JP6251241B2 - 微生物によるアルカノールアミドおよびアミドアミンの生産ならびにそれらの使用 - Google Patents
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Description
本出願は2012年4月13日に出願された米国仮特許出願第61/623,711号の恩典を主張し、その開示全体は参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。2013年3月11日に作成された前記ASCIIコピーは、LS00041PCT_SL.txtと命名され、69,769バイトの大きさである。
本開示は、炭素源の存在下で培養された場合に脂肪酸アミドを産生するために酵素を発現するよう操作された微生物に関する。
脂肪酸アミドは、多種多様な生化学的機能および生理学的機能を有する動物脂質および植物脂質の内因性成分である (Bachur et al. (1965) J. Biol. Chem. 240:1019-1024(非特許文献1))。N-パルミトイルエタノールアミン (PEA)、N-アラキドノイルエタノールアミド(アナンダミド)、N-オレオイルエタノールアミド (OEA)、およびN-アラキドノイルドーパミン (NADA) などの内因性脂肪酸アミドは、中枢神経系および末梢神経系においてシグナル伝達分子として機能する(例えば、Tan et al. (2006) AAPSJ. 8(3): E461-E465(非特許文献2);およびLo Verme et al. (2004) Mol. Pharmacol. 67(1):15-19(非特許文献3)を参照されたい)。PEAは抗炎症活性および抗侵害受容活性を発揮することが実証されており、疼痛治療のためのPEAの薬学的製剤がNORMASTという商品名でヨーロッパで入手可能である(Petrosino et al. (2010) Biochimie 92(6):724-7(非特許文献4);およびBacci et al. (2011) ISRN Surgery, Volume 2011, Article ID 917350, 6 pages; doi:10.5402/2011/917350(非特許文献5))。
。
本開示の1つの局面は、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え微生物を提供し、この場合、該微生物は炭素源の存在下で培養される。本明細書において、微生物は、炭素源の存在下で培養された場合に、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を発現するように操作される。1つの態様において、炭素源は炭水化物である。別の態様において、ポリペプチドは、パルミトイルプトレシン合成酵素 (PPS) ポリペプチドである。さらに別の態様において、ポリペプチドは、N-(4-アミノ-2-ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) ポリペプチドである。
[本発明1001]
一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、炭素源の存在下で培養される、組換え微生物。
[本発明1002]
前記ポリペプチドがパルミトイルプトレシン合成酵素 (PPS) ポリペプチドである、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1003]
前記PPSポリペプチドが、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1002の組換え微生物。
[本発明1004]
前記PPSポリペプチドが、SEQ ID NO: 1を含むアミノ酸配列を有する、本発明1002の組換え微生物。
[本発明1005]
前記PPSポリペプチドが、SEQ ID NO: 2を含む核酸配列によってコードされる、本発明1002の組換え微生物。
[本発明1006]
前記ポリペプチドが、N-(4-アミノ-2-ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) ポリペプチドである、本発明1001の組換え微生物。
[本発明1007]
前記AhtSポリペプチドが、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1006の組換え微生物。
[本発明1008]
前記AhtSポリペプチドが、SEQ ID NO: 3を含むアミノ酸配列を有する、本発明1006の組換え微生物。
[本発明1009]
前記AhtSポリペプチドが、SEQ ID NO: 22を含む核酸配列によってコードされる、本発明1006の組換え微生物。
[本発明1010]
前記炭素源が炭水化物である、本発明1001〜1009のいずれかの組換え微生物。
[本発明1011]
前記一級アミンが、3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン、(±)-1-アミノ-2-プロパノール、2-メトキシエチルアミン、3-アミノ-1-プロパノール、2-アミノ-1,3プロパンジオール、3-メトキシプロピルアミン、N-(2-ヒドロキシエチル)エチレンジアミン、ブチルアミン、および1,4-ジアミノブタン、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1001〜1010のいずれかの組換え微生物。
[本発明1012]
前記アシルチオエステルが脂肪酸アシル-ACPまたは脂肪酸アシル-CoAである、本発明1001〜1011のいずれかの組換え微生物。
[本発明1013]
前記脂肪酸アシル-ACPまたは前記脂肪酸アシル-CoAが、前記微生物によって産生される、本発明1012の組換え微生物。
[本発明1014]
脂肪酸生合成ポリペプチド、チオエステラーゼポリペプチド(EC 3.1. 2.14またはEC 3.1.1.5)、およびアシル-CoA合成酵素ポリペプチド (EC 2.3.1.86) のうちの1つまたは複数をコードする核酸配列を含む、本発明1001〜1013のいずれかの組換え微生物。
[本発明1015]
チオエステラーゼポリペプチドおよびアシル-CoA合成酵素ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、本発明1014の組換え微生物。
[本発明1016]
前記チオエステラーゼポリペプチドをコードする核酸配列が、‘tesAの核酸配列を含む、本発明1014または1015の組換え微生物。
[本発明1017]
前記アシルCoA合成酵素ポリペプチドをコードする核酸配列がfadDである、本発明1014〜1016のいずれかの組換え微生物。
[本発明1018]
前記脂肪酸生合成ポリペプチドが、accABCD、FabD、FabH、FabG、FabB、FabA、FabZ、FabF、FabI、またはFadRをコードする核酸配列より選択される、本発明1014〜1017のいずれかの組換え微生物。
[本発明1019]
細菌、ラン藻、藻類、または真菌である、本発明1001〜1018のいずれかの組換え微生物。
[本発明1020]
真菌である、本発明1019の組換え微生物。
[本発明1021]
前記真菌が酵母または糸状菌である、本発明1020の組換え微生物。
[本発明1022]
サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・リポリティカ (Candida lipolytica)、大腸菌 (Escherichia coli)、アルスロバクター (Arthrobacter)、ロドトルラ・グルチニス (Rhodotorula glutinins)、アシネトバクター (Acinetobacter)、カンジダ・リポリティカ、ボツリオコッカス・ブラウニー (Botryococcus braunii)、ビブリオ・ファーニシイ (Vibrio furnissii)、ミクロコッカス・ルテウス (Micrococcus leuteus)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア (Stenotrophomonas maltophilia)、枯草菌 (Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス (Bacillus lichenoformis)、シュードモナス・プチダ (Pseudomonus putida)、シュードモナス・フルオレッセンス (Pseudomonas florescens)、ストレプトマイセス・セリカラー (Streptomyces coelicolor)、シネココッカス・エスピー (Synechococcus sp.) PCC7002、サーモシネココッカス・エロンガタス (Thermosynechococcus elongatus) BP-1、プロトテカ・モリフォルミス (Prototheca moriformis)、プロトテカ・クルガニ (Prototheca krugani)、プロトテカ・スタグノラ (Prototheca stagnora)、プロトテカ・ゾフィ (Prototheca zopfii)、またはクロレラ・プロトセコイデス (Chorella protothecoide) 細胞である、本発明1001〜1019のいずれかの組換え微生物。
[本発明1023]
アルスロバクター AK 19、アシネトバクター・エスピー M-1株、大腸菌B、大腸菌C、大腸菌K、または大腸菌W細胞である、本発明1022の組換え微生物。
[本発明1024]
前記一級アミンおよび前記アシルチオエステルの前記脂肪酸アミドへの変換を触媒する前記ポリペプチドが、前記微生物にとって内因性である、本発明1001〜1023のいずれかの組換え微生物。
[本発明1025]
前記一級アミンおよび前記アシルチオエステルの前記脂肪酸アミドへの変換を触媒する前記ポリペプチドが、前記微生物にとって外因性である、本発明1001〜1023のいずれかの組換え微生物。
[本発明1026]
前記脂肪酸アミドが脂肪酸アルカノールアミドまたは脂肪酸アミドアミンである、本発明1001〜1025のいずれかの組換え微生物。
[本発明1027]
セリンデカルボキシラーゼポリペプチドを発現する、本発明1001〜1026のいずれかの組換え微生物。
[本発明1028]
以下の段階を含む、脂肪酸アミドを生産する方法:
(a) 本発明1001〜1027のいずれかの組換え微生物を提供する段階;および
(b) 一級アミンおよびアシルチオエステルの該脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列の発現に適した条件下において、該ポリペプチドに対する少なくとも1つの基質の存在下で、該組換え微生物を培地中で培養する段階。
[本発明1029]
前記培地から前記脂肪酸アミドを単離する段階をさらに含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記脂肪酸アミドが、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20脂肪酸アルカノールアミドである、本発明1028または1029の方法。
[本発明1031]
前記脂肪酸アミドが、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20脂肪酸アミドアミンである、本発明1028または1029の方法。
天然抗生物質パルミトイルプトレシンは、GenBankアクセッション番号AY632377.1(以下、「AY632377」)(SEQ ID NO: 2) の核酸配列によってコードされるパルミトイルプトレシン合成酵素 (PPS)(GenBankアクセッション番号AAV33349.1(以下、「AAV33349」))(SEQ ID NO: 1) を発現する細菌によって産生され得る (Brady et al. (2004) J. Nat. Prod. 67:1283-1286)。大腸菌で過剰発現された場合、AY632377によってコードされるPPSは、プトレシンの1つの主要なN-アシル誘導体(1,4-ジアミノブタン)、すなわちパルミトイルプトレシンンのみを生成することが実証された(Brady et al、前記)。酵素、N-(4-アミノ-2_ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) をコードする相同体(GeneBankアクセッション番号ACX33975.1)(SEQ ID NO: 3) は、PPSのアミノ酸配列と38%同一であるアミノ酸配列を有する。非培養細菌RM44由来のN-(4-アミノ-2-ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) 遺伝子 (GenBank GQ869386) は、(SEQ ID NO: 22) に示される。
δ13C (%o) = [(13C/12C)試料 - (13C/12C)標準物質] / (13C/12C)標準物質 x 1000
本実施例は、アシル-CoAデヒドロゲナーゼ、外膜タンパク質受容体、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、および転写リプレッサーの発現が減弱された、遺伝子操作された微生物の構築を説明する。
本実施例は、チオエステラーゼ (‘tesA) およびアシル-CoA合成酵素 (fadD) をコードするヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下において微生物の染色体に組み込まれた、遺伝子操作された微生物の構築を説明する。
‘tesA遺伝子は、以前に記載された通りに、NdeI/AvrII消化したpETDuet-1プラスミド(Novagen、Madison, WI)に‘tesA遺伝子をクローニングすることによって構築された、pETDuet-1-‘tesAプラスミドから得た(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2010/0242345号および国際特許出願公開第WO 2007/136762号を参照されたい)。fadD遺伝子は、以前に記載された通りに、pCDFDuet-1プラスミド(Novagen、Madison, WI)にfadD遺伝子をクローニングすることによって構築された、pHZ1.61プラスミド (SEQ ID NO: 8) から得た(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2010/0257777号もまた参照されたい)。‘tesA遺伝子およびfadD遺伝子は、高忠実度PHUSION(商標)ポリメラーゼ(New England Biolabs, Inc.、Ipswich, MA)および以下のプライマーを用いて、それぞれpETDuet-1-‘tesAおよびpHZ1.61から増幅した:
。
pACYC-Ptrc-‘tesAプラスミドおよびpACYC-Ptrc-‘tesA-fadDプラスミドを鋳型として用いて、それぞれPtrc-‘tesAカセットおよびPtrc-‘tesA-fadDカセットを生成した。以下のプライマーを用いて、そのようなカセットを得た:
。
McKenzie et al., BMC Microbiology, 6:39 (2006) によって記載されるプロトコールを用いて、プラスミドTn7tesおよびTn7tesfadをそれぞれ別々に大腸菌株MG1655 DG5(実施例1に記載)にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、0.1%グルコースおよび100μg/mLカルベニシリンを含むLB培地中で32℃で一晩増殖させることにより、アンピシリン耐性細胞を選択し、次に0.1%アラビノースを含むLBプレート上で32℃で一晩増殖させることにより、Tn7転位部分を含む細胞を選択した。単一コロニーを、アンピシリンを含むまたは含まないLB培地プレート上に画線し、42℃で一晩増殖させて、Tn7tesプラスミドまたはTn7tesfadプラスミドをキュアリングした。このようにして、lacIqおよびPtrc-‘tesA遺伝子またはlacIqおよびPtrc-‘tesA-fadD遺伝子を、大腸菌MG1655染色体上のpstS遺伝子とglmS遺伝子との間に位置するattTn7部位に組み込んだ。これらの遺伝子の組込みは、以下のプライマーを用いてPCRおよび配列決定により確認した:
。
本実施例は、遺伝子操作された微生物において、パルミトイルプトレシン合成酵素をコードする遺伝子を発現させることにより、N-パルミトイルエタノールアミドを生産する方法を説明する。
本実施例は、遺伝子操作された微生物において、パルミトイルプトレシン合成酵素をコードする遺伝子を発現させることにより、N-パルミトイルエタノールアミドを生産する方法を示す。
本実施例は、遺伝子操作された微生物において、PPSをコードする遺伝子を発現させることにより、飽和脂肪酸アミドおよび不飽和脂肪酸アミドを生産する方法を示す。
本実施例は、遺伝子操作された微生物に種々の一級アミンを供給することにより、様々な脂肪酸アミドを生産するための方法を説明する。
本実施例は、遺伝子操作された微生物におけるPPSの相同体の発現により、PPSが発現された場合に産生されるものと同じ脂肪酸アミド化合物が産生されたことを示す。
。2個のコロニーが、制限消化により、AhtSコード挿入物を含むプラスミドについて陽性であった。このプラスミドは、配列解析によりAhtSコード遺伝子を含むことが確認され、「OP80-AhtS」と命名された。OP80-AhtSプラスミドを、大腸菌MG1655株DG5、DG5 Tn7-‘tesA、およびDG5 Tn7-‘tesA-fadDに形質転換した。3つの株を、実施例4に記載されるように培養して誘導し、各培養物に、3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン、(±)-1-アミノ-2-プロパノール、またはエタノールアミンのいずれかを1%の最終濃度になるまで供給した。pH調整されたインキュベーター内で60時間培養した後、培養物を回収し、酢酸エチルで抽出した(2倍量の培養物 対 1倍量の酢酸エチル)。有機画分を収集し、実施例3に記載されるように、GC-MS解析に使用した。
本実施例は、本開示による脂肪酸アミドの生成において、出発材料として有用な一級アミンを生成するためのインビボ方法を提供する。
Claims (21)
- 一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒する、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列を含むパルミトイルプトレシン合成酵素 (PPS) ポリペプチドまたはSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を含むN-(4-アミノ-2-ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) ポリペプチドをコードする核酸配列を過剰発現するように遺伝子操作された組換え微生物であって、EC 3.1.2.14またはEC 3.1.1.5のチオエステラーゼを過剰発現するようにさらに遺伝子操作された、前記組換え微生物。
- EC 2.3.1.86のアシル-CoA合成酵素をさらに発現する、請求項1に記載の組換え微生物。
- 前記PPSポリペプチドが、
(a)SEQ ID NO: 1を含むアミノ酸配列を有する、または
(b)SEQ ID NO: 2を含む核酸配列によってコードされる、
請求項1または2に記載の組換え微生物。 - 前記AhtSポリペプチドが、
(a)SEQ ID NO: 3を含むアミノ酸配列を有する、または
(b)SEQ ID NO: 22を含む核酸配列によってコードされる、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。 - 前記一級アミンが、3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン、(±)-1-アミノ-2-プロパノール、2-メトキシエチルアミン、3-アミノ-1-プロパノール、2-アミノ-1,3プロパンジオール、3-メトキシプロピルアミン、N-(2-ヒドロキシエチル)エチレンジアミン、ブチルアミン、および1,4-ジアミノブタン、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記アシルチオエステルが脂肪酸アシル-CoAである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記脂肪酸アシル-CoAが、アシル-CoA合成酵素によって産生される、請求項6に記載の組換え微生物。
- 脂肪酸生合成ポリペプチドの1つまたは複数をさらに発現する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記チオエステラーゼポリペプチドが、リーダー配列を含まない核酸配列を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記アシルCoA合成酵素ポリペプチドが、大腸菌由来のfadDである、請求項2〜9のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記脂肪酸生合成ポリペプチドが、accABCD、FabD、FabH、FabG、FabB、FabA、FabZ、FabF、FabI、またはFadRをコードする核酸配列より選択される、請求項8に記載の組換え微生物。
- 細菌、ラン藻、藻類、または真菌である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記真菌が酵母または糸状菌である、請求項12に記載の組換え微生物。
- サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・リポリティカ (Candida lipolytica)、大腸菌 (Escherichia coli)、アルスロバクター (Arthrobacter)、ロドトルラ・グルチニス (Rhodotorula glutinins)、アシネトバクター (Acinetobacter)、カンジダ・リポリティカ、ボツリオコッカス・ブラウニー (Botryococcus braunii)、ビブリオ・ファーニシイ (Vibrio furnissii)、ミクロコッカス・ルテウス (Micrococcus leuteus)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア (Stenotrophomonas maltophilia)、枯草菌 (Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス (Bacillus lichenoformis)、シュードモナス・プチダ (Pseudomonus putida)、シュードモナス・フルオレッセンス (Pseudomonas florescens)、ストレプトマイセス・セリカラー (Streptomyces coelicolor)、シネココッカス・エスピー (Synechococcus sp.) PCC7002、サーモシネココッカス・エロンガタス (Thermosynechococcus elongatus) BP-1、プロトテカ・モリフォルミス (Prototheca moriformis)、プロトテカ・クルガニ (Prototheca krugani)、プロトテカ・スタグノラ (Prototheca stagnora)、プロトテカ・ゾフィ (Prototheca zopfii)、またはクロレラ・プロトセコイデス (Chorella protothecoide) 細胞である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- アルスロバクター AK 19、アシネトバクター・エスピー M-1株、大腸菌B、大腸菌C、大腸菌K、または大腸菌W細胞である、請求項14に記載の組換え微生物。
- 前記パルミトイルプトレシン合成酵素 (PPS) ポリペプチドが、
(a)前記微生物にとって内因性である、または
(b)前記微生物にとって外因性である、
請求項1〜15のいずれか一項に記載の組換え微生物。 - 前記脂肪酸アミドが脂肪酸アルカノールアミドまたは脂肪酸アミドアミンである、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- セリンデカルボキシラーゼポリペプチドを発現する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 以下の段階を含む、脂肪酸アミドを生産する方法:
(a) 請求項1〜18のいずれか一項に記載の組換え微生物を提供する段階;および
(b) 前記PPSポリペプチドまたは前記AhtSポリペプチドをコードする核酸配列の過剰発現に適した条件下において、該ポリペプチドに対する少なくとも1つの基質の存在下で、該組換え微生物を培地中で培養する段階。 - 前記培地から前記脂肪酸アミドを単離する段階をさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 前記脂肪酸アミドが、
(a)C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20脂肪酸アルカノールアミドである、または
(b)C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20脂肪酸アミドアミンである、
請求項19または20に記載の方法。
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