provavelmente, ao piruvirato, um precursor anterior de 2,3-butano diol (Figura 1), e à acumulação devido à eliminação do gene budA gene, que bloqueou a produção de 2,3-butano diol.
[000190] A produção de succinato e de lactato pelo by ΔbudA C. autoethanogenum DSM23693 foi também confirmada através de Cromatografia Gasosa- Espectometria de Massa (CG- EM). Para isto, cerca de 2,5 ml da cultura do clone 1 de ΔbudA C. autoethanogenum DSM23693 desenvolvido com gás de rejeito de moinho de aço (composição, 44% de CO, 32% de N2, 22% de CO2, e 2% de H2; coletados a partir de um sítio de aço em Glenbrook, New Zealand) em uma densidade óptica de 0.32, foi centrifugado e o sobrenadante foi então filtrado através de um filtro de 0,2 uM (Smart KF, Aggio RB, Van Houtte JR, Villas-Bôas SG, Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry, Nat Protoc. 2010 Sep;5(10):1709-29. 2010). Cerca de 0,65 ml da cultura do tipo selvagem de C. autoethanogenum DSM23693 e 2,5 ml de meio neutro foroam processados de um modo similar. As amostras foram secadas por congelamento e analisadas através de CG- EM, em in triplicatas, na Universidade de Auckland. Tal como observado na Tabela 6, a intensidade de pico do sinal de succinato e de lactato foi mais fornte no clone 1 de do ΔbudA C. autoethanogenum DSM23693, comparada a um C. autoethanogenum DSM23693 não modificado e o meio neutro de controle. Os resultados de CG-EM para o succinato e o lactato são consistentes com os resultados de HPLC.
[000191] Os resultados de CG-EM (Tabela 6) não apenas confirmaram a produção de lactato e de succinato com o clone 1 do ΔbudA C. autoethanogenum DSM23693, mas também a produção do -oxogluterato do outro produto final do ciclo de TCA, além do succinato, e dos aminoácidos de cadeia ramificada valina, leucina, isoleucina, que são produzidos a partir de piruvato e de acetolactato, os precursores de 2,3- butano diol, que estão igualmente presentes em níveis elevados na cepa do ΔbudA C. autoethanogenumn. Os intermediários do ciclo de TCA, tais que malato, fumerato, citrato, cis-Aconitato, iso-Citrato não foram testados, mas provavelmente devem ser elevados, pois foi verificado que foram produzidos os produtos finais succinato e 2-oxogluterato (Figure 1b). Tabela 6: Análise do Metabólito do clone 1 do ΔbudA C. autoethanogenum DSM23693 clone 1 (ΔbudA) e do C. autoethanogenum DSM23693 do tipo selvagem não modificado (Tipo Selvagem) através de CG-EM. O meio foi incluído nas análises como o controle. Os valores fornecidos na tabela correspondem à intensidade de pico normalizada, obtida para cada réplica ®. ND = não detectado.
Figure img0007
[000192] A produção de acetoína e de 2,3-butano diol está associada, de um modo usual, com a desacidificação de ácido pirúvico forte (Xiao, Z., and P. Xu. 2007. Acetoin metabolism in bacteria. Crit. Rev. Biochem. Microbiol. 33:127-140), que pode representar uma ameaça séria para a célula por meio da destruição do pH interno e do gradiente de próton, requerido para a conservação de energia. Ambos a acetoína e o 2,3-butano diol são compostos de pH neutro. A produção de 2,3- butano diol também serve como um tanque de elétrons para a descarga do excesso de equivalentes de redução, produzidos durante o processo de fermentação.
[000193] Embora sem desejarmos estar limitados por qualquer teoria particular, acredita-se que, através da aliminação da produção de acetoína e de 2,3- butano dio, a célula precisa encontrar outros meios para a desacidificação do ácido pirúvico (pKa = 2,50) e descarregar os equivalentes de redução, e deste modo, deslocar o seu metabolismo para a produção de outros produtos (novos), tais que os aminoácidos de cadedia ramificada valina, leucina ou isoleucina, succinato (pKa1 = 4.20, pKa2 = 5,60), ácido láctico (pKa = 3,86), e ácido fórmico (pka = 3,77). A produção de ácido succínico também oferece uma oportunidade de descarregar 4 equivalentes de redução, enquanto que 2 equivale4ntes de redução podem ser descarregados pela produção do ácido láctico.
Exemplo 2: Via de Succinato
[000194] A via para a produção de succinato é descrita na Figura 1b. Os genes respectivos foram indentificados em Clostridium autoethanogenum e a atividade da enzima foi demonstrada.
[000195] Em um primeiro estágio, o piruvato é convertido para malato, seja diretamente catalsiado por uma enzima málica ou através do oxaloacetato catalisador por uma malato desidrogenase. O oxaloacetato (OAA) pode ser ainda produzido a partir do piruvato por meio da ação de uma Piruvato carboxilase, ou través de um Fosfenoenol piruvato (PEP) em uma conversão em dois estágios, catalisada por Piruvato fosfato diquinase (PPDK) e PEP carboxiquinase (PCK). O malato é subsequentemente convertido ao succinato em um processo de dois estágios, catalsiador por Fumarato hidratase e por fumato redutase. Os respectivos genes foram identificados no C. autoethanogenum e os genes homólogos estão rpesentes em outros acetógenos carboxidrotróficos, tais como C. ljungdahlii e C. ragsdalei (Tabela 7). Tabela 7: Genes e Enzimas identificados como estando envolvidos na produção de Succinato C.autoethanogenum C. Ijungdahlii C. ragsdalei
Figure img0008
Figure img0009
Ensaio de Atividades de Enzima:
[000196] Células (Clostridium autoethanogenum) foram coletadas na fase exponencial de crescimento anaeróbico. Cultivadas (A600 ~ 0.45), e transformadas em pelotas a 8000 x q, 4°C durante 10 minutos. O sobrenadante foi então descartado, e a pelota foi lavada, duas vezes, em um tampão de lavagem (Tris-HCl 0,1 M, diitiotreitol 10 mM (DTT), pH 6,5, 4 °C). Finalmente, a pelota foi novamente suspensa em um tampão de lavagem contendo um inibidor de protease e misturada com 1,44 g de contas de zircônia (Ambion RiboPure Bacteria Kit). Tubo foam resfriados em gelo, durante 5 minutos, antes da ruptura em um Misturador Vortex com um adaptador Vortex (Vortex Genie 2, Scientific Industries, Inc.) durante 5 ciclos de 1 minuto, sendo batidas a 3200 rpm, seguido por ciclos intermediários de 1 minuto em gelo. Após a lise, a amostra foi então centrifugada (13.000 x g, 4 °C durante 10 minutos), e o sobrenadante foi dividido em alíquotas e armazenado a -80 °C, até a análise.
[000197] Todos os ensaios foram baseados na oxidação de NADH para NAD (ε = 6,2 mM-1 cm-1), sob condições aeróbicas em uma cubeta, com um comprimento de trajeto de 1 cm. As atividades da enzima foram obtidas a partir de três réplicas de pelo menos duas extrações celulares independentes. O conteúdo de proteína dos extratos foi determinado por meio do uso de um kit comercial (Pierce® Microplate BCA Protein Assay Kit-Reducing Agent Compatible, Thermo Scientific). Uma unidade de atividade da enzima foi definida como a quantidade de enzima que poderia converter um nanomol do substrato no produto por minuto por mg de proteína total.
[000198] A atividade de malato desidrogenase foi medida, de um modo espectrofotométrico, seguindo-se à oxidação dos nucleotídeos de piridina reduzidos com oxaloacetato (OAA) (Sridhar J. et al, 2000, Elucidation of enzymes in fermentation pathways used by Clostridium thermosuccinogenes growing on inulin. Appl. Environ. Microbiol. 66, 246-51). A mistura da reação continha o seguinte: Tris 0,1 M- Cl pH 6,5, DTT 10 mM, NADH 0,15mM, fumarato 5 mM, NADH 0,3 mM e extrato isentod e células. A reação foi iniciada através da adição de OAA e monitorada em temperatura ambiente. A atividade específica desta enzima em extratos isentos de células de Clostridium autoethanogenum foi medida como 160±17 nmol min-1 mg de protein-1. Esta atividade foi comparável à de malato desidrogenase encontrada em Clostridium thermosuccinogenes medida a 37°C (Sridhar J. et al, 2000, Elucidation of enzymes in fermentation pathways used by Clostridium thermosuccinogenes growing on inulin. Appl. Environ. Microbiol. 66, 246-51).
[000199] A atividade de fumarato redutase foi medida com base na conversão de fumarato para succinato (Sridhar J. et al, 2000, Elucidation of enzymes in fermentation pathways used by Clostridium thermosuccinogenes growing on inulin. Appl. Environ. Microbiol. 66, 246-51). A mistura da reação continha o seguinte: Tris-Cl 0,1M, pH 6,5, DTT 10 mM, NADH 0, 15 mM, fumarato 5 mM e extrato isento de células. A reação foi iniciada através da adição de fumarato e foi monitorada em temperatura ambiente. A atividade específica desta enzima nos extratos isentos de células de Clostridium autoethanogenum foi medida como 17.3 ±1,3 nmol min-1 mg de protein-1.
[000200] Os ensaios confirmaram que t Clostridium autoethanogenum possui atividade de malato desidrogenase, fumarato redutase / succinato desidrogenase.
[000201] Tal como aqui descrito, a invenção provê micro-organismos e métodos que permitem a produção aumentada de etanol através da fermentação microbiana de substratos, que compreende monóxido de carbono. Isto também provê a produção de succinato. Não houveram relatórios precedentes quanto à produção de succinato por acetógenos, apenas por acetógenos carboxidotróficos. O potencial para produzir succinato através de fermentação microbiana pode apresentar um número de vantagens em relação aos métodos de produção petroquímicos correntes. Os micro-organismos também produzem formato de aminoácidos de cadeia ramificada, que não haviam sido previamente descritos como produtos de fermentação por micro-organismos acetogênicos.
[000202] O succinato é usado como uma substância química de plataforma de massa para a produção de um número de substâncias químicas industriais, que incluem, 1,4-butano dio,l tetraidrofurano, gama- butirolactona, etileno diamina succinato, succinato de dietila, e ácido adípico. O formato é usado na conservação de ração animal e em processos de curtimento de couro, assim como em uma solução de branqueamento na induústria de papel e de polpa. Os aminoácidos ramificados possuem um número de usos em biotecnoplogia industrial.
[000203] Os micro-organismos da invenção podem ainda produzir um ou mais outros produtos. O uso destes produtos já foi aqui descrito em um outro local.
Example 3: Inativação insercional baseada em intron do Grupo II de genes envolvidos na biossíntese de 2,3-BDO em C. autoethanogenum DSM23693
[000204] Projeto e Construção de construtos ClosTron que objetivam o gene budA e 2,3bdh gene:
[000205] Os genes de acetolactato descarboxilase (budA) e 2,3-butano diol desidrogenase (2,3-bdh) envolvidos na produção em C. autoethanogenum DSM23693 foram inativados usando uma ferramenta de ruptura de gene mediada pelo intron do grupo II ClosTron (Heap et al., 2010). O algoritmo de Perutka hospedado em ClosTron.com foi usado para identificar o sítio alvo do intron do Grupo II entre as bases 450 / 451 r 468 / 469 no filmaneto de sentido dos genes budA e 2,3-bdh, respectivamente. O mesmo algoritomo foi usado para designar as regiões alvo do intron (Seq. ID. 82 e 83) que foram comercialemtne sientetizadas pelo DNA2.0 e fornecidas no vetor pMTL007C-E5. Os vetores finais, pMTL007C-E5-budA-450!451s e pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s, contêm um Marcador ermB de Retro- tranposição-Ativada (RAM) que confere resistência ao antibiótico Claritromicina mediante a inserção no sítio alvo.
[000206] Os plasmídeos pMTL007C-E5-budA-450!451s e pMTL007C- E5-2,3bdh-468!469s foram introduzidos em C. autoethanogenum DSM23693 através da conjugação com a cepa E. coli doadora CA434 como o doador. De um modo resumido, a cepa doadora foi desenvolvida durante a noite em um meio LB, suplementado com 25 μg/ml de cloramfenicol e 100 μg/ml de espectinomicina. As células a partir da cultura de 1,5 ml foram coletadas e lavadas em solução salina tamponada com fosfato. As pelotas das células dodoras foram novamente suspensas em uma cultura de 200 μl do receptor, que cresce exponencialmente, C. autoethanogenum DSM23693. A mistura foi então manchada em um meio de ágar de PETC suplementado com frutose e incubado a 370 C em uma jarra de gás pressurizado. Após 24 horas, as células foram então raspadas e novamente suspensas em 500 μl de caldo de PETC e espalhadas em um meio de ágar de PETC suplementado com 15 μg/ml de tiamfenicol (Sigma) e 10 μg/ml trimetoprima (Sigma). Os transconjugantes de C. autoethanogenum foram selecionados mediante o uso de 15 μg/ml de tiamfenicol e a cepa E. coli CA434 foi selecionada por contagem usando 10 μg/ml de trimetoprima. As colônias foram observadas após 3 dias de incubação a 370 C em jarras de gás pressurizado.
[000207] Listras de colônicas únicas foram efetuadas, de um modo sequencial, primeiramente em um meio de PETC-MES contendo 15 μg/ml de tiamfenicol e 10 μg/ml de trimetoprima, e a seguir em placas de ágar com meio PETC contendo 5 μg/ml Claritromicina. 4 colônias por plasmídeo foram então selecioandas de um modo aleatório para a inserção do intron do grupo II através de PCR usando os iniciadores Og44f (Seq. ID. 29) e Og45r (Seq. ID. 30), flanqueando o sítio de inserção do intron do grupo II no gene budA, e os iniciadores Og42f (Seq. ID. 84) e Og43r (Seq. ID. 85), flanqueando o sítio de inserção do intron do grupo II no gene 2,3-bdh. O kit Maxime PCR PreMix foi usado para o PCR. O 16s rDNA foi também amplificado por PCR usando os iniciadores fD1 (Seq. ID. 27) e rP2 (Seq. ID.28) e o kit Maxime PCR PreMix.
[000208] Confirmação da ruptura do gene budA e 2,3bdh usando a ferramenta de inativação insercional do grupo II ClosTron:
[000209] A amplificação dos produtos de PCR 273 e 375 bp com os iniciadores primers Og44f / Og45r e Og42f / Of43r indica os genes budA e 2,3-bdh do tipo selvagem não modificado, respectivamente. A amplificação dos produtos de PCR de ~2 kb usando o mesmo conjunto de iniciadores indica a inserção do intron do grupo II ClosTron nos genes alvo. No caso de clones, que objetivam o gene budA, os clones 1 e 3 possuíam faixas de tamanho esperado. O clone 4 parece ser uma mistura com ambos os genes de tipo selvagem e rompido (Figura 6). Todos os 4 clones, que foram objetivados para o gene 2,3-bdh parecem positivos para a ruptura de gene, tal como observado pela amplificação do produto de PCR de ~2 kb (Figura 6). Estes resutlados confirmam a ruptura dos genes budA e 2,3-bdh no C. autoethanogenum DSM23693.
[000210] O produto de PCR 16s rDNA PCR dos clones 2 Δ2,3bdh ClosTron (Seq ID. 86, and 87) e 4 (Seq ID. 88 and 89) e dos clones 1 ΔbudA ClosTron (Seq ID. 90 e 91) e 3 (Seq ID. 92 e 93) foram confirmados por sequência como sendo do C. autoethanogenum DSM23693.
[000211] Deste modo, demonstrou-se a ruptura de gene objetivada no C. autoethanogenum DSM23693 acetogênico por meio do uso de duas abordagens diferentes - (i) eliminação do gene através de recombinação homóloga e (ii) ruptura do gene usando uma ferramenta de inativação insercional baseada no intron do grupo II.
Estudo dos mutantes ΔbudA and Δ2,3bdh ClosTron para a produção de 2,3BDO:
[000212] Os metabólitos dos mutantes ΔbudA e Δ2,3bdh, que foram desenvovlidos em garrafas de soro, foram analisados através de HPLC (tal como explicado anteriormente). O mutante ΔbudA Clostron, tal como o mutante de eliminação ΔbudA não produziram o 2,3-BDO (Tabela 8). A ruptura do gene budA através de dois métodos diferentes no C. autoethanogenum confirma o papel do gene budA na biossíntese de 2,3-BDO. Tabela 8: Produção de metabólicos pelos mutantes ΔbudA e Δ2,3bdh ClosTron de C. autoethanogenum DSM23693
Figure img0010
[000213] O mutante Δ2,3bdh ClosTron produziu ainda 2,3-BDO (Tabela 8) indicando a participação de um segundo gene na conversão de acetoína para 2,3-BDO.
[000214] Yan et al demonstraram que uma álcool desidrogenase secundária de C. beijerinckii e de três outros organismos pode também converter a acetoína para 2,3-BDO (Yan. Lee & Liao, 2009). Um gene de álcool desidrogenase similar secundária (SecAdh) é encontrado em C. autothenogenum DSM23693 (Seq ID 34 e 35), C. ljungdahlii (Seq ID 36) e C. ragsdalei (Seq ID 37).
[000215] Na ausência do gene 2,3-bdh gene no C. autoethanogenum DSM23693, o SecAdh poderia mais provavelmente converter a acetoína para 2,-3 BDO.
[000216] Função de uma segunda desidrogenase na conversão de acetoína para 2,3-BDO:
[000217] De um modo a testar a função de um segundo gene na conversão de acetoína para 2,3-BDO, C. autoethanogenum DSM23693 do tipo selvagem e o mutante Δ2,3bdh ClosTron foram alimentados com 10 g /L acetoína em experimentos de fermentação. Fermentação com tipo selvagem e o mutante Δ2,3bdh ClosTron:
[000218] As fermentações foram executadas em biorreatores de 1,5 l, a 37°C e gás de moinho de aço contendo CO como a única fonte de energia e de carbono, tal como abaixo descrito. Um meio definido contendo por litro:: MgCl, CaCl2 (0,5mM), KCl (2mM), H3PO4 (5mM), Fe (100μM), Ni, Zn (5μM), Mn, B, W, Mo, Se(2 μM) foi usado para o crescimento da cultura. O meio foi então transferido ao interior do reator e autoclavado a 121°C durante 45 minutos. Após a autoclavagem, o meio foi então suplementado com Tiamina, Pantotenato (0,05mg), Biotina (0,02mg) e reduzido com Cisteína- HCl 3 mM. De um modo a que seja alcançada a anaerobicidade, o vaso do reator foi borrifado com nitrogênio através de um filtro de 0,2 μm. Antes da inoculação, o gás foi então trocado pelo gás de moinho de aço contendo CO, sendo alimentado continuamente ao reator. A composição do gás de alimentação foi de 2% de H2, 42% de CO, 20% de CO2, 36% de N2. O pH da cultura foi entãomantido entre 5 e 5,2. O fluxo de gás foi inicialmente ajustado em 80 ml/ minuto, sendo aumentado para 200 ml/ minuto durante a fase semi- exponencial, ao mesmo tempo em que a agitação foi aumentada de 200 rpm para 350. O Na2S foi então dosado ao interior do biorreator, a 0, 25 ml/ hora. Uma vez que o OD600 alcançou a 0,5, o biorreator foi então trocado para um modo contínuo, em uma taxa de 1,0 ml/ minuto (taxa de diluição 0,96 d-1). Quando o crescimento estava estável, o reator foi então borrifado com 10 g/ L da mistura racêmica de acetoína. Amostras do meio foram então tomadas, de um modo a medir a biomassa e os metabólitos através de HPLC.
[000219] Os metabólitos foram então analisados através de HPLC, de um modo regular, até o desaparecimento da acetoína. O C. autoethanogenum DSM23693 do tipo selvagem converteu toda a acetoína para meso-BDO e 2,3-BDO em menos do que 1 hora. (Figura 7). A taxa de conversão de acetoína para meso-BDO e 2,3 -BDO estava relativamente baixa no mutante Δ2,3bdh ClosTron. The O mutante Δ2,3bdh ClosTron reduziu 10 g/L de acetoína em mais do que 2 horas. Estes resultados indicam a função de uma segunda desidrogenase na complementação quanto à ruptura do gene 2,3bdh, embora em uma taxa mais lenta.
Example 4: Cepa de C. autoethanogenum DSM23693 modificada produzindo apenas acetoína
[000220] A separação industrial de acetoína a partir de etanol é tecnicamente mais exequível, comparada a seu produto a jusante 2,3-BDO. É deste modo desejável que se tenha uma cepa C. autoethanogenum produzindo a acetoína e não a sua forma reduzida, 2,3-BDO. Como o mutante Δ2,3bdh ClosTron mutant ainda produz o 2,3-BDO, é desejável ter uma cepa de C. autoethanogenum DSM23693, na qual ambos os genes 2,3bdh e SecAdh sejam rompidos. Isto pode ser alcançado por meio de dois modos (a) recombinação homóloga e (b) ruptura do gene sem marcador usando a ferramenta ClosTron, tal como explicado no Exemplo 1 e no Exemplo 3.
(a) Cepa de C. autoethanogenum DSM23693 de eliminação dupla de Δ 2,3 bdh Δ SecAdh através de recombinação homóloga:
[000221] Os braços de homologia ~1 kb 5’ (Seq. ID. 94) e 3’ (Seq. ID. 95) dos genes 2,3bdh são amplificados por PCR usando o DNA genômico de C. autoethanogenum DSM23693. Os iniciadores Og13f (Seq. ID. 96) / Og14r (Seq. ID. 97) e Og15f (Seq. ID. 98) / Og16r (Seq. ID. 99) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/ Not1 e Nhe1/Asc1, de um modo a obter pMTL85151-2,3bdh-KO. Este plasmídeo é então introduzido no C. autoethanogenum DSM23693, seja através de conjugação ou de eletroporação, tal como descrito nos exemplos acima. Seguindo-se à seleção em placas de tiamfenicol, os transformantes sao testados quanto à eliminação de 2,3bdh usando os iniciadores Og33f (Seq. ID.100) e Og34r (Seq. ID.101), que flanqueiam os braços de homologia de 2,3bdh para o PCR e a sequenciação deste produto de PCR.
[000222] O plasmídeo para a eliminação do gene SecAdh é construtído de um modo similar. Os braços de homologia ~1 kb 5’ (Seq. ID. 102) e 3’ (Seq. ID. 103) dos genes SecAdh são amplificados por PCR usando o DNA genômico de C. autoethanogenum DSM23693. Os iniciadores Sec5f (Seq. ID. 104) / Sec5r (Seq. ID. 105) e Sec3f (Seq. ID. 106) / Sec3r (Seq. ID. 107) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítos Sbf1/ Not1 e Nhe1/Asc1, de um modo a obter pMTL85151-SecAdh-KO. Seguindo-se à seleção em placas de tiamfenicol, os transformantes são testados quanto à eliminação de SecAdh usando os iniciadores SecOf (Seq. ID.108) e SecOr (Seq. ID.109), que flanqueiam os braços de homologia do gene f SecAdh para o PCR.
[000223] Uma vez tendo sido alcançada a eliminação ou do gene 2,3bdh ou do gene SecAdh no C. autoethanogenum DSM23693, o segundo gene nestes mutantes únicos é objetivado usando ou o plasmídeo pMTL85151- 2,3bdh-KO ou o plasmídeo pMTL85151-SecAdh-KO. O plasmídeo é introduzido no ininterior do mutante de eliminação do gene único, seja através de eletroporação ou de conjugação, tal como já descrito nos Exemplos 1 e 3. Os transformantes são então testados quanto à eliminação do segundo gene, usando os iniciadores que flanqueiam os braços de homologia dos genes correspondentes.
(b) Ruptura do gene duplo Δ2,3bdh ΔSecAdh usando ClosTron:
[000224] O cartucho RAM ermB no contruto do grupo II ClosTron é flanqueado pelos sítos de Recombinação de Flipase (Frt). Através da introdução de flipase recombinase no mutante Δ2,3bdh ClosTron, seja através de conjugação ou de electroporação, o marcador ermB RAM de ~1.3 kb é removido a partir dop genoma do mutante e, deste modo, o marcador ermB marker é reciclado. Um fragmento de 0,8 kb do intron do grupo II deverá ser deixado no genoma. Isto é confirmado através de (i) teste de sua susctibilidade à claritromicina e (ii) por PCR com os iniciadores flanqueado o sítio de inserção de intron do grupo II com os iniciadores Og42f (Seq. ID. 84) e Og43r (Seq. ID. 85) e a sequenciação do produto de PCR. Uma vez obtido o mutante Δ2,3bdh ClosTron sem o marcador ermB RAM (Δ2,3bdh-ermB ClosTron), o gene SecAdh no mutante é objetivado de um modo similar por meio do uso da ferramenta de inativação insercional do intron do grupo II. O sítio de inserção do intron entre as bases 399 e 400 no filamento de sentido é identificado no gene SecAdh usando o algoritmo de Perutka hospedado no ClosTron.com e o cartucho alvo de intron que foi designado (Seq. ID. 110). O cartucho alvo de intron é sintetizado comercialmente através do DNA2.0 e fornecido no vetor pMTL007C-E2 como o pMTL007C-E5-SecAdh-399!400s, que é então introduzido no mutante Δ2,3bdh-ermB ClosTron ou através de conujugação ou de eletroporação. Os transformantes são sequencialmente selecionados em placas de ágar de tiamfenicol e claritromicina e testados através de PCR com os iniciadores SecCTf (Seq. ID. 111) e SecCTr (Seq. ID. 112), tal como explicado precedentemente no Exemplo 3.
[000225] O gene duplo The Δ2,3bdh ΔsecAdh, que rompeu o mutante C. autoethanogenum DSM23693, é criado por meio do uso ou de uma técnica de recombinação homóloga ou de uma ferramenta de inativação insercional de intron do grupo II ClosTron, tal como explicado nos parágrafos acima.
[000226] A ruptura dos genes 2,3bdh e SecAdh e a produção de acetoína, outros metabólitos e de 2,3-BDO é confirmada através da execução de ensaios de atividade de enzima quanto à conversão de acetoína para 2,3- BDO e também através da análise dos produtos produzidos pelo mutante através de HPLC, tal como previamente descrito.
Example 5: Cepa de C. autoethanogenum DSM23693 modificada não produzindo ou produzindo 2,3-BDO reduzido
[000227] Tal como mostrato na Figura 1, o acetoacetato é um dos intermediários na biossítnese de 2,3- BDO e é também o precursor para a síntese de aminoácidos de cadeia ramificada. A enzima acetolactato sintase catalisa a reação, que conduz ao acetolactato a partir de 2 moléculas de piruvato como substratos. A enzima acetolactato sintase é amplamente classificada em dois grupos: (i) a acetolacto sintase anabólica é associada com os genes envolvidos na síntese de aminoácidos ramificados, tais que valina, isoleucina e leucina e (ii) a acetolactato sintase catabólica é associada com a síntese de 2,3-BDO (alsS; aminoácido - AEI90719.1 e ácido nucleico - HQ876013.1).
[000228] O genoma de C. autoethanogenum DSM23693 possui 3 genes de acetolactato sintase anabólicos putativos, ilvC, ilvI and ilvB. A sequência de aminoácido exemplar a partir de C. autoethanogenum (AEI90719.1, AEI90730.1, AEI90731.1, AEI90713.1, AEI90714.1), C. ljungdahlii (ADK15104.1, ADK15104.1, ADK15105.1, ADK15400.1, ADK15400.1), e C. ragsdalei (AEI90734.1, AEI90734.1, AEI90735.1, AEI90727.1, AEI90727.1) e as respectiva sequências de ácido nucleico de C. autoethanogenum (HQ876013.1, HQ876023.1, HQ876021.1), C. ljungdahlii (CP001666.1 - CLJU_c38920, CLJU_c32420, CLJU_c20420-30), e C. ragsdalei (HQ876014.1, HQ876024.1, HQ876022.1) são obtidas a partir do GenBank.
[000229] A ruptura de todos os 4 genes de acetolactato sintase ou qualquer combinação destes 4 genes deveria conduzir a um decréscimo na produção de acetoína e de 2,3-BDO. De um modo assegurar o crescimento destes mutantes, o meio é suplementado com três aminoácidos de cadeia ramificada, valina, leucina e isoleucina.
[000230] Tal como descrito nos Exemplos 1, 3 e 4, os mutantes únicos de C. autoethanogenum DSM23693 alsS, ilvC, ilvI e ilvB podem ser tratados ou através de recombinação homóloga ou através do uso de uma ferramenta de mutagênese de intron do grupo II ClosTron. Design of alsS, ilvC, ilvI and ilvB knockout cassettes:
[000231] Os construtos de eliminação para os genes alsS, ilvC, ilvI e ilvB são designados tal como acima explicado. Os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 113) e 3’ (Seq. ID. 114) do gene alsS são amplificados por PCR através do uso do DNA genômico de C. autoethanogenum DSM23693. Os iniciadores alsS5f (Seq. ID. 115) / alsS5r (Seq. ID. 116) e lsS3f (Seq. ID. 117) / alsS3r (Seq. ID. 118) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos MTL85151 entre os sítios Sbf1/ Not1 e Nhe1/Asc1, de um modo a que seja obtido o pMTL85151-alsS-KO. Este plasmídeo é introduzido no C. autoethanogenum DSM23693, seja através de conjugação ou de eletroporação, tal como descrito nos exemplos acima. Seguindo-se à seleção em placas de tiafenical, os transformantes são testados quanto à eliminação de alsS, usando os iniciadores alsSOf (Seq. ID.119) e alsSOr (Seq. ID.120), que flanqueiam os braços de homologia de alsS para o PCR e sequenciação deste produto de PCR.
[000232] Para a eliminação do gene ilvC, os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 121) e 3’ (Seq. ID. 122) do gene ilvC são amplificados por PCR usando o DNA genômico de C. autoethanogenum DSM23693. Os iniciadores ilvC5f (Seq. ID. 123) / ilvC5r (Seq. ID. 124) e ilvC3f (Seq. ID. 125) / ilvC3r (Seq. ID. 126) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/ Not1 e Nhe1/Asc1, de um modo a que seja então obtido pMTL85151-ilvC-KO. Este plasmídeo é então introduzido no C. autoethanogenum DSM23693, seja através de conjugação ou de eletroporação, tal como descrito nos exemplos acima. Seguindo-se à seleção em placas de tianfenicol, os transformantes são testados quanto à eliminação de ilvC por meio do uso dos iniciadores ilvCOf (Seq. ID. 127) e ilvCOr (Seq. ID. 128), que flanqueiam os braços de homologia do gene ilvC para o PCR e a sequenciação deste produto de PCR.
[000233] Para a eliminação do gene ilvI, os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 129) e 3’ (Seq. ID. 130) do gene ilvI são amplificados por PCR usando o DNA genômico de C. autoethanogenum DSM23693. Os iniciadores ilvI5f (Seq. ID. 131) / ilvI5r (Seq. ID. 132) e ilvI3f (Seq. ID. 133) / ilvI3r (Seq. ID. 134) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/Not1 e Nhe1/Asc1, de um modo a que seja obtido pMTL85151-ilvI-KO. Este plasmídeo é então introduzido no C. autoethanogenum DSM23693, ou através de conjugação ou de eletroporação, tal como descrito nos Exemplos acima. Seguindo-se à seleção em placas de tianfenicol, os transformantes podem ser testados quanto à eliminação de ilvI knockout, usando os iniciadores ilvIOf (Seq. ID.135) e ilvIOr (Seq. ID. 136), que flanqueiam os braços de homologia do gene ilvI para o PCR e a sequenciação deste produto de PCR.
[000234] Para a eliminação do gene ilvB, os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 137) e 3’ (Seq. ID. 138) do gene ilvB são amplificados por PCR usando o DNA genômico de C. autoethanogenum DSM23693. Os iniciadores ilvB5f (Seq. ID. 139) / ilvB5r (Seq. ID. 140) e ilvB3f (Seq. ID. 141) / ilvB3r (Seq. ID. 142) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/Not1 e Nhe1/Asc1 para obter pMTL85151-ilvB-KO. Estes plasmídeos são introduzidos no o C. autoethanogenum DSM23693, seja através de conjugação ou através de eletroporação, tal como descrito nos exemplos acima. Seguindo-se à seleção em placas de tianfenicol, os transfromantes são testados quanto à eliminação de ilvB usando os iniciadores ilvBOf (Seq. ID.143) e ilvBOr (Seq. ID.144), que flanqueiam os braços de homologia do gene ilvB para o PCRe a sequenciação deste produto de PCR.
[000235] Uma vez que os mutantes de eliminação do gene único sejam obtidos, os outros 3 genes de acetolactato sintase são sequencialmente objetivados, de um modo a criar um mutante tendo todos os 4 genes de acetolactato sintase deletados. O crescimento destes mutantes pode ser auxotrófico para aminoácidos de cadeia ramificada. A produção ou a falta de produção de acetoína, 2,3-BDO e de outros metabólitos nestes mutantes pode ser analisada através de HPLC, tal como descrito para os exemplos precedentes. Os ensaios de atividade de enzima com piruvato como o substrato e difosfato de tiamina e dinucleotídeo de flavina adenina como cofatores, que podem ser executados, de um modo a confirmar quanto à perda da atividade de acetolactato sintase nestes mutantes. (Tittmann, Vyazmensky, Hubner, Barak & Chipman, 2005; Vinogradov et al, 2006).
Projeto de cartuchos de objetivação de intron do grupo II ClosTron para os genes alsS, ilvC, ilvI e ilvB:
[000236] Os genes alsS, ilvC, ilvI e ilvB de C. autoethanogenum DSM23693 podem ser também rompidos ou inativados usando a ferramenta de ruptura de gene mediada pelo intron do grupo II ClosTron (Heap et al., 2010). O algoritmo de Perutka hospedado em ClosTron.com é usado para identificar o sítio alco do intron do grupo II entre as bases 303/ 304, 228 / 229, 975 / 976 e 157 / 158 na cepa de sentido dos genes alsS, ilvC, ilvI e na cepa de antissentido do gene ilvB, respectivamente. Outros sítios, identificados pelo algoritmo, podem ser também objetivados. O mesmo algoritmo foi usado para projetar as regiões alvo do intron (alsS - Seq. ID.145; ilvC - Seq. ID.146; ilvI - Seq. ID.147 and ilvB - Seq. ID.148), que podem ser comercialmente sintetizadas pelo DNA2.0 e fornecidas no vetor pMTL007C-E2. Os vetores finais, pMTL007C-E2-alsS-303!304s, pMTL007C-E2-ilvC-228!229s, pMTL007C-E2-ilvI-975!976s e pMTL007C- E2-ilvB-157!158a, contêm um Marcador ermB Ativado por Retrotransposição (RAM), que confere resistência ao antibiótico Claritromicina mediante a inserção no sítio alvo. Estes plasmídeossão introduzidas no C. autoethanogenum DSM23693, ou através de conjugação ou de eletroporação. Os transformantes são sequencialmente selecionados nas placas de ágar de tianfenicol and claritromicina e testados através de PCR com os iniciadores alsSCTf (Seq. ID. 149) e alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) e ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvICTf (Seq. ID. 153) e ilvICTr (Seq. ID. 154) e ilvBCTf (Seq. ID. 155) e ilvBCTr (Seq. ID. 156) para a inativação dos genes alsS, ilvC, ilvI e ilvB, respectivamente.
[000237] Uma vez que os mutantes ClosTron com gene único rompido tenham sido obtidos, o cartucho ermB RAM é removido a partir do genomadestes mutantes por meio do uso de plasmídeos pMTL, que portam um gene de flipase, que é introduzido no mutante ou através de eletroporação ou através de conjugação. Os transformantes resultantes são testados quanto à paerda do cartucho ermB através do teste de sua suscetibilidade à claritromicina e (ii) por PCR com os iniciadores que flanqueiam o sítio de inserção do intron do grupo II com alsSCTf (Seq. ID. 149) e alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) r ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvICTf (Seq. ID. 153) e ilvBICTr (Seq. ID. 154) e ilvBCTf (Seq. ID. 155) e ilvBCTr (Seq. ID. 156) nos genes alsS, ilvC, ilvB1 e ilvB2, respectivamente, e através da sequenciação posterior deste produto de PCR.
[000238] Após confirmar a perda do cartucho ermB, os mutantes ClosTron, tais que os mutantes de eliminação, são sequencialmente objetivados para a inativação dos outros genes de acetolactato sintase. Em ainda uma forma de realização, estes mutantes ClosTron são desenvolvidos na presença de aminoácidos ramificados. A produção ou a falta de produção de acetoína, 2,3-BDO e outros metabólitos nestes mutantes pode ser analisada através de HPLC, tal como descrito nos exemplos precedentes. Os ensaios de atividade de enzima, com piruvato como o substrato e difosfato de tiamina e dinucleotídeo de flavina adenina como cofatores, podem ser executados, de um modo a confirmar quanto à perda da atividade de acetolatato sintase nestes mutantes (Tittman et al, 2005; Vinogradov et al, 2006).
Exemplo 6: Ruptura dos genes da via de 2,3-BDO em C. ljungdhalii e C. ragsdalei
[000239] A via para a produção de 2,3-BDO é conservada através de acetógenos, que incluem C. autoethanogenum, C. ljungdahlii e C. ragsdalei. Os genes alsS, ilvC, ilvI ilvB, budA, 2,3bdh e SecAdh nos três acetógenos compartilham um alto grau de homologia de sequência. Deste modo, estes genes podem ser geneticamente modificados, de um modo a que seja aumentada ou diminuída a produção de 2,3-BDO nos três acetógenos. Métodos para modificar geneticamente C. ljungdahlii através de eletroporação foram descritos (Kopke et al. 2010) (PCT/ NZ2011/ 000203). Os métodos de eletroporação e de conjugação, que foram descritos acima para C. autoethanogenum podem ser aplicados a C. ragsdalei por qualquer pessoa versada na técnica.
[000240] As sequências de aminoácido e de ácido nucleico para os genes C. ljungdahlii e C. ragsdalei alsS, ilvC, ilvB1, ilvB2, budA, e 2,3bdh podem ser obtidas a partir do GenBank. As sequências de nucleotídeo C. ljungdahlii (Seq. ID. 36) e C. ragsdalei (Seq. ID. 37) SecAdh são providas.
[000241] Os plasmídeos ClosTron e de eliminação, que foram usados para romper os genes alsS, ilvC, ilvB1 ilvB2, budA, 2,3bdh e SecAdh aravés de recombinação análoga e de inativação insercional baseada no intron do grupo II ClosTron em C. autoethanogenum podem ser também usados para romper os memos genes C. ljungdahlii e C. ragsdalei. Por exemplo, pMTL85141-budA-ko, pMTL007C-E5-budA-450!451s e pMTL007C-E5- 2,3bdh-468!469s podem ser introduzidos em C. ljungdahlii (explicado abaixo no Exemplo 6a) e C. ragsdalei (explicado abaixo no Exemplo 6b) ou através de eletroporação ou de conjugação, tal como descrito acima para C. autoethanogenum nos Exemplos 1 e 3. Os métodos de teste e de caracterização de mutantes similares podem ser aplicados em C. ljungdahlii e C. ragsdalei.
Example 6a: Ruptura dos genes budA e 2,3bdh em C. Ijungdahlii agtravés de recombinação homóloga e de ferramenta de inativação insercional baseada no intron do grupo II para nenhuma produção e para a produção reduzida de 2,3- BDO.
[000242] Os plasmídeos pMTL85141-budA-ko são introduzidos em C. ljungdahlii através de eletroporação (Koepke et al 2010). Os transformantes são selecionados em placas de ágar-PETC contendo 15 μg/ml de tianfenicol e testados quanto à eliminação de budA usando os iniciadores Og44f (Seq. ID. 29) e Og45r (Seq. ID. 30)
[000243] Para as rupturas do gene budA e 2,3-bdh na ferramenta insercional baseada no intron II do grupo ClosTron, os plasmídeos pMTL007C-E5-budA-450!451s e pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s são introduzidos em C. ljungdahlii através de conjugação. Listras de colônias únicas, seguindo-se à conjugação, são efetuadas, de um modo sequencial, primeiramente em um meio de ágar-PETC contendo 15 μg/ml de thianfenicol e 10 μg/ml de trimetoprim, e a seguir em placas de ágar com metio de PETC contendo 5 μg/ml de Claritromicina. As colônias por plasmídeo são testadas, de um modo aleatório, para a inserção de intron do grupo II, através de PCR, usando os iniciadores Og44f (Seq. ID. 29) e Og45r (Seq. ID. 30), que flanqueiam o sítio de inserção de intron do grupo I no gene budA, e os iniciadores Og42f (Seq. ID. 84) e Og43r (Seq. ID. 85), que flanqueiam o sítio de inserção de intron do grupo II no gene 2,3-bdh gene.
[000244] A eliminação de budA e de 2,3bdh e os mutantes C. ljungdahlii ClosTron gerados acima são analisados quanto à produção de 2,3- DBO e de acetoína através de HPLC e fermentação nos biorreatores, tal como explicado nos Exemplos 1 e 3.
Example 6b: Ruptura dos genes budA e 2,3bdh em C. ragsdalei através de recombinação homóloga e de ferramenta de inativação insercional baseada no intron do grupo II para nenhuma produção e para a produção reduzida de 2,3-BDO.
[000245] Os plasmídeos pMTL85141-budA-ko são introduzidos em C. ragsdalei através de eletroporação, tal como acima descrito para C. autoethaogenum ou C. ljungdahlii, seja através de eletroporação ou de conjugação. Os transformantes são selecionados em placas de águar-PETC contendo 15 μg/ml de tianfenicol e testados quanto à eliminação de budA usando os iniciadores Og44f (Seq. ID. 29) e Og45r (Seq. ID. 30)
[000246] Para as rupturas dos genes budA e 2,3bdh em C. ragsdalei usando uma ferramenta de inativação insercional baseada em intron do grupo II ClosTron, os plasmídeos pMTL007C-E5-budA-450!451s e pMTL007C- E5-2,3bdh-468!469s são introduzidos em C. ragsdalei através de conjugação. Listras de colônias únicas, seguindo-se à conjugação, são produzidas de um modo sequencial, primeiramente em um meio de ágar PETC contendo 15 μg/ml de tianfenicol e 10 μg/ml de trimetoprim, seguido por placas de ágar com meio PETC contendo 5 μg/ml de Claritromicina. Colônias por plasmídeo são testados, de um modo aleatório, para a inserção de intron do grupo II através de PCR, usando os iniciadores Og44f (Seq. ID. 29) e Og45r (Seq. ID. 30), que flanqueiam o sítio de inserção do grupo II no gene budA, e os iniciadores Og42f (Seq. ID. 84) e Og43r (Seq. ID. 85), que flanqueiam o sítio de inserção do intron do grupo II no gene 2,3-bdh.
[000247] A eliminação de budA e 2,3bdh e dos mutantes C. ragsdalei ClosTron gerados acima são analisados quanto à produção de 2,3-BDO e de acetoína, através de HPLC e fermentação nos biorreatores, tal como explicado nos Exemplos 1 e 3.
Example 7: C. ljungdahlii modificado produzindo apenas acetoína
[000248] Tal como explicado anteriormente, a separação de acetoína a partir de etanol é tecnicamente mais exequível comparada à de 2,3-BDO. É, portanto assim desejável que se tenha uma cepa C. ljungdahlii strain produzindo acetoína e não 2,3-BDO. Isto deverá ser então alcançado por meio da deleção ou da ruptura de ambos os genes 2,3bdh e SecAdh em dois modos, tal como explicado no Exemplo 6a: (a) recombinação homóloga e (b) ruptura de gene sem marcador usando a ferramenta Clos Tron. (a) Cepa C. ljungdahlii de eliminação dupla Δ2,3 bdh ΔsecAdh através de recombinação homóloga by homologous recombination:
[000249] Os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 94)e 3’ (Seq. ID. 95) dos genes 2,3bdh são amplificados por PCR usando o DNA genômico de C. ljungdahlii genomic DNA. Os iniciadores Og13f (Seq. ID. 96) / Og14r (Seq. ID. 97) e Og15f (Seq. ID. 98) / Og16r (Seq. ID. 99) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/ Not1 e Nhe1/Asc1, de um modo a que seja obtido pMTL85151-2,3bdh-KO. Este plasmídeo é então introduzido em C. ljungdahlii, ou através de conjugação ou através de eletroporação, tal como descrito no Exemplo 6a acima. Seguindo- se à seleção em placas de tianfenicol, os transformantes são testados quanto à eliminação de 2,3bdh usando os iniciadores Og33f (Seq. ID.100) e Og34r (Seq. ID.101), que flanqueiam os braços de homologia de 2,3bdh para PCR e sequenciação deste produto de PCR..
[000250] O plasmídeo para a eliminação do gene SecAdh é construído de um modo similar. Os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 102) e 3’ (Seq. ID. 103) dos genes SecAdh são amplificados por PCR usando o DNA genômico de C. ljungdahlii. Os iniciadores Sec5f (Seq. ID. 104) / Sec5r (Seq. ID. 105) e Sec3f (Seq. ID. 106) / Sec3r (Seq. ID. 107) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/ Not1 e Nhe1/Asc1 de um modo a que seja obtido pMTL85151-SecAdh-KO. Seguindo-se à seleção em placas de tianfenicol, os transformantes são testados quanto à eliminação de SecAdh usando os iniciadores SecOf (Seq. ID.108) e SecOr (Seq. ID.109), que flanqueiam os braços de homologia do gene SeccAdh para PCR.
[000251] Tendo alcançado a eliminação dos genes 2,3 bdh ou SecAdh em C. ljungdahlii, o segundo gene nestes mutantes únicos é objetivado usando o plasmídeo pMTL85151-2,3bdh-KO ou pMTL85151-SecAdh-KO. O plasmídeo é introduzido no mutante de eliminação de gene único, ou através de eletroporação ou através de conjugação, como já descrito no Exemplo 6a. Os transformantes são testados quanto à eliminação do segundo gene, usando os iniciadores, que flanqueiam os braços de homologia dos genes correspondentes. (b) Ruptura do gene duplo usando ClosTron em C. ljungdahlii:
[000252] O cartucho ermB RAM no construto do intron fo grupo II ClosTron é flanqueado por sítios de Recombinação de Flipase (Frt). Através da introdução de flipase recombinase no mutante Δ2,3bdh ClosTron, ou através de conjugação ou através de eletroporação, o marcador ermB RAM de ~1.3 kb é removido a partir do genoma do mutante e, deste modo, o marcador ermB pode ser então reciclado. Um fragmento de ~0.8 kb do intron do grupo II deverá ser deixado no genoma. Isto é confirmado através de (i) sua suscetibilidade à claritromicina e (ii) por PCR com os iniciadores, que flanqueiam o sítio de inserção do intron do grupo II Og42f com os iniciadores (Seq. ID. 84) e Og43r (Seq. ID. 85) e sequenciando o produto de PCR. Uma vez obtido o mutante Δ2,3bdh ClosTron sem o marcador ermB RAM (Δ2,3bdh-ermB ClosTron), o gene SecAdh gene no mutante é objetivado de um modo similar através do uso de uma ferramenta de inativação insercional do intron do grupo II ClosTron. O sítio de inserção do intron entre as bases 399 e 400 na cepa de sentido é identificado no gene SecAdh gene usando o algoritmo Perutka hospedado em ClosTron.com e o cartucho de objetivação do intron é designado (Seq. ID. 110). O cartucho de objetivação do intron é comercialmente sintetizado por DNA2.0 e fornecido no vetor pMTL007C-E2 como pMTL007C-E5-SecAdh-399!400s, que é introduzido no mutante Δ2,3bdh-ermB ClosTron, através ou de conjugação ou de eletroporação. Os transformantes são sequencialmente selecionados em placas de águar de tianfenicol ou de claritromicina e testados através de PCR com os iniciadores SecCTf (Seq. ID. 111) e SecCTr (Seq. ID. 112), tal como explicado precedentemente no Exemplo 6a.
[000253] O mutante de ruptura C. ljungdahlii Δ2,3bdh ΔSecAdh é criado por meio do uso de qualquer técnica de recombinação homóloga ou através de uma ferramenta de inativação insercional do intron do grupo II ClosTron, tal como explicado nos parágrafos acima.
[000254] A ruptura dos genes 2,3bdh e SecAdh e a produção dos metabólitos e de 2,3-BDO é confirmada por meio da execução de ensaios quanto à atividade da enzima para a conversão de acetoína em 2,3-BDO, e também através da análise dos produtos produzidos pelo mutante HPLC, tal como previamente descrito.
Example 8: Cepa de C. ljungdahlii modificada não produzindo ou produzindo 2,3-BDO reduzido
[000255] Tal como mostrato na Figura 1, o acetolactato é um dos intermediários na biossíntese de 2,3-BDO e é também o precursor para a sítnese de aminoácidos ramificados. A enzima acetolactato sintase catalisa a reação, conduzindo ao acetolactato a partir de 2 moléculas de piruvato como substratos. A enzima acetolactato sintase é amplamente classificada em dois grupos: (i) a acetolactato sintase anabólica está associada com os genes envolvidos na síntese de aminoácidos ramifcados, tais que valina, isoleucina e leucina e (ii) a acetolactato sintase catabólica está associada com a síntese de 2,3-BDO.
[000256] O genoma de C. ljungdahlii possui 3 genes putativs de acetolactato sintase anabólicos, ilvC, ilvI e ilvB e 1 gene de acetolactato sintase catabólico, alsS. A sequência de aminoácido eemplar de C. ljungdahlii (ADK15104.1, ADK15104.1, ADK15105.1, ADK15400.1, ADK15400.1) e as sequências de ácido nucleico de C. ljungdahlii (CP001666.1, CLJU_c38920, CLJU_c32420, CLJU_c20420-30) são obtidos de GenBank.
[000257] A ruptura de todos os 4 genes de acetolactato sintase ou uma combinação destes 4 genes deve conduzir a um decréscimo na produção de acetoína e de 2,3-BDO. De um modo a assegurar o crescimento destes mutantes, o meio é suplementado com os três aminoácidos de cadeia ramificada, valina, leucina e isoleucina.
[000258] Tal como descrito nos Exemplos 6a, e 7 mutantes únicos de C. ljungdahlii alsS, ilvC, ilvI e ilvB podem ser criados ou através de recombinação homóloga ou por meio do uso de uma ferramenta de mutagênese intron do grupo II ClosTron. Projeto de cartuchos de eliminação alsS, ilvC, ilvI e ilvB:
[000259] Os construtos de eliminação para os genes alsS, ilvC, ilvI e ilvB são projetados tal como explicado acima.
[000260] Os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 113) e 3’ (Seq. ID. 114) do gene alsS são amplificados por PCR usando o DNA genômico C. ljungdahlii. Os iniciadores Primers alsS5f (Seq. ID. 115) / alsSr (Seq. ID. 116) e alsS3f (Seq. ID. 117) / alsS3r (Seq. ID. 118) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/ Not1 e Nhe1/Asc1 de um modo a que seja obtido pMTL85151-alsS-KO. Este plasmídeo é introduzido no C. ljungdahlii, ou através de conjugação ou através de eletroporação, tal como descrito nos exemplos acima. Seguindo-se à seleção em placas de tiamfenicol, os transformantes são testados quanto à eliminação de alsS usando os iniciadores alsSOf (Seq. ID.119) e alsSOr (Seq. ID.120) que flanqueiam os braços de homologia de alsS para o PCR e a sequenciação deste produto de PCR.
[000261] Para a eliminação do gene ilvC, os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 121) e 3’ (Seq. ID. 122) do gene ilvC são amplificados por PCR usando o DNA genômico de C. ljungdahlii. Os iniciadores ilvC5f (Seq. ID. 123) / ilvC5r (Seq. ID. 124) e ilvC3f (Seq. ID. 125) / ilvC3r (Seq. ID. 126) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítos Sbf1/ Not1 e Nhe1/Asc1 sites, de um modo a que seja obtido pMTL85151-ilvC-KO. Este plasmídeo é introduzido no C. ljungdahlii, ou através de conjugação ou através de eletroporação, tal como descrito nos exemplos acima. Seguindo-se à seleção das placas de tianfenicol, os transformantes são testados quanto à eliminação de ilvC, usando os iniciadores ilvCOf (Seq. ID. 127) e ilvCOr (Seq. ID. 128), que flanqueiam os braços de homologia do gene ilvC gene para PCR e sequenciação deste produto de PCR.
[000262] Para a eliminação do gene ilvI, os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 129) e 3’ (Seq. ID. 130) do gene ilvI gene são amplificados por PCR usando o DNA genômico de C. ljungdahlii. Os iniciadores ilvI5f (Seq. ID. 131) / ilvI5r (Seq. ID. 132) e ilvI3f (Seq. ID. 133) / ilvI3r (Seq. ID. 134) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/Not1 e Nhe1/Asc1 de um modo a que seja obtido pMTL85151-ilvI-KO. Este plasmídeos é então introduzido em C. ljungdahlii, ou através de conjugação ou através de eletroporação, tal como descrito nos exemplos acima. Seguindo-se à seleção em placas de tianfenicol, os transformantes são testados quanto à aliminação de ilvI, usando os iniciadores ilvIOf (Seq. ID.135) e ilvIOr (Seq. ID. 136), que flanqueiam os braços de homologia do gene ilvI para o PCR e a sequenciaçãod este produto de PCR.
[000263] Para a eliminação do gene ilvB gene, os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 137) e 3’ (Seq. ID. 138) do gene ilvB são amplificados por PCR usando o DNA genômico de C. ljungdahlii. Os iniciadores ilvB5f (Seq. ID. 139) / ilvB5r (Seq. ID. 140) e ilvB3f (Seq. ID. 141) / ilvB3r (Seq. ID. 142) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/Not1 e Nhe1/Asc1, de um modo a que seja obtido pMTL85151-ilvB-KO. Este plasmídeo é introduzido no C. ljungdahlii, ou através de conjugação ou através de eletroporação, tal como descrito nos exemplos acima. Seguindo-se à seleção em placas de tianfenicol, os transformantes são testados quanto à eliminação de ilvB. Usando os iniciadores ilvBOf (Seq. ID.143) e ilvBOr (Seq. ID.144), que flanqueiam os braços de homologia do gene ilvB para o PCR e sequenciação deste produto de PCR.
[000264] Uma vez que os mutantes de eliminação de gene único são obtidos, os outros genes de 3-acetolacto sintase são sequencialmente objetivados para criar um mutante tendo 4 genes de acetolactato sintease deletados. A produção ou a falta de produção de acetoína, 2,3-DBO e de outros metabólitos nos mutantes pode ser analisada através de HPLC, tal como descrito nos exemplos precedentes. Os ensaios de atividade de enzima com piruvato como o substrato e tiamina difosfato de dinucleotídeo de flavina adenina como os cofatores podem ser executados de um modo a confirmar a perda de atividade de acetolactato sintase nestes mutantes (Tittmann, Vyazmensky, Hübner, Barak, & Chipman, 2005; Vinogradov et al., 2006).
Projeto de cartuchos de objetivação de intron do grupo II ClosTron para os genes e alsS, ilvC, ilvI e ilvB genes:
[000265] Os genes C. ljungdahlii alsS, ilvC, ilvI e ilvB podem ser rompidos ou inativados usando uma ferramenta de ruptura de gene mediado por intron do grupo II ClosTron (Heap et al., 2010). O algoritmo de The Perutka hospedado em ClosTron.com é usado para identificar o sítio alco de intrtron do grupo II entre as bases 303/ 304, 228 / 229, 975 / 976 e 157 / 158 na cepa de sentido de alsS, ilvC, ilvI e na cepa de antissentido do gene ilvB, respectivamente. Outros sítos identificados pelo algoritmo podem ser também objetivados. O mesmo algoritmo é usado para projetar as regiões alvo de intron (alsS - Seq. ID.145; ilvC - Seq. ID.146; ilvI - Seq. ID.147 e ilvB - Seq. ID.148), que são comercialemente sintetizadas por DNA2.0 e fornecidas no vetor pMTL007C-E2. Os vetores finais, pMTL007C-E2-alsS-303!304s, pMTL007C-E2-ilvC-228!229s, pMTL007C-E2-ilvI-975!976s e pMTL007C- E2-ilvB-157!158a, contêm um Marcador ermB Ativado por Retrotransposição (RAM), que confere resistência ao antibiótico Claritromicina mediante a inserção no sítio alvo. Estes plasmídeos são introduzidos no C. ljungdahlii ou através de conjugação ou de eletroporação. Os transformantes são sequencialmente selecionados em placas de ágar de tianfeicol ou de claritromicina e testados por PCR com os iniciadores alsSCTf (Seq. ID. 149) e alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) e ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvICTf (Seq. ID. 153) e ilvICTr (Seq. ID. 154) e ilvBCTf (Seq. ID. 155) e ilvBCTr (Seq. ID. 156) para a inativação dos genes alsS, ilvC, ilvI e ilvB, respectivamente.
[000266] Uma vez que os mutantes ClosTron com gene único rompido são obtidos, o cartucho ermB RAM é removido a partir do genoma destes mutantes usando os plasmídeos pMTL, que portam um gene de flipase, que é introduzido no mutante ou através de eletroporação ou de conjugação. Os transformantes resultantes são testados quanto à perda do cartucho ermB através de testes quanto à sua suscetibilidade à claritromicina e (ii) por PCR com os iniciadores, que flanqueiam o sítio de inserção de intron do grupo II com alsSCTf (Seq. ID. 149) e alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) e ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvICTf (Seq. ID. 153) e ilvICTr (Seq. ID. 154) e ilvBCTf (Seq. ID. 155) e ilvBCTr (Seq. ID. 156) nos genes alsS, ilvC, ilvB1 e ilvB2, respectivamente, e adicionalmente através do sequenciamento destes produtos de PCR.
[000267] Após confirmar a perda do cartucho ermB, os mutantes ClosTron, assim como os mutantes de eliminação são sequencialmente objetivados para a inativação de outros genes de acetolactato sintase. Em ainda uma outra forma de realização, estes mutantes ClodTron são desenvolvidos na presença de aminoácidos de cadeia ramificada. A produção ou a falta de produção de acetoína, 2,3-BDO e de outros metabólitos nestes mutantes é analisada por HPLC, tal como descrito nos exemplos prévios e estudado através da execução dos ensaios de atividade de enzima com piruvato como o substrato e difosfato de tiamina e dinucleotídeo de flavina adenina como os cofatores, que podem ser executados, de um modo a confirmar quanto à perda de atividade de acetolactato sintase nestes mutantes (Tittmann et al., 2005; Vinogradov et al., 2006).
Exemplo 9: C. ragsdalei modificado produzindo apenas acetoína
[000268] Tal como explicado anteriormente, a separação de acetoína a partir de etanol é tecnicamente mais exequível, comparada à de 2,3-BDO. É desejável, deste modo, ter uma cepa de C. ragsdalei que produza acetoína e não 2,3-BDO. Isto será ainda alcançado através da deleção ou da ruptura de ambos os genes 2,3bdh e SecAdh em dois ensaios, tal como explicado no Exemplo 6b.: (a) recombinação homóloga e (b) ruptura de gene sem marcador usando a ferramenta ClosTron. (a) Cepa de C. ragsdalei de eliminação dupla Δ2,3bdh ΔSecAdh através de recomibnação homóloga:
[000269] Os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 94) e 3’ (Seq. ID. 95) de genes 2,3bdh são amplifiados por PCR usando o DNA genômico de C. ragsdalei. Os iniciadores Og13f (Seq. ID. 96) / Og14r (Seq. ID. 97) e Og15f (Seq. ID. 98) / Og16r (Seq. ID. 99) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/ Not1 e Nhe1/Asc1 para que seja obtido pMTL85151-2,3bdh-KO. Este plasmídeo é então introduzido no o C. ragsdalei, ou através de conjugação ou através de eletroporação, tal como descrito no Exemplo acima 6b. Seguindo-se à seleção em placas de tianfenicol, os transfromanetes são testados quanto à eliminação de 2,3 bdh usando os iniciadores Og33f (Seq. ID.100) e Og34r (Seq. ID.101), que flanqueiam os braços de homologia de 2,3bdh para PCR e a sequenciação deste produto de PCR.
[000270] O plasmídeo para a eliminação do gene SecAdh é construído de um modo simila. Os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 102) e 3’ (Seq. ID. 103) dos genes SecAdh são amplificados por PCR usando o DNA genômico de C. ragsdalei. Os iniciadores Sec5f (Seq. ID. 104) / Sec5r (Seq. ID. 105) e Sec3f (Seq. ID. 106) / Sec3r (Seq. ID. 107) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/ Not1 e Nhe1/Asc1, de um mkodo a que seja obtido pMTL85151-SecAdh-KO. Seguindo-se à seleção em placas de tianfenicol, os transformantes são testados quanto à eliminação de SecAdh usando os iniciadores SecOf (Seq. ID.108) e SecOr (Seq. ID.109), que flanqueiam os braços de homologia do gene SecAdh para PCR.
[000271] Uma vez tendo sido alcançada a eliminação ou dos gene 2,3 bdh ou do gene SecAdh em C. ragsdalei, o segundog ene nestes mutantes únicos é objetivado usando ou o plasmídeo pMTL85151-2,3bdh-KO ou o plasmídeo pMTL85151-SecAdh-KO. O plasmídeo é então introduzido no mutante de eliminação de gene único, ou através de eletroporação ou através de conjugação, tal como já anteriormente descrito no Exemplo 6b. Os transformantes são testados quanto à eliminação do segundo gene, usando os iniciadores que flanqueiam os braços de homologia dos genes correspondentes. (b) Ruptura de gene duplo Δ2,3bdh ΔsecAdh usando ClosTron em C. ragsdalei:
[000272] O cartucho ermB RAM no construto do intron do grupo II Clos Tron é flanqueado por sítios de Recombinação de Flipase (Frt). Através da introdução de flipase recombinase no mutante Δ2,3bdh ClosTron, ou através de conjugação ou através de eletroporação, o marcador ermB RAM de ~1.3 kb é removido a partir do genoma do mutante e, deste modo, o marcador ermB pode ser então reciclado. Um fragmento de ~0.8 kb do intron do grupo II será deixando no genoma. Isto é confirmado através de (i) teste de sua suscetibilidade à claritromicina, e (ii) por PCR com os iniciadores que flanqueiam o sítio de isnerção de intron do grupo II com os iniciadores Og42f (Seq. ID. 84) e Og43r (Seq. ID. 85) e a sequenciação do produto de PCR. Uma vez obtido o mutante e Δ2,3bdh ClosTron sem o marcador ermB RAM (Δ2,3bdh-ermB ClosTron), o gene SecAdh no mutante é objetivado de um modo similar usando uma ferramenta de inativação insercional de intron do grupo II ClosTron. O sítio de inserção de intron entre as bases 399 e 400 na cepa de sentido é identificado no gene SecAdh usando o algoritmo de Perutka hospedado em ClosTron.com e o cartucho de objetivação de intron designado( Seq. ID. 110). O cartucho de objetivação de intron é comercialmente sintetizado por DNA2.0 e é fornecido no vetor pMTL007C- E2 como pMTL007C-E5-SecAdh-399!400s, que é introduzido no mutante Δ2,3bdh-ermB ClosTron, ou através de conjugação ou através de eletroporação. Os transformantes podem ser sequencialmente selecionados em placas de ágar de tianfenicol e claritromicina e testados por PCR com os iniciadores SecCTf (Seq. ID. 111) e SecCTr (Seq. ID. 112), tal como explicado anteriormente no Exemplo 6b.
[000273] O mutante C. ragsdalei de ruptura de gene duplo Δ2,3bdh ΔSecAdh é criado através do uso de uma técnica de recombinação homóloga ou de uma ferramenta de inativação insercional de intron do grupo II ClosTron group, tal como explicado nos parágrafos acima.
[000274] A ruptura dos genes 2,3bdh e SecAdh é confirmada por meio da execução de ensais de atividade de enzima para a conversão de acetoína para o 2,3-BDO e também através da análise dos metabólitos e de 2,3-BDO produzido pelo mutante através de HPLC, tal como previamente descrito.
Exemplo 10: Cepa de C. ragsdalei não produzindo 2,3-BDO ou produzindo 2,3-BDO reduzido
[000275] Tal como mostrato na Figura 1, o acetolactato é um dos intermediários na biossíntese de 2,3-BDO e é também o precursor para a síntese de aminoácidos de cadeia ramificada. A enzima acetolactato sintase catalisa a reação, conduzindo ao acetolactato a partir de 2 moléculas de piruvato como os substratos. A enzima acetolactato sintase é amplamente classificada em dois grupos: (i) a sintase de acetolactato anabólica está associada com os genes envolvidos na síntese de aminoácidos ramificados, tais que a valina, isoleucina e leucina e (ii) a acetolactato sintase catabólica está associada com a síntese de 2,3- BDO).
[000276] O genoma de C. ragsdalei possui 3 genes de acetolactato sintase anabólica putativos ilvC, ilvI and ilvB e a 1 de acetolactato sintase catabólica, alsS. A sequência de aminoácido exemplar a partir de C. ragsdalei (AEI90734.1, AEI90734.1, AEI90735.1, AEI90727.1, AEI90727.1) e as respectivas sequências de ácido nucleico HQ876014.1, HQ876024.1, HQ876022.1) são obtidas a partir do GenBank.
[000277] A ruptura de todos os 4 genes de acetolactato sintase de ou qualquer combinação destes 4 genes deveria conduzir a um decréscimo na produção de acetoína e de 2,3-BDO. De um modo a assegurar o crescimento destes mutantes, o meio é então suplementado com os três aminoácidos ramificados valina, leucina e isoleucina.
[000278] Tal como descrito nos Exemplos 6b, e 9, os mutantes únicos de C. ragsdalei alsS, ilvC, ilvI e ilvB podem ser criados ou através de recombinação homóloga ou através do uso de uma ferramenta de mutagênese de Intron do grupo II Clos Tron..
Projeto de cartuchos de eliminação de alsS, ilvC, ilvI e ilvB s:
[000279] Os construtos de eliminação para os genes alsS, ilvC, ilvI e ilvB são projetados como acima explicado.
[000280] Os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 113) ed 3’ (Seq. ID. 114) do gene alsS são amplificados por PCR usando DNA genômico de C. ragsdalei. Os iniciadores alsS5f (Seq. ID. 115) / alsSr (Seq. ID. 116) e alsS3f (Seq. ID. 117) / alsS3r (Seq. ID. 118) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/ Not1 and Nhe1/Asc1, de um modo a que seja obtido pMTL85151-alsS-KO. Este plasmídeo é então introduzido no C. ragsdalei ou através de conjugação ou através de eletroporação, tal como descrito nos exemlos acima. Seguindo-se à seleção em placas de tianfenicol, os transformantes são testados quanto à eliminação de alsS usando os iniciadores alsSOf (Seq. ID.119) e alsSOr (Seq. ID.120), que flanqueiam os braços de homologia de alsS para o PCR e a sequenciação deste produto de PCR.
[000281] Para a eliminação do gene ilvC, os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 121) e 3’ (Seq. ID. 122) do gene ilvC são amplificados por PCR usando o DNA genômico de C. ragsdalei. Os iniciadores ilvC5f (Seq. ID. 123) / ilvC5r (Seq. ID. 124) and ilvC3f (Seq. ID. 125) / ilvC3r (Seq. ID. 126) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/ Not1 e Nhe1/Asc1, de um modo a que seja obtido pMTL85151-ilvC-KO. Este plasmídeo é então introduzido em C. ragsdalei, ou através de conjugação ou através de eletroporação, tal como descrito nos exemplos acima. Seguindo-se à seleção em placas de tianfenicol, os transformantes são testados quanto à eliminação de ilvC usando os iniciadores ilvCOf (Seq. ID. 127) e ilvCOr (Seq. ID. 128), que flanqueiam os braços de homologia do gene ilvC para o PCR e a sequenciação deste produto de PCR.
[000282] Para a eliminação do gene ilvI, os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 129) e 3’ (Seq. ID. 130) do gene ilvI são amplificados por PCR usando o DNA genômico de C. ragsdalei. Os iniciadores ilvI5f (Seq. ID. 131) / ilvI5r (Seq. ID. 132) e ilvI3f (Seq. ID. 133) / ilvI3r (Seq. ID. 134) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados nos plasmídeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/Not1 e Nhe1/Asc1, de um modo a que seja obtido pMTL85151- ilvI-KO. Este plasmídeo é então introduzido em C. ragsdalei, ou através de conjugação ou através de eletroporação, tal como descrito nos exemplos acima. Seguindo-se tanto pela conjugação ou pela eletroporação como descrito nos exemplos acima. Seguindo-se à seleção placas de tianfenicol, os transformantes são então testados quanto à eliminação de ilvI, por meio do uso dos iniciadores ilvIOf (Seq. ID.135) e ilvIOr (Seq. ID. 136), que flanqueiam os braços de homologia do gene ilvI gene para PCR e a sequenciação deste produto de PCR.
[000283] Para a eliminação do gene ilvB gene, os braços de homologia de ~1 kb 5’ (Seq. ID. 137) e 3’ (Seq. ID. 138) do gene ilvB são amplificados por PCR usando o DNA genômico de C. ragsdalei. Os iniciadores ilvB5f (Seq. ID. 139) / ilvB5r (Seq. ID. 140) e ilvB3f (Seq. ID. 141) / ilvB3r (Seq. ID. 142) são usados para amplificar os braços de homologia 5’ e 3’, respectivamente. Os dois produtos de PCR são clonados em plasmíeos pMTL85151 entre os sítios Sbf1/Not1 and Nhe1/Asc1, de um modo a que seja obtido pMTL85151-ilvB-KO. Este plasmídeo é então introduzido em C. ragsdalei, ou através de conjugação ou através de eletroporação, tal como descrito nos exemplos acima. Seguindo-se à seleção em placas de tianfenicol, os transformantes são testados quanto à eliminação de ilvB usando os iniciadores ilvBOf (Seq. ID.143) e ilvBOr (Seq. ID.144), que flanqueiam os braços de homologia do gene ilvB gene para PCR e a sequenciação deste produto de PCR.
[000284] Uma vez que os mutantes de eliminação do gene único são obtidos, os outros 3 genes de acetolactato sintase são objetivados, de um modo a criar um mutante tendo 4 genes de acetolactase sintase deletados. O crescimento destes mutantes pode ser auxotrófico para aminoácidos de cadeia ramificada. A produção ou a falta de produção de acetoína, 2,3-BDO ou ainda de outros metabólitos nestes mutantes pode ser analisada através de HPLC, tal como descrito para os exemplos precedentes. Os ensaios de atividade de enzima com o piruvato como o substrato e difosfato de tiamina e dinucleotídeo de flavina adenina como cofatores pode ser executado, de um modo a que seja confirmada a perda de ativiade de acetolactato sintase nestes mutantes (Tittmann, Vyazmensky, Hübner, Barak, & Chipman, 2005; Vinogradov et al., 2006).
[000285] Projeto de cartuchos de objetivação de intron do grupo II ClosTron para os genes alsS, ilvC, ilvI e ilvB:
[000286] Os genes de C. ragsdalei alsS, ilvC, ilvI e ilvB podem ser também rompidos ou inativados por meio do uso de uma ferramenta de ruptura de gene mediada por intron do grupo II ClosTron (Heap et al., 2010). O algoritmo de Perutka hospedado em ClosTron.com é usado para identificar o sítio alvo de intron do grupo II entre as bases 303/ 304, 228 / 229, 975 / 976 e 157 / 158 na cepa de sentido dos genes alsS, ilvC, ilvI e na cepa de antisentidoa do gene lvB, respectivamente. Outros sítios identificados pelo algoritmo podem ser também objetivados. O mesmo algoritmo é usado para projetar as regiões alvo de intron (alsS - Seq. ID.145; ilvC - Seq. ID.146; ilvI - Seq. ID.147 and ilvB - Seq. ID.148) que é comercialemtne sintetizado por DNA2.0 e fornecido no vetor pMTL007C-E2. Os vetores finais, pMTL007C- E2-alsS-303!304s, pMTL007C-E2-ilvC-228!229s, pMTL007C-E2-ilvI- 975!976s e pMTL007C-E2-ilvB-157!158a, contêm um Marcador ermB Ativado por Retrotransposição (RAM), que confere resistência ao antibiótico Claritromicina mediante a inserção no sítio alvo. Estes plasmídeos são introduzidos no C. ragsdalei, ou através de conjugação ou através de eletroporação. Os transformantes são sequencialmente deletados nas placas de ágar de tianfenicol e de claritromicina e testados por PCR com os iniciadores alsSCTf (Seq. ID. 149) e alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) e ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvICTf (Seq. ID. 153) e ilvICTr (Seq. ID. 154) e ilvBCTf (Seq. ID. 155) e ilvBCTr (Seq. ID. 156) para a inativação dos genes alsS, ilvC, ilvI e ilvB, respectivamente.
[000287] Uma vez que os mutantes Clos Tron com gene único rompido sejam obtidos, o cartucho ermB RAM é removido a partir do genoma destes mutantes usando os plasmídeos pMTL, que portam um gene de flipase, que é introduzido no mutante, ou através de eletroporação, ou através de conjugação. Os transformantes resultantes são testados quanto à perda do cartucho ermB por meio do teste de sua suscetibilidade à claritromicina e (ii) por PCR com os iniciadores que flanqueiam o sítio de inserção do intron do grupo II com alsSCTf (Seq. ID. 149) e alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) e ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvICTf (Seq. ID. 153) e ilvICTr (Seq. ID. 154) and ilvBCTf (Seq. ID. 155) and ilvBCTr (Seq. ID. 156) nos genes alsS, ilvC, ilvB1 ilvB2, respectivamente, e posteriormente sequenciação deste produto de PCR.
[000288] Após a confirmação da perda do cartucho ermB, os mutantes ClosTron, de um modo similar aos mutantes de eliminação, são sequencialmente objetivados para a inativação de outros genes de acetolacatato sintase. Em ainda uma outra forma de realização, estes mutantes ClosTron são desenvolvidos na presença de aminoácidos de cadeia ramificada. A produção ou a falta de produção de acetoína, 2,3-BDO e de ainda outros metabólitos neste mutante é analsiada por meio de HPLC, tal como descrito nos exemplos prévios e estudada através da execução de ensaios de atividade de enzima com piruvirato como e substrato e difosfato de tiamina e dinucleotídeo de flavina adenina como os cofatores, podem ser executados, de um modo a que seja confirmada a perda da atividade de acetolactato sintase nestes mutantes (Tittmann et al., 2005; Vinogradov et al., 2006).
[000289] A invenção foi aqui descrita, com referência a certas formas de realização preferidas, de um modo a permitir com que o leitor possa praticar a invenção sem a experimentação indevida. No entanto, uma pessoa tendo habilidade ordinária na técnica irá prontamente reconhecer que muitos dos componentes e parâmetros podem ser variados ou modificados, em uma certa extensão ou ainda substituídos por equivalentes conhecidos, sem que haja afastamento do escopo da invenção. Deve ser ainda apreciado que tais modificações e equivalenes são incorporados a este, como se abordados individualmente. Os títulos, cabeçalhos ou os similares são providos de um modo a aumentar a comrpeensão do leitor deste documento, e não de um modo a limitar o escopo da presente invenção.
[000290] As exposições totais de todos estes pedidos, patentes e publicações, citados acima e abaixo, se houverem, são incorporados a este a título referencial. No entanto, a referência a quaisquer pedidos, patentes e publicações neste relatório, não constitui, e não deve ser considerada como um reconhecimento de qualquer forma de sugestão de que eles possam constituir técnica antecedente válida ou constituir parte do conhecimento geral comum em qualquer país do mundo.
[000291] Ao longo de todo este relatório e em quaisquer das reivindicações que se seguem, a não ser que o contexto o requeira de um outro modo, as palavras “compreendem”, “compreendendo” e as similares, devem ser construídas em um sentido inclusivo, em oposição a um sentido exclusivo, ou seja dizer, no sentido de “incluindo, mas não limitado a”.
[000292] REFERÊNCIAS Abrini, J, Naveau, H. & Nyns, E.J., 1994. Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Archives of microbiology, 161(4), pp.345-351. Available at: http://www.springerlink.com/index/vl43151w30423660.pdf [Accessed September 4, 2011]. Collins, M. D., Lawson, P. A., Willems, A., Cordoba, J. J., Fernandez-Garayzabal, J., Garcia, P., Cai, J., et al. (1994). The phylogeny of the genus Clostridium: proposal of five new genera and eleven new species combinations. International journal of systematic bacteriology, 44(4), 812-26. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7981107 Drake, H. L., Küsel, K., Matthies, C., Wood, H. G., & Ljungdahl, L. G. (2006). Acetogenic Prokaryotes. In M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, & E. Stackebrandt (Eds.), The Prokaryotes (3rd Editio., pp. 354-420). New York, NY: Springer. doi:10.1007/0-387- 30742-7 Kopke, M., Mihalcea, C., Liew, F., Tizard, J. H., Ali, M. S., Conolly, J. J., Al-Sinawi, B., et al. (2011). 2,3-Butanediol Production By Acetogenic Bacteria, an Alternative Route To Chemical Synthesis, Using Industrial Waste Gas. Applied and environmental microbiology, 77(15), 5467-75. doi:10.1128/AEM.00355-11 Perez, J. M., Richter, H., Loftus, S. E., & Angenent, L. T. (2012). Biocatalytic reduction of short-chain carboxylic acids into their corresponding alcohols with syngas fermentation. Biotechnology and bioengineering, 1-30. doi:10.1002/bit.24786 Smart KF, Aggio RB, Van Houtte JR, Villas-Bôas SG, Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry, Nat Protoc. 2010 Sep;5(10):1709-29. 2010 Tanner, R. S., Miller, L. M., & Yang, D. (1993). Clostridium ljungdahlii sp. nov., an acetogenic species in clostridial rRNA homology group I. International journal of systematic bacteriology, 43(2), 232. Retrieved from http://ijs.sgmjournals.org/content/43/2/232.short Heap, J. T., Kuehne, S. a, Ehsaan, M., Cartman, S. T., Cooksley, C. M., Scott, J. C., & Minton, N. P. (2010). The ClosTron: Mutagenesis in Clostridium refined and streamlined. Journal of microbiological methods, 80(1), 49-55. doi:10.1016/j.mimet.2009.10.018 Kopke, M., Held, C., Hujer, S., Liesegang, H., Wiezer, A., Wollherr, A., Ehrenreich, A., et al. (2010). Clostridium ljungdahlii represents a microbial production platform based on syngas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(29), 13087-92. doi:10.1073/pnas.1004716107 Tittmann, K., Vyazmensky, M., Hübner, G., Barak, Z., & Chipman, D. M. (2005). The carboligation reaction of acetohydroxyacid synthase II: steady-state intermediate distributions in wild type and mutants by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(3), 553-8. doi:10.1073/pnas.0408210101 Vinogradov, V., Vyazmensky, M., Engel, S., Belenky, I., Kaplun, A., Kryukov, O., Barak, Z., et al. (2006). Acetohydroxyacid synthase isozyme I from Escherichia coli has unique catalytic and regulatory properties. Biochimica et biophysica acta, 1760(3), 356-63. doi:10.1016/j.bbagen.2005.10.008 Yan, Y., Lee, C.-C., & Liao, J. C. (2009). Enantioselective synthesis of pure (R,R)-2,3-butanediol in Escherichia coli with stereospecific secondary alcohol dehydrogenases. Organic & biomolecular chemistry, 7(19), 3914-7. doi:10.1039/b913501d

Claims (9)

1. Micro-organismo acetogênico carboxidotrófico recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma modificação genética que rompe a via de biossíntese de 2,3-butanodiol comparado a um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico parental e produz uma quantidade reduzida de 2,3-butanodiol e/ ou de um precursor do mesmo, comparado a um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico parental, e produz pelo menos um produto desejado por fermentação de um substrato gasoso compreendendo CO, em que o micro-organismo acetogênico carboxidrotrófico compreende pelo menos uma modificação genética que rompe a expressão e/ ou a atividade de uma enzima selecionada do grupo consistindo de uma enzima capaz de converter piruvato para acetolactato (acetolactato sintase (alsS)), uma enzima capaz de converter acetolactato para acetoína (acetolactato descarboxilase (budA)), e uma enzima capaz de converter acetoína para 2,3-butanodiol (selecionada do grupo consistindo em 2,3-butanodiol desidrogenase (2,3-dbh), uma acetoína redutase, uma álcool desidrogenase primária:secundária e misturas das mesmas), em que o micro-organismo parental é selecionado ado grupo compreendendo Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, e Clostridium coskatii.
2. Micro-organismo acetogênico carboxidotrófico recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma modificação genética que rompe a via de biossíntese de 2,3-butanodiol comparado a um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico parental e assim produz uma quantidade reduzida de 2,3-butanodiol e/ ou de um precursor do mesmo, comparado a um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico parental, e produz etanol como produto principal por fermentação de um substrato compreendendo CO, em que o micro-organismo acetogênico carboxidrotrófico compreende pelo menos uma modificação genética que rompe a expressão e/ ou a atividade de uma enzima selecionada do grupo consistindo de uma enzima capaz de converter piruvato para acetolactato (acetolactato sintase (alsS)), uma enzima capaz de converter acetolactato para acetoína (acetolactato descarboxilase (budA)), e uma enzima capaz de converter acetoína para 2,3-butanodiol (selecionada do grupo consistindo em 2,3-butanodiol desidrogenase (2,3-dbh), uma acetoína redutase, uma álcool desidrogenase primária:secundária e misturas das mesmas).
3. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que em que o micro-organismo é adaptado para produzir adicionalmente pelo menos um produto selecionado do grupo consistindo em formato, lactato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, acetolactato, malato, fumerato, 2-oxogluterato, e citrato.
4. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é adaptado para produzir uma quantidade aumentada de pelo menos um produto selecionado do grupo consistindo em etanol, formato, lactato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, acetolactato, malato, fumerato, 2- oxogluterato, e citrato comparado a um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico parental.
5. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo acetogênico carboxidotrófico compreende pelo menos uma modificação genética que rompe a expressão e/ ou a atividade de uma combinação de duas ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo daquelas enzimas capazes de converter piruvato para acetolactato (acetolactato sintase (alsS)), acetolactato para acetoína (acetolactato descarboxilase (budA)), e acetoína para 2,3-butanodiol (selecionada do grupo consistindo em 2,3-butanodiol desidrogenase (2,3-dbh), uma acetoína redutase, uma álcool desidrogenase primária:secundária e misturas das mesmas).
6. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma modificação genética rompe a expressão e/ou atividade de pelo menos uma enzima selecionada do grupo consistindo em Acetolactato sintase (alsS), Acetolactato descarboxilase (BudA), 2,3-Butanodiol desidrogenase (2,3-dbh), acetoína redutase, e álcool desidrogenase primária:secundária.
7. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo parental é Clostridium autoethanogenum DSM23693.
8. Método para a produção de um ou mais produtos, caracterizado pelo fato de compreende fermentação de um substrato compreendendo CO usando um micro-organismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o dito produto é preferivelmente um ou mais de etanol, formato, lactato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, acetolactato, malato, fumerato, 2-oxogluterato, citrato.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) prover um substrato compreendendo CO a um biorreator contendo uma cultura de um ou mais micro-organismos como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; e (b) fermentar anaerobicamente a cultura no biorreator para produzir um ou mais produtos, preferivelmente incluindo etanol; ou (c) capturar o gás contendo CO produzido como um resultado de um processo industrial, antes que o gás seja liberado na atmosfera; (d) fermentação anaeróbica do gás contendo CO para produzir um ou mais produtos, preferivelmente incluindo etanol, por meio de uma cultura contendo um ou mais micro-organismos como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; e opcionalmente compreendendo adicionalmente a etapa de recuperar um ou mais produtos a partir do caldo de fermentação; em que preferivelmente o substrato compreende pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% de CO em volume.
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