CN102459569A - 脂肪酸衍生物的产生 - Google Patents

脂肪酸衍生物的产生 Download PDF

Info

Publication number
CN102459569A
CN102459569A CN2010800247220A CN201080024722A CN102459569A CN 102459569 A CN102459569 A CN 102459569A CN 2010800247220 A CN2010800247220 A CN 2010800247220A CN 201080024722 A CN201080024722 A CN 201080024722A CN 102459569 A CN102459569 A CN 102459569A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
gene
ester
fatty acid
fatty
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2010800247220A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102459569B (zh
Inventor
阿尔弗雷德·盖尔特纳
安德里亚斯·席尔默
费尔南科·瓦勒
斯蒂芬·德尔·卡德耶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genomatica Inc
Original Assignee
LS9 Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LS9 Inc filed Critical LS9 Inc
Priority claimed from PCT/US2010/030656 external-priority patent/WO2010118410A1/en
Publication of CN102459569A publication Critical patent/CN102459569A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102459569B publication Critical patent/CN102459569B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
    • C10L1/02—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only
    • C10L1/026—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only for compression ignition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/649—Biodiesel, i.e. fatty acid alkyl esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2200/00—Components of fuel compositions
    • C10L2200/04—Organic compounds
    • C10L2200/0461—Fractions defined by their origin
    • C10L2200/0469—Renewables or materials of biological origin
    • C10L2200/0476—Biodiesel, i.e. defined lower alkyl esters of fatty acids first generation biodiesel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2270/00—Specifically adapted fuels
    • C10L2270/02—Specifically adapted fuels for internal combustion engines
    • C10L2270/026—Specifically adapted fuels for internal combustion engines for diesel engines, e.g. automobiles, stationary, marine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2290/00—Fuel preparation or upgrading, processes or apparatus therefore, comprising specific process steps or apparatus units
    • C10L2290/26—Composting, fermenting or anaerobic digestion fuel components or materials from which fuels are prepared
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P30/00—Technologies relating to oil refining and petrochemical industry
    • Y02P30/20—Technologies relating to oil refining and petrochemical industry using bio-feedstock

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Liquid Carbonaceous Fuels (AREA)

Abstract

描述了用于产生诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法和组合物。

Description

脂肪酸衍生物的产生
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年4月10日提交的美国临时申请号61/168,293、于2009年7月20日提交的美国临时申请号61/266,749、于2009年7月20日提交的美国临时申请号61/227,025和于2009年11月19日提交的美国临时申请号61/262,544的权益，特此将每篇申请的全部内容通过引用并入本文。
发明背景
石油是地球上发现的、液体、气体或固体形式的有限的天然资源。石油主要由碳氢化合物组成，碳氢化合物主要由碳和氢组成。石油还含有大量的处于不同形式的其他元素，例如氮、氧或硫。
石油是宝贵资源，但是以相当大的金融和环境代价对石油产品进行开发。首先，必须发现石油资源。石油勘探是耗资并有风险的投资。勘探深水井的费用可以超过1亿美元。除经济费用外，石油勘探带来严重的环境代价。例如近海勘探扰乱周围海洋环境。
发现生产井后，必须以巨大代价从地球开采石油。即使在最佳条件下，仅可以开采50％的井中石油。石油开采还带来环境代价。例如，石油开采可以导致大量石油渗漏上升至表面。近海钻井涉及挖掘河床，这扰乱或破坏周围海洋环境。
开采后，必须将石油从石油产生区长距离运输到石油消耗区。除运输费用外，还存在大规模油泄漏的环境风险。
从地球开采的原油在天然形式时商业用途较少。其是具有不同长度和复杂性的碳氢化合物(例如，石蜡(或烷)、烯烃(或烯)、炔、环烷(napthenes)(或环烷(cylcoalkanes))、脂肪族化合物、芳香族化合物等)的混合物。此外，原油含有其他有机化合物(例如含有氮、氧、硫等的有机化合物)和杂质(例如硫磺、盐、酸、金属等)。
因此，在商业上可以使用前，必须提炼并纯化原油。由于其高能量密度及其便利的可运输性，大部分石油被提炼为燃料，例如运输燃料(例如汽油、柴油、航空燃料等)、燃用油、液化石油气等。
原油还是用于产生石化产品的原材料的主要来源。两类主要的来自石油的原材料是短链烯烃(例如乙烯和丙烯)和芳香族化合物(例如苯和二甲苯异构体)。这些原材料来源于原油中较长链的碳氢化合物，这是通过以相当大的费用使用各种方法裂化长链碳氢化合物来产生的，例如催化裂化、蒸汽裂化或催化重整，裂化原油。这些原材料用于制造不能直接从原油提炼的石化产品，例如单体、溶剂、去垢剂或粘合剂。
来源于原油的原材料的一个实例是乙烯。乙烯被用于生产石化产品，例如聚乙烯、乙醇、氧化乙烯、乙二醇、聚酯、乙二醇醚、乙氧基化物、乙酸乙烯酯、1，2-二氯乙烷、三氯乙烯、四氯乙烯、氯乙烯和聚氯乙烯。来源于原油的原材料的另一个实例是丙烯。丙烯用于生产异丙醇、丙烯腈、聚丙烯、氧化丙烯、丙烯二醇、乙二醇醚、丁烯、异丁烯、1，3-丁二烯、合成橡胶、聚烯烃、α-烯烃、脂肪醇、丙烯酸、丙烯聚合物、氯化丙烯、环氧氯丙烷和环氧树脂。
石化产品可以用于制造特种化学品，例如塑料、树脂、纤维、橡胶、药品、润滑剂或凝胶。可以产自石化原材料的特种化学品的实例为：脂肪酸、碳氢化合物(例如长链碳氢化合物、支链碳氢化合物、饱和碳氢化合物、不饱和碳氢化合物等)、脂肪醇、酯、脂肪醛、酮、润滑剂等。
特种化学品有许多商业用途。脂肪酸在商业上被用作表面活性剂。特种化学品可见于去垢剂和肥皂中。脂肪酸也可以用作燃料、润滑油、涂料、油漆、蜡烛、色拉油、起酥油、化妆品以及乳化剂中的添加剂。此外，脂肪酸在橡胶制品中被用作促进活性剂。脂肪酸也可以用作给料，生产甲酯、酰胺、胺、酰基氯、酸酐、乙烯酮二聚体，以及过氧酸与酯。
酯具有很多商业用途。例如，生物柴油，一种替换燃料，由酯(例如，脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯等)组成。一些低分子量的酯是挥发性的，具有好闻的气味，使得它们可以用作芳香剂或增味剂。此外，酯被用作漆、涂料和清漆的溶剂。而且，一些天然存在的物质，例如蜡、脂肪和油由酯组成。酯还可以用作树脂和塑料的软化剂、增塑剂、阻燃剂以及汽油和油的添加剂。此外，酯可用于生产聚合物、薄膜、染料和药物。
此外，原油是润滑油的来源。石油来源的润滑油通常由烯烃，尤其是聚烯烃和α-烯烃组成。润滑油可以从原油提炼或可以利用来自原油提炼的原材料生产。
从原油获得这些特种化学品需要大量的金融投资以及大量的能量。因为原油中的长链碳氢化合物常常被裂化以产生较小的单体，其也是低效的过程。这些单体然后被用作生产更复杂的特种化学品的原材料。
除勘探、开采、运输和提炼石油的问题外，石油是有限并逐渐减少的资源。估计当前世界石油消耗为每年300亿桶。据估计，以现有生产水平，世界石油储量预计在2050年前会耗竭。
最后，基于石油的燃料的燃烧释放温室气体(例如二氧化碳)和其他形式的空气污染物(例如一氧化碳、二氧化硫等)。随着世界对燃料需求的增加，温室气体和其他形式的空气污染物的排放也增加。大气中温室气体的累积导致全球变暖增速。因此，除局部破坏环境外(例如油泄漏、海洋环境的挖掘等)，燃烧石油还破坏全球环境。
由于石油所引起的内在挑战，存在对于不需要像石油一样被勘探、开采、长距离运输或大量提炼的可再生石油资源的需要。还存在对于可以经济生产可再生石油资源的需要。此外，存在对于不会产生石油工业和基于石油的燃料的燃烧所产生的环境破坏类型的可再生石油资源的需要。基于相似原因，还存在对于通常来自石油的化学品的可再生资源的需要。
诸如日光、水、风和生物质(biomass)的可再生能源是石油燃料的潜在替代品。生物燃料是一种由生物质产生的可生物降解的、清洁燃烧的燃料，其由烷烃和酯类构成。生物柴油即是一种示例性的生物燃料。生物柴油可以采用纯的形式(被称为“纯”生物柴油)，或者以任何浓度与常规的石化柴油混合用于大部分内燃柴油发动机中。
与基于石油的柴油相比，生物柴油提供了优点，包括燃烧过程中的排放量(例如，一氧化碳、硫、芳香烃、烟灰颗粒)降低。因其基于可再生的生物材料，生物柴油还能维持平衡的二氧化碳循环。生物柴油通常是可生物降解的，而且因为燃点高，易燃性低因此非常安全。此外，生物柴油提供良好的润滑性能，从而减少发动机的磨损。
目前生产生物柴油的方法涉及将来自植物油原料的三酰甘油进行酯交换，植物油原料，比如在欧洲是油菜，在北美是大豆，在东南亚是棕榈油。因此工业规模的生物柴油生产在地理和季节上局限于植物油原料的产地。酯交换过程产生脂肪酯(fatty esters)混合物，其可以作为生物柴油。然而，甘油是酯交换过程中的一种不希望的副产品。要作为生物柴油使用，必须从上述异质产物中进一步纯化脂肪酯。这最增加了脂肪酯生产的成本和所需能量，以及最终增加生物柴油生产的成本和所需能量。而且，植物油原料不是高效的能量来源，因为它们需要广大的种植面积。例如，因为只有菜子油用于生物柴油产生，而油菜生物质的其他部分被弃掉，所以从油菜产生生物柴油的产量仅有1300L/公顷。此外，某些植物油原料，比如油菜和大豆的种植需要经常进行农作物轮种以防止土地养分耗尽。
需要在经济和能量方面高效的生物燃料，以及由诸如生物质的可再生能量来源生产所述生物柴油的方法。
发明概述
本发明至少部分地基于从基因工程化微生物产生脂肪酯，包括例如脂肪酸甲酯(“FAME”)和脂肪酸乙酯(“FAEE”)。因此，一方面，本发明的特征是产生脂肪酯的方法。所述方法包括在碳源存在下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞经基因工程改造，从而超表达编码硫酯酶的基因、编码酰基辅酶A合酶的基因和编码酯合酶的基因。在一些实施方案中，所述方法还包括分离脂肪酯。
在一些实施方案中，所述脂肪酯存在于细胞外环境中。在一些实施方案中，所述脂肪酯从宿主细胞的细胞外环境分离得到。在一些实施方案中，所述脂肪酯部分或完全地从宿主细胞自发分泌。在可选的实施方案中，任选地在一种或多种合适的转运蛋白的辅助下，所述脂肪酯被运输到细胞外环境。在其他实施方案中，所述脂肪酯被动运输到细胞外环境。
在一些实施方案中，所述方法还包括在醇的存在下培养宿主细胞。在某些实施方案中，所述醇是甲醇或乙醇。在一些实施方案中，所述甲醇或乙醇以约1mL/L至约100mL/L的浓度存在。例如，所述甲醇或乙醇以约1mL/L或更高(例如，约1mL/L或更高、约5mL/L或更高、约10mL/L或更高)的浓度存在。在可选的实施方案中，所述甲醇或乙醇以约100mL/L或更低(例如，约100mL/L或更低、约90mL/L或更低、约80mL/L或更低)的浓度存在。
在某些实施方案中，编码硫酯酶的基因可以是例如，tesA、‘tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA1或fatA。在一些实施方案中，编码酰基辅酶A合酶的基因可以是例如，fadD、fadK、BH3103、pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa39、编码GenBank登录号ZP_01644857蛋白的基因或yhfL。在其他实施方案中，编码酯合酶的基因可以是例如，编码酶分类EC 2.3.1.75或EC 2.3.1.20的酶的基因。
在其他实施方案中，所述宿主细胞经基因工程改造，相对于野生型宿主细胞表达降低水平的至少一种以下基因：编码酰基辅酶A脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成转录调节子的基因。
在一些实施方案中，编码酰基辅酶A脱氢酶的基因是fadE。在一些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因编码外膜铁色素转运蛋白，例如，fhuA。在其他实施方案中，编码脂肪酸生物合成转录调节子的基因编码DNA转录抑制子，例如，fabR。
在一些实施方案中，所述宿主细胞在包含约2g/L至约100g/L起始浓度的碳源的培养基中培养。在其他实施方案中，所述培养基包含约2g/L至约10g/L起始浓度的碳源、约10g/L至约20g/L起始浓度的碳源、约20g/L至约30g/L起始浓度的碳源、约30g/L至约40g/L起始浓度的碳源或约40g/L至约50g/L起始浓度的碳源。在示例性的实施方案中，所述培养基包含约2g/L或更高(例如，约2g/L或更高、约5g/L或更高、约10g/L或更高)起始浓度的碳源。
在一些实施方案中，所述方法还包括监测培养基中碳源水平的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括当培养基中的碳源水平低于约0.5g/L时，向所述培养基添加补充性碳源。在一些实施方案中，当培养基中的碳源水平低于约0.4g/L、低于约0.3g/L、低于约0.2g/L或低于约0.1g/L时，向所述培养基添加补充性碳源。
在一些实施方案中，所述补充性碳源被添加以维持约2g/L至约5g/L的碳源水平。在一些实施方案中，所述补充性碳源被添加以维持约2g/L或更高(例如，约2g/L或更高、约3g/L或更高、约4g/L或更高)的碳源水平。在某些实施方案中，所述补充性碳源被添加以维持约5g/L或更低(例如，约5g/L或更低、约4g/L或更低、约3g/L或更低)的碳源水平。在一些实施方案中，所述补充性碳源被添加以维持约2g/L至约3g/L、约3g/L至约4g/L或约4g/L至约5g/L的碳源水平。在一些实施方案中，所述碳源是葡萄糖。
在一些实施方案中，以约1g/L至约200g/L的浓度产生脂肪酸甲酯。在一些实施方案中，以约1g/L更高(例如，约1g/L或更高、约5g/L或更高、约10g/L或更高、约20g/L或更高、约30g/L或更高)的浓度产生脂肪酸甲酯。在一些实施方案中，以约1g/L至约170g/L、约1g/L至约10g/L、约40g/L至约170g/L、约100g/L至约170g/L、约10g/L至约100g/L、约1g/L至约40g/L、约40g/L至约100g/L或约1g/L至约100g/L的浓度产生脂肪酸甲酯。
在一些实施方案中，所述宿主细胞可以选自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞以及细菌细胞。
在具体的实施方案中，所述宿主细胞选自以下属：埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、根毛霉属(Rhizomucor)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、毛霉菌属(Mucor)、蚀丝霉属(Myceliophtora)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)、金黄孢子菌属(Chrysosporium)、酵母属(Saccharomyces)、寡养单胞菌属(Stenotrophamonas)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)或链霉菌属(Streptomyces)。
在其他实施方案中，所述宿主细胞为迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)细胞、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)细胞、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)细胞、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)细胞、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)细胞、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)细胞、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)细胞、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis))细胞、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)细胞、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)细胞。
在其他实施方案中，所述宿主细胞为康宁木霉(Trichoderma koningii)细胞、绿色木霉(Trichoderma viride)细胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)细胞、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)细胞、烟曲霉(Aspergillus fumigates)细胞、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)细胞、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞、黑曲霉(Aspergillusniger)细胞、米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞、特异腐质霉(Humicola insolens)细胞、棉毛状腐质霉(Humicola lanuginose)细胞、混浊红球菌(Rhodococcusopacus)细胞、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)细胞或米黑毛霉(Mucormichei)细胞。
在其他实施方案中，所述宿主细胞是浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)细胞或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)细胞。在其他实施方案中，所述宿主细胞是放线菌(Actinomycetes)细胞。在其他实施方案中，所述宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。
在其他实施方案中，所述宿主细胞是来自真核植物、藻类、蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌、紫非硫细菌、嗜极生物、酵母、真菌、以上的基因工程化有机体或合成的有机体。在一些实施方案中，所述宿主细胞是光依赖性的或固定碳。在一些实施方案中，所述宿主细胞具有自养活性。在一些实施方案中，所述宿主细胞具有光合自养活性，例如在存在光的情况下。在某些实施方案中，所述宿主细胞是来自以下的细胞：拟南芥(Avabidopsis thaliana)、柳枝稷(Panicum virgatums)、巨芒(Miscanthus giganteus)、玉米(Zea mays)、葡萄藻(Botryococcusebraunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、杜氏盐藻(Dunalielasalina)、细长嗜热聚球蓝细菌(Thermosynechococcus elongatus)、绿硫菌(Chlorobium tepidum)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus auranticus)、酒色着色菌(Chromatiumm vinosum)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalusris)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、热纤梭菌(Clostridiuthermocellum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)。在某些其他实施方案中，所述宿主细胞来自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母、固定化解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)或运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。在其他实施方案中，所述宿主细胞是来自聚球蓝细菌(Synechococcus Sp.)PCC 7002、聚球蓝细菌PCC 7942、集胞蓝细菌(Synechocystis Sp.)PCC 6803的细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cv1细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或PC12细胞。
在具体的实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。在某些实施方案中，所述大肠杆菌细胞是菌株B、菌株C、菌株K或菌株W的大肠杆菌细胞。
在一些实施方案中，本发明涉及在允许产物产生的条件下能产生脂肪酯的基因工程微生物。在一些实施方案中，所述基因工程微生物包含编码硫酯酶的基因、编码酰基辅酶A合酶的基因和编码酯合酶的基因中的至少一种的一个或多个。在某些实施方案中，所述基因工程微生物包含编码硫酯酶的基因、编码酰基辅酶A合酶的基因和编码酯合酶的基因。在某些实施方案中，编码硫酯酶的基因、编码酰基辅酶A合酶的基因和编码酯合酶的基因中的两个或多个被连接在一个操纵子中。在某些其他实施方案中，编码硫酯酶的基因、编码酰基辅酶A合酶的基因和编码酯合酶的基因所有三个被连接在一个操纵子中。
在某些实施方案中，所述基因工程微生物包含稳定并入所述微生物基因组DNA中的外源控制序列，所述外源控制序列位于编码硫酯酶的基因、编码酰基辅酶A合酶的基因和编码酯合酶的基因中的至少一种的一个或多个的上游。在示例性的实施方案中，微生物经工程改造，使其包含稳定并入所述微生物基因组DNA中的外源控制序列，所述外源控制序列位于编码硫酯酶的基因、编码酰基辅酶A合酶的基因和编码酯合酶的基因的上游。在某些实施方案中，微生物经工程改造，使其相对于野生型微生物产生提高水平的脂肪酯。在某些实施方案中，所述外源控制序列是，例如，启动子。示例性的启动子包括但不限于，发育调控型启动子、细胞器特异型启动子、组织特异型启动子、诱导型启动子、组成型启动子和细胞特异型启动子。
在其他实施方案中，所述微生物经基因工程改造，相对于野生型微生物表达降低水平的至少一种以下基因：编码酰基辅酶A脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成转录调节子的基因。在某些实施方案中，所述微生物经基因工程改造，使得编码酰基辅酶A脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成转录调节子的基因中的至少一种缺失。在某些实施方案中，编码酰基辅酶A脱氢酶的基因是fadE。在其他实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因编码外膜铁色素转运蛋白，例如，fhuA。在其他实施方案中，编码脂肪酸生物合成转录调节子的基因编码DNA转录抑制子，例如，fabR。
在某些实施方案中，所述基因工程微生物可适合选自革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中，所述基因工程微生物选自大肠杆菌、分支杆菌(mycrobacterium)、诺卡氏菌(Nocardia sp.)、皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、稀有海洋放线菌(Salinispora arenicola)、密执安棍状杆菌(Clavibacter michiganenesis)、不动杆菌属(Acinetobacter)、食烷菌属(Alcanivorax)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、拟南芥(Arabidopsis)、海床杆菌属(Fundibacter)、海杆菌属(Marinobacter)、小家鼠(Mus musculus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或希蒙得木属(Simmodsia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)或油脂酵母属(Lipomyces)。在某些实施方案中，所述基因工程微生物选自大肠杆菌B菌株、C菌株、K菌株或W菌株。在其他实施方案中，所述基因工程微生物选自聚球蓝细菌PCC 7002、细长聚球蓝细菌(Synechococcus elongatus)PCC 7942、集胞蓝细菌PCC 6803。
在一些实施方案中，本发明还涉及产生脂肪酯的方法，所述方法包括在合适的醇底物存在下培养基因工程微生物。在某些实施方案中，所述醇底物可以选自乙醇或甲醇。在优选的实施方案中，所述醇底物是甲醇。在其他实施方案中，所述方法还包括在允许基因工程微生物产生脂肪酯产物的条件下培养基因工程微生物。
在一些实施方案中，培养基中产生脂肪酯的产率为每100g葡萄糖约0.5g-约50g脂肪酯。例如，产生脂肪酯的产率为每100g葡萄糖约0.5g脂肪酯或更多(例如，每100g葡萄糖约0.5g脂肪酯或更多、每100g葡萄糖约2g脂肪酯或更多、每100g葡萄糖约5g脂肪酯或更多、每100g葡萄糖约5g脂肪酯或更多、每100g葡萄糖约10g脂肪酯或更多)。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酯的产率为每100g葡萄糖约0.5g至约40g脂肪酯、每100g葡萄糖约0.5g至约30g脂肪酯、每100g葡萄糖约0.5g至约20g脂肪酯、每100g葡萄糖约0.5g至约10g脂肪酯、每100g葡萄糖约0.5g至约5g脂肪酯或每100g葡萄糖约0.5g至约4g脂肪酯。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酯的产率为每100g葡萄糖至少0.5g脂肪酯、至少4g脂肪酯、至少5g脂肪酯、至少10g脂肪酯、至少20g脂肪酯、至少30g脂肪酯、至少40g脂肪酯或至少50g脂肪酯。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酯的产率为每100g葡萄糖不超过50g脂肪酯。
在一些实施方案中，培养基中产生脂肪酯的产率为葡萄糖重量的约0.5％至约50％。例如，培养基中产生脂肪酯的产率为葡萄糖重量的约0.5％或更高(例如，约0.5％或更高、约2％或更高、约5％或更高)。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酯的产率为葡萄糖重量的约0.5％至约40％、约0.5％至约30％、约0.5％至约20％、约0.5％至约10％、约0.5％至约5％或约0.5％至约4％。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酯的产率为葡萄糖重量的至少约0.5％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酯的产率为不超过葡萄糖重量的50％。
在一些实施方案中，培养基中产生脂肪酯的产率为碳源中碳重量的约10％至约95％。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酯的产率为碳源中碳重量的约15％至约90％、约20％至约80％或约30％至约70％。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酯的产率为碳源中碳重量的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酯的产率为不超过碳源中碳重量的95％。
在一些实施方案中，所述脂肪酯是脂肪酸乙酯，并且其在培养基中产生的产率为每100g葡萄糖约0.5g至约50g脂肪酸乙酯。例如，所述脂肪酯是脂肪酸乙酯，并且其在培养基中产生的产率为每100g葡萄糖约0.5g或更多(例如，约0.5g或更多、约2g或更多、约5g或更多、约10g或更多、约15g或更多)。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸乙酯的产率为每100g葡萄糖约0.5g至约40g脂肪酸乙酯、每100g葡萄糖约0.5g至约30g脂肪酸乙酯、每100g葡萄糖约0.5g至约20g脂肪酸乙酯、每100g葡萄糖约0.5g至约10g脂肪酸乙酯、每100g葡萄糖约0.5g至约5g脂肪酸乙酯或每100g葡萄糖约0.5g至约4g脂肪酸乙酯。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸乙酯的产率为每100g葡萄糖至少0.5g脂肪酸乙酯、至少4g脂肪酸乙酯、至少5g脂肪酸乙酯、至少10g脂肪酸乙酯、至少20g脂肪酸乙酯、至少30g脂肪酸乙酯、至少40g脂肪酸乙酯或至少50g脂肪酸乙酯。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸乙酯的产率为每100g葡萄糖不超过50g脂肪酸乙酯。
在一些实施方案中，培养基中产生脂肪酸乙酯的产率为葡萄糖重量的约0.5％至约50％。例如，培养基中产生脂肪酸乙酯的产率为葡萄糖重量的约0.5％或更多(例如，约0.5％或更多、约1％或更多、约2％或更多、约5％或更多、约10％或更多)。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸乙酯的产率为葡萄糖重量的约0.5％至约40％、约0.5％至约30％、约0.5％至约20％、约0.5％至约10％、约0.5％至约5％或约0.5％至约4％。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸乙酯的产率为葡萄糖重量的至少约0.5％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸乙酯的产率为不超过葡萄糖重量的50％。
在一些实施方案中，培养基中产生脂肪酸乙酯的产率为碳源中碳重量的约10％至约95％。例如，培养基中产生脂肪酸乙酯的产率为碳源中碳重量的约10％或更多(例如，约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约25％或更多)。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸乙酯的产率为碳源中碳重量的约15％至约90％、约20％至约80％或约30％至约70％。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸乙酯的产率为碳源中碳重量的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸乙酯的产率为不超过碳源中碳重量的95％。
在一些实施方案中，所述脂肪酯是脂肪酸甲酯，并且其在培养基中产生的产率为每100g葡萄糖约0.5g至约50g脂肪酸甲酯。例如，所述脂肪酯是脂肪酸甲酯，并且其在培养基中产生的产率为每100g葡萄糖约0.5g或更多(例如，约0.5g或更多、约1g或更多、约2g或更多、约5g或更多、约10g或更多)脂肪酸甲酯。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸甲酯的产率为每100g葡萄糖约0.5g至约40g脂肪酸甲酯、每100g葡萄糖约0.5g至约30g脂肪酸甲酯、每100g葡萄糖约0.5g至约20g脂肪酸甲酯、每100g葡萄糖约0.5g至约10g脂肪酸甲酯、每100g葡萄糖约0.5g至约5g脂肪酸甲酯或每100g葡萄糖约0.5g至约4g脂肪酸甲酯。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸甲酯的产率为每100g葡萄糖至少0.5g脂肪酸甲酯、至少4g脂肪酸甲酯、至少5g脂肪酸甲酯、至少10g脂肪酸甲酯、至少20g脂肪酸甲酯、至少30g脂肪酸甲酯、至少40g脂肪酸甲酯或至少50g脂肪酸甲酯。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸甲酯的产率为每100g葡萄糖不超过50g脂肪酸甲酯。
在一些实施方案中，培养基中产生脂肪酸甲酯的产率为葡萄糖重量的约0.5％至约50％。例如，培养基中产生脂肪酸甲酯的产率为葡萄糖重量的约0.5％或更多(例如，约0.5％或更多、约1％或更多、约2％或更多、约5％或更多、约10％或更多、约15％或更多)。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸甲酯的产率为葡萄糖重量的约0.5％至约40％、约0.5％至约30％、约0.5％至约20％、约0.5％至约10％、约0.5％至约5％或约0.5％至约4％。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸甲酯的产率为葡萄糖重量的至少约0.5％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸甲酯的产率为不超过葡萄糖重量的50％。
在一些实施方案中，培养基中产生脂肪酸甲酯的产率为碳源中碳重量的约10％至约95％。例如，培养基中产生脂肪酸甲酯的产率为碳源中碳重量的约10％或更多(例如，约10％或更多、约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约35％或更多、约40％或更多)。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸甲酯的产率为碳源中碳重量的约15％至约90％、约20％至约80％或约30％至约70％。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸甲酯的产率为碳源中碳重量的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％。在具体的实施方案中，培养基中产生脂肪酸甲酯的产率为不超过碳源中碳重量的95％。
另一方面，本发明涉及通过本文所述的方法产生的脂肪酯，例如脂肪酸酯。在一些实施方案中，所述脂肪酸酯是脂肪酸甲酯。在一些实施方案中，所述脂肪酸甲酯的长度为至少约4、6、8、10、12、14、16或18个碳。
在一些实施方案中，所述脂肪酸甲酯包含A侧和B侧。在一些实施方案中，所述脂肪酸甲酯B侧的长度为至少约4、6、8、10、12、14、16或18个碳。在一些实施方案中，所述脂肪酸甲酯的B侧包含直链。在其他实施方案中，所述脂肪酸甲酯的B侧包含支链。在其他实施方案中，所述脂肪酸甲酯的B侧包含至少一个环状部分。在其他实施方案中，所述脂肪酸选自十二烷酸甲酯、5-十二烯酸甲酯、十四烷酸甲酯、7-十四烯酸甲酯、十六烷酸甲酯、9-十六烯酸甲酯、十八烷酸甲酯、11-十八烯酸甲酯或以上的组合。在其他实施方案中，所述脂肪酯选自十二烷酸乙酯、5-十二烯酸乙酯、十四烷酸乙酯、7-十四烯酸乙酯、十六烷酸乙酯、9-十六烯酸乙酯、十八烷酸乙酯、11-十八烯酸乙酯或以上的组合。
在一些实施方案中，所述脂肪酸甲酯是饱和的。在其他实施方案中，所述脂肪酸甲酯是不饱和的。在其他实施方案中，所述脂肪酸甲酯是单不饱和的。在某些实施方案中，所述脂肪酸乙酯是饱和的。在其他实施方案中，所述脂肪酸乙酯是不饱和的。在其他实施方案中，所述脂肪酸乙酯是单不饱和的。
本文所提供的附图和实施例仅意图说明本发明的特征。它们并非意图是限制性的。
附图简要说明
图1是显示用于产生质粒pCLTFWcat的克隆方法的示意图。
图2是显示用于产生整合片段lacZ::tesA fadD atfA1的克隆方法的示意图。
图3是整合片段lacZ::tesA fadD atfA1的核苷酸序列。
图4列出pLacZ质粒的核苷酸序列(SEQ ID NO：28)。
发明的详细描述
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有的含义与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义一样。尽管在本发明的实践或测定中可以使用与本文所述相似或等同的方法和材料，但在下文中描述了合适的方法和材料。对于本文提及的包括GenBank数据库序列在内的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献，通过引用将其全部内容并入本文。在产生矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，这些材料、方法以及实施例仅仅是说明性的而并非意图限制。
根据以下详细说明以及权利要求书，本发明的其他特征和优势将变得清楚。
定义
本文所用冠词“a”和“an”是指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。作为实例，“元件(an element)”表示一个元件或多于一个元件。
本文所用术语“约”表示给定数值的±20％的值。因此，“约60％”表示在60±(60的20％)之间的值(即48至70)。
本文所用的术语“减弱”表示削弱、降低或缩小。例如，可以通过修饰多肽来减弱多肽以降低其活性(例如，通过修饰编码所述多肽的核苷酸序列)。
本文所用的术语“生物原油”是指来源于生物质、生物质衍生物或其他生物来源的产品，生物原油生物原油和石油原油一样，均可以转化为其他燃料，例如生物原油可被转化为汽油、柴油、喷气燃料或燃用油(heating oil)。而且，生物原油与石油原油一样，可以转化为其他工业上有用的化学品，用于例如制药、化妆品、消费品、工业加工等。
生物原油可以包括例如烃、烃产品、脂肪酯以及/或者脂肪族酮。在优选的实施方案中，生物原油由烃，例如脂肪(例如，烷烃、烯烃、炔)或芳香烃构成。
本文所用的术语“生物柴油”表示可以作为来源于石油的柴油的替代品的生物燃料。生物柴油可以以被称为“纯(neat)”生物柴油的纯品形式或作为以任何浓度与基于石油的柴油的混合物用于内燃柴油发动机。在一个实施方案中，生物柴油可以包括酯类或烃类，例如醛、烷或烯。
本文所用的术语“生物燃料”是指来源于生物质、生物质衍生物或其他生物资源的任何燃料。生物燃料可以替代基于石油的燃料。例如，生物燃料包括运输工具燃料(例如汽油、柴油、喷气燃料等)、燃用燃料和发电燃料。生物燃料是可再生能源。
本文所用的术语“生物质”是指来源于生物材料的碳源。生物质可以被转化为生物燃料。生物质的一个示例性来源是植物物质。例如，玉米、甘蔗或柳枝稷可以用作生物质。生物质的另一非限制性实例是动物物质，例如牛粪。生物质还包括来自工业、农业、林业和家庭的废品。可以用作生物质的这些废品的实例是发酵废渣、秸秆、木材、污水、垃圾、和剩余食物。生物质还包括例如碳水化合物(例如单糖、二糖或多糖)的碳源。
本文所用的短语“碳源”是指适于用作原核或简单真核细胞生长的碳源的底物或化合物。碳源可以是不同形式的，包括但不限于聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽和气体(例如CO和CO2)。这些包括，例如各种单糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖；寡糖，例如低聚果糖和低聚半乳糖；多糖，例如木糖和阿拉伯糖；二糖，例如蔗糖、麦芽糖和松二糖；纤维素材料，例如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；饱和或不饱和脂肪酸酯，例如琥珀酸酯、乳酸酯和醋酸酯；醇，例如甲醇、乙醇、丙醇或其混合物。碳源还可以是光合作用的产物，包括但不限于葡萄糖。优选的碳源是生物质。另一优选的碳源是葡萄糖。
本文所用的“降低浊点的添加剂”是添加到组合物以减少或降低溶液的浊点的添加剂。
本文所用的短语“液体的浊点”表示溶解的固体不再完全可溶的温度。在该温度以下，固体开始作为第二相沉淀，给予液体浑浊的外观。在石油工业中，浊点是指这样的温度：在该温度以下，固化物质或其他重碳氢化合物在原油、提炼油或燃料中结晶从而形成浑浊的外观。固化物质的存在影响该液体的流动特性、该液体堵塞燃料过滤器、喷嘴等的倾向、固化物质在冷表面(例如管道或热交换器污垢)上的累积以及该液体与水的乳化特性。
如果两个序列的每个碱基都匹配(即能够形成Watson Crick碱基对)，则核苷酸序列与另一核苷酸序列是“互补的”。术语“互补链”在本文中与术语“互补序列”互换使用。核酸链的互补序列可以是编码链的互补序列或非编码链的互补序列。
术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应被解释为开放式的术语(例如，表示“包括但不限于”)，除非指出并非如此。
本文所用的术语“足以允许表达的条件”表示允许宿主细胞产生诸如本文所述的多肽、醛或烷的所需产物的任何条件。合适的条件包括，例如发酵条件。发酵条件可以包含很多参数，例如温度范围、通气水平和培养基组分。这些条件中的每一个单独地并联合地允许宿主细胞生长。示例性的培养基包括培养液或凝胶。通常，所述培养基包含诸如葡萄糖、果糖、纤维素等的碳源，该碳源可以直接被宿主细胞代谢。此外，培养基中可以使用酶以便于碳源的动员(例如淀粉或纤维素解聚为可发酵的糖)和随后的代谢。
为了确定条件是否足以允许表达，可以将宿主细胞进行培养例如约4、8、12、24、36或48小时。培养中和/或培养后，可以获取样品并分析样品以确定该条件是否允许表达。例如，可以测试样品中的宿主细胞或宿主细胞所生长的培养基中所需产物的存在。当测试产物的存在时，可以使用诸如但不限于TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS的检测。
应当理解，本文所述的多肽可以具有另外的对多肽功能没有本质影响的保守型或非必需氨基酸取代。可以按照Bowie et al.，Science(1990)247：1306 1310中所述确定特定取代是否会被允许(例如不会不利地影响所需的生物学性质，例如脱羧酶活性)。“保守型氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所替代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
如本文所用，“允许产物产生的条件”是指允许生产宿主产生所需产物的任何发酵条件，所需产物例如酰基辅酶A或脂肪酸衍生物(例如，脂肪酸、烃、脂肪醇、蜡或脂肪酯)。发酵条件通常包括很多参数。示例性的条件包括但不限于，温度范围、通气水平和培养基组分。这些条件中的每一种，单独和/或联合允许生产宿主生长。
示例性的培养基包括培养液和/或凝胶。通常，合适的培养基包含碳源(例如葡萄糖、果糖、纤维素等)，该碳源可以直接被微生物代谢。此外，培养基中可以使用酶以便于碳源的动员(例如淀粉或纤维素解聚为可发酵的糖)和随后的代谢。
为了确定发酵条件是否允许产物产生，可以将生产宿主培养约4、8、12、24、36或48小时。在培养期间或培养后，获得样品并分析确定发酵条件是否已允许产物产生。例如，可以检测样品的生产宿主中或生产宿主所生长的培养基中所需产物的存在。示例性的测定，例如TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS以及本文提供的那些，可用于鉴定产物的存在并对其进行定量。
本文所用的“控制元件”表示转录控制元件。控制元件包括启动子和增强子。术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”是指发挥激活基因表达开关功能的DNA序列。如果基因被激活，认为其被转录或参与转录。转录涉及由基因合成mRNA。因此，启动子作为转录调节元件并且还提供基因转录为mRNA的起始位点。控制元件与参与转录的细胞蛋白特异性地相互作用(Maniatis et al，Science 236：1237，1987)。
本文所用的术语“缺失”或“敲除”表示修饰或钝化编码靶蛋白的多核苷酸序列，以便降低或消除所述靶蛋白的功能。可以利用本领域内公知的方法实现多核苷酸缺失(参见例如，Datsenko et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，97：6640-45，2000或国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788)。
本文所用的术语“内源的”是指位于细胞内的且不是利用重组基因工程技术导入细胞的多核苷酸。例如，当细胞最初从自然界分离时，已经存在于所述细胞中的基因。即使调控序列，诸如能够激活转录或者翻译的启动子或者增强子序列已经通过重组技术被改变，多核苷酸仍被认为是内源的。
本文所用的术语“酯合酶”表示能够产生脂肪酯的肽。更具体地说，酯合酶是能够将硫酯转化为脂肪酯的肽。在优选的实施方案中，酯合酶将硫酯(酰基辅酶A)转化为脂肪酯。
在可选的实施方案中，酯合酶利用硫酯和醇作为底物产生脂肪酯。酯合酶能够利用短链和长链硫酯作为底物。此外，酯合酶能够利用短链和长链醇作为底物。
酯合酶的非限制性实例是蜡合酶、蜡-酯合酶、酰基辅酶A:醇转酰基酶、酰基转移酶和脂酰辅酶A:脂肪醇酰基转移酶。示例性的酯合酶分类到酶分类号EC2.3.1.75中。很多这类酶以及用于制备本文所述产物的其他有用的酶已经在例如国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788中披露，通过引用将上述国际申请并入本文。
本文使用的术语“脂肪酸”表示具有式RCOOH的羧酸。R表示脂肪族基团，优选地表示烷基。R可以包含约4到约22个碳原子。脂肪酸可以为饱和的、单不饱和的或多不饱和的。在优选的实施方案中，所述脂肪酸由脂肪酸生物合成途径产生。
本文所用的术语“脂肪酸生物合成途径”表示产生脂肪酸的生物合成途径。所述脂肪酸生物合成途径包括脂肪酸酶，可以按照本文所述将所述脂肪酸酶进行工程改造来产生脂肪酸，并且在一些实施方案中脂肪酸酶可以与其他酶一起表达来产生具有所需碳链特征的脂肪酸。
本文所用的术语“脂肪酸降解酶”表示参与脂肪酸或脂肪酸衍生物分解或转化成另一产物的酶。脂肪酸降解酶的非限制性实例是酰基辅酶A合酶。很多这类酶以及用于制备本文所述产物的其他有用的酶已经在例如国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788中披露，通过引用将上述国际申请并入本文。脂肪酸降解酶的其他实例如本文所述。
本文所用的术语“脂肪酸衍生物”表示部分地产生于生产宿主生物体的脂肪酸生物合成途径的产物。“脂肪酸衍生物”还包括部分地产生于酰基-ACP或酰基-ACP衍生物的产物。所述脂肪酸生物合成途径包括脂肪酸合酶，可以按照本文所述将所述脂肪酸合酶进行工程改造来产生脂肪酸衍生物，并且在一些实例中，脂肪酸合酶可以与其他酶一起表达以产生具有所需碳链特征的脂肪酸衍生物。示例性的脂肪酸衍生物包括，例如脂肪酸、酰基辅酶A、脂肪醛、短和长链醇、烃类、脂肪醇、酮和酯(例如蜡、脂肪酸酯或脂肪酯)。
本文所用的术语“脂肪酸衍生酶”表示在脂肪酸衍生物的产生中可以被表达或超表达的所有酶。这些酶在本文统称为脂肪酸衍生酶。这些酶可以是脂肪酸生物合成途径的一部分。脂肪酸衍生酶的非限制性实例包括脂肪酸合酶、硫酯酶、酰基辅酶A合酶、酰基辅酶A还原酶、醇脱氢酶、醇酰基转移酶、羧酸还原酶、脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶、酯合酶、醛生物合成多肽以及烷生物合成多肽。脂肪酸衍生物酶可以将底物转化成脂肪酸衍生物。在一些实施例中，所述底物可以是脂肪酸衍生物，该衍生物被脂肪酸衍生酶转化为不同的脂肪酸衍生物。很多这类酶以及用于制备本文所述产物的其他有用的酶已经在例如国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788中披露，通过引用将上述国际申请并入本文。
本文所用的“脂肪酸酶”表示参与脂肪酸生物合成的任何酶。脂肪酸酶可以在宿主细胞中被表达或超表达以产生脂肪酸。脂肪酸酶的非限制性实例包括脂肪酸合酶和硫酯酶。很多这类酶以及用于制备本文所述产物的其他有用的酶已经在例如国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788中披露，通过引用将上述国际申请并入本文。
本文所用的术语“脂肪酯”表示酯类。在优选实施方案中，脂肪酯是由脂肪酸制备产生的任何酯，例如脂肪酸酯。在一个实施方案中，脂肪酯含有A侧(即连接在羧酸氧上的碳链)和B侧(即包含亲本羧酸酯的碳链)。在优选实施方案中，当脂肪酯来源于脂肪酸生物合成途径时，A侧来自醇，B侧来自脂肪酸。任何醇都可以用于形成脂肪酯的A侧。例如，醇可以来源于脂肪酸生物合成途径。可选地，可以通过非脂肪酸生物合成途径来产生醇。此外，醇可以是外源提供的。例如在脂肪酯是由还能产生脂肪酸的生物产生的情况下，醇可以在发酵液中提供。可选地，在脂肪酯是由还能产生醇的生物产生的情况下，可以提供外源的羧酸，诸如脂肪酸或乙酸。
包含A侧或B侧的碳链可以是任意长度。在一个实施方案中，酯的A侧长度为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16或18个碳。酯的B侧长度为至少约4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26个碳。A侧和/或B侧可以是直链或支链。支链可以有一或多个分支点。此外，支链可以包括环形分支。再者，A侧和/或B侧可以是饱和或不饱和的。如果是不饱和的，A侧和/或B侧可以有一或多个不饱和位点。
在一个实施方案中，脂肪酯是通过生物合成产生的。在这个实施方案中，首先脂肪酸被“激活”。“激活的”脂肪酸的非限制性实例是酰基辅酶A、酰基-ACP和酰基磷酸酯。酰基辅酶A可以是脂肪酸生物合成或降解的直接产物。此外，可以由游离脂肪酸、辅酶A或腺苷核苷酸三磷酸(ATP)合成酰基辅酶A。产生酰基辅酶A的酶的实例是酰基辅酶A合酶。
脂肪酸被激活后，可以容易地转移到受体亲核分子上。示例性的亲核分子是醇、巯醇或磷酸酯。
在一个实施方案中，所述脂肪酯是蜡。蜡可以来源于长链醇和长链脂肪酸。在另一实施方案中，脂肪酯可以来源于脂肪酰基硫酯和醇。另一实施方案中，脂肪酯是脂肪酸硫酯，例如脂酰辅酶A(CoA)。在其他实施方案中，所述脂肪酸酯是脂肪酰基泛酸酯、酰基载体蛋白(ACP)或者脂肪磷酸酯。脂肪酯有很多用途。例如，脂肪酯可以用作生物燃料、表面活性剂或配制成添加剂，该添加剂可以为燃料和工业化学品提供润滑和其他作用。
本文所用的“现代碳分数(fraction of modern carbon)”或“fM”与分别由称为草酸标准品HOxI和HOxII的国家标准技术研究院(NationalInstitute of Standards and Technology(NIST))标准参考物(SRM)4990B和4990C所定义的具有相同意义。基本定义涉及14C/12C同位素比例HOxI(参考AD 1950)的0.95倍。这大概等同于经衰变修正的前工业革命时代的木头(decay-corrected pre-Industrial Revolution wood)。对于现今有生命生物圈(例如植物物质)而言，fM为约1.1。
本文的基因“fhuA”和“tonA”可交替使用。
本文所用的“基因敲除”是指这样的操作：通过该操作，编码靶蛋白的基因被修饰或失活从而降低或消除完整蛋白的功能。可以通过一般方法进行基因的失活，例如通过UV照射或用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理的诱变、定点诱变、同源重组、插入-缺失诱变或“Red驱动的整合(Red-driven integration)”(Datsenko et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：6640-45，2000)。例如，在一个实施方案中，将构建体引入宿主细胞中，使得能够选择所述宿主细胞中的同源重组事件。本领域技术人员可以容易地设计包含阳性和阴性选择基因的敲除构建体，所述阳性和阴性选择基因用于有效选择经历与所述构建体的同源重组事件的转染细胞。例如，通过单交叉重组或双交叉重组，用含有改变的DNA序列替换野生型DNA序列可以获得所述宿主细胞中的改变。为了便于转化体的选择，所述改变可以是，例如编码抗生素抗性标记的DNA序列或弥补了所述宿主细胞可能的营养缺陷型的基因。突变包括但不限于缺失-插入突变。此类改变的实例包括基因破坏，即基因扰动，使得从该基因正常产生的产物不能以功能形式产生的。这可以归因于完全缺失、选择标记的缺失和插入、选择标记的插入、移码突变、框内缺失或导致提前终止的点突变。在一些情况下，所述基因的全部mRNA是不存在的。在其它的情形下，所产生的mRNA的量改变。
可以按照以下计算两个序列之间的“同源性”。序列以最佳比较目的进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入空位用于最佳比对，并且为了比较目的可以忽略非同源序列)。在优选的实施方案中，为比较目的而比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少约30％、优选地至少约40％、更优选地至少约50％、更优选地至少约60％并且更优选地至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。然后比较位于对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的百分比同一性是序列所共享的相同位置数的函数，这考虑到了为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数量和每个空位的长度。
可以使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间百分比同源性的测定。在优选的实施方案中，使用以下算法测定两个氨基酸序列之间的百分比同源性：Needleman and Wunsch(1970)、J.Mol.Biol.48：444 453的算法，该算法被并入GCG软件包中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。在另一优选的实施方案中，使用以下程序测定两个核苷酸序列之间的同源性百分比：GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及约40、50、60、70或80的空位权重和约1、2、3、4、5或6的长度权重。特别优选的参数组(和如果操作者不确定应当应用哪些参数确定分子是否在要求的同源性限制内而应该使用的参数组)是具有12的空位罚分、4的空位延伸罚分和5的移码空位罚分的Blossum 62评分矩阵。
比对用于比较的序列的其他方法是本领域内公知的。多种程序和比对算法描述于例如，Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988；Higgins &Sharp，Gene 73：237244，1988；Higgins & Sharp，CABIOS 5：151-153，1989；Corpet et al.，Nucleic Acids Research 16：10881-10890，1988；Huang et al.，CABIOS 8：155-165，1992；和Pearson et al.，Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)24：307-331，1994.以及Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410，1990中。
本文所用的“宿主细胞”是用于产生本文所述的产物(例如醛类或烷类)的细胞。可以修饰宿主细胞，使其表达或超表达所选择的基因或具有所选择的基因的减弱的表达。宿主细胞的非限制性实例包括植物、动物、人、细菌、蓝细菌、酵母或丝状真菌细胞。
本文所用的术语“在低严紧性、中等严紧性、高严紧性或极高严紧性条件下杂交”描述杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可以见于例如Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术)，JohnWiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。该参考资料中描述了水性和非水性方法并且可以使用任一方法。本文涉及的具体杂交条件如下：1)低严紧性杂交条件在约45℃下、在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，然后是在至少50℃下、在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤两次(对于低严紧性条件，洗涤温度可以升至55℃)；2)中等严紧性杂交条件在约45℃下、在6×SSC中，然后是在60℃下、0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；3)高严紧性杂交条件在约45℃下、6×SSC中，然后是在65℃下、在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；以及优选地4)极高严紧性杂交条件为65℃下、0.5M磷酸钠、7％SDS中，然后是在65℃下、在0.2×SSC、1％SDS中洗涤一次或多次。除非另作规定，极高严紧性条件(4)是优选的条件。
本文中涉及诸如DNA或RNA的核酸时，所用的术语“分离的”是指分别从所述核酸的天然来源中存在的其他DNA或RNA分离的分子。此外，“分离的核酸”包括核酸片段，例如不是天然存在的片段。本文所用的术语“分离的”还指从其他细胞蛋白分离的多肽，并且包括纯化的内源多肽和重组多肽两者。当核酸或多肽是通过重组DNA技术产生时，本文使用的术语“分离的”还指基本上游离于细胞物质、病毒物质或培养基的核酸或多肽。当核酸或多肽是化学合成时，本文所用的术语“分离的”还指基本上游离于化学前体或其他化学品的核酸或多肽。
本文所用的“细胞中基因的表达水平”是指由所述细胞中的基因编码的mRNA、前体mRNA新生转录物、转录加工中间体、成熟mRNA和/或降解产物的水平。
本文所用的术语“微生物”表示来自古菌域、细菌域和真核域的原核和真核微生物种类，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高等原生生物。本文所用的术语“微生物细胞”表示来源于微生物的细胞。
本文所用的术语“核酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)以及适当情况下，指核糖核酸(RNA)。该术语还包括产生自核苷酸类似物的RNA或DNA的类似物，以及适用于所描述的实施方案的单链(有义或反义)和双链多核苷酸、EST、染色体、cDNA、mRNA和rRNA。术语“核酸”和“多核苷酸”、“DNA”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和/或“基因”可互换地使用，除非本文指出并非如此或上下文明确指出相反。
本文所用的术语“可操作地连接”表示所选择的核苷酸序列(例如编码本文所述的多肽)与启动子接近，从而允许所述启动子调节该选择的核苷酸序列的表达。此外，按照转录和翻译的方向，启动子位于所述选择的核苷酸序列的上游。“可操作地连接”表示将核苷酸序列和调节序列连接，以便当合适的分子(例如转录激活蛋白)与调节序列结合时允许基因表达。
本文所用术语“或”表示术语“和/或”并且与术语“和/或”可交换地使用，除非上下文明确表示并非如此。
本文所用的“超表达”表示在细胞中以高于对应野生型细胞中正常表达浓度的浓度表达或产生的核酸、多肽或烃类。例如，当在重组宿主细胞中多肽存在的浓度比其在相同物种的非重组宿主细胞中的浓度更高时，所述多肽在所述重组宿主细胞中可以是“超表达”的。
本文所用的“分配系数”或“P”定义为化合物在有机相中的平衡浓度除以在水相中(例如发酵液)平衡时的浓度。在本文所述的两相系统的一个实施方案中，在生产过程中所述有机相是由醛类或烷类形成的。但是，在一些实施例中，可以例如通过提供辛烷层来提供有机相以便于产物分离。当描述两相系统时，化合物的分配特性可以描述为logP。例如，logP为1的化合物会10∶1分配到有机相。logP为-1的化合物会1∶10分配到有机相。通过选择合适的发酵液和有机相，在发酵容器中具有高logP值的有机脂肪酸衍生物或产物可以分离到有机相中，即使处于很低的浓度。
本文所用的术语“多肽”可以与“蛋白”、“肽”和/或“酶”交换使用，除非本文指出并非如此或上下文明确指出相反。
本文所用的术语“生产宿主”表示用于产生本文所述产品的细胞。生产宿主经修饰从而表达或超表达、减弱或缺失所选多核苷酸的表达。生产宿主的非限制性实例包括植物、藻类、动物、人、细菌、酵母或丝状真菌细胞。
本文所用的术语“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”或“纯化(purification)”表示通过例如分离或隔离从分子的环境中移出或分离所述分子。“基本上纯化的”分子为至少约60％、优选地至少约75％以及更优选地至少约90％游离于与其相关的其他组分。本文所用的这些术语还指从样品中去除污染物。例如，污染物的去除可以导致样品中脂肪酸衍生物或产物的百分比增加。例如，当在宿主细胞中产生脂肪酸衍生物或产物时，可以通过去除宿主细胞蛋白纯化脂肪酸衍生物或产物。纯化后，样品中脂肪酸衍生物或产物的百分比增加。
术语“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”或“纯化(purification)”不需要绝对纯。它们是相对的术语。因此，例如当在宿主细胞中产生脂肪酸衍生物或产物时，纯化的脂肪酸衍生物或产物是基本与其他细胞组分(例如核酸、多肽、脂质、碳水化合物或其他脂肪酸衍生物或产物)分离的脂肪酸衍生物或产物。在另一实例中，纯化的脂肪酸衍生物或产物制剂是这样的：在该制剂中，所述脂肪酸衍生物或产物基本不含污染物，例如发酵后可能存在的那些污染物。在一些实施方案中，当样品重量的至少约50％是由脂肪酸衍生物或产物组成时，所述脂肪酸衍生物或产物是纯化的。在其他实施方案中，当样品重量的至少约60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％或更多是由脂肪酸衍生物或产物组成时，所述脂肪酸衍生物或产物是纯化的。
本文所用的术语“重组多肽”是指通过重组DNA技术产生的多肽，其中通常将编码所表达的多肽或RNA的DNA插入合适的表达载体，并且所述表达载体接下来用于转化宿主细胞以产生多肽或RNA。
本文所用的术语“基本相同”(或“基本同源”)是用于指第一氨基酸或核苷酸序列含有足够数量的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同的(例如具有相似侧链)氨基酸残基(例如保守型氨基酸取代)或核苷酸，使得所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似活性。
本文所用的术语“合酶”表示催化合成过程的酶。本文所用的术语合酶包括合酶、合成酶和连接酶。
本文所用的术语“转染”表示将核酸通过核酸介导的基因转移而引入(例如通过表达载体)到接受体细胞。
本文所用的术语“转化”是指这样的过程，在该过程中，细胞的基因型由于细胞摄入外源核酸而改变。这可以导致表达重组形式的RNA或多肽的转化的细胞。在由转移的基因反义表达的情况下，天然存在形式的多肽的表达被干扰。
本文所用的术语“转运蛋白”表示便于一种或多种化合物移入和/或移出细胞器和/或细胞的多肽。多种这些蛋白以及用于制备本文所述产物的其他有用的蛋白在例如国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788中披露，通过引用将上述国际申请并入本文。
本文所用的多肽X的“变体”是指具有改变了一个或多个氨基酸残基的多肽X的氨基酸序列的多肽。所述变体可以具有保守型改变或非保守型改变。使用本领域公知的计算机程序，例如LASERGENE软件(DNASTAR)，可以确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不影响生物活性。
在用于多核苷酸序列的情况下，术语“变体”可以包括与基因或其编码序列的多核苷酸序列相关的多核苷酸序列。该定义还可以包括，例如“等位基因”变体、“剪接”变体、“物种”变体或“多态性”变体。剪接变体可以与参考多核苷酸具有显著的一致性，但是由于在mRNA加工中的外显子备选剪接而通常会具有更多或更少的多核苷酸数。对应的多肽可以具有另外的功能结构域或结构域缺失。物种变体是在物种之间彼此不同的多核苷酸序列。得到的多肽通常会具有相对于彼此的显著的氨基酸一致性。多态性变体是在给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列中的变异。
本文所用的术语“载体”是指能够转运另一核酸的核酸分子，所述核酸分子连接到所述另一核酸。一种有用的载体是附加体(即能够进行染色体外复制的核酸)。有用的载体是能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的那些载体。能够指导与其可操作地连接的基因的表达的载体在本文被称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中，有用的表达载体通常是“质粒”的形式，所述“质粒”通常是指在其载体形式时不与染色体结合的环状双链DNA环。在本说明书中，因为质粒是最通常使用的载体形式，所以“质粒”和“载体”是可交换地使用的。但是，还包括发挥等同功能并随后至今成为本领域已知的表达载体的其他形式。
本文所用的术语“蜡”表示蜡由脂肪酯构成的组合物。在优选实施方案中，蜡中的脂肪酯由中到长碳链构成。除了脂肪酯以外，蜡可以包含其他成分(例如，烃、甾醇酯、脂肪醛、醇、酮、β-二酮、三酰甘油等)。
贯穿整个说明书，使用缩写的基因名称或多肽名称进行参考，但是用当理解，这种缩写的基因或多肽名称代表基因或多肽的种类。这类基因名称包括编码相同多肽和具有相同生理功能的同源多肽的所有基因。多肽名称包括具有相同活性(例如，催化相同的基本化学反应)的所有多肽。
除非另有所指，本文引用的登录号均来自美国国立卫生维护的研究院NCBI数据库(美国国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information))。除非另有所指，所述登录号如该数据库在2009年10月提供的。
EC编号由国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(NC-IUBMB)(在http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/获得)建立。本文引用的EC编号来自京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomics)维护的KEGG Ligand数据库，该数据库由东京大学部分资助。除非另有所指，所述EC编号如该数据库在2009年10月提供的。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有的含义与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义一样。
尽管在本发明的实践或测定中可以使用与本文所述相似或等同的方法和材料，但在下文中描述了合适的方法和材料。可以以任何合适的顺序实施本文所述的所有方法，除非本文指出并非如此或上下文明确指出相反。
除非另有所指，以百分比(％)列出的量是基于组合物总重量的重量百分比。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献，通过引用整体并入。在产生矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，这些材料、方法以及实施例仅仅是说明性的而并非意图限制。
本文所记载的数值范围仅仅是意图作为单独提及落入本范围内的每个个别数值的速记方法，除非本文指出并非如此，并且每个个别的数值被并入说明书，如同本文单独引用一样。
本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的用途仅仅为更好地说明本发明，而并非是限制本发明的范围，除非所要求的并非如此。说明书中的语言不应该被解释为指示实施本发明所必需的任何未要求的语言。
根据以下详细说明以及权利要求书，本发明的其他特征和优势将变得清楚。
脂肪酯
本公开涉及宿主细胞中脂肪酯，例如脂肪酸酯的产生，所述脂肪酸酯包括例如脂肪酸甲酯(“FAME”)和脂肪酸乙酯(“FAEE”)。在具体的实施方案中，本文所述的方法用于产生脂肪酸甲酯，脂肪酸甲酯可用于生物柴油中。
通过本文所述的方法产生的脂肪酯并非限制于任何具有特定长度或其他特性的酯。例如，利用本文所提供的启示可以将微生物进行基因工程改造，以产生Knothe，Fuel Processing Technology 86：1059-1070(2005)中所述的任何一种脂肪酯。这种脂肪酯可以如Knothe所述用以下特征表征，例如，十六烷值(CN)、粘度、熔点和燃烧热。
按照本文的方法、细胞或微生物产生的脂肪酯包括以下式、基本由以下式组成或由以下式组成：具有A侧和B侧的BCOOA，其中“A侧”是指连接在酯的羧酸氧上的碳链，而“B侧”是指包含酯的亲本羧酸酯的碳链。A侧由诸如脂肪醇的醇提供，且B侧由诸如脂肪酸的酸提供。B是脂肪族基团。在一些实施方案中，B是碳链。在一些实施方案中，B包含长度至少为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碳的碳链。A包含至少一个碳原子。在一些实施方案中，A是脂肪族基团。在一些实施方案中，A是烷基。在一些实施方案中，所述烷基包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子，或基本由或由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子组成。在一些实施方案中，任何一种上述B基团可以与任何一种上述A基团组合。在一些实施方案中，A包含具有选自1、2、3、4和5个碳原子数的碳链，或基本由或由1、2、3、4和5个碳原子数的碳链组成，而B包含至少12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子，或基本由或由至少12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子组成。
在一些实施方案中，本发明的脂肪酯包含多种单独的脂肪酯。在一些实施方案中，本文所述的方法允许产生多种不同长度的脂肪酯。在一些实施方案中，脂肪酯产物包含碳原子含量限于5-25个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酯产物。换句话而言，本发明提供了含有C5-C25脂肪酯(例如，C10-C20脂肪酯或C12-C18脂肪酯)的组合物。
在一些实施方案中，脂肪酯包含一种或多种在碳链的一个或多个点具有双键的脂肪酯。因此，在一些实施方案中，6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、16-、17-、18-、19-、20-、21-、22-、23-、24-、25-、26-、27-、28-、29-或30-碳链可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个双键，并且1-24个上述双键可以位于以下碳位置：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29。在一些实施方案中，A的1-、2-、3-、4-或5-碳链可以具有1、2、3或4个双键，且1-4个所述双键可以位于以下碳位置：1、2、3或4。在一些实施方案中，任何一种上述A基团可以与任何一种上述B基团组合。
在某些优选的实施方案中，B基团的碳链中可以具有12、13、14、15、16、17、18个碳原子。在其他实施方案中，A基团具有一个或两个碳原子。
在一些优选的实施方案中，B基团在碳链的一个或多个点具有一个双键。在更优选的实施方案中，B基团在碳链的第7位(从碳链的还原末端编号)具有一个双键。本领域技术人员应当意识到，B基团的一末端具有甲基，则B基团的另一末端具有羧基(C(＝O)O-)。B基团的具有甲基的末端是包含B基团的碳链的还原末端，因此，双键位于从B基团的甲基末端开始计算的第7位(例如，在B基团的第7个和第8个碳之间)。双键可以具有任何几何形状，因此，B基团中的双键可以是顺式的或反式的。
在一些实施方案中，脂肪酯包含直链脂肪酯。在一些实施方案中，脂肪酯包含支链脂肪酯。在一些实施方案中，脂肪酯包含环状部分。
在某些优选的实施方案中，脂肪酯可以选自十二烷酸甲酯、5-十二烯酸甲酯、十四烷酸甲酯、7-十四烯酸甲酯、十六烷酸甲酯、9-十六烯酸甲酯、十八烷酸甲酯、11-十八烯酸甲酯及以上的组合。
在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约5wt.％或更多的十二烷酸甲酯。在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约25％或更多的十二烷酸甲酯。在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约5wt.％至约25wt.％的十二烷酸甲酯。
在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约10wt.％或更少的7-十二烯酸甲酯。在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约0wt.％至约10wt.％的7-十二烯酸甲酯。
在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约30wt.％或更多的十四烷酸甲酯。在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约50wt.％或更少的十四烷酸甲酯。在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约30wt.％至约50wt.％得十四烷酸甲酯。
在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约10wt.％或更少的7-十四烯酸甲酯。在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约0wt.％至约10wt.％的7-十四烯酸甲酯。
在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约15wt.％或更少的十六烷酸甲酯。在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约0wt.％至约15wt.％的十六烷酸甲酯。
在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约10wt.％或更多的7-十六烯酸甲酯。在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约40wt.％或更少的9-十六烯酸甲酯。在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约10wt.％至约40wt.％的9-十六烯酸甲酯。
在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约15wt.％或更少的7-十八烯酸甲酯。在一些实施方案中，脂肪酯组合物包含约0wt.％至约15wt.％的7-十八烯酸甲酯。
可以利用具有相似或相同特征的底物制备并产生这些具有A侧和/或B侧典型特征的的示例性的脂肪酯产物。因此，导致产生脂肪酸衍生物的生物合成途径中的每一步骤都可以被改进，以便产生或超量产生通向脂肪醇和/或脂肪酸的底物。例如，宿主细胞中参与脂肪酸生物合成途径或参与脂肪醇途径的已知基因可以被表达、超表达或减弱，从而产生所需的底物(参见例如，WO2008/119082，通过引用将其公开内容并入本文)。
底物的合成
脂肪酸合酶(FAS)是催化酰基链的起始和延长的一组多肽(Marrakchiet al.，Biochemical Society，30：1050-1055，2002)。酰基载体蛋白(ACP)连同FAS途径中的酶控制所产生的脂肪酸衍生物的长度、饱和度以及分支情况。脂肪酸生物合成途径涉及前体乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。这个途径中的步骤是由脂肪酸生物合成的酶类(fab)和乙酰辅酶A羧化酶(acc)基因家族催化的(参见例如Heath et al.，Prog.Lipid Res.40(6)：467-97(2001))。
可以通过重组表达或超表达一种或多种脂肪酸合酶基因，例如乙酰辅酶A和/或丙二酰辅酶A合酶基因，将宿主细胞进行基因工程改造，使其表达脂肪酸衍生物底物。例如，为了增加乙酰辅酶A产生，可以在宿主细胞中表达一种或多种以下基因：pdh(包含aceEF(编码丙酮酸和2-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1p脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分)和lpd的多酶复合物)、panK、fabH、fabB、fabD、fabG、acpP和fabF。这些基因的示例性GenBank登录号为：pdh(BAB34380、AAC73227、AAC73226)、panK(也称为辅酶A、AAC76952)、aceEF(AAC73227、AAC73226)、fabH(AAC74175)、fabB(P0A953)、fabD(AAC74176)、fabG(AAC74177)、acpP(AAC74178)、fabF(AAC74179)。此外，可以通过用含有相应基因的无效或缺失突变的条件复制或非复制质粒进行转化或通过取代启动子或增强子序列，在工程化的宿主细胞中减弱或敲除fadE、gpsA、ldhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA和/或ackB的表达水平。这些基因的示例性GenBank登录号为：fadE(AAC73325)、gspA(AAC76632)、ldhA(AAC74462)、pflb(AAC73989)、adhE(AAC74323)、pta(AAC75357)、poxB(AAC73958)、ackA(AAC75356)和ackB(BAB81430)。得到的宿主细胞当在合适的环境中生长时，会具有增加的乙酰辅酶A产生水平。
例如，可以通过将四亚基蛋白accABCD(例如登录号AAC73296、EC6.4.1.2)的一个或多个或所有亚基引入宿主细胞来实现丙二酰辅酶A超表达。可以通过将编码脂肪酶(例如，登录号CAA89087、CAA98876)的DNA序列引入宿主细胞，在宿主细胞中进一步产生脂肪酸。
此外，抑制PlsB可以导致长链酰基ACP水平的增加，这会抑制途径中的早期步骤(例如，accABCD、fabH或fabI的表达)。plsB(例如，登录号AAC77011)D311E突变可以用于增加可用脂肪酸的量。
此外，可以将宿主细胞进行基因工程改造，使其超表达sfa基因(fabA的抑制基因，例如，登录号AAN79592)，从而增加单不饱和脂肪酸的产生(Rock et al.，J.Bacteriology 178：5382-5387，1996)。
可以通过修饰硫酯酶的表达来选择脂肪酸衍生物底物的链长度，硫酯酶影响所产生的脂肪酸的链长度。因此，可以将宿主细胞进行工程化改造，使其表达、超表达、减弱表达、或不表达一种或多种所选择的硫酯酶，从而增加优选的脂肪酸衍生物底物的产生。例如，可以通超表达具有产生C10脂肪酸偏好的硫酯酶并且减弱具有产生除C10脂肪酸外的脂肪酸偏好的硫酯酶(例如，偏好产生C14脂肪酸的硫酯酶)来产生C10脂肪酸。这将导致碳链长度例如为10的脂肪酸的相对同种的群体。在其他的情形下，可以通过减弱产生非C14脂肪酸的内源性硫酯酶并且表达利用C14-ACP的硫酯酶来产生C14脂肪酸。在一些情形下，可以通超表达利用C12-ACP的硫酯酶并同时减弱产生非C12脂肪酸的硫酯酶来产生C12脂肪酸。可以使用本领域已知的方法来核实乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、以及脂肪酸的过量产生，例如通过在细胞溶解后使用放射性前体、HPLC或GC-MS。在本文所述方法中可以使用的硫酯酶的非限制性实例列于表1中。
表1：硫酯酶
*Mayer et al.，BMC Plant Biology 7：1-11(2007)
在其它的情形中，在包含天然存在的突变的宿主细胞中产生脂肪酯，所述突变导致所述宿主细胞中脂肪酸的水平增加。在一些实例中，将所述宿主细胞进行基因基因工程改造，从而使所述宿主细胞中脂肪酸的水平相对于对应的野生型宿主细胞增加。例如，可以将所述宿主细胞进行基因工程改造，使其表达相对于对应的野生型宿主细胞降低或减弱水平的酰基辅酶A合酶。在一具体的实施方案中，通过基因工程改造其中一种或多种基因被缺失的“敲除”的宿主细胞可以消除所述一种或多种基因(例如酰基辅酶A合酶基因)的表达水平。
可以降低或敲除宿主细胞中任何已知的酰基辅酶A合酶基因。酰基辅酶A合酶基因的非限制性实例包括：fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因。酰基辅酶A合酶基因的具体实例包括：来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv的fadDD35[NP_217021]、来自结核分枝杆菌H37Rv的fadDD22[NP_217464]、来自大肠杆菌的fadD[NP_416319]、来自大肠杆菌的fadK[YP_416216]、来自不动杆菌ADP1的fadD[YP_045024]、来自流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)RdkW20的fadD[NP_438551]、来自沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)Bis B18的fadD[YP_533919]、来自耐碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125[NP_243969]的BH3101、来自荧光假单胞菌Pfo-1的Pfl-4354[YP_350082]、来自睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosterone)KF-1的EAV15023[ZP_01520072]、来自枯草芽孢杆菌的yhfL[NP_388908]、来自绿脓杆菌(P.aeruginosa)PAO1的fadD1[NP_251989]、来自茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)GM1 1000的fadD1[NP_520978]、来自绿脓杆菌PAO1的fadD2[NP_251990]、编码来自嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)R551-3的蛋白ZP_01644857的基因、来自酿酒酵母的faa3p[NP_012257]、来自酿酒酵母的faa1p[NP_014962]、来自枯草芽孢杆菌的lcfA[CAA99571]或描述于Shockey et al.，Plant.Physiol.129：1710-1722，(2002)；Caviglia et al.，J.Biol.Chem.279：1163-1169，(2004)；Knoll et al.，J.Biol.Chem.269(23)：16348-56，(1994)；Johnson et al.，J.Biol.Chem.269：18037-18046，(1994)；以及Blacket al.，J.Biol Chem.267：25513-25520，(1992)中的那些基因。
分支脂肪酯的形成
通过使用分支脂肪酸衍生物作为底物或前体，可以产生包含分支点的脂肪酯。例如，虽然大肠杆菌天然产生直链脂肪酸(sFA)，但是可以通过在大肠杆菌中引入并且表达或超表达提供分支前体的基因(例如bkd、ilv、icm和fab基因家族)来将大肠杆菌进行基因工程改造，使其产生支链脂肪酸(brFA)。此外，可以将宿主细胞进行基因工程改造，使其表达或超表达编码用于brFA的延长的一种或多种蛋白的一种或多种基因(例如ACP、FabF等)，和/或使其缺失或减弱通常导致sFA的对应宿主细胞基因。
形成brFA的第一步骤是利用支链氨基酸氨基转移酶产生对应的α-酮酸。宿主细胞可以内源性地包含编码这些酶的基因，或可以重组引入这些基因。例如，大肠杆菌内源性地表达此酶IlvE(EC 2.6.1.42；GenBank登录号YP_026247)。在一些宿主细胞中，可能不表达异源支链氨基酸氨基转移酶。但是，对于大肠杆菌IlvE或任何其他支链氨基酸氨基转移酶(例如，来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的IlvE(GenBank登录号AAF34406)、来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的IlvE(GenBank登录号NP_745648)或来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的IlvE(GenBank登录号NP_629657))，如果不是内源性的，可以将它们引入。
在另一实施方案中，可以通过使用Atsumi et al.，Nature 451：86-89，2008中所描述的方法实现α-酮酸的产生。例如，可以通过超表达编码IlvI、IlvH、IlvC或IlvD的基因来产生2-酮异戊酸酯。在另一个实例中，可以通过超表达编码IlvA和IlvI、IlvH(或枯草芽孢杆菌的AlsS)、IlvC、IlvD或它们的对应同系物的基因来产生2-酮-3-甲基-戊酸酯。在其它实施方案中，可以通过超表达编码IlvI、IlvH、IlvC、IlvD和LeuA、LeuB、LeuC、LeuD或它们的对应同系物的基因来产生2-酮-4-甲基-戊酸酯。
第二步骤是将α-酮酸氧化脱羧为对应的支链酰基CoA。该反应可以由支链α-酮酸脱氢酶复合物(bkd；EC 1.2.4.4.)(Denoya et al.，J.Bacteriol.177：3504，1995)催化，该复合物由E1α/β(脱羧酶)、E2(二氢硫辛酸转酰酶)和E3(二氢硫辛酸脱氢酶)亚基组成。这些支链α-酮酸脱氢酶复合物与丙酮酸和α-酮戊二酸脱氢酶复合物相似。具有brFA和/或生长在支链氨基酸上的任何微生物可以用作分离用于在例如大肠杆菌的宿主细胞中表达的bkd基因的来源。此外，大肠杆菌具有E3组分作为其丙酮酸脱氢酶复合物的一部分(lpd、EC 1.8.1.4、GenBank登录号NP_414658)。因此，仅表达E1a/β和E2 bkd基因就足够了。表2列出了来自几种微生物的、可以在宿主细胞中重组引入并表达以提供支链酰基CoA前体的bkd基因的非限制性实例。
表2：来自所选择的微生物的Bkd基因
在另一个实例中，可以通过在宿主细胞中(例如在大肠杆菌中)共表达丁烯酰辅酶A还原酶(Ccr，EC 1.6.5.5，1.1.1.1)与异丁酰基辅酶A变位酶(大亚基IcmA，EC 5.4.99.2；小亚基IcmB，EC 5.4.99.2)来产生异丁酰辅酶A(Han and Reynolds，J.Bacteriol.179：5157，1997)。丁烯酰辅酶A是大肠杆菌和其它的微生物中脂肪酸生物合成中的中间体。表3中列出了来自所选择的微生物的ccr和icm基因的非限制性实例。
表3：来自所选择的微生物的ccr和icm基因
除bkd基因的表达外，brFA生物合成的起始利用对支链酰基辅酶A具有特异性的β-酮酰-酰基-载体蛋白合酶III(FabH、EC 2.3.1.41)(Li et al.，J.Bacteriol.187：3795-3799，2005)。这些FabH酶的非限制性实例在表4中列出。可以在宿主细胞中表达参与任何含有brFA的微生物的脂肪酸生物合成的fabH基因。来自不天然产生brFA的宿主细胞的Bkd和FabH酶可能不支持brFA产生。因此，可以重组表达bkd和fabH。可以将含有bkd和fabH基因的载体插入这样的宿主细胞中。同样，Bkd和FabH的内源性产生水平可能不足以产生brFA。这种情况下，可以将它们超表达。此外，可以表达或超表达脂肪酸生物合成途径的其他组分，例如酰基载体蛋白(ACP)和β-酮酰-酰基-载体蛋白合酶II(fabF、EC 2.3.1.41)(来自选择的有机体的FabH、ACP和fabF基因的非限制性实例在表4中列出)。除表达这些基因外，可以减弱宿主细胞中内源性脂肪酸生物合成途径中的一些基因(例如，大肠杆菌基因fabH(GenBank登录号NP_415609)和/或fabF(GenBank登录号NP_415613))。
表4：来自所选择的具有brFA的微生物的FabH、ACP和fabF基因
Figure BPA00001479644500381
环状脂肪酯的形成
可以使用环状脂肪酸衍生物作为底物产生环状脂肪酯。为了产生环状脂肪酸衍生物底物，可以将提供环状前体的基因(例如ans、chc和plm基因家族)引入宿主细胞并使其表达，以允许从环状前体起始脂肪酸生物合成。例如，为了将例如大肠杆菌的宿主细胞转变为能够合成ω-环状脂肪酸衍生物(cyFA)的细胞，可以在宿主细胞中引入并表达提供环状前体环己基羰基辅酶A(CHC辅酶A)的基因(Cropp et al.，Nature Biotech.18：980-983，2000)。在大肠杆菌中提供CHC辅酶A的基因的非限制性实例包括：来自山丘链霉菌(Streptomyces collinus)的安莎三烯(ansatrienin)基因簇的ansJ、ansK、ansL、chcA和ansM(Chen et al.，Eur.J.Biochem.261：98-107，1999)或来自链霉菌(Streptomyces sp.)HK803的磷内酯霉素B(phoslactomycin B)基因簇的plmJ、plmK、plmL、chcA和plmM(Palaniappanet al.，J.Biol.Chem.278：35552-35557，2003)，以及来自山丘链霉菌、除虫链霉菌(S.avermitilis)或天蓝色链霉菌的chcB基因(Patton et al.，Biochem.39：7595-7604，2000)(参见表5)。此外，表4中所列举的基因倾向于具有宽的底物特异性，可以使它们表达以允许ω-环状脂肪酸的起始和延长。或者，可以从产生cyFA的微生物中分离同源基因并在宿主细胞(例如大肠杆菌)中表达该同源基因。
表5：用于CHC-辅酶A合成的基因
Figure BPA00001479644500391
*GenBank条目U72144中只注释了chcA，ansJKLM是根据Chen et al.(Eur.J.Biochem.261：98-107，1999)。
表4中所列的基因(fabH、acp、和fabF)允许ω-环状脂肪酸的起始和延伸，这是因为它们具有宽的底物特异性。若任何这些基因与表5中所列的基因共表达没有产生cyFA，那么可以从产生cyFA的微生物(例如表6中列出的那些微生物)中分离fabH、acp和/或fabF同系物(例如通过使用简并PCR引物或异源的DNA序列探针)并且将其共表达。
表6：包含ω-环状脂肪酸的微生物的非限制性实例
Figure BPA00001479644500401
*使用环庚基羰基辅酶A而非环己基羰基辅酶A作为cyFA生物合成的前体。
脂肪酯饱和水平
通过调节脂肪酸中间体的饱和度，可以控制脂肪酸的饱和度。例如，可以表达、超表达或以降低水平表达sfa、gns和fab基因家族以控制脂肪酸的饱和。很多这类基因描述于例如WO 2008/119082中，通过引用将其公开内容并入。这些基因家族的非限制性实例包括GenBank登录号：AAN79592、AAC44390、ABD18647.1、AAC74076.1、BAA16180、AAF98273、AAU39821或DDA05501。
例如，可以通过将生产宿主进行基因工程改造，使其超表达fabB或通过使生产宿主在低温(例如低于37℃)下生长而将宿主细胞进行改造，使其产生不饱和脂肪酸。FabB具有对于cis-δ3癸烯酰-ACP的偏向性并导致大肠杆菌中不饱和脂肪酸的产生。fabB的超表达导致显著百分比的不饱和脂肪酸的产生(de Mendoza et al.，J.Biol.Chem.258：2098-2101(1983))。在一些实施方案中，可以修饰内源fabB基因使其超表达。在一些其他的实施方案中，可以将异源fabB基因插入不是天然具有基因fabB的宿主细胞中并在其中表达。然后，在被进行基因工程改造从而产生诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的宿主细胞中，这些不饱和脂肪酸可以被用作中间体。
在其他情况下，可以缺失脂肪酸生物合成的阻抑物，例如fabR(GenBank登录号NP_418398)，这也可以导致大肠杆菌中不饱和脂肪酸产生的增加(Zhang et al.，J.Biol.Chem.277：15558，2002)。可以在其他宿主细胞中进行相似的缺失。例如，通过超表达fabM(反式-2，顺式-3-癸烯酰-ACP异构酶、GenBank登录号DAA05501)和来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的fabK(反式-2-烯酰-ACP还原酶II，GenBank登录号NP_357969)的受控表达(Marrakchi et al.，J.Biol.Chem.277：44809，2002)，同时缺失大肠杆菌fabI(反式-2-烯酰-ACP还原酶，GenBank登录号NP_415804)，可以实现不饱和脂肪酸的进一步增加。在一些实例中，可以减弱内源fabF基因，从而增加所产生的棕榈油酸酯(C16:1)的百分比。
在另外的实例中，可以通过降低sfa、gns、或fab基因的表达而将宿主细胞进行基因工程改造，使其产生饱和脂肪酸。
例如，可以将宿主细胞进行基因工程改造，使其表达降低水平的fabA和/或fabB。在一些实例中，可以使宿主细胞在不饱和脂肪酸的存在下生长。在其它的实例中，可以将宿主细胞进一步进行基因工程改造，使其表达或超表达编码脱饱和酶的基因。脱饱和酶的一个非限制性的实例是枯草芽孢杆菌DesA(AF037430)。编码脱饱和酶的其它基因在本领域是已知的，并且可以被用于本文所述的宿主细胞和方法中，诸如使用酰基-ACP(诸如十六烷酰-ACP或十八烷酰-ACP)的脱饱和酶。
酯合酶
可以通过酰基辅酶A:脂肪醇酰基转移酶合成脂肪酯，该酶通过酯键将醇连接于脂肪酰基辅酶A。已知酯合酶及其编码基因来自加州希蒙得木植物和细菌不动杆菌(Acinetobacter sp.)菌株ADP1(以前为乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)ADP1)。细菌酯合酶是双功能酶，表现酯合酶活性以及可由甘油二酯底物和脂酰基辅酶A形成甘油三酯的能力(酰基辅酶A:二甘油酰基转移酶(DGAT)活性)。基因wax/dgat编码酯合酶和DGAT两者。参见Cheng et al.，J.Biol.Chem.279(36)：37798-37807(2004)；Kalscheuer and Steinbuchel，J.Biol.Chem.278：8075-8082(2003)。
其他酯合酶(EC 2.3.1.20，2.3.1.75)是本领域内已知的，并且示例性的GenBank登录号包括但不限于，NP_190765、AAA16514、AAF19262、AAX48018、AAO17391或AAD38041。鉴定酯合酶活性的方法提供于例如美国专利第7,118,896号，通过引用将该专利整体并入本文。其他酯合酶包括双功能的酯合酶/酰基辅酶A:甘油二酯酰基转移酶，双功能的酯合酶/酰基辅酶A:甘油二酯酰基转移酶的非限制性实例包括多酶复合物，该多酶复合物来自希蒙得木(Simmondsia chinensis)、不动杆菌菌株ADP1(以前为乙酸钙不动杆菌ADP1)，泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、亚德海床杆菌(Fundibacterjadensis)、拟南芥或真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)(后来重命名为真养雷氏菌)。在一个实施方案中，脂肪酸延长酶、酰基辅酶A还原酶或蜡合酶可以来自真养产碱杆菌(后来重命名为真养雷氏菌)的或其他有机体的多酶复合物，所述其他有机体在文献中已知产生诸如蜡或脂肪酯的酯。编码可用于产生脂肪酯的酯合成蛋白的异源DNA序列的其他来源包括但不限于，高山被孢霉(Mortierella alpina)(例如，ATCC 32222)、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)(也被称为Apiotricum curvatum)、亚德食烷菌(Alcanivorax jadensis)(例如T9T＝DSM 12718＝ATCC 700854)、不动杆菌HO1-N(例如，ATCC 14987)、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)(例如，PD630、DSMZ 44193)以及来自除烃海杆菌(Marinobacterhydrocarbonoclastics)(例如，DSM 8798)的酯合酶。
将宿主细胞进行基因工程化使其产生脂肪酯
如本文所述，可以将不同的宿主细胞用于产生脂肪酯。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本文所述的多肽可以在以下细胞中表达：细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cv1细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或PC12细胞)。其他示例性的宿主细胞包括来自以下属的成员的细胞：埃希氏菌属、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、曲霉属、木霉属、脉孢菌属、镰刀菌属、腐质霉属、根毛霉属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属、毛霉菌属、蚀丝霉属、青霉属、平革菌属、侧耳属、栓菌属、金黄孢子菌属、酵母属、裂殖酵母属、耶氏酵母属或链霉菌属。其他示例性的宿主细胞可以是迟缓芽孢杆菌细胞、短芽孢杆菌细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌细胞、地衣芽孢杆菌细胞、嗜碱芽孢杆菌细胞、凝结芽孢杆菌细胞、环状芽孢杆菌细胞、短小芽孢杆菌细胞、苏云金芽孢杆菌细胞、克劳氏芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、解淀粉芽孢杆菌细胞、康宁木霉细胞、绿色木霉细胞、里氏木霉细胞、长枝木霉细胞、泡盛曲霉细胞、烟曲霉细胞、臭曲霉细胞、构巢曲霉细胞、黑曲霉细胞、米曲霉细胞、特异腐质霉细胞、棉毛状腐质霉细胞、米黑根毛霉细胞、米黑毛霉细胞、浅青紫链霉菌细胞、鼠灰链霉菌细胞或放线菌细胞。其它的宿主细胞是蓝细菌宿主细胞。
在某些实施方案中，宿主细胞是放线菌、酿酒酵母、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)(或固定化解脂耶氏酵母)、大肠杆菌、节杆菌(Arthrobacter)AK 19、粘红酵母(Rhodotorula glutinims)、不动杆菌M-1细胞或来自其它产油微生物的细胞。
在其他实施方案中，所述宿主细胞是来自真核植物、藻类、蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌、紫非硫细菌、嗜极生物、酵母、真菌、以上的基因工程化有机体或合成的有机体的细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是光依赖性的或固定碳。在一些实施方案中，所述宿主细胞具有自养活性。在一些实施方案中，所述宿主细胞具有光合自养活性，例如在存在光的情况下。在某些实施方案中，宿主细胞是来自拟南芥、柳枝稷、巨芒、玉米、葡萄藻、莱茵衣藻、杜氏盐藻、细长嗜热聚球蓝细菌、绿硫菌、橙色绿屈挠菌、酒色着色菌、深红红螺菌、荚膜红细菌、沼泽红假单胞菌、扬氏梭菌、热纤梭菌或产黄青霉。在某些其他实施方案中，宿主细胞来自巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、粟酒裂殖酵母、荧光假单胞菌或运动发酵单胞菌。在其他实施方案中，宿主细胞来自聚球蓝细菌PCC 7002、细长聚球蓝细菌PCC 7942或集胞蓝细菌PCC6803。
在优选的实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞、酿酒酵母细胞或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的实施方案中，宿主细胞来自大肠杆菌菌株B、C、K或W。其它适宜的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
本领域公知的各种方法可用于将宿主细胞进行基因工程改造，使其产生脂肪酯。所述方法可以包括使用包含编码本文所述的脂肪酸生物合成多肽的核酸的载体，优选表达载体。本领域技术人员应当理解，多种病毒载体(例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体以及腺相关病毒载体)和非病毒载体可以用于本文所述的方法中。
本文所述的重组表达载体包括适于宿主细胞中核酸表达的形式的本文所述的核酸。所述重组表达载体可以包括一个或多个基于将被用于表达的宿主细胞所选择的控制序列。所述控制序列被可操作地连接到待表达的核酸序列。这些控制序列描述于，例如Goeddel，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology(基因表达技术：酶学方法)185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)。控制序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些控制序列和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的那些控制序列(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员应当理解到，表达载体的设计可以取决于，例如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等因素。可以将本文所述的表达载体引入宿主细胞，以产生本文所述核酸所编码的多肽，包括融合多肽。
可以设计重组表达载体用于在原核或真核细胞(例如，诸如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达脂肪酸生物合成多肽或变体。适合的宿主细胞在Goeddel，GeneExpression Technology：Methods in Enzymology(基因表达技术：酶学方法)185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中进一步作了详细讨论。可选地，所述重组表达载体可以在体外进行转录和翻译，例如通过使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
最经常用含有指导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体在诸如大肠杆菌的原核生物中进行多肽表达。融合载体将许多氨基酸添加到其编码的多肽，通常添加到重组多肽的氨基末端。这些融合载体通常担任3个用途：(1)增加重组多肽的表达；(2)增加重组多肽的可溶性；和(3)通过作为亲和纯化中的配体，帮助重组多肽的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组多肽的连接处引入蛋白水解切割位点。这使得在融合多肽纯化后，重组多肽能够从融合部分分离。这些酶及其同源识别序列的实例包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。示例性的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith et al.，Gene 67：31-40(1988))、pMAL(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)和pRITS(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合到靶重组多肽。
诱导型、非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann et al.，Gene 69：301-315(1988))和pET 11d(Studier et al.，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology(基因表达技术：酶学方法)185，Academic Press，San Diego，Calif.60-89(1990))。从pTrc载体表达靶基因依赖于来自杂合trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。从pET 11d载体表达靶基因依赖于共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)所介导的来自T7 gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由来自携带T7 gn1基因的定居λ原噬菌体的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供，所述T7gn1基因受lacUV 5启动子的转录控制。
使重组多肽表达最大化的一种策略是，在蛋白水解切割重组多肽的能力受损的宿主细胞中表达多肽(参见Gottesman，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology(基因表达技术：酶学方法)185，Academic Press，San Diego，Calif.119-128(1990))。另一策略是改变待插入表达载体中的核酸序列，使得每个氨基酸的单独密码子是所述宿主细胞偏好使用的那些密码子(Wada et al.，Nucleic Acids Res.20：2111-2118(1992))。通过标准DNA合成技术可以进行该核酸序列的改变。
在另一实施方案中，宿主细胞是酵母细胞。在该实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldari et al.，EMBO J.(1987)6：229-234)、pMFa(Kurjan etal.，Cell 30：933-943(1982))、pJRY88(Schultz et al.，Gene 54：113-123(1987))、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)和picZ(Invitrogen Corp，San Diego，Calif.)。
可选地，使用杆状病毒表达载体，可以在昆虫细胞中表达本文所述的多肽。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括，例如pAc系列(Smith et al.，Mol.Cell Biol.3：2156-2165(1983))和pVL系列(Lucklow et al.，Virology 170：31-39(1989))。
在另一实施方案中，可以使用哺乳动物表达载体，在哺乳动物细胞中表达本文所述的核酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，Nature 329：840(1987))和pMT2PC(Kaufman et al.，EMBO J.6：187-195(1987))。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能可以由病毒调节元件提供。例如，通常使用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于原核和真核细胞都合适的其他表达系统描述于Sambrook et al.，eds.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd(分子克隆：实验手册，第2版)，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989的16和17章中。
通过常规转化或转染技术可以将载体引入原核或真核细胞。本文所用的术语“转化”和“转染”是指许多领域公认的用于将外源核酸(例如DNA)引入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。转化或转染宿主细胞的合适的方法可以见于例如Sambrook et al.(同上)。
对于细菌细胞的稳定转化，已知的是，根据所用的表达载体和转化技术，仅小部分的细胞会摄入并复制所述表达载体。为了鉴定和选择这些转化体，可以将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与目的基因一同引入宿主细胞中。选择标记包括赋予药物抗性的那些标记，所述药物诸如氨苄西林、卡那霉素、氯霉素或四环素。编码选择标记的核酸可以在与编码本文所述多肽的载体相同的载体上被引入宿主细胞或可以在单独的载体上被引入。可以通过药物选择鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，具有并入的选择标记基因的细胞会存活，而其他细胞死亡)。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知的是，根据使用的表达载体和转染技术，仅小部分的细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，可以将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与目的基因一同引入宿主细胞中。优选的选择标记包括赋予药物抗性的那些标记，所述药物诸如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。编码选择标记的核酸可以在与编码本文所述的多肽的载体相同的载体上被引入宿主细胞或可以在单独的载体上被引入。可以通过药物选择鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，具有并入的选择标记基因的细胞会存活，而其他细胞死亡)。
转运蛋白
转运蛋白可以将多肽和有机化合物(例如脂肪酯)输出宿主细胞。很多转运和外排蛋白用于分泌多种化合物并且可以被天然修饰，从而对于特定类型的脂肪酯具有选择性。
合适的转运蛋白的非限制性实例是ATP结合盒(ABC)转运蛋白、外排蛋白和脂肪酸转运蛋白(FATP)。合适的转运蛋白的其他非限制性实例包括来自诸如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、拟南芥(Arabidopsisthalania)、真养产碱杆菌(Alkaligenes eutrophus)和红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)的生物体的ABC转运蛋白。可以使用的示例性ABC转运蛋白例如在WO 08/119082中描述，通过引用将其公开内容并入本文。示例性的GenBank登录号包括但不限于CER5[GenBank登录号：At1g51500、AY734542、At3g21090或At1g51460]、AtMRP5[GenBank登录号：NP_171908]、AmiS2[GenBank登录号JC5491]或AtPGP1[GenBank登录号：NP_181228]。也可以根据宿主细胞分泌有机化合物的内源能力来选择宿主细胞。有机化合物产生和分泌进入宿主细胞环境(例如培养基、发酵液)的效率可以表达为细胞内产物与细胞外产物的比值。在一些实施例中，该比值可以为约5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4或1∶5。
在某些实施方案中，通过本文的宿主细胞所产生的脂肪酯存在于细胞外环境。在一些实施方案中，所述脂肪酯从宿主细胞的细胞外环境分离得到。在一些其他实施方案中，所述脂肪酯部分或完全地从宿主细胞自发分泌。在其他实施方案中，任选地在本文所述的一种或多种合适的转运蛋白的辅助下，所述脂肪酯被运输到细胞外环境。在其他实施方案中，所述脂肪酯被动运输到细胞外环境。
发酵
通过使用有益发酵技术，可以增强脂肪酯的产生和分离。使产量最大化同时降低费用的一种方法是增加被转变为脂肪酯产物的碳源的百分比。
在正常的细胞生命周期中，碳被用于细胞功能，例如产生脂质、糖类、蛋白质、有机酸和核酸。降低生长相关活性所必需的碳的量可以增加碳源转变为产物的效率。可以通过例如首先使宿主细胞生长到所需密度(例如，达到对数生长期高峰的密度)来实现这点。在这点上，可以使用复制检查点基因(replication checkpoint gene)阻止细胞生长。具体而言，群体感应机制(quorum sensing mechanisms)(综述于Camilli et al.，Science311：1113，2006；Venturi FEMS Microbio.Rev.30：274-291，(2006)；和Readinget al.，FEMS Microbiol.Lett.254：1-11，(2006))可以用于激活例如p53、p21的检查点基因或其他检查点基因。
可以被激活以阻止大肠杆菌中细胞复制和生长的基因包括umuDC基因。umuDC基因的超表达阻止从静止期到指数性生长的进展(Murli et al.，J.of Bact.182：1127，(2000))。UmuC是可以对非编码损伤进行跨损伤修复(translesion synthesis)的DNA聚合酶，所述非编码损伤是大部分UV和化学诱变的机制基础。umuDC基因产物参与跨损伤修复的过程并且还作为DNA序列损伤检查点。umuDC基因产物包括UmuC、UmuD、umuD′、UmuD′2C、UmuD′2和UmuD2。同时，可以激活产生产物的基因，从而在产生脂肪酯的同时，使复制和保持待使用的途径的需要最小化。通过umuC和umuD与合适的终产物产生基因的重新合成，可以将宿主细胞进行基因工程，使其在prpBCDE启动子系统下的pBAD24中从大肠杆菌表达umuC和umuD。
转变为脂肪酯的输入碳的百分比可以是成本动因。该过程的效率更高(即转变为脂肪酯的输入碳的百分比越高)，该过程的耗费越小。对于含氧碳源(例如葡萄糖和其他基于碳水化合物的来源)，氧必须以二氧化碳的形式释放。对于每2个释放的氧原子，碳原子也被释放，这导致约34％(w/w)的最大理论代谢效率(对于脂肪酸来源的产物)。但是，这个数字对于其他有机化合物产物和碳源会变化。文献中的通常效率约低于5％。进行基因工程从而产生脂肪酯的宿主细胞可以具有大于约1、3、5、10、15、20、25和30％的效率。在一个实例中，宿主细胞可以表现出约10％至约25％的效率。在其他实例中，这些宿主细胞可以表现出约25％至约30％的效率。在其他实例中，宿主细胞可以表现出大于30％的效率。
另外，可以将宿主细胞进行基因工程改造，使其表达重组纤维小体，例如PCT申请第PCT/US2007/003736号中描述的那些。这些纤维小体可以允许宿主细胞使用纤维素原料作为碳源。例如，可以另外将宿主细胞进行基因工程，使其表达转化酶(EC 3.2.1.26)，使得蔗糖可以被用作碳源。相似地，可以使用美国专利第5,000,000号、第5,028,539号、第5,424,202号、第5,482,846号和第5,602,030号中描述的教导将宿主细胞进行基因工程，使得宿主细胞可以有效地吸收碳并使用纤维素原料作为碳源。
在一个实例中，发酵室可以将正在进行连续还原的发酵封闭。这种情况下，可以创造稳定的还原环境。通过二氧化碳的释放(以气体形式)可以保持电子平衡。提高NAD/H和NADP/H平衡的努力也可以有助于稳定电子平衡。通过将宿主细胞进行基因工程，使其表达NADH:NADPH转氢酶，也可以增强细胞内NADPH的可利用性。一个或多个NADH:NADPH转氢酶的表达将糖酵解中产生的NADH转变为NADPH，NADPH可以增强脂肪酸的产生。
对于小规模生产，可以使工程化的宿主细胞批量生长，例如约100mL、500mL、1L、2L、5L或10L；进行发酵；并且基于适当的质粒中编码的具体基因，诱导表达所希望的生物合成基因。对于大规模生产，可以使工程化的宿主细胞批量生长，约10L、100L、1000L、10,000L、100,000L、1,000,000L或更大；进行发酵；并且基于适当的质粒中编码的的具体基因，诱导表达所希望的生物合成基因。
例如，可以将携带包含所需生物合成基因的质粒的或具有整合入染色体中的生物合成基因的合适的生产宿主(例如大肠杆菌细胞)在合适的反应器(例如1L的反应器)中、在37℃下、在补充有2％葡萄糖、羧苄西林以及氯霉素的M9培养基中孵育20小时。当培养物的OD600达到0.9时，可以用IPTG诱导生产宿主，从而激活用于产生脂肪酯的工程化基因系统。在孵育之后，可以萃取消耗过的培养基并且可以使用GC-MS检测有机相中脂肪酯的存在。
在一些实例中，第一小时的诱导后，可以每小时移除不多于10％的全部细胞体积的部分并允许其静置而不摇动以允许脂肪酯上升至表面并经历自发的相分离或沉淀。然后可以收集脂肪酯组分，并且将水相返回到反应室。可以连续操作反应室。当OD600下降至0.6以下时，可以用生长自种子培养物的新批次替换细胞。
葡萄糖
在一些情况下，用葡萄糖作为碳源来实施本文所述方法。在某些情况下，微生物在含有初始葡萄糖浓度为约2g/L至约50g/L，例如约5g/L至约20g/L的培养基中生长。在一些情况下，随着微生物消耗葡萄糖，培养基的葡萄糖浓度从初始葡萄糖浓度下降，并且在脂肪酯产生过程期间，维持培养基中约0g/L至约5g/L葡萄糖的浓度。在某些情况下，以约50％至约65％的葡萄糖溶液向微生物供应葡萄糖。
在一些情况下，将发酵罐中葡萄糖的供应率设定为与细胞的生长速率匹配，以避免葡萄糖的过量积累(即＞0％葡萄糖)。在其他情况下，维持低浓度的过量葡萄糖(例如，约2g/L至约5g/L)。
在某些情况下，从除了葡萄糖之外的碳水化合物产生脂肪酯，所述除了葡萄糖之外的碳水化合物包括但不限于果糖、水解的蔗糖、水解的糖蜜和甘油。
产生后加工
可以从发酵培养基中分离发酵中产生的脂肪酯。可以使用从水性培养基分离脂肪酯的任何已知技术。一个示例性分离过程是两相(twophase)(两相(bi-phasic))分离过程。该过程涉及使基因工程宿主细胞在足以产生脂肪酯的条件下发酵，允许脂肪酯收集在有机相中并从水性发酵液分离该有机相。可以在批次发酵过程和连续发酵过程中实施该方法。
两相分离利用脂肪酯的相对不混溶性来促进分离。不混溶是指化合物相对不溶于水的能力并且由化合物的分配系数所限定。本领域技术人员应当理解到，通过选择发酵液和有机相，使产生的脂肪酯具有高logP值，这样即使脂肪酯在发酵容器中处于非常低的浓度也可以被分离到有机相。
通过本文所述的方法产生的脂肪酯在发酵液以及细胞质中可以是相对不混溶的。因此，无论在细胞内或细胞外，脂肪酯可以收集在有机相中。有机相中产物的收集可以减轻脂肪酯对细胞功能的影响并可以允许宿主细胞产生更多产物。
本文所述的方法可以导致同质化合物的产生，其中至少约60％、70％、80％、90％或95％的产生的脂肪酯所具有的碳链长度变化少于约6个碳、少于约4个碳或少于约2个碳。产生的这些化合物也可以具有相对一致的饱和度。这些化合物可以直接用作燃料、燃料添加剂、用于生产其他化学化合物(例如聚合物、表面活性剂、塑料、纺织品、溶剂、粘合剂等)的起始原料或个人护理产品添加剂。这些化合物也可以用作例如氢化、催化裂解的后续反应(通过氢化、热解或两者)的原料以制造其他产品。
在一些实施方案中，使用本文所述的方法产生的脂肪酯可以含有约50％至约90％的碳；或约5％至约25％的氢。在其他实施方案中，使用本文所述的方法产生的脂肪酯可以含有约65％至约85％的碳；或约10％至约15％的氢。
生物产品
包含生物学上产生的有机化合物，特别是使用本文脂肪酸生物合成途径生物学上产生的脂肪酯的生物产品(例如按照本公开产生的脂肪酯)不是从可再生的来源产生的，并且因此是新的物质组合物。基于双重碳同位素指纹法(dual carbon-isotopic fingerprinting)或14C年代测定，可以将这些新的生物产物与来源于石油化学碳的有机化合物区别开。此外，可以通过双重碳同位素指纹法(例如参见美国专利第7,169,588号，通过引用将其并入本文)确定生物来源碳的具体来源(例如葡萄糖与甘油相比)。
在商业中，区别生物产品与基于石油的有机化合物的能力在追踪这些材料方面是有益的。例如，包含基于生物学的和基于石油的碳同位素谱二者的有机化合物或化学品可以区别于仅由基于石油的材料制成的有机化合物和化学品。因此，在商业中，可以基于本文生物产品的独特的碳同位素谱来追踪或跟踪它们。
通过比较各燃料中稳定碳同位素比(13C/12C)，可以将生物产品区别于基于石油的有机化合物。给定的生物产品中13C/12C比是大气二氧化碳中该二氧化碳被固定时的13C/12C比的结果。它还反映了准确的代谢途径。还存在区域性差异。石油，C3植物(阔叶树)，C4植物(草)以及海产的碳酸盐类在13C/12C以及相应的δ13C值中全部表现出显著差异。此外，C3和C4植物的脂质分析不同于来源于相同植物的作为代谢途径结果的碳水化合物组分的材料。
在测量精度之内，由于同位素分馏效应13C表现出大的差异，对于生物产品最显著的效应是光合机制。植物中碳同位素比中差异的主要原因与植物中光合碳代谢通路的差异紧密相关，特别是在初级羧化(即大气CO2的初始固定)期间发生的反应。两大类植物是涉及“C3”(或Calvin-Benson)光合循环以及涉及“C4”(或Hatch-Slack)光合循环的植物。
在C3植物中，初级CO2固定或羧化反应涉及酶核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶，并且第一稳定产物是3-碳化合物。诸如阔叶树和针叶树的C3植物在温带气候地带中是最主要的。
在C4植物中，涉及另一种酶(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)的其它羧化反应是初级羧化反应。第一稳定的碳化合物是4-碳的酸，所述4-碳的酸随后被脱羧基。如此释放的CO2被C3循环再固定。C4植物的实例是热带牧草、玉米和甘蔗。
C4和C3植物都表现出一定范围的13C/12C同位素比，但是对于C4植物，通常的值是约-7‰至约-13‰，并且对于C3植物，是约-19‰至约-27‰(例如参见Stuiver et al.，Radiocarbon 19：355，1977)。煤和石油通常落在后一范围内。13C测量标准最初由皮迪箭石(Pee Dee Belemnite(PDB))石灰石设定的零所定义，其中给出的值是与该材料的偏差的千分比。“δ13C”值被表达为千分比(千分之一)，缩写为‰，并且按照以下进行计算：
δ13C(‰)＝[(13C/12C)样品-(13C/12C)标准品]/(13C/12C)标准品×1000
因为PDB参考物(RM)已经被耗尽，已经与IAEA、USGS、NIST和其它选定的国际同位素实验室合作开发了一系列备选RM。与PDB的偏差的千分比的记号为δ13C。通过对质量44、45以及46的分子离子的高精度稳定比率质谱(IRMS)对CO2进行测量。
本文所述的组合物包括通过本文所述的任何方法产生的生物产品，包括例如脂肪酯产品。具体而言，所述生物产品的δ13C可以为约-28或更大、约-27或更大、约-20或更大、约-18或更大、约-15或更大、约-13或更大、约-10或更大或约-8或更大。例如所述生物产品的δ13C可以为约-30至约-15、约-27至约-19、约-25至约-21、约-15至约-5、约-13至约-7或约-13至约-10。在其它的实例中，所述生物制品的δ13C可以为约-10、-11、-12或-12.3。
也可以通过比较每种化合物中14C的量，将生物产品(包括按照本文公开产生的生物产品)区别于基于石油的有机化合物。因为14C具有5730年的核半衰期，所以包含“较老的”碳的基于石油的燃料可以区别于包含“较新的”碳的生物产品(参见例如Currie，“Source Apportionment ofAtmospheric Particles”，Characterization of Environmental Particles，J.Buffle以及H.P.van Leeuwen，Eds.，1 of Vol.I of the IUPAC EnvironmentalAnalytical Chemistry Series(Lewis Publishers，Inc)3-74，(1992))。
放射性碳年代测定的基本假设是大气中14C浓度的恒定性导致活生物中14C的恒定性。然而，由于1950年以来的大气层核试验以及1850年以来的化石燃料的燃烧，14C已经获得了继发的地球化学时间特征(geochemical time characteristic)。大气CO2中以及生物圈中14C的浓度在19世纪60年代中期核试验的高峰时几乎翻倍。此后，14C的浓度逐渐地返回到约1.2×10-12的稳态宇宙发生(大气)基线同位素率(14C/12C)，大致的驰豫“半衰期”(relaxation“half-life”)为7至10年。(后一半衰期必须不能按照字面理解；而是必须使用详细的大气核输入/衰变函数来追踪核时代开始以来的大气和生物圈14C的变化。)
该后一生物圈14C时间特征支持每年年代测定近代生物圈碳。可以通过加速器质谱(AMS)测量14C，给出的结果的单位为“现代碳比例”(fM)。fM是由国家标准与技术协会(NIST)标准参照物质(SRM)4990B和4990C所定义的。本文使用的“现代碳比例”或“fM”具有相同意义，都是按照国家标准与技术协会(NIST)标准参照物质(SRM)4990B和4990C定义的，4990B和4990C分别被称为草酸标准品HOxI和HOxII。基本的定义涉及0.95倍的14C/12C同位素比HOxI(参考AD 1950)。这粗略地等于衰变校正的工业革命前树木(decay-corrected pre-Industrial Revolution wood)。对于现今生命生物圈(植物物质)而言，fM约为1.1。
本发明提供含有可以具有至少约1的fM 14C的一种或多种脂肪酯的生物产品。例如，本发明的生物产品可以具有至少约1.01的fM 14C、约1至约1.5的fM 14C、约1.04至约1.08的fM 14C或约1.111至1.124的fM 14C。
14C的另一种测量被称为现代碳百分比(pMC)。对于使用14C年代测定的考古学家或地质学家，AD 1950等于“旧的零年”。这还代表100pMC。在1963年热核武器的顶峰，大气中的“炸弹碳”达到正常水平的几乎两倍。“炸弹碳”在大气中的分布自其出现以来是一致的，对于自从AD 1950生活的植物和动物，表现出大于100pMC的值。随着时间它已经逐渐降低，当今的值是接近107.5pMC。这意味着诸如玉米的新生物质材料应当给出接近107.5pMC的14C特征。基于石油的化合物应具有零的pMC值。化石碳与现代碳的组合会导致当代pMC含量的稀释。通过假定107.5pMC代表当代生物质材料的14C含量并且0pMC代表基于石油的产品的14C含量，该材料所测量的pMC值会反映两种组分类型的比例。例如，100％来源于当代大豆的材料应当给出接近107.5pMC的放射性碳特征。若用基于石油的制品将该材料稀释50％，它应当给出约54pMC的放射性碳特征。
通过将107.5pMC指定为“100％”并且将0pMC指定为“0％”而衍生得到基于生物学的碳含量。例如，测量为99pMC的样品会给出93％的等同的基于生物学的碳含量。该值被称为平均的基于生物学的碳结果并且假定在所分析的材料之内全部组分起源于当代的生物材料或基于石油的材料。
本文所述的含有一种或多种脂肪酯的生物产品的pMC可以为至少约50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100。在其它的实例中，本文所述的生物产品的pMC可以为约50-约100；约60-约100；约70-约100；约80-约100；约85-约100；约87-约98；或约90-约95。在其它的实例中，本文所述的生物产品的pMC可以为约90、91、92、93、94或94.2。
通过本文所述方法产生的脂肪酯可用作生物燃料。例如，本文所述的脂肪酸甲酯可以单独地用作生物柴油或用作生物柴油的组分。
通过以下实施例进一步说明本发明。所提供的这些实例只是用于说明性的目的。它们不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例
实施例1-大肠杆菌MG1655ΔfadE的产生
本实施例描述了其中脂肪酸降解酶的表达被减弱的基因工程微生物的构建。
利用Datsenko et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645(2000)中所描述的λRed(还称为Red驱动的整合)系统缺失大肠杆菌MG1655(大肠杆菌菌株K)的fadE基因，同时进行了如下改动。
用于产生缺失的两条引物：
Del-fadE-F
5’-AAAAACAGCAACAATGTGAGCTTTGTTGTAATTATATTGTAAACATATTGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO：1)
Del-fadE-R
5’-AAACGGAGCCTTTCGGCTCCGTTATTCATTTACGCGGCTTCAACTTTCCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO：2)
Del-fadE-F和Del-fadE-R引物用于通过PCR从质粒pKD13(如Datsenko et al.中所述，同上)扩增卡那霉素抗性(KmR)盒。然后用PCR产物转化含有pKD46的电转感受态大肠杆菌MG1655细胞(如Datsenko et al.中所述，同上)。这些细胞之前已用阿拉伯糖诱导了3-4小时。于37℃在具有代谢产物抑制物的最佳肉汤(SOC)培养基中生长3小时之后，将细胞接种于含有50μg/mL卡那霉素的Luria琼脂板上。在37℃过夜孵育之后，鉴定并分离抗性菌落。通过利用引物fadE-L2和fadE-R1的PCR扩增验证所选菌落中fadE基因的破坏，fadE-L2和fadE-R1被设计为位于fadE基因的侧翼。
fadE-L2 5’-CGGGCAGGTGCTATGACCAGGAC(SEQ ID NO：3)
fadE-R1 5’-CGCGGCGTTGACCGGCAGCCTGG(SEQ ID NO：4)
在验证了fadE缺失之后，利用Datsenko et al.，同上.中所描述的pCP20质粒使单菌落去除KmR标记。得到的缺失fadE基因并去除KmR标记的MG1655大肠杆菌菌株被称为大肠杆菌MG1655ΔfadE或大肠杆菌MG1655D1。
实施例2-大肠杆菌MG1655ΔfadEΔfhuA的产生
本实施例描述了其中脂肪酸降解酶和外膜蛋白受体的表达被减弱的基因工程微生物的构建。
使用Datsenko et al.，同上.中所述的λRed系统将编码铁色素外膜转运蛋白(GenBank登录号NP_414692)的大肠杆菌MG1655的fhuA(也称为tonA)基因从实施例1的大肠杆菌MG1655D1缺失，但是进行了如下改动。
用于产生缺失的两条引物：
Del-fhuA-F
5’-ATCATTCTCGTTTACGTTATCATTCACTTTACATCAGAGATATACCAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO：5)；
Del-fhuA-R
5’-GCACGGAAATCCGTGCCCCAAAAGAGAAATTAGAAACGGAAGGTTGCGG TTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO：6)
Del-fhuA-F和Del-fhuA-R引物用于通过PCR从质粒pKD13扩增KmR盒。用所获得的PCR产物转化含有pKD46的电转感受态大肠杆菌MG1655D1细胞(参见实施例1)。这些细胞之前已用阿拉伯糖诱导了3-4小时。于37℃在SOC培养基中生长3小时之后，将细胞接种于含有50μg/mL卡那霉素的Luria琼脂板上。在37℃过夜孵育之后，鉴定并分离抗性菌落。通过利用引物fhuA-verF和fhuA-verR的PCR扩增验证所选菌落中fadE基因的破坏，fhuA-verF和fhuA-verR被设计为位于fhuA基因的侧翼。
用以下引物进行缺失的验证：
fhuA-verF 5’-CAACAGCAACCTGCTCAGCAA(SEQ ID NO：7)
fhuA-verR 5’-AAGCTGGAGCAGCAAAGCGTT(SEQ ID NO：8)
在验证了fhuA缺失之后，利用Datsenko et al，同上.中所描述的pCP20质粒使单菌落去除KmR标记。得到的缺失fadE和fhuA基因的MG1655大肠杆菌菌株被称为大肠杆菌MG1655ΔfadEΔfhuA或大肠杆菌MG1655DV2。
实施例3-大肠杆菌MG1655ΔfadE，ΔfhuA，lacZ::‘tesA fadD atfA1的产生
本实施例描述了基因工程微生物的构建，其中编码硫酯酶、酰基辅酶A合酶和酯合酶的核苷酸序列被整合进该微生物的染色体中。
以下核苷酸序列：‘tesA、fadD和aftA1被整合进大肠杆菌MG1655ΔfadEΔfhuA菌株(或DV2菌株，参见实施例2)染色体的lacZ基因座中。这些序列被整合的顺序为‘tesA，之后为fadD，然后为aftA1。
‘tesA是包含无前导子的大肠杆菌tesA(GenBank词条AAC73596、refseq登录号U00096.2)的核苷酸序列。‘tesA编码大肠杆菌硫酯酶(EC3.1.1.5，3.1.2.-)，在该硫酯酶中前25个氨基酸被缺失，并且第26位的丙氨酸用蛋氨酸取代。这个蛋氨酸变成‘tesA的第一个氨基酸。参见Cho et al.，J.Biol.Chem.，270：4216-4219(1995)。
大肠杆菌fadD(GenBank词条AAC74875；REFSEQ：登录号U00096.2)编码酰基辅酶A合酶。
泊库岛食烷菌菌株SK2 atfA1(GenBank词条YP_694462；REFSEQ：登录号NC_008260.1)编码酯合酶。
按以下所述，‘tesA、fadD和atfA1被整合进大肠杆菌MG1655 DV2染色体的lacZ基因座中，所有基因均在Trc启动子的控制下。‘tesA、fadD、atfA1整合盒的设计和产生
‘tesA质粒的构建
从按以下所述构建的pETDuet-1-‘tesA质粒扩增‘tesA(还参见，例如，WO 2007/136762A2，通过引用并入)。将‘tesA基因克隆入NdeI/AvrII消化的pETDuet-1质粒中(Novagen，Madison，WI)。
fadD质粒的构建
从按以下所述构建的pHZ1.61质粒扩增fadD。将fadD基因克隆入pCDFDuet-1质粒(Novagen，Madison，WI)，位于T7启动子的控制下，产生含有下列核苷酸序列的pHZ1.61质粒：
GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTGTAGAAATAATTTTGTT
TAACTTTAATAAGGAGATATACCATGGTGAAGAAGGTTTGGCTTAAC
CGTTATCCCGCGGACGTTCCGACGGAGATCAACCCTGACCGTTATC
AATCTCTGGTAGATATGTTTGAGCAGTCGGTCGCGCGCTACGCCGAT
CAACCTGCGTTTGTGAATATGGGGGAGGTAATGACCTTCCGCAAGC
TGGAAGAACGCAGTCGCGCGTTTGCCGCTTATTTGCAACAAGGGTT
GGGGCTGAAGAAAGGCGATCGCGTTGCGTTGATGATGCCTAATTTA
TTGCAATATCCGGTGGCGCTGTTTGGCATTTTGCGTGCCGGGATGAT
CGTCGTAAACGTTAACCCGTTGTATACCCCGCGTGAGCTTGAGCATC
AGCTTAACGATAGCGGCGCATCGGCGATTGTTATCGTGTCTAACTTT
GCTCACACACTGGAAAAAGTGGTTGATAAAACCGCCGTTCAGCAC
GTAATTCTGACCCGTATGGGCGATCAGCTATCTACGGCAAAAGGCA
CGGTAGTCAATTTCGTTGTTAAATACATCAAGCGTTTGGTGCCGAAA
TACCATCTGCCAGATGCCATTTCATTTCGTAGCGCACTGCATAACGG
CTACCGGATGCAGTACGTCAAACCCGAACTGGTGCCGGAAGATTTA
GCTTTTCTGCAATACACCGGCGGCACCACTGGTGTGGCGAAAGGCG
CGATGCTGACTCACCGCAATATGCTGGCGAACCTGGAACAGGTTAA
CGCGACCTATGGTCCGCTGTTGCATCCGGGCAAAGAGCTGGTGGTG
ACGGCGCTGCCGCTGTATCACATTTTTGCCCTGACCATTAACTGCCT
GCTGTTTATCGAACTGGGTGGGCAGAACCTGCTTATCACTAACCCG
CGCGATATTCCAGGGTTGGTAAAAGAGTTAGCGAAATATCCGTTTAC
CGCTATCACGGGCGTTAACACCTTGTTCAATGCGTTGCTGAACAATA
AAGAGTTCCAGCAGCTGGATTTCTCCAGTCTGCATCTTTCCGCAGG
CGGAGGGATGCCAGTGCAGCAAGTGGTGGCAGAGCGTTGGGTGAA
ACTGACAGGACAGTATCTGCTGGAAGGCTATGGCCTTACCGAGTGT
GCGCCGCTGGTCAGCGTTAACCCATATGATATTGATTATCATAGTGGT
AGCATCGGTTTGCCGGTGCCGTCGACGGAAGCCAAACTGGTGGAT
GATGATGATAATGAAGTACCACCGGGTCAACCGGGTGAGCTTTGTG
TCAAAGGACCGCAGGTGATGCTGGGTTACTGGCAGCGTCCGGATGC
TACAGATGAGATCATCAAAAATGGCTGGTTACACACCGGCGACATC
GCGGTGATGGATGAAGAAGGGTTCCTGCGCATTGTCGATCGTAAAA
AAGACATGATTCTGGTTTCCGGTTTTAACGTCTATCCCAACGAGATT
GAAGATGTCGTCATGCAGCATCCTGGCGTACAGGAAGTCGCGGCTG
TTGGCGTACCTTCCGGCTCCAGTGGTGAAGCGGTGAAAATCTTCGT
AGTGAAAAAAGATCCATCGCTTACCGAAGAGTCACTGGTGACCTTT
TGCCGCCGTCAGCTCACGGGCTACAAAGTACCGAAGCTGGTGGAG
TTTCGTGATGAGTTACCGAAATCTAACGTCGGAAAAATTTTGCGAC
GAGAATTACGTGACGAAGCGCGCGGCAAAGTGGACAATAAAGCCT
GAAAGCTTGCGGCCGCATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCG
TATTGTACACGGCCGCATAATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG
GAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTA
TAAGAAGGAGATATACATATGCGCCCATTACATCCGATTGATTTTATA
TTCCTGTCACTAGAAAAAAGACAACAGCCTATGCATGTAGGTGGTT
TATTTTTGTTTCAGATTCCTGATAACGCCCCAGACACCTTTATTCAAG
ATCTGGTGAATGATATCCGGATATCAAAATCAATCCCTGTTCCACCAT
TCAACAATAAACTGAATGGGCTTTTTTGGGATGAAGATGAAGAGTT
TGATTTAGATCATCATTTTCGTCATATTGCACTGCCTCATCCTGGTCG
TATTCGTGAATTGCTTATTTATATTTCACAAGAGCACAGTACGCTGCT
AGATCGGGCAAAGCCCTTGTGGACCTGCAATATTATTGAAGGAATT
GAAGGCAATCGTTTTGCCATGTACTTCAAAATTCACCATGCGATGGT
CGATGGCGTTGCTGGTATGCGGTTAATTGAAAAATCACTCTCCCATG
ATGTAACAGAAAAAAGTATCGTGCCACCTTGGTGTGTTGAGGGAAA
ACGTGCAAAGCGCTTAAGAGAACCTAAAACAGGTAAAATTAAGAA
AATCATGTCTGGTATTAAGAGTCAGCTTCAGGCGACACCCACAGTC
ATTCAAGAGCTTTCTCAGACAGTATTTAAAGATATTGGACGTAATCC
TGATCATGTTTCAAGCTTTCAGGCGCCTTGTTCTATTTTGAATCAGC
GTGTGAGCTCATCGCGACGTTTTGCAGCACAGTCTTTTGACCTAGAT
CGTTTTCGTAATATTGCCAAATCGTTGAATGTGACCATTAATGATGTT
GTACTAGCGGTATGTTCTGGTGCATTACGTGCGTATTTGATGAGTCAT
AATAGTTTGCCTTCAAAACCATTAATTGCCATGGTTCCAGCCTCTATT
CGCAATGACGATTCAGATGTCAGCAACCGTATTACGATGATTCTGGC
AAATTTGGCAACCCACAAAGATGATCCTTTACAACGTCTTGAAATTA
TCCGCCGTAGTGTTCAAAACTCAAAGCAACGCTTCAAACGTATGAC
CAGCGATCAGATTCTAAATTATAGTGCTGTCGTATATGGCCCTGCAG
GACTCAACATAATTTCTGGCATGATGCCAAAACGCCAAGCCTTCAAT
CTGGTTATTTCCAATGTGCCTGGCCCAAGAGAGCCACTTTACTGGAA
TGGTGCCAAACTTGATGCACTCTACCCAGCTTCAATTGTATTAGACG
GTCAAGCATTGAATATTACAATGACCAGTTATTTAGATAAACTTGAA
GTTGGTTTGATTGCATGCCGTAATGCATTGCCAAGAATGCAGAATTT
ACTGACACATTTAGAAGAAGAAATTCAACTATTTGAAGGCGTAATT
GCAAAGCAGGAAGATATTAAAACAGCCAATTAAAAACAATAAACTT
GATTTTTTAATTTATCAGATAAAACTAAAGGGCTAAATTAGCCCTCCT
AGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGC
CTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAACCTCAGGCATTT
GAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTAA
ACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACC
GACGACCGGGTCATCGTGGCCGGATCTTGCGGCCCCTCGGCTTGAA
CGAATTGTTAGACATTATTTGCCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTTTC
ACGTAGTGGACAAATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGC
GATCTTCTTCTTGTCCAAGATAAGCCTGTCTAGCTTCAAGTATGACG
GGCTGATACTGGGCCGGCAGGCGCTCCATTGCCCAGTCGGCAGCGA
CATCCTTCGGCGCGATTTTGCCGGTTACTGCGCTGTACCAAATGCGG
GACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCGCCAGCCCAGTCGGGCG
GCGAGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTCAAATAGATCC
TGTTCAGGAACCGGATCAAAGAGTTCCTCCGCCGCTGGACCTACCA
AGGCAACGCTATGTTCTCTTGCTTTTGTCAGCAAGATAGCCAGATCA
ATGTCGATCGTGGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAGAATGTCATTGC
GCTGCCATTCTCCAAATTGCAGTTCGCGCTTAGCTGGATAACGCCAC
GGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAGCGCGGA
GAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTT
GATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACGGTCACCGTA
ACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTG
CGGAGCCGTACAAATGTACGGCCAGCAACGTCGGTTCGAGATGGC
GCTCGATGACGCCAACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGGCG
ATCACCGCTTCCCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTT
ATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGA
AAAATAAACAAATAGCTAGCTCACTCGGTCGCTACGCTCCGGGCGT
GAGACTGCGGCGGGCGCTGCGGACACATACAAAGTTACCCACAGA
TTCCGTGGATAAGCAGGGGACTAACATGTGAGGCAAAACAGCAGG
GCCGCGCCGGTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCTCCTGCCAGAG
TTCACATAAACAGACGCTTTTCCGGTGCATCTGTGGGAGCCGTGAG
GCTCAACCATGAATCTGACAGTACGGGCGAAACCCGACAGGACTTA
AAGATCCCCACCGTTTCCGGCGGGTCGCTCCCTCTTGCGCTCTCCT
GTTCCGACCCTGCCGTTTACCGGATACCTGTTCCGCCTTTCTCCCTT
ACGGGAAGTGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACACACTGGTATCTCGG
CTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTAAGCAAGAACTC
CCCGTTCAGCCCGACTGCTGCGCCTTATCCGGTAACTGTTCACTTGA
GTCCAACCCGGAAAAGCACGGTAAAACGCCACTGGCAGCAGCCAT
TGGTAACTGGGAGTTCGCAGAGGATTTGTTTAGCTAAACACGCGGT
TGCTCTTGAAGTGTGCGCCAAAGTCCGGCTACACTGGAAGGACAG
ATTTGGTTGCTGTGCTCTGCGAAAGCCAGTTACCACGGTTAAGCAG
TTCCCCAACTGACTTAACCTTCGATCAAACCACCTCCCCAGGTGGT
TTTTTCGTTTACAGGGCAAAAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCT
CAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACTGAACCGCTCTAGATTTCAGT
GCAATTTATCTCTTCAAATGTAGCACCTGAAGTCAGCCCCATACGAT
ATAAGTTGTAATTCTCATGTTAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGG
AGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCG
GTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTG
CCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAA
TCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGG
GTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCT
TCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGG
TTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGG
GATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGAT
GTCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCG
CCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGA
TGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCA
CTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGT
GAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGA
ACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCG
ACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAA
TAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGC
CGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCA
TCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAA
GATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACC
ATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAA
TCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGG
TGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGC
CACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTT
TTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCG
GGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTAT
AACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGG
GCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGT
CCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAATT
AATACGACTCACTATA(SEQ ID NO：9)
atfA1质粒的构建
从按以下所述构建的pHZ1.97-atfA1质粒扩增atfA1。atfA1基因通过DNA2.0(Menlo Park，CA)合成，并克隆入NdeI和AvrII消化的pCOLA-Duet-1质粒(Novagen，Madison，WI)中，产生具有下列核苷酸序列的pHZ1.97-atfA1质粒：
GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTGTAGAAATAATTTTGTT
TAACTTTAATAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCACCATCAT
CACCACAGCCAGGATCCGAATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAGGTC
GACAAGCTTGCGGCCGCATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATC
GTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAATTAATACGACTCACTATAGG
GGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGT
ATAAGAAGGAGATATACATATGAAAGCGCTTAGCCCAGTGGATCAA
CTGTTCCTGTGGCTGGAAAAACGACAGCAACCCATGCACGTAGGC
GGTTTGCAGCTGTTTTCCTTCCCGGAAGGTGCCGGCCCCAAGTATG
TGAGTGAGCTGGCCCAGCAAATGCGGGATTACTGCCACCCAGTGGC
GCCATTCAACCAGCGCCTGACCCGTCGACTCGGCCAGTATTACTGG
ACTAGAGACAAACAGTTCGATATCGACCACCACTTCCGCCACGAAG
CACTCCCCAAACCCGGTCGCATTCGCGAACTGCTTTCTTTGGTCTCC
GCCGAACATTCCAACCTGCTGGACCGGGAGCGCCCCATGTGGGAA
GCCCATTTGATCGAAGGGATCCGCGGTCGCCAGTTCGCTCTCTATTA
TAAGATCCACCATTCGGTGATGGATGGCATATCCGCCATGCGTATCG
CCTCCAAAACGCTTTCCACTGACCCCAGTGAACGTGAAATGGCTCC
GGCTTGGGCGTTCAACACCAAAAAACGCTCCCGCTCACTGCCCAG
CAACCCGGTTGACATGGCCTCCAGCATGGCGCGCCTAACCGCGAGC
ATAAGCAAACAAGCTGCCACAGTGCCCGGTCTCGCGCGGGAGGTTT
ACAAAGTCACCCAAAAAGCCAAAAAAGATGAAAACTATGTGTCTAT
TTTTCAGGCTCCCGACACGATTCTGAATAATACCATCACCGGTTCAC
GCCGCTTTGCCGCCCAGAGCTTTCCATTACCGCGCCTGAAAGTTATC
GCCAAGGCCTATAACTGCACCATTAACACCGTGGTGCTCTCCATGTG
TGGCCACGCTCTGCGCGAATACTTGATTAGCCAACACGCGCTGCCC
GATGAGCCACTGATTGCAATGGTGCCCATGAGCCTGCGGCAGGACG
ACAGCACTGGCGGCAACCAGATCGGTATGATCTTGGCTAACCTGGG
CACCCACATCTGTGATCCAGCTAATCGCCTGCGCGTCATCCACGATT
CCGTCGAGGAAGCCAAATCCCGCTTCTCGCAGATGAGCCCGGAAG
AAATTCTCAATTTCACCGCCCTCACTATGGCTCCCACCGGCTTGAAC
TTACTGACCGGCCTAGCGCCAAAATGGCGGGCCTTCAACGTGGTGA
TTTCCAACATACCCGGGCCGAAAGAGCCGCTGTACTGGAATGGTGC
ACAGCTGCAAGGAGTGTATCCAGTATCCATTGCCTTGGATCGCATCG
CCCTAAATATCACCCTCACCAGTTATGTAGACCAGATGGAATTTGGG
CTTATCGCCTGCCGCCGTACTCTGCCTTCCATGCAGCGACTACTGGA
TTACCTGGAACAGTCCATCCGCGAATTGGAAATCGGTGCAGGAATT
AAATAGTAACCTAGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATA
ACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAA
CCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCA
ATAAACC GGTAAAC CAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACC
CTGCCCTGAACCGACGACAAGCTGACGACCGGGTCTCCGCAAGTG
GCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTC
TAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAA
CTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATC
AATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACT
CACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGC
GATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTC
AAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGAC GACTGAA
TCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTC
AACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACC
AAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGC
GGTCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCG
GCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCA
GGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGT
GGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATG
GTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCT
CATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAAC
AACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACC
TGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGC
ATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTT
GAATATGGCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCA
GGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAA
TAAACAAATAGGCATGCTAGCGCAGAAACGTCCTAGAAGATGCCAG
GAGGATACTTAGCAGAGAGACAATAAGGCCGGAGCGAAGCCGTTT
TTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAACATCACGAAATCTGACGCT
CAAATCAGTGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGC
GTTTCCCCCTGATGGCTCCCTCTTGCGCTCTCCTGTTCCCGTCCTGC
GGCGTCCGTGTTGTGGTGGAGGCTTTACCCAAATCACCACGTCCCG
TTCCGTGTAGACAGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCAAGAACCC
CCCGTTCAGCCCGACTGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCATCTTGA
GTCCAACCCGGAAAGACACGACAAAACGCCACTGGCAGCAGCCAT
TGGTAACTGAGAATTAGTGGATTTAGATATCGAGAGTCTTGAAGTGG
TGGCCTAACAGAGGCTACACTGAAAGGACAGTATTTGGTATCTGCG
CTCCACTAAAGCCAGTTACCAGGTTAAGCAGTTCCCCAACTGACTT
AACCTTCGATCAAACCGCCTCCCCAGGCGGTTTTTTCGTTTACAGA
GCAGGAGATTACGACGATCGTAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTA
CGGATTCCCGACACCATCACTCTAGATTTCAGTGCAATTTATCTCTTC
AAATGTAGCACCTGAAGTCAGCCCCATACGATATAAGTTGTAATTCT
CATGTTAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTG
AAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGA
GCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCG
GGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGG
GGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCA
CCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTG
AGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCG
AAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGT
CTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATGTCCGCACCAACGCGC
AGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGAT
CGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCAT
TTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCC
CGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCA
GCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGC
TAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACG
CCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGG
TGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAG
GCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAAT
GATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCT
TTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGC
TGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTG
CGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAG
CAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATG
TAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGC
AGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATA
AGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCA
CATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATA
CCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGC
TCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAATTAATACGACTCACTATA
(SEQ ID NO：10)
含有‘tesA、fadD和atfA1的pACYC-PTrc质粒的构建
具有下列序列的pACYC-PTrc载体用于构建pACYC-PTrc-‘tesA-fadD-atfA1质粒。pACYC-PTrc载体的核苷酸序列如下：
ACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAG
AGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCC
AACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTT
TTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAA
CCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACG
ATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCG
AACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAG
GCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTG
GCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCG
CGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCG
TAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAA
TAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAAC
TGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTC
ATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCA
TGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGA
CCCCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCGTTTTGGTCTGCGCGTAAT
CTCTTGCTCTGAAAACGAAAAAACCGCCTTGCAGGGCGGTTTTTCG
AAGGTTCTCTGAGCTACCAACTCTTTGAACCGAGGTAACTGGCTTG
GAGGAGCGCAGTCACCAAAACTTGTCCTTTCAGTTTAGCCTTAACC
GGCGCATGACTTCAAGACTAACTCCTCTAAATCAATTACCAGTGGCT
GCTGCCAGTGGTGCTTTTGCATGTCTTTCCGGGTTGGACTCAAGAC
GATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGACTGAACGGGGGGTTC
GTGCATACAGTCCAGCTTGGAGCGAACTGCCTACCCGGAACTGAGT
GTCAGGCGTGGAATGAGACAAACGCGGCCATAACAGCGGAATGAC
ACCGGTAAACCGAAAGGCAGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGC
CGCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGC
CACCACTGATTTGAGCGTCAGATTTCGTGATGCTTGTCAGGGGGGC
GGAGCCTATGGAAAAACGGCTTTGCCGCGGCCCTCTCACTTCCCTG
TTAAGTATCTTCCTGGCATCTTCCAGGAAATCTCCGCCCCGTTCGTA
AGCCATTTCCGCTCGCCGCAGTCGAACGACCGAGCGTAGCGAGTCA
GTGAGCGAGGAAGCGGAATATATCCTGTATCACATATTCTGCTGACG
CACCGGTGCAGCCTTTTTTCTCCTGCCACATGAAGCACTTCACTGA
CACCCTCATCAGTGCCAACATAGTAAGCCAGTATACACTCCGCTAGC
GCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGC
CTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTG
ATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTG
CTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGA
TCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTG
TGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCAT
CATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGG
TGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGA
TTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGC
GATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAA
GCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTT
GCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGG
AATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATG
ATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCA
GGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGC GC
TGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGT
CCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACG
AATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTA
ATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTT
GCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTG
ATAACCTTATTTTTGAC GAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTG
GACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATG
GAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTC
AAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATT
TGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAAC
ACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGA
ATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATCAGATCACGCATCTTCC
CGACAACGCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAAAAGTTCAAAATCAC
CAACTGGTCCACCTACAACAAAGCTCTCATCAACCGTGGCTCCCTC
ACTTTCTGGCTGGATGATGGGGCGATTCAGGCCTGGTATGAGTCAG
CAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGCTCAAAGATGCAGG
GGTAAAAGCTAACCGCATCTTTACCGACAAGGCATCCGGCAGTTCA
ACAGATCGGGAAGGGCTGGATTTGCTGAGGATGAAGGTGGAGGAA
GGTGATGTCATTCTGGTGAAGAAGCTCGACCGTCTTGGCCGCGACA
CCGCCGACATGATCCAACTGATAAAAGAGTTTGATGCTCAGGGTGT
AGCGGTTCGGTTTATTGACGACGGGATCAGTACCGACGGTGATATG
GGGCAAATGGTGGTCACCATCCTGTCGGCTGTGGCACAGGCTGAAC
GCCGGAGGATCCTAGAGCGCACGAATGAGGGCCGACAGGAAGCAA
AGCTGAAAGGAATCAAATTTGGCCGCAGGCGTACCGTGGACAGGA
ACGTCGTGCTGACGCTTCATCAGAAGGGCACTGGTGCAACGGAAA
TTGCTCATCAGCTCAGTATTGCCCGCTCCACGGTTTATAAAATTCTTG
AAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCA
TGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCTTAATTAATCAGGAGAGCGTTC
ACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGA
GCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCATGGG
GAGACCCCACACTACCATCGGCGCTACGGCGTTTCACTTCTGAGTT
CGGCATGGGGTCAGGTGGGACCACCGCGCTACTGCCGCCAGGCAA
ATTCTGTTTTATCAGACCGCTTCTGCGTTCTGATTTAATCTGTATCAG
GCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTGGAGACCG
TTTAAACTCAATGATGATGATGATGATGGTCGACGGCGCTATTCAGA
TCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC
ATATGGTACCAGCTGCAGATCTCGAGCTCGGATCCATGGTTTATTCC
TCCTTATTTAATCGATACATTAATATATACCTCTTTAATTTTTAATAATA
AAGTTAATCGATAATTCCGGTCGAGTGCCCACACAGATTGTCTGATA
AATTGTTAAAGAGCAGTGCCGCTTCGCTTTTTCTCAGCGGCGCTGTT
TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAG
CCGGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATATTTGCCAGAAC
CGTTATGATGTCGGCGCAAAAAACATTATCCAGAACGGGAGTGCGC
CTTGAGCGACACGAATTATGCAGTGATTTACGACCTGCACAGCCATA
CCACAGCTTCCGATGGCTGCCTGACGCCAGAAGCATTGGTGCACCG
TGCAGTCGATGATAAGCTGTCAAACCAGATCAATTCGCGCTAACTC
ACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCT
GTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGC
GGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAG
ACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTT
GCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCT
GTTTGATGGTGGTTGACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTA
TCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGG
ACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGC
AACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATG
GTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCG
CTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCC
AGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGC
GCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTC
GCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGG
TCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTT
CCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGC
CCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGG
CTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACC
CAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGC
GCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGAC
TGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCA
GCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACG
TGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACA
CCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCAC
CACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAA
AGGTTTTGCACCATTCGATGGTGTCAACGTAAATGCATGCCGCTTCG
CCTTCGCGCGCGAATTGATCTGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGAC
GGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCT
TGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCG
TCAGCGGGTGTTGGCGGGGCCGGCCTCG (SEQ ID NO：11)
用高保真PhusionTM聚合酶(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)，使用以下引物从‘tesA、fadD和atfA1基因各自的质粒pETDuet-1-‘tesA、pHZ1.61和pHZ1.97-atfA1扩增‘tesA、fadD和atfA1基因：
‘tesA正向-
5’-CTCTAGAAATAATTTAACTTTAAGTAGGAGAUAGGTACCCATGGCGGACACGTTATTGAT(SEQ ID NO：12)
‘tesA反向-
5’-CTTCGAATTCCATTTAAATTATTTCTAGAGTCATTATGAGTCATGATTTACTAAAGGC(SEQ ID NO：13)
fadD正向-
5’-CTCTAGAAATAATTTTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACCATGGTGAAGAAGGTTTGGCTTAA(SEQ ID NO：14)
fadD反向-
5’-CTTCGAATTCCATTTAAATTATTTCTAGAGTTATCAGGCTTTATTGTCCAC(SEQ ID NO：15)
atfA1正向-
5’-CTCTAGAAATAATTTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACAT(SEQID NO：16)
atfA1反向-
5’-CTTCGAATTCCATTTAAATTATTTCTAGAGTTACTATTTAATTCCTGCACCGATTTCC(SEQ ID NO：17)
‘tesA向pACYC-Ptrc质粒的插入
使用插入子和载体两者之上的NcoI和EcoRI位点，将从pETDuet-1-‘tesA扩增出的‘tesA PCR产物克隆入pACYC-PTrc载体(SEQID NO：11)的起始位置。然后用T4 DNA连接酶(New England Biolabs，Ipswich，MA)将pACYC-PTrc载体和‘tesA连接起来，得到pACYC-PTrc-‘tesA质粒。过夜连接之后，将DNA产物转化进入Top 10 OneShot
Figure BPA00001479644500711
细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。通过限制性消化验证‘tesA向pACYC-PTrc载体的插入。还在‘tesA插入子的3’末端产生了SwaI限制性位点以及用于In-FusionTM克隆(Clontech，Mountain View，CA)的重叠片段。
pACYC-PTrc-‘tesA-fadD-atfA1的构建
然后通过SwaI对pACYC-PTrc-‘tesA质粒进行过夜消化。使用In-FusionTM克隆将从pHZ1.61扩增出的fadD克隆在‘tesA基因之后。通过限制性消化验证该fadD的插入。fadD的插入破坏了‘tesA基因之后的SwaI位点，但是在fadD的3’末端再次产生了新的SwaI位点。
通过SwaI再次将pACYC-PTrc-‘tesA-fadD质粒线性化，并用In-FusionTM克隆将从pHZ1.97-atfA1扩增出的atfA1克隆在fadD基因之后。通过限制性消化验证atfA1的正确插入。
pOP-80(pCL)质粒的构建
用限制性酶AflII和SfoI(New England BioLabs Inc.Ipswich，MA)消化携带强转录启动子的低拷贝质粒pCL1920(按照Lerner et al.，NucleicAcids Res.18：4631(1990))。通过这次消化产生三段DNA序列片段，使用凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Inc.Valencia，CA)凝胶纯化其中的3737bp的片段。
同时，通过使用以下引物的PCR从商购质粒pTrcHis2(Invitrogen，Carlsbad，CA)扩增包含Trc-启动子和lacI区域的片段：
LF302 5’-ATATGACGTCGGCATCCGCTTACAGACA-3’(SEQ ID NO：18)
LF303(5’-AATTCTTAAGTCAGGAGAGCGTTCACCGACAA-3’(SEQ ID NO：19)。
这两条引物同时在PCR产物的末端引入ZraI(gacgtc)和AflII(cttaag)的识别位点。用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Inc.Valencia，CA)纯化该PCR产物，并按照供应商(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)的建议用ZraI和AflII消化。然后凝胶纯化经消化的PCR产物，并与来自pCL1920的3737bp的DNA序列连接。将连接混合物转化入TOP10
Figure BPA00001479644500721
化学感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并将转化子铺在含有100μg/mL壮观霉素的Luria琼脂板上。于37℃过夜孵育之后，可以看到很多菌落。选择一定数量的这些菌落进行纯化，用限制性酶分析，并进行测序。保留质粒中的一个，并命名为pOP-80。
pCL-TFW-atfA1的构建
使用MluI和EcoRI(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)的限制性消化从pACYC-‘tesA-fadD-atfA1移出操纵子‘tesA-fadD-atfA1。然后将该操纵子克隆入pOP-80的互补位点上，得到质粒pCL-TFW-atfA1。
PTrc-‘tesA-fadD-atfA1操纵子被整合入大肠杆菌MG1655ΔfadEΔfhuA染色体的lacI-lacZ基因座
用限制性酶HindIII(New England Biolabs，Inc.，Ipswich)消化质粒pCL-TFW-atfA1。同时，通过使用限制性酶BamHI和AvrII(New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA)的消化从质粒pLoxPcat2(Genbank登录号AJ401047)获得氯霉素基因盒。使用DNA聚合酶Klenow片段使两种DNA片段成为平末端。将得到的片段连接起来并转化，从而产生质粒pCLTFWcat(参见图1)。
将按照SEQ ID NO：28的序列通过DNA2.0(Menlo Park，CA)构建和合成的质粒placZ被用作PCR扩增的模板。PCR引物LacZFnotI和pKDRspeI被设计成分别产生NotI和SpeI的限制性位点。
LacZFnotI
5’-CAACCAGCGGCCGCGCAGACGATGGTGCAGGATATC(SEQ IDNO：20)
pKDRspeI
5’-CCACACACTAGTCAGATCTGCAGAATTCAGGCTGTC(SEQ IDNO：21)
将得到的DNA片段与用SpeI和NotI酶从质粒pCLTFWcat消化的DNA片段连接起来。
连接混合物用作另一PCR反应的模板，该另一PCR反应使用位于lacI和lacZ区域的引物lacIF和lacZR：
lacIF 5’-GGCTGGCTGGCATAAATATCTC(SEQ ID NO：22)
lacZR 5’-CATCGCGTGGGCGTATTCG(SEQ ID NO：23)
得到的PCR产物(“整合盒”)含有大约500个碱基，在其每一端与lacI或lacZ同源。用该PCR产物转化已用质粒pKD46使其超感的大肠杆菌MG1655ΔfadEΔfhuA(DV2)细胞(参见实施例2)。
本实施例说明了大肠杆菌MG1655ΔfadE，ΔfhuA，lacZ::‘tesA fadDatfA1的构建，其是这样的基因工程微生物，其中脂肪酸降解酶和铁色素外膜蛋白受体被减弱，并且编码硫酯酶、酰基辅酶A合酶和酯合酶的核苷酸序列被整合入该微生物的基因组中。该菌株被命名为“IDV2”。
实施例4-大肠杆菌MG1655ΔfadE_ΔfhuA_ΔfabR的产生
本实施例描述了其中DNA结合转录抑制子的表达被减弱的基因工程微生物的构建。
使用Dastsenko et al.，同上.所述的λRed系统将编码DNA结合转录抑制子(GenBank登录号AAC76945；REFSEQ：登录号U00096.2)的大肠杆菌MG1655的fabR基因从菌株DV2缺失(参见实施例2)，并进行了如下改动。
以下两条引物用于产生缺失，同时产生新的KmR标记：
Del-fabR1：
5’-CGTACCTCTATCTTGATTTGCTTGTTTCATTACTCGTCCTTCACATTTCCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQ ID NO：24)
Del-fabR2：
5’-ATGTTTTATTGCGTTACCGTTCATTCACAATACTGGAGCAATCCAGTATGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO：25)
用以下引物进行fabR缺失的验证：
fabR-F 5’-AACCGGCCAAAGAATTGCAG(SEQ ID NO：26)
fabR-R 5’-TAAGCCAGCAACTAACGCCA(SEQ ID NO：27)
在验证了fabR缺失之后，利用Datsenko et al，同上.中所描述的pCP20质粒使单菌落去除KmR标记。得到的缺失fadE、fhuA和fabR基因的MG1655大肠杆菌菌株被称为大肠杆菌MG1655ΔfadEΔfhuAΔfabR或大肠杆菌MG1655DV2ΔfabR。
实施例5-大肠杆菌MG1655ΔfadE_ΔfhuA_ΔfabR，lacZ::tesA fadDatfA1的产生
本实施例描述了基因工程微生物的构建，其中编码硫酯酶、酰基辅酶A合酶和酯合酶的核苷酸序列被整合进该微生物的染色体中。此外，所述微生物的编码脂肪酸降解酶、铁色素外膜蛋白受体和DNA结合转录抑制子的基因被减弱。
如实施例3所述，操纵子‘tesA-fadD-atfA1可以获自pACYC-PTrc-‘tesA-fadD-atfA1质粒。将该操纵子整合入实施例4的大肠杆菌MG1655 DV2-fabR菌株中。得到的菌株被称为大肠杆菌MG1655ΔfadEΔfhuAΔfabR，lacZ::tesA fadD atfA1或大肠杆菌MG1655 IDV2ΔfabR。
实施例6-基因工程蓝细菌宿主细胞的构建
可以使用对应于pAQ1的第3301-3800位和第3801-4300位的500bp的同源区域构建用于同源重组入聚球蓝细菌PCC7002质粒pAQ1(genbank登录号NC_0050525)中的载体。
作为选择标记的壮观霉素抗性盒(含有氨基糖苷3’腺苷酰基转移酶、aad、启动子、基因和终止子)，例如，获自质粒pCL1920(按照Lerner et al.，Nucleic Acids Res.18：4631(1990)，如实施例3所述)的壮观霉素抗性盒，可以被添加在同源区域之间。
可以按照Chang，et al.J.Bacteriol.134：1141-1156(1978)制备诸如pACYC177的质粒。通过合适且独特的克隆位点，例如NdeI和EcoRI识别序列，可以随后添加氨基糖苷磷酸转移酶aph的启动子和核糖体结合位点。该完全的整合盒可以被合成，并克隆入pUC19载体(New EnglandBiolabs，Inc.，Ipswich，MA)中。得到的质粒pLS9-7002将允许(i)克隆和表达外源基因以及(ii)向聚球蓝细菌PCC7002质粒pAQ1中呈递并稳定地体内整合。
可以按照实施例3的公开内容，产生由硫酯酶基因(例如，来自大肠杆菌的‘tesA)、脂酰基辅酶A合成酶基因(例如，来自大肠杆菌的fadD)和酯合酶基因(例如，来自泊库岛食烷菌SK2菌株的atfA1)组成的合成的操纵子。然后可以将该操纵子克隆入pLS9-7002的NdeI和EcoRI位点，位于aph启动子和核糖体结合位点的下游。
然后可以用Stevens et al.，PNAS 77：6052-56(1980)所述的方法将得到的质粒转化入聚球蓝细菌PCC7002中。可以在补充有15μg/mL壮观霉素的ATCC 1047培养基上鉴定并选择稳定整合子。具体而言，1L ATCC1047培养基含有：40mg MgSO4×7H2O、20mg CaCl2×2H2O、750mgNaNO3、2mg K2HPO4、3.0mg柠檬酸、3.0mg柠檬酸铁铵、0.5mg EDTA、20mg Na2CO3、2.86mg H3BO3、1.81mg MnCl2、0.22mg ZnSO4、0.04mgNa2MoO4、0.08mg CuSO4、0.05mg Co(NO3)2、0.02mg维生素B12、10g琼脂和750mL海水。可以将壮观霉素抗性菌落在补充有壮观霉素的ATCC 1047培养基上重新划板数次，并通过使用以下引物的PCR检测‘tesA-fadD-atfA1操纵子的同基因型整合。
pAQ1-U：ATGTCTGACAAGGGGTTTGACCCCT(SEQ ID NO：29)
pAQ1-D：GCACATCCTTATCCAATTGCTCTAG(SEQ ID NO：30)
然后可以使完全同基因型的‘tesA-fadD-atfA1整合子在500mL摇瓶中的含有壮观霉素的50mL液体ATCC 1047培养基中，在30℃下，在合适的通风和照明下生长长达7天。可以在接种后5-15小时，添加甲醇(2％v/v)。可以用乙酸乙酯在不同的间隔对培养物等分试样进行提取，并分析提取物的脂肪酯产生。
实施例7-蓝细菌细长聚球蓝细菌PCC7942中脂肪酯的光合自养产生
可以使用对应于CP_000100的第2577844-2578659位和第2578660-2579467位的800bp的同源区域构建用于同源重组入细长聚球蓝细菌PCC7942基因组(genbank登录号CP_000100)中的载体。该染色体位置被称为中性位点一(NS1)(Mackey et al.，Meth.Mol.Biol.362：115-129(2007)。
作为选择标记的壮观霉素抗性盒(含有氨基糖苷3’腺苷酰基转移酶、aad、启动子、基因和终止子)，例如，获自质粒pCL1920(按照Lerner et al.，Nucleic Acids Res.18：4631(1990)，如实施例3所述)的壮观霉素抗性盒，可以被添加在同源区域之间。此外，可以添加合适且独特的克隆位点，例如NdeI和EcoRI识别位点。
可以合成该整合盒，并克隆入pUC19(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)中。得到的质粒pLS9-7942-NS1允许(i)克隆和表达外源基因以及(ii)向细长聚球蓝细菌PCC7942基因组中呈递并稳定整合。
可以按照实施例3的公开内容，产生由硫酯酶基因(例如，来自大肠杆菌的‘tesA)、脂酰基辅酶A合成酶基因(例如，来自大肠杆菌的fadD)和酯合酶基因(例如，来自泊库岛食烷菌SK2菌株的atfA1)组成的合成的操纵子，所述操纵子包含PTrc启动子和核糖体结合位点。然后将操纵子克隆入pLS9-7942-NS1的NdeI或EcoRI位点。按照Mackey et al.，同上.所述的方法，将得到的质粒转化入细长聚球蓝细菌PCC7942中。
可以在补充有4μg/mL壮观霉素的BG-11培养基上鉴定并选择稳定整合子。具体而言，1L BG-11培养基含有：75mg MgSO4×7H2O、36mgCaCl2×2H2O、1.5g NaNO3、40mg K2HPO4、6.0mg柠檬酸、6.0mg柠檬酸铁铵、1.0mg EDTA、20mg Na2CO3、2.86mg H3BO3、1.81mg MnCl2、0.22mg ZnSO4、0.04mg Na2MoO4、0.08mg CuSO4、0.05mg Co(NO3)2和10g琼脂。可以将壮观霉素抗性菌落在补充有壮观霉素的BG-11培养基上重新划板数次，并通过使用以下引物的PCR检测PTrc-‘tesA-fadD-atfA1操纵子的同基因型整合：
NS1-U：GATCAAACAGGTGCAGCAGCAACTT(SEQ ID NO：31)
NS1-D：ATTCTTGACAAGCGATCGCGGTCAC(SEQ ID NO：32)
然后可以使完全同基因型的PTrc-‘tesA-fadD-atfA1整合子在500mL摇瓶中的补充有壮观霉素的50mL液体BG-11培养基中，在30℃下，在合适的通风和照明下生长5-7天。可以在接种后5-15小时，添加甲醇(2％v/v)。可以用乙酸乙酯在不同的间隔对培养物等分试样进行提取，并分析提取物的脂肪酯产生。
实施例8-蓝细菌集胞蓝细菌PCC6803中脂肪酯的光合自养产生
可以使用分别对应于BA_000022的第2299015-2300690位和第2300691-2302056位的1300至1700bp的同源区域构建用于同源重组入集胞蓝细菌PCC6803基因组(genbank登录号BA_000022)中的载体。该染色体位置被称为中性位点RS1/2(Shao et al.，Appl.Environ.Microbiol.68：5026-33(2002))。
可以按照Chang，et al.J.Bacteriol.134：1141-1156(1978)制备诸如pACYC177的质粒。作为选择标记的壮观霉素抗性盒(含有氨基糖苷氨基糖苷磷酸转移酶、aph、启动子、基因和终止子)可以来源于pACY177质粒，并且可以被添加在同源区域之间。此外，可以添加合适且独特的克隆位点，例如NdeI和XbaI识别位点。可以合成该整合盒，并克隆入pUC19(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)中。得到的质粒pLS9-6803-RS允许(i)克隆和表达外源基因以及(ii)向集胞蓝细菌PCC6803基因组中呈递并稳定整合。
可以按照实施例3的公开内容，产生由硫酯酶基因(例如，来自大肠杆菌的‘tesA)、脂酰基辅酶A合成酶基因(例如，来自大肠杆菌的fadD)和酯合酶基因(例如，来自泊库岛食烷菌SK2菌株的atfA1)组成的合成的操纵子，所述操纵子包含PTrc启动子和核糖体结合位点。然后将该操纵子克隆入pLS9-6803-RS的NdeI或XbaI位点。按照Zang et al.J.Microbiol.，45：241-45(2007)所述的方法，将得到的质粒转化入集胞蓝细菌PCC6803中。
可以在补充有10μg/mL卡那霉素的BG-11培养基上选择稳定整合子。具体而言，1L BG-11培养基含有：75mg MgSO4×7H2O、36mgCaCl2×2H2O、1.5g NaNO3、40mg K2HPO4、6.0mg柠檬酸、6.0mg柠檬酸铁铵、1.0mg EDTA、20mg Na2CO3、2.86mg H3BO3、1.81mg MnCl2、0.22mg ZnSO4、0.04mg Na2MoO4、0.08mg CuSO4、0.05mg Co(NO3)2和10g琼脂。可以将卡那霉素抗性菌落在补充有卡那霉素的BG-11培养基上重新划板数次，并通过使用以下引物的PCR检测PTrc-‘tesA-fadD-atfA1操纵子的同基因型整合：
RS1：ATTCAATACACCCCCCTAGCCGATC(SEQ ID NO：33)
RS2：TAAGGGTGGTGGGAAAAATGGGCCA(SEQ ID NO：34)
然后可以使完全同基因型的PTrc-‘tesA-fadD-atfA1整合子在500mL摇瓶中的补充有卡那霉素的50mL液体BG-11培养基中，在30℃下，在合适的通风和照明下生长5-7天。可以在接种后5-15小时，添加甲醇(2％v/v)。可以用乙酸乙酯在不同的时间点对培养物等分试样进行提取，并分析提取物的脂肪酯产生。
实施例9-通过发酵产生生物柴油
本实施例表明可以利用本文所描述的遗传修饰的微生物来产生脂肪酯组合物的过程。使用发酵和回收过程通过碳水化合物的发酵产生商业级别质量的生物柴油。使用实施例1-5所描述的基因工程微生物通过发酵过程产生了用作生物柴油的脂肪酸甲酯(FAME)和脂肪酸乙酯(FAEE)的混合物。
发酵
开发出在体积为2L至5L的实验室规模的发酵罐中产生FAME和脂肪酸乙酯(FAEE)的以下发酵方案。使用本领域技术人员公知的方法，可以将这些示例性的方案扩大为任何其它的大肠杆菌发酵。
发酵在2L的发酵罐中进行。使冻存的大肠杆菌细胞在规定的培养基中生长，所述培养基由以下成分组成：4.54g/L K2HPO4·3H2O、4g/L(NH4)2SO4、0.15g/L MgSO4·7H2O、20g/L葡萄糖、200mM Bis-Tris缓冲液(pH7.2)、1.25mL/L微量无机物溶液和1.25mL/L维生素溶液。微量金属溶液由27g/L FeCl3·6H2O、2g/L ZnCl2·4H2O、2g/L CaCl2·6H2O、2g/LNa2MoO4·2H2O、1.9g/L CuSO4·5H2O、0.5g/L H3BO3和100mL/L浓HCl组成。维生素溶液由0.42g/L核黄素、5.4g/L泛酸、6g/L烟酸、1.4g/L吡哆醇、0.06g/L生物素和0.04g/L叶酸组成。
50mL的IDV2和IDV2ΔfabR菌株(分别在实施例3和5中描述)的培养物过夜生长，然后将其接种于控制温度、pH、搅拌、通风和溶解氧的发酵罐中的1L含有以下成分的培养基中：0.5g/L(NH4)2SO4、4.9g/LKH2PO4、0.15g/L MgSO4·7H2O、2g/L葡萄糖、1.25mL/L微量无机物溶液和1.25mL/L维生素溶液。发酵的优选条件是32℃、pH 6.8和溶解氧(DO)为饱和度30％。通过添加NH4OH来维持pH，NH4OH还能作为细胞生长的氮源。使用本领域技术人员已知的方法监测培养物中的葡萄糖水平。当最初的葡萄糖被消耗殆尽时，向发酵罐中提供由600g/L葡萄糖、3.9g/L MgSO4·7H2O和10mL/L微量无机物溶液组成的补料。将补料速率设置成允许0.3h-1的生长速率，最大为10g葡萄糖/L/h，在该点补料速率是固定的。只要葡萄糖不会在发酵罐中积累，在余下的发酵时间维持该速率。通过避免葡萄糖的积累，可以降低或消除诸如醋酸盐、甲酸盐和乙醇的副产物的形成，这些副产物是大肠杆菌常常产生的。在早期生长阶段，通过添加1mM IPTG和20mL/L的纯甲醇来诱导FAME的产生。发酵持续进行3天。在运行期间数次添加甲醇以补充用于产生FAME而由细胞消耗的甲醇，但是主要是为了替代由废气蒸发而损失的甲醇。所述添加物用来将发酵液中的甲醇浓度维持在10-30mL/L，以便保证有效的生产同时避免细胞生长抑制。
通过检测OD600(600nm处的光密度)、葡萄糖消耗和酯产生来关注发酵的进程。使用本领内公知的方法可以将该发酵方案扩大至700L的发酵罐。
分析
是通过高压液相层析(HPLC)分析发酵过程中葡萄糖消耗。根据本领域通常用于一些糖和有机酸的方法进行HPLC分析，该方法包括以下条件：带有折射率检测器的Agilent HPLC 1200系列；柱：Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm；柱温：350C；流动相：0.01M H2SO4(水性的)；流速：0.6mL/min；进样量：20μL。
通过带有火焰电离检测仪的气相色谱(GC-FID)分析脂肪酸甲基和乙基酯的产生。用乙酸乙酯以1∶1vol/vol的比例从发酵液中提取样品。在强力涡旋之后，离心样品并且通过气相色谱(GC)分析有机相。分析条件如下：仪器：Trace GC Ultra；Thermo Electron Corporation，带有火焰电离检测仪(FID)；柱：Thermo Electron Corporation的DB-1(1％二苯基硅氧烷；99％二甲基硅氧烷)CO1UFM 1/0.1/501DET，相pH 5，FT：0.4μm，长度5m，内径(id)：0.1mm；入口条件：250℃不分流法，根据样品浓度所用的3.8min 1/25分流方法的分流流速为75ml/min；运载气体，流速：氦，3.0ml/min；加热块温度：330℃；炉温：在50℃维持0.5分钟；100℃/分钟至330℃；330℃维持0.5分钟；检测器温度：300℃；进样量：2μL；运行时间/流速：6.3min/3.0ml/min(不分流法)，3.8min/1.5ml/min(分流1/25方法)，3.04min/1.2ml/min(分流1/50方法)。
回收
发酵后，可以通过本领内公知的数种不同的方法从发酵培养液分离脂肪酯组合物。在发酵结束之后，对培养液进行离心，以便从由水、盐和微生物生物质组成的第一重相分离含有甲酯的第一轻相。将所述第一轻相再离心一次，以回收生物柴油和从第二重相分离第二轻相(其由乙醚混合物组成)。
在实验规模容量的圆盘式连续离心机(固定离心力为约10,000g)上进行离心，该离心机的流量为每分钟约1至约5L。对于第一和第二步骤，每次使用同一离心机。在每种情况下采取本领域技术人员已知的对离心构造和条件的正常调节(重力环大小、出口处的背压、流量)，以便就回收效率和产物纯度方面来说，实现最佳分离。对于第一离心步骤，将发酵液从发酵罐直接移到离心机，而无需任何物理或化学调节。
在很难破坏乳状液并获取清澈的油的情况下，对所述轻相进行额外预处理，以帮助第二离心步骤过程中的分离。这些处理由以下组成：加热到60至80℃，用硫酸将pH调到2.0至2.5，并添加反乳化剂(ARB-8285(Baker Hughes，Houston，TX)，小于1％的乳状液/轻相体积)。在第二次离心之前，使温度保持1至2h。
精加工
从收获步骤获取的组合物具有非常接近于生物柴油监管标准的特征。该组合物的内在性质以及与纯度相关的性质满足生物柴油的监管标准，所述性质包括十六烷值、运动黏度、闪点、氧化稳定性、铜腐蚀性、游离和总甘油含量、甲醇含量、磷的含量、硫的含量、K+和Na+的含量。但是，在某些实施方案中，从收获步骤获取的组合物可进行可选的、较小的、进一步的纯化步骤，以去除其他杂质。
对纯化的组合物进行以下可选的操作：通过石灰洗涤消除游离脂肪酸、通过稀酸洗涤去除过量的钙、通过水洗涤去除可能过量的游离酸和用MagnesolTM D60(The Dallas Group，Inc.，Whitehouse，NJ)进行最终干燥。
结果
发酵运行：按照本文的方案，IDV2和IDV2ΔfabR菌株在2L、5L和700L的发酵罐中生长。获取的代表性的结果显示在表7中。将产率表示为每使用100g碳源所获得的产物的克数。
表7
  参数   IDV2   IDV2ΔfabR
  FAME浓度(g/L)   34.1   35.3
  FFA浓度(g/L)   3.5   NA
  FAME对葡萄糖的产率(％)   11.8   12.9
  FAME+FFA对葡萄糖的产率(％)   13.0   NA
  不饱和百分比   32.8   51.5％
其他实施方案
应理解的是，虽然已经详细描述了本发明，但以上的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书的范围所限定。其它的方面、优点以及修改在以下权利要求的范围之内。

Claims (100)

1.产生脂肪酸衍生物的方法，所述方法包括在碳源存在下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞经基因工程改造，从而超表达编码硫酯酶的基因、编码酰基辅酶A合酶的基因和编码酯合酶的基因。
2.如权利要求1所述的方法，还包括分离所述脂肪酸衍生物。
3.如权利要求1所述的方法，还包括在醇的存在下培养所述宿主细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述编码硫酯酶的基因是tesA、‘tesA、fatB、fatB2、fatB3、fatA1或fatA。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述编码酰基辅酶A合酶的基因是fadD、fadK、BH3103、pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD、faa39、编码GenBank登录号ZP_01644875蛋白的基因或yhfL。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述编码酯合酶的基因获自不动杆菌(Acinetobacter sp.)、泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、亚德海床杆菌(Fundibacter jadensis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)、除烃海杆菌(Marinobacterhydrocarbonoclastics)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、智人(Homosapiens)或希蒙得木(Simmondis chinensis)。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述编码酯合酶的基因是wax/dgat、编码蜡合酶的基因或编码双功能的酯合酶/酰基辅酶A:甘油二酯酰基转移酶的基因。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞经基因工程改造，从而相对于野生型宿主细胞表达降低水平的至少一种以下基因：编码酰基辅酶A脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成转录调节子的基因。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞经基因工程改造，使得编码酰基辅酶A脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成转录调节子的基因中的至少一种缺失。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中所述编码酰基辅酶A合酶的基因是fadE。
11.如权利要求8-9所述的方法，其中所述编码外膜蛋白受体的基因是编码外膜铁色素转运蛋白的基因。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述编码外膜铁色素转运蛋白的基因是fhuA。
13.如权利要求8或9所述的方法，其中所述编码脂肪酸生物合成转录调节子的基因编码DNA转录抑制子。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述编码DNA转录抑制子的基因是fadR。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述脂肪酸衍生物是脂肪酯。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞在包含约2g/L或更高起始浓度的碳源的培养基中培养。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述宿主细胞在包含约5g/L或更高起始浓度的碳源的培养基中培养。
18.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞在包含约100g/L或更低起始浓度的碳源的培养基中培养。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述宿主细胞在包含约50g/L或更低起始浓度的碳源的培养基中培养。
20.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞在包含约2g/L至约100g/L起始浓度的碳源的培养基中培养。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述宿主细胞在包含约10g/L至约20g/L起始浓度的碳源的培养基中培养。
22.如权利要求1-15中任一项所述的方法，还包括监测所述培养基中的碳源水平。
23.如权利要求22所述的方法，其中添加补充性碳源以维持约2g/L或更高浓度的碳源。
24.如权利要求23所述的方法，其中添加所述补充性碳源以维持约3g/L或更高浓度的碳源。
25.如权利要求22所述的方法，其中添加补充性碳源以维持约5g/L或更低浓度的碳源。
26.如权利要求25所述的方法，其中添加补充性碳源以维持约4g/L或更低浓度的碳源。
27.如权利要求22所述的方法，其中添加补充性碳源以维持约2g/L至约5g/L的碳源浓度。
28.如权利要求1所述的方法，其中所述碳源是葡萄糖。
29.如权利要求3所述的方法，其中所述醇是甲醇或乙醇。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述甲醇或乙醇以约1mL/L或更高的浓度存在。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述甲醇或乙醇以约10mL/L或更高的浓度存在。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述甲醇或乙醇以约100mL/L或更低的浓度存在。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述甲醇或乙醇以约80mL/L或更低的浓度存在。
34.如权利要求29所述的方法，其中所述甲醇或乙醇以约1mL/L至约100mL/L的浓度存在。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中以约1g/L或更高的浓度产生所述脂肪酸衍生物。
36.如权利要求35所述的方法，其中以约10g/L或更高的浓度产生所述脂肪酸衍生物。
37.如权利要求36所述的方法，其中以约20g/L或更高的浓度产生所述脂肪酸衍生物。
38.如权利要求37所述的方法，其中以约30g/L或更高的浓度产生所述脂肪酸衍生物。
39.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中以约1g/L至约200g/L的浓度产生所述脂肪酸衍生物。
40.如权利要求39所述的方法，其中以约10g/L至约50g/L的浓度产生所述脂肪酸衍生物。
41.如权利要求15所述的方法，其中所述脂肪酯是脂肪酸甲酯。
42.如权利要求41所述的方法，其中以约1g/L或更高的浓度产生所述脂肪酸甲酯。
43.如权利要求42所述的方法，其中以约10g/L或更高的浓度产生所述脂肪酸甲酯。
44.如权利要求43所述的方法，其中以约20g/L或更高的浓度产生所述脂肪酸甲酯。
45.如权利要求44所述的方法，其中以约30g/L或更高的浓度产生所述脂肪酸甲酯。
46.如权利要求41所述的方法，其中以约1g/L至约200g/L的浓度产生所述脂肪酸甲酯。
47.如权利要求46所述的方法，其中以约10g/L至约50g/L的浓度产生所述脂肪酸甲酯。
48.如权利要求1-47中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、蓝细菌细胞以及细菌细胞。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述宿主细胞选自以下属：埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、根毛霉属(Rhizomucor)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、毛霉菌属(Mucor)、蚀丝霉属(Myceliophtora)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)、金黄孢子菌属(Chrysosporium)、酵母属(Saccharomyces)、寡养单胞菌属(Stenotrophamonas)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)或链霉菌属(Streptomyces)。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述宿主细胞为迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)细胞、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)细胞、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)细胞、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)细胞、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)细胞、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)细胞、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)细胞、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)细胞、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)细胞、康宁木霉(Trichoderma koningii)细胞、绿色木霉(Trichoderma viride)细胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)细胞、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)细胞、烟曲霉(Aspergillus fumigates)细胞、臭曲霉(Aspergillus foetidus)细胞、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞、黑曲霉(Aspergillus niger)细胞、米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞、特异腐质霉(Humicola insolens)细胞、棉毛状腐质霉(Humicola lanuginose)细胞、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)细胞、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)细胞、米黑毛霉(Mucor michei)细胞、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)细胞、放线菌(Actinomycetes)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cv1细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或PC12细胞。
51.如权利要求48所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述大肠杆菌细胞是B菌株、C菌株、K菌株或W菌株大肠杆菌细胞。
53.如权利要求48所述的方法，其中所述宿主细胞是聚球蓝细菌(Synechococcus Sp.)PCC 7002细胞、细长聚球蓝细菌(Synechococcuselongatus)PCC7942细胞、集胞蓝细菌(Synechocystis Sp.)PCC 6803细胞。
54.通过权利要求1-53中任一项所述的方法所产生的脂肪酸衍生物。
55.通过权利要求1-53中任一项所述的方法所产生的脂肪酯。
56.如权利要求55所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯包含A侧和B侧。
57.如权利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B侧的长度为至少约4个碳。
58.如权利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B侧的长度为至少约6个碳。
59.如权利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B侧的长度为至少约8个碳。
60.如权利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B侧的长度为至少约10个碳。
61.如权利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B侧的长度为至少约12个碳。
62.如权利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B侧的长度为至少约14个碳。
63.如权利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B侧的长度为至少约16个碳。
64.如权利要求56所述的脂肪酯，其中所述脂肪酯的B侧的长度为至少约18个碳。
65.如权利要求55所述的脂肪酯，其选自十二烷酸甲酯、5-十二烯酸甲酯、十四烷酸甲酯、7-十四烯酸甲酯、十六烷酸甲酯、9-十六烯酸甲酯、十八烷酸甲酯、11-十八烯酸甲酯或以上的组合。
66.如权利要求15所述的方法，其中所述脂肪酯是脂肪酸乙酯。
67.如权利要求28所述的方法，其中培养基中产生所述脂肪酸衍生物的产率为每100g葡萄糖约0.5g或更多。
68.如权利要求67所述的方法，其中培养基中产生所述脂肪酸衍生物的产率为每100g葡萄糖约2g或更多。
69.如权利要求68所述的方法，其中培养基中产生所述脂肪酸衍生物的产率为每100g葡萄糖约5g或更多。
70.如权利要求69所述的方法，其中培养基中产生所述脂肪酸衍生物的产率为每100g葡萄糖约10g或更多。
71.如权利要求28所述的方法，其中培养基中产生所述脂肪酸衍生物的产率为每100g葡萄糖约0.5g至约30g。
72.如权利要求71所述的方法，其中培养基中产生所述脂肪酸衍生物的产率为每100g葡萄糖约0.5g至约10g。
73.如权利要求1所述的方法，其中产生所述脂肪酸衍生物的产率为碳源中碳重量的约10％或更多。
74.如权利要求73所述的方法，其中产生所述脂肪酸衍生物的产率为碳源中碳重量的约20％或更多。
75.如权利要求74所述的方法，其中产生所述脂肪酸衍生物的产率为碳源中碳重量的约35％或更多。
76.如权利要求1所述的方法，其中产生所述脂肪酸衍生物的产率为碳源中碳重量的约10％至约95％。
77.如权利要求76所述的方法，其中产生所述脂肪酸衍生物的产率为碳源中碳重量的约20％至约65％。
78.如权利要求28所述的方法，其中培养基中产生所述脂肪酸衍生物的产率为葡萄糖重量的约0.5％或更多。
79.如权利要求78所述的方法，其中培养基中产生所述脂肪酸衍生物的产率为葡萄糖重量的约5％或更多。
80.如权利要求28所述的方法，其中培养基中产生所述脂肪酸衍生物的产率为葡萄糖重量的约0.5％至约50％。
81.如权利要求81所述的方法，其中培养基中产生所述脂肪酸衍生物的产率为葡萄糖重量的约5％至约40％。
82.基因工程微生物，其包含编码硫酯酶的基因、编码酰基辅酶A合酶的基因和编码酯合酶的基因中的至少一种，其中相对于野生型微生物，所述微生物产生提高水平的脂肪酯。
83.基因工程微生物，其包含稳定并入所述微生物基因组DNA中的外源控制序列，所述外源控制序列位于编码硫酯酶的基因、编码酰基辅酶A合酶的基因和编码酯合酶的基因中的至少一种的一个或多个基因的上游，其中相对于野生型微生物，所述微生物产生提高水平的脂肪酯。
84.如权利要求83所述的基因工程微生物，其中所述外源控制序列是启动子。
85.如权利要求84所述的基因工程微生物，其中所述启动子是发育调控型启动子、细胞器特异型启动子、组织特异型启动子、诱导型启动子、组成型启动子和细胞特异型启动子。
86.如权利要求82或83所述的基因工程微生物，其中所述微生物经基因工程改造，从而相对于野生型微生物表达降低水平的至少一种以下基因：编码酰基辅酶A脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成转录调节子的基因。
87.如权利要求82或83所述的基因工程微生物，其中所述微生物经基因工程改造，缺失编码酰基辅酶A脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成转录调节子的基因中的至少一种。
88.如权利要求86或87所述的基因工程微生物，其中所述编码酰基辅酶A脱氢酶的基因是fadE。
89.如权利要求86或87所述的基因工程微生物，其中所述编码外膜蛋白受体的基因编码铁色素外膜转运蛋白。
90.如权利要求89所述的基因工程微生物，其中所述编码铁色素外膜转运蛋白的基因是fhuA。
91.如权利要求86或87所述的基因工程微生物，其中所述编码转录调节子的基因编码DNA结合转录抑制子。
92.如权利要求91所述的基因工程微生物，其中所述编码DNA结合转录抑制子的基因是fabR。
93.如权利要求82-92中任一项所述的基因工程微生物，其选自革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。
94.如权利要求93所述的基因工程微生物，其选自大肠杆菌、分支杆菌(mycrobacterium)、诺卡氏菌(Nocardia sp.)、皮疽诺卡氏菌(Nocardiafarcinica)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、稀有海洋放线菌(Salinisporaarenicola)、密执安棍状杆菌(Clavibacter michiganenesis)、不动杆菌属(Acinetobacter)、食烷菌属(Alcanivorax)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、拟南芥(Arabidopsis)、海床杆菌属(Fundibacter)、海杆菌属(Marinobacter)、小家鼠(Mus musculus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或希蒙得木属(Simmodsia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)或油脂酵母属(Lipomyces)。
95.如权利要求94所述的基因工程微生物，其选自大肠杆菌B菌株、C菌株、K菌株或W菌株。
96.如权利要求82-92中任一项所述的基因工程微生物，其选自聚球蓝细菌(Synechococcus Sp.)PCC 7002、细长聚球蓝细菌(Synechococcuselongatus)PCC7942、集胞蓝细菌(Synechocystis Sp.)PCC 6803。
97.产生脂肪酸衍生物的方法，包括在醇存在下培养权利要求82-96中任一项所述的基因工程微生物。
98.通过权利要求97所述方法所产生的脂肪酸衍生物。
99.如权利要求98所述的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物是脂肪酯。
100.包含权利要求54-65和98-99中任一项所述的脂肪酸衍生物的生物燃料组合物。
CN201080024722.0A 2009-04-10 2010-04-10 脂肪酸衍生物的产生 Expired - Fee Related CN102459569B (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16829309P 2009-04-10 2009-04-10
US61/168,293 2009-04-10
US22674909P 2009-07-20 2009-07-20
US22702509P 2009-07-20 2009-07-20
US61/227,025 2009-07-20
US61/226,749 2009-07-20
US26254409P 2009-11-19 2009-11-19
US61/262,544 2009-11-19
PCT/US2010/030656 WO2010118410A1 (en) 2009-04-10 2010-04-10 Production of fatty acid derivatives

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102459569A true CN102459569A (zh) 2012-05-16
CN102459569B CN102459569B (zh) 2018-02-23

Family

ID=42933202

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080024722.0A Expired - Fee Related CN102459569B (zh) 2009-04-10 2010-04-10 脂肪酸衍生物的产生

Country Status (6)

Country Link
US (3) US20100257777A1 (zh)
EP (2) EP2417246A4 (zh)
CN (1) CN102459569B (zh)
BR (2) BRPI1014472A8 (zh)
CA (2) CA2758301A1 (zh)
WO (1) WO2010118409A1 (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103014037A (zh) * 2012-12-10 2013-04-03 山东省农业科学院高新技术研究中心 一种提高集胞藻pcc6803脂肪酸含量的方法
CN103194419A (zh) * 2013-04-03 2013-07-10 武汉大学 微生物及其用途
CN104640977A (zh) * 2012-06-21 2015-05-20 朗泽科技新西兰有限公司 重组微生物制备生物柴油
CN105143458A (zh) * 2013-03-15 2015-12-09 索拉兹米公司 用于产生定制油的硫酯酶和细胞
CN106574280A (zh) * 2014-05-15 2017-04-19 凯利斯塔公司 用于生物制备极长碳链化合物的方法
US10125382B2 (en) 2014-09-18 2018-11-13 Corbion Biotech, Inc. Acyl-ACP thioesterases and mutants thereof
US10246728B2 (en) 2014-07-24 2019-04-02 Corbion Biotech, Inc. Variant thioesterases and methods of use
CN109929870A (zh) * 2019-02-20 2019-06-25 天津大学 糖代谢与脂质代谢协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用
US10557114B2 (en) 2013-03-15 2020-02-11 Corbion Biotech, Inc. Thioesterases and cells for production of tailored oils

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100242345A1 (en) 2006-05-19 2010-09-30 LS9, Inc Production of fatty acids & derivatives thereof
US8110670B2 (en) 2006-05-19 2012-02-07 Ls9, Inc. Enhanced production of fatty acid derivatives
WO2009009391A2 (en) * 2007-07-06 2009-01-15 Ls9, Inc. Systems and methods for the production of fatty esters
WO2009085278A1 (en) 2007-12-21 2009-07-09 Ls9, Inc. Methods and compositions for producing olefins
BR122020013701B1 (pt) 2008-05-16 2021-06-01 Genomatica, Inc Microorganismo geneticamente modificado para produção de um hidrocarboneto, método de produção de um alcano ou alceno e cultura de células
US20110146142A1 (en) * 2008-08-18 2011-06-23 Ls9, Inc. Systems and methods for production of mixed fatty esters
WO2010021711A1 (en) * 2008-08-18 2010-02-25 Ls9, Inc. Systems and methods for the production of mixed fatty esters
CN102325864B (zh) 2008-12-23 2016-01-27 Reg生命科学有限责任公司 硫酯酶相关的方法和组合物
CA2758301A1 (en) * 2009-04-10 2010-10-14 Ls9, Inc. Production of fatty acid derivatives
CN102459622B (zh) 2009-04-27 2020-08-18 基因组股份公司 脂肪酸酯的产生
CN105969710A (zh) * 2009-09-25 2016-09-28 Reg生命科学有限责任公司 脂肪酸衍生物的产生
EP2480673B1 (en) 2009-09-27 2018-05-23 OPX Biotechnologies, Inc. Method for producing 3-hydroxypropionic acid and other products
MX2013010076A (es) 2011-03-03 2014-04-07 Tersus Pharmaceuticals Llc Composiciones y metodos que comprenden c16:1n7 palmitoleato.
US20140215904A1 (en) 2011-03-30 2014-08-07 Ls9, Inc. Compositions comprising and methods for producing beta-hydroxy fatty acid esters
DE102011110945A1 (de) 2011-08-15 2013-02-21 Evonik Degussa Gmbh Biotechnologisches Syntheseverfahren von organischen Verbindungen mit alkIL-Genprodukt
DE102011110946A1 (de) 2011-08-15 2016-01-21 Evonik Degussa Gmbh Biotechnologisches Syntheseverfahren von omegafunktionalisierten Carbonsäuren und Carbonsäure-Estern aus einfachen Kohlenstoffquellen
US20130149757A1 (en) * 2011-12-09 2013-06-13 Optinol, Inc. Method for Producing Butanol and Isopropanol
US9163267B2 (en) 2012-04-11 2015-10-20 REG Life Sciences, LLC Metathesis transformations of microbially-produced fatty acids and fatty acid derivatives
JP6251241B2 (ja) 2012-04-13 2017-12-20 アールイージー ライフ サイエンシズ リミテッド ライアビリティ カンパニー 微生物によるアルカノールアミドおよびアミドアミンの生産ならびにそれらの使用
KR20150040359A (ko) 2012-08-10 2015-04-14 오피엑스 바이오테크놀로지스, 인크. 지방산 및 지방산 유도된 산물의 생산을 위한 미생물 및 방법
CA2889031A1 (en) 2012-10-23 2014-05-01 Basf Se Quaternized ammonium salts of hydrocarbyl epoxides and use thereof as additives in fuels and lubricants
EP3896104A1 (en) 2012-11-21 2021-10-20 Basf Se Surface-postcrosslinked water-absorbent polymer particles
EP2970859A4 (en) 2013-03-14 2017-07-19 The University Of Wyoming Research Corporation Conversion of carbon dioxide utilizing chemoautotrophic microorganisms systems and methods
WO2014152830A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The University Of Wyoming Research Corporation Methods and systems for biological coal-to-biofuels and bioproducts
WO2014146026A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Opx Biotechnologies, Inc. Bioproduction of chemicals
CN109521397B (zh) 2013-06-13 2023-03-28 巴斯夫欧洲公司 用于光学地检测至少一个对象的检测器
KR20160019067A (ko) 2013-06-13 2016-02-18 바스프 에스이 적어도 하나의 물체의 배향을 광학적으로 검출하기 위한 검출기
EP2984490B1 (en) 2013-06-14 2020-05-20 Genomatica, Inc. Methods of producing omega-hydroxylated fatty acid derivatives
EP3022310B1 (en) 2013-07-19 2019-10-16 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
US11408013B2 (en) 2013-07-19 2022-08-09 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
JP2016535646A (ja) 2013-08-26 2016-11-17 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 流体吸収性製品
EP3132022A4 (en) 2014-04-15 2017-12-13 Industrial Microbes, Inc. Synthetic methanotrophic and methylotrophic microorganisms
WO2015195697A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 REG Life Sciences, LLC Omega-hydroxylase-related fusion polypeptides with improved properties
US11041718B2 (en) 2014-07-08 2021-06-22 Basf Se Detector for determining a position of at least one object
EP2993228B1 (en) 2014-09-02 2019-10-09 Cargill, Incorporated Production of fatty acid esters
CN107003785B (zh) 2014-12-09 2020-09-22 巴斯夫欧洲公司 光学检测器
WO2016120392A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 Trinamix Gmbh Detector for an optical detection of at least one object
KR102644439B1 (ko) 2015-07-17 2024-03-07 트리나미엑스 게엠베하 하나 이상의 물체를 광학적으로 검출하기 위한 검출기
US10412283B2 (en) 2015-09-14 2019-09-10 Trinamix Gmbh Dual aperture 3D camera and method using differing aperture areas
MY197415A (en) 2015-11-18 2023-06-16 Ind Microbes Inc Functional expression of monooxygenase and methods of use
EP3380911A1 (en) 2015-11-25 2018-10-03 trinamiX GmbH Detector for optically detecting at least one object
WO2017089553A1 (en) 2015-11-25 2017-06-01 Trinamix Gmbh Detector for optically detecting at least one object
WO2017101987A1 (en) 2015-12-15 2017-06-22 REG Life Sciences, LLC Omega-hydroxylase-related fusion polypeptide variants with improved properties
US20170281425A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 Basf Se Fluid-absorbent article
US10881555B2 (en) 2016-03-30 2021-01-05 Basf Se Fluid-absorbent article
US10806640B2 (en) 2016-03-30 2020-10-20 Basf Se Ultrathin fluid-absorbent article
WO2018019921A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Trinamix Gmbh Optical sensor and detector for optical detection
BR102016023104B1 (pt) * 2016-10-04 2021-08-31 Petróleo Brasileiro S.A. - Petrobras Processo de purificação de biodiesel
US10662448B2 (en) 2016-10-17 2020-05-26 Xylome Corporation Compositions and methods for producing lipids and other biomaterials from grain ethanol stillage and stillage derivatives
CN109891265B (zh) 2016-10-25 2023-12-01 特里纳米克斯股份有限公司 用于光学检测至少一个对象的检测器
JP2019532517A (ja) 2016-10-25 2019-11-07 トリナミクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 光学的に検出するための光検出器
KR102484739B1 (ko) 2016-11-17 2023-01-05 트리나미엑스 게엠베하 적어도 하나의 대상체를 광학적으로 검출하기 위한 검출기
US11860292B2 (en) 2016-11-17 2024-01-02 Trinamix Gmbh Detector and methods for authenticating at least one object
WO2018096083A1 (en) 2016-11-25 2018-05-31 Trinamix Gmbh Optical detector comprising at least one optical waveguide
EP3577227A4 (en) 2017-02-02 2020-12-30 Cargill Inc. GENETICALLY MODIFIED CELLS PRODUCING C6-C10 FATTY ACID DERIVATIVES
PL3576701T3 (pl) 2017-02-06 2023-03-20 Basf Se Wyrób absorbujący płyn
JP7247094B2 (ja) 2017-02-17 2023-03-28 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 流体吸収性物品
EP3612805A1 (en) 2017-04-20 2020-02-26 trinamiX GmbH Optical detector
CN110998223B (zh) 2017-06-26 2021-10-29 特里纳米克斯股份有限公司 用于确定至少一个对像的位置的检测器
WO2019011803A1 (en) 2017-07-10 2019-01-17 Trinamix Gmbh DETECTOR FOR OPTICALLY DETECTING AT LEAST ONE OBJECT
JP7361717B2 (ja) 2018-04-20 2023-10-16 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 薄い流体吸収性コア－吸収紙
WO2020025401A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 Basf Se Fluid-absorbent core
WO2020025400A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 Basf Se Feminine hygiene absorbent article
CN109433198B (zh) * 2018-12-04 2021-01-29 中国科学院过程工程研究所 一种PtM合金催化剂及其制备方法和用途
US11795403B2 (en) 2021-05-28 2023-10-24 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Free fatty acid separation and recovery using resin

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007024756A2 (en) * 2005-08-20 2007-03-01 Scarab Genomics, Llc Reduced genome e. coli
WO2007041713A1 (en) * 2005-10-04 2007-04-12 Zymogenetics, Inc. Production and purification of il-29
WO2007119891A1 (en) * 2006-04-18 2007-10-25 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE fhuA GENE
WO2008147781A2 (en) * 2007-05-22 2008-12-04 Ls9, Inc. Hydrocarbon-producing genes and methods of their use
US20090084025A1 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Ls9,Inc. Reduction of the toxic effect of impurities from raw materials by extractive fermentation

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2237815B (en) * 1989-11-06 1994-01-05 Univ Singapore Production of synthetic crude petroleum
US20080178519A1 (en) * 1996-11-18 2008-07-31 Bp Oil International Limited Fuel composition
AU1417901A (en) * 1999-11-26 2001-06-04 Kansai Chemical Engineering Co., Ltd. Process for producing fatty acid lower alcohol ester
WO2002033061A2 (en) * 2000-10-20 2002-04-25 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 32229, a human acyl-coa dehydrogenase family member and uses thereof
AU2002302919A1 (en) * 2001-02-22 2002-10-03 Institut Pasteur Comparative mycobacterial geneomics as a tool for identifying targets for the diagnosis, prophylaxis or treatment of mycobacterioses
EP1439217B1 (en) * 2001-10-12 2012-06-20 Nippon Oil Corporation Lubricating oil composition for internal combustion engine
WO2003074676A2 (en) * 2002-03-01 2003-09-12 Monsanto Technology Llc Wax ester synthase dna sequence, protein and uses thereof
AU2003270038A1 (en) * 2002-08-30 2004-03-19 North Carolina State University Abiz phage resistance gene
US6933323B2 (en) * 2003-01-31 2005-08-23 Chevron U.S.A. Inc. Production of stable olefinic fischer tropsch fuels with minimum hydrogen consumption
US7056714B2 (en) * 2003-03-11 2006-06-06 University Of Iowa Research Foundation, Inc. Carboxylic acid reductase polypeptide, nucleotide sequence encoding same and methods of use
BRPI0415072B1 (pt) * 2003-10-09 2020-11-03 The Dallas Group Of America, Inc método de purificação de um combustível biodiesel com materiais adsorventes
US20070251141A1 (en) * 2004-02-26 2007-11-01 Purdue Research Foundation Method for Preparation, Use and Separation of Fatty Acid Esters
US7608700B2 (en) * 2004-03-08 2009-10-27 North Carolina State University Lactobacillus acidophilus nucleic acid sequences encoding stress-related proteins and uses therefor
US7652167B2 (en) * 2004-07-19 2010-01-26 Board Of Trustees Of Michigan State University Process for production of organic acid esters
US7648785B2 (en) * 2004-09-17 2010-01-19 Eaton Corporation Clean power system
GB0421937D0 (en) * 2004-10-02 2004-11-03 Univ York Acyl CoA synthetases
US20080271364A1 (en) * 2005-05-26 2008-11-06 Zeev Wiesman Production of Biodiesel From Balanites Aegyptiaca
US8110670B2 (en) * 2006-05-19 2012-02-07 Ls9, Inc. Enhanced production of fatty acid derivatives
US20100242345A1 (en) * 2006-05-19 2010-09-30 LS9, Inc Production of fatty acids & derivatives thereof
EP2157170B1 (en) * 2006-05-19 2014-01-15 LS9, Inc. Production of fatty acids and derivatives thereof
TWI330178B (en) * 2006-12-29 2010-09-11 Univ Nat Taiwan Process for transesterification of methyl acetate
CN106987532B (zh) * 2007-03-28 2021-06-08 基因组股份公司 提高脂肪酸衍生物的产量
MY154965A (en) * 2007-06-01 2015-08-28 Solazyme Inc Production of oil in microorganisms
CA2617614C (en) * 2007-08-10 2012-03-27 Indian Oil Corporation Limited Novel synthetic fuel and method of preparation thereof
BR122020013701B1 (pt) * 2008-05-16 2021-06-01 Genomatica, Inc Microorganismo geneticamente modificado para produção de um hidrocarboneto, método de produção de um alcano ou alceno e cultura de células
WO2010021711A1 (en) * 2008-08-18 2010-02-25 Ls9, Inc. Systems and methods for the production of mixed fatty esters
US20110146142A1 (en) * 2008-08-18 2011-06-23 Ls9, Inc. Systems and methods for production of mixed fatty esters
CA2758301A1 (en) * 2009-04-10 2010-10-14 Ls9, Inc. Production of fatty acid derivatives
CN102459622B (zh) * 2009-04-27 2020-08-18 基因组股份公司 脂肪酸酯的产生
CN105969710A (zh) * 2009-09-25 2016-09-28 Reg生命科学有限责任公司 脂肪酸衍生物的产生

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007024756A2 (en) * 2005-08-20 2007-03-01 Scarab Genomics, Llc Reduced genome e. coli
WO2007041713A1 (en) * 2005-10-04 2007-04-12 Zymogenetics, Inc. Production and purification of il-29
WO2007119891A1 (en) * 2006-04-18 2007-10-25 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE fhuA GENE
WO2008147781A2 (en) * 2007-05-22 2008-12-04 Ls9, Inc. Hydrocarbon-producing genes and methods of their use
US20090084025A1 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Ls9,Inc. Reduction of the toxic effect of impurities from raw materials by extractive fermentation

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MELANIE BONHIVERS，ET AL: "FhuA, a transporter of the Escherichia coli outer membrane, is converted into a channel upon binding of bacteriophage T5", 《THE EMBO JOURNAL》 *
RAINER KALSCHEUER,ET AL: "Microdiesel: Escherichia coli engineered for fuel production", 《MICROBIOLOGY》 *
V. BRAUN,ET AL: "Inactivation of FhuA at the Cell Surface of Escherichia coli K-12 by a Phage T5 Lipoprotein at the Periplasmic Face of the Outer Membrane", 《JOURNAL OF BACRERIOLOGY》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104640977A (zh) * 2012-06-21 2015-05-20 朗泽科技新西兰有限公司 重组微生物制备生物柴油
CN104640977B (zh) * 2012-06-21 2019-04-12 朗泽科技新西兰有限公司 重组微生物制备生物柴油
CN103014037A (zh) * 2012-12-10 2013-04-03 山东省农业科学院高新技术研究中心 一种提高集胞藻pcc6803脂肪酸含量的方法
CN105143458A (zh) * 2013-03-15 2015-12-09 索拉兹米公司 用于产生定制油的硫酯酶和细胞
US10557114B2 (en) 2013-03-15 2020-02-11 Corbion Biotech, Inc. Thioesterases and cells for production of tailored oils
CN103194419A (zh) * 2013-04-03 2013-07-10 武汉大学 微生物及其用途
CN103194419B (zh) * 2013-04-03 2016-01-13 武汉大学 微生物及其用途
CN106574280A (zh) * 2014-05-15 2017-04-19 凯利斯塔公司 用于生物制备极长碳链化合物的方法
US10570428B2 (en) 2014-07-24 2020-02-25 Corbion Biotech, Inc. Variant thioesterases and methods of use
US10246728B2 (en) 2014-07-24 2019-04-02 Corbion Biotech, Inc. Variant thioesterases and methods of use
US10760106B2 (en) 2014-07-24 2020-09-01 Corbion Biotech, Inc. Variant thioesterases and methods of use
US10125382B2 (en) 2014-09-18 2018-11-13 Corbion Biotech, Inc. Acyl-ACP thioesterases and mutants thereof
CN109929870A (zh) * 2019-02-20 2019-06-25 天津大学 糖代谢与脂质代谢协同提高解脂耶氏酵母合成脂肪酸衍生物的产量的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA2758298A1 (en) 2010-10-14
WO2010118409A1 (en) 2010-10-14
US20150267134A1 (en) 2015-09-24
EP2417244A4 (en) 2015-10-14
EP2417244A1 (en) 2012-02-15
CA2758301A1 (en) 2010-10-14
BRPI1014952A2 (pt) 2019-09-24
BRPI1014472A2 (pt) 2015-08-25
US20100257777A1 (en) 2010-10-14
CN102459569B (zh) 2018-02-23
BRPI1014472A8 (pt) 2015-12-08
US20100257778A1 (en) 2010-10-14
EP2417246A4 (en) 2015-11-04
EP2417246A1 (en) 2012-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102459569A (zh) 脂肪酸衍生物的产生
US20210324430A1 (en) Methods And Compositions For Producing Fatty Alcohols
US20110162259A1 (en) Production of fatty acid derivatives
CN102027109B (zh) 产生碳氢化合物的方法和组合物
CA2738938C (en) Methods and compositions for producing fatty aldehydes
US8597922B2 (en) Methods and compositions for producing olefins
WO2010118410A1 (en) Production of fatty acid derivatives
US20110250663A1 (en) Methods and compositions related to fatty alcohol biosynthetic enzymes
CN102459622A (zh) 脂肪酸酯的产生
US20170342388A1 (en) Acyl-acp reductase with improved properties
US20160002681A1 (en) Acp-mediated production of fatty acid derivatives
WO2010021711A1 (en) Systems and methods for the production of mixed fatty esters
BRPI0912684B1 (pt) Método para produzir um alcano ou alceno, célula hospedeira microbiana recombinante e cultura celular

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: REG LIFE SCIENCES, LLC

Free format text: FORMER OWNER: LS9 INC.

Effective date: 20150128

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20150128

Address after: American California

Applicant after: REG Life Sciences, LLC

Address before: California, USA

Applicant before: LS9, Inc.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20191211

Address after: California, USA

Patentee after: GENOMATICA, Inc.

Address before: California, USA

Patentee before: REG Life Sciences, LLC

TR01 Transfer of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180223