CN105969710A - 脂肪酸衍生物的产生 - Google Patents

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Abstract

描述了用于产生诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法和组合物，以及包含脂肪酸衍生物的商用燃料组合物。

Description

脂肪酸衍生物的产生
本申请是申请日为2010年9月23日、申请号为201080053578.3、发明名称为“脂肪酸衍生物的产生”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年9月25日提交的第61/245,943号美国临时申请的权益，其全部内容并入本文。
发明背景
石油是地球上发现的、液体、气体或固体形式的有限的天然资源。石油主要由碳氢化合物组成，碳氢化合物主要由碳和氢组成。石油还含有大量的处于不同形式的其他元素，例如氮、氧或硫。
石油是宝贵资源，但是对石油产品进行开发的金融和环境成本却相当大。首先，必须发现石油资源。石油勘探是耗资并有风险的投资。勘探深水井的费用超过1亿美元。除经济费用外，石油勘探带来严重的环境代价。例如近海勘探扰乱周围海洋环境。
发现生产井后，必须以巨大代价从地球开采石油。即使在最佳条件下，仅可以开采井中石油的50％。石油开采还带来环境代价。例如，石油开采可以导致大量石油渗漏上升至海洋表面。近海钻井涉及挖掘河床，这扰乱或破坏周围海洋环境。
开采后，必须将石油从石油产生区长距离运输到石油消耗区。除运输费用外，还存在大规模油泄漏的环境风险。
从地球开采的原油在天然形式时商业用途很少。其是具有不同长度和复杂程度不同的碳氢化合物(例如，石蜡(或烷)、烯烃(或烯)、炔、环烷(napthenes)(或环烷(cylcoalkanes))、脂肪族化合物、芳香族化合物等)的混合物。此外，原油含有其他有机化合物(例如含有氮、氧、硫等的有机化合物)和杂质(例如硫磺、盐、酸、金属等)。
因此，在原油在商业上可以使用前，必须进行提炼并纯化。由于其高能量密度及其便利的可运输性，大部分石油被提炼为燃料，例如运输燃料(例如汽油、柴油、航空燃料等)、燃用油、液化石油气等。
原油还是用于产生石化产品的原材料的主要来源。两类主要的来自石油的原材料是短链烯烃(例如乙烯和丙烯)和芳香族化合物(例如苯和二甲苯异构体)。这些原材料来源于原油中较长链的碳氢化合物，其是通过以相当大的费用使用各种方法裂化原油中的长链碳氢化合物而产生的，例如催化裂化、蒸汽裂化或催化重整。这些原材料用于制造不能直接从原油提炼的石化产品，例如单体、溶剂、去垢剂或粘合剂。
来源于原油的原材料的一个实例是乙烯。乙烯被用于生产石化产品，例如聚乙烯、乙醇、氧化乙烯、乙二醇、聚酯、乙二醇醚、乙氧基化物、乙酸乙烯酯、1,2-二氯乙烷、三氯乙烯、四氯乙烯、氯乙烯和聚氯乙烯。来源于原油的原材料的另一个实例是丙烯。丙烯用于生产异丙醇、丙烯腈、聚丙烯、氧化丙烯、丙烯二醇、乙二醇醚、丁烯、异丁烯、1,3-丁二烯、合成橡胶、聚烯烃、α-烯烃、脂肪醇、丙烯酸、丙烯聚合物、氯化丙烯、环氧氯丙烷和环氧树脂。
石化产品可以用于制造特种化学品，例如塑料、树脂、纤维、橡胶、药品、润滑剂或凝胶。可以产自石化原材料的特种化学品的实例为：脂肪酸、碳氢化合物(例如长链碳氢化合物、支链碳氢化合物、饱和碳氢化合物、不饱和碳氢化合物等)、脂肪醇、酯、脂肪醛、酮、润滑剂等。
特种化学品有许多商业用途。脂肪酸在商业上被用作表面活性剂。特种化学品可见于去垢剂和肥皂中。脂肪酸也可以用作燃料、润滑油、涂料、油漆、蜡烛、色拉油、起酥油、化妆品以及乳化剂中的添加剂。此外，脂肪酸在橡胶制品中被用作促进活性剂。脂肪酸也可以用作给料，以生产甲酯、酰胺、胺、酰基氯、酸酐、乙烯酮二聚体，以及过氧酸与过氧酯。
酯具有很多商业用途。例如，生物柴油，一种替换燃料，其由酯(例如，脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯等)组成。一些低分子量的酯是挥发性的，具有好闻的气味，使得它们可以用作芳香剂或增味剂。此外，酯被用作漆、涂料和清漆的溶剂。而且，一些天然存在的物质由酯组成，例如蜡、脂肪和油。酯还可以用作树脂和塑料的软化剂、增塑剂、阻燃剂以及汽油和油的添加剂。此外，酯可用于生产聚合物、薄膜、染料和药物。
此外，原油是润滑油的来源。石油来源的润滑油通常由烯烃，尤其是聚烯烃和α-烯烃组成。润滑油可以从原油提炼或可以利用从原油提炼的原材料生产。
从原油获得这些特种化学品需要大量的金融投资以及大量的能量。因为原油中的长链碳氢化合物常常被裂化以产生较小的单体，其也是低效的过程。这些单体然后被用作生产更复杂的特种化学品的原材料。
除勘探、开采、运输和提炼石油的问题外，石油是有限并逐渐减少的资源。估计当前世界每年消耗的石油为300亿桶。据估计，以现有生产水平，世界石油储量预计在2050年前会耗竭。
最后，基于石油的燃料的燃烧释放温室气体(例如二氧化碳)和其他形式的空气污染物(例如一氧化碳、二氧化硫等)。随着世界对燃料需求的增加，温室气体和其他形式的空气污染物的排放也增加。大气中温室气体的累积导致全球变暖增速。因此，除局部破坏环境外(例如油泄漏、海洋环境的挖掘等)，燃烧石油还破坏全球环境。
由于石油所引起的内在挑战，存在对于不需要像石油一样被勘探、开采、长距离运输或大量提炼的可再生石油资源的需要。还存在对于可以经济生产可再生石油资源的需要。此外，存在对于不会产生由石油工业和基于石油的燃料的燃烧所导致的环境破坏的类型的可再生石油资源的需要。基于类似的原因，还存在对于通常来自石油的化学品的可再生资源的需要。
诸如日光、水、风和生物质(biomass)的可再生能源是石油燃料的潜在替代品。生物燃料是一种由生物质产生的可生物降解的、清洁燃烧的燃料，其由烷烃和酯类组成。生物柴油即是一种示例性的生物燃料。生物柴油可以采用纯的形式(被称为“纯”生物柴油)，或者以任何浓度与常规的石化柴油混合来用于大部分内燃柴油发动机中。
与基于石油的柴油相比，生物柴油提供的优点包括燃烧过程中的排放量(例如，一氧化碳、硫、芳香烃、烟灰颗粒)降低。因其基于可再生的生物材料，生物柴油还能维持平衡的二氧化碳循环。生物柴油通常是可生物降解的，而且因为燃点高，易燃性低因此非常安全。此外，生物柴油提供良好的润滑性能，从而减少发动机的磨损。
目前生产生物柴油的方法涉及将来自植物油原料的三酰甘油进行酯基转移，植物油原料比如在欧洲是油菜，在北美是大豆，在东南亚是棕榈油。因此工业规模的生物柴油生产在地理和季节上局限于植物油原料的产地。酯基转移过程产生脂肪酯(fatty esters)混合物，其可以作为生物柴油。然而，甘油是酯基转移过程中的一种不希望的副产品。如果要作为生物柴油使用，必须从上述异质产物中进一步纯化脂肪酯。这增加了脂肪酯生产的成本和所需能量，并且最终增加生物柴油生产的成本和所需能量。而且，植物油原料不是高效的能量来源，因为它们需要广大的种植面积。例如，因为只有菜子油用于生物柴油产生，而油菜生物质的其他部分被弃掉，所以从油菜产生的生物柴油的产量仅有1300L/公顷。此外，某些植物油原料，比如油菜和大豆的种植需要经常进行农作物轮种以防止土地养分耗尽。
需要在经济和能量方面高效的生物燃料，以及由诸如生物质的可再生能量来源生产所述生物柴油的方法。
发明概述
本公开涉及从经过基因工程处理的微生物产生脂肪酸及其衍生物，包括例如脂肪酯。脂肪酯的实例包括脂肪酸酯，例如那些来源于短链醇的，包括脂肪酸乙酯(“FAEE”)和脂肪酸甲酯(“FAME”)，以及那些来源于长链脂肪醇的。产生的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物可单独地或以适合的组合用作生物燃料(例如，生物柴油)、工业化学品、或生物燃料或工业化学品的组分或原料。在一些方面，本发明涉及产生一种或多种游离脂肪酸和/或一种或多种脂肪酸衍生物的方法，所述脂肪酸衍生物例如脂肪酯，包括例如FAEE、FAME和/或长链醇的脂肪酯衍生物。在相关方面，该方法包括提供适用于制备脂肪酸和脂肪酸衍生物的经过基因工程处理的生产宿主。
因此，在一方面，本发明特征为制备脂肪酸或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法。该方法包括在宿主细胞中表达编码酯合酶的基因。在一些实施方案中，编码酯合酶的基因选自分类为EC 2.3.1.75的酶以及可以催化酰基硫酯转变为脂肪酯的任何其他多肽，包括但不限于，蜡酯合酶、酰基CoA:醇转酰酶、醇O-脂肪酸酰基转移酶、酰基转移酶和脂肪酰CoA:脂肪醇酰基转移酶、或其适合的变体。在其他实施方案中，所述酯合酶基因是编码蜡/dgat——来自油蜡树(Simmondsia chinensis)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPl、泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、Fundibacter jadensis、拟南芥(Arabidopsis thaliana)或真养产碱杆菌(Alkaligeneseutrophus)的双功能酯合酶/酰基CoA：二酰基甘油酰基转移酶的一个基因。在一些实施方案中，编码酯合酶的基因选自：AtfA1(来源于泊库岛食烷菌SK2的酯合酶，GenBank登录号YP_694462)、AtfA2(来自泊库岛食烷菌SK2的另一酯合酶，GenBank登录号YP_693524)、ES9(来自除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)DSM 8798的酯合酶，GenBank登录号ABO21021)、ES8(来自除烃海杆菌DSM 8798的另一酯合酶，GenBank登录号ABO21020)、以及它们的变体。在具体实施方案中，编码酯合酶或其适合的变体的基因被超表达。
在另一方面，本发明特征在于制备诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码酯合酶多肽或其变体的基因，所述酯合酶多肽包括SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述多肽具有酯合酶和/或酰基转移酶活性。在某些实施方案中，所述多肽具有催化硫脂转化为脂肪酸和/或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的能力。在具体实施方案中，所述多肽具有利用醇作为底物催化脂肪酰CoA和/或脂肪酰ACP转化为脂肪酸和/或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的能力。在可选实施方案中，所述多肽具有利用醇作为底物催化游离脂肪酸转化为脂肪酯的能力。
在某些实施方案中，宿主细胞的内源硫酯酶如果存在的话，则未被修饰。在某些其它实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的硫酯酶活性或硫酯酶被功能上缺失。在一些实施方案中，宿主细胞不具有可检测的硫酯酶活性。如本文所用的术语“可检测的”是指能够可查明地存在或出现。例如，使用本文提供的方法，期望来自反应物的产品的产生(例如，某种类型的脂肪酯的产生)是可检测的。在某些实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶，或者所述脂肪酸降解酶被功能上缺失。在一些实施方案中，宿主细胞不具有可检测的脂肪酸降解酶活性。在具体实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的硫酯酶、脂肪酸降解酶、或以上二者。在另外的实施方案中，硫酯酶、脂肪酸降解酶、或以上二者被功能上缺失。在一些实施方案中，宿主细胞不具有可检测的硫酯酶活性、酰基CoA合酶活性、或不具有以上二者。在一些实施方案中，在硫酯酶、脂肪酸衍生酶或以上二者不存在的情况下，宿主细胞可以将酰基ACP或酰基CoA转化成脂肪酸和/或诸如酯的脂肪酸衍生物。或者，在硫酯酶、脂肪酸衍生酶或以上二者不存在的情况下，宿主细胞可以将游离脂肪酸转化为脂肪酯。在某些实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞分离脂肪酸或其衍生物。
在某些实施方案中，脂肪酸衍生物是脂肪酯。在某些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物来源于适合的醇底物，例如短链或长链醇。在一些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物存在于细胞外环境。在某些实施方案中，从宿主细胞的细胞外环境分离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物从宿主细胞部分地或全部地自发分泌。在可选实施方案中，脂肪酸或其衍生物转运至细胞外环境，任选地具有一种或多种转运蛋白的辅助。在其他实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物被动地转运到细胞外环境。
在另一方面，本发明特征在于胞外产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的体外方法，包括提供底物和纯化的酯合酶或其变体，所述酯合酶包括SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：24、SEQID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括在允许酯合酶多肽或其变体表达或超表达的条件下培养宿主细胞，并从所述细胞分离酯合酶。在一些实施方案中，所述方法还包括将适合的底物与无细胞提取物在允许脂肪酸和/或脂肪酸衍生物产生的条件下接触。
在一些实施方案中，酯合酶多肽包括具有一个或多个氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列，并且所述多肽具有酯合酶和/或酰基转移酶活性。在某些实施方案，所述酯合酶多肽具有增加的酯合酶和/或转移酶活性。例如，酯合酶多肽能够催化诸如脂肪酰CoA或脂肪酰ACP的硫脂转化为脂肪酸和/或脂肪酸衍生物，或具有增强的这种能力。在具体实施方案中，在硫酯酶活性、脂肪酸降解酶活性或以上二者不存在的情况下，酯合酶多肽能够催化硫脂底物转化为脂肪酸和/或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物，或具有增强的这种能力。例如，在硫酯酶或酰基CoA合酶活性不存在的情况下，该多肽在体内将脂肪酰ACP和/或脂肪酰Coa转化为脂肪酯。在可选实施方案中，在硫酯酶活性、脂肪酸降解酶活性或以上二者不存在的情况下，该多肽能够催化游离脂肪酸转化为脂肪酯。例如，在硫酯酶活性、酰基CoA合酶活性或以上二者不存在的情况下，该多肽可以在体内或体外将游离脂肪酸转化为脂肪酯。
在一些实施方案中，酯合酶多肽是包含一个或多个非保守氨基酸(non-conservedamino acid)被取代的SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列的变体，其中所述酯合酶多肽具有酯合酶和/或酰基转移酶活性。在某些实施方案，所述酯合酶多肽具有增加的酯合酶和/或酰基转移酶活性。例如，SEQ ID NO:18的395位甘氨酸残基可以被碱性氨基酸残基取代，使得所得到的酯合酶变体保留酯合酶和/或酰基转移酶活性或具有增强的酯合酶和/或酰基转移酶活性。在示例性的实施方案中，SEQ ID NO：18的395位甘氨酸残基被精氨酸或赖氨酸残基取代，其中所得到的酯合酶变体保留催化硫脂转化为脂肪酸和/或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的能力，或具有增强的这种能力。
在一些实施方案中，所述酯合酶变体包含一个或多个以下保守型氨基酸(conserved amino acid)取代：诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的脂肪族氨基酸被另一脂肪族氨基酸替换；丝氨酸被苏氨酸替换；苏氨酸被丝氨酸替换；诸如天冬氨酸和谷氨酸的酸性残基被另一酸性残基替换；诸如天冬酰胺和谷氨酰胺的携带酰胺基的残基被另一携带酰胺基的残基替换；诸如赖氨酸和精氨酸的碱性残基被另一碱性残基交换；以及诸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族残基被另一芳香族残基替换。在一些实施方案中，所述酯合酶变体具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸取代、添加、插入或缺失。在一些实施方案中，所述多肽变体具有酯合酶和/或酰基转移酶活性。例如，酯合酶多肽能够利用醇作为底物催化硫脂转化为脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。在非限制性的实例中，该多肽能够利用适合的醇底物催化脂肪酰CoA和/或脂肪酰ACP转化为脂肪酸和/或脂肪酯，所述醇底物例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、癸醇、十二醇、十四醇或十六醇。在另一非限制性的实例中，在硫酯酶、脂肪酸降解酶或以上二者不存在的情况下，酯合酶多肽能够催化脂肪酰ACP和/或脂肪酰CoA转化为脂肪酸和/或脂肪酯。在另一实施方案中，在硫酯酶、脂肪酸降解酶或以上二者不存在的情况下，该多肽能够催化游离脂肪酸转化为脂肪酯。
在一些实施方案中，酯合酶多肽长度为约200个氨基酸-约2000个氨基酸，例如长度为约250-约1500个氨基酸残基，长度为约300-约1200个氨基酸残基，长度为约350-约100个氨基酸残基，长度为约400-约800个氨基酸残基或长度为约450-约600个氨基酸残基。在某些实施方案中，酯合酶多肽长度为约300个氨基酸残基或更长，例如长度为约400个氨基酸残基或更长，或长度为约450个氨基酸残基或更长。在某些相关实施方案中，酯合酶多肽长度为约1,000个氨基酸残基或更短，例如长度为约800个氨基酸残基或更短，例如长度为约700个氨基酸残基或更短，或长度为约600个氨基酸残基或更短。示例性的本发明的酯合酶长度为约500个氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述方法还包括在所述宿主细胞中改变编码酯合酶的基因的表达。在某些实施方案中，改变编码酯合酶的基因的表达包括在宿主细胞中表达编码酯合酶的基因和/或提高宿主细胞中内源酯合酶的表达或活性。
在某些实施方案中，宿主细胞的内源硫酯酶如果存在的话，则未被修饰。在其他实施方案中，所述方法包括在所述宿主细胞中改变编码硫酯酶的基因的表达。在某些实施方案中，改变编码硫酯酶的基因的表达包括在宿主细胞中表达编码硫酯酶的异源基因和/或提高宿主细胞中内源硫酯酶的表达和/或活性。在可选实施方案中，改变编码硫酯酶的基因的表达包括减弱宿主细胞中编码硫酯酶的内源基因的表达和/或降低宿主细胞中内源硫酯酶的表达和/或活性。在某些实施方案中，改变宿主细胞中硫酯酶的表达包括在功能上使编码硫酯酶的内源基因缺失。在一些实施方案中，宿主细胞不具有可检测的硫酯酶活性。在具体实施方案中，硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatAl编码。
可以使用多种已知的体外或体内检测方法来测定或检测硫酯酶活性，包括但不限于酰基CoA水解检测，其利用DTNB(5,5’-二硫-双(2-硝基苯甲酸))反应检测酰基CoA底物的分解速率和并监测412nm处吸收的改变以及13,600M-1cm-1的摩尔消光系数。领域内已知多种酯合酶可以具有重叠的硫酯酶活性。然而，如本文所用的术语“酯合酶”不包括还具有硫酯酶活性的那些酶。同时具有酯合酶活性和硫酯酶活性的酶在本文被归类为硫酯酶。
在另一方面，本发明特征在于制备脂肪酸和/或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法，包括在宿主细胞中不存在硫酯酶或硫酯酶活性的情况下，在宿主细胞中表达编码酯合酶的基因。在某些实施方案中，经过基因工程处理宿主细胞以相对于野生型宿主细胞的水平表达减弱水平的脂肪酸降解酶。脂肪酸降解酶的实例包括但不限于，酰基CoA合酶EC2.3.1.86或EC 6.2.1.3。可以从中发现脂肪酸降解酶的宿主细胞的实例包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、大肠杆菌(Escherichia coli)、节杆菌(Arthrobacter)、粘红酵母(Rhodotorula glutinins)、不动杆菌(Acinetobacter)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)、弗氏弧菌(Vibrio furnissii)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、藤黄微球菌(Micrococcus leuteus)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophila)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在一些实施方案中，经过基因工程处理的宿主细胞以相对于野生型宿主细胞降低的水平来表达酰基CoA合酶。在具体实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因所编码的酰基CoA合酶。在某些实施方案中，使诸如酰基CoA合酶基因的脂肪酸降解被在功能上缺失使得宿主细胞不具有可检测的酰基CoA合酶活性。
在某些实施方案中，宿主细胞的内源硫酯酶如果存在的话，则未被修饰。在其他实施方案中，将宿主经过基因工程处理以表达减弱水平的硫酯酶、减弱水平的脂肪酸降解酶或以上二者。在一些实施方案中，硫酯酶、脂肪酸降解酶、或以上二者在功能上被缺失。在一些实施方案中，宿主细胞不具有可检测的硫酯酶活性、酰基CoA合酶活性、或不具有以上二者。在一些实施方案中，宿主细胞可以从硫脂和醇底物产生脂肪酸和/或衍生物。在可选实施方案中，宿主细胞可以从游离脂肪酸和醇底物产生脂肪酯。
在一些实施方案，酯合酶多肽来源于，例如细菌、植物、昆虫、酵母、真菌或哺乳动物。在某些实施方案中，酯合酶多肽来源于哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、细菌细胞、蓝细菌细胞、或本文所述的任何其他有机体的细胞。在某些实施方案中，天然存在的酯合酶来自于酸杆菌(Acidobacteria)、热酸菌(Acidothermus)、不动杆菌(Acinetobacter)、气单胞菌(Aeromonas)、食烷菌(Alcanivorax)、产碱杆菌(Alcaligenes)、交替单胞菌(Alteromonas)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter)、鼠耳芥(Arabidopsis)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、赤细菌(Erythrobacter)、弗兰克氏菌(Frankia)、海床杆菌(Fundibacter)、哈赫拉菌(Hahella chejuensis)、两面神菌(Janibacter)、湖沉积杆菌(Limnobacter)、海杆菌(Marinobacter)、Methylibium、微颤菌(Microscilla)、摩替亚氏菌(Moritella)、小家鼠(Mus musculus)、分枝杆菌(Mycobacterium)、粘球菌(Myxococcus)、嗜盐碱单胞菌(Natronomonas)、诺卡氏菌(Nocardia)、类诺卡氏菌(Nocardioides)、发光细菌(Photobacterium)、变形细菌(Proteobacterium)、Plesiocystis、Polaromonas、假单胞菌(Pseudomonas)、嗜冷杆菌(Psychrobacter)、Reinekea、红育菌(Rhodoferax)、红球菌(Rhodococcus)、玫瑰弯菌(Roseiflexus)、糖多孢菌(Saccharopolyspora)、Salinibacter、Simmodsia Solibacter、鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis)、标记菌(Stigmatella)、链霉菌(Streptomyces)、黏着杆菌(Tenacibaculum)、或黑粉菌(Ustilago)。
在具体实施方案中，本发明的天然存在的酯合酶来源于以下的任何一种：酸杆菌(Acidobacteria bacterium)、解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑产气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、真养产碱菌(Alcaligenes europhus)、泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)、亚德食烷菌(Alcanivorax jadensis)、麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter dehalogenans)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter sp.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)、赤细菌(Erythrobacter sp.)、弗兰克氏菌(Frankia sp.)、Fundibacter jadensis、γ变型菌(gamma proteobacterium)、哈赫拉菌(Hahellachejuensis)、智人(Homo sapiens)、两面神菌(Janibacter sp.)、湖沉积杆菌(Limnobacter sp.)、海洋γ变型菌(marine gamma proteobacterium)、栖藻海杆菌(Marinobacter algicola)、水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)、除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbinoclasticus)、海杆菌(Marinobacter sp.)、Methylibiumpetroleiphilum、海洋微颤菌(Microscilla marina)、摩替亚氏菌(Moritella sp.)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、小家鼠(Mus musculus)、脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、浅黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、Mycobacterium vanbaalenii、橙黄色粘球菌(Myxococcusxanthus)、法老嗜盐碱单胞菌(Natronomonas pharaonis)、皮疽诺卡氏菌(Nocardiafarcinica)、类诺卡氏菌(Nocardioides sp.)、深海嗜压菌(Photobacterium profundum)、太平洋邻囊菌(Plesiocystis pacifica)、萘降解极地单胞菌(Polaromonasnaphthalenivorans)、极地单胞菌(Polaromonas sp.)、铜绿假单胞菌(Psudomonasaeruginosa)、绿脓杆菌(Psychrobacter arcticus)、北极嗜冷杆菌(Psychrobactercryohalolentis)、嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.)、Reinekea sp.、不透明红球菌(Rhodococcus opacus)、铁还原红育菌(Rhodoferax ferrireducens)、红球菌(Rhodococcus sp.)、铁还原红育菌(Rhodoferax ferrireducens)、玫瑰弯菌(Roseiflexussp.)、Roseiflexus castenholzii、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)、嗜盐菌(Salinibacter ruber)、Simmodsia chinensis、Solibacter usitatus、阿拉斯加鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis alaskensis)、橙色标记菌(Stigmatella aurantiaca)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、黏着杆菌(Tenacibaculum sp.)和玉米黑粉菌(Ustilago maydis)。在特定的实施方式中，编码酯合酶或其变体的基因被超表达。
在其他实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞表达降低水平的至少一种以下基因：编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因。在某些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因、编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因中的一个或多个被在功能上缺失。在某些实施方案中，表达降低水平的外膜蛋白受体的宿主细胞对噬菌体感染有抵抗力。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因是fadE。在一些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是编码铁色素、大肠杆菌素M、噬菌体T1、噬菌体T5或噬菌体受体的一个基因。包含这样的外膜蛋白受体的宿主细胞包括，例如啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、解脂耶氏酵母(Candida lipolytica)、大肠杆菌(Escherichia coli)、节杆菌(Arthrobacter)、黏红酵母(Rhodotorula glutinins)、不动菌(Acinetobacter)、解脂耶氏酵母(Candida lipolytica)、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、弗氏弧菌(Vibriofurnissii)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、藤黄微球菌(Micrococcus leuteus)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophila)、或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在某些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是fhuA(又被称为tonA)。在又一实施方案中，编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因是fabR。
在某些实施方案中，该方法还包括在酯合酶多肽的至少一种生物底物的存在下培养所述宿主细胞。在一些实施方案总，该方法包括在允许酯合酶或其适合的变体表达或超表达的条件下培养所述宿主细胞。在又一实施方案中，该方法包括在允许产生脂肪酸或其衍生物的条件下培养所述宿主细胞，所述脂肪酸或其衍生物的产生是通过由酯合酶或其变体催化而没有硫酯酶、脂肪酸降解酶或以上二者参与的酶促反应。在某些实施方案中，酯合酶多肽的生物底物是硫脂。在其他实施方案中，所述生物底物是醇，例如短链或长链脂肪醇。在又一实施方案中，所述生物底物是游离脂肪酸。
在另一方面，本发明特征为产生脂肪酸和/或包括例如脂肪酸酯的脂肪酸衍生物的方法。该方法包括在宿主细胞中表达编码酯合酶或其变体的基因，所述酯合酶或其变体包含与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述酯合酶具有SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该方法还包括从经过基因工程处理的宿主细胞中分离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物存在于细胞外环境。在某些实施方案中，从宿主细胞的细胞外环境分离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在某些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物部分地或全部地自发分泌到细胞外环境。在一些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物借助于或不借助于一种或多种适合的转运蛋白而被转运到细胞外环境。在其他实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物被动被转运到细胞外环境。
在某些实施方案中，宿主细胞的内源硫酯酶如果存在的话，则未被修饰。在某些实施方案中，该方法包括改变宿主细胞中编码硫酯酶的基因的表达。在一些实施方案中，改变编码硫酯酶的基因的表达包括在宿主细胞中表达编码硫酯酶的异源基因和/或增加宿主细胞中内源硫酯酶的表达或活性。在可选实施方案中，改变编码硫酯酶的基因的表达包括减弱宿主细胞中编码硫酯酶的内源基因的表达。在一些实施方案中，改变编码硫酯酶的基因的表达包括在功能上使编码硫酯酶的内源基因缺失。在具体实施方案中，硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatAl编码。
在一些实施方案中，将宿主细胞经过基因工程处理以相对于野生型宿主细胞中的脂肪酸降解酶水平表达减弱水平的脂肪酸降解酶。示例性的脂肪酸降解酶包括，但不限于EC 2.3.1.86或EC 6.2.1.3的酰基CoA合酶。在具体实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的由fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码的酰基CoA合酶。在某些实施方案中，诸如酰基CoA合酶的上述脂肪酸降解酶被在功能上缺失使得宿主细胞不具有可检测的酰基CoA合酶活性。
在某些实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以表达减弱水平的硫酯酶、减弱水平的脂肪酸降解酶或以上二者。在一些实施方案中，硫酯酶、酰基CoA合酶或以上二者被在功能上缺失。在一些实施方案中，宿主细胞不具有可检测的硫酯酶活性或脂肪酸降解酶活性。在一些实施方案中，宿主细胞可以产生脂肪酸和/或其衍生物。
在其他实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞表达降低水平的至少一种以下基因：编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因、和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因中的一个或多个被在功能上缺失。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因是fadE。在一些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是编码铁色素、大肠菌素M、噬菌体T1、噬菌体T5或噬菌体受体的一个基因。在某些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是fhuA(又被称为tonA)。在又一实施方案中，编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因是fabR。
在某些实施方案中，酯合酶多肽来源于细菌、植物、昆虫、酵母、真菌或哺乳动物。在一些实施方案中，所述多肽来自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、细菌细胞或任何其他本文所述的有机体的细胞。在某些实施方案中，酯合酶来自于酸杆菌(Acidobacteria)、热酸菌(Acidothermus)、不动杆菌(Acinetobacter)、气单胞菌(Aeromonas)、食烷菌(Alcanivorax)、产碱杆菌(Alcaligenes)、交替单胞菌(Alteromonas)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter)、鼠耳芥(Arabidopsis)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、赤细菌(Erythrobacter)、弗兰克氏菌(Frankia)、海床杆菌(Fundibacter)、哈赫拉菌(Hahella chejuensis)、两面神菌(Janibacter)、湖沉积杆菌(Limnobacter)、海杆菌(Marinobacter)、Methylibium、微颤菌(Microscilla)、摩替亚氏菌(Moritella)、小家鼠(Mus musculus)、分枝杆菌(Mycobacterium)、粘球菌(Myxococcus)、嗜盐碱单胞菌(Natronomonas)、诺卡氏菌(Nocardia)、类诺卡氏菌(Nocardioides)、发光细菌(Photobacterium)、变形细菌(Proteobacterium)、Plesiocystis、Polaromonas、假单胞菌(Pseudomonas)、嗜冷杆菌(Psychrobacter)、Reinekea、红育菌(Rhodoferax)、红球菌(Rhodococcus)、玫瑰弯菌(Roseiflexus)、糖多孢菌(Saccharopolyspora)、Salinibacter、Simmodsia Solibacter、鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis)、标记菌(Stigmatella)、链霉菌(Streptomyces)、黏着杆菌(Tenacibaculum)、或黑粉菌(Ustilago)。
在具体实施方案中，酯合酶来源于以下的任何一种：酸杆菌(Acidobacteriabacterium)、解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑产气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、真养产碱菌(Alcaligenes europhus)、泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)、亚德食烷菌(Alcanivorax jadensis)、麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter dehalogenans)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter sp.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)、赤细菌(Erythrobacter sp.)、弗兰克氏菌(Frankia sp.)、Fundibacter jadensis、γ变型菌(gamma proteobacterium)、哈赫拉菌(Hahellachejuensis)、智人(Homo sapiens)、两面神菌(Janibacter sp.)、湖沉积杆菌(Limnobacter sp.)、海洋γ变型菌(marine gamma proteobacterium)、栖藻海杆菌(Marinobacter algicola)、水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)、除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbinoclasticus)、海杆菌(Marinobacter sp.)、Methylibiumpetroleiphilum、海洋微颤菌(Microscilla marina)、摩替亚氏菌(Moritella sp.)、高山被孢霉(Mortierella alpine)、小家鼠(Mus musculus)、脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、浅黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、Mycobacterium vanbaalenii、橙黄色粘球菌(Myxococcusxanthus)、法老嗜盐碱单胞菌(Natronomonas pharaonis)、皮疽诺卡氏菌(Nocardiafarcinica)、类诺卡氏菌(Nocardioides sp.)、深海嗜压菌(Photobacterium profundum)、太平洋邻囊菌(Plesiocystis pacifica)、萘降解极地单胞菌(Polaromonasnaphthalenivorans)、极地单胞菌(Polaromonas sp.)、铜绿假单胞菌(Psudomonasaeruginosa)、绿脓杆菌(Psychrobacter arcticus)、北极嗜冷杆菌(Psychrobactercryohalolentis)、嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.)、Reinekea sp.、不透明红球菌(Rhodococcus opacus)、铁还原红育菌(Rhodoferax ferrireducens)、红球菌(Rhodococcus sp.)、铁还原红育菌(Rhodoferax ferrireducens)、玫瑰弯菌(Roseiflexussp.)、Roseiflexus castenholzii、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)、嗜盐菌(Salinibacter ruber)、Simmodsia chinensis、Solibacter usitatus、阿拉斯加鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis alaskensis)、橙色标记菌(Stigmatella aurantiaca)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、黏着杆菌(Tenacibaculum sp.)和玉米黑粉菌(Ustilago maydis)。在特定的实施方式中，编码酯合酶或其变体的基因被超表达。
在一些实施方案中，该方法还包括在酯合酶多肽的至少一种生物底物的存在下培养所述宿主细胞。在某些实施方案中，该方法包括在足以允许宿主细胞中酯合酶的表达或超表达的条件下培养所述宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞的内源硫酯酶如果存在的话，则未被修饰。在其他实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的硫酯酶、脂肪酸降解酶或以上二者。在一些实施方案中，硫酯酶、脂肪酸降解酶或以上二者被在功能上缺失。在一些实施方案中，宿主细胞不具有可检测的硫酯酶活性或酰基CoA合酶活性或不具有以上二者。在一些实施方案中，该方法包括在足以允许产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的条件下培养宿主细胞。在某些实施方案中，在硫脂底物的存在下培养宿主细胞。在其他实施方案中，在醇的存在下培养宿主细胞。在又一实施方案中，在游离脂肪酸的存在下培养宿主细胞。
在另一方面，本发明特征为产生脂肪酸和/或包括例如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法。该方法包括在宿主细胞中表达与SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQID NO：30的核苷酸序列的互补序列或其片段杂交的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有酯合酶和/或酰基转移酶活性的多肽。例如，该多肽可以利用一种或多种醇作为底物催化硫脂转化为脂肪酸和/或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物。在具体实施方案中，适合的硫脂底物包括诸如脂肪酰CoA的酰基CoA和诸如脂肪酰ACP的酰基ACP。适合的醇底物包括，例如，短链或长链醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、辛醇、庚醇、癸醇、十二醇、十四醇或十六醇。在一些实施方案中，该多肽可以催化游离脂肪酸转化为脂肪酯。
在一些实施方案中，所述多核苷酸与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的核苷酸序列的互补序列或其片段在低严紧性、中严紧性、高严紧性或极高严紧性(stringency)条件下杂交。在某些实施方案中，该多核苷酸包含已被密码子优化以用于在选择的宿主细胞中表达或超表达的序列。
在一些实施方案中，该方法还包括从宿主细胞中分离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物存在于细胞外环境。在某些实施方案中，从宿主细胞的细胞外环境分离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物部分地或全部地从宿主细胞自发分泌。在可选实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物借助于或不借助于一种或多种转运蛋白而被转运到细胞外环境。在其他实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物被动地被转运到细胞外环境。
在某些实施方案中，宿主细胞的内源硫酯酶如果存在的话，则未被修饰。在某些其他实施方案中，该方法包括改变宿主细胞中编码硫酯酶的基因的表达。在某些实施方案中，改变编码硫酯酶的基因的表达包括在宿主细胞中表达编码硫酯酶的异源基因和/或增加宿主细胞中内源硫酯酶的表达或活性。在可选实施方案中，改变编码硫酯酶的基因的表达包括减弱宿主细胞中编码硫酯酶的内源基因的表达和/或在功能上使内源硫酯酶缺失。在具体实施方案中，硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatAl编码。
在一些实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞降低的水平来表达脂肪酸降解酶。示例性的脂肪酸降解酶包括，但不限于EC 2.3.1.86或EC6.2.1.3的酰基CoA合酶。在具体实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的由fadD、fadK、BH3103、yhfL、pfl-4354、eav15023、fadD1、fadD2、rpc_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码的酰基CoA合酶。在某些实施方案中，诸如酰基CoA合酶基因的上述脂肪酸降解酶被在功能上缺失使得宿主细胞不具有可检测的酰基CoA合酶活性。
在一些实施方案中，宿主细胞进行基因工程处理以表达减弱水平的硫酯酶、减弱水平的脂肪酸降解酶或以上二者。在一些实施方案中，硫酯酶、脂肪酸降解酶或以上二者被在功能上缺失。在某些实施方案中，宿主细胞不具有可检测的硫酯酶活性或脂肪酸降解酶活性。在一些实施方案中，宿主细胞可以产生脂肪酸和/或其衍生物。
在其他实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞表达降低水平的至少一种以下基因：编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因。在其他实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因、和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因中的一个或多个被在功能上缺失。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因是fadE。在一些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是编码铁色素、大肠菌素M、噬菌体T1、噬菌体T5或噬菌体受体的一个基因。在某些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是fhuA(又被称为tonA)。在又一实施方案中，编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因是fabR。
在某些实施方案中，酯合酶来源于细菌、植物、昆虫、酵母、真菌或哺乳动物。在一些实施方案中，酯合酶来自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、细菌细胞或任何其他本文所述的有机体的细胞。在某些实施方案中，所述多核苷酸来自于酸杆菌(Acidobacteria)、热酸菌(Acidothermus)、不动杆菌(Acinetobacter)、气单胞菌(Aeromonas)、食烷菌(Alcanivorax)、产碱杆菌(Alcaligenes)、交替单胞菌(Alteromonas)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter)、鼠耳芥(Arabidopsis)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、赤细菌(Erythrobacter)、弗兰克氏菌(Frankia)、海床杆菌(Fundibacter)、哈赫拉菌(Hahella chejuensis)、两面神菌(Janibacter)、湖沉积杆菌(Limnobacter)、海杆菌(Marinobacter)、Methylibium、微颤菌(Microscilla)、摩替亚氏菌(Moritella)、小家鼠(Mus musculus)、分枝杆菌(Mycobacterium)、粘球菌(Myxococcus)、嗜盐碱单胞菌(Natronomonas)、诺卡氏菌(Nocardia)、类诺卡氏菌(Nocardioides)、发光细菌(Photobacterium)、变形细菌(Proteobacterium)、Plesiocystis、Polaromonas、假单胞菌(Pseudomonas)、嗜冷杆菌(Psychrobacter)、Reinekea、红育菌(Rhodoferax)、红球菌(Rhodococcus)、玫瑰弯菌(Roseiflexus)、糖多孢菌(Saccharopolyspora)、Salinibacter、Simmodsia Solibacter、鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis)、标记菌(Stigmatella)、链霉菌(Streptomyces)、黏着杆菌(Tenacibaculum)、或黑粉菌(Ustilago)。
在具体实施方案中，酯合酶多核苷酸来源于以下的任何一种：酸杆菌(Acidobacteria bacterium)、解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑产气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、真养产碱菌(Alcaligenes europhus)、泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)、亚德食烷菌(Alcanivorax jadensis)、麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter dehalogenans)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter sp.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)、赤细菌(Erythrobacter sp.)、弗兰克氏菌(Frankia sp.)、Fundibacter jadensis、γ变型菌(gamma proteobacterium)、哈赫拉菌(Hahellachejuensis)、智人(Homo sapiens)、两面神菌(Janibacter sp.)、湖沉积杆菌(Limnobacter sp.)、海洋γ变型菌(marine gamma proteobacterium)、栖藻海杆菌(Marinobacter algicola)、水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)、除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbinoclasticus)、海杆菌(Marinobacter sp.)、Methylibiumpetroleiphilum、海洋微颤菌(Microscilla marina)、摩替亚氏菌(Moritella sp.)、高山被孢霉(Mortierella alpine)、小家鼠(Mus musculus)、脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、浅黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、Mycobacterium vanbaalenii、橙黄色粘球菌(Myxococcusxanthus)、法老嗜盐碱单胞菌(Natronomonas pharaonis)、皮疽诺卡氏菌(Nocardiafarcinica)、类诺卡氏菌(Nocardioides sp.)、深海嗜压菌(Photobacterium profundum)、太平洋邻囊菌(Plesiocystis pacifica)、萘降解极地单胞菌(Polaromonasnaphthalenivorans)、极地单胞菌(Polaromonas sp.)、铜绿假单胞菌(Psudomonasaeruginosa)、绿脓杆菌(Psychrobacter arcticus)、北极嗜冷杆菌(Psychrobactercryohalolentis)、嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.)、Reinekea sp.、不透明红球菌(Rhodococcus opacus)、铁还原红育菌(Rhodoferax ferrireducens)、红球菌(Rhodococcus sp.)、铁还原红育菌(Rhodoferax ferrireducens)、玫瑰弯菌(Roseiflexussp.)、Roseiflexus castenholzii、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)、嗜盐菌(Salinibacter ruber)、Simmodsia chinensis、Solibacter usitatus、阿拉斯加鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis alaskensis)、橙色标记菌(Stigmatella aurantiaca)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、黏着杆菌(Tenacibaculum sp.)和玉米黑粉菌(Ustilago maydis)。在具体实施方案中，编码酯合酶的多核苷酸或其变体被超表达。
在一些实施方案中，该方法还包括在酯合酶多肽的至少一种生物底物的存在下培养所述宿主细胞。在某些实施方案中，该方法包括在足以允许宿主细胞中酯合酶的表达或超表达的条件下培养所述宿主细胞。在一些实施方案中，该方法还包括在足以允许产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的条件下培养宿主细胞。在一些实施方案中，该方法包括在诸如脂肪酰CoA或脂肪酰ACP的硫脂底物的存在下培养宿主细胞。在某些其他实施方案中，该方法包括在醇底物的存在下培养宿主细胞。在仍然其他实施方案中，该方法包括在游离脂肪酸的存在下培养宿主细胞。
在另一方面，本发明特征为产生脂肪酸或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法。该方法包括在宿主细胞中表达编码具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的酯合酶的外源基因或其变体。或者，该方法包括使用遗传改变操纵宿主细胞的编码SEQ ID NO：18的酯合酶的内源酯合酶基因或其变体。在一些实施方案中，该方法还包括从宿主细胞中分离脂肪酸或脂肪酸衍生物。
在又一方面，本发明特征为使用纯化的具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的酯合酶或其变体在细胞外从底物产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的体外方法。在一实施方案中，在允许酯合酶或其变体表达或超表达的条件下培养宿主细胞。然后收获并溶解宿主细胞。任选地，将所得混合物纯化。在允许产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的条件下将诸如本文所述的那些底物的适合的底物添加到无细胞的提取物中。
在一些实施方案中，酯合酶变体包含具有一个或多个氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQ ID NO:18的氨基酸序列，其中所述多肽具有酯合酶活性和/或酰基转移酶活性。在某些实施方案中，酯合酶变体具有增加的酯合酶和/或酰基转移酶活性。例如，酯合酶多肽可以具有增加的利用醇作为底物催化硫脂转化为脂肪酯的能力。硫脂底物包括，例如诸如脂肪酰CoA或脂肪酰ACP的脂肪硫脂。在一些实施方案中，酯合酶变体可以具有增加的利用醇作为底物催化游离脂肪酸转化为脂肪酯的能力。醇底物包括，例如，长链或短链醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、癸醇、十二醇、十四醇或十六醇。
在一些实施方案中，酯合酶变体包含具有一个或多个非保守氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQ ID NO:18的氨基酸序列，其中所述变体保留酯合酶和/或酰基转移酶活性。在一些实施方案中，酯合酶变体具有改善的酯合酶和/或酰基转移酶活性。在示例性的实施方案中，SEQ ID NO：18的395位处的甘氨酸残基被碱性氨基酸残基取代，并且所得的酯合酶变体保留或具有改善的酯合酶和/或酰基转移酶活性。在一些实施方案中，SEQ ID NO：18的395位处的甘氨酸残基被精氨酸或赖氨酸残基取代，并且所得的酯合酶变体具有改善的酯合酶和/或酰基转移酶活性。
在一些实施方案中，酯合酶变体包含一个或多个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，酯合酶变体具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸取代、添加、插入或缺失。在一些实施方案中，酯合酶变体具有酯合酶和/或酰基转移酶活性。例如，多肽可以利用醇作为底物催化硫脂转化为脂肪酸和/或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物。在可选实施方案中，多肽可以从何时的游离脂肪酸和醇产生脂肪酯，所述醇例如长链或短链醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、癸醇、十二醇、十四醇或十六醇。
在某些实施方案中，宿主细胞的内源硫酯酶如果存在的话，则未被修饰。在其他实施方案中，该方法包括改变宿主细胞中编码硫酯酶的基因的表达。在某些实施方案中，改变硫酯酶基因的表达包括减弱宿主细胞中编码硫酯酶的内源基因的表达和/或在功能上缺失这类基因。在具体实施方案中，硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatAl编码。
在一些实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞降低的水平来表达脂肪酸降解酶。示例性的脂肪酸降解酶包括，但不限于EC 2.3.1.86或EC6.2.1.3的酰基CoA合酶。在具体实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的由fadD、fadK、BH3103、yhfL、pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、rpc_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码的酰基CoA合酶。在某些实施方案中，诸如酰基CoA合酶基因的上述脂肪酸降解酶被在功能上缺失使得宿主细胞不表达酰基CoA合酶或不具有可检测的酰基CoA合酶活性。
在某些实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以表达减弱水平的硫酯酶、减弱水平的脂肪酸降解酶或以上二者。在示例性的实施方案中，硫酯酶、脂肪酸降解酶或以上二者被在功能上缺失。在一些实施方案中，宿主细胞不具有可检测水平的硫酯酶活性或酰基CoA合酶活性。在某些实施方案中，宿主细胞可以产生脂肪酸和/或其衍生物。
在其他实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞表达降低水平的至少一种以下基因：编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因、和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因中的一个或多个被在功能上缺失。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因是fadE。在一些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是编码铁色素、大肠菌素M、噬菌体T1、噬菌体T5或噬菌体受体的一个基因。在某些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是fhuA(又被称为tonA)。在又一实施方案中，编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因是fabR。
在一些实施方案中，该方法还包括在酯合酶多肽的至少一种生物底物的存在下培养所述宿主细胞。在某些实施方案中，该方法包括在允许宿主细胞中酯合酶的表达或超表达的条件下培养所述宿主细胞。在其他实施方案中，该方法包括在允许产生所需脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的条件下培养宿主细胞。在一些实施方案中，该方法包括在硫脂底物的存在下培养宿主细胞。在某些其他实施方案中，该方法包括在醇的存在下培养宿主细胞。在其他实施方案中，该方法包括在游离脂肪酸的存在下培养宿主细胞。
在另一方面，本发明特征为产生脂肪酸和/或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法。该方法包括在宿主细胞中表达编码酯合酶多肽的基因，所述酯合酶包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少约35％的序列同一性，例如至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，将宿主细胞工程处理以具有减弱水平的硫酯酶、脂肪酸降解酶或以上二者。或者，硫酯酶、脂肪酸降解酶或以上二者被在功能上缺失。在一些实施方案中，宿主细胞不具有可检测的硫酯酶活性或酰基CoA合酶活性。在一些实施方案中，该方法还包括从宿主细胞中分离由此产生的脂肪酸或脂肪酸衍生物。
在可选实施方案中，本发明还特征为使用纯化的与SEQ ID NO：18的氨基酸序列具有至少约35％序列同一性的酯合酶在细胞外从适合的底物产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的体外方法。在示例性的实施方案中，在允许酯合酶或其变体表达或超表达的条件下培养宿主细胞。然后收获并溶解宿主细胞。任选地，将所得混合物纯化。在允许产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的条件下将诸如本文所述的那些底物的适合的底物添加到无细胞的提取物中。
在一些实施方案中，本发明的酯合酶或适合的变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的序列同一性。在一些实施方案中，酯合酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:18。示例性的酯合酶多肽包括GenBank登录号为ZP_01915978(SEQ ID NO：41)的来自湖沉积杆菌MED105(Limnobacter sp.MED105)的酯合酶，其与来自除烃海杆菌DSM8798(Marinobacterhydrocarbonclasticus DSM 8798)的酯合酶的氨基酸序列SEQ ID NO:18具有约51％的序列同一性。
在某些实施方案中，宿主细胞的内源硫酯酶如果存在的话，则未被修饰。在其他实施方案中，该方法包括改变宿主细胞中编码硫酯酶的基因的表达。在某些实施方案中，改变硫酯酶基因的表达包括减弱宿主细胞中编码硫酯酶的内源基因的表达和/或在功能上缺失该基因。在具体实施方案中，硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatAl编码。
在一些实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞降低的水平来表达脂肪酸降解酶。示例性的脂肪酸降解酶包括，但不限于EC 2.3.1.86或EC6.2.1.3的酰基CoA合酶。在具体实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的由fadD、fadK、BH3103、yhfL、pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、rpc_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码的酰基CoA合酶。在某些实施方案中，诸如酰基CoA合酶基因的上述脂肪酸降解酶被在功能上缺失使得宿主细胞不表达酰基CoA合酶或不具有可检测的酰基CoA合酶活性。
在某些实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以表达减弱水平的硫酯酶、诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶或以上二者。在示例性的实施方案中，硫酯酶、酰基CoA合酶或以上二者被在功能上缺失。在一些实施方案中，宿主细胞可以产生脂肪酸和/或其衍生物。
在其他实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞表达降低水平的至少一种以下基因：编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因、和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因中的一个或多个被在功能上缺失。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因是fadE。在一些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是编码铁色素、大肠菌素M、噬菌体T1、噬菌体T5或噬菌体受体的一个基因。在某些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是fhuA(又被称为tonA)。在又一实施方案中，编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因是fabR。
在另一方面，本发明特征为产生脂肪酸或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法。该方法包括在宿主细胞中表达在低严紧性、中严紧性、高严紧性或超高严紧性条件下与SEQID NO：27的互补序列或其片段杂交的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有酯合酶和/或酰基转移酶活性的多肽。例如，该多肽具有酯合酶活性并可以利用醇作为底物将硫脂转化为脂肪酯。适合的硫脂底物包括，例如诸如脂肪酰CoA或脂肪酰ACP的脂肪硫脂。在其他实施方案中，宿主细胞从游离脂肪酸和醇底物产生脂肪酯。适合的醇底物包括，例如，长链或短链醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、辛醇、庚醇、癸醇、十二醇、十四醇或十六醇。
在某些实施方案中，宿主细胞的内源硫酯酶如果存在的话，则未被修饰。在其他实施方案中，该方法包括改变宿主细胞中编码硫酯酶的基因的表达。在一些实施方案中，改变硫酯酶基因的表达包括减弱宿主细胞中编码硫酯酶的内源基因的表达和/或在功能上缺失该基因。在具体实施方案中，硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatAl编码。
在一些实施方案中，将宿主细胞经过基因工程处理以相对于野生型宿主细胞降低的水平来表达脂肪酸降解酶。示例性的脂肪酸降解酶包括，但不限于EC 2.3.1.86或EC6.2.1.3的酰基CoA合酶。在具体实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的由fadD、fadK、BH3103、yhfL、pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、rpc_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码的酰基CoA合酶。在某些实施方案中，诸如酰基CoA合酶基因的上述脂肪酸降解酶被在功能上缺失使得宿主细胞不表达酰基CoA合酶或不具有可检测的酰基CoA合酶活性。
在某些实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以表达减弱水平的硫酯酶、诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶或以上二者。在一些实施方案中，硫酯酶、酰基CoA合酶或以上二者被在功能上缺失。在一些实施方案中，宿主细胞可以产生脂肪酸和/或其衍生物。
在其他实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞表达降低水平的至少一种以下基因：编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因、和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因中的一个或多个被在功能上缺失。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因是fadE。在一些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是编码铁色素、大肠菌素M、噬菌体T1、噬菌体T5或噬菌体受体的一个基因。在某些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是fhuA(又被称为tonA)。在又一实施方案中，编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因是fabR。
在一些实施方案中，该方法还包括在酯合酶的至少一种生物底物的存在下培养所述宿主细胞。在某些实施方案中，该方法包括在允许宿主细胞中酯合酶的表达或超表达的条件下培养所述宿主细胞。在其他实施方案中，该方法包括在允许产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的条件下培养宿主细胞。在一些实施方案中，该方法包括在硫脂底物的存在下培养宿主细胞。在一些其他实施方案中，该方法包括在醇底物的存在下培养宿主细胞。在其他实施方案中，该方法包括在游离脂肪酸的存在下培养宿主细胞。
在一些实施方案中，该方法还包括从宿主细胞中分离由此产生的脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物存在于细胞外环境。在某些实施方案中，从宿主细胞的细胞外环境分离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物部分地或全部地从宿主细胞自发分泌。在可选实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物借助于或不借助于一种或多种适合的转运蛋白而被转运到细胞外环境。在其他实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物被动地被转运到细胞外环境。
在可选实施方案中，本发明特征为在细胞外产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的体外方法，所述方法利用纯化的由与SEQ ID NO：27的互补序列或其片段杂交的多核苷酸编码的酯合酶和适合的底物。例如，可以在允许酯合酶或其变体表达或超表达的条件下培养宿主细胞，然后收获和溶解细胞。任选地，所得混合物可以被纯化。在允许产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的条件下将诸如本文所述的那些底物的适合的底物添加到无细胞的提取物中。
在另一方面，本发明特征为产生脂肪酸和/或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法。本发明包括在宿主细胞中表达重组载体，所述重组载体包含与图16的多核苷酸序列具有至少约50％序列同一性的酯合酶多核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ IDNO：27、28、29或30的核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的序列同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列是SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30。在示例性的实施方案中，重组载体包含SEQ ID NO：42的酯合酶多核苷酸序列(从编码来自湖沉积杆菌MED105的酯合酶同系物的多核苷酸密码子优化的)，其与SEQ ID NO：27具有约50％的序列同一性，可以在宿主细胞中表达以产生脂肪酸和/或其衍生物。在某些实施方案中，将宿主细胞进行工程处理以表达减弱水平的硫酯酶、脂肪酸降解酶或以上二者。在一些实施方案中，硫酯酶、脂肪酸降解酶或以上二者被在功能上缺失。在某些实施方案中，宿主细胞可以产生脂肪酸和/或其衍生物。
在一些实施方案中，该方法还包括从宿主细胞中分离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物存在于细胞外环境。在某些实施方案中，从宿主细胞的细胞外环境分离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物部分地或全部地从宿主细胞自发分泌。在可选实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物借助于或不借助于一种或多种适合的转运蛋白而被转运到细胞外环境。在其他实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物被动地被转运到细胞外环境。
在另一方面，本发明还特征为在细胞外产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的体外方法，其中在允许酯合酶表达或超表达的条件下培养包含重组载体的宿主细胞，所述重组载体包含与图16所列的核苷酸序列具有至少约50％序列同一性的酯合酶核苷酸序列。然后收获并溶解宿主细胞。任选地，将所得混合物纯化。然后在允许体外产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的条件下将适合的底物添加到无细胞提取物中。
在一些实施方案中，重组载体还包含可操作地连接到编码酯合酶或适合的变体的核苷酸序列的启动子。在某些实施方案中，所述启动子是发育调节性、或细胞器特异性、组织特异性、诱导型、组成型或细胞特异性启动子。
在其他实施方案中，所述重组载体包含至少一个选自以下的序列：(a)可操作地连接到所述核苷酸序列的调节序列；(b)可操作地连接到所述核苷酸序列的选择标记；(c)可操作地连接到所述核苷酸序列的标记序列；(d)可操作地连接到所述核苷酸序列的纯化部分；(e)可操作地连接到所述核苷酸序列的分泌序列(secretion sequence)；和(f)可操作地连接到所述核苷酸序列的导向序列(targeting sequence)。
在一些实施方案中，重组载体是质粒。
在一些实施方案中，宿主细胞表达由重组载体编码的酯合酶多肽。在一些实施方案中，所述核苷酸序列被稳定并入所述宿主细胞的基因组DNA，并且所述核苷酸序列的表达受可调型启动子区的控制。
在某些实施方案中，宿主细胞的内源硫酯酶如果存在的话则未被修饰。在其他实施方案中，该方法包括改变宿主细胞中编码硫酯酶的基因的表达。在一些实施方案中，改变硫酯酶基因的表达包括减弱宿主细胞中编码硫酯酶的内源基因的表达和/或在功能上缺失该基因。在具体实施方案中，硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatAl编码。
在一些实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞降低的水平来表达脂肪酸降解酶。示例性的脂肪酸降解酶包括，但不限于EC 2.3.1.86或EC6.2.1.3的酰基CoA合酶。在具体实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的由fadD、fadK、BH3103、yhfL、pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、rpc_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码的酰基CoA合酶。在某些实施方案中，诸如酰基CoA合酶基因的上述脂肪酸降解酶被在功能上缺失使得宿主细胞不表达酰基CoA合酶或不具有酰基CoA合酶活性。
在其他实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞表达降低水平的至少一种以下基因：编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因、和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因中的一个或多个被在功能上缺失。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因是fadE。在一些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是编码铁色素、大肠菌素M、噬菌体T1、噬菌体T5或噬菌体受体的一个基因。在某些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是fhuA(又被称为tonA)。在又一实施方案中，编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因是fabR。
在一些实施方案中，该方法还包括在酯合酶的至少一种生物底物的存在下培养所述宿主细胞。在一些实施方案中，该方法包括在允许宿主细胞中酯合酶的表达或超表达的条件下培养所述宿主细胞。在其他实施方案中，该方法包括在允许产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的条件下培养宿主细胞。在一些实施方案中，该方法包括在硫脂底物的存在下培养宿主细胞。在其他实施方案中，该方法包括在醇底物的存在下培养宿主细胞。在其他实施方案中，该方法包括在游离脂肪酸的存在下培养宿主细胞。
在另一方面，本发明特征为产生脂肪酸和/或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法。该方法包括在宿主细胞中表达包含酯合酶核酸序列的重组载体，所述酯合酶核酸序列与SEQ ID NO:27的核酸序列具有至少约50％的序列同一性。在某些实施方案中，及宿主细胞进行工程处理以表达减弱水平的硫酯酶、诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶或以上二者。在示例性的实施方案中，内源硫酯酶、酰基CoA合酶或以上二者被在功能上缺失。在一些实施方案中，宿主细胞可以产生脂肪酸和/或其衍生物。
在一些实施方案中，该方法还包括从宿主细胞中分离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物存在于细胞外环境。在某些实施方案中，从宿主细胞的细胞外环境分离脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物部分地或全部地从宿主细胞自发分泌。在可选实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物借助于或不借助于一种或多种适合的转运蛋白而被转运到细胞外环境。在其他实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物被动地被转运到细胞外环境。
在又一方面，本发明特征为在细胞外产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的体外方法，其中宿主细胞包含重组载体，所述重组载体进而包含与SEQ ID NO：27具有至少约50％同一性的酯合酶多核苷酸序列，并且其中在允许酯合酶表达或超表达的条件下培养所述宿主细胞。然后收获并溶解宿主细胞。任选地，将所得混合物纯化。然后在允许体外产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的条件下将适合的底物添加到无细胞提取物中，适合的底物例如选自本文所述的那些中的一个。
在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:27的核苷酸序列具有至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。在一些实施方案中，所述核苷酸序列是SEQ ID NO:27。
在某些实施方案中，宿主细胞的内源硫酯酶如果存在的话则未被修饰。在某些其他实施方案中，该方法还包括改变宿主细胞中编码硫酯酶的基因的表达。在某些实施方案中，改变硫酯酶基因的表达包括减弱宿主细胞中编码硫酯酶的内源基因的表达和/或在功能上缺失该基因。在具体实施方案中，硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatAl编码。
在一些实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞降低的水平来表达脂肪酸降解酶。示例性的脂肪酸降解酶包括，但不限于EC 2.3.1.86或EC6.2.1.3的酰基CoA合酶。在具体实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的由fadD、fadK、BH3103、yhfL、pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、rpc_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码的酰基CoA合酶。在某些实施方案中，诸如酰基CoA合酶基因的上述脂肪酸降解酶被在功能上缺失使得宿主细胞不表达酰基CoA合酶或不具有酰基CoA合酶活性。
在某些实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以表达减弱水平的硫酯酶、减弱水平的诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶或以上二者。在一些实施方案中，硫酯酶、酰基CoA合酶或以上二者被在功能上缺失。在某些实施方案中，宿主细胞可以产生脂肪酸和/或其衍生物。
在其他实施方案中，将宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞表达降低水平的至少一种以下基因：编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因、和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因中的一个或多个被在功能上缺失。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因是fadE。在一些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是编码铁色素、大肠菌素M、噬菌体T1、噬菌体T5或噬菌体受体的一个基因。在某些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是fhuA(又被称为tonA)。在又一实施方案中，编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因是fabR。
在一些实施方案中，重组载体还包含可操作地连接到编码酯合酶或其变体的核苷酸序列的启动子。在某些实施方案中，所述启动子是发育调节性、或细胞器特异性、组织特异性、诱导型、组成型或细胞特异性启动子。
在其他实施方案中，所述重组载体包含至少一个选自以下的序列：(a)可操作地连接到所述核苷酸序列的调节序列；(b)可操作地连接到所述核苷酸序列的选择标记；(c)可操作地连接到所述核苷酸序列的标记序列；(d)可操作地连接到所述核苷酸序列的纯化部分；(e)可操作地连接到所述核苷酸序列的分泌序列；和(f)可操作地连接到所述核苷酸序列的导向序列(targeting sequence)。
在一些实施方案中，重组载体是质粒。
在一些实施方案中，宿主细胞表达由重组载体编码的酯合酶或适合的变体。在一些实施方案中，所述核苷酸序列被稳定并入所述宿主细胞的基因组DNA，并且所述核苷酸序列的表达受可调型启动子区的控制。
在一些实施方案中，该方法还包括在酯合酶的至少一种生物底物的存在下培养所述宿主细胞。在某些实施方案中，该方法包括在足以允许宿主细胞中酯合酶的表达或超表达的条件下培养所述宿主细胞。在其他实施方案中，该方法包括在足以允许产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的条件下培养宿主细胞。
在某些实施方案中，宿主细胞的内源硫酯酶如果存在的话则未被修饰。在其他实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的硫酯酶。在示例性的实施方案中，硫酯酶被在功能上缺失。在其他实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶。在其他实施方案中，诸如酰基CoA合酶的内源脂肪酸降解酶被在功能上缺失。在一些实施方案中，在硫脂的存在下培养宿主细胞。在其他实施方案中，在适合的醇底物的存在下培养宿主细胞。在又一实施方案中，在游离脂肪酸的存在下培养宿主细胞。
在本文所述的本发明的任何方面中，所述宿主细胞可以选自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、蓝细菌细胞和细菌细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞是革兰氏阳性细菌细胞。在其他实施方案中，所述宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞选自以下的属：埃希氏菌(Escherichia)、芽孢杆菌(Bacillus)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、红球菌(Rhodococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、脉孢菌(Neurospora)、镰刀菌(Fusarium)、腐质霉(Humicola)、根毛霉(Rhizomucor)、克鲁维酵母菌(Kluyveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、毛霉菌(Mucor)、蚀丝霉(Myceliophtora)、青霉(Penicillium)、平革菌(Phanerochaete)、侧耳(Pleurotus)、栓菌(Trametes)、金孢子菌(Chrysosporium)、酵母(Saccharomyces)、寡养单胞菌(Stenotrophamonas)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母(Yarrowia)或链霉菌(Streptomyces)。
在具体实施方案中，所述宿主细胞为迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)细胞、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)细胞、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)细胞、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)细胞、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)细胞、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)细胞、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)细胞、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)细胞、克劳氏芽孢杆菌
(Bacillus clausii)细胞、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)细胞。
在其他实施方案中，宿主细胞为康氏木霉(Trichoderma koningii)细胞、绿色木霉(Trichoderma viride)细胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)细胞、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)细胞、烟曲霉(Aspergillus fumigates)细胞、臭曲霉(Aspergillus foetidus)细胞、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞、黑曲霉(Aspergillus niger)细胞、米曲霉(Aspergillusoryzae)细胞、特异腐质霉(Humicola insolens)细胞、棉毛状腐质霉(Humicolalanuginose)细胞、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)细胞、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)细胞或米黑毛酶(Mucor michei)细胞。
在其他实施方案中，所述宿主细胞是浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)细胞。
在又一实施方案中，宿主细胞是放线菌(Actinomycetes)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、解脂假丝酵母(Candida Lipolytica)(或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))细胞、大肠杆菌节杆菌AK19(E.coli Arthrobacter AK19)细胞、粘红酵母(Rhodotorula glutinins)细胞、不动杆菌M-1菌株(Acintobacter sp.StrainM-1)细胞或来自其他产油(oleaginous)微生物的细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞是产油酵母的细胞，例如，耶氏酵母(Yarrowia)、假丝酵母(Candida)、红酵母(Rhodotorula)、红冬孢酵母(Rhodosporidium)、隐球酵母(Cryptococcus)、丝孢酵母(Trichosporon)或油脂酵母(Lipomyces)。在某些实施方案中，宿主细胞是圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloide)、斯达油脂酵母(Lipomycesstarkeyii)、产油油脂酵母(L.Lipoferus)、Candida revkaufi、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母(C.Tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、Trichosporon pullas、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、粘红酵母(Rhodotorula glutinous)、牧草红酵母(R.Garminis)、和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(正式分类为解脂假丝酵母(Yarrowia lipolytica))。在具体实施方案中，宿主细胞是来自解脂耶氏酵母菌株ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944、ATCC#76982和/或LGAM S(7)1的细胞(PapanikolaouS.,and Aggelis G.,Bioresour.Technol.,82(1):43-9,2002)。
如本文所用的，术语“产油”是指趋向于以脂质(或油)的形式储存它们的能量的那些微生物(Weete,Fungal Lipid Biochemistry(真菌脂质生物化学),2nd Ed.,Plenum,1980)。并且出于本文的目的，产油有机体可以是具有产油能力的细菌、藻类、苔藓、酵母、真菌或植物。
术语“产油酵母”是那些可以制造油的被分类为酵母的微生物。通常，产油微生物的细胞内的油或甘油三酯含量遵循S曲线，其中脂质的浓度增加直至其在对数生长晚期或静止生长早期达到最大值，然后在静止生长晚期和死亡期逐步减少(Yongmaitchai&Ward,Appl.Environ.Microbiol.57:419-25(1991))。产油微生物所积累油的量超过其干细胞重量约25％并非罕见。产油酵母的实例包括，但不限于以下属：耶氏酵母(Yarrowia)、假丝酵母(Candida)、红酵母(Rhodotorula)、红冬孢酵母(Rhodosporidium)、隐球酵母(Cryptococcus)、丝孢酵母(Trichosporon)和油脂酵母(Lipomyces)。
在具体实施方案中，宿主细胞是来自以下的细胞：真核植物、藻类、蓝细菌(cyanobacterium)、绿色硫细菌(green sulfur bacterium)(包括，例如绿菌(Chlorobium)、绿硫菌(Clathrochloris)、突柄绿菌(Prosthecochloris))、绿色非硫细菌(包括，例如绿屈挠菌(Chloroflexus)、绿线菌(chloronema)、颤绿菌(Oscillochloris)、太阳发菌(Heliothrix)、滑柱菌(Herpetosiphon)、玫瑰弯菌(Roseiflexus)、和嗜热菌(Termomicrobium))、紫色硫细菌(purple sulfur bacterium)(包括，例如着色菌(Allochromatium)、着色菌(Chromatium)、盐着色菌(Halochromatium)、等着色菌(Isochromatium)、海洋着色菌(Marichromatium)、小红卵菌(Rhodovulum)、热着色菌(Thermochromatium)、荚硫菌(Thiocapsa)、硫红球菌属(Thiorhodococcus)、和囊硫菌(Thiocystis))、紫色非硫细菌(purple non sulfur bacterium)(包括，例如棕色螺菌(Phaeospirillum)、红杆菌(Rhodobac)、红细菌(Rhodobacter)、红微菌(Rhodomicrobium)、红球形菌(Rhodopila)、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)、海玫瑰菌(Rhodothalassium)、玫瑰弧菌(Rhodovibrio)、蔷薇螺菌(Roseospira))、极端微生物、酵母、真菌、其经过工程化的有机体、或合成的有机体。
在一些实施方案中，宿主细胞是光依赖性的或通过已知途径中的一种来固定碳，所述已知途径包括，例如，开尔文碳循环途径、乙酰CoA途径和还原性TCA途径。参见，例如，Fuchs,G,Alternative pathways of autotrophic CO2fixation(自养CO2固定的替代途径),p.365-382(1989)、AUTOTROPHIC BACTERIA,Springer-Verlag,Berlin,Germany(H.G.Schlegel&B.Bowien ed.)。在一些实施方案中，宿主细胞具有自养活性。在一些实施方案中，宿主细胞具有光能自养活性，例如在光的存在下。在一些实施方案中，在缺乏光时，宿主细胞是非自养的或兼养的。在一些实施方案中，宿主细胞是来自极端微生物的细胞，极端微生物已知耐受多种极端环境参数，例如温度、辐射、压力、重力、真空、干燥、盐度、pH值、氧张力和化学品。来自多种已知极端微生物的宿主细胞可以是适合的。例如，宿主细胞可以是来自于超嗜热微生物，例如生长在80℃或以上的烟孔火叶菌(Pyrolobus fumarii)。在另一实例中，宿主细胞可以是来自于嗜热微生物，例如生长在60-80℃的聚球蓝细菌(Synechococcus lividis)。在另一实例中，宿主细胞可以来自于生长在15℃-60℃的嗜温微生物。在又一实例中，宿主细胞可以是来自于在15℃或更低生长的嗜冷生物，例如嗜冷杆菌或某些昆虫。此外，宿主细胞可以来自于耐辐射有机体，例如耐辐射奇球菌(Deinococcusradiodurans)。在一些实施方案中，宿主细胞可以来自于耐压有机体，例如耐受130MPa的压力的嗜压微生物(piezophile)。可选地，宿主细胞可以来自于耐重压有机体，例如嗜压微生物(barophile)。在一些其他实施方案中，宿主细胞可以是耐超重力(例如，＞1g)或低重力(例如，＜1g)有机体。在其他实施方案中，宿主细胞可以来自于耐真空有机体，例如缓步类动物、昆虫、微生物和种子。在其他实施方案中，宿主细胞可以来自于干燥耐受的和脱水生活的有机体，例如耐旱生物丰年虾(Artemia salina)、线虫、某些微生物、某些真菌和地衣。在某些其他实施方案中，宿主细胞来自于耐盐有机体，例如嗜盐生物(例如，2-5M NaCl)盐杆菌和杜氏盐藻(Dunaliella salina)。宿主细胞还可以来自于耐pH有机体，例如嗜碱微生物盐碱杆菌、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)OF4、螺旋藻(Spirulina spp.)(例如，pH值＞9)或嗜酸微生物，例如类蓝藻(Cyanidium caldarium)、铁原体(Ferroplasma sp.)(例如，低pH值)。可选地，宿主细胞可以来自于诸如詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的不能耐受O2的厌氧生物，或诸如梭菌(Clostridium)的耐受一些O2的微氧生物，或需要O2的需氧生物。此外，宿主细胞可以来自于耐受纯CO2的耐毒气有机体，包括，例如类蓝藻(Cyanidium caldarium)。宿主细胞可以来自于耐金属有机体，包括例如，耐金属菌例如嗜中高温嗜酸古菌(Ferroplasma acidarmanus)(例如，Cu、As、Cd、Zn)、劳尔氏菌(Ralstonia)CH34(例如，Zn、Co、Cd、Hg、Pb)。参见，例如Gross,Michael.Life on the Edge:Amazing Creatures Thriving in Extreme Environments(边缘生物：极端环境中惊人的生物繁荣).New York:Plenum(1998)；Seckbach,J."Search for Life in the Universewith Terrestrial Microbes Which Thrive Under Extreme Conditions(利用在极端条件下繁荣的陆生微生物搜寻宇宙中的生命)."In Cristiano Batalli Cosmovici,StuartBowyer,and Dan Wertheimer,eds.,Astronomical and Biochemical Origins and theSearch or Life in the Universe(天文和生物化学起源以及宇宙中生命的搜寻),p.511.Milan:Editrice Compositori(1997)。
在某些实施方案中，宿主细胞可以来自于植物，包括但不限于以下属的植物：鼠耳芥属(Arabidopsis)、菾属(Beta)、大豆属(Glycine)、麻风树属(Jatropha)、芒属(Miscanthus)、稷属(Panicum)、虉草属(Phalaris)、杨属(Populus)、甘蔗属(Saccharum)、柳属(Salix)、油蜡树属(Simmondsia)、和玉蜀黍属(Zea)。例如，宿主细胞可以来自于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、柳枝稷(Panicum virgatum)、奇岗(Miscanthus giganteus)、或玉蜀黍(Zea mays)。在其他实施方案中，宿主细胞可以来自于藻类和蓝细菌，包括但不限于以下属：刺菊石(Acanthoceras)、刺粉蚧(Acanthococcus)、蓝藻菌(Acaryochloris)、曲壳藻(Achnanthes)、细曲壳藻(Achnanthidium)、星状藻(Actinastrum)、Actinochloris、辐环藻(Actinocyclus)、辐射鼓藻(Actinotaenium)、双金藻(Amphichrysis)、前沟藻(Amphidinium)、尖粒藻(Amphikrikos)、双肋藻(Amphipleura)、茧形藻(Amphiprora)、分须藻(Amphithrix)、双眉藻(Amphora)、鱼腥藻(Anabaena)、项圈藻(Anabaenopsis)、暗额藻(Aneumastus)、纤维藻(Ankistrodesmus)、锚藻(Ankyra)、异菱藻(Anomoeoneis)、虚幻球藻(Apatococcus)、束丝藻(Aphanizomenon)、隐球藻(Aphanocapsa)、隐毛藻(Aphanochaete)、隐杆藻(Aphanothece)、梨囊藻(Apiocystis)、顶丝藻(Apistonema)、四棘鼓藻(Arthrodesmus)、节旋藻(Artherospira)、Ascochloris、星杆藻(Asterionella)、绿星球藻(Asterococcus)、奥杜藻(Audouinella)、直链藻(Aulacoseira)、棍形藻(Bacillaria)、巴尔比亚藻(Balbiania)、似竹鼓藻(Bambusina)、红毛菜(Bangia)、Basichlamys、串珠藻(Batrachospermum)、骈胞藻(Binuclearia)、双棘藻(Bitrichia)、盘苔(Blidingia)、Botrdiopsis、气球藻(Botrydium)、葡萄藻(Botryococcus)、球葡萄藻(Botryosphaerella)、咸胞藻(Brachiomonas)、短纹藻(Brachysira)、海雹菜(Brachytrichia)、Brebissonia、毛鞘藻(Bulbochaete)、柱杆藻(Bumilleria)、拟杆藻(Bumilleriopsis)、美壁藻(Caloneis)、眉藻(Calothrix)、马鞍藻(Campy lodiscus)、盒管藻(Capsosiphon)、四鞭藻(Carteria)、Catena、Cavinula、顶剌藻(Centritractus)、Centronella、角藻(Ceratium)、角毛藻(Chaetoceros)、Chaetochloris、毛藻(Chaetomorpha)、卡盾藻(Chaetonella)、毛丝藻(Chaetonema)、盾毛藻(Chaetopeltis)、胶毛藻(Chaetophora)、毛球藻(Chaetosphaeridium)、管孢藻(Chamaesiphon)、轮藻(Chara)、Characiochloris、拟小椿藻(Characiopsis)、小椿藻(Characium)、轮藻目(Charales)、缘胞藻(Chilomonas)、拟衣藻(Chlainomonas)、Chlamydoblepharis、Chlamydocapsa、衣藻(Chlamydomonas)、Chlamydomonopsis、衣粘藻(Chlamydomyxa)、Chlamydonephris、Chlorangiella、拟绿囊藻(Chlorangiopsis)、拟绿囊藻(Chlorella)、绿囊藻属(Chlorobotrys)、绿幅藻(Chlorobrachis)、绿点藻(Chlorochytrium)、绿球藻(Chlorococcum)、绿胶藻(Chlorogloea)、拟绿胶蓝细菌(Chlorogloeopsis)、绿梭藻(Chlorogonium)、绿带藻(Chlorolobion)、拟衣藻(Chloromonas)、Chlorophysema、绿藻门(Chlorophyta)、绿胶囊藻(Chlorosaccus)、叠球藻(Chlorosarcina)、Choricystis、色植藻(Chromophyton)、单鞭金藻(Chromulina)、拟色球蓝细菌(Chroococcidiopsis)、色球蓝细菌(Chroococcus)、色指藻(Chroodactylon)、蓝隐藻(Chroomonas)、色盒藻(Chroothece)、金变形藻(Chrysamoeba)、金网藻(Chrysapsis)、金星藻属(Chrysidiastrum)、金囊藻(Chrysocapsa)、Chrysocapsella、Chrysochaete、金色藻(Chrysochromulina)、金颗藻(Chrysococcus)、Chrysocrinus、Chrysolepidomonas、Chrysolykos、Chrysonebula、金藻门(Chrysophyta)、金钟藻(Chrysopyxis)、Chrysosaccus、Chrysophaerella、金环藻(Chrysostephanosphaera)、刚毛藻(Clodophora)、链孢藻(Clastidium)、拟新月藻(Closteriopsis)、新月藻(Closterium)、胶球藻(Coccomyxa)、卵形藻(Cocconeis)、Coelastrella、空星藻(Coelastrum)、腔球藻(Coelosphaerium)、Coenochloris、无胶集球藻(Coenococcus)、集囊藻(Coenocystis)、胶柄藻(Colacium)、鞘毛藻(Coleochaete)、Collodictyon、Compsogonopsis、弯枝藻(Compsopogon)、Conjugatophyta、Conochaete、Coronastrum、鼓藻(Cosmarium)、Cosmioneis、胶球鼓藻(Cosmocladium)、Crateriportula、杯状藻(Craticula)、发毛针藻(Crinalium)、十字藻(Crucigenia)、Crucigeniella、Cryptoaulax、隐藻(Cryptomonas)、隐藻门(Cryptophyta)、栉水母(Ctenophora)、蓝网藻(Cyanodictyon)、Cyanonephron、蓝载藻(Cyanophora)、蓝藻门(Cyanophyta)、蓝杆藻(Cyanothece)、Cyanothomonas、环胞藻(Cyclonexis)、环冠藻(Cyclostephanos)、小环藻(Cyclotella)、筒藻(Cylindrocapsa)、柱胞鼓藻(Cylindrocystis)、筒孢藻(Cylindrospermum)、筒柱藻(Cylindrotheca)、波缘藻(Cymatopleura)、桥弯藻(Cymbella)、Cymbellonitzschia、胞甲藻(Cystodinium)、拟指球藻(Dactylococcopsis)、单板藻(Debarya)、细齿藻(Denticula)、Dermatochrysis、皮果藻(Dermocarpa)、小皮果蓝细菌(Dermocarpella)、缢带藻(Desmatractum)、角丝鼓藻(Desmidium)、鼓球藻(Desmococcus)、带线藻(Desmonema)、Desmosiphon、长刺藻(Diacanthos)、丝瓣芹(Diacronema)、等半藻(Diadesmis)、等片藻(Diatoma)、等隔藻(Diatomella)、双细胞藻(Dicellula)、双须藻(Dichothrix)、叉球藻(Dichotomococcus)、Dicranochaete、网绿藻(Dictyochloris)、球网藻(Dictyococcus)、胶网藻(Dictyosphaerium)、泡双吸虫(Didymocystis)、空星藻(Didymogenes)、双楔藻(Didymosphenia)、丝藻(Dilabifilum)、双形藻(Dimorphococcus)、锥囊藻(Dinobryon)、球甲藻(Dinococcus)、双绿藻(Diplochloris)、双壁藻(Diploneis)、双十藻(Diplostauron)、Distrionella、基纹鼓藻(Docidium)、竹枝藻(Draparnaldia)、杜氏盐藻(Dunaliella)、孔壳藻(Dysmorphococcus)、科氏藻(Ecballocystis)、纺锤藻(Elakatothrix)、Ellerbeckia、内丝藻(Encyonema)、浒苔(Enteromorpha)、内枝藻(Entocladia)、茧形藻(Entomoneis)、石囊藻(Entophysalis)、附金藻(Epichrysis)、附钟藻(Epipyxis)、窗纹藻(Epithemia)、独球藻(Eremosphaera)、凹顶藻(Euastropsis)、凹顶鼓藻(Euastrum)、立方藻(Eucapsis)、真卵形藻(Eucocconeis)、空球藻(Eudorina)、裸藻(Euglena)、裸藻门(Euglenophyta)、短缝藻(Eunotia)、Eustigmatophyta、双鞭藻(Eutreptia)、曲解藻(Fallacia)、飞氏藻(Fischerella)、脆杆藻(Fragilaria)、Fragilariforma、披刺藻(Franceia)、肋缝藻(Frustulia)、Curcilla、双胞藻(Geminella)、短水绵(Genicularia)、灰胞藻(Glaucocystis)、灰色藻门(Glaucophyta)、Glenodiniopsis、薄甲藻(Glenodinium)、库氏粘球藻(Gloeocapsa)、Gloeochaete、Gloeochrysis、圆球藻(Gloeococcus)、胶囊藻(Gloeocystis)、Gloeodendron、胶胞藻(Gloeomonas)、Gloeoplax、粘杆藻(Gloeothece)、胶丝藻(Gloeotila)、胶刺藻(Gloeotrichia)、Gloiodictyon、多芒藻(Golenkinia)、拟多芒藻(Golenkiniopsis)、孢根藻(Gomontia)、楔桥弯藻(Gomphocymbella)、异极藻(Gomphonema)、束球藻(Gomphosphaeria)、白氏膝接藻(Gonatozygon)、Gongrosia、链瘤藻(Gongrosira)、角绿藻(Goniochloris)、孢原细胞(Gonium)、膝口藻(Gonyostomum)、Granulochloris、拟粒囊藻(Granulocystopsis)、Groenbladia、裸甲藻(Gymnodinium)、缢丝鼓藻(Gymnozyga)、布纹藻(Gyrosigma)、鞭毛藻(Haematococcus)、海洋聚磷菌(Hafniomonas)、Hallassia、双尖藻(Hammatoidea)、Hannaea、菱板藻(Hantzschia)、软管藻(Hapalosiphon)、Haplotaenium、定鞭藻门(Haptophyta)、海斯藻(Haslea)、半沟藻(Hemidinium)、Hemitonia、茸壳藻(Heribaudiella)、异毛藻(Heteromastix)、异线藻(Heterothrix)、Hibberdia、胭脂藻(Hildenbrandia)、隐鞭藻(Hillea)、单肢溞(Holopedium)、须藻(Homoeothrix)、Hormanthonema、皮襟藻(Hormotila)、Hyalobrachion、Hyalocardium、Hyalodiscus、明盘藻(Hyalogonium)、圆丝鼓藻(Hyalotheca)、Hydrianum、Hydrococcus、水鞘藻(Hydrocoleum)、水条藻(Hydrocoryne)、水网藻(Hydrodictyon)、水链藻(Hydrosera)、水树藻(Hydrurus)、蓝枝藻(Hyella)、膜胞藻(Hymenomonas)、细绿藻(Isthmochloron)、拟丝藻(Johannesbaptistia)、肾粒藻(Juranyiella)、Karayevia、Kathablepharis、下沟藻(Katodinium)、金杯藻(Kephyrion)、角球藻(Keratococcus)、蹄形藻(Kirchneriella)、克里藻(Klebsormidium)、Kolbesia、Koliella、Komarekia、Korshikoviella、Kraskella、拉氏藻(Lagerheimia)、金瓶藻(Lagynion)、丽枝藻(Lamprothamnium)、鱼子菜(Lemanea)、鳞孔藻(Lepocinclis)、细链藻(Leptosira)、Lobococcus、Lobocystis、叶衣藻属(Lobomonas)、泥生藻(Luticola)、鞘丝藻(Lyngbya)、Malleochloris、鱼鳞藻(Mallomonas)、微单胞藻(Mantoniella)、射星藻(Marssoniella)、Martyana、鞭鞘藻(Mastigocoleus)、胸隔藻(Gastogloia)、直链藻(Melosira)、裂面藻(Merismopedia)、Mesostigma、中带鼓藻(Mesotaenium)、微芒藻(Micractinium)、微星鼓藻(Micrasterias)、微毛藻(Microchaete)、微鞘藻(Microcoleus)、小球藻(Microcystis)、微鞘藻(Microglena)、微胞藻(Micromonas)、微孢藻(Microspora)、小丛藻(Microthamnion)、柄球藻(Mischococcus)、单鞭金藻(Monochrysis)、蒜头藻(Monodus)、Monomastix、单针藻(Monoraphidium)、礁膜(Monostroma)、转板藻(Mougeotia)、拟转板藻(Mougeoti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宿主细胞可以来源于其中的示例性的微生物包括但不限于：拟南芥(Arabidopsisthaliana)、葡萄藻(Botryococcus braunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、杜氏盐藻(Dunaliela salina)、聚球蓝细菌PCC 7002(Synechococcus Sp.PCC 7002)、聚球蓝细菌PCC 7942(Synechococcus Sp.PCC 7942)、集胞藻PCC 6803(Synechocystis Sp.PCC6803)、长嗜热聚球蓝细菌BP-1(Thermosynechococcus elongatus BP-1)、绿硫菌(Chlorobium tepidum)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus auranticus)、酒色着色菌(Chromatium vinosum)、微温着色菌(Chromatium tepidum)、深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalusris)、将达梭菌(Clostridium ljungdahlii)、热纤梭菌(Clostridiuthermocellum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、奇岗(Miscanthus giganteus)、玉蜀黍(Zea mays)或运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。
宿主细胞可以来源于其中的其他适合的有机体可以来自包括合成细胞或由美国专利公开2007/0264688或2007/0269862所述的合成的基因组产生的细胞。
在其他实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cv1细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或PC12细胞。
在其他实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。在某些实施方案中，所述大肠杆菌细胞是菌株B、菌株C、菌株K或菌株W大肠杆菌细胞。
在其他实施方案中，所述宿主细胞是蓝细菌宿主细胞。
在一些实施方案中，本文所述的经过基因工程处理的宿主细胞以约50mg/L或更高、约100mg/L或更高、约150mg/L或更高、约200mg/L或更高、约500mg/L或更高、约1000mg/L或更高的滴度产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。
在某些实施方案中，宿主细胞超表达编码酯合酶或本文所述的变体的核酸序列。在某些实施方案中，可以应用已知的遗传改变技术以改变一种或多种内源酯合酶的特征使得它们被超表达。在一些实施方案中，该方法还包括转化宿主细胞以超表达编码本文所述的外源酯合酶的核酸序列。
在某些实施方案中，宿主细胞的内源硫酯酶如果存在的话则未被修饰。在其他实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的硫酯酶、诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶或以上二者。在示例性的实施方案中，硫酯酶、酰基CoA合酶或以上二者被在功能上缺失。
在某些实施方案中，所述宿主细胞超量产生本文所述的底物。例如，宿主细胞可以经过工程处理以超量产生醇底物或硫酯底物。在其他实施方案中，宿主细胞经过工程处理以产生或超量产生游离脂肪酸，利用本文所述的方法可以将游离脂肪酸转化为脂肪酯。在一些实施方案中，该方法还包括修饰一种或多种内源酯合酶使得宿主细胞超表达那些酯合酶。在可选的实施方案中，该方法包括用编码酯合酶的核酸序列转化宿主细胞，并且该宿主细胞产生本文所述的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。
在其他实施方案中，该方法包括在至少一种本文所述的底物的存在下培养宿主细胞，所述底物被同一宿主细胞表达或超表达。在一些实施方案中，所述底物是脂肪硫酯，例如脂肪酰ACP或脂肪酰CoA。在其他实施方案中，底物是本文所述的醇或游离脂肪酸。
在一些实施方案中，底物是醇。在一些实施方案中，醇底物是引入到宿主细胞的外源醇。在其他实施方案中，醇底物由经过基因工程处理的宿主细胞产生。例如，诸如脂肪醇底物的醇底物可以由宿主细胞合适地产生，所述宿主细胞共表达或超表达一种或多种脂肪醛生物合成基因和/或一种或多种脂肪醇生物合成基因。在可选的实施方案中，诸如脂肪醇底物的醇底物由宿主细胞产生，所述宿主细胞共表达或超表达一种或多种酰基ACP还原酶基因和/或一种或多种脂肪醇生物合成基因。在重组宿主细胞或微生物中产生脂肪酸的方法已经描述于，例如国际专利公开号WO/2010/042664，通过引用将其公开并入本文。
在又一实施方案中，所述底物是游离脂肪酸。在某些实施方案中，游离脂肪酸是不期望的副产物，可利用本文所述的方法由宿主细胞将其转化为期望的脂肪酯。
在另一方面，本发明特征为产生脂肪酸或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法。该方法包括将底物与以下物质接触：(i)包含SEQ ID NO：18、24、25或26的氨基酸序列或其变体的酯合酶；或(ii)由与SEQ ID NO：27、28、29或30的多核苷酸序列或其变体具有至少约50％同一性的多核苷酸序列编码的酯合酶多肽。在一些实施方案中，该方法还包括分离和/或纯化脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。
在一些实施方案中，酯合酶多肽包括具有一个或多个氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQ ID NO：16、24、25或26的氨基酸序列，其中所述多肽具有酯合酶和/或酰基转移酶活性。在某些实施方案，所述酯合酶多肽被修饰，其中所述多肽具有增加的酯合酶和/或酰基转移酶活性。
在一些实施方案中，酯合酶多肽包括具有一个或多个非保守氨基酸取代的SEQ IDNO：16、24、25或26的氨基酸序列，其中所述多肽具有酯合酶和/或酰基转移酶活性。在一些实施方案中，该多肽包含一个或多个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述多肽具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸取代、添加、插入或缺失。在其他实施方案中，所述多肽具有改善的酯合酶和/或酰基转移酶活性。例如，该多肽具有或具有增加的以下能力：利用醇作为底物催化硫酯或游离脂肪酸转化为脂肪酯。
在一些实施方案中，所述多肽具有与SEQ ID NO:18、24、25或26的氨基酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽具有SEQ ID NO:18、24、25或26的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:27、28、29或30的多核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列是SEQ ID NO:27、28、29或30。
在另一方面，本发明特征为由本文所述方法产生的游离脂肪酸。在一些实施方案中，游离脂肪酸包含一个或多个分支点、一个或多个非饱和位点和/或一个或多个环状部分。
在另一方面，本发明特征为由本文所述方法产生的脂肪酸衍生物。在示例性的实施方案中，脂肪酸衍生物选自脂肪酸甲酯衍生物、脂肪酸乙酯衍生物、其他脂肪酸衍生物和以上的组合。在一些实施方案中，脂肪酸衍生物的碳链包含一个或多个分支点、一个或多个非饱和位点和/或一个或多个环状部分。
在另一方面，本发明特征为由本文所述方法产生的脂肪酯。在一些实施方案中，脂肪酯含有A侧(即连接于羧基氧的碳链)和B侧(即包含母体羧基的碳链)。在一些实施方案中，脂肪酯的B侧包含直链。在其他实施方案中，脂肪酯的B侧包含支链。支链可以具有一个或多个分支点。在其他实施方案中，脂肪酯的B侧包含至少一个环状部分。
在其他实施方案中，脂肪酯是脂肪酸乙酯或脂肪酸甲酯。在一些实施方案中，脂肪酯长度至少为约4、6、8、10、12、14、18或20个碳。包含A侧或B侧的碳链可以是任何合适长度。在一个实施方案中，酯的A侧的长度为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16或18个碳。酯的B侧的长度为至少约4、6、8、10、12、14、16、18或20个碳。在一些实施方案，脂肪酯是饱和的。在其他实施方案，脂肪酯是不饱和的。在其他实施方案，脂肪酯是单不饱和的。如果是不饱和的，A侧和/或B侧可以具有一个或多个不饱和点。
在一些实施方案中，B侧可以在碳链的一个或多个位点具有一个双键。在具体实施方案中，B侧可以在碳链上从碳链的还原末端数第7位具有一个双键。本领域技术人员会认识到，在脂肪甲酯中，B侧的一个末端会具有甲基基团，而B侧的另一个末端会具有羧基(C(＝O)O-)。B侧的甲基末端是包含B侧的碳链的还原末端。因此双键是在从B基团的甲基末端数第7位碳(例如，在B基团的第7位和第8位碳之间)。双键可以具有任何立体结构，因此B基团中的双键可以是顺式或反式的。因此，在一些实施方案中，脂肪酯在碳链的从脂肪酯的还原末端数第7位处(C7和C8之间)包含双键。
在一些实施方案中，脂肪酯包含一个或多个分支点。在其他实施方案中，脂肪酯是线性的并且不包含任何分支链。
在另一方面，本发明特征为经过基因工程处理的微生物，其包含稳定并入所述微生物基因组DNA中位于包含核苷酸序列的多核苷酸上游的外源控制序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：27、28、29或30的核苷酸序列具有至少约50％的同一性，其中所述微生物相对于野生型微生物产生提高水平的脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，所述多核苷酸对于所述微生物来说是内源的。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:27、28、29或30的多核苷酸序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列是SEQ ID NO:27、28、29或30。
在其他实施方案中，微生物被基因工程处理以表达修饰水平的编码酯合酶的基因。在某些实施方案中，微生物表达编码酯合酶的异源基因或表达提高水平的内源酯合酶。在某些实施方案中，微生物的内源硫酯酶如果存在的话则未被修饰。在其他实施方案中，微生物表达减弱水平的编码硫酯酶的内源基因。或者，内源硫酯酶被在功能上缺失。在具体实施方案中，硫酯酶由tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatAl编码。
在一些实施方案中，微生物被基因工程处理以相对于野生型微生物表达减弱水平的脂肪酸降解酶。示例性的脂肪酸降解酶包括，但不限于EC 2.3.1.86或EC 6.2.1.3的酰基CoA合酶。在具体实施方案中，微生物表达减弱水平的由fadD、fadK、BH3103、yhfL、pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、rpc_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因编码的酰基CoA合酶。在某些实施方案中，诸如酰基CoA合酶基因的上述脂肪酸降解酶被在功能上缺失使得微生物不包含酰基CoA合酶活性或功能。
在某些其他实施方案中，微生物被基因工程处理以表达减弱水平的硫酯酶、诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶或以上二者。在其他实施方案中，内源硫酯酶、脂肪酸降解酶或以上二者被在功能上缺失。在具体实施方案中，微生物不具有可检测的硫酯酶或酰基CoA合酶活性。在一些实施方案中，微生物可以产生脂肪酸和/或其衍生物。
在其他实施方案中，微生物被基因工程处理以相对于野生型微生物表达降低水平的至少一种以下基因：编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因、编码外膜蛋白受体的基因、和编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因中的一个或多个被在功能上缺失。在一些实施方案中，编码酰基CoA脱氢酶的基因是fadE。在一些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是编码铁色素、大肠菌素M、噬菌体T1、噬菌体T5或噬菌体受体的一个基因。在某些实施方案中，编码外膜蛋白受体的基因是fhuA(又被称为tonA)。在其他方案中，编码脂肪酸生物合成的转录调控子的基因是fabR。
在一些实施方案中，所述微生物是细菌。在某些实施方案中，所述细菌是革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
在一些实施方案中，所述微生物是选自耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的分枝杆菌。在其他实施方案中，细菌是诺卡氏菌属NRRL 5646、皮疽诺卡氏菌、灰色链霉菌、砂嗜盐产孢菌或番茄溃疡病菌。
在其他实施方案中，微生物选自：不动杆菌、食烷菌、产碱杆菌、鼠耳芥、海床杆菌、海杆菌、小家鼠、假单胞菌或油蜡树(Simmodsia)。
在具体实施方案中，微生物选自：藻类、蓝细菌、绿色硫细菌(包括，例如绿菌、绿硫菌、突柄绿菌)、绿色非硫细菌(包括，例如绿屈挠菌、绿线菌、颤绿菌、太阳发菌、滑柱菌、玫瑰弯菌、和嗜热菌)、紫色硫细菌(包括，例如着色菌(Allochromatium)、着色菌、盐着色菌、等着色菌(Isochromatium)、、海洋着色菌(Marichromatium)、小红卵菌、热着色菌、荚硫菌、硫红球菌属、和囊硫菌)、紫色非硫细菌(包括，例如棕色螺菌、红杆菌(Rhodobac)、红细菌、红微菌、红球形菌、红假单胞菌、海玫瑰菌、玫瑰弧菌、蔷薇螺菌)或极端微生物。
在某些其他实施方案中，微生物选自：拟南芥、葡萄藻、莱茵衣藻、杜氏盐藻、聚球蓝细菌PCC 7002)、聚球蓝细菌PCC 7942)、集胞藻PCC 6803、长嗜热聚球蓝细菌BP-1、绿硫菌、橙色绿屈挠菌、酒色着色菌、微温着色菌、深红红螺菌、荚膜红细菌、沼泽红假单胞菌、将达梭菌、热纤梭菌、柳枝稷、产黄青霉菌、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、粟酒裂殖酵母、荧光假单胞菌、奇岗、玉蜀黍或运动发酵单胞菌。
在一些实施方案中，微生物是产油酵母，例如耶氏酵母、假丝酵母、红酵母、红冬孢酵母、隐球酵母、丝孢酵母或油脂酵母。在某些实施方案中，微生物是圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloide)、斯达油脂酵母、产油油脂酵母(L.Lipoferus)、Candidarevkaufi、铁红假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、Trichosporon pullas、皮状丝孢酵母、粘红酵母(Rhodotorula glutinous)、牧草红酵母(R.Garminis)、和解脂耶氏酵母(正式分类为解脂假丝酵母)。在具体实施方案中，宿主细胞是来自解脂耶氏酵母菌株ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944、ATCC#76982和/或LGAM S(7)1的细胞(Papanikolaou S.,and Aggelis G.,Bioresour.Technol.,82(1):43-9,2002)。
在另一方面，本发明特征为由本文所述的任何方法或任何微生物所产生的脂肪酸或脂肪酸衍生物，或包含本文所述的任何方法或任何微生物所产生的脂肪酸或脂肪酸衍生物的组合物。
在一些实施方案，脂肪酸或脂肪酸衍生物具有约-15.4或更高的δ13C。在某些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物的δ13C为约-15.4至约-10.9，或约-13.92至约-13.84。
在一些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物的fM 14C为至少约1.003。在某些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物的fM 14C为至少约1.01或至少约1.5。在一些实施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物的fM 14C为约1.111至约1.124。
在另一方面，本发明特征为包含由本文所述的任何方法或任何微生物所产生的脂肪酸或脂肪酸衍生物的生物燃料组合物。
在本文所述的任何方面，脂肪酸或脂肪酸衍生物是由本文所述的宿主细胞或微生物从碳源产生的，所述碳源包括，例如醇、游离脂肪酸或硫酯。
在本文所述的任何方面，碳源底物可以是例如醇底物、硫酯底物和游离脂肪酸。适合的醇底物包括短链醇，例如甲醇、乙醇、丙醇(异丙醇)、丁醇、戊醇、己醇、庚醇等，以及诸如脂肪醇的多种长链醇，例如辛醇、十四醇或十六醇、十六烯醇、十八烯醇等。此外，本发明涉及利用经过基因工程处理的产物宿主将甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇和/或其他醇底物转化为诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物。在某些实施方案中，由适当地经过工程处理的产物宿主转化乙醇。优选地，产生一种或多种脂肪酸乙酯和/或游离脂肪酸。在某些其他实施方案中，由适当地经过工程处理的产物宿主转化甲醇。优选地，产生一种或多种脂肪酸甲酯和/或游离脂肪酸。在其他实施方案中，由适当地经过工程处理的产物宿主转化丁醇。在其他实施方案中，通过在允许游离脂肪酸和/或脂肪酸衍生物产生的条件下培养一种或多种根据本发明的方法经过工程处理的产物宿主，来将乙醇、甲醇和/或其他适合的醇底物的混合物转化为脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的混合物。例如，产生一种或多种游离脂肪酸、一种或多种脂肪酸乙酯和/或一种或多种脂肪酸甲酯。
在本文所述的任何方面，适合的碳源底物可以是游离脂肪酸和硫酯。例如，游离脂肪酸可以包含分支碳链。或者，游离脂肪酸可以包含直链碳链。在一些实施方案中，游离脂肪酸可以包含环状基团或一个或多个不饱和位点。在一些实施方案中，硫酯底物是脂肪酰CoA或脂肪酰ACP。在又一方面，本发明特征为从常规脂肪酯生产工艺的废物流中的游离脂肪酸产生脂肪酯的方法。
在本文所述的任何方面，酯合酶多肽长度为约200个氨基酸-约2000个氨基酸，例如长度为约250-约1500个氨基酸残基，长度为约300-约1200个氨基酸残基，长度为约350-约1000个氨基酸残基，长度为约400-约800个氨基酸残基或长度为约450-约600个氨基酸残基。在某些实施方案中，酯合酶多肽长度为约300个氨基酸残基或更长，例如长度为约400个氨基酸残基或更长，或长度为约450个氨基酸残基或更长。在某些相关实施方案中，酯合酶多肽长度为约1000个氨基酸残基或更短，例如长度为约800个氨基酸残基或更短，例如长度为约700个氨基酸残基或更短，或长度为约600个氨基酸残基或更短。示例性的本发明的酯合酶长度为约500个氨基酸残基。
下文提供的附图和实施例意图单独地举例说明本发明的特征。它们不意图限制。
附图简述
图1A是阐述领域内已知的典型生物合成途径的示意图(参见，例如，WO2007/136762，通过引用将其公开并入本文)，其根据所提供的底物产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。图1B是例示本发明的替代方式并更有效的途径的示意图。
图2描述了大肠杆菌spc核糖体蛋白操纵子的启动子Pspc的序列(SEQ ID No：13)。
图3描述了细菌表达质粒pDS33.ES9(SEQ ID NO：22)，其中来自除烃还杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)DSM8798(GenBank登录号ABO21021)的酯合酶基因的表达处于大肠杆菌spc核糖体蛋白操纵子的启动子Pspc(SEQ ID No：13)的控制之下。
图4描述了细菌表达质粒pDS57(SEQ ID NO:23)，其中酯合酶基因的表达处于Trc启动子的控制之下。
图5描述了在微孔板存在和不存在乙醇下，不共表达酰基CoA合酶或硫酯酶的实施例6的各培养物产生的游离脂肪酸(FFA)和脂肪酸乙酯(FAEE)。ES9在乙醇的存在下产生近200mg/L FAEE，但是仅产生少量的(＜20％)FFA。包括ES8、atfA1和atfA2的其他酯合酶在乙醇的存在下产生显著较少量的FAEE，伴随着较高比例的FFA。培养物大肠杆菌'tesA在乙醇的存在下产生较高的总FFA和FAEE滴度，但是FFA的量显著高于产生的FAEE的量。
图6描述了在震荡瓶中存在乙醇下，不共表达酰基CoA合酶或硫酯酶的实施例7中FFA和/或FAEE的产生。在指定的条件下，酯合酶ES9、ES8、atfA1和atfA2均可以体内产生FAEE。ES9在乙醇的存在下产生高水平的FAEE，但几乎不产生FFA。相对于ES9，atfA1、AtfA2和ES8产生显著较小量的FAEE。与实施例6和图5的结果相一致，大肠杆菌‘tesA的表达单独产生高的总FFA和FAEE滴度，但是具有显著较高的FFA比例。
图7描述了在震荡瓶中存在甲醇下，不共表达酰基CoA合酶或硫酯酶的实施例8中FFA和/或FAME的产生。产生的FFA的量低于检测限。相对于在乙醇存在下获得的总滴度，在表达atfA1、atfA2、ES8和ES9的培养物中观察到较低水平的总滴度。然而，ES9产生大量FAME。
图8描述了在不共表达酰基CoA合酶或酯合酶的情况下，随诱导后时间，表达ES9的大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD产生脂肪酯的过程。
图9描述了实施例11所述的ES9 395位突变文库的菌株产生脂肪酸/脂肪酯的z值。
图10A描述了由表达ES9和ES9突变体G395R、G395K、G395S、G395D和G395E的大肠杆菌DV2ΔfadD体内产生游离脂肪酸和/或脂肪酯。图10B描述了发酵期间从菌株获得的OD600。
图11描述了实施例12-13的ES1、ES2、ES3和ES4(ES9的同系物)产生脂肪酸甲酯的滴度，它们将酰基ACP和甲醇转化为甲酯。
图12描述了实施例12-13的ES1、ES2、ES3和ES4(ES9的同系物)、产生脂肪酸乙酯的滴度，它们将酰基ACP和乙醇转化为乙酯。
图13是监视从供给棕榈酸钠和短链醇的F.jadensis T9菌株产生酯的GC/MS图谱。上排是不供给醇的对照。中排描述了由乙醇供给所得的产物。下排描述了由异丙醇供给所得的产物。
图14比较了涉及实施例18所述的具有或不具有减弱的/缺失的fadE的重组宿主菌株的脂肪酯生产工艺的细胞生长曲线。在该实施例中，酰基ACP和乙醇被用作底物。
图15比较了利用实施例18所述的具有或不具有减弱的/缺失的fadE的重组宿主菌株的总脂肪酯产量。在该实施例中，酰基ACP和乙醇被用作底物。
图16描述了多种酯合酶和同系物氨基酸和多核苷酸序列。该表还包括编码四种同系物ES1、ES2、ES3和ES4的多种密码子优化的多核苷酸序列。
图17描述了可连同本发明使用的酶的其他序列。
图18描述了pFBAIN-MOD-1载体的特征，其用于完成实施例20所述的方法。
发明详述
除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域技术人员通常理解的具有相同的意义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，仍然在下文描述了适合的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考资料，包括GenBank数据库序列，通过引用全文并入。如有冲突，以包括定义在内的本说明书为准。此外，材料、方法和实施例仅是举例说明并不意图限制。
根据下文的详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优势会清晰。
定义
本文所用冠词“一个(a)”和“一个(an)”是指该冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。作为实例，“事物(an element)”表示一个事物或多于一个事物。
如本文所用，术语“醛生物合成基因”或“醛生物合成多核苷酸”是编码醛生物合成多肽的核酸。
如本文所用，术语”醛生物合成多肽”是作为醛生物合成途径中一部分的多肽。该多肽可以在生物底物上起作用以生成醛。在一些实例中，醛生物合成多肽具有还原酶活性。
如本文所用的术语“减弱(attenuate)”表示削弱、降低或缩小。例如，可以通过修饰多肽来减弱多肽以降低其活性(例如，通过修饰编码所述多肽的核苷酸序列)。
如本文所用，术语“生物原油(Biocrude)”是指从生物质、生物质衍生物或其他生物资源来源的产品，其与原油类似，可以转化为其他燃料。例如，生物原油可以转化为汽油、柴油、航空煤油或燃用油。此外，生物原油与原油类似，可以被转化为其他工业有用的化学品，用于例如药品、化妆品、日用消费品、工业过程等。
生物原油可以包括，例如，烃类、烃类产品、脂肪酯和/或脂肪酮。在优选实施方案中，生物燃油由烃类组成，例如脂肪族(例如，烷烃、烯烃、炔烃)或芳香族烃类。
如本文所用的术语“生物柴油(biofuel)”表示可以作为来源于石油的柴油的替代品的生物燃料。生物柴油可以以被称为“纯(neat)”生物柴油的纯品形式或作为以任何浓度与基于石油的柴油的混合物用于内燃柴油发动机。在一个实施方案中，生物柴油可以包括酯或烃类，例如烷烃、烯烃或炔烃。
如本文所用，术语“生物燃料”是指来源于生物质、生物质衍生物或其它生物资源的任何燃料。生物燃料可以替代基于石油的燃料。例如，生物燃料包括运输工具燃料(例如汽油、柴油、喷气燃料(jet fuel)等)、燃用燃料和发电燃料。生物燃料是可再生能源。
如本文使用，术语“生物质(biomass)”是指来源于生物材料的碳源。生物质可以转化成生物燃料。生物质的一个示例性来源是植物物质。例如，玉米、甘蔗或柳枝稷可以用作生物质。生物质的另一非限制性实例是动物物质，例如牛粪。生物质还包括来自工业、农业、林业和家庭的废品。可以用作生物质的这些废品的实例是发酵废渣、秸秆、无用杂物、污水、垃圾和剩余食物。生物质还包括例如碳水化合物(例如单糖、二糖或多糖)的碳源。
如本文所用的短语“碳源(carbon source)”是指适于用作原核细胞或简单真核细胞生长的碳源的底物或化合物。碳源可以具有不同形式，包括但不限于聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽和气体(例如CO和CO2)。这些包括，例如，多种单糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖；寡糖，例如低聚果糖和低聚半乳糖；多糖，例如木糖和阿拉伯糖；二糖，例如蔗糖、麦芽糖和土冉糖；纤维素原料，例如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；饱和或不饱和脂肪酸酯，例如琥珀酸酯、乳酸酯和醋酸酯；醇，例如甲醇、乙醇、丙醇或其混合物。碳源还可以是光合作用的产物，包括但不限于葡萄糖。优选的碳源是生物质。另一优选的碳源是葡萄糖。
如本文所用，“浊点(cloud point)降低添加剂”是添加到组合物以减少或降低溶液的浊点的添加剂。
如本文所用，术语“液体的浊点”意指溶解的固体不再完全溶解的温度。低于该温度，固体开始沉淀为第二相，赋予液体混浊状外观。在石油工业中，浊点所指的温度为，低于该温度时原油、精炼油或燃料中固化的材料或其他重碳水化合物结晶形成浑浊状态。固化物质的存在影响该液体的流动特性、该液体堵塞燃料过滤器、喷嘴的倾向等，固化物质在冷表面(例如管道或热交换器污垢)上的聚积以及该液体与水的乳化特性。
如果两个序列的每个碱基都匹配(例如，能够形成Watson Crick碱基对)，则核苷酸序列与另一核苷酸序列是“互补的”。术语“互补链”在本文中与术语“互补序列(complement)”互换使用。核酸链的互补序列可以是编码链的互补序列或非编码链的互补序列。
除非另有所指，术语“包含(comprising)”、“具有”、“包括(including)”和“含有(containing)”被解释为开放性术语(例如，意指“包括但不限于”)。
如本文所用的术语“足以允许表达的条件”表示允许宿主细胞或产物宿主产生诸如本文所述的多肽、酰基CoA、脂肪酸衍生物(例如，脂肪酸、烃类、脂肪醇、脂肪酯等)或其他产品的所需产物的任何条件。适合的条件包括，例如发酵条件。发酵条件可以包含很多参数。示例性的条件包括温度范围、通气水平和培养基组分。这些条件中每一个单独地并联合地允许宿主细胞生长。
示例性培养基包括培养液或凝胶。通常，所述培养基包括诸如葡萄糖、果糖、纤维素等的碳源，该碳源可以直接被宿主细胞代谢。此外，培养基中可以使用酶以便于促进运动化(例如淀粉或纤维素解聚为可发酵的糖)和随后碳源的代谢。
为了确定条件是否足以允许表达，可以将宿主细胞培养例如约4、8、12、24、36或48小时。培养中和/或培养后，可以获取样品并分析样品以确定该条件是否允许表达。例如，可以测试样品或宿主细胞在其中生长的培养基中的宿主细胞的所需产物的存在。当测试产物的存在时，可以使用的检测方法诸如但不限于TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS。
如本文所用，“允许产品产生的条件”是指允许产物宿主产生诸如酰基CoA或脂肪酸衍生物(例如，脂肪酸、烃类、脂肪醇、蜡或脂肪酯)的所需产物的任何发酵条件。发酵条件通常包括很多参数。示例性的条件包括但不限于：温度范围、通气水平和培养基组分。这些条件中每一个单独地并联合地允许宿主细胞生长。
示例性培养基包括培养液和/或胶。通常，适合的培养基包含可以被微生物直接代谢的碳源(例如，葡萄糖、果糖、纤维素等)。此外，培养基中可以使用酶以促进运动化(例如淀粉或纤维素的解聚为可发酵的糖)和随后碳源的代谢。
为了确定发酵条件是否允许产物产生，可以将生产宿主培养例如约4、8、12、24、36或48小时。培养中或培养后，可以获取样品并分析样品以确定发酵条件是否允许产物产生。例如，可以测试样品中的产物宿主或产物宿主在其中生长的培养基中的所需产物的存在。示例性的测试方法例如TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS以及本文所提供的那些可以用于对产物的存在进行确定和定量。
如本文所用的，“保守的氨基酸取代”意指氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已经被确定。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)、β-分枝侧链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。
应当理解到，本文所述的多肽可以具有另外的对于多肽功能没有本质影响的保守型或非必需氨基酸取代。特定取代是否会被允许(即不会不利地影响例如脱羧酶活性的所需生物性质)，可以按照Bowie et al.Science 247:1306 1310(1990)所述地确定。
如本文所用的“控制元件(control element)”表示转录控制元件。控制元件包括启动子和增强子。术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”是指作为激活基因表达的开关而发挥功能的DNA序列。如果基因被激活，认为其被转录或参与转录。转录涉及由基因合成mRNA。因此，启动子充当转录调节元件并且还提供基因转录为mRNA的起始位点。控制元件与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用(Maniatis et al,Science 236:1237,1987)。
如本文所用，术语“功能地缺失”或“敲除”是指修饰或失活编码靶蛋白的多核苷酸以降低或消除该靶蛋白的功能。可以利用本领域公知的方法进行多核苷酸缺失(参见，例如，Datsenko et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,97:6640-45(2000)或国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788)。
如本文所用，术语“内源”意指位于细胞中并且不是通过重组基因工程技术引入细胞中的多核苷酸。例如，当细胞丛自然界原始地分离时存在于细胞中的基因。如果诸如启动子或增强子序列的激活转录或翻译的控制序列已经通过重组技术改变，则多核苷酸仍被认为是内源的。
如本文所用的术语“酯合酶”表示能够产生脂肪酯的肽。更具体而言，酯合酶是将硫酯转变为脂肪酯的肽。在优选的实施方案中，所述酯合酶将硫酯(例如酰基CoA)转变为脂肪酯。
在可选的实施方案中，酯合酶使用硫酯和醇作为底物产生脂肪酯。酯合酶能够使用短和长链硫酯作为底物。此外，酯合酶能够使用短链和长链醇作为底物。
酯合酶的非限制性实例是蜡合酶、蜡酯合酶、酰基CoA:醇转酰酶、酰基转移酶和脂肪酰辅酶A:脂肪醇酰基转移酶。示例性的酯合酶被分在酶分类号EC 2.3.1.75中。多种这些酶，以及制备本文所述产物的其他有用的酶已经公开于，例如国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788，通过引用将其并入本文。
如本文所用，术语“外源”意指不是来源于自然界中所见的具体细胞的多核苷酸。例如，“外源多核苷酸”可以指插入微生物的基因组多核苷酸序列的多核苷酸或者指引入到微生物中的额外染色体多核苷酸。因此，非天然存在的多核苷酸一旦被引入到细胞则被认为对于细胞是外源的。对于具体细胞，天然存在的多核苷酸也可以是外源的。例如，如果来自第一细胞的多核苷酸被引入到第二细胞中，则从第一细胞分离的完整多核苷酸相对于第二细胞可以是外源多核苷酸。
如本文使用，术语“脂肪酸”表示具有通式RCOOH的羧酸。R表示脂肪族基团，优选地表示烷基。R可以包含约4到约22个碳原子。脂肪酸可以为饱和的、单不饱和的或多不饱和的。在优选的实施方案中，所述脂肪酸由脂肪酸生物合成途径产生。
如本文所用的术语“脂肪酸生物合成途径”表示产生脂肪酸的生物合成途径。所述脂肪酸生物合成途径包括脂肪酸酶，所述脂肪酸酶可以按照本文所述经工程处理产生脂肪酸，并且在一些实施方案中可以与其他酶一起表达以产生具有所需碳链特征的脂肪酸。
如本文所用的术语“脂肪酸降解酶”表示涉及将脂肪酸或脂肪酸衍生物分解或转变成另一产物的酶。脂肪酸降解酶的非限制性实例是酰基CoA合酶。多种这些酶，以及制备本文所述产物的其他有用的酶已经公开于，例如国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788，通过引用将其并入本文。本文描述了脂肪酸降解酶的其他实例。
如本文所用的术语“脂肪酸衍生物”表示部分地产生于生产宿主生物体的脂肪酸生物合成途径的产物。“脂肪酸衍生物”还包括部分地产生于酰基ACP或酰基ACP衍生物的产物。所述脂肪酸生物合成途径包括脂肪酸合酶酶类，所述脂肪酸合酶酶类可以按照本文所述经工程处理产生脂肪酸衍生物，并且在一些实施例中可以与其他酶一起表达以产生具有所需碳链特征的脂肪酸衍生物。示例性的脂肪酸衍生物包括，例如脂肪酸、酰基CoA、脂肪醛、短和长链醇、碳氢化合物、脂肪醇和酯(例如蜡、脂肪酸酯或脂肪酯)。
如本文所用的术语“脂肪酸衍生酶”表示在脂肪酸衍生物的产生中可以被表达或超表达的所有酶。这些酶在本文统称为脂肪酸衍生酶。这些酶可以是脂肪酸生物合成途径的一部分。脂肪酸衍生酶的非限制性实例包括脂肪酸合酶、硫酯酶、酰基CoA合酶、酰基CoA还原酶、醇脱氢酶、醇酰基转移酶、羧酸还原酶、脂肪醇形成酰基CoA还原酶、酯合酶、醛生物合成多肽和烷生物合成多肽。脂肪酸衍生酶将底物转变为脂肪酸衍生物。在一些实施例中，所述底物可以是被脂肪酸衍生酶转变为不同的脂肪酸衍生物的脂肪酸衍生物。多种这些酶，以及制备本文所述产物的其他有用的酶已经公开于，例如国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788，通过引用将其并入本文。
如本文所用的“脂肪酸酶”表示参与脂肪酸生物合成的任何酶。脂肪酸酶可以在宿主细胞中表达或超表达以产生脂肪酸。脂肪酸酶的非限制性实例包括脂肪酸合酶和硫酯酶。多种这些酶，以及制备本文所述产物的其他有用的酶已经公开于，例如国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788，通过引用将其并入本文。
如本文使用，术语“脂肪醇”表示具有通式ROH的醇。在优选的实施方案中，所述脂肪醇是产生自脂肪酸或脂肪酸衍生物的任何醇。
在一个实施方案中，R基长度为至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳。R可以是直链或支链。支链可以具有一个或多个分支点。此外，支链可以包括环状分支。另外，R可以是饱和的或不饱和的。如果是不饱和的，R可以具有一个或多个不饱和点。
在一个实施方案中，脂肪醇是生物合成产生的。脂肪醇具有很多用途。例如，脂肪醇可被用于产生多种特种化学品。例如，脂肪醇可以用作生物燃料；脂肪、蜡、树胶和树脂的溶剂；药用药膏、软化剂和洗剂；润滑油添加剂；洗涤剂和乳化剂；纺织品抗静电和涂饰剂；增塑剂；非离子型表面活性剂；以及化妆品，例如作为增稠剂。
如本文所用的术语“脂肪酯”表示酯。在优选的实施方案中，脂肪酯是产生自脂肪酸的任何酯，以产生例如脂肪酸酯。在一个实施方案中，脂肪酯含有A侧(即连接于羧基氧的碳链)和B侧(即包含母体羧基的碳链)。在优选的实施方案中，当所述脂肪酯来源于脂肪酸生物合成途径时，A侧由醇贡献，并且B侧由脂肪酸贡献。任何醇可以用于形成脂肪酯的A侧。例如，所述醇可以来自脂肪酸生物合成途径。可选地，所述醇可以通过非脂肪酸生物合成途径产生。此外，所述醇可以是外源提供的。例如，在脂肪酯是由也可以产生脂肪酸的生物体产生的情况下，所述醇可以在发酵液(fermentation broth)中提供。可选地，例如在脂肪酯是由还产生醇的生物体产生的情况下，诸如脂肪酸或乙酸的羧酸可以是外源提供的。
包含A侧或B侧的碳链可以是任何长度。在一个实施方案中，酯的A侧的长度为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16或18个碳。酯的B侧的长度为至少约4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26个碳。A侧和/或B侧可以是直链或支链。支链可以具有一个或多个分支点。此外，支链可以包括环状分支。而且，A侧和/或B侧可以是饱和的或不饱和的。如果是不饱和的，A侧和/或B侧可以具有一个或多个不饱和点。
在一个实施方案中，脂肪酯是生物合成产生的。在该实施方案中，首先脂肪酸被“活化”。“活化的”脂肪酸的非限制性实例是酰基CoA、酰基ACP和酰基磷酸盐。酰基CoA可以是脂肪酸生物合成或降解的直接产物。此外，酰基CoA可以由游离脂肪酸、CoA或三磷酸腺苷(ATP)合成。产生酰基CoA的酶的实例是酰基CoA合酶。
在脂肪酸被活化后，其可以被容易地转移到接受体亲核试剂(recipientnucleophile)。示例性的亲核试剂为醇、硫醇或磷酸盐。
在一个实施方案中，脂肪酯是蜡。蜡可以来自长链醇和长链脂肪酸。在另一实施方案中，所述脂肪酯可以来自脂肪酰基硫酯和醇。在另一实施方案中，所述脂肪酯是脂肪酸硫酯，例如脂肪酰辅酶A(CoA)。在其他实施方案中，所述脂肪酯是脂肪酰基泛酸酯、酰基载体蛋白(ACP)或脂肪磷酸酯。脂肪酯具有很多用途。例如，脂肪酯可以用作生物燃料、表面活性剂或配置到对燃料和工业化学品提供润滑和其他益处的添加剂中。
如本文所用的“现代碳比例(fraction of modern carbon)”或“fM”与分别由称为草酸标准HOxI和HOxII的国家标准技术研究院(National Institute of Standards andTechnology(NIST))标准参考物(SRMs)4990B和4990C所定义的具有相同意义。基本定义涉及0.95倍的14C/12C同位素比例HOxI(参考AD 1950)。这粗略地等于衰变校正的工业革命前树木(decay-corrected pre-Industrial Revolution wood)。对于现今生命生物圈(例如，植物物质)而言，fM约为1.1。
可以按照以下计算两个序列之间“同源性”。序列以最佳比较目的进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入空位(gap)用于最佳比对，并且出于比较目的可以忽略非同源序列)。在优选的实施方案中，出于比较目的的而比对的参考序列长度为参考序列长度的至少约30％、优选地至少约40％、更优选地至少约50％、更优选地至少约60％并且更优选地至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。然后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的(如本文所用的，氨基酸或核酸“同一性(identity)”等同于氨基酸或核酸“同源性(homology)”)。两个序列之间的同一性百分比随所述序列所共享的相同位置数而变，这考虑到空位数和每个空位的长度，为了两个序列的最佳比对需要引入空位。
可以使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间同源性百分比的测定。在优选的实施方案中，使用以下测定两个氨基酸序列之间的同源性百分比：Needleman andWunsch(1970)、J.Mol.Biol.48:444 453的算法，其被并入GCG软件包中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。在另一优选的实施方案中，使用以下测定两个核苷酸序列之间的同源性百分比：GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及约40、50、60、70或80的空位权重和约1、2、3、4、5或6的长度权重。特别优选的参数组(和如果操作者不确定应当应用哪些参数确定分子是否在要求的同源性限制内而应该使用的参数组)是具有12的空位罚分、4的空位延伸罚分和5的移码空位罚分的Blossum 62评分矩阵。
用于比较比对序列的其他方法是领域内公知的。多种程序和比对算法描述于，例如Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)；Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)；Higgins&Sharp,Gene 73:237 244(1988)；Higgins&Sharp,CABIOS 5:151-153(1989)；Corpet et al.,Nucleic Acids Research 16:10881-10890(1988)；Huang et al.,CABIOS 8:155-165(1992)；和Pearson et al.,Methods in Molecular Biology 24:307-331(1994)以及Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。
如本文所用的“宿主细胞”是用于产生本文所述产物(例如醛或烷烃)的细胞。可以将宿主细胞改变以表达或超表达所选择的基因或具有所选择的基因的减弱的表达。宿主细胞的非限制性实例包括植物、动物、人、细菌、蓝细菌、酵母或丝状真菌细胞。
如本文所用的术语在“低严紧性、中严紧性、高严紧性或极高严紧性条件下杂交”，描述用于杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可以见于，例如Current Protocols inMolecular Biology(现代分子生物学实验技术),John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。该参考资料中描述了水性和非水性方法并且可以使用任一方法。本文涉及的具体杂交条件如下：1)低严紧性杂交条件在约45℃下、在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，然后是在至少50℃下、在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤两次(对于低严紧性条件，洗涤温度可以升至55℃)；2)中严紧性杂交条件在约45℃下在、在6×SSC中，然后是在60℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；3)高严紧性杂交条件在约45℃的6×SSC中，然后是在65℃下、在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；以及优选地4)极高严紧性杂交条件为65℃的0.5M磷酸钠、7％SDS，然后是在65℃下、在0.2×SSC、1％SDS中洗涤一次或多次。除非另作规定，极高严紧性条件(4)是优选的条件。
本文中涉及诸如DNA或RNA的核酸所用的术语“分离的”是指分别从所述核酸的天然来源中存在的其他DNA或RNA中隔离的分子。此外，“分离的核酸”包括核酸片段，例如不是天然存在的片段。本文所用的术语“分离的”还指从其他细胞蛋白分离的多肽，并且包括纯化的内源多肽和重组的多肽两者。当核酸或多肽是通过重组DNA技术产生时，本文使用的术语“分离的”还指基本上不含细胞物质、病毒物质或培养基的核酸或肽。当核酸或多肽是化学合成时，本文所用的术语“分离的”还指基本上不含化学前体或其他化学品的核酸或多肽。
如本文所用的“细胞中的基因表达水平”是指由所述细胞中基因编码的mRNA、前体mRNA新生转录物、转录加工中间体、成熟mRNA和/或降解产物的水平。
如本文所用的术语“微生物”表示来自古菌域、细菌域和真核域的原核和真核微生物种类，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高等原生生物。本文所用的术语“微生物细胞”表示来自于微生物的细胞。
如本文所用的术语“核酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)以及适当情况下，指核糖核酸(RNA)。该术语还包括产生自核苷酸类似物的RNA或DNA的类似物，以及适用于所述实施方案的单链(有义或反义)和双链多核苷酸、EST、染色体、cDNA、mRNA和rRNA。除非另有所指，或除非上下文明确地表示相反意思，术语“核酸”与“多核苷酸”、“DNA”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和/或“基因”可交换地使用。
如本文所用的术语“可操作地连接”表示所选择的核苷酸序列(例如编码本文所述的多肽)与启动子接近以允许所述启动子调节该选择的核苷酸序列的表达。此外，按照转录和翻译的方向，所述启动子位于所述选择的核苷酸序列的上游。“可操作地连接”表示将核苷酸序列和调节序列连接以便当适合的分子(例如转录激活蛋白)与调节序列结合时允许基因表达。
本文所用术语“或”表示术语“和/或”并且与术语“和/或”交换使用，除非上下文明确表示并非如此。
如本文所用的“超表达”表示在细胞中以高于相应野生型细胞中正常表达浓度的浓度表达核酸、多肽或碳氢化合物或使之表达或产生。例如，当在重组宿主细胞中多肽以与其在相同种类的非重组宿主细胞中的浓度相比更高的浓度存在时，所述多肽在所述重组宿主细胞中能够“超表达”。
如本文所用的“分配系数”或“P”定义为化合物在有机相中的平衡浓度除以在水相中(例如发酵液)平衡时的浓度。在本文所述的两相系统的一个实施方案中，生产过程中所述有机相是由醛或烷烃形成的。但是，在一些实施例中，可以例如通过提供辛烷层来提供有机相以便促进产物分离。当描述两相系统时，化合物的分配特性可以描述为logP。例如，logP为1的化合物会10:1分配到有机相。logP为-1的化合物会1:10分配到有机相。通过选择适合的发酵液和有机相，具有高logP值的有机脂肪酸衍生物或产物在发酵容器中也会分离到有机相中，即使是处于很低的浓度。
除非另有所指，或除非上下文明确地表示相反意思，如本文所用的术语“多肽”与“蛋白”、“肽”和/或“酶”可交换地使用。
如本文所用，术语“产物宿主”意指用于产生本文所述的产物的细胞。产物宿主被修饰以表达、超表达、减弱或缺失所选的多核苷酸的表达。产物宿主的非限制性实例包括植物、藻类、动物、人、细菌、酵母和丝状真菌细胞。
如本文所用的术语“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”或“纯化(purification)”表示通过例如纯化或分离从分子的环境中移除或分离所述分子。“基本上纯化的”分子为至少约60％、优选地至少约75％以及更优选地至少约90％游离于与其相关的其他组分。如本文所用的这些术语还指从样品中去除污染物。例如，污染物的去除可以导致样品中脂肪酸衍生物或产物的百分比增加。例如，当脂肪酸衍生物或产物在宿主细胞中产生时，可以通过去除宿主细胞蛋白纯化脂肪酸衍生物或产物。纯化后，样品中脂肪酸衍生物或产品的百分比增加。
术语“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”或“纯化(purification)”不需要绝对纯。它们是相对的术语。因此，例如当脂肪酸衍生物或产物在宿主细胞中产生时、纯化的脂肪酸衍生物或产物是基本与其他细胞组分(例如核酸、多肽、脂质、碳水化合物或其他脂肪酸衍生物或产物)分离的脂肪酸衍生物或产物。在另一实施例中，纯化的脂肪酸衍生物或纯化的产物的制剂是这样的制剂，在该制剂中，所述脂肪酸衍生物或产物基本不含例如发酵后可能存在的那些污染物。在一些实施方案中，当样品重量的至少约50％是由脂肪酸衍生物或产物组成时，所述脂肪酸衍生物或产物是纯化的。在其他实施方案中，当样品重量的至少约60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％或更多是由脂肪酸衍生物或产物组成时，所述脂肪酸衍生物或产物是纯化的。
如本文所用，术语“重组多肽”是指通过重组DNA技术产生的多肽，其中通常将编码所表达的多肽或RNA的DNA插入适合的表达载体，并且所述表达载体接下来用于转化宿主细胞以产生所述肽或RNA。
如本文所用的术语“基本相同”(或“基本同源”)是用于指含有足够数量的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同的(例如具有相似侧链)氨基酸残基(例如保守氨基酸取代)或核苷酸的第一氨基酸或核苷酸序列，这样所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似活性。
如本文所用的术语“合酶”表示催化合成过程的酶。如本文所用的术语合酶包括合酶、合成酶和连接酶。
如本文所用的术语“转染”表示将核酸(例如通过表达载体)通过核酸介导的基因转移引入到受体细胞。
如本文所用的术语“转化”是指这样的过程，在该过程中，细胞的基因型由于细胞摄入外源核酸而改变。这可以导致表达重组形式的RNA或多肽的转化的细胞。在由转移的基因反义表达的情况下，天然存在形式的多肽的表达遭到破坏。
如本文所用的术语“转运蛋白”意指便于一种或多种化合物移入和/或移出细胞器和/或细胞的多肽。多种这些酶，以及制备本文所述产物的其他有用的酶已经公开于，例如国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788，通过引用将其并入本文。
如本文所用，多肽X的“变体”是指具有多肽X的氨基酸序列的多肽，其中一个或多个氨基酸残基发生改变。所述变体可以具有保守型改变或非保守型改变。使用本领域熟知的计算机程序，例如LASERGENE软件(DNASTAR)，可以找到确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不影响生物活性的指导。
在用于多核苷酸序列的情况下，术语“变体”可以包括与基因或其编码序列的多核苷酸序列相关的多核苷酸序列。该定义还可以包括，例如“等位基因”变体、“剪接”变体、“物种”变体或“多态性”变体。剪接变体可以与参考多核苷酸具有显著的同一性，但是由于在mRNA加工中的可选的外显子剪接，会通常具有更多或更少的多核苷酸数。相应的多肽可以具有另外的功能结构域或结构域缺失。物种变体是在物种之间彼此不同的多核苷酸序列。得到的多肽通常会具有显著的相对于彼此的氨基酸同一性。多态性变体是在给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列中的变异。
如本文所用，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种有用的载体是附加体(即能够在染色体外复制的核酸)。有用的载体是能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的那些载体。能够指导基因的表达的载体在本文被称为“表达载体”，所述载体被可操作地连接到所述基因。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体经常是“质粒”的形式，所述“质粒”通常是指在其载体形式时不与染色体结合的环状双链DNA环。在本说明书中，因为质粒是最通常使用的载体形式，所以“质粒”和“载体”是交换使用的。但是，还包括发挥等同功能并随后至今成为本领域已知的表达载体的这些其他形式。
如本文所用的术语“蜡”意指由脂肪酯组成的组合物。在优选实施方案中，蜡中的脂肪酯由中到长链碳链组成。除了脂肪酯，蜡还包含其他组分(例如，烃类、甾醇酯、脂肪醛、醇、酮、β-二酮、甘油三酯等)。
在整个本说明书中，可以使用缩写基因名称或多肽名称进行引用，但是应当理解到，该缩写基因或多肽名称表示基因或多肽的种类。这些基因名称包括编码相同多肽和具有相同生理功能的同源多肽的所有基因。多肽名称包括具有相同活性(例如催化相同基础化学反应活性)的所有多肽。
本文引用的登录号来自美国国立卫生研究院(National Institute of Health,U.S.A)所维护的NCBI数据库(国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information))。除非另作说明，登录号按照截止到2009年4月的数据库中提供的。
EC号由国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会(Nomenclature Committeeof the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB))(可获取自http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)制定。本文引用的EC号来自由东京大学部分资助的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomics)所维护的KEGG配体数据库。除非另作说明，EC号按照截止到2009年4月的数据库中提供的。
除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域技术人员通常理解的具有相同的意义。
尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，仍然在下文描述了适合的方法和材料。除非另有所指，或除非上下文明确地表示相反意思，本文所述的所有方法可以以任何适合的顺序进行。
除非另有所指，百分比中所列的量是指基于组合物的总重量的重量百分比。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考资料通过引用全文并入。如有冲突，以包括定义在内的本说明书为准。此外，材料、方法和实施例仅是举例说明并不意图限制。
除非本文另有所指，本文中数值范围的列举仅意图作为单独地涉及落入该范围内的每个单独的值的速记法，并且每个单独的值被并入说明书中，如同在本文中单独地列举。
本文所提供的任何和所有实例或示例性的语言(例如，“例如”)的使用仅意图更好地说明本发明并不意欲对本发明的范围造成除了所要求保护之外的限制。由于说明书中的语言对发明的实践是基本的，它们不应被解释为指示任何非要求保护的要素。
根据下文的详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优势会清晰。
本发明至少部分地基于这样的发现：通过培养经过基因工程处理的宿主细胞可以产生脂肪酸和/或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物，所述宿主细胞包含表达的或超表达的酯合酶或其适合的变体，但是其以减弱水平的或缺乏诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶或硫酯酶或以上二者，所述水平是相对于这些酶的天然存在的水平。先前公开的通过微生物发酵方法产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的方法，其通常除了酯合酶还涉及硫酯酶和诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶中的至少一个，其优选地要求增加活性或水平的这些酶的存在，，相对于该先前的方法，本方法在能量上更有利且更高效。例如，本文所述的方法允许诸如酰基ACP和/或酰基CoA的硫酯直接转化为脂肪酸和/或脂肪酸衍生物，避开了首先水解ACP以产生脂肪酸，然后再活化脂肪酸以产生酰基CoA的必要条件。
酯合酶基因及变体
通过培养经过基因工程处理的宿主细胞来产生脂肪酯，所述宿主细胞包含酯合酶、编码这些酶的核酸，包含编码这些酶的核酸的载体；或通过培养用所述载体转化的重组宿主细胞和包含并入宿主细胞染色体的编码这些酯合酶的多核苷酸的重组宿主细胞。具体地，该方法包括在宿主细胞中表达编码酯合酶的基因，所述酯合酶选自例如分类为EC2.3.1.75的酶，其催化饱和或不饱和酰基残基(例如长链C18至C20的那些)酶催转移到醇上。酯合酶可以是选自以下的一种：蜡酯合酶、酰基CoA：醇转酰酶、酰基转移酶和脂肪酰CoA：脂肪醇酰基转移酶。例如，酯合酶基因可以是编码ws/dgat——来自油蜡树、不动杆菌ADPl、泊库岛食烷菌、铜绿假单胞菌、Fundibacter jadensis、拟南芥、或真养产碱杆菌的双功能酯合酶/酰基CoA：甘油二酯酰基转移酶——的一个基因。在一些实施方案中，本发明特征为制备脂肪酸或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法，其中所述方法包括在宿主细胞中表达编码酯合酶或其变体的基因，所述酯合酶选自AtfA1(YP_694462,SEQ ID NO:25)、AtfA2(YP_693524,SEQ ID NO:26)、ES9(ABO21021,SEQ ID NO:18)和ES8(ABO21020,SEQ ID NO:24)。
在某些实施方案中，本发明特征在于制备脂肪酸或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法，其中所述方法包括在宿主细胞中表达编码酯合酶多肽或其变体的基因，所述酯合酶多肽包括SEQ ID NO：18、24、25或26的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述多肽或变体具有酯合酶和/或酰基转移酶活性。在具体实施方案中，多肽或变体利用醇作为底物催化硫酯转化为脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。在一实例中，多肽或变体利用醇作为底物催化酰基CoA转化为脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。在另一实例中，多肽或变体利用醇作为底物催化酰基ACP转化为脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。在又一实例中，多肽或变体还能利用醇作为底物将游离脂肪酸转化为脂肪酯。醇底物可以是短或长链醇。在一些实施方案中，醇底物是甲醇，从而表达酯合酶的宿主细胞产生脂肪酸和/或诸如甲酯的脂肪酸甲基衍生物。在其他实施方案中，醇底物是乙醇，从而表达酯合酶的宿主细胞产生脂肪酸和/或诸如乙酯的脂肪酸乙基衍生物。
在某些实施方案中，宿主细胞的内源硫酯酶如果存在的话则未被修饰。在其他实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的硫酯酶，所述减弱水平为相对于硫酯酶的天然存在的水平。在可选的实施方案中，硫酯酶被功能地缺失。在一些实施方案中，宿主细胞不具有可检测的硫酯酶活性。在其他实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶，所述减弱水平为相对于该酶的天然存在的水平。在可选实施方案中，酰基CoA合酶被功能地缺失。在一些实施方案中，宿主细胞不具有可检测的酰基CoA合酶活性。在其他实施方案中，宿主细胞表达减弱水平的硫酯酶和诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶。在其他实施方案中，硫酯酶和酰基CoA合酶被功能地缺失。在一些实施方案中，宿主细胞不具有可检测活性的硫酯酶或酰基CoA合酶。
在某些实施方案中，该方法包括在宿主细胞中表达编码包含SEQ ID NO：18、24、25或26的氨基酸序列的酯合酶多肽的基因，其中从所述宿主细胞中功能地缺失或敲除硫酯酶、酰基CoA合酶或以上二者。在一些实施方案中，宿主细胞不具有可检测的硫酯酶活性或酰基CoA合酶活性。
变体可以是天然存在的或体外产生的。特别是，可以使用基因工程技术产生变体，例如定点诱变、随机化学诱变、外切核酸酶III缺失操作或标准克隆技术。可选地，可以使用化学合成或修饰操作产生这些变体、片段、类似物或衍生物。
制造变体的方法是本领域熟知的。这些方法包括这样的操作，在该操作中，修饰获得自天然分离物的核酸序列以生成编码多肽的核酸，所述多肽具有增强其在工业或实验室应用中的价值的特征。在这样的操作中，产生及表征了大量具有相对于来自天然隔离种群所获得的序列的一个或多个核苷酸差异的变体序列。通常，这些核苷酸差异导致相对于来自天然分离物的核酸所编码的多肽的氨基酸改变。
例如，可以使用易错PCR(参见，例如Leung et al.,Technique 1:11-15,1989；和Caldwell et al.,PCR Methods Applic.2:28-33,1992)产生变体。在易错PCR中，在DNA聚合酶的复制保真度低的条件下进行PCR，这样沿着PCR产物的整个长度获得了高效点突变。简单地说，在这些操作中，将待诱变的核酸(例如酯合酶序列)与PCR引物、反应缓冲液、MgCl2、MnCl2、Taq聚合酶和适当浓度的dNTPs混合，以实现沿着PCR产物的整个长度的高效点突变。例如，可以使用20fmoles的待诱变的核酸(例如酯合酶多核苷酸序列)，30pmole的每种PCR引物，包含50mM KCl、10mM Tris HCl(pH 8.3)和0.01％明胶的反应缓冲液，7mMMgCl2，0.5mM MnCl2，5单位的Taq聚合酶，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP和1mM dTTP进行反应。PCR可以进行30个以下循环：94℃持续1分钟、45℃持续1分钟和72℃持续1分钟。但是，应当理解到这些参数可以视情况变化。然后，将诱变后的核酸克隆到适合的载体中并且评价所述诱变后的核酸编码的多肽的活性。
还可以使用寡核苷酸定向诱变以在任何相关克隆DNA中产生位点特异性突变来产生变体。寡核苷酸诱变描述于，例如Reidhaar-Olson et al.,Science 241:53-57,1988。简单地说，在这些操作中，合成大量带有一个或多个待被引入克隆DNA中的突变的双链寡核苷酸并且将其插入待诱变的克隆DNA(例如酯合酶多核苷酸序列)。重获含有诱变后的DNA的克隆并且评价其编码的多肽的活性。
产生变体的另一方法是组合PCR(assembly PCR)。组合PCR涉及由小DNA片段的混合物组合PCR产物。大量的不同PCR反应在相同小管中平行发生，伴随一个反应的产物引发另一反应的产物。组合PCR描述于例如美国专利第5,965,408号。
生成变体的又一方法是有性PCR诱变。在有性PCR诱变中，作为基于序列同源性的DNA分子随机破碎的结果，体外发生了不同但高度相关的DNA序列的DNA分子之间的被迫的同源重组。然后是通过在PCR反应中的引物延伸固定交换。有性PCR诱变描述于例如Stemmer,PNAS,USA 91:10747-10751,1994。
还可以通过体内诱变产生变体。在一些实施方案中，核酸序列中的随机突变通过在携带一个或多个DNA修复途径中的突变的例如大肠杆菌菌株的细菌菌株中增殖所述序列来生成。这些“突变株(mutator)”菌株具有比野生型菌株更高的随机突变率。在这些菌株的一个菌株中增殖DNA序列(例如酯合酶多核苷酸序列)会最终在所述DNA中产生随机突变。适用于体内诱变的致突变菌株描述于例如PCT公布第WO 91/16427号。
还可以使用盒诱变产生变体。在盒诱变中，双链DNA分子的小的区被不同于天然序列的合成的寡核苷酸“盒”替换。该寡核苷酸经常含有完全和/或部分随机化的天然序列。
回归整体诱变(recursive ensemble mutagenesis)也可以用于产生变体。回归整体诱变是开发用以产生表型相关的突变体的多样性群体的蛋白工程(即蛋白诱变)的运算法则，所述群体成员的氨基酸序列是不同的。该方法使用反馈机制来控制连续轮的组合盒诱变。回归整体诱变描述于例如Arkin et al.,PNAS,USA 89:7811-7815,1992。
在一些实施方案中，使用指数整体诱变(exponential ensemble mutagenesis)产生变体。指数整体诱变是产生具有高百分比的独特并且有功能的变体的组合文库的过程，其中小群残基被平行随机化以鉴定每个改变的位置上导致功能性蛋白的氨基酸。指数整体诱变描述于例如Delegrave et al.,Biotech.Res.11:1548-1552,1993。随机诱变和定点诱变描述于例如Arnold,Curr.Opin.Biotech.4:450-455,1993。
在一些实施方案中，如例如美国专利第5,965,408号和第5,939,250号中所述，使用改组操作产生变体，其中许多编码不同多肽的核酸中的部分融合在一起以产生编码嵌合多肽的嵌合核酸序列。
多核苷酸变体还包括核酸类似物。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分或磷酸主链处进行修饰以改善例如核酸的稳定性、杂交或溶解性。碱基部分的修饰包括将脱氧胸苷修饰为脱氧尿苷和将脱氧胞苷修饰为5-甲基-2'-脱氧胞苷或5-溴-2’-脱氧胞苷。糖部分的修饰包括修饰核糖的2’羟基以形成2’-O-甲基糖、2’-卤素或2’-O-烯丙基糖。可以修饰脱氧核糖磷酸主链以产生吗啉代核酸，其中每个碱基部分连接到六元吗啉代环，或产生肽核酸，其中脱氧磷酸主链被假肽主链代替并保留4个碱基(参见，例如Summerton et al.,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7:187-195(1997)；和Hyrup et al.,Bioorgan.Med.Chem.4:5-23(1996))。此外，脱氧磷酸主链可以被例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主链、亚磷酰胺、或烷基磷酸三酯主链所代替。
在一些实施方案中，酯合酶多肽是包括具有一个或多个氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQ ID NO：18、24、25或26的氨基酸序列的变体，并且所述多肽具有酯合酶和/或酰基转移酶活性。例如，酯合酶变体利用醇作为底物催化硫酯转化为脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。在某些实施方案中，酯合酶变体还催化游离脂肪酸转化为脂肪酯。
在某些实例中，本文所述的方法可用于利用具有SEQ ID NO：18、24、25或26的氨基酸序列的酯合酶多肽及其多肽变体产生脂肪酸或脂肪酸衍生物。酯合酶多肽变体可以是其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基取代的变体。这些取代的氨基酸残基可以是或可以不是遗传密码所编码的残基。
在一些实施方案中，酯合酶多肽是包括具有一个或多个非保守氨基酸取代的SEQID NO：18、24、25或26的氨基酸序列的变体，其中所述多肽变体具有酯合酶和/或酰基转移酶活性。在一些实施方案中，SEQ ID NO：18的395位处的甘氨酸残基被碱性氨基酸残基取代，其中所得的酯合酶变体保留或具有改善的酯合酶和/或酰基转移酶活性。
在一些实施方案中，酯合酶多肽是包含具有一个或多个保守氨基酸取代的SEQ IDNO：18、24、25或26的氨基酸序列的变体。保守型取代为由具有相似性质的另一氨基酸取代多肽中给定氨基酸残基的那些取代。典型的保守型氨基酸取代包括以下替换：诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的脂肪族氨基酸被另一脂肪族氨基酸替换；丝氨酸被苏氨酸替换；苏氨酸被丝氨酸替换；诸如天冬氨酸和谷氨酸的酸性残基被另一酸性残基替换；诸如天冬酰胺和谷氨酰胺的携带酰胺基的残基被另一携带酰胺基的残基替换；诸如赖氨酸和精氨酸的碱性残基被另一碱性残基交换；以及诸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族残基被另一芳香族残基替换。在一些实施方案中，酯合酶多肽变体具有酯合酶和/或酰基转移酶活性。例如，酯合酶多肽变体催化硫酯转化为脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。在另一实例中，酯合酶多肽催化游离脂肪酸转化为脂肪酯。
其他多肽变体包括那些其中一个或多个氨基酸残基包括取代基的变体。还有其他多肽变体包括那些其中所述多肽与另一化合物结合的变体，如增加多肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)。
另外的多肽变体是那些其中其他氨基酸残基被融合到所述多肽的变体，所述其他氨基酸例如前导序列、分泌序列、前蛋白序列或便于所述多肽的纯化、富集或稳定的序列。
在某些实例中，所述多肽变体保留了与具有诸如SEQ ID NO：18、24、25或26的氨基酸序列的多肽相同的生物学功能并且具有与其基本相同的氨基酸序列。在具体实例中，多肽变体保留诸如SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽的酯合酶和/或酰基转移酶活性。
在其他实例下，所述多肽变体与SEQ ID NO：18、24、25或26的氨基酸序列具有至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％的同源性。在另一实例中，所述多肽变体包括片段，所述片段包含其至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150或200个保守氨基酸残基。
所述多肽变体或其片段可以通过使用本文所述的技术分离编码它们的核酸或通过超表达编码它们的合成的核酸来获得。可选地，多肽变体或其片段可以通过生物化学富集或纯化操作来获得。多肽变体或片段的序列可以通过蛋白水解消化、凝胶电泳和/或微测序来确定。例如，然后使用本文所述的任何程序，可以将所述多肽变体或片段的序列与SEQID NO：18、24、25或26的氨基酸序列进行比较。
使用常规方法，可以检测所述多肽变体及其片段的产生酯合酶活性和/或酰基转移酶活性。例如，在允许所述多肽发挥功能的条件下，可以使所述多肽变体或片段与底物(例如，酰基CoA、酰基ACP、游离脂肪酸、或醇)接触。可以测量底物水平的下降或脂肪酸和/或脂肪酸衍生物产物水平的升高以测定酯合酶/酰基转移酶的活性。
在一些实施方案中，酯合酶多肽变体可以包括具有一个或多个非保守氨基酸取代的SEQ ID NO：18、24、25或26的氨基酸序列，但仍然具有酯合酶和/或酰基转移酶活性。在一些实施方案中，395位处的甘氨酸残基被碱性氨基酸残基取代，其中所得的酯合酶变体保留或具有改善的酯合酶和/或酰基转移酶活性，所述活性为相对于天然或野生型酯合酶的活性。在具体实例中，SEQ ID NO：18的395位的甘氨酸残基被精氨酸或赖氨酸取代，其中所得的酯合酶变体具有改善的酯合酶和/或酰基转移酶活性，所述活性为相对于SEQ ID NO：18的野生型酯合酶的活性。
在一些实施方案中，该多肽包含一个或多个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述多肽具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸取代、添加、插入或缺失。在一些实施方案中，包含一个或多个氨基酸取代、添加、插入或缺失的多肽保留与SEQ ID NO：18、24、25或26的多肽相同的生物活性。如本文所用的“保留生物活性”是指该生物活性的可检测水平的保留，而不是活性的相同水平的保留。例如，包含一个或多个氨基酸取代、添加、插入或缺失的多肽具有酯合酶和/或酰基转移酶活性。例如，多肽可以利用醇作为底物催化硫酯转化为脂肪酸和/或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物。适合的硫酯底物包括，例如诸如脂肪酰CoA或脂肪酰ACP的脂肪硫酯。在另一实例中，所述多肽可以利用醇作为底物催化游离脂肪酸转化为脂肪酯。适合的醇底物包括，例如，长链或短链醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、辛醇、庚醇、癸醇、十二醇、十四醇或十六醇。
在某些实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法，其中所述方法包括在宿主细胞中表达编码酯合酶变体ES9(GenBank登录号ABO21021，SEQ ID NO：18)的基因或多核苷酸，其中所述宿主细胞表达减弱水平的硫酯酶或其中硫酯酶被在功能上缺失。在其他实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的方法，其中所述方法包括在宿主细胞中表达编码ES9(SEQ ID NO：18)的变体的基因或多核苷酸，其中所述宿主细胞表达减弱水平的诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶或其中酰基CoA合酶被在功能上缺失。在其他实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸或其衍生物的方法，其中所述方法包括在宿主细胞中表达编码ES9(SEQ ID NO：18)的变体的基因或多核苷酸，其中所述宿主细胞表达减弱水平的硫酯酶、诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶或以上二者，或其中硫酯酶、酰基CoA合酶或以上二者被在功能上缺失。在一些实施方案中，宿主细胞不具有可检测的硫酯酶活性或酰基CoA合酶活性。
在一些实施方案中，酯合酶变体在相当于SEQ ID NO：18的395位的氨基酸残基出包含取代。在具体实施方案中，变体在395位包含碱性氨基酸残基，替代SEQ ID NO：18该位置的甘氨酸残基。例如碱性氨基酸残基可以是赖氨酸或精氨酸残基。在一些实施方案中，变体具有与SEQ ID NO：18的多肽的酯合酶和/或酰基转移酶活性相同的或改善的酯合酶和/或酰基转移酶活性。
在某些实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸或脂肪酸衍生物的方法，其中该方法包括在宿主细胞中表达编码酯合酶ES9的变体的多核苷酸，其中所述宿主细胞还表达减弱水平的硫酯酶、酰基CoA合酶或以上二者，或其中硫酯酶、酰基CoA合酶或以上二者被在功能上缺失。在一些实施方案中，酯合酶的变体在相当于SEQ ID NO:18的395位的氨基酸残基包含取代，以及包含一个或多个氨基酸取代、添加、插入或缺失的，并且所述变体具有酯合酶活性和/或酰基转移酶活性。在一些实施方案中，变体催化硫酯底物和/或醇底物转化为脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。在其他实施方案中，变体催化游离脂肪酸转化为脂肪酯。
在一些实施方案中，酯合酶多肽或其变体长度为约200个氨基酸至约2000个氨基酸，例如长度为约250至约1500个氨基酸残基，长度为约300至约1200个氨基酸残基，长度为约350至约1000个氨基酸残基，长度为约400至约800个氨基酸残基或长度为约450至约600个氨基酸残基。在某些实施方案中，天然存在的酯合酶多肽长度为约300个氨基酸残基或更长，例如长度为约400个氨基酸残基或更长，或长度为约450个氨基酸残基或更长。在某些相关实施方案中，酯合酶多肽或其变体长度为约1000个氨基酸残基或更短，例如长度为约800个氨基酸残基或更短，例如长度为约700个氨基酸残基或更短，或长度为约600个氨基酸残基或更短。示例性的本发明的酯合酶长度为约500个氨基酸残基。
可以使用的其他酯合酶描述于与本发明同时提交的名称为“Production ofFatty Acid Derivatives(脂肪酸衍生物的产生)”，代理卷号为2001235.150WO1的PCT专利申请。
酯合酶多肽的抗体
本文所述的酯合酶多肽可被用于产生针对酯合酶多肽的抗体。这些抗体可以用于，例如利用本领域已知的方法检测酯合酶多肽的表达。所述抗体可以是，例如多克隆抗体；单克隆抗体或其抗原结合片段；例如嵌合抗体、重构抗体(reshaped antibody)、人源化抗体的修饰的抗体或其片段(例如Fab’、Fab、F(ab’)2)；或例如单链抗体、单结构域抗体(DAB)、Fv、单链Fv(scFv)等的生物合成抗体。
制造和使用多克隆和单克隆抗体的方法描述于，例如Harlow et al.,UsingAntibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol I(使用抗体：实验室指南：操作手册I).Cold Spring Harbor Laboratory(1998年12月1日)。制造修饰的抗体和抗体片段(例如嵌合抗体、改形抗体、人源化抗体或其片段，所述片段例如Fab’、Fab、F(ab’)2片段)或生物合成抗体(例如单链抗体、单结构域抗体(DABs)、Fv、单链Fv(scFv)等)的方法是本领域已知的并且可以见于，例如Zola,Monoclonal Antibodies:Preparation and Use ofMonoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives(单克隆抗体：单克隆抗体和改造抗体衍生物的制备和使用),施普林格(Springer Verlag)(2000年12月15；第一版)。
底物
本文所述的组合物和方法可以用于产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物，例如，从硫酯和醇或从游离脂肪酸和醇，它们自身可以在同一宿主细胞中从适合的底物产生。不希望被理论限制，相信重组修饰的产物宿主可被修饰以增加诸如酰基CoA或酰基ACP、游离脂肪酸的硫酯底物的产生，或增加诸如脂肪醇的适合的醇底物的产生。此外，重组修饰的产物宿主可被修饰以降低脂肪酸或脂肪酸衍生物的分解代谢和/或脂肪酸生物合成途径中的中间体，或降低同一途径中特定位点的反馈抑制。除了修饰本文所述的基因，可以转移其他细胞自愿以超量产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。例如，乳酸、琥珀酸和/或乙酸途径可被减弱，而乙酰CoA羧化酶(由acc基因编码)可以被超表达。对产物宿主的修饰可以通过例如遗传改变，添加重组表达系统或以上的组合实现。
典型的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物生物合成途径在图1A中示出。随后的部分描述了这些途径中的步骤。途径中不同的步骤由多种酶催化。可以修饰导致脂肪酸和/或脂肪酸衍生物底物的产生的途径中的每一个步骤以产生或过量产生目的底物。例如，宿主细胞中参与脂肪酸生物合同途径的已知基因可被表达、超表达或减弱以产生所需底物(参见，例如PCT/US08/05877所述的方法，通过引用将其公开并入本文)。可以作为改变的位点的示例性的基因包括但不限于：accA(EC 6.4.1.2)、accB(EC 6.4.1.2)、accC(EC 6.4.1.2、EC6.3.4.14)、accD(EC 6.4.1.2)、aceE(EC 1.2.4.1)、aceF(EC 2.3.1.12)、fabD(EC2.3.1.39)、fabG(EC 1.1.1.100)、fabH(EC 2.3.1.180)、panD(EC 4.1.1.11)、panK(EC2.7.1.33)、pdh(EC 1.2.4.1)、udhA(EC 1.6.1.1)。
脂肪酸合酶(FAS)是一组催化酰基链的起始和延长的肽(Marrakchi et al.,Biochemical Society,30:1050-1055,2002)。酰基载体蛋白(ACP)以及FAS途径中的酶控制所产生的脂肪酸的长度、饱和度和分支。该途径中的步骤由脂肪酸生物合成(fab)和乙酰CoA羧化酶(acc)基因家族的酶催化(参见，例如Heath et al.,Prog.Lipid Res.40(6):467-97(2001))。根据所需产品，这些基因中的一种或多种可以被减弱或超表达。
可以通过重组表达或超表达一种或多种脂肪酸合酶基因，例如乙酰CoA和/或丙二酰CoA合酶基因，改造宿主细胞以表达脂肪酸衍生物底物。例如，为了增加乙酰CoA产生，可以在宿主细胞中表达或超表达一个或多个以下基因：pdh、panK、aceEF(编码丙酮酸和2-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1p脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分)、fabH、fabD、fabG、acpP和fabF。这些基因的示例性GenBank登录号在基因名称后的括号内列出：pdh(BAB34380、AAC73227、AAC73226)、panK(也称为coaA、AAC96952)、aceEF(AAC73227、AAC73226)、fabH(AAC74175)、fabD(AAC74176)、fabG(AAC74177)、acpP(AAC74178)、fabF(AAC74179)。
此外，可以通过用含有相应基因的无效或缺失突变的条件复制或非复制质粒进行转化或通过取代启动子或增强子序列，在经过工程处理的微生物中降低或在功能上缺失fadE、gpsA、ldhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA和/或ackB的表达水平。这些基因的示例性GenBank登录号在括号内列出：fadE(AAC73325)、gspA(AAC76632)、ldhA(AAC74462)、pflb(AAC73989)、adhE(AAC74323)、pta(AAC75357)、poxB(AAC73958)、ackA(AAC75356)和ackB(BAB81430)。在示例性的实施方案中，在本发明的产物宿主细胞中减弱或在功能上缺失fadE表达。当在适合的环境中培养时，所得的经过工程处理的产物宿主可以产生增加水平的乙酰CoA。
类似地，可以通过用从头合成地包含在质粒中的accABCD(例如，GenBank登录号AAC73296，分类为EC 6.4.1.2)如本文所述经过工程处理产物宿主来实现丙二酰CoA的超量产生。通过还在从头合成的质粒中包含编码脂肪酶(例如，GenBank登录号：CAA89087、CAA98876)的DNA序列来实现脂肪酸的超量产生。
在一些实施方案中，所得的宿主细胞超表达乙酰CoA使得其细胞内浓度相对于乙酰CoA的天然表达水平增加多于约2倍，例如多于约5倍或多于约10倍。
使用本领域已知的方法可以证实乙酰CoA和丙二酰CoA的过量产生，例如，通过在细胞裂解后使用放射性操作、HPLC和GC-MS。
此外，plsB(例如，GenBank登录号AAC77011)D311E突变体可以用于增加可用酰基CoA的量。
此外，sfa基因(FabA抑制剂，例如GenBank登录号AAN79592)的超表达可以在产物宿主中实现以增加单不饱和脂肪酸的产生(Rock et al.,J.Bacteriology 178:5382-5387(1996))。
在脂肪酸和脂肪酸衍生物合成的典型的微生物方法模型中，通过一系列步骤转化乙酰CoA和丙二酰CoA以形成酰基ACP链。然后通过一系列的替代酶促步骤将酰基ACP转化为多种最终产物，包括脂肪酸衍生物。例如，酰基ACP通常被硫酯酶、酰基CoA连接酶/合成酶和酯合酶的联合连贯反应转化为脂肪酯。代谢途径中的这些酶的商业应用的限制是需要水解ACP以产生脂肪酸，脂肪酸随后被再活化以产生脂肪酰CoA底物，这需要至少两个酶促步骤和消耗来自两个碳酸酐键的代谢能。已经发现通过绕过硫酯酶的参与和/或绕过诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶的参与可以在酯合酶的存在下产生脂肪酸和/或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物。这种更经济和高效的方法减轻由其他多步骤途径引起的ATP损失。具体地，已经发现在不存在共表达的硫酯酶和/或共表达的诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶的情况下，适合的酯合酶在适合的条件下可以有效地利用诸如酰基ACP或酰基CoA的硫酯、游离脂肪酸和/或诸如短或长链醇的醇作为底物以产生所需的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。
本领域技术人员可以确定利用具体酯合酶以从硫酯底物直接产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的适合性。实施例14描述了可以用于确定是否产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物和/或在给定的产物系统中产生的量的代表性的测试以及其它适合的方法。
根据本发明的该方面，那么在酯合酶存在或不存在下和/或在诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶的存在或不存在下，多种酯合酶可以用于直接产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。例如，在重组宿主菌株中可以催化脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的直接产生的酯合酶的表达或超表达。如果菌株还表达硫酯酶和/或脂肪酸降解酶，这可以用于补充脂肪酸衍生物产生。例如，在其中游离脂肪酸是脂肪酯产生过程的非预期产物的场合，可以利用本文的酯合酶、变体、宿主细胞和微生物以及方法将有力脂肪酸转化为脂肪酯。此外，如果硫酯酶不表达或很低表达，可以使用在重组宿主细胞中可以催化脂肪酸和/或诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的直接产生的酯合酶的表达。
术语“硫酯酶”是指具有硫酯酶活性的酶。硫酯酶包括硫酯水解酶，其鉴定为酶分类号E.C.3.1.2并可从多种来源获得。植物硫酯酶描述于，例如Voelker&Davies,J.Bact.,176(23):7320-27(1994),美国专利第5,667,997号和第5,455,167号。硫酯酶还可以从微生物来源获得，例如描述于以下的那些：Akoh et al.,Prog.Lipid Res.,43(6):534-52(2004)；Diczfalusy&Alexson,Arch.Biochem.Biophys.,334(1):104-12(1996)；Larson&Kolattukudy,Arch.Biochem.Biophys.,237(1):27-37(1985)；Lawson et al.,Biochemistry 33(32):9382-88(1994)；Lee et al.,Eur.J.Biochem.,184(1):21-28(1989)；Naggert et al.,J.Biol.Chem.,266(17):11044-50(1991)；Nie et al.,Biochemistry,47(29):7744-51(2008)；Seay&Lueking,Biochemistry 25(9):2480-85(1986)；Spencer et al.,J.Biol.Chem.,253(17):5922-26(1978)；和Zhuang et al.,Biochemistry 47(9):2789-96(2008)。硫酯酶还可以从例如蓝细菌、藻类、哺乳动物、昆虫和真菌来源获得。硫酯酶可以具有除了硫酯酶活性之外的其他活性，例如蛋白水解活性或氧代酯水解活性。特别有用的硫酯酶是来自大肠杆菌的‘TesA(也被称为“硫酯酶I”或“无前导序列的硫酯酶”)酶，其是Cho&Cronan,J.Biol.Chem.,268(13):9238-45(1992)所描述的全长TesA丝氨酸硫酯酶的截短版本。大肠杆菌‘TesA多肽包含182个氨基酸，并且是其中大肠杆菌TesA的26个氨基酸的前导序列被移除的裂解反应的产物。
术语“硫酯酶活性”是指催化硫酯裂解反应的能力，其通常涉及在硫醇基团处将硫酯水解为酸和硫醇，但是还可以包括其中硫酯键被裂解并形成新的酯键的酰基转移步骤。通常，酰基ACP硫酯酶可以催化脂肪酰-酰基载体蛋白硫酯和/或脂肪酰CoA硫酯的水解裂解。具有硫酯酶活性的酶的实例包括乙酰CoA水解酶、十六烷酰CoA水解酶、琥珀酰CoA水解酶、甲酰CoA水解酶、酰基CoA水解酶、十六烷酰蛋白硫酯酶和泛素巯基酯酶。硫酯酶活性可以通过以下测定中的任何一个确定：
酰基CoA水解测定：
Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH 8.0)；十六烷酰CoA(5μM)和DTNB(0.01M，溶于0.1M pH7.0的磷酸钾缓冲液中)被用于制备完整的测定混合物。因此，测定混合物包含最终浓度的10μmol Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，0.05μmol DTNB和0.01μmol十六烷酰CoA。然后将完整的测定混合物与硫酯混合，终体积为2.0mL。通过使用13,600M-1cm-1的摩尔消光系数在412nm处监测吸收的改变来测量酰基CoA底物的裂解速率。
体内测定：
在表达目的蛋白之后，用1N HCL将预期具有硫酯酶活性的培养物酸化至约2.5的终pH值，然后用等体积的乙酸丁酯萃取。用BSTFA(N,O-双(三甲基(硅烷基)三氯乙酰胺)和1％TMCS(三甲基氯硅烷)衍生有机相中的有利脂肪酸以产生各自的TMS(三甲基硅烷)酯，其随后在安装有火焰离子化检测器的气相色谱上分析。
4-MU-6S-Palm-βGlc测定：
首先制备20μL底物溶液。底物溶液包含0.64mM MU-6S-Palm-β-Glc，15mM二硫苏糖醇，0.375％(w/v)Triton X-100和0.1U来自杏仁的β-葡糖苷酶，溶于McIlvain’s磷酸/柠檬酸缓冲液(pH 4.0)中。然后将预期具有硫酯酶活性的培养物混合物与底物溶液混合。反应混合物在37℃孵育1小时。添加外源的杏仁β-葡糖苷酶以定量地水解反应中间体MU-6-硫代-β-葡糖苷酶。通过添加含有0.025％Triton X-100的200μL 0.5M碳酸钠(pH 10.7)终止水解反应。然后在荧光计中测量释放的4-甲基伞形酮(MU)的荧光(λex＝372,λem＝445nm)。
溶血磷脂酶测定：
制备含有10μL预期具有硫酯酶活性的培养物混合物且混合有10μL 3mM 1-油酰-磷脂酰乙醇胺，25μL 100mM Tris-HCl(pH 7.0)和5μL 5mM EDTA的反应混合物。添加1.5mLCHCl3:CH3OH(1:2)终止反应，随后通过添加水将总水溶液体积定至0.9mL。然后使用由悬浮于95mL的1mM四硼酸钠中的40g硅胶H制备的平板，通过薄层色谱法用适合的标准分析有机相。溶剂系统由CHCl3:CH3OH:H2O(95:35:5)组成。
蛋白酶底物测定：
制备含有10μL预期具有硫酯酶活性的培养物混合物且混合有800μL 12.5mM的含有0.25％Triton X-100的Tris-HCl(pH 8.0)和10μL溶于DMSO的Cbz-Phe-ONp的反应混合物。通过监测405nm处的吸光度测量通过底物的裂解释放的p-硝基酚。
脂肪酰PCP水解测定：
首先制备含有溶于50mM磷酸钠的2％Triton X-100和10mM溶于丙酮的C12-p-硝基酚(酰基PNP)的试剂溶液。然后通过将600μL 10mM C12-PNP混合到9.4mL磷酸盐缓冲液中来制备C12-PNP工作液。通过将40μL酰基PNP工作也加入到96孔板的每个孔中，然后快速添加40μL预期具有硫酯酶活性的培养物混合物，进行测定。混合溶液15秒，然后在酶标仪于25℃读取405nm处的吸光度改变。
从硫酯形成酯：
制备含有预期具有硫酯酶活性的培养物混合物、100μM十四酰CoA、10％(v/v)甲醇和50mM磷酸钠(pH 7.0)的反应混合物。反应混合物在20℃孵育1小时，然后通过添加1N HCl把pH降低至约2.5来终止。用等体积的乙酸乙酯萃取混合物，并通过GC-MS或诸如GC-FID、LC-MS或薄层色谱法的其他标准方法确定产生的脂肪酯的量。
从酯形成酯：
制备含有预期具有硫酯酶活性的培养物混合物、300μM十二酰CoA、10％(v/v)甲醇和50mM磷酸钠(pH 7.0)的反应混合物。反应混合物在20癈孵育1小时，然后通过添加1N HCl把pH降低至约2.5来终止。用等体积的乙酸乙酯萃取混合物，并通过GC-MS或诸如GC-FID、LC-MS或薄层色谱法的其他标准方法确定产生的十二烷基酯的量。
因此，在本发明的宿主细胞中可以减弱和/或在功能上缺失内源硫酯酶。在某些实施方案中，硫酯酶选自tesA、‘tesA、fatB1、fatB2、fatB3、fatA1、fatA和atfata。硫酯酶和宿主细胞的非限制性实例在表1中列出。
表1：硫酯酶
*Mayer et al.,BMC Plant Biology 7:1-11(2007)
在其他实例中，在宿主细胞中产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物，所述宿主细胞含有导致所述宿主细胞中增加水平的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的一种或多种天然存在的突变。在一些实例下，所述宿主细胞被遗传工程化以相对于野生型宿主细胞增加所述宿主细胞中脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的水平。例如，可以遗传工程化宿主细胞以相对于野生型宿主细胞表达降低水平的诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶。在一实施方案中，通过遗传工程化“敲除的”宿主细胞以减弱或在功能上缺失一个或多个基因(例如，酰基CoA合酶基因)的表达水平。
可以降低或在功能上缺失宿主细胞中任何已知的酰基CoA合酶基因。酰基CoA合酶基因的非限制性实例包括，fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p或编码蛋白ZP_01644857的基因。酰基CoA合酶基因的具体实例包括，来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv[NP_217021]的fadDD35、来自结核分枝杆菌H37Rv[NP_217464]的fadDD22、来自大肠杆菌[NP_416319]的fadD、来自大肠杆菌[YP 416216]的fadK、来自不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADPl[YP_045024]的fadD、来自流感嗜血菌(Haemophilus influenza)RdkW20[NP_438551]的fadD、来自沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)Bis B18[YP 533919]的fadD、来自耐碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125[NP_243969]的BH3101、来自荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)Pfo-1[YP 350082]的Pfl-4354、来自睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosterone)KF-I[ZP_01520072]的EAV15023、来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)[NP_388908]的yhfL、来自铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAOl[NP_251989]的fadD1、来自青枯菌(Ralstonia solanacearum)GMl 1000[NP_520978]的fadD1、来自铜绿假单胞菌PAOl[NP251990]的fadD2、来自嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)R551-3的编码蛋白ZP_01644857的基因、来自酿酒酵母[NP_012257]的faa3p、来自酿酒酵母[NP_014962]的faa1p、来自枯草芽孢杆菌[CAA99571]的lcfA，或描述于Shockey et al.,Plant.Physiol.129:1710-1722,2002；Caviglia et al,J.Biol.Chem.279:1163-1169,2004；Knoll et al.,J.Biol.Chem.269(23):16348-56,1994；Johnson et al.,J.Biol.Chem.269:18037-18046,1994和Black et al.,J.Biol Chem.267:25513-25520,1992的那些基因。
醇底物可以供给给宿主细胞。在可选实施方案中，当脂肪醇用作底物时，可以通过共表达一个或多个脂肪醛生物合成基因和/或一个或多个脂肪醇生物合成基因由宿主细胞制备脂肪醇底物。可以将异源脂肪醛生物合成基因引入宿主细胞或修饰内源脂肪醛生物合成基因使得它们在宿主细胞中超表达。适合的脂肪醛生物合成基因包括但不限于：编码羧酸还原酶或其变体的那些基因，例如SEQ ID NO：54-97中的任一个。也可以将异源脂肪醇生物合酶引入宿主细胞或修饰内源脂肪醇生物合成基因使得它们在宿主细胞中超表达。适合的脂肪醇生物合成基因包括但不限于编码醇脱氢酶或其变体的那些基因，例如SEQ ID NO：98-147中的任一个。在其他实施方案中，通过共表达一种或多种酰基ACP还原酶基因和/或一种或多种脂肪醇生物合成基因由宿主细胞制备脂肪醇底物。可以将异源酰基ACP还原酶基因引入宿主细胞或可以修饰内源酰基ACP还原酶基因使得它们在宿主细胞中超表达。适合的酰基ACP还原酶基因基因包括但不限于编码酰基ACP还原酶或其变体的那些基因，例如SEQ ID NO：148-156中的任一个。产生脂肪醇的方法、宿主细胞和微生物之前已经描述于例如国际专利公开号WO/2010/042664，通过引用将其公开并入本文。
在另一实施方案中，本发明的酯合酶多肽及其变体可以在适合的醇底物的存在下催化游离脂肪酸转化为脂肪酯。因此，在一些实施方案中，当游离脂肪酸不是所需产物时，本发明的酯合酶多肽及其变体可以用于通过将游离脂肪酸转化为脂肪酯而降低脂肪酯生产过程中产生的游离脂肪酸的量。
分支脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的形成
通过使用分支硫酯和/或分支醇作为底物，可以产生含有分支点的脂肪酸及其衍生物。例如，虽然大肠杆菌天然产生直链脂肪酸(sFA)，但是可以通过在大肠杆菌中引入且表达或超表达提供分支前体的异源基因(例如bkd、ilv、icm和fab基因家族)工程化大肠杆菌，以产生支链脂肪酸(brFA)和/或brFA衍生物。此外，可以工程化宿主细胞以表达或超表达编码用于brFA或衍生物的延长的蛋白的基因(例如ACP、FabF等)，和/或缺失或减弱通常导致直链脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的相应宿主细胞基因。
形成brFA或brFA衍生物中的第一步是通过支链氨基酸氨基转移酶产生相应α-酮酸。宿主细胞可以内源包括编码这些酶的基因或这些基因可以被异源或重组引入。例如，大肠杆菌内源表达这样的酶I1vE(EC 2.6.1.42；GenBank登录YP_026247)。在一些宿主细胞中，可以不表达异源支链氨基酸氨基转移酶。但是，大肠杆菌I1vE或任何其他支链氨基酸氨基转移酶(例如，来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的I1vE(GenBank登录AAF34406)、来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的I1vE(GenBank登录NP_745648)或来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的I1vE(GenBank登录NP 629657))，如果不是内源的，可以被引入。
在另一实施方案中，α酮酸的产生可以通过使用Atsumi et al.,Nature 451:86-89,(2008)所述的方法实现。例如，2-酮异戊酸可以通过超表达编码IlvI、IlvH、IlvC或IlvD的基因产生。在另一实例中，2-酮-3-甲基-戊酸酯可以通过超表达编码IlvA和IlvI、IlvH(或枯草芽孢杆菌的AlsS)、IlvC、IlvD或它们的相应同系物的基因产生。在另一实施方案中，2-酮-4-甲基-戊酸酯可以通过超表达编码IlvI、IlvH、IlvC、IlvD和LeuA、LeuB、LeuC、LeuD或它们的相应同系物的基因产生。
第二步是将α酮酸氧化脱羧为相应的支链酰基CoA。该反应可以由支链α-酮酸脱氢酶复合物(bkd；EC 1.2.4.4.)(Denoya et al.,J.Bacteriol.177:3504,1995)催化，该复合物由E1α/β(脱羧酶)、E2(二氢硫辛酸转酰酶)和E3(二氢硫辛酸脱氢酶)亚基组成。这些支链α-酮酸脱氢酶复合物与丙酮酸和α-酮戊二酸脱氢酶复合物相似。包含brFA和/或brFA细胞组分和/或可以生长在支链氨基酸上的任何微生物可以用作分离用于在例如大肠杆菌的宿主细胞中表达的bkd基因的来源。此外，大肠杆菌具有E3组分，作为其丙酮酸脱氢酶复合物(lpd、EC 1.8.1.4、GenBank登录NP_414658)的一部分。因此，仅表达E1a/β和E2bkd基因就足够了。表2列除了来自几种微生物的、可以在宿主细胞中异源或重组引入并表达以提供支链酰基CoA前体的bkd基因的非限制性实例。
表2：来自选择的微生物的Bkd基因
在另一实例中，通过丁烯酰CoA还原酶(Ccr、EC 1.6.5.5、1.1.1.1)和异丁酰CoA变位酶(大亚基IcmA、EC 5.4.99.2；小亚基IcmB、EC 5.4.99.2)的共表达，异丁酰CoA可以在宿主细胞中产生，例如在大肠杆菌中(Han和Reynolds,J.Bacteriol.179:5157,(1997))。丁烯酰CoA是大肠杆菌和其他微生物中脂肪酸生物合成的中间体。来自所选微生物的ccr和icm基因的非限制性实例在表3中列出。
表3:来自选择的微生物的Ccr和icm基因
除bkd基因的表达外，brFA生物合成的起始利用对支链酰基CoA具有特异性的β-酮脂酰-酰基-载体-蛋白合酶III(FabH、EC 2.3.1.41)(Li et al.,J.Bacteriol.187:3795-3799,2005)。这些FabH酶的非限制性实例在表4中列出。参与任何含有brFA的微生物或以支链氨基酸为能源的有机体的脂肪酸生物合成的fabH基因可以在宿主细胞中表达。来自不天然产生brFA的宿主细胞的Bkd和FabH酶可能不支持brFA产生。因此，可以重组或异源表达bkd和fabH。可以将含有bkd和/或fabH基因的载体插入这样的宿主细胞中。同样，Bkd和FabH产生的内源水平可能不足以产生brFA。这种情况下，可以超表达内源bkd和/或fabH。或者，内源bkd和/或fabH可以被在功能上缺失并被异源bkd和/或fabH替代。优选地，引入到宿主细胞中的异源bkd和/或fabH编码比内源bkd和/或fabH所编码的那些酶更有效的BKD和/或FabH酶。此外，可以表达或超表达脂肪酸生物合成途径的其他组分，例如酰基载体蛋白(ACPs)和β-酮脂酰-酰基-载体-蛋白合酶II(fabF、EC 2.3.1.41)(非限制性实例在表4中列出)。除表达这些基因外，可以在宿主细胞中减弱内源脂肪酸生物合成途径中的一些基因(例如，大肠杆菌基因fabH(GenBank登录号NP_415609)和/或fabF(GenBank登录号NP_415613))。
表4.来自选择的具有brFA的微生物的FabH、ACP和fabF基因
环状脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的形成
通过使用适合的环状底物，可以产生环状脂肪酸和/或诸如环状脂肪酯的其衍生物。为了产生环状底物，可以将提供环状前体的基因(例如ans、chc和plm基因家族)引入宿主细胞并使其表达，以允许由环状前体起始脂肪酸生物合成。例如，为了将例如大肠杆菌的宿主细胞转变为能够合成ω-环状脂肪酸(cyFA)的细胞，可以在宿主细胞中引入并表达提供环状前体环己基羰基CoA(CHC-CoA)的基因(Cropp et al.,Nature Biotech.18:980-983,(2000))。在大肠杆菌中提供CHC-CoA的基因的非限制性实例包括：来自山丘链霉菌(Streptomyces collinus)的安莎三烯(ansatrienin)基因簇的ansJ、ansK、ansL、chcA和ansM(Chen et al.,Eur.J.Biochem.261:98-107,(1999))或来自链霉菌(Streptomycessp.)HK803的磷内酯霉素B(phoslactomycin B)基因簇的plmJ、plmK、plmL、chcA和plmM(Palaniappan et al.,J.Biol.Chem.278:35552-35557,(2003))，以及来自山丘链霉菌、阿维链霉菌(S.avermitilis)或天蓝色链霉菌的chcB基因(Patton et al.,Biochem.39:7595-7604,(2000))(参见表5)。然后，可以表达表4中所列的基因，以允许ω-环状脂肪酸的起始和延长。可选地，可以从产生cyFA的微生物中分离同源基因并在宿主细胞(例如大肠杆菌)中表达该同源基因。
表5.用于合成CHC-CoA的基因
*仅chcA在GenBank条目U72144中注释,ansJKLM是根据Chen et al.(Eur.J.Biochem.261:98-107,1999)。
表4中列出的基因，同上(fabH、ACP和fabF)允许ω-环状脂肪酸的起始和延长，因为它们具有宽泛的底物特异性。如果任何这些基因与表5中列出的基因的共表达不产生cyFA，则可以分离(例如通过使用简并PCR引物或异源DNA序列探针)并共表达来自产生cyFA的微生物的fabH、ACP和/或fabF同系物(例如表6中列出的那些)。
表6.含有ω-环状脂肪酸的微生物的非限制性实例
*利用环庚基羰基-CoA而不是环己基羰基-CoA作为cyFA生物合成的前体
脂肪酸和脂肪酸衍生物饱和水平
通过调节中间体的饱和度，可以控制脂肪酸和/或其衍生物的饱和度。例如，可以表达、超表达或以降低水平表达sfa、gns和fab基因家族以控制脂肪酸的饱和。示例性的基因包括但不限于：fabB(EC 2.3.1.41)，fabK(EC 1.3.1.9)，fabL(EC 1.3.1.9)，fabM(EC4.2.1.17)，它们可以用于本文所述的方法和宿主细胞。
例如，通过工程化生产宿主以超表达fabB或通过使生产宿主在低温生长(例如低于37℃)，可以工程化宿主细胞以产生不饱和脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。FabB偏重于顺式δ3癸烯酰ACP并导致大肠杆菌中不饱和脂肪酸产生。fabB的超表达导致显著百分比的不饱和脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的产生(de Mendoza et al.,J.Biol.Chem.258:2098-2101,(1983))。基因fabB可以在不是天然具有该基因的宿主细胞中插入和表达。然后，这些不饱和脂肪酸和/或脂肪酸衍生物可以在宿主细胞中被用作中间物。
在其他情况下，可以缺失脂肪酸生物合成的阻抑物，例如fabR (GenBank登录NP_418398)，这也可以导致大肠杆菌中不饱和脂肪酸和/或脂肪酸衍生物产生的增加(Zhanget al.,J.Biol.Chem.277:15558,(2002))。可以在其他宿主细胞中进行相似的缺失。例如，通过超表达fabM(反式-2、顺式-3-癸烯酰-ACP异构酶、GenBank登录DAA05501)和来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的fabK(反式-2-烯酰-ACP还原酶II，GenBank登录NP_357969)的受控表达(Marrakchi et al.,J.Biol.Chem.277:44809,2002)，同时缺失大肠杆菌fabI(反式-2-烯酰-ACP还原酶，GenBank登录NP_415804)，可以实现不饱和脂肪酸的进一步增加。在一些实例中，可以减弱内源fabF基因，从而增加所产生的棕榈油酸酯(C16:1)的百分比。
在其他实例中，通过降低sfa、gns或fab基因的表达，可以工程化宿主细胞以产生饱和脂肪酸。
例如，可以工程化宿主细胞以表达降低水平的fabA和/或fabB。在一些情况下，所述宿主细胞可以在不饱和脂肪酸的存在下生长。在其他情况下，还可以工程化所述宿主细胞以表达或超表达编码去饱和酶的基因。去饱和酶的一个非限制性实例是枯草芽孢杆菌DesA(AF037430)。编码去饱和酶的其他基因是领域内已知的并可用于本文所述的宿主细胞和方法，例如使用诸如十六酰基-ACP或十八酰基-ACP的酰基-ACP的去饱和酶。
遗传工程化宿主细胞以产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物
如本文所述，可以用各种宿主细胞产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本文所述的多肽可以在细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cv1细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或PC12细胞)中表达。其他示例性的宿主细胞包括来自以下属的成员的细胞：埃希氏菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌、红球菌、假单胞菌、曲霉、木霉、脉孢菌、镰刀菌、腐质霉、根毛霉、克鲁维酵母菌、毕赤酵母、毛霉菌、蚀丝霉、青霉、平革菌、侧耳、栓菌、金黄孢子菌、酵母、裂殖酵母、耶氏酵母或链霉菌。其他示例性的宿主细胞可以是迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、康氏木霉、绿色木霉、里氏木霉、长枝木霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、特异腐质霉、棉毛状腐质霉、米黑根毛霉、米黑毛酶、浅青紫链霉菌、鼠灰链霉菌或放线菌的细胞。其他宿主细胞是蓝细菌宿主细胞。
在优选的实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞、酿酒酵母细胞或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的实施方案中，所述宿主细胞来自大肠杆菌菌株B、C、K或W。其他适合的宿主细胞对于本领域技术人员是已知的。
本领域熟知的各种方法可以用于遗传工程化宿主细胞以产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。所述方法可以包括使用载体，优选表达载体，所述载体含有编码本文所述的酯合酶多肽或其多肽变体或片段的核酸。本领域技术人员会意识到多种病毒载体(例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体)和非病毒载体可以用于本文所述的方法。
本文所述的重组表达载体包括以适于核酸在宿主细胞中表达的形式的本文所述的核酸。所述重组表达载体可以包括一个或多个基于将被用于表达的宿主细胞所选择的控制序列。所述控制序列可操作地连接到待表达的核酸序列。这些控制序列描述于，例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology(基因表达技术：酶学方法)185,Academic Press,San Diego,CA(1990)。控制序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些控制序列，和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的那些控制序列(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员应当理解到，表达载体的设计可以取决于例如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等因素。可以将本文所述的表达载体引入宿主细胞，以产生本文所述核酸所编码的多肽，包括融合多肽。
可以设计重组表达载体用于在原核或真核细胞(例如，例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达脂肪酸生物合成多肽或变体。适合的宿主细胞在Goeddel,Gene Expression Technology:Methods inEnzymology(基因表达技术：酶学方法)185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中进一步作了详细讨论。可选地，所述重组表达载体可以在体外进行转录和翻译，例如通过使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
最经常用含有指导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体在例如大肠杆菌的原核生物中进行多肽的表达。融合载体将许多氨基酸添加到其中编码的多肽，通常添加到重组多肽的氨基末端。这些融合载体通常担任3个用途：(1)增加重组多肽的表达；(2)增加重组多肽的可溶性；和(3)通过作为亲和纯化中的配体，帮助重组多肽的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组多肽的连接处引入蛋白水解切割位点。这使得在融合多肽纯化后，重组多肽能够从融合部分分离。这些酶的实例及其同源识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。示例性的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith et al.,Gene 67:31-40(1988))、pMAL(New England Biolabs,Ipswich,MA.)和pRITS(Pharmacia,Piscataway,N.J.)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合到靶重组多肽。
诱导型、非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann et al.,Gene(1988)69:301-315(1988))和pET 11d(Studier et al.,Gene Expression Technology:Methodsin Enzymology(基因表达技术：酶学方法)185,Academic Press,San Diego,CA60-89(1990))。从pTrc载体表达靶基因依赖于由杂合trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。从pET 11d载体表达靶基因依赖于来自共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)所介导的T7gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由来自携带T7gn1基因的定居λ原噬菌体的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供，所述T7gn1基因受lacUV 5启动子的转录控制。
使重组多肽表达最大化的一种策略是，在具有受损的蛋白水解切割所述重组多肽的能力的宿主细胞中表达多肽(参见Gottesman,Gene Expression Technology:Methodsin Enzymology(基因表达技术：酶学方法)185,Academic Press,San Diego,CA 119-128(1990))。另一策略是改变待插入表达载体中的核酸序列，这样每个氨基酸的单独密码子是所述宿主细胞优选使用的那些密码子(Wada et al.,Nucleic Acids Res.20:2111-2118(1992))。通过标准DNA合成技术可以进行该核酸序列的改变。
在另一实施方案中，所述宿主细胞是酵母细胞。在该实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母中表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldari et al.,EMBOJ.6:229-234(1987))、pMFa(Kurjan et al.,Cell 30:933-943(1982))、pJRY88(Schultzet al.,Gene 54:113-123(1987))、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,CA)、picZ(Invitrogen Corp,San Diego,CA)和pRS425(Christianson et al.,Gene 110:119-122(1992))。
可选地，使用杆状病毒表达载体，可以在昆虫细胞中表达本文所述的多肽。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf 9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括，例如pAc系列(Smithet al.,Mol.Cell Biol.3:2156-2165(1983))和pVL系列(Lucklow et al.,Virology 170:31-39(1989))。
在又一实施方案中，使用哺乳动物表达载体，可以在哺乳动物细胞中表达本文所述的核酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed,Nature 329:840(1987))和pMT2PC(Kaufman et al.,EMBO J.6:187-195(1987))。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能可以由病毒调节元件提供。例如，通常使用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于原核和真核细胞都适合的其他表达系统描述于Sambrook et al.,eds.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd(分子克隆：实验手册，第2版),ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1989的16和17章中。
通过常规转化或转染技术可以将载体引入原核或真核细胞。如本文所用，术语“转化”和“转染”是指许多本领域公认的用于将外源核酸(例如DNA)引入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的适合的方法可以见于例如Sambrook et al.(同上)。
对于细菌细胞的稳定转化，已知的是，根据所用的表达载体和转化技术，仅小部分的细胞会摄入并复制所述表达载体。为了鉴定和选择这些转化体，可以将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因伴随目的基因引入宿主细胞中。选择标记包括赋予药物抗性的那些标记，所述药物诸如氨苄西林、卡那霉素、氯霉素或四环素。编码选择标记的核酸可以在与编码本文所述的多肽相同的载体上被引入宿主细胞或可以在单独的载体上被引入。可以通过药物选择鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，具有并入的选择标记基因的细胞会存活，而其他细胞死亡)。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知的是，根据使用的表达载体和转染技术，仅小部分的细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，可以将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因伴随目的基因引入宿主细胞中。优选的选择标记包括赋予药物抗性的那些标记，所述药物诸如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。编码选择标记的核酸可以在与编码本文所述的多肽相同的载体上被引入宿主细胞或可以在单独的载体上被引入。可以通过药物选择鉴定用引入的核酸稳定转染的细胞(例如，具有并入的选择标记基因的细胞会存活，而其他细胞死亡)。
转运蛋白
转运蛋白可以将多肽(例如酯合酶)和有机化合物(例如脂肪酸、脂肪酸衍生物)输出宿主细胞。很多转运和外排蛋白用于排出种类广泛的化合物并且可以被天然修饰，从而对于特定类型的碳氢化合物具有选择性。
适合的转运蛋白的非限制性实例是ATP结合盒(ABC)转运蛋白、外排蛋白和脂肪酸转运蛋白(FATP)。适合的转运蛋白的其他非限制性实例包括来自诸如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、拟南芥(Arabidopsis thalania)、真养产碱杆菌(Alkaligenes eutrophus)和红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的有机体的ABC转运蛋白。示例性的可以使用的ABC转运蛋白包括但不限于CER5、AtMRP5、AmiS2、AtPGP1、AcrA、AcrB、TolC、AcrE、AcrF、tll1618、tll1619和tll0319。宿主细胞也可以对于其分泌有机化合物的内源能力进行选择。有机化合物产生和分泌进入宿主细胞环境(例如培养基、发酵液)的效率可以表达为细胞内产物与细胞外产物的比值。在一些实施例中，该比值可以为约5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。
发酵
通过使用有益发酵技术，可以增强根据本发明产生的脂肪酸和/或其衍生物的产生和分离。使产量最大化同时降低费用的一种方法是增加被转化为碳氢化合物产物的碳源的百分比。
在正常的细胞生命周期中，碳被用于细胞功能，例如产生脂质、糖类、蛋白质、有机酸和核酸。降低生长相关活性所需的碳的量可以增加碳源转化为产物的效率。这可以通过例如首先使宿主细胞生长到所需密度(例如，在生长对数期峰值所达到的密度)来实现。在这点上，可以使用复制检查点基因(replication checkpoint gene)阻止细胞生长。具体而言，群体感应机制(quorum sensing mechanisms)(综述于Camilli et al.,Science 311:1113,(2006)；Venturi FEMS Microbio.Rev.30:274-291,(2006)；和Reading et al.,FEMSMicrobiol.Lett.254:1-11,(2006))可以用于激活例如p53、p21的检查点基因或其他检查点基因。
可以被激活以阻止大肠杆菌中细胞复制和生长的基因包括umuDC基因。umuDC基因的超表达阻止从静止期到指数性生长的进展(Murli et al.,J.of Bact.182:1127,(2000))。UmuC是可以对非编码损伤进行跨损伤修复(translesion synthesis)的DNA聚合酶，所述非编码损伤是大部分UV和化学诱变的机制基础。umuDC基因产物参与跨损伤修复的过程并且还作为DNA序列损伤检查点。umuDC基因产物包括UmuC、UmuD、umuD'、UmuD'2C、UmuD'2和UmuD2。同时，产生产物的基因可以被激活，从而在产生脂肪醛的同时，使对于待使用的复制和保持途径的需要最小化。通过用适合的终产物产生基因重新合成umuC和umuD，可以工程化宿主细胞以在prpBCDE启动子系统下的pBAD24中表达来自大肠杆菌的umuC和umuD。
输入碳转化为脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的百分比是成本动因。该过程越有效，(即输入碳转化为脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的百分比越高)该过程的费用越低。对于含氧碳源(例如葡萄糖和其他基于碳水化合物的来源)，氧必须以二氧化碳的形式释放。对于每释放2个氧原子，1碳原子也被释放，这导致约34％(w/w)的最大理论代谢效率(对于脂肪酸来源的产物)。但是，这个数字对于其他有机化合物和碳源会发生变化。文献中的通常效率约低于5％。经工程化产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的宿主细胞可以具有大于约1、3、5、10、15、20、25和30％的效率。在其他实例中，宿主细胞可以表现出约10％至约25％的效率。在其他实例中，这些宿主细胞可以表现出约25％至约30％的效率。在其他实例中，宿主细胞可以表现出大于30％的效率。
可以另外工程化宿主细胞以表达重组纤维小体，例如PCT申请第PCT/US2007/003736号中描述的那些。这些纤维小体可以允许宿主细胞使用纤维素原料作为碳源。例如，可以另外工程化宿主细胞以表达转化酶(EC 3.2.1.26)，这样蔗糖可以被用作碳源。相似地，可以使用美国专利第5,000,000号、第5,028,539号、第5,424,202号、第5,482,846号和第5,602,030号中描述的教导工程化宿主细胞，这样宿主细胞可以有效地吸收碳并使用纤维素原料作为碳源。
在一个实例中，发酵室可以将正在进行连续还原的发酵封闭。这种情况下，可以创造稳定的还原环境。通过二氧化碳的释放(以气体形式)可以保持电子平衡。提高NAD/H和NADP/H平衡的努力也可以有助于稳定电子平衡。通过工程化宿主细胞以表达NADH:NADPH转氢酶，也可以增强细胞内NADPH的可利用性。一个或多个NADH:NADPH转氢酶的表达将糖酵解中产生的NADH转变为NADPH，所述NADPH可以增强脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的产生。
对于小规模生产，工程化的的宿主细胞可以在例如约100mL、500mL、1L、2L、5L或10L的批量中生长；发酵；并且基于适合的质粒中所编码的特定基因，经诱导而表达所需的生物合成基因。对于大规模生产，工程化的宿主细胞可以在约10L、100L、1000L、10,000L、100,000L、1,000,000L或更大的批量中生长；发酵；并且基于适合的质粒中所编码的或并入所述宿主细胞基因组中的特定基因，经诱导而表达所需的生物合成基因。
例如，诸如大肠杆菌细胞的适合的生产宿主，其携带含有所需的生物合成基因的质粒或具有整合到其基因组的生物合成基因，可以在适合的反应器内，例如，在1L的反应器内，在补充了2％葡萄糖、羧苄青霉素和氯霉素的M9培养基中于37℃孵育20小时。当培养物的OD600达到约0.9时，用IPTG诱导生产宿主以活化工程化的基因系统用于产生脂肪酸/脂肪酸衍生物。孵育后，可以提取废培养基并且使用诸如GC-MS的抑制检测方法检查有机相的脂肪酸/脂肪酸衍生物的存在。
在一些情况下，第一小时的诱导后，可以每小时移除不多于约10％的全部细胞体积的等分部分，并允许其静置而不摇动以允许脂肪酸酯上升至表面并经历自发的相分离或沉淀。然后可以收集脂肪酸/脂肪酸衍生物组分，并且将水相返回到反应室。可以连续操作反应室。当OD600下降至约0.6以下时，可以用生长自种子培养物的新批次替换细胞。
葡萄糖
在一些实例中，本文所述的方法利用葡萄糖作为碳源进行。在某些实例中，微生物在含有约2g/L至约50g/L，例如约5g/L至约20g/L的初始葡萄糖浓度的培养基中生长。在一些实例中，培养基的葡萄糖浓度随着微生物小号葡萄糖而从初始葡萄糖浓度下降，并且在脂肪酸/脂肪酸衍生物生产工艺过程中，培养基中维持约0g/L至约5g/L的葡萄糖浓度。在某些实例中，以约50％-约65％的葡萄糖溶液向微生物供给葡萄糖。
在一些实例中，葡萄寡糖的供给速率被设定为匹配细胞生长素率以避免发酵容器中葡萄糖的过度积累(即＞0％的葡萄糖)。在其他实例中，维持低浓度的过量葡萄糖(例如，约2g/L-约5g/L)。
在某些实例中，可以从除了葡萄糖之外的碳源产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物，所述碳源包括但不限于：果糖、水解的蔗糖、水解的糖浆和甘油。
产生后加工
在发酵中产生的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物可以从发酵培养基中分离。可以使用用于从水性培养基分离脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的任何已知技术。一个示例性分离过程是两相(two phase)(二相(bi-phasic))分离过程。该过程涉及使遗传工程化的宿主细胞在足以产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的条件下发酵，允许脂肪酸和/或脂肪酸衍生物收集在有机相中并从水性发酵液分离该有机相。该过程可以在批次和连续发酵过程中实施。
两相分离利用脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的相对不混溶性促进分离。不混溶是指化合物相对不溶于水的能力并且由化合物的分配系数定义。本领域技术人员应当理解到，通过选择发酵液和有机相，使产生的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物具有高logP值，在发酵容器中脂肪酸和/或脂肪酸衍生物即使处于非常低的浓度也可以分离到有机相。
通过本文所述的方法产生的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物在发酵液以及细胞质中可以是相对不混溶的。因此，脂肪酸和/或脂肪酸衍生物可以细胞内或细胞外地收集在有机相中。有机相中产物的收集可以减轻脂肪酸和/或脂肪酸衍生物对细胞功能的影响并可以允许宿主细胞产生更多产物。
本文所述的方法可以导致同种化合物的产生，其中至少约60％、70％、80％、90％或95％的产生的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物会具有改变少于约8个碳、少于约6个碳、少于约4个碳或少于约2个碳的碳链长度。也可以产生具有相对一致的饱和度的这些化合物。这些化合物可以直接用作燃料、燃料添加剂、用于生产其他化学化合物(例如聚合物、表面活性剂、塑料、纺织品、溶剂、粘合剂等)的起始原料或个人护理添加剂。这些化合物也可以用作例如氢化、催化裂解(通过氢化、热解或两者)的后续反应的原料以制造其他产品。
在一些实施方案中，使用本文所述的方法产生的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物可以含有约50％至约90％的碳；或约5％至约25％的氢。在其他实施方案中，使用本文所述的方法产生的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物可以含有约65％至约85％的碳；或约10％至约15％的氢。
使用无细胞方法产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物
本文所述的某些方法还包括使用本文所述的纯化的酯合酶多肽或其片段以及由诸如本文所述的方法提供或产生的底物产生脂肪酸或其衍生物。例如，宿主细胞可以被工程化以表达如本文所述的适合的酯合酶或其片段。可以在允许酯合酶多肽表达的条件下培养宿主细胞。然后，可以使用已知方法产生无细胞提取物。例如，可以使用去垢剂或通过超声处理裂解宿主细胞。然后，可以使用已知方法纯化或基本上纯化所表达的多肽。获得无细胞提取物后，可以将本文所述的底物提供给所述无细胞提取物并在允许所述底物转变为所需脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的条件下孵育。然后可以使用已知技术分离和纯化脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。因此，本发明的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物可以在体外细胞外地产生并分离。
生物产品
包含生物学产生的有机化合物生物产品，特别是包含使用脂肪酸合成途径生物学产生的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物，还未从可再生资源产生过，并且由于如此，其是新的物质组合物。基于双重碳同位素指纹谱或14C测定年代法，这些新生物产品可以区别于来自石化产品的碳的有机化合物。此外，可以通过双重碳同位素指纹谱确定生物来源的碳的具体来源(例如葡萄糖与甘油相比)(参见，例如美国专利第7,169,588号，该美国专利以引用的方式并入本文中)。
区别生物产品与基于石油的有机化合物的能力对于在商业中追踪这些材料是有益的。例如，包含基于生物学的和基于石油的碳同位素谱两者的有机化合物或化学品可以区别于仅由基于石油的原料制造的有机化合物和化学品。因此，可以根据所述即时材料独特的碳同位素谱在商业中追踪它们。
通过比较每份燃料中稳定的碳同位素比(13C/12C)，可以区别生物产品与基于石油的有机化合物。给定的生物产品中13C/12C比是二氧化碳固定时大气二氧化碳中的13C/12C比的结果。它还反映精确的新陈代谢途径。还存在区域变化。石油、C3植物(阔叶植物)、C4植物(草)和海洋碳酸盐均表现出13C/12C比和相应的δ13C值的显著差异。此外，作为新陈代谢途径的结果，C3和C4植物的脂质物质与来自相同植物的碳水化合物的材料分析上是不同的。
在测量的精度之内，由于同位素分馏效应，13C表现出大量变化，对于生物产品最显著的同位素分馏效应是光合作用机制。植物碳同位素比中差异的主要原因与植物中光合碳新陈代谢途径中的差异密切相关，特别是在原初羧化期间发生的反应(即，大气CO2最初的固定)中的差异。两大类植物是包含“C3”(或开尔文-本森)光合循环的那些植物和包含“C4”(或哈奇-斯莱克)光合循环的那些植物。
C3植物中，原初CO2固定或羧化反应涉及核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶，并且第一个稳定的产物是3-碳化合物。诸如阔叶树和针叶树的C3植物主要在温带气候带。
在C4植物中，涉及另一个酶即磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的另外的羧化反应是原初羧化反应。第一个稳定的碳化合物是随后被脱羧基的4-碳酸。然后，通过C3循环重新固定释放的CO2。C4植物的实例是热带草类、玉米和甘蔗。
C4和C3植物都表现出13C/12C同位素比的范围，但是对于C4植物，典型值为约-7‰至约-13‰；对于C3植物，典型值为约-19‰至约-27‰(参见，例如，Stuiver et ah,Radiocarbon 19:355,1977)。煤炭和石油通常落入此较后的范围。13C测量标尺最初通过由Pee Dee Belemnite(PDB)石灰石所设定的零所定义，其中值是以从该物质的偏差的千分比给出。“δ13C”值以每千分比部分(千分)表达，简写为‰，并且按照以下计算：
δ13C(‰)＝[(13C/12C)样品-(13C/12C)标准]/(13C/12C)标准×1000
由于PDB标准物质(RM)已被耗尽，IAEA、USGS、NIST和其他选择的国际同位素实验室合作开发了一系列的替代RM。从PDB的千分偏离的符号为δ13C。通过高精度稳定同位素比质谱仪(IRMS)对质量为44、45和46的CO2分子离子进行测量。
本文所述的组合物包括由本文所述的任何方法产生的生物产品。具体而言，生物产品的δ13C可以为约-28或更大、约-27或更大、-20或更大、-18或更大、-15或更大、-13或更大、-10或更大或-8或更大。例如，生物产品的δ13C可以为约-30至约-15、约-27至约-19、约-25至约-21、约-15至约-5、约-13至约-7、约-13至约-10。在其他情况下，生物产品的δ13C可以为约-10、-11、-12或-12.3。
还可以通过比较每种化合物中14C的量来区分生物产品与石油来源的有机化合物。因为14C具有5730年的核半衰期，包含“较老的”碳的基于石油的燃料可以区别于包含“较新的”碳的生物产品(参见，例如Currie,"Source Apportionment of AtmosphericParticles(气体微粒的来源分布)",Characterization of Environmental Particles,J.Buffle and H.P.van Leeuwen,Eds.,1of Vol.I of the IUPAC EnvironmentalAnalytical Chemistry Series (Lewis Publishers,Inc)(1992)3-74)。
放射性碳测定年代法的基本假定是大气中的14C浓度的恒定导致活有机体中14C的恒定。然而，由于1950年开始的大气层核试验和1850年开始的化石燃料的燃烧，14C获得了第二地球化学时代特征。大气CO2中并且因此活的生物圈中14C的浓度在核试验的峰期，20世纪60年代中期，大约加倍。然后，14C的浓度以约7-10年的松弛“半衰期”逐渐回落到约1.2x 10-12的恒稳态宇宙(大气)基线同位素比。(不必照字面意思理解这个后来的半衰期；而是，自从核时代开始后，人们必须使用精细的大气核输入/衰变函数以追踪大气和生物圈14C的变化)。
正是这个后来的生物圈14C时代特征保证能每年对近期生物圈碳进行年代测定。可以通过加速器质谱(AMS)测量14C，结果以“现代碳比例”(fM)为单位给出。fM由国家标准技术研究院(National Institute of Standards and Technology)(NIST)标准参考物质(Standard Reference Materials)(SRMs)4990B和4990C定义。如本文所用的“现代碳比例(fraction of modern carbon)”或“fM”与分别由称为草酸标准HOxI和HOxII的国家标准技术研究院(National Institute of Standards and Technology(NIST))标准参考物(SRMs)4990B和4990C所定义的具有相同意义。基本定义涉及0.95倍的14C/12C同位素比例HOxI(参考AD 1950)。这粗略地等于衰变校正的工业革命前树木(decay-corrected pre-Industrial Revolution wood)。对于现今生命生物圈(植物物质)而言，fM约为1.1。
本发明可以提供具有至少约1的fM 14C的包含根据本文方法产生的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的生物产品。例如，所述生物产品可以具有至少约1.01的fM 14C、约1至约1.5的fM 14C、约1.04至约1.08的fM 14C或约1.111至1.124的fM 14C。
14C的另一测量也被称为现代碳百分比，pMC。对于使用14C定年法的考古学家或地质学家而言，公元1950年等于“零年龄”。这也代表100pMC。大气中“爆炸碳(bomb carbon)”在热核子武器高峰的1963年几乎达到正常水平的两倍。从爆炸碳出现开始，对其在大气中的分布进行了评估，表现出大于公元1950年以后活着的植物和动物的100pMC的值。其随着时间逐渐下降到约107.5pMC的现值。这意味着，诸如玉米的新鲜生物量材料，会产生约107.5pMC的14C特征。基于石油的化合物的pMC值为0。将化石碳与现代的碳结合会导致现代pMC含量的稀释。通过假定107.5pMC代表现代生物量材料的14C含量而0pMC代表基于石油的产品的14C含量，则该材料测量的pMC值会反映两种组分类型的比例。例如，100％来源于现代大豆的材料会产生约107.5pMC的放射性碳标记。如果该材料用基于石油的产品50％稀释，它会产生约54pMC的放射性碳标记。
通过指定“100％”等于107.5pMC和指定“0％”等于0pMC，推导出基于生物学的碳含量。例如，测得99pMC的样品会产生相当于93％的基于生物学的碳含量。该值称为平均的基于生物学的碳结果，并且假定分析的材料中所有组分或者来源于现代的生物学材料或者来源于基于石油的材料。
本文所述的包含根据本文方法产生的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的生物产品可以具有至少约50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100的pMC。在其他情况下，本文所述的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物可以具有约50至约100、约60至约100、约70至约100、约80至约100、约85至约100、约87至约98、约90至约95的pMC。在仍然其他情况下，包含脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的生物产品可以具有约90、91、92、93、94或94.2的pMC。
例如，由本文所述方法产生的脂肪酸和/或其衍生物可以用作生物燃料。例如，本文所述的脂肪酸和/或其衍生物可以单独地用作生物柴油或用作生物柴油的组分。根据本文所述方法产生的脂肪酸和/或其衍生物还可以用作多种工业化学品或工业化学品的组分或原料，所述工业化学品包括但不限于燃料添加剂。所得的生物燃料或工业化学品是生物产品，并因此会具有约-28或更大、约-27或更大、-20或更大、-18或更大、-15或更大、-13或更大、-10或更大或-8或更大的δ13C。例如，生物产品可以具有约-30至约-15、约-27至约-19、约-25至约-21、约-15至约-5、约-13至约-7、约-13至约-10的δ13C。此外，所得的生物燃料或工业化学品会具有至少约1的fM 14C的生物产品。例如，所述生物产品可以具有至少约1.01的fM 14C、约1至约1.5的fM 14C、约1.04至约1.08的fM 14C或约1.111至1.124的fM 14C。
燃料组合物
根据本文所述方法和组合物产生的脂肪酸和/或其衍生物具有用作燃料的多种有利特征。本领域技术人员会意识到，根据燃料的的与其用途，不同的脂肪酸和/或其衍生物可以相对于其他脂肪酸和/或衍生物具有优势。例如，支链脂肪酸和/或其衍生物可能是更适合的预期在寒冷气候使用的汽车燃料或预期在寒冷气候使用的汽车燃料的组分。类似地，对于某些应用，产生多或少氧化的或多或少饱和的燃料是有利的。
使用本文所述的方法，可以产生具有所需性质和质量的同时包含相对均质的脂肪酸和/或其衍生物的燃料。这类基于脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的燃料可以用碳指纹谱来表征，并且相对于来源于石油的燃料或来源于甘油三酯的生物柴油，它们没有杂质也是有利的。基于脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的燃料可以与其他燃料或燃料添加剂联合使用以产生具有所需性质的可选燃料组合物。
本文公开的产物宿主和方法可以用于产生游离脂肪酸和/或多种脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，本文公开的产物宿主和方法可以用于产生更高和/或改善的游离脂肪酸和/或包括诸如脂肪酯的脂肪酸衍生物的滴度或产量。在一些实施方案中，由产物宿主产生的产品中游离脂肪酸的百分比至少为约1％，例如至少约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或25％。在一些实施方案中，由产物宿主产生的产品中脂肪酸衍生物的百分比至少为约50％，例如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在一些实施方案中，由产物宿主产生的产品中脂肪酸衍生物与游离脂肪酸的比为约10:1、9:1、8:1、7:1、5:1、2:1或1:1。
在某些实施方案中，由产物宿主产生的脂肪酸衍生物是脂肪酸乙基衍生物。示例性的脂肪酸乙基衍生物是脂肪乙酯。在具体实施方案中，脂肪乙酯是十二酸乙酯、十三酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、顺式-9-十六碳烯酸乙酯、十六酸乙酯、十七酸乙酯、顺式-11-十八碳烯酸乙酯或硬脂酸乙酯。在具体实施方案中由产物宿主产生的脂肪酸衍生物产品是多种脂肪酸衍生物的组合。例如，脂肪酸衍生物产品包含以下的任意组合的混合物：十二酸乙酯、十三酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、顺式-9-十六碳烯酸乙酯、十六酸乙酯、十七酸乙酯、顺式-11-十八碳烯酸乙酯和硬脂酸乙酯。在某些实施方案，产生的脂肪酸衍生物是脂肪甲基衍生物。示例性的脂肪甲基盐食物是脂肪甲酯。在具体实施方案中，由产物宿主产生的脂肪甲酯是十二酸甲酯、十三酸甲酯、十四酸甲酯、十五酸甲酯、顺式-9-十六碳烯酸甲酯、十六酸甲酯、十七酸甲酯、顺式-11-十八碳烯酸甲酯或硬脂酸甲酯。在某些实施方案中，由产物宿主产生的脂肪酸衍生物产品是多种脂肪酸衍生物产品的组合。例如，脂肪酸衍生物是以下的一种或多种的混合物：十二酸甲酯、十三酸甲酯、十四酸甲酯、十五酸甲酯、顺式-9-十六碳烯酸甲酯、十六酸甲酯、十七酸甲酯、顺式-11-十八碳烯酸甲酯和硬脂酸甲酯。在某些其他实施方案中，脂肪酸衍生物是一种或多种脂肪甲酯和一种或多种脂肪乙酯的混合物。在某些实施方案中，产品是一种或多种游离脂肪酸和/或一种或多种脂肪酸衍生物的混合物。在又一实施方案中，产品是一种或多种游离脂肪酸和/或一种或多种脂肪甲酯和/或一种或多种脂肪乙酯的混合物。
本文公开的产物宿主和方法可以用于产生不同比例的游离脂肪酸和脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，产品中游离脂肪酸的比例可以根据本文所述的方法、组合物、载体和细胞改变，使得该比例相对于产生的脂肪酸衍生物更高或更低。在某些相关实施方案中，产品中脂肪酸衍生物的比例也可以根据本文的公开改变，使得该比例相对于产生的诸如游离脂肪酸的其他产品更高或更低。在某些其他实施方案中，可以增加或降低具有某些碳链长度的脂肪酸衍生物的比例产量。
本文所用的术语“比例产量”是指所需产品与由本发明的重组宿主产生的同一混合物中其他产品的相对量。例如，可以改善所需产品的比例产量，使得其比产品混合物中其他组分更占优势，以降低纯化负担。在另一实例中，可以降低非所需产品(即，将需要从所需产品中移除的组分)的比例产量使得其比产品混合物中所需组分更不占优势以达到相同目的。
碳指纹谱
生物产生的脂肪酸衍生物可以提供诸如醇、柴油和汽油的燃料的新来源。根据本文所述的方法和组合物制备的生物燃料迄今为止尚未从可再生来源产生并且是新的组合物物质。基于双重碳同位素指纹谱，这些新燃料可以区别于来自石化产品的碳的燃料。此外，可以通过双重碳同位素指纹谱确定生物来源的碳的具体来源(例如葡萄糖与甘油相比)(参见，例如美国专利第7,169,588号，通过引用将其全文并入本文，特别是第4栏第31行至第6栏第8行)。
基于14C(fM)和双重碳同位素指纹谱，脂肪酸和/或脂肪酸衍生物及相关的生物燃料、化学品和混合物可以区别于其来源于石油化学品的对应物。
本文所述的脂肪酸和/或其衍生物在产生生物燃料和化学品中具有实用性。基于双重碳同位素指纹谱，本发明提供的产品可以区别于单独来源于石油化学品来源的那些材料。区别这些产品的能力对于在商业中追踪这些材料是有益的。例如，包含“新”和“旧”的碳同位素谱两者的燃料或化学品可以区别于仅由“旧”原料制造的燃料和化学品。因此，可以基于本材料独特的谱在商业上跟踪或“追踪”或在商业上鉴定作为生物燃料的本材料。此外，可以鉴定出其他竞争材料是生物来源的或来自石油化学资源。
在一些实例中，制备了生物燃料组合物，其包含具有约-10.9至约-15.4的δ13C的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物占组合物中生物来源的材料(即，来源于诸如纤维材料和糖的可再生资源)的至少约85％。在其他实例中，生物燃料组合物包含具有以下通式的脂肪酸衍生物：
X—(CH(R))nCH3
其中
X＝CH3、-CH2OR1；-C(O)OR2；或-C(O)NR3R4；
R＝对于各个n，独立地无、H或低级脂肪；
n＝从约8至约34的整数，优选地从约10至约24的整数；
R1、R2、R3、R4＝独立地选自H或低级烷基。
通常，当R是低级脂肪基团是，R代表支链、非支链或环状低级烷基或低级烯基部分。示例性的R基团包括但不限于：甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、环戊烯基等。脂肪酸衍生物还特征为具有约-10.9至约-15.4的δ13C，并且所述脂肪酸衍生物占组合物中生物来源的材料的至少约85％。在一些实例中，生物燃料中的脂肪酸衍生物特征为具有一部分现代碳(fM 14C至少约1.003、1.010或1.5)。
杂质
根据本文公开产生的脂肪酸和/或其衍生物可用作制备生物燃料以及其他工业化学品的组分或原料。这些产品可以从适合的底物直接制备而不是从甘油三酯的化学加工过程制备。因此，包含公开的脂肪酸和/或衍生物的燃料和其他工业化学品通常包含较少的杂质，所述较少为相对于通常与诸如来源于植物油和脂肪的燃料的来源于甘油三酯的产品相联系的杂质。
根据本文的公开制备的粗生物燃料(在将脂肪酸和/或衍生物与诸如基于石油的燃料的其他燃料混合之前)含有比基于石油的柴油或经由一个或多个酰基转移步骤产生的其他生物柴油更少的酰基转移催化剂。生物燃料可以含有少于约2.0wt.％，例如，少于约1.5、1.0、0.5、0.3、0.1、0.05或0wt.％的酰基转移催化剂或由酰基转移催化剂造成的杂质。酰基转移催化剂的实例包括但不限于：氢氧化物催化剂，例如NaOH、KOH和LiOH；和酸催化剂，例如无机酸催化剂和路易斯酸催化剂。催化剂和由酰基转移催化剂造成的杂质的非限制性实例包括但不限于：锡、铅、汞、镉、锌、钛、锆、铪、硼、铝、磷、砷、锑、铋、钙、镁、锶、铀、钾、钠和锂。
相对于其他类型的生物燃料的凝胶点，根据本文公开制备的生物燃料(在将脂肪酸和/或脂肪酸衍生物与一种或多种其他燃料混合之前)趋向于具有低胶凝点，特别是当脂肪酸和/或脂肪酸衍生物产品包含C16:1乙酯或C18:1乙酯时。
类似地，根据本文公开制备的粗生物燃料含有比从甘油三酯制备的生物燃料更少的甘油(glycerol)(或甘油(glycerin))。生物燃料可以包含少于约2.0wt.％，例如少于约1.5、1.0、0.5、0.3、0.1、0.05或0wt.％的甘油。
本文的粗生物燃料也可以含有比从甘油三酯制备的生物柴油更少的游离醇(例如，用于产生酯的醇)。这部分地是由于本公开的产物宿主对醇的高效利用。例如，生物燃料可以包含少于约2.0、1.5、1.0、0.5、0.3、0.1、0.05或0wt.％的游离醇。
本文的生物燃料还特征为其相对于来源于石油的柴油更低的硫浓度。例如，生物燃料可以具有少于约2.0wt.％，例如少于约1.5、1.0、0.5、0.3、0.1、0.05或0wt.％的硫。
添加剂和燃料组合物
燃料添加剂用于增强燃料或发动机的性能。例如，燃料添加剂可以用于改变冻/凝点、浊点、润滑性、粘性、氧化稳定性、点火性能、辛烷水平和闪点。在美国，所有的燃料添加剂必须在环境保护署(Environmental Protection Agency)注册。通过联系EPA或通过浏览EPA的网站可公开获取燃料添加剂的名称和销售该燃料添加剂的公司。本领域技术人员应当理解到，本文所述的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物可以与一种或多种燃料添加剂混合以赋予所需品质。
本文所述的脂肪酸和/或其衍生物可以配制成或加工成增强燃料或发动机性能的适合的燃料添加剂。例如，本文所述的脂肪酸和/或衍生物可以配制成润滑性改良剂，其赋予诸如对发动机部分的磨损保护的所需性质。因此，提供了包含根据本公开产生的脂肪酸和/或其衍生物的添加剂组合物。在另一实例中，本文所述的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物可以配制进缓蚀剂。
本文所述的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物可以与其它燃料混合，所述其它燃料例如一种或多种来源于甘油三酯的生物柴油，诸如乙醇和丁醇的多种春，以及诸如汽油或柴油的来源于石油的产品。在某些环境下，产生具有低胶凝点的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物，例如C16:1乙酯或C18:1乙酯。该低胶凝点产品可以与一种或多种由甘油三酯制备的生物柴油混合以降低所得的燃料的胶凝点，所述降低为相对于仅含有一种或多种由甘油三酯制备的生物柴油的燃料。类似地，诸如C16:1乙酯或C18:1乙酯的脂肪酸衍生物可以与机遇石油的柴油混合以提供还有至少约5％重量，并通常高于约5％重量的生物柴油的混合物。在一些实施例中，所述燃料混合物包括至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％或60％重量的脂肪酸衍生物。
在一些实施方案中，燃料组合物还可以包含合成燃料。来自煤炭、天然气或生物质的任何合成燃料可以合适地使用。在另一实施方案中，合成燃料包括基于Fischer-Tropsch的燃料、基于Bergius的燃料、基于Mobil的燃料、基于Karrick的燃料或以上的组合物。在又一实施方案中，合成燃料包括基于Coal-To-Liquids的燃料(基于CTL的燃料)、基于Gas-To-Liquids的燃料(基于GTL的燃料)、基于Biomass-To-Liquids的燃料(基于BTL的燃料)、基于Coal and Biomass-To-Liquids的燃料(基于CBTL的燃料)或以上的组合物。在示例性的实施方案中，合成燃料包含基于Fischer-Tropsch的燃料。
本文公开的燃料组合物中合成燃料的量可以为约5％至约90％、约5％至约80％、约5％至约70％、约5％至约60％、约5％至约50％。
在某些实施方案中，生物燃料可以被制成包含至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的含有8:0、10:0、12:0、14:0、14:1、16:0、16:1、18:0、18:1、18:2、18:3、20:0、20:1、20:2、20:3、22:0、22:1或22:3的碳链的脂肪酸衍生物。这类生物燃料组合物还可以包含至少一种选自以下的添加剂：可以把浊点降低至低于约5℃或低于约0℃的浊点降低添加剂；表面活性剂；微乳液；至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的来自甘油三酯的柴油燃料；来源于石油的汽油；或来源于石油的柴油燃料。
在一些实施方案中，包含根据本文的方法、载体、细胞和组合物产生的脂肪酸和/或诸如脂肪酯的其衍生物的燃料组合物还包含一种或多种柴油燃料添加剂。给予改善的性能而且与燃料组合物中的组分和通常与柴油发动机相关联的设备相兼容的适合的添加剂是适合的。其他适合的燃料添加剂的实例包括：点火改良剂或十六烷值改进剂，清洁剂，分散剂，抗磨剂，粘度指数改性剂，摩擦改进剂，润滑性改良剂，稳定剂，抗氧剂，缓蚀剂，杀菌剂，金属消磁剂，以及少量的其他任选的添加剂，包括但不限于，消泡剂和密封修复剂。
在具体实施方案中，经常添加点火改良剂和十六烷值改进剂以增强柴油发动机性能。示例性的十六烷值改进剂包括2’-硝酸异辛酯和其他硝酸烷酯。可以以基于燃料组合物总重量的约0.01wt.％至约1.0wt.％，例如约0.05wt.％至约0.5wt.％的量向燃料组合物添加十六烷值改进剂。
在某些实施方案中，可以向包含根据本公开产生的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的燃料组合物中包含多种清洁剂和/或分散剂以缔合和分散或移除来自柴油发动机部分的有害沉淀。适合的清洁剂通常包含极性头部和长疏水性尾部，所述极性头部包括有机酸化合物的金属盐。示例性的清洁剂包括碳酸硼酸盐、硫酸硼酸盐，它们优选地是高碱性的。参见，例如美国专利第4,744,920号和第4,965,003号，其公开并入本文。示例性的分散剂包括但不限于：羧酸分散剂、琥珀酸亚胺分散剂、胺分散剂和Mannich分散剂。参见，例如美国专利第3,172,892号、第3,438,757号、第3,980,569号和第6,165,235号，通过引用将其公开并入本文。分散剂可以以基于燃料组合物总重量的约0.01wt.％至约0.1wt.％，例如0.03wt.％至约0.05wt.％的量存在于燃料组合物中。
在某些实施方案中，可以向燃料组合物添加包括诸如二烷基二硫代磷酸将金属盐的抗磨剂以提供抗磨和抗氧化好处。参见，例如美国专利第5,898,023号，通过引用将其公开并入本文。
在具体实施方案中，燃料组合物中润滑性改善剂的量为约1ppm至约50,000ppm，例如，约10ppm至约20,000ppm或约25ppm至约10,000ppm。润滑性改良剂的非限制性实例包括酯和脂肪酸，其可以与根据本文所述方法产生的那些相同或不相同。
在具体实施方案中，改善燃料组合物的储存稳定性的稳定剂的量可以为基于燃料组合物总重量的约0.001wt.％至约2wt.％，例如约0.01wt.％至约1wt.％。示例性的稳定剂是三烷基伯胺。
抗氧化剂防止燃料系统组件上由于储存的燃料的氧化而形成粘性沉淀和/或抑制燃料组合物中形成过氧化物化合物。抗氧化剂的量可以为基于燃料组合物总重量的约0.001wt.％至约5wt.％，例如约0.01wt.％至约1wt.％。
缓蚀剂保护诸如输油管和油箱的燃料储运系统中的黑色金属免受腐蚀。已知某些缓蚀剂还给予额外的润滑性，并且当需要额外的润滑性时这些缓蚀剂是特别适合的。缓蚀剂可以以基于燃料组合物总重量的约0.001wt.％至约5wt.％，例如约0.01wt.％至约1wt.％的量存在于燃料组合物中。
杀菌剂用于对抗燃料组合物中微生物生长，其可以以基于燃料组合物总重量的约0.001wt.％至约5wt.％，例如约0.01wt.％至约1wt.％的浓度存在于燃料组合物中。
金属消磁剂抑制某些金属对燃料氧化的催化效果，特别是铜，金属消磁剂可以以基于燃料组合物总重量的约0.001wt.％至约5wt.％，例如约0.01wt.％至约1wt.％的量存在于燃料组合物中。
此外，可以少量添加粘度改性剂(通常是分子量平均数为约5,000至约250,000的聚合物材料)和摩擦改进剂(通常是含硫的有机钼化合物)。还可以以低于约10ppm的量向燃料组合物中添加通常含有烷基异丁烯酸酯聚合物或二甲基硅聚合物的抑泡剂。此外，可以添加以确保适当的弹性体密封和防止过早的密封失效的密封修复剂可以被包含在燃料组合物中。
在下文的实施例中将进一步说明本发明。仅以示例性目的提供实施例。这些实施例不被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例
实施例1
本实施例描述了其中脂肪酸降解酶的表达被减弱的遗传工程化的微生物的构建。
使用Datsenko et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645(2000)所述的但进行了以下修改的Lambda Red(也被称为Red-Driven Integration)系统缺失大肠杆菌MG1655(大肠杆菌K菌株)的fadE基因：
使用以下两个引物以引起fadE缺失：Del-fadE-F
5’-AAAAACAGCAACAATGTGAGCTTTGTTGTAATTATATTGTAAACATATTGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO:1)；和Del-fadE-R
5’-AAACGGAGCCTTTCGGCTCCGTTATTCATTTACGCGGCTTCAACTTTCCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO:2)
Del-fadE-F和Del-fadE-R引物被用于通过PCR从质粒pKD13(描述于Datsenko etal.,同上)扩增卡那霉素抗性(KmR)表达盒。然后将PCR产物用于转化含有pKD46的电感受态大肠杆菌MG1655细胞(描述于Datsenko et al.,同上)，所述细胞之前已经用阿拉伯糖诱导3-4小时。在添加有代谢物抑制(SOC)培养基的超级优化肉汤中37℃过生长3小时后，将细胞在含有50μg/mL的卡那霉素的Luria琼脂平板上倒平板。37℃过夜孵育后鉴定和分离抗性菌落。通过使用引物fadE-L2和fadE-R1的PCR扩增确认fadE基因的破坏，所述引物被设计为侧翼连接于大肠杆菌fadE基因。
fadE缺失确认引物为：
fadE-L2 5’-CGGGCAGGTGCTATGACCAGGAC(SEQ ID NO:3)；和
fadE-R1 5’-CGCGGCGTTGACCGGCAGCCTGG(SEQ ID NO:4)
确认fadE缺失之后，如Datsenko et al.,同上所述利用pCP20质粒使用单菌落去除KmR标志物。将所得的缺失fadE基因且去除KmR标志物的MG1655大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔfadE或大肠杆菌MG1655D1。
实施例2
本实施例描述了其中脂肪酸降解酶和外膜蛋白受体的表达被减弱的遗传工程化的微生物的构建。
使用Datsenko et al.同上的进行了以下修改的Lambda Red系统从实施例1的大肠杆菌MG1655D1菌株缺失编码高铁色素外膜受体的大肠杆菌MG1655的fhuA(又被称为tonA)基因(GenBank登录号：NP_414692)：
用于引起缺失的引物：
Del-fhuA-F
5’-ATCATTCTCGTTTACGTTATCATTCACTTTACATCAGAGATATACCAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO:5)；和
Del-fhuA-R
5’-GCACGGAAATCCGTGCCCCAAAAGAGAAATTAGAAACGGAAGGTTGCGGTTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO:6)
Del-fhuA-F和Del-fhuA-R引物被用于通过PCR从质粒pKD13扩增卡那霉素抗性(KmR)表达盒。获得的PCR产物用于转化含有pKD46的电感受态MG1655D1细胞(参见，实施例1)。这些细胞之前已经用阿拉伯糖诱导约3-4小时。在SOC培养基中37℃过生长3小时之后，将细胞在含有50μg/mL的卡那霉素的Luria琼脂平板上倒平板。在37℃过夜孵育后鉴定和分离抗性菌落。通过利用侧翼连接于大肠杆菌fhuA基因的引物的PCR扩增确认某些菌落中fhuA基因的破坏。
利用以下引物进行缺失的确认：
fhuA-verF 5’-CAACAGCAACCTGCTCAGCAA(SEQ ID NO:7)；和
fhuA-verR5’-AAGCTGGAGCAGCAAAGCGTT(SEQ ID NO:8)
确认fhuA缺失之后，如Datsenko et al.,同上所述利用pCP20质粒使用单菌落去除KmR标志物。fadE和fhuA基因缺失的所得MG1655大肠杆菌菌株被命名为大肠杆菌MG1655ΔfadE_ΔfhuA或大肠杆菌MG1655DV2。
实施例3
本实施例描述了其中酰基-CoA脱氢酶、外膜蛋白受体、丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶的表达被减弱的遗传工程化的微生物的构建。
使用Datsenko et al.同上的进行了以下修改的Lambda Red系统从大肠杆菌MG1655DV2(参见，实施例2)的菌株缺失编码丙酮酸甲酸裂解酶的大肠杆菌MG1655的pflB基因(GenBank登录号AAC73989)：
用于引起缺失菌株的引物为：
Del-pflB-F:5’-GCCGCAGCCTGATGGACAAAGCGTTCATTATGGTGCTGCCGGTCGCGATGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO:9)
Del-pflB-R:5’-ATCTTCAACGGTAACTTCTTTACCGCCATGCGTGTCCCAGGTGTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQ ID NO:10)
Del-pflB-F和Del-pflB-R引物被用于通过PCR从质粒pKD13扩增卡那霉素抗性(KmR)表达盒。然后将PCR产物用于转化电感受态大肠杆菌MG1655DV2细胞(参见实施例2)。
同时，还使用Datsenko et al.,同上所述的但进行以下修改的Lambda Red系统从大肠杆菌MG1655DV2缺失大肠杆菌MG1655的ldhA基因(参见，例如Mat-Jan et al.,J.Bacteriol.171(1):342-8(1989)；Bunch et al.,Microbiol.143(1):187-95(1997)(GenBank登录号AAC74462)，所述ldha基因编码乳酸脱氢酶，明确地说是NAD偶联的发酵D乳酸脱氢酶。
两种引物用于引起缺失：
Del-ldhA-F:
5’-CTCCCCTGGAATGCAGGGGAGCGGCAAGATTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’(SEQ ID NO:11)
Del-ldhA-R:
5’-TATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCAACATCACTGGAGAAAGTCTTATGCATATGAATATCCTCCTTAGTTCC-3’(SEQ ID NO:12)
Del-ldhA-F和Del-ldhA-R引物被用于通过PCR从质粒pKD3(参见，Datsenko etal.,同上)扩增氯霉素乙酰基转移酶抗性(CmR)表达盒。还将PCR产物用于转化电感受态大肠杆菌MG1655DV2细胞(参见实施例2)。
大肠杆菌MG1655DV2(参见，实施例2)细胞之前已经用阿拉伯糖诱导约3-4小时。在SOC培养基中37℃过生长3小时之后，将细胞在含有50μg/mL的卡那霉素和30μg/ml的氯霉素的Luria琼脂平板上倒平板。在37℃过夜孵育后鉴定和分离同时对卡那霉素和氯霉素有抗性的菌落。使用侧翼连接于大肠杆菌pflB基因的引物确认pflB基因的破坏，并使用侧翼连接于大肠杆菌ldhA基因的引物证实ldhA基因的破坏。
利用以下引物进行pflB缺失的确认：
pflB-verF:5’-GGACTAAACGTCCTACAAAC(SEQ ID NO:14)
PflB-verR:5’-TTCATCTGTTTGAGATCGAG(SEQ ID NO:15)
利用以下引物进行ldhA基因缺失的确认：
ldhA-verF:5’-CCCGAGCGGTAGCCAGATGCCCGCCAGCG(SEQ ID NO:16)
ldhA-verR:5’-GCTGCGGGTTAGCGCACATCATACGGGTC(SEQ ID NO:17)
确认缺失之后，根据Datsenko et al.,同上所述的方法，使用单菌落去除KmR和CmR标志物。fadE、fhuA、pflB和ldhA基因缺失的所得MG1655大肠杆菌菌株被命名为大肠杆菌MG1655ΔfadE_ΔfhuA_ΔpflB_ΔldhA或大肠杆菌MG1655DV4。
实施例4
本实施例描述了其中诸如酰基CoA合酶的脂肪酸降解酶、外膜蛋白受体和酰基CoA脱氢酶的表达被减弱的遗传工程化的微生物的构建。
使用Datsenko et al.,同上所述的但进行以下修改的Lambda Red系统从菌株大肠杆菌MG1655DV2(参见，实施例2)缺失大肠杆菌MG1655的fadD基因。
用于引起fadD缺失的引物为：
fad1:
5’-TAACCGGCGTCTGACGACTGACTTAACGCTCAGGCTTTATTGTCCACTTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’(SEQ ID NO:19)；和
fad2:
5’-ATTTGGGGTTGCGATGACGACGAACACGCATTTTAGAGGTGAAGAATTGCATATGAATATCCTCCTTTAGTTCC-3’(SEQ ID NO:20)
fad1和fad2引物用于通过PCR从质粒pKD3(描述于Datsenko et al.,同上)扩增氯霉素乙酰转移抗性(CmR)。将PCR产物用于转化电感受态大肠杆菌MG1655DV2(参见实施例2)。转化的细胞在含有30μg/mL的氯霉素的Luria琼脂平板上倒平板并在37℃过夜生长。分离单独的菌落，转移到新鲜Luria琼脂平板并在42℃生长。然后将这些菌落在含有30μg/mL氯霉素和100μg/mL羧苄青霉素的Luria琼脂平板上点接种并在37℃过夜生长。通过PCR进一步评估对氯霉素有抗性并对羧苄青霉素敏感的菌落，以确保PCR产物插入到正确的位点。具体的，通过使用设计为侧翼连接于fadD基因的引物fadF和fadR的PCR扩增反应确认fadD基因的破坏：
fadF:5’-CGTCCGTGGTAATCATTTGG-3’(SEQ ID NO:21)；和
fadR:5’-TCGCAACCTTTTCGTTGG-3’(SEQ ID NO:31)
确认fad缺失之后，如Datsenko et al.,同上所述利用FLP辅助质粒移除CmR标志物。将所得的MG1655大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔfadEΔfhuAΔfadD或大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD。DV2ΔfadD菌株不能在M9+油酸酯琼脂平板(其供应油酸酯作为碳源)上生长。其叶不能在M9+油酸酯液态培养基中生长。
实施例5
本实施例描述了细菌表达质粒pDS33.ES9(图3)的构建，其中来自除烃海杆菌DSM8798的酯合酶基因(GenBank登录号ABO21021)在大肠杆菌spc核糖体蛋白操纵子的启动子Pspc(SEQ ID NO：13，图4)的控制下表达。
用以下引物从大肠杆菌MG1655染色体DNA扩增图2所示的Pspc启动子：
PspclFF
5’-AAAGGATGTCGCAAACGCTGTTTCAGTACACTCTCTCAATAC-3’(SEQ ID NO:32)；和
PspclFR
5’-GAGCTCGGATCCATGGTTTAGTGCTCCGCTAATG-3’(SEQ ID NO:33)
本实施例中所述的所有PCR反应时利用PhusionTM聚合酶(NEB,Ipswich,MA)进行的。通过利用InFusionTM克隆试剂盒(Clontech,Palo Alto,CA)将PCR产物克隆进BseRI/NcoI限制性酶切的OP80来将Pspc启动子PCR片段用于替代质粒OP80的lacIq和Trc启动子区域。命名为pDS22的所得质粒在多克隆位点下游仍然具有lacZ序列。然后，利用以下引物通过质粒pDS22的PCR扩增去除lacZ序列：
pCLlacDF 5’-GAATTCCACCCGCTGACGAGCTTAG-3’(SEQ ID NO:34)；和
pCLEcoR 5’-CGAATTCCCATATGGTACCAG-3’(SEQ ID NO:35)
用EcoRI消化PCR产物并自连接以形成pDS23.质粒pDS23不包含lacIq、lacZ或TrcDNA。
通过DNA2.0(Menlo Park,CA)合成在本文被称为ES9的来自除烃海杆菌DSM8798的酯合酶(GenBank登录号ABO21021)。该合成的ES9酯合酶被亚克隆进pColaDuet-1质粒以形成质粒pHZ1.97-ES9。利用QuikChange(R)Multi Kit(Stratagene,Carlsbad,CA)和以下的诱变引物通过定点诱变移除ES9酯合酶基因中的内部BspHI位点：
ES9BspF 5’-CCCAGATCAGTTTTATGATTGCCTCGCTGG-3’(SEQ ID NO:36)
该引物向ES9酯合酶基因中引入沉默突变。然后，命名为pDS32的所得质粒被用作模板以利用以下引物扩增ES9酯合酶基因：
ES9BspHF 5’-ATCATGAAACGTCTCGGAAC-3’(SEQ ID NO:37)；and
ES9XhoR 5’-CCTCGAGTTACTTGCGGGTTCGGGCGCG-3’(SEQ ID NO:38)
所得的PCR产物接受BspHI和Xhol限制性酶消化并连接进用Ncol和Xhol消化的质粒pDS23以形成pDS33.ES9(SEQ ID NO：22)。pDS33.ES9的序列在图3示出，代表pSPC启动子的残基为斜体而ES9酯合酶的残基为黑体。
实施例6
本实施例描述了细菌表达质粒pDS57(SEQ ID NO：23)的构建，其中酯合酶的表达处于Ptrc启动子的控制之下。
利用引物ES9BspHF(SEQ ID NO:37)和ES9XhoR(SEQ ID NO:38)从质粒pDS33.ES9(SEQ ID NO:22,实施例5)扩增ES9酯合酶基因。
PCR产物被BspHI和Xhol消化并连接进Ncol/Xhol限制性酶切的OP80以形成质粒pDS57(SEQ ID NO：23)，其中ES9酯合酶基因处于Trc启动子的控制之下。pDS33.ES9的序列在图4示出，Trc启动子为斜体而ES9酯合酶基因为黑体。
实施例7
本实施例说明了单独表达酯合酶而不共表达酰基CoA合酶或硫酯酶可以用于体内产生脂肪酯。
各自携带以下质粒中的一个的实施例4的大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD的种菌培养物在24孔板中的添加有100μg/mL壮观霉素的LB肉汤中生长：
(1)不包含插入子的pCL质粒(阴性对照)；
(2)含有大肠杆菌硫酯酶'tesA的质粒；
(3)含有编码泊库岛食烷菌SK2酯合酶atfA1(GenBank登录号YP_694462)的多核苷酸的质粒；
(4)含有编码泊库岛食烷菌SK2酯合酶atfA2(GenBank登录号YP_693524)的多核苷酸的质粒；
(5)含有编码除烃海杆菌DSM 8798酯合酶ES8(GenBank登录号ABO21020)的多核苷酸的质粒；和
(6)含有编码除烃海杆菌DSM 8798酯合酶ES9(GenBank登录号ABO21021)的多核苷酸的质粒。如实施例5所述构建酯合酶质粒以产生质粒pDS41.S(含有atfAl基因)、pDS31atfa2(含有atfA2基因)、pDS31.ES8(含有编码ES8的基因)和pDS33.ES9(含有编码ES9的基因)。
生长4h之后，将培养物1:25稀释进含有壮观霉素的Che-9 2N-BT(2％葡萄糖，氮限制培养基，0.2M Bis-Tris，pH 7.0，0.1％Triton)并过夜培养。将培养物稀释进4N-BT(4％葡萄糖，氮限制培养基，0.2M Bis-Tris，pH7.0，0.1％Triton)至最终约0.2的OD600(600nm处的光密度)。生长6h之后，添加IPTG至1mM的终浓度，以及水或乙醇(2％)(v/v)。诱导后22小时，用200μM HCl将1mL培养物酸化并用500μL乙酸乙酯萃取。然后用衍生剂TMAH处理脂肪酸和酯并通过GC/FID定量。各个培养物中产生的游离脂肪酸(FFA)和脂肪酰乙酯(FAEE)的量在图5中示出。
如图5所示，在乙醇的存在下，ES9产生近200mg/L FAEE，但是仅产生少量的(＜20％)FFA。在乙醇的存在下，相对于酯合酶ES9，包括ES8、atfA1和atfA2的其他酯合酶产生显著较低量的FAEE，伴随着较高的FFA比例。在乙醇的存在下，培养物大肠杆菌'tesA产生更高的FFA和FAEE总滴度，但是FFA的量显著高于产生的FAEE的量。
结果表明大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD中酯合酶的表达导致在乙醇的存在下产生酯。具体地，在乙醇的存在下，相对于其他酯合酶的酯产量，酯合酶ES9的表达导致最高的酯产量。此外，本实施例表明大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD中'TesA的单独表达导致在乙醇的存在下产生低水平的酯和高水平的游离脂肪酸。
实施例8
本实施例说明了单独表达酯合酶而不共表达酰基CoA合酶或硫酯酶可以用于在乙醇的存在下体内产生脂肪酯。
各自携带以下质粒中的一个的实施例4的大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD的种菌培养物在摇瓶培养物中生长并用1mM IPTG和2％(v/v)乙醇诱导：
(1)含有大肠杆菌’tesA的质粒；
(2)含有编码泊库岛食烷菌SK2酯合酶atfA1(GenBank登录号YP_694462)的多核苷酸的质粒；
(3)含有编码泊库岛食烷菌SK2酯合酶atfA2(GenBank登录号YP_693524)的多核苷酸的质粒；
(4)含有编码除烃海杆菌DSM 8798酯合酶ES8(GenBank登录号ABO21020)的多核苷酸的质粒；和
(5)含有编码除烃海杆菌DSM 8798酯合酶ES9(GenBank登录号ABO21021)的多核苷酸的质粒。诱导后24h，萃取来自各个培养物的小份并用GC-FID分析脂肪酸和酯含量。各个培养物中产生的游离脂肪酸(FFA)和脂肪酰乙酯(FAEE)的量在图6中示出。
如图6所示，在乙醇的存在下，酯合酶ES9产生高水平的FAEE，伴随低水平的FFA。相对于ES9，酯合酶atfA1、atfA2和酯合酶ES8产生显著较少量的FAEE。与上文实施例7和图5的结果一致，大肠杆菌’tesA的单独表达产生更高的FFA和FAEE总滴度，但是伴有显著较高的FFA比例。
结果表明，本实施例表明大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD中酯合酶ES9的表达导致在乙醇的存在下产生高水平的酯和低水平的游离脂肪酸。此外，本实施例表明大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD中'TesA的表达导致在乙醇的存在下产生低水平的酯和高水平的游离脂肪酸。
实施例9
本实施例说明了单独表达酯合酶而不共表达酰基CoA合酶或硫酯酶可以用于在甲醇的存在下体内产生脂肪酯。
各自携带以下质粒中的一个的实施例4的大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD的种菌培养物在摇瓶培养物中生长并用1mM IPTG和2％(v/v)甲醇诱导：
(1)含有编码泊库岛食烷菌SK2酯合酶atfA1(GenBank登录号YP_694462)的多核苷酸的质粒；
(2)含有编码泊库岛食烷菌SK2酯合酶atfA2(GenBank登录号YP_693524)的多核苷酸的质粒；
(3)含有除烃海杆菌DSM 8798酯合酶ES8(GenBank登录号ABO21020)的多核苷酸的质粒；和
(4)含有除烃海杆菌DSM 8798酯合酶ES9(GenBank登录号ABO21021)的多核苷酸的质粒。诱导后24h，萃取来自各个培养物的小份并用GC-FID分析脂肪酸和酯含量。各个培养物中产生的游离脂肪酸(FFA)和脂肪酰甲酯(FAME)的量在图7中示出。
在甲醇的存在下观察到的FFA和FAME的总产物或滴度的量相对于在乙醇的存在下观察到的总滴度降低(参见图6)。此处，产生的FFA的量低于检测限，因此在甲醇的存在下可能产生FFA，尽管以低浓度产生。在表达酯合酶atfA1、atfA2和ES8的培养物中也观察到总滴度相对于在乙醇的存在下获得的总滴度的较低水平的总滴度。
结果表明大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD中酯合酶ES9的表达导致在甲醇的存在下产生酯。
实施例10
本实施例说明了单独表达酯合酶而不共表达酰基CoA合酶或硫酯酶可以用于在乙醇或甲醇的存在下体内产生脂肪酯。
携带含有编码除烃海杆菌DSM8798酯合酶ES9(GenBank登录号ABO21020)的多核苷酸的质粒的大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD在摇瓶培养物中生长并用1mM IPTG和(1))2％(v/v)乙醇或(2)2％(v/v)甲醇诱导。诱导后18、24、48和68小时萃取来自各个培养物的小份，并用GC-FID分析脂肪酸和酯含量。各个培养物中产生的脂肪酰甲酯(FAME)或脂肪酰乙酯(FAEE)的量以及FAME或FAEE加游离脂肪酸(FFA)的总量在图8中示出。
如图8所示，在诱导后整个时间过程，相对于在甲醇的存在下产生的酯(FAME)的水平，在乙醇的存在下产生显著较高水平的酯(FAEE)。在乙醇的存在下和在甲醇的存在下都产生低水平的游离脂肪酸。
结果表明，本实施例表明大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD中酯合酶ES9的表达导致在甲醇和乙醇的存在下产生高水平的酯和低产物水平的游离脂肪酸。此外，该实施例表明在表达酯合酶ES9的大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD中的酯产量在乙醇的存在下显著高于在甲醇的存在下。
实施例11
本实施例描述了酯合酶突变文库的构建，其中每个成员包含对ES9的395位甘氨酸的氨基酸取代。
当除烃海杆菌DSM8798的酯合酶ES9的序列(GenBank登录号ABO21021.1)接受BLAST检索时(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，鉴定出多种细菌酯合酶同系物。这些微生物酯合酶的序列比对揭示了395位谷氨酸或天冬氨酸的酸性氨基酸的一般模式，尽管事实上报告的酯合酶ES9序列在395位氨基酸处包含甘氨酸。
ES9的395位甘氨酸残基被突变成20种常规氨基酸的每一种，以评估该位置处的氨基酸取代的影响。利用Stratagene's针对多位点的诱变试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)引起突变。如表7所示，引物G395Xf与载体特异性引物联合用于产生编码所有20中可能的395位氨基酸残基的3’酯合酶片段池。指定为G395Xr的与G395Xf的5’部分互补的反向引物与载体特异性引物联合用于产生5’酯合酶片段。然后将各个3’片段与5’片段通过重叠衍生装配，以重构编码在395位具有20种不同的氨基酸残基的序列的基因序列的随机池。
表7
然后将酯合酶突变序列的随机池电穿孔进根据下面的描述制备的电感受态大肠杆菌MG1655DV4/1/2KmRCmR/pKD46细胞中。
从质粒pKD3获得含有启动子和开放阅读框的氯霉素抗性第一基因(SEQ ID NO：157)(参见，Datsenko et al.,同上)。分别地，从质粒pKD13获得含有启动子和卡那霉素抗性基因的前531个碱基的第二基因的部分(SEQ ID NO：158)(参见，Datsenko et al.,同上)。通过首先连接第一基因与第二基因构建抗性表达盒，其中第一基因位于第二基因上游。将与lacZ基因序列的3’端(SEQ ID NO：159)同源的50个碱基对的序列添加到氯霉素抗性基因下游，并将lacI基因序列(SEQ ID NO：160)添加到部分卡那霉素抗性基因的上游。然后将该抗性表达盒用于转化大肠杆菌MG1655DV4菌株，所述菌株之前已经用如下所述的pKD46转化。
将致力pKD46(参见Datsenko et al.,同上)转化进大肠杆菌MG1655DV4(参见，实施例3)中。该DV4/pKD46菌株在含有100μg/mL羧苄青霉素的固体培养基上于32℃过夜生长。然后将单个菌落接种到含有100μg/mL羧苄青霉素的过夜培养基上。在32℃生长16h之后，将DV4/pKD46培养物1:500稀释进含有100μg/mL羧苄青霉素、阿拉伯糖和MgCl2的LB培养基中，以诱导来自pKD46的重组基因的表达。通过测量OD600监测生长，当OD600达到约0.6时，将细胞制成电感受态并用抗性表达盒转化。
在含有34μg/mL氯霉素、X凝胶和IPTG的固体氯霉素选择性培养基上倒平板之前，允许转化的细胞在非选择性SOC培养基中恢复3h。使用菌落PCR、蓝/白筛选和DNA测序确认正确的插入。该菌株被命名为大肠杆菌MG1655DV4/1/2KmRCmR/pKD46。然后，在酯合酶突变序列被转化之前，该菌株接受3-4h的阿拉伯糖处理。
转化后，允许培养物恢复并在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基上倒平板，然后于32℃过夜生长。来自该板的96个克隆被测序以核实ES9的395位的预期突变的类型。然后测试各个菌落的制造脂肪酸/脂肪酯的能力。
每个克隆的种菌培养物在96孔板的含有50μg/mL卡那霉素的LB肉汤中于32℃生长。6h的生长之后，将培养物以1:10稀释进添加有50μg/mL卡那霉素的2N-BT(2％葡萄糖，氮限制培养基，0.2M Bis-Tris，pH 7.0，0.1％Triton)中并于32℃过夜生长。过夜生长之后，将培养物以1:10稀释进4N-BT(4％葡萄糖，氮限制培养基，0.2M Bis-Tris，pH 7.0，0.1％Triton)中并于32℃生长6h。然后向每个培养物添加IPTG和乙醇以达到分别为1mM和2％(v/v)的终浓度。诱导后22h，使用40μL 1M HCl酸化培养物并用400μL乳酸正丁酯萃取。使用GC-FID测量萃取物中脂肪类(包括，例如脂肪酸和脂肪酯)的量。
如从图9可见，图9显示来自突变和野生型菌株的产物滴度的z值，其中ES9的395位甘氨酸残基被精氨酸或赖氨酸残基取代的样品导致脂肪类产量最显著的增加，并且其中表达野生型ES9的产物菌株的中位滴度被设为0。例如，G395R突变菌株的Z值为大于10，而G395K突变菌株的Z值为约9.此外，计算p值以评定滴度改善的统计学显著性。G395R突变菌株的生产力改善具有1.74E-19的p值，而G395K的生产力改善具有5.43E-05的p值，这些改善是统计学上显著的。
实施例12
本实施例展示了来自除烃海杆菌的酯合酶ES9的酯合酶突变(其中报告的序列的395位氨基酸残基处的甘氨酸被多种其他氨基酸残基代替)的表达可以用于在适合的醇底物的存在下体内产生酯。
使用以下引物从实施例11的酯合酶突变和野生型片段的大肠杆菌MG1655DV4/1/2KmRCmR/pKD46转化株移除酯合酶突变和野生型片段：
ES9BspHF 5’-ATCATGAAACGTCTCGGAAC-3’(SEQ ID NO:37)；和
ES9XhoR 5’-CCTCGAGTTACTTGCGGGTTCGGGCGCG–3’(SEQ ID NO:38)
利用这些引物从大肠杆菌MG1655DV4/1/2KmRCmR/pKD46转化株获得的酯合酶片段是野生型ES9以及突变G395R、G395S、G395K、G395S和G395D。随后利用NcoI和HindIII限制性酶切位点将这些片段克隆到pCL1920载体中IPTG诱导的启动子的下游。
将所得的质粒转化进电感受态大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD(参见实施例4)，并在含有100mg/L壮观霉素(spectinomycin)的LB平板上倒平板、于37℃过夜孵育并纯化。
表达ES9以及突变G395R、G395S、G395K、G395S和G395D的纯化的DV2fadD菌株声场与15mL摇瓶中，并用1mM IPTG和2％(v/v)甲醇诱导。诱导后，在第15.5h、第40h和第65h从每个摇瓶取样品，利用GC-FID确定这些时间点游离脂肪酸和FAME的产物水平。结果在图10A中示出。
还通过取发酵肉汤的少量样品并测量OD600来追踪发酵期间的细胞生长。结果在图10B中示出。
如图10A所示，在甲醇的存在下，表达ES9(其在395位具有甘氨酸残基)的菌株，以及表达ES9的G395R、G395K、G395D和G395E突变的菌株产生大量FAME和游离脂肪酸。相比之下，表达G395S突变的菌株几乎不产生(如果有的话)FAME和/或游离脂肪酸。
在甲醇的存在下，表达G395R突变酯合酶的产物菌株产生约1,800g/L FAME/FFA，而表达G395K突变酯合酶的产物菌株产生约1400g/L FAME/FFA。相对于由包含野生型酯合酶ES9的产物菌株产生的FAME/FFA的量，这两种突变似乎具有显著改善的产生脂肪酸及其衍生物的能力。用酸性氨基酸残基取代ES9的395位甘氨酸残基不提供具有改善的产生脂肪酸和/或衍生物的能力的产物菌株。用半胱氨酸残基取代ES9的395位甘氨酸残基也不提供具有改善的产生脂肪酸和/或衍生物的能力的产物菌株。
结果表明，酯合酶ES9的报告的序列的395位氨基酸残基处的甘氨酸突变为诸如赖氨酸或精氨酸残基的碱性氨基酸残基提供改善的酯合酶变体，所述变体可以用于实现提高的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物产量。
实施例13
本实施例描述了针对酰基ACP比针对酰基CoA或β羟酰ACP具有改变的活性和/或特异性的酯合酶同系物。根据生物信息学分析鉴定了四种酯合酶同系物并在下表中描述。评价了这些酯合酶同系物的活性:
表8
这些同系物与酯合酶ES9的报告的序列的百分比同一性和百分比相似性在下表列出：
表9
利用DNA2.0(DNAstar,Menlo Park,CA)对上述四种酯合酶同系物的核苷酸序列进行大肠杆菌密码子优化以及合成，然后利用NcoI和HindIII位点克隆进pCL1920载体中IPTG诱导的Ptrc启动子的下游。
将所得的质粒转化进大肠杆菌MG1655DV2ΔfadD用于在摇瓶中评价。所得的当用甲醇供给细胞时的FAME的产物滴度在图11中示出。所得的当用乙醇供给细胞时的FAEE的产物滴度在图12中示出。
实施例14
本实施例描述了利用本文所述的遗传修饰的微生物产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物组合物的发酵工艺。
使用发酵和回收工艺产生经由碳水化合物的发酵的商品级质量的生物柴油。
开发发酵工艺以利用实施例1-12所述的遗传工程化的微生物产生用作生物柴油的脂肪酸乙酯(FAEE)和脂肪酸甲酯(FAME)的混合物。以本领域技术人员乙酯的任何方式进行发酵。例如在2L至10L的实验室规模的发酵罐中进行发酵。利用本领域技术人员已知的方法，这些示例性的操作方案可以按比例地放大的任何其他大肠杆菌。
在一实施方案中，在2L发酵罐中进行发酵流程。来自冻存的大肠杆菌细胞在由4.54g/L三水K2HPO4、4g/L(NH4)2SO4、0.15g/L七水MgSO4、20g/L葡萄糖、200mM Bis-Tris缓冲液(pH 7.2),1.25mL/L微量矿物质溶液和1.25mL/L维生素溶液组成的确定的培养基中生长。微量矿物质溶液包含27g/L FeCl3·6H2O、2g/L ZnCl2·4H2O、2g/L CaCl2·6H2O、2g/LNa2MoO4·2H2O、1.9g/L CuSO4·5H2O、0.5g/L H3BO3和100mL/L高浓度HCl。维生素溶液包含0.42g/L核黄素、5.4g/L泛酸、6g/L烟酸、1.4g/L吡哆醇、0.06g/L生物素以及0.04g/L叶酸。
50(50)mL本文所述的培养物过夜生长并随后用于接种1L的培养基，所述培养基含有0.5g/L(NH4)2SO4、2.0g/L KH2PO4、0.15g/L七水MgSO4、0.034g/L柠檬酸铁、2.5g/L bacto酪蛋白氨基酸、10g/L葡萄糖、1.25mL/L微量矿物质溶液2和1.25mL/L维生素溶液。微量矿物质溶液2包含2g/L ZnCl2·4H2O、2g/L CaCl2·6H2O、2g/L Na2MoO4·2H2O、1.9g/L CuSO4·5H2O、0.5g/L H3BO3和100mL/L高浓度HCl。维生素溶液与接种物培养基所述的相同。
发酵罐安装有温度控制装置、pH值控制装置、搅拌控制装置、通风控制装置和溶解氧控制装置。优选的发酵条件包括温度为32℃，pH值为6.8，溶解氧(DO)水平为约30％饱和。通过添加NH4OH维持pH值，NH4OH还作为细胞生长的氮源起作用。当初始葡萄糖几乎耗尽时，向发酵罐供给由600g/L葡萄糖、3.9g/L七水MgSO4、1.6g/L KH2PO4、2.5g/L酪蛋白氨基酸、0.05g/L柠檬酸铁、20mL/L微量矿物质溶液2和2ml/L维生素溶液组成的给养。供给速率设置为高达允许细胞生长速率为0.3h-1，在该点供给速率固定为10g葡萄糖/L/h的最大值。只要发酵罐中不积累葡萄糖，在剩余的发酵流程中维持该速率。通过避免葡萄糖积累，可能降低或消除否则通常由大肠杆菌产生的诸如乙酸盐、甲酸盐和乙醇的副产品的形成。在生长的早期，通过添加1mM IPTG和10ml/L纯乙醇诱导FAEE的产生。发酵持续3天。
在流程期间添加数次乙醇以补充细胞在产生脂肪酰酯时消耗的乙醇，但大多数乙醇蒸发在废气中而丧失。所述添加帮助将发酵肉汤中乙醇的浓度维持在10至20mL/L，以促进高效地生产而不抑制细胞生长。通过测量OD600、葡萄糖消耗、和酯产量来追踪发酵流程的进行。
该发酵操作方案也可以按比例放大到700L发酵罐。用于追踪发酵流程的分析方法在以下实施例中描述。
实施例15
本实施例描述了用于检测葡萄糖消耗、游离脂肪酸和/或脂肪酸酯的产生的分析程序。通过高效液相色谱(HPLC)分析发酵期间的葡萄糖消耗。根据本领域内通常用于测量糖和有机酸的方法进行HPLC分析，该方法通常涉及以下设备和条件：安装有折光率检测器的Agilent HPLC 1200系列(Agilent Technology,Santa Clara,CA)，Aminex HPX-87H柱，300mm×7.8mm(Catalogue:125-0140)；柱温:50℃；pH值范围:1-3；流动相：0.005M H2SO4(水溶液)；流速:0.6mL/分钟；进样体积:5μL；运行时间:25分钟。
通过装有火焰离子化检测器的气相色谱(GC-FID)分析脂肪酸甲酯或乙酯的产生。用乙酸乙酯以1:1的体积比萃取来自发酵肉汤的样品。高速混合后，离心样品并用GC分析单独的有机相。分析条件如下：
仪器：装有火焰离子化(FID)检测器的Trace GC Ultra,Thermo Electron Corp.(Marietta,OH)；
柱：DB-1(1％二苯基硅氧烷；99％二甲基硅氧烷)Col UFM 1/0.1/5/0.1DET，来自Thermo Electron Corp.(部件#UFMC00001010401；S/N 520070046),相pH值为5，FT为0.1μm,长度为5m并且内径为0.1mm；
进样条件：300℃，分流流量为150mL/分钟的1/300分流进样，总运行时间:2分钟；
载气/流速：氦/0.5mL/分钟；
加热块温度：260℃；
炉温：140℃保持0.3分钟；以100℃/分钟梯度升温至300℃；保持0.05分钟，总运行时间：4分钟。
检测器温度：300℃；
进样体积：1μL。
通过气相色谱与质谱检测器联用(GC-MS)追踪脂肪甲酯或脂肪乙酯的产生。用乙酸乙酯或乙酸丁酯以1:1的体积比萃取来自发酵肉汤的样品。高速混合后，离心样品并用GC-MS在安装有5975B VL MSD的Agilent 6850(Agilent Technology,Santa Clara,CA)上分析单独的有机相。通过单离子监测提取离子。分析条件如下：
炉温：100℃保持3分钟；以20℃/分钟梯度升温至320℃并保持5分钟，总运行时间为19分钟；
毛细管柱：DB-5MS UI,毛细管：公称30.0m x 250μM x0.250μm x0.25μm；
载气/流速/压力：氦/1.2mL/分钟/12.56psi；
进样条件：320℃不分流；
总流速：16.2mL/分钟。
实施例16
本实施例证明了在不存在硫酯酶和/或酰基CoA合酶的情况下，通过发酵表达酯合酶的大肠杆菌菌株可以产生脂肪酸乙酯。
如实施例5所述，用质粒pDS57(SEQ ID NO：23)转化分别描述于实施例2和4的大肠杆菌MG1655DV2和DV2ΔfadD。根据实施例14的发酵操作方案使所得的DV2pDS57和DV2ΔfadD pDS57在2L和5L发酵罐中生长。对每种菌株的FAEE、FFA的分析以及FAEE的总产量的代表性的结果在表10中示出。以从每100克使用的碳源获得的产品的克数表示产量。
表10
参数 DV2pDS57 DV2 fadD pDS57
FAEE浓度(g/L) 5.9 7.3
FFA浓度(g/L) 0.3 0.5
相对于葡萄糖的FAEE产量(％) 5.6 6.1
结果表明通过发酵表达酯合酶ES9的大肠杆菌菌株DV2和DV2ΔfadD可以产生高水平的脂肪酸乙酯和低水平的游离脂肪酸。
实施例17
本实施例证明了通过向含有天然(即非重组的)酯合酶的微生物菌株供给脂肪酸和醇可以产生脂肪酯。亚德海床杆菌菌株被用作含有这类酯合酶的微生物菌株的实例。在海水培养基中培养它。
制备海水培养基并高压灭菌：23.6g/L NaCl，0.64g/L KCl，4.53g/L MgCl2x 6H2O，5.94g/L MgSO4x 7H2O。用NaHCO把pH至调节至7.2。
从DSMZ(http://www.dsmz.de)获得菌株亚德海床杆菌T9(DSM12178)。菌株在25mL的添加有100μL棕榈酸钠(1％溶于水中)和表11所列的四种醇中的一种的海水培养基中生长。在30℃生长18小时后，用20mL乙酸乙酯萃取培养物肉汤。然后用GC/MS分析乙酸乙酯萃取剂的单独的乙酸乙酯相。产生的酯类型在表11中列出。图13在中排和下排分别描述了由供给乙醇和异丙醇的亚德海床杆菌T9菌株产生的棕榈酸乙酯和棕榈酸异丙酯的GC/MS图谱。
表11
实施例18
本实施例证明了在非减弱水平的内源fadE的存在下野生型大肠杆菌宿主细胞中脂肪酸衍生物的产生。基因fadE编码酰基CoA、脱氢酶，起催化脂肪酰CoA降解的第一步。因此，当利用酰基CoA作为底物制备脂肪酸衍生物时，fadE通常被认为是必需的。然而，本发明的脂肪酸衍生物产物细胞可以利用酰基ACP作为底物。因此，酰基CoA脱氢酶的存在不再必然引起底物的降解。本实施例证明，确实，fadE的内源表达可以原封不动保留而不影响脂肪酸衍生物的产量。
用将ES9置于trc启动子的转录控制之下的质粒pDS57(SEQ ID NO：23，参见实施例6)转化电感受态大肠杆菌菌株MG1655。把同一质粒转化进菌株大肠杆菌MG1655D1(或大肠杆菌MG1655ΔfadE，参见实施例1)作为比较。菌株在摇瓶中生长并利用诸如实施例7同上所述的标准摇瓶发酵操作方案评价。当用1mM IPTG诱导菌株是，向它们补充乙醇，至2％(v/v)的终体积。取4个时间点并分析菌株的生长和脂肪酸乙酯产量。结果在图11和12中示出。两种菌株具有接近相同的生长性质(图11)和脂肪酸乙酯产量性质(图12)。菌株MG1655pDS57可以产生约2g/L FAEE，表明ES9在没有减弱的fadE的野生型菌株中可以直接产生酯。
还确定的是，每种菌株的总游离脂肪酸积累小于20mg/L。
实施例19
本实施例提供了在酿酒酵母中表达酯合酶多肽的示例性的方法。利用本文所述的适合的方法可以减弱或在功能上缺失内源硫酯酶和/或酰基CoA合酶或其他脂肪酸降解酶(如果存在)。
酵母附加体质粒(YEp)型载体pRS425(Christianson et al.,Gene 110:119-122(1992))含有来自酿酒酵母2微米的内源质粒的序列、LEU2选择性标志物、和基于多功能噬菌粒pBluescript II SK(+)的骨架的序列。利用Jia et al.,Physio.l Genomics 3:83-92(2000)所述的方法将酿酒酵母的强组成性甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)启动子克隆到pRS425的SacII和SpeI位点之间以产生pGPD-425(SEQ ID NO:50)。将NotI位点引入到pGPD-425的BamHI位点中，赋予侧翼连接于BamHI位点的NotI位点，该质粒被称为pY75(SEQ IDNO：48)。
首先处理诸如编码选自SEQ ID NO：18、24、25和26或其变体的基因的目的酯合酶基因，使得该DNA片段可以连接进pY75(SEQ ID NO:48)的唯一的NotI位点。在用于克隆之前，用NotI线性化pY75载体，用T4DNA聚合酶填充并用虾碱性磷酸酶(New EnglandBiolabs,Ipswich,MA)去磷酸化。然后利用标准技术分离质粒DNA。进行利用EcoRI的限制性酶切消化以鉴定其中起始密码子接近pY75的GPD启动子的3’端(酯合酶基因的有义方向)的质粒克隆。该质粒被称为pY75_ES。
空白pY75载体用作对照。利用诸如Gietz et al.,Meth.Enzymol.350:87-96(2002)所描述的方法的标准方法将pY75_ES的质粒DNA和pY75空载体的质粒DNA转化进酿酒酵母菌株INVSC1(Invitrogen,Carlsbad,CA)。在补充有CSM-leu(Qbiogene,Carlsbad,CA)的DoBA培养基上选择重组酵母克隆。向培养物供给适合的醇底物。使用本文所述的方法从宿主细胞分离所得的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。利用诸如GC/MS的已知技术确定产生的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的量。
实施例20
本实施例提供了在解脂耶氏酵母中表达酯合酶的示例性的方法。
根据PCT公开号WO2008/147935的方法构建pFBAIN-MOD-1载体，通过引用将其公开并入本文。该载体的特征的图形表示在本文以图18呈现。
将目的酯合酶连接到用NcoI和NotI预消化的pFBAIN-MOD-1(SEQ ID NO：51)。连接反应包含10μL 2x连接缓冲液，1μL T4DNA连接酶(Promega,Madison,WI)，3μL酯合酶多核苷酸片段(～300ng)和1μL pFBAIN-MOD-1(～150ng)。然后，反应混合物在室温孵育2h，并用于转化大肠杆菌Top10感受态细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)。利用Qiagen纯化试剂盒(Valencia,CA)回收来自转化株的质粒DNA。通过限制性酶切图谱法鉴定恰当的克隆并将最终的构建体定名为pFBAIN_ES。
将pFBAIN_ES克隆和对照质粒pFBAIN-MOD-1转化进解脂耶氏酵母菌株，例如Y_FOAR。通过获得解脂耶氏酵母ATCC#20362细胞并将它们在YPD琼脂平板(含有10g/L酵母提取物(DIFCO Labs,Detroit,MI),20g/L蛋白胨(DIFCO)和20g/L葡萄糖)上倒平板来制备Y_FOAR。随后将细胞在含有250mg/L 5-FOA(Zymo Research,Orange,CA)的Minimum Medium(MM)平板(含有75mg/L尿嘧啶和75mg/L尿苷，有硫酸铵而无氨基酸的6.7g/L YNB(酵母氮源)和20g/L葡萄糖)上划线。平板在28℃孵育，然后将所得的菌落单独地点接种在含有200mg/mL 5-FOA的MM平板和缺乏尿嘧啶和尿苷的MM平板上。然后获得Ura3营养缺陷型，所得的菌株为Y_FOAR菌株。
来自转化的细胞在缺乏尿嘧啶的MM平板(无硫酸铵或氨基酸的0.17％酵母氮源(DIFCO Labs)，2％葡萄糖，0.1％脯氨酸，pH6.1，20g/L琼脂)并在30℃维持2d。然后用一些转化株接种单独的25mL MM培养基(无硫酸铵或氨基酸的0.17％酵母氮源(DIFCO Labs)，2％葡萄糖，0.1％脯氨酸，pH6.1，20g/L琼脂)的培养物。允许每种培养物在30℃生长2d，然后转换到25mL HGM(含有80g/L葡萄糖,2.58g/L KH2PO4,5.36g/L K2HPO4的高葡萄糖培养基)，并允许在30℃生长5d。向培养物供给适合的醇底物。
然后利用本文所述的方法萃取总脂肪类并可以确定和/或测量脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的产量。
实施例21
本实施例描述了蓝细菌宿主细胞中酯合酶的表达。
制备适合的载体以在蓝细菌宿主细胞中产生脂肪酸和/或其衍生物，所述宿主细胞包括，例如聚球蓝细菌PCC7002，细长聚球蓝细菌PCC7942或集胞藻PCC6803。然后将诸如atfA1(来自泊库岛食烷菌SK2,GenBank登录号YP_694462),AtfA2(来自泊库岛食烷菌SK2,GenBank登录号YP_693524),ES9(来自除烃海杆菌DSM 8789,GenBank登录号ABO21021),ES8(来自除烃海杆菌DSM 8789,GenBank登录号ABO21020)的目的酯合酶及其变体，任选地整合进染色体中处于适合的启动子(例如，PTrc)控制之下，克隆进这些载体。
构建载体以实现利用与3301-3800和3801-4300位相对应的500bp的同源区域向聚球蓝细菌PCC7002pAQ1[GenBank登录号NC_0050525]的同源重组。诸如含有氨基糖苷类3’腺苷酰基转移酶基因(aad)、启动子和终止子的壮观霉素抗性表达盒的选择性标志物来源于质粒PCL1920(根据Lerner et al.,Nucleic Acids Res.18:4631(1990))。将选择性标志物插入同源区域。根据Chang,et al.J.Bacteriol.134:1141-1156(1978)制备诸如pACYC177的质粒。随后通过诸如NdeI和EcoRI识别序列的适合的唯一的克隆位点添加氨基糖苷磷酸转移酶(aph)的启动子和核糖体结合位点。合成该完整的整合表达盒并克隆进pUC19载体(New England Biolabs,Ipswich,MA)。所得的质粒pLS9-7002允许外源基因的克隆和表达，递送并体内稳定整合进聚球蓝细菌PCC7002pAQ1。
产生含有酯合酶基因(例如，编码ES9的一个基因)的质粒或合成操纵子并克隆进pLS9-7002的NdeI和NcoRI位点，位于aph启动子和核糖体结合位点下游。利用Stevens etal.,PNAS 77:6052-56(1980)所述的方法将所得的质粒转化进聚球蓝细菌PCC7002。
在一些实施方案中，构建另一载体用于利用与2577844-2578659和2578660-2579467位相对应的800bp的同源区域向细长聚球蓝细菌PCC7942基因组[GenBank登录号NC_0050525]同源重组。该染色体位置又被称为中性位点1(NS1)(Mackey et al.,Meth.Mol.Biol.362:115-129(2007)。如上文所述，获得并引入诸如壮观霉素抗性表达盒的选择性标志物。合成该整合表达盒并克隆进pUC19(New England Biolabs)。所得的质粒pLS9-7942-NS1允许外源基因的克隆和表达，递送并稳定整合进细长聚球蓝细菌PCC7942基因组。
如上文所述产生包含目的酯合酶基因的质粒或合成操纵子，然后克隆进pLS9-7942-NS1的NdeI或EcoRI位点。根据Mackey et al.,同上所述的方法将所得的质粒转化进细长聚球蓝细菌PCC7942。
在一些实施方案中，构建又一载体用于利用分别与2299015-2300690和2300691-2302056位相对应的1300-1700bp的同源区域向集胞藻PCC6803基因组[GenBank登录号BA_000022]同源重组。该染色体位置又被称为中性位点RS1/2(Shao et al.,Appl.Environ.Microbiol.68:5026-33(2002))。根据Chang,et al.J.Bacteriol.134:1141-1156(1978)制备诸如pACYC177的质粒。诸如卡那霉素抗性表达盒(含有氨基糖苷磷酸转移酶(aph)、启动子、基因和终止子)的选择性标志物来源于pACYC177质粒，并被添加到同源区域之间。此外，添加诸如NdeI和XbaI识别位点的适合的唯一克隆位点。合成该整合表达盒并克隆进pUC19(New England Biolabs)。所得的质粒pLS9-6803-RS允许外源基因的克隆和表达，递送并稳定整合进集胞藻PCC6803基因组。
如上文所述产生包含酯合酶基因的质粒或合成操纵子，然后克隆进pLS9-6803-RS的NdeI或XbaI位点。利用Zang et al.J.Microbiol.,45:241-45(2007)所述的方法将所得的质粒转化进集胞藻PCC6803。
其他实施方案
应当理解到，尽管对本发明结合其详细的描述进行了描述，但上文的描述意图举例说明而不是限制附加的权利要求的范围所界定的本发明的范围。其他方面、优点和改动在以下权利要求的范围内。
优选的实施方式：
1.产生脂肪酸衍生物的方法，所述方法包括在碳源的存在下培养宿主细胞，其中将所述宿主细胞进行基因工程处理以表达或超表达编码酯合成酶的基因，以及分离所述脂肪酸衍生物。
2.如项目1所述的方法，还包括在醇的存在下培养所述宿主细胞。
3.如项目1所述的方法，其中所述天然存在的酯合成酶基因从酸杆菌(Acidobacteria bacterium)、解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑产气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、真养产碱菌(Alcaligenes europhus)、泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)、亚德食烷菌(Alcanivorax jadensis)、麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter dehalogenans)、厌氧粘细菌属(Anaeromyxobacter)、厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter sp.)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、弯曲隐球菌(Cryptococcuscurvatus)、海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)、赤细菌(Erythrobacter sp.)、弗兰克氏菌(Frankia sp.)、Fundibacter jadensis、γ变型菌(gamma proteobacterium)、哈赫拉菌(Hahella chejuensis)、智人(Homo sapiens)、两面神菌(Janibacter sp.)、湖沉积杆菌(Limnobacter sp.)、海洋γ变型菌(marine gamma proteobacterium)、栖藻海杆菌(Marinobacter algicola)、水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)、除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbinoclasticus)、海杆菌(Marinobacter sp.)、Methylibiumpetroleiphilum、海洋微颤菌(Microscilla marina)、摩替亚氏菌(Moritella sp.)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、小家鼠(Mus musculus)、脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、浅黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、Mycobacterium vanbaalenii、橙黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)、法老嗜盐碱单胞菌(Natronomonas pharaonis)、皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)、类诺卡氏菌(Nocardioides sp.)、深海嗜压菌(Photobacterium profundum)、太平洋邻囊菌(Plesiocystis pacifica)、萘降解极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、极地单胞菌(Polaromonas sp.)、铜绿假单胞菌(Psudomonas aeruginosa)、绿脓杆菌(Psychrobacter arcticus)、北极嗜冷杆菌(Psychrobacter cryohalolentis)、嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.)、Reinekea sp.、不透明红球菌(Rhodococcus opacus)、铁还原红育菌(Rhodoferax ferrireducens)、红球菌(Rhodococcus sp.)、铁还原红育菌(Rhodoferaxferrireducens)、玫瑰弯菌(Roseiflexus sp.)、Roseiflexus castenholzii、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)、嗜盐菌(Salinibacter ruber)、Simmodsia chinensis、Solibacter usitatus、阿拉斯加鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis alaskensis)、橙色标记菌(Stigmatella aurantiaca)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、黏着杆菌(Tenacibaculum sp.)和玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)获得。
4.如项目3所述的方法，其中所述编码酯合成酶的基因是wax/dgat、编码蜡合成酶的基因、编码双功能酯合成酶/酰基CoA:二酰基甘油酰基转移酶的基因、ES9、ES8、DSM8798、AtfA1或AtfA2。
5.如项目1所述的方法，其中所述基因编码包含SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：24、SEQID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列的多肽。
6.如项目1所述的方法，其中所述基因编码包含一个或多个氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列的多肽。
7.如项目6所述的方法，其中所述多肽包含在395位氨基酸残基处取代的SEQ IDNO：18的氨基酸序列。
8.如项目7所述的方法，其中将395位氨基酸残基处的甘氨酸用碱性氨基酸残基替代。
9.如项目8所述的方法，其中所述碱性氨基酸残基是赖氨酸残基。
10.如项目8所述的方法，其中所述碱性氨基酸残基是精氨酸残基。
11.如项目1所述的方法，其中将所述宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞降低的水平来表达至少一种编码脂肪酸降解酶的基因。
12.如项目11所述的方法，其中所述脂肪酸降解酶基因编码酰基CoA合成酶。
13.如项目12所述的方法，其中所述酰基CoA合成酶是fadD。
14.如项目1所述的方法，其中将所述宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞降低的水平来表达至少一种硫酯酶基因。
15.如项目14所述的方法，其中所述硫酯酶基因是tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatA1。
16.如项目1所述的方法，其中将所述宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞降低的水平来表达至少一种编码酰基CoA脱氢酶的基因。
17.如项目16所述的方法，其中所述酰基CoA脱氢酶基因是fadE。
18.如项目1所述的方法，其中将所述宿主细胞进行基因工程处理以相对于野生型宿主细胞降低的水平来表达编码外膜蛋白受体的基因。
19.如项目18所述的方法，其中所述编码外膜蛋白受体的基因编码受体铁色素、大肠杆菌素M、噬菌体T1、噬菌体T5或噬菌体
20.如项目18所述的方法，其中所述编码外膜蛋白受体的基因是fhuA。
21.如项目1所述的方法，其中所述宿主细胞对噬菌体感染有抵抗力。
22.如项目1所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、蓝细菌细胞或细菌细胞。
23.如项目1所述的方法，其中所述宿主细胞是革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。
24.如项目1所述的方法，其中所述宿主细胞是：埃希氏菌(Escherichia)、芽孢杆菌(Bacillus)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、红球菌(Rhodococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、曲霉菌(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、脉孢菌(Neurospora)、镰刀菌(Fusarium)、腐质霉(Humicola)、根毛霉(Rhizomucor)、克鲁维酵母菌(Kluyveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、毛霉菌(Mucor)、蚀丝霉(Myceliophtora)、青霉菌(Penicillium)、平革菌(Phanerochaete)、侧耳菌(Pleurotus)、栓菌(Trametes)、金孢子菌(Chrysosporium)、酵母(Saccharomyces)、寡养单胞菌(Stenotrophamonas)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、假丝酵母(Candida)、红酵母(Rhodotorula)、红冬孢酵母(Shodosporidium)、隐球菌(Cryptococcus)、丝孢酵母(Trichosporon)、油脂酵母(Lipomyces)或链霉菌(Streptomyces)细胞。
25.如项目1所述的方法，其中所述细胞是大肠杆菌细胞。
26.如项目25所述的方法，其中所述大肠杆菌细胞是菌株B、菌株C、菌株K或菌株W大肠杆菌细胞。
27.如项目1所述的方法，其中所述细胞是蓝细菌细胞。
28.如项目27所述的方法，其中所述蓝细菌细胞是聚球蓝细菌PCC7002、细长聚球蓝细菌PCC7942或集胞蓝细菌PCC6803细胞。
29.如项目1所述的方法，其中所述酯合成酶基因相对于天然存在的酯合成酶基因在所述宿主细胞中优化表达。
30.如项目1所述的方法，其中在启动子的控制下，所述酯合成酶稳定并入所述宿主细胞的基因组。
31.如项目30所述的方法，其中所述启动子是发育调节性、细胞器特异性、组织特异性、诱导型、组成型或细胞特异性启动子。
32.如项目30所述的方法，其中所述启动子是大肠杆菌spc核糖体蛋白操纵子的启动子Pspc。
33.通过项目1-32中任一项项目所述的方法产生的脂肪酸衍生物。
34.通过项目1-32中任一项项目所述的方法产生的脂肪酯。
35.经过基因工程处理的微生物，其包含至少一种编码酯合成酶的基因，其中所述编码酯合成酶的基因相对于野生型酯合成酶被超表达，并且其中所述微生物相对于野生型微生物产生提高水平的脂肪酯。
36.经过基因工程处理的微生物，其包含稳定并入所述微生物的基因组DNA中编码酯合成酶的基因上游的外源控制序列，其中所述微生物相对于野生型微生物产生提高水平的脂肪酯。
37.如项目36所述的经过基因工程处理的微生物，其中所述外源控制序列是启动子。
38.如项目37所述的经过基因工程处理的微生物，其中所述启动子是发育调节性、细胞器特异性、组织特异性、诱导型、组成型或细胞特异性启动子。
39.如项目35或36所述的经过基因工程处理的微生物，其中将所述微生物进行基因工程处理以相对于野生型微生物降低的水平来表达至少一种编码脂肪酸降解酶的基因。
40.如项目39所述的经过基因工程处理的微生物，其中所述脂肪酸降解酶是酰基CoA合成酶。
41.如项目40所述的经过基因工程处理的微生物，其中所述酰基CoA合成酶是fadD。
42.如项目35或36所述的经过基因工程处理的微生物，其中所述微生物进行基因工程处理以相对于野生型微生物细胞降低的水平来表达至少一种硫酯酶基因。
43.如项目42所述的微生物，其中所述硫酯酶基因是tesA、无前导序列的tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatA或fatA1。
44.如项目35或36所述的经过基因工程处理的微生物，其中将所述微生物进行基因工程处理以相对于野生型微生物降低的水平来表达至少一种编码酰基CoA脱氢酶的基因。
45.如项目44所述的微生物，其中所述酰基CoA脱氢酶基因是fadE。
46.如项目35或36所述的经过基因工程处理的微生物，其中将所述微生物进行基因工程处理以相对于野生型微生物降低的水平来表达编码外膜蛋白受体的基因。
47.如项目46所述的微生物，其中所述编码外膜蛋白受体的基因编码受体铁色素、大肠杆菌素M、噬菌体T1、噬菌体T5或噬菌体
48.如项目46所述的微生物，其中所述编码外膜蛋白受体的基因是fhuA。
49.如项目35-48中任一项项目所述的经过基因工程处理的微生物，其选自革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
50.如项目49所述的经过基因工程处理的微生物，其选自：大肠杆菌(E.coli)、分枝杆菌(mycrobacterium)、诺卡氏菌(Nocardia sp.)、皮疽诺卡氏菌(Nocardiafarcinica)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、海洋放线菌(Salinisporaarenicola)、密执岁棍状杆菌(Clavibacter michiganenesis)、不动杆菌(Acinetobacter)、食烷菌(Alcanivorax)、产碱菌(Alcaligenes)、鼠耳芥(Arabidopsis)、海床杆菌(Fundibacter)、海杆菌(Marinobacter)、小家鼠(Mus musculus)、假单胞菌(Pseudomonas)、或油蜡树(Simmodsia)、耶氏酵母(Yarrowia)、假丝酵母(Candida)、红酵母(Rhodotorula)、红冬孢酵母(Rhodosporidium)、隐球菌(Cryptococcus)、丝孢酵母(Trichosporon)、或油脂酵母(Lipomyces)。
51.如项目50中任一项项目所述的经过基因工程处理的微生物，其选自大肠杆菌菌株B、菌株C、菌株K或菌株W。
52.如项目35-48中任一项项目所述的经过基因工程处理的微生物，其选自聚球蓝细菌PCC7002、细长聚球蓝细菌PCC7942或集胞蓝细菌PCC6803。
53.产生脂肪酸衍生物的方法，其包括在醇的存在下培养项目35-52中任一项项目所述的经过基因工程处理的微生物。
54.如项目53所述的方法，其中所述醇是乙醇、甲醇、丙醇或丁醇。
55.通过项目53的方法产生的脂肪酸衍生物。
56.如项目55所述的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物是脂肪酯。
57.生物燃料组合物，其包含项目33-34和55-56中任一项项目所述的脂肪酸衍生物。
58.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约5℃或更低的浊点。
59.如项目58所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0℃或更低的浊点。
60.如项目59所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约-4℃或更低的浊点。
61.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约360℃或更低的模拟蒸馏T90。
62.如项目61所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约358℃或更低的模拟蒸馏T90。
63.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约15ppm或更低的硫含量。
64.如项目63所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约12ppm或更低的硫含量。
65.如项目64所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约10.7ppm或更低的硫含量。
66.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.1wt％或更低的卡尔-费休水分含量。
67.如项目66所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.08wt％或更低的卡尔-费休水分含量。
68.如项目67所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.06wt％或更低的卡尔-费休水分含量。
69.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.50mg KOH/g或更低的总酸值。
70.如项目69所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.20mg KOH/g或更低的总酸值。
71.如项目70所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.15mg KOH/g或更低的总酸值。
72.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约5ppm或更低的钙镁总含量。
73.如项目72所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约2ppm或更低的钙镁总含量。
74.如项目73所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.5ppm或更低的钙镁总含量。
75.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约5ppm或更低的钠钾总含量。
76.如项目75所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约2.5ppm或更低的钠钾总含量。
77.如项目76所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约1.6ppm或更低的钠钾总含量。
78.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物在20℃具有约850kg/m3-约900kg/m3的密度。
79.如项目78所述的生物燃料组合物，其中所述组合物在20℃具有约860kg/m3-约890kg/m3的密度。
80.如项目79所述的生物燃料组合物，其中所述组合物在20℃具有约870kg/m3-约880kg/m3的密度。
81.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物在40℃具有约3mm2/s-约6mm2/s的运动粘度。
82.如项目81所述的生物燃料组合物，其中所述组合物在40℃具有约3.2mm2/s-约5mm2/s的运动粘度。
83.如项目82所述的生物燃料组合物，其中所述组合物在40℃具有约3.5mm2/s-约4mm2/s的运动粘度。
84.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约500mg/kg或更低的含水量。
85.如项目84所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约480mg/kg或更低的含水量。
86.如项目85所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约450mg/kg或更低的含水量。
87.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约24mg/kg或更低的总污染水平含水量。
88.如项目87所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约20mg/kg或更低的总污染水平含水量。
89.如项目88所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约10mg/kg或更低的总污染水平含水量。
90.如项目89所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约5mg/kg或更低的总污染水平含水量。
91.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约100℃或更高的闪点。
92.如项目91所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约110℃或更高的闪点。
93.如项目92所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约120℃或更高的闪点。
94.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约96.5wt.％或更高的酯含量。
95.如项目94所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约97wt.％或更高的酯含量。
96.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.05wt.％或更低的残碳量。
97.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有0.02wt.％或更低的硫酸盐灰分水平。
98.如项目97所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有0.01wt.％或更低的硫酸盐灰分水平。
99.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约10mg/kg或更低的磷水平。
100.如项目99所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约5mg/kg或更低的磷水平。
101.如项目100所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约1mg/kg或更低的磷水平。
102.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有1的铜腐蚀评分。
103.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约19℃或更低的冷滤点。
104.如项目103所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约10℃或更低的冷滤点。
105.如项目104所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0℃或更低的冷滤点。
106.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.02wt.％或更低的游离甘油水平。
107.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.25wt.％或更低的总甘油水平。
108.如项目107所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.15wt.％或更低的总甘油水平。
109.如项目108所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.10wt.％或更低的总甘油水平。
110.如项目109所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.05wt.％或更低的总甘油水平。
111.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.02wt.％或更低的单酰基甘油水平。
112.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.2wt.％或更低的甲醇或乙醇水平。
113.如项目112所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.1wt.％或更低的甲醇或乙醇水平。
114.如项目113所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约0.02wt.％或更低的甲醇或乙醇水平。
115.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物具有约65g/100g或更低的碘值。
116.如项目57所述的生物燃料组合物，其中所述组合物在110℃下具有约6小时或更长的氧化稳定性。
117.如项目116所述的生物燃料组合物，其中所述组合物在110℃下具有约9小时或更长的氧化稳定性。
118.如项目117所述的生物燃料组合物，其中所述组合物在110℃下具有约11小时或更长的氧化稳定性。

Claims (8)

1.经过基因工程处理以超表达编码酯合酶的异源基因的细菌宿主细胞，其中所述酯合酶包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽，其中所述多肽具有在395位氨基酸残基处的取代，在395位氨基酸残基处的甘氨酸被精氨酸或赖氨酸取代。
2.如权利要求1所述的细菌宿主细胞，其中所述多肽具有增加的酯合酶活性。
3.如权利要求1所述的细菌宿主细胞，其中所述取代是非保守氨基酸取代。
4.如权利要求1所述的细菌宿主细胞，其中所述所述取代是G395L。
5.如权利要求1所述的细菌宿主细胞，其中所述所述取代是G395R。
6.如权利要求1-5中任一项所述的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞是埃希氏菌细胞或隐球菌细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的细菌宿主细胞产生的脂肪酯。
8.包含权利要求7所述的脂肪酯的生物燃料组合物。
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