ES2655214T3

ES2655214T3 - Microorganismos recombinantes que producen biodiesel

Info

Publication number: ES2655214T3
Application number: ES13806177.5T
Authority: ES
Inventors: Fungmin Liew; Michael Koepke
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Current assignee: Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2013-06-21
Publication date: 2018-02-19
Anticipated expiration: 2033-06-21
Also published as: NO2953671T3; CA2876178A1; ES2655214T5; EP2864470A1; IN2014DN10507A; WO2013191567A1; JP6466836B2; EP2864470B2; US9347076B2; KR102097844B1; CA2876178C; CN104640977B; BR112014031876A2; CN104640977A; MY164882A; BR112014031876B1; EP2864470A4; KR20150023651A; US20130344547A1; PL2864470T3

Abstract

Una bacteria acetogénica carboxidotrófica preparada por ingeniería genética que comprende un ácido nucleico exógeno que codifica una aciltransferasa no específica; en la que el ácido nucleico cuando se expresa en un microorganismo permite al microorganismo producir biodiésel por fermentación de CO y/o CO2.

Description

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ventajas sobre la producción de biocombustibles a partir de sustratos basados en azúcar y proporciona un medio alternativo para la producción de biodiésel utilizando gases residuales incluyendo monóxido de carbono de procesos industriales.

Para los acetógenos anaerobios que usan un sustrato C1 como CO o CO2, es más difícil producir moléculas largas tales como ácido grasos ya que a diferencia de la glicolisis, no se gana energía neta a partir de la fosforilación a nivel de sustrato en la ruta de fijación de carbono Wood-Ljungdahl, de hecho la activación de CO2 a formato incluso requiere una molécula de ATP y se requiere un gradiente de membrana. Hasta ahora, el producto con más átomos de carbono reportado en acetógenos (organismos tanto nativos como recombinantes) son los compuestos C4 butanol y 2,3-butanodiol.

Los inventores han mostrado que es posible producir estas moléculas de ácido graso de cadena más larga tal como biodiésel usando la materia prima base de C1 CO mediante el intermedio acetil CoA. Como el sustrato CO o CO2 está en la ruta Wood-Ljungdahl canalizada directamente en acetil-CoA (el punto de partida de la biosíntesis de ácidos grasos), son necesarias menos reacciones y enzimas que de azúcares mediante glicolisis, haciendo que el proceso sea más rápido y más eficiente incluso cuando está disponible menos ATP. Aunque está disponible menos ATP en los acetógenos carboxidotróficos, los inventores consideran que esta ruta más directa puede sostener un mayor flujo metabólico (debido a una mayor fuerza motriz química de reacciones intermedias).

En una realización particular de la invención, los inventores han encontrado que la producción de biodiésel (un éster de alquilo de ácidos grasos) por un microorganismo recombinante de la invención se permite por la introducción en el microorganismo de una acil transferasa exógena. Los métodos de producción tradicionales de biodiésel implican la transestenficación de un lípido (triglicérido) en presencia de alcohol para rendir glicerina y biodiésel. Sin embargo, la presente invención proporciona un microorganismo recombinante que es capaz de co-producir tanto alcohol (incluyendo etanol y/o butanol) como ácido graso. Los inventores creen que esta co-producción proporciona los sustratos requeridos para proporcionar una fuerza directriz para la producción in vivo de biodiésel que comprende bien FAEE (Ésteres de etilo de ácidos grasos) y/o FABE (Ésteres de butilo de ácidos grasos).

Para conseguir una realización de la invención, una aciltransferasa no específica (éster de cera sintasa/acil Coenzima A:diacilglicerol aciltransferasa) de Acinetobacter baylyi se introdujo en el microorganismo acetogénico. El microorganismo produce un alcohol (por ejemplo, etanol o butanol) y un acil graso-CoA que se convierten en un éster de alquilo de ácido graso (es decir, biodiésel) (Fig. 1) (Kalscheuer et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol., 70: 71 19-25; Stöveken et al., 2005, J. Bacteriol., 187: 1369-76). Las acil-CoA de ácido graso son un producto directo de ácidos grasos y se producen por la acción de por ejemplo acil-CoA sintetasa (ácido graso de cadena larga--CoA ligasa) que puede estar presente en acetógenos carboxidotróficos. La producción in vivo de FAEE usando esta enzima no se ha mostrado excepto con el suministro de ácidos grasos o alcohol suplementarios a la reacción externamente (Kalscheuer et al., 2006, Microbiology, 152, 2529-36). Aunque todos los organismos producen precursores de ácidos grasos, para los organismos que no producen (altas cantidades de) alcoholes como E. coli, son necesarias modificaciones genéticas adicionales. La producción bacteriana de FABE no se ha demostrado previamente en absoluto. La presente invención no requiere dicho suministro externo de alcohol por lo tanto puede proporcionar varias ventajas. Incluidas en estas ventajas está la reducción del coste de la materia prima base, una reducción significativa de la complejidad del equipo y control de parámetros y etapas de manejo y separación limitadas requeridas por el proceso.

Aunque los inventores han demostrado la eficacia de la invención en Clostridium autoethanogenum, contemplan que la invención es aplicable al grupo más amplio de microorganismos acetogénicos carboxidotróficos y se discute adicionalmente en la presente memoria.

Microorganismos

Como se ha discutido anteriormente en la presente memoria, la invención proporciona un microorganismo recombinante capaz de producir biodiésel, y opcionalmente uno o más otros productos, por fermentación de un sustrato que comprende CO.

En una realización particular, el microorganismo se adapta para expresar una o más enzimas exógenas en la ruta de biosíntesis de biodiésel. En otra realización, el microorganismo se adapta para sobreexpresar una o más enzimas endógenas en la ruta de biosíntesis de biodiésel.

En una realización, el microorganismo recombinante se adapta para producir una mayor cantidad de biodiésel de la que se produciría por un microorganismo parental a partir del que se deriva el microorganismo recombinante.

En una realización, el microorganismo parental a partir del que se deriva el microorganismo recombinante es capaz de fermentar un sustrato que comprende CO para producir un alcohol, pero no para convertir el alcohol en un biodiésel, y el microorganismo recombinante se adapta para expresar una o más enzimas implicadas en la conversión de etanol a biodiésel.

En una realización, el microorganismo acetogénico carboxidotrófico recombinante se adapta además para expresar una o más enzimas exógenas en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos. En un aspecto adicional, el microorganismo

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secuencias reguladoras).

En una realización, los ácidos nucleicos exógenos que codifican una o más enzimas como se menciona en la presente memoria anteriormente comprenderán además un promotor adaptado para estimular la expresión de una o más enzimas codificadas por los ácidos nucleicos exógenos. El promotor puede ser un promotor constitutivo que es preferiblemente altamente activo en condiciones de fermentación apropiadas. También podrían usarse promotores inducibles. El promotor puede seleccionarse del grupo que comprende agrupación génica Wood-Ljungdahl, un promotor de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, un promotor del operón del complejo Rnf, promotor del operón de ATP sintasa y promotores de Fosfotransacetilasa/Acetato quinasa. Los expertos en la técnica apreciarán que otros promotores que puedan dirigir la expresión, preferiblemente un alto nivel de expresión en condiciones de fermentación apropiadas, serían efectivos como alternativas a las realizaciones ejemplificadas.

En una realización, el ácido nucleico exógeno es un plásmido de expresión.

En una realización, el microorganismo acetogénico carboxidotrófico parental se selecciona del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Butyribacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia product, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Oxobacter pfennigii, y Thermoanaerobacter kiuvi.

En una realización particular del primer o segundo aspectos, el microorganismo parental se selecciona del grupo de Clostridia carboxidotrófica que comprende Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum.

En una realización, el microorganismo se selecciona de una agrupación de Clostridia carboxidotrófica que comprende las especies C autoethanogenum, C. ljungdahlii, y "C. ragsdalei" y aislados relacionados. Éstos incluyen pero no están limitados a cepas C. autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Naveau, y Nyns, 1994), C. autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) (WO/2009/064200), C. autoethanogenum LBS1561 (DSM23693), C. ljungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Miller, y Yang, 1993), C. ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (patente US 5.593.886), C. ljungdahlii C-01 (ATCC 55988) (patente US 6.368.819), C. ljungdahlii O-52 (ATCC 55989) (patente US 6.368.819), o "C. ragsdalei Ρ11T" (ATCC BAA-622) (WO 2008/028055), y aislados relacionados tal como "C. coskatii" (patente US 2011/0229947), "Clostridium sp. MT351" (Michael Tyurin y Kiriukhin, 2012) y cepas mutantes de éstas tal como C. ljungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. tesis de doctorado, North Carolina State University, 2010).

Estas cepas forman una subagrupación en la agrupación I de ARNr de Clostridia (Collins et al., 1994), que tiene al menos 99% de identidad a nivel de gen de ARNr 16S, aunque son especies distintas como se determina por reasociación de ADN-ADN y experimentos de huella de ADN (WO 2008/028055, patente US 2011/0229947).

Las cepas de esta agrupación se definen por características comunes, teniendo tanto un genotipo como fenotipo similar, y todas comparten el mismo modo de conservación de energía y metabolismo fermentativo. Las cepas de esta agrupación carecen de citocromos y conservan la energía a través de un complejo Rnf.

Todas las cepas de esta agrupación tienen un tamaño de genoma de alrededor de 4,2 MBp (Köpke et al., 2010) y una composición en GC de alrededor de 32% en moles (Abrini et al., 1994; Köpke et al., 2010; Tanner et al., 1993) (WO 2008/028055; patente US 2011/0229947), y operones de genes clave esenciales conservados que codifican enzimas de la ruta Wood-Ljungdahl (Monóxido de carbono deshidrogenasa, Formil-tetrahidrofolato sintetasa, Metilen-tetrahidrofolato deshidrogenasa, Formil-tetrahidrofolato ciclohidrolasa, Metilen-tetrahidrofolato reductasa, y Monóxido de carbono deshidrogenasa/Acetil-CoA sintasa), hidrogenasa, formato deshidrogenasa, complejo Rnf (rnfCDGEAB), piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, aldehído:ferredoxina oxidorreductasa (Köpke et al., 2010, 2011). Se ha encontrado que la organización y número de genes de la ruta Wood-Ljungdahl, responsables de la captación de gas, es la misma en todas las especies, a pesar de las diferencias en las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos (Köpke et al., 2011).

Todas las cepas tienen una morfología y tamaño similares (las células en crecimiento logarítmico son entre 0,5-0,7 x 3-5 μm), son mesofílicas (temperatura de crecimiento óptima entre 30-37°C) y estrictamente anaerobias (Abrini et al., 1994; Tanner et al., 1993) (WO 2008/028055). Además, todas comparten los mismos rasgos filogenéticos principales, tal como mismo intervalo de pH (pH 4-7,5, con un pH inicial óptimo de 5,5-6), crecimiento autotrófico fuerte en gases que contienen CO con velocidades de crecimiento similares, y un perfil metabólico con etanol y ácido acético como producto final de fermentación principal, con pequeñas cantidades de 2,3-butanodiol y ácido láctico formadas en determinadas condiciones (Abrini et al., 1994; Köpke et al., 2011 ; Tanner et al., 1993). Sin embargo, las especies se diferencian en la utilización de sustrato de varios azúcares (por ejemplo, ramnosa, arabinosa), ácidos (por ejemplo, gluconato, citrato), aminoácidos (por ejemplo, arginina, histidina), u otros sustratos (por ejemplo, betaína, butanol). Se encontró que algunas de las especies eran auxótrofas para determinadas vitaminas (por ejemplo, tiamina, biotina) mientras otras no lo eran. La reducción de ácidos carboxílicos a sus alcoholes correspondientes se ha mostrado en un rango de estos organismos (Perez, Richter, Loftus, y Angenent, 2012).

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Los rasgos descritos son por lo tanto no específicos para un organismo como C. autoethanogenum o C. ljungdahlii, sino que son rasgos generales para Clostridia carboxidotróficas que sintetizan etanol. Así, puede anticiparse que la invención funciona en todas estas cepas, aunque puede haber diferencias en el rendimiento.

Los microorganismos acetogénicos carboxidotróficos recombinantes de la invención pueden prepararse a partir de un microorganismo acetogénico carboxidotrófico parental y uno o más ácidos nucleicos exógenos usando cualquier número de técnicas conocidas en la técnica para producir microorganismos recombinantes. Sólo como ejemplo, la transformación (incluyendo transducción o transfección) puede conseguirse por electroporación, electrofusión, ultrasonicación, transformación mediada por polietilen glicol, conjugación, o competencia química y natural. Las técnicas de trasformación adecuadas se describen por ejemplo en Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989.

La electroporación se ha descrito para varios acetógenos carboxidotróficos como C. ljungdahlii (Köpke et al., 2010; Leang, Ueki, Nevin, y Lovley, 2012) (PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), C. autoethanogenum (PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), Acetobacterhim woodii (Strätz, Sauer, Kuhn, y Dürre, 1994) o Moorella thermoacetica (Kita et al., 2012) y es un método estándar usado en muchas Clostridia tal como C. acetobutylicum (Mermelstein, Welker, Bennett, y Papoutsakis, 1992), C. cellulolyticum (Jennert, Tardif, Young, y Young, 2000) o C. thermocellum (MV Tyurin, Desai, y Lynd, 2004).

La electrofusión se ha descrito para Clostridium sp. acetogénica MT351 (Tyurin y Kiriukhin, 2012).

La inducción de profagos se ha descrito para acetógeno carboxidotrófico así como en el caso de C. scatologenes (Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project Western Kentucky University).

La conjugación se ha descrito como método de elección para el acetógeno Clostridium difficile (Herbert, O'Keeffe, Purdy, Elmore, y Minton, 2003) y muchas otras Clostridia incluyendo C. acetobuylicum (Williams, Young, y Young, 1990).

En una realización, la cepa parental usa CO como su única fuente de carbono y energía.

En una realización, el microorganismo parental es Clostridium autoethanogenum o Clostridium ljungdahlii. En una realización particular, el microorganismo es Clostridium autoethanogenum DSM23693. En otra realización particular, el microorganismo es Clostridium ljungdahlii DSM13528 (o ATCC55383).

Ácidos nucleicos

La invención también proporciona uno o más ácidos nucleicos o construcciones de ácido nucleico para uso en la generación de un microorganismo recombinante de la invención.

En una realización, los ácidos nucleicos comprenden secuencias que codifican una o más de las enzimas en la ruta de biosíntesis de biodiésel, que cuando se expresan en un microorganismo permiten que el microorganismo produzca biodiésel por fermentación de un sustrato que comprende CO. En una realización particular, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica dos o más enzimas que cuando se expresan en un microorganismo permiten que el microorganismo produzca biodiésel por fermentación de un sustrato que comprende CO. En una realización, los ácidos nucleicos de la invención codifican tres de dichas enzimas, o cinco de dichas enzimas.

En una realización particular, las enzimas se eligen del grupo que consiste en acil transferasa y una variante funcionalmente equivalente de ésta.

Las secuencias de aminoácidos y secuencias de ácido nucleico ejemplares que codifican enzimas descritas en la presente memoria se proporcionan en la presente memoria o pueden obtenerse de GenBank como se ha mencionado anteriormente en la presente memoria. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán fácilmente secuencias de ácidos nucleicos alternativas que codifican las enzimas o variantes funcionalmente equivalentes de éstas, teniendo en cuenta la información contenida en la presente memoria, en GenBank y otras bases de datos, y el código genético.

En una realización, la acil transferasa está codificada por la secuencia de SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de ésta.

En una realización, el ácido nucleico codifica además una o más enzimas exógenas en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos. En un aspecto adicional, el ácido nucleico codifica además una o más enzimas endógenas en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender además un promotor. El promotor puede permitir la expresión constitutiva de los genes bajo su control. Sin embargo, también pueden emplearse promotores inducibles. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente promotores para uso en la invención. Preferiblemente, el promotor puede dirigir un alto nivel de expresión en condiciones de fermentación apropiadas. Puede usarse un promotor de la agrupación Wood-Ljungdahl. Puede usarse un promotor de Fosfotransacetilasa/Acetato quinasa. El promotor puede

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Masters Project Western Kentucky University), mientras la conjugación se ha descrito como método de elección para muchas Clostridia incluyendo Clostridium difficile (Herbert et al., 2003, FEMS Microbiol. Lett. 229: 103-110) o C. acetobuylicum (Williams et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 819-826) y podría usarse de una forma similar para acetógenos carboxidotróficos.

En determinadas realizaciones, debido a los sistemas de restricción que son activos en el microorganismo que se va a transformar, es necesario metilar el ácido nucleico que se va a introducir en el microorganismo. Esto puede hacerse usando una variedad de técnicas, incluyendo las descritas más adelante, y ejemplificadas adicionalmente en la sección de Ejemplos en la presente memoria posteriormente.

Como ejemplo, en una realización, un microorganismo recombinante de la invención se produce por un método que comprende las etapas siguientes:

introducción en un microorganismo lanzadera de (i) una construcción/vector de expresión como se describe en la presente memoria y (ii) una construcción/vector de metilación que comprende un gen de metiltransferasa;

expresión del gen de metiltransferasa;

aislamiento de una o más construcciones/vectores del microorganismo lanzadera; e,

introducción de la una o más construcciones/vectores en un microorganismo de destino.

En una realización, el gen de metiltransferasa se expresa constitutivamente. En otra realización, la expresión del gen de metiltransferasa es inducida.

El microorganismo lanzadera es un microorganismo, preferiblemente un microorganismo negativo para restricción, que facilita la metilación de las secuencias de ácido nucleico que constituyen la construcción/vector de expresión. En una realización particular, el microorganismo lanzadera es una E. coli, Bacillus subtillis, o Lactococcus lactis negativo para restricción.

La construcción/vector de metilación comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una metiltransferasa.

Una vez la construcción/vector de expresión y la construcción/vector de metilación se introducen en el microorganismo lanzadera, el gen de metiltransferasa presente en la construcción/vector de metilación se induce. La inducción puede ser por cualquier sistema de promotor adecuado, aunque en una descripción particular, la construcción/vector de metilación comprende un promotor lac inducible y se induce por la adición de lactosa o un análogo de ésta, más preferiblemente isopropil-β-D-tio-galactósido (IPTG). Otros promotores adecuados incluyen el sistema ara, tet, o T7. El promotor de la construcción/vector de metilación puede ser un promotor constitutivo.

En una realización particular, la construcción/vector de metilación tiene un origen de replicación específico para la identidad del microorganismo lanzadera de manera que cualesquiera genes presentes en la construcción/vector de metilación se expresan en el microorganismo lanzadera. Preferiblemente, la construcción/vector de expresión tiene un origen de replicación específico para la identidad del microorganismo de destino de manera que cualesquiera genes presentes en la construcción/vector de expresión se expresan en el microorganismo de destino.

La expresión de la enzima metiltransferasa resulta en la metilación de los genes presentes en la construcción/vector de expresión. La construcción/vector de expresión puede aislarse a partir del microorganismo lanzadera según uno cualquiera de un número de métodos conocidos. Sólo como ejemplo, la metodología descrita en la sección de Ejemplos descrita en la presente memoria posteriormente puede usarse para aislar la construcción/vector de expresión.

En una realización particular, ambos construcción/vector se aíslan simultáneamente.

La construcción/vector de expresión puede introducirse en el microorganismo de destino usando cualquier número de métodos conocidos. Sin embargo, como ejemplo, puede usarse la metodología descrita en la sección de Ejemplos descrita en la presente memoria posteriormente. Como la construcción/vector de expresión está metilada, las secuencias de ácido nucleico presentes en la construcción/vector de expresión pueden ser incorporadas en el microorganismo de destino y expresarse con éxito.

Se prevé que un gen de metiltransferasa puede introducirse en un microorganismo lanzadera y sobreexpresarse. Así, en una realización, la enzima metiltransferasa resultante puede recogerse usando métodos conocidos y usarse in vitro para metilar un plásmido de expresión. La construcción/vector de expresión puede introducirse entonces en el microorganismo de destino para expresión. En otra realización, el gen de metiltransferasa se introduce en el genoma del microorganismo lanzadera seguido de la introducción de la construcción/vector de expresión en el microorganismo lanzadera, aislamiento de una o más construcciones/vectores del microorganismo lanzadera y después introducción de la construcción/vector de expresión en el microorganismo de destino.

Se prevé que la construcción/vector de expresión y la construcción/vector de metilación como se ha definido anteriormente pueden combinarse para proporcionar una composición de materia. Dicha composición tiene una

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utilidad particular para sortear los mecanismos de barrera de restricción para producir los microorganismos recombinantes de la invención.

En una realización particular, la construcción/vector de expresión y/o la construcción/vector de metilación son plásmidos.

Los expertos en la técnica apreciarán un número de metiltransferasas adecuadas para uso en la producción de los microorganismos de la invención. Sin embargo, como ejemplo, pueden usarse la metiltransferasa del fago ΦΤ1 de Bacillus subtilis y la metiltransferasa descrita en los Ejemplos en la presente memoria posteriormente. En una realización, la metiltransferasa tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o es una variante funcionalmente equivalente de ésta. Los ácidos nucleicos que codifican metiltransferasas adecuadas se apreciarán fácilmente teniendo en cuenta la secuencia de la metiltransferasa deseada y el código genético. En una realización, el ácido nucleico que codifica una metiltransferasa es como se describe en los Ejemplos en la presente memoria posteriormente (por ejemplo, el ácido nucleico de SEQ ID NO: 17, o es una variante funcionalmente equivalente de ésta).

Puede usarse cualquier número de construcciones/vectores adaptados para permitir la expresión de un gen de metiltransferasa para generar la construcción/vector de metilación. Sin embargo, como ejemplo, puede usarse el plásmido descrito en la sección de Ejemplos en la presente memoria posteriormente (por ejemplo, SEQ ID NO: 14).

Métodos de producción

La invención proporciona un método para la producción de biodiésel, y opcionalmente uno o más otros productos, por fermentación microbiana que comprende fermentar un sustrato que comprende CO usando un microorganismo recombinante de la invención. Los métodos de la invención pueden usarse para reducir las emisiones atmosféricas totales de carbono de un proceso industrial.

Preferiblemente, la fermentación comprende las etapas de fermentar anaeróbicamente un sustrato en un biorreactor para producir al menos biodiésel usando un microorganismo recombinante de la invención.

En una realización el método comprende las etapas de:

a.: proporcionar un sustrato que comprende CO a un biorreactor que contiene un cultivo de uno o más microorganismos de la invención; y

b.: fermentar anaeróbicamente el cultivo en el biorreactor para producir al menos biodiésel.

En una realización, el método comprende las etapas de:

a.: capturar el gas que contiene CO producido como resultado de un proceso industrial;

b.: fermentación anaeróbica del gas que contiene CO para producir biodiésel por un cultivo que contiene uno o más microorganismos de la invención.

En una realización de la invención, el sustrato gaseoso fermentado por el microorganismo es un sustrato gaseoso que contiene CO. El sustrato gaseoso puede ser un gas residual que contiene CO obtenido como un subproducto de un proceso industrial, o de alguna otra fuente tal como de gases de escape de automóviles. En determinadas realizaciones, el proceso industrial se selecciona del grupo que consiste en fabricación de productos metálicos ferrosos, tal como una acería, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinado de petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoniaco, producción de metanol y fabricación de coque. En estas realizaciones, el gas que contiene CO puede capturarse del proceso industrial antes de que sea emitido en la atmósfera, usando cualquier método conveniente. El CO puede ser un componente de gas de síntesis (gas que comprende monóxido de carbono e hidrógeno). El CO producido a partir de procesos industriales normalmente se queman para producir CO2 y por lo tanto la invención tiene una utilidad particular en la reducción de las emisiones del gas invernadero CO2 y producción de biodiésel para uso como un biocombustible. Dependiendo de la composición del sustrato gaseoso que contiene CO, también puede ser deseable tratarlo para eliminar cualesquiera impurezas no deseadas, tal como partículas de polvo antes de introducirlo en la fermentación. Por ejemplo, el sustrato gaseoso puede filtrarse o lavarse usando métodos conocidos.

Se apreciará que para que se produzca el crecimiento de las bacterias y la producción de biodiésel, además del gas sustrato que contiene CO, se necesitará alimentar al biorreactor un medio nutriente líquido adecuado.

En realizaciones particulares de los aspectos del método, la fermentación se produce en un medio de cultivo acuoso. En realizaciones particulares de los aspectos del método, la fermentación del sustrato tiene lugar en un biorreactor.

El sustrato y los medios pueden alimentarse en el biorreactor de una forma continua, discontinua o de lecho discontinuo. Un medio nutriente contendrá vitaminas y minerales suficientes para permitir el crecimiento del microorganismo usado. Los medios anaeróbicos adecuados para fermentación usando CO son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los medios adecuados se describen en Biebel (2001). En una realización de la invención, los medios

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son como se describen en la sección de Ejemplos en la presente memoria posteriormente.

La fermentación se llevará a cabo de forma deseable en condiciones de fermentación apropiadas para que se produzca la producción de biodiésel. Las condiciones de reacción que deberían considerarse incluyen presión, temperatura, velocidad de flujo de gas, velocidad de flujo de líquido, pH del medio, potencial redox del medio, velocidad de agitación (si se usa un reactor de tanque agitado continuo), nivel de inóculo, concentraciones máximas de gas sustrato para asegurar que el CO en la fase líquida no se vuelva limitante, y concentraciones máximas de producto para evitar la inhibición por producto.

Además, frecuentemente es deseable incrementar la concentración de CO de una corriente de sustrato (o presión parcial de CO en un sustrato gaseoso) y así incrementar la eficiencia de las reacciones de fermentación en las que CO es un sustrato. La operación a presiones incrementadas permite un incremento significativo en la velocidad de transferencia de CO desde la fase gas a la fase líquida donde puede ser captado por el micro-organismo como una fuente de carbono para la producción de fermentación. Eso significa a su vez que el tiempo de retención (definido como el volumen de líquido en el biorreactor dividido por la velocidad de flujo del gas de entrada) puede reducirse cuando los biorreactores se mantienen a presión elevada en lugar de presión atmosférica. Las condiciones óptimas de reacción dependerán parcialmente del micro-organismo particular de la invención usado. Sin embargo, en general, se prefiere que la fermentación se realice a una presión mayor que la presión ambiental. También, como una velocidad de conversión dada de CO-a-biodiésel es en parte función del tiempo de retención del sustrato, y el conseguir un tiempo de retención deseado dicta a su vez el volumen requerido de un biorreactor, el uso de sistemas presurizados puede reducir en gran medida el volumen del biorreactor requerido, y consecuentemente, el coste de capital del equipo de fermentación. Según los ejemplos proporcionados en la Patente US No. 5.593.886, el volumen del reactor puede reducirse en proporción lineal con incrementos en la presión de operación del reactor, es decir, los biorreactores operados a 10 atmósferas de presión sólo necesitan un décimo del volumen de aquellos operados a 1 atmósfera de presión.

Como ejemplo, se han descrito los beneficios de llevar a cabo una fermentación de gas-a-etanol a presiones elevadas. Por ejemplo, WO 02/08438 describe fermentaciones de gas-a-etanol realizadas bajo presiones de 30 psig y 75 psig, proporcionando productividades de etanol de 150 g/l/día y 369 g/l/día, respectivamente. Sin embargo, se encontró que las fermentaciones de ejemplo realizadas usando medios y composiciones de gas de entrada similares a presión atmosférica producen entre 10 y 20 veces menos de etanol por litro por día.

También es deseable que la velocidad de introducción del sustrato gaseoso que contiene CO sea tal que se asegure que la concentración de CO en la fase líquida no se vuelva limitante. Esto es porque una consecuencia de condiciones limitantes de CO puede ser que uno o más productos se consuman por el cultivo.

La composición de las corrientes de gas usadas para alimentar una reacción de fermentación puede tener un impacto significativo en la eficiencia y/o costes de esa reacción. Por ejemplo, el O2 puede reducir la eficiencia de un proceso de fermentación anaeróbica. El procesamiento de gases no deseados o no necesarios en los estadios de un proceso de fermentación antes o después de la fermentación puede incrementar la carga en dichos estadios (por ejemplo, cuando la corriente de gas se comprime antes de entrar en un biorreactor, puede usarse energía innecesaria para comprimir gases que no son necesarios en la fermentación). De acuerdo con esto, puede ser deseable tratar corrientes de sustrato, particularmente corrientes de sustrato derivadas de fuentes industriales, para eliminar componentes no deseados e incrementar la concentración de componentes deseados.

En determinadas realizaciones, un cultivo de una bacteria de la invención se mantiene en un medio de cultivo acuoso. Preferiblemente, el medio de cultivo acuoso es un medio de crecimiento bacteriano anaeróbico mínimo. Los medios adecuados son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las Patentes U.S. Nos. 5.173.429 y

5.593.886 y WO 02/08438, y como se describe en la sección de Ejemplos en la presente memoria posteriormente.

El biodiésel, o una corriente mixta que contiene biodiésel y/o uno o más otros productos, puede recuperarse del caldo de fermentación por métodos conocidos en la técnica, tal como destilación o evaporación fraccionada, pervaporación, arrastre de gas y fermentación extractiva, incluyendo, por ejemplo, extracción líquido-líquido. Los productos también pueden difundirse o secretarse en el medio, del que pueden extraerse por separación de fases.

En determinadas realizaciones preferidas de la invención, el biodiésel y uno o más productos se recuperan del caldo de fermentación por la eliminación continua de una parte del caldo del biorreactor, separando las células microbianas del caldo (convenientemente por filtración), y recuperando uno o más productos del caldo. Los alcoholes pueden recuperarse convenientemente por ejemplo por destilación. La acetona puede recuperarse por ejemplo por destilación. Cualesquiera ácidos producidos pueden recuperarse por ejemplo por adsorción en carbón activado. Las células microbianas separadas se devuelven preferiblemente al biorreactor de fermentación. El permeado sin células que permanece después de que hayan eliminado los alcoholes y ácidos también se devuelve preferiblemente al biorreactor de fermentación. Los nutrientes adicionales (tal como vitaminas B) pueden añadirse al permeado sin células para reponer el medio nutriente antes de que se devuelva al biorreactor.

También, si el pH del caldo se ajustó como se ha descrito anteriormente para aumentar la adsorción de ácido acético al carbón activado, el pH debería re-ajustarse a un pH similar al del caldo en el biorreactor de fermentación, antes de devolverlo al biorreactor.

Ejemplos

La invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los ejemplos no limitativos siguientes.

Ejemplo 1 -Producción de biodiésel a partir de CO

Un Clostridium autoethanogenum acetogénico carboxidotrófico se preparó por ingeniería con la aciltransferasa no

5 específica de Acinetobacter baylyi para la producción de un biodiésel, éster de acilo de ácido graso, éster de butilo de ácido butanoico (FABE). La producción de butanol se demostró con anterioridad usando una cepa modificada genéticamente de Clostridium autoethanogenum (WO 2012/053905).

Cepas y condiciones de crecimiento:

Todas las etapas de subclonación se realizaron en E. coli usando cepas y condiciones de crecimiento estándar

10 como se ha descrito previamente (Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989; Ausubel et al, Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, Ltd., Hoboken, 1987).

C. autoethanogenum DSM10061 y DSM23693 (un derivado de DSM10061) se obtuvieron de DSMZ (The German Collection of Microorganismos and Cell Cultures, InhoffenstraBe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania). El

15 crecimiento se llevó a cabo a 37°C usando condiciones y técnicas estrictamente anaeróbicas (Hungate, 1969, Methods in Microbiology, vol. 3B. Academic Press, Nueva York: 1 17-132; Wolfe, 1971, Adv. Microb. Physiol., 6: 107-146). Se usó medio PETC químicamente definido sin extracto de levadura (Tab. 1) y 30 psi de gas residual de acería que contenía de monóxido de carbono (recogido del sitio de Nueva Zelanda Steel en Glenbrook, NZ; composición: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2) como la única fuente de carbono y energía.

20 Tabla 1: medio PETC

Componente del medio: Concentración por 1,0L de medio

NH4Cl: 1 g

KCl: 0,1 g

MgSO4.7H2O: 0,2 g

NaCl: 0,8 g

KH2PO4: 0,1 g

CaCl2: 0,02 g

Disolución de metal traza: 10 ml

Disolución de vitaminas de Wolfe: 10 ml

Resazurina (preparación madre 2 g/L): 0,5 ml

NaHCO3: 2 g

Agente reductor: 0,006-0,008% (v/v)

Agua destilada: Hasta 1 L, pH 5,5 (ajustado con HCl)

Disolución de vitaminas de Wolfe: por L de Preparación madre

Biotina: 2 mg

Ácido fólico: 2 mg

Hidrocloruro de piridoxina: 10 mg

Riboflavina: 5 mg

Ácido nicotínico: 5 mg

D-(+)-pantotenato de calcio: 5 mg

Vitamina B12: 0,1 mg

Componente del medio: Concentración por 1,0L de medio

Ácido p-aminobenzoico: 5 mg

Ácido lipoico: 5 mg

Tiamina: 5 mg

Agua destilada: Hasta 1 L

Disolución de metal traza: por L de preparación madre

Ácido nitrilotriacético: 2 g

MnSO4.H2O: 1 g

Fe(SO4)2(NH4)2.6H2O: 0,8 g

CoCl2.6H2O: 0,2 g

ZnSO4.7H2O: 0,2 mg

CuCl2.2H2O: 0,02 g

NaMoO4.2H2O: 0,02 g

Na2SeO3: 0,02 g

NiCl2.6H2O: 0,02 g

Na2WO4.2H2O: 0,02 g

Agua destilada: Hasta 1 L

Preparación madre de agente reductor: por 100 ml de preparación madre

NaOH: 0,9 g

Cisteína.HCl: 4 g

Na2S: 4 g

Agua destilada: Hasta 100 mL

Construcción del plásmido de expresión:

Se usaron técnicas estándar de ADN recombinante y clonación molecular en esta invención y se describen por Sambrook et al, 1989 y Ausubel et al, 1987. La aciltransferasa no específica (YP_045555.1; Gene ID: 2879218) de 5 Acinetobacter baylyi se optimizó por codones y se sintetizó (SEQ ID NO: 1).

Se aisló ADN genómico de Clostridum autoethanogenum DSM 10061 usando un método modificado por Bertram y Dürre (1989). Un cultivo de 100 ml de toda la noche se recogió (6.000 x g, 15 min, 4°C), se lavó con tampón fosfato de potasio (10 mM, pH 7,5) y se suspendió en 1,9 ml de tampón STE (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM sacarosa; pH 8,0). Se añadieron 300 μl de lisozima (~100.000 U) y la mezcla se incubó a 37°C durante 30 min, 10 seguido de la adición de 280 μl de una disolución al 10% (p/v) de SDS y otra incubación durante 10 min. El ARN se digirió a temperatura ambiente por la adición de 240 μl de una disolución de EDTA (0,5 M, pH 8), 20 μl de Tris-HCl (1 M, pH 7,5), y 10 μl de ARNasa A (Fermentas). Después, se añadieron 100 μl de Proteinasa K (0,5 U) y la proteolisis tuvo lugar durante 1-3 h a 37°C. Finalmente, se añadieron 600 μl de perclorato de sodio (5 M), seguido de una extracción con fenol-cloroformo y una precipitación con isopropanol. La cantidad y calidad del ADN se

15 inspeccionaron espectrofotométricamente.

La región promotora de la fosfotransacetilasa/acetato quinasa de C. autoethanogenum (SEQ ID NO: 4) se amplificó por PCR a partir de ADN genómico con los oligonucleótidos Ppta-ack-NotI-F (SEQ ID NO: 2: GAGCGGCCGCAATATGATATTTATGTCC) y Ppta-ack-Ndel-R (SEQ ID NO: 3: TTCCATATGTTTCATGTTCATTTCCTCC) y ADN Polimerasa de Alta Fidelidad iProof (Bio-Rad Laboratories)

20 aplicando el programa siguiente: desnaturalización inicial a 980C durante 30 segundos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización (98°C durante 10 segundos), hibridación (55°C durante 30 segundos) y elongación (72°C durante 30 segundos), antes de una etapa de extensión final (72°C durante 10 minutos).

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Claims

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