CN104640977B - 重组微生物制备生物柴油 - Google Patents
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Abstract
对一氧化碳营养型产乙酸重组微生物进行修饰以使得它通过发酵包含CO的底物而生产生物柴油和任选的一种或多种其它产品。生物柴油是通过微生物发酵包含CO的底物来生产。所述重组微生物是经过修饰以表达生物柴油生物合成途径中的一种或多种外源性酶，所述一种或多种外源性酶在用于衍生出所述重组微生物的亲本微生物中不存在。所述一种或多种酶包括非特异性酰基转移酶。
Description
技术领域
本发明涉及重组微生物和用于通过微生物发酵包含CO的底物来生产生物柴油的方法。
背景技术
包括一氧化碳营养型(carboxydotrophic)产乙酸菌自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)或杨氏梭菌(C.ljungdahlii)在内的细菌在脂质和细胞膜的生物合成中产生脂肪酸。
在野生型梭菌属(Clostridia)菌株中，沿脂肪酸途径向下的通量是显著的，其中脂质通常占干细胞质量的5％-6％(w/w)(分别为湿细胞质量的1％-1.5％(w/w))(Lepageet al.，1987,Microbiology 133:103-110)。通常，多于95％的脂质处在非常确定的C16-C18链长范围内(Lepage et al.，1987,Microbiology 133:103-110)，其中存在12:0、14:0、14:1、16:0、16:1、17Δ、18:0、18:1、19Δ脂肪酸。
脂肪酸(FA)和它们的衍生物具有高能量密度并且因此具有作为用作“直接注入型(drop-in)”运输燃料/喷气燃料的生物燃料和/或用于生产其它工业化合物的潜能。脂肪酸衍生物的实例包括生物柴油、游离脂肪酸、烯烃以及烷烃。
生物柴油是一种单烷基酯并且可以被单独用于标准的柴油发动机中，或可以与石化柴油混合。它还可以被用作加热用油的低碳替代物。在2009年，在世界范围内，使用了超过35亿加仑的生物柴油。生物柴油通常是通过在存在醇的情况下对脂质进行酯交换反应以产生甘油和单烷基酯而以化学方式由植物性脂肪或动物脂肪产生。然而，通过这种方法生产的生物柴油可能会对柴油发动机造成损伤，这归因于各种动物和植物来源的油的变化，所述油不是非常确定的并且具有广泛的碳链长度且(Fukuda et al.，2001,Biosci Bioeng92:405-416)。关键点在于机油的稀释、活塞环的结焦、液压部件的腐蚀、以及喷射系统中的沉积，从而导致生产过程和燃料老化，使得一些汽车制造商拒绝在他们的一些型号中使用动物或植物来源的生物柴油(et al.，2011,The Past,Present,and Future ofBiofuels-Biobutanol as Promising Alternative,dos Santos Bernades(Ed.)BiofuelProduction-Recent Developments and Prospects,InTech,451-486)。
当前使用粮食作物或非粮食作物生产基于糖或纤维素的原料的生物燃料产生方法可能具有与土地使用、粮食安全、供应波动以及环境问题有关的缺点。
本发明的目的在于克服这些问题并且提供一种生产生物柴油的方法，或至少为公众提供一个有用的选择。
发明内容
本发明广义上尤其提供了用于通过微生物发酵包含CO的底物来生产生物柴油的方法以及用于这些方法中的重组微生物。
在第一方面，本发明提供了一氧化碳营养型产乙酸重组微生物，所述微生物能够通过发酵包含CO的底物来生产生物柴油和任选的一种或多种其它产品。
在一个具体的实施方案中，所述微生物被改造为适于表达生物柴油生物合成途径中的一种或多种外源性酶，所述一种或多种外源性酶在用于衍生出所述重组微生物的亲本微生物中不存在(在本文可以被称为外源性酶)。在另一个实施方案中，所述微生物被改造为适于过表达生物柴油合成途径中的一种或多种内源性酶，所述一种或多种内源性酶在用于衍生出所述重组微生物的亲本微生物中存在(在本文可以被称为内源性酶)。
在一个实施方案中，所述重组微生物被改造为适于与用于衍生出所述重组微生物的亲本微生物所生产的生物柴油的量相比，生产更大量的生物柴油。
在一个实施方案中，所述微生物被改造为适于表达或过表达的所述一种或多种酶是酰基转移酶。
在一个实施方案中，所述酶是如SEQ ID NO:1中所限定的酰基转移酶或其功能上等价的变体。
在一个实施方案中，所述亲本微生物能够发酵包含CO的底物以产生醇，但不能将所述醇转化成生物柴油，并且所述重组微生物被改造为适于表达乙醇向生物柴油的转化中涉及的一种或多种酶。
在一个实施方案中，所述微生物包含一种或多种外源性核酸，所述一种或多种外源性核酸被改造为适于增加一种或多种内源性核酸的表达并且所述一种或多种内源性核酸编码上文所提及的所述酶中的一种或多种。
在一个实施方案中，所述被改造为适于增加表达的一种或多种外源性核酸是调节元件。在一个实施方案中，所述调节元件是启动子。在一个实施方案中，所述启动子是组成型启动子。在一个实施方案中，所述启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇、丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合体操纵子启动子、ATP合酶操纵子启动子以及磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。
在一个实施方案中，所述产乙酸一氧化碳营养型重组微生物被进一步改造为适于表达脂肪酸生物合成途径中的一种或多种外源性酶。在另一方面，所述微生物被改造为适于过表达脂肪酸生物合成途径中的一种或多种内源性酶。
在一个实施方案中，所述微生物包含编码并且被改造为适于表达上文所提到的酶中的一种或多种的一种或多种外源性核酸。在一个实施方案中，所述微生物包含编码并且被改造为适于表达所述酶中的至少两种的一种或多种外源性核酸。在其它实施方案中，所述微生物包含编码并且被改造为适于表达所述酶中的五种或更多种的一种或多种外源性核酸。
在一个实施方案中，所述一种或多种外源性核酸是以任何组合形式编码上文所提到的酶中的一种或多种的核酸构建体或载体，在一个具体的实施方案中，是质粒。
在一个实施方案中，所述外源性核酸是表达质粒。
在一个具体的实施方案中，所述亲本微生物选自一氧化碳营养型产乙酸细菌，包括自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorellathermautotrophica)、卵形鼠孢菌(Sporomusa ovata)、银醋鼠孢菌(Sporomusasilvacetica)、球形鼠孢菌(Sporomusa sphaeroides)、普氏产醋杆菌(Oxobacterpfennigii)以及凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。
在一个实施方案中，所述亲本微生物是自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在一个具体的实施方案中，所述微生物是自产乙醇梭菌DSM23693，所述自产乙醇梭菌DSM23693是菌株DSM10061的衍生物。在另一个具体的实施方案中，所述微生物是杨氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。
在第二方面，本发明提供了一种编码一种或多种酶的核酸，所述一种或多种酶当在微生物中表达时允许所述微生物通过发酵包含CO的底物来生产生物柴油。
在一个实施方案中，所述核酸编码两种或更多种酶，所述两种或更多种酶当在微生物中表达时允许所述微生物通过发酵包含CO的底物来生产生物柴油。
在一个实施方案中，本发明的核酸编码五种或更多种这类酶。
在一个实施方案中，所述酶选自酰基转移酶和其功能上等价的变体。
在一个实施方案中，所述编码酰基转移酶的核酸是SEQ ID NO:1或是其功能上等价的变体。
在一个实施方案中，本发明的核酸进一步包含启动子。在一个实施方案中，所述启动子允许所述基因在其控制下进行组成型表达。在一个具体的实施方案中，使用Wood-Ljungdahl基因簇启动子。在其它具体的实施方案中，使用丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合体操纵子启动子、ATP合酶操纵子启动子或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。在一个具体的实施方案中，所述启动子来自于自产乙醇梭菌。
在第三方面，本发明提供了一种核酸构建体或载体，所述核酸构建体或载体包含第二方面的一种或多种核酸。
在一个具体的实施方案中，所述核酸构建体或载体是表达构建体或载体。在一个具体的实施方案中，所述表达构建体或载体是质粒。
在第四方面，本发明提供了一种宿主生物体，所述宿主生物体包含第二方面的核酸或者第三方面的载体或构建体中的任何一种或多种。
在第五方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含如在本发明的第三方面所提到的表达构建体或载体以及甲基化构建体或载体。
优选地，所述组合物能够产生根据本发明的第一方面的重组微生物。
在一个具体的实施方案中，所述表达构建体/载体和/或所述甲基化构建体/载体是质粒。
在第六方面，本发明提供了一种用于通过微生物发酵来生产生物柴油和任选的一种或多种其它产品的方法，所述方法包括使用本发明的第一方面的重组微生物发酵包含CO的底物。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a.向包含本发明的第一方面的一种或多种微生物的培养物的生物反应器中提供包含CO的底物；以及
b.厌氧发酵所述培养物在所述生物反应器中以生产生物柴油。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a.捕获由于工业过程所产生的含CO的气体
b.通过含有本发明的第一方面的一种或多种微生物的培养物厌氧发酵所述含CO的气体以生产生物柴油。
在所述方法方面的具体实施方案中，所述发酵在水性培养基中进行。
在所述方法方面的具体实施方案中，使所述底物的发酵在生物反应器中进行。
优选地，所述包含CO的底物是包含CO的气态底物。在一个实施方案中，所述底物包含工业废气。在某些实施方案中，所述气体是钢厂废气或合成气。
在一个实施方案中，所述底物将通常含有较大比例的CO，如至少约20体积％至约100体积％的CO、20体积％至70体积％的CO、30体积％至60体积％的CO、以及40体积％至55体积％的CO。在具体实施方案中，所述底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％的CO、或约55体积％的CO、或约60体积％的CO。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括从发酵液中回收所述生物柴油和任选的一种或多种其它产品的步骤。
在第七方面，本发明提供了通过第六方面的方法生产的生物柴油。
在另一方面，本发明提供了一种用于产生本发明的第一方面的微生物的方法，所述方法包括通过引入一种或多种核酸来转化一氧化碳营养型产乙酸亲本微生物以使得所述微生物能够通过使包含CO的底物发酵来生产生物柴油或生产与所述亲本微生物相比增加量的生物柴油，以及任选的一种或多种其它产品，其中所述亲本微生物不能通过发酵包含CO的底物来生产生物柴油，或以低于所述重组微生物的水平生产生物柴油。
在一个具体的实施方案中，通过引入一种或多种外源性核酸来转化亲本微生物，所述一种或多种外源性核酸被改造为适于表达生物柴油生物合成途径中的一种或多种酶。在另一个实施方案中，通过引入一种或多种外源性核酸来进一步转化亲本微生物，所述一种或多种外源性核酸被改造为适于表达脂肪酸生物合成途径中的一种或多种酶。在另一个实施方案中，通过表达或过表达一种或多种内源性核酸来进一步转化亲本微生物，所述一种或多种内源性核酸被改造为适于表达脂肪酸生物合成途径中的一种或多种酶。在一个实施方案中，使用一种或多种核酸转化亲本微生物，所述一种或多种核酸被改造为适于过表达生物柴油途径中的一种或多种内源性酶，所述一种或多种内源性酶天然地存在于所述亲本微生物中。
在某些实施方案中，所述一种或多种酶是如本文之前所述。
在一个实施方案中，遗传工程化的一氧化碳营养型产乙酸细菌包含编码非特异性乙酰转移酶(蜡酯合酶/酰基辅酶A：二酰甘油酰基转移酶)的外源性核酸。所述细菌可以是梭菌属，包括但不限于自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌以及大梭菌。可以使用的其它梭菌属种(虽然不是产乙酸的)包括丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)、糖丁醇丙酮梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)、热纤梭菌(C.thermocellum)、解纤维素梭菌(C.cellulolyticum)、植物发酵梭菌(C.phytofermentans)、克氏梭菌(C.kluyveri)以及巴氏梭菌(C.pasterianum)
所述细菌还可以是例如食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、Blautiaproducta、粘液真杆菌、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、卵形鼠孢菌、银醋鼠孢菌、球形鼠孢菌、普氏产醋杆菌或凯伍热厌氧菌。所述外源性非特异性乙酰转移酶可以是贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)非特异性乙酰转移酶。所述核酸可以是在质粒上。所述编码所述非特异性乙酰转移酶的核酸可以是针对自产乙醇梭菌或针对另一种宿主细菌进行密码子优化的。
另一个实施方案是一种用于将CO和/或CO2转化成生物柴油的方法。将含CO和/或含CO2的气态底物传送到包含在培养基中的一氧化碳营养型产乙酸细菌的培养物的生物反应器中。所述细菌包含编码非特异性乙酰转移酶(蜡酯合酶/酰基辅酶A：二酰甘油酰基转移酶)的外源性核酸。所述细菌将所述CO和/或CO2直接转化成生物柴油，而不需要供应醇(例如乙醇或丁醇)或脂肪酸。从所述生物反应器中回收所述生物柴油。所述底物可以包含工业废气。可以培养所述培养物并且严格地保持厌氧。所述生物柴油可以包含脂肪酸乙酯和/或脂肪酸丁酯。
另一个实施方案是一种在一氧化碳营养型产乙酸细菌中复制的质粒。所述质粒包含编码非特异性乙酰转移酶(蜡酯合酶/酰基辅酶A：二酰甘油酰基转移酶)的外源性核酸。所述编码非特异性乙酰转移酶的核酸可以是针对自产乙醇梭菌进行密码子优化的。任选地，所述质粒可以例如通过以含有所需的甲基化酶的细菌传代而被甲基化。
本发明还可以被广义地认为包括本申请的说明书中单独或共同提及或指示的部分、元件以及特征，包括所述部分、元件或特征中两种或更多种的任何或所有组合，并且在本文提到在与本发明相关的领域中具有已知的等价方案的具体整体时，这些已知的等价方案被认为纳入到本文中，如同被单独地阐述一般。
附图说明
参考附图，根据以下说明本发明的这些方面和其它方面(应当以其所有新的方面考虑)将变得显而易见，所述说明仅是以举例方式给出的，其中：
图1：将一氧化碳和/或氢气转化成诸如乙醇或丁醇的醇，然后通过非特异性酰基转移酶将所述醇和脂肪酸-辅酶A酯后续转化成脂肪酸酰基酯(生物柴油)。
图2：表达质粒pMTL85245-atf的遗传图谱。
图3：确认用CO生产的生物柴油的GC-MS结果。
具体实施方式
以下是广义上给出的对包括本发明的优选实施方案在内的本发明的说明。下文中的标题“实施例”下给出的公开内容对本发明进行进一步阐明，所述公开内容提供了支持本发明的实验数据、本发明的各个方面的具体实施例以及实施本发明的方式。
如本文所提到的“发酵液”是至少包含营养培养基和细菌细胞的培养基。
如本文所提到的“穿梭微生物”是表达甲基转移酶且不同于目的微生物的微生物。
如本文所提到的“目的微生物”是表达被包括在表达构建体/载体上的基因且不同于穿梭微生物的微生物。
术语“主要发酵产物”旨在意指以最高的浓度和/或产率产生的一种发酵产物。
术语“提高效率”、“提高的效率”等当用于发酵过程时包括但不限于提高以下中的一个或多个：催化所述发酵的微生物的生长速率、在升高的产物浓度下的生长速率和/或产物产生速率、所产生的所需产物的体积/所消耗的底物的体积、所需产物的产生速率或产生水平、以及所产生的所需产物与其它发酵副产物相比的相对比例。
短语“包含一氧化碳的底物”和类似术语应当被理解为包括例如其中一氧化碳可被一种或多种细菌菌株利用以进行生长和/或发酵的任何底物。
短语“包含一氧化碳的气态底物”以及类似短语和术语包括含有一定水平的一氧化碳的任何气体。在某些实施方案中，所述底物含有至少约20体积％至约100体积％的CO、20体积％至70体积％的CO、30体积％至60体积％的CO、以及40体积％至55体积％的CO。在具体实施方案中，所述底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％的CO、或约55体积％的CO、或约60体积％的CO。
虽然所述底物不必含有任何氢气，但H2的存在应当不会对根据本发明方法的产物形成有害。在具体实施方案中，氢气的存在使得醇产生的总效率提高。举例来说，在具体实施方案中，所述底物可以包含约2:1、或1:1、或1:2比率的H2:CO。在一个实施方案中，所述底物包含约30体积％或更少的H2、20体积％或更少的H2、约15体积％或更少的H2、或约10体积％或更少的H2。在其它实施方案中，所述底物流包含低浓度的H2，例如少于5％、或少于4％、或少于3％、或少于2％、或少于1％，或基本上不含氢气。所述底物还可以含有一些CO2，例如像约1体积％至约80体积％的CO2、或1体积％至约30体积％的CO2。在一个实施方案中，所述底物包含少于或等于约20体积％的CO2。在具体的实施方案中，所述底物包含少于或等于约15体积％的CO2、少于或等于约10体积％的CO2、少于或等于约5体积％的CO2或基本上不含CO2。
在随后的说明中，就递送和发酵“含有CO的气态底物”的方面对本发明的实施方案进行描述。然而，应当了解的是，所述气态底物可以替代的形式提供。举例来说，所述含有CO的气态底物可以溶解于液体中的形式提供。基本上，使用含有一氧化碳的气体使液体饱和，然后将该液体添加到生物反应器中。这可以使用标准方法来实现。举例来说，可以使用微泡分散发生器(Hensirisak et al.，Scale-up of microbubble dispersion generator foraerobic fermentation；Applied Biochemistry and Biotechnology,第101卷,第3期/2002年10月)。再举例来说，可以使所述含有CO的气态底物吸附到固体载体上。这些替代方法由术语“含有CO的底物”等所涵盖。
在本发明的具体实施方案中，所述含CO的气态底物是工业尾气或废气(industrial off or waste gas)。“工业废气或尾气”应当被广义地视作包括由工业过程产生的任何包含CO的气体并且包括由于以下所产生的气体：铁金属产品制造、非铁产品制造、石油精炼过程、煤的气化、生物质的气化、电力生产、炭黑生产以及焦炭制造。另外的实例可能于本文其它地方提供。
除非上下文另有要求，本文所用的短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等意在涵盖所述过程的生长阶段和产品生物合成阶段这两者。如将在本文进一步描述的，在一些实施方案中，所述生物反应器可以包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因而，向发酵反应物中添加金属或组合物应当被理解为包括向这些反应器中的任何一个或两个中添加。
术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成的发酵装置，它包括连续搅拌釜式反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器、或者适合于气-液接触的其它容器或其它装置。在一些实施方案中，所述生物反应器可以包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因而，当提及向生物反应器或发酵反应物中添加底物时，在适当情况下应当被理解为包括向这些反应器中的任何一个或两个中添加。
“外源性核酸”是如下的核酸，所述核酸源于待引入它们的微生物的外部。外源性核酸可以来源于任何适当的来源，包括但不限于待引入它们的微生物(例如在用于衍生出重组微生物的亲本微生物中)、不同于待引入它们的生物体的微生物菌株或菌种，或者它们可以人工或重组方式产生。在一个实施方案中，所述外源性核酸代表在待引入它们的微生物内天然存在的核酸序列，并且它们被引入以增加特定基因的表达或过表达特定基因(例如通过增加所述序列(例如基因)的拷贝数，或引入强启动子或组成型启动子以增加表达)。在另一个实施方案中，所述外源性核酸代表在待引入它们的微生物内并非天然存在的核酸序列并且允许在所述微生物中并非天然存在的产物的表达或增加所述微生物的天然基因的表达(例如在引入诸如启动子的调节元件的情况下)。所述外源性核酸可以被改造为适于整合到待引入它的微生物的基因组中或保持在染色体外的状态。
“外源性”也可以被用于指代蛋白质。这指的是在用于衍生出重组微生物的亲本微生物中不存在的蛋白质。
在本文中用于重组微生物和核酸或蛋白质的术语“内源性”指的是用于衍生出重组微生物的亲本微生物中存在的任何核酸或蛋白质。
如本文所提到的“生物柴油”指的是例如包含脂肪酸乙酯(FAEE)和/或脂肪酸丁酯(FABE)的脂肪酸烷基酯。所生产的生物柴油可以是脂肪酸烷基酯的混合物。
如本文所提到的“生物柴油生物合成途径”指的是从脂肪酰辅酶A到生物柴油的途径。这个途径中的示例性酶包括但不限于酰基转移酶[EC:2.3.-.-]和酰基辅酶A合成酶/长链脂肪酸-辅酶A连接酶[EC:6.2.3.1]。
“脂肪酸生物合成途径”指的是从乙酰辅酶A到产生脂肪酰辅酶A的途径。这个途径中的示例性酶包括但不限于乙酰辅酶A羧化酶/生物素羧化酶[EC:6.3.4.14/EC:6.4.1.2/EC:6.4.1.3]、丙二酰基转移酶/丙二酸脱羧酶[EC:2.3.1.39]、脂肪酸合酶[EC:2.3.1.85/EC:2.3.1.86/EC:2.3.1.-]、3-氧代酰基-[酰基-载体蛋白]合酶[EC:2.3.1.41/EC:2.3.1.179/EC:2.3.1.180]、3-氧代酰基-[酰基-载体蛋白]还原酶[EC:1.1.1.100]、3-羟基肉豆蔻酰基ACP脱水酶[EC:4.2.1.-]、3-羟基癸酰基-[酰基-载体蛋白]脱水酶[EC:4.2.1.60]、烯酰基-[酰基-载体蛋白]还原酶[EC:1.3.1.9，EC:1.3.1.-，EC:1.3.1.-]、脂肪酰基-ACP硫酯酶[EC:3.1.2.-3.1.2.14]、油酰基-[酰基-载体蛋白]水解酶[EC:3.1.2.14]、酰基-[酰基-载体蛋白]去饱和酶[EC:1.14.19.2]、乙酰辅酶A酰基转移酶[EC:2.3.1.16]、3-羟基酰基辅酶A脱氢酶[EC:1.1.1.35]、烯酰辅酶A水合酶/长链3-羟基酰基辅酶A脱氢酶[EC:1.1.1.211，EC:4.2.1.17]、烯酰辅酶A水合酶[EC:4.2.1.17]、反式-2-烯酰辅酶A还原酶[EC:1.3.1.38]、棕榈酰基-蛋白质硫酯酶[EC:3.1.2.22]、脂肪酸延长蛋白[EC:2.3.1.-]、3-酮酰基-辅酶A合酶[EC:2.3.1.-]、β-酮还原酶[EC:1.1.1.-]、3-羟基酰基辅酶A脱水酶[EC:4.2.1.-]、烯酰还原酶[EC:1.3.1.-]、棕榈酰辅酶A水解酶[EC:3.1.2.2]。
应当了解的是，本发明可以使用其序列不同于本文所具体举例说明的序列的核酸来实施，只要它们发挥基本上相同的功能。对于编码蛋白质或肽的核酸序列来说，这意味着所编码的蛋白质或肽具有基本上相同的功能。对于代表启动子序列的核酸序列，变体序列将能够促进一种或多种基因的表达。这些核酸在本文可以被称为“功能上等价的变体”。举例来说，核酸的功能上等价的变体包括等位基因变体、基因片段、包括突变(缺失、插入、核苷酸置换等)和/或多态性等的基因。来自其它微生物的同源基因也可以被认为是本文所具体举例说明的序列的功能上等价变体的实例。这些包括诸如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、杨氏梭菌、贝氏不动杆菌的菌种中的同源基因，关于这些基因的详情可在诸如Genbank或NCBI网站上公开获得。短语“功能上等价的变体”也应当被视作包括其序列由于针对特定的生物体进行密码子优化而发生改变的核酸。本文的核酸的“功能上等价的变体”将与所鉴定出的核酸优选地具有至少约70％，优选地约80％，更优选地约85％，优选地约90％，优选地约95％或更大的核酸序列同一性。
还应当了解的是，本发明可以使用如下的多肽来实施，所述多肽的序列不同于本文所具体举例说明的氨基酸序列。这些变体在本文可以被称为“功能上等价的变体”。蛋白质或肽的功能上等价的变体包括这样的蛋白质或肽，所述蛋白质或肽与所鉴定出的蛋白质或肽共有至少40％，优选地50％，优选地60％，优选地70％，优选地75％，优选地80％，优选地85％，优选地90％，优选地95％或更大的氨基酸同一性并且与目的肽或蛋白质具有基本上相同的功能。这些变体在它们的范围内包括蛋白质或肽的片段，其中所述片段包含多肽的截短形式，在所述截短形式中，缺失可以是1至5个、至10个、至15个、至20个、至25个氨基酸，并且可以在多肽的任何一端处从残基1延伸到残基25，并且其中缺失可以具有所述范围内的任何长度；或可以位于内部位置。本文的特定多肽的功能上等价的变体还应当被视作包括由例如前一段落中所举例说明的其它细菌种中的同源基因表达的多肽。
如本文所用的“基本上相同的功能”意在指这样的核酸或多肽，即其作为核酸或多肽的变体能够发挥所述核酸或多肽的功能。举例来说，本发明的酶的变体将能够与该酶催化相同的反应。然而，它不应当被视作意指所述变体与产生所述变体的多肽或核酸具有相同水平的活性。
可以使用本领域技术人员已知的方法来评估功能上等价的变体是否与产生所述变体的核酸或多肽具有基本上相同的功能。然而，举例来说，测试酰基转移酶活性的测定法记载于Kalscheuer et al.，2004,Appl.Environ.Microbiol.,70:7119-25；etal.，2005,J.Bacteriol.,187:1369-76中。
“过表达(over-express)”、“过表达(over expression)”以及类似术语和短语在用于本发明时应当被广义地视作包括在相同条件下一种或多种蛋白质的表达(包括编码其的一种或多种核酸的表达)与亲本微生物的蛋白质(包括核酸)的表达水平相比的任何增加。它不应当被视作意指所述蛋白质(或核酸)以任何特定的水平表达。
“亲本微生物”是用于产生本发明的重组微生物的微生物。亲本微生物可以是在天然存在的微生物(即野生型微生物)或先前已经过修饰但不表达或不过表达作为本发明主题的一种或多种酶的微生物。因此，本发明的重组微生物可以被修饰成表达或过表达在亲本微生物中不表达或不过表达的一种或多种酶。
术语核酸“构建体”或“载体”和类似术语应当被广义地视作包括适于用作运载体将遗传物质转移到细胞中的任何核酸(包括DNA和RNA)。所述术语应当被视作包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒以及人工染色体。构建体或载体可以包括一种或多种调节元件、复制起点、多克隆位点和/或选择标记。在一个具体的实施方案中，构建体或载体被改造为适于允许由所述构建体或载体编码的一种或多种基因的表达。核酸构建体或载体包括裸核酸，以及使用一种或多种试剂配制以促进向细胞中的递送的核酸(例如与脂质体缀合的核酸、含有所述核酸的生物体)。
本发明人已惊奇地证实重组微生物可以被工程化以用含CO的底物生产生物柴油。本发明人已对重组生物体进行工程化并且发明了使用其生产脂肪酸衍生性生物柴油的方法。本发明人还预期可以生产包括游离脂肪酸、烷烃以及烯烃在内的其它脂肪酸衍生物作为本发明的一部分。所有这些产物均可以由脂肪酸关键中间体脂肪酸酰基辅酶A(具有辅酶A的硫酯)或脂肪酸ACP(酰基载体蛋白)产生。
由本发明生产的生物柴油是一种长链的具有高能量密度的化合物，并且它的合成需要细胞消耗三磷酸核苷(如ATP)形式的能量。需氧过程中和/或使用糖作为底物时，需要由糖酵解供应足够的能量来产生若干ATP分子。在需氧过程中和/或使用糖作为底物时，经由脂肪酸生物合成途径生产生物柴油可以相对直接的方式进行，这是因为C5戊糖和C6己糖分子在高ATP可利用率的驱动下被转化成更长链的脂肪酸，但是需要大量的反应。本发明与以基于糖的底物来生产生物燃料相比可以具有优势并且提供了一种用于利用来自工业过程的包括一氧化碳的废气生产生物柴油的替代性手段。
对于使用如CO或CO2的C1底物的厌氧产乙酸菌，更难以形成诸如脂肪酸的长分子，这是因为不同于在糖酵解中，没有从固定碳的Wood-Ljungdahl途径中的底物水平磷酸化获得净能量，实际上将CO2活化成甲酸盐甚至需要一分子的ATP并且需要膜梯度。迄今为止，所报道的在产乙酸菌(天然生物体和重组生物体这两者)中的具有最多碳原子的产物是C4化合物，丁醇和2,3-丁二醇。
本发明人已经证实有可能使用C1原料CO经由乙酰辅酶A中间体生产这些更长链的脂肪酸分子，如生物柴油。由于底物CO或CO2在Wood-Ljungdahl途径中直接被引导到乙酰辅酶A中(脂肪酸生物合成的起点)，因此与用糖经由糖酵解相比，需要更少的反应和酶，从而使得即使可获得较少的ATP，也能使所述过程更快并且更高效。虽然在一氧化碳营养型产乙酸菌中可获得较少的ATP，但本发明人认为这一更直接的途径可以维持更高的代谢通量(因为中间反应的化学动力更高)。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明人已发现通过向本发明的重组微生物中引入外源性酰基转移酶使得能够通过所述微生物生产生物柴油(脂肪酸烷基酯)。生产生物柴油的传统方法包括在存在醇的情况下使脂质(甘油三酯)进行酯交换以产生甘油和生物柴油。然而，本发明提供了一种能够共同生产醇(包括乙醇和/或丁醇)以及脂肪酸这两者的重组微生物。本发明人认为这种共同生产提供了必要的底物以向体内生物柴油生产(包含FAEE(脂肪酸乙酯)和/或FABE(脂肪酸丁酯))提供了驱动力。
为了实现本发明的一个实施方案，将来自贝氏不动杆菌的非特异性酰基转移酶(蜡酯合酶/酰基辅酶A：二酰甘油酰基转移酶)引入到产乙酸微生物中。所述微生物产生醇(例如乙醇或丁醇)和脂肪酰辅酶A，它们被转化成脂肪酸烷基酯(即生物柴油)(图1)(Kalscheuer et al.，2004,Appl.Environ.Microbiol.,70:7119-25；et al.，2005,J.Bacteriol.,187:1369-76)。脂肪酸酰基辅酶A是脂肪酸的直接产物并且在例如酰基辅酶A合成酶(长链脂肪酸辅酶A连接酶)的作用下产生，所述酰基辅酶A合成酶可以存在于一氧化碳营养型产乙酸菌中。还没有证明使用这种酶进行的体内FAEE产生，除非从外部向所述反应中供应补充的脂肪酸或醇(Kalscheuer et al.，2006,Microbiology,152,2529-36)。虽然所有生物体均产生脂肪酸前体，但对于不产生(大量的)醇的生物体(如大肠杆菌)来说，额外的遗传修饰变得必不可少。先前完全没有证实FABE的细菌产生。本发明不需要这种醇的外部供应，因此可以提供许多优势。在这些优势中包括降低了原料的成本、显著降低了设备和参数控制的复杂性以及限制了所述方法所需的处理和分离步骤。
虽然本发明人已经在自产乙醇梭菌中证实了本发明的功效，但他们预期本发明适用于更广泛的一氧化碳营养型产乙酸微生物并且在本文加以进一步论述。
微生物
如上文所论述，本发明提供了一种重组微生物，所述重组微生物能够通过发酵包含CO的底物来生产生物柴油和任选的一种或多种其它产品。
在一个具体的实施方案中，所述微生物被改造为适于表达生物柴油生物合成途径中的一种或多种外源性酶。在另一个实施方案中，所述微生物被改造为适于过表达生物柴油生物合成途径中的一种或多种内源性酶。
在一个实施方案中，与用于衍生出所述重组微生物的亲本微生物所生产的生物柴油的量相比，所述重组微生物被改造为适于生产更大量的生物柴油。
在一个实施方案中，用于衍生出所述重组微生物的亲本微生物能够发酵包含CO的底物产生醇，但不使所述醇转化成生物柴油，并且所述重组微生物被改造为适于表达乙醇向生物柴油的转化中涉及的一种或多种酶。
在一个实施方案中，所述产乙酸一氧化碳营养型重组微生物被进一步改造为适于表达脂肪酸生物合成途径中的一种或多种外源性酶。在另一方面，所述微生物被进一步改造为适于过表达脂肪酸生物合成途径中的一种或多种内源性酶。
所述微生物可以通过多种重组方法而被改造为适于表达或过表达一种或多种酶，所述重组方法包括例如增加内源性基因的表达(例如通过引入更强或组成型启动子以驱动基因表达)、通过引入编码酶并且被改造为适于表达特定酶的外源性核酸来增加编码所述酶的基因的拷贝数、或引入编码在亲本微生物内并非天然存在的酶并且被改造为适于表达所述酶的外源性核酸。
在某些实施方案中，可以转化亲本微生物以提供以下的组合：a)增加或过表达一种或多种内源性基因，以及b)引入一种或多种外源性基因。举例来说，编码生物柴油以及任选的脂肪酸生物合成途径中的一种或多种酶的一种或多种基因可以是亲本微生物天然包含的，但所述亲本微生物可能不包括编码所述途径中的一种或多种其它酶的一种或多种其它基因。
在一个实施方案中，生物柴油生物合成途径中的一种或多种酶选自酰基转移酶和其功能上等价的变体。仅以举例方式，提供了酰基转移酶的序列信息。
用于本发明的微生物中的酶和功能性变体可以来源于任何适当的来源，包括不同的细菌属和菌种，或其它生物体。然而，在一个实施方案中，酰基转移酶是来源于贝氏不动杆菌如SEQ ID NO:1所述的酰基转移酶或其功能上等价的变体。在一个具体的实施方案中，酰基转移酶具有贝氏不动杆菌的非特异性酰基转移酶YP_045555.1(Gene ID：2879218)的识别特征。酰基辅酶A合成酶/长链脂肪酸辅酶A连接酶是例如以登录号P69451或Gene ID：946327给出的。
在一个实施方案中，所述微生物包含一种或多种外源性核酸，所述一种或多种外源性核酸被改造为适于增加亲本微生物天然包含的一种或多种核酸的表达并且所述一种或多种核酸编码上文所提到的酶中的一种或多种。在一个实施方案中，所述被改造为适于增加表达的一种或多种外源性核酸是调节元件。在一个实施方案中，所述调节元件是启动子。在一个实施方案中，所述启动子是优选地在适当的发酵条件下具有高度活性的组成型启动子。也可以使用诱导型启动子。在优选的实施方案中，所述启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇、丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合体操纵子启动子、ATP合酶操纵子启动子或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。本领域技术人员应了解的是，可以在适当的发酵条件下引导表达(优选地高水平的表达)的其它启动子也可有效地作为所举例说明的实施方案的替代方案。
在一个实施方案中，所述微生物包含编码并且被改造为适于表达上文所提到的酶中的一种或多种的一种或多种外源性核酸。在一个实施方案中，所述微生物包含编码并且被改造为适于表达所述酶中的至少两种的一种或多种外源性核酸。在其它实施方案中，所述微生物包含编码并且被改造为适于表达所述酶中的三种的一种或多种外源性核酸。在其它实施方案中，所述微生物包含编码并且被改造为适于表达所述酶中的五种的一种或多种外源性核酸。
在一个具体的实施方案中，所述微生物包含编码酰基转移酶或其功能上等价的变体的一种或多种外源性核酸。
在一个实施方案中，酰基转移酶是由以SEQ ID NO:1举例说明的核酸序列或其功能上等价的变体编码。
所述微生物可以包含一种或多种外源性核酸。在需要使用两种或更多种的遗传元件(如基因或调节元件(例如启动子))转化亲本微生物的情况下，所述遗传元件可以被包含在一种或多种外源性核酸上。
在一个实施方案中，所述一种或多种外源性核酸是以任何组合形式编码上文所提到的酶中的一种或多种的核酸构建体或载体，在一个具体的实施方案中，是质粒。
所述外源性核酸可以在转化亲本微生物后保持在染色体外或可以整合到亲本微生物的基因组中。因此，它们可以包括额外的核苷酸序列，所述核苷酸序列被改造为适于帮助整合(例如允许同源重组和靶向整合到宿主基因组中的区域)或染色体外构建体的表达和复制(例如复制起点、启动子以及其它调节元件或序列)。
在一个实施方案中，编码上文所提到的一种或多种酶的外源性核酸将进一步包含被改造为适于促进由所述外源性核酸编码的一种或多种酶的表达的启动子。在一个实施方案中，所述启动子是优选地在适当的发酵条件下具有高度活性的组成型启动子。也可以使用诱导型启动子。在优选的实施方案中，所述启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇、丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合体操纵子启动子、ATP合酶操纵子启动子以及磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。本领域技术人员应了解的是，可以在适当的发酵条件下引导表达(优选地高水平的表达)的其它启动子也可有效作为所举例说明的实施方案的替代方案。
在一个实施方案中，所述外源性核酸是表达质粒。
在一个实施方案中，一氧化碳营养型产乙酸亲本微生物选自自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、粘液丁酸杆菌(Butyribacteriumlimosum)、食甲基丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、Blautia producta、粘液真杆菌、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、普氏产醋杆菌以及凯伍热厌氧菌。在第一或第二方面的一个具体的实施方案中，所述亲本微生物选自一氧化碳营养型梭菌，包括自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌。
在一个实施方案中，所述微生物选自一群一氧化碳营养型梭菌，包括菌种自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和“拉氏梭菌”以及相关分离株。这些包括但不限于菌株自产乙醇梭菌JAI-1T(DSM10061)(Abrini,Naveau,&Nyns,1994)、自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200)、自产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)、杨氏梭菌PETCT(DSM13528＝ATCC55383)(Tanner,Miller,&Yang,1993)、杨氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)(美国专利5,593,886)、杨氏梭菌C-01(ATCC 55988)(美国专利6,368,819)、杨氏梭菌O-52(ATCC55989)(美国专利6,368,819)、或“拉氏梭菌P11T”(ATCC BAA-622)(WO2008/028055)、以及相关分离株，如“克氏梭菌(C.coskatii)”(美国专利2011/0229947)、“梭菌属种MT351”(MichaelTyurin&Kiriukhin,2012)、以及其突变株，如杨氏梭菌OTA-1(Tirado-AcevedoO.Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridiumljungdahlii.PhD thesis,North Carolina State University,2010)。
这些菌株形成了梭菌属rRNA簇I(Clostridial rRNA cluster I)内的一个亚簇(Collins et al.，1994)，在16S rRNA基因水平上具有至少99％同一性，但仍是不同的菌种，如由DNA-DNA重新组合和DNA指纹图谱实验(WO2008/028055、美国专利2011/0229947)所确定。
这个簇中的菌株是由共同的特征限定，即具有相似的基因型和表型，并且它们都共有相同的能源保存和发酵代谢的模式。这个簇中的菌株缺少细胞色素并且经由Rnf复合体来保存能量。
这个簇中的所有菌株均具有约4.2MBp的基因组大小(et al.，2010)以及约32摩尔％的GC组成(Abrini et al.，1994；et al.，2010；Tanner et al.，1993)(WO2008/028055；美国专利2011/0229947)，以及编码以下酶的保守的基本关键基因操纵子：Wood-Ljungdahl途径的酶(一氧化碳脱氢酶、甲酰基-四氢叶酸合成酶、亚甲基-四氢叶酸脱氢酶、甲酰基-四氢叶酸环化水解酶、亚甲基-四氢叶酸还原酶、以及一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合酶)、氢化酶、甲酸脱氢酶、Rnf复合体(rnfCDGEAB)、丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶、醛：铁氧还蛋白氧化还原酶(et al.，2010,2011)。已经发现在所有菌种中负责气体吸收的Wood-Ljungdahl途径基因的组织和数量是相同的，尽管在核酸序列和氨基酸序列方面存在差异( et al.，2011)。
这些菌株均具有相似的形态和大小(对数生长的细胞是0.5-0.7x3-5μm)，是嗜温的(最佳生长温度是30℃-37℃)和严格厌氧菌(Abrini et al.，1994；Tanner et al.，1993)(WO 2008/028055)。此外，它们均共有相同的主要系统发育性状，如相同的pH值范围(pH 4-7.5，最佳的初始pH值是5.5-6)、以相似的生长速率基于含CO的气体的强自养性生长、以及代谢谱，其中乙醇和乙酸是主要的发酵最终产物，在一定条件下形成少量的2,3-丁二醇和乳酸(Abrini et al.，1994；et al.，2011；Tanner et al.，1993)。然而，这些菌种在对不同的糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡萄糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)、或其它底物(例如甜菜碱、丁醇)的底物利用方面有所不同。发现这些菌种中的一些是某些维生素(例如硫胺素、生物素)营养缺陷的，而其它则不是。已证实在许多这类生物体中将羧酸还原成它们相应的醇(Perez,Richter,Loftus以及Angenent,2012)。
因此，所述的性状并非是如自产乙醇梭菌或杨氏梭菌的生物体所特有的，而是合成乙醇的一氧化碳营养型梭菌的一般性状。因此，预期本发明可以所有这些菌株起作用，但在性能方面可能会存在差异。
本发明的重组一氧化碳营养型产乙酸微生物可以使用任意数量的本领域中已知用于产生重组微生物的技术用亲本一氧化碳营养型产乙酸微生物和一种或多种外源性核酸制备而来。仅举例来说，可以通过电穿孔、电融合、超声处理、聚乙二醇介导的转化、缀合、或化学和天然感受态来实现转化(包括转导或转染)。合适的转化技术例如记载于SambrookJ,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold SpringHarbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989中。
电穿孔已被记载用于多种一氧化碳营养型产乙酸菌，如杨氏梭菌(et al.，2010；Leang,Ueki,Nevin,&Lovley,2012)(PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)、自产乙醇梭菌(PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)、伍氏醋酸杆菌(Sauer,Kuhn,&1994)或热醋穆尔氏菌(Kita et al.，2012)并且是用于许多梭菌属的标准方法，如丙酮丁醇梭菌(Mermelstein,Welker,Bennett,&Papoutsakis,1992)、解纤维素梭菌(Jennert,Tardif,Young,&Young,2000)或热纤梭菌(MV Tyurin,Desai,&Lynd,2004)。
电融合已被记载用于产醋酸梭菌属菌种MT351(Tyurin and Kiriukhin,2012)。
原噬菌体诱导已被记载用于一氧化碳营养型产乙酸菌以及粪味梭菌的情况下(Prasanna Tamarapu Parthasarathy,2010,Development of a Genetic ModificationSystem in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants,Masters Project Western Kentucky University)。
缀合已被记载为选择用于产乙酸菌艰难梭菌(Clostridium difficile)(Herbert,O’Keeffe,Purdy,Elmore以及Minton,2003)以及包括丙酮丁醇梭菌在内的许多其它梭菌属(Williams,Young,&Young,1990)的方法。
在一个实施方案中，亲本菌株使用CO作为它唯一的碳源和能量来源。
在一个实施方案中，所述亲本微生物是自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在一个具体的实施方案中，所述微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。在另一个具体的实施方案中，所述微生物是杨氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。
核酸
本发明还提供了一种或多种用于产生本发明的重组微生物的核酸或核酸构建体。
在一个实施方案中，所述核酸包含编码生物柴油生物合成途径中的一种或多种酶的序列，所述一种或多种酶在微生物中表达时允许所述微生物通过发酵包含CO的底物来生产生物柴油。在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种编码两种或更多种酶的核酸，所述两种或更多种酶在微生物中表达时允许所述微生物通过发酵包含CO的底物来生产生物柴油。在一个实施方案中，本发明的核酸编码三种这类酶或五种这类酶。
在一个具体的实施方案中，所述酶选自酰基转移酶和其功能上等价的变体。
编码本文所述的酶的示例性氨基酸序列和核酸序列在本文中提供或可以从如在上文所提到的GenBank中获得。然而，本领域技术人员在考虑本文所含的信息时将容易地认识到GenBank和其它数据库中编码所述酶或其功能上等价的变体的替代性核酸序列和遗传密码。
在一个实施方案中，酰基转移酶是由序列SEQ ID NO:1或其功能上等价的变体所编码。
在一个实施方案中，所述核酸进一步编码脂肪酸生物合成途径中的一种或多种外源性酶。在另一方面，所述核酸进一步编码脂肪酸生物合成途径中的一种或多种内源性酶。
在一个实施方案中，本发明的核酸将进一步包含启动子。在一个实施方案中，所述启动子允许所述基因在它的控制下进行组成型表达。然而，还可以使用诱导型启动子。本领域技术人员将容易地认识到用于本发明中的启动子。优选地，所述启动子可以在适当的发酵条件下引导高水平的表达。在一个具体的实施方案中，使用Wood-Ljungdahl基因簇启动子。在另一个实施方案中，使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。在另一个实施方案中，使用丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合体操纵子启动子或ATP合酶操纵子启动子。在一个具体的实施方案中，所述启动子来自于自产乙醇梭菌。
本发明的核酸可以在转化亲本微生物后保持在染色体外或可以被改造为适于整合到微生物的基因组中。因此，本发明的核酸可以包括额外的核苷酸序列，所述核苷酸序列被改造为适于帮助整合(例如允许同源重组和靶向整合到宿主基因组中的区域)或染色体外构建体稳定的表达和复制(例如复制起点、启动子以及其它调节序列)。
在一个实施方案中，所述核酸是核酸构建体或载体。在一个具体的实施方案中，所述核酸构建体或载体是表达构建体或载体，然而，其它构建体和载体，如用于克隆的那些构建体和载体也被本发明所涵盖。在一个具体的实施方案中，所述表达构建体或载体是质粒。
应当了解的是，除了启动子之外，本发明的表达构建体/载体还可以含有任意数量的调节元件并且如果需要的话，还可以含有适用于表达另外的蛋白质的额外基因。在一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括启动子。在另一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括两个或更多个启动子。在一个具体的实施方案中，所述表达构建体/载体包括用于所要表达的每一种基因的启动子。在一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括一个或多个核糖体结合位点，优选地用于所要表达的每一种基因的核糖体结合位点。
本领域技术人员应当了解的是，本文所述的核酸序列和构建体/载体序列可以含有标准的接头核苷酸，如核糖体结合位点和/或限制性位点所需的那些接头核苷酸。这些接头序列不应当被解释为是必要的并且不对所限定的序列构成限制。
本发明的核酸和核酸构建体(包括表达构建体/载体)可以使用任意数量的本领域中标准技术来构建。举例来说，可以使用化学合成或重组技术。这些技术记载于例如Sambrook et al(Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)中。另外的示例性技术记载于下文的实施例部分中。基本上，单个基因和调节元件将彼此可操作地连接以使得这些基因可以表达从而形成所需的蛋白质。用于本发明中的合适的载体将由本领域的普通技术人员所了解。然而，举例来说，以下载体可以是合适的：pMTL80000载体、pIMP1、pJIR750以及下文的实施例部分中所举例说明的质粒。
应当了解的是，本发明的核酸可以呈任何适当的形式，包括RNA、DNA或cDNA。
本发明还提供了包含本文所述的核酸中的任一种或多种的宿主生物体，特别是微生物并且包括病毒、细菌以及酵母。
制备微生物的方法
一种或多种外源性核酸可以裸核酸形式被递送到亲本微生物中或可以使用一种或多种试剂配制以促进转化过程(例如与脂质体缀合的核酸、含有所述核酸的生物体)。所述一种或多种核酸在适当时可以是DNA、RNA或其组合。在某些实施方案中，可以使用限制性抑制剂；参见例如Murray,N.E.et al.(2000)Microbial.Molec.Biol.Rev.64,412)。
本发明的微生物可以使用任意数量的本领域中已知用于产生重组微生物的多种技术用亲本微生物和一种或多种外源性核酸制备而来。仅举例来说，可以通过电穿孔、超声处理、聚乙二醇介导的转化、化学或天然感受态、原生质体转化、原噬菌体诱导或缀合来实现转化(包括转导或转染)。合适的转化技术记载于例如Sambrook J,Fritsch EF,ManiatisT:Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold Spring Harbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989中。
电穿孔已被记载用于多种一氧化碳营养型产乙酸菌，如杨氏梭菌(et al.，2010,Poc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.107:13087-92；PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)、自产乙醇梭菌(PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)、或伍氏醋酸杆菌(Straetz et al.，1994,Appl.Environ.Microbiol.60:1033-37)并且是用于许多梭菌属的标准方法，如丙酮丁醇梭菌(Mermelstein et al.，1992,Biotechnology,10,190-195)、解纤维素梭菌(Jennert et al.，2000,Microbiology,146:3071-3080)或热纤梭菌(Tyurin et al.，2004,Appl.Environ.Microbiol.70:883-890)。原噬菌体诱导已被证实用于一氧化碳营养型产乙酸菌以及粪味梭菌的情况(Prasanna Tamarapu Parthasarathy,2010,Developmentof a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 forGeneration of Mutants,Masters Project Western Kentucky University)，而缀合已被记载为选择用于许多梭菌属的方法，包括艰难梭菌(Herbert等，2003,FEMSMicrobiol.Lett.229:103-110)或丙酮丁醇梭菌(Williams et al.，1990,J.Gen.Microbiol.136:819-826)并且可以类似的方式用于一氧化碳营养型产乙酸菌。
在某些实施方案中，由于在所要转化的微生物中具有有活性的限制性系统，需要将所要被引入到所述微生物中的核酸甲基化。这可以使用多种技术来进行，包括下文所述的那些技术，并且在下文的实施例部分中进一步举例说明。
举例来说，在一个实施方案中，本发明的重组微生物由包括以下步骤的方法来产生：
将(i)如本文所述的表达构建体/载体和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体引入到穿梭微生物中；
使所述甲基转移酶基因表达；
将一种或多种构建体/载体从所述穿梭微生物中分离；以及
将所述一种或多种构建体/载体引入到目的微生物中。
在一个实施方案中，使所述甲基转移酶基因进行组成型表达。在另一个实施方案中，所述甲基转移酶基因的表达是被诱导的。
穿梭微生物是帮助构成表达构建体/载体的核酸序列的甲基化的微生物，优选限制性阴性微生物。在一个具体的实施方案中，穿梭微生物是限制性阴性大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。
在将表达构建体/载体和甲基化构建体/载体引入到穿梭微生物中之后，诱导甲基化构建体/载体上存在的甲基转移酶基因。诱导可以是通过任何合适的启动子系统进行，但是在本发明的一个具体的实施方案中，甲基化构建体/载体包含诱导型lac启动子并且是通过添加乳糖或其类似物，更优选异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导。其它合适的启动子包括ara、tet或T7系统。在本发明的另一个实施方案中，甲基化构建体/载体启动子是组成型启动子。
在一个具体的实施方案中，甲基化构建体/载体具有复制起点，所述复制起点对穿梭微生物的种类具有特异性以使得甲基化构建体/载体上存在的任何基因在所述穿梭微生物中表达。优选地，所述表达构建体/载体具有复制起点，所述复制起点对目的微生物的种类具有特异性以使得所述表达构建体/载体上存在的任何基因在所述目的微生物中表达。
甲基转移酶的表达使得表达构建体/载体上存在的基因甲基化。然后可以根据多种已知方法中的任一种将表达构建体/载体从穿梭微生物中分离。仅举例来说，可以使用下文所述的实施例部分中所述的方法来分离表达构建体/载体。
在一个具体的实施方案中，同时分离两种构建体/载体。
可以使用任意数量的已知方法将表达构建体/载体引入到目的微生物中。然而，举例来说，可以使用下文实施例部分中所述的方法。由于表达构建体/载体被甲基化，因此所述表达构建体/载体上存在的核酸序列能够被、纳入到目的微生物中并且成功地表达。
可以想到的是，可以将甲基转移酶基因引入到穿梭微生物中并且使其过表达。因此，在一个实施方案中，可以使用已知的方法收集所产生的甲基转移酶并且将其在体外用于使表达质粒甲基化。然后可以将表达构建体/载体引入到目的微生物中以进行表达。在另一个实施方案中，将甲基转移酶基因引入到穿梭微生物的基因组中，继而将表达构建体/载体引入到所述穿梭微生物中，从所述穿梭微生物中分离一种或多种构建体/载体，然后将表达构建体/载体引入到目的微生物中。
可以想到的是，可以将如上文所限定的表达构建体/载体和甲基化构建体/载体组合起来以提供物质组合物。这种组合物特别适用于规避限制性屏障机制以产生本发明的重组微生物。
在一个具体的实施方案中，表达构建体/载体和/或甲基化构建体/载体是质粒。
本领域普通技术人员将了解用于产生本发明的微生物的多种合适的甲基转移酶。然而，举例来说，可以使用枯草芽孢杆菌噬菌体ΦT1甲基转移酶和下文的实施例中所述的甲基转移酶。在一个实施方案中，甲基转移酶具有氨基酸序列SEQ ID NO:12或是其功能上等价的变体。在考虑所需的甲基转移酶的序列和遗传密码的情况下，将容易地认识到编码合适的甲基转移酶的核酸。在一个实施方案中，编码甲基转移酶的核酸如下文的实施例中所述(例如SEQ ID NO:17的核酸或它是其功能上等价的变体)。
可以使用被改造为适于允许甲基转移酶基因表达的多种构建体/载体以产生甲基化构建体/载体。然而，举例来说，可以使用下文的实施例部分中所述的质粒(例如SEQ IDNO:14)。
生产方法
本发明提供了一种用于通过微生物发酵来生产生物柴油和任选的一种或多种其它产品的方法，所述方法包括使用本发明的重组微生物发酵包含CO的底物。可以使用本发明的方法来降低来自工业过程的总的大气碳排放。
优选地，所述发酵包括使用本发明的重组微生物在生物反应器中厌氧发酵底物以至少生产生物柴油的步骤。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a.向包含本发明的一种或多种微生物的培养物的生物反应器中提供包含CO的底物；以及
b.在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物以至少生产生物柴油。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a.捕获由于工业过程所产生的含CO的气体；
b.通过含有本发明的一种或多种微生物的培养物厌氧发酵所述含CO的气体以生产生物柴油。
在本发明的一个实施方案中，由所述微生物发酵的气态底物是含有CO的气态底物。所述气态底物可以是作为工业过程的副产品或从一些其它来源(如从汽车尾气)获得的含CO的废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品制造(如钢厂)、非铁产品制造、石油精炼过程、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产以及焦炭制造。在这些实施方案中，可以在含CO的气体被排放到大气中之前，使用任何简便的方法从工业过程对它进行捕获。CO可以是合成气(包含一氧化碳和氢气的气体)的组分。由工业过程产生的CO通常被燃烧掉而产生CO2，因此，本发明特别适用于减少CO2温室气体排放和生产用作生物燃料的生物柴油。根据含CO的气态底物的组成，也可能需要在将它引入到发酵中之前对它进行处理以去除任何不需要的杂质，如尘粒。举例来说，可以使用已知的方法对气态底物进行过滤或洗涤。
应了解的是，为了使细菌生长并且进行生物柴油的生产，除了含CO的底物气体之外，还将需要将合适的液体营养培养基进料到生物反应器中。
在所述方法方面的具体实施方案中，所述发酵在水性培养基中进行。在所述方法方面的具体实施方案中，使所述底物的发酵是在生物反应器中进行。
可以连续、分批或分批补料方式将底物和培养基进料到生物反应器中。营养培养基将含有足以允许所使用的微生物生长的维生素和矿物质。适用于使用CO的发酵的厌氧培养基是本领域已知的。举例来说，合适的培养基记载于Biebel(2001)中。在本发明的一个实施方案中，所述培养基如下文的实施例部分中所述。
所述发酵应当理想地在适当的用于进行生物柴油生产的发酵条件下进行。反应条件应当被认为包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH值、培养基氧化还原电位、搅拌速率(如果使用连续搅拌釜式反应器的话)、接种物水平、确保液相中的CO不会成为限制的最高气态底物浓度、以及避免产物抑制的最高产物浓度。
此外，往往需要提高底物流的CO浓度(或气态底物中的CO分压)并且因此提高以CO作为底物的发酵反应的效率。在增大的压力下进行操作允许CO从气相向液相的转移的速率显著增加，在所述液相中CO可以由微生物摄取作为用于发酵生产的碳源。这进而意味着在将生物反应器维持在高压而非大气压时可以缩短保留时间(被定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)。最佳的反应条件将部分取决于所使用的本发明的具体微生物。然而，一般来说，优选的是，在高于环境压力的压力下进行发酵。此外，由于给定的CO向生物柴油的转化率部分地是底物保留时间的函数，并且实现所需的保留时间进而要求生物反应器具有所需的容积，因此使用加压系统可以极大地减小所需的生物反应器的容积，并且因此降低发酵设备的资金成本。根据美国专利No.5,593,886中所给出的实施例，反应器的容积的减小与反应器的操作压力的增加为线性比例以，即在10个大气压的压力下操作的生物反应器仅需要在1个大气压的压力下操作的那些生物反应器的容积的十分之一。
举例来说，在高压下进行气体向乙醇的发酵的益处已有记载。举例来说，WO 02/08438记载了在30psig和75psig的压力下进行气体向乙醇的发酵，分别得到150克/升/天和369克/升/天的乙醇生产率。然而，发现在大气压下使用类似的培养基和输入气体组成进行的示例性发酵生产1/20至1/10的乙醇/升/天。
还需要引入含CO的气态底物的速率以确保液相中CO的浓度不会成为限制。这是因为CO受限的条件的后果可能是一种或多种产物被培养物消耗。
用于向发酵反应中进料的气流的组成可能对该反应的效率和/或成本具有显著的影响。举例来说，O2可能会降低厌氧发酵过程的效率。在发酵之前或之后在发酵过程的各阶段中对不需要的或不必要的气体进行处理可能会增加这些阶段上的负担(例如在气流进入生物反应器中之前进行压缩的情况下，可能使用不必要的能量来压缩在发酵中不需要的气体)。因此，可能需要处理底物流，特别是来源于工业来源的底物流以去除不需要的组分并且提高所需要的组分的浓度。
在某些实施方案中，将本发明的细菌的培养物维持在水性培养基中。优选地，所述水性培养基是基本的厌氧微生物生长培养基。合适的培养基是本领域中已知的，并且记载于例如美国专利No.5,173,429和5,593,886以及WO 02/08438中，并且如下文的实施例部分中所述。
可以通过本领域中已知的方法从发酵液中回收生物柴油或含有生物柴油和/或一种或多种其它产物的混合流，所述方法如分馏或蒸发、全蒸发、气提以及萃取发酵，包括例如液-液萃取。产物也可以扩散或分泌到培养基中，可以通过相分离将它们从所述培养基中提取。
在本发明的某些优选的实施方案中，通过以下方式从发酵液中回收生物柴油和一种或多种产物：连续地从生物反应器中取出一部分发酵液，(方便地通过过滤)从所述发酵液中分离微生物细胞，并且从所述发酵液中回收一种或多种产物。可以方便地例如通过蒸馏回收醇。可以例如通过蒸馏回收丙酮。可以例如通过吸附在活性炭上来回收所产生的任何酸。优选地，将分离的微生物细胞返回至发酵生物反应器中。也优选地，将在已去除任何一种或多种醇和一种或多种酸之后残留的无细胞渗透物返回至发酵生物反应器中。在将无细胞渗透物返回至生物反应器中之前，可以将额外的营养物质(如B族维生素)添加到所述无细胞渗透物中以补充营养培养基。
此外，如果如上文所述对发酵液的pH值进行调节以增强乙酸至活性炭的吸附，那么应当在返回至生物反应器中之前，将pH值重新调节到与发酵生物反应器中的发酵液的pH值类似的pH值。
实施例
现在将参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。
实施例1—用CO生产生物柴油
使用贝氏不动杆菌的非特异性酰基转移酶对产乙酸的一氧化碳营养型自产乙醇梭菌进行工程化以产生生物柴油脂肪酸酰基酯，即丁酸丁酯(FABE)。先前使用自产乙醇梭菌的遗传修饰的菌株证实丁醇的产生(WO2012/053905)。
菌株和生长条件：
如先前所述使用标准的菌株和生长条件在大肠杆菌中进行所有亚克隆步骤(Sambrook et al，Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold Spring HarbourLabrotary Press,Cold Spring Harbour,1989；Ausubel et al，Current protocols inmolecular biology,John Wiley&Sons,Ltd.,Hoboken,1987)。
自产乙醇梭菌DSM10061和DSM23693(DSM10061的衍生株)是从DSMZ(德国布伦瑞克英豪丰大街7B的德国微生物和细胞培养物保藏中心(邮编：38124)(The GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures,Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig,Germany))获得的。在37℃下使用严格厌氧条件和技术进行生长(Hungate,1969,Methods in Microbiology,vol.3B Academic Press,New York:117-132；Wolfe,1971,Adv.Microb.Physiol.,6:107-146)。使用不含酵母提取物的化学成分确定的PETC培养基(表1)和作为唯一的碳源和能量来源的30psi含有一氧化碳的钢厂废气(从位于新西兰格兰布鲁克(Glenbrook,NZ)的新西兰钢厂(New Zealand Steel)收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)。
表1：PETC培养基
| 沃尔夫维生素溶液 | 每升储液 |
| 生物素 | 2mg |
| 叶酸 | 2mg |
| 盐酸吡哆醇 | 10mg |
| 核黄素 | 5mg |
| 烟酸 | 5mg |
| D-(+)-泛酸钙 | 5mg |
| 维生素B12 | 0.1mg |
| 对氨基苯甲酸 | 5mg |
| 硫辛酸 | 5mg |
| 硫胺素 | 5mg |
| 蒸馏水 | 至1L |
| 微量金属溶液 | 每升储液 |
| 次氮基三乙酸 | 2g |
| MnSO4.H2O | 1g |
| Fe(SO4)2(NH4)2.6H2O | 0.8g |
| CoCl2.6H2O | 0.2g |
| ZnSO4.7H2O | 0.2mg |
| CuCl2.2H2O | 0.02g |
| NaMoO4.2H2O | 0.02g |
| Na2SeO3 | 0.02g |
| NiCl2.6H2O | 0.02g |
| Na2WO4.2H2O | 0.02g |
| 蒸馏水 | 至1L |
| 还原剂储液 | 每100mL储液 |
| NaOH | 0.9g |
| Cystein.HCl | 4g |
| Na2S | 4g |
| 蒸馏水 | 直到100mL |
表达质粒的构建：
将标准重组DNA和分子克隆技术用于本发明中并且这些技术记载于Sambrook etal，1989和Ausubel et al，1987。对贝氏不动杆菌的非特异性酰基转移酶(YP_045555.1；Gene ID：2879218)进行密码子优化并且合成(SEQ ID NO:1)。
使用Bertram和Dürre(1989)的经过改良的方法分离来自自产乙醇梭菌DSM 10061的基因组DNA。收获100ml过夜培养物(6,000×g，15分钟，4℃)，用磷酸钾缓冲液(10mM，pH7.5)洗涤并且悬浮在1.9ml STE缓冲液(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、200mM蔗糖；pH 8.0)中。添加300μl溶菌酶(约100,000U)并且将所得混合物在37℃下孵育30分钟，继而添加280μl的10％(w/v)SDS溶液并且再孵育10分钟。在室温下通过添加240μl的EDTA溶液(0.5M，pH 8)、20μl Tris-HCl(1M，pH 7.5)以及10μl RNA酶A(Fermentas)来消化RNA。然后，添加100μl蛋白酶K(0.5U)并且在37℃下进行蛋白水解，持续1-3小时。最终，添加600μl的高氯酸钠(5M)，继而进行酚-氯仿萃取和异丙醇沉淀。用分光光度测定法对DNA的量和质量进行检验。
应用以下程序通过PCR以寡核苷酸Ppta-ack-NotI-F(SEQ ID NO:2：GAGCGGCCGCAATATGATATTTATGTCC)和Ppta-ack-NdeI-R(SEQ ID NO:3：TTCCATATGTTTCATGTTCATTTCCTCC)以及iProof高保真DNA聚合酶(Bio-Rad Labratories)从基因组DNA来扩增自产乙醇梭菌的磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子区域(SEQ ID NO:4)：最初在98℃下变性30秒，继而35个循环的变性(98℃，持续10秒)、退火(55℃，持续30秒)以及延长(72℃，持续30秒)，之后是最终的延伸步骤(72℃，持续10分钟)。
使用NotI和NdeI限制性酶切位点以及菌株DH5α-T1R(Invitrogen)将扩增的磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子(Ppta-ack)的498bp启动子区域克隆到大肠杆菌-梭菌属穿梭载体pMTL 85241(FJ797651.1；Nigel Minton,University of Nottingham；Heap et al.，2009)中。随后，使用NdeI和EcoRI克隆合成的酰基转移酶基因(SEQ ID NO:1)以形成质粒pMTL85245-atf(SEQ ID NO:5；图2)。使用表2中给出的寡核苷酸对插入片段进行完全测序并且结果确认atf基因不含突变。
表2：用于测序的寡核苷酸
DNA的甲基化：
使用根据来自自产乙醇梭菌、拉氏梭菌和杨氏梭菌的甲基转移酶基因设计的合成的杂合II型甲基转移酶(SEQ ID NO:12)在大肠杆菌中在体内进行对FAEE表达质粒pMTL85245-atf的甲基化。将甲基转移酶融合到载体pGS20(SEQ ID NO:14)中的诱导型lac启动子(SEQ ID NO:13)。
将表达质粒和甲基化质粒这两者转化到限制性阴性大肠杆菌XL1-Blue MRF'Kan(Stratagene)的相同细胞中，这可能是由于它们的相容性革兰氏-(-)复制起点(表达质粒中高拷贝ColE1和甲基化质粒中低拷贝p15A)。通过添加1mM IPTG诱导体内甲基化，并且使用QIAGEN Plasmid Midi Kit(QIAGEN)分离甲基化的质粒。将所得的混合物用于使用自产乙醇梭菌DSM23693进行的转化实验，但仅丰富(高拷贝)表达质粒具有允许它在梭菌属中复制的革兰氏-(+)复制起点(repL)。
向自产乙醇梭菌中的转化：
在整个转化实验期间，在补充有1g/L酵母提取物和10g/l果糖的PETC培养基(表1)以及作为碳源的30psi钢厂废气(从位于新西兰格兰布鲁克的新西兰钢厂收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)中培养自产乙醇梭菌DSM23693。
为了产生感受态细胞，将自产乙醇梭菌DSM23693的50ml培养物传代培养到新鲜的培养基中，持续连续3天。以0.05的OD600nm使用这些细胞接种50ml含有40mM DL-苏氨酸的PETC培养基。在培养物达到0.4的OD600nm时，将细胞转移到厌氧室中并且在4,700×g和4℃下收获。将培养物用冰冷的电穿孔缓冲液(270mM蔗糖、1mM MgCl2、7mM磷酸钠，pH 7.4)洗涤两次并且最终悬浮在600μl体积的新鲜电穿孔缓冲液中。将所得混合物转移到预先冷却的包含1μg甲基化的质粒混合物的电穿孔杯(0.4cm电极间距)中并且立即使用Gene pulserXcell电穿孔系统(Bio-Rad)以如下设置进行冲击：2.5kV、600Ω以及25μF。实现3.7-4.0毫秒的时间常数。将培养物转移到5ml新鲜培养基中。使用装备有试管夹的SpectronicHelios Epsilon分光光度计(Thermo)在600nm的波长下监测细胞的再生。在生物质最初下降之后，细胞再次开始生长。在生物质相对于该点加倍后，收获细胞，将所述细胞悬浮在200μl新鲜的培养基中并且铺板到具有4μg/ml克拉霉素(Clarithromycin)的选择性PETC板(含有1.2％的BactoTM琼脂(BD))上。在使用30psi钢厂气体在37℃下接种4-5天后，菌落可见。
将所述菌落用于接种含有4μg/μl克拉霉素的2ml PETC培养基。在生长发生时，将培养物放大到5ml并且随后放大到含有4μg/ml克拉霉素的50ml PETC培养基和作为唯一碳源的30psi钢厂气体。
成功转化的确定：
为了验证DNA转移，使用Zyppy质粒微量制备试剂盒(Zymo)由10ml体积培养物进行质粒的微量制备。由于所分离的质粒的质量因梭菌属核酸外切酶活性而不足以进行限制性酶切消化[Burchhardt and Dürre,1990]，因此使用所分离的质粒和表2中给出的寡核苷酸进行PCR以确认质粒的存在。使用iNtRON Maximise Premix PCR试剂盒(Intron BioTechnologies)以如下的条件进行PCR：最初在94℃下变性2分钟，继而35个循环的变性(94℃，持续20秒)、退火(55℃，持续20秒)和延长(72℃，持续60秒)，之后是最终的延伸步骤(72℃，持续5分钟)。
为了确认克隆的种类，从50ml自产乙醇梭菌DSM23693培养物中分离基因组DNA(参见上文)。使用寡核苷酸fD1(SEQ ID NO:15：ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和rP2(SEQ ID NO:16：cccgggatccaagcttACGGCTACCTTGTTACGACTT)[Weisberg et al.，1991]和iNtRON Maximise Premix PCR试剂盒(Intron Bio Technologies)以如下的条件针对16s rRNA基因进行PCR：最初在94℃下变性2分钟，继而35个循环的变性(94℃，持续20秒)、退火(55℃，持续20秒)以及延长(72℃，持续60秒)，之后是最终的延伸步骤(72℃，持续5分钟)。测序结果是与自产乙醇梭菌(Y18178，GI：7271109)的16s rRNA基因(rrsA)具有至少99.9％同一性。
确认用CO产生生物柴油的生长实验：
为了证实FAEE产生，制备PETC培养基并且使用带有表达质粒pMTL85245-atf的自产乙醇梭菌菌株接种。使用来自钢厂废气(从位于新西兰格兰布鲁克的新西兰钢厂收集；组成：44％CO、32％N2、22％CO2、2％H2)的30psi含CO的气流对具有50mL PETC培养基(表1)的血清瓶加压并且培养5天。还使用没有质粒的野生型自产乙醇梭菌菌株进行同样的实验。
通过GC-MS使用顶空取样对培养物进行分析。使20mL小瓶中的2mL样品在40℃下暴露于纤维(Supelco PDMS 100纤维)10分钟，然后使用装备有30m×0.25mm×0.25μm ZB-Wax柱的具有5973MSD的Agilent 6890GC在以下条件下进行分析：进样器温度：250℃；不分流进样；在250℃下解吸10分钟；1毫升/分钟恒流；烘箱：在40℃下保持5分钟，以10℃/分钟升高至190℃，保持5分钟，以3℃/分钟升高至208℃，以10℃/分钟升高至220℃，保持10分钟，以60℃/分钟回到40℃；MSD：扫描模式，质量范围：38-650AMU，以每秒1.47次扫描。在携带表达质粒的菌株中发现相对于美国国家标准技术研究所(national Institute of Standardsand Technology，NIST)标准参考数据库与生物柴油物质丁酸丁酯相匹配的两个峰，但在没有质粒的野生型菌株中没有发现，并且发现C14-C18范围内的一些脂肪酸产物，如1-十八醇(C18)或十四醛(C14)、十七烷(C17)、9-十八醛(C18)以及11-十六醛(C16)(表3；图3)。通过使用装备有在35℃下操作的RID(折射率检测器)和保持在35℃下的Aminex HPX-87H柱(300×7.8mm，粒度9μm)的Agilent 1100系列HPLC系统进行的HPLC来检测诸如乙醇和丁醇的醇。将RID在35℃下操作(折射率检测器)并且将Alltech IOA-2000有机酸柱(150×6.5mm，粒度8μm)保持在60℃下。使用稍微酸化的水(0.005M H2SO4)作为流动相，流速为0.25毫升/分钟。为了去除蛋白质和其它细胞残余物，将400μl样品与100μl的2％(w/v)5-磺基水杨酸混合并且以14,000×g离心3分钟以分离沉淀的残余物。然后将10μl上清液注射到HPLC中以进行分析。
表3：对带有表达质粒pMTL85245-atf的菌株自产乙醇梭菌进行GC-MS分析的结果：
| 保留时间 | NIST匹配％ | |
| 1.5-2.8 | CO<sub>2</sub> | 90 |
| 3.84 | 二硫化物(disulfide) | 90 |
| 4-4.5 | 乙酸 | 96 |
| 14.37 | 1-十八醇 | <50 |
| 16.35 | 丁酸丁酯 | 50 |
| 16.64 | 丁酸丁酯 | 78 |
| 18.84 | 十四醛 | 95 |
| 21 | 十七烷 | >90 |
| 21.7 | 9-十八醛(Z)/11-十六醛(Z) | 93/87 |
已在本文中参考某些优选的实施方案对本发明进行描述以使得读者能够实施本发明而无需过多的实验。然而，本领域的普通技术人员将容易认识到，可以在某种程度上对许多组分和参数进行改变或修改或者将其替代为已知的等价物而不脱离本发明的范围。应当了解的是，这些修改和等价物被纳入本文中，如同被单独地阐述一般。提供题目、标题等以增强读者对这份文件的理解，并且不应当被视作限制本发明的范围。
在上文和下文所引用的所有申请、专利以及出版物(如果有的话)的全部公开内容以引用方式纳入本文。然而，在本说明书中对任何申请、专利以及出版物的提及不是并且不应当被视作承认或以任何形式表明它们在世界上任何国家构成了有效的现有技术或形成了公知常识的一部分。
在整个本说明书以及所附的任何权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包含(comprising)”等将被解释成包括性的含义(与排他性的含义相反)，也就是说，“包括但不限于”的含义。
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Claims (12)
1.一种遗传工程化的一氧化碳营养型产乙酸细菌，所述细菌包含编码非特异性酰基转移酶的外源性核酸，其中所述非特异性酰基转移酶是来自贝氏不动杆菌的蜡酯合酶/酰基辅酶A：二酰甘油酰基转移酶，并且所述细菌来自自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。
2.如权利要求1所述的细菌，其中所述核酸是质粒。
3.如权利要求1所述的细菌，其中所述编码所述非特异性酰基转移酶的核酸是针对自产乙醇梭菌进行过密码子优化的。
4.一种用于使CO和/或CO2转化成生物柴油的方法，所述方法包括：
将含CO和/或含CO2的气态底物传送到包含在培养基中的如权利要求1所述的一氧化碳营养型产乙酸细菌的培养物的生物反应器中，以使得所述细菌将所述CO和/或CO2转化成生物柴油；以及
从所述生物反应器中回收所述生物柴油。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述底物包含工业废气。
6.如权利要求4所述的方法，其中培养物是厌氧的。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述生物柴油包含脂肪酸乙酯。
8.如权利要求4所述的方法，其中所述生物柴油包含脂肪酸丁酯。
9.如权利要求4所述的方法，其中所述底物包含合成气。
10.一种质粒，所述质粒在一氧化碳营养型产乙酸细菌中复制，所述质粒包含编码非特异性酰基转移酶的外源性核酸，其中所述非特异性酰基转移酶是来自贝氏不动杆菌的蜡酯合酶/酰基辅酶A：二酰甘油酰基转移酶，并且所述细菌来自自产乙醇梭菌，其中所述编码所述非特异性酰基转移酶的核酸是针对自产乙醇梭菌进行过密码子优化的。
11.如权利要求10所述的质粒，所述质粒是经甲基化的。
12.如权利要求1所述的细菌，其中所述细菌来自自产乙醇梭菌。
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