CN104619834B

CN104619834B - 改变代谢活性的酶

Info

Publication number: CN104619834B
Application number: CN201380029615.0A
Authority: CN
Inventors: M·科普克; W·M·帕特里克; D·J·马多克; M·格斯
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Current assignee: Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2012-04-05
Filing date: 2013-04-04
Publication date: 2018-06-15
Anticipated expiration: 2033-04-04
Also published as: EP2834351A1; CN104619834A; EP2834351B1; JP6407141B2; TW201343914A; US9550979B2; US20130267006A1; WO2013152236A1; KR102079274B1; KR20150005951A; EP2834351A4; NZ700609A; TWI659104B; JP2015512646A

Abstract

本发明涉及突变型醇脱氢酶、包含其的微生物以及通过微生物发酵产生一种或多种产物的方法。

Description

改变代谢活性的酶

技术领域

背景技术

通过微生物发酵生产醇(例如乙醇或丁醇)是众所周知的并且几个世纪以来已经被用在工业上。从历史上看，乙醇发酵是最大的过程。丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵被认为是第二大发酵过程(Duerre P:Production of solvents.In:Handbook on Clostridia,CRCPress,2005:671-696)，并且目前在例如中国的这些国家中的生产能力超过了100万吨(NiY and Sun Z:Recent progress on industrial fermentative production of acetone-butanol-ethanol by Clostridium acetobutylicum inChina.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2009,83:415-423)。丁醇经常被用作溶剂或生物燃料，而丙酮被认为是不需要的副产物(Duerre P:Production of solvents.In:Handbookon Clostridia,CRC Press,2005:671-696)。已知拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的一些分离株由于存在仲醇脱氢酶而产生异丙醇而非丙酮(George HA,Johnson JL,MooreWEC,Holdeman LV,Chen JS:Acetone,isopropanol,and butanol production byClostridium beijerinckii(syn.Clostridium butylicum)and Clostridiumaurantibutyricum.Appl Environ Microbiol 45:1160-1163)。异丙醇具有和丁醇类似的特性且其比丙酮更有益。但是，这种还原不是非常有效，并且相应的拜氏梭菌菌株不能产生良好的效价且不被认为是有用的生产菌株。

近来，已经将丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)进行代谢改造用于使用来自拜氏梭菌的仲醇脱氢酶产生异丙醇(Leeet al,2012:Metabolic engineering of Clostridiumacetobutylicum ATCC824for isopropanol-butanol-ethanol fermentation,Appl.Environ.Microbiol.78:1416-1423)，但是需要高效的醇脱氢酶来优化该过程。

ABE发酵的挑战在于所有已知的生物都依赖于基于糖或淀粉的底物。很多适用于产生化学产物(例如丙酮和异丙醇)的碳水化合物原料的成本受它们作为人类食物或动物饲料的价值的影响，同时用于所述生产的产淀粉或蔗糖作物的栽培并非在所有地理条件下都是经济上可持续的。因此，开发将更低成本和/或更丰富的碳源转化成有用的化学产物(例如丙酮和异丙醇)的技术是非常有益的。

CO是有机材料(例如煤炭或油和油衍生产物)不完全燃烧的主要的免费的、富含能量的副产物。例如，据报道，澳大利亚的钢铁工业每年生产并释放超过50万吨CO到大气中。产乙酸的生物(例如紧密相关的微生物自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、杨氏梭菌(C.ljungdahlii)和拉氏梭菌(C.ragsdalei))能够以含CO或含CO₂/H₂的气体作为唯一能源或碳源进行化能自养生长，并且能够合成产物例如乙酸盐、乙醇或2,3-丁二醇，但是不能合成丙酮或异丙醇(Munasinghe PC,Khanal SK:Biomass-derived syngasfermentation into biofuels:Opportunities and challenges.Bioresource Technol2010,5013-22)。

最近，一项研究报道了拉氏梭菌(梭菌属菌株P11)在100L中试规模发酵罐中从柳枝稷(switchgrass)来源的合成气产生了异丙醇(Kundiyana DK,Huhnke RL,Wilkins MR:Syngas fermentation in a 100-L pilot scale fermentor:Design and processconsiderations.J Biosci Bioeng 2010,109:492-498)。但是，来自所述同一实验室的相关研究显示，这是由所使用的合成气中的污染引起的，因为所述合成气通过了含有20％丙酮的洗涤混合物(Ramachandriya KD:Effect of biomass generated producer gas,methane and physical parameters on producer gas fermentations by Clostridiumstrain P11.Masters thesis,Oklahoma State University 2009；Ramachandriya KD,Wilkins MR,Delorme MJM,Zhu X,Kundiyana DK,Atiyeh HK,Huhnke RL:Reduction ofacetone to isopropanol using producer gas fermenting microbes.BiofuelsEnviron Biotechnol,2011,epub)。但是，作者确认拉氏梭菌(梭菌属菌株P11)可将丙酮还原为异丙醇并且推测存在仲醇脱氢酶，但没有找到任何证据。

本发明的目的是克服现有技术的一种或多种缺陷，或者至少为公众提供有用的选择。

发明内容

本发明人已经在自产乙醇梭菌中鉴定出新的伯醇:仲醇脱氢酶——该酶被用于例如从CO产生异丙醇和/或一种或多种其他产物或用于将丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵升级为异丙醇-丙醇-乙醇(IBE)发酵或用于将MEK转化成2-丁醇，并且已经通过定点诱变对该酶的特性(例如底物和/或辅因子特异性)进行了优化。

在本发明的一个方面，提供了对至少一种第一底物比对至少一种第二底物具有更强的特异性的醇脱氢酶，其中所述至少一种第一底物和所述至少一种第二底物选自：

所述第一底物是丙酮且所述第二底物是MEK；

所述第一底物是丙酮且所述第二底物是乙醛；

所述第一底物是丙酮且所述第二底物是乙偶姻；

所述第一底物是MEK且所述第二底物是乙醛；

所述第一底物是MEK且所述第二底物是乙偶姻；

所述第一底物是乙偶姻且所述第二底物是丙酮；

所述第一底物是乙偶姻且所述第二底物是MEK；

所述第一底物是乙偶姻且所述第二底物是乙醛；

所述第一底物是乙醛且所述第二底物是丙酮；

所述第一底物是乙醛且所述第二底物是乙偶姻；和

所述第一底物是乙醛且所述第二底物是MEK；并且

其中和相应的野生型醇脱氢酶相比，所述醇脱氢酶包含至少一个或多个突变。

在一个实施方案中，所述醇脱氢酶对一种、两种或三种第一底物比对两种或三种第二底物具有增强的特异性。在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶对两种或三种第一底物比对一种、两种或三种第二底物具有增强的特异性。

在另一方面，本发明提供了对NADH辅因子比对NADPH辅因子具有增强的特异性的醇脱氢酶，其中和相应的野生型醇脱氢酶相比，所述醇脱氢酶包含至少一个或多个突变。

在另一方面，本发明提供了使用NADH作为辅因子的醇脱氢酶，其中和相应的使用NADPH作为辅因子的野生型醇脱氢酶相比，所述醇脱氢酶包含至少一个或多个突变。

在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶对丙酮比对MEK和/或乙醛和/或乙偶姻具有增强的特异性。

在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶对MEK比对丙酮和/或乙醛和/或乙偶姻具有增强的特异性。

在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶对乙醛比对丙酮和/或MEK和/或乙偶姻具有增强的特异性。

在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶对乙偶姻比对丙酮和/或MEK和/或乙醛具有增强的特异性。

在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶基本没有使用乙偶姻作为底物的能力。在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶基本没有使用乙偶姻作为底物的能力，但是能够使用丙酮、MEK和/或乙醛作为底物。

在一个实施方案中，所述至少一个突变是在对应于SEQ ID 36的醇脱氢酶序列的位置Gly198、Ser199、Arg200、Pro201和Tyr218的氨基酸中的一个或其组合上的氨基酸置换。

在一个实施方案中，和所对应的野生型醇脱氢酶相比，所述醇脱氢酶包含一个或多个以下突变：Gly198Asp、Gly198Ile、Gly198Leu、Gly198Val、Ser199Asp、Ser199Glu、Ser199Leu、Ser199Val、Arg200Glu、Pro201Asp、Pro201Glu、Tyr218Ala和Tyr218Phe。

在另一个实施方案中，和所对应的野生型醇脱氢酶相比，所述醇脱氢酶包含以下突变中的一个：Tyr218Gly、Tyr218Ser或Tyr218Val。

在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Ser199Asp置换。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Ser199Glu置换。

在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Leu和Pro201Glu。在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Ala。在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Phe。在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Gly。在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Ser。在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Val。

在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Ser199Asp置换并且1)对丙酮比对MEK和/或乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Ser199Asp置换并且对丙酮比对MEK和乙偶姻具有增强的底物特异性。

在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Ser199Glu置换并且1)对丙酮比对MEK、乙醛和/或乙偶姻；和/或2)对MEK比对乙醛和/或乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Ser199Glu置换并且1)对丙酮比对MEK和乙醛以及乙偶姻具有增强的底物特异性。在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Ser199Glu置换并且对MEK比对乙醛和乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Ser199Glu置换并且1)对丙酮比对MEK、乙醛以及乙偶姻；和2)对MEK比对乙醛和乙偶姻具有增强的底物特异性。

在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Val和Pro201Glu，并且1)对丙酮比对MEK；和/或2)对乙醛比对MEK、丙酮和/或乙偶姻；和/或3)对乙偶姻比对丙酮和/或MEK具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶对乙醛比对MEK、丙酮以及乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶对乙偶姻比对丙酮和MEK具有增强的底物特异性。在另一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶1)对丙酮比对MEK；和2)对乙醛比对MEK、丙酮以及乙偶姻；和3)对乙偶姻比对丙酮和MEK具有增强的底物特异性。

在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Ala，并且1)对丙酮比对MEK、乙醛和/或乙偶姻；和/或2)对MEK比对乙醛和/或乙偶姻；和/或3)对乙偶姻比对乙醛具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶对丙酮比对MEK、乙醛以及乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶对MEK比对乙醛和乙偶姻具有增强的底物特异性。在另一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶1)对丙酮比对MEK、乙醛以及乙偶姻；和2)对MEK比对乙醛和乙偶姻；和3)对乙偶姻比对乙醛具有增强的底物特异性。

在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Phe，并且1)对丙酮比对MEK、乙醛和/或乙偶姻；和/或对MEK比对乙醛和/或乙偶姻；和/或3)对乙醛比对乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶对丙酮比对MEK、乙醛以及乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶对MEK比对乙醛和乙偶姻具有增强的底物特异性。在另一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶1)对丙酮比对MEK、乙醛和乙偶姻；和2)对MEK比对乙醛和乙偶姻；和3)对乙醛比对乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含所述置换组合的醇脱氢酶基本没有使用乙偶姻作为底物的能力。

在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Ala，并且能够使用NADH作为辅因子。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含所有这些置换并且1)对丙酮比对MEK、乙醛和乙偶姻；和2)对MEK比对乙醛和乙偶姻；和3)对乙偶姻比对乙醛具有增强的底物特异性；并且4)能够使用NADH作为辅因子。

在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Phe，并且能够使用NADH作为辅因子。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含所有这些置换并且1)对丙酮比对MEK、乙醛和乙偶姻；和2)对MEK比对乙醛和乙偶姻；和3)对乙醛比对乙偶姻具有增强的底物特异性；并且5)能够使用NADH作为辅因子。

在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 38中提供的序列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 42中提供的序列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQID 50中提供的序列。

在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 44中提供的序列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 46中提供的序列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQID 48中提供的序列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 52中提供的序列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 54中提供的序列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 63中提供的序列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 64中提供的序列。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ ID 65中提供的序列。

在第二方面，本发明提供了编码本发明第一方面的醇脱氢酶的核酸。

在某些实施方案中，所述核酸具有SEQ ID 37、SEQ ID 41、SEQ ID47、SEQ ID 49、SEQ ID 67、SEQ ID 68、SEQ ID 69或SEQ ID 70的序列。在其他实施方案中，所述核酸具有SEQ ID 39、SEQ ID 43、SEQ ID 45、SEQ ID 51或SEQ ID 53的序列。

在第三方面，本发明提供了包含编码本发明第一方面的醇脱氢酶的核酸的核酸载体。在一个实施方案中，所述载体是表达载体。在一个实施方案中，所述编码第一方面的醇脱氢酶的核酸是第二方面的核酸。

在第四方面，本发明提供了包含本发明第二或第三方面的核酸的宿主细胞。

在第五方面，本发明提供了包含一种或多种本发明第二或第三方面的核酸的重组微生物。

在一个实施方案中，所述微生物能够通过发酵产生一种或多种选自异丙醇、2,3-丁二醇、乙醇和2-丁醇的产物和任选的一种或多种其他产物。

在一个实施方案中，所述微生物能够通过发酵产生一种或多种选自乙偶姻、乙醛、MEK和丙酮的产物和任选的一种或多种其他产物。

在一个实施方案中，所述重组微生物选自包括细菌、古细菌和真菌的微生物。

在一个实施方案中，所述重组微生物选自：梭菌属(Clostridium)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、穆尔氏菌属(Moorella)、丁酸杆菌属(Butyribacterium)、Blautia、产醋杆菌属(Oxobacter)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝汉逊酵母属(Candida Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、红酵母属(Rhodotorula)、根霉菌属(Rhizopus)、毛孢子菌属(Trichosporon)、油脂酵母属(Lipomyces)、曲霉菌属(Aspergillus)、木霉菌属(trichoderma)、外瓶霉属(Exophila)、毛霉菌属(Mucor)、枝孢菌属(Cladosporium)、革菌属(Phanerochaete)、支孢瓶霉属(Cladiophilalophora)、拟青霉属(Paecilomyces)、丝孢菌属(Scedosporium)、长喙壳霉属(Ophistoma)、芽孢杆菌属(Bacillus)、寡养菌属(Oligotropha)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜碳杆菌属(Carbophilus)、氢噬胞菌属(Hydrogenophaga)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、扎瓦尔金氏菌属(Zavarzinia)、贪铜菌属(Cupravidus)、集胞藻菌属(Senechocystis)、绿屈挠菌属(Chloroflexus)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基球形菌属(Methylosphera)、甲基暖菌属(Methylocaldum)，甲基孢囊菌属(Methylocystis)，甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷球菌属(Methanococcus)、产甲烷菌属(Methanogenium)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷球形菌属(Methanoshera)、甲烷嗜热杆菌属(Methanothermobacter)、甲烷丝菌属(Methanotrix)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、放线菌属(Actinomyces)、拟杆菌(Bacteriodes)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、短杆菌属(Brevibacterium)、火球菌(Pyrococcus)、地杆菌属(Geobacter)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)，类芽孢杆菌(Paenibacillus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)、热袍菌属(Thermatoga)、热厌氧菌属(Thermoanaerobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、红杆菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、梭形杆菌(Fusobacterium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、韦荣球菌属(Veillonella)、水居菌属(Aquincola)、节杆菌属(Arthrobacter)、莫拉克斯氏菌属(Moraxella)和嗜冷杆菌属(Psychrobacter)。

在一个实施方案中，所述生物选自一氧化碳营养型产乙酸微生物、ABE微生物、肠道菌(Enterobacteria)、乳酸杆菌、真菌和酵母、需氧一氧化碳营养菌、需氧二氧化碳固定生物、甲基营养菌(methylotrophe)和产甲烷菌。

在一个实施方案中，所述微生物是选自如下的一氧化碳营养型产乙酸菌：自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、科斯卡塔梭菌(Clostridium coskatii)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、大梭菌(Clostridiummagnum)、梭菌属种(Clostridium sp.)、淤泥丁酸杆菌(Butyribacterium limosum)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacteriumwoodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。在一个实施方案中，所述微生物是自产乙醇梭菌或杨氏梭菌。在一个具体实施方案中，所述微生物是自产乙醇梭菌DSM10061或DSM23693。在另一个具体实施方案中，所述微生物是杨氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。

在一个实施方案中，所述微生物是选自如下的ABE微生物：丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)。在一个实施方案中，所述微生物是丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌。在一个具体实施方案中，所述微生物是丙酮丁醇梭菌ATCC824(或DSM792)。在另一个具体实施方案中，所述微生物是拜氏梭菌NCIMB8052(ATCC51743)。

在一个实施方案中，所述微生物是选自如下的肠道菌：埃希氏杆菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、发酵单胞菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属。在一个实施方案中，所述微生物是大肠杆菌(Eschericia coli)、运动发酵单胞菌(Zymononas mobilis)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxtoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。

在一个实施方案中，所述微生物是选自如下的乳酸菌:乳酸杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、片球菌属、链球菌属(Streptococcus)。在一个实施方案中，所述微生物是短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。

在一个实施方案中，所述微生物是选自如下的真菌或酵母：酵母属、毕赤酵母属、假丝汉逊酵母属、耶氏酵母属(Yarrowia)、红酵母属、根霉菌属、毛孢子菌属、油脂酵母属以及选自曲霉菌属、木霉属、外瓶霉属、毛霉菌属、枝孢菌属、革菌属、支孢瓶霉属、拟青霉属、丝孢菌属、长喙壳霉属。在一个实施方案中，所述微生物是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、热带假丝酵母(Candidia tropicalis)、白色念珠菌(Candidia albicans)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。在一个实施方案中，所述微生物是黑曲霉(Aspargillus niger)或里氏木霉(Trichderma resei)。

在一个实施方案中，所述微生物是选自如下的需氧一氧化碳营养菌：芽孢杆菌属、寡养菌属(Oligotropha)、假单胞菌属、嗜碳杆菌属、氢噬胞菌属、分枝杆菌属、扎瓦尔金氏菌属。在一个实施方案中，所述微生物是食羧寡养菌(Oligotropha carboxydovorans)、碳酸嗜碳菌(Carbophilus carboxidus)、类黄氢噬胞菌(Hydrogenophaga pseudoflava)、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)、氢碳酸假单胞菌(Pseudomonas carboxydohydrogena)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、伴餐扎瓦尔金氏菌属(Zavarzinia compransoris)或施氏芽胞杆菌(Bacillus schlegelii)。

在一个实施方案中，所述微生物是选自如下的需氧二氧化碳固定生物：贪铜菌属、集胞藻菌属、绿屈挠菌属。在一个实施方案中，所述微生物是钩虫贪铜菌(Cupravidusnecator)、集胞藻菌(Senechocystis sp.)或橙色绿屈挠菌(Chloroflexus auranticus)。

在一个实施方案中，所述微生物是选自如下的甲基营养菌：甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基微菌属、甲基球形菌属、甲基暖菌属，甲基孢囊菌属，甲基弯曲菌属。在一个实施方案中，所述微生物是荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)或发孢甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)。

在一个实施方案中，所述微生物是选自如下的产甲烷菌：甲烷杆菌属、甲烷球菌属、产甲烷菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷球形菌属、甲烷嗜热杆菌属、甲烷丝菌属。在一个实施方案中，所述微生物是嗜热自养甲烷杆菌(Methanothermobacter marburgensis)或巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina bakeri)。

在第六方面，本发明提供了通过使用本发明第五方面的微生物对底物进行微生物发酵以产生异丙醇、2,3-丁二醇、乙醇和2-丁醇中的一种或多种，和任选的一种或多种其他产物的方法。

在另一方面，本发明提供了产生乙偶姻、MEK、丙酮和乙醛中的一种或多种的方法。

在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：

(a)将底物提供给含有本发明的一种或多种微生物的培养物的生物反应器；和

(b)在所述生物反应器中发酵所述培养物以产生异丙醇、2,3-丁二醇、乙醇和2-丁醇中的一种或多种，和任选的一种或多种其他产物。

在一个实施方案中，所述底物是包含CO、CO₂和H₂中的一种或多种的底物。在另一个实施方案中，所述底物是包含一种或多种碳水化合物的底物。

在另一个实施方案中，可使用两种或更多种不同底物的组合。在一个实施方案中，使用包含CO、CO₂和H₂中的一种或多种的底物与包含一种或多种碳水化合物的底物的组合。

在一个实施方案中，所述底物是包含CO的底物，并且所述方法包括以下步骤：

(a)在由工业过程产生的含CO的气体释放到大气中之前，将所述气体捕获；

(b)通过培养物厌氧发酵所述含CO的气体以产生异丙醇、2,3-丁二醇、乙醇和2-丁醇中的一种或多种和任选的一种或多种其他产物，所述培养物含有本发明的一种或多种一氧化碳营养型产乙酸微生物。

广义上说，本发明还可单独或综合地包括本申请说明书中提及或指出的部分、要素和特征，包括两个或多个所述部分、要素或特征的任意或所有组合，并且当本文提及的具体整体在本发明所涉及的领域具有已知的等价物时，所述已知的等价物如同单独被提出一样纳入本文。

附图说明

本发明的这些方面和其他方面——应以本发明的所有新方面考虑——将通过仅以示例方式给出的下文描述并参考附图而变得清楚，其中：

图1：示出了当在大肠杆菌中表达时，野生型蛋白是高度可溶的，且可被很容易地纯化。样品(从左到右)：总细胞提取物；可溶裂解物；分子量梯度(ladder)；柱洗脱级分1-7。

图2：示出了Ser199Asp(左图)和Arg200Gln(右图)突变型蛋白是高度可溶的。Ser199Asp样品(从左到右)：总细胞提取物；梯度；柱洗涤1；柱洗涤2；洗脱级分1-5。Arg200Gln样品(从左到右)：总细胞提取物；柱洗涤1；柱洗涤2；梯度；洗脱级分1-5。

图3：示出了野生型蛋白和Ser199Asp突变体的活性。所述Ser199Asp突变体对丙酮的活性与野生型对丙酮的活性几乎相同。

图4：示出了Ser199Asp突变体的相对活性。

图5：示出了突变体2(图A)、突变体7(图B)、突变体10(图C)、突变体11(图D)和突变体13(图E)是可溶的。突变体2样品(从左到右)：总细胞提取物、可溶裂解物、柱洗涤级分(1-6)、分子量梯度、柱洗脱级分(1-6)。突变体7样品(从左到右)：总细胞提取物、可溶裂解物、柱洗涤级分(1-5)、分子量梯度、柱洗脱级分(1-7)。突变体10样品(从左到右)：总细胞提取物、可溶裂解物、柱洗涤级分(1)、分子量梯度、柱洗涤级分(2-4)、柱洗脱级分(1-5)。突变体11样品(从左到右)：总细胞提取物、可溶裂解物、柱洗涤级分(1-3)、分子量梯度、柱洗脱级分(1-5)。突变体13样品(从左到右)：总细胞提取物、可溶裂解物、柱洗涤级分(1)、分子量梯度、柱洗涤级分(2-3)、柱洗脱级分(1-5)、分子量梯度。

图6：示出了野生型蛋白和突变体2、7、10、11和13以NADH作为辅因子且以丙酮作为底物时的活性。只有突变体11使用NADH作为辅因子时具有显著的活性。

图7：示出了野生型和突变型ADH酶对标准化为丙酮的不同底物(丙酮设置为1)的比活性。对于每一种酶，使用优选的辅因子(即，野生型ADH、突变体2和突变体7使用了NADPH；突变体10和突变体11使用了NADH)。

图8：示出了野生型和突变型ADH酶对标准化为MEK(2-丁酮)的不同底物(MEK设置为1)的比活性。对于每一种酶，使用优选的辅因子(即，野生型ADH、突变体2和突变体7使用了NADPH；突变体10和突变体11使用了NADH)。

图9：示出了野生型和突变型ADH酶对标准化为乙醛的不同底物(乙醛设置为1)的比活性。对于每一种酶，使用优选的辅因子(即，野生型ADH、突变体2和突变体7使用了NADPH；突变体10和突变体11使用了NADH)。

图10：示出了野生型和突变型ADH酶对标准化为乙偶姻的不同底物(乙偶姻设置为1)的比活性。对于每一种酶，使用优选的辅因子(即，野生型ADH、突变体2和突变体7使用了NADPH；突变体10和突变体11使用了NADH)。

图11：使用NADH和NADPH作为辅因子并使用丙酮作为底物(包括对照(CNTL))对自产乙醇梭菌DSM10061野生型酶进行的活力测试。

图12：使用不同底物测量的野生型Adh酶的动力学、KM值和活性。

图13：pMTL85147-ThlA-CtfAB-Adc-Adh的质粒图谱。

图14：产生异丙醇、2,3-丁二醇、2-丁醇和乙醇的发酵途径以及醇脱氢酶(adh)的作用。其他反应：乙酰乳酸合酶(als)、乙酰乳酸脱羧酶(aldc)、二醇脱水酶(pdd)、醛脱氢酶(ald)、醛：铁氧还蛋白氧化还原酶(aor)、磷酸转乙酰酶(pta)、乙酸激酶(ack)、硫解酶(thlA)、CoA转移酶(ctfAB)、乙酰乙酸脱羧酶(adc)。

序列表说明

本说明书附有序列表，其中列出了以下序列：

SEQ ID No.1-34:记载在下文的表3、4和5中。

SEQ ID No.35:本发明人研究的野生型ADH的核酸序列。

SEQ ID No.36:本发明人研究的野生型ADH的氨基酸序列。

SEQ ID No.37:本发明人制备的包含置换Ser199Asp的突变型ADH的核酸序列。

SEQ ID No.38:本发明人制备的包含置换Ser199Asp的突变型ADH的氨基酸序列。

SEQ ID No.39:Wood Ljungdahl启动子区的核酸序列。

SEQ ID No.40:本文进一步描述的质粒pMTL85147-ThlA-CtfAB-Adc-Adh的核苷酸序列。

SEQ ID No.41:下文进一步描述的突变体7的核酸序列(密码子优化的)。

SEQ ID No.42:下文进一步描述的突变体7的氨基酸序列。

SEQ ID No.43:下文进一步描述的突变体8的核酸序列(密码子优化的)。

SEQ ID No.44:下文进一步描述的突变体8的氨基酸序列。

SEQ ID No.45:下文进一步描述的突变体9的核酸序列(密码子优化的)。

SEQ ID No.46:下文进一步描述的突变体9的氨基酸序列。

SEQ ID No.47:下文进一步描述的突变体10的核酸序列(密码子优化的)。

SEQ ID No.48:下文进一步描述的突变体10的氨基酸序列。

SEQ ID No.49:下文进一步描述的突变体11的核酸序列(密码子优化的)。

SEQ ID No.50:下文进一步描述的突变体11的氨基酸序列。

SEQ ID No.51:下文进一步描述的突变体12的核酸序列(密码子优化的)。

SEQ ID No.52:下文进一步描述的突变体12的氨基酸序列。

SEQ ID No.53:下文进一步描述的突变体13的核酸序列(密码子优化的)。

SEQ ID No.54:下文进一步描述的突变体13的氨基酸序列。

SEQ ID No.55:自产乙醇梭菌醇脱氢酶基因的5’同源臂的核苷酸序列。

SEQ ID No.56:自产乙醇梭菌醇脱氢酶基因的3’同源臂的核苷酸序列。

SEQ ID No.57：引物Sec5f。

SEQ ID No.58：引物Sec5r。

SEQ ID No.59：引物Sec3f。

SEQ ID No.60：引物Sec3r。

SEQ ID No.61：引物SecOf。

SEQ ID No.62：引物SecOr。

SEQ ID No.63:具有以下置换Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Gly的醇脱氢酶的氨基酸序列。

SEQ ID No.64:具有以下置换Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Ser的醇脱氢酶的氨基酸序列。

SEQ ID No.65:具有以下置换Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Val的醇脱氢酶的氨基酸序列。

SEQ ID No.66:具有以下置换Ser199Glu的醇脱氢酶的氨基酸序列。

SEQ ID No.67:具有以下置换Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Gly的醇脱氢酶的核酸序列。

SEQ ID No.68:具有以下置换Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Ser的醇脱氢酶的核酸序列。

SEQ ID No.69:具有以下置换Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Val的醇脱氢酶的核酸序列。

SEQ ID No.70:具有以下置换Ser199Glu的醇脱氢酶的核酸序列(密码子优化的)。

具体实施方式

以下是在广义上给出的对本发明(包括其优选的实施方案)的说明。在下文标题“实施例”下给出的公开内容进一步解释本发明，其提供了支持本发明的实验数据、本发明多个方面的具体实例以及实施本发明的方法。

本发明人意外地发现来自一氧化碳营养型产乙酸微生物的醇脱氢酶的突变增强了其对底物乙偶姻、甲基乙基酮(MEK或2-丁酮)、丙酮和乙醛中的一种或多种相对于彼此的特异性。

另外，本发明人鉴定了能够接受NADH而不是NADPH作为辅因子的突变体或者除了NADPH之外还能够接受NADH作为辅因子的突变体。因此，其不受只有一种所述辅因子可用的限制且能够将更丰富的细胞内NADH池用于提高产物形成的总效率。

所述突变意指本发明的酶被改造为适于优选地产生一种发酵终产物而由于产生另一种发酵终产物，并且使得能够使用通常比NADPH池更大的NADH池(Bennett&San,2009)。在ABE发酵中产生乙醇和丙酮二者，并且在IBE发酵中产生异丙醇(&Dürre,2011)。本发明可使得能够增强丙酮到异丙醇的还原或者相对于乙醛到乙醇的反应优先催化该反应，或反之亦然。例如，本发明可有助于克服异丙醇生产中的缺陷，这是因为所有的菌株都依赖于未经修饰的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶是严格依赖NADPH的并且对乙醛具有高背景活性。经改造的用于异丙醇生产的大肠杆菌菌株具有相同的缺陷和低产率，这是因为使用了来自拜氏梭菌的相同的NADPH依赖性醇脱氢酶而没有其他选择(Hanai T et al(2007)Engineered synthetic pathway for isopropanol production in Escherichiacoli.Applied and environmental microbiology73:7814–8；Inokuma K et al(2010)Improvement of isopropanol production by metabolically engineered Escherichiacoli using gas stripping.Journal of bioscience and bioengineering 110:696–701；Jojima T et al(2008)Production of isopropanol by metabolically engineeredEscherichia coli.Applied microbiology and biotechnology 77:1219–24)。类似地，本发明提供了由之前不能产生可行水平的异丙醇的一氧化碳营养型产乙酸微生物从含一氧化碳的底物产生异丙醇的方法。一些一氧化碳营养型生物(如自产乙醇梭菌、杨氏梭菌或拉氏梭菌)能够同时形成乙醇和和2,3-丁二醇(et al.,2011)。本发明还可使得能够增强乙偶姻到2,3-丁二醇的还原或者能够相对于乙醛到乙醇的反应优先催化该反应，或反之亦然。可通过二醇脱水酶将2,3-丁二醇转化成MEK(Toraya et al,1976,Substratespecificity of coenzyme B12-dependent diol dehydrase-glycerol as both a goodsubstrate and a potent inactivator.Biochem.Biophys.Res.Commun.,69:475-80)。本发明使得能够将MEK有效转化成2-丁醇。因此，本发明还提供了以更高特异性从乙偶姻产生2,3-丁二醇和从MEK产生2-丁醇的方案。

因此，除此之外，本发明还提供了醇脱氢酶，所述醇脱氢酶对丙酮底物比对其他底物(如乙偶姻、甲基乙基酮(MEK或2-丁酮)和/或乙醛底物)，对MEK底物比对乙醛和/或乙偶姻底物，对乙醛底物比对MEK、乙偶姻和/或丙酮底物，并且/或者对乙偶姻底物比对丙酮、MEK和/或乙醛底物具有增强的特异性，其中和相应的野生型醇脱氢酶相比，所述醇脱氢酶包含至少一个或多个突变；编码所述醇脱氢酶的核酸；包含所述核酸的核酸载体；能够通过发酵底物产生异丙醇、2,3-丁二醇、乙醇和2-丁醇中的一种或多种和任选的一种或多种其他产物并且包含编码本发明的一种或多种醇脱氢酶的一种或多种核酸的微生物；以及产生异丙醇、2,3-丁二醇、乙醇和2-丁醇中的一种或多种和任选的一种或多种其他产物的方法。

本发明还提供了基本不能使用乙偶姻作为底物的醇脱氢酶、编码所述醇脱氢酶的核酸和核酸载体、包含所述核酸或核酸载体的微生物以及所述醇脱氢酶的使用方法。

短语“含CO、CO₂和H₂中的一种或多种的底物”应被理解为包括其中的CO、CO₂和H₂中的一种或多种可被一种或多种微生物菌株获得用于例如生长和/或发酵的任意底物。应理解，所述底物可包含100％CO、CO₂或H₂或者和其他气体相比大部分为CO、CO₂或H₂，或者所述底物可包含所述气体中的两种或多种以任意比例的组合。在具体实施方案中，所述底物包含CO和CO₂的组合。在另一个实施方案中，所述底物包含CO和H₂的组合。在另一个实施方案中，所述底物包含CO、CO₂和H₂的组合。

在某些实施方案中，所述底物可包含CO₂以及在光(光合作用)和/或电(电合成)的存在下进行的任何培养、生长或发酵。在某些实施方案中，CO₂与O₂组合。

在一个实施方案中，所述“含CO、CO₂和H₂的底物”是“含一氧化碳的底物”。“含CO的底物”及类似术语应被理解为包括其中一氧化碳可被一种或多种微生物菌株用于例如生长和/或发酵的任意底物。

短语“含一氧化碳的气态底物”及类似短语和术语包括含有一个水平的一氧化碳的任意气体。在某些实施方案中，所述底物含有至少约20体积％至约100体积％的CO、20体积％至70体积％的CO、30体积％至60体积％的CO和40体积％至55体积％的CO。在具体实施方案中，所述底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％的CO、或约55体积％的CO、或约60体积％的CO。

虽然所述含CO的底物不必需含有任何氢气，但是H₂的存在不会对依据本发明方法的产物形成够成不利。在具体实施方案中，氢气的存在可获得提高的醇产生的整体效率。例如，在具体实施方案中，所述底物可包含约2:1、或1:1或1:2比率的H₂:CO。在一个实施方案中，所述底物包含约30体积％或更低的H₂、20体积％或更低的H₂、约15体积％或更低的H₂、或者约10体积％或更低的H₂。在其他实施方案中，所述底物流包含低浓度的H₂，例如小于5体积％、或小于4体积％、或小于3体积％、或小于2体积％、或小于1体积％或者基本上不含氢气。例如，所述底物还可含有一些CO₂，例如约1体积％至约80体积％的CO₂或1体积％至约30体积％的CO₂。在一个实施方案中，所述底物包含小于或等于约20体积％的CO₂。在具体实施方案中，所述底物包含小于或等于约15体积％的CO₂、小于或等于约10体积％的CO₂、小于或等于约5体积％的CO₂或者基本上不含CO₂。

在本发明的具体实施方案中，所述含CO的气态底物是工业排气或废气。“工业废气或工业排气”应被广义地认为包括工业过程产生的任何含CO的气体，并且包括铁金属产品制造、有色金属产品制造、石油精炼过程、煤的气化、生物质的气化、电力生产、炭黑生产和焦炭生产所产生的气体。本文别处提供了其他实例。

在一个实施方案中，所述“含CO、CO₂和H₂的底物”是“含CO₂和H₂的底物”。“含CO₂和H₂的底物”及类似术语应被理解为包括其中二氧化碳和氢气可被一种或多种微生物菌株用于例如生长和/或发酵的任意底物。

所述含CO₂和H₂的底物通常会含有大比例的H₂，例如至少约30体积％的H₂、或至少40体积％的H₂、或至少50体积％的H₂、或至少60体积％的H₂、或至少70体积％的H₂、或至少80体积％的H₂、或至少85体积％的H₂。

所述气态底物通常含有至少约10体积％的CO₂、或至少15体积％的CO₂、或至少20体积％的CO₂、或至少25体积％的CO₂、或至少30体积％的CO₂、或至少40体积％的CO₂。

在某些实施方案中，所述H₂:CO₂的比率为约1:1、或约2:1、或约3:1。

在某些实施方案中，所述含CO₂和H₂的底物是作为工业过程的副产物获得的或者从一些其他来源获得的废气。全球CO₂排放的最大来源来自发电厂、工业设备和其他来源中的化石燃料(例如煤、油和气体)的燃烧。

所述气态底物可以是作为工业过程的副产物获得的或者从一些其他来源(例如从汽车废气)获得的含CO₂和H₂的废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自氢气制造、氨制造、燃料的燃烧、煤的气化以及石灰石和水泥的生产。所述气态底物可以是混合一种或多种气态底物以提供混合流的结果。技术人员会理解，富含H₂或富含CO₂的废气流比同时富含H₂和CO₂的废气流更丰富。技术人员会理解，混合一种或多种包含所需的CO₂和H₂组分之一的气流会落在本发明的范围内。

可通过多种方法(包括碳氢化合物的蒸汽重整(stream reformation)，尤其是天然气的蒸汽重整)产生富含氢气的气流。所述煤或碳氢化合物的部分氧化也是富含氢气的气体的来源。所述富含氢气的气体的其它来源包括水的电解、来自用于产生氯的电解池的副产物和来自多种精炼厂和化学流的副产物。

通常富含二氧化碳的气流包括来自碳氢化合物(例如天然气或油)的燃烧的废气。二氧化碳还可以作为生产氨、石灰或磷酸盐的副产物产生。

在以下的描述中，以递送和发酵“含CO的气态底物”或“含CO、CO₂和H₂中的一种或多种的气态底物”的措辞描述本发明的实施方案。但是，应理解，所述气态底物可以以其他形式提供。例如，所述气态底物可以以溶解于液体中的形式提供。基本上，将液体用含一氧化碳、二氧化碳和/或氢气的气体饱和，然后将所述液体加入生物反应器中。这可使用标准方法实现。例如，可使用微泡分散发生器(Hensirisak et.al.Scale-up of microbubbledispersion generator for aerobic fermentation；Applied Biochemistry andBiotechnology Volume 101,Number 3/October,2002)。又例如，可将所述含CO的气态底物吸附到固态载体上。这类替代方法是使用术语“含CO的底物”、“含CO₂和H₂的底物”以及“含CO、CO₂和H₂中的一种或多种的底物”和类似短语所涵盖。

短语“含一种或多种碳水化合物的底物”及类似术语应被理解为包括其中一种或多种碳水化合物可被一种或多种微生物菌株用于例如生长和/或发酵的任意底物。“碳水化合物”应被广义地认为包括单糖、二糖、寡糖和多糖，简单和复杂的碳水化合物(包括葡萄糖、果糖、糖蜜和淀粉)。

在一个实施方案中，所述“含一种或多种碳水化合物的底物”可来自生物质。所述生物质可以是具有任何性质的并且包括例如，来自森林或其他商业作物(如树木、树枝、树桩、木片、锯屑、剪下物(clipping))的残留物、城市固体废物和为通过微生物发酵进行的一种或多种产物的生产提供原料而生长的作物(包括例如，芒草(miscanthus)、柳枝稷(switchgrass)、麻类植物、玉米、白杨、柳树、高粱、甘蔗和竹子)。

除非上下文需要另有说明，否则本文使用的短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等意图既包含所述过程的生长阶段也包含产物生物合成阶段。如本文将要进一步描述的，在一些实施方案中，所述生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，向发酵反应中添加金属或组合物应被理解为包括加入到这些反应器之一或二者中。

术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管路布置构成的发酵装置，其包括连续搅拌釜式反应器(CSTR)、固定化细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、鼓泡塔、气升发酵罐、静态混合器、或适合用于气液接触的其他容器或其他装置。在一些实施方案中，所述生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，当提到向所述生物反应器或发酵反应中加入底物时，如果合适，应该理解为加入到这些反应器之一或二者中。

术语核酸”构建体“或”载体“及类似术语应被广义地认为包括任何适合用作载体将遗传物质转移到细胞中的核酸(包括DNA、cDNA和RNA)。该术语应被认为包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒和人工染色体。构建体或载体可包含一种或多种调节元件、复制起点、多克隆位点和/或选择标记。在一个具体实施方案中，所述构建体或载体被改造为适于使得由所述构建体或载体编码的一个或多个基因表达。核酸构建体或载体包括裸露核酸，以及用一种或多种有助于向细胞递送的试剂配制的核酸(例如脂质体缀合的核酸、其中含有所述核酸的生物)。可将所述载体用于核酸的克隆或表达以及用于微生物的转化以产生重组微生物。所述载体可包含编码本发明的一种或多种醇脱氢酶的一种或多种核酸。

“外源核酸”是源自待引入核酸的微生物之外的核酸。外源核酸可源自任意适合的来源，包括但不限于待引入它们的微生物、与待引入它们的生物不同的微生物菌株或种，或者它们可通过人工或重组方法形成。在另一个实施方案中，所述外源核酸代表非天然存在于待引入它们的微生物中的核酸序列，并且所述外源核酸使得可表达非天然存在于所述微生物中的产物。所述外源核酸可被改造为适于整合到待引入其的微生物的基因组中，或者保持染色体外状态。

”亲代微生物“是用于产生本发明微生物的微生物。所述亲代微生物可以是天然存在的微生物(即野生型微生物)或之前曾被修饰过但是不表达或不过表达本发明主题的一种或多种酶的微生物。因此，本发明的微生物已被修饰以在所述亲代微生物中表达本发明的一种或多种醇脱氢酶。

本文提到的本发明的醇脱氢酶对一种底物比对另一种底物具有“增强的特异性”。这意在指和野生型醇脱氢酶相比，所述醇脱氢酶对一种底物相对于对另一种底物具有增强的特异性。不应被认为必须推定，和野生型醇脱氢酶相比，本发明的醇脱氢酶对具体的底物具有增强的特异性，尽管在一些实施方案中可能是这种情况。另外，所述术语不应被理解为意指，本发明的醇脱氢酶对一种具体底物相对于对另一种底物具有绝对的特异性(尽管在一些实施方案中可能是这种情况)，并且所述术语至少包括对一种具体底物相对于对另一种底物的偏好。

当与NADH辅因子或NADPH辅因子关联使用时，“增强的特异性”、“更高的特异性”或类似术语是指在反应过程中辅因子与醇脱氢酶结合的亲和度。不应被认为意指，醇脱氢酶和辅因子具有绝对的特异性(尽管可能是这种情况)，并且包括至少对具体的醇脱氢酶与一种辅因子之间的结合相对于与另一种辅因子之间的结合具有偏好。

本文提到了产生“一种或多种包含异丙醇、2,3-丁二醇、乙醇和2-丁醇的产物”。但是，应理解，也可产生其他产物。

本文还提到了产生“一种或多种包含乙偶姻、MEK、乙醛和丙酮的产物”。同时这些产物在本文还被称为“底物”，在某些实施方案中，当本发明的突变型醇脱氢酶对一种具体底物的特异性相比于对另一种底物的特异性发生降低时，该底物会以更低的水平被转化成下游产物或者基本不发生转化，使得增加水平的乙偶姻、MEK、乙醛和/或丙酮能够发生累积。例如，在一个实施方案中，本发明的醇脱氢酶基本不能使用乙偶姻作为底物，因此乙偶姻可发生累积。

另外，在一些实施方案中，应理解，本文提到的一种或多种包含异丙醇、2,3-丁二醇、乙醇和2-丁醇中的一种或多种的产物可被用作中间体或前体，所述中间体或前体在同一发酵反应中、不同的发酵反应中、或通过化学合成被进一步转化成下游产物。在这种情况下，可能不能检测到具体微生物中的一种或多种产物的产生或者可能只能检测到少量的产生。但是，可基于一种或多种下游产物的产生而推断所述一种或多种产物的产生。

在本发明的某些实施方案中，本发明的醇脱氢酶“基本没有使用乙偶姻作为底物的能力”。这不必然意味着所述酶绝对没有使用乙偶姻作为底物的能力，尽管这可能是优选的。在一个实施方案中，所述短语应被认为容许野生型酶活性的约1％或更低，或者容许kcat/K_M低于0.1sec^-1mM^-1的酶效率。

酶

尽管本发明人已经证明了来自自产乙醇梭菌的醇脱氢酶(SEQ ID36)的突变增强了对多种底物相比于对其他底物的特异性，并且证明了在某些实施方案中可改变或优化辅因子特异性，但是本发明人认为本发明可被广泛用于来自其他生物的其他醇脱氢酶；具体地，任何对伯醇或仲醇具有活性且使用NADH或NADPH作为底物的醇脱氢酶(EC 1.1.1.1或EC1.1.1.2)。

通常，本发明所适用的醇脱氢酶组与SEQ ID 36的醇脱氢酶具有至少约65％的序列同一性，更特别地至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。

例如，本发明可用于以下醇脱氢酶：自产乙醇梭菌的伯醇：仲醇脱氢酶(SEQ ID36)、杨氏梭菌(YP_003780646.1)的伯醇：仲醇脱氢酶、拜氏梭菌(P25984.2)的伯醇：仲醇脱氢酶、嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)(ABC50090.1)的伯醇：仲醇脱氢酶、或布氏嗜热厌氧菌(Thermoanaerobium brockii)(P14941.1)的伯醇：仲醇脱氢酶。

和相应的野生型醇脱氢酶相比，本发明的醇脱氢酶包含至少一个突变。在一个实施方案中，所述至少一个突变是在对应于SEQ ID 36的醇脱氢酶序列的位置Gly198、Ser199、Arg200、Pro201和Tyr218的氨基酸中的一个或所述氨基酸的组合上的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含至少一个突变，其中所述至少一个突变是在对应于SEQ ID 36的醇脱氢酶序列的位置Ser199的位置上的氨基酸置换。技术人员通过根据本领域已知的标准方法将所述序列与SEQ ID 36的醇脱氢酶序列进行比对，会很容易地理解在其他醇脱氢酶中的相关位置(对应于SEQ ID 36的ADH的位置198、199、201和208)。

在一个实施方案中，和相应的野生型醇脱氢酶相比，所述醇脱氢酶包含以下突变中的一个或多个：Gly198Asp、Gly198Ile、Gly198Leu、Gly198Val、Ser199Asp、Ser199Glu、Ser199Leu、Ser199Val、Arg200Glu、Pro201Asp、Pro201Glu、Tyr218Ala和Tyr218Phe。

本发明人还想到和相应的野生型醇脱氢酶相比，本发明的醇脱氢酶包含以下突变中的一个：Tyr218Gly、Tyr218Ser和Tyr218Val。这些突变代表全部都和下文实施例部分中所示例的Tyr218Ala和Tyr218Phe置换在大小上接近的置换。

在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Ser199Glu置换并且1)对丙酮比对MEK、乙醛和/或乙偶姻；和/或2)对MEK比对乙醛和/或乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Ser199Glu置换并且1)对丙酮比对MEK、乙醛以及乙偶姻具有增强的底物特异性。在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Ser199Glu置换并且对MEK比对乙醛和乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含Ser199Glu置换并且1)对丙酮比对MEK、乙醛以及乙偶姻；和2)对MEK比对乙醛和乙偶姻具有增强的底物特异性。

在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Val和Pro201Glu，并且1)对丙酮比对MEK；和/或2)对乙醛比对MEK、丙酮和/或乙偶姻；和/或3)对乙偶姻比对丙酮和/或MEK具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含该置换组合的醇脱氢酶对乙醛比对MEK、丙酮以及乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含该置换组合的醇脱氢酶对乙偶姻比对丙酮和MEK具有增强的底物特异性。在另一个实施方案中，包含该置换组合的醇脱氢酶1)对丙酮比对MEK；和2)对乙醛比对MEK、丙酮以及乙偶姻；和3)对乙偶姻比对丙酮和MEK具有增强的底物特异性。

在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Ala，并且1)对丙酮比对MEK、乙醛和/或乙偶姻；和/或2)对MEK比对乙醛和/或乙偶姻；和/或3)对乙偶姻比对乙醛具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含该置换组合的醇脱氢酶对丙酮比对MEK、乙醛以及乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含该置换组合的醇脱氢酶对MEK比对乙醛和乙偶姻具有增强的底物特异性。在另一个实施方案中，包含该置换组合的醇脱氢酶1)对丙酮比对MEK、乙醛以及乙偶姻；和2)对MEK比对乙醛和乙偶姻；和3)对乙偶姻比对乙醛具有增强的底物特异性。

在另一个实施方案中，所述醇脱氢酶包含以下置换的组合：Gly198Asp、Ser199Val、Pro201Glu和Tyr218Phe，并且1)对丙酮比对MEK、乙醛和/或乙偶姻；和/或对MEK比对乙醛和/或乙偶姻；和/或3)对乙醛比对乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含该置换组合的醇脱氢酶对丙酮比对MEK、乙醛以及乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含该置换组合的醇脱氢酶对MEK比对乙醛和乙偶姻具有增强的底物特异性。在另一个实施方案中，包含该置换组合的醇脱氢酶1)对丙酮比对MEK、乙醛和乙偶姻；和2)对MEK比对乙醛和乙偶姻；和3)对乙醛比对乙偶姻具有增强的底物特异性。在一个实施方案中，包含该置换组合的醇脱氢酶基本没有使用乙偶姻作为底物的能力。

可通过本领域已知的任何合适的方法制备本发明的醇脱氢酶，所述方法包括，例如，下文描述的定点诱变技术、随机诱变技术、重组方法和化学合成。

在一些情况下，本发明的突变型醇脱氢酶可能是天然不溶的。可使用标准技术使这些酶可溶。例如，可使用包括共表达一种或多种分子伴侣的技术。在一个具体实施方案中，采用了GroEL和/或GroES伴侣分子的共表达。在一个具体实施方案中，可使用质粒pGro7(Takara Bio,Inc；clontech.com/takara/NZ/Products/Protein_Research/Protein_Folding_and_Expr ession/Chaperone_Plasmid_Set)。该质粒促进阿拉伯糖诱导的GroEL/ES分子伴侣蛋白的表达。下文实施例2中还提供了示例性技术。

可使用任意数量的已知方法评估本发明的醇脱氢酶是否具有合适的功能。但是，例如，可使用下文实施例列出的方法。或者，可使用在Ismail et al.(Purification andcharacterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from twostrains of Clostridium beijerinckii.J Bacteriol 1993,175:5097-5105)，或在Khorkin et al(NADP-dependent bacterial alcohol dehydrogenases:crystalstructure,cofactor-binding and cofactor specificity of the ADHs ofClostridium beijerinckii and Thermoanaerobacter brockii.J Mol Biol.1998,22:278(5):967-981)中列出的方法来评估酶活性。

可使用标准方法来评估辅因子特异性。但是，例如，可使用下文“实施例”部分描述的方法。

核酸

就本发明涉及新的醇脱氢酶而言，本发明还提供了编码所述醇脱氢酶的核酸和包含所述核酸的核酸载体。

考虑到所述酶的氨基酸序列和遗传密码的简并性，本领域技术人员会容易地理解所述编码本发明的醇脱氢酶的核酸的序列。但是，仅举例来说，在一个实施方案中，所述核酸具有SEQ ID 37的序列。在其他实施方案中，所述核酸具有SEQ ID 41或SEQ ID 49的序列。在其他实施方案中，所述核酸具有SEQ ID 39、SEQ ID 43、SEQ ID 45、SEQ ID 47、SEQID 51、SEQ ID 53、SEQ ID 67、SEQ ID 68、SEQ ID 69或SEQ ID70的序列。

应理解，可对所述编码本发明的醇脱氢酶的核酸进行密码子优化以用于任何具体的微生物。

就可使用重组技术来制备和使用本发明的核酸、醇脱氢酶和微生物来说，本发明还提供了包含编码本发明的一种或多种醇脱氢酶的一种或多种核酸的核酸载体。

本发明的核酸在转化微生物后可保持染色体外状态或可被改造为适于整合到所述微生物的基因组中。因此，本发明的核酸可包括其他核苷酸序列，所述其他核苷酸序列被改造为适于帮助整合(例如可允许同源重组并靶向整合到宿主基因组中的区域)或帮助染色体外构建体的稳定表达和复制(例如复制起点、启动子和其他调节序列)。

在一个实施方案中，所述编码本发明的一种或多种醇脱氢酶的核酸会包含启动子，所述启动子被改造为适于促进由所述核酸编码的一种或多种酶的表达。在一个实施方案中，所述启动子是优选在合适的发酵条件下具有高活性的组成型启动子。也可使用诱导型启动子。在优选的实施方案中，所述启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇或阿拉伯糖诱导型pBAD启动子。本领域技术人员会理解，可指导表达(优选在适合的发酵条件下的高水平表达)的其他启动子可有效作为所示例的实施方案的替代方案。

可使用任意数量的本领域的标准技术构建核酸和核酸构建体(包括本发明的表达构建体/载体)。例如，可使用化学合成、定点诱变或重组技术。这类技术记载于例如，Sambrook et al(Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)中。其他示例性技术记载于下文的实施例部分。实质上，所述单个基因和调节元件将被可操作地相互连接以使得可表达所述基因以形成所需蛋白。本领域普通技术人员会理解适用于本发明的载体。但是，例如，下述载体可能是适合的：pBAD或pMTL80000载体和下文实施例部分所示例的质粒。

本发明还提供了包含任意一种或多种本文记载的核酸的宿主生物，尤其是微生物，并且包括病毒、细菌和酵母。

微生物

本发明还提供了能够通过发酵底物产生异丙醇、MEK、2,3-丁二醇和2-丁醇中的一种或多种和任选的一种或多种其他产物，并且包含至少一种本发明的核酸的微生物。

可使用任意数量的本领域已知的技术从亲代微生物制备本发明的微生物，所述技术包括例如，用来将所需突变引入到亲代微生物的天然醇脱氢酶基因中的定点诱变技术，或用来将编码本发明的一种或多种醇脱氢酶的一种或多种核酸引入到亲代微生物中的其他重组技术。

在一个实施方案中，编码一种或多种醇脱氢酶的一种或多种外源核酸被引入到亲代微生物中且替换了一种或多种来源于所述亲代微生物的醇脱氢酶基因。在另一个实施方案中，编码本发明的一种或多种醇脱氢酶的一种或多种外源核酸被引入到亲代微生物中且是对于来源于所述亲代微生物的醇脱氢酶基因的补充。在其他实施方案中，可将一种或多种外源核酸引入到亲代微生物中以将一个或多个所需突变引入到一种或多种来源于所述亲代微生物的醇脱氢酶基因中。在另一个实施方案中，将编码一种或多种醇脱氢酶的一种或多种外源核酸引入到亲代微生物中，并且将一个或多个突变引入到一种或多种来源于所述亲代微生物的醇脱氢酶基因中以降低或敲除所述基因的表达和活性。

在一个实施方案中，使用重组技术从亲代微生物制备本发明的微生物。例如，用一种或多种编码本发明的醇脱氢酶的外源核酸转化亲代微生物，或者用一种或多种被改造为适于将所需突变引入到所述亲代微生物的天然醇脱氢酶基因中的核酸转化亲代微生物。外源核酸在转化所述亲代微生物后可保持染色体外状态或可整合到所述亲代微生物的基因组中(在一个实施方案中用来替换天然醇脱氢酶基因，或将突变引入到天然醇脱氢酶基因中)。因此，如上文所述，所述外源核酸可包括额外的核苷酸序列，所述核苷酸序列被改造为适于帮助整合(例如允许同源重组并靶向整合到宿主基因组中的区域)或帮助染色体外构建体的表达和复制(例如复制起点、启动子和其他调节元件或序列)。

仅举例来说，微生物的转化(包括转导或转染)可通过电穿孔、超声波法、聚乙二醇介导的转化、化学感受态或天然感受态、或接合来实现。适合的转化技术记载于例如Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual,ColdSpring Harbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989中。

可将所述一种或多种外源核酸以裸露核酸形式递送到亲代微生物或可将其用一种或多种可促进转化过程的试剂配制(例如脂质体缀合的核酸、其中含有所述核酸的生物体)。在适当的情况下，所述一种或多种核酸可以是DNA、RNA或其组合。在某些实施方案中可使用限制性抑制剂(restriction inhibitor)；参见，例如Murray,N.E.et al.(2000)Microbial.Molec.Biol.Rev.64,412。

在一个实施方案中，所述亲代微生物为细菌、古细菌和真菌。

在一个实施方案中，所述亲代微生物选自：梭菌属、醋酸杆菌属、穆尔氏菌属、丁酸杆菌属、Blautia、产醋杆菌属、热厌氧杆菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、发酵单胞菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、片球菌属、链球菌属、酵母菌属、毕赤酵母属、假丝汉逊酵母属、耶氏酵母属、红酵母属、根霉菌属、毛孢子菌属、油脂酵母属、曲霉菌属、木霉菌属、外瓶霉属、毛霉菌属、枝孢属、革菌属、支孢瓶霉属、拟青霉属、丝孢菌属、长喙壳霉属、芽孢杆菌属、寡养菌属、假单胞菌属、嗜碳杆菌属、氢噬胞菌属、分枝杆菌属、扎瓦尔金氏菌属、贪铜菌属、集胞藻菌属、绿屈挠菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基微菌属、甲基球形菌属、甲基暖菌属，甲基孢囊菌属，甲基弯曲菌属、甲烷杆菌属、甲烷球菌属、产甲烷菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷球形菌属、甲烷嗜热杆菌属、甲烷丝菌属、棒状杆菌属、不动杆菌属、放线菌属、拟杆菌、伯克霍尔德氏菌属、短杆菌属、火球菌、地杆菌属、地芽孢杆菌属，类芽孢杆菌、分枝杆菌属、红假单胞菌、热袍菌属、热厌氧菌属、链霉菌属、红杆菌属、红球菌属、消化球菌属、双歧杆菌属、丙酸杆菌属、梭形杆菌、弯曲杆菌属、韦荣球菌属、水居菌属、节杆菌属、莫拉克斯氏菌属和嗜冷杆菌属。

在一个实施方案中，所述亲代微生物选自一氧化碳营养型产乙酸微生物、ABE微生物、肠道菌、乳酸杆菌、真菌和酵母、需氧一氧化碳营养菌、需氧二氧化碳固定生物、甲基营养菌、产甲烷菌。

在一个实施方案中，所述亲代微生物选自一氧化碳营养型产乙酸细菌。在某些实施方案中，所述微生物选自自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、科斯卡塔梭菌、醋酸梭菌、大梭菌、梭状芽孢杆菌属种、淤泥丁酸杆菌、甲基营养丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、Blautia producta、淤泥真杆菌、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。

这些一氧化碳营养型产乙酸菌由它们在形成乙酰-CoA、乙酸和其他产物的厌氧条件下利用气态一碳(C1)源(例如一氧化碳(CO)和含有CO和/或氢气(H₂)的二氧化碳(CO₂))并以其作为能源而进行化能自养生长的能力来定义。所述一氧化碳营养型产乙酸菌具有相同的发酵模式——Wood-Ljungdahl或还原性乙酰-CoA途径，并且由酶组的存在而定义，所述酶组由一氧化碳脱氢酶(CODH)、氢化酶、甲酸脱氢酶、甲酰四氢叶酸合成酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶、甲酰四氢叶酸环化水解酶、亚甲基四氢叶酸还原酶和一氧化碳脱氢酶/乙酰-CoA合酶(CODH/ACS)组成，该组合是这类细菌特征性的和特有的(Drake,Küsel,Matthies,Wood,&Ljungdahl,2006)。与糖发酵细菌的化能自养生长不同，所述糖发酵细菌能将底物转化为生物质、次级代谢产物和丙酮酸，从丙酮酸形成产物(经由乙酰-CoA或直接形成)，而在产乙酸菌中底物被直接转化(channel)为乙酰-CoA，从乙酰-CoA形成产物、生物质和次级代谢产物。

在一个实施方案中，所述微生物选自一组一氧化碳营养型梭菌，所述梭菌包含自产乙醇梭菌、杨氏梭菌、和“拉氏梭菌”以及相关分离株。这些包括但不限于自产乙醇梭菌JAI-1^T(DSM10061)(Abrini,Naveau,&Nyns,1994)、自产乙醇梭菌LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200)、自产乙醇梭菌LBS1561(DSM23693)、杨氏梭菌PETC^T(DSM13528＝ATCC55383)(Tanner,Miller,&Yang,1993)、杨氏梭菌ERI-2(ATCC 55380)(美国专利5,593,886)、杨氏梭菌C-01(ATCC 55988)(美国专利6,368,819)、杨氏梭菌O-52(ATCC 55989)(美国专利6,368,819)、或“拉氏梭菌P11^T”(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055)、和相关分离株例如“科斯卡塔梭菌”(US专利2011/0229947)、“梭状芽孢杆菌属种MT351”(Tyurin&Kiriukhin,2012)以及其突变株例如杨氏梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O.Production ofBioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii.PhD thesis,NorthCarolina State University,2010)或“梭状芽孢杆菌属种MT896”(Berzin,Kiriukhin,&Tyurin,2012)。

这些菌株形成梭菌rRNA簇I内的亚簇(Collins et al.,1994)，尽管如DNA-DNA重新组合和DNA印迹实验所测定的，所述菌株是不同的种(WO 2008/028055,美国专利2011/0229947)，但是它们在16S rRNA基因水平上具有至少99％的同一性。

该簇的菌株由共有的特征(具有类似的基因型和表型)定义，并且它们均具有相同的能量保存和发酵代谢的模式。该簇菌株缺少细胞色素并通过Rnf复合体保存能量。

该簇的所有菌株的基因组大小为约4.2MBp(et al.,2010)且GC组成为约32％mol(Abrini et al.,1994；et al.,2010；Tanner et al.,1993)(WO 2008/028055；美国专利2011/0229947)并具有编码以下酶的保守必要关键基因操纵子：Wood-Ljungdahl途径的酶(一氧化碳脱氢酶、甲酰-四氢叶酸合成酶、亚甲基-四氢叶酸脱氢酶、甲酰-四氢叶酸环化水解酶、亚甲基-四氢叶酸还原酶和一氧化碳脱氢酶/乙酰-CoA合酶)、氢化酶、甲酸脱氢酶、Rnf复合体(rnfCDGEAB)、丙酮酸/铁氧还蛋白氧化还原酶、醛：铁氧还蛋白氧化还原酶(et al.,2010，2011)。已经发现负责气体摄取的Wood-Ljungdahl途径基因的组织和数目在所有种中都相同，尽管在核酸和氨基酸序列上有所不同(etal.,2011)。

所述菌株都具有相似的形态和大小(对数生长细胞为0.5-0.7×3-5μm)，是嗜温的(最适生长温度为30-37℃)严格厌氧菌(Abriniet al.,1994；Tanneret al.,1993)(WO2008/028055)。而且，它们都具有相同的主要系统发育特征例如相同的pH范围(pH4-7.5，最适初始pH为5.5-6)、依赖含CO的气体以相似的生长速率进行强的自养生长、以及类似的代谢谱—以乙醇和乙酸作为主要发酵终产物并且在某些条件下形成少量2,3-丁二醇和乳酸(Abriniet al.,1994；et al.,2011；Tanner et al.,1993)(WO在对不同糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡萄糖酸、柠檬酸)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)或其它底物(例如甜菜碱、丁醇)的底物利用上是不同的)。发现一些种是某些维生素(例如硫胺素、生物素)的营养缺陷型而其它种则不是。已经表明在这些生物的范围内羧酸被还原成它们相应的醇(Perez,Richter,Loftus,&Angenent,2012)。

因此所述特征不是一种生物如自产乙醇梭菌或杨氏梭菌所特有的，而是一氧化碳营养型乙醇合成的梭菌属的一般特征。因此，可预期本发明可用于所有这些菌株，尽管在表现上可能有所不同。

在一个实施方案中，所述亲代菌株使用CO作为其唯一碳源和能源。

在某些实施方案中，所述亲代微生物选自自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和拉氏梭菌。在一个实施方案中，该组也包括科斯卡塔梭菌。在一个具体实施方案中，所述微生物是自产乙醇梭菌DSM10061或DSM23693。在另一个具体实施方案中，所述微生物是杨氏梭菌DSM13528(或ATCC55383)。

在一个实施方案中，所述亲代微生物是ABE发酵微生物。“ABE发酵微生物”或“ABE微生物”是革兰氏阳性梭菌生物，其能够产生溶剂丁醇、和乙醇、和丙酮或异丙醇。该组中的种类包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌。这些生物都是产孢子的、革兰氏阳性的且属于梭菌rRNA簇I。该组已经被Keis et al.(Keis,Shaheen,&Jones,2001)详细描述。

在一个具体实施方案中，所述ABE微生物选自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌。

在一个实施方案中，所述亲代微生物是丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌。在一个具体实施方案中，所述微生物是丙酮丁醇梭菌ATCC824(DSM792)或EA 2018(CCTCC M 94061)。在另一个具体实施方案中，所述微生物是拜氏梭菌NCIMB8052(ATCC51743)和NRRL B-593(DSM6423)。

在一个实施方案中，所述亲代微生物是肠道菌。肠道菌是属于肠杆菌目的棒状革兰氏阴性细菌，其能够发酵糖以产生乳酸、和/或乙醇、和/或乙偶姻、和/或2,3-丁二醇、和/或其他产物。

在一个具体实施方案中，所述肠道菌选自埃希氏杆菌属、克雷伯氏菌属、发酵单胞菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属。在一个实施方案中，所述亲代微生物是大肠杆菌、运动发酵单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌或粘质沙雷氏菌。

在一个实施方案中，所述亲代微生物是乳酸杆菌。乳酸杆菌是选自乳杆菌目中的革兰氏阳性乳酸细菌，其能够发酵糖以产生乳酸、和/或2,3-丁二醇、和/或MEK、和/或2-丁醇、和/或其他产物。

在一个具体实施方案中，所述乳酸杆菌选自乳酸杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、小球菌属、链球菌属。在一个实施方案中，所述亲代微生物是短乳杆菌、粪肠球菌、乳酸乳球菌。

在一个实施方案中，所述亲代微生物是真菌或酵母。真菌是真核微生物，酵母是其特定的亚群，它们能够将糖发酵为乙醇、和/或乙偶姻、和/或其他产物。

在一个具体实施方案中，所述真菌选自曲霉菌属、木霉菌属、外瓶霉属、毛霉菌属、枝孢菌属、革菌属、支孢瓶霉属、拟青霉属、丝孢菌属、长喙壳霉属。在一个实施方案中，所述亲代微生物是黑曲霉或里氏木霉。

在一个具体实施方案中，所述酵母选自酵母属、毕赤酵母属、假丝汉逊酵母属、耶氏酵母属、红酵母属、根霉菌属、毛孢子菌属、油脂酵母属以及选自曲霉菌属、木霉菌属、外瓶霉属、毛霉菌属、枝孢菌属、革菌属、支孢瓶霉属、拟青霉属、丝孢菌属、长喙壳霉属。在一个实施方案中，所述亲代微生物是酿酒酵母、热带假丝酵母、白色念珠菌或解脂耶氏酵母。在一个实施方案中，所述亲代微生物是黑曲霉或里氏木霉。

在一个实施方案中，所述亲代微生物是需氧一氧化碳营养菌。需氧一氧化碳营养菌是可在天然中普遍存在且已经从多种环境以及人类中分离的细菌(King and Weber,2007)。在分类学水平上，该生理群是相当多样的，其包括不同门(如α-变形菌门(α-proteobacteria)、厚壁菌门(firmicutes)或放线菌门(actinobacteria))(King andWeber,2007)。所有这些生物被证明在空气的存在下依赖于>1％的CO水平生长(King andWeber,2007)。典型的气体混合物由50％CO和50％空气组成(Cypionka et al.,1980)。

在具体实施方案中，所述亲代微生物选自芽孢杆菌属、寡养菌属、假单胞菌属、嗜碳杆菌属、氢噬胞菌属、分枝杆菌属、扎瓦尔金氏菌属。在一个实施方案中，所述亲代微生物是食羧寡养菌、类黄氢噬胞菌、分枝杆菌、氢碳酸假单胞菌、假单胞菌、伴餐扎瓦尔金氏菌属或施氏芽胞杆菌。

在一个实施方案中，所述亲代微生物是需氧二氧化碳固定生物。需氧二氧化碳固定微生物是能够在氧气存在下使用H₂或通过光合作用固定CO₂的细菌。所述需氧二氧化碳固定微生物选自贪铜菌属、集胞藻菌属、绿屈挠菌属。在一个实施方案中，所述亲代微生物是钩虫贪铜菌、集胞藻菌或橙色绿屈挠菌。

在一个实施方案中，所述亲代微生物是甲基营养菌。所述甲基营养微生物能够将还原性一碳底物(如甲烷或甲醇)作为碳源用于生长。所述甲基营养菌选自甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基微菌属、甲基球形菌属、甲基暖菌属，甲基孢囊菌属，甲基弯曲菌属。在一个实施方案中，所述亲代微生物是荚膜甲基球菌或发孢甲基弯菌。

在一个实施方案中，所述亲代微生物是产甲烷菌。产甲烷菌是能够将CO₂还原为甲烷的古细菌。所述产甲烷菌选自甲烷杆菌属、甲烷球菌属、产甲烷菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷球形菌属、甲烷嗜热杆菌属、甲烷丝菌属。在一个实施方案中，所述亲代微生物是嗜热自养甲烷杆菌或巴氏甲烷八叠球菌。

方法

本发明提供了通过使用本发明的重组微生物对底物进行微生物发酵以产生异丙醇、乙醇、2,3-丁二醇和/或2-丁醇以及任选的一种或多种其他产物的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供了产生乙偶姻、MEK、乙醛和丙酮中的一种或多种，以及任选的一种或多种其他产物的方法。

在一个实施方案中，所述底物是包含一种或多种碳水化合物的底物。在另一个实施方案中，所述底物是包含CO、CO₂和H₂中的一种或其组合的底物。在某些实施方案中，可使用同时包含一种或多种碳水化合物和含有CO、CO₂和H₂中的一种或多种的底物的混合底物。

在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：

优选地，所述一种或多种产物包括异丙醇。

在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：

(b)在所述生物反应器中发酵所述培养物以产生乙偶姻、MEK、乙醛和丙酮中的一种或多种，和任选的一种或多种其他产物。

所述方法还可包括回收一种或多种产物的步骤。在某些实施方案中，所述一种或多种产物是一种或多种下游产物的产生过程中的中间体。在该实施方案中，可将所述一种或多种产物回收，然后在例如单独的发酵反应中或在化学合成反应中将其作为底物使用。在另一个实施方案中，不回收所述一种或多种产物并在同一发酵过程中将其转化为一种或多种下游产物。

应理解，为使所述微生物生长并将底物转化为所述一种或多种产物，除所述底物外，还需要将适合的液体营养培养基进料至所述生物反应器。可将所述底物和培养基以连续、分批或分批进料方式进料至所述生物反应器。营养培养基会含有足以允许所使用的微生物生长的维生素和矿物质。适用于发酵的培养基是本领域中已知的。但是，例如，对于包含一种或多种碳水化合物的底物的发酵，可使用Luria Broth(LB)、酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YEPD)或强化的梭菌培养基(RCM)。另外，虽然适合用于使用CO进行发酵的厌氧培养基是本领域中已知的，但是例如，Biebel(2001)记载了适合的培养基。在本发明的一个实施方案中，所述培养基如下文实施例部分所述。

需要在适合于将底物转化为所述一种或多种产物和任选的一种或多种其他产物的条件下进行所述发酵。应考虑的反应条件包括压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率(如果使用连续搅拌釜反应器的话)、接种物水平、确保所述底物不会成为限制的最大底物浓度以及避免产物抑制的最大产物浓度。

如以上所表明的，将使用合适的培养基和发酵条件进行发酵。在一个实施方案中，当使用气态底物时，考虑最大气体底物浓度以确保液相中的CO(和/或CO₂和/或H₂)不成为限制。

此外，通常需要增加底物流中的CO(和/或CO₂和/或H₂)浓度(或CO(和/或CO₂和/或H₂)在气态底物中的分压)，从而提高CO(和/或CO₂和/或H₂)作为底物的发酵反应的效率。在增加的压力下操作可显著增加CO(和/或CO₂和/或H₂)从气相到液相的转移速率，在液相中其可被所述微生物作为碳源摄取用于产生一种或多种产物。这进而意味着，当生物反应器保持在升高的压力而非大气压力下时，能够减少保留时间(定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速)。最佳反应条件将部分地取决于所使用的本发明的具体微生物。但是，一般来说，优选所述发酵在高于环境压力的压力下进行。并且，因为给定的CO(和/或CO₂和/或H₂)到所述一种或多种产物的转化率部分地是所述底物保留时间的函数，并且实现所需保留时间反过来决定了所需生物反应器的体积，所以使用增压系统可大大地减少所需生物反应器的体积，从而减少所述发酵设备的资金成本。依据美国专利号5,593,886中给出的实例，反应器体积的减少与反应器操作压力的增加成线性比例，即在10个大气压下操作的生物反应器仅需要在1个大气压下操作的生物反应器体积的十分之一。

例如，已经描述了在升高的压力下进行气体到乙醇发酵的益处。例如，WO 02/08438描述了在30psig和75psig压力下进行的气体到乙醇的发酵，获得的乙醇产率分别为150g/l/天和369g/l/天。但是，发现在大气压下使用相似的培养基和输入气体组成进行的示例性发酵产生1/20到1/10的乙醇/升/天。

还合乎需要的是，含CO(和/或CO₂和/或H₂)的气态底物的引入速率为例如能够确保液相中的CO(和/或CO₂和/或H₂)浓度不成为限制。这是因为CO(和/或CO₂和/或H₂)受限条件的结果可能是所述一种或多种产物被所述培养物消耗。

用于进料至发酵反应的气流组成可对所述反应的效率和/或成本有显著影响。例如，O₂可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵之前或之后的发酵过程各阶段中，对不需要或不必要的气体的处理可增加这些阶段的负担(例如，当在气体流进入生物反应器之前将气体流压缩时，不必要的能量可能被用于压缩发酵过程中不需要的气体)。因此，可能需要处理底物流(尤其是来自工业来源的底物流)以除去不需要的组分并增加需要的组分的浓度。

在某些实施方案中，将本发明的微生物培养物维持在水性培养基中。优选地，所述水性培养基是基本厌氧微生物生长培养基。合适的培养基是本领域中已知的，记载于例如美国专利号5,173,429和5,593,886和WO 02/08438，并且记载于下文实施例部分。

在包含发酵含CO的底物的本发明的实施方案中，所述发酵包括以下步骤：使用本发明的重组微生物在生物反应器中厌氧发酵所述底物以产生所述一种或多种产物。

可使用该实施方案的方法来降低来自工业过程的总的大气碳排放。

在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：

(a)将含CO的底物提供给含有本发明的一种或多种微生物的培养物的生物反应器；和

(b)在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物以产生异丙醇、2,3-丁二醇、乙醇和2-丁醇中的一种或多种，和任选的一种或多种其他产物。

在另一个实施方案中，以上步骤b)中的一种或多种产物是乙偶姻、MEK、乙醛和丙酮，和任选的一种或多种其他产物。

在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：

在由工业生产过程产生的含CO的气体释放到大气中之前，将所述气体捕获；

通过本发明的培养物厌氧发酵含CO的气体以产生异丙醇、2,3-丁二醇、乙醇和2-丁醇中的一种或多种，和任选的一种或多种其他产物，所述培养物含有本发明的一种或多种微生物。

在另一个实施方案中，以上步骤b)中的一种或多种产物是乙偶姻、MEK、乙醛和丙酮，和任选的，一种或多种其他产物。

在本发明的一个实施方案中，被所述微生物发酵的气态底物是含CO的气态底物。所述气态底物可以是作为工业过程副产物或者从某些其他来源(例如汽车废气)获得的含CO的废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品制造例如钢铁厂、有色金属产品制造、石油精炼过程、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在这些实施方案中，可使用任意方便的方法在所述含CO的气体被排放到大气中之前从所述工业过程中将其捕获。所述CO可以是合成气(含一氧化碳和氢气的气体)的组分。从工业过程产生的CO通常被燃烧掉以产生CO₂，因此本发明在减少CO₂温室气体排放和产生用作生物燃料的丁醇方面尤其有用。根据所述含CO的气态底物的组成，还可能会需要对其进行处理，以在将其引入所述发酵之前除去任何不需要的杂质例如尘粒。例如，可使用已知的方法过滤或洗涤所述气态底物。

技术人员会很容易地理解用于使用含一种或多种碳水化合物的底物进行发酵的多种方法。但是，例如，可使用记载于以下中的所述方法：Vogel,H.C.,&Todaro,C.C.(2007).Fermentation and Biochemical Engineering Handbook:Principles,processdesign and equipment(ISBN:0-8155-1407-7)；Vogel,H.C.,&Todaro,C.C.(1996).Fermentation and Biochemical Engineering Handbook(ISBN:978-0-8155-1407-7)；Ezeji TC,Qureshi N,Blaschek HP(2005)Industrial relevant fermentations.InHandbook on Clostridia,ed Dürre P(CRC Press,Boca Raton,FL),pp 799–814。

产物回收

可通过本领域已知的方法(例如分馏或蒸发、渗透蒸发、气提和萃取发酵(包括例如液-液萃取))从所述发酵液中回收异丙醇、2,3-丁二醇、乙醇、2-丁醇、乙偶姻、MEK、乙醛和/或丙酮或者含有这些产物中的任意一种或多种和丙酮以及任选的一种或多种其它产物的混合流。

在本发明某些优选实施方案中，可通过以下方式从所述发酵液中回收所述一种或多种产物：从所述生物反应器连续移出部分发酵液，从所述发酵液中分离微生物细胞(方便地通过过滤)，并从所述发酵液中回收一种或多种产物。醇可通过例如蒸馏方便地回收。丙酮可通过例如蒸馏回收。所产生的任何酸可通过例如吸附到活性炭上来回收。优选地将分离的微生物细胞返回至所述发酵生物反应器。优选地将已除去任何的醇和酸后剩余的无细胞渗透物返回至所述发酵生物反应器。可在将所述无细胞渗透物返回至所述生物反应器之前将另外的营养物(例如B族维生素)加入到所述无细胞渗透物中以补充所述营养培养基。

同样地，如果如上所述调整所述发酵液的pH以增强乙酸到活性炭的吸附，那么应在将其返回至所述生物反应器之前将pH重新调整到与所述发酵生物反应器中发酵液相似的pH。

实施例

实施例1-对自产乙醇梭菌的野生型醇脱氢酶进行表征并对带有单个氨基酸置换的底物特异性范围进行表征

已经证明了梭属(包括杨氏梭菌(et al.,2010))中的一些种利用CO作为唯一碳源，并以乙醇作为终产物。所述细菌能够通过Wood-Ljungdahl途径固定CO并将其转化为乙酰-CoA。然后可将所述乙酰CoA的乙酰基部分用于多种代谢途径。这里特别值得注意的是可通过醇脱氢酶(ADH)将羧基基团还原成其对应的醇(et al.,2010)。这提供了将CO转化成具有商业价值的生物燃料和生化物质的途径。

自产乙醇梭菌DSM10061菌株的基因组测序鉴定出和之前表征的来自拜氏梭菌的酶具有86％同一性的ADH。来自该菌株的ADH能够利用乙醛作为其底物且产生乙醇作为终产物。所述ADH还能够催化丙酮还原成异丙醇。

异丙醇是比乙醇更具有经济价值的终产物，因为它可被脱水形成丙烯，丙烯可聚合成聚丙烯——一种常用的塑料(Inokuma et al.,2010)。形成丙烯的微生物途径会降低对石油的需求，目前大多数丙烯都来源自石油。

完成了诱变研究，目的是通过所述ADH酶提高异丙醇产生的效率。构建并测试了五种突变体：Ser199Asp、Ser199Glu、Arg200Gln、Arg200Glu和一个双突变体Ser199Glu/Arg200Gln。

材料

微生物和生长条件

从Invitrogen获得了大肠杆菌DH5α-E。该菌株的基因型是：F–80ΔlacZM15(lacZYA-argF)U169recA1endA1hsdR17(rk–,mk+)gal–phoA supE44–thi–1gyrA96relA1。

从Invitrogen获得了大肠杆菌LMG194。该菌株的基因型是：F-ΔlacX74galE thirpsLΔphoA(Pvu II)Δara714leu::Tn10。

从Coli Genetic Stock Centre获得了大肠杆菌MC1061。该菌株的基因型是：araD139Δ(araA-leu)7697Δ(lac)X74galK16galE15(GalS)lambda-e14-mcrA0relA1rpsL150(strR)spoT1mcrB1hsdR2。

从DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心，德国布伦瑞克，Inhoffenstraβe 7B,38124(The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig,Germany))获得了自产乙醇梭菌DSM10061。

从大卫·琼斯教授(Prof.David Jones)(奥塔哥大学)处获得了丙酮丁醇梭菌ATCC824和拜氏梭菌NCIMB8052，并且其还可分别以登录号ATCC824/DSM792和ATCC51743从公共菌株收藏中心DSMZ和ATCC获得。

在需氧条件下使用补充有氨苄青霉素(100μg/mL)或羧苄青霉素(50μg/mL)的Luria Burtani培养基培养所有大肠杆菌菌株。固体培养基含有1.5％的琼脂。除非另有说明，所有菌株在37℃下生长。

电穿孔后，使用SOC培养基(20g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10mM NaCl、2.5mMKCl和20mM葡萄糖)复苏大肠杆菌。

使用标准厌氧技术使自产乙醇梭菌在pH为5.6的PETC培养基(表1)中生长并使丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌在RCM培养基(表2)中生长(Hungate RE:A roll tube method forcultivation of strict anaerobes,in Norris JR and Ribbons DW(eds.),Methods inMicrobiology,vol.3B.Academic Press,New York,1969:117-132；Wolfe RS:Microbialformation of methane.Adv Microb Physiol 1971,6:107-146)。

表1：PECT培养基

培养基组分	浓度/1.0L培养基
		NH₄Cl	1g
KCl	0.1g
		MgSO₄.7H₂O	0.2g
NaCl	0.8g
		KH₂PO₄	0.1g
CaCl₂	0.02g
		微量金属溶液(见下文)	10ml
Wolfe’s维生素溶液(见下文)	10ml
		酵母提取物(任选)	1g
刃天青(2g/L储液)	0.5ml
		NaHCO₃	2g
还原剂	0.006-0.008％(v/v)
		果糖(用于异养生长)	5g

微量金属溶液	每L储液
		次氮基三乙酸	2g
MnSO₄.H2O	1g
		Fe(SO₄)₂(NH₄)₂.6H₂O	0.8g
CoCl₂.6H₂O	0.2g
		ZnSO₄.7H₂O	0.2mg
CuCl₂.2H₂O	0.02g
		NaMoO₄.2H₂O	0.02g
Na₂SeO₃	0.02g
		NiCl₂.6H₂O	0.02g
Na₂WO₄.2H₂O	0.02g
		还原剂储液	每100mL储液
NaOH	0.9g
		Cystein.HCl	4g
Na₂S	4g

表2：强化的梭菌培养基RCM(丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌)

ADH基因和蛋白

自产乙醇梭菌DSM10061的野生型ADH的氨基酸和核酸序列分别示于SEQ ID 36和SEQ ID 35。

引物

表3-用于扩增和定点诱变的寡核苷酸。

质粒

将pMTL85147-ThlA-CtfAB-Adc-Adh(图8)用于扩增自产乙醇梭菌DSM10061ADH基因。

使用标准重组DNA和分子克隆技术构建了质粒pMTL85147-ThlA-CtfAB-Adc-Adh(Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual,ColdSpring Harbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989；Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,Moore DD,Seidman JG,Smith JA,Struhl K:Current protocols inmolecular biology.John Wiley&Sons,Ltd.,Hoboken,1987)。从丙酮丁醇梭菌的基因组DNA扩增了ThlA基因(NC_003030.1；GI:1119056)，从拜氏梭菌扩增了基因adc-ctfAB-adc(NC_009617；区域：4,400,524-4,402,656；包括GI:5294994、GI:5294995和GI:5294996)，并从自产乙醇梭菌DSM10061扩增了adh基因(图5)和Wood-Ljungdahl启动子区域(SEQ ID39)。用于扩增的寡核苷酸序列在表4中给出。随后使用限制性位点NotI、NdeI、EcoRI、KpnI、BamHI、SalI、XhoI将所有扩增的片段克隆到质粒pMTL 85141中(FJ797651.1；NigelMinton,University of Nottingham,UK)[Heap JT,Pennington OJ,Cartman ST,MintonNP.A modular system for Clostridium shuttle plasmids.J MicrobiolMethods.2009,78:79-85]。最终质粒在SEQ ID 40中给出并已经对其进行测序以确保其不含突变。

使用Bertram和Dürre的改良方法(Conjugal transfer and expression ofstreptococcal transposons in Clostridium acetobutylicum.ArchMicrobiol1989,151:551-557)分离了丙酮丁醇梭菌ATCC824、拜氏梭菌NCIMB8052和自产乙醇梭菌DSM10061的基因组DNA。收集100-ml过夜培养物(6,000×g，15min，4℃)，将其用磷酸钾缓冲液(10mM，pH7.5)洗涤并悬浮于1.9ml STE缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，200mM蔗糖；pH 8.0)中。加入300μl溶菌酶(约100,000U)，将混合物在37℃下孵育30min，然后加入280μl的10％(w/v)SDS溶液并且再孵育10min。通过加入240μl的EDTA溶液(0.5M,pH 8)、20μl Tris-HCl(1M,pH 7.5)和10μl RNase A在室温下消化RNA。然后，加入100μl蛋白酶K(0.5U)并在37℃进行蛋白酶解1-3h。最后，加入600μl高氯酸钠(5M)，然后进行酚-氯仿提取和异丙醇沉淀。通过分光光度计测量法来检验DNA数量和质量。

表4：用于扩增丙酮生物合成基因和启动子区域的寡核苷酸

从Invitrogen获得了表达载体pBAD(KpnI)-WpiMetC。之前已经通过插入编码六组氨酸(His₆)标签的片段、TEV蛋白酶切割位点(如果需要的话，用于纯化后从ADH去除His₆)和编码来自不相关细菌(派毕梯斯沃巴契亚体(Wolbachia pipientis))的MetC酶的基因对本研究中使用的质粒进行了修饰。

方法

野生型ADH的扩增

使用引物ADH_TEV_KpnI_for和ADH_HindIII_Reverse从50ng/μl的质粒pMTL85147-ThlA-CtfAB-Adc-Adh(LZ)工作储液扩增了自产乙醇梭菌DSM10061的野生型ADH。

50μl PCR混合物的制备如下：

使用以下循环条件：

用Cycle Pure kit(Omega Bio-Tek)纯化所述产物。

载体和插入片段的消化：

通过使用以下配方，用酶KpnI-HF和HindIII消化pBAD(KpnI)-WpiMetC来制备pBAD骨架。

类似地，用KpnI-HF和HindIII消化所扩增的ADH基因。

两种消化都在37℃下进行16个小时。在用SYBRsafe(Invitrogen)染色的1％琼脂糖凝胶上分离所消化的产物。切下对应于消化载体和插入片段的条带并使用凝胶纯化试剂盒(Omega Bio-Tek)回收DNA。

pBAD(KpnI)-ADH的构建

在以下反应中将来自ADH和pBAD消化产物的纯化DNA进行连接，同时进行对照连接反应，所述反应含有相对于载体的3x摩尔过量的插入片段：

将所述反应体系在16℃下孵育2小时。通过电穿孔用2μL等份试样的连接混合物转化50μL等份试样的大肠杆菌MC1061细胞。在37℃下在SOC中复苏1小时后，将等份试样涂布到LB-氨苄青霉素平板上并在37℃下孵育过夜。挑取6个克隆并通过使用pBAD_for和ADH_HindIII_rev引物进行的PCR来筛选ADH插入片段的存在。用700μL培养物和300μL无菌的50％(v/v)甘油将成功克隆制成冷冻储液。通过DNA测序证实所述ADH基因的序列。

ADH的定点诱变

除了使用了其相应的诱变引物构建每种突变体之外，用于通过重叠延伸PCR构建所有5种突变体的方案都相同。因此，只提供了产生一种突变体的方案。

Ser199Asp第一步产物的产生

定点诱变的第一步是产生两种重叠的第一步产物。用于这些的PCR反应体系如下：

第一产物1.0：

第一产物1.1：

循环条件如下：

用Omega Cycle Pure kit纯化产物。

Ser199Asp第二产物的产生

定点诱变的第二步是通过使用外侧引物进行重叠延伸PCR(Ho SN,Hunt HD,Horton RM,Pullen JK,Pease LR.(1989)Site-directed mutagenesis by overlapextension using the polymerase chain reaction.Gene,77,51-59)，将所述两种第一产物重新结合成为全长的第二产物，所述第二产物含有具有引入突变的完整基因。将所述两种第一步产物混合以使它们处于相等摩尔浓度。使用了以下PCR配方：

循环条件和用于扩增野生型ADH的循环条件相同。

pBAD(KpnI)-ADH(Ser199Asp)的构建:

用于克隆所述五种ADH突变体(即，具有以下突变：Ser199Asp；Ser199Glu；Arg200Gln；Arg200Glu；和Ser199Glu/Arg200Gln)中的每一种的消化和连接方案和用于构建pBAD(KpnI)-ADH的方案相同。通过DNA测序确认了每种突变的存在。

ADH酶的表达和纯化

除非另有说明，所有突变体以及野生型的表达和纯化方案都是相同的。以下提供了用于表达和纯化所述野生型ADH的方案。

可溶性表达的测试:

使来自冷冻储液的5mL LB-氨苄青霉素过夜培养物在37℃下生长，并于第二天早上将其用于接种100mL LB-氨苄青霉素。在37℃下孵育所述培养物直至OD₆₀₀达到0.8。在该时间点，加入1mL的20％阿拉伯糖并将所述培养物在28℃下孵育以继续表达。在时间为0h、2h、4h和16h(即过夜)时取500μL样品。对于每一个样品，使细胞沉淀并倒出上清液。然后将所述沉淀重悬于HEPES缓和液(50mM Na-HEPES和0.2mM DTT,pH8.0)，并加入Benzonase(Merck,25units/μL)和rLysozyme(Merck,30kU/μL)各0.2μL。将所得混合物在室温下孵育15分钟，然后使其进行3次的冷冻(-80℃)和融化。在该时间点从每一种混合物中取出10μL作为“总蛋白”样品。将样品的剩余部分以13000rpm离心1分钟，移出上清液并将上清液置于冰上。从每一种混合物中取出10μL等份试样的上清液作为“可溶蛋白”样品。向每个10μL总蛋白和可溶蛋白样品中加入10μL SDS缓冲液，并将所有的混合物在98℃下加热5分钟。将15μL各等份试样上样到具有12％分离胶和4％浓缩胶的SDS-PAGE凝胶中。在200V下将凝胶运行40分钟。用考马斯亮蓝对凝胶进行过夜染色然后将凝胶脱色。

在表达结束时，将100mL培养物的剩余部分在50mL管中沉淀并冷冻保存在-80℃。

蛋白质纯化：

由于野生型和突变型ADH酶在它们的N-末端都携带His₆标签，因此其都可使用固定化金属亲和层析进行纯化。将上述冷冻的细胞片状沉淀(来自100mL培养物)重悬于10mL冰冷的裂解缓冲液(50mM磷酸钾、300mM NaCl、pH7.0)中，并加入0.5μl rLysozyme(30kU/μl)、0.5μl Benzonase(25U/μl)和50μl蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)。在冰上孵育30分钟后，通过超声裂解细胞，使不溶的碎片沉淀，并用0.2微米过滤器使上清液澄清。将所得澄清的上清液加入到已经用裂解缓冲液充分洗涤的Talon树脂(Clontech)中。使用500μL柱床体积纯化野生型ADH，并使用200μL柱床体积纯化每一种突变体。使所述蛋白在4℃下与Talon树脂结合1小时，然后将其用裂解缓冲液洗涤若干次。使用补充有150mM咪唑的裂解缓冲液将所述蛋白从柱子上洗脱下来，并且将所述洗脱液收集为500μL的级分。将在整个纯化过程的不同阶段取出的等份试样以及所有洗脱级分在SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳以确认所述蛋白的存在和确定纯化成功。使用Amicon Ultra-4Centrifugal Filter Units(Millipore)将蛋白交换到储存缓冲液(50mM磷酸钾、150mM NaCl、10％v/v甘油、pH7.0)中。

当在大肠杆菌中表达时，所述野生型蛋白是高度可溶的，并且可被很容易地纯化(图1)。所述Ser199Asp和Arg200Gln突变型蛋白也是高度可溶的(图2)。其他两种点突变体(Ser199Glu和Arg200Glu)的溶解度更易变(结果未显示)。稍令人吃惊的是，所述双突变体(Ser199Glu+Arg200Gln)比Ser199Glu更可溶(结果未显示)。

所述Ser199Asp突变体的序列在SEQ ID 37(核酸)和SEQ ID 38(氨基酸)中提供。

活性测定

使用Cary 100UV/vis分光光度计用石英比色杯进行所有的活性测定。实验中使用的所有化学药品源自Sigma-Aldrich。

除非另有说明，测定中的辅因子(NADPH/NADH)浓度为0.2mM、底物(乙醛、乙酰-CoA、丙酮、DL-乙偶姻、MEK)浓度为3mM，ADH浓度为30nM。在含有1mM DTT的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中进行这些测定。所有测定都使用新鲜制备的底物和辅因子进行三次。

首先，测量了自产乙醇梭菌的野生型酶，并且证明了如针对拜氏梭菌的醇脱氢酶所记载的(Ismaiel,Zhu,Colby,&Chen,1993)，该酶是严格NADPH依赖性的，使用NADH时几乎没有可检测的活性(图11)。

之后，测定所纯化的自产乙醇梭菌DSM10061的野生型酶的动力学(图12)，作为评估具有置换的突变型酶的基准(图9)。可使用一些发酵途径中重要的酮(丙酮、MEK、乙偶姻)和醛(乙醛)检测活性(图14)。

随后，对产生的突变型醇脱氢酶进行测定，并将其与野生型酶进行比较。由于没有可溶性蛋白，因此不能对Ser199Glu突变体进行测定。对粗细胞裂解物的测定表明其没有ADH活性。虽然Arg200Gln突变体可溶，但是其也没有表现出可检测的活性。不出所料，结合所述两种突变的突变体——Ser199Glu+Arg200Gln——也没有活性。当底物浓度增加到5倍(到15mM)和酶浓度增加到6倍(到180nM)时，在三种剩余的蛋白质中，只有Arg200Glu的活性是可测量的。

另一方面，Ser199Asp突变体对丙酮的活性与野生型对丙酮的活性几乎相同(图3)。最有意思的是，Ser199Asp突变体对丙酮具有更强的特异性(图4)。这表明用Ser199Asp突变体替换野生型ADH可能导致异丙醇产生的增加。如实施例2所述，该突变体是用于进一步置换的基础。

实施例2–具有多种氨基酸置换的底物和辅因子特异性的改变

基于实施例1的结果，本发明人产生和研究了带有1到4个氨基酸置换的其他8种醇脱氢酶突变体的活性：

材料

引物

表5：用于Quikchange诱变的寡核苷酸

质粒

通过DNA2.0合成突变体7的基因序列。对该序列进行密码子优化以在大肠杆菌中表达所述蛋白。在质粒pJ201中提供所述合成的基因。该序列包含用于将突变体7ADH基因亚克隆到表达载体pBAD(KpnI)-ADH中的HindIII和KpnI酶切位点。

方法

突变体7表达质粒的构建

通过使用限制性酶KpnI-HF和HindIII-HF消化pBAD(KpnI)-ADH制备pBAD骨架。

类似地使用限制性酶KpnI-HF和HindIII-HF从pJ201载体上消化所述突变体7基因。

在用SYBRsafe(Invitrogen)染色的1％琼脂糖凝胶上分离所消化的产物。切下对应于消化的载体和插入片段的条带并使用凝胶纯化试剂盒(Omega Bio-Tek)回收DNA。

根据生产商的标准方案使用T4DNA连接酶(NEB)以摩尔比为3:1的插入片段和载体将所纯化的插入片段和载体DNA进行连接。

通过电穿孔用连接混合物转化大肠杆菌MC1061细胞。将转化细胞的等份试样涂布在LB-氨苄青霉素平板上并在37℃下过夜孵育。挑取单克隆。纯化所得的表达质粒，并通过DNA测序确认了突变体7基因的序列。将成功的克隆制成冷冻储液。

ADH的Quikchange诱变

用于构建突变体8、9、10、11和12的模板DNA为pBAD(KpnI)-突变体7ADH。用于构建突变体13的模板DNA为pBAD(KpnI)-ADH。除了不同的模板DNA和相应的诱变引物之外，用于构建突变体8-13的方案相同。使用来自Stratagene的Quikchange II定点诱变试剂盒并使用其标准的推荐的方案构建每一种突变体。用于构建每一种突变体的正向和反向引物在表5中列出。

用Quikchange诱变反应的产物通过热激转化化学感受态大肠杆菌XL1-Blue细胞。挑取单克隆。纯化所得的表达质粒，并通过DNA测序确认每一种突变基因的序列。将每个成功的克隆制成冷冻储液。

蛋白质表达和纯化

用突变体2、7、10、11的表达载体转化已经在先用质粒pGro7(Takara Bio,Inc.)转化的大肠杆菌LMG194。该质粒促进阿拉伯糖诱导的GroEL/ES分子伴侣蛋白的表达。用突变体13的表达载体转化大肠杆菌LMG194。

通过加入L-阿拉伯糖到终浓度为0.2％(w/v)，在对数中期培养物(OD600≈0.5)中诱导每种ADH突变体的表达。将所述培养物在28℃下再孵育5小时。通过离心收集细胞并将所得片状沉淀储存在-80℃。将每种片状沉淀重悬于10mL的裂解缓冲液(50mM磷酸钾、300mMNaCl、pH7.0)中。加入蛋白酶抑制剂混合物(150μL)、Benzonase核酸酶(37.5U)和溶菌酶(0.2mg.mL^-1，终浓度)。在4℃下孵育20分钟后，通过在冰上超声裂解细胞，并通过离心(21,000g、4℃、30分钟)使所述裂解物澄清。将所述澄清的裂解物与500μL Talon金属亲和树脂(50％w/v浆体)混合并在4℃下将所得混合物温和搅拌1小时以使得带His₆标签的ADH蛋白结合到树脂上。在将所述树脂转移到重力流柱上之前，用裂解缓冲液对其进行多次洗涤。对于突变体7、8、9、10和12的纯化，在该洗脱步骤中包括5mM ATP/MgCl₂以便于除去伴侣蛋白。用分别含有5mM咪唑和10mM咪唑的10个柱床体积的裂解缓冲液进一步洗涤以后，用5个柱床体积的洗脱缓冲液(50mM磷酸钾、300mM NaCl、150mM咪唑、pH7.0)洗脱每种纯化的蛋白。使用Amicon Ultra离心过滤装置(截留分子量为10kDa；Merck Millipore,Billerica,MA)将所纯化的蛋白交换到储存缓冲液中(50mM磷酸钾、150mM NaCl、10％(v/v)甘油、pH7.5)。通过无菌0.22μm过滤器(Millex-GV；Millipore)过滤去除聚集物。由SDS-PAGE判断出每种蛋白的纯度为>90％。通过测量A₂₈₀(使用根据Pace,Vajdos et al.1995计算的消光系数)对ADH浓度进行定量。将所述纯化蛋白的等份试样储存在-80℃。活性测定证实了这些储存条件以及冷冻/融化循环不导致活性的任何损失。

如图5所示，当在带有所述pGro7质粒的大肠杆菌中表达时，突变体2、7和11都是高度可溶的。突变体10的可溶蛋白的产量比其他变体低。突变体8、9和12是完全不溶的，即使与pGro7共表达时。突变体13是高度可溶的，并且可在与所述野生型ADH蛋白相同的条件下大量产生。

活性测定

基于之前描述的方法(Ismaiel,Zhu et al.1993)，使用分光光度测定法来测定野生型和突变型ADH的活性。通过监测与NADPH或NADH氧化相关的340nm处吸光度的降低而对活性进行定量(ε₃₄₀＝6,220M^-1.cm^-1)。在25℃下使用带有Peltier温度控制器的Cary100UV-Vis分光光度计测量稳态动力学参数。所述标准测定混合物含有50mM Tris-HCl、1mMDTT、pH7.5，并具有0.2mM的辅因子(NADPH或NADH)。用5mM的底物浓度测量起始反应速率。进行三次平行测量并针对背景进行校正。辅因子NADH和NADPH以及底物丙酮、乙偶姻、MEK源自Sigma-Aldrich。由于没有商业来源，如下所述纯化D-乙偶姻。

总的来说，使用NADH作为辅因子时，突变体11具有最高的活性(图6)。突变体11的辅因子的使用(和野生型ADH相比)完全转换；使用NADPH时突变体11没有可检测的活性。

突变体11具有4个突变(G198D、S199V、P201E、Y218A)。所有4个突变对于观察到的辅因子使用的转换都是必需的。Y218A突变的加入对于使用NADH时的活性是必需的，但是单独的该突变(即，突变体13)对辅因子偏好没有影响。这可能在如图14所示的产生异丙醇、2,3-丁二醇、2-丁醇和乙醇的发酵途径中具有重要的优势。

如图7所示，一些突变体也对丙酮比对更大的底物(乙偶姻和MEK)或更小的底物(乙醛)具有更高的特异性。所有的突变体(2、7、10和11)对丙酮比对MEK具有增强的底物特异性。突变体2、10和11对丙酮比对乙醛和比对乙偶姻具有增强的底物特异性。

如图8所示，一些突变体也对MEK比对更大的底物(乙偶姻)或更小的底物(乙醛)具有更高的特异性。突变体2、10和11对MEK比对乙醛和比对乙偶姻具有增强的底物特异性。

如图9所示，一些突变体也对乙醛比对更大的底物(丙酮、乙偶姻和MEK)具有更高的特异性。突变体7对乙醛比对丙酮和比对MEK具有增强的底物特异性。突变体2、10和11对乙醛比对乙偶姻具有增强的底物特异性。

如图10所示，一些突变体也对乙偶姻比对更小的底物(丙酮、乙偶姻和MEK)具有更高的特异性。突变体7对乙偶姻比对丙酮和比对MEK具有增强的底物特异性。突变体7和11对乙偶姻比对乙醛具有增强的底物特异性。突变体10对乙偶姻没有活性，然而其对其他底物丙酮、MEK和乙醛仍然具有活性。

总之，如图7-10所示的结果表明：

-突变体21)对丙酮比对MEK、乙醛和乙偶姻，2)对MEK比对乙醛和乙偶姻具有增强的底物特异性。

-突变体71)对丙酮比对MEK，2)对乙醛比对MEK、丙酮和乙偶姻，3)对乙偶姻比对丙酮和MEK具有增强的底物特异性。

-突变体111)对丙酮比对MEK、乙醛和乙偶姻，2)对MEK比对乙醛和乙偶姻，3)对乙偶姻比对乙醛具有增强的底物特异性；和，

-突变体101)对丙酮比对MEK、乙醛和乙偶姻，2)对MEK比对乙醛和乙偶姻，3)对乙醛比对乙偶姻具有增强的底物特异性。这可能在图14所示的产生异丙醇、2，3-丁二醇、2-丁醇和乙醇的发酵途径中具有重要的优势。

D-乙偶姻的纯化

D-乙偶姻(或(S)-乙偶姻)的对映选择性合成：按照描述通过D-(-)-2,3-丁二醇的区域选择性控制的单氧化合成D-乙偶姻(D’Accoloti et al.1993J.Org.Chem.58:3600-1)。根据对之前报道的方法的改良，新鲜制备必需的二甲基双环氧乙烷(DMDO)-丙酮溶液，随后通过碘量滴定法对其进行滴定。

DMDO-丙酮溶液的产生：在一个1000mL 3-颈圆底烧瓶安装上一个气体适配器和一个二口蒸馏头(double distillation head)，所述二口蒸馏头连接一个真空适配接收器(vacuum adapted receiver)。将最后的接合点用塞子塞住并用于添加试剂。将圆底烧瓶固定在接收端并在丙酮-干冰浴中将其冷却到-78℃。与所述真空适配接收器排成一行的是一个用冰盐(salted ice)冷却到-20℃的指型冷凝管，在其后连接一个-196℃的液氮指型冷阱。

将大的椭圆形搅拌子、水(220mL)、丙酮(160mL)和碳酸氢钠(120.063g)加入到反应容器中。在0℃时开始剧烈搅拌，同时用氮气吹扫，在以3分钟的间隔分5部分加入固态臭氧(250.047g)的过程中继续该操作。表现出较强的泡腾现象(effervescence)，因此控制臭氧加入的速率以控制该现象。在加入第二部分臭氧以后，白色浆体上面的无色溶液呈现出粉红色。在全部加入臭氧后继续搅拌15分钟。在泡腾沉降时，施加微真空(900mbar)，在监测泡腾现象的同时将真空缓慢提高到约450mbar。在逐步施加真空过程中，将浅黄色溶液收集到冷却接收器中。收集到约100mL DMDO-丙酮溶液后，用饱和的Na₂S₂O₃溶液终止反应并将所得产物恢复到室温。

DMDO的碘滴定：将新鲜蒸馏的DMDO的丙酮溶液(1.00mL)用移液到乙酸-丙酮溶液(2mL，3:2)中。然后加入饱和碘化钾水溶液(2.0mL)，并加入干冰以去除溶液中的空气。在室温下允许其混合同时储存于黑暗中10分钟。用水(5mL)稀释所述混合物，并以1％淀粉溶液为终点指示剂，用Na₂S₂O₃(0.00099mol/L)水溶液滴定所述混合物，得到浓度为29.9mM。然后将烧瓶密封并储存在-18℃。

(R,R)-2,3-丁二醇的DMDO氧化。按照文献(D’Accoloti et al.1993J.Org.Chem.58:3600-1)报道的方法进行了D-(-)-2,3-丁二醇至(R)-3-羟基丁酮的单氧化。

实施例3-在使用优化的醇脱氢酶的一氧化碳营养菌中相对于乙醇优选产生2,3- 丁二醇

已经证明一氧化碳营养型生物自产乙醇梭菌从CO产生乙醇和2,3-丁二醇(et al.,2011)(图14)。如实施例1所证明的，在自产乙醇梭菌中存在醇脱氢酶，该酶催化乙醇和2,3-丁二醇途径中的最后一步——分别为乙醛到乙醇的反应和乙偶姻到2,3-丁二醇的反应(图14)。所述野生型酶对乙醛的活性比对乙偶姻的活性高(图12)，这导致了在用自产乙醇梭菌DSM10061发酵时相对于2,3-丁二醇，乙醇是主要产物(et al.,2011)。在实施例2中，使用氨基酸置换G198E、S199V、P201E产生了醇脱氢酶突变体(突变体7)，该突变体对乙偶姻比对乙醛具有提高的底物特异性(图7)。与野生型酶相比，该酶优选使用乙偶姻而非乙醛，该酶可用于使得与野生型菌株相比2,3-丁二醇产生相对于乙醇产生增加。

使用NdeI和EcoRI位点将突变型醇脱氢酶的基因(Seq.ID 41)克隆到携带铁氧还蛋白启动子的pMTL85353穿梭载体(Heap,Pennington,Cartman,&Minton,2009)中。然后将所述构建体甲基化，并按照US 2012/0252083、WO/2012/115527所述的通过电穿孔将所述构建体转化到自产乙醇梭菌中。挑取甲砜霉素抗性克隆并使其在5mL液体培养基中生长。通过PCR验证转化的培养物并进行发酵实验。当将代谢终产物与自产乙醇梭菌的野生型相比时，携带所述突变型醇脱氢酶的菌株将具有增大的2,3-丁二醇:乙醇比率。

与此类似，可使用相同的质粒并用所述醇脱氢酶突变体修饰其他产乙酸菌株(如杨氏梭菌)。电穿孔已经被记载用于一些一氧化碳营养型产乙酸菌，如杨氏梭菌(etal.2010,Poc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.107:13087-92；(Leang,Ueki,&Lovley,2011)PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)、伍氏醋酸杆菌(Straetz et al.,1994,Appl.Environ.Microbiol.60:1033-37)和热醋穆尔氏菌(Kita et al.,2012)。自产乙醇梭菌、杨氏梭菌和其他产乙酸菌株能够产生乙醇和2,3-丁二醇(et al.2011)。通过表达所述突变型醇脱氢酶，可提高有利于2,3-丁二醇的比率。

实施例4-在使用优化的醇脱氢酶的一氧化碳营养菌中相对于2,3-丁二醇优选产生乙醇

如实施例3所述，自产乙醇梭菌能够从CO产生乙醇和2,3-丁二醇(图14)。但是，对于一些过程，为了保持低的生产过程(例如分离)成本只产生单种产物可能是有利的。通常，这可通过使所述途径中的一种途径中的酶失活来实现。但是，在催化多种途径中的反应的多功能酶的情况下，不能使用该策略，催化乙醛还原成乙醇和催化乙偶姻还原成2,3-丁二醇的自产乙醇梭菌的醇脱氢酶也是这种情况。本发明给出了替代的方法以实现，例如，产生乙醇而同时产生降低水平的2,3-丁二醇或不产生2,3-丁二醇。在实施例2中，使用氨基酸置换G198D、S199V、P201E、Y218F产生醇脱氢酶突变体(突变体10)，该突变体丧失了还原乙偶姻的能力，但是仍然对乙醛有活性(图7)。将该突变型醇脱氢酶的基因(Seq.ID 47)连同所述醇脱氢酶的侧翼区一起克隆到载体中以使得能够进行双同源交换整合(用突变型醇脱氢酶替代野生型)。使用自产乙醇梭菌DSM23693基因组DNA PCR扩增SecAdh基因的1kb5’(Seq.ID.55)和3’(Seq.ID.56)同源臂。分别使用引物Sec5f(attcatcctgcaggACAGTTAAAAAGCATATCTAACAGT(SEQ ID 57))/Sec5r(gactgcggccgcTAAATATATAAGCAAATGTTGTGCC(SEQID58))和Sec3f(atatgctagCGTATTTTTAATTGCGAACTTAAGA(SEQ ID59))/Sec3r(gactggcgcgcCAGTTAAAGTTAGACATCCGATTAT(SEQ ID 60))扩增所述5’和3’同源臂。将所得两种PCR产物克隆到pMTL85151质粒的SbfI/NotI和NheI/AscI位点之间以得到pMTL85151-SecAdh-KO。如上所述转化所述载体。在甲砜霉素平板上选择后，使用位于所述同源臂侧翼的引物SecOf(TTGGAATTTTAGCTGTAGATAACAA(SEQ ID 61))和SecOr(TAAGTGATTTTCAATGGACTTTACT(SEQ ID 62))筛选野生型醇脱氢酶被突变型醇脱氢酶置换了的转化体。测序确认后，进行发酵实验，证实产生了乙醇并同时产生降低的2,3-丁二醇或不产生2,3-丁二醇。在自产乙醇梭菌中，存在对丁二醇具有活性的第二种酶，在某些条件下可将该酶敲除以完全除去2,3丁二醇的产生。

与此类似，可使用相同的质粒并用所述醇脱氢酶突变体修饰其他产2,3-丁二醇的产乙酸菌株如杨氏梭菌和拉氏梭菌。已经记载了电穿孔以及用于双同源交换的方法可用于杨氏梭菌(et al.2010,Poc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.107:13087-92；(Leang et al.,2011))。

实施例5-在使用优化的醇脱氢酶的一氧化碳营养菌中产生异丙醇

已经通过引入丙酮生物合成基因对自产乙醇梭菌进行了修饰，以依赖于所述野生型醇脱氢酶从CO产生异丙醇(US 2012/0252083、WO/2012/115527)。为了提高生产，可引入实施例2中产生的含有置换G198D、S199V、P201E、Y218A的对丙酮高度特异性的突变型醇脱氢酶(突变体11)。通过SalI/XhoI限制性位点将所述突变型醇脱氢酶基因(Seq.ID 53)克隆到丙酮生物合成质粒(Seq.ID 40)中。然后如上文所述将所述质粒转化到自产乙醇梭菌中。用所述转化培养物进行的发酵实验将表现出异丙醇产生的增加，其中所有丙酮都被转化成异丙醇。除了对丙酮具有增强的特异性之外，所述生物还将NADPH和NADH用于异丙醇合成，使得能够使用两种池。

与此类似，可使用相同的质粒并用所述醇脱氢酶突变体修饰其他产乙酸菌株如杨氏梭菌。已经记载了电穿孔用于一些一氧化碳营养型产乙酸菌如杨氏梭菌(etal.2010,Poc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.107:13087-92；(Leang,Ueki,&Lovley,2011)PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)、伍氏醋酸杆菌(Straetz et al.,1994,Appl.Environ.Microbiol.60:1033-37)和热醋穆尔氏菌(Kita et al.,2012))。与自产乙醇梭菌相同，杨氏梭菌和其他产乙酸菌株能够产生乙醇和2,3-丁二醇(etal.2011)。通过表达所述突变型醇脱氢酶，可提高有利于2,3-丁二醇的比率。

实施例6-在使用优化的醇脱氢酶的ABE生物中产生异丙醇

已经证明可使用来自拜氏梭菌的仲醇脱氢酶对丙酮丁醇梭菌进行代谢改造以产生异丙醇，但是所报道的结果显示只有较低的异丙醇水平，以及未转化为异丙醇的残留丙酮[Lee et al,2012:Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicumATCC824for isopropanol-butanol-ethanol fermentation,Appl.Environ.Microbiol.78:1416-1423]。为了改进该方法，需要优化的醇脱氢酶来克服该限制。

在实施例2中，使用置换G198D、S199V、P201E、Y218A产生了优化的突变型醇脱氢酶(突变体11)，该突变型醇脱氢酶对乙偶姻具有高度的特异性并且能够使用在丙酮丁醇梭菌中比NADPH更丰富的NADH。使用NdeI和EcoRI位点将所述突变型醇脱氢酶基因(Seq.ID53)克隆到携带强丙酮丁醇梭菌硫解酶启动子的pMTL85354穿梭载体中(Heap et al.,2009)。如Mermelstein&Papoutsakis,1993中所述，然后使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)噬菌体甲基转移酶对所述质粒进行体内甲基化，并将其转化到丙酮丁醇梭菌中。在使用所述转化培养物进行的发酵中，所有乙偶姻都被高度特异地转化成异丙醇。

实施例7-在使用优化的醇脱氢酶的大肠杆菌中产生异丙醇

在一些研究中大肠杆菌已经成为用于产生异丙醇的靶标[Hanai T et al(2007)Engineered synthetic pathway for isopropanol production in Escherichiacoli.Applied and environmental microbiology 73:7814–8；Inokuma K et al(2010)Improvement of isopropanol production by metabolically engineered Escherichiacoli using gas stripping.Journal of bioscience and bioengineering 110:696–701；Jojima T et al(2008)Production of isopropanol by metabolically engineeredEscherichia coli.Applied microbiology and biotechnology 77:1219–24]。但是，所有研究都使用了来自拜氏梭菌的完全相同的未经优化的醇脱氢酶，由于该酶的低特异性和NADPH依赖性而限制了异丙醇的产生。由于在所有研究中丙酮不能被足够有效地还原成异丙醇而作为副产物积累，因此这变得特别明显。在大肠杆菌中，所述NADH池比所述NADPH池大几倍(Bennett&San,2009)。

在实施例2中，使用置换G198D、S199V、P201E、Y218A产生了优化的突变型醇脱氢酶(突变体11)，该突变型醇脱氢酶对乙偶姻具有高度特异性并且能够使用NADH。使用本领域中使用的标准技术对大肠杆菌进行改造以包含该突变型醇脱氢酶。和野生型生物相比，所得重组大肠杆菌具有增加的异丙醇产生。

实施例8-在使用优化的醇脱氢酶的酵母酿酒酵母中产生2-丁醇

除了乙醇之外，酵母酿酒酵母的一些菌株还能够产生高水平的乙偶姻(Romano,Suzzi,Mortimer,&Polsinelli,1995)。可通过实施例1中描述的自产乙醇梭菌的醇脱氢酶的作用将D-乙偶姻(或(S)-乙偶姻)转化为内消旋-2,3-丁二醇。已经描述了用例如产气乳杆菌(A.aerogenes)(Toraya T,Shirakashi T,Kosuga T,1976)或肺炎克雷伯氏菌(Bachovchin,Eagar,Moore,&Richards,1977)的二醇脱水酶将内消旋-2,3-丁二醇转化为MEK。然后可使用实施例1描述的自产乙醇梭菌的醇脱氢酶将MEK再转化为2-丁醇(图14)。但是，由于所述醇脱氢酶也对乙醇有活性，因此需要这样一种酶，该酶对乙醛到乙醇的转化只具有低的活性但是对乙偶姻到2,3-丁二醇的转化和MEK到2-丁醇的转化具有相对更高的活性。实施例2的突变体11恰好具有这些特性并且使用NADH作为辅因子，这在酵母中有利的。

如Steen et al.,2008所述，在诱导型酵母启动子GAL1/10下将突变体11(Seq.ID50)的密码子优化的基因和密码子优化的来自肺炎克雷伯氏菌的二醇脱水酶(YP_002236782；YP_002236783；YP_002236784)的基因克隆到适合的载体中。如Gietz RW:RAGuide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology.Part B.San Diego,CA:Academic Press Inc；2002:87-96所述，使用乙酸锂方法进行所有酿酒酵母菌株的转化。成功转化和验证后，在30℃下在丰富的YPD培养基中进行使用酿酒酵母的发酵，以2-丁醇和低水平的乙醇为产物。

本文已参照某些优选实施方案描述了本发明，以使得读者无需过多实验即可实施本发明。但是，本领域普通技术人员应容易地认识到，可将许多组分和参数作一定程度的变化或修改或者替换为已知的等价物，而不背离本发明范围。应理解，这样的修改和等价物如同单独提出一样被纳入本文。提供名称、标题等的目的是增强读者对本文的理解，而不应当被解读为是限制本发明的范围。

上下文引用的所有申请、专利和出版物的全部公开内容(如果有的话)都以引用的方式纳入本文。但是，在此说明书中对任何申请、专利和出版物的引用都不是也不应被看作是承认或以任何形式暗示它们组成有效的现有技术或在世界上任何国家中构成公共常识的一部分。

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Claims

1.一种醇脱氢酶，其中所述醇脱氢酶的序列为SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:66。

2.一种核酸，其编码权利要求1的醇脱氢酶。

3.权利要求2的核酸，其中所述核酸的序列为SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:70。

4.一种核酸载体，其包含权利要求2或3的核酸。

5.一种宿主细胞，其包含权利要求2或3的核酸或权利要求4的核酸载体。

6.一种重组微生物，其包含一种或多种权利要求2或3的核酸或权利要求4的核酸载体，其中所述微生物能够通过发酵产生一种或多种选自异丙醇、2,3-丁二醇、乙醇、2-丁醇的产物和任选的一种或多种其他产物。

7.一种重组微生物，其包含一种或多种权利要求2或3的核酸或权利要求4的核酸载体，其中所述微生物能够通过发酵产生一种或多种选自乙偶姻、MEK、乙醛、丙酮的产物和任选的一种或多种其他产物。

8.权利要求7的重组微生物，其中所述微生物选自细菌、古细菌和真菌。

9.权利要求8的重组微生物，其中所述微生物是选自如下的一氧化碳营养型产乙酸菌：自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、科斯卡塔梭菌(Clostridium coskatii)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、大梭菌(Clostridiummagnum)、梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)、淤泥丁酸杆菌(Butyribacterium limosum)、甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculum bacchii)、Blautia producta、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermautotrophica)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)和凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kiuvi)。

10.权利要求8的重组微生物，其中所述微生物是选自如下的ABE发酵微生物：丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、糖丁酸梭菌(Clostridium saccharobutylicum)和糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)。

11.权利要求8的重组微生物，其中所述微生物选自：大肠杆菌(Eschericia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxtoca)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

12.一种通过使用权利要求6-11中任一项的微生物来对底物进行微生物发酵以产生异丙醇、2,3-丁二醇、乙醇、2-丁醇、乙偶姻、MEK、乙醛和丙酮中的一种或多种和任选的一种或多种其他产物的方法。

13.权利要求12的方法，所述方法至少包括以下步骤:

(a)将底物提供给含有权利要求6-12中任一项的一种或多种微生物的培养物的生物反应器；和

(b)在所述生物反应器中发酵所述培养物以产生所述一种或多种产物。

14.权利要求12或13的方法，其中所述底物选自包含CO、CO₂和H₂中的一种或多种的底物和/或包含一种或多种碳水化合物的底物。

15.权利要求14的方法，其中所述底物包含含有CO的底物并且所述方法包括以下步骤：

(a)在由工业生产过程产生的含CO的气体释放到大气中之前，将所述气体捕获；

(b)通过培养物厌氧发酵所述含CO的气体以产生所述一种或多种产物，其中所述培养物含有一种或多种一氧化碳营养型产乙酸微生物。