ES2655214T5 - Microorganismos recombinantes que producen biodiésel - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓN
Microorganismos recombinantes que producen biodiésel
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a microorganismos recombinantes y a métodos para la producción de biodiesel por fermentación microbiana de un sustrato que comprende CO.
Antecedentes de la invención
Las bacterias incluyendo los acetógenos carboxidotróficos Clostridium autoethanogenum o C. Ijungdahlii producen ácidos grasos en la biosíntesis de lípidos y membranas celulares.
En las cepas de Clostridia de tipo salvaje, el flujo hacia abajo de la ruta de los ácidos grasos es significativo representando los lípidos típicamente el 5-6 % (p/p) de la masa celular seca (respectivamente 1-1,5% (p/p) de la masa celular húmeda) (Lepage et al., 1987, Microbiology 133: 103-1 10). Típicamente, más del 95% de los lípidos están en un intervalo de longitud de cadena C16-C18 bien definido (Lepage et al., 1987, Microbiology 133: 103-1 10), estando presentes ácidos grasos 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 17A, 18:0, 18:1, 19A.
Los ácidos grasos (FA) y sus derivados son densos energéticamente y por lo tanto tienen potencial como biocombustibles para uso como un combustible de sustitución directa de transporte/pesado y/o para la producción de otros compuestos químicos industriales. Los ejemplos de derivados de ácidos grasos incluyen biodiesel, ácidos grasos libres, alquenos y alcanos.
El biodiesel es un mono-alquil éster y puede usarse solo en motores diésel estándar, o puede mezclarse con petrodiésel. También puede usarse como una alternativa baja en carbón del gasoil de calefacción. En 2009 se usaron, en todo el mundo, más de 3,5 billones de galones de biodiesel. El biodiesel normalmente se deriva químicamente de grasa vegetal o animal por transesterificación de lípidos en presencia de alcohol para rendir glicerina y un mono-alquil éster. El biodiesel producido por este proceso puede dar lugar sin embargo a daño en los motores diésel debido a variaciones en los aceites de varias fuentes animales y vegetales que no están muy definidos con un amplio intervalo de longitud de cadena carbonada (Fukuda et al., 2001, Biosci Bioeng 92: 405-416). Los puntos críticos son dilución del aceite del motor, coquización de los anillos del pistón, corrosión de componentes hidráulicos, y deposiciones en el sistema de inyección, que resulta del proceso de producción y envejecimiento del combustible, que resulta en que algunos fabricantes de coches rechacen el uso de biodiesel derivado de animales o vegetales en algunos de sus modelos (Kopke et al., 2011, The Past, Present, and Future of Biofuels - Biobutanol as Promising Alternative, En: dos Santos Bernades (Ed.) Biofuel Production-Recent Developments and Prospects, InTech, 451-486).
La generación actual de biocombustibles que usan bien cosechas alimentarias o alimentarias para producir materias primas base basadas en azúcar o celulosa pueden tener inconvenientes referidos al uso de la tierra, seguridad alimentaria, volatilidad de suministro y problemas medioambientales.
Es un objeto de la invención superar estos problemas y proporcionar un método de producción de biodiesel, o al menos proporcionar al público una elección útil.
Resumen de la invención
La invención proporciona generalmente, inter alia, métodos para la producción de biodiesel por fermentación microbiana de un sustrato que comprende CO, y microorganismos recombinantes para usar en dichos métodos.
En un primer aspecto, la invención proporciona un microorganismo acetogénico carboxidotrófico recombinante genéticamente diseñado que comprende una bacteria acetogénica carboxidotrófica recombinante genéticamente diseñada que comprende un ácido nucleico endógeno de SEQ ID NO:1 o que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, que codifica una aciltransferasa no específica, en el que el ácido nucleico cuando se expresa en un microorganismo permite que el microorganismo produzca biodiesel por fermentación de CO.
El microorganismo puede adaptarse para expresar una o más enzimas exógenas en la ruta de biosíntesis de biodiesel no presentes en un microorganismo parental a partir del que se deriva el microorganismo recombinante (puede referirse en la presente memoria como una enzima exógena). En otra descripción, el microorganismo se adapta para sobreexpresar una o más enzimas endógenas en la ruta de síntesis de biodiesel que están presentes en un microorganismo parental a partir del que se deriva el microorganismo recombinante (puede referirse en la presente memoria como una enzima endógena).
El microorganismo recombinante puede adaptarse para producir una mayor cantidad de biodiesel de la que se produciría por un microorganismo parental a partir del que se deriva el microorganismo recombinante.
En una descripción, el microorganismo parental es capaz de fermentar un sustrato que comprende CO para producir un alcohol, pero no para convertir el alcohol en biodiesel y el microorganismo recombinante se adapta para expresar una o más enzimas implicadas en la conversión de etanol en biodiesel.
El microorganismo puede comprender uno o más ácidos nucleicos exógenos adaptados para incrementar la expresión de uno o más ácidos nucleicos endógenos y dichos uno o más ácidos nucleicos endógenos codifican una o más de las enzimas como se hace referencia en la presente memoria anteriormente.
El uno o más ácidos nucleicos exógenos adaptados para incrementar la expresión puede ser un elemento regulador. El elemento regulador puede ser un promotor. El promotor puede ser un promotor constitutivo. El promotor puede seleccionarse del grupo que comprende agrupación génica Wood-Ljungdahl, un promotor de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, un promotor del operón del complejo Rnf, promotor del operón de ATP sintasa y promotores del operón de Fosofotransacetilasa/Acetato quinasa.
El microorganismo acetogénico carboxidotrófico recombinante puede adaptarse adicionalmente para expresar una o más enzimas exógenas en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos. El microorganismo puede adaptarse para sobreexpresar una o más enzimas endógenas en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos.
El microorganismo puede comprender uno o más ácidos nucleicos exógenos que codifican y están adaptados para expresar una o más de las enzimas referidas anteriormente en la presente memoria. Los microorganismos pueden comprender uno más ácidos nucleicos exógenos que codifican y están adaptados para expresar al menos dos de las enzimas. El microorganismo puede comprender uno o más ácidos nucleicos exógenos que codifican y están adaptados para expresar cinco o más de las enzimas.
El uno o más ácidos nucleicos exógenos puede ser una construcción o vector de ácido nucleico, en una realización particular un plásmido, que codifican una o más de las enzimas referidas anteriormente en la presente memoria en cualquier combinación.
En una realización, el ácido nucleico exógeno es un plásmido.
En una realización particular, el microorganismo parental se selecciona del grupo de bacterias acetogénicas carboxidotróficas que comprende Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacter pfennigii, y Thermoanaerobacter kiuvi.
En una realización, el microorganismo parental es Clostridium autoethanogenum. El microorganismo puede ser Clostridium autoethanogenum DSM23693 un derivado de la cepa DSM10061. El microorganismo puede ser Clostridium ljungdahlii DSM13528 (o ATCC55383).
Se describe un ácido nucleico que codifica una o más enzimas que cuando se expresa en un microorganismo permite al microorganismo producir biodiesel por fermentación de un sustrato que comprende CO.
El ácido nucleico puede codificar dos o más enzimas que cuando se expresan en un microorganismo permiten al microorganismo producir biodiesel por fermentación de un sustrato que comprende CO.
Los ácidos nucleicos pueden codificar cinco o más de dichas enzimas.
Las enzimas pueden elegirse del grupo que consiste en acil transferasa y una variante funcionalmente equivalente de ésta.
El ácido nucleico que codifica acil transferasa puede ser SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de ésta.
Los ácidos nucleicos pueden comprender además un promotor. El promotor permite la expresión constitutiva de los genes bajo su control. Puede usarse un promotor de la agrupación Wood-Ljungdahl. Puede usarse un promotor de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, un promotor del operón del complejo Rnf, promotor del operón de ATP sintasa o un promotor del operón de Fosfotransacetilasa/Acetato quinasa. El promotor es de C. autoethanogenum.
Se describe una construcción o vector de ácido nucleico que comprende uno o más ácidos nucleicos descritos anteriormente.
La construcción o vector de ácido nucleico puede ser una construcción o vector de expresión. La construcción o vector de expresión puede ser un plásmido.
Se describe un organismo huésped que comprende uno cualquiera o más de los ácidos nucleicos descritos anteriormente o vectores o construcciones descritos anteriormente.
Se describe una composición que comprende una construcción o vector de expresión como se refiere anteriormente y una construcción o vector de metilación.
Preferiblemente, la composición es capaz de producir un microorganismo recombinante según el primer aspecto de la invención.
La construcción/vector de expresión y/o la construcción/vector de metilación puede ser un plásmido.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para un proceso para convertir CO en biodiesel, comprendiendo el proceso:
hacer pasar un sustrato que contiene CO gaseoso a un biorreactor que contiene un cultivo de la bacteria carboxidotrófica, acetogénica de la reivindicación 1 en un medio de cultivo de tal manera que la bacteria convierta el CO en biodiesel; y
recuperar el biodiesel del biorreactor.
Se describe un método que comprende las etapas de:
a. proporcionar un sustrato que comprende CO a un biorreactor que contiene un cultivo de uno o más microorganismos del primer aspecto de la invención; y
b. fermentar anaeróbicamente el cultivo en el biorreactor para producir biodiesel.
Se describe un método que comprende las etapas de:
a. capturar gas que contiene CO producido como resultado de un proceso industrial
b. fermentación anaeróbica del gas que contiene CO para producir biodiesel por un cultivo que contiene uno o más microorganismos del primer aspecto de la invención.
En descripciones particulares del método, la fermentación ocurre en un medio de cultivo acuoso.
En descripciones particulares del método, la fermentación del sustrato tiene lugar en un biorreactor.
Preferiblemente, el sustrato que comprende CO es un sustrato gaseoso que comprende CO. En una realización, el sustrato comprende un gas residual industrial. El gas puede ser gas residual de acería o gas de síntesis.
En una descripción, el sustrato contendrá típicamente una proporción mayor de CO, tal como al menos aproximadamente 20% a aproximadamente 100% CO en volumen, de 20% a 70% CO en volumen, de 30% a 60% CO en volumen, y de 40% a 55% CO en volumen. El sustrato puede comprender aproximadamente 25%, o aproximadamente 30%, o aproximadamente 35%, o aproximadamente 40%, o aproximadamente 45%, o aproximadamente 50% CO, o aproximadamente 55% CO, o aproximadamente 60% CO en volumen.
Los métodos pueden comprender además la etapa de recuperar el biodiesel y opcionalmente uno o más otros productos del caldo de fermentación.
Se describe biodiesel producido por el método del segundo aspecto.
La descripción proporciona un método para la producción de un microorganismo del primer aspecto de la invención que comprende transformar un microorganismo parental acetogénico carboxidotrófico por la introducción de uno o más ácidos nucleicos de manera que el microorganismo es capaz de producir biodiesel, o producir una cantidad incrementada de biodiesel comparado con el microorganismo parental, y opcionalmente uno o más otros productos por fermentación de un sustrato que comprende CO, en el que el microorganismo parental no es capaz de producir biodiesel, o produce biodiesel a un nivel menor que el microorganismo recombinante, por fermentación de un sustrato que comprende CO.
Un microorganismo parental puede transformarse por la introducción de uno o más ácidos nucleicos exógenos adaptados para expresar una o más enzimas en la ruta de biosíntesis de biodiesel. Un microorganismo parental puede transformarse además por la introducción de uno o más ácidos nucleicos exógenos adaptados para expresar una o más enzimas en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos. Un microorganismo parental puede transformarse además por la expresión o sobreexpresión de uno o más ácidos nucleicos endógenos adaptados para expresar una o más enzimas en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos. Un microorganismo parental puede transformarse con uno o más ácidos nucleicos adaptados para sobreexpresar una o más enzimas endógenas en la ruta de biodiesel que están presentes naturalmente en el microorganismo parental.
La una o más enzimas pueden ser como se han descrito anteriormente en la presente memoria.
Se describe una bacteria acetogénica carboxidotrófica preparada por ingeniería genética comprende un ácido nucleico exógeno que codifica una acetiltransferasa no específica (éster de cera sintasa/acil Coenzima A:diacilglicerol aciltransferasa). La bacteria puede ser un Clostridium, incluyendo, pero no limitado a Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, y Clostridium magnum. Otras especies de Clostridia que pueden usarse, no obstante no acetogénicas, incluyen, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. thermocellum, C. cellulolyticum, C. phytofermentans, C. kluyveri, y C. pasterianum.
La bacteria también puede ser, por ejemplo, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia product, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacter pfennigii, o Thermoanaerobacter kiwi. La acetil transferasa no específica exógena puede ser acetil transferasa no específica de Acinetobacterbaylyi. El ácido nucleico puede estar en un plásmido. El ácido nucleico que codifica la acetiltransferasa no específica puede estar optimizado en codones para C. autoethanogenum o para otra bacteria huésped.
Otra realización es un proceso para convertir CO en biodiesel. Un sustrato gaseoso que contiene CO y/o que contiene CO2 se pasa a un biorreactor que contiene un cultivo de bacterias acetogénicas carboxidotróficas de acuerdo con el primer aspecto en un medio de cultivo. Las bacterias convierten el CO directamente en biodiesel, sin la necesidad de suministrar alcoholes (por ejemplo, etanol o butanol) o ácidos grasos. El biodiesel se recupera del biorreactor. El sustrato puede comprender un gas residual industrial. El cultivo puede crecerse y mantenerse estrictamente como anaerobio. El biodiesel puede comprender ésteres de etilo de ácidos grasos y/o ésteres de butilo de ácidos grasos.
Otra realización es un plásmido que se replica en una bacteria acetogénica carboxidotrófica, comprendiendo dicho plásmido un ácido nucleico exógeno de SEQ ID NO: 1 o que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, que codifica una acetiltransferasa no específica; en el que el ácido nucleico que codifica la acetiltransferasa no específica está optimizado en codones para C. autoethanogenum; y además en el que el ácido nucleico cuando se expresa en un microorganismo permite que el microorganismo produzca biodiesel por fermentación de CO. Opcionalmente, el plásmido puede estar metilado, por ejemplo, por paso a través de una bacteria que contiene una metilasa deseada.
La invención también puede decirse que consiste ampliamente en las partes, elementos y características referidas o indicadas en la memoria descriptiva de la solicitud, individualmente o colectivamente, en cualquiera o todas las combinaciones de dos o más de dichas partes, elementos o características, y en el que los números enteros específicos que se mencionan en la presente memoria tienen equivalentes conocidos en la técnica a la que se refiere la invención, dichos equivalentes conocidos se considera que están incorporados en la presente memoria como si se mostraran individualmente.
Descripción breve de las figuras
Éstos y otros aspectos de la presente invención, que deberían considerarse en todos sus aspectos nuevos, serán evidentes a partir de la descripción siguiente, que se proporciona solo como ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas, en las que:
Figura 1: Conversión de monóxido de carbono y/o hidrógeno en un alcohol tal como etanol o butanol, después conversión posterior del alcohol y un éster de ácido graso-CoA en un aciléster de ácido graso (biodiesel) por una aciltransferasa no específica
Figura 2: Mapa genético del plásmido de expresión pMTL85245-atf
Figura 3: Resultado de GC-MS que confirma la producción de biodiesel a partir de CO.
Descripción detallada de la invención
Lo siguiente es una descripción de la presente invención, incluyendo realizaciones preferidas de ésta, proporcionada en términos generales. La invención se elucida además a partir de la descripción proporcionada bajo el encabezamiento "Ejemplos" en la presente memoria más adelante, que proporciona datos experimentales que apoyan la invención, ejemplos específicos de varios aspectos de la invención, y medios para llevar a cabo la invención.
Como se hace referencia en la presente memoria, un "caldo de fermentación" es un medio de cultivo que comprende al menos un medio nutriente y células bacterianas.
Como se hace referencia en la presente memoria, un "microorganismo lanzadera" es un microorganismo en el que se expresa una enzima metiltransferasa y es distinto del microorganismo de destino.
Como se hace referencia en la presente memoria, un "microorganismo de destino" es un microorganismo en el que se expresan los genes incluidos en la construcción/vector de expresión y es distinto del microorganismo lanzadera.
El término "producto principal de la fermentación" se pretende que signifique el producto de la fermentación que se produce en la mayor concentración y/o rendimiento.
Los términos "incrementar la eficiencia", "eficiencia incrementada" y semejantes, cuando se usan en relación con un proceso de fermentación, incluyen, pero no están limitados a, incrementar uno o más de la velocidad de crecimiento de los microorganismos que catalizan la fermentación, la velocidad de crecimiento y/o producción de producto a concentraciones de producto elevadas, el volumen de producto deseado producido por volumen de sustrato consumido, la velocidad de producción o nivel de producción del producto deseado, y la proporción relativa del producto deseado producido comparado con otros subproductos de la fermentación.
La expresión "sustrato que comprende monóxido de carbono" y términos semejantes debería entenderse que incluye cualquier sustrato en el que el monóxido de carbono está disponible para una o más cepas de bacterias para crecimiento y/o fermentación, por ejemplo.
La expresión "sustrato gaseoso que comprende monóxido de carbono" y expresiones y términos semejantes incluye cualquier gas que contiene un nivel de monóxido de carbono. El sustrato puede contener al menos aproximadamente 20% a aproximadamente 100% CO en volumen, de 20% a 70% CO en volumen, de 30% a 60% CO en volumen, y de 40% a 55% CO en volumen. El sustrato puede comprender aproximadamente 25%, o aproximadamente 30%, o aproximadamente 35%, o aproximadamente 40%, o aproximadamente 45%, o aproximadamente 50% CO, o aproximadamente 55% CO, o aproximadamente 60% CO en volumen.
Aunque no es necesario que el sustrato contenga hidrógeno, la presencia de H2 no debería ser perjudicial para la formación del producto según métodos de la invención. La presencia de hidrógeno puede resultar en una eficiencia global mejorada de la producción de alcohol. Por ejemplo, el sustrato puede comprender una proporción de aprox 2:1, o 1:1, o 1:2 de H2:CO. El sustrato puede comprender aproximadamente 30% o menos H2 en volumen, 20% o menos H2 en volumen, aproximadamente 15% o menos H2 en volumen o aproximadamente 10% o menos H2 en volumen. La corriente de sustrato puede comprender concentraciones bajas de H2, por ejemplo, menos de 5%, o menos de 4%, o menos de 3%, o menos de 2%, o menos de 1%, o carecer sustancialmente de hidrógeno. El sustrato también puede contener algo de CO2 por ejemplo, tal como aproximadamente 1% a aproximadamente 80% CO2 en volumen, o 1% a aproximadamente 30% CO2 en volumen. El sustrato puede comprender menos de o igual a aproximadamente 20% CO2 en volumen. El sustrato puede comprender menos de o igual a aproximadamente 15% CO2 en volumen, menos de o igual a aproximadamente 10% CO2 en volumen, menos de o igual a aproximadamente 5% CO2 en volumen o sustancialmente no comprende CO2.
En la descripción que sigue, las realizaciones de la invención se describen en términos de administrar y fermentar un "sustrato gaseoso que contiene CO". Sin embargo, debe apreciarse que el sustrato gaseoso puede proporcionarse en formas alternativas. Por ejemplo, el sustrato gaseoso que contiene Co puede proporcionarse disuelto en un líquido. Esencialmente, un líquido está saturado con un gas que contiene monóxido de carbono y entonces ese líquido se añade al biorreactor. Esto puede conseguirse usando metodología estándar. Como ejemplo, podría usarse un generador de dispersión de microburbujas (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volumen 101, Número 3 / Octubre, 2002). Como ejemplo adicional, el sustrato gaseoso que contiene CO puede adsorberse en un soporte sólido. Dichos métodos alternativos están englobados por el uso del término "sustrato que contiene CO" y semejantes.
En realizaciones particulares de la invención, el sustrato gaseoso que contiene CO es un gas de desecho o residual industrial. Los "gases residuales o de desecho industriales" deben tomarse como que incluyen ampliamente cualesquiera gases que comprenden CO producidos por un proceso industrial e incluyen gases producidos como resultado de la fabricación de productos metálicos ferrosos, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinado del petróleo, gasificación de carbón, gasificación de biomasa, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, y fabricación de coque. Los ejemplos adicionales pueden proporcionarse en otro lugar de la presente memoria.
A no ser que el contexto requiera otra cosa, las expresiones "fermentando", "proceso de fermentación" o "reacción de fermentación" y semejantes, tal y como se usan en la presente memoria, se pretende que engloben tanto la fase de crecimiento como la fase de biosíntesis de producto del proceso. Como se describirá adicionalmente en la presente memoria, el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de fermentación. Como tal, la adición de metales o composiciones a una reacción de fermentación debería entenderse que incluye la adición a uno o ambos de estos reactores.
El término "biorreactor" incluye un dispositivo de fermentación que consiste en uno o más recipientes y/o disposición de torres o tuberías, que incluye el Reactor de Tanque Agitado Continuo (CSTR), Reactor de Célula Inmovilizada
(ICR), Reactor de Lecho de Goteo (TBR), Columna de Burbujas, Fermentador de Inyección de Gas, Mezclador Estático, u otro recipiente u otro dispositivo adecuado para contacto gas-líquido. El biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de fermentación. Como tal, cuando se hace referencia a la adición de sustrato al biorreactor o reacción de fermentación debe entenderse que incluye la adición a uno o ambos de estos reactores cuando sea apropiado.
"Ácidos nucleicos exógenos" son ácidos nucleicos que se originan fuera del microorganismo en el que se introducen. Los ácidos nucleicos exógenos pueden derivar de cualquier fuente apropiada, incluyendo, pero no limitado a, el microorganismo en el que se van a introducir (por ejemplo, en un microorganismo parental a partir del que se deriva el microorganismo recombinante), cepas o especies de microorganismos que se diferencian del organismo en el que se van a introducir, o pueden crearse artificialmente o recombinantemente. Los ácidos nucleicos exógenos pueden representar secuencias de ácido nucleico que están presentes naturalmente en el microorganismo en el que se van a introducir, y se introducen para incrementar la expresión de o para sobreexpresar un gen particular (por ejemplo, mediante el incremento del número de copias de la secuencia (por ejemplo, un gen), o mediante la introducción de un promotor fuerte o constitutivo para incrementar la expresión). Los ácidos nucleicos exógenos pueden representar secuencias de ácido nucleico que no están presentes naturalmente en el microorganismo en el que se van a introducir y permiten la expresión de un producto que no está presente naturalmente en el microorganismo o expresión incrementada de un gen nativo para el microorganismo (por ejemplo, en el caso de la introducción de un elemento regulador tal como un promotor). El ácido nucleico exógeno puede adaptarse para integrarse en el genoma del microorganismo en el que se va a introducir o permanecer en un estado extra-cromosómico.
"Exógeno" también puede usarse para hacer referencia a proteínas. Esto se refiere a una proteína que no está presente en el microorganismo parental a partir del que se deriva el microorganismo recombinante.
El término "endógeno" tal y como se usa en la presente memoria en relación con un microorganismo recombinante y un ácido nucleico o proteína se refiere a cualquier ácido nucleico o proteína que está presente en un microorganismo parental a partir del que se deriva el microorganismo recombinante.
"Biodiesel" como se hace referencia en la presente memoria se refiere a un éster de alquilo de ácido graso por ejemplo que comprende bien éster de etilo de ácido graso (FAEE) y/o éster de butilo de ácido graso (FABE). El biodiesel producido puede ser una mezcla de ésteres de alquilo de ácidos grasos.
La "ruta de biosíntesis de biodiesel" como se hace referencia en la presente memoria se refiere a la ruta desde acil graso CoA a biodiesel. Las enzimas ejemplares en esta ruta incluyen pero no están limitadas a acil transferasa [EC:2.3.-.-] y acil-CoA sintetasa/ácido graso de cadena larga --CoA ligasa [EC:6.2.3.1].
La "ruta de biosíntesis de ácidos grasos" se refiere a la ruta desde acetil CoA a la producción de un acil graso CoA. Las enzimas ejemplares en esta ruta incluyen pero no están limitadas a acetil-CoA carboxilasa/biotina carboxilasa [EC:6.3.4.14/e C:6.4.1.2/EC:6.4.1.3], maloniltransferasa/malonato descarboxilasa [EC:2.3.1.39], ácido graso sintasa [EC:2.3.1.85/EC:2.3.1.86/EC:2.3.1.-], 3-oxoacil-[proteína transportadora de acilo] sintasa [EC:2.3.1.41/EC:2.3.1.179/EC:2.3.1.180], 3-oxoacil-[proteína transportadora de acilo] reductasa [EC: 1.1.1.100], 3-hidroximiristoil ACP dehidrasa [EC:4.2.1.-], 3-hidroxidecanoil-[proteína transportadora de acilo] deshidratasa [EC:4.2.1.60], enoil-[proteína transportadora de acilo] reductasa [Ec : 1.3.1.9,EC:1.3.1.-, EC: 1.3.1.-], acil graso-ACP tioesterasa [EC:3.1.2.- 3.1.2.14], oleoil-[proteína de acilo] hidrolasa [EC:3.1.2.14], acil-[proteína transportadora de acilo] desaturasa [EC: 1.14.19.2], acetil-CoA aciltransferasa [EC:2.3.1.16], 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa [EC:1.1.1.35], enoil-CoA hidratasa / 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa de cadena larga [EC: 1.1.1.211, EC:4.2.1.17], enoil-CoA hidratasa [EC:4.2.1.17], trans-2-enoil-CoA reductasa [EC: 1.3.1.38], palmitoil-proteína tioesterasa [EC:3.1.2.22], proteína de elongación de ácidos grasos [EC:2.3.1.-], 3-cetoacil-CoA sintasa [EC:2.3.1.-], beta-ceto reductasa [EC: 1.1.1.-], 3-hidroxi acil-CoA deshidratasa [EC:4.2.1.-], enoil reductasa [EC: 1.3.1 .-], palmitoil-CoA hidrolasa [EC:3.1.2.2].
Debe apreciarse que la invención puede llevarse a la práctica usando ácidos nucleicos cuya secuencia varía de las secuencias ejemplificadas específicamente en la presente memoria siempre que realicen sustancialmente la misma función. Para secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína o péptido, esto significa que la proteína o péptido codificado tiene sustancialmente la misma función. Para secuencias de ácidos nucleicos que representan secuencias de promotor, la secuencia variante tendrá la capacidad de estimular la expresión de uno o más genes. Dichos ácidos nucleicos pueden referirse en la presente memoria como "variantes funcionalmente equivalentes". Como ejemplo, las variantes funcionalmente equivalentes de un ácido nucleico incluyen variantes alélicas, fragmentos de un gen, genes que incluyen mutaciones (deleción, inserción, sustituciones de nucleótidos y semejantes) y/o polimorfismos y semejantes. Los genes homólogos de otros microorganismos también pueden considerarse como ejemplos de variantes funcionalmente equivalentes de las secuencias ejemplificadas específicamente en la presente memoria. Éstos incluyen genes homólogos en especies tales como Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, C. Ijungdahlii, Acinetobacter baylyi detalles de los cuales están disponibles públicamente en sitios de internet tales como Genbank o NCBI. La expresión "variantes funcionalmente equivalentes" también debe tomarse que incluye ácidos nucleicos cuya secuencia varía como resultado de la optimización de codones para un organismo particular. Las "variantes funcionalmente equivalentes" de un ácido nucleico en la presente memoria tendrán
preferiblemente al menos aproximadamente 70%, preferiblemente aproximadamente 80%, más preferiblemente aproximadamente 85%, preferiblemente aproximadamente 90%, preferiblemente aproximadamente 95% o mayor, identidad de secuencia de ácido nucleico con el ácido nucleico identificado.
También debería apreciarse que la invención puede llevarse a la práctica usando polipéptidos cuya secuencia varía de las secuencias de aminoácidos ejemplificadas específicamente en la presente memoria. Estas variantes pueden referirse en la presente memoria como "variantes funcionalmente equivalentes". Una variante funcionalmente equivalente de una proteína o un péptido incluye aquellas proteínas o péptidos que comparten al menos 40%, preferiblemente 50%, preferiblemente 60%, preferiblemente 70%, preferiblemente 75%, preferiblemente 80%, preferiblemente 85%, preferiblemente 90%, preferiblemente 95% o mayor, identidad de aminoácidos con la proteína o péptido identificado y tiene sustancialmente la misma función que el péptido o proteína de interés. Dichas variantes incluyen en su alcance fragmentos de una proteína o péptido en los que el fragmento comprende una forma truncada del polipéptido en el que las deleciones pueden ser de 1 a 5, a 10, a 15, a 20, a 25 aminoácidos, y pueden extenderse de residuo 1 a 25 en cualquiera de los extremos del polipéptido, y en el que las deleciones pueden ser de cualquier longitud en la región; pueden estar en una localización interna. Las variantes funcionalmente equivalentes de los polipéptidos específicos en la presente memoria también deben tomarse que incluyen polipéptidos expresados por genes homólogos en otras especies de bacterias, por ejemplo, como se ejemplifica en el párrafo anterior.
"Sustancialmente la misma función" tal y como se usa en la presente memoria se pretende que signifique que el ácido nucleico o polipéptido es capaz de realizar la función del ácido nucleico o polipéptido del que es una variante. Por ejemplo, una variante de una enzima de la invención será capaz de catalizar la misma reacción que esa enzima. Sin embargo, no debe tomarse que significa que la variante tiene el mismo nivel de actividad que el polipéptido o ácido nucleico del que es una variante.
Se puede evaluar si una variante funcionalmente equivalente tiene sustancialmente la misma función que el ácido nucleico o polipéptido del que es una variante usando métodos conocidos para un experto en la técnica. Sin embargo, como ejemplo, los ensayos para ensayar para actividad aciltransferasa se describen en Kalscheuer et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol., 70: 71 19-25; Stoveken et al., 2005, J. Bacteriol., 187: 1369-76.
"Sobreexpresar", "sobreexpresión " y términos y expresiones semejantes cuando se usan en relación con la invención deben tomarse que incluyen ampliamente cualquier incremento en la expresión de una o más proteínas (incluyendo la expresión de uno o más ácidos nucleicos que codifican las mismas) comparado con el nivel de expresión de la proteína (incluyendo ácidos nucleicos) de un microorganismo parental en las mismas condiciones. No debe tomarse que significa que la proteína (o ácido nucleico) se expresa a ningún nivel particular.
Un "microorganismo parental" es un microorganismo usado para generar un microorganismo recombinante de la invención. El microorganismo parental puede ser uno que aparece en la naturaleza (es decir, un microorganismo de tipo salvaje) o uno que se ha modificado previamente pero que no expresa o sobreexpresa la enzima objeto de la presente invención. De acuerdo con esto, los microorganismos recombinantes de la invención pueden haber sido modificados para expresar o sobreexpresar una o más enzimas que no se expresaban o sobreexpresaban en el microorganismo parental.
Los términos "construcciones" o "vectores" de ácidos nucleicos y términos semejantes deben tomarse que incluyen ampliamente cualquier ácido nucleico (incluyendo ADN y ARN) adecuado para uso como un vehículo para transferir material genético en una célula. Los términos deben tomarse que incluyen plásmidos, virus (incluyendo bacteriófago), cósmidos y cromosomas artificiales. Las construcciones o vectores pueden incluir uno o más elementos reguladores, un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple y/o un marcador seleccionable. Las construcciones o vectores pueden estar adaptados para permitir la expresión de uno o más genes codificados por la construcción o vector. Las construcciones o vectores de ácidos nucleicos incluyen ácidos nucleicos desnudos, así como ácidos nucleicos formulados con uno o más agentes para facilitar la administración a una célula (por ejemplo, ácido nucleico conjugado con liposoma, un organismo en el que está contenido el ácido nucleico).
Los inventores han mostrado sorprendentemente que un microorganismo recombinante puede prepararse por ingeniería para producir un biodiesel a partir de un sustrato que contiene CO. Los inventores han preparado por ingeniería organismos recombinantes y han inventado métodos para uso de éstos para la producción del biodiesel derivado de ácidos grasos. Los inventores también contemplan que otros derivados de ácidos grasos incluyendo ácidos grasos libres, alcanos y alquenos podrían producirse como parte de la invención. Todos estos productos pueden derivar de intermedios clave de ácidos grasos de acil-CoA de ácidos grasos (tioésteres con CoA) o ACP de ácidos grasos (Proteínas transportadoras de acilo).
El biodiesel producido por la invención es un compuesto energéticamente denso de cadena larga, y su síntesis requiere que la célula invierta energía en la forma de nucleósidos trifosfato tal como ATP. En un proceso aeróbico y/o usando azúcar como un sustrato requiere un suministro de energía suficiente de la glicolisis para rendir varias moléculas de ATP. La producción de biodiesel a través de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos en un proceso aeróbico y/o usando azúcar como un sustrato se produce de una manera relativamente directa debido a las moléculas de C5 pentosa y C6 hexosa que se convierten en ácidos grasos de cadena más larga dirigido por la alta disponibilidad de ATP, aunque se
requiere un número mayor de reacciones. La presente invención puede tener ventajas sobre la producción de biocombustibles a partir de sustratos basados en azúcar y proporciona un medio alternativo para la producción de biodiesel utilizando gases residuales incluyendo monóxido de carbono de procesos industriales.
Para los acetógenos anaerobios que usan un sustrato C1 como CO o CO2, es más difícil producir moléculas largas tales como ácido grasos ya que a diferencia de la glicolisis, no se gana energía neta a partir de la fosforilación a nivel de sustrato en la ruta de fijación de carbono Wood-Ljungdahl, de hecho la activación de CO2 a formato incluso requiere una molécula de ATP y se requiere un gradiente de membrana. Hasta ahora, el producto con más átomos de carbono reportado en acetógenos (organismos tanto nativos como recombinantes) son los compuestos C4 butanol y 2,3-butanodiol.
Los inventores han mostrado que es posible producir estas moléculas de ácido graso de cadena más larga tal como biodiesel usando la materia prima base de C1 CO mediante el intermedio acetil CoA. Como el sustrato CO o CO2 está en la ruta Wood-Ljungdahl canalizada directamente en acetil-CoA (el punto de partida de la biosíntesis de ácidos grasos), son necesarias menos reacciones y enzimas que de azúcares mediante glicolisis, haciendo que el proceso sea más rápido y más eficiente incluso cuando está disponible menos ATP. Aunque está disponible menos ATP en los acetógenos carboxidotróficos, los inventores consideran que esta ruta más directa puede sostener un mayor flujo metabólico (debido a una mayor fuerza motriz química de reacciones intermedias).
En una realización particular de la invención, los inventores han encontrado que la producción de biodiesel (un éster de alquilo de ácidos grasos) por un microorganismo recombinante de la invención se permite por la introducción en el microorganismo de una acil transferasa exógena en el que la acil transferasa está codificada por SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1. Los métodos de producción tradicionales de biodiesel implican la transestenficación de un lípido (triglicérido) en presencia de alcohol para rendir glicerina y biodiesel. Sin embargo, la presente invención proporciona un microorganismo recombinante que es capaz de co-producir tanto alcohol (incluyendo etanol y/o butanol) como ácido graso. Los inventores creen que esta co producción proporciona los sustratos requeridos para proporcionar una fuerza directriz para la producción in vivo de biodiesel que comprende bien FAEE (Ésteres de etilo de ácidos grasos) y/o FABE (Ésteres de butilo de ácidos grasos).
Para conseguir una realización de la invención, una aciltransferasa no específica (éster de cera sintasa/acil Coenzima A:diacilglicerol aciltransferasa) de Acinetobacter baylyi se introdujo en el microorganismo acetogénico en el que la acil transferasa está codificada por SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1. El microorganismo produce un alcohol (por ejemplo, etanol o butanol) y un acil graso-CoA que se convierten en un éster de alquilo de ácido graso (es decir, biodiesel) (Fig. 1) (Kalscheuer et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol., 70: 71 19-25; Stoveken et al., 2005, J. Bacteriol., 187: 1369-76). Las acil-CoA de ácido graso son un producto directo de ácidos grasos y se producen por la acción de por ejemplo acil-CoA sintetasa (ácido graso de cadena larga--CoA ligasa) que puede estar presente en acetógenos carboxidotróficos. La producción in vivo de FAEE usando esta enzima no se ha mostrado excepto con el suministro de ácidos grasos o alcohol suplementarios a la reacción externamente (Kalscheuer et al., 2006, Microbiology, 152, 2529-36). Aunque todos los organismos producen precursores de ácidos grasos, para los organismos que no producen (altas cantidades de) alcoholes como E. coli, son necesarias modificaciones genéticas adicionales. La producción bacteriana de FABE no se ha demostrado previamente en absoluto. La presente invención no requiere dicho suministro externo de alcohol por lo tanto puede proporcionar varias ventajas. Incluidas en estas ventajas está la reducción del coste de la materia prima base, una reducción significativa de la complejidad del equipo y control de parámetros y etapas de manejo y separación limitadas requeridas por el proceso.
Aunque los inventores han demostrado la eficacia de la invención en Clostridium autoethanogenum, contemplan que la invención es aplicable al grupo más amplio de microorganismos acetogénicos carboxidotróficos y se discute adicionalmente en la presente memoria.
Microorganismos
Como se ha discutido anteriormente en la presente memoria, la invención proporciona un microorganismo recombinante capaz de producir biodiesel, y opcionalmente uno o más otros productos, por fermentación de un sustrato que comprende CO.
El microorganismo puede adaptarse para expresar una o más enzimas exógenas en la ruta de biosíntesis de biodiesel. El microorganismo puede adaptarse para sobreexpresar una o más enzimas endógenas en la ruta de biosíntesis de biodiesel.
El microorganismo recombinante puede adaptarse para producir una mayor cantidad de biodiesel de la que se produciría por un microorganismo parental a partir del que se deriva el microorganismo recombinante.
El microorganismo parental a partir del que puede derivar el microorganismo recombinante es capaz de fermentar un sustrato que comprende CO para producir un alcohol, pero no para convertir el alcohol en un biodiesel, y el microorganismo recombinante se adapta para expresar una o más enzimas implicadas en la conversión de etanol a
biodiesel.
El microorganismo acetogénico carboxidotrófico recombinante puede adaptarse además para expresar una o más enzimas exógenas en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos. El microorganismo puede adaptarse además para sobreexpresar una o más enzimas endógenas en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos.
El microorganismo puede adaptarse para expresar o sobreexpresar la una o más enzimas por cualquier número de métodos recombinantes incluyendo, por ejemplo, incrementar la expresión de genes endógenos (por ejemplo, mediante la introducción de un promotor más fuerte o constitutivo para dirigir la expresión de un gen), incrementar el número de copias de un gen que codifica una enzima particular mediante la introducción de ácidos nucleicos exógenos que codifican y están adaptados para expresar la enzima, o mediante la introducción de un ácido nucleico exógeno que codifica y está adaptado para expresar una enzima que no está presente naturalmente en el microorganismo parental.
El microorganismo parental puede transformarse para proporcionar una combinación de a) expresión incrementada o sobreexpresión de uno o más genes endógenos y b) introducción de uno o más genes exógenos. Por ejemplo, uno o más genes que codifican una o más enzimas en la ruta de biosíntesis de biodiesel y opcionalmente de ácidos grasos pueden ser nativos para el microorganismo parental, pero pueden no incluir uno o más otros genes que codifican una o más otras enzimas en la ruta.
La una o más enzimas en la ruta de biosíntesis de biodiesel pueden elegirse del grupo que consiste en acil transferasa y una variante funcionalmente equivalente de ésta. Solo como ejemplo, se proporciona información de secuencia para acil transferasa.
Las enzimas y variantes funcionales para uso en los microorganismos de la invención pueden derivar de cualquier fuente apropiada, incluyendo diferentes géneros y especies de bacterias, u otros organismos. Sin embargo, en una realización, la acil transferasa es la derivada de Acinetobacter baylyi como se describe en SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1. la acil transferasa puede tener las características identificativas de la aciltransferasa no específica YP_045555.1; Gene ID: 2879218 de Acinetobacter baylyi. Una acil-CoA sintetasa/ácido graso de cadena larga--CoA ligasa se proporciona por ejemplo con los números de acceso P69451 o GenelD: 946327.
El microorganismo puede comprender uno o más ácidos nucleicos exógenos adaptados para incrementar la expresión de uno o más ácidos nucleicos nativos para el microorganismo parental y dichos uno o más ácidos nucleicos codifican una o más de las enzimas como se hace referencia en la presente memoria anteriormente. El uno o más ácido nucleico exógeno puede adaptarse para incrementar la expresión es un elemento regulador. El elemento regulador puede ser un promotor. El promotor puede ser un promotor constitutivo que es preferiblemente altamente activo en condiciones de fermentación apropiadas. También podrían usarse promotores inducibles. El promotor puede seleccionarse del grupo que comprende agrupación génica Wood-Ljungdahl, un promotor de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, un promotor del operón del complejo Rnf, promotor del operón de ATP sintasa o promotores del operón de Fosfotransacetilasa/Acetato quinasa. Los expertos en la técnica apreciarán que otros promotores que puedan dirigir la expresión, preferiblemente un alto nivel de expresión en las condiciones de fermentación apropiadas, también serían efectivos como alternativas.
El microorganismo puede comprender uno o más ácidos nucleicos exógenos que codifican y están adaptados para expresar una o más de las enzimas como se hace referencia en la presente memoria anteriormente. Los microorganismos pueden comprender uno o más ácidos nucleicos exógenos que codifican y están adaptados para expresar al menos dos de las enzimas. El microorganismo puede comprender uno o más ácidos nucleicos exógeno que codifican y está adaptados para expresar tres de las enzimas. El microorganismo puede comprender uno o más ácido nucleicos exógenos que codifican y está adaptados para expresar cinco de las enzimas.
En una realización particular, el microorganismo comprende uno o más ácidos nucleicos exógenos que codifican una acil transferasa en el que la acil transferasa está codificada por SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
El microorganismo puede comprender uno o más ácidos nucleicos exógenos. Cuando es deseable transformar el microorganismo parental con dos o más elementos genéticos (tales como genes o elementos reguladores (por ejemplo, un promotor)) éstos pueden estar contenidos en uno o más ácidos nucleicos exógenos.
El uno o más ácidos nucleicos exógenos puede ser una construcción o vector de ácido nucleico, en una realización particular un plásmido, que codifica una o más de las enzimas referidas anteriormente en la presente memoria en cualquier combinación.
Los ácidos nucleicos exógenos pueden permanecer en estado extra-cromosómico después de la transformación del microorganismo parental o pueden integrarse en el genoma del microorganismo parental. De acuerdo con esto, pueden incluir secuencias de nucleótidos adicionales adaptadas para ayudar a la integración (por ejemplo, una región
que permite la recombinación homóloga e integración dirigida en el genoma del huésped) o expresión y replicación de una construcción extracromosómica (por ejemplo, origen de replicación, promotor y otros elementos o secuencias reguladoras).
Los ácidos nucleicos exógenos que codifican una o más enzimas como se menciona en la presente memoria anteriormente pueden comprender además un promotor adaptado para estimular la expresión de una o más enzimas codificadas por los ácidos nucleicos exógenos. El promotor puede ser un promotor constitutivo que es preferiblemente altamente activo en condiciones de fermentación apropiadas. También podrían usarse promotores inducibles. El promotor puede seleccionarse del grupo que comprende agrupación génica Wood-Ljungdahl, un promotor de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, un promotor del operón del complejo Rnf, promotor del operón de ATP sintasa y promotores de Fosfotransacetilasa/Acetato quinasa. Los expertos en la técnica apreciarán que otros promotores que puedan dirigir la expresión, preferiblemente un alto nivel de expresión en condiciones de fermentación apropiadas, serían efectivos como alternativas.
El ácido nucleico exógeno puede ser un plásmido de expresión.
En una realización, el microorganismo acetogénico carboxidotrófico parental se selecciona del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Butyribacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia product, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Oxobacter pfennigii, y Thermoanaerobacter kiuvi.
En una realización particular del primer aspecto, el microorganismo parental se selecciona del grupo de Clostridia carboxidotrófica que comprende Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum.
El microorganismo puede seleccionarse de una agrupación de Clostridia carboxidotrófica que comprende las especies C autoethanogenum, C. ljungdahlii, y "C. ragsdalei" y aislados relacionados. Éstos incluyen pero no están limitados a cepas C. autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Naveau, y Nyns, 1994), C. autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) (WO/2009/064200), C. autoethanogenum LBS1561 (DSM23693), C. ljungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Miller, y Yang, 1993), C. ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (patente US 5.593.886), C. ljungdahlii C-01 (ATCC 55988) (patente US 6.368.819), C. ljungdahlii O-52 (ATCC 55989) (patente US 6.368.819), o "C. ragsdalei P11T" (ATCC BAA-622) (WO 2008/028055), y aislados relacionados tal como "C. coskatir (patente US 2011/0229947), "Clostridium sp. MT351" (Michael Tyurin y Kiriukhin, 2012) y cepas mutantes de éstas tal como C. ljungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. tesis de doctorado, North Carolina State University, 2010).
Estas cepas forman una subagrupación en la agrupación I de ARNr de Clostridia (Collins et al., 1994), que tiene al menos 99% de identidad a nivel de gen de ARNr 16S, aunque son especies distintas como se determina por reasociación de ADN-ADN y experimentos de huella de ADN (WO 2008/028055, patente US 2011/0229947).
Las cepas de esta agrupación se definen por características comunes, teniendo tanto un genotipo como fenotipo similar, y todas comparten el mismo modo de conservación de energía y metabolismo fermentativo. Las cepas de esta agrupación carecen de citocromos y conservan la energía a través de un complejo Rnf.
Todas las cepas de esta agrupación tienen un tamaño de genoma de alrededor de 4,2 MBp (Kopke et al., 2010) y una composición en GC de alrededor de 32% en moles (Abrini et al., 1994; Kopke et al., 2010; Tanner et al., 1993) (WO 2008/028055; patente US 2011/0229947), y operones de genes clave esenciales conservados que codifican enzimas de la ruta Wood-Ljungdahl (Monóxido de carbono deshidrogenasa, Formil-tetrahidrofolato sintetasa, Metilentetrahidrofolato deshidrogenasa, Formil-tetrahidrofolato ciclohidrolasa, Metilen-tetrahidrofolato reductasa, y Monóxido de carbono deshidrogenasa/Acetil-CoA sintasa), hidrogenasa, formato deshidrogenasa, complejo Rnf (rnfCDGEAB), piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, aldehído:ferredoxina oxidorreductasa (Kopke et al., 2010, 2011). Se ha encontrado que la organización y número de genes de la ruta Wood-Ljungdahl, responsables de la captación de gas, es la misma en todas las especies, a pesar de las diferencias en las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos (Kopke et al., 2011).
Todas las cepas tienen una morfología y tamaño similares (las células en crecimiento logarítmico son entre 0,5-0,7 x 3-5 |jm), son mesofílicas (temperatura de crecimiento óptima entre 30-37°C) y estrictamente anaerobias (Abrini et al., 1994; Tanner et al., 1993) (WO 2008/028055). Además, todas comparten los mismos rasgos filogenéticos principales, tal como mismo intervalo de pH (pH 4-7,5, con un pH inicial óptimo de 5,5-6), crecimiento autotrófico fuerte en gases que contienen CO con velocidades de crecimiento similares, y un perfil metabólico con etanol y ácido acético como producto final de fermentación principal, con pequeñas cantidades de 2,3-butanodiol y ácido láctico formadas en determinadas condiciones (Abrini et al., 1994; Kopke et al., 2011 ; Tanner et al., 1993). Sin embargo, las especies se diferencian en la utilización de sustrato de varios azúcares (por ejemplo, ramnosa, arabinosa), ácidos (por ejemplo, gluconato, citrato), aminoácidos (por ejemplo, arginina, histidina), u otros sustratos (por ejemplo, betaína, butanol). Se
encontró que algunas de las especies eran auxótrofas para determinadas vitaminas (por ejemplo, tiamina, biotina) mientras otras no lo eran. La reducción de ácidos carboxílicos a sus alcoholes correspondientes se ha mostrado en un rango de estos organismos (Perez, Richter, Loftus, y Angenent, 2012).
Los rasgos descritos son por lo tanto no específicos para un organismo como C. autoethanogenum o C. Ijungdahlii, sino que son rasgos generales para Clostridia carboxidotróficas que sintetizan etanol. Así, puede anticiparse que la invención funciona en todas estas cepas, aunque puede haber diferencias en el rendimiento.
Los microorganismos acetogénicos carboxidotróficos recombinantes de la invención pueden prepararse a partir de un microorganismo acetogénico carboxidotrófico parental y uno o más ácidos nucleicos exógenos usando cualquier número de técnicas conocidas en la técnica para producir microorganismos recombinantes. Solo como ejemplo, la transformación (incluyendo transducción o transfección) puede conseguirse por electroporación, electrofusión, ultrasonicación, transformación mediada por polietilen glicol, conjugación, o competencia química y natural. Las técnicas de trasformación adecuadas se describen por ejemplo en Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989.
La electroporación se ha descrito para varios acetógenos carboxidotróficos como C. Ijungdahlii (Kopke et al., 2010; Leang, Ueki, Nevin, y Lovley, 2012) (PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), C. autoethanogenum (PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), Acetobacterhim woodii (Stratz, Sauer, Kuhn, y Dürre, 1994) o Moorella thermoacetica (Kita et al., 2012) y es un método estándar usado en muchas Clostridia tal como C. acetobutylicum (Mermelstein, Welker, Bennett, y Papoutsakis, 1992), C. cellulolyticum (Jennert, Tardif, Young, y Young, 2000) o C. thermocellum (MV Tyurin, Desai, y Lynd, 2004).
La electrofusión se ha descrito para Clostridium sp. acetogénica MT351 (Tyurin y Kiriukhin, 2012).
La inducción de profagos se ha descrito para acetógeno carboxidotrófico así como en el caso de C. scatologenes (Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project Western Kentucky University).
La conjugación se ha descrito como método de elección para el acetógeno Clostridium difficile (Herbert, O'Keeffe, Purdy, Elmore, y Minton, 2003) y muchas otras Clostridia incluyendo C. acetobuylicum (Williams, Young, y Young, 1990).
La cepa parental puede usar CO como su única fuente de carbono y energía.
El microorganismo parental puede ser Clostridium autoethanogenum o Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum DSM23693 o Clostridium ljungdahlii DSM13528 (o ATCC55383).
Ácidos nucleicos
La invención también proporciona uno o más ácidos nucleicos o construcciones de ácido nucleico para uso en la generación de un microorganismo recombinante de la invención.
Los ácidos nucleicos pueden comprender secuencias que codifican una o más de las enzimas en la ruta de biosíntesis de biodiesel, que cuando se expresan en un microorganismo permiten que el microorganismo produzca biodiesel por fermentación de un sustrato que comprende CO. La invención puede proporcionar un ácido nucleico que codifica dos o más enzimas que cuando se expresan en un microorganismo permiten que el microorganismo produzca biodiesel por fermentación de un sustrato que comprende CO. Los ácidos nucleicos de la invención pueden codificar tres de dichas enzimas, o cinco de dichas enzimas.
Las enzimas pueden elegirse del grupo que consiste en acil transferasa y una variante funcionalmente equivalente de ésta.
Las secuencias de aminoácidos y secuencias de ácido nucleico ejemplares que codifican enzimas descritas en la presente memoria se proporcionan en la presente memoria o pueden obtenerse de GenBank como se ha mencionado anteriormente en la presente memoria. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán fácilmente secuencias de ácidos nucleicos alternativas que codifican las enzimas o variantes funcionalmente equivalentes de éstas, teniendo en cuenta la información contenida en la presente memoria, en GenBank y otras bases de datos, y el código genético. En una realización, la acil transferasa está codificada por la secuencia de SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.
El ácido nucleico puede codificar además una o más enzimas exógenas en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos. El ácido nucleico puede codificar además una o más enzimas endógenas en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos. Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender además un promotor. El promotor puede permitir la expresión
constitutiva de los genes bajo su control. Sin embargo, también pueden emplearse promotores inducibles. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente promotores para uso en la invención. Preferiblemente, el promotor puede dirigir un alto nivel de expresión en condiciones de fermentación apropiadas. Puede usarse un promotor de la agrupación Wood-Ljungdahl. Puede usarse un promotor de Fosfotransacetilasa/Acetato quinasa. El promotor puede ser de C. autoethanogenum.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden permanecer en estado extra-cromosómico después de la transformación de un microorganismo parental o pueden adaptarse para integración en el genoma del microorganismo. De acuerdo con esto, los ácidos nucleicos de la invención pueden incluir secuencias de nucleótidos adicionales adaptadas para ayudar en la integración (por ejemplo, una región que permita la recombinación homóloga e integración dirigida en el genoma del huésped) o expresión estable y replicación de una construcción extracromosómica (por ejemplo, origen de replicación, promotor y otras secuencias reguladoras).
El ácido nucleico puede ser una construcción o vector de ácido nucleico. La construcción o vector de ácido nucleico puede ser una construcción o vector de expresión, sin embargo, otras construcciones y vectores, tales como las usadas para clonar están englobadas por la descripción. En una realización particular, la construcción o vector de expresión es un plásmido.
Se apreciará que una construcción/vector de expresión de la presente invención puede contener cualquier número de elementos reguladores además del promotor, así como genes adicionales adecuados para la expresión de proteínas adicionales, si se desea. La construcción/vector de expresión puede incluir un promotor. La construcción/vector de expresión puede incluir dos o más promotores. La construcción/vector de expresión puede incluir un promotor para cada gen que se va a expresar. La construcción/vector de expresión puede incluir uno o más sitios de unión ribosomales, preferiblemente un sitio de unión ribosomal para cada gen que se va a expresar
Los expertos en la técnica apreciarán que las secuencias de ácido nucleico y secuencias de construcción/vector descritas en la presente memoria pueden contener nucleótidos conectores estándar tales como los requeridos para sitios de unión al ribosoma y/o sitios de restricción. No debería interpretarse que dichas secuencias conectoras se requieren y no proporcionan una limitación en las secuencias definidas.
Los ácidos nucleicos y construcciones de ácido nucleico, incluyendo construcciones/vectores de expresión de la invención pueden construirse usando cualquier número de técnicas estándar en la técnica. Por ejemplo, puede usarse síntesis química o técnicas recombinantes. Dichas técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook et al (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Las técnicas adicionales ejemplares se describen en la sección de Ejemplos en la presente memoria posteriormente. Esencialmente, los genes individuales y elementos reguladores se unirán de forma operativa entre sí de manera que los genes pueden expresarse para formar las proteínas deseadas. Los vectores adecuados para uso en la invención serán apreciados por los expertos en la técnica. Sin embargo, como ejemplo, pueden ser adecuados los vectores siguientes: vectores pMTL80000, pIMP1, pJIR750, y los plásmidos ejemplificados en la sección de Ejemplos en la presente memoria posteriormente.
Debe apreciarse que los ácidos nucleicos de la invención pueden estar en cualquier forma apropiada, incluyendo ARN, ADN, o ADNc.
La descripción también proporciona organismos huésped, particularmente microorganismos, e incluyendo virus, bacterias, y levaduras, que comprenden uno cualquiera o más de los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria.
Método para producir microorganismos
El uno o más ácidos nucleicos exógenos pueden administrarse a un microorganismo parental como ácidos nucleicos desnudos o pueden formularse con uno o más agentes para facilitar el proceso de transformación (por ejemplo, ácido nucleico conjugado con liposoma, un organismo en el que está contenido el ácido nucleico). El uno o más ácidos nucleicos pueden ser ADN, ARN, o combinaciones de éstos, según sea apropiado. Pueden usarse inhibidores de restricción; véase, por ejemplo, Murray, N.E. et al. (2000) Microbial. Molec. Biol. Rev. 64, 412.)
Los microorganismos de la invención pueden prepararse a partir de un microorganismo parental y uno o más ácidos nucleicos exógenos usando cualquier número de técnicas conocidas en la técnica para producir microorganismos recombinantes. Solo como ejemplo, la transformación (incluyendo transducción o transfección) puede conseguirse por electroporación, ultrasonicación, transformación mediada por polietilen glicol, competencia química o natural, transformación de protoplastos, inducción de profago o conjugación. Las técnicas de transformación adecuadas se describen, por ejemplo, en, Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989.
La electroporación se ha descrito para varios acetógenos carboxidotróficos como C. Ijungdahlii (Kopke et al. 2010, Poc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 107: 13087-92; PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), C. autoethanogenum
(PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), o Acetobacterium woodii (Straetz et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol.
60:1033-37) y es un método estándar usando en muchas Clostridia tal como C. acetobutylicum (Mermelstein et al, 1992, Biotechnology, 10, 190-195), C. cellulolyticum (Jennert et al., 2000, Microbiology, 146: 3071-3080) o C. thermocellum (Tyurin et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70: 883-890). La inducción de profago se ha demostrado para acetógeno carboxidotrófico, así como en el caso de C. scatologenes (Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project Western Kentucky University), mientras la conjugación se ha descrito como método de elección para muchas Clostridia incluyendo Clostridium difficile (Herbert et al., 2003, FEMS Microbiol. Lett. 229: 103-110) o C. acetobuylicum (Williams et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 819-826) y podría usarse de una forma similar para acetógenos carboxidotróficos.
Debido a los sistemas de restricción que son activos en el microorganismo que se va a transformar, puede ser necesario metilar el ácido nucleico que se va a introducir en el microorganismo. Esto puede hacerse usando una variedad de técnicas, incluyendo las descritas más adelante, y ejemplificadas adicionalmente en la sección de Ejemplos en la presente memoria posteriormente.
Como ejemplo, un microorganismo recombinante de la invención se produce por un método que comprende las etapas siguientes:
introducción en un microorganismo lanzadera de (i) una construcción/vector de expresión como se describe en la presente memoria y (ii) una construcción/vector de metilación que comprende un gen de metiltransferasa; expresión del gen de metiltransferasa;
aislamiento de una o más construcciones/vectores del microorganismo lanzadera; e,
introducción de la una o más construcciones/vectores en un microorganismo de destino.
El gen de metiltransferasa puede expresarse constitutivamente. La expresión del gen de metiltransferasa puede inducirse.
El microorganismo lanzadera es un microorganismo, preferiblemente un microorganismo negativo para restricción, que facilita la metilación de las secuencias de ácido nucleico que constituyen la construcción/vector de expresión. El microorganismo lanzadera puede ser una E. coli, Bacillus subtillis, o Lactococcus lactis negativo para restricción.
La construcción/vector de metilación comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una metiltransferasa.
Una vez la construcción/vector de expresión y la construcción/vector de metilación se introducen en el microorganismo lanzadera, el gen de metiltransferasa presente en la construcción/vector de metilación se induce. La inducción puede ser por cualquier sistema de promotor adecuado, aunque en una descripción particular, la construcción/vector de metilación comprende un promotor lac inducible y se induce por la adición de lactosa o un análogo de ésta, más preferiblemente isopropil-p-D-tio-galactósido (IPTG). Otros promotores adecuados incluyen el sistema ara, tet, o T7. El promotor de la construcción/vector de metilación puede ser un promotor constitutivo.
La construcción/vector de metilación puede tener un origen de replicación específico para la identidad del microorganismo lanzadera de manera que cualesquiera genes presentes en la construcción/vector de metilación se expresan en el microorganismo lanzadera. Preferiblemente, la construcción/vector de expresión tiene un origen de replicación específico para la identidad del microorganismo de destino de manera que cualesquiera genes presentes en la construcción/vector de expresión se expresan en el microorganismo de destino.
La expresión de la enzima metiltransferasa resulta en la metilación de los genes presentes en la construcción/vector de expresión. La construcción/vector de expresión puede aislarse a partir del microorganismo lanzadera según uno cualquiera de un número de métodos conocidos. Solo como ejemplo, la metodología descrita en la sección de Ejemplos descrita en la presente memoria posteriormente puede usarse para aislar la construcción/vector de expresión.
Ambos construcción/vector pueden aislarse simultáneamente.
La construcción/vector de expresión puede introducirse en el microorganismo de destino usando cualquier número de métodos conocidos. Sin embargo, como ejemplo, puede usarse la metodología descrita en la sección de Ejemplos descrita en la presente memoria posteriormente. Como la construcción/vector de expresión está metilada, las secuencias de ácido nucleico presentes en la construcción/vector de expresión pueden ser incorporadas en el microorganismo de destino y expresarse con éxito.
Se prevé que un gen de metiltransferasa puede introducirse en un microorganismo lanzadera y sobreexpresarse. Así, la enzima metiltransferasa resultante puede recogerse usando métodos conocidos y usarse in vitro para metilar un plásmido de expresión. La construcción/vector de expresión puede introducirse entonces en el microorganismo de destino para expresión. El gen de metiltransferasa puede introducirse en el genoma del microorganismo lanzadera seguido de la introducción de la construcción/vector de expresión en el microorganismo lanzadera, aislamiento de una
o más construcciones/vectores del microorganismo lanzadera y después introducción de la construcción/vector de expresión en el microorganismo de destino.
Se prevé que la construcción/vector de expresión y la construcción/vector de metilación como se ha definido anteriormente pueden combinarse para proporcionar una composición de materia. Dicha composición tiene una utilidad particular para sortear los mecanismos de barrera de restricción para producir los microorganismos recombinantes de la invención.
La construcción/vector de expresión y/o la construcción/vector de metilación pueden ser plásmidos.
Los expertos en la técnica apreciarán un número de metiltransferasas adecuadas para uso en la producción de los microorganismos de la invención. Sin embargo, como ejemplo, pueden usarse la metiltransferasa del fago OT1 de Bacillus subtilis y la metiltransferasa descrita en los Ejemplos en la presente memoria posteriormente. La metiltransferasa puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o es una variante funcionalmente equivalente de ésta. Los ácidos nucleicos que codifican metiltransferasas adecuadas se apreciarán fácilmente teniendo en cuenta la secuencia de la metiltransferasa deseada y el código genético. El ácido nucleico puede codificar una metiltransferasa es como se describe en los Ejemplos en la presente memoria posteriormente (por ejemplo, el ácido nucleico de SEQ ID NO: 17, o es una variante funcionalmente equivalente de ésta).
Puede usarse cualquier número de construcciones/vectores adaptados para permitir la expresión de un gen de metiltransferasa para generar la construcción/vector de metilación. Sin embargo, como ejemplo, puede usarse el plásmido descrito en la sección de Ejemplos en la presente memoria posteriormente (por ejemplo, SEQ ID NO: 14).
Métodos de producción
La invención proporciona un método para la producción de biodiesel, y opcionalmente uno o más otros productos, por fermentación microbiana que comprende fermentar un sustrato que comprende CO usando un microorganismo recombinante de la invención. Los métodos de la invención pueden usarse para reducir las emisiones atmosféricas totales de carbono de un proceso industrial.
Preferiblemente, la fermentación comprende las etapas de fermentar anaeróbicamente un sustrato en un biorreactor para producir al menos biodiesel usando un microorganismo recombinante de la invención.
El método puede comprender las etapas de:
a. proporcionar un sustrato que comprende CO a un biorreactor que contiene un cultivo de uno o más microorganismos de la invención; y
b. fermentar anaeróbicamente el cultivo en el biorreactor para producir al menos biodiesel.
El método puede comprender las etapas de:
a. capturar el gas que contiene CO producido como resultado de un proceso industrial;
b. fermentación anaeróbica del gas que contiene CO para producir biodiesel por un cultivo que contiene uno o más microorganismos de la invención.
En una realización de la invención, el sustrato gaseoso fermentado por el microorganismo es un sustrato gaseoso que contiene CO. El sustrato gaseoso puede ser un gas residual que contiene CO obtenido como un subproducto de un proceso industrial, o de alguna otra fuente tal como de gases de escape de automóviles. El proceso industrial puede seleccionarse del grupo que consiste en fabricación de productos metálicos ferrosos, tal como una acería, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinado de petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoniaco, producción de metanol y fabricación de coque. El gas que contiene CO puede capturarse del proceso industrial antes de que sea emitido en la atmósfera, usando cualquier método conveniente. El CO puede ser un componente de gas de síntesis (gas que comprende monóxido de carbono e hidrógeno). El CO producido a partir de procesos industriales normalmente se queman para producir CO2 y por lo tanto la invención tiene una utilidad particular en la reducción de las emisiones del gas invernadero CO2 y producción de biodiesel para uso como un biocombustible. Dependiendo de la composición del sustrato gaseoso que contiene CO, también puede ser deseable tratarlo para eliminar cualesquiera impurezas no deseadas, tal como partículas de polvo antes de introducirlo en la fermentación. Por ejemplo, el sustrato gaseoso puede filtrarse o lavarse usando métodos conocidos.
Se apreciará que para que se produzca el crecimiento de las bacterias y la producción de biodiesel, además del gas sustrato que contiene CO, se necesitará alimentar al biorreactor un medio nutriente líquido adecuado.
La fermentación puede producirse en un medio de cultivo acuoso. La fermentación del sustrato puede tener lugar en un biorreactor.
El sustrato y los medios pueden alimentarse en el biorreactor de una forma continua, discontinua o de lecho discontinuo. Un medio nutriente contendrá vitaminas y minerales suficientes para permitir el crecimiento del micro organismo usado. Los medios anaeróbicos adecuados para fermentación usando CO son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los medios adecuados se describen en Biebel (2001).
La fermentación se llevará a cabo de forma deseable en condiciones de fermentación apropiadas para que se produzca la producción de biodiesel. Las condiciones de reacción que deberían considerarse incluyen presión, temperatura, velocidad de flujo de gas, velocidad de flujo de líquido, pH del medio, potencial redox del medio, velocidad de agitación (si se usa un reactor de tanque agitado continuo), nivel de inóculo, concentraciones máximas de gas sustrato para asegurar que el CO en la fase líquida no se vuelva limitante, y concentraciones máximas de producto para evitar la inhibición por producto.
Además, frecuentemente es deseable incrementar la concentración de CO de una corriente de sustrato (o presión parcial de CO en un sustrato gaseoso) y así incrementar la eficiencia de las reacciones de fermentación en las que CO es un sustrato. La operación a presiones incrementadas permite un incremento significativo en la velocidad de transferencia de CO desde la fase gas a la fase líquida donde puede ser captado por el micro-organismo como una fuente de carbono para la producción de fermentación. Eso significa a su vez que el tiempo de retención (definido como el volumen de líquido en el biorreactor dividido por la velocidad de flujo del gas de entrada) puede reducirse cuando los biorreactores se mantienen a presión elevada en lugar de presión atmosférica. Las condiciones óptimas de reacción dependerán parcialmente del micro-organismo particular de la invención usado. Sin embargo, en general, se prefiere que la fermentación se realice a una presión mayor que la presión ambiental. También, como una velocidad de conversión dada de CO-a-biodiesel es en parte función del tiempo de retención del sustrato, y el conseguir un tiempo de retención deseado dicta a su vez el volumen requerido de un biorreactor, el uso de sistemas presurizados puede reducir en gran medida el volumen del biorreactor requerido, y consecuentemente, el coste de capital del equipo de fermentación. Según los ejemplos proporcionados en la Patente US No. 5.593.886, el volumen del reactor puede reducirse en proporción lineal con incrementos en la presión de operación del reactor, es decir, los biorreactores operados a 10 atmósferas de presión solo necesitan un décimo del volumen de aquellos operados a 1 atmósfera de presión.
Como ejemplo, se han descrito los beneficios de llevar a cabo una fermentación de gas-a-etanol a presiones elevadas. Por ejemplo, WO 02/08438 describe fermentaciones de gas-a-etanol realizadas bajo presiones de 30 psig y 75 psig, proporcionando productividades de etanol de 150 g/l/día y 369 g/l/día, respectivamente. Sin embargo, se encontró que las fermentaciones de ejemplo realizadas usando medios y composiciones de gas de entrada similares a presión atmosférica producen entre 10 y 20 veces menos de etanol por litro por día.
También es deseable que la velocidad de introducción del sustrato gaseoso que contiene CO sea tal que se asegure que la concentración de CO en la fase líquida no se vuelva limitante. Esto es porque una consecuencia de condiciones limitantes de CO puede ser que uno o más productos se consuman por el cultivo.
La composición de las corrientes de gas usadas para alimentar una reacción de fermentación puede tener un impacto significativo en la eficiencia y/o costes de esa reacción. Por ejemplo, el O2 puede reducir la eficiencia de un proceso de fermentación anaeróbica. El procesamiento de gases no deseados o no necesarios en los estadios de un proceso de fermentación antes o después de la fermentación puede incrementar la carga en dichos estadios (por ejemplo, cuando la corriente de gas se comprime antes de entrar en un biorreactor, puede usarse energía innecesaria para comprimir gases que no son necesarios en la fermentación). De acuerdo con esto, puede ser deseable tratar corrientes de sustrato, particularmente corrientes de sustrato derivadas de fuentes industriales, para eliminar componentes no deseados e incrementar la concentración de componentes deseados.
Un cultivo de una bacteria de la invención puede mantenerse en un medio de cultivo acuoso. Preferiblemente, el medio de cultivo acuoso es un medio de crecimiento bacteriano anaeróbico mínimo. Los medios adecuados son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las Patentes U.S. Nos. 5.173.429 y 5.593.886 y WO 02/08438, y como se describe en la sección de Ejemplos en la presente memoria posteriormente.
El biodiesel, o una corriente mixta que contiene biodiesel y/o uno o más otros productos, puede recuperarse del caldo de fermentación por métodos conocidos en la técnica, tal como destilación o evaporación fraccionada, pervaporación, arrastre de gas y fermentación extractiva, incluyendo, por ejemplo, extracción líquido-líquido. Los productos también pueden difundirse o secretarse en el medio, del que pueden extraerse por separación de fases.
El biodiesel y uno o más productos pueden recuperarse del caldo de fermentación por la eliminación continua de una parte del caldo del biorreactor, separando las células microbianas del caldo (convenientemente por filtración), y recuperando uno o más productos del caldo. Los alcoholes pueden recuperarse convenientemente por ejemplo por destilación. La acetona puede recuperarse por ejemplo por destilación. Cualesquiera ácidos producidos pueden recuperarse por ejemplo por adsorción en carbón activado. Las células microbianas separadas se devuelven preferiblemente al biorreactor de fermentación. El permeado sin células que permanece después de que hayan eliminado los alcoholes y ácidos también se devuelve preferiblemente al biorreactor de fermentación. Los nutrientes adicionales (tal como vitaminas B) pueden añadirse al permeado sin células para reponer el medio nutriente antes de
que se devuelva al biorreactor.
También, si el pH del caldo se ajustó como se ha descrito anteriormente para aumentar la adsorción de ácido acético al carbón activado, el pH debería re-ajustarse a un pH similar al del caldo en el biorreactor de fermentación, antes de devolverlo al biorreactor.
Ejemplos
La invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los ejemplos no limitativos siguientes.
Ejemplo 1 - Producción de biodiesel a partir de CO
Un Clostridium autoethanogenum acetogénico carboxidotrófico se preparó por ingeniería con la aciltransferasa no específica de Acinetobacter baylyi para la producción de un biodiesel, éster de acilo de ácido graso, éster de butilo de ácido butanoico (FABE). La producción de butanol se demostró con anterioridad usando una cepa modificada genéticamente de Clostridium autoethanogenum (WO 2012/053905).
Cepas y condiciones de crecimiento:
Todas las etapas de subclonación se realizaron en E. coli usando cepas y condiciones de crecimiento estándar como se ha descrito previamente (Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989; Ausubel et al, Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, Ltd., Hoboken, 1987).
C. autoethanogenum DSM10061 y DSM23693 (un derivado de DSM10061) se obtuvieron de DSMZ (The German Collection of Microorganismos and Cell Cultures, InhoffenstraBe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemania). El crecimiento se llevó a cabo a 37°C usando condiciones y técnicas estrictamente anaeróbicas (Hungate, 1969, Methods in Microbiology, vol. 3B. Academic Press, Nueva York: 1 17- 132; Wolfe, 1971, Adv. Microb. Physiol., 6: 107-146). Se usó medio PETC químicamente definido sin extracto de levadura (Tab. 1) y 30 psi de gas residual de acería que contenía de monóxido de carbono (recogido del sitio de Nueva Zelanda Steel en Glenbrook, NZ; composición: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2) como la única fuente de carbono y energía.
Tabla 1: medio PETC
continuación
Construcción del plásmido de expresión:
Se usaron técnicas estándar de ADN recombinante y clonación molecular en esta invención y se describen por Sambrook et al, 1989 y Ausubel et al, 1987. La aciltransferasa no específica (YP_045555.1; Gene ID: 2879218) de Acinetobacter baylyi se optimizó por codones y se sintetizó (SEQ ID NO: 1).
Se aisló ADN genómico de Clostridium autoethanogenum DSM 10061 usando un método modificado por Bertram y Dürre (1989). Un cultivo de 100 ml de toda la noche se recogió (6.000 x g, 15 min, 4°C), se lavó con tampón fosfato de potasio (10 mM, pH 7,5) y se suspendió en 1,9 ml de tampón STE (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM sacarosa; pH 8,0). Se añadieron 300 |jl de lisozima (~100.000 U) y la mezcla se incubó a 37°C durante 30 min, seguido de la adición de 280 j l de una disolución al 10% (p/v) de SDS y otra incubación durante 10 min. El ARN se digirió a temperatura ambiente por la adición de 240 j l de una disolución de EDTA (0,5 M, pH 8), 20 j l de Tris-HCl (1 M, pH 7,5), y 10 j l de ARNasa A (Fermentas). Después, se añadieron 100 j l de Proteinasa K (0,5 U) y la proteolisis tuvo lugar durante 1-3 h a 37°C. Finalmente, se añadieron 600 j l de perclorato de sodio (5 M), seguido de una extracción con fenol-cloroformo y una precipitación con isopropanol. La cantidad y calidad del ADN se inspeccionaron espectrofotométricamente.
La región promotora de la fosfotransacetilasa/acetato quinasa de C. autoethanogenum (SEQ ID NO: 4) se amplificó por PCR a partir de ADN genómico con los oligonucleótidos Ppta-ack-Notl-F (SEQ ID NO: 2: GAGCGGCCGCAATATGATATTTATGTCC) y Ppta-ack-Ndel-R (SEQ ID NO: 3: TTCCATATGTTTCATGTTCATTTCCTCC) y ADN Polimerasa de Alta Fidelidad iProof (Bio-Rad Laboratories) aplicando el programa siguiente: desnaturalización inicial a 980C durante 30 segundos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización (98°C durante 10 segundos), hibridación (55°C durante 30 segundos) y elongación (72°C durante 30 segundos), antes de una etapa de extensión final (72°C durante 10 minutos).
La región promotora de 498 pb amplificada del operón de fosfotransacetilasa/acetato quinasa (Ppta-ack) se clonó en el vector lanzadera E. coli-Clostridium pMTL 85241 (FJ797651.1; Nigel Minton, University of Nottingham; Heap et al., 2009) usando los sitios de restricción NotI y NdeI y la cepa DH5a-T1R (Invitrogen). Posteriormente, el gen de aciltransferasa sintetizado (SEQ ID NO: 1) se clonó en usando NdeI y EcoRI para formar el plásmido pMTL85245-atf (SEQ ID NO: 5; Fig. 2). El inserto se secuenció completamente usando los oligonucleótidos proporcionados en la Tabla 2 y los resultados confirmaron que el gen atf estaba desprovisto de mutaciones.
T l 2 li n l i r n i i n
Metilación del ADN:
La metilación del plásmido de expresión de FAEE, pMTL85245-atf, se realizó in vivo en E. coli usando una metiltransferasa Tipo II híbrida sintetizada (SEQ ID NO: 12) diseñada a partir de los genes de metiltransferasa de C. autoethanogenum, C. ragsdalei y C. ljungdahlii. La metiltransferasa se fusiona a un promotor lac inducible (SEQ ID NO: 13) en el vector pGS20 (SEQ ID NO: 14).
Tanto el plásmido de expresión como el plásmido de metilación se transformaron en las mismas células de E. coli
XL1-Blue MRF' Kan negativas para restricción (Stratagene), lo que es posible debido a sus orígenes de replicación Gram-(-) compatibles (altas copias de ColE1 en el plásmido de expresión y bajas copias de p15A en el plásmido de metilación). La metilación in vivo se indujo por la adición de 1 mM IPTG, y los plásmidos metilados se aislaron usando el Kit QIAGEN Plasmid Midi (QIAGEN). La mezcla resultante se usó para experimentos de transformación con C. autoethanogenum DSM23693, pero solo el plásmido de expresión abundante (altas copias) tiene un origen de replicación Gram-(+) (repL) lo que le permite replicarse en Clostridia.
Transformación en C. autoethanogenum:
Durante el experimento de transformación completo, C. autoethanogenum DSM23693 se creció en medio PETC (Tab.
1) suplementado con 1 g/L de extracto de levadura y 10 g/l de fructosa, así como 30 psi de gas residual de acería (recogido en el sitio New Zealand Steel en Glenbrook, NZ; composición: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2) como fuente de carbono.
Para preparar células competentes, un cultivo de 50 ml de C. autoethanogenum DSM23693 se subcultivó en medio fresco durante 3 días consecutivos. Estas células se usaron para inocular 50 ml de medio PETC que contenía 40 mM DL-treonina a una DO600nm de 0,05. Cuando el cultivo alcanzó una DO600nm de 0,4, las células se transfirieron a una cámara anaeróbica y se recogieron a 4.700 x g y 4°C. El cultivo se lavó dos veces con tampón de electroporación enfriado en hielo (270 mM sacarosa, 1 mM MgCh, 7 mM fosfato de sodio, pH 7,4) y finalmente se suspendió en un volumen de 600 |jl de tampón de electroporación fresco. Esta mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación pre-enfriada con un hueco de electrodo de 0,4 cm que contenía 1 jg de la mezcla de plásmido metilado e inmediatamente se pulsó usando el sistema de electroporación de pulsador Gene Xcell (Bio-Rad) con los ajustes siguientes: 2,5 kV, 600 O, y 25 jF . Se consiguieron las constantes de tiempo de 3,7-4,0 ms. El cultivo se transfirió a 5 ml de medio fresco. La regeneración de las células se monitorizó a una longitud de onda de 600 nm usando un Espectrofotómetro Spectronic Helios Epsilon (Thermo) equipado con un soporte de tubo. Después de una caída inicial en la biomasa, las células empezaron a crecer de nuevo. Una vez la biomasa se duplicó a partir de este punto, las células se recogieron, se suspendieron en 200 j l de medio fresco y se plaquearon en placas PETC selectivas (que contenían 1,2% Bacto™ Agar (BD)) con 4 jg/m l de Claritromicina. Después de 4-5 días de inoculación con 30 psi de gas de acería a 37°C, las colonias fueron visibles.
Las colonias se usaron para inocular 2 ml de medio PETC que contenía 4 jg / j l de Claritromicina. Cuando se produjo el crecimiento, el cultivo se aumentó de escala hasta 5 ml y posteriormente 50 ml de medio PETC que contenía 4 jg/m l de Claritromicina y 30 psi de gas de acería como la única fuente de carbono.
Confirmación de la transformación exitosa:
Para verificar la transferencia de ADN, se realizó una mini prep de plásmido a partir de 10 ml de volumen de cultivo usando el kit miniprep de plásmido Zyppy (Zymo). Como la calidad del plásmido aislado no fue suficiente para una digestión de restricción debido a la actividad exonucleasa Clostridial [Burchhardt y Dürre, 1990], se realizó una PCR con el plásmido aislado y oligonucleótidos proporcionados en la Tabla 2 para confirmar la presencia del plásmido. La PCR se llevó a cabo usando el kit de PCR de Premezcla iNtRON Maximise (Intron Bio Technologies) con las condiciones siguientes: desnaturalización inicial a 94°C durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización (94°C durante 20 segundos), hibridación (55°C durante 20 segundos) y elongación (72°C durante 60 segundos), antes de una etapa de extensión final (72°C durante 5 minutos).
Para confirmar la identidad de los clones, se aisló ADN genómico (véase anteriormente) a partir de cultivos de 50 ml de C. autoethanogenun DSM23693. Se realizó una PCR frente al gen de 16s ARNr usando oligonucleótidos fD1 (SEQ ID NO: 15 : ccgaattcgtcgacaacAGAGTTT GATCCTGGCTCAG) y rP2 (SEQ ID NO: 16: cccgggatccaagcttACGGCTACCTTGTTACGACTT) [Weisberg et al., 1991] y kit de Pc R de Premezcla iNtRON Maximise (Intron Bio Technologies) con las condiciones siguientes: desnaturalización inicial a 940C durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización (94°C durante 20 segundos), hibridación (55°C durante 20 segundos) y elongación (72°C durante 60 segundos), antes de una etapa de extensión final (72°C durante 5 minutos). Los resultados de la secuenciación fueron al menos 99,9% de identidad frente al gen de 16s ARNr (rrsA) de C. autoethanogenum (Y18178, GI:7271109).
Experimentos de crecimiento para confirmar la producción de biodiesel a partir de CO:
Para demostrar la producción de FAEE, se preparó medio PETC y se inoculó con la cepa de C. autoethanogenum que porta el plásmido de expresión pMTL85245-atf. Se presurizaron botellas de suero con 50 ml de medio PETC (Tabla 1) con 30 psi de una corriente de gas que contenía CO de un gas residual de acería (recogido en el sitio New Zealand Steel en Glenbrook, NZ; composición: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2) y se cultivó durante 5 días. El mismo experimento también se llevó a cabo con la cepa de C. autoethanogenum de tipo salvaje sin plásmido.
Los cultivos se analizaron por GC-MS usando muestreo de espacio de cabeza. Se expusieron 2 ml de muestra en un vial de 20 ml durante 10 min a 40°C a una fibra (fibra Supelco PDMS 100) y después se analizó usando un Agilent 6890 GC con 5973 MSD equipado con una columna de 30m x 0,25mm x 0,25jm ZB-Wax en las condiciones
siguientes: Temperatura del inyector: 250°C; Inyección Splitless; desorb durante 10 min a 250°C; flujo constante de Iml/min; Horno: 40°C mantenidos durante 5 min, elevar a 10°C/min hasta 190°C, mantener durante 5 min, elevar a 3°C/min hasta 208°C, elevar a 10°C/min hasta 220°C, mantener 10 min, de nuevo a 40°C a 60°C/min; MSD: Modo de barrido, intervalo de masa 38-650 AMU a 1,47 barridos por segundo. Se encontraron dos picos que concuerdan con la sustancia biodiesel éster de butilo de ácido butanoico frente a la base de datos de referencia de estándares del National Institute of Standards and Technology (NIST) en la cepa que porta el plásmido de expresión pero no en la cepa de tipo salvaje sin plásmido, así como algunos productos de ácidos grasos en el intervalo C14-C18 como 1-Octanodecanol (C18) o Tetradecanal (C14), Heptadecano (C 17), 9-Octadecanal (C18) y 11-Hexadecanal (C16) (Tab.
3; Fig. 3). Se detectaron alcoholes como etanol y butanol por HPLC realizada usando un sistema de HPLC Serie Agilent 1100 equipado con un RID operado a 35°C (Detector de Índice de Refracción) y una columna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm, tamaño de partícula 9 |jm) mantenido a 35°C. El RID se operó a 35°C (Detector de Índice de Refracción) y una columna ácida Alltech IOA-2000 Organic (150 x 6,5 mm, tamaño de partícula 8 jm ) mantenido a 60°C. Se usó agua ligeramente acidificada (0,005 M H2SO4) como fase móvil con una velocidad de flujo de 0,25 ml/min. Para eliminar proteínas y otros residuos celulares, se mezclaron muestras de 400 j l con 100 j l de 2% (p/v) ácido 5-sulfosalicílico y se centrifugó a 14.000 x g durante 3 min para separar los residuos precipitados. Se inyectaron entonces 10 j l del sobrenadante en el HPLC para análisis.
Tabla 3: Resultados del análisis por GC-MS de la cepa de C. autoethanogenum que porta el plásmido de expresión MTL85245-atf:
La invención se ha descrito en la presente memoria, con referencia a determinadas realizaciones preferidas, con el fin de permitir al lector llevar a la práctica la invención sin experimentación excesiva. Los títulos, encabezamientos, o semejantes se proporcionan para aumentar la comprensión del lector de este documento, y no deben leerse como limitantes del alcance de la presente invención.
La referencia a cualesquiera solicitudes, patentes y publicaciones en esta memoria descriptiva no es, y no debe tomarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que constituyen técnica anterior válida o forman parte del conocimiento general común en ningún país del mundo.
A lo largo de esta memoria descriptiva y cualesquiera reivindicaciones que siguen, a no ser que el contexto requiera otra cosa, las palabras "comprenden", "que comprenden" y semejantes, deben considerarse en un sentido inclusivo a diferencia de un sentido exclusivo, es decir, en el sentido de "incluyendo, pero no limitado a".
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Claims (15)
1. Una bacteria acetogénica carboxidotrófica preparada por ingeniería genética que comprende un ácido nucleico exógeno de SEQ ID NO: 1 o que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con s Eq ID NO: 1, que codifica una aciltransferasa no específica;
en la que el ácido nucleico cuando se expresa en un microorganismo permite al microorganismo producir biodiesel por fermentación de CO.
2. La bacteria de la reivindicación 1 que es un Clostridium.
3. La bacteria de la reivindicación 1 en la que la aciltransferasa no específica es una aciltransferasa de Acinetobacter baylyi.
4. La bacteria de la reivindicación 1 en la que el ácido nucleico es un plásmido.
5. La bacteria de la reivindicación 1 en la que la bacteria es Clostridium autoethanogenum.
6. La bacteria de la reivindicación 1 en la que la bacteria es Clostridiumljundahlii.
7. La bacteria de la reivindicación 1 en la que la bacteria es Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacter pfennigii, o Thermoanaerobacter kiuvi.
8. La bacteria de la reivindicación 5 en la que el ácido nucleico que codifica la aciltransferasa no específica está optimizado por codones para Clostridium autoethanogenum.
9. Un proceso para convertir CO en biodiesel, comprendiendo el proceso:
pasar un sustrato gaseoso que contiene CO y a un biorreactor que contiene un cultivo de la bacteria acetogénica carboxidotrófica de la reivindicación 1 en un medio de cultivo tal que la bacteria convierte el CO en biodiesel; y recuperar el biodiesel del biorreactor.
10. El proceso de la reivindicación 9 en el que el sustrato comprende un gas residual industrial.
11. El proceso de la reivindicación 9 en el que el cultivo es estrictamente anaeróbico.
12. El proceso de la reivindicación 9 en el que el biodiesel comprende:
(a) ésteres de etilo de ácidos grasos; o
(b) ésteres de butilo de ácidos grasos.
13. El proceso de la reivindicación 9 en el que el sustrato comprende gas de síntesis.
14. Un plásmido que se replica en una bacteria acetogénica carboxidotrófica, comprendiendo dicho plásmido un ácido nucleico exógeno de SEQ ID NO: 1 o que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, que codifica una aciltransferasa no específica;
en la que el ácido nucleico que codifica la aciltransferasa no específica está optimizado por codones para Clostridium autoethanogenum;
y en la que además el ácido nucleico cuando se expresa en un microorganismo permite al microorganismo producir biodiesel por fermentación de CO.
15. El plásmido de la reivindicación 14 que está metilado.
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