ES2583203T3 - Microorganismos recombinantes y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Microorganismos recombinantes y métodos de uso de los mismos Download PDF

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seq
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Michael Koepke
Shilpa NAGARAJU
Wendy Chen
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Lanzatech New Zealand Ltd
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Abstract

Un microorganismo acetógeno carboxidotrófico recombinante que está adaptado para producir uno o más productos y una cantidad reducida o no producir sustancialmente 2,3-butanodiol por fermentación de un sustrato que comprende monóxido de carbono, comprendiendo el microorganismo una o más modificaciones genéticas que alteran la ruta de biosíntesis del 2,3-butanodiol, comparado con un microorganismo original, en donde la una o más modificaciones genéticas que alteran la ruta de biosíntesis del 2,3-butanodiol se seleccionan de: (a) al menos una modificación genética que altera la expresión y/o actividad de una o más enzimas capaces de convertir el piruvato en acetolactato; (b) al menos una modificación genética que altera la expresión y/o actividad de una o más enzimas capaces de convertir el acetolactato en acetoína; (c) al menos una modificación genética que altera la expresión y/o actividad de una o más enzimas capaces de convertir la acetoína en 2,3-butanodiol; y (d) combinaciones de las mismas.

Description

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SEQ ID 80: Secuencia en la dirección 5' o brazo de homología del gen budA de Clostridium ragsdalei. SEQ ID 81: Secuencia en la dirección 3' o brazo de homología del gen budA de Clostridium ragsdalei SEQ ID 82: Secuencia de nucleótidos de la región a la que se dirige ClosTron en budA de C. autoethanogenum
DSM23693
SEQ ID 83: Secuencia de nucleótidos de la región a la que se dirige ClosTron en 2,3bdh de C. autoethanogenum DSM23693 SEQ ID 84: Oligonucleótido Og42f usado para el cribado de mutantes de Δ2,3bdh ClosTron SEQ ID 85: Oligonucleótido Og43r usado para el cribado de mutantes de Δ2,3bdh ClosTron SEQ ID 86: Secuencia de nucleótidos del producto amplificado por PCR de ARNr 16s del clon 2 de Δ2,3bdh
ClosTron de C. autoethanogenum DSM23693 obtenido usando el cebador fD1.
SEQ ID 87: Secuencia de nucleótidos del producto amplificado por PCR de ARNr 16s del clon 2 de Δ2,3bdh ClosTron de C. autoethanogenum DSM23693 obtenido usando el cebador rP2. SEQ ID 88: Secuencia de nucleótidos del producto de PCR de ARNr 16s del clon 4 de Δ2,3bdh ClosTron de C.
autoethanogenum DSM23693 obtenido usando el cebador fD1.
SEQ ID 89: Secuencia de nucleótidos del producto de PCR de ARNr 16s del clon 4 de Δ2,3bdh ClosTron de C. autoethanogenum DSM23693 obtenido usando el cebador rP2. SEQ ID 90: Secuencia de nucleótidos del producto de PCR de ARNr 16s del clon 1 de ΔbudA ClosTron de C.
autoethanogenum DSM23693 obtenido usando el cebador fD1.
SEQ ID 91: Secuencia de nucleótidos del producto de PCR de ARNr 16s del clon 1 de Δbud4 ClosTron de C. autoethanogenum DSM23693 obtenido usando el cebador rP2. SEQ ID 92: Secuencia de nucleótidos del producto de PCR de ARNr 16s del clon 3 de ΔbudA ClosTron de C.
autoethanogenum DSM23693 obtenido usando el cebador fD1.
SEQ ID y 93: Secuencia de nucleótidos del producto de PCR de ARNr 16s del clon 3 de ΔbudA ClosTron de C. autoethanogenum DSM23693 obtenido usando el cebador rP2. SEQ ID 94: Secuencia de nucleótidos del brazo de homología 5' del gen 2,3bdh de C. autoethanogenum DSM23693. SEQ ID 95: Secuencia de nucleótidos del brazo de homología 3' del gen 2,3bdh de C. autoethanogenum DSM23693. SEQ ID 96 y 97: Los cebadores usados para amplificar el brazo de homología 5' del gen 2,3bdh de C.
autoethanogenum DSM23693.
SEQ ID 98 y 99: Los cebadores usados para amplificar el brazo de homología 3' del gen 2,3bdh de C. autoethanogenum DSM23693. SEQ ID 100 y 101: Cebadores flanqueadores que se pueden usar para confirmar la inactivación del gen 2,3bdh de
C. autoethanogenum DSM23693.
SEQ ID 102: Secuencia de ácido nucleico del brazo de homología 5' del gen SecAdh de C. autoethanogenum DSM23693 SEQ ID 103: Secuencia de ácido nucleico del brazo de homología 3' del gen SecAdh de C. autoethanogenum
DSM23693
SEQ ID 104 y 105: Cebadores usados para amplificar el brazo de homología 5' del gen 2,3bdh de C. autoethanogenum DSM23693. SEQ ID 106 y 107: Cebadores usados para amplificar el brazo de homología 3' de C. autoethanogenum DSM23693
2,3bdh.
SEQ ID 108 y 109: Cebadores que se pueden usar para confirmar la inactivación génica del gen SecAdh de C. autoethanogenum DSM23693. SEQ ID 110: Secuencia de nucleótidos del casete director de intrón del grupo II para el gen SecAdh de C.
autoethanogenum DSM23693. SEQ ID 111 y 112: Cebadores flanqueadores que se pueden usar para confirmar la inactivación insercional del gen
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Se usan abreviaturas IUPAC convencionales para todas las secuencias, véase http://en.M.wikipedia.org/wiki/Nucleic acid notation#section 1. A modo de ejemplo:
A
Adenosina
C
Citidina
G
Guanosina
T
Timidina
W
A o T
S
C o G
M
A o C
K
G o T
R
A o G
Y
C o T
B
C, G o T
D
A, G o T
H
A, C o T
V
A, C o G
N o
cualquier base (no un hueco), A, C, G, T
Descripción detallada de la invención
A continuación se da una descripción de la presente invención, que incluye realizaciones generales de la misma, dadas en términos generales. La invención se elucida adicionalmente en la descripción dada bajo el encabezado "Ejemplos" a continuación en la presente memoria, que proporciona datos experimentales que respaldan la invención, ejemplos específicos de diferentes aspectos de la invención y medios ilustrativos de llevar a cabo la invención.
La invención proporciona microorganismos capaces de producir uno o más productos por fermentación de un sustrato que comprende CO. En una realización particular, la invención proporciona microorganismos capaces de producir etanol o, etanol y uno o más de otros productos, por fermentación de un sustrato que comprende CO. El microorganismo recombinante produce al menos una cantidad reducida de 2,3-butanodiol comparado con un microorganismo original. En una realización, no produce sustancialmente 2,3-butanodiol o un precursor del mismo comparado con un microorganismo original.
Mediante varios estudios de inactivación de genes, los autores de la invención han identificado sorprendentemente que si se altera la ruta de biosíntesis del 2,3-butanodiol en un microorganismo acetógeno carboxidotrófico, el microorganismos es capaz de producir niveles mayores de formiato, lactato, succinato, 2-oxoglutarato, valina, leucina, isoleucina y etanol, comparado con el microorganismo original. Los autores de la invención también creen que los microorganismos producen niveles mayores de piruvato y compuestos intermedios del ciclo de TCA acetolactato, malato, fumarato, citrato, puesto que estos son precursores de la producción de succinato, 2oxoglutarato y valina, leucina e isoleucina. Esto tiene una serie de ventajas significativas. Una ventaja principal es un aumento de la eficacia de la producción de etanol incluyendo niveles mayores de etanol producido. Sin querer estar limitados por ninguna teoría particular, los autores de la invención creen que los niveles mayores de valina, leucina, formiato, lactato y piruvato, dan como resultado que estén disponibles más de estos productos químicos para los microorganismos para alimentar la producción de etanol. Además, los caldos de fermentación a menudo deben ser complementados con aminoácidos y otros productos químicos para asegurar la viabilidad y eficacia de producción del microorganismo durante la fermentación. La producción de valina, leucina, formiato, lactato y piruvato por un microorganismo recombinante de la invención obvia la necesidad de complementar el caldo de fermentación con estos productos químicos, lo cual puede producir ahorro en los costes. Además, la reducción o eliminación de la producción de 2,3-butanodiol en los microorganismos de la invención tiene ventajas. El 2,3-butanodiol puede ser tóxico para los microorganismos y por lo tanto puede tener un efecto negativo en la fermentación y crecimiento. La reducción o eliminación de 2,3-butanodiol del caldo de fermentación también permite una recuperación más fácil del etanol del caldo; típicamente tanto el etanol como el 2,3-butanodiol deben recuperarse juntos y después separar en una etapa posterior. El 2,3-butanodiol también es una fuente de potencial contaminación microbiana en un fermentador, puesto que es un sustrato para muchos organismos indeseables. Además, el succinato, 2-oxoglutarato,
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formiato, lactato, piruvato, valina, leucina e isoleucina tienen valor económico independiente ya que se pueden usar en una serie de procedimientos comerciales y como compuestos intermedios en la producción de productos químicos corriente abajo.
Los autores de la invención han demostrado por primera vez la alteración o inactivación génica de un gen no esencial en un microorganismo acetógeno carboxidotrófico. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención también proporciona microorganismos acetógenos carboxidotróficos en los que se ha alterado uno o más genes no esenciales comparado con un microorganismo original, junto con métodos de producción de dichos microorganismos y métodos de uso de dichos microorganismos. Un gen "no esencial" es uno que codifica una proteína que no es necesaria para la supervivencia de un microorganismo, de modo que el microorganismo puede sobrevivir sin suministro de la proteína. Los ejemplos de genes no esenciales incluyen los que codifican la acetolactato descarboxilasa y 2,3-butanodiol deshidrogenasa. Los expertos en la técnica serán capaces de identificar genes no esenciales usando técnicas convencionales en la materia, incluyendo técnicas recombinantes para alterar genes (como se describen en la presente memoria) junto con ensayos convencionales para ensayar si dichas modificaciones genéticas tienen un efecto en la supervivencia de los microorganismos.
Aunque la descripción de la invención en lo sucesivo se centra en la alteración de la ruta de biosíntesis del 2,3butanodiol por modificación genética, debe apreciarse que los microorganismos de la descripción también pueden incluir una o más modificaciones genéticas adicionales si se desea (incluyendo la alteración de uno o más genes no esenciales no asociados con la ruta de biosíntesis del 2,3-butanodiol. En el caso del aspecto de la descripción relacionado con la alteración de genes no esenciales, debe apreciarse que están abarcadas modificaciones genéticas en genes que codifican otras enzimas distintas de las de la ruta del 2,3-butanodiol.
Además, aunque la descripción en lo sucesivo se puede centrar en la producción y recuperación de etanol como producto principal, debe apreciarse que la invención se puede usar para aumentar el nivel de producción de uno o más productos distintos del etanol o además del etanol.
Definiciones
Como se menciona en la presente memoria, un "caldo de fermentación" es un medio de cultivo que comprende al menos un medio nutriente y células bacterianas.
Como se menciona en la presente memoria, un microorganismo transportador es un microorganismo en el que se expresa una enzima metiltransferasa y es distinto del microorganismo destino.
Como se menciona en la presente memoria, un microorganismo destino es un microorganismo en el que son expresados los genes incluidos en una construcción/vector de expresión y es distinto del microorganismo transportador.
La expresión "producto de fermentación principal" se pretende que signifique el producto de fermentación que es producido en la mayor concentración y/o rendimiento.
Las expresiones "aumento de la eficacia", "mayor eficacia" y similares, cuando se usan en relación con un proceso de fermentación incluyen, pero no se limitan, a aumentar uno o más de la velocidad de crecimiento de los microorganismos que catalizan la fermentación, la velocidad de crecimiento y/o producción de producto, el volumen de producto deseado (tal como alcoholes) producido por volumen de sustrato consumido, la velocidad de producción
o nivel de producción del producto deseado, y la proporción relativa del producto deseado producido comparado con otros subproductos de la fermentación.
Debe entenderse que la frase "sustrato que comprende monóxido de carbono" y las expresiones similares incluyen cualquier sustrato en el que haya disponible monóxido de carbono para una o más cepas de bacterias para el crecimiento y/o la fermentación, por ejemplo.
La frase "sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono" y frases y términos similares, incluyen cualquier gas que contiene un nivel de monóxido de carbono. En algunas realizaciones, el sustrato contiene al menos de aproximadamente 20% a aproximadamente 100% de CO en volumen. El sustrato también puede contener de 20% a 70% de CO en volumen, de 30% a 60% de CO en volumen, y de 40% a 55% de CO en volumen, aproximadamente 25%, o aproximadamente 30%, o aproximadamente 35%, o aproximadamente 40%, o aproximadamente 45%, o aproximadamente 50% de CO, o aproximadamente 55% de CO, o aproximadamente 60% de CO en volumen.
Aunque no es necesario que el sustrato contenga hidrógeno, la presencia de H2 no debería ser perjudicial para la formación de producto de acuerdo con métodos de la descripción. En realizaciones particulares, la presencia de hidrógeno da como resultado una eficacia total mejorada de producción de alcohol. Por ejemplo, en realizaciones particulares, el sustrato puede comprender una relación aproximada de 2:1, o 1:1, o 1:2 de H2:CO. En una descripción, el sustrato comprende aproximadamente 30% o menos de H2 en volumen, 20% o menos de H2 en volumen, aproximadamente 15% o menos de H2 en volumen o aproximadamente 10% o menos de H2 en volumen. En otras descripciones, la corriente de sustrato comprende concentraciones bajas de H2, por ejemplo menos de 5%,
o menos de 4%, o menos de 3%, o menos de 2%, o menos de 1%, o está sustancialmente exenta de hidrógeno. El
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sustrato también puede contener algo de CO2 por ejemplo, tal como de aproximadamente 1% a aproximadamente 80% de CO2 en volumen, o de 1% a aproximadamente 30% de CO2 en volumen. En una descripción el sustrato comprende menos o igual a aproximadamente 20% de CO2 en volumen. En descripciones particulares, el sustrato comprende menos de o igual a aproximadamente 15% de CO2 en volumen, menos de o igual a aproximadamente 10% de CO2 en volumen, menos de o igual a aproximadamente 5% de CO2 en volumen o sustancialmente no comprende CO2.
En la siguiente descripción, las realizaciones de la invención se describen en términos de suministro y fermentación de un "sustrato gaseoso que contiene CO". Sin embargo, debe apreciarse que el sustrato gaseoso se puede proporcionar en formas alternativas. Por ejemplo, el sustrato gaseoso que contiene CO se puede proporcionar disuelto en un líquido. Esencialmente, se satura un líquido con un gas que contiene monóxido de carbono y después se añade el líquido al biorreactor. Esto se puede lograr usando metodología convencional. A modo de ejemplo, se podría usar un generador de dispersión de microburbujas (Hensirisak et. al. "Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation"; Applied Biochemistry and Biotechnology, Volumen 101, Número 3 / Octubre, 2002). A modo de ejemplo adicional, el sustrato gaseoso que contiene CO se puede adsorber en un soporte sólido. Dichos métodos alternativos están englobados por el uso de la expresión "sustrato que contiene CO" y similares.
En descripciones particulares de la invención, el sustrato gaseoso que contiene CO es un gas residual o de descarga industrial. Los "gases residuales o de descarga industrial" deben considerarse de forma amplia que incluyen cualesquiera gases que comprenden CO producido por un procedimiento industrial, e incluyen gases producidos como resultados de la fabricación de productos metálicos ferrosos, fabricación de productos no ferrosos, procedimientos de refinado del petróleo, gasificación de carbón, gasificación de biomasa, producción de energía eléctrica, producción de negro de humo y fabricación de coque. Se pueden proporcionar ejemplos adicionales en otra parte en la presente memoria.
Salvo que el contexto requiera otra cosa, las frases "fermentación", "procedimiento de fermentación" o "reacción de fermentación" y similares, como se usan en la presente memoria, se pretende que abarquen tanto la fase de crecimiento como la fase de biosíntesis de producto del procedimiento. Como se describirá además en la presente memoria, el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de fermentación. Como tal, la adición de metales o composiciones a la reacción de fermentación debe entenderse que incluye la adición a uno o ambos de estos reactores.
El término "biorreactor" incluye un dispositivo de fermentación que consiste en uno o más recipientes y/o torres o disposición de tuberías, que incluyen el reactor de tanque agitado continuo (CSTR), reactor de celdas inmovilizadas (ICR), reactor de lecho percolador (TBR), columna de burbujeo, fermentador de levantamiento por aire, mezclador estático u otro recipiente u otros dispositivos adecuados para el contacto con el gas-líquido. Como se describe en lo sucesivo, el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de fermentación. Como tal, cuando se menciona la adición de sustrato al biorreactor o reacción de fermentación debe entenderse que incluye adición a cualquiera o ambos de estos reactores donde sea apropiado.
Cuando se usa en relación con los productos de fermentación de acuerdo con la invención, "uno o más productos" y frases similares se pretende que incluyan etanol, succinato, piruvato, lactato, valina, formiato, isoleucina, y leucina, por ejemplo. En una realización, "uno o más productos" también pueden incluir uno o más de acetolactato, malato, fumarato, citrato y 2-oxoglutarato. Debe apreciarse que los métodos de la invención se pueden aplicar a métodos destinados a la producción y recuperación de etanol (solo o en combinación con otros productos) o la producción y recuperación de productos distintos del etanol.
El término "acetato" incluye tanto la sal de acetato sola como una mezcla de ácido acético molecular o libre y sal de acetato, tal como la mezcla de sal de acetato y ácido acético libre presente en un caldo de fermentación como se puede describir en la presente memoria. La relación de ácido acético molecular a acetato en el caldo de fermentación depende del pH del sistema. Los términos succinato, piruvato, lactato, formiato, acetolactato, malato, fumarato, citrato y 2-oxoglutarato, deben considerarse de forma similar.
Salvo que el contexto requiera otra cosa, la referencia a cualquier compuesto en la presente memoria que puede existir en una o más formas isómeras (por ejemplo, forma D, L, meso, S, R, cis o trans) debe considerarse en general que incluye la referencia a uno cualquiera o más de dichos isómeros del compuesto. Por ejemplo, la referencia a "acetoína" debe considerarse que incluye la referencia a cualquiera o ambos de sus isómeros D y L.
Los "ácidos nucleicos exógenos" son ácidos nucleicos que se originan fuera del microorganismo en el que se introducen. Los ácidos nucleicos exógenos se pueden obtener de cualquier fuente adecuada incluyendo, pero no limitado, al microorganismo en el que se van a introducir, cepas o especies de los organismos que difieren del organismo en el que se deben introducir, o se pueden crear de forma artificial o recombinante. El ácido nucleico exógeno se puede adaptar para integrarlo en el genoma del microorganismo al que se va a introducir o para permanecer en un estado extracromosómico.
La "ruta de biosíntesis del 2,3-butanodiol" es una ruta de reacciones que incluyen la conversión de piruvato en acetolactato, acetolactato en acetoína, y acetoína en 2,3-butanodiol.
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otros elementos, sitios y marcadores. En una realización particular, las construcciones o vectores están adaptados para permitir la alteración de un gen natural de un microorganismo original. En otra descripción, las construcciones o vectores se adaptan para permitir la expresión de uno o más genes codificados por la construcción o vector. Las construcciones o vectores de ácido nucleico incluyen ácidos nucleicos desnudos así como ácidos nucleicos formulados con uno o más agentes para facilitar el suministro a una célula (por ejemplo, ácido nucleico conjugado con liposoma, un organismo en el que está contenido el ácido nucleico).
A lo largo de esta memoria descriptiva, se proporciona información de secuencias de ejemplo para enzimas aplicables a la invención (por ejemplo, acetolactato sintasa, acetolactato descarboxilasa, 2,3-butanodiol deshidrogenasa, acetoína reductasa). Esta información se proporciona para identificar enzimas de ejemplo aplicables a la invención y permitir a un experto en la técnica la práctica de realizaciones específicas de la invención sin excesiva experimentación. Debe apreciarse que las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para las enzimas pueden diferir de un microorganismo a otro. Por consiguiente, la invención no debe considerarse que esté limitada a esas realizaciones específicas sino que se extiende a la alteración de enzimas que tienen diferentes secuencias pero que son capaces de catalizar la conversión de piruvato en acetolactato, la conversión de acetolactato en acetoína, y/o la conversión de acetoína en 2,3-butanodiol. Típicamente, dichas enzimas tendrán una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 75% con la enzima ilustrada en la presente memoria. En descripciones particulares, dichas enzimas tendrán al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%
o 99% de identidad de secuencia con una enzima ilustrada en la presente memoria. A nivel del ácido nucleico, los genes que codifican dichas enzimas variantes tendrán al menos una homología de secuencia de aproximadamente 75% con un ácido nucleico que codifica una enzima ilustrada en la presente memoria. En descripciones particulares dichos ácidos nucleicos tendrán una homología de secuencia de al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%
o 99% con un ácido nucleico que codifica una enzima ilustrada en la presente memoria.
Debe apreciarse que no es necesario que la enzima variante tenga el mismo nivel de actividad que una enzima ilustrada específicamente en la presente memoria. Todo lo que se requiere es que tenga algún nivel de actividad en la catálisis de la conversión de interés. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente otras de dichas enzimas, en particular a la luz de la información contenida en la presente memoria. Los ensayos enzimáticos útiles para evaluar actividades de enzimas para la ruta del 2,3-butanodiol incluyen, por ejemplo, el ensayo Voges-Proskauer descrito por Speckman y Collins (Specificity of the Westerfeld Adaptation of the Voges-Proskauer Test, 1982, Appl. Environ. Microbiol. 44: 40-43) o Dulieu y Poncelet (Spectrophotometric assay of acetolactate decarboxylase, 1999, Enzy and Microbiol Technol, 25, 537-42).
Microorganismo
Como se ha descrito en la presente memoria antes, la invención proporciona un microorganismo recombinante capaz de usar monóxido de carbono para producir uno o más productos (en una realización particular, etanol como el producto principal) y producir una cantidad reducida o no producir sustancialmente 2,3-butanodiol y/o un precursor del mismo comparado con un microorganismo original. El microorganismo comprende una o más modificaciones genéticas (comparado con el microorganismo original) que alteran la ruta de biosíntesis del 2,3-butanodiol.
Como se ha indicado antes, en una realización, el microorganismo produce etanol como el producto principal. En una realización, el microorganismo también produce uno o más de formiato, lactato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina. En una realización particular, el microorganismo está adaptado para producir una mayor cantidad de uno o más de etanol, formiato, lactato, piruvato, succinato, valina, leucina, isoleucina, comparado con el microorganismo original. En algunas realizaciones, el microorganismo produce uno o más de acetolactato, malato, citrato, fumarato, 2-oxoglutarato. En una realización particular, el microorganismo está adaptado para producir una mayor cantidad de uno o más de acetolactato, malato, fumarato, 2-oxoglutarato.
La una o más modificaciones genéticas preferiblemente alteran la expresión y/o actividad de una o más enzimas capaces de convertir piruvato en acetolactato, acetolactato en acetoína, acetoína en 2,3-butanodiol. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones genéticas alteran la conversión de piruvato en acetolactato solo, la conversión de acetolactato en acetoína solo, o la conversión de acetoína en 2,3-butanodiol solo. En otras realizaciones, la una o más modificaciones genéticas alteran dos o tres de estas conversiones.
En una realización, la una o más enzimas capaces de convertir el piruvato en acetolactato es una acetolactato sintasa (alsS).
La actividad de la acetolactato sintasa es capaz de convertir piruvato en acetolactato y es esencial para la producción de aminoácidos de cadena ramificada (incluyendo valina, leucina, isoleucina) (Figura 1). En un microorganismo original pueden ser expresadas una o más enzimas que tienen actividad de acetolactato sintasa. Los ejemplos de secuencia de aminoácidos de C. autoethanogenum (AEI90719.1, AEI90730.1, AEI90731.1, AEI90713.1, AEI90714.1), C. ljungdahlii (ADK15104.1, ADK15104.1, ADK15105.1, ADK15400.1, ADK15400.1), y C. ragsdalei (AEI90734.1, AEI90734.1, AEI90735.1, AEI90727.1, AEI90727.1) y respectivas secuencias de ácidos nucleicos de C. autoethanogenum (HQ876013.1, HQ876023.1, HQ876021.1), C. ljungdahlii (CP001666.1 CLJU_c38920, CLJU_c32420, CLJU_c20420-30), y C. ragsdalei (HQ876014.1, HQ876024.1, HQ876022.1) se pueden obtener de GenBank. Sin embargo, como se ha indicado antes en la presente memoria, la secuencia del
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isoleucina, etanol, lactato, formiato y succinato, y/o uno o más compuestos intermedios del ciclo de TCA por encima del nivel que se puede lograr si solo se altera una sola enzima. Los niveles de producción se pueden aumentar más con la alteración de cada enzima adicional presente en el microorganismo original. Aunque la alteración de la expresión y/o actividad de todas dichas enzimas de actividad puede proporcionar algunas ventajas en términos de producción de los productos deseados, los autores de la invención no contemplan que sea necesaria alterar la expresión y/o actividad de todas dichas enzimas con el fin de obtener los beneficios de la invención.
En una realización, se alteran al menos dos o tres enzimas capaces de convertir la acetoína en 2,3-butanodiol.
En una realización, el microorganismo se selecciona del grupo de organismos acetógenos carboxidotróficos, que comprenden las especies Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei.
Estos acetógenos carboxidotróficos se definen por su capacidad para usar y crecer de forma quimioautotrófica en fuentes gaseosas de un carbono (C1) tales como monóxido de carbono (CO) y dióxido de carbono (CO2) con monóxido de carbono (CO) y/o hidrógeno (H2) como fuente de energía en condiciones anaerobias, formando acetil-CoA, acetato y otros productos. Comparten el mismo modo de fermentación, la ruta Wood-Ljungdahl o reductora de la acetil-CoA, y se definen por la presencia del conjunto de enzimas que consiste en monóxido de carbono deshidrogenasa (CODH), hidrogenasa, formiato deshidrogenasa, formil-tetrahidrofolato sintasa, metilentetrahidrofolato deshidrogenasa, formil-tetrahidrofolato ciclohidrolasa, metilen-tetrahidrofolato reductasa, y monóxido de carbono deshidrogenasa/acetil-CoA sintasa (CODH/ACS), cuya combinación es característica y única de este tipo de bacterias (Drake, Küsel, Matthies, Wood, y Ljungdahl, 2006). A diferencia del crecimiento quimioheterótrofo de bacterias fermentadoras de azúcar que convierten el sustrato en biomasa, metabolitos secundarios y piruvato a partir de los cuales se forman productos (vía la acetil-CoA o directamente), en acetógenos el sustrato es canalizado directamente en acetil-CoA, a partir de los cuales se forman productos, biomasa y metabolitos secundarios.
En una realización, el microorganismo se selecciona de un grupo de Clostridia carboxidotróficas que comprenden las especies C. autoethanogenum, C. ljungdahlii, y "C. ragsdalei y aislados relacionados. Estas incluyen, pero no se limitan a las cepas C. autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Naveau, y Nyns, 1994), C. autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) (WO/2009/064200), C. autoethanogenum LBS1561 (DSM23693), C. ljungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Miller, y Yang, 1993), C. ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (patente de EE.UU. 5.593.886), C. ljungdahlii C-01 (ATCC 55988) (patente de EE.UU. 6.368.819), C. ljungdahlii O-52 (ATCC 55989) (patente de EE.UU. 6.368.819), o "C. ragsdalei P11T" (ATCC BAA-622) (WO 2008/028055), y aislados relacionados tales como "C. coskatii" (patente de EE.UU. 2011/0229947), y cepas mutantes de los mismos tales como C. ljungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo O. "Production of Bioetanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. Tesis doctoral, North Carolina State University, 2010).
Estas cepas forman una subagrupación dentro de la agrupación I de ARNr de clostridio (Collins et al., 1994), que tiene una identidad de al menos 99% en el nivel del gen de ARNr 16S, aunque son distintas especies determinado por reasociación de ADN-ADN y experimentos de huella dactilar de ADN (WO 2008/028055, patente de EE.UU. 2011/0229947).
Las cepas de esta agrupación están definidas por características comunes, teniendo tanto genotipo como fenotipo similar, y todas comparten el mismo modo de conservación de energía y metabolismo fermentador. Estas cepas de esta agrupación carecen de citocromos y conservan energía por un complejo Rnf.
Todas las cepas de esta agrupación tiene un tamaño de genoma de aproximadamente 4,2 Mpb (Köpke et al., 2010) y una composición de GC de aproximadamente 32% en moles (Abrini et al., 1994; Köpke et al., 2010; Tanner et al., 1993) (documento WO 2008/028055; patente de EE.UU. 2011/0229947), y operones de genes clave esenciales conservados que codifican las enzimas de la ruta Wood-Ljungdahl (monóxido de carbono deshidrogenasa, formiltetrahidrofolato sintetasa, metilen-tetrahidrofolato deshidrogenasa, formil-tetrahidrofolato ciclohidrolasa, metilentetrahidrofolato reductasa, y monóxido de carbono deshidrogenasa/acetil-CoA sintasa), hidrogenasa, formiato deshidrogenasa, complejo Rnf (rnfCDGEAB), piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, aldehído:ferredoxina oxidorreductasa (Köpke et al., 2010, 2011). Se ha encontrado que la organización y número de genes de la ruta Wood-Ljungdahl, responsables de la absorción de gas, son los mismos en todas las especies, a pesar de las diferencias en las secuencias nucleicas y de aminoácidos (Köpke et al., 2011).
Las cepas tienen todas morfología y tamaño similares (las células en crecimiento logarítmico son entre 0,5-0,7 x 3-5 µm), son mesófilos (temperatura de crecimiento óptimo entre 30-37 °C) y estrictamente anaerobios (Abrini et al., 1994; Tanner et al., 1993) (documento WO 2008/028055). Además, comparten todos los mismos rasgos filogenéticos principales, tal como un mismo intervalo de pH (pH 4-7,5, con un pH inicial óptimo de 5,5-6), crecimiento autótrofo fuerte en gases que contienen CO con velocidades de crecimiento similares y un perfil metabólico con etanol y ácido acético como el producto final de fermentación principal, con pequeñas cantidades de 2,3-butanodiol y ácido láctico formados en determinadas condiciones (Abrini et al., 1994; Köpke et al., 2011; Tanner et al., 1993)(documento WO 2008/028055). Se ha observado la producción de indol con todas las especies. Sin embargo, las especies se diferencian en el uso de sustratos de diferentes azúcares (p. ej. ramnosa, arabinosa), ácidos (p. ej. gluconato, citrato), aminoácidos (p. ej. arginina, histidina), u otros sustratos (p. ej. betaína, butanol). Algunas de las especies se encontró que eran auxótrofas para determinadas vitaminas (p. ej., tiamina, biotina)
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mientras que otras no lo eran. Se ha mostrado la reducción de ácidos carboxílicos a sus correspondientes alcoholes en una variedad de estos organismos (Perez, Richter, Loftus, y Angenent, 2012).
Por lo tanto, los rasgos descritos no son específicos a un organismo como C. autoethanogenum o C. ljungdahlii, sino más bien rasgos generales para clostridios sintetizadores de etanol, caboxidotróficos. Por lo tanto, la invención se puede prever para trabajar con estas cepas, aunque puede haber diferencias de rendimiento.
En algunas realizaciones, el microorganismo original se selecciona del grupo que comprende Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, y Clostridium ragsdalei. En una realización, el grupo también comprende Clostridium coskatii. En una realización particular, el microorganismo original es Clostridium autoethanogenum DSM23693.
Los microorganismos originales se pueden modificar para llegar a los microorganismos de la invención usando cualquier número de técnicas de transformación y ácidos nucleicos recombinantes conocidas. Dichas técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook et al, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). A modo de ejemplo adicional, se puede usar la metodología descrita en la sección de ejemplos en lo sucesivo.
A modo de ejemplo general, en el caso de introducir una mutación en un gen, o alterar de otra forma o inactivar un gen, se puede diseñar una construcción o vector de ácido nucleico adecuado para integrar en el genoma del microorganismo original para alterar el gen. Dichas construcciones incluirán típicamente secuencias de ácido nucleico (brazos) homólogos a una región dentro o que flanquea el gen que se va a alterar, lo que permite que se produzca la recombinación homóloga, y en contraste que se produzca la introducción de una mutación, la escisión de una región de ácido nucleico del gen, o la sustitución de una región del gen por un ácido nucleico. Aunque se prefiere que los brazos en las construcciones tengan 100% de complementariedad con la región en el genoma a la que se dirigen, esto no es necesario, con la condición de que la secuencia sea suficientemente complementaria para permitir la recombinación dirigida con la región genética de interés. Típicamente, los brazos tendrán un nivel de homología que permitiría la hibridación con una región diana en condiciones restrictivas, como se define en Sambrook et al 1989.
Los expertos en la técnica apreciarán las secuencias de ácidos nucleicos suficientes para permitir la recombinación homóloga dirigida e integración de un ácido nucleico exógeno en el genoma de un microorganismo original, teniendo en cuenta la información de secuencia disponible para las enzimas implicadas en la ruta de biosíntesis del 2,3butanodiol. Sin embargo, a modo de ejemplo, en el caso de budA, se pueden usar los brazos de homología flanqueadores (por ejemplo, SEQ ID 3, 4 y 78-81), o en el caso de C. ljungdahlii, diseñados a partir de la información de secuencias de ácidos nucleicos de Genbank (CP001666.1). A modo de ejemplo adicional, las secuencias flanqueadoras de genes que codifican enzimas que se van a alterar de acuerdo con la invención, se pueden determinar a partir de la información de secuencia genómica de microorganismos relevantes. A modo de ejemplo particular, las secuencias flanqueadoras en C.ljundahlii se pueden determinar a partir de la información en GenBank CP001666.1
A modo de ejemplo general adicional, cuando se introduce un ácido nucleico en un microorganismo original para expresar una proteína o ácido nucleico que inhibe la expresión o actividad de una enzima en la ruta de biosíntesis del 2,3-butanodiol, o para expresar una proteína que aumenta la expresión de un compuesto que inhibe la expresión
o actividad de una enzima en la ruta de biosíntesis del 2,3-butanodio, la construcción se diseñará para permitir la expresión de la proteína en el microorganismo. Típicamente incluirán elementos reguladores adecuados, incluyendo un promotor. Se pueden usar promotores constitutivos o inducibles.
Donde la invención usa la alteración directa de un gen introduciendo una mutación o similar, la construcción o vector usado para transformar el microorganismo original se adaptará para que se integre en el genoma del microorganismo, como se ha mencionado antes. En el caso de expresión de una proteína o ácido nucleico que se adapte para alterar la expresión o actividad de una enzima en la ruta de biosíntesis del 2,3-butanodiol, o aumentar la expresión o actividad de un inhibidor de una enzima implicada en la ruta, las construcciones pueden permanecer extracromosómicas tras la transformación de un microorganismo original, o se pueden adaptar para la integración en el genoma del microorganismo. Por consiguiente, las construcciones útiles en la invención pueden incluir secuencias de nucleótidos adaptadas para ayudar a la integración (por ejemplo, una región que permite la recombinación homóloga e integración dirigida en el genoma del hospedante) o expresión y replicación de una construcción extracromosómica (por ejemplo, origen de replicación y otras secuencias reguladoras).
Las construcciones de ácido nucleico útiles en la invención se pueden construir usando cualquier número de técnicas convencionales en la materia. Por ejemplo, se pueden usar técnicas de síntesis química o recombinante. Dichas técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook et al, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). Se describen técnicas de ejemplo adicionales en la sección de ejemplos en lo sucesivo. Esencialmente, los genes individuales, elementos reguladoras, brazos de homología y similares, se unirán operativamente entre sí de modo que puedan realizar su función deseada. Los expertos en la técnica apreciarán los vectores adecuados para usar en la invención. Sin embargo, a modo de ejemplo, los siguientes vectores pueden ser adecuados: pMTL, pIMP, pJIR y los plásmidos ilustrados en la sección
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La expresión de la enzima metiltransferasa produce la metilación de los genes presentes en la construcción/vector que se va a introducir en el microorganismo original. La construcción/vector después se puede aislar del microorganismo transportador de acuerdo con uno cualquiera de una serie de métodos conocidos. A modo de ejemplo solo, se puede usar la metodología descrita en la sección de ejemplos en lo sucesivo para aislar la construcción/vector.
En una descripción particular, se aíslan simultáneamente ambas construcciones/vectores.
La construcción/vector destinada para el microorganismo original se puede introducir en el microorganismo usando cualquier número de métodos conocidos. Sin embargo, a modo de ejemplo, se puede usar la metodología descrita en la sección de ejemplos en lo sucesivo.
Está previsto que se pueda introducir un gen de metiltransferasa en un microorganismo transportador y ser expresado en exceso. Por lo tanto, en una descripción, la enzima metiltransferasa resultante se puede recoger usando métodos conocidos y usar para metilar in vitro la construcción que se va a introducir en el microorganismo original. Después la construcción/vector se puede introducir en el microorganismo destino (original). En otra descripción, se introduce el gen de metiltransferasa en el genoma del microorganismo transportador seguido de introducción de la construcción destinada al microorganismo original en el microorganismo transportador, aislamiento de una o más construcciones/vectores a partir del microorganismo transportador y después introducción de la construcción/vector en el microorganismo destino (original).
Está previsto que la construcción/vector destinada para el microorganismo original y la construcción/vector de metilación como se ha definido antes, se puedan combinar para proporcionar una composición importante. Dicha composición tiene utilidad particular para evitar mecanismos barrera de restricción para producir microorganismos recombinantes de la invención.
En una descripción particular, las construcciones/vectores descritos en la presente memoria antes son plásmidos.
El experto en la técnica apreciará una serie de metiltransferasas adecuadas útiles para producir los microorganismos de la invención. Sin embargo, a modo de ejemplo se puede usar la metiltransferasa del fago ΦT1 de Bacillus subtilis y la metiltransferasa descrita en los ejemplos en lo sucesivo. Los ácidos nucleicos que codifican metiltransferasas adecuadas serán fácilmente evidentes teniendo en cuenta la secuencia de la metiltransferasa deseada y el código genético. En una descripción, el ácido nucleico que codifica una metiltransferasa se describe en los ejemplos en lo sucesivo (por ejemplo, el ácido nucleico de SEQ ID NO: 31).
Se puede usar cualquier número de construcciones/vectores adaptados para permitir la expresión de un gen de metiltransferasa, para generar una construcción/vector de metilación. Sin embargo, a modo de ejemplo, se puede usar el plásmido descrito en la sección de ejemplos en lo sucesivo.
A partir de la información contenida en la presente memoria, se apreciará que se puede adaptar la modificación genética a un microorganismo original para favorecer la producción de uno o más productos frente a uno o más de otros productos. Por ejemplo, la alteración de la conversión de piruvato en acetolactato favorece la producción de lactato, formiato, malato, fumarato, citrato, succinato y 2-oxoglutarato frente a la producción de valina, leucina e isoleucina.
Método de producción
La invención proporciona un método para producir uno o más productos por fermentación microbiana, que comprende fermentar un sustrato que comprende CO usando un microorganismo de la invención. En una realización particular, el método es para producir etanol o uno o más de otros productos para la fermentación microbiana, que comprende fermentar un sustrato que comprende CO usando un microorganismo de la invención. Los métodos de la invención se pueden usar para reducir las emisiones atmosféricas totales de carbono de un procedimiento industrial.
Preferiblemente, la fermentación comprende las etapas de fermentar anaeróbicamente un sustrato en un biorreactor para producir uno o más productos (en una realización particular, etanol, o etanol y uno o más de otros productos) usando un microorganismo recombinante de la invención.
En una realización el método comprende las etapas de:
(a)
proporcionar un sustrato que comprende CO a un birreactor que contiene un cultivo de uno o más microorganismos del primer aspecto de la invención; y
(b)
fermentar anaeróbicamente el cultivo en el biorreactor para producir uno o más productos (en una realización, incluyendo etanol).
En una realización el método comprende las etapas de:
i. capturar el gas que contiene CO producido como resultado del procedimiento industrial, antes de liberar el gas a la atmósfera;
20
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imagen14
que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 32). El gen de metiltransferasa híbrido se sintetizó químicamente y se clonó en el vector pGS20 (ATG:biosynthetics GmbH, Merzhausen, Alemania-SEQ ID NO: 33) usando EcoRI. El plásmido de metilación resultante pGS20-metiltransferasa se transformó doblemente con el plásmido pMTL85141-budA-ko en XL1-Blue MRF' Kan E. coli de restricción negativa (Stratagene). La metilación in vivo se indujo por
5 adición de IPTG 1 mM y los plásmidos metilados se aislaron usando el kit Zymo mini prep Kit (Zymo). La composición de plásmidos metilados resultante se usó para la transformación de C. autoethanogenum DSM23693.
Transformación:
Durante el experimento de transformación completo, C. autoethanogenum DSM23693 se cultivó en medio YTF (tabla 2) en presencia de agentes de reducción y con 2,11 kg/cm2 (30 psi) de gas residual de acería (recogido de la 10 acería de Nueva Zelanda en Glenbrook, NZ; composición: 44% de CO, 32% de N2, 22% de CO2, 2% de H2) a 37 °C usando técnicas anaerobias estándar descritas por Hungate (1969) y Wolfe (1971).
Tabla 2: Medio YTF
Componente del medio
por litro de solución madre
Extracto de levadura
10 g
Triptona
16 g
Cloruro sódico
0,2 g
Fructosa
10 g
Agua destilada
hasta 1 litro
solución madre de agente reductor
por 100 ml de solución madre
NaOH
0,9 g
Cisteína.HCl
4 g
Na2S
4 g
Agua destilada
Hasta 100 ml
Para hacer cultivos competentes, se subcultivaron 50 ml de cultivo de C. autoethanogenum DSM23693 en medio
15 YTF de nueva aportación durante 5 días consecutivos. Estas células se usaron para inocular 50 ml de medio YTF que contenía DL-treonina 40 mM con una DO600nm de 0,05. Cuando el cultivo alcanzó una DO600nm de 0,5, las células se incubaron sobre hielo durante 30 min y después se transfirieron a una cámara anaerobia y se recogieron a 4.700 x g y 4°C. El cultivo se lavó dos veces con tampón de electroporación enfriado con hielo (sacarosa 270 mM, MgCl2 1 mM, fosfato sódico 7 mM, pH 7,4) y finalmente se suspendió en un volumen de 600 µl de tampón de electroporación
20 de nueva aportación. Esta mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación previamente enfriada con una separación de los electrodos de 0,4 cm, que contenía 2 µg de la mezcla de plásmidos metilados y 1 µl de inhibidor de restricción de tipo 1 (Epicentre Biotechnologies) y se aplicaron pulsos inmediatamente usando un sistema de electroporación Gene pulser Xcell (Bio-Rad) con los siguientes ajustes: 2,5 kV, 600 Ω y 25 µF. Se lograron constantes de tiempo de 3,7-4,0 ms. El cultivo se transfirió a 5 ml de medio YTF de nueva aportación. La
25 regeneración de las células se controló a una longitud de onda de 600 nm usando un espectrofotómetro Spectronic Helios Epsilon (Thermo) equipado con un tubo de objetivo. Después de una disminución inicial en la biomasa, las células empezaron a crecer de nuevo. Una vez que la biomasa era el doble desde ese punto, aproximadamente 200 µl de cultivo se extendieron sobre placas de YTF-agar y placas de agar-PETC que contenían fructosa 5 g/l (Tabla 3) (ambas contenían agar Bacto™ al 1,2 % (BD) y tianfenicol 15 µg/ml). Después de 3-4 días de incubación con 2,11
30 kg/cm2 (30 psig) de gas de acería a 37ºC, se veían claramente 500 colonias por placa.
24
Tabla 3: Medio PETC (medio ATCC 1754; atcc.org/Attachments/2940.pdf)
Componente del medio
Concentración por 1,0 litro de medio
NH4Cl
1 g
KCl
0,1 g
MgSO4.7H2O
0,2 g
NaCl
0,8 g
KH2PO4
0,1 g
CaCl2
0,02 g
Solución de metales traza
10 ml
Solución de vitaminas de Wolfe
10 ml
Extracto de levadura
1 g
Resazurina (2 g/l de cultivo madre)
0,5 ml
MES
2 g
Agente reductor
0,006-0,008 % (v/v)
Agua destilada
Hasta 1 litro, pH 5,5 (ajustada con HCl)
Solución de vitaminas de Wolfe
por litro de solución madre
Biotina
2 mg
Ácido fólico
2 mg
Hidrocloruro de piridoxina
10 mg
Tiamina.HCl
5 mg
Riboflavina
5 mg
Ácido nicotínico
5 mg
D-(+)-Pantotenato de calcio
5 mg
Vitamina B12
0,1 mg
Ácido p-aminobenzoico
5 mg
Ácido tióctico
5 mg
Agua destilada
hasta 1 litro
25
Solución de metales traza
por litro de solución madre
Ácido nitrilotriacético
2 g
MnSO4.H2O
1 g
Fe (SO4)2(NH4)2.6H2O
0,8 g
CoCl2.6H2O
0,2 g
ZnSO4.7H2O
0,2 mg
CuCl2.2H2O
0,02 g
NaMoO4.2H2O
0,02 g
Na2SeO3
0,02 g
NiCl2.6H2O
0,02 g
Na2WO4.2H2O
0,02 g
Agua destilada
hasta 1 litro
Solución madre de agente reductor
por 100 ml de solución madre
NaOH
0,9 g
Cisteína.HCl
4 g
Na2S
4 g
Agua destilada
Hasta 100 ml
Las colonias se aplicaron en estriado sobre placas de agar-PETC de nueva aportación que también contenían fructosa 5 g/l y tianfenicol 15 µg/ml. Después de 2 días de incubación con 2,11 kg/cm2 (30 psig) de gas de acería a 37ºC, se volvieron a aplicar en estriado colonias individuales de estas placas sobre placas de agar-PETC no 5 selectivo de nueva aportación que contenían solo fructosa 5 g/l. La aplicación en estriado sobre placas de agar-PETC con fructosa 5 g/l se repitió una vez más y las placas se incubaron con 2,11 kg/cm2 (30 psig) de gas de acería a 37ºC. Después de 3 días, en 6 colonias individuales que crecían en medio no selectivo, se inocularon 2 ml de medio líquido PETC que contenía fructosa 5 g/l. Cuando se produjo el crecimiento, se aumentó secuencialmente la escala del cultivo a 5 ml, 25 ml y después a 50 ml de medio PETC que contenía fructosa 5 g/l y 2,11 kg/cm2 (30 psig)
10 de gas de acería como fuente de carbono.
Conformación de la transformación satisfactoria:
C. autoethanogenum: Para verificar la identidad de las seis colonias y la transferencia de ADN, se aisló ADN genómico de las 6 colonias/clon en medio líquido PETC usando el kit Purelink™ Genomic DNA mini kit (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estos ADN genómicos junto con los de C. autoethanogenum 15 DSM23693 de tipo natural se usaron como molde en la PCR. La PCR se llevó a cabo con la ADN polimerasa de alta fidelidad iproof (Bio-Rad Labratories), los cebadores citados en la tabla 4 y el siguiente programa: desnaturalización inicial a 98 °C durante 2 minutos, seguido de 25 ciclos de desnaturalización (98°C durante 10 segundos), reasociación (61°C durante 15 segundos) y elongación (72°C durante 90 segundos), antes de una etapa de extensión final (72°C durante 7 minutos). El ADN genómico de C. autoethanogenum DSM23693 de tipo natural se
20 usó como molde en la PCR de control.
26
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Tabla 6: Análisis de metabolitos del clon 1 de C. autoethanogenum DSM23693 ΔbudA (ΔbudA) y de C. autoethanogenum DSM23693 de tipo natural (Tipo natural) por GC-MS. Se incluyó el medio en el análisis como control. Los valores dados en la tabla corresponden a la intensidad de los picos normalizada obtenida para cada repetición (R). ND = no detectado.
Metabolito
imagen17 Medio imagen18 Promedio
Lactato
imagen19 0,547053273 imagen20 0,474988 0,431645 0,48
Succinato
imagen21 1,036264929 imagen22 0,960478 1,243932 1,08
2-Oxoglutarato
imagen23 ND imagen24 ND ND 0,00
Valina
imagen25 5,970408365 imagen26 5,446962 5,937764 5,79
Leucina
imagen27 3,418425725 imagen28 3,154261 3,237803 3,27
Isoleucina
imagen29 ND imagen30 ND 0,607184 0,20
Metabolito
imagen31 Tipo natural imagen32 Promedio
Lactato
imagen33 0,801302932 imagen34 0,691344 0,853559 0,78
Succinato
imagen35 0,547053273 imagen36 0,474988 0,431645 0,48
2-Oxoglutarato
imagen37 ND imagen38 0,003092 0,0028 0,00
Valina
imagen39 0,018545724 imagen40 0,011764 0,014182 0,01
Leucina
imagen41 0,0307755 imagen42 0,024291 0,023099 0,03
Isoleucina
imagen43 0,008136206 imagen44 0,005305 0,00643 0,01
imagen45
imagen46 imagen47 imagen48 imagen49 imagen50 imagen51
Metabolito
Clon 1 de ΔbudA (Muestra 1) imagen52 Clon 2 de ΔbudA (Muestra 2) Promedio
Lactato
5,017350825 5,672474 5,237064 5,987887 5,138095 4,39521 5,24
Succinato
2,535447097 2,984226 2,516218 5,017351 5,672474 5,237064 3,99
2-Oxoglutarato
0,522265764 0,462277 ND 1,22281 0,021205 ND 0,37
Valina
11,13216958 9,419048 7,824351 10,08887 10,66202 9,192138 9,72
Leucina
10,92981831 5,478571 4,497006 4,70419 11,36585 4,441235 6,90
Isoleucina
6,087638048 9,397619 0,895459 10,59162 2,912456 9,976735 6,64
La producción de acetoína y 2,3-butanodiol normalmente está asociada con la desacidificación de ácido pirúvico fuerte (Xiao, Z., y P. Xu. 2007. "Acetoin metabolism in bacteria". Crit. Rev. Biochem. Microbiol. 33:127-140), lo que supone una amenaza grave para la célula destruyendo el gradiente de pH y protones interno necesario para la
10 conservación de energía. Tanto la acetoína como el 2,3-butanodiol son compuestos de pH neutro. La producción de 2,3-butanodiol también sirve como sumidero de electrones para descargar equivalentes de reducción sobrantes producidos durante el proceso de fermentación.
29
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