ES2730713T3

ES2730713T3 - Métodos y composiciones relacionados con enzimas tioesterasas

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Publication number: ES2730713T3
Application number: ES09803969T
Authority: ES
Original assignee: REG Life Sciences LLC
Current assignee: REG Life Sciences LLC
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2019-11-12
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Abstract

Una enzima tioesterasa genomanipulada que transforma un sustrato de acil-ACP C10, C12 o C14 en un derivado de ácido graso con una mayor actividad en comparación con la tioesterasa de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 31, en donde la tioesterasa genomanipulada (a) procede una tioesterasa precursora que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a la SEC ID NO: 31; y (b) tiene una sustitución correspondiente a una sustitución seleccionada de: i) D45A, D45C, D45E, D45F, D45G, D45H, D45I, D45K, D45L, D45M, D45P, D45Q, D45S, D45T, D45V, D45W; ii) N73A, N73C, N73G, N73H, N73I, N73L, N73P, N73R, N73S, N73T, N73V, N73W; iii) G78A, G78C, G78D, G78E, G78F, G78M, G78N, G78P, G78Q, G78R, G78S, G78T, G78V, G78Y; iv) Q80A, Q80E, Q80G, Q80L, Q80M, Q80S, Q80W, Q80Y; v) E101A, E101D, E101G, E101L, E101M, E101P, E101S, E101T, E101V; vi) R108A, R108C, R108D, R108E, R108F, R108G, R108H, R108I, R108L, R108M, R108R, R108S, R108V, R108W, R108Y; vii) A111C, A111E, A111L, A111M, A111N, A111P, A111Q, A111R, A111S, A111V, A111W, A111Y; viii) Y117A, Y117C, Y117D, Y117E, Y117G, Y117H, Y1171, Y117L, Y117M, Y117N, Y117P, Y117Q, Y117R, Y117S, Y117T, Y117V, Y117W; ix) N118A, N118C, N118E, N118F, N118G, N118H, N118I, N118K, N118L, N118M, N118P, N118Q, N118S, N118T, N118V, N118W; x) S122A, S122C, S122D, S122E, S122F, S122G, S122I, S122L, S122M, S122P, S122R, S122V, S122W, S122Y; xi) Y145A, Y145C, Y145D, Y145E, Y145G, Y145I, Y145L, Y145M, Y145N, Y145Q, Y145R, Y145S, Y145T, Y145W; xii) Q152A, Q152D, Q152E, Q152F, Q152H, Q152I, Q152K, Q152L, Q152N, Q152R, Q152S, Q152T, Q152V, Q152Y; xiii) V178A, V178F, V178G, V178L, V178R, V178S, V178T, V178W; en la SEQ ID NO: 31, en donde la metionina está en la posición 0 y la alanina está en la posición 1 de la SEC ID NO: 31.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones relacionados con enzimas tioesterasas

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a una nueva enzima tioesterasa, a células hospedadoras recombinantes que comprenden la nueva tioesterasa, a métodos de producción de derivados de ácidos grasos y a derivados de ácidos grasos producidos de ese modo y a usos de los mismos. Un aspecto particular de la presente divulgación se refiere a la producción de productos químicos industriales y combustibles.

Antecedentes de la invención

Los avances en tecnología han venido acompañados por una mayor dependencia de combustibles y productos químicos industriales de fuentes petroquímicas. Dichas fuentes de combustibles son cada vez más limitadas y difíciles de adquirir. Con la quema de combustibles fósiles que tiene lugar a un ritmo sin precedentes, es probable que la demanda mundial de combustibles y de productos químicos procedentes de fuentes petroquímicas supere pronto los suministros actuales.

Como resultado, se han dirigido esfuerzos hacia el aprovechamiento de las fuentes de energía renovable, tales como la luz del sol, el agua, el viento y la biomasa. El uso de biomasa para producir nuevas fuentes de combustible y productos químicos no procedentes de fuentes de petróleo (por ejemplo, biocombustible), ha surgido como una opción alternativa.

El biocombustible es un combustible biodegradable y de combustión limpia que puede estar compuesto por alcanos y/o ésteres. Un biocombustible ejemplar es el biodiésel. El biodiésel puede utilizarse en la mayoría de los motores diésel de combustión interna en forma pura, que se conoce como biodiésel "no diluido", o como una mezcla en cualquier concentración con diésel de petróleo regular u otros biodiesel.

El biodiésel ofrece diversas propiedades beneficiosas en comparación con el diésel basado en petróleo, incluyendo emisiones reducidas (por ejemplo, monóxido de carbono, azufre, hidrocarburos aromáticos, partículas de hollín, etc.) durante la combustión. El biodiésel también mantiene un ciclo equilibrado de dióxido de carbono porque se basa en materiales biológicos renovables. Normalmente el biodiésel es completamente biodegradable y tiene un buen perfil de seguridad debido a su punto de ignición relativamente alto y a su baja combustibilidad. Asimismo, el biodiésel proporciona buenas propiedades lubricantes, reduciendo así el desgaste y la rotura de los motores.

Los métodos actuales para producir biodiésel implican la transesterificación de triacilglicéridos a partir de materias primas de aceites vegetales, tales como de la colza en Europa, de la soja en norteamérica y de aceite de palma en el sudeste asiático. Por lo tanto, la producción de biodiésel a escala industrial está restringida geográfica y estacionalmente a zonas donde se producen materias primas de aceites vegetales. El proceso de transesterificación conduce a una mezcla de ésteres grasos que puede utilizarse como biodiésel, aunque también a un subproducto indeseable, la glicerina. Para ser utilizables como biodiésel, los ésteres grasos deben purificarse adicionalmente del producto heterogéneo. Esto aumenta los costes y la cantidad de energía requerida para la producción de ésteres grasos y, finalmente, también para la producción de biodiésel. Asimismo, las materias primas de aceite vegetal son fuentes de energía ineficaces porque requieren una extensa superficie de cultivo. Por ejemplo, el rendimiento de biodiésel procedente de la colza es de solo 1300 l/hectárea porque solo se utiliza el aceite de la semilla para la producción de biodiesel, y no el resto de la biomasa de la colza. Adicionalmente, cultivar algunas materias primas de aceite vegetal, como la colza y la soja, requiere una rotación frecuente del cultivo para evitar el empobrecimiento de nutrientes de la tierra.

La publicación PCT No. WO 2007/136762 desvela microorganismos recombinantes que son capaces de sintetizar productos procedentes de la ruta sintética de ácidos grasos, incluyendo, entre otros, ésteres de ácidos grasos y alcoholes grasos. En particular, se describen determinados derivados de ácidos grasos que tienen una longitud, una ramificación y niveles de saturación definidos de la cadena de carbonos. La publicación '762 describe células recombinantes que utilizan sobreexpresión endógena o expresión heteróloga de proteínas tioesterasas en la producción de derivados de ácidos grasos.

La publicación PCT No. WO 2008/119082 desvela células y microorganismos genomanipulados que producen productos a partir de la ruta biosintética de ácidos grasos, incluyendo, entre otros, ésteres de ácidos grasos y alcoholes grasos. La publicación '082 describe células recombinantes que utilizan la sobreexpresión de enzimas acil-CoA sintetasa para producir de manera más eficiente derivados de ácidos grasos.

La Patente de Estados Unidos N° 5.955.329 desvela proteínas acil-ACP tioesterasas de plantas genomanipuladas (manipuladas mediante ingeniería genética), que tienen especificidad de sustrato alterada. En particular, la patente '329 desvela la producción de acil-ACP tioesterasas de plantas genomanipuladas, en donde las acil-ACP tioesterasas de plantas genomanipuladas demuestran especificidad de sustrato alterada con respecto a sustratos de acil-ACP hidrolizados por las tioesterasas de plantas en comparación con la acil-ACP tioesterasa nativa.

Lee et al. (Biochimica et Biophysica Acta 1774 (2007) 959-967) describen una variante de la tioesterasa de SEC ID NO: 31 que tiene una sustitución de aminoácido en la posición 109 (L109P), conservando dicha variante solo aproximadamente el 5 % de las actividades de la enzima nativa hacia tanto la lauroil como la estearoil-CoA.

Mientras que la técnica anterior desvela ciertas descripciones útiles con respecto a la producción de ciertos derivados de ácidos grasos, existe una necesidad en el campo de métodos y procedimientos mejorados para una producción más eficaz y económica de dichos derivados de ácidos grasos, y también para tecnología que facilite la producción de composiciones que tengan especificaciones de producto alteradas. Como ejemplo específico, existe una necesidad para la producción de composiciones de ácidos grasos que tengan especificaciones y propiedades previamente diseñadas o "adaptadas" para aplicaciones particulares tales como combustibles, detergentes, lubricantes, moléculas precursoras industriales y otras aplicaciones valiosas de derivados de ácidos grasos.

Sumario de la invención

La presente divulgación se refiere a enzimas tioesterasas mutantes y naturales útiles, a polinucleótidos que codifican estas enzimas, a vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican las enzimas tioesterasas útiles, a células hospedadoras recombinantes que comprenden enzimas tioesterasas endógenas mutadas, a células hospedadoras recombinantes transformadas con los vectores, a células hospedadoras recombinantes que tienen polinucleótidos que codifican enzimas tioesterasas útiles cromosómicamente integradas en ellas, a tioesterasas producidas por las células hospedadoras, a composiciones derivadas de ácidos grasos (tales como productos químicos industriales y biocombustibles) producidas in vitro y/o in vivo, a métodos para producir composiciones derivadas de ácidos grasos in vitro y/o in vivo, y a métodos de uso de las composiciones producidas derivadas de ácidos grasos.

La presente divulgación se refiere a métodos para producir composiciones derivadas de ácidos grasos a través de fermentaciones microbianas que tienen perfiles de productos predeterminados con respecto a las longitudes de las cadenas de carbono y rendimientos proporcionales. Estas composiciones son muy adecuadas para aplicaciones en las industrias química y de combustibles porque sus propiedades pueden adaptarse a las aplicaciones particulares para las que están destinadas. Por ejemplo, es posible adaptar un producto de éster graso, según los métodos descritos en el presente documento, de tal manera que pueda utilizarse como combustible para automóviles y/o para diseñar una composición que tenga, por ejemplo, características de combustible mejoradas, tales como el punto de enturbamiento, lubricidad, número de cetano, viscosidad cinemática, número de ácido, punto de ebullición, estabilidad oxidativa, punto de obstrucción del filtro en frío, perfil de impurezas, nivel de ceniza sulfatada y/o punto de ignición. Del mismo modo, es posible producir productos químicos industriales según los métodos descritos en el presente documento que puedan reemplazar a los productos químicos actuales procedentes de fuentes de petróleo, y que estén adaptados a aplicaciones particulares, por ejemplo, para producir alcoholes grasos que son óptimamente idóneos para su uso como tensioactivos y/o detergentes.

La presente divulgación se refiere a métodos alternativos para producir ésteres grasos sin la presencia (o en ausencia) de una éster sintasa. Este método es energéticamente más favorable que los métodos hasta ahora desvelados para producir composiciones de ésteres grasos a través de procesos de fermentación microbiana, que requieren al menos tanto una enzima tioesterasa como una enzima éster sintasa. Como tales, las nuevas tioesterasas de la divulgación proporcionan ventajas adicionales. La presente invención está definida por las reivindicaciones. En particular, la presente invención proporciona una enzima tioesterasa genomanipulada que transforma un sustrato de acil-ACP C10, C12 o C14 en un derivado de ácido graso con una mayor actividad en comparación con la tioesterasa de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID NO: 31, en donde la tioesterasa genomanipulada (a) procede de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a la SEC ID NO: 31, y (b) tiene una sustitución correspondiente a una sustitución seleccionada de:

i) D45A, D45C, D45E, D45F, D45G, D45H, D45I, D45K, D45L, D45M, D45P, D45Q, D45S, D45T, D45V, D45W; ii) N73A, N73C, N73G, N73H, N73I, N73L, N73P, N73R, N73S, N73T, N73V, N73W;

iii) G78A, G78C, G78D, G78E, G78F, G78M, G78N, G78P, G78Q, G78R, G78S, G78T, G78V, G78Y;

iv) Q80A, Q80E, Q80G, Q80L, Q80M, Q80S, Q80W, Q80Y;

v) E101A, E101D, E101G, E101L, E101M, E101P, E101S, E101T, E101V;

vi) R108A, R108C, R108D, R108E, R108F, R108G, R108H, R108I, R108L, R108M, R108R, R108S, R108V, R108W, R108Y;

vii) A111C, A111E, A111L, A111M, A111N, A111P, A111Q, A111R, A111S, A111V, A111W, A111Y;

viii) Y117A, Y117C, Y117D, Y117E, Y117G, Y117H, Y117I, Y117L, Y117M, Y117N, Y117P, Y117Q, Y117R, Y117S, Y117T, Y117V, Y117W;

ix) N118A, N118C, N118E, N118F, N118G, N118H, N118I, N118K, N118L, N118M, N118P, N118Q, N118S, N118T, N118V, N118W;

x) S122A, S122C, S122D, S122E, S122F, S122G, S122I, S122L, S122M, S122P, S122R, S122V, S122W, S122Y;

xi) Y145A, Y145C, Y145D, Y145E, Y145G, Y145I, Y145L, Y145M, Y145N, Y145Q, Y145R, Y145S, Y145T, Y145W;

xii) Q152A, Q152D, Q152E, Q152F, Q152H, Q152I, Q152K, Q152L, Q152N, Q152R, Q152S, Q152T, Q152V, Q152Y;

xiii) V178A, V178F, V178G, V178L, V178R, V178S, V178T, V178W;

de la SEC ID NO: 31, en donde la metionina está en la posición 0 y alanina está en la posición 1 de la SEC ID NO: 31 (Fig. 58).

Se desvelan tioesterasas mutantes (o sus equivalentes naturales) que proceden de una tioesterasa precursora, en donde cada una de las mutantes (o los equivalentes naturales) tiene al menos una propiedad alterada in vitro y/o in vivo, en comparación con las propiedades de la tioesterasa precursora. La propiedad alterada puede ser, por ejemplo, una propiedad biofísica, tal como estabilidad térmica (punto de fusión T^m(melting, fusión)); estabilidad de disolventes, solutos y/u oxidativa; lipofilicidad; hidrofilidad; estructura cuaternaria; momento dipolar; y/o punto isoeléctrico. La propiedad alterada también puede ser, por ejemplo, una propiedad bioquímica, tal como pH óptimo, temperatura óptima y/o fuerza iónica óptima. Adicionalmente, la propiedad alterada puede ser, por ejemplo, un parámetro catalítico enzimático, tal como la distribución del producto (incluyendo, por ejemplo, un mayor o menos porcentaje o rendimiento proporcional para un producto en particular en comparación con otros productos en la mezcla del producto), actividad específica, preferencia de sustrato, afinidad de sustrato, inhibición del sustrato, afinidad del producto, velocidad de recambio o velocidad catalítica, inhibición del producto, mecanismo cinético, K^m, k^cat, k^cat/K^my/o V^Máx. Adicionalmente, la propiedad alterada es, por ejemplo, un aumento o una disminución de la actividad o un cambio en la preferencia por la alcohólisis frente a la hidrólisis, sustratos de acil proteína transportadora de acil-CoA frente a acil proteína transportadora de acilos, sustratos de ésteres frente a tioéster, sustratos saturados frente a insaturados, sustratos de cadena lineal frente a ramificados; cambios en las posiciones de insaturación, intervalos de números de cetano, o longitudes de cadenas de carbono específicas, sustratos ramificados, posición de ramificación, sustratos de hidroxiacilo, sustratos de ceto-acilo; y/o productos con un intervalo cambiado de números de cetano o con números de cetano específicos, índice de octano, estabilidad oxidativa, lubricidad, punto de ignición, viscosidad, punto de ebullición, punto de fusión, punto de fluidez, punto de enturbamiento, punto de obstrucción del filtro en frío, características de flujo en frío, aromaticidad y/o número de yodos. Las propiedades alteradas también pueden incluir, por ejemplo, una disminución de la actividad o una atenuación de la hidrólisis de los ésteres, de tal manera que la hidrólisis de las moléculas del producto deseado se reduce o elimina. Las propiedades alteradas pueden incluir, además, por ejemplo, una disminución en la toxicidad de la proteína para la célula y/o un cambio en el nivel de expresión de la proteína en la célula, en comparación con la toxicidad de la proteína precursora para la célula y/o con el nivel de expresión en la misma célula. En un aspecto ejemplar, una propiedad alterada puede incluir un cambio en la capacidad para catalizar la síntesis de derivados de acilo graso directa o indirectamente in vivo o in vitro. En otra realización ejemplar, una propiedad alterada es la mejora o aumento del rendimiento in vitro y/o in vivo o rendimiento proporcional de un derivado de ácido graso particularmente deseable.

En un aspecto, una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales) procede de una tioesterasa precursora. En un aspecto particular, la tioesterasa precursora es una tioesterasa natural, una tioesterasa previamente modificada, o una tioesterasa sintética.

En un aspecto, la tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales) procede de una tioesterasa precursora que es una tioesterasa natural. La tioesterasa precursora natural puede obtenerse a partir de, por ejemplo, una planta, un animal, una bacteria, un hongo, una levadura, o de otras fuentes microbianas. La tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales) puede proceder de una tioesterasa precursora de los siguientes géneros Acidovorax, Acinetobacter, Aeromonas, Alcanivorax, Aliivibrio, Alkalilimnicola, Alteromonadales, Alteromonas, Aurantimonas, Azoarcus, Azorhizobium, Azotobacter, Beggiatoa, Beijerinckia, Bordetella, Bradyrhizobium, Burkholderia, Caulobacter, Cellvibrio, Chromobacterium, Citrobacter, Comamonas, Cupriavidus, Dechloromonas, Delftia, Desulfovibrio, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Geobacter, Hahella, Halorhodospira, Herminiimonas, Idiomarina, Janthinobacterium, Klebsiella, Leptospira, Leptotrix, Limnobacter, Magnetospirillum, Marinobacter, Marinomonas, Metilibio, Metilobacilo, Methylobacterium, Metilocella, Methylococcus, Moritella, Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrosomonas, Nitrosospira, Oceanospirillum, Oligotropha, Pectobacterium, Photobacterium, Photorhabdus, Polaromonas, Proteus, Providencia, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Psychromonas, Ralstonia, Reinekea, Rhodobacterales, Rhodoferax, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Saccharophagus, Salmonella, Serratia, Shewanella, Shigella, Stenotrophomonas, Streptococcus, Thauera, Thioalkalivibrio, Thiobacillus, Vibrio, Xanthomonas o Yersinia.

En un aspecto particular, la tioesterasa precursora puede proceder de cualquiera de Acidovorax avenae subsp. citrulli AAC00-1, Acidovorax sp. JS42, Acinetobacter baumannii ACICU, Acinetobacter baumannii ATCC 17978, Aeromonas hydrophila subsp. Hydrophila ATCC 7966, Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida A449, Alcanivorax borkumensis SK2, Alcanivorax sp. DG881, Aliivibrio salmonicida LFI1238, Alkalilimnicola ehrlichei MLHE-1, alfa proteobacterium HTCC2255, Alteromonadales bacterium TW-7, ecotipo profundo de Alteromonas macleodii, Aurantimonas sp. SI85-9A1, Azoarcus sp. BH72, Azorhizobium caulinodans ORS 571, Azotobacter vinelandii AvOP, Beggiatoa sp. PS, Beijerinckia indica subsp. indica ATCC 9039, Bordetella avium 197N, Bordetella bronchiseptica RB50, Bordetella parapertussis 12822, Bordetella pertussis Tohama I, Bordetella petrii DSM 12804, Bradyrhizobium sp. BTAil, Bradyrhizobium sp. ORS278, Burkholderia ambifaria AMMD, Burkholderia ambifaria IOP40-10, Burkholderia ambifaria MC40-6, Burkholderia ambifaria MEX-5, Burkholderia cenocepacia AU 1054, Burkholderia cenocepacia HI2424, Burkholderia cenocepacia J2315, Burkholderia cenocepacia MC0-3, Burkholderia cenocepacia PC184, Burkholderia dolosa AUO158, Burkholderia graminis C4D1M, Burkholderia mallei ATCC 23344, Burkholderia mallei GB8 horse 4, Burkholderia mallei NCTC 10229, Burkholderia multivorans ATCC 17616, Burkholderia oklahomensis C6786, Burkholderia oklahomensis EO147, Burkholderia phymatum STM815, Burkholderia pseudomallei 1106a, Burkholderia pseudomallei 1106b, Burkholderia pseudomallei 14, Burkholderia pseudomallei 1655, Burkholderia pseudomallei 1710b, Burkholderia pseudomallei 305, Burkholderia pseudomallei 406e, Burkholderia pseudomallei 668, Burkholderia pseudomallei 7894, Burkholderia pseudomallei K96243, Burkholderia pseudomallei NCTC 13177, Burkholderia sp. 383, Burkholderia thailandensis Bt4, Burkholderia thailandensis E264, Burkholderia thailandensis MSMB43, Burkholderia thailandensis TXDOH, Burkholderia ubonensis Bu, Burkholderia vietnamiensis G4, Caulobacter crescentus CB15, Cellvibrio japonicus Ueda107, Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Chromohalobacter salexigens DSM 3043, Citrobacter koseri ATCC BAA-895, Comamonas testosteroni KF-1, Cupriavidus taiwanensis, Dechloromonas aromatica RCB, Delftia acidovorans SPH-1, Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans cepa G20, Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans cepa G20, Enterobacter cancerogenus ATCC 35316, Enterobacter sakazakii ATCC BAA-894, Enterobacter sp. 638, Erwinia tasmaniensis, Escherichia albertii TW07627, Escherichia coli O157.H7 EDL933, Escherichia coli O157:H7 cepa EC4024, Escherichia coli O157:H7 cepa EC4196, gamma proteobacterium HTCC5015, gamma proteobacterium KT 71, Geobacter sp. M21, Hahella chejuensis KCTC 2396, Halorhodospira halophila SL1, Herminiimonas arsenicoxydans, Idiomarina baltica OS145, Idiomarina loihiensis L2TR, Janthinobacterium sp. Marseille, Klebsiella pneumoniae 342, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578, Klebsiella sp. ZD414, Leptospira interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130, Leptospira interrogans serovar Copenhageni cepa 56601, Leptothrix cholodnii SP-6, Limnobacter sp. MED105, Magnetospirillum magneticum AMB-1, gamma proteobacterium marina HTCC2080, gamma proteobacterium marina HTCC2143, gamma proteobacterium marina HTCC2207, metagenoma marino, Marinobacter algicola DG893, Marinobacter aquaeolei VT8, Marinobacter sp. ELB17, Marinomonas sp. MWYL1, Methylibium petroleiphilum PM1, Methylobacillus flagellatus KT, Methylobacterium chloromethanicum CM4, Methylobacterium extorquens PA1, Methylobacterium populi BJ001, Methylocella silvestris BL2, Methylococcus capsulatus cepa Bath, Moritella sp. PE36, Nitrobacter sp. Nb-311A, Nitrobacter winogradskyi Nb-255, Nitrococcus mobilis nb-231, Nitrosococcusoceani ATCC 19707, Nitrosococcus oceani C-27, Nitrosomonas europaea ATCC 19718, Nitrosomonas eutropha C91, Nitrosospira multiformis ATCC 25196, Oceanospirillum sp. MED92, Oligotropha carboxidovorans OM5, Pectobacterium atrosepticum SCRI1043, Photobacterium profundum 3TCK, Photobacterium profundum SS9, Photobacterium sp. SKA34, Photorhabdus luminescens, Photorhabdus luminescens subsp. laumondii TTO1, Polaromonas naftalenivoranos CJ2, Polaromonas sp. JS666, Polynucleobacter sp. QLW-P1DMWA-1, Proteus mirabilis HI4320, Providencia stuartii ATCC 25827, Pseudoalteromonas atlantica T6c, Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125, Pseudoalteromonas sp. 643A, Pseudoalteromonas tunicata D2, Pseudomonas aeruginosa PA7, Pseudomonas aeruginosa PACS2, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14, Pseudomonas entomophila L48, Pseudomonas fluorescens Pf0-1, Pseudomonas fluorescens Pf-5, Pseudomonas mendocina ymp, Pseudomonas putida F1, Pseudomonas putida GB-1, Pseudomonas putida KT2440, Pseudomonas putida W619, Pseudomonas stutzeri A1501, Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola 1448A, Pseudomonas syringae pv. syringae B728a, Pseudomonas syringae pv. tomate cepa DC3000, Psychromonas ingrahamii 37, Ralstonia eutropha H16, Ralstonia eutropha JMP134, Ralstonia metallidurans CH34, Ralstonia pickettii 12D, Ralstonia pickettii 12J, Ralstonia solanacearum GMI1000, Ralstonia solanacearum IPO1609, Ralstonia solanacearum MolK2, Ralstonia solanacearum UW551, Reinekea sp. Med297, Bacteria Rhodobacterales Y4I, Rhodoferax ferrireducens T118, Rhodopseudomona spalustris BisA53, Rhodopseudomonas palustris BisB18, Rhodopseudomonas palustris BisB5, Rhodopseudomonas palustris CGA009, Rhodopseudomonas palustris HaA2, Rhodopseudomonas palustris TIE-1, Rhodospirillum centenum SW, Saccharophagus degradans 2-40, Salmonella enterica subsp. arizonae serovar 62:z4,z23:--,Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis cepa SC-B67, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar allinarum cepa 287/91, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Hadar cepa RI_05P066, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Javiana cepa GA_MM04042433, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Saintpaul cepa SARA23, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Saintpaul cepa SARA29, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhi cepa CT18, Salmonella typhimurium LT2, Serratia proteamaculans 568, Shewanella amazonensis SB2B, Shewanella baltica OS155, Shewanella baltica OS185, Shewanella baltica OS195, Shewanella baltica OS223, Shewanella benthica KT99, Shewanella denitrificans OS217, Shewanella frigidimarina NCIMB 400, Shewanella halifaxensis HAW-EB4, Shewanella loihica PV-4, Shewanella oneidensis MR-1, Shewanella pealeana ATCC 700345, Shewanella putrefaciens 200, Shewanella sediminis HAW-EB3, Shewanella sp. ANA-3, Shewanella sp. MR-4, Shewanella sp. MR-7, Shewanella sp. W3-18-1, Shewanella woodyi ATCC 51908, Shigella boydii Sb227, Shigella dysenteriae Sd197, Stenotrophomonas maltophilia K279a, Stenotrophomonas maltophilia R551-3, Streptococcus sp. (N1), construcción sintética, Thauera sp. MZ1T, Thioalkalivibrio sp. HL-EbGR7, Thiobacillus denitrificans ATCC25259, Thiomicrospira crunogena x CL-2, Vibrio alginolyticus 12G01, Vibrio angustum S14, Vibrio campbellii AND4, Vibrio cholerae 2740-80, Vibrio cholerae MZO-2, Vibrio cholerae O1 biovar eltor cepa N16961, Vibrio cholerae V51, Vibrio fischeri ES114, Vibrio fischeri MJ11, Vibrio harveyi ATCC BAA-1116, Vibrio mimicus, Vibrionales bacterium SWAT-3, Vibrio parahaemolyticus AQ3810, Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633, Vibrio shilonii AK1, Vibrio splendidus 12B01, Vibrio sp. MED222, Vibrio vulnificus CMCP6, Vibrio vulnificus YJ016, Xanthomonas axonopodis pv. citri cepa 306, Xanthomonas campestris pv. campestris cepa ATCC 33913, Xanthomonas campestris pv. campestris cepa B100, Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria cepa 85-10, Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC10331, Xanthomonas oryzae pv. oryzae PXO99A, Xanthomonas oryzae pv. oryzicola BLS256, Yersinia bercovieri ATCC 43970, Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 8081, Yersinia frederiksenii ATCC 33641, Yersinia intermedia ATCC 29909, Yersinia mollaretii ATCC 43969, Yersinia pestis Angola, Yersinia pestis biovar Orientalis cepa F1991016, Yersinia pestis CO92, Yersinia pestis KIM o Yersinia pseudotuberculosis IP 31758.

En un aspecto, la tioesterasa precursora es una tioesterasa que tiene una secuencia análoga a la de 'TesA (por ejemplo, una enzima TesA sin el péptido señal). La tioesterasa precursora puede tener al menos aproximadamente 20 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con 'TesA. En otro ejemplo más, la tioesterasa precursora tiene al menos aproximadamente 20 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% o 99% de identidad de secuencia con una 'TesA que se obtiene de una bacteria E. coli, tal como, una bacteria E.coli K12. En un ejemplo adicional, la tioesterasa precursora es una tioesterasa que tiene una secuencia análoga a la secuencia de la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, y preferentemente al menos aproximadamente 20 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58. La secuencia análoga puede ser de una proteína de origen natural o puede ser de una proteína modificada previamente.

En un aspecto, la tioesterasa precursora es una tioesterasa que comprende las siguientes series de aminoácidos:

G-D-S-L-X(5)-M (SEQ ID NO:28), en la que:

la "X" se refiere a cualquier resto de aminoácido; el número en el paréntesis adyacente al mismo, cuando está presente, se refiere al número de restos X en el tramo de restos de aminoácidos;

el resto S en la posición 3 es un resto catalítico;

el resto D en la posición 2 puede estar sustituido con N o T;

el resto L en la posición 4 puede estar sustituido con C o Q;

el resto M en la posición 10 puede estar sustituido con C, D, L, N, T o V;

y/o

V-X(2)-G-X-N-D-X-L (SEQ ID NO:29), en la que:

cada "X" se refiere a cualquier resto de aminoácido; el número en el paréntesis adyacente al mismo, cuando está presente, se refiere al número de restos X en el tramo de restos de aminoácidos;

el resto N en la posición 6 está en el orificio oxianiónico;

el resto V en la posición 1 puede estar sustituido con L;

el resto N en la posición 6 puede estar sustituido con V, L, C, A, G, H, I, T o W;

el resto D en la posición 7 puede estar sustituido con E;

el resto L en la posición 9 puede estar sustituido con I, W, F, T, M, A, E, N o V;

y/o

D-X(2)-H-P-X(7)-I (SEQ ID NO:30), en la que:

cada "X" se refiere a cualquier resto de aminoácido; cada número en el paréntesis adyacente al mismo, cuando está presente,

se refiere al número de restos X en el tramo respectivo de restos de aminoácidos;

los restos D y H en las posiciones 1 y 4 respectivamente son los restos catalíticos;

el resto P en la posición 5 puede estar sustituido con G, A, F, L, S o V;

el resto I en la posición 13 puede estar sustituido con L o V.

En un aspecto, la tioesterasa precursora es una tioesterasa que tiene inmunorreactividad cruzada con una 'TesA obtenida de una bacteria E. coli. En un aspecto particular, la tioesterasa precursora tiene inmunorreactividad cruzada con la 'TesA obtenida de una bacteria E. coli K-12. En un aspecto particular, la tioesterasa precursora tiene inmunorreactividad cruzada con una tioesterasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 31 como se expone en la FIG. 58. En un aspecto particular, la tioesterasa precursora tiene reactividad cruzada con fragmentos (o partes) de cualquiera de las tioesterasas obtenidas de una bacteria E. coli, o de una bacteria E. coli K-12 y/o de cualquier tioesterasa que comprenda la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 31 como se expone en la FIG. 58. La enzima precursora que tiene inmunorreactividad cruzada con 'TesA puede ser una proteína de origen natural, una proteína previamente modificada, o una proteína sintética.

En otro ejemplo particular, la tioesterasa precursora es una 'TesA de una bacteria E. coli, o es un homólogo, un parálogo o un ortólogo de una 'TesA de una bacteria E. coli, tal como una 'TesA de una bacteria E. coli K12. La tioesterasa precursora de la que procede un mutante de la presente divulgación, también puede ser una parte o un fragmento enzimáticamente activa(o) de una cualquiera de las tioesterasas descritas anteriormente.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una sustitución de un aminoácido, en comparación con una tioesterasa precursora, de modo que la tioesterasa mutante tiene al menos una propiedad alterada en relación con la tioesterasa precursora. En un aspecto ejemplar, se desvela una tioesterasa mutante que tiene una secuencia de aminoácidos con una sola mutación por sustitución y muestra al menos una propiedad alterada en comparación con la tioesterasa precursora de la que procede la mutante. En un aspecto ejemplar, se desvela una tioesterasa mutante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene dos o más mutaciones por sustitución a partir de la secuencia de su tioesterasa precursora, y la tioesterasa mutante tiene al menos una propiedad alterada en comparación con la tioesterasa precursora.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que es una variante de una tioesterasa precursora, y que tiene al menos una propiedad alterada in vitro o en vivo en relación con dichas tioesterasa precursora, en donde la tioesterasa precursora es una tioesterasa que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58 y, por consiguiente, comprende los restos de aminoácidos correspondientes 1-182 de la s Ec ID NO: 31, y en donde la tioesterasa precursora se modifica en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas de las posiciones correspondientes a uno o más restos 1-182 de la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58 y, por consiguiente, comprende los correspondientes restos de aminoácidos 1-182 de la SEC ID NO: 31, y que tiene al menos una propiedad alterada in vitro o in vivo en relación con dicha tioesterasa precursora, en donde la tioesterasa precursora se muta en una o más posiciones, correspondientes a una o más posiciones de aminoácidos de la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, seleccionadas de las posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 y/o 182.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o un equivalente natural), que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58 y, por consiguiente, comprende los correspondientes restos de aminoácidos 1-182 de la SEC ID NO: 31, y que tiene al menos una propiedad alterada in vitro o in vivo en relación con dicha tioesterasa precursora, en donde la tioesterasa precursora se muta con una o más sustituciones seleccionadas de A1C, A1F, A1L, A1Q, A1R, A1S, A1V, A1Y, D2E, D2H, D2K, D2L, D2M, D2P, D2R, D2W, T3E, T3G, T3K, T3L, T3R, T3W, L4A, L4G, L4M, L4N, L4S, L4V, L4Y, L5C, L5E, L5F, L5G, L5H, L5K, L5N, L5Q, L5S, L5W, L5Y, I6A, I6L, I6T, I6V, L7A, L7C, L7E, L7K, L7M, L7N, L7S, L7T, L7V, L7W, L7Y, G8A, G8K, G8S, D9N, D9T, S10C, L11A, L11C, L11I, L11M, L11Q, L11V, S12A, S12I, S12L, S12M, S12N, S12T, S12V, S12Y, A13C, A13D, A13G, A13H, A13I, A13L, A13N, A13S, A13T, A13V, A13W, A13Y, G14A, G14C, G14E, G14F, G14I, G14K, G14M, G14N, G14P, G14Q, G14R, G14S, G14T, G14V, Y15A, Y15C, Y15D, Y15E, Y15G, Y15I, Y15L, Y15M, Y15N, Y15Q, Y15R, Y15S, Y15V, R16A, R16D, R16E, R16G, R16H, R16I, R16L, R16M, R16N, R16P, R16Q, R16S, R16T, R16V, R16W, M17A, M17C, M17D, M17E, M17G, M17K, M17L, M17N, M17P, M17Q, M17R, M17S, M17T, M17V, S18E, S18M, S18N, S18T, A19C, A19E, A19L, A19V, S20A, S20C, S20D, S20G, S20L, S20T, S20W, A21G, A21I, A21L, A21P, A21Y, A22C, A22D, A22E, A22F, A22G, A22H, A22I, A22K, A22L, A22M, A22N, A22P, A22R, A22S, A22T, A22Y, W23A, W23H, W23N, W23P, W23Y, P24A, P24C, P24D, P24E, P24F, P24G, P24I, P24M, P24N, P24S, P24T, P24V, P24W, A25D, A25E, A25L, A25N, A25P, A25Q, A25R, A25S, A25V, L26C, L26D, L26E, L26F, L26G, L26H, L26I, L26K, L26N, L26P, L26Q, L26R, L26S, L26V, L26W, L26Y, L27A, L27C, L27F, L27H, L27M, L27R, L27S, L27T, L27V, L27W, L27Y, N28A, N28G, N28I, N28K, N28M, N28P, N28R, N28W, D29M, D29P, D29V, K30P, W31D, W31E, W31G, W31L, W31N, W31P, W31R, W31S, W31T, Q32V, Q32Y, S33F, S33G, 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D161E, D161G, D161I, D161K, D161L, D161M, D161N, D161Q, D161R, D161S, D161V, D161W, A162G, A162I, A162K, A162L, A162N, A162R, A162T, A162V, A162Y, Q163A, Q163C, Q163D, Q163E, Q163F, Q163G, Q163I, Q163L, Q163M, Q163S, Q163T, Q163V, Q163W, Q163Y, P164A, P164C, P164D, P164K, P164L, P164M, P164N, P164R, P164T, P164V, P164W, F165D, F165E, F165G, F165H, F165I, F165K, F165L, F165M, F165R, F165S, F165T, F165V, F165W, F165Y, I166A, I166C, I166F, I166L, I166M, I166S, I166V, I166Y, A167C, A167D, A167E, A167F, A167G, A167K, A167L, A167M, A167N, A167Q, A167R, A167T, A167V, A167W, A167Y, D168A, D168G, D168H, D168L, D168M, D168P, D168R, D168T, D168V, D168W, W169A, W169D, W169E, W169G, W169K, W169M, W169Q, W169R, W169S, W169T, W169V, M170A, M170E, M170F, M170G, M170H, M170L, M170N, M170Q, M170S, M170T, M170V, M170W, M170Y, A171E, A171F, A171I, A171S, A171V, A171W, K172A, K172M, K172P, Q173D, Q173I, Q173N, Q173P, Q173W, Q173Y, L174A, L174F, L174G, L174Q, L174S, L174T, L174W, L174W, L174Y, Q175F, Q175I, Q175L, Q175M, Q175Y, P176D, P176H, P176K, P176L, P176N, P176Q, P176R, P176V, P176W, P176Y, L177D, L177F, L177G, L177M, L177S, L177T, V178A, V178F, V178G, V178K, V178L, V178R, V178S, V178T, V178W, N179G, N179H, N179R, N179T, N179V, N179W, N179Y, H180A, H180E, H180G, H180L, H180P, H180R, H180S, H180V, H180W, D181A, D181C, D181E, D181G, D181H, D181I, D181L, D181P, D181Q, D181R, D181S, D181T, D181W, S182A, S182C, S182D, S182E, S182G, S182I, S182K, S182L, S182N, S182P, S182Q, S182R, S182T y/o S180V, en donde, en las designaciones de mutación por sustitución, los números se refieren a posiciones de aminoácidos de la SEC ID NO: 31.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que tiene una especificidad por el sustrato, y/o una actividad del sustrato, aumentada (por ejemplo, velocidad catalítica), con respecto a sustratos de C10 (es decir, sustratos, cuyas cadenas de carbono tienen una longitud de 10 carbonos), y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a uno o más de los restos seleccionados de 5-30, 35-60, 65-98, 102-139 y/o 140-180 de la SEC ID NO: 31. El aumento de la especificidad por el sustrato y/o de la actividad del sustrato con respecto a sustratos de C10 puede medirse in vitro y/o in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que tiene una especificidad por el sustrato, y/o una actividad del sustrato, aumentada (por ejemplo, velocidad catalítica), con respecto a sustratos de C10 y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a uno o más restos de la SEC ID NO: 31 seleccionados de 1, 3, 4, 7, 9, 12, 13, 14, 16, 17, 20, 22, 24, 25, 28, 32, 38, 39, 40, 42, 43, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 56, 59, 60, 64, 68, 72, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 130 ,132, 133, 134, 138, 139, 140, 141, 142, 144, 145, 146, 147, 148, 150, 151, 152, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 , 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 y/o 182. El aumento de la especificidad por el sustrato y/o de la actividad del sustrato con respecto a sustratos de C10 puede medirse in vitro y/o in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o un equivalente natural), que tiene una especificidad por el sustrato, y/o una actividad del sustrato, aumentada (por ejemplo, velocidad catalítica), con respecto a sustratos de C10 y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta con una o más sustituciones seleccionadas de A1L, A1S, T3K, L4A, L7M, L7V, D9N, S12A, A13D, G14A, G14E, G14P, G14Q, G14R, G14S, G14V, R16G, R16L, R16M, R16N, R16P, R16Q, R16T, M17C, M17L, M17T, M17V, S20A, S20C, S20D, S20G, S20L, S20T, S20W, A22C, A22D, A22E, A22G, A22H, A22I, A22K, A22N, P24A, P24C, P24D, P24F, P24I, P24S, P24T, P24V, P24W, A25E, A25L, A25N, A25Q, A25V, N28A, N28R, Q32V, Q32Y, V38E, V38K, V38R, N39A, N39T, A40D, A40H, I42A, I42E, I42L, I42S, I42T, I42W, I42Y, S43A, S43C, S43D, S43E, S43L, S43N, S43P, T46E, T46F, T46I, T46L, T46V, S47A, S47C, S47F, S47G, S47L, S47M, S47T, S47V, Q48D, Q48E, Q48G, Q48S, Q48T, Q48V, Q48W, Q49A, Q49C, Q49D, Q49G, Q49H, Q49L, Q49M, Q49S, G50A, G50Q, L51A, L51F, L51H, L51Y, A52D, A52M, L54T, A56P, K59R, Q60M, R64D, R64E, R64Q, V68L, G72A, G72C, G72P, G72S, G75A, G75C, G75D, G75E, G75F, G75I, G75K, G75L, G75M, G75N, G75P, G75T, G75V, G75W, G75Y, L76A, L76D, L76G, L76I, L76K, L76M, L76N, L76P, L76Q, L76R, L76W, R77G, R77L, R77Q, G78A, G78C, G78E, G78F, G78M, G78N, G78Q, G78R, G78S, G78T, G78V, G78Y, F79A, F79D, F79E, F79G, F79H, F79N, F79Q, F79W, F79Y, Q80E, P81N, P81T, P81Y, Q82R, Q82S, Q82T, Q83A, Q83C, Q83F, Q83G, Q83K, Q83L, Q83M, Q83N, Q83R, Q83S, Q83T, Q83V, Q83W, Q83Y, T84A, T84F, T84L, T84M, T84N, T84Q, T84V, T84Y, E85A, E85C, E85L, E85Q, E85R, E85S, E85T, E85W, E85Y, Q86A, Q86G, Q86K, Q86T, T87D, T87P, R89A, R89G, Q90E, Q90Y, I91V, L92V, Q93A, Q93E, Q93G, Q93H, Q93I, Q93L, Q93S, Q93W, Q93Y, D94E, D94F, D94G, D94H, D94K, D94N, D94Q, D94R, D94S, D94V, V95L, V95T, K96V, K96Y, A98W, N99G, N99L, N99P, N99Q, N99R, N99Y, A100G, A100V, E101A, E101D, E101G, E101L, E101M, E101S, E101T, E101V, P102S, L103G, M105C, M105I, M105V, Q106A, Q106D, Q106H, Q106W, I107Y, R108A, R108D, R108E, R108F, R108G, R108H, R108I, R108L, R108M, R108S, R108W, R108Y, L109A, L109D, L109E, L109F, L109G, L109K, L109P, L109R, L109S, L109Y, P110C, P110D, P110E, P110F, P110G, P110H, P110K, P110L, P110M, P110N, P110R, P110S, P110V, P110W, A111C, A111E, A111L, A111M, A111P, A111Q, A111R, A111V, A111W, A111Y, N112A, N112F, N112G, N112K, N112R, N112W, Y113A, Y113C, Y113G, Y113I, Y113M, G114K, G114L, G114P, R115A, R115C, R115E, R115G, R115N, R115S, R115W, R115Y, R116D, R116E, R116W, Y117A, Y117C, Y117E, Y117I, Y117L, Y117N, Y117Q, Y117R, Y117S, Y117T, Y117V, N118C, N118G, N118I, N118K, N118S, N118T, N118V, N118W, E119C, E119F, E119G, E119K, E119M, E119R, E119W, E119Y, A120D, A120E, A120G, A120W, F121A, F121D, F121E, F121M, F121P, F121Q, F121R, F121S, F121Y, S122D, S122E, S122F, S122I, S122L, S122M, S122V, S122W, S122Y, A123H, A123L, A123V, I124T, Y125C, Y125F, Y125G, Y125P, Y125S, Y125V, Y125W, P126R, P126T, P126V, P126Y, K127S, L128C, L128T, L128V, K130E, K130I, K130V, F132D, F132E, F132N, F132T, D133K, D133R, D133S, D133T, D133V, D133Y, V134I, V134M, V134S, P138E, P138N, P138R, P138T, P138V, F139A, F139D, F139G, F139H, F139M, F139S, F139W, F140C, F140G, F140M, F140N, F140P, F140S, M141A, M141C, M141D, M141E, M141F, M141G, M141K, M141L, M141P, M141Q, M141R, M141T, M141V, M141W, M141Y, E142A, E142C, E142P, E142Q, E142W, E142Y, V144D, V144E, V144G, V144H, V144N, V144P, V144Q, V144R, V144S, V144W, V144Y, Y145A, Y145C, Y145D, Y145E, Y145G, Y145I, Y145L, Y145M, Y145N, Y145Q, Y145T, Y145W, L146A, L146C, L146D, L146E, L146G, L146H, L146S, L146W, K147G, K147P, K147W, P148D, P148E, W150C, W150D, W150E, W150G, W150L, W150Q, W150T, M151A, M151C, M151E, M151F, M151G, M151I, M151Q, M151S, M151T, M151V, M151W, Q152D, Q152F, Q152I, Q152L, Q152T, I156L, P158A, P158F, P158G, P158H, P158I, P158L, P158Q, P158T, P158V, N159C, N159E, N159G, N159I, N159K, N159L, N159M, N159R, N159T, N159V, R160A, R160C, R160D, R160E, R160G, R160H, R160N, R160Q, R160S, R160W, D161E, D161G, D161I, D161K, D161L, D161M, D161Q, D161R, D161W, A162I, A162L, A162T, A162V, A162Y, Q163G, Q163L, Q163M, Q163S, P164A, P164C, P164D, P164M, P164N, P164R, P164V, P164W, F165D, F165E, F165G, F165H, F165I, F165K, F165L, F165M, F165R, F165S, F165T, F165V, F165Y, I166F, I166L, I166M, I166V, A167C, A167M, A167R, A167T, D168G, D168P, D168R, W169E, W169K, W169Q, M170F, M170H, M170L, M170T, M170V, M170Y, A171E, A171F, A171V, A171W, K172A, K172M, Q173N, Q175I, P176H, P176K, P176N, P176W, L177M, L177T, V178T, V178W, N179G, N179H, N179R, N179T, N179V, N179Y, H180E, H180G, H180R, H180V, H180W, D181A, D181H, D181I, D181L, D181P, D181R, D181W, S182A, S182G, S182K, S182L, S182P y/o S182R, en donde, en las designaciones de mutación por sustitución, los números se refieren a posiciones de aminoácidos de la SEC ID NO: 31. El aumento de la especificidad por el sustrato y/o de la actividad del sustrato con respecto a sustratos de C10 puede medirse in vitro y/o in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que tiene una especificidad por el sustrato, y/o una actividad de sustrato, aumentada (por ejemplo, velocidad catalítica), con respecto a sustratos de C¹²(es decir, sustratos, cuyas cadenas de carbono tienen una longitud de 12 carbonos), y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a los restos 10-25, 35-85, 90-103, 110-143, 146-180 de la SEC ID NO: 31. El aumento de la especificidad por el sustrato y/o de la actividad del sustrato con respecto a sustratos de C¹²puede medirse in vitro y/o in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o un equivalente natural), que tiene una especificidad por el sustrato, y/o una actividad del sustrato, aumentada (por ejemplo, velocidad catalítica), con respecto a sustratos de C12 y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a uno o más restos de la SEC ID NO: 31 seleccionados de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 35, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 119, 120, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 141, 142, 145, 149, 152, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 166, 167, 168, 169, 170, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 179, 180, 181 y/o 182. El aumento de la especificidad por el sustrato y/o de la actividad del sustrato con respecto a sustratos de C12 puede medirse in vitro y/o in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que tiene una especificidad por el sustrato, y/o una actividad del sustrato, aumentada (por ejemplo, velocidad catalítica), con respecto a sustratos de C12 y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta con una o más sustituciones seleccionadas de A1Q, A1S, A1V, D2E, D2K, D2P, D2W, T3R, T3W, L4A, L4Y, L5F, L5G, L5S, L5Y, I6T, I6V, L7A, L7C, L7M, L7N, L7S, L7T, L7V, L7Y, D9N, L11M, S12A, S12I, S12V, A13C, A13G, A13H, A13I, A13L, A13N, A13T, A13W, G14F, G14I, G14K, G14M, G14V, Y15A, Y15C, Y15D, Y15E, Y15G, Y15I, Y15L, Y15M, Y15N, Y15Q, Y15R, Y15S, Y15V, R16D, R16E, R16G, R16H, R16I, R16L, R16N, R16P, R16S, R16T, R16V, R16W, M17A, M17C, M17G, M17K, M17N, M17P, M17Q, M17R, M17S, M17T, S18M, S18N, A19L, S20A, S20C, S20D, S20G, S20L, S20T, S20W, A21I, A21L, A21P, A21Y, A22F, A22L, A22M, A22N, A22R, A22Y, P24G, P24V, A25D, A25E, A25L, A25N, A25Q, A25R, A25V, L26D, L26E, L26F, L26G, L26H, L26I, L26K, L26N, L26R, L26S, L26W, L26Y, L27A, L27C, L27F, L27M, L27W, L27Y, N28R, N28W, D29P, K30P, W31E, W31N, T35L, T35Y, V37F, V37S, V37W, V38D, V38F, V38G, V38P, N39A, N39C, N39E, N39G, N39Q, N39W, A40D, A40L, A40M, A40P, A40V, A40Y, S41C, S41T, I42A, I42C, I42D, I42E, I42G, I42K, I42L, I42M, I42P, I42S, I42T, I42W, I42Y, S43A, S43D, S43E, S43F, S43G, S43H, S43L, S43M, S43N, S43R, S43T, S43V, G44C, G44E, G44H, G44K, G44L, G44N, G44Q, G44R, G44S, D45A, D45C, D45E, D45F, D45H, D45I, D45K, D45L, D45M, D45P, D45Q, D45S, D45T, D45V, D45W, T46A, T46C, T46D, T46G, T46K, T46N, T46R, T46S, S47P, S47Q, Q48E, Q48V, Q48W, Q48Y, Q49A, Q49C, Q49D, Q49E, Q49G, Q49H, Q49I, Q49K, Q49L, Q49M, Q49P, Q49R, Q49S, Q49V, Q49W, Q49Y, G50A, G50C, G50F, G50I, G50K, G50L, G50M, G50N, G50P, G50Q, G50R, G50S, G50T, G50Y, L51A, L51D, L51N, L51T, L51V, L51W, A52C, A52M, A52P, A52W, R53A, R53C, R53D, R53E, R53F, R53G, R53I, R53K, R53L, R53N, R53S, R53T, R53V, R53W, R53Y, L54A, L54C, L54E, L54F, L54G, L54M, L54N, L54S, L54W, L54Y, P55Y, L57A, L57C, L57F, L57K, L57P, L57Q, L57R, L57Y, L58A, L58D, L58E, L58G, L58H, L58N, L58R, L58S, L58W, L58Y, Q60P, H61D, H61G, H61P, Q62P, Q62W, P63I, P63L, P63N, P63S, P63T, P63V, P63W, R64F, R64P, R64W, R64Y, W65A, W65E, W65G, W65K, W65M, W65N, W65V, V66M, V66S, L67A, L67T, V68A, V68L, V68M, V68S, V68T, E69A, E69C, E69D, E69G, E69H, E69K, E69L, E69M, E69N, E69P, E69V, E69Y, L70A, L70C, L70E, L70F, L70H, L70I, L70K, L70Q, L70S, L70T, L70V, G71A, G72A, N73G, N73H, N73L, N73R, N73S, N73T, D74E, D74G, L76I, L76M, L76W, R77C, R77D, R77E, R77G, R77K, R77L, R77Q, R77S, R77V, R77W, G78D, F79P, Q80G, Q80M, Q80S, Q80Y, P81A, P81E, P81K, P81L, P81M, P81W, P81Y, Q82F, Q82V, Q82W, Q82Y, Q83A, T84E, T84R, T84W, Q86A, Q86T, T87E, T87G, T87L, L88C, R89L, R89P, Q90N, Q90P, Q90W, I91G, I91M, I91S, I91V, I91Y, L92A, L92C, L92G, L92H, L92N, L92S, L92T, L92V, L92Y, Q93A, Q93G, Q93H, Q93I, Q93P, Q93Y, D94P, V95F, V95G, V95L, V95N, V95Q, V95T, V95W, K96A, K96L, K96P, K96Y, A97K, A97P, A98L, A98P, A98V, A98W, A98Y, N99C, N99D, N99G, N99L, N99M, N99P, N99Q, N99R, N99W, N99Y, A100D, A100E, A100G, A100H, A1001, A100K, A100L, A100Q, A100R, A100V, A100W, A100Y, E101G, E101L, E101M, E101P, E101S, E101T, E101V, P102E, P102F, P102H, P102L, P102Q, P102R, P102S, P102W, P102Y, L103E, L103K, L103N, L103Q, L103R, L104C, L104P, L104S, L104W, M105C, M105E, M105G, M105V, Q106A, Q106C, Q106G, Q106K, Q106R, Q106S, Q106T, I107C, I107E, I107K, I107L, I107M, I107S, I107V, R108F, R108W, L109M, A111C, A111Q, A111W, N112A, N112G, N112W, Y113A, Y113D, Y113G, Y113I, G114K, G114L, G114M, G114Y, R115A, R115C, R115E, R115G, R115N, R115S, R115Y, R116H, R116W, Y117C, Y117H, Y117I, Y117L, Y117M, Y117N, Y117S, Y117T, Y117V, E119C, E119F, E119K, E119M, E119R, E119W, E119Y, A120D, A120G, A120I, A120T, A120W, S122F, S122I, S122L, S122M, S122V, S122W, S122Y, A123C, A123F, A123H, A123L, A123R, A123T, A123V, A123W, A123Y, I124G, I124H, I124K, I124L, I124R, I124S, I124Y, Y125F, Y125R, P126C, P126F, P126H, P126Y, K127I, K127P, L128A, L128S, L128T, A129H, A129I, A129K, A129N, A129W, A129Y, K130P, E131A, E131C, E131F, E131G, E131K, E131L, E131N, E131V, E131W, D133K, V134D, V134E, V134K, V134N, V134Q, V134R, V134W, V134Y, L136A, L136D, L136E, L136F, L136G, L136H, L136K, L136N, L136P, L136Q, L136R, L136S, L136T, L137E, L137G, L137H, L137P, L137Q, L137S, L137Y, F140M, M141A, M141C, M141L, M141P, E142C, Y145E, Q149L, Q152A, Q152D, Q152E, Q152H, Q152K, Q152R, Q152Y, D153K, G155F, G155W, G155Y, I156C, I156F, I156M, I156V, P158A, P158G, N159G, N159Q, N159T, N159V, R160A, R160D, R160E, R160G, R160H, R160N, R160Q, R160S, R160W, D161I, D161K, D161L, D161M, D161N, D161Q, D161W, A162G, Q163A, Q163C, Q163G, Q163L, Q163M, Q163S, Q163T, P164C, P164M, I166L, I166V, A167C, A167E, A167F, A167G, A167K, A167L, A167N, A167Q, A167R, A167T, A167V, A167Y, D168G, D168H, D168L, D168R, D168V, D168W, W169A, W169D, W169E, W169G, W169K, W169Q, W169S, M170F, M170G, M170N, M170Q, M170S, M170V, M170W, K172M, K172P, Q173N, L174A, L174F, L174G, L174T, L174W, Q175I, P176H, P176K, P176L, P176N, P176W, L177D, L177G, N179H, N179R, N179Y, H180A, H180G, D181H, D181I, D181L, D181R, D181W, S182K, S182L, S182P y/o S182R, en donde, en las designaciones de mutación por sustitución, los números se refieren a posiciones de aminoácidos de la SEC ID NO: 31. El aumento de la especificidad por el sustrato y/o de la actividad del sustrato con respecto a sustratos de C12 puede medirse in vitro y/o in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que tiene una especificidad por el sustrato, y/o una actividad del sustrato, aumentada (por ejemplo, velocidad catalítica), con respecto a sustratos de C14 (es decir, sustratos, cuyas cadenas de carbono tienen una longitud de 14 carbonos), y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a los restos 5-20, 35-58, 65-80, 83-90, 110-130, 140-145, 155-160, 165-180 de la SEC ID NO: 31. El aumento de la especificidad por el sustrato y/o de la actividad del sustrato con respecto a sustratos de C14 puede medirse in vitro y/o in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que tiene una especificidad por el sustrato, y/o una actividad del sustrato, aumentada (por ejemplo, velocidad catalítica), con respecto a sustratos de C14 y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a uno o más restos de la SEC ID NO: 31 seleccionados de 1,4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 33, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 66, 68, 69, 70, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 131, 133, 134, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 147, 148, 151, 152, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 176, 178, 179, 180, 181 y/o 182. El aumento de la especificidad por el sustrato y/o de la actividad del sustrato con respecto a sustratos de C14 puede medirse in vitro y/o in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que tiene una especificidad por el sustrato, y/o una actividad del sustrato, aumentada (por ejemplo, velocidad catalítica), con respecto a sustratos de C14 y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta con una o más sustituciones seleccionadas de A1S, L4S, L4Y, L5H, L5Y, L7C, L7M, L7N, L7S, L7T, L7Y, G8S, D9N, D9T, L11C, L11I, L11M, L11Q, L11V, S12I, S12L, S12M, S12T, S12V, A13H, A13I, A13L, A13T, A13V, G14F, G14I, G14R, G14T, G14V, Y15A, Y15C, Y15D, Y15E, Y15G, Y15I, Y15L, Y15M, Y15N, Y15Q, Y15R, Y15S, Y15V, R16G, R16N, R16P, R16W, M17C, M17D, M17G, M17K, M17N, M17P, M17R, M17S, M17T, S20A, S20D, S20G, S20L, S20T, S20W, A21G, A22L, A22N, A22Y, W23Y, A25E, A25N, A25Q, A25V, L26C, L26F, L26H, L26Q, L26V, L26Y, N28K, N28P, D29V, S33F, S36H, V37H, V37Q, V38F, N39F, N39M, N39Q, N39V, N39W, N39Y, A40G, A40P, A40T, A40V, S41P, S41T, I42A, I42D, I42E, I42G, I42L, I42M, I42P, I42S, I42T, I42W, I42Y, S43A, S43D, S43E, S43F, S43G, S43H, S43L, S43M, S43N, S43T, S43V, S43W, G44A, G44C, G44E, G44F, G44H, G44K, G44L, G44M, G44N, G44Q, G44R, G44S, G44W, G44Y, D45A, D45C, D45E, D45F, D45G, D45H, D45M, D45P, D45Q, D45S, D45T, D45V, D45W, T46A, T46C, T46D, T46G, T46K, T46N, T46S, T46W, S47E, S47P, S47Q, S47W, S47Y, Q48C, Q48F, Q48I, Q48M, Q48V, Q48W, Q48Y, Q49A, Q49C, Q49D, Q49E, Q49G, Q49H, Q49I, Q49K, Q49L, Q49M, Q49P, Q49R, Q49S, Q49V, Q49W, Q49Y, G50A, G50C, G50E, G50F, G50I, G50K, G50L, G50M, G50N, G50P, G50Q, G50R, G50S, G50T, G50W, G50Y, L51A, L51C, L51D, L51S, L51V, A52H, A52I, A52L, A52M, A52P, A52R, A52V, A52W, A52Y, R53A, R53C, R53D, R53E, R53F, R53G, R53I, R53K, R53L, R53N, R53S, R53T, R53V, R53W, R53Y, L54W, L54Y, A56R, A56W, A56Y, L57F, L58F, L58I, L58Y, V66I, V68L, E69A, E69C, E69D, E69F, E69G, E69H, E69K, E69L, E69M, E69N, E69Q, E69S, E69V, E69Y, L70A, L70C, L70E, L70F, L70H, L70Q, L70S, L70T, L70V, L70W, G72A, G72C, G72P, G72S, N73A, N73C, N73G, N73H, N73I, N73L, N73P, N73R, N73S, N73T, N73V, N73W, D74E, D74G, G75A, G75C, G75D, G75E, G75F, G75I, G75K, G75L, G75M, G75N, G75P, G75T, G75W, G75Y, L76A, L76C, L76D, L76E, L76F, L76G, L76I, L76K, L76M, L76N, L76P, L76Q, L76R, L76T, L76V, L76W, R77A, R77C, R77D, R77E, R77F, R77G, R77H, R77K, R77L, R77N, R77Q, R77S, R77V, R77W, G78P, F79M, F79P, F79V, Q80A, Q80G, Q80L, Q80M, Q80S, Q80W, Q80Y, P81A, P81E, P81K, P81L, P81M, P81W, P81Y, Q82F, Q82I, Q82N, Q82P, Q82V, Q82W, Q82Y, Q83A, T84S, E85D, Q86A, Q86T, Q86V, Q86W, T87A, T87C, T87E, T87F, T87G, T87H, T87L, T87M, T87S, T87V, T87W, R89H, R89T, R89V, R89W, I91L, I91V, I91Y, L92V, Q93A, Q93G, Q93H, Q93I, Q93P, Q93Y, V95L, V95M, V95T, V95W, K96A, K96L, K96P, K96Y, A97W, A98K, A98L, A98W, N99G, N99L, N99P, N99Q, N99R, N99Y, A100G, A100H, A100I, A100K, A100L, A100M, A100R, A100T, A100V, A100Y, E101G, E101L, E101M, E101S, E101T, E101V, P102S, M105A, M105C, M105E, M105G, M105I, M105L, MI05V, Q106A, Q106C, Q106D, Q106G, Q106H, Q106K, Q106L, Q106M, Q106R, Q106S, Q106T, Q106V, Q106W, Q106Y, I107C, I107E, I107G, I107L, I107M, I107Q, I107V, R108A, R108C, R108D, R108F, R108I, R108L, R108S, R108V, R108W, R108Y, L109C, L109M, L109Q, L109T, L109V, L109Y, P110A, P110E, P110H, P110N, P110R, P110V, A111C, A111L, A111Q, A111R, A111V, A111W, N112A, N112F, N112G, N112I, N112L, N112P, N112V, N112W, N112Y, Y113A, Y113D, Y113G, Y113I, Y113M, Y113W, G114F, G114K, G114L, G114M, G114W, G114Y, R115A, R115C, R115E, R115G, R115I, R115N, R115P, R115Q, R115S, R115V, R115W, R115Y, R116C, R116H, R116T, R116V, R116W, Y117C, Y117H, Y117I, Y117L, Y117M, Y117N, YI17S, Y117W, N118A, N118C, N118E, N118G, N118H, N118I, N118L, N118M, N118P, N118Q, N118T, N118V, N118W, E119C, E119D, E119F, E119K, E119M, E119P, E119R, E119T, E119W, E119Y, A120D, A120G, A120I, A120L, A120T, A120W, F121A, F121C, F121D, F121E, F121K, F121L, F121M, F121P, F121Q, F121R, F121S, F121V, F121Y, S122A, S122C, S122D, S122E, S122F, S122G, S122I, S122L, S122M, S122P, S122V, S122W, S122Y, A123C, A123E, A123F, A123H, A123L, A123T, A123V, A123W, A123Y, I124A, I124C, I124G, I124L, I124Y, Y125C, Y125F, Y125G, Y125I, Y125L, Y125P, Y125Q, Y125R, Y125S, Y125T, Y125V, P126C, P126H, P126Y, E131I, E131L, D133K, D133Y, V134S, L136C, L136M, L136Q, L136S, L137P, P138E, P138R, P138T, F139M, F140M, M141A, M141C, M141L, M141P, E142A, E142C, E142L, E142M, E142N, E142P, E142Q, E142S, E142Y, E143I, E143P, K147R, P148W, M151I, M151Q, M151V, Q152A, Q152K, Q152S, D153I, D153K, D153M, D153W, G155F, G155H, G155W, G155Y, I156C, I156F, I156M, I156Q, I156R, I156S, I156V, P158A, P158G, P158S, N159G, N159T, R160A, R160G, R160H, R160N, R160W, D161G, D161I, D161K, D161L, D161M, D161N, D161Q, D161R, D161S, D161V, D161W, A162G, Q163G, Q163L, Q163M, Q163S, P164A, P164C, P164K, P164L, P164M, P164N, P164R, P164T, P164W, F165G, F165H, F165S, F165W, F165Y, I166L, I166V, A167T, D168A, D168G, D168H, D168P, D168R, D168T, W169A, W169E, W169K, W169M, W169Q, W169R, W169S, W169T, W169V, M170A, M170F, M170V, A171I, Q173N, Q173W, Q173Y, L174Q, L174W, Q175I, Q175Y, P176H, P176K, P176L, P176R, P176W, P176Y, V178A, V178T, V178W, N179H, N179R, N179T, N179V, N179Y, H180G, H180R, H180S, H180W, D181A, D181H, D181I, D181L, D181Q, D181R, D181S, D181W, S182A, S182E, S182G, S182I, S182K, S182L, S182P, S182Q, S182R y/o S182T, en donde, en las designaciones de mutación por sustitución, los números se refieren a posiciones de aminoácidos de la SEC ID NO: 31. El aumento de la especificidad por el sustrato y/o de la actividad del sustrato con respecto a sustratos de C14 puede medirse in vitro y/o in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que tiene preferencia por sustratos de éster (por ejemplo, acil-PNP) sobre sustratos de tioéster (por ejemplo, acil-CoA), y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a restos seleccionados de 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109 y/o 110 de la SEC ID NO: 31. La preferencia por sustratos de éster sobre sustratos de tioéster puede medirse in vitro y/o in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que tiene preferencia por sustratos de éster (por ejemplo, acil-PNP) sobre sustratos de tioéster (por ejemplo, acil-CoA), y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta con una o más sustituciones seleccionadas de V95L, V95M, V95T, K96A, K96L, K96W, K96Y, A97F, A97K, A97S, A97T, A97W, A98E, A98F, A98K, A98L, A98Q, A98W, N99Y, A100K, A100V, E101L, P102S, L104C, M105F, Q106A, Q106C, Q106T, Q106Y, I107A, I107C, I107G, I107L, I107M, I107Q, I107V, R108A, R108C, R108D, R108F, R108I, R108L, R108S, R108V, R108W, R108Y, L109M, L109V, P110A, P110F, P110H, P110N, P110V y/o P110W, en donde, en las designaciones de mutación por sustitución, los números se refieren a posiciones de aminoácidos de la SEC ID NO: 31. La preferencia por sustratos de éster sobre sustratos de tioéster puede medirse in vitro y/o in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que tiene preferencia por sustratos de tioéster (por ejemplo, acil-CoA) sobre sustratos de éster (por ejemplo, acil-PNP), y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a restos seleccionados de 95, 96, 97, 101, 102, 103, 104, 105, 107, 109 y/o 110 de la SEC ID NO: 31. La preferencia por los sustratos de tioéster sobre los sustratos de éster puede medirse in vitro y/o in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que tiene preferencia por sustratos de tioéster (por ejemplo, acil-CoA) sobre sustratos de éster (por ejemplo, acil-PNP), y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta con una o más sustituciones seleccionadas de V95E, V95I, V95W, V95Y, K96P, A97E, A97M, E101P, P102D, P102K, P102Y, L103E, L103K, L103N, L104A, L104D, L104E, L104N, L104Q, L104W, L104Y, M105W, I107E, I107K, I107P, L109A, L109C, L109D, L109E, L109G, L109K, L109N, L109P, L109Q, L109S, L109T, L109Y y/o P110R, en donde, en las designaciones de mutación por sustitución, los números se refieren a posiciones de aminoácidos de la SEC ID NO: 31. La preferencia por los sustratos de tioéster sobre los sustratos de éster puede medirse in vitro y/o in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que es capaz de producir un aumento del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos de ésteres no grasos (por ejemplo, ácidos grasos libres y/o derivados de ácidos grasos distintos de los ésteres grasos), y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEQ ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a los restos de la SEC ID NO: 31 seleccionados de 1-14, 22-29, 33-58, 65-100, 103-109, 114-117, 119-121, 127-136, 139-144, 150-151, 155-170 y / o 173-174. El aumento del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos (por ejemplo, derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos) puede observarse o determinarse in vitro y/o in vivo. Preferentemente, el aumento del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos se determina in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que es capaz de producir un aumento del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos de ésteres grasos (por ejemplo, ácidos grasos libres y/o derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos), y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEQ ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a los restos de la SEC ID NO: 31 seleccionados de 1,2, 4, 5, 6 , 7, 8, 12, 13, 14, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 44, 45, 46, 47, 49, 50, 53, 58, 65, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 79, 81, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 95, 96, 99, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 114, 115, 117, 119, 120, 121, 127, 128, 129, 131, 132, 134, 135, 136, 139, 141, 142, 143, 144, 150, 151, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 169, 170, 173 y / o 174. El aumento del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos (por ejemplo, derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos) puede observarse o determinarse in vitro y/o in vivo. Preferentemente, el aumento del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos (por ejemplo, derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos) se determina in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que es capaz de producir un aumento del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos de ésteres grasos (por ejemplo, ácidos grasos libres y/o derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos), y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEQ ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta con una o más sustituciones seleccionadas de A1R, D2H, D2R, L4G, L4M, L5Q, I6A, I6L, L7E, G8A, S12N, A13I, A13L, A13S, A13T, A13W, A13Y, G14K, G14R, G14S, G14T, A22D, A22E, A22H, A22Y, W23Y, P24C, P24G, P24T, A25P, L26C, L26D, L26E, L26G, L26N, N28A, N28M, D29V, S33G, S33M, K34A, K34H, K34M, T35G, T35M, S36A, V37A, V37G, V37H, V37S, V38D, V38G, V38P, N39E, N39Q, N39R, A40M, A40P, S41T, G44F, G44Y, D45P, D45Q, T46W, S47F, Q49I, G50A, G50K, G50M, G50S, R53S, L58D, L58M, L58R, W65L, L67G, V68G, V68M, V68N, E69P, E69Q, L70A, L70E, L70H, G71C, G72A, N73C, N73G, N73L, N73R, N73T, N73V, D74C, D74S, D74W, G75A, G75K, G75L, G75M, L76A, L76F, L76G, L76I, L76M, L76N, L76T, L76W, R77G, F79A, F79M, F79P, P81E, P81W, T84F, T84H, T84Y, Q86P, Q86W, T87M, T87S, T87W, L88C, L88F, L88G, L88H, L88Y, R89G, Q90P, Q90W, I91M, I91S, L92C, L92G, Q93F, Q93P, V95A, V95D, V95E, V95L, V95M, K96P, N99L, N99M, N99S, A100D, A100K, A100L, A100M, A100V, A100Y, L103A, L104A, L104C, L104P, L104Q, L104W, M105A, Q106A, Q106C, Q106T, Q106W, I107C, I107M, R108E, L109F, L109M, G114F, R115W, Y117P, E119D, E119P, A120P, F121A, F121C, F121W, K127P, L128F, A129L, A129Y, E131A, F132P, V134P, P135A, L136A, F139M, M141A, M141P, E142A, E143P, V144A, W150D, W150E, M151S, G155V, I156K, I156M, P158A, P158G, P158Q, P158S, N159E, N159I, R160H, R160I, R160K, D161G, A162T, A162Y, Q163A, Q163C, Q163E, Q163G, Q163I, Q163M, Q163S, Q163T, Q163V, P164C, F165D, F165S, I166A, I166L, W169M, M170E, M170G, M170N, M170S, Q173P y/o L174A, en donde, en las designaciones de mutación por sustitución, los números se refieren a posiciones de aminoácidos de la SEC ID NO: 31. El aumento del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos (por ejemplo, derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos) puede observarse o determinarse in vitro y/o in vivo. Preferentemente, el aumento del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos (por ejemplo, derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos) se determina in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que es capaz de producir una disminución del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos (por ejemplo, ácidos grasos libres y/o derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos) cuando la producción de ésteres grasos no es deseable, y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEQ ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a los restos de la SEC ID NO: 31 seleccionados de 3, 5, 15-18, 27-42, 46, 57-68, 77 78, 95-106, 121-123, 152-154, 167 y/o 175-182. La disminución del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos (por ejemplo, derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos) puede observarse o determinarse in vitro y/o in vivo. Preferentemente, la disminución del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos (por ejemplo, derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos) se determina in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que es capaz de producir una disminución del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos (por ejemplo, ácidos grasos libres y/o derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos) cuando la producción de ésteres grasos no es deseable, y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEQ ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a los restos de la SEC ID NO: 31 seleccionados de 3, 5, 15, 16, 18, 27, 28, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 42, 46, 57, 59, 60, 62, 65, 68, 77, 78, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 105, 106, 121, 123, 152, 153, 154, 167, 175, 176, 178, 179, 180, 181 y/o 182. La disminución del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos (por ejemplo, derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos) puede observarse o determinarse in vitro y/o in vivo. Preferentemente, la disminución del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos (por ejemplo, derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos) se determina in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que es capaz de producir una disminución del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos (por ejemplo, ácidos grasos libres y/o derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos) cuando la producción de ésteres grasos no es deseable, y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEQ ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta con una o más sustituciones seleccionadas de T3E, T3G, T3K, T3L, L5C, L5G, Y15A, Y15L, Y15Q, Y15R, Y15V, R16D, R16E, R16G, R16I, R16V, S18E, L27V, N28G, N28I, S33I, S33R, K34R, T35F, T35K, T35L, T35Q, T35V, S36F, S36I, S36L, S36W, V37L, V38E, V38F, V38K, V38L, A40D, A40G, I42T, T46L, L57A, L57F, L57G, L57H, L57K, L57N, L57P, L57R, L57S, L57T, L57V, L57W, L57Y, K59V, Q60E, Q60P, Q62G, W65V, V68L, R77L, G78M, V95F, V95N, K96C, K96L, K96N, K96Q, K96R, K96Y, A97E, A97F, A97R, A97W, A98E, N99A, N99D, A100S, P102I, L103Q, L103W, M105L, Q106G, Q106H, Q106K, Q106S, Q106V, F121P, A123E, Q152D, Q152E, Q152F, Q152H, Q152I, Q152K, Q152L, Q152S, Q152T, Q152Y, D153P, D153V, D154E, A167V, Q175L, P176D, V178K, N179H, N179W, H180E, H180L, H180P, H180R, D181C, D181E, S182K, S182L, S182N, S182R, S182T y/o S182V, en donde, en las designaciones de mutación por sustitución, los números se refieren a posiciones de aminoácidos de la SEC ID NO: 31. La disminución del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos (por ejemplo, derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos) puede observarse o determinarse in vitro y/o in vivo. Preferentemente, la disminución del rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos sobre otros productos (por ejemplo, derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos) se determina in vivo.

En un aspecto, se desvela una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), que es capaz de aumentar y/o mejorar la producción de uno o más derivados de ácidos grasos, y que es una variante de una tioesterasa precursora que comprende una secuencia análoga a la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58, en donde la tioesterasa precursora se muta en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a los restos de la SEC ID NO: 31 seleccionados de 2, 4, 11-22, 25-31, 37-45, 49-58, 63-80, 84- 130, 136-146 y/o 150-174. Un derivado de ác ido g ra so e je m p la r que se p roduce de a cu e rd o con esto es un ác ido g raso libre. El a u m en to y /o la m e jo ra de la p ro du cc ión de de riva dos de ác ido s g ra sos puede m ed irse in vitro y /o in vivo. P re fe re n tem e n te , el au m e n to y /o la m e jo ra de la p ro du cc ión de d e riva d o s de ác ido s g ra sos se m ide in vivo.

En un aspecto , se de sve la una tio e s te ra sa m u ta n te (o uno de sus eq u iva le n te s na tu ra les), que es cap az de a u m e n ta r y /o m e jo ra r la p ro du cc ión de uno o m ás de riva dos de ác ido s g rasos, y que es una va ria n te de una t io e s te ra sa p re cu rso ra que com p ren de una secu en c ia a n á loga de la S E C ID NO: 31 exp ue s ta en la FIG. 58, en do nde la t io e s te ra sa p re cu rso ra se m uta en una o m ás p o s ic io ne s de a m in o á c id o s co rre sp o n d ie n te s a los res tos de la S E C ID NO: 31 se le c c io n a d o s de 2, 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 21, 22, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 37, 39, 41, 42, 43, 44, 45, 49, 50, 51, 53, 54, 58, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 ,73 , 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 84, 87, 88, 90, 91 ,92 , 93, 94, 95, 96, 97, 98, 100, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 127, 128, 129, 130, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 150, 151, 152, 154, 155, 156, 158, 162, 163, 166, 167, 169, 170, 173 y/o 174. Un de riva d o de ác ido g raso e je m p la r que se p roduce de a cu e rd o con esto es un ác ido g ra so libre. El a u m en to y/o la m e jo ra de la p ro du cc ión de un de riva d o de ác ido graso puede m ed irse in vitro y /o in vivo. P re fe re n tem e n te , el a u m en to y /o la m e jo ra de la p ro du cc ión de un de riva do de ác ido g ra so se m ide in vivo.

En un aspecto , se de sve la una tio e s te ra sa m u ta n te (o uno de sus eq u iva le n te s na tu ra les), que es cap az de a u m e n ta r y /o m e jo ra r la p ro du cc ión de uno o m ás de riva dos de ác ido s g rasos, y que es una va ria n te de una t io e s te ra s a p re cu rso ra que co m p re n d e una se cu e n c ia a n á lo g a a la S E C ID NO: 31 e xp u e s ta en la FIG. 58, en dond e la t io e s te ra s a p re cu rso ra se m u ta con una o m ás s u s titu c io n e s se le c c io n a d a s de: D 2L, D 2P , D2R, L5G , L11I, S 12N , S 12T , A 13N , G 14C , G 14P , G 14S , G 14T , G 14V , Y 15C , Y 15I, Y 15V , R16T, M 17D , M 17E, M 17N , M 17R , M 17S, M 17V , A 19C , A 21G , A 22 L , A 22R , A 22 T , A 25P , L26D , L26G , L26W , L27C , L27F, L27W , L27Y , N28I, N28P , D29P, K30P , W 31D , W 31G , W 31N , W 31P , W 31R , W 31S , W 31T , V 37Y , N 39P , S 41C , I42D, I42G , S43E , G 44K , G 44R , G 44W , D 45G , Q 49E , G 50A , G 50K , G 50M , G 50Q , L51D , L51T , R 53A , R 53G , R 53L, R 53N , R53S, R 53V , L54E, L54F , L54G , L54N , L54S , L54W , L58R , P63G , P 63M , P63N , P 63T, P 63W , W 65E , W 65G , V 66G , V 66S , L67T , V 68S , E 69F , E 69V , L70C , L70F , L70Q , L70S , L70T , L70V , G 71A , N 73G , N 73L, D 74A , D 74C , G 75A , G 75C , G 75F , G 75R , G 75W , L76I, R 77A , R 77C , R 77D , R77F, R 77G , R 77H , R 77K , R 77L, R 77N , R 77Q , R 77S , R 77W , G 78D , G 78E , F79K , Q 80G , T84H , T 84N , T84Q , T87A , T87F , T87H , T87W , L88A, L88C , L88H , Q 90N , Q 90W , I91G, I91L, I91M , I91S, L92G , L92N , L92Q , L92S, L92T , L92Y , Q 93P , D94P, V 95F , V 95N , V 95Q , K 96P , A 97 C , A 97P , A 98 P , A 98V , A 100D , A 100E , A 100Q , A 100Y , P 102L, P 102Q , P 102R , L103E , L103K , L104A , L104Q , L104W , L104Y , M 105C , M 105E , M 105F , M 105L , Q 106D , Q 106G , Q 106L , Q 106V , Q 106W , Q 106Y , I107A , I107C , I107E , I107G , I107K, I107L, I107Q , I107S , I107T , R 108G , L109F, L109V , L109Y , P 110A , P 110E , P 110F , P 110G , P 110H , P 110N , P 110S , P 110V , A 111Y , N 112F, N 112P , Y 113D , Y 113E , Y 113P , R 115W , Y 117A , Y 117D , Y 117E , Y 117G , Y 117P , Y 117Q , N 118F , E 119P , A 120P , F121C , F121L, F121M , F121N , F121Q , F121R , F121V , F121W , F121Y , S 122D , S 122F , S 122L , S 122P , S 122W , S 122Y , I124A , I124G , I124H , I124K , I124R , K 127P , L128S , A 129I, A 129W , A 129Y , K 130P, L136A , L136D , L136E , L136G , L136K , L136N , L136P , L136Q , L136S , L136T , L137A , L137C , L137H , L137K , L137Q , L137S , L137Y , P 138F , F139L, F139M , F140C , F140I, F140L, F140M , F140V , M 141T , E 143P , V 144H , Y 145I, L146G , L146P , W 150 G , W 150 I, W 150 V , M 151F , M 151L , M 151R , M 151S , M 151T , M 151W , Q 152N , Q 152V , Q 152Y , D 154C , D 154E , G 155 I, I156C , I156K , I156T , I156V , P 158G , P 158T , A 162T , Q 163A , Q 163C , Q 163E , Q 163 I, Q 163S , Q 163T , Q 163V , I166C , A 167E , A 167F , A 167L , A 167N , A 167R , A 167V , A 167Y , W 169 K , M 170N , M 170S , Q 173D , L174A , L174 T y /o L174W , en donde, en las d e s ig n a c io n e s de m u tac ión po r sus titu c ión , los nú m e ro s se re fie ren a p o s ic io ne s de a m in o á c id o s de la S E C ID NO: 31. Un de riva d o de á c id o g ra so e je m p la r que se p ro d u ce de a cu e rd o con e s to es un á c id o g ra so libre. El a u m e n to y /o la m e jo ra de la p ro du cc ión de un de riva d o de ác ido g ra so pu ede m ed irse in v itro y /o in v ivo . P re fe re n tem e n te , el au m e n to y /o la m e jo ra de la p ro du cc ión de un de riva d o de ác ido g ra so se m id e in vivo .

En un asp ec to , se d e sve la una t io e s te ra s a m u ta n te (o uno de sus e q u iv a le n te s na tu ra les), que es ca p a z de p ro d u c ir un a u m e n to de l re n d im ie n to p ro p o rc io n a l o p o rce n tu a l de d e riv a d o s de á c id o s g ra so s de ca d e n a co rta (p o r e jem p lo , C e, C g, C 10, C 11, C 12, C 13, C 14) (p o r e jem p lo , ác ido s g ra sos de cad en a corta , és te res g ra sos de cad en a corta, a lco h o le s g ra so s de ca d e n a corta , e tc .) fre n te a o tros p ro du c to s (p o r e jem p lo , d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cad en a no corta, inc luyendo , po r e jem p lo , ác ido s g ra sos de ca d e n a la rga (p o r e jem p lo , C 15, C 16, C 17, C 18, C 19, C 20), és te res g ra sos de cad en a la rga , a lcoh o le s g ra sos de cadena larga, e tc.), y que es una va ria n te de una t io e s te ra sa p re cu rso ra que co m p re n d e una se cu e n c ia a n á loga a la S E C ID NO: 31 exp u e s ta en la FIG. 58, en dond e la t io e s te ra s a p re cu rso ra se m u ta en una o m ás p o s ic io n e s de a m in o á c id o s c o rre s p o n d ie n te s a uno o m ás res tos de la S E C ID NO: 31 se le cc io n a d o s de 13, 16-17, 25 -38 , 55 -67 , 78 -98 , 105-119 , 122, 126, 132-145, 153 y/o 161-182. Un de riva d o de ác ido g ra so de ca d e n a co rta e je m p la r es un de riva d o de ác ido g ra so C 12. Un de riva d o de ác ido g ra so de cad en a co rta a lte rn a tivo es un de riva d o de ác ido g raso C 14. En d e te rm in a d a s c ircu ns tan c ias , el au m e n to del re n d im ie n to p ro p o rc io n a l o p o rcen tu a l de l de riva do de ác ido g ra so de cad en a co rta puede c o rre la c io n a rse con una d ism in u c ió n de l re n d im ie n to p ro p o rc io n a l de de riva dos de ác ido g ra so de ca d e n a la rga . El au m en to de l re n d im ie n to p ro p o rc io n a l o p o rcen tu a l de d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cad en a co rta y /o la co rre sp o n d ie n te d ism in u c ió n del re n d im ie n to p ro p o rc io n a l o po rcen tu a l de d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cad en a la rga puede m e d irse in vitro o in vivo. P re fe re n te m e n te , el a u m e n to de l re n d im ie n to p ro p o rc io n a l de d e riv a d o s de á c id o s g ra so s de ca d e n a co rta o la d ism in u c ió n de l re n d im ie n to p ro p o rc io n a l o po rcen tu a l c o rre sp o n d ie n te de d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cad en a la rga se m ide in vivo.

En un asp ec to , se d e sve la una t io e s te ra s a m u ta n te (o uno de sus e q u iv a le n te s na tu ra les), que es ca p a z de p ro d u c ir un a u m e n to de l re n d im ie n to p ro p o rc io n a l o p o rce n tu a l de d e riv a d o s de á c id o s g ra so s de ca d e n a co rta (p o r e jem p lo , C 8, C g, C 10, C 11, C 12, C 13, C 14) (p o r e jem p lo , ác ido s g ra sos de cad en a corta , és te res g ra sos de cad en a corta, a lco h o le s g ra sos de cad en a corta, e tc .) fre n te a o tros p ro d u c to s (p o r e jem p lo , d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cad en a no corta , in c luye nd o , po r e jem p lo , á c id o s g ra so s de ca d e n a la rga , é s te re s g ra so s de ca d e n a la rga , a lco h o le s g ra sos de ca d e n a larga, etc.), y que es una va ria n te de una t io e s te ra sa p re cu rso ra que c o m p re n d e una se cu e n c ia a n á lo g a a la S E C ID NO: 31 exp ue s ta en la FIG. 58, en dond e la t io e s te ra s a p re cu rso ra se m u ta en una o m ás po s ic io ne s de a m in o á c id o s co rre s p o n d ie n te s a uno o m ás res tos de la S E C ID NO: 31 s e le c c io n a d o s de 13, 16, 17, 25, 29, 31, 35, 36, 38, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 78, 79, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 105, 106, 108, 111, 113, 114, 117, 119, 122, 126, 132, 135, 136, 139, 142, 144, 145, 153, 161, 162, 165, 168, 173, 175, 176, 178, 179, 180, 181 y/o 182. Un de riva do de ác ido g raso de cad en a co rta e je m p la r es un de riva do de ác ido g ra so C 12. Un de riva d o de ác ido g ra so de cad en a corta a lte rn a tivo es un de riva d o de ác ido g ra so C 14. En d e te rm in a d a s c ircu ns tan c ias , el a u m en to del re n d im ie n to p ro po rc ion a l o po rcen tu a l de de riva dos de ác idos g rasos de cad en a co rta puede c o rre la c io n a rse con una d ism inu c ió n del ren d im ien to p ro po rc ion a l de de riva dos de ác idos g ra sos de cad en a larga. El a u m en to del ren d im ien to p ro po rc ion a l o po rcen tu a l de de riva dos de ác ido s g ra sos de cad en a co rta y /o la c o rre sp o n d ie n te d ism in u c ió n de l ren d im ien to p ro p o rc io n a l o po rcen tu a l de d e riva d o s de ác idos g ra sos de cad en a la rga puede m ed irse in vitro o in vivo. P re fe re n te m e n te , el au m e n to de l re n d im ie n to p ro po rc ion a l de d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cad en a co rta o la d ism in u c ió n de l re n d im ie n to p ro po rc ion a l c o rre sp o n d ie n te de d e riva d o s de ác ido s g ra sos de ca d e n a la rga se m ide in vivo.

En un asp ec to , se d e sve la una t io e s te ra s a m u ta n te (o uno de sus e q u iv a le n te s na tu ra les), que es ca p a z de p ro d u c ir un a u m e n to de l re n d im ie n to p ro p o rc io n a l o p o rce n tu a l de d e riv a d o s de ác ido s g ra so s de ca d e n a co rta (p o r e jem p lo , C e, C 9, C 10, C 11, C 12, C 13, C 14) (p o r e jem p lo , ác ido s g ra sos de cad en a corta , és te res g ra sos de cad en a corta, a lco h o le s g ra sos de cad en a corta , e tc .) fre n te a o tros p ro d u c to s (p o r e jem p lo , d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cad en a no corta inc luyendo , po r e jem p lo , ác ido s g rasos de cad en a la rga , és te re s g rasos de cad en a larga, a lcoh o le s grasos de ca d e n a larga, etc.), y que es una va ria n te de una tio e s te ra s a p re cu rso ra que c o m p re n d e una se cu e n c ia a n á lo g a a la S E C ID NO: 31 exp ue s ta en la FIG. 58, en do n d e la t io e s te ra sa p re cu rso ra se m uta con una o m ás sus titu c ion es s e le cc io n a d a s de: A 13V , R 16A , M 17T, A 25S , D 29M , W 31L , T35Y , S 36W , V 38S , P55A , P55G , L57I, L58M , L58V, K59E , H 61W , Q 62M , P63V, R 64M , W 65L , V 66C , L67C , L67M , G 78F , G 78M , G 78R , G 78T , G 78V , F79K , F79Y, Q 82A , Q 82M , Q 82R , Q 83G , Q 83K , T 84M , T 84V , E85A , E85C , E85G , E85Q , E85S , E85T, E85V, E 85W , E85Y, Q 86H , Q 86Y , T 87R , R 89V , Q 90L , Q 93M , Q 93N , Q 93V , D 94C , D 94L, V 95G , K 96C , A 97N , A 97 V , A 98 G , A98Y , M 105I, Q 106K , Q 106R , R 108W , A 111E , A 111N , A 111S , A 111W , A 111Y , Y 113A , Y 113S , Y 113V , G 114K , G 114Y , Y 117R , E 119M , E 119Q , E 119R , S 122F , S 122I, S 122M , S 122R , P 126K , F132C , F132D , F132K , F132L, F132N , F132V , P 135A , P 135E , P 135K , P 135Q , L136H , F139L, E 142W , V 144Y , Y 145A , Y 145C , Y 145D , Y 145E , Y 145G , Y 145 I, Y 145L , Y 145M , Y 145N , Y 145R , Y 145S , Y 145T , D 153K , D 153Q , D 161K , A 162 I, F165K , D 168W , Q 173I, Q 175M , P 176Q , P 176R , P 176V , V 178F , V 178G , V 178L , V 178R , V 178S , V 178T , N 179H , H 180E , H 180P , H 180R , H 180S , H 180V , H 180W , D 181R , D 181T, S 182C , S 182D , S 182 G y/o S 182R , en donde, en las d e s ig n a c io n e s de m u tac ión po r sus titu c ión , los nú m e ro s se re fie ren a p o s ic io n e s de a m in o á c id o s de la S E C ID NO: 31. Un d e riva d o de ác ido g ra so de cad en a co rta e je m p la r es un de riva do de ác ido g ra so C 12. Un de riva do de ác ido g raso de cadena co rta a lte rn a tivo es un de riva d o de ác ido g ra so C 14. En d e te rm in a d a s c ircu n s ta n c ia s , el a u m en to de l ren d im ien to p ro p o rc io n a l o po rcen tu a l de d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cad en a co rta puede c o rre la c io n a rse con una d ism in u c ió n de l ren d im ie n to p ro po rc ion a l de d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cad en a larga. El au m en to del re n d im ie n to p ro p o rc io n a l o po rcen tu a l de d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cad en a co rta y /o la co rre sp o n d ie n te d ism in u c ió n de l re n d im ie n to p ro p o rc io n a l de d e riva d o s de á c id o s g ra so s de ca d e n a la rga pued e m ed irse in vitro o in vivo. P re fe re n te m e n te , el a u m e n to de l re n d im ie n to p ro p o rc io n a l de d e riv a d o s de á c id o s g ra so s de ca d e n a co rta o la d ism in u c ió n de l re n d im ie n to p ro p o rc io n a l co rre sp o n d ie n te de d e riva d o s de ác ido s g ra sos de ca d e n a la rga se m ide in vivo.

En un aspec to , se d e sve la una t io e s te ra s a m u ta n te (o uno de sus e q u iva le n te s na tu ra les), que es ca p a z de p ro d u c ir una d ism inu c ió n del ren d im ien to p ro p o rc io n a l o po rcen tu a l de de riva dos de ác ido s g ra sos de cad en a co rta (po r e jem p lo , C 8, C 9, C 10, C 11, C 12, C 13, C 14) (p o r e jem p lo , ác ido s g ra sos de cadena corta , é s te re s g ra sos de cadena corta , a lcoh o le s g ra sos de cad en a corta, e tc .) fre n te a o tro s p ro du c to s (p o r e jem p lo , d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cad en a no co rta in c luye nd o , po r e jem p lo , ác ido s g rasos de cad en a la rga (p o r e jem p lo , C 15, C 16, C 17, C 18, C 19, C 20), é s te re s g ra sos de cadena larga, a lcoh o le s g rasos de cadena larga, e tc.), y que es una va ria n te de una t io e s te ra sa p re cu rso ra que co m p re n d e una se cu e n c ia a n á loga a la S E C ID NO: 31 exp u e s ta en la FIG. 58, en dond e la t io e s te ra s a p re cu rso ra se m u ta en una o m ás p o s ic io n e s de a m in o á c id o s c o rre s p o n d ie n te s a uno o m ás res tos de la S E C ID NO: 31 s e le cc io n a d o s de 1-31, 36 -81 , 84 -159 , 162 -177 y /o 181. Un de riva d o de ác ido g ra so de cad en a corta e je m p la r es un de riva d o de ác ido g raso C 12. Un de riva do de ác ido g ra so de cad en a corta a lte rna tivo es un de riva do de á c id o g raso C 14. En d e te rm in a d a s c ircu n s ta n c ia s , la d ism in u c ió n de l re n d im ie n to p ro po rc ion a l o po rcen tu a l de d e riva d o s de á c id o s g ra so s de ca d e n a co rta pu ed e co rre la c io n a rs e con un a u m e n to de l re n d im ie n to p ro p o rc io n a l de d e riva d o s de á c id o s g ra so s de ca d e n a larga. La d ism in u c ió n de l re n d im ie n to p ro p o rc io n a l o p o rce n tu a l de d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cad en a co rta y /o el c o rre sp o n d ie n te a u m e n to de l re n d im ie n to p ro po rc ion a l de de riva dos de ác ido s g ra sos de cad en a la rga puede m ed irse in vitro o in vivo. P re fe re n te m e n te , la d ism in u c ió n de l ren d im ie n to p ro p o rc io n a l de d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cad en a co rta o el c o rre sp o n d ie n te a u m e n to de l ren d im ien to p ro p o rc io n a l de de riva dos de ác ido s g ra sos de ca d e n a co rta se m ide in vivo.

En un aspec to , se d e sve la una t io e s te ra s a m u ta n te (o uno de sus e q u iv a le n te s n a tu ra les ), q u e es ca p a z de p ro d u c ir una d ism inu c ió n del ren d im ien to p ro p o rc io n a l o po rcen tu a l de de riva dos de ác ido s g ra sos de cad en a co rta (po r e jem p lo , C 8, C g, C 10, C 11, C 12, C 13, C 14) (p o r e jem p lo , ác ido s g ra sos de cadena corta , é s te re s g ra sos de cadena corta , a lcoh o le s g ra sos de cad en a corta, e tc .) fre n te a o tros p ro d u c to s (p o r e jem p lo , d e riva d o s de ác ido s g ra sos de ca d e n a no co rta in c luye nd o , po r e jem p lo , á c id o s g ra so s de ca d e n a larga, és te re s g ra so s de ca d e n a larga, a lco h o le s g ra sos de cad en a larga, etc.), y que es una va ria n te de una t io e s te ra sa p re cu rso ra que com p ren de una secu en c ia an á lo g a a la S E C ID NO: 31 exp ue s ta en la FIG. 58, en donde la tio e s te ra sa p re cu rso ra se m u ta en una o m ás p o s ic io n e s de a m in o á c id o s co rre sp o n d ie n te s a uno o m ás res tos de la S E C ID NO: 31 s e le cc io n a d o s de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24 , 26, 27, 30, 31, 36, 37, 38, 42, 44 , 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 57, 61, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 125, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 162, 163, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 173, 174, 175, 176, 177 y /o 181. Un de riva d o de ác ido g ra so de cad en a co rta e je m p la r es un de riva d o de ác ido g ra so C 12. Un de riva d o de ác ido g ra so de cad en a co rta a lte rna tivo es un de riva do de ác ido g ra so C 14. En de te rm in ada s c ircu n s ta n c ia s , la d ism in u c ió n de l re n d im ie n to p ro p o rc io n a l o p o rce n tu a l de d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cadena co rta pued e co rre la c io n a rs e con un au m e n to de l ren d im ie n to p ro p o rc io n a l de d e riva d o s de á c id o s g ra so s de cad en a la rga . La d ism inu c ió n de l re n d im ie n to p ro po rc ion a l o po rcen tu a l de de riva dos de á c id o s g ra so s de cad en a co rta y/o el co rre sp o n d ie n te a u m e n to de l re n d im ie n to p ro po rc ion a l de d e riva d o s de ác ido s g ra sos de cad en a la rga puede m ed irse in vitro o in vivo. P re fe re n te m e n te , la d ism inu c ió n de l re n d im ie n to p ro po rc ion a l de d e riva d o s de ác idos g ra sos de cad en a co rta o el c o rre sp o n d ie n te au m e n to de l ren d im ie n to p ro po rc ion a l de d e riva d o s de ác ido s grasos de ca d e n a co rta se m ide in vivo.

En un asp ec to , se d e sve la una t io e s te ra s a m u ta n te (o uno de sus e q u iv a le n te s na tu ra les ), que es ca p a z de p ro d u c ir una d ism inu c ió n del ren d im ien to p ro p o rc io n a l o po rcen tu a l de de riva dos de ác ido s g ra sos de cad en a co rta (po r e jem p lo , C e, C 9, C 10, C 11, C 12, C 13, C 14) (p o r e jem p lo , ác ido s g ra sos de cadena corta , é s te re s g ra sos de cadena corta , a lcoh o le s g ra sos de cad en a corta, e tc .) fre n te a o tros p ro d u c to s (p o r e jem p lo , d e riva d o s de ác ido s g ra sos de ca d e n a no co rta in c luye nd o , po r e jem p lo , ác ido s g ra sos de ca d e n a larga, és te re s g ra so s de ca d e n a larga, a lco h o le s g ra sos de cad en a larga, e tc.), y que es una va ria n te de una t io e s te ra sa p re cu rso ra que com p ren de una secu en c ia an á lo g a a la S E C ID NO: 31 exp ue s ta en la FIG. 58, en donde la tio e s te ra s a p re cu rso ra se m u ta con una o m ás su s titu c io n e s se le cc io n a d a s de: A 1C , A 1F , A 1L, A 1Y , D2L, D 2M , D2P, D 2W , T3R , L4A, L4M, L4N , L4S, L4V, L4Y, L5E, L5F, L5G, L5K, L5N, L5S, L5W , I6T, L7A, L7E, L7K, L7M , L7W , G 8K, D9N, D9T, L11A , L11C , L11I, L11M , L11Q , L11V, S 12I, S12L, S 12M , S 12N , S 12T , S 12V , S 12Y , A 13 C , G 14 C , G 14E , G 14 I, G 14M , G 14N , G 14P , G 14S , G 14T , G 14V , Y 15C , Y 15E , Y 15G , Y 15I, Y 15N , Y 15V , R 16T, M 17D , M 17E , M 17G , M 17L, M 17N , M 17P , M 17R , M 17S , M 17V , S18M , S 18N , S 18T , A 19E , A 19L , A 19 V , A 21 P , A 22 D , A 22E , A 22 F , A 22H , A 22 I, A 22 K , A 22L, A 22P , A 22 R , A 22 S , A 22T , A 22 Y , W 23A , W 23H , W 23N , W 23P , P24A , P24C , P24D , P24E, P 24F, P 24G , P24I, P 24M , P24N , P24S , P 24T, P24V, P 24W , L26P , L27A, L27C , L27F, L27H , L27R , L27S , L27T , L27W , L27Y, K 30P , W 31 D , W 31P , W 31R , S 36F, S 36L, V 37G , V 37H , V 37N , V 37Q , V 37 W , V 37Y , V 38P , N39E, N 39G , N39K, N 39M , N39P, N39Q , N 39Y , I42D , I42G , I42P, G 44A , G 44E , G 44K , G 44M , G 44N , G 44R , G 44S , G 44W , G 44Y , D 45G , D 45M , T 46D , S 47E , S 47P , S 47Q , S47R , S 47Y , Q 48Y , G 50C , G 50E , G 50F , G 50I, G 50K , G 50L, G 50M , G 50N , G 50P , G 50Q , G 50R , G 50S , G 50T , G 50W , G 50Y , L51D , L51P, L51T, A 52 P , R53A, R53C , R53D , R 53E , R53F, R53G , R53I, R 53K , R53L, R 53N , R53S, R53T, R 53V , R 53W , R53Y, L54C , L54E , L54G , L54N , L54Y, P 55Y , L57P, H61A, H 61D , H61E, P63D , P63E , P63G , P63K, P 63M , P63N , P63Q , P63R , R 64L, W 65 G , W 65P , W 65R , V 66N , V 66Q , V 66S , V 66W , V66Y , L67E , L67G , L67Q , L67R , L67S, L67W , V 68E , V 68G , V 68N , V 68P , V 68Q , E69A, E 69C , E69D, E 69F, E69G , E69H , E 69K , E69L, E69M , E 69N , E69P , E69Q , E69S , E 69V , E 69W , E69Y , L70A , L70C , L70E , L70F, L70G , L70H , L70K, L70Q , L70S , L70T , L70W , G 71C , G 71S , G 72A , G 72M , G 72P , N 73A , N 73G , N 73H , N73I, N 73L , N 73P , N 73R , N 73S , N 73T , N 73W , D74A, D74C , D74F, D 74G , D74Q , D74S, D 74W , D74Y, G 75A , G 75C , G 75D , G 75E , G 75F , G 75I, G 75K , G 75L, G 75M , G 75N , G 75P , G 75R , G 75T , G 75V , G 75W , G 75Y , L76A, L76C , L76D , L76E, L76F, L76G , L76I, L76K , L76M , L76N , L76P, L76Q , L76R , L76T , L76V , L76W , R 77A , R 77C , R77D , R 77E , R 77F, R 77G , R 77H , R77N , R 77S , R 77V , R 77W , G 78A , G 78C , G 78D , G 78E , G 78N , G 78P , G 78Q , G 78Y , F79P , F79Q , F79S , F79V , P81E, P 81W , T 84D , T84E , T84G , T84H , T84K , T84L , T84N , T84Q , T 84R , T84W , T84Y , E85F, E85P , Q 86A , T87F , L88A, L88E , L88G , L88H , L88Q , L88S , L88W , L88Y , R 89P , Q 90P , Q 90W , I91E, I91L, I91M , I91N , I91Q , I91S, I91Y, L92C , L92E , L92G , L92H , L92N , L92Q , L92R , L92S , L92Y , Q 93P , D 94P , D 94V , V 95A , V 95C , V 95D , V 95E , V 95F , V95I, V 95P , V 95Q , V 95W , V 95Y , K96P , A 97C , A 97 P , N99D , A 100Q , A 100Y , P 102E , P 102G , P 102H , P102L, P 102R , P 102V , P 102W , L103C , L103E , L103I, L103K , L103N , L103R , L103S , L103T , L103V , L104A , L104C , L104E , L104G , L104I, L104N , L104P , L104Q , L104S , L104W , L104Y , M 105A , M 105C , M 105E , M 105F , M 105G , M 105K , M 105L, M 105P , M 105T , M 105W , Q 106D , Q 106G , Q 106H , Q 106L , Q 106W , I107A , I107E , I107F, I107G , I107K , I107L, I107Q , I107S , I107T , I107Y , R 108A , R 108C , R 108D , R 108E , R 108F, R 108G , R 108H , R 108I, R 108L, R 108M , R 108S , R 108V , R 108Y , L109C , L109F, L109G , L109K , L109Q , L109R , L109T, L109V , L109Y , P 110A , P 110C , P 110D , P 110E , P 110F , P 110G , P 110H , P 110K , P110L, P 110M , P 110N , P 110R , P 110S , P 110V , P 110W , A 111C , A 111L , A 111P , A 111Q , A 111R , A 111V , N 112I, N 112L, N 112P , N 112Y , Y 113D , Y 113E , Y 113Q , G 114A , R 115W , Y 117D , Y 117G , Y 117P , N 118F, E 119C , E119L, A 120P , F121A , F121C , F121D , F121E , F121G , F121K , F121L, F 121N , F121P , F121Q , F121R , F121S , F121V , F121W , F121Y , S 122D , S 122E , S 122L , S 122P , I124D , I124E, I124G , I124H , I124K , I124R , I124W , I124Y , Y 125C , Y 125G , Y 125H , Y 125 I, Y 125L , Y 125P , Y 125Q , Y 125R , Y 125S , Y 125T , Y 125V , K 127A , L128E , L128F, L128G , L128K , L128Q , L128R , L128S , L128W , A 129D , A 129F , A 129L , A 129 W , A 129Y , K 130P , K 130V , E 131A , E 131C , E 131D , E 131P , E 131V , F132P , D 133C , V 134C , V 134D , V 134N , V134P, V134W, L136A, L136D, L136E, L136G, L136N, L136P, L136T, L137D, L137E, L137G, L137H, L137K, L137P, L137Q, L137R, L137S, P138G, P138N, P138V, F139A, F139C, F139D, F139E, F139G, F139H, F139M, F139N, F139S, F139T, F139V, F139W, F140A, F140C, F140G, F140I, F140L, F140M, F140N, F140P, F140S, F140T, F140V, F140W, M141C, M141D, M141E, M141F, M141G, M141K, M141L, M141P, M141Q, M141R, M141T, M141W, M141Y, E142A, E142C, E142G, E142I, E142L, E142M, E142P, E142Q, E142R, E142T, E142V, E143A, E143D, E143F, E143G, E143I, E143M, E143P, E143W, V144A, V144D, V144E, V144G, V144H, V144N, V144P, V144Q, V144R, V144S, Y145Q, Y145W, L146C, L146P, W150P, W150R, M151A, M151C, M151D, M151E, M151F, M151G, M151I, M151L, M151Q, M151R, M151S, M151T, M151V, M151W, Q152P, D153A, D153E, D153F, D154A, D154C, D154E, D154F, D154G, D154H, D154I, D154K, D154L, D154M, D154N, D154P, D154R, D154S, D154T, D154V, D154W, G155A, G155P, G155V, I156A, I156C, I156E, I156F, I156G, I156K, I156M, I156Q, I156R, I156S, I156T, I156Y, H157C, H157E, P158F, P158H, P158I, P158L, P158Q, P158V, P158W, N159P, N159W, A162K, A162L, A162N, A162R, A162Y, Q163A, Q163D, Q163E, Q163F, Q163I, Q163V, Q163W, Q163Y, F165L, I166A, I166F, I166M, I166S, I166Y, A167C, A167D, A167E, A167F, A167L, A167N, A167R, A167V, A167W, A167Y, D168M, D168R, M170E, M170F, M170G, M170N, M170S, M170T, A171S, Q173D, Q173P, L174A, L174G, L174S, L174T, L174W, L174Y, Q175F, P176L, P176Y, L177F, L177M, L177S, D181C, D181E y/o D181G, en las que, en las designaciones de mutación por sustitución, los números se refieren a posiciones de aminoácidos de la s Ec ID NO: 31. Un derivado de ácido graso de cadena corta ejemplar es un derivado de ácido graso C12. Un derivado de ácido graso de cadena corta alternativo es un derivado de ácido graso C14. En determinadas circunstancias, la disminución del rendimiento proporcional o porcentual de derivados de ácidos grasos de cadena corta puede correlacionarse con un aumento del rendimiento proporcional de derivados de ácidos grasos de cadena larga. La disminución del rendimiento proporcional o porcentual de derivados de ácidos grasos de cadena corta y/o el correspondiente aumento del rendimiento proporcional de derivados de ácidos grasos de cadena larga puede medirse in vitro o in vivo. Preferentemente, la disminución del rendimiento proporcional de derivados de ácidos grasos de cadena corta o el correspondiente aumento del rendimiento proporcional de derivados de ácidos grasos de cadena corta se mide in vivo.

En un aspecto, se proporciona un polinucleótido (o un gen) que codifica una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales) de la divulgación. En otro aspecto, se desvela un vector que comprende el polinucleótido (o el gen) según la presente divulgación.

En un aspecto, la tioesterasa precursora está codificada por un gen que puede hibridarse selectivamente con la secuencia de polinucleótidos de ’tesA, o con un ortólogo, parálogo u homólogo de la misma. En la FIG. 56 se ofrece un listado de Números de Registro de GenBank de homólogos de proteínas de 'TesA que tienen una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 40% con 'TesA. La tioesterasa precursora puede codificarse mediante un polinucleótido que puede hibridarse selectivamente en condiciones de rigurosidad intermedia, alta o máxima.

En un aspecto, se desvela un polinucleótido que codifica una tioesterasa precursora en donde la tioesterasa precursora comprende la secuencia de aminoácidos de 'TesA, un ortólogo de la misma, un parálogo de la misma o un homólogo de la misma. Por ejemplo, la tioesterasa precursora comprende la secuencia de aminoácidos de una 'TesA obtenida de una bacteria E. coli, tal como una bacteria E.coli K12. En un aspecto particular, se desvela un polinucleótido que codifica la tioesterasa precursora, en donde la tioesterasa precursora comprende la secuencia de aminoácidos, una variante, o un fragmento de la SEC ID NO: 31 de la FIG. 58. En un aspecto particular, el gen que codifica la tioesterasa precursora comprende la secuencia de polinucleótidos de la SEC ID NO: 32 expuesta en la FIG. 59, o un fragmento de la misma.

En un aspecto, se desvela un polinucleótido que codifica una tioesterasa precursora en donde la tioesterasa precursora comprende una proteína que tiene al menos aproximadamente 20 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 31 de la FIG.

58. En un aspecto, se desvela un polinucleótido que codifica una tioesterasa precursora en donde la tioesterasa precursora comprende una proteína que tiene al menos aproximadamente 20 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de una 'TesA de la bacteria E.coli K12. En un aspecto, se desvela un polinucleótido, que comprende una secuencia que tiene al menos aproximadamente 20 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la SEQ ID NO:32 expuesta en la FIG. 59.

En un aspecto, se desvela un vector que comprende un gen (o un polinucleótido) que codifica una tioesterasa mutante o uno de sus equivalentes naturales. Los vectores de acuerdo con la divulgación pueden transformarse en células hospedadoras adecuadas para producir células hospedadoras recombinantes.

En un aspecto, se desvela una sonda que comprende un polinucleótido que tiene una longitud de aproximadamente 4 a aproximadamente 150 nucleótidos, que es sustancialmente idéntico a un fragmento correspondiente de la SEQ ID NO: 32 expuesta en la FIG. 59, en donde la sonda es útil para detectar y/o identificar secuencias de polinucleótidos que codifican enzimas que tienen actividad tioesterasa. Según la divulgación, puede utilizarse una sonda para detectar y aislar posibles tioesterasas precursoras de fuentes desconocidas, para producir dichas tioesterasas precursoras o para las cuales no se conoce la secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos.

En determinados aspectos, se desvela una célula hospedadora recombinante que comprende un polinucleótido que codifica una tioesterasa mutante o uno de sus equivalentes naturales. En un aspecto, para alterar o modificar las tioesterasas endógenas de la célula hospedadora pueden emplearse técnicas conocidas de modificación o alteración genómica, efectuando una o más de las mutaciones mencionadas anteriormente, de modo que al menos una de las tioesterasas endógenas mutantes tenga al menos una propiedad alterada. En otro aspecto, la célula hospedadora recombinante se genomanipula para incluir un plásmido que comprende un polinucleótido que codifica una tioesterasa mutante o uno de sus equivalentes naturales. En otro aspecto más, la célula hospedadora recombinante expresa la tioesterasa después de que el polinucleótido que codifica la tioesterasa se integre en el cromosoma de la célula hospedadora.

En un aspecto, la célula hospedadora recombinante de la divulgación puede seleccionarse de cualquier célula que sea capaz de expresar una construcción génica recombinante, y puede seleccionarse de una célula microbiana, vegetal o animal. En un aspecto particular, el origen de la célula hospedadora es bacteriano, cianobacteriano, fúngico, de levaduras, de algas, de ser humano o de mamífero. En un aspecto particular, la célula hospedadora se selecciona de cualquiera de las especies de bacterias grampositivas tales como Actinomycetes; Bacillaceae, incluyendo Bacillus alkalophilus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, B. thuringiensis; Brevibacteria sp., incluyendo Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium healii, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium paraffinolyticum; Corynebacterium spp. tales como C. glutamicum y C. melassecola, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebactertium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitrilophilus; o especies de bacterias acidolácticas incluyendo Lactococcus spp. tales como Lactococcus lactis; Lactobacillus spp. incluyendo Lactobacillus reuteri; Leuconostoc spp.; Pediococcus spp.; Serratia spp. tal como Serratia marcescens; especies del género Streptomyces, tales como Streptomyces lividans, Streptomyces murinus, S. coelicolor y Streptococcus spp.. Como alternativa, cepas de una especie bacteriana gramnegativa perteneciente a la familia Enterobacteriaceae incluyendo E. coli, Cellulomonas spp.; o a la familia Pseudomonadaceae incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae y Burkholderia cepacia, Salmonella sp., Stenotrophomonas spp. y Stenotrophomonas maltophilia. también son útiles los microorganismos oleaginosos tales como Rhodococcus spp, Rhodococcus opacus, Ralstonia spp. y Acetinobacter spp.. Asimismo, las cepas de levaduras y de hongos filamentosos pueden ser células hospedadoras útiles, incluyendo Absidia spp.; Acremonium spp.; Agaricus spp.; Anaeromyces spp.; Aspergillus spp., incluyendo A. aculeatus, A. awamori, A. flavus, A. foetidus, A. fumaricus, A. fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae, A. terreus; A. tubingensis y A. versicolor; Aeurobasidium spp.; Cephalosporum spp.; Chaetomium spp.; Coprinus spp.; Dactyllum spp.; Fusarium spp., incluyendo F. conglomerans, F. decemcellulare, F. javanicum, F. lini, F. oxysporum y F. solani; Gliocladium spp.; Kluyveromyces sp.; Hansenula sp.; Humicola spp., incluyendo H. insolens y H. lanuginosa; Hypocrea spp.; Mucor spp.; Neurospora spp., incluyendo N. crassa y N. sitophila; Neocallimastix spp.; Orpinomyces spp.; Penicillium spp.; Phanerochaete spp.; Phlebia spp.; Pichia sp.; Piromyces spp.; Rhizopus spp.; especies de Rizomucor tales como Rhizomucor miehei; Schizophyllum spp.; Schizosaccharomyces tal como, por ejemplo, la especie S. pombe; chytalidium sp., Sulpholobus sp., Thermoplasma sp., Thermomyces sp.; Trametes spp.; Trichoderma spp., incluyendo T. reesei, T. reesei (longibrachiatum) y T. viride; Yarrowinia sp.; y Zygorhynchus spp y en particular incluyendo precisamente las levaduras oleaginosas Phafia spp., Rhorosporidium toruloides Y4, Rhodotorula Glutinis y Candida 107.

En un aspecto, se desvela una célula hospedadora recombinante, que expresa o sobreexpresa un gen que codifica la tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), y que también expresa (o sobreexpresa) uno o más genes que codifican una o más enzimas que utilizan, como sustratos, productos de reacción de la tioesterasa mutante (por ejemplo, ácidos grasos, acil-CoA grasas, ésteres grasos de acil-fosfato, aldehídos grasos, ésteres grasos, o alcoholes grasos) o productos de reacción de una o más enzimas distintas que forman parte de una ruta metabólica, incluyendo productos de reacción de la tioesterasa mutante (por ejemplo, ácidos grasos) como precursores y/o sustratos.

En un aspecto, se desvela una célula hospedadora recombinante, que expresa o sobreexpresa un gen que codifica una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales) y que también expresa (o sobreexpresa) uno o más genes que codifican una o más enzimas que reaccionan con un sustrato que es necesario como un precursor para una reacción en una ruta biosintética de ácidos grasos. En un aspecto particular, la célula hospedadora recombinante incluye un gen que codifica la tioesterasa y un gen que codifica una enzima que reacciona con un sustrato que es necesario como un precursor para una reacción en una ruta sintética de ácidos grasos, que comprende la sobreexpresión o modificación de un gen seleccionado de pdh, pank, acef, fabH, fabD, fabG, acpP y/o fabF.

En un aspecto , la cé lu la h o spe da do ra re co m b in a n te com p ren de un gen (o un p o lin u c le ó tid o ) que cod ifica una t io e s te ra s a m u ta n te (o uno de sus e q u iva le n te s n a tu ra le s ) y ta m b ié n co m p re n d e la a te n u a c ió n o de le c ió n de un gen que reduce el flu jo de ca rbono , o un gen que com p ite po r sus tra to s , co fa c to res , o req u is itos de ene rg ía de n tro de una ru ta b ios in té tica de ác ido s g rasos. En un asp e c to pa rticu la r, el gen a te nua do com p ren de al m en os uno de los s ig u ie n te s ge ne s fadE, gpsA, IdhA, pflB, adhE, pta, poxB, ackA, ackB, pIsB y/o sfa.

En un aspec to , una cé lu la h o sp e d a d o ra re co m b in a n te co m p re n d e un gen (o un p o lin u c le ó tid o ) que cod ifica una t io e s te ra s a m u tan te (o uno de sus e q u iva le n te s n a tu ra les ) y un gen exógeno in tro d u c id o de m an e ra he te ró loga que cod ifica al m en os una en z im a de riva da de ác idos grasos. En d e te rm in a d o s aspectos, el gen exógeno o p o lin u c le ó tid o cod ifica , po r e jem p lo , una a c il-C o A s in tasa , una é s te r s in tasa , una a lcoh o l a c iltra n s fe ra sa , una a lcoho l de sh id ro g e n a sa , una a c il-C o A reduc tasa , una a c il-C o A red uc tasa fo rm a d o ra de a lcoh o l graso, una ác ido ca rb o x ílico red uc tasa , una d e sca rb o x ila sa , una a ld e h íd o red uc tasa , una a ce til tra n s fe ra s a de a lcoh o l graso , una en z im a co n d e n sa d o ra de ac ilo , una a m in o tra n s fe ra sa o una de sca rb on ila sa .

En un aspec to , la cé lu la h o sp e d a d o ra re c o m b in a n te c o m p re n d e un gen que co d ifica una t io e s te ra s a m u tan te (o uno de sus eq u iva le n te s n a tu ra les ) y al m en os dos genes e xó ge no s in tro d u c id o s de m an era he te ró loga que cod ifican en z im a s d e riva d a s de ác ido s g rasos. En d e te rm in a d o s aspec tos , los ge ne s o p o lin u c le ó tid o s e xó g e n o s cod ifican , po r e jem p lo , una a c il-C o A s in tasa , una é s te r s in tasa , una a lcoh o l ac iltran s fe rasa , una a lcoh o l de sh id ro g e n a sa , una ac il-C o A reductasa , una a c il-C o A red uc tasa fo rm a d o ra de a lcoh o l graso, una ác ido ca rb ox ílico reduc tasa , una d e sca rb o x ila sa , una a ld e h íd o reduc tasa , una a ce til tra n s fe ra s a de a lcoh o l graso , una e n z im a co n d e n sa d o ra de ac ilo , una a m in o tra n s fe ra sa o una de sca rb on ila sa .

En un a sp ec to p re fe rido , un gen que cod ifica la t io e s te ra sa m u tan te (o uno de sus e q u iva le n te s n a tu ra le s ) y /o una e n z im a d e riva d a de á c id o s g ra sos , po r e jem p lo , una a c il-C o A s in tasa , una é s te r s in tasa , una a lcoh o l a c iltra n s fe ra sa , una a lcoh o l d e sh id ro g e n a sa , una a c il-C o A reduc tasa , una a c il-C o A red u c ta sa fo rm a d o ra de a lcoh o l graso , una ác ido c a rb o x ílico reduc tasa , una de sca rb ox ilasa , una a ld e h íd o reduc tasa , una ace til tra n s fe ra s a de a lcoh o l graso, una e n z im a c o n d e n sa d o ra de ac ilo , una a lcoh o l ace tiltra n s fe ra sa , una a m in o tra n s fe ra sa , una tio e s te ra sa o una d e sca rb o x ila sa ad ic io n a l que se sob ree xp resa .

En un aspecto , genes que cod ifican t io e s te ra sa s m u ta n te s (o sus eq u iva le n te s na tu ra les), enz im as de riva das de ác ido s g ra sos y/u o tros genes e xp re sa d o s de fo rm a reco m b in an te en una cé lu la h o sp e d a d o ra re co m b in an te , se m od ifica n para o p tim iz a r al m en os un codón para la exp res ión en la cé lu la h o sp e d a d o ra reco m b in an te .

En un aspec to , la cé lu la ho spe d a d o ra re co m b in a n te com p ren de al m en os un gen que cod ifica una t io e s te ra sa m u tan te (o uno de sus e q u iva le n tes n a tu ra les ) y un gen que cod ifica una a c il-C o A s in tasa . El gen de la ac il-C o A s in ta sa pued e s e r c u a lq u ie ra de los s ig u ie n te s genes, fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadDI, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p, o el gen que cod ifica la p ro te ína Z P _ 01644857. O tro s e jem p los de genes de a c il-C o A s in ta sa inc luyen los genes fadDD35 de M. tuberculosis HR7Rv [N P _217021 ], yhfL de B. subtilis [N P _ 388908 ], fadD1 de P. aeruginosa PAO1 [N P _251989 ], el gen que cod ifica la p ro te ína Z P _ 01644857 de Stenotrophomonas maltophilia R551-3, o el gen faa3p de Saccharomyces cerevisiae [N P _012257 ].

En un aspecto , se de sve la una cé lu la h o sp e d a d o ra re co m b in a n te que com p ren de al m en os un gen o po lin uc leó tido que cod ifica una t io e s te ra s a m u tan te (o uno de sus e q u iva le n tes n a tu ra le s ) y un gen o p o lin uc leó tido que cod ifica una é s te r s in tasa , ta l com o un gen de é s te r s in ta sa ob te n id o de Acinetobacter spp., Alcanivorax borkumensis, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae, Homo sapiens, Simmondsia chinensis, Mortierella alpina, Cryptococcus curvatus, Alcanivorax jadensis, Alcanivorax borkumensis, Acinetobacter sp. HO1-N, o Rhodococcus opacus. C om o e jem p los de genes de é s te r s in ta sa se inc luyen los genes wax/dgat, que cod ifican una és te r s in ta s a /a c il-C o A b ifu nc iona l: d ia c ilg lice ro l a c iltra n s fe ra sa de Simmondsia chinensis, Acinetobacter sp. cepa ADP1, Alcanivorax borkumensis, Pseudomonas aeruginosa, Fundibacter jadensis, Arabidopsis thaliana o Alkaligenes eutrophus. En un a sp e c to p re fe rido , el gen que cod ifica la é s te r s in ta sa es tá so b ree xp resa do .

En un aspecto , la cé lu la h o spe da do ra re co m b in a n te co m p re n d e al m en os un gen que cod ifica una en z im a b io s in té tica de a ld e h íd o graso . Un gen que co d ifica una e n z im a b io s in té tica de a ld e h íd o g ra so puede ser, po r e jem p lo , un gen de ác ido ca rb o x ílico red uc tasa (p o r e jem p lo , un gen car), que tie n e una se cu e n c ia de p o lin u c le ó tid o s y/o un m o tivo de po lip ép tido s p ro p o rc io n a d o en los lis ta do s de las figu ras 32 y 33, o una v a ria n te de los m ism os. En a lg u n o s casos, el gen qu e c o d ifica una e n z im a b io s in té tica de a ld e h íd o g ra so co d ifica uno o m ás de los m o tivo s de a m in o á c id o s re p re se n ta d o s en la FIG . 33.

En un aspecto , la cé lu la h o spe da do ra reco m b in an te com p ren de al m en os un gen de p roducc ión de a lcoh o l graso. Los g e n e s de p ro du cc ión de a lco h o l g ra so inc luyen , po r e jem p lo , acr1. Los ge ne s de p ro du cc ión de a lcoh o l g ra so se de scrib en , po r e jem p lo , en las p u b lica c io n e s P C T n .°W O 2008 /119082 y W O 2007 /136762.

En un aspec to , la cé lu la h o sp e d a d o ra re co m b in a n te co m p re n d e un gen q u e co d ifica una t io e s te ra s a m u ta n te (o uno de sus e q u iv a le n te s n a tu ra le s ) y un gen que co d ifica al m en os un gen p ro d u c to r de o le fina . El gen pued e s e r un gen p ro d u c to r de o le fin a te rm in a l o un gen p ro d u c to r de o le fina in te rna . C o m o e je m p lo s de ge ne s p ro d u c to re s de o le finas te rm in a le s , los de sc ritos en la P ub licac ió n P C T No. 2009 /085278 , in c luye nd o el gen orj880, son ap rop iad os . C om o e je m p lo s de genes p ro d u c to re s de o le finas in te rnas, los de sc rito s en la pub licac ión P C T No. 2008 /147781 A 2 son ap rop iad os .

En un aspec to , se p ro p o rc io n a una cé lu la h o spe da do ra re co m b in a n te que c o m p re n d e al m en os un gen o p o lin u c le ó tid o q u e c o d ifica una t io e s te ra s a m u ta n te (o uno de sus e q u iv a le n te s na tu ra les ), y a l m en os uno de (a ) un gen o p o lin u c le ó tid o que cod ifica una e n z im a de riva d a de ác ido s g ra sos y (b) un gen o po lin u c le ó tid o que cod ifica una e n z im a a c il-C o A d e sh id ro g e n a sa que está a tenuado . P re fe re n te m e n te , ese gen que c o d ifica una en z im a d e riva d a de ác ido g ra so que es tá a te n u a d o o d e le c io n a d o y que es e n d ó g e n o a la cé lu la ho sp e d a d o ra , cod ifica , po r e jem p lo , una a c il-C o A s in tasa , una é s te r s in tasa , una a lcoh o l ac iltran s fe rasa , una a lcoh o l de sh id ro g e n a sa , una ac il-C o A reduc tasa , una ác ido ca rb o x ílico reduc tasa , una de sca rb on ila sa , una ace til tra n s fe ra s a de a lcoh o l graso , una d e sca rb o x ila sa de ác ido graso , o una a c il-C o A red uc tasa fo rm a d o ra de a lco h o l graso . En un aspecto , el gen a te n u a d o cod ifica una a c il-C o A s in ta sa o una é s te r s in tasa .

En un aspecto , se de sve la una cé lu la ho spe d a d o ra re co m b in a n te que exp resa , o p re fe re n te m e n te sob ree xp resa , una en z im a t io e s te ra s a en co n d ic io n e s que dan com o resu ltad o la s ín tes is d irec ta de é s te re s g ra sos de ac il-A C P o ac il-C o A , ta le s com o és te re s m e tílico s de á c id o s g ra so s (F A M E , s ig las de l in g lé s fatty acid methyl esters) y és te res e tílico s de ác ido s g ra sos (F A E E , fatty acid ethyl esters), m ed ia n te d icha tio e s te ra sa . En este aspec to , la tio e s te ra sa tra n s fo rm a d ire c ta m e n te la a c il-A C P o a c il-C o A en é s te r g ra so sin e x p re s a r n e ce sa ria m e n te n ing una e n z im a que sea una ac il C o A s in ta sa o una é s te r s in ta sa g rasa para p ro d u c ir és te res g rasos. No obs tan te , au nq ue la exp res ión o so b re e xp re s ió n de una a c il-C o A s in ta sa o é s te r s in ta sa g rasa sea inne cesa ria , d ichas e n z im a s pueden se r d e sea b le s pa ra a u m e n ta r los re n d im ie n to s del p roducto . En este aspecto , la en z im a tio e s te ra s a puede se r cu a lq u ie ra de una t io e s te ra s a e n dó ge na , una t io e s te ra s a e xp re sa d a de m an e ra he te ró loga , una t io e s te ra sa m utan te , o uno de sus e q u iva le n te s na tu ra les .

En un aspecto , la cé lu la h o sp e d a d o ra reco m b in an te tie n e un gen e n d ó ge no que co d ifica una e n z im a ac il-C o A d e sh id ro g e n a sa que está d e le c io n a d o o a tenuado .

En un asp ec to , se d e sve la un m é to d o en d o n d e la cé lu la h o sp e d a d o ra re co m b in a n te se g ú n la d ivu lg a c ió n se cu ltiva en co n d ic io n e s que pe rm iten la exp res ión o so b re e xp re s ió n de una o m ás e n z im a s t io e s te ra sa s , que pueden se le cc io n a rse de tio e s te ra s a s endó ge nas , t io e s te ra sa s exp re sa d a s de m an e ra he te ró loga , tio e s te ra s a s m u tan tes (o sus eq u iva le n te s na tu ra les), o una com b in ac ió n de estas t io e s te ra sa s . En un asp ec to pa rticu la r, la en z im a tio e s te ra s a que se e xp re sa o so b re e x p re s a pu e d e recu pe ra rse , y m ás p re fe re n te m e n te , se pu rifica su s ta n c ia lm e n te , d e sp u é s de re co g e r y /o e fe c tu a r la lis is de la cé lu la ho spe da dora .

En un asp ec to , se d e sve la un m é to d o en d o n d e la cé lu la h o sp e d a d o ra re c o m b in a n te se g ú n la d ivu lg a c ió n se cu ltiva en co n d ic io n e s que pe rm iten la p ro du cc ión de d e riva d o s de ác ido s g rasos. En un a sp e c to p re fe rido , el de riva d o de ác ido g ra so puede recu pe ra rse , y m ás p re fe ren te m en te , el d e riva d o de ác ido g ra so se pu rifica su s ta n c ia lm e n te . En un asp ec to pa rticu la rm e n te p re fe rido , la com p os ic ión de de riva dos de ác idos g ra sos se pu rifica s u s ta n c ia lm e n te de o tros co m p o n e n te s p ro d u c id o s d u ran te el cu ltivo m ed ia n te cen trifu ga c ión .

En un aspecto , se de sve la un m é tod o para p ro d u c ir un de riva do de ác ido graso , que co m p re n d e c u ltiv a r una cé lu la h o sp e d a d o ra re co m b in a n te de la d ivu lg ac ión en co n d ic io n e s ad e cu a d a s para g a ra n tiz a r la exp res ión o s o b re e xp re s ió n de una t io e s te ra s a m u ta n te (o uno de sus e q u iva le n te s na tu ra les), y re c u p e ra r el de riva d o de ác ido g ra so que se produce .

En un aspecto , se de sve la un m é tod o para p ro d u c ir e x tra ce lu la rm e n te un de riva do de ác ido g ra so in vitro, que co m p re n d e c u ltiv a r una cé lu la h o spe da do ra reco m b in an te en con d ic io n e s ad e cu a d a s para la exp res ión o so b re e xp re s ió n de una en z im a tio e s te ra sa (in c luye nd o , po r e jem p lo , una t io e s te ra sa endó ge na , una t io e s te ra sa e xp re sa d a de m an e ra he te ró loga , una tio e s te ra s a m u tan te , o uno de sus e q u iva le n te s na tu ra les), re co g ie n d o y e fe c tu a n d o la lis is de las cé lu las , de ta l m an era que la en z im a tio e s te ra sa que se p roduce pueda recu pe ra rse y u tiliza rse para p ro d u c ir d e riva d o s de á c id o s g ra sos in vitro. En un asp ec to e jem p la r, la e n z im a tio e s te ra s a se pu rifica sus ta n c ia lm e n te . En o tro aspec to e jem p la r, la e n z im a tio e s te ra sa no se pu rifica de l lisado ce lu la r. La en z im a tio e s te ra s a pu rifica d a o el lisado c e lu la r que co m p re n d e d ich a enz im a , puede so m e te rse de sp u é s a su s tra to s de t io e s te ra s a a d e cu a d o s en c o n d ic io n e s que pe rm ita n la p ro d u cc ió n e x tra c e lu la r de d e riva d o s de ác ido s g rasos. En la m a te ria se con oce n b ien té c n ic a s pa ra in tro d u c ir su s tra to s a enz im as. Un e jem p lo no lim itan te es a ñ a d ir el sus tra to (o sus tra to s ) en fo rm a de so luc ión a la so luc ión e n z im á tica o al lisado ce lu la r, y pe rm itir que la m ezc la se incube. O tro e jem p lo no lim itan te con s is te en in cu b a r el sus tra to (o sus tra to s ) y la so luc ió n e n z im á tica o el lisado c e lu la r fija nd o el sus tra to (o su s tra to s ) o la enz im a a un m ed io só lido (p o r e jem p lo , perlas, res inas, p lacas, e tc .) y pa sa r la so luc ió n e n z im á tica /lisa d o o el sus tra to (o sus tra to s), re sp ec tiva m en te , a tra v é s de l m ed io só lido a una ve lo c id a d que pe rm ita que se rea lice su fic ie n te co n ta c to e n tre el sus tra to (o sus tra to s ) y la enz im a .

En o tro aspec to , se d e sve la un m é tod o pa ra p ro d u c ir un d e riva d o de ác ido graso , que co m p re n d e c u ltiv a r una cé lu la h o sp e d a d o ra re co m b in a n te en co n d ic io n e s ad e cu a d a s para g a ra n tiz a r la exp res ión de una en z im a tio e s te ra sa (in c luye nd o , po r e jem p lo , una tio e s te ra sa endógena , una tio e s te ra sa e xp resa da de m an era he te ró loga , una t io e s te ra s a m u tan te , o uno de sus e q u iva le n te s na tu ra les), y re c u p e ra r el d e riva d o de ác ido g raso que se sec re ta o libe ra e x tra ce lu la rm e n te . P o r con s ig u ie n te , el p ro du c to de riva do de ác ido g raso se recu pe ra de, po r e jem p lo , el sobrenadante de un caldo de fermentación en donde se cultiva la célula hospedadora.

En un aspecto, se desvela un método para obtener extracelularmente una composición de derivado de ácido graso cultivando una célula hospedadora recombinante que se ha transformado con un polinucleótido que codifica una enzima tioesterasa (incluyendo, por ejemplo, una tioesterasa endógena, una tioesterasa heteróloga, una tioesterasa mutante, o uno de sus equivalentes naturales), en condiciones que permitan la producción de un derivado de ácido graso, una parte más grande o más pequeña de la cual se secreta o libera extracelularmente, y recuperar el derivado de ácido graso que se produce. En un aspecto ejemplar, el derivado de ácido graso se produce dentro de la célula, aunque la célula hospedadora libera una parte de este. Por consiguiente, el método comprende además la recogida de las células, su lisis y la recuperación del derivado de ácido graso.

En un aspecto, se desvela un método para producir derivados de ácidos grasos en donde una célula hospedadora recombinante que expresa, o preferentemente sobreexpresa, una enzima tioesterasa en condiciones que dan como resultado la síntesis de ésteres grasos a partir de acil-ACP o acil-CoA mediante dicha tioesterasa, se cultiva en condiciones que permitan dicha producción directa de ésteres grasos.

En un aspecto, se desvela un método para producir derivados de ácidos grasos que comprende: modificar una o más tioesterasas endógenas de la célula hospedadora utilizando técnicas adecuadas de alteración genómica de modo que las tioesterasas endógenas comprendan una o más mutaciones y tengan una o más propiedades alteradas, en comparación con los precursores de las tioesterasas endógenas; y cultivar la célula hospedadora en condiciones adecuadas para que dicha célula hospedadora exprese o sobreexprese dichas tioesterasas mutantes; y recuperar los derivados de ácidos grasos. En un aspecto ejemplar, el derivado de ácido graso que se produce puede secretarse o liberarse extracelularmente, de modo que pueda recuperarse, por ejemplo, del sobrenadante del caldo de fermentación en donde se cultiva la célula hospedadora.

En un aspecto, se desvela un método para producir derivados de ácidos grasos que comprende: transformar la célula hospedadora con una secuencia de polinucleótidos que codifica una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales), de modo que la producción de derivados de ácidos grasos en la célula hospedadora se altera con respecto a una célula que no se ha transformado con el gen de tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales).

En un aspecto, se desvela un método para producir derivados de ácidos grasos que comprende: proporcionar una secuencia de polinucleótidos que comprende un gen que codifica una tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales); transformar una célula hospedadora adecuada en condiciones en las que dicha secuencia de polinucleótidos se incorpore en dicho cromosoma de dicha célula y dicho gen pueda expresarse dentro de dicha célula hospedadora; cultivar la célula hospedadora transformada en condiciones adecuadas para que dicha célula hospedadora exprese dicho gen y produzca una proteína tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales); y recuperar los derivados de ácidos grasos.

En cualquiera de los aspectos anteriores, los derivados de una longitud de cadena de carbono determinada pueden recuperarse a un mayor rendimiento proporcional, en comparación con la producción de dichos derivados de ácidos grasos de la misma longitud de cadena de carbono en la misma célula hospedadora en ausencia de la tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales). En un aspecto particular, los derivados de ácidos grasos que se recuperan a un mayor o menor rendimiento comprenden una longitud de cadena primaria de Ce, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, Cíe, C17, C18, C19, C20, C2I, C22, C23, C24, C25, C26, C28, C29, C30, C31, C32, C33, C34, C35, C36, C37, C38 o C39 de cadena de acilo graso. Los derivados de ácidos grasos que se recuperan que se recuperan a un mayor o menor rendimiento en la composición, pueden seleccionarse de todos los tipos de derivados de ácidos grasos, incluyendo, por ejemplo, hidrocarburos, ácidos grasos, ésteres grasos, aldehidos grasos, alcoholes grasos, olefinas terminales, olefinas internas, alcanos, dioles, aminas grasas, ácidos dicarboxílicos o cetonas o combinaciones de los mismos.

Como alternativa, en cualquiera de los aspectos anteriores, un derivado de ácido graso particular puede producirse a un rendimiento proporcional o porcentual aumentado o disminuido en relación con los otros derivados de ácidos grasos, cuando se compara con el rendimiento proporcional o porcentual de ese derivado de ácido graso en particular en la misma célula hospedadora en ausencia de la tioesterasa mutante (o uno de sus equivalentes naturales). En un aspecto particular, el derivado de ácido graso que se produce a un rendimiento proporcional o porcentual aumentado es un éster graso. En otro aspecto, el derivado de ácido graso que se produce a un rendimiento proporcional o porcentual reducido es un éster graso.

Como alternativa, en cualquiera de los aspectos anteriores, los derivados de ácidos grasos pueden producirse a un mayor rendimiento, o a un mayor rendimiento proporcional de productos de cadena corta (por ejemplo, C8, C9, C10, C11, C12, C13 o C14). A la inversa, en cualquiera de los aspectos anteriores, los derivados de ácidos grasos pueden producirse a un rendimiento reducido, o a un rendimiento proporcional reducido de productos de cadena corta (por ejemplo, C8, C9, C10, C11, C12, C13 o C14).

En un aspecto, se desvela un método de producción de derivados de ácidos grasos, en donde el rendimiento de derivados de ácidos grasos producidos por el método de la divulgación es de al menos aproximadamente 0,001 g de producto derivado de ácido graso/g de fuente de carbono, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,01 g de producto derivado de ácido graso/g de fuente de carbono, aproximadamente 0,1 g de producto derivado de ácido graso/g de fuente de carbono, aproximadamente 0,2 g de producto derivado de ácido graso/g de fuente de carbono, aproximadamente 0,3 g de producto derivado de ácido graso/g de fuente de carbono, aproximadamente 0,4 g de producto derivado de ácido graso/g de fuente de carbono o de aproximadamente 0,45 g de producto derivado de ácido graso/g de fuente de carbono.

En un aspecto, se desvela un método de producción de derivados de ácidos grasos, en donde el método da como resultado un título de al menos aproximadamente 0,5 g/l, por ejemplo, al menos aproximadamente 1 g/l, 2 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 75 g/l, 100 g/l, 150 g/l o 200 g/l.

En un aspecto, se desvela un método de producción de derivados de ácidos grasos en donde la productividad del método es tal que se producen al menos aproximadamente 0,1 g/l.h, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,5 g/l.h, 1 g/l.h, 2 g/l.h, 3 g/l.h, 4 g/l.h, 5 g/l.h, 6 g/l.h, 7 g/l.h u 8 g/l.h.

En un aspecto, se desvelan composiciones de derivados de ácidos grasos que producen las células hospedadoras de la divulgación. Dichas composiciones pueden comprender hidrocarburos, ésteres, alcoholes, cetonas, aldehídos, ácidos grasos, ácidos dicarboxílicos, olefinas internas, olefinas terminales y/o combinaciones de los mismos. Dichas composiciones son útiles en aplicaciones en la industria química, por ejemplo, en la producción de tensioactivos y detergentes, o como un biocombustible y un sustituto del petróleo, gasoil para calefacción, queroseno, diésel, combustible de aviación o gasolina.

En un aspecto, se desvelan composiciones de derivados de ácidos grasos que comprenden una cantidad menor o igual a aproximadamente 50 ppm de arsénico, aproximadamente 30 ppm, aproximadamente 25 ppm, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 ppm de arsénico; menor o igual a aproximadamente 200 ppm de calcio, aproximadamente 150 ppm de calcio, aproximadamente 119 ppm de calcio o entre aproximadamente 50 y aproximadamente 200 ppm de calcio; menor o igual a aproximadamente 200 ppm de cloro, aproximadamente 150 ppm de cloro, aproximadamente 119 ppm de cloro o entre aproximadamente 50 y aproximadamente 200 ppm de cloro; menor o igual a aproximadamente 50 ppm de cobre, aproximadamente 30 ppm de cobre, aproximadamente 23 ppm de cobre, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 ppm de cobre; menor o igual a aproximadamente 300 ppm de hierro, aproximadamente 200 ppm de hierro, aproximadamente 136 ppm de hierro, o entre aproximadamente 50 y aproximadamente 250 ppm de hierro; menor o igual a aproximadamente 50 ppm de plomo, aproximadamente 30 ppm de plomo, aproximadamente 25 ppm de plomo, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 ppm de plomo; menor o igual a aproximadamente 50 ppm de manganeso, aproximadamente 30 ppm de manganeso, aproximadamente 23 ppm de manganeso, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 ppm de manganeso; menor o igual a aproximadamente 50 ppm de magnesio, aproximadamente 30 ppm de magnesio, aproximadamente 23 ppm de magnesio, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 ppm de magnesio; menor o igual a aproximadamente 0,5 ppm de mercurio, aproximadamente 0,1 ppm de mercurio, aproximadamente 0,06 ppm de mercurio o entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,2 ppm de mercurio; menor o igual a aproximadamente 50 ppm de molibdeno, aproximadamente 30 ppm de molibdeno, aproximadamente 23 ppm de molibdeno o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 ppm de molibdeno; menor o igual a aproximadamente 2 % de nitrógeno; aproximadamente 1 % de nitrógeno, aproximadamente 0,5 % de nitrógeno, o entre aproximadamente 0,1-1 % de nitrógeno; menor o igual a aproximadamente 200 ppm de potasio, aproximadamente 150 ppm de potasio, aproximadamente 103 ppm de potasio, o entre aproximadamente 50 y aproximadamente 200 ppm de potasio; menor o igual a aproximadamente 300 ppm de sodio, 200 ppm de sodio, aproximadamente 140 ppm de sodio, o entre aproximadamente 50 y aproximadamente 300 ppm de sodio; menor o igual a aproximadamente 1 ppm de azufre, menor o igual a aproximadamente 1 % de azufre, aproximadamente 0,14% de azufre, o entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 0,3% de azufre; menor o igual a aproximadamente 50 ppm de cinc, aproximadamente 30 ppm de cinc, aproximadamente 23 ppm de cinc, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 ppm de cinc; o menor o igual a aproximadamente 700 ppm de fósforo, aproximadamente 500 ppm de fósforo, aproximadamente 350 ppm de fósforo, o entre aproximadamente 100 y aproximadamente 700 ppm de fósforo.

En un aspecto, se desvelan derivados de ácidos grasos que tienen fracciones de carbono moderno de aproximadamente 1,003 a aproximadamente 1,5.

En un aspecto, se desvela una composición de derivado de ácido graso en donde la composición incluye constituyentes que comprenden un grupo acilo que tiene un doble enlace en la posición 7 en la cadena de carbono (entre el número de carbono 7 en la cadena de carbono y el número de carbono 8 en la cadena de carbono) desde su extremo reducido.

En un aspecto particular, la composición de derivados de ácidos grasos comprende ésteres grasos C5-C25 (es decir, una longitud de cadena de carbono de 5 a 25 carbonos), ácidos grasos C5-C25, aldehídos grasos C5-C25, alcoholes grasos C5-C25; o ésteres ácidos C10-C20 (es decir, una longitud de cadena de carbono de 10 a 20 carbonos),ácidos grasos C10-C20, aldehídos grasos C10-C20, alcoholes grasos C10-C20; o ésteres grasos C12-C18 (es decir, una longitud de ca d e n a de c a rb o n o de 12 a 18 ca rb o n o s ),á c id o s g ra so s C ¹²-C ¹⁸, a ld e h id o s g ra so s C ¹²-C ¹⁸, a lco h o le s g ra so s C ¹²-C ¹⁸.

En un a sp e c to pa rticu la r, los de riva dos de ác ido s g ra sos de la d ivu lg ac ión com p re n d e n de riva dos de ác ido s g ra sos de ca d e n a linea l, d e riva d o s de ác ido s g ra sos de ca d e n a ra m ifica d a y /o g ru p o s c íc licos . En un a sp e c to pa rticu la r, los d e riva d o s de ác ido s g ra sos son in sa tu ra d o s (p o r e jem p lo , m o n o in sa tu ra d o s ) o sa tu rados .

En un asp ec to , la c o m p o s ic ió n de d e riv a d o s de á c id o s g ra s o s c o m p re n d e un é s te r g ra so q u e se p ro d u ce a p a rtir de un a lcoh o l y una ac il-C oA , en do nde el a lcoh o l t ie n e una lo ng itud de al m en os a p ro x im a d a m e n te 1, po r e jem p lo , de al m en os a p ro x im a d a m e n te 2, a p ro x im a d a m e n te 3, a p ro x im a d a m e n te 4, a p ro x im a d a m e n te 5, a p ro x im a d a m e n te 6, a p ro x im a d a m e n te 7, a p ro x im a d a m e n te 8, a p ro x im a d a m e n te 10, a p ro x im a d a m e n te 12, a p ro x im a d a m e n te 14, a p ro x im a d a m e n te 16 o a p ro x im a d a m e n te 18 ca rb o n o s y la a c il-C o A tie n e una lo ng itud de al m enos a p ro x im a d a m e n te 2, po r e jem p lo , de al m en os a p ro x im a d a m e n te 4, a p ro x im a d a m e n te 6, a p ro x im a d a m e n te 8, a p ro x im a d a m e n te 10, a p ro x im a d a m e n te 12, a p ro x im a d a m e n te 14, a p ro x im a d a m e n te 16, a p ro x im a d a m e n te 18, a p ro x im a d a m e n te 20, a p ro x im a d a m e n te 22, a p ro x im a d a m e n te 24 o a p ro x im a d a m e n te 26 ca rbonos . En a lgunos asp ec tos , el a lco h o l y la ac il-C oA , a p a rtir de los cua le s se p ro du cen los és te re s g rasos, va ría n en a p ro x im a d a m e n te 2, a p ro x im a d a m e n te 4, a p ro x im a d a m e n te 6, a p ro x im a d a m e n te 8, a p ro x im a d a m e n te 10, a p ro x im a d a m e n te 12 o a p ro x im a d a m e n te 14 á to m o s de carbono .

En o tro aspec to , la co m p o s ic ió n de d e riva d o s de ác ido s g ra sos c o m p re n d e un é s te r g ra so que se p ro du ce a pa rtir de un a lcoh o l y una ac il-A C P , en dond e el a lcoh o l t ie n e una lo ng itud de al m en os a p ro x im a d a m e n te 1, po r e jem p lo , al m en os de a p ro x im a d a m e n te 2, a p ro x im a d a m e n te 3, a p ro x im a d a m e n te 4, a p ro x im a d a m e n te 5, a p ro x im a d a m e n te 6, a p ro x im a d a m e n te 7, a p ro x im a d a m e n te 8, a p ro x im a d a m e n te 10, a p ro x im a d a m e n te 12, a p ro x im a d a m e n te 14, a p ro x im a d a m e n te 16 o a p ro x im a d a m e n te 18 ca rb on os y la ac il-A C P tie n e una long itud de a p ro x im a d a m e n te 2, por e jem p lo , a p ro x im a d a m e n te 4, a p ro x im a d a m e n te 6, a p ro x im a d a m e n te 8, a p ro x im a d a m e n te 10, a p ro x im a d a m e n te 12, a p ro x im a d a m e n te 14, a p ro x im a d a m e n te 16, a p ro x im a d a m e n te 18, a p ro x im a d a m e n te 20, a p ro x im a d a m e n te 22, a p ro x im a d a m e n te 24 o a p ro x im a d a m e n te 26 ca rb on os . En a lg u n o s asp ec tos , el a lcoh o l y la ac il-A C P , a p a rtir de los cua le s se p roduce el é s te r graso , va ría n en a p ro x im a d a m e n te 2, a p ro x im a d a m e n te 4, a p ro x im a d a m e n te 6, a p ro x im a d a m e n te 8, a p ro x im a d a m e n te 10, a p ro x im a d a m e n te 12 o a p ro x im a d a m e n te 14 á to m o s de carbono.

En un aspecto , la com p o s ic ió n de de riva dos de ác idos g ra sos co m p re n d e una m ezc la de de riva dos que inc luyen ác ido s g ra so s lib res. En un aspec to , el p o rce n ta je en peso de ác ido s g ra so s lib res es de al m en os a p ro x im a d a m e n te 0 ,5 %, po r e jem p lo , de al m en os a p ro x im a d a m e n te 1 %, a p ro x im a d a m e n te 2 %, a p ro x im a d a m e n te 3 %, a p ro x im a d a m e n te 4 %, a p ro x im a d a m e n te 5 %, a p ro x im a d a m e n te 6 %, a p ro x im a d a m e n te 7 %, a p ro x im a d a m e n te 8 % , a p ro x im a d a m e n te 9 % , a p ro x im a d a m e n te 10 % , a p ro x im a d a m e n te 15 % , a p ro x im a d a m e n te 20 % o de a p ro x im a d a m e n te 25 %. En un asp ec to de te rm in ado , el po rcen ta je en peso de é s te re s g ra sos p ro du c ido s es de al m en os a p ro x im a d a m e n te 50 %, po r e jem p lo , de al m en os a p ro x im a d a m e n te 55 %, a p ro x im a d a m e n te 60 %, a p ro x im a d a m e n te 65 %, a p ro x im a d a m e n te 70 %, a p ro x im a d a m e n te 75 %, a p ro x im a d a m e n te 80 %, a p ro x im a d a m e n te 85 % o de a p ro x im a d a m e n te 90 %. En un a sp ec to a d ic io na l, la re lac ión en peso de de riva dos de á c id o s g ra so s d is tin to s de ác ido s g ra so s lib res con re sp e c to a á c id o s g ra so s lib res, es m a yo r que a p ro x im a d a m e n te 90 :1 , po r e jem p lo , m a yo r que a p ro x im a d a m e n te 80:1, a p ro x im a d a m e n te 50:1, a p ro x im a d a m e n te 20:1, a p ro x im a d a m e n te 10:1, a p ro x im a d a m e n te 9:1, a p ro x im a d a m e n te 8:1, a p ro x im a d a m e n te 7:1, a p ro x im a d a m e n te 5:1, a p ro x im a d a m e n te 2:1 o a p ro x im a d a m e n te 1:1.

En un aspec to , la co m p o s ic ió n de de riva dos de ác ido s g ra sos com p ren de una m ezc la de de riva dos que inc luye ác ido s g ra sos lib res. En un aspec to , el p o rce n ta je en peso de ác ido s g ra sos lib res es de al m en os a p ro x im a d a m e n te 50 %, por e jem p lo , de al m en os a p ro x im a d a m e n te 55 %, a p ro x im a d a m e n te 60 %, a p ro x im a d a m e n te 65 %, a p ro x im a d a m e n te 70 %, a p ro x im a d a m e n te 75 %, a p ro x im a d a m e n te 80 %, a p ro x im a d a m e n te 85 % o de a p ro x im a d a m e n te 90 %. En un asp e c to d e te rm in ado , el po rcen ta je en peso de é s te r g ra so p ro du c ido es de al m enos a p ro x im a d a m e n te 0 ,5 % , po r e jem p lo , de al m en os a p ro x im a d a m e n te 1 % , a p ro x im a d a m e n te 2 % , a p ro x im a d a m e n te 3 %, a p ro x im a d a m e n te 4 %, a p ro x im a d a m e n te 5 %, a p ro x im a d a m e n te 6 %, a p ro x im a d a m e n te 7 %, a p ro x im a d a m e n te 8 %, a p ro x im a d a m e n te 9 %, a p ro x im a d a m e n te 10 %, a p ro x im a d a m e n te 15 %, a p ro x im a d a m e n te 20 %, a p ro x im a d a m e n te 25 %, a p ro x im a d a m e n te 30 %, a p ro x im a d a m e n te 35 %, a p ro x im a d a m e n te 40 %, a p ro x im a d a m e n te 45 % o de a p ro x im a d a m e n te 50 %. En un asp ec to ad ic iona l, la re lac ión en peso de de riva dos de ác ido s g ra sos p ro du c ido s d is tin to s de ác idos g ra sos lib res con respec to a ác idos g rasos lib res es m e n o r que a p ro x im a d a m e n te 60 :1 , po r e jem p lo , m e n o r que a p ro x im a d a m e n te 50:1; a p ro x im a d a m e n te 40:1, a p ro x im a d a m e n te 30:1, a p ro x im a d a m e n te 20 :1 , a p ro x im a d a m e n te 10:1, a p ro x im a d a m e n te 1:1, a p ro x im a d a m e n te 1:2; a p ro x im a d a m e n te 1:3, a p ro x im a d a m e n te 1:5 o a p ro x im a d a m e n te 1:10.

En un asp ec to , la co m p o s ic ió n de d e riva d o s de ác ido s g ra sos inc luye uno o m ás és te re s g ra sos s e le cc io n a d o s de: d e ca n o a to de etilo , d o d e ca n o a to de e tilo , tr id e c a n o a to de etilo , te tra d e c a n o a to de etilo , p e n ta d e ca n o a to de e tilo , cis-9 -h e xa d e ce n o a to de etilo , h e xa d e ca n o a to de etilo , h e p ta d e ca n o a to de e tilo , c is -11 -o c ta d e ce n o a to de etilo, o c ta d e ca n o a to de etilo, d e ca n o a to de m etilo , do d e ca n o a to de m etilo , tr id e ca n o a to de m etilo , te tra d e c a n o a to de m etilo , pe n ta d e ca n o a to de m etilo , cis-9 -h e x a d e c e n o a to de m etilo , h e xa d e ca n o a to de m etilo , he p ta d e ca n o a to de m etilo , c is -11 -o c ta d e ce n o a to de m etilo , o c ta d e ca n o a to de m etilo , o una co m b in a c ió n de los m ism os.

En un aspecto, la composición de derivados de ácidos grasos incluye uno o más ácidos grasos libres seleccionados de: ácido octanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido tetradecanoico, ácido pentadecanoico, ácido cis-9-hexadecenoico, ácido hexadecanoico, ácido cis-11-octadecenoico, o combinaciones de los mismos.

Las composiciones que comprenden los derivados de ácidos grasos de la divulgación pueden utilizarse como combustibles. Por ejemplo, los derivados de ácidos grasos pueden utilizarse como, o como un componente de, un biodiesel, un alcohol graso, un éster graso, un triacilglicérido, una gasolina, un diésel, o un combustible de avión. En un motor de combustión interna puede utilizarse una composición de gasolina o de biodiesel. En un motor a reacción puede utilizarse un combustible de aviación. Por consiguiente, en el presente documento se desvelan composiciones de combustible que comprenden los derivados de ácidos grasos preparados según las presentes divulgaciones.

Las composiciones que comprenden derivados de ácidos grasos de la divulgación pueden utilizarse como aditivos para combustibles. Por ejemplo, se pueden añadir a un diésel o biodiésel basado en petróleo para mejorar su contenido de combustible renovable, lubricidad, viscosidad cinemática, número de ácido, punto de ebullición, estabilidad oxidativa, punto de obstrucción del filtro en frío, perfiles de impurezas, nivel de ceniza sulfatada, número de cetano, punto de enturbamiento o punto de fluidez. Por consiguiente, también se desvelan composiciones de aditivos para combustible que comprenden derivados de ácidos grasos producidos según las presentes divulgaciones.

Las composiciones que comprenden derivados de ácidos grasos de la divulgación también pueden utilizarse como composiciones de biocrudo, que pueden servir como materia prima para producir otros compuestos derivados del petróleo. Por ejemplo, hidrocarburos de cadena larga, olefinas internas o terminales, alcanos, aldehídos grasos y ésteres grasos preparados según la presente divulgación pueden procesarse adicionalmente para producir combustibles, aditivos de combustible, aleaciones de combustible y/o productos químicos. Por consiguiente, se describen composiciones de biocrudo que comprenden derivados de ácidos grasos preparados según las presentes divulgaciones.

Las composiciones que comprenden derivados de ácidos grasos de la divulgación pueden utilizarse como materias primas en la fabricación de detergentes y tensioactivos, complementos nutricionales, polímeros, reemplazos de parafina, lubricantes, disolventes, productos para el cuidado personal, aditivos de procesamiento de caucho, inhibidores de corrosión, emulsionantes, plásticos, tejidos, cosméticos, productos de papel, recubrimientos, líquidos para la metalurgia, dieléctricos, engrasantes y/o emolientes. Por consiguiente, también se desvelan composiciones de materia prima que comprenden derivados de ácidos grasos preparados según las presentes divulgaciones.

Descripción de las figuras

La figura 1 (FIG. 1) es una tabla que identifica diversos genes que pueden sobreexpresarse o atenuarse para aumentar la producción de derivados de ácidos grasos. La tabla también identifica varios genes que pueden modularse para alterar la estructura del producto derivado de ácido graso. Algunos de los genes que se utilizan para alterar la estructura del derivado de ácido graso también aumentarán la producción de derivados de ácido graso.

La figura 2 (FIG. 2) es un diagrama que ilustra la ruta de la betaoxidación, incluyendo etapas catalizadas por las siguientes enzimas (1) acil-CoA sintasa (EC 6.2.1.-). (2) acil-CoA deshidrogenasa (EC 1.3.99.3), (3) enoil-CoA hidratasa (EC 4.2.1.17); (4) 3-hidroxibutiril-CoA epimerasa (EC 5.1.2.3) y (5) 3-cetoacil-CoA tiolasa (e C 2.3.1.16). Esta reacción final del ciclo de la p-oxidación, libera acetil-CoA y un ácido graso acil-CoA dos carbonos más corto, listos para pasar nuevamente por las reacciones de la p-oxidación.

La figura 3 (FIG. 3) es un diagrama que ilustra la ruta biosintética de la FAS (Fatty Acid Synthase, ácido graso sintasa).

La figura 4 (FIG. 4) es un diagrama que ilustra las rutas biosintéticas que producen ésteres grasos dependiendo de los sustratos proporcionados.

La figura 5 (FIG. 5) es un diagrama que ilustra las rutas biosintéticas que producen alcoholes grasos.

La figura 6 (FIG. 6) es un gráfico que representa la producción de alcohol graso por la cepa transformada conjuntamente con pCDFDuet-1-fadD-acr1 y plásmidos que contienen diversos genes de tioesterasa. Se identificaron ácidos grasos C10, C12, C14, C16 y C-^saturados.

La figura 7 (FIG. 7) es un gráfico que representa la producción de alcohol graso mediante la cepa descrita en el Ejemplo 3, transformado conjuntamente con pCDFDuet-1 -fadD-acrl y plásmidos que contienen diversos genes de tioesterasa. Las cepas se cultivaron en condiciones aerobias a 25 °C o a 37 °C en un medio mineral M9 que contenía glucosa al 0,4 % en matraces de agitación. Los alcoholes grasos se detectaron en los sedimentos celulares, así como en los sobrenadantes, lo que indica una producción extracelular sustancial de dichos alcoholes. El cultivo a 25 °C produjo la liberación de aproximadamente 25 % del producto de las células, mientras que el cultivo a 37 °C produjo la liberación de aproximadamente 50 % del producto de la célula.

Las figuras 8A-D (FIGs. 8A-D) son gráficos que representan espectros de GC-MS (Cromatografía de gases-Espectrometría de masas) de octanoato de octilo (C8C8) producido por un hospedador de producción que expresa alcohol acetil transferasa (AAT, EC 2.3.1.84) y hospedadores de producción que expresan éster sintasa (EC 2.3.1.20, 2.3.1.75). La FIG. 8A es un espectro de GC-MS que muestra un extracto de acetato de etilo de la cepa C41 (DE3,Afad£/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B) en donde el plásmido pHZ1.43 expresaba ADP1 éster sintasa (EC 2.3.1.20, 2.3.1.75). La FIG. 8 B es un espectro de GC-MS que muestra un extracto de acetato de etilo de la cepa C41 (DE3, AfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B) en donde el plásmido pHZ1.43 expresaba SAAT. La FIG. 8 C es un espectro de GC-MS que muestra un extracto de acetato de acetilo de la cepa C41 (DE3, AfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B) en donde el plásmido pHZ1.43 no contenía ADP1 (una éster sintasa) o SAAT. La FIG. 8 D es un espectro de GC-MS que muestra el espectro de masas y el patrón de fragmentación de C8C8 producido por la cepa C41 (DE3, AfadE1/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B en donde el plásmido pHZ1.43 expresó SAAT).

La Figura 9 (FIG. 9) es un gráfico que representa la distribución de ésteres etílicos elaborados (según el Ejemplo 9) cuando la éster sintasa de A. baylyi ADP1 (WSadpl) se expresó conjuntamente con una tioesterasa de Cuphea hookeriana en un hospedador de producción.

La Figura 10 (FIG. 10) es un gráfico que representa la producción de ésteres etílicos por diversas éster sintasas a 25 °C. Los ésteres etílicos se produjeron mediante cepas de E. coli recombinantes portadoras de diversos genes de éster sintasa. Las cepas recombinantes fueron (1) C41 (DE3, AfadEAfabR)/pETDuet-1-'TesA+pCDFDuet-1-fadD con 1 pHZ1.43; (2) pHZ1.97_377; (3) pHZ1.97_atfA2; (4) pHZ1.97_376; (5) pHZ1.97_atfA1; y (6) sin plásmidos (control).

La Figura 11 (FIG. 11) es un gráfico que representa la composición de acilo de los ésteres etílicos de ácidos grasos (FAEE, fatty acid ethyl esters) producidos a partir de diversas cepas de E. coli. Las cepas recombinantes son (1) C41 (DE3, AfadEAfabR)/pETDuet-1-'TesA pCDFDuet-1 -fadD con 1 pHZ1.43; (2) pHZ1.97_377; (3) pHZ1.97_atfA2; (4) pHZ1.97_376; (5) pHZ1.97_atfA1; y (6) sin plásmidos (control).

La Figura 12 (FIG. 12) es un gráfico que representa la producción de ésteres etílicos mediante diversas éster sintasas a 37 °C. Los ésteres etílicos se produjeron mediante cepas de E. coli recombinantes portadoras de diversos genes de éster sintasa. Las cepas recombinantes fueron (1) C41 (DE3, AfadEAfabR)/pETDuet-1-'TesA + pCDFDuet-1-fadD con 1 pHZ1.43; (2) pHZ1.97_377; (3) pHZ1.97_atfA2; (4) pHZ1.97_376; (5) pHZ1.97_atfA1; y (6) sin plásmidos (control).

La Figura 13 (FIG. 13) es un gráfico que muestra las concentraciones de ácidos grasos libres (FFA, free fatty acids) y ésteres etílicos de ácidos grasos (FAEE, fatty acid ethyl esters) producidos a partir de tres colonias individuales de los transformantes, C41 (DE3, AfadEAfabR)/ pETDuet-1-'TesA+pCD-FDuet-1-fadD pHZ1.97_atfA2. El FFA se transformó en éster etílico de ácido graso (FAEE) y se cuantificó mediante GC/MS. La Figura 14 (FIG. 14) es un diagrama que representa las regiones de control de FabA (SEC ID NO: 33) y FabB (SEC ID NO: 34). Los sitios de unión consenso de FadR y FabR se muestran en negrita. Las flechas verticales indican las posiciones donde pueden realizarse mutaciones para alterar la expresión de fabA. La base propuesta para cada posición también se indica entre paréntesis. Las dos regiones que constituyen las regiones -35 y -10 del promotor típico de E. coli, se indican entre paréntesis. También se muestran las mutaciones propuestas que acercan al promotor a la secuencia promotora consenso.

Las figuras 15A-B (FIGs. 15A-B) son cromatogramas que representan análisis de GC/MS. La FIG. 15A es un cromatograma que representa los componentes de un extracto de acetato de etilo del cultivo de la cepa LS9001 de E. coli transformada con plásmidos pCD-FDuet-1-fadD-WSadp1, pETDuet-1-'TesA. La FIG. 15B es un cromatograma que representa el hexadecanoato de etilo y el oleato de etilo, que se utilizaron como referencias. La Figura 16 (FIG. 16) es un mapa del plásmido pOP-80.

La Figura 17 (FIG. 17) es la secuencia de ADN completa del plásmido pOP-80 (SEC ID NO: 1)

La Figura 18 (FIG. 18 ) es la secuencia de ADN (s Ec ID n O: 2) del gen fadD35 (n° de registro NP_217021 de GenBank) de E. coli optimizada con codones.

La Figura 19 (FIG. 19) es la secuencia de ADN (SEC ID NO: 3) del gen fadDI (n° de registro NP_251989 de GenBank) de E. coli optimizada con codones.

La Figura 20 (FIG. 20) es el cebador BsyhfLBspHIF (SEQ ID NO: 4) basado en la secuencia de ADN depositada en el NCBI con el n° de registro NC_000964 de GenBank.

La Figura 21 (FIG. 21) es el cebador BsyhfLEcoR (SEQ ID NO: 5) basado en la secuencia de ADN depositada en el NCBI con el n° de registro NC_000964 de GenBank.

La Figura 22 (FIG. 22) es la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 6) del gen yhfL de Bacillus subtilis.

La Figura 23 (FIG. 23) es el cebador Scfaa3pPciF (SEQ ID NO: 7) basado en la secuencia de ADN depositada en el NCBI con el n° de registro NC_001141 de GenBank.

La Figura 24 (FIG. 24) es el cebador Scfaa3pPciI (SEQ ID NO: 8) basado en la secuencia de ADN depositada en el NCBI con el n° de registro NC_001141 de GenBank.

La Figura 25 (FIG. 25) es la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 9) del gen faa3 de Saccharomyces cerevisiae (n° de registro NP_012257 de GenBank).

La Figura 26 (FIG. 26) es el cebador Smprk59BspF (SEQ ID NO: 10) basado en la secuencia de ADN depositada en el NCBI con el n° de registro n Z_AAVz 01000044 de GenBank.

La Figura 27 (FIG. 27) es el cebador Smprk59HindR (SEQ ID NO: 11) basado en la secuencia de ADN depositada en el NCBI con el n° de registro n Z_AAVZ01000044 de GenBank.

La Figura 28 (FIG. 28) es el cebador PrkBsp (SEC ID NO: 12).

La Figura 29 (FIG. 29) es la secuencia de ADN que codifica la proteína ZP_01644857 de Stenotrophomonas maltophilia R551-3 (SEC ID NO: 13).

La Figura 30 (FIG. 30) es la secuencia de proteínas de ZP_01644857 de Stenotrophomonas maltophilia ATCC 17679 (SEC ID N°: 14).

La figura 31 (FIG. 31) Es un esquema de una nueva ruta para la producción de aldehído graso.

La figura 32 (FIG. 32) es un listado de la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 15) y de la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID NO: 16) del gen carde Nocardia sp. NRRL 5646.

La figura 33 (FIG. 33) es un listado de motivos de secuencia de aminoácidos de homólogos de CAR.

Las figuras 34A-B (FIGs. 34A-B) son trazados de GC/MS de olefinas producidas por células de Jeotgalicoccus sp.ATCC 8456 y células de Jeotgalicoccus halotolerans DSMZ 17274, respectivamente.

Las figuras 35A-B (FIGs. 35A-B) son trazados de GC/MS de olefinas producidas por células de Jeotgalicoccus pinnipedalis DSMZ 17030 y células de Jeotgalicoccus psychrophilus DSMZ 19085, respectivamente.

Las figuras 36A-B (FIGs. 36A-B) son patrones de fragmentación de espectrometría de masas de dos a-olefinas producidas por células de Jeotgalicoccus ATCC 8456. El compuesto A se identificó como 1-nonadeceno y el compuesto B como 18-metil-1-nonadeceno.

La figura 37 (FIG. 37) es un esquema de un análisis filogenético de ARNr 16s de Jeotgalicoccus ATCC 8456. Las figuras 38A-B (FIGs. 38A-B) son trazados de GC/MS de a-olefinas producidas por células de Jeotgalicoccus sp. ATCC 8456 después de suministrar ácido eicosanoico (FIG. 38A) o ácido esteárico (FIG.

38B).

La Figura 39 (FIG. 39) es un trazado de GC/MS de a-olefinas (1-heptadeceno) producidas por lisados acelulares de células de Jeotgalicoccus sp. ATCC 8456, en comparación con un trazado de lisado acelular sin el sustrato de ácidos grasos C18 y un trazado del propio sustrato de ácidos grasos C18.

La Figura 40 (FIG. 40) es una representación digital de un gel de SDS-PAGE de una fracción proteica de producción final de a-olefinas purificadas de células de Jeotgalicoccus sp. ATCC 8456.

Las figuras 41A-B (FIGs. 41A-B) son secuencias de nucleótidos (SEC ID NO: 25) y de aminoácidos (SEC ID NO: 26) de la orf880, respectivamente. La FIG. 41C es la secuencia parcial de ARNr 16s (SEQ ID NO: 27) de Jeotgalicoccus sp. ATCC8456.

La Figura 42 (FIG. 42) es un trazado de GC/MS de a-olefinas producidas por E. coli después de la expresión de 8456_orf880 de Jeotgalicoccus sp. y el suministro de ácido esteárico.

La Figura 43 (FIG. 43) es un esquema de un análisis de remuestreo (bootstrap) filogenético de homólogos de 8456_orf880 utilizando el programa ClustalW.

La figura 44 (FIG. 44) describe motivos de aminoácidos para identificar tioesterasas precursoras útiles en la presente divulgación.

Las figuras 45A-B (FIGs. 45A-B) incluyen tablas que enumeran los resultados de ensayos que identifican tioesterasas mutantes con propiedades alteradas. En particular, la FIG. 45A incluye listados de mutantes con puntuaciones Z con un valor de al menos 3 para la actividad (es decir, velocidad catalítica) con respecto al sustrato mencionado o especificidad para el sustrato mencionado; y la FIG. 45B es una tabla de mutantes que tienen un rendimiento/producción mejorado y/o aumentado de derivados de ácidos grasos con puntuaciones Z con un valor de al menos 3.

Las figuras 46A-E (FIGs. 46A-E) incluyen tablas que enumeran los resultados de ensayos que identifican tioesterasas mutantes con rendimiento proporcional alterado de ésteres grasos frente a otros productos (por ejemplo, derivados de ácidos grasos distintos de ésteres grasos). En particular, la FIG. 46A es una tabla que muestra mutantes que tienen puntuaciones Z con un valor de al menos 3 con respecto al rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos frente a ácidos grasos libres. La FIG. 46B es una tabla que muestra mutantes que tienen puntuaciones Z con un valor inferior a -3 con respecto al rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos frente a ácidos grasos libres. La FIG. 46C es una tabla que muestra mutantes que tienen puntuaciones Z con un valor de al menos 3 con respecto al rendimiento in vivo de derivados de ácidos grasos. La FIG. 46D es una tabla que muestra mutantes que tienen puntuaciones Z con un valor de al menos 3 con respecto al rendimiento proporcional de derivados de ácidos grasos de cadena corta (por ejemplo, C8, Cg, C10, C11, C12, C13 y/o C14) frente a otros derivados de ácidos grasos (por ejemplo, derivados de ácidos grasos distintos de derivados de ácidos grasos de cadena corta incluyendo, por ejemplo, derivados de ácidos grasos de cadena larga (por ejemplo, C15, C16, C17, C18, C1gy/o C20)). La FIG. 46E es una tabla que muestra mutantes que tienen puntuaciones Z con un valor inferior a -3 con respecto al rendimiento proporcional de derivados de ácidos grasos de cadena corta (por ejemplo, C8, Cg, C10, C11, C12, C13 y/o C14) frente a otros derivados de ácidos grasos (por ejemplo, derivados de ácidos grasos distintos de derivados de ácidos grasos de cadena corta incluyendo, por ejemplo, derivados de ácidos grasos de cadena larga (por ejemplo, C15, C16, C17, C18, C1gy/o C20)).

La Figura 47 (FIG. 47) es un alineamiento de secuencias de homólogos de 'TesA utilizando, como secuencia de referencia con fines de numeración, los restos de aminoácidos de una 'TesA de E. coli (es decir, una TesA sin el péptido señal).

La Figura 48 (FIG. 48) es un gráfico que representa los títulos y la composición de FAME para la cepa MG1655 (AfadE) pTrc-'TesA_fadD.

La Figura 49 (FIG. 49) es un gráfico que representa los títulos y la composición de FAME para las cepas MG1655 (AfadE) y C41(AfadE) que expresan fadD y 'tesAen plásmidos durante un ciclo de fermentación de 25 horas.

La Figura 50 (FIG. 50) es un gráfico que representa los títulos y la composición de FAME para la cepa MG1655 (AfadE) pTrc-'TesA_fadD.

La Figura 51 (FIG. 51) es un gráfico que representa los títulos y la composición de FAME para las cepas MG1655 (AfadE) y C41 (AfadE) que expresan fadD y 'tesA en plásmidos durante un ciclo de fermentación de 25 horas.

La Figura 52 (FIG. 52) es un gráfico que representa los títulos y la composición de FFA para las cepas MG1655 (AfadE) y C41 (AfadE) que expresan fadD y 'tesA en plásmidos durante un ciclo de fermentación de 25 horas. La Figura 53 (FIG. 53) es un gráfico que muestra los títulos de FAME para las cepas MG1655 (AfadE) que exp resa n 'tesA de E. coli 'tesA de P. luminescens, 'tesA de V. harveyi y tesB de P. profundum en p lásm idos, d u ra n te un c ic lo de fe rm e n ta c ió n de 24 horas. Los títu lo s se rep re se n ta n en m g/l y m g/l/D O .

La Figura 54 (FIG. 54) es un g rá fico de títu lo s de F F A pa ra las ce p a s M G 1655 (AfadE) que e xp re sa n 'te sA de E. coli, 'tesA de P. luminescens, 'te sA de V. harveyi y te sB de P. profundum en p lásm idos , d u ran te un c ic lo de fe rm e n ta c ió n de 24 horas. Los títu lo s se rep re se n ta n en m g/l (b a rra s ) y m g /l/D O (trián gu los).

La Figura 55 (FIG. 55) com p ara las reg io nes de se cu e n c ia re leva n tes de las t io e s te ra sa s na tu ra les que com p re n d e n res tos en p o s ic io ne s que co rre spo nde n a m u ta c io n e s en 'T e sA que in tro du cen p ro p ieda de s a lte rad as . El resto re leva n te se resa lta en co lo r oscu ro y se a line a con res tos co rre sp o n d ie n te s en las tio e s te ra s a s na tu ra les .

La Figura 56 (FIG. 56) es un lis tado de nú m ero s de reg is tro de G e n B a n k de ho m ó lo g o s de 'TesA .

Las Figuras 57A-C (FIG. 57A-C) son g rá fico s que rep rese n tan e sp ec ific ida d de sus tra to (p u n tu a c ió n Z ) fre n te a p o s ic io n e s de res tos de a m in o á c id o s c o rre sp o n d ie n te s a la se cu e n c ia de 'T e sA de la S E C ID NO: 31 con s ím b o lo s que rep rese n tan n ive les de co n se rva c ió n en el a lin e a m ie n to con s70 para e sp e c ific id a d de C 10 (FIG.

57A), e sp e c ific id a d de C 12 (FIG. 57B) y e sp e c ific id a d de C 14 (FIG. 57C).

La Figura 58 (FIG. 58) m ue s tra la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de una 'T e s A de E. coli (S E C ID NO: 31).

La Figura 59 (FIG. 59) m ue s tra una se cu e n c ia de nu c le ó tid o s que cod ifica una 'T e s A de E. coli (S E C ID NO: 32). La Figura 60 (FIG. 60) es un g rá fico de títu lo s de ác ido g ra so lib re (F F A ) y de é s te r m e tílico de ác ido graso (F A M E ) en cu ltivo s de cé lu la s de E. coli M G 1655 AfadE tra n s fo rm a d a s con pA C Y C que con tien en los h o m ó logo s de 'tesA de E. coli (E co lA ), Pectobacterium atrosepticum (P a trA ), Pseudomonas putida (P pu tA ), Vibrio harveyi (V ha rA ), Photorhabdus luminescens (P lum A ), o con pA C Y C que no co n tie n e in se rto (N eg).

La Figura 61 (FIG. 61) es un g rá fico de títu lo s de F F A y FA M E en cu ltivo s de cé lu la s de E. coli M G 1655 AfadE que sob re e xp re sa n fadD y 'tesA de E. coli (E co li), Pectobacterium atrosepticum (P atr), Photorhabdus luminescens (P lum ), Photobacterium profundum (P pro ), Vibrio harveyi (V hA ), Pseudomonas putida (P pu t), o sin 'tesA (N eg). (Los da tos m arca do s con un a s te risco (*) son de un e xp e rim e n to d is tin to ).

La Figura 62 (FIG. 62) es un g rá fico de títu lo s de F F A y F A M E en cu ltivo s de E. coli M G 1655 AfadE que exp resa n 'tesA de E. co li de t ip o s ilve s tre (TS), el m u tan te S 10 C (S 10C ), o sin 'tesA (N eg).

La Figura 63 (FIG. 63) es un g rá fico de p ro du cc ión de FA M E fre n te al t ie m p o de un c ic lo de fe rm e n ta c ió n con cé lu la s h o sp e d a d o ra s re co m b in a n te s que exp re sa n tio e s te ra s a en au se n c ia de é s te r s in ta sa exógena .

La Figura 64 (FIG. 64) es un g rá fico de p ro du cc ión de F FA fren te al t ie m p o de un c ic lo de fe rm e n ta c ió n con cé lu la s h o sp e d a d o ra s re co m b in a n te s que exp re sa n t io e s te ra sa en au se n c ia de é s te r s in ta sa exógena .

Descripción detallada de la invención

S a lvo que se de finan de otra m anera , to d o s los té rm in o s té cn ico s y c ie n tíficos u tilizados en el p resen te d o cum e n to tie n e n el m ism o s ig n ifica d o que el que e n tie n d e co m ú n m e n te un exp e rto h a b itu a l en la m a te ria a la cua l p e rte ne ce la p re sen te invenc ión . A u n q u e en la p rá c tica o e n sayo de la p re sen te invenc ión , pu ed en u tiliza rse m é to d o s y m a te ria le s s im ila re s o e q u iva le n te s a los d e sc rito s en el p re sen te do cu m e n to , a con tinu ac ió n se de sc rib en m é to d o s y m a te ria le s ad ecu ad os . En caso de con flic to , la p re sen te m e m o ria de scrip tiva , in c lu ye n d o las d e fin ic ion es , p re va lece rá . A d e m á s , los m a te ria les , m é to d o s y e je m p lo s son so la m e n te ilu s tra tivo s y no p re te nd en s e r lim itan tes.

O tra s ca ra c te rís tic a s y v e n ta ja s de la in ve n c ió n se rán obv ias a p a rtir de la s ig u ie n te d e sc rip c ió n de ta lla d a y a pa rtir de las re iv ind ica c ion es .

Definiciones:

A lo la rgo de la m em o ria d e sc rip tiva , se pu ede h a ce r una re fe re n c ia u tiliza n d o una a b re v ia tu ra de un no m bre de gen o un no m bre de po lip ép tido , pero se en tie n d e que d icho nom bre a b re v ia d o de gen o p o lip é p tid o re p re se n ta el géne ro de ge ne s o po lip ép tido s , re sp e c tiva m e n te . D ichos nom bres de genes in c luyen to d o s los genes que cod ifica n el m ism o p o lip é p tid o y p o lip é p tid o s ho m ó lo g o s que tie n e n la m ism a fun c ión fis io lóg ica . Los no m bre s de los po lip ép tido s in c luye n to d o s los p o lip é p tid o s que tie n e n la m ism a a c tiv id a d (p o r e jem p lo , que ca ta liza n la m ism a re a cc ió n q u ím ica fu n dam e n ta l).

A m en os que se in d iq ue o tra cosa , los nú m ero s de reg is tro a los que se hace re fe re n c ia en el p re sen te docum e n to , p roceden de la base de d a to s de l N C BI (National Center for Biotechnology Information, C e n tro N a c ion a l de In fo rm a c ión B io te cn o ló g ica ) m a n te n id a po r el Ins titu to N a c ion a l de S a lud , EE. UU. A m enos que se in d iq ue otra cosa, los nú m ero s de reg is tro son los que figu ran en la base de da tos a m arzo de 2008.

Los n ú m e ro s EC (Enzyme Commission, C o m is ió n de E n z im a s ) son los e s ta b le c id o s p o r el C o m ité de N o m e n c la tu ra de la U n ión In te rn ac io na l de B io q u ím ica y B io lo g ía M o le cu la r (N C -IU B M B ) (d isp o n ib le en h ttp ://w w w .c h e m .q m u l/a c /u k /iu b m b /e n z y m e /). Los núm eros EC a los que se hace re fe re nc ia en el p re sen te do cum e n to , p roceden de la base de da tos de ligan do s de la K E G G , m a n te n id a po r la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (E n c ic lo p e d ia de G enes y G e n o m a s de K io to ), p a tro c in ada en pa rte po r la U n ive rs ida d de Tokio . A m en os que se in d iq ue o tra cosa, los nú m e ro s de C E son los que figu ran en la base de da tos a m arzo de 2008.

En el p re se n te do cu m e n to , los a rtícu lo s "un", "u n o " y "u na ", se u tilizan pa ra re fe rirse a un o (a ) o a m ás de un o (a ) (es decir, a al m en os uno(a )) de l ob je to g ra m a tica l de l artícu lo . C o m o e jem p lo , "un e le m e n to " s ig n ifica un e lem e n to o más de un elemento.

En el presente documento, el término "aproximadamente" significa un valor de ± 20 % de un valor numérico dado.

Por lo tanto, "aproximadamente 60 %" se refiere a un valor de 60 ± (20 % de 60) (es decir, entre 48 y 70).

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "alcohol deshidrogenasa" (EC 1.1.1. *) es un polipéptido

capaz de catalizar la conversión de un aldehído graso en un alcohol (por ejemplo, un alcohol graso). Adicionalmente,

un experto habitual en la materia apreciará que algunas alcohol deshidrogenasas también catalizarán otras

reacciones. Por ejemplo, algunas alcohol deshidrogenasas aceptarán otros sustratos además de los aldehídos

grasos. Por lo tanto, dichas alcohol deshidrogenasas inespecíficas, también se incluyen en esta definición. En la

técnica se conocen secuencias de polinucleótidos que codifican alcohol deshidrogenasas, y dichas deshidrogenasas

están disponibles al público.

La expresión "propiedad alterada" se refiere a una modificación en una o más propiedades de un polinucleótido

mutante o proteína mutante con referencia a un polinucleótido precursor o a una proteína precursora.

Ventajosamente, las propiedades que pueden alterarse con respecto a las proteínas fabricadas según la presente

divulgación, incluyen estabilidad oxidativa, especificidad de sustrato, selectividad de sustrato, actividad catalítica,

estabilidad térmica, estabilidad del pH, perfil de actividad del pH, resistencia a la degradación proteolítica, K^m, k^{c a t},

relación entre k^{ca t}/k^m, plegamiento de proteína, inducción de una respuesta inmunitaria, capacidad de unirse a un

ligando, capacidad de unirse a un receptor, capacidad de secretarse, capacidad de translocarse de una manera

activa en una membrana, capacidad para mostrase en la superficie de una célula, capacidad de oligomerizar,

capacidad de señalizar, capacidad de estimular la proliferación celular, capacidad de inhibir la proliferación celular,

capacidad de inducir la apoptosis, capacidad de modificarse por fosforilación o glicosilación, capacidad para tratar

enfermedades. En un aspecto, se proporcionan tioesterasas mutantes que proceden de una tioesterasa precursora,

en donde la tioesterasa mutante tiene al menos una propiedad alterada ya sea in vitro o in vivo, en comparación con

las propiedades de la tioesterasa precursora. En un aspecto, la propiedad alterada puede ser una propiedad

biofísica, tal como estabilidad térmica (punto de fusión T^m), estabilidad del solvente, estabilidad del soluto,

estabilidad oxidativa, lipofilia, hidrofilia, estructura cuaternaria, momento dipolar, o punto isoeléctrico. En un aspecto,

la propiedad alterada puede ser una propiedad bioquímica tal como pH óptimo, temperatura óptima, fuerza iónica

óptima y/o un parámetro catalítico enzimático (tal como, por ejemplo, distribución del producto, rendimiento

proporcional o porcentual del producto, actividad específica, preferencia de sustrato, afinidad de sustrato, inhibición

de sustrato, afinidad por el producto, velocidad de recambio, inhibición del producto, mecanismo cinético, K^m, k^{c a t},

k^cat/K^my/o V^{m é x}). En un aspecto, la propiedad alterada es un cambio de preferencia para sustratos particulares, como

se refleja, por ejemplo, en un cambio de preferencia para la alcohólisis o la hidrólisis, sustratos de acil CoA o acil

proteína transportadora de acilo, sustratos de éster o tioéster, sustratos saturados o insaturados, posición de

insaturaciones, especificidad amplia o estrecha (por ejemplo, la capacidad de catalizar una variedad de sustratos o

solo sustratos de una longitud cadena de carbono específica). En un aspecto, la propiedad alterada puede ser un

aumento de preferencia o actividad para sustratos ramificados, sustratos que tienen una posición de ramificación

específica, sustratos de hidroxiacilo, sustratos de cetoacilo, sustratos que dan como resultado un producto que tiene

atributos de combustible deseables (es decir, número de cetano, índice de octano, estabilidad oxidativa, lubricidad,

punto de ignición, viscosidad, punto de ebullición, punto de fusión, punto de fluidez, punto de enturbamiento, punto

de obstrucción del filtro en frío, características de flujo en frío, aromaticidad, y/o número de yodo). Las propiedades

alteradas también incluyen una disminución en la actividad o atenuación de la hidrólisis del éster, tal como la

hidrólisis de las moléculas del producto deseado, o una disminución en la toxicidad de la proteína para la célula y/o

un cambio en el nivel de expresión de la proteína en la célula. En un aspecto particular, la al menos una propiedad

alterada es, por ejemplo, un cambio en la capacidad de la tioesterasa para catalizar directa o indirectamente la

síntesis de acil ésteres grasos, in vivo o in vitro, tal como mediante transesterificación.

Tal como se usa en el presente documento, una "secuencia análoga" es una en la que la función del gen es

esencialmente la misma que la de un gen de referencia, tal como, por ejemplo, un gen 'tesA de E. coli.

Adicionalmente, los genes análogos incluyen al menos aproximadamente 20 %, por ejemplo, al menos

aproximadamente 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 % 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de un gen o

polinucleótido de referencia tal como, por ejemplo, la secuencia de polinucleótidos o de polipéptidos de un gen 'tesA

o de una tioesterasa 'TesA, respectivamente. En aspectos adicionales, a la secuencia se la aplica más de una de las

propiedades anteriores. Las secuencias análogas se determinan mediante métodos de alineamiento de secuencias

conocidos.

El término "alineamiento" se refiere a un método para comparar dos o más secuencias de polinucleótidos o de

polipéptidos con el fin de determinar su relación entre sí. Normalmente, los alineamientos se realizan mediante

programas informáticos que aplican diversos algoritmos, sin embargo, también es posible realizar un alineamiento

manualmente. Normalmente, los programas de alineamiento se repiten a través de posibles alineamientos de

secuencias y puntúan los alineamientos utilizando tablas de sustitución, empleando una variedad de estrategias para

alcanzar una posible puntuación de alineamiento óptimo. Como algoritmos de alineamiento habitualmente utilizados

se incluyen, pero sin limitación, CLUSTALW, (véase, Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J., CLUSTAL W:

improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific

gap pe na lties and w e ig h t m a trix cho ice , N u c le ic A c id s R esea rch 22 :4673 -4680 , 1994); C L U S T A LV , (véase , Larkin M .A ., e t al., C L U S T A LW 2, C lu s ta lW y C lu s ta lX ve rs ió n 2, B io in fo rm a tics 23 (21 ): 2947 -2948 , 2007 ); Jo tu n -H e in , M usc le e t al., M U S C LE : a m u ltip le seq ue nce a lig n m e n t m e thod w ith reduced tim e and space com p le x ity , BM C B io in fo rm a tics 5: 113, 2004 ); M afft, K a lign , P rob C o ns, y T -C o ffe e (véa se N o tre d a m e e t al., T -C o ffe e : A no ve l m ethod fo r m u ltip le seq ue nce a lign m en ts , Jo u rn a l o f M o le cu la r B io lo gy 302: 205 -217 , 2000). Los p ro g ra m as e je m p la re s que im p le m e n ta n uno o m ás de los a lgo ritm o s a n te rio res inc luyen , pero sin lim itac ión , M egA lign de D N A S ta r (D N A S ta r, Inc. 3801 R e g e n t St. M ad ison , W I 53705), M U S C LE , T -C o ffee , C L U S T A LX , C L U S T A LV , Ja lV iew , P hylip , y D iscove ry S tud io de A cce lrys (A cce lrys , Inc., 10188 T e le s is Ct, S u ite 100, S an D iego , C A 92121). En un e jem p lo no lim itan te , se u tiliza M eg A lig n para im p le m e n ta r el a lg o ritm o de a lin e a m ie n to C L U S T A L W con los s ig u ie n te s pa rám e tros: p e n a liza c ió n po r hu eco 10, p e n a liza c ió n po r lo ng itud de hu eco 0,20, re ta rd o de s e cu e n c ia s d ive rg e n te s (30 % ), peso de tra n s ic ió n de A D N 0,50, peso de p ro te ína de la m a triz de la se rie G onne t, peso de A D N de la m a triz IUB.

El té rm in o "a n ticu e rp o s " se re fie re a in m un og lob u linas . Los an ticu e rp o s inc luyen , pero sin lim itac ión , in m u n o g lo b u lin a s o b te n id a s d ire c ta m e n te de cu a lq u ie r esp ec ie de la cua l es d e se a b le p ro d u c ir an ticue rpos . A dem ás, en la p re sen te d ivu lg a c ió n se in c luye n an ticu e rp o s m od ifica dos . El té rm in o ta m b ié n se re fie re a fra g m e n to s de a n ticu e rp o s que con se rva n la ca p ac idad de un irse al m ism o e p íto po al que ta m b ié n se une el an ticu e rp o in tac to , e in c luye a n ticu e rp o s po lic lon a le s , a n ticu e rp o s m on o c lo n a le s , a n ticu e rp o s q u im é ricos , a n ticu e rp o s a n tiid io típ ico s (a n ti ID). Los fra g m e n to s de an ticu e rp o s inc luyen , pero sin lim itac ión , reg io nes d e te rm in a n te s de la co m p le m e n ta rie d a d (C D R , del ing lés complementarity-determining regions), reg io nes va r ia b le s de fra g m e n to s m o n o ca te n a rio s (scFv, single chain Fv), reg iones v a ria b le s de cadena pesada (VH ), reg iones v a ria b le s de cadena lige ra (VL). En la p re se n te d ivu lg a c ió n ta m b ié n se in c luye n a n ticu e rp o s p o lic lo n a le s y m on oc lona le s . P re fe re n te m e n te , los an ticu e rp o s son a n ticu e rp o s m on oc lona le s .

El té rm in o "a te n u a r" s ig n ifica de b ilita r, re d u c ir o d ism inu ir. En un e jem p lo , la s e n s ib ilid a d de una e n z im a p a rticu la r a la in h ib ic ión po r re tro a lim e n ta c ió n o in h ib ic ión ca u sa d a po r una co m p o s ic ió n que no es un p ro du c to o un reactivo (re tro a lim e n ta c ió n no e s p e c ífic a de la ru ta ) se red uce de ta l m an e ra que la a c tiv id a d de la e n z im a no se ve a fe c ta d a po r la p re sen c ia de un com p ue s to . En un e je m p lo pa rticu la r, la e xp res ión de l gen fabH es se n s ib le a la te m p e ra tu ra y su secu en c ia puede a lte ra rse para d ism in u ir la sen s ib ilidad a las flu c tu a c io n e s de la te m p e ra tu ra . A d e m á s , la e xp res ión de l gen fabH puede a te n u a rse cua nd o se desea o b te n e r a m in o á c id o s ram ificado s . En o tro e jem p lo , una e n z im a que se ha m od ifica do para que sea m en os activa , puede d e c irse que está a tenuada . P ara a te n u a r la e xp res ión de una en z im a puede u tiliza rse una m o d ifica c ió n fu n c io n a l de la secu en c ia que co d ifica una enz im a . Las m o d ifica c io n e s de se cu e n c ia s pueden inc lu ir, po r e jem p lo , una m u tac ión , de lec ión , o in se rc ión de uno o m ás nu c le ó tid o s en una secu en c ia de genes o una secu en c ia que con tro la la tra n sc rip c ió n o la tra d u cc ió n de una se cu e n c ia de genes, cuya m o d ifica c ió n da com o re su lta d o una reducc ión o in h ib ic ión de la p ro du cc ión de l p roducto gén ico , o hace que el p ro du c to g é n ico no sea fun c ion a l. P o r e jem p lo , la sup res ión fu n c io n a l de fabR en E. coli reduce la rep res ión de la ruta b ios in té tica de ác idos g rasos y pe rm ite a E. coli p ro d u c ir m ás ác idos g rasos in sa tu ra d o s (U FA , de l ing lés unsaturated fatty acids). En a lgu nos casos, una de le c ión fu n c io n a l se de sc rib e com o una m u tac ión po r in ac tiva c ión (knock-out). P ara a te n u a r la e xp res ión de una e n z im a se d ispone de o tros m étodos. P o r e jem p lo , la a te nua c ió n puede rea liza rse m od ifica n d o la secu en c ia que cod ifica el gen com o el descrito a n te rio rm e n te ; c o lo c a n d o el gen ba jo el c o n tro l de un p ro m o to r m en os activo , e x p re s a n d o los A R N in te rfe ren te s , las riboz im as, o las s e cu e n c ia s a n tise n tid o que se d irigen al gen de in te rés; ca m b ia n d o el en to rno fís ico o qu ím ico , ta l com o la tem p e ra tu ra , el pH, o la co n ce n tra c ió n de so lu to , de ta l m an era que la ac tiv idad óp tim a del gen o del p ro du c to gén ico no se rea lice ; o a tra vé s de cu a lq u ie r o tra té cn ica c o n o c id a en la m ateria .

El té rm in o "b io c ru d o " se re fie re a un b io co m b u s tib le que puede u tiliza rse com o su s titu to de co m b u s tib le s ba sad os en pe tró leo . A de m ás , el b iocrudo , com o el pe tró leo crudo , puede tra n s fo rm a rs e en o tros com b us tib les , po r e jem p lo , gaso lina , d iése l, com b u s tib le de av iac ió n o ga so il para ca le facc ión . A d e m á s , el b iocrudo , com o el pe tró leo crudo, puede tra n s fo rm a rs e en o tros p ro du c to s qu ím icos de u tilidad in du s tria l para su uso, po r e jem p lo , en p roductos fa rm a cé u tico s , cosm é ticos , b ienes de con sum o , p ro ceso s in du s tria le s , etc. Una com p o s ic ió n de b ioc ru do puede co m p re n d e r, po r e jem p lo , h id ro ca rb u ro s , p ro d u c to s de h id ro ca rbu ro , és te re s de ác ido s g ra sos y /o ce to n a s a lifá ticas , o una com b in ac ió n de los m ism os. En un a sp e c to p re fe rido , una com p o s ic ió n de b ioc ru do es tá co m p u e s ta por h id ro ca rbu ros , po r e jem p lo , h id ro ca rb u ro s a lifá tico s (p o r e jem p lo , a lcanos, a lqu eno s , a lq u in o s ) o a ro m ático s .

El té rm in o "b io d ié se l" se re fie re a un t ip o p a rticu la r de b io co m b u s tib le que puede u tiliza rse en m o to re s d iése l. El b io d ié se l puede s e r un su s titu to de l d iése l tra d ic io n a l, que n o rm a lm e n te p rocede de l pe tró leo . El b iod iése l puede u tiliza rse en m o to re s d iése l de co m b u s tió n in te rna en fo rm a pura, que se co n o ce com o b iod iese l "n o d ilu ido ", o com o una m ezc la en cu a lq u ie r co n ce n tra c ió n con un d iése l basado en pe tró leo . Una com p o s ic ió n de b iod iése l tam b ién puede c o m p re n d e r d ive rso s ad itivo s ad ecu ad os . El b iod iese l pued e e s ta r co m p u e s to po r h id ro ca rb u ro s o éste res. En un aspec to , el b iod iese l es tá c o m p u e s to po r és te res g rasos , ta le s com o los és te re s m e tílico s de ác ido s grasos (F A M E ) o los és te res e tílico s de ác ido s g ra sos (F A E E ). En un asp ec to p re fe rido , es to s F A M E y F A E E están co m p u e s to s po r g ru po s de ac ilo g ra so que tie n e n una lo ng itud de ca d e n a de ca rb o n o de a p ro x im a d a m e n te 8-20, 10 18 o 12-16. Los és te res g ra sos u tilizad os com o b iod iese l pueden co n te n e r cad en as de ca rbono rectas, ram ificadas, sa tu ra d a s o insa tu radas .

El té rm in o "b io co m b u s tib le " se re fie re a cu a lq u ie r co m b u s tib le p ro ced en te de b iom asa . La b iom asa es un m a te ria l b io ló g ico que puede tra n s fo rm a rs e en b ioco m bus tib le . Una fu e n te e je m p la r de b iom asa es la m a te ria veg e ta l. P o r ejemplo, como biomasa, puede utilizarse maíz, caña de azúcar y césped de pradera. Otro ejemplo no limitativo de biomasa es la materia animal, por ejemplo, estiércol de vaca. La biomasa también incluye productos de desecho de la industria, agricultura, silvicultura, y domésticos. Como ejemplos de dichos productos de desecho se incluyen, sin limitación, desechos de fermentación, paja, madera, aguas residuales, basura y restos de comida y glicerol. La biomasa también incluye fuentes de carbono, tales como hidratos de carbono (por ejemplo, azúcares). Los biocombustibles pueden sustituirse por combustibles basados en petróleo. Por ejemplo, los biocombustibles incluyen combustibles para el transporte (por ejemplo, gasolina, diésel, combustible de aviación, etc.), combustibles de calefacción, y combustibles generadores de electricidad. Un biocombustible es una fuente de energía renovable. Como ejemplos no limitativos de biocombustibles se incluyen biodiesel, hidrocarburos (por ejemplo, alcanos, alquenos, alquinos, o hidrocarburos aromáticos), y alcoholes procedentes de biomasa.

En el presente documento, la expresión "longitud de la cadena de carbono" se define como el número de átomos de carbono en una cadena de carbono de un sustrato de tioesterasa o de un derivado de ácido graso. La longitud de la cadena de carbono de una molécula particular se indica como Cx, en la que el subíndice "x" se refiere al número de carbonos en la cadena de carbono. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "cadena larga" se refiere a aquellas moléculas que tienen una cadena de carbono con una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 carbonos (por ejemplo, C¹⁵, C¹⁶, C¹⁷, C¹⁸, C¹⁹o C²⁰). La expresión "cadena corta" se refiere a aquellas moléculas que tienen una cadena de carbono con una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 14 carbonos (por ejemplo, C8, C⁹, C¹⁰, C¹¹o C¹²).

La expresión "fuente de carbono" significa un sustrato o compuesto que es adecuado para utilizar como una fuente de carbono para el crecimiento de células procariotas o eucariotas simples. Las fuentes de carbono pueden estar en diversas formas, incluyendo, pero sin limitación, polímeros, hidratos de carbono, ácidos, alcoholes, aldehídos, cetonas, aminoácidos, péptidos, gases (por ejemplo, CO y CO²), y formas similares. Estas incluyen, por ejemplo, diversos monosacáridos tales como glucosa, fructosa, manosa y galactosa; oligosacáridos tales como fructooligosacáridos y galactooligosacáridos; polisacáridos tales como xilosa y arabinosa; disacáridos tales como sacarosa, maltosa y turanosa; material celulósico tal como metilcelulosa y carboximetilcelulosa sódica; ésteres de ácidos grasos saturados o insaturados tales como succinato, lactato y acetato; alcoholes tales como metanol, etc., o mezclas de los mismos. La fuente de carbono también puede ser un producto de la fotosíntesis, incluyendo, pero sin limitación, la glucosa. El glicerol también puede ser una fuente de carbono eficaz. A partir de cualquier cantidad de fuentes naturales y renovables pueden generarse fuentes de carbono adecuadas, incluyendo particularmente biomasa procedente de residuos agrícolas, urbanos e industriales, siempre que el material pueda utilizarse como un componente de una fermentación para proporcionar una fuente de carbono. Las fuentes de biomasa incluyen rastrojos de maíz, caña de azúcar, césped de pradera, materia animal, o materiales residuales.

La expresión "integración cromosómica" significa el proceso mediante el cual se introduce una secuencia entrante en el cromosoma de una célula hospedadora. Las regiones homólogas del ADN transformante se alinean con las regiones homólogas del cromosoma. Después, la secuencia que está entre las cajas de homología, puede reemplazarse por la secuencia entrante en un doble cruce (es decir, por recombinación homóloga). En algunos aspectos, las secciones homólogas de un segmento cromosómico inactivador de una construcción de ADN se alinean con las regiones homólogas flanqueantes de la región cromosómica autóctona del cromosoma microbiano. Posteriormente, la construcción de ADN elimina la región cromosómica autóctona en un doble cruce.

La expresión "punto de enturbamiento" se refiere a la temperatura de un líquido a la cual los sólidos disueltos ya no son completamente solubles, precipitando como una segunda fase y dando al líquido un aspecto turbio. Esta expresión es relevante para diversas aplicaciones con consecuencias algo o completamente diferentes. En la industria petrolera, el punto de enturbamiento se refiere a la temperatura por debajo de la cual la cera u otros hidrocarburos pesados cristalizan en un petróleo crudo, aceite o combustible refinado, para formar un aspecto turbio. La presencia de cera solidificada influye en el comportamiento de flujo del fluido, aumentando la tendencia a obstruir los filtros de combustible / inyectores y otras piezas de la maquinaria, causando la acumulación de cera en superficies frías (por ejemplo, en superficies de tuberías o termocambiadores) y cambiando incluso las características de emulsión con agua. El punto de enturbamiento es un signo de la tendencia que tiene el aceite a obstruir los filtros o los pequeños orificios a bajas temperaturas de funcionamiento. El punto de enturbamiento de un tensioactivo no iónico o solución de glicol es la temperatura a la cual la mezcla comienza a separarse en dos o más fases, volviéndose así turbia. Este comportamiento es característico de los tensioactivos no iónicos que contienen cadenas de polioxietileno, que puede mostrar un comportamiento de solubilidad inversa frente a la temperatura en agua y, por lo tanto, pueden "enturbiarse" en algún momento a medida que aumenta la temperatura. Los glicoles que demuestran este comportamiento se conocen como "glicoles de punto de enturbamiento" y se utilizan como inhibidores de esquisto. Normalmente, la salinidad también influye en el punto de enturbamiento, siendo generalmente más bajo en líquidos más salinos.

La expresión "aditivo que reduce el punto de enturbamiento" se refiere a un aditivo que puede añadirse a una composición para disminuir o reducir el punto de enturbamiento de la composición, como se ha descrito anteriormente.

La expresión "condiciones que permiten la producción del producto", se refiere a cualquier condición de fermentación que pe rm ita a un h o sp e d a d o r de p ro d u cc ió n p ro d u c ir un p ro d u c to de sea do , ta l com o a c il-C o A o d e riva d o s de ác ido s g rasos , in c luye nd o , po r e jem p lo , ác ido s g rasos, h id ro ca rbu ros , a lcoh o le s g rasos, ceras o és te res g rasos. Las co n d ic io n e s de fe rm e n ta c ió n g e n e ra lm e n te com p ren den m uch os pa rám e tro s . C om o con d ic io n e s e je m p la re s se inc luyen , pero sin lim itac ión , in te rva los de tem p e ra tu ra , n ive les de ox ige nac ión , in te rva los de pH y co m p o s ic ió n de los m ed io s (p o r e jem p lo , d iso lve n te s y so lu tos). C ada una de es ta s con d ic ion es , de m an e ra in d iv idu a l y en co m b in ac ió n , pe rm ite c re ce r al h o sp e d a d o r de p ro du cc ión . C o m o m ed io s e jem p la re s se inc luyen ca ldo s o ge les. En gene ra l, un m ed io a d e cu a d o in c luye una fu e n te de ca rbono , ta l com o g lucosa , fruc tosa , ce lu losa , o fu e n te s s im ila res, que puede m e ta b o liz a r d ire c ta m e n te el m ic ro o rga n ism o . A de m ás , en el m ed io , pueden u tiliza rse e n z im a s para fa c il ita r la m o v iliza c ió n (p o r e jem p lo , la d e s p o lim e riz a c ió n de l a lm id ó n o de la ce lu lo sa a a zú ca re s fe rm e n ta b le s ) y el m e ta b o lism o p o s te r io r de la fu e n te de ca rb on o . P a ra d e te rm in a r si las co n d ic io n e s de c u ltivo son a d e c u a d a s pa ra la p ro du cc ión de l producto , el h o sp e d a d o r de p ro du cc ión puede cu ltiva rse d u ran te a p ro x im a d a m e n te 4, 8, 12, 24, 36, 48 o 72 horas. D u ra n te el cu ltivo o d e sp u é s de l m ism o, las m u e s tra s pueden o b te n e rse y a n a liza rse para d e te rm in a r si las co n d ic io n e s de cu ltivo pe rm iten la p ro du cc ión de l p roducto . P o r e jem p lo , los h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión en la m u e s tra o en el m ed io en do n d e se cu ltiva ro n los h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión , pu ed en e xa m in a rse pa ra d e te rm in a r la p re sen c ia del p ro du c to deseado . C u an do se exa m in a la p re sen c ia de un producto , pueden u tiliza rse ensayos, ta le s com o, pero sin lim itac ión , T LC , H P LC , G C /F ID , G C /M S , LC /M S , M S, a s í com o los p ro p o rc io n a d o s en los e je m p lo s de este docum e n to .

Las e xp res ione s "se cu e n c ia co n se n so " o "se cu e n c ia can ón ica " se re fie ren a una se cu e n c ia de a m ino ác id os a rq u e típ ica fre n te a la que se com p ara n to d a s las v a ria n te s de una p ro te ína o secu en c ia de in te rés pa rticu la r. C u a lq u ie ra de las dos e xp res ione s ta m b ié n se re fie re a una se cu e n c ia que expone los nu c le ó tido s que están p re sen te s con m a yo r fre cu e n c ia en una se cu e n c ia de p o lin u c le ó tid o s de in te rés. P a ra cad a po s ic ión de una p ro te ína , la secu en c ia con sen so p ro p o rc io n a el am in o á c id o que es m ás a b u n da n te en esa pos ic ión en el a lin e a m ie n to de secu en c ias .

T a l com o se usa en el p resen te do cu m e n to , la e x p re s ió n "m u ta c ió n co n se n so " se re fie re a una d ife ren c ia en la s e cu e n c ia de un gen de pa rtida y una se cu e n c ia co n sen so . Las m u ta c io n e s con sen so se id en tifican c o m p a ra n d o las s e cu e n c ia s de l gen de p a rtida y la se cu e n c ia con sen so resu lta n te de un a lin e a m ie n to de secu en c ias . En a lgunos asp ec tos , las m u ta c io n e s c o n s e n s o se in tro d u ce n en el gen de p a rtida de ta l m a n e ra que se v u e lv e m ás s im ila r a la se cu e n c ia consenso . Las m u ta c io n e s con sen so ta m b ié n in c luye n cam b io s de a m ino ác id os que cam b ian un a m in o á c id o en un gen de pa rtida po r un am in o á c id o que se e n cu e n tra m ás fre c u e n te m e n te en un a lin e a m ie n to de se cu e n c ia s m ú ltip le (M S A , múltiple sequence alignment) en esa pos ic ión en re lac ión con la fre cu e n c ia de ese a m in o á c id o en el gen de pa rtida . P o r lo tan to , la exp res ión "m u ta c ió n co n se n so " se re fie re a cu a lq u ie r cam b io de a m in o á c id o que re e m p la ce un a m in o á c id o de l gen de pa rtida po r un a m in o á c id o que sea m ás a b u n d a n te en el M S A que el a m in o á c id o nativo.

Las e x p re s io n e s "su s titu c io n e s co n se rva tiva s " o "s u s titu c io n e s co n se rva d a s " se re fie ren , po r e jem p lo , a sus titu c ion es en las que se rea lizan una o m ás de las s ig u ie n tes su s titu c io n e s de am ino ác id os : ree m p la zo de un a m ino ác id o a lifá tico , ta l co m o a lan ina , va lina , le uc in a e iso leuc ina , po r o tro a m in o á c id o a lifá tico ; re e m p la zo de una se rina po r una treon in a ; ree m p la zo de una tre o n in a po r una serina ; ree m p la zo de un resto ác ido , ta l com o ác ido asp á rtico y ác ido g lu tám ico , po r o tro resto ác ido ; ree m p la zo de un resto que lleva un g rupo am ida , ta l com o a sp a ra g in a y g lu tam ina , po r o tro res to que lleva un g ru p o am ida ; in te rca m b io de un res to básico , ta l com o h is tid ina , lis ina y a rg in ina , po r o tro res to bás ico ; y re e m p la zo de un res to a ro m á tico , ta l com o trip tó fa n o , fe n ila la n in a y tiro s in a , po r o tro res to a ro m á tico ; o re e m p la zo de a m in o á c id o s pequeños , ta le s com o g lic ina , a lan ina , se rina , tre o n in a y m e tion ina , po r o tro am in o á c id o pequeño. En la té cn ica se conocen su s titu c io n e s de am in o á c id o s que g e n e ra lm e n te no a lte ran la ac tiv ida d e s p e c ífic a y las d e sc rib e n , po r e jem p lo , H. N e u ra th y R .L. H ill, en T h e P ro te ins , A c a d e m ic P ress, N u eva Y ork , 1979. Las m o d ifica c io n e s co n se rva tiva s ú tiles in c luyen de a lan ina a c is te ína , g lic in a o serina ; de a rg in in a a iso leuc ina , lis ina , m e tio n ina u o rn itina ; de a s p a ra g in a a ác ido aspártico , g lu tam ina , ác ido g lu tá m ico o h is tid ina ; de ác ido asp á rtico a asp a ra g in a , g lu tam ina o ác ido g lu tám ico ; de c is te ína a m e tion ina , se rina o treon in a ; de g lu tam ina a asp a ra g in a , ác ido asp á rtico o ác ido g lu tám ico ; de ác ido g lu tám ico a a sp a ra g in a , ác ido asp á rtico o g la tm ina ; de g lic in a a ác ido aspártico , a lan ina o pro lina ; de h is tid in a a asp a ra g in a o g lu tam ina ; de iso leu c in a a leuc ina , m e tio n ina o va lina ; de le uc in a a iso leu c in a , m e tio n ina o va lina ; de lis ina a a rg in ina , g lu tam ina , ác ido g lu tám ico , iso leuc ina , m e tio n in a u o rn itin a ; de m e tio n in a a c is te ína , iso leu c in a , le uc in a o va lina ; de fe n ila la n in a a h is tid ina , L-D opa, leucina, m e tio n ina , treon in a , trip tó fa n o , tiros ina , 3 -fe n ilp ro lin a , 4 -fe n ilp ro lin a o 5 -fen ilp ro lina ; de p ro lin a a ác ido L -1 -tio a zo lid ín -4 -ca rb o x ílico o ác ido D- o L -1 -o xa zo lid ín -4 -ca rb o x ílico ; de se rin a a c is te ína , m e tio n ina o tre o n in a ; de tre o n in a a m e tio n ina , se rina o va lina ; de tr ip tó fa n o a tiro s in a ; de tiro s in a a L -D opa , h is tid ina o fe n ila la n in a ; y de va lin a a iso leuc ina , le uc in a o m e tion ina .

La exp res ión "co rre sp o n d e a" se re fie re a un resto de am ino ác id o en una p rim e ra secu en c ia de p ro te ínas que, en cua n to a su pos ic ión , es e q u iva le n te a un res to de a m in o á c id o en una seg un da secu en c ia de p ro te ínas de re fe renc ia , de b ido que el res to de la p rim e ra secu en c ia de p ro te ínas se a linea con el resto de la secu en c ia de p ro te ín a s de re fe re nc ia u tiliza n d o té c n ic a s b io in fo rm á tica s , po r e jem p lo , u tiliza n d o los m é to d o s de sc rito s en el p re se n te d o cu m e n to para p re p a ra r un a lin e a m ie n to de se cu e n c ia s . El res to co rre sp o n d ie n te en la p rim e ra se cu e n c ia de p ro te ín a s se a s ig n a d e sp u é s al n ú m ero de res to en la s e g u n d a s e c u e n c ia de p ro te ín a s de re fe re nc ia . La p rim era se cu e n c ia de p ro te ínas puede s e r an á loga a la seg un da secu en c ia de p ro te ínas o no a n á loga a la seg un da se cu e n c ia de p ro te ínas , au nque se p re fie re que las dos s e cu e n c ia s de p ro te ín a s sean s e cu e n c ia s aná logas . P or e jem p lo , cua nd o la secu en c ia de a m in o á c id o s de una 'T e sA de E. co li, S E Q ID NO:31 exp ue s ta en la FIG. 58, se u tiliza com o una secu en c ia de re fe renc ia , a cada uno de los res tos de a m in o á c id o s en o tra p ro te ína a line ad a de in te rés o en una p ro te ína aná loga , se le puede a s ig n a r un nú m ero de resto c o rre sp o n d ie n te a los núm eros de los res tos 1-182 de la S E C ID NO: 31. P o r e jem p lo , en la FIG. 47, las s e cu e n c ia s de a m in o á c id o s a line ad as están re la c io n a d a s o se c o rre s p o n d e n con la se cu e n c ia de una 'T e sA de E. c o li. P o r c o n s ig u ie n te , a una po s ic ió n da da en o tra t io e s te ra s a de in te rés, ya sea una tio e s te ra s a p re cu rso ra o m u tan te , se la puede a s ig n a r una posic ión co rre sp o n d ie n te en la secu en c ia 'TesA , u tilizan do té cn ica s b io in fo rm a tica s conoc idas , ta le s com o las desc ritas en el p re sen te docum e n to .

El té rm in o "d e le c ió n ", cua nd o se u tiliza en el con tex to de una se cu e n c ia de am ino ác id os , s ig n ifica una de le c ión o e lim in a c ió n de un res to de la secu en c ia de am in o á c id o s de una p ro te ína p recu rso ra , dand o com o resu ltad o una p ro te ína m u tan te que tien e un resto de am in o á c id o m en os en co m p a ra c ió n con la p ro te ína p recu rso ra . El té rm in o ta m b ié n pued e u tiliza rse en el co n te x to de una s e c u e n c ia de nu c le ó tid o s , lo que s ig n ifica una d e le c ió n o e lim in a c ió n de un res to de la se cu e n c ia de p o lin u c le ó tid o s de un p o lin u c le ó tid o precurso r.

Las e xp res ione s "p ro ce d e n te de" y "o b te n id o (a ) de" se re fie ren , en el co n te x to de una t io e s te ra s a p recu rso ra , a una t io e s te ra s a p ro du c ida por, o que puede p roduc ir, una cepa de l o rg a n ism o en cuestión , y ta m b ié n una t io e s te ra sa co d ifica d a po r una se cu e n c ia de p o lin u c le ó tid o s a is lad a de d icha cepa y p ro d u c id a en un o rg a n ism o h o sp e d a d o r que co n tie n e d icha s e cu e n c ia de p o lin u c le ó tid o s . A d ic io n a lm e n te , las e xp re s io n e s se re fie ren a una t io e s te ra s a que está co d ifica d a po r una secu en c ia de p o lin u c le ó tid o s de origen s in té tico y /o A D N c y que tien e las ca ra c te rís tica s de id e n tifica c ió n de la t io e s te ra sa en cue s tión . P ara e jem p lifica r, " tio e s te ra sa s p ro ced en te s de la fam ilia E n te ro b a c te r ia c a e a (e n te ro b a c te ria s )" se re fie re a aq ue lla s e n z im a s que tie n e n ac tiv ida d tio e s te ra s a y que las e n te ro b a c te ria s p roducen de m a n e ra na tu ra l, a s í com o a tio e s te ra s a s com o las p ro du c ida s po r fu e n te s de e n te ro b a c te ria s pero que, u tilizan do té cn ica s de in g e n ie ría gené tica , se p ro du cen m ed ia n te o rg a n ism o s que no son e n te ro b a c te ria s tra n s fo rm a d o s con un po lin u c le ó tid o que cod ifica d icha tioe s te rasa .

En el p re sen te d o cum e n to , las e x p re s io n e s "co n s tru cc ió n de A D N " y "A D N tra n s fo rm a n te ", se u tilizan in d is tin ta m e n te pa ra re fe rirse a un A D N que se u tiliza para in tro d u c ir se cu e n c ia s en una cé lu la ho spe d a d o ra o en un o rg an ism o h o spe da do r. N o rm a lm e n te , una con s tru cc ió n de A D N se ge ne ra m ed ia n te P C R in v itro o m ed ia n te otra té c n ic a o té c n ic a s a d ecu ad as con oc idas po r los exp e rtos en la m a te ria . En d e te rm in a d o s aspec tos , la con s tru cc ió n de A D N co m p re n d e una s e cu e n c ia de in te rés (p o r e jem p lo , una secu en c ia en tran te ). En a lgunas rea liza c io nes , la secu en c ia es tá un ida o p e ra tiva m e n te a e le m e n to s ad ic io na le s , ta le s com o e le m e n to s de con tro l (p o r e jem p lo , p ro m o to re s , etc.). U na con s tru cc ió n de A D N puede co m p re n d e r a d e m á s un m a rc a d o r de se lecc ión . T a m b ié n puede co m p re n d e r una secu en c ia e n tra n te fla n q u e a d a po r ca jas de hom o log ía . En un a sp e c to a d ic io na l, la co n s tru cc ió n de A D N c o m p re n d e o tras se cu e n c ia s no ho m ó loga s , a ñ a d id a s a los ex tre m o s (p o r e jem p lo , s e cu e n c ia s re lle n a d o ra s o fla n q u e a n te s ). En a lg u n o s aspec tos , los e x tre m o s de la se cu e n c ia e n tra n te se c ie rran de ta l m an e ra que la co n s tru cc ió n de A D N fo rm a un c írcu lo ce rrado . Las se cu e n c ia s tra n s fo rm a d o ra s pueden s e r de tip o s ilves tre , m u tan te o pueden es ta r m od ifica das . En a lg u n o s asp ec tos , la con s tru cc ió n de A D N com p ren de se cu e n c ia s h o m ó loga s a las del c rom o som a de la cé lu la ho spe da do ra . En o tros aspec tos , la con s tru cc ió n de A D N co m p re n d e s e cu e n c ia s no hom ó logas . Una ve z que la con s tru cc ió n de A D N está en sa m b la d a in v itro , esta puede u tiliza rse para: 1) in se rta r secu en c ias h e te ró lo g a s en una se cu e n c ia d ian a d e se a d a de una cé lu la ho spe da do ra ; 2 ) m u ta g e n iza r una reg ión de l c ro m o so m a de la cé lu la h o sp e d a d o ra (es decir, re e m p la z a r una secu en c ia e n d ó ge na con una se cu e n c ia h e te ró loga ); 3) d e le c io n a r ge ne s d iana ; y /o (4) in tro d u c ir un p lásm id o de re p lica c ió n en el hospedador.

S e d ice que un po lin u c le ó tid o "co d ifica " un A R N o un po lip é p tid o si, en su es ta do na tivo o cua nd o se m an ip u la m ed ia n te m é tod os c o n o c id o s po r los e xp e rto s en la té cn ica , se puede tra n s c r ib ir y /o tra d u c ir para p ro d u c ir el A R N , el po lip ép tido , o un fra g m e n to de los m ism os. T a m b ié n se d ice que la cad en a a n tise n tid o de d icho po lin uc leó tido co d ifica las se c u e n c ia s de A R N o de l po lip ép tido . C o m o se sabe en la técn ica , un A D N pu ede tra n s c r ib irs e m ed ia n te una A R N po lim e rasa para p ro d u c ir un A R N , y un A R N puede tra n s c r ib irs e m ed ia n te tra n sc rip c ió n in ve rsa para p ro d u c ir un A D N . P o r tan to , un A D N puede c o d ifica r un A R N , y v ice ve rsa .

La fra se "e q u iva le n te " en este con tex to , se re fie re a e n z im a s t io e s te ra sa s que están co d ifica d a s po r un p o lin u c le ó tid o ca p a z de h ib rid a rse con el p o lin uc leó tido que t ie n e la se cu e n c ia de la S E C ID NO: 31 exp ue s ta en la FIG. 58, en co n d ic io n e s de m ed io a m á x im a rig u ro s id a d . P o r e jem p lo , s e r eq u iva le n te s ig n ifica que una tio e s te ra sa m ad u ra e q u iva le n te co m p re n d e al m e n o s 70 %, al m en os 75 %, al m en os 80 %, al m en os 85 %, al m e n o s 90 %, al m en os 91 %, al m en os 92 %, al m en os 93 %, al m en os 94 %, al m enos 95 %, al m en os 96 %, al m en os 97 %, al m en os 98 % y /o al m en os 99 % de id en tidad de se cu e n c ia con la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la S E C ID NO: 31 e xp u e s ta en la FIG. 58.

U na "é s te r s in ta sa " es un pép tido cap az de c a ta liz a r una reacc ión b ioq u ím ica para p ro d u c ir és te res. P o r e jem p lo , una é s te r s in ta sa es un pé p tido que puede p a rtic ip a r en la tra n s fo rm a c ió n de un t io é s te r a un é s te r graso . En d e te rm in a d o s aspec tos , un é s te r s in ta sa tra n s fo rm a en tioé s te r, una ac il-C oA , en un é s te r graso . En un asp ec to a lte rna tivo , una é s te r s in ta sa u tiliza un t io é s te r y un a lcoh o l com o sus tra to s para p ro d u c ir un é s te r graso . Las és te r s in ta sa s son cap ace s de u tiliza r a c il-C o A de cad en a corta y la rga com o sustra to . A d e m á s , las e s te r s in ta sa son c a p a ce s de u tiliz a r a lco h o le s de ca d e n a co rta y la rga co m o sus tra to . C o m o e je m p lo s no lim ita n te s de é s te r s in ta sa s se in c luye n ce ra s in tasas , é s te r ce ra s in ta sa s , acy l-C o A : a lco h o l tra n sa c ila sa s , a c iltra n s fe ra sa s , ac il co e n z im a grasa : a lco h o l a c iltra n s fe ra sa s grasas, a c il-A C P tra n s a c ila s a g rasa y a lcoh o l ace tiltra n s fe ra sa . U na é s te r s in ta sa que tra n s fo rm a un t io é s te r de a c il-C o A en una ce ra se d e n o m in a ce ra s in tasa . Las é s te r s in ta sa s e je m p la re s in c luyen las c la s ifica d a s con el nú m ero de c la s ifica c ió n de en z im a s EC 2.3.1.75. la exp res ión "é s te r s in ta sa " no com p ren de e n z im a s que ta m b ié n tie n e n ac tiv id a d tio e s te ra sa . En el p re se n te do cu m e n to , las e n z im a s que tie n e n ac tiv id a d ta n to é s te r s in ta sa com o tio e s te ra sa , se ca te g o riza n com o tioe s te rasa s .

La exp res ión "g en es e xp re sa d o s " se re fie re a ge ne s que se tra n sc r ib e n en A R N m e n sa je ro (A R N m ) y que de spués se tra d u c e n en p ro te ínas , as í co m o a genes que se tra n sc rib e n en tip o s de A R N , ta le s com o A R N de tra n s fe re n c ia (A R N t), A R N r ib o só m ico (A R N r) y A R N regu lado r, que no se tra d u ce n en p ro te ínas.

Las exp re s io n e s "ca se te de e xp res ión " o "v e c to r de exp res ión ", se re fie ren a una con s tru cc ió n de po lin u c le ó tid o s ge ne ra d a de fo rm a reco m b in an te o s in té tica , con una serie de e le m e n to s e sp e c ífico s que pe rm iten la tra n sc rip c ió n de un po lin u c le ó tid o p a rticu la r en una cé lu la d iana. Un case te de exp res ión reco m b in an te puede in co rp o ra rse en un p lásm ido , en un c rom o som a , en un A D N m itoco nd ria l, en un A D N p lasm íd ico , en un v iru s o en un fra g m e n to de po lin u c le ó tid o . N o rm a lm e n te , la pa rte de case te de e xp re s ió n re co m b in a n te de un v e c to r de e xp re s ió n inc luye , e n tre o tras se cu e n c ia s , una secu en c ia de p o lin u c le ó tid o s que se va a tra n s c r ib ir y un p rom oto r. En asp ec tos pa rticu la res, los v e c to re s de e xp re s ió n tie n e n la ca p a c id a d de in c o rp o ra r y e x p re s a r fra g m e n to s de p o lin u c le ó tid o s h e te ró lo g o s en una cé lu la ho spe da do ra . En el co m e rc io se d ispo ne de m uch os ve c to re s de exp res ión p ro ca rio tas y eu ca rio tas . La se lecc ió n de ve c to re s de exp res ión ap ro p ia d o s está de n tro de l co n o c im ie n to de los exp e rtos en la té cn ica . En el p re sen te d o cum e n to , las e x p re s io n e s "ca se te de exp res ión ", "co n s tru cc ió n de A D N " y sus e q u iva le n te s g ra m a tica les , se u tilizan in d is tin tam en te .

La exp res ión "d e riva d o de ác ido graso", ta l com o se usa en el p resen te d o cum e n to , se re fie re a una com p os ic ión que p rocede de una ru ta m e tab ó lica , cuya ruta in c luye una reacc ión de tio e s te ra sa . P o r tan to , los p roduc tos p ro ce d e n te s de ác ido s g ra sos pueden s e r p ro du c to s que son, o p roceden de, ác ido s g ra sos o és te res g rasos, que son p ro d u c to s de una rea cc ió n de tio e s te ra sa . P o r tan to , co m o d e riva d o s de ác ido s g ra sos se inc luyen , po r e jem p lo , p ro du c to s que son, o que p roceden de, ác ido s g ra sos que son el p ro du c to de reacc ión d irec ta de una tioe s te rasa , y /o de un é s te r g raso que es un p ro du c to de rea cc ió n d irec ta de una tio e s te ra sa . C om o de riva dos de ác idos g rasos e je m p la re s se in c luyen , po r e jem p lo , a lco h o le s de ca d e n a co rta y la rga , h id ro ca rb u ro s , y a lco h o le s g ra sos y és te res, in c lu ye n d o ceras, és te res de ác ido s g ra sos y/o és te res g rasos. C o m o e jem p los no lim ita tivo s e sp e c ífico s de d e riva d o s de ác ido s g ra sos se inc luyen , ác ido s g rasos, é s te re s m e tílico s de ác ido s g rasos, é s te re s e tílico s de ác ido s g rasos , a lcoh o le s g rasos, a lq u il-a ce ta to s g rasos , a ld e h íd o s g rasos , a m in a s g rasas , am ida s g rasas, su lfa tos grasos, é te re s g rasos, ce tonas , a lcanos , o le fin a s in te rnas, o le fin as te rm in a le s , ác ido s d ica rb o x ílico s , ác ido s u>-d icarboxílicos, d io le s y ác ido s g ra sos te rm in a le s y /o in te rnos.

La exp res ión "e n z im a s de riva d a s de ác ido s g ra sos" se re fie re a, con ju n ta e in d iv idu a lm e n te , en z im a s que pueden exp re sa rse o so b re e xp re sa rse en la p ro du cc ión de de riva d o s de ác ido s grasos. E stas en z im a s pueden fo rm a r parte de una ru ta b ios in té tica de ác ido s grasos. C o m o e jem p los no lim itan te s de s in ta sas de riva das de ác ido s g ra sos se in c luye n s in ta sas de ác ido s g rasos, t io e s te ra sa s , a c il-C o A s in tasas , a c il-C o A red uc tasa s , a lcoh o l d e sh id rog en asa s , a lcoh o l ac iltran s fe rasas , a c il-C o A red uc tasa fo rm a d o ra de a lcoh o l graso , d e sca rb o x ila sa s de ác ido s grasos, ác ido ca rb o x ílico reduc tasas , ace til tra n s fe ra s a s de a lcoh o l g raso y é s te r s in tasas. Las e n z im a s de riva das de ác idos g ra sos tra n s fo rm a n los sus tra to s en de riva d o s de ác ido s grasos. En d e te rm in a d a s c ircu ns tan c ias , un sus tra to a d e cu a d o puede s e r un p r im e r de riva do de ác ido graso , que se tra n s fo rm a m ed ia n te una en z im a de riva da de ác ido graso , en un seg u n d o de riva d o de ác ido g raso d ife ren te .

La e xp res ión "a lco h o l g ra so " se re fie re a un a lcoh o l que tie n e la fó rm u la R O H . En d e te rm in a d o s asp ec tos , un a lcoh o l g ra so es un a lcoh o l fa b rica d o a p a rtir de un ác ido g raso o de riva do de ác ido graso . En un aspecto , el g rupo R tien e una lo ng itud de al m en os a p ro x im a d a m e n te 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 ca rbonos . El g ru p o R puede te n e r una cad en a linea l o ram ificada . Las cad en as ra m ifica d a s pueden te n e r uno o m ás pun tos de ram ificac ió n . A de m ás , las ca d e n a s ra m ifica d a s pueden in c lu ir ram as c íc licas, ta le s com o g rupos de c ic lo p ro p a n o o epóx ido . A s im ism o , el g rupo R puede e s ta r sa tu ra do o insa tu rado . Si está insa tu rado , el g rupo R puede te n e r uno o m ás pu n tos de insa tu ra c ión . En una rea liza c ió n , el a lcoh o l g ra so se p ro du ce b io s in té tica m e n te . Los a lco h o le s g ra sos tie n e n m u ch o s usos. P o r e jem p lo , los a lcoh o le s g ra sos pueden u tiliza rse para p ro d u c ir p ro du c to s qu ím icos esp ec ia le s . E spe c íficam en te , los a lcoh o le s g ra sos pueden u tiliza rse com o b ioco m bus tib le s ; com o d iso lve n te s para g rasas, ceras, go m as y res inas; en bá lsa m os fa rm a cé u tico s , e m o lie n te s y loc iones; com o ad itivos para ace ites lu b rica n tes ; en de te rg e n te s y em u ls io n a n te s ; com o ag e n te s te x tile s a n tie s tá tico s y de acabado ; com o p las tifican tes ; com o te n s io a c tiv o s no ión icos; y en cosm é tica , po r e jem p lo , com o esp esa n tes .

La e xp res ión "p é p tid o s fo rm a d o re s de a lcoh o l g ra so " se re fie re a pé p tid os c a p a ce s de c a ta liz a r la co n ve rs ió n de ac il-C o A en a lcoh o l graso , in c luye nd o la a c il-C o A red uc tasa fo rm a d o ra de a lcoh o l g ra so (FA R , EC 1.1.1. *), la ac il-C o A re d u c ta sa (E C 1.2.1.50 ) o la a lco h o l d e s h id ro g e n a s a (E C 1.1.1.1 ). A d ic io n a lm e n te , un e xp e rto ha b itu a l en la m a te ria a p rec ia rá que a lgu nos pép tidos fo rm a d o re s de a lcoh o l g ra so ca ta liza rán ta m b ié n o tras reacc iones . P o r e jem plo , a lg u n o s pé p tid os de a c il-C o A red u c ta sa a ce p ta rá n su s tra to s d is tin tos de ác idos g rasos. P o r lo tan to , ta m b ié n se in c luye n d icho s pép tidos no esp ec íficos . En la té cn ica se con oce n s e cu e n c ia s de po lin u c le ó tid o s que cod ifican p é p tid o s fo rm a d o re s de a lcoh o l graso , y d icho s pé p tid os están d isp o n ib le s al púb lico .

La exp res ión "a ld e h id o g ra so " se re fie re a un a ld e h id o que tie n e la fó rm u la R C H O c a ra c te riza d a po r un grupo ca rb o n ilo in sa tu ra do (C =O ). En d e te rm in a d o s aspec tos , un a ld e h íd o g raso es un a ld e h íd o fa b rica d o a pa rtir de un á c id o g ra so o d e riva d o de á c id o g ra so . En un asp ec to , el g ru p o R t ie n e una lo ng itud de al m e n o s a p ro x im a d a m e n te 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 ca rb on os . El g ru p o R pued e te n e r una ca d e n a linea l o ram ificada . Las ca d e n a s ra m ifica d a s pueden te n e r uno o m ás pu n tos de ram ificac ió n . A d e m á s , las cadenas ra m ifica d a s pueden s e r ra m ifica c io n e s c íc licas. A s im ism o , el g ru p o R puede e s ta r sa tu ra d o o in sa tu ra do . Si está in sa tu ra do , el g rupo R puede te n e r uno o m ás pun tos de insa tu ra c ión . En un aspecto , el a lde h ído g raso se p roduce b io s in té tica m e n te . Los a ld e h íd o s g ra sos tie n e n m u ch o s usos. P o r e jem p lo , los a ld e h íd o s g ra sos pueden u tiliza rse pa ra p ro d u c ir p ro d u c to s q u ím ico s esp e c ia le s . E sp e c ífica m e n te , los a ld e h íd o s g ra so s pu ed en u tiliza rse pa ra p ro d u c ir po lím e ro s , res inas, tin te s , a ro m a tiza n te s , p las tifica n tes , pe rfum es, p ro du c to s fa rm a cé u tico s y o tros p roduc tos qu ím icos . A lg u n o s se u tilizan com o d iso lve n tes , co n se rva n te s o de s in fe c ta n tes . A lg u n o s co m p u e s to s na tu ra les y s in té ticos , ta le s com o v ita m in a s y ho rm onas, ta m b ié n son a ldeh ídos .

En el p re sen te do cu m e n to , las e x p re s io n e s "p o lip é p tid o b io s in té tico de a ld e h íd o g ra so " "á c id o c a rb o x ílico reduc tasa " y "C A R ", se u tilizan in d is tin tam en te .

La exp res ión "é s te r g raso" se re fie re a un é s te r que t ie n e m ás de 5 á to m o s de carbono . En d e te rm in a d o s aspectos, un é s te r g ra so es un é s te r fa b rica d o a p a rtir de un ác ido graso , po r e jem p lo , un é s te r de ác ido graso. En una re a liza c ió n , un é s te r g ra so con tiene un lado A (es dec ir, la ca d e n a de c a rb o n o un id a al o x íg e n o de ca rb o x ila to ) y un lado B (es decir, la cad en a de ca rb o n o que co m p re n d e el c a rb o x ila to p recu rso r). En un a sp ec to pa rticu la r, cua nd o un é s te r g ra so p ro ce d e de la ru ta b io s in té tica de á c id o s g rasos , el lado A ap o rta un a lcoho l, y el lado B a p o rta un ác ido g raso . S e pu ed e u tiliz a r c u a lq u ie r a lco h o l pa ra fo rm a r el lado A de los és te re s g rasos . P o r e jem p lo , el a lco h o l puede p ro c e d e r de la ru ta b io s in té tica de los ác ido s g rasos. C o m o a lte rna tiva , el a lcoh o l puede p ro du c irse a tra v é s de ru tas b io s in té tica s de ác idos no grasos. A de m ás , el a lcoh o l puede p ro p o rc io n a rse de m an era exógena . P o r e jem p lo , el a lco h o l puede su m in is tra rse al ca ldo de fe rm e n ta c ió n en los caso s en los que el é s te r g ra so lo p roduce un o rg an ism o . C om o a lte rna tiva , un ác ido ca rb ox ílico , ta l com o un á c id o g ra so o á c id o acé tico , puede s u m in is tra rse de m an e ra exó ge na en los caso s en los que el é s te r g ra so lo p roduce un o rg a n ism o que ta m b ié n puede p ro d u c ir a lcoho l. Las cad en as de ca rb on o que com p ren den el lado A o el lado B pueden te n e r cu a lq u ie r long itud . En un asp ec to , e l lado A de l é s te r t ie n e una lo ng itud de al m en os a p ro x im a d a m e n te 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 ca rb on os . El la do B de l é s te r tien e una lo ng itud de al m en os a p ro x im a d a m e n te 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 ca rbonos . El lado A y/o el lado B pueden s e r de cad en a linea l o ram ificada . Las ca d e n a s ram ificada s pueden te n e r uno o m ás pun tos de ram ificac ió n . A de m ás , las cad en as ram ificada s pueden in c lu ir ram ificac io ne s c íc licas , ta le s com o g ru po s de c ic lo p ro p a n o o ep óx ido . A d e m á s , el lado A y /o el lado B pueden e s ta r sa tu ra d o s o in sa tu ra dos . Si es tá in sa tu ra do , el lado A y /o el lado B puede te n e r uno o m ás pu n tos de insa tu ra c ión . En una rea liza c ió n , el é s te r g raso se p roduce b io s in té tica m e n te . En este aspecto , p rim ero se "a c tiva " el ác ido graso. E je m p lo s no lim ita n te s de ác ido s g ra so s ac tiva d o s son ac il-C oA , ac il A C P , a c il-A M P y ac il fos fa to . La a c il-C o A puede s e r un p ro d u c to d irec to de la b io s ín te s is o d e g ra d a c ió n de los ác ido s g rasos. A de m ás , la a c il-C o A pued e s in te tiza rse a p a rtir de un ác ido g ra so libre, una C o A y un tr ifo s fa to de nu c le ó tid o de a d e n o s in a (A T P ). Un e jem p lo de una e n z im a que p roduce a c il-C o A es una a c il-C o A s in tasa . Una ve z que se ac tiva el ác ido graso , se puede tra n s fe r ir fá c ilm e n te a un nuc le ó filo recep to r. Los nu c le ó filo s e je m p la re s son a lcoh o le s , tio les , am ina s o fos fa tos . En o tro aspec to , el é s te r g raso puede p ro ce d e r de un a c ilt io é s te r g raso y un a lcoho l. En un aspecto , el é s te r g raso es una cera . La ce ra puede p ro ce d e r de un a lcoh o l g raso de cadena la rga y de un ác ido g ra so de cad en a la rga . En otra rea liza c ió n , el é s te r g raso es un t io é s te r de ác ido graso , po r e jem p lo , ac il C o e n z im a A (a c il-C o A ) grasa . En o tros asp ec tos , el é s te r g ra so es un ac il p a n to te n a to g raso , una ac il p ro te ína tra n s p o rta d o ra de ac ilo (ac il-A C P ), un és te r de e n z im a ac ilo g ra so o un é s te r de fo s fa to g raso . Un é s te r puede fo rm a rs e a p a rtir de un p ro du c to in te rm e d io de é s te r de e n z im a acilo a tra vé s de la a lcoh ó lis is del en la ce é s te r para fo rm a r un nuevo é s te r y la e n z im a libre. Los é s te re s g ra sos tien en m uch os usos. P o r e jem p lo , los és te res g ra sos pueden u tiliza rse com o un b io co m b u s tib le o com o un te n s io a c tivo , o com o un co m p o n e n te de estos.

La exp res ión "é s te r g ra so fre n te a o tros d e riva d o s de ác ido s g rasos", com o se usa en el p resen te d o cum e n to , se re fie re al re n d im ie n to p ro p o rc io n a l de é s te r g ra so en co m p a ra c ió n con la ca n tid a d to ta l de o tro s d e riva d o s de ác ido s g ra sos que no son és te res g rasos. En o tras pa lab ras, la can tidad de és te res g ra sos se com p ara con la can tidad de d e riva d o s de ác ido s g ra sos d is tin to s de é s te re s grasos.

Las e xp res ione s "p ro d u c tiv id a d de fe rm e n ta c ió n " o "p ro d u c tiv id a d ", se re fie ren a la v e lo c id a d de p ro du cc ión del p ro du c to y se exp resa en g l-1h '1. La p ro du c tiv ida d e sp ec ífica es la p ro du c tiv ida d n o rm a liza d a para la c o n ce n tra c ió n de c a ta liz a d o r y se exp re sa com o g/g l-1h '1 g (c a ta liz a d o r) '1.

Las exp re s io n e s "títu lo de fe rm e n ta c ió n " o "títu lo ", se re fie ren a la co n ce n tra c ió n de un p ro du c to de reacción, g e n e ra lm e n te e xp resa da com o g/l pero ta m b ié n en o tras un idades (es decir, m o la r, m asa /m a sa , m a sa /vo lu m e n o vo lu m e n /vo lu m e n ).

La exp res ión "re n d im ie n to de fe rm e n ta c ió n " o el té rm in o "re n d im ie n to ", se re fie ren a la can tida d de p roducto p ro d u c id o a p a rtir de una can tidad dada de m a te ria p rim a y g e n e ra lm e n te se exp resa co m o la re lac ión de m asa del p ro d u c to p ro d u c id o d iv id id o en tre la m asa de m a te ria p rim a co n su m id a (g de p ro d u c to /g de m a te ria prim a). T am b ién pued e e x p re s a r un ren d im ie n to m o la r (m o les p ro d u c to /m o le s de m a te ria prim a).

La expresión "fracción de carbono moderno" se refiere al parámetro ' V según lo definido por el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) en Materiales de Referencia Estándar (SRM) 4990B y 4990C, conocido como estándares de ácidos oxálico HOxI y HOxII, respectivamente. La definición fundamental se refiere a 0,95 veces la relación isotópica 14C/12C HOxI (referenciado a AD 1950). Esto es muy equivalente a la madera previa a la revolución industrial con deterioro corregido. Para la biosfera viva actual (material vegetal), la fM es de aproximadamente 1,1.

La expresión "ensayo funcional" se refiere a un ensayo que proporciona una indicación de la actividad de una proteína. En aspectos particularmente preferidos, la expresión se refiere a un sistema de ensayo en donde se analiza una proteína para determinar su capacidad natural para funcionar. Por ejemplo, en el caso de enzimas, un ensayo funcional implica determinar la eficacia de la enzima para catalizar una reacción.

"Gen" se refiere a un polinucleótido (por ejemplo, un segmento de ADN), que codifica un polipéptido y que incluye regiones que preceden y siguen a las regiones codificantes, así como a secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).

La expresión "genes homólogos" se refiere a un par de genes de especies diferentes pero relacionadas, que se corresponden entre sí y que son idénticos o similares entre sí. La expresión abarca genes que están separados por el proceso de especiación durante el desarrollo de nuevas especies (por ejemplo, genes ortólogos), así como genes que se han separado por duplicación genética (por ejemplo, genes parálogos).

La expresión "proteína endógena" se refiere a una proteína que es nativa para una célula, o que se produce en ella de manera natural. Un "polinucleótido endógeno" se refiere a un polinucleótido que está en la célula y no se introdujo en la célula utilizando técnicas de ingeniería recombinante. Por ejemplo, un gen que estaba presente en la célula cuando la célula se aisló originalmente de la naturaleza. Un gen todavía se considera endógeno si las secuencias de control, tales como secuencias promotoras o potenciadoras que activan la transcripción o la traducción, se han alterado a través de técnicas recombinantes. A la inversa, el término "heterólogo" también se utiliza en el presente documento, y se refiere a una proteína o a un polinucleótido que no se produce de manera natural en una célula hospedadora.

La expresión "recombinación homóloga" se refiere al intercambio de fragmentos de ADN entre dos moléculas de ADN o cromosomas emparejados en sitios de secuencias de nucleótidos idénticas o casi idénticas. En determinados aspectos, la integración cromosómica es una recombinación homóloga.

La expresión "secuencias homólogas", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos que tiene, por ejemplo, aproximadamente 100%, aproximadamente 99% o más, aproximadamente 98 % o más, aproximadamente 97 % o más, aproximadamente 96 % o más, aproximadamente 95 % o más, aproximadamente 94 % o más, aproximadamente 93 % o más, aproximadamente 92 % o más, aproximadamente 91 % o más, aproximadamente 90 % o más, aproximadamente 88 % o más, aproximadamente 85 % o más, aproximadamente 80 % o más, aproximadamente 75 % o más, aproximadamente 70 % o más, aproximadamente 65 % o más, aproximadamente 60 % o más, aproximadamente 55 % o más, aproximadamente 50 % o más, aproximadamente 45 % o más, o aproximadamente 40 % o más de identidad de secuencia con otra secuencia de polinucleótidos o polipéptidos cuando se alinean de manera óptima para la comparación. En aspectos particulares, las secuencias homólogas pueden conservar el mismo tipo y/o nivel de una actividad de interés particular. En algunos aspectos, las secuencias homólogas tienen entre 85% y 100% de identidad de secuencia, mientras que en otros aspectos hay una identidad de secuencia de entre 90 % y 100 %. En aspectos particulares, hay una identidad de secuencia de 95 % y de 100 %.

"Homología" se refiere a similitud de secuencia o identidad de secuencia. La homología se determina utilizando técnicas estándar conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; programas tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, WI); y Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395, 1984). Un ejemplo no limitativo incluye el uso del programa BLASt (Altschul et al., Gapped BLAST y PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997) para identificar secuencias que puede decirse que son "homólogas". Una versión reciente, tal como las versiones 2.2.16, 2.2.17, 2.2.18, 2.2.19, o la última versión, incluyendo subprogramas tales como blastp para comparaciones entre proteínas, blastn para comparaciones entre nucleótidos, tblastn para comparaciones entre proteínas y nucleótidos o blastx para comparaciones entre nucleótidos y proteínas, y con los siguientes parámetros: número máximo de secuencias devueltas 10000 o 100000; valor E (valor esperado) de 1e-2 o 1e-5, tamaño de palabra de 3, matriz de puntuación BLOSUM62, existencia de coste por hueco 11, extensión de coste por hueco 1, puede ser adecuada. Un valor E de 1e-5, por ejemplo, indica que la probabilidad de que se produzca una coincidencia homóloga al azar es de aproximadamente 1 en 10000, indicando de este modo una confianza alta de homología verdadera.

Las expresiones "cepa hospedadora" o "célula hospedadora" se refieren a un hospedador adecuado para un vector de expresión que comprende un ADN de la presente divulgación.

C o m o se sabe en la m a te ria , el té rm in o "h ib rid a c ió n " se re fie re al p ro ceso m ed ia n te el cua l una cadena de p o lin u c le ó tid o s se une con una ca d e n a co m p le m e n ta r ia m ed ian te e m p a re ja m ie n to de bases. S e co n s id e ra que una se cu e n c ia de po lin u c le ó tid o s se "h ib rid a s e le c tiva m e n te " con una secu en c ia de po lin u c le ó tid o s de re fe renc ia , si las dos se cu e n c ia s se h ib ridan esp e c ífica m e n te en tre sí en con d ic io n e s de h ib rid ac ión y lavado de rigu ros idad m o d e ra d a a alta . Las co n d ic io n e s de h ib rid ac ión d e p e nd en de la te m p e ra tu ra de fus ió n (Tm) de l co m p le jo o so n d a de un ión al p o lin uc leó tido . P o r e jem p lo , no rm a lm e n te se p roduce una "r ig u ro s id a d m áx im a" a una te m p e ra tu ra de fus ión , Tm, de a p ro x im a d a m e n te -5 °C (5 °C po r de ba jo de la Tm de la sonda ); una "r ig u ro s id a d a lta " a a p ro x im a d a m e n te 5 -10 °C po r de ba jo de la Tm; una "r ig u ro s id a d in te rm e d ia " a a p ro x im a d a m e n te 10 -20 °C por de ba jo de la Tm de la sonda ; y una "r ig u ro s id a d ba ja" a a p ro x im a d a m e n te 20 -25 °C po r de ba jo de la Tm. F u n c io n a lm e n te , para id e n tific a r se cu e n c ia s que tien en id en tidad es tric ta o id en tidad casi es tr ic ta con la son da de h ib rid ac ión , pu ed en u tiliza rse co n d ic io n e s de rig u ros ida d m áxim a; m ie n tras que para id e n tifica r o d e te c ta r h o m ó logo s de se cu e n c ia s de po lin uc leó tidos , pueden u tiliza rse con d ic io n e s de h ib ridac ión con una rig u ros ida d in te rm ed ia o ba ja . Las con d ic io n e s de h ib rid ac ión con rig u ro s id a d m o d e ra d a y a lta son bien c o n o c id a s en la té cn ica . Un e jem p lo de co n d ic io n e s de rig u ros ida d a lta in c luye una h ib rid ac ión a a p ro x im a d a m e n te 42 °C en fo rm a m id a al 50 %, s Sc 5x , so lu c ió n de D e n h a rd t 5X , S D S al 0 ,5 % y 100 pg /m l de A D N p o rta d o r d e sn a tu ra liza d o , se g u id o de la vad o dos ve ce s en 2 X S S C y S D S al 0 ,5 % a te m p e ra tu ra am b ie n te y dos vece s m ás en 0 ,1 X S S C y S D S al 0 ,5 % a 42 °C. C om o e jem p lo de con d ic io n e s de rig u ros ida d m od e ra da se inc luye una in cub ac ió n du ran te la noche a 37 °C en una so luc ió n que com p ren de fo rm a m id a al 20 % , 5X S S C (N a C l 150 m M , c itra to tr isó d ico 15 m M ), fo s fa to de sod io 50 m M (pH 7,6), so luc ió n de D e n h a rd t 5X, su lfa to de d e x tra n o al 10 % y 20 m g /m l de A D N de esp e rm a de sa lm ón co rta d o y d e sn a tu ra liza d o , se g u id o de la vad o de los filtros en 1X S S C a una te m p e ra tu ra de a p ro x im a d a m e n te 37 °C a a p ro x im a d a m e n te 50 °C. Los exp e rtos en la m a te ria saben cóm o a ju s ta r la te m p e ra tu ra , la fu e rza ión ica y o tras con d ic ion es , según sea necesa rio , para a d e c u a r fa c to re s ta le s com o la long itud de la so n d a y s im ila res.

El té rm in o "h id ro ca rb u ro " se re fie re a co m p u e s to s qu ím icos que con tienen los e lem e n tos ca rb on o (C ) e h id rógeno (H). T o d o s los h id ro ca rb u ro s con s tan de un e sq u e le to de ca rb o n o y de á to m o s de h id ró g e n o un id os a ese esque le to . A lg u n a s vece s , el té rm in o se u tiliza com o una fo rm a a b re v ia d a de la e xp res ión "h id ro c a rb u ro a lifá tico ". B á s ica m e n te hay tres tip o s de h id ro ca rbu ros : (1) h id ro ca rb u ro s a ro m ático s , que tien en al m en os a p ro x im a d a m e n te un an illo a ro m á tico ; (2) h id ro ca rbu ros sa tu rados , tam b ién con oc idos com o a lcanos, que ca recen de en laces dob les, tr ip le s o a ro m á tico s ; y (3) h id ro ca rb u ro s in sa tu ra dos , que en tre los á to m o s de ca rb on o tien en uno o m ás en la ces do b les o tr ip le s e inc luyen , po r e jem p lo , a lqu eno s (p o r e jem p lo , d ien os ) y a lqu inos.

El té rm in o "idén ticos", en el con tex to de dos se cu e n c ia s de p o lin u c le ó tid o s o po lip ép tido s , s ig n ifica que cua nd o las dos se cu e n c ia s se a linean pa ra o b te n e r una co rre sp o n d e n c ia m áxim a , los res tos son igua les, ta l y com o se m ide u tiliza n d o un a lg o ritm o de an á lis is o co m p a ra c ió n de se cu e n c ia s com o los d e sc rito s en este do cum e n to . P or e jem p lo , si cua nd o se a linean co rre c ta m en te , los se g m e n to s c o rre sp o n d ie n te s de dos se cu e n c ia s tie n e n res tos id é n tico s en 5 po s ic io ne s de 10, se d ice que las dos se cu e n c ia s tie n e n una id en tidad de l 50 %. La m ayo ría de los p ro g ra m a s b io in fo rm á tico s in d ica n el po rcen ta je de id en tidad sob re las reg io nes de se cu e n c ia a line ad as , que n o rm a lm e n te no son las m o lé cu la s com p le ta s . Si un a lin e a m ie n to es lo s u fic ie n te m e n te la rgo y con tiene su fic ie n te s res tos idén ticos, se pued e ca lc u la r un v a lo r de exp ec ta tiva , que ind ica que es im p roba b le que el n ive l de id en tidad en el a lin e a m ie n to ocu rra po r azar.

Las e xp res ione s "m u ta c ión de m e jo ra " o "m u ta c ió n de po tenc iac ió n del ren d im ie n to " se re fie ren a una m u tac ión en una p ro te ína que co n d u ce a p ro p ieda de s a lte rad as , que con fie ren un re n d im ie n to m e jo ra d o en té rm in o s de una d ian a y /o p ro p ieda d de sea da de una p ro te ína en c o m p a ra c ió n con una p ro te ína p recu rso ra .

El té rm in o "in se rc ió n " cu a n d o se usa en el co n te x to de una se cu e n c ia de po lip ép tido s , se re fie re a una inse rc ió n en la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de un po lip é p tid o p recu rso r, da ndo com o resu lta d o un po lip é p tid o m u tan te que t ie n e un a m in o á c id o que se in se rta e n tre dos a m in o á c id o s co n tig u o s e x is te n tes , es decir, res tos de a m in o á c id o s adyacen tes , que están p re sen te s en el p o lip ép tido p recurso r. El té rm in o "inse rc ión ", cua nd o se u tiliza en el con tex to de una se cu e n c ia de po lin uc leó tidos , se re fie re a una in se rc ión de uno o m ás nu c le ó tido s en el p o lin uc leó tido p re cu rso r en tre dos nu c le ó tid o s con tigu os ex is te n tes , es decir, nu c le ó tido s ad yace n tes , que están p re sen te s en los p o lin u c le ó tid o s p recu rso res .

El té rm in o "in tro d u c id o ", en el con tex to de in tro d u c ir una secu en c ia de p o lin u c le ó tid o s en una cé lu la , se re fie re a cu a lq u ie r m é tod o a d e cu a d o para tra n s fe r ir la secu en c ia de po lin u c le ó tid o s a la cé lu la . D ichos m é tod os de in tro d u cc ió n in c luyen , pero sin lim itac ión , fus ió n de p ro to p las tos , tra n s fe cc ió n , tra n s fo rm a c ió n , con ju g a c ió n y tra n sd u cc ió n (véase, po r e jem p lo , Fe rra ri e t al., G en e tics , en H a rdw o od e t al, (eds.), B ac illu s , P le nu m P ub lish ing C orp., págs. 57 -72 , 1989).

Los té rm in o s "a is la d o " o "p u rifica d o " s ign ifican un m a te ria l que se e lim in a de su en to rno o rig ina l, po r e jem p lo , el e n to rn o na tu ra l en caso de que sea de o rige n na tu ra l, o un ca ldo de fe rm e n ta c ió n si se p roduce en un m e d io de fe rm e n ta c ió n de cé lu la s ho sp e d a d o ra s reco m b in an te s . S e d ice que un m a te ria l está "p u rif ica d o " cuando está p re sen te en una c o m p o s ic ió n p a rtic u la r en una c o n ce n tra c ió n m a y o r o m e n o r que la c o n c e n tra c ió n que ex is te an tes de re a liza r la e ta pa o e ta pas de pu rifica c ión . P o r e jem p lo , con resp ec to a una com p o s ic ió n que ha b itu a lm e n te se e n cu e n tra en un o rg a n ism o na tu ra l o de t ip o s ilves tre , d icha co m p o s ic ió n se "p u rif ica " cu a n d o la co m p o s ic ió n fina l no in c luye a lgún m a te ria l de la m a triz o rig ina l. C o m o otro e jem p lo , dond e una com p o s ic ió n se e n cu e n tra en combinación con otros componentes en un medio de fermentación de células hospedadoras recombinantes, esa composición se purifica cuando el medio de fermentación se trata de una manera que se elimine algún componente de la fermentación, por ejemplo, desechos celulares u otros productos de fermentación, a través de, por ejemplo, centrifugación o destilación. Como otro ejemplo, un polinucleótido o polipéptido natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, esta aislado, si dicho proceso se realiza a través de ingeniería genética o separación mecánica. Dichos polinucleótidos pueden ser partes de vectores. Como alternativa, dichos polinucleótidos o polipéptidos pueden ser partes de composiciones. Dichos polinucleótidos o polipéptidos pueden considerarse "aislados" porque los vectores o composiciones que los comprenden no forman parte de sus entornos naturales. En otro ejemplo, se dice que un polinucleótido o proteína se purifica si da lugar básicamente a una banda en un gel o transferencia de electroforesis.

El término "madura", en el contexto de una proteína, significa una forma de una proteína o péptido que se encuentra en su forma funcional final. Para ejemplificar, una forma madura de una tioesterasa de la presente divulgación comprende los restos de aminoácidos 1-182 de la SEC ID NO: 31 expuesta en la FIG. 58.

La expresión "derivados de ácidos grasos modificados" se refiere a productos fabricados, al menos en parte, a partir de una parte de la ruta biosintética de ácidos grasos de una célula hospedadora recombinante, en donde el producto difiere del producto fabricado por dicha célula hospedadora en ausencia de la tioesterasa mutante de la divulgación. Por tanto, cuando se introduce una tioesterasa mutante (o su equivalente de origen natural) en una célula hospedadora recombinante, se da como resultado la producción de un derivado de ácido graso que tiene un perfil de producto diferente, por ejemplo, una concentración más alta o más baja de ciertos derivados de ácidos grasos que tienen una longitud de cadena específica, o una concentración más alta o más baja de un cierto tipo de derivado de ácidos grasos, ese material de ácido graso está "modificado" en el contexto de esta divulgación.

Las expresiones "tioesterasa mutante" o "tioesterasa variante", se refieren a una tioesterasa que comprende una mutación con referencia a una tioesterasa precursora.

El término "mutación", en el contexto de una proteína, se refiere a una modificación de la secuencia de polinucleótidos que produce un cambio en la secuencia de un polinucleótido con referencia a una secuencia de polinucleótidos precursora. Una secuencia de polinucleótidos mutante puede referirse a una alteración que no cambia la secuencia de aminoácidos codificada, por ejemplo, con respecto a la optimización de codones con fines de expresión, o que modifica un codón de tal manera que produce una modificación de la secuencia de aminoácidos codificada. Las mutaciones pueden introducirse en un polinucleótido a través de cualquiera de los diversos métodos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo mutagénesis aleatoria, mutagénesis específica de sitio, mutagénesis dirigida por oligonucleótido, transposición de genes, técnicas de evolución dirigida, mutagénesis combinatoria, mutagénesis de saturación de sitios, entre otros.

"Mutación" o "mutada" significa, en el contexto de una proteína, una modificación en la secuencia de aminoácidos que produce un cambio en la secuencia de una proteína con referencia a una secuencia de proteína precursora. Una mutación puede referirse a una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido, a una inserción o a una deleción de uno o más restos de aminoácidos. Específicamente, una mutación también puede ser el reemplazo de un aminoácido con un aminoácido no natural, o con un aminoácido modificado químicamente o restos similares. Una mutación también puede ser un truncamiento (por ejemplo, una deleción o interrupción) en una secuencia o una subsecuencia de la secuencia precursora. Una mutación también puede ser una adición de una subsecuencia (por ejemplo, dos o más aminoácidos en un tramo, que se insertan entre dos aminoácidos contiguos en una secuencia proteica precursora) dentro de una proteína, o en cualquier extremo terminal de una proteína, aumentando así la longitud de la proteína (o alargándola). Se puede hacer una mutación modificando la secuencia de ADN correspondiente en la proteína precursora. Las mutaciones pueden introducirse en una secuencia de proteínas mediante métodos conocidos en la materia, por ejemplo, creando secuencias sintéticas de ADN que codifican la mutación con referencia a proteínas precursoras, o alterando químicamente la propia proteína. Una proteína "mutante", como se usa en el presente documento, es una proteína que comprende una mutación. Por ejemplo, también es posible crear un mutante, reemplazando una parte de una tioesterasa con una secuencia de tipo silvestre que corresponde a dicha parte, pero que incluye una variación deseada en una posición específica que se produce de manera natural en la secuencia de tipo silvestre.

Un "equivalente natural", en el contexto de la presente invención, se refiere a una tioesterasa natural, o a una parte de la misma, que comprende un resto natural, en donde el resto natural corresponde a una mutación en 'TesA (por ejemplo, una mutación en la SEC ID NO: 31 de la FIG. 58) que ha introducido una propiedad alterada deseable para 'TesA. En la FIG. 55 se proporcionan ejemplos de tioesterasas equivalentes naturales que tienen dichas modificaciones.

La expresión "unido operativamente", en el contexto de una secuencia de polinucleótidos, se refiere a la colocación de una secuencia de polinucleótidos en una relación funcional con otra secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, un ADN que codifica un líder de secreción (por ejemplo, un péptido señal) está unido operativamente a un a Dn que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido. Un promotor o p o te n c ia d o r es tá un ido o p e ra tiva m e n te a una s e cu e n c ia c o d ifica n te si a fe c ta a la tra n s c r ip c ió n de la secu en c ia . Un s itio de un ión al rib oso m a está un ido o p e ra tiva m e n te a una se cu e n c ia co d ifica n te si es tá c o lo ca d o de m a n e ra que fa c ilite la tra d u cc ió n . En genera l, "u n id o o p e ra tiva m e n te " s ig n ifica que las se cu e n c ia s de A D N que están un idas son co n tig u a s y, en el caso de un líde r de secre c ió n , co n tig u o y en el m ism o m arco de lectura.

La e xp re s ió n "re g ió n o p e ró n " se re fie re a un g ru p o de ge ne s co n tig u o s que se tra n s c r ib e n com o una so la un id ad de tra n sc r ip c ió n a p a rtir de un p ro m o to r com ún, y po r lo ta n to su je to a reg u lac ió n con jun ta . En a lgunos aspec tos , el op e rón in c luye un gen regu lado r.

La e xp res ión "a lin e a m ie n to óp tim o", se re fie re al a lin e a m ie n to que da la pun tua c ió n de a lin e a m ie n to g lob a l m ás alta. El té rm in o "o rtó lo g o s " o la exp res ión "g e n e s o rtó log os", se re fie ren a ge ne s en d ife re n te s esp e c ie s que han e v o lu c io n a d o a p a rtir de un gen an ce s tra l com ún po r esp ec iac ió n . N o rm a lm e n te , los o rtó lo g o s con se rva n la m ism a fu n c ió n d u ra n te e l tra n s c u rs o de la e vo lu c ió n . La id e n tifica c ió n de o rtó lo g o s e n cu e n tra uso en la p re d icc ió n f ia b le de la fun c ión gén ica en g e n o m a s rec ién se cu en c iad os .

La "s o b re e x p re s ió n " de una cé lu la h o sp e d a d o ra o una cé lu la h o sp e d a d o ra "so b re xp re sa d a ", se p ro du ce si la e n z im a se exp resa en la cé lu la a un n ive l m ás a lto que el n ive l en dond e se exp resa en una cé lu la de t ip o s ilves tre co rre spo nd ien te .

El té rm in o "p a rá lo g o " o la exp res ión "g en es pa rá logo s" se re fie ren a genes que están re la c io n a d o s po r du p licac ión d e n tro de un genom a. M ie n tras que los o rtó lo g o s con se rva n la m ism a fu n c ió n en el cu rso de la evo lu c ión , los p a rá lo g o s d e sa rro lla n nu eva s fu n c io n e s , a u n q u e a lg u n a s fu n c io n e s a m en ud o están re la c io n a d a s con las o rig ina les . C o m o e je m p lo s de genes pa rá logo s se inc luyen , pero sin lim itac ión , genes que cod ifica n la m io g lo b ina y la he m og lob in a , que su rg en de l m ism o a n te p a sa d o a n tigu o pero que e vo lu c io n a ro n pa ra te n e r d ife ren te s fun c ion es . La exp res ión "co e fic ie n te de rep a rto " s ig n ifica la co n ce n tra c ió n de e q u ilib rio de un co m p u e s to en una fa se o rg án ica d iv id ida en tre la co n ce n tra c ió n en eq u ilib rio en una fase acu osa (p o r e jem p lo , en un ca ldo de fe rm e n ta c ió n ). En un a sp e c to del s is tem a b ifá s ico de sc rito en el p re sen te docum e n to , la fase o rg án ica está fo rm a d a po r el de riva do de ác ido g raso d u ran te el p roceso de p roducc ión . En de te rm in a d a s c ircu ns tan c ias , ta m b ié n puede p ro p o rc io n a rse una fase o rgán ica , po r e jem p lo , para fa c ilita r la sep a ra c ión de l p roduc to , puede p ro p o rc io n a rse una cap a de o c ta no al ca ldo de fe rm e n ta c ió n . C u ando se de sc rib e un s is tem a de dos fases, el coe fic ie n te de reparto , P, g e n e ra lm e n te se expone en té rm in o s de logP. Un co m p u e s to con un logP de 1 te n d ría un rep a rto de 10: 1 en la fase o rgán ica . Un c o m p u e s to con un logP de -1 te n d ría un rep a rto de 1:10 en la fase o rgán ica . A l e le g ir un ca ldo de fe rm e n ta c ió n y una fa se o rg á n ic a a d e cu a d o s , un d e riva d o de ác ido g ra so con un v a lo r logP a lto se se p a ra rá en la fa se o rg á n ica in c luso a c o n ce n tra c io n e s m uy ba jas en el rec ip ie n te de fe rm en tac ió n .

Las e x p re s io n e s "p o rce n ta je de id en tidad de se cu e n c ia " "p o rce n ta je (% ) de id en tidad de se cu e n c ia de am ino ác id os ", "p o rce n ta je de id en tidad de se cu e n c ia gén ica ", y /o "p o rce n ta je de id en tidad de se cu e n c ia de p o lin uc leó tidos ", con resp ec to a dos se cu e n c ia s de po lip ép tido s , p o lin u c le ó tid o s y /o de genes (seg ún co rre spo nda ), se re fie ren al po rcen ta je de restos que son idén ticos en las dos se cu e n c ia s cuando las s e cu e n c ia s están a line ad as de m anera óp tim a . P o r lo tan to , una id en tidad de se cu e n c ia de a m in o á c id o s de 80 % s ig n ifica que, en dos s e cu e n c ia s de po lip é p tid o s a lin e a d a s óp tim am e n te , el 80 % de los a m in o á c id o s son idén ticos.

El té rm in o "p lá sm id o " se re fie re a una con s tru cc ió n de A D N b ica ten a rio (bc) c ircu la r que se u tiliza com o v e c to r de c lo na c ión , y que fo rm a un e lem e n to ge n é tico a u to rre p lica n te e x tra c ro m o s ó m ic o en a lg u n o s e u ca rio ta s o p ro ca rio tas , o se in te g ra en el c ro m o so m a de l hospedador.

La e xp re s ió n " tio e s te ra s a p re cu rso ra " se re fie re a una p ro te ín a t io e s te ra s a de la que pu ede o b te n e rse la tio e s te ra s a m u tan te de la d ivu lg ac ión , a tra vé s de, po r e jem p lo , m ed io s re co m b in a n te s o qu ím icos . Son e je m p lo s de t io e s te ra sa s p re cu rso ras las t io e s te ra sa s na tu ra les o de t ip o s ilves tre que p roceden de p lan tas, an im a le s o m ic ro b io s . U na tio e s te ra s a p re cu rso ra ta m b ié n pu e d e s e r una tio e s te ra s a no na tu ra l. Un e jem p lo de una tio e s te ra s a no na tu ra l es una t io e s te ra sa fab ricad a , po r e jem p lo , m ed ia n te m u ta c ió n a lea to ria , s ín tes is qu ím ica , evo luc ión m o lecu la r, o m u ta g é n e s is d ir ig ida a s itio , que puede s e rv ir com o un pun to de pa rtida útil desde el cua l d is e ñ a r y/o c re a r las tio e s te ra s a s m u tan tes de la d ivu lg ac ión .

Un "ce b a d o r" es un o ligo nu c le ó tido , p ro du c ido de m an e ra na tu ra l, co m o en una m ue s tra de d iges tión pu rifica da por res tricc ión , o p ro du c ido s in té ticam e n te , que es cap az de a c tu a r com o un pun to de in ic io de s ín tes is cu a n d o se co loca en co n d ic io n e s en las que se induce la s ín te s is de un p ro du c to de ex te ns ió n c e b a d o r que es c o m p le m e n ta rio a una cad en a de p o lin u c le ó tid o s de re fe renc ia . Las co n d ic io n e s a d ecu ad as inc luyen , po r e jem p lo , la p resenc ia de nu c le ó tid o s y de un agen te in d u c to r ta l com o una A D N po lim e rasa , y una te m p e ra tu ra y un pH adecuados . P re fe re n te m e n te , para o b te n e r una e fica c ia m áx im a en la am p lifica c ió n , un c e b a d o r es m on oca te na rio , pero, com o a lte rna tiva , pued e s e r b ica ten a rio . Si es b ica te n a rio (do b le cadena), un c e b a d o r pued e tra ta rs e p rim e ro para se p a ra r sus cad en as an tes de u tiliza rlo para p re p a ra r p ro du c to s de ex te ns ió n . En asp ec tos pa rticu la res , un c e b a d o r es un o lig o d e so x irr ib o n u c le ó tid o . En c ie rto s asp e c to s p re fe ridos , un c e b a d o r es lo s u fic ie n te m e n te la rgo co m o pa ra in ic ia r la s ín te s is de p ro du c to s de ex te ns ió n en p re sen c ia de un agen te induc to r. Las lo n g itu d e s exa c tas de los ce b a d o re s d e p e n d e rá n de d ive rso s fa c to re s , in c lu ye n d o la te m p e ra tu ra , la fu e n te de l ceb ad o r, y de los m é to d o s u tiliza d o s para la a m p lifica c ió n .

El té rm in o "so n d a " se re fie re a un o lig o n u c le ó tid o , p ro d u c id o de m an e ra na tu ra l com o en una d iges tión p u rifica da po r res tricc ión o p ro du c ido de m an e ra s in té tica , re co m b in a n te o m ed ia n te am p lifica c ió n po r PCR, que es capaz de h ib rid a rse con o tro o lig o n u c le ó tid o de in te rés. Una son da puede s e r m o n o ca te n a ria o b ica tenaria . Las sondas son ú tiles en la de tecc ió n , id e n tifica c ió n y a is la m ie n to de s e cu e n c ia s g e né ticas pa rticu la res . S e co n tem p la que c u a lq u ie r so n d a u tilizad a en la p re se n te d ivu lg a c ió n se m arq ue con cu a lq u ie r "m o lé cu la in d ica do ra ", po r lo que se rá de te c ta b le en cu a lq u ie r s is tem a de de tecc ión , inc luyendo , pero sin lim itac ión , s is te m a s e n z im á tico s (p o r e jem p lo , ensayos de t ip o E L IS A u o tros e n sayo s h is to q u ím ico s ba sad os en enz im as), flu o re sce n te s , ra d io a c tivo s y lu m in iscen te s . No se p re te nd e lim ita r la p re sen te inven c ión a n ingún s is te m a o m arca je de de tecc ió n pa rticu la r.

Un "h o s p e d a d o r de p ro du cc ión " es una cé lu la u tiliza d a pa ra p ro d u c ir p ro du c to s . T a l com o se d e sve la en el p re se n te do cum e n to , un h o sp e d a d o r de p ro du cc ión se m od ifica para e x p re s a r o s o b re e x p re s a r genes se lecc io na do s , o para te n e r una exp res ión a te nua da de genes se lecc io na do s . C o m o e je m p lo s no lim itan te s de ho sp e d a d o re s de p ro d u cc ió n se in c luye n cé lu la s de p lan tas, an im a les , se re s hum anos, ba c te ria s , le vad u ras , c ia n o b a c te ria s , a lg a s y /o de h o ng os fila m en to sos .

Un "p ro m o to r" es una secu en c ia de p o lin u c le ó tid o s que fu n c io n a para d ir ig ir la tra n s c r ip c ió n de un gen en d irecc ión 3'. En asp e c to s p re fe ridos, el p ro m o to r es ap rop iad o para la cé lu la h o spe da do ra en la que se exp resa el gen diana. El p rom oto r, ju n to con o tras se cu e n c ia s de p o lin u c le ó tid o s reg u la d o ra s de la tra n sc r ip c ió n y de la tradu cc ió n (tam b ién de n o m in a d a s "se cu e n c ia s de con tro l"), es n e cesa rio para e xp re sa r un gen dado. En gene ra l, las s e cu e n c ia s reg u la d o ra s de la tra n sc r ip c ió n y de la tra d u cc ió n inc luyen , pero sin lim itac ión , se cu e n c ia s p rom oto ras, s itio s de un ión a ribosom as, se cu e n c ia s de in ic io y te rm in a c ió n de la tra n sc rip c ió n , s e cu e n c ia s de in ic io y te rm in a c ió n de la tra d u cc ió n y s e cu e n c ia s p o te n c ia d o ra s o ac tiva do ras .

En e u ca rio ta s , los té rm in o s "p ro m o to re s " o "p o te n c ia d o re s " se re fie ren a señ a les de con tro l de la tra n sc rip c ió n . Los p ro m o to re s y p o te n c ia d o re s co n s is te n en m a trice s co rta s de se c u e n c ia s de A D N que in te ra cc io n a n e sp e c ífica m e n te con p ro te ínas ce lu la re s im p lica da s en la tra n sc rip c ió n (M a n ia tis et al., S c ience , 236 :1237 , 1987). S e han a is lado e le m e n to s p ro m o to re s y po te n c ia d o re s de una va rie d a d de fu e n te s euca rio tas , in c luye nd o genes de cé lu las de levadura , insecto , m a m ífe ro y ve g e ta le s . T a m b ié n se han a is lad o e le m e n to s p ro m o to re s y p o te n c ia d o re s de v irus. En p ro ca rio tas ta m b ié n se e n cue n tran e lem e n tos de con tro l an á logo s , ta le s com o p ro m o to re s y p o tenc iad o res . La se lecc ió n de un p ro m o to r y p o te n c ia d o r p a rticu la r de pende de l t ipo de cé lu la u tilizad o para e xp re sa r la p ro te ína de in te rés. A lg u n o s p ro m o to re s y po te n c ia d o re s e u ca rio tas y p ro ca rio tas tien en una am p lia gam a de cé lu las h o sp e d a d o ra s de p ro du cc ión , m ie n tra s que o tros son fu n c io n a le s en un s u b co n ju n to lim itado de cé lu las h o sp e d a d o ra s de p ro du cc ión (véase, por ejemplo, V oss e t al., T re n d s B iochem . Sci., 11 :287 , 1986; Maniatis et al., 1987, a n te rio rm e n te c itado). Las e xp res ione s "e le m e n to p ro m oto r", "p rom o to re s ", o "se cu e n c ia p rom oto ra ", se re fie ren a una s e cu e n c ia de A D N que fu n c io n a co m o un in te rru p to r que a c tiva la e xp re s ió n de un gen. Si el gen está ac tivado , se d ice que se transc ribe , o que pa rtic ipa en la tra n sc rip c ió n . La tra n sc rip c ió n im p lica la s ín tes is de A R N m a p a rtir de l gen. P o r lo tan to , el p rom oto r, s irve com o un e le m e n to re g u la d o r de la tra n sc r ip c ió n y tam b ién p ro p o rc io n a un sitio para el in ic io de la tra n sc r ip c ió n del gen en el A R N m .

El té rm in o "p rop ied ad ", en el con tex to de una p ro te ína , se re fie re a cu a lq u ie r ca ra c te rís tica o a tr ib u to de un p o lin u c le ó tid o que pued a se le c c io n a rs e o d e te c ta rse . E stas p ro p ie d a d e s in c luyen , pero sin lim itac ión , una p ro p ieda d que a fe c ta a la un ión a un po lip ép tido , una p ro p ieda d con fe rid a a una cé lu la que co m p re n d e un po lin uc leó tido pa rticu la r, una p rop iedad que a fe c ta a la tra n sc rip c ió n de ge ne s (p o r e jem p lo , fu e rza de l p rom oto r, reco no c im ie n to de l p rom oto r, reg u lac ió n de l p rom oto r, fu n c ió n po tenc iad o ra ), una p rop iedad que a fe c ta al p ro ce sa m ie n to de A R N (p o r e jem p lo , corte y e m p a lm e de A R N , e s ta b ilida d de A R N , c o n fo rm a c ió n de A R N , y m od ifica c ión po s tra n sc rip c io n a l), una p rop iedad que a fe c ta a la tra d u cc ió n (p o r e jem p lo , n ivel, reg u lac ió n , un ión de A R N m a p ro te ín a s r ib osó m icas , m o d ifica c ió n p o s tra du cc ion a l). P o r e jem p lo , un s itio de un ión pa ra un fa c to r de tra n sc rip c ió n , una po lim e rasa , un fa c to r regu lado r, y s im ila res , de un p o lin uc leó tido , puede a lte ra rse para p ro d u c ir ca ra c te rís tica s d e se a d a s o para id e n tifica r ca ra c te rís tica s no deseab les .

El té rm in o "p ro p ie d a d ", en el co n te x to de una p ro te ína , se re fie re a cu a lq u ie r ca ra c te rís tica o a tr ib u to de una p ro te ína que pued a s e le cc io n a rse o de tec ta rse .

En el p re sen te docum e n to , los té rm in o s "p ro te ín a " y "p o lip é p tid o " se u tilizan in d is tin tam en te . A lo la rgo de la p re sen te d ivu lg ac ión , para los res tos de am ino ác id os , se u tiliza el cód ig o de 3 le tras as í com o el cód ig o de 1 le tra co m o se de fin e de c o n fo rm id a d con la C o m is ió n C o n ju n ta sob re N o m e n c la tu ra B io q u ím ica (JC B N ) de la IU P A C -IU B . T a m b ié n se en tiende que, deb ido a la de ge ne ra c ió n de l cód ig o gené tico , m ás de una secu en c ia de p o lin uc leó tidos pued e un c o d ifica r un po lipép tido . U na e n z im a es una pro te ína .

En el p re sen te d o cum e n to , los té rm in o s "re n d im ie n to p ro p o rc io n a l" y "re n d im ie n to po rcen tu a l" se u tilizan in d is tin tam en te . S e re fie ren a la can tidad de un p roduc to de sea do en re lac ió n con o tros p roduc tos que están den tro de la m ism a m ezc la p ro du c ida po r un h o s p e d a d o r re co m b in a n te de la p resen te d ivu lg ac ión . P o r e jem p lo , el re n d im ie n to p ro p o rc io n a l de un p ro du c to de sea do puede m e jo ra rse de m odo que sea m ás p re do m ina n te sob re los o tros c o m p o n e n te s en la m ezc la de l p ro du c to para re d u c ir la ca rg a de la pu rifica c ión . En o tro e jem p lo , el ren d im ien to p ro p o rc io n a l de un p ro du c to no de sea do (es decir, un com p o n e n te que d e be rá e lim in a rse de l p ro du c to de sea do ) puede re d u c irse de m od o que sea m en os p re do m ina n te sob re el co m p o n e n te de sea do en la m ezc la de l p roducto para lo g ra r el m ism o fin. En el p resen te d o cu m e n to los ren d im ien to s p ro p o rc io n a le s se exp resan en fo rm a de "X fre n te a o tros de riva d o s de ác idos g rasos", que com p ara n la can tidad de X, que es un tipo de de riva do de ác ido g ra so (p o r e jem p lo , un é s te r g raso , un d e riva d o de á c id o g ra so de una lo ng itud de ca d e n a pa rticu la r), y la exp res ión "o tro s de riva dos de ác idos g ra sos" s ig n ifica la can tidad a ñ ad ida de to d o s los de m ás de riva dos de ác ido s grasos d is tin to s de X que se p ro du cen en el m ism o e xp e rim e n to , cu ltivo o c ic lo de fe rm en tac ió n .

El té rm in o "p ro se q u e n c ia " se re fie re a una secu en c ia de am in o á c id o s e n tre la se cu e n c ia seña l y la p ro te ína m adura que es ne cesa ria para la sec re c ió n de la p ro te ína . La esc is ión de la p ro se cu e n c ia puede c o n d u c ir a una p ro te ín a /e n z im a a c tiva m adura en c ie rta s c ircu n s ta n c ia s y co n d ic io n e s ad ecu ad as .

El té rm in o "re co m b in a n te " cu a n d o se usa para m o d ifica r el té rm in o "cé lu la " o "ve c to r" en el p resen te docum e n to , se re fie re a una cé lu la o a un v e c to r que se ha m o d ifica d o in tro d u c ie n d o una s e cu e n c ia de p o lin u c le ó tid o s he te ró loga , o que la cé lu la p rocede de una cé lu la que se ha m od ifica do de esta m anera . P o r tan to , po r e jem p lo , las cé lu las re co m b in a n te s exp resan ge ne s que no se en cu e n tra n en la m ism a fo rm a de n tro de la fo rm a na tiva (no re co m b in a n te ) de las cé lu las o, com o resu ltad o de una in te rve n c ió n hu m an a in te nc iona da , exp resan genes na tivos que, de lo con tra rio , se exp resan de fo rm a anóm a la , se in fra exp resan o no se exp resan en abso lu to . Los té rm in o s "re co m b in a c ió n " "re co m b in a n d o " y la g e ne rac ió n de un po lin u c le ó tid o "re co m b in a d o ", se re fie ren g e n e ra lm e n te al e n sa m b la je de dos o m ás fra g m e n to s de p o lin u c le ó tid o s en dond e el e n sa m b la je da lu g a r a un po lin uc leó tido q u im é rico fa b rica d o a p a rtir de las pa rtes en sam b lad as .

Las e xp re s io n e s "se g m e n to reg u lado r", "se c u e n c ia s re g u la d o ra s ", o "se c u e n c ia de con tro l de e xp res ión ", se re fie ren a una se cu e n c ia de p o lin u c le ó tid o s que es tá un ida o p e ra tiva m e n te a o tra s e cu e n c ia de p o lin u c le ó tid o s que cod ifica la secu en c ia de a m in o á c id o s de una cad en a de po lip é p tid o s para e fe c tu a r la exp res ión de esa se cu e n c ia de a m in o á c id o s cod ifica da . La se cu e n c ia re g u la d o ra puede inh ib ir, rep rim ir, p rom ove r, o in c luso d ir ig ir la exp res ión de la se cu e n c ia de p o lin u c le ó tid o s un ida o p e ra tiva m e n te que cod ifica la se cu e n c ia de am ino ác id os .

Las exp re s io n e s "m a rc a d o r de se le cc ió n " o "m a rc a d o r se lec tivo ", se re fie ren a un p o lin uc leó tido (p o r e jem p lo , un ge n ) ca p a z de e xp re sa rse en una cé lu la h o spe da do ra , lo que pe rm ite fa c ilita r la se lecc ió n de aq u e llo s h o sp e d a d o re s que con tien en el vec to r. C o m o e jem p los de m arca d o re s de se lecc ió n se inc luyen , en tre o tros, m a rca do res a n tim ic ro b ia n o s . P o r tan to , la e xp re s ió n "m a rc a d o r de se le cc ió n " se re fie re a un gen que p ro p o rc io n a una in d ica c ió n cu a n d o una cé lu la h o sp e d a d o ra ha ca p ta d o una se cu e n c ia e n tra n te de in te rés o cu a n d o se ha p ro d u c id o a lgu na otra reacc ión . N o rm a lm e n te , los m a rca d o re s de se lecc ió n son genes que con fie re n res is te nc ia a n tim ic ro b ia n a o una v e n ta ja m e ta b ó lica en las cé lu las ho sp e d a d o ra s para p e rm itir que las cé lu la s que con tien en las secu en c ias e xó ge na s se d is tin g a n de las cé lu la s que no han rec ib id o las s e cu e n c ia s exógenas . Un "m a rc a d o r de se lecc ión res ide n te " es uno que se lo ca liza en el c ro m o so m a de l m ic ro o rg a n ism o que se va a trans fo rm a r. Un m a rca d o r de se lecc ió n res iden te co d ifica un gen que es d ife re n te de l m a rc a d o r de se le cc ió n en la con s tru cc ió n tra n s fo rm a d o ra . Los e xp e rto s en la m a te ria conocen m a rca d o re s se lec tivo s . C o m o se in d icó an te rio rm e n te , a d e cu a d a m e n te el m a rc a d o r es un m a rc a d o r res is te n te a a n tim ic ro b ia n o s , in c luye nd o , po r e jem p lo , a m p R; f le o R; e s p e c R; k a n R; e r iR; te tR; c m p R; y n e oR. V éa se , po r e jem p lo , G u e ro t-F le u ry , G ene, 167 :335 -337 , 1995; P a lm ero s e t al., G ene, 247 :255 -264, 2000 ; y T r ie u -C u o t e t al., G ene, 23 :331 -341 , 1983. O tro s m a rca d o re s ú tiles de acu e rd o con la d ivu lg ac ión inc luyen, pero s in lim itac ión , m a rca d o re s a u xo tro fos , ta le s com o trip tó fa n o ; y m a rca d o re s de d e tecc ió n , ta le s com o 6-g a la c to s ida sa .

La exp res ión "se cu e n c ia de nu c le ó tido s que cod ifica un m a rc a d o r de se le cc ió n " se re fie re a una secu en c ia de p o lin u c le ó tid o s que es cap az de e xp resa rse en las cé lu las ho sp e d a d o ra s y donde la exp res ión del m a rc a d o r de se lecc ió n co n fie re a las cé lu las que con tienen el gen exp resa do , la cap ac idad de c re c e r en p re sen c ia de un agen te se le c tivo co rre sp o n d ie n te o en a u se n c ia de uno o m ás nu trien te s esenc ia les .

U na "se cu e n c ia seña l" o "p ép tido señ a l" se re fie re a una se cu e n c ia de po lin u c le ó tid o s o de am in o á c id o s que pa rtic ip a en la secre c ió n de las fo rm a s m a d u ra o p re cu rso ra de una p ro te ína . Esta de fin ic ión de se cu e n c ia señ a l es fun c ion a l, y s ig n ifica que in c luye to d a s aq u e lla s se cu e n c ia s de a m in o á c id o s c o d ifica d a s po r la pa rte N -te rm ina l del gen de la p ro te ína , que pa rtic ip an en la rea liza c ió n de la sec re c ió n de p ro te ínas . A m enudo , pero no g lob a lm e n te , es tá n u n id as a la pa rte N -te rm in a l de una p ro te ín a o a la pa rte N -te rm in a l de una p ro te ína p re cu rso ra . La se cu e n c ia señ a l puede s e r e n d ó ge na o exógena . La se cu e n c ia señ a l puede s e r una que no rm a lm e n te está aso c ia d a con la p ro te ína (p o r e jem p lo , t io e s te ra sa ), o puede s e r una o rig in a d a o que p rocede de un gen que co d ifica o tra p ro te ína sec re ta da . Una secu en c ia seña l exó ge na e je m p la r com p ren de los s ie te p rim e ros res tos de a m in o á c id o s de la se cu e n c ia seña l de sub tilis in a de Bacillus subtilis fu s io n a d a con el resto de la secu en c ia seña l de la sub tilis ina de Bacillus lentus (A T C C 21536). O tra s e cu e n c ia señ a l e je m p la r c o m p re n d e la s e cu e n c ia seña l de T e s A que se e lim in a para p ro d u c ir 'TesA .

La exp res ión "su s ta n c ia lm e n te id én ticos", en el con tex to de dos po lin u c le ó tid o s o dos po lip ép tido s , se re fie re a un po lin u c le ó tid o o a un p o lip ép tido que com p ren de una id en tidad de secu en c ia de al m en os 70 %, po r e jem p lo , al m en os 75 %, al m en os 80 %, al m en os 85 %, al m en os 90 %, al m enos 91 %, al m en os 92 %, al m en os 93 %, al m en os 94 %, al m en os 95 %, al m en os 96 %, al m en os 97 %, al m en os 98 % o al m en os 99 % de id en tidad de se cu e n c ia en c o m p a ra c ió n con una se cu e n c ia de re fe re nc ia u tiliza n d o los p ro g ra m as o a lg o ritm o s (p o r e jem p lo , B LA S T, A L IG N , C L U S T A L ) u tilizan do p a rám e tro s es tánda r. Una in d ica c ió n de que dos po lip ép tido s son su s ta n c ia lm e n te id é n tico s puede s e r que el p r im e r p o lip ép tido te n g a in m u n o rre a c tiv id a d c ru za d a con el seg un do po lip ép tido . N o rm a lm e n te , los po lip ép tido s que d ifie ren po r su s titu c io n e s de a m ino ác id os con se rva tivas , tien en in m u n o rre a c tiv id a d c ruzada . P o r tan to , un p o lip é p tid o es s u s ta n c ia lm e n te idén tico a un seg un do po lipép tido , por e jem p lo , cuando los dos pé p tid os d ifie ren so lo en una su s titu c ió n con se rva tiva . O tra in d ica c ió n de que dos s e cu e n c ia s de p o lin u c le ó tid o s son su s ta n c ia lm e n te idén ticas es que las dos m o lécu las se h ib rid an en tre s í en co n d ic io n e s rig u rosa s (p o r e jem p lo , en un in te rva lo de r ig u ros ida d m ed io a m áxim o).

M o lécu las "su s ta n c ia lm e n te p u rifica das" s ig n ifica m o lécu las que al m en os a p ro x im a d a m e n te en un 60 %, p re fe re n te m e n te al m en os a p ro x im a d a m e n te en un 75 %, a p ro x im a d a m e n te en un 80 %, a p ro x im a d a m e n te en un 85 % y m ás p re fe re n te m e n te al m en os a p ro x im a d a m e n te en un 90 %, carecen de o tros c o m p o n e n te s con los que es tá n a s o c ia d o s de fo rm a na tu ra l. T a l co m o se usa en el p re se n te do cu m e n to , los té rm in o s "p u rif ic a d o " o "pu rifica r", ta m b ié n se re fie ren a la e lim in a c ió n de co n ta m in a n te s de una m uestra . P o r e jem p lo , la e lim in a c ió n de co n ta m in a n te s pued e p ro d u c ir un a u m e n to en el p o rce n ta je de d e riva d o s de á c id o s g ra so s de in te rés en una m uestra . P o r e jem p lo , de sp u é s de que los de riva dos de ác idos g ra sos se exp resen en cé lu la s ho sp e d a d o ra s de p ro du cc ión de p lan tas, bac te rias , le va d u ra s o m am ífe ros , los d e riva d o s de ác ido s g ra sos pueden p u rifica rse , po r e jem p lo , m ed ian te e lim in a c ió n de p ro te ínas de la cé lu la h o spe da do ra de p ro du cc ión . Esta e tapa , d e n o m in a d a ta m b ié n e tapa de recu pe rac ió n , im p lica la se p a ra c ió n y el p ro ce sa m ie n to de la com p o s ic ió n de d e riva d o s de ác ido s g ra sos de m odo que la com p o s ic ió n sea útil en a p lica c io n e s in du s tria le s , po r e jem p lo , com o co m b u s tib le o p ro du c to qu ím ico . D e spu és de la pu rifica c ión , el po rcen ta je de d e riva d o s de ác ido s g ra sos en la m ue s tra se aum en ta . El té rm in o p u rif ica d o no requ ie re pu reza ab so lu ta ; m ás bien, se en tiende com o un té rm in o re la tivo . P o r tan to , po r e jem p lo , una p re pa rac ió n de de riva do de ác ido g raso p u rifica do es una en la que el p ro du c to está m ás co n ce n tra d o que el p ro du c to en su e n to rno de n tro de una cé lu la . P o r e jem p lo , un é s te r g ra so pu rifica do es uno que es tá s u s ta n c ia lm e n te se p a ra d o de c o m p o n e n te s ce lu la re s (p o r e jem p lo , p o lin u c le ó tid o s , líp idos, h id ra to s de c a rb o n o y o tros p é p tid o s ) que pueden aco m p a ñ a rlo . En o tro e jem p lo , una p re pa rac ió n de é s te r g raso pu rifica do es una en la que el é s te r graso ca re ce su s ta n c ia lm e n te de c o n ta m in a n te s , co m o los que puede h a b e r de sp u é s de la fe rm e n ta c ió n . P o r e jem p lo , se d ice que un é s te r g ra so está "p u rif ica d o " cu a n d o al m en os a p ro x im a d a m e n te el 50 % en peso de una m u e s tra está c o m p u e s to po r el é s te r graso . En o tro e jem p lo , cua nd o al m en os a p ro x im a d a m e n te el 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % o m ás en peso de una m u e s tra está com p ue s to po r el é s te r graso.

"S u s titu c ió n " s ig n ifica re e m p la z a r un a m in o á c id o en la se cu e n c ia de una p ro te ína p re cu rso ra con o tro a m in o á c id o en una pos ic ión pa rticu la r, da n d o com o resu ltad o un m u tan te de la p ro te ína p re cu rso ra . El am in o á c id o u tilizado com o su s titu to puede se r un a m in o á c id o na tura l, o pued e s e r un a m in o á c id o s in té tico o no na tura l.

El té rm in o "te n s io a c tivo s " se re fie re a su s ta n c ia s que son ca p a ce s de re d u c ir la te n s ió n su p e rfic ia l de un líqu id o en do nde se d isue lven . N o rm a lm e n te , se co m p o n e n de una cab eza s o lu b le en ag ua y de una cadena o co la de h id ro ca rbu ro . La cabeza so lub le en agua es h id ró fila y puede s e r ión ica o no ión ica . La cad en a de h id ro ca rbu ro es h id ró foba . Los te n s io a c tivo s se u tilizan en una va rie d a d de p roduc tos , in c luye nd o de te rg e n te s y lim p ia do res , y ta m b ié n se u tilizan com o a u x ilia re s para tex tile s , cue ro y pape l, en p ro ceso s qu ím icos , en p ro du c to s co sm é tico s y fa rm a cé u tico s , en la in du s tria a lim en ta ria , en la ag ricu ltu ra , y en la recu pe rac ió n de ace ites . A de m ás , pueden u tiliza rse para a yu d a r en la ex tracc ión y el a is la m ie n to de ace ites c rud os que se e n cue n tran en en to rno s de d ifíc il acce so o en e m u ls io n e s de agua. H ay cua tro tip o s de te n s io a c tiv o s c a ra c te riza d o s po r d ife ren te s usos. Los te n s io a c tiv o s an ió n ico s tien en una ac tiv idad s im ila r al de te rge n te y se u tilizan ge n e ra lm e n te para ap lica c io n e s de lim p ieza . Los te n s io a c tiv o s ca tió n icos con tien en h id ro ca rb u ro s de cad en a la rga y a m en ud o se u tilizan para tra ta r p ro te ín a s y p o lím e ro s s in té tico s o son c o m p o n e n te s de s u a v iz a n te s pa ra te jid o s y a co n d ic io n a d o re s pa ra el cabe llo . Los te n s io a c tivo s an fó te ro s ta m b ié n con tien en h id ro ca rb u ro s de cad en a la rga y no rm a lm e n te u tilizan en cham pús. Los te n s io a c tiv o s no ió n ico s a m en ud o se u tilizan en p ro du c to s de lim pieza.

El té rm in o "s in ta sa " se re fie re a una en z im a que ca ta liza un p ro ceso de s ín tes is . T a l com o se usa en el p resen te do cum e n to , el té rm in o "s in ta sa " in c luye s in ta sa s y s in te tasas .

La exp res ión "p ro p ie d a d d ian a " se re fie re a una p ro p ieda d del gen de pa rtida que se p re te n d e a lte rar.

El té rm in o "tio e s te ra sa " se re fie re a una en z im a que tien e ac tiv id a d tio e s te ra sa . Las tio e s te ra s a s inc luyen t io é s te r h id ro lasa s , que se id e n tifica n co m o m ie m b ro s de la C la s ifica c ió n de E nz im as , EC 3.1.2 , y que p u ed en o b te n e rs e de una v a rie d a d de fuen tes . P o r e jem p lo , en V o e lk e r y D av ies, J. Bact., Vol., 176, n.° 23, págs. 7320 -27 , 1994 y en las pa ten tes de E s tad os U n idos n.° 5.667.997 y n.° 5.455.167 , se de sc rib en t io e s te ra sa s ve g e ta le s . Las t io e s te ra sa s ta m b ié n pu ed en o b te n e rse de fu e n te s m ic ro b ia na s , ta le s co m o las d e sc rita s en A ko h e t al., P rog. L ip id Res., vo l. 43, n.° 6, págs. 534 -52 , 2004 ; D icz fa lu sy y A le xso n , A rch . B iochem . B iophys., vo l. 334, n.° 1, págs. 104-12, 1996; La rson y K o la ttukudy , A rch . B iochem . B iophys., vo l. 237, n.° 1, págs. 27 -37 , 1985; Law son et al., B io che m is try , vo l. 33, n.° 32, págs. 9382 -88 , 1994; Lee e t al., Eur. J. B iochem ., vo l. 184, n.° 1, págs. 21 -28 , 1989; N a gg e rt e t al., J. Biol. C hem ., vo l. 266, n.° 17, págs. 11044-50 , 1991; N ie e t al., B io che m is try , vo l. 47, n.° 29, págs. 7744 -51 ,2008 ; S ea y y Luek ing , B io che m is try , vo l. 25, n.° 9, págs. 2480 -85 , 1986; S p e n ce r e t al., J. Biol. C hem ., vo l. 253, n.° 17, págs.

5922 -26 , 1978; y en Z h u a n g et al., B io che m is try , vol. 47, n.° 9, págs. 2789 -96 , 2008. T am b ién pueden ob tene rse t io e s te ra sa s , po r e jem p lo , de c ia n o b a c te ria s , a lgas, m am ífe ros , in sec tos y hongos. Una tio e s te ra sa puede te n e r ac tiv ida d d is tin ta de ac tiv idad tio e s te ra sa , po r e jem p lo , ac tiv idad p ro te o lítica o ac tiv ida d de h id ró lis is de é s te r y ox ígeno . Una tio e s te ra sa pa rticu la rm e n te útil es la en z im a 'T e sA (o t io e s te ra sa I) de E. coli, que es una ve rs ión tru n c a d a de la e n z im a T e s A se rin a t io e s te ra s a T e s A de lo ng itud c o m p le ta que se de sc rib e en C ho y C ronan , J. B io l. C hem ., vo l., 268, n.° 13, págs. 9238 -45 , 1992. Un p o lip ép tido 'T e sA de E. coli c o m p re n d e 182 a m in o á c id o s , y es el p ro d u c to de una re a cc ió n de e sc is ió n en d o n d e se e lim in a la s e c u e n c ia líd e r de 26 a m in o á c id o s de T e s A de E. coli. El p o lip é p tid o 'T e s A de E. coli, po r e jem p lo , t ie n e la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la S E Q ID NO: 31 e xp u e s ta en la FIG. 58.

La exp res ión "a c tiv id a d tio e s te ra s a " se re fie re a la c a p a c id a d de c a ta liz a r una rea cc ió n de esc is ió n de l t io é s te r, que g e n e ra lm e n te im p lica la h id ró lis is de un t io é s te r en un g ru p o tio l en un ác ido y un tio l, pero ta m b ié n pued e in c lu ir una e ta pa de tra n se s te r if ica c ió n en la que se esc inde un en la ce t io é s te r y se fo rm a un nuevo en lace éste r. En genera l, una a c il-A C P tio e s te ra s a es cap az de c a ta liz a r la esc is ión h id ro lítica de tio é s te re s de ac il p ro te ín a tra n s p o rta d o ra de ac ilo y /o tio é s te re s de a c il-co e n z im a A grasa . C o m o e jem p los de e n z im a s que tie n e n ac tiv ida d t io e s te ra s a se in c luye n a ce til-C o A h id ro lasa , p a lm ito il-C o A h id ro lasa , su cc in il-C o A h id ro lasa , fo rm il-C o A h id ro lasa , ac il-C o A h id ro lasa , pa lm ito il-p ro te ín a tio e s te ra s a y ub iq u itin a tio le s te ra sa . La ac tiv ida d t io e s te ra sa puede es ta b le ce rse m ed ia n te cu a lq u ie ra de los s ig u ie n te s ensayos:

Ensayo de hidrólisis de acil-CoA:

P ara p re p a ra r una m ezc la de en sayo com p le ta , se u tiliza un ta m p ó n T ris -H C l, 0,1 M, pH 8,0; P a lm ito il-C o A , 5 pM; D TN B , 0,01 M en ta m p ó n de fo s fa to de po tas io 0,1 M, pH 7,0. P o r tan to , la m ezc la de e n sayo con tien e una c o n ce n tra c ió n fina l de 10 p m o l de ta m p ó n T ris -H C l, pH 8,0, 0 ,05 pm o l de D TN B y 0,01 pm o l de pa lm ito il-C o A . D espués, la m ezc la de e n sayo c o m p le ta se m ezc la con la tio e s te ra sa , en un v o lu m e n fina l de 2 ,0 ml.

La v e lo c id a d de e sc is ió n de l sus tra to a c il-C o A se m ide co n tro la n d o el c a m b io en la a b so rb a n c ia a 405 nm, u tilizan do un co e fic ie n te de ex tin c ió n m o la r de 13 600 M-1 cm -1.

Ensayo in v iv o :

La tio e s te ra sa de in te rés se exp resa en un h o sp e d a d o r adecu ad o , ta l com o E. coli. D e spu és de la exp res ión de la p ro te ína , el cu ltivo se ac id ifica con HCl 1 N hasta un pH fina l de a p ro x im a d a m e n te 2 ,5 y de spu és se ex trae con un m ism o vo lu m e n de a ce ta to de etilo . Los ác ido s g ra sos lib res en la fase o rg á n ica se d e riva tizan con h id ró x ido de te tra m e tila m o n io (T M A H ) para g e n e ra r los és te re s m e tílico s resp ec tivo s , que de sp u é s se ana lizan en un c ro m a tó g ra fo de ga ses d o tado de un d e te c to r de io n iza c ió n de llam a.

Ensayo de hidrólisis de tiolactona:

En p r im e r lugar, se p re pa ra una so luc ió n de rea c tivo que co n tie n e L -h o m o c is te ín a t io la c to n a (L -H cyT ) 25 m M y ác ido 5 ,5 -d itio -b is -2 -n itro b e n z o ic o (D T N B ) 0 ,5 m M en ta m p ó n H E P E S 0,1 M (pH 7,3). D espués, a la so luc ió n de reactivo se la añade en z im a y la h id ró lis is de L -H cyT se con tro la d e te c ta n d o el g rupo tio l lib re con D TN B a 412 nm (£ = 13 600 M-1 cm-1 pa ra el ác ido 5 -tio -2 -n itro b e n zo ico ).

Ensayo de 4-MU-6S-Palm-pGlc:

En p r im e r lugar, se p re pa ra una m ezc la de rea cc ió n que co n tie n e 10 pl de e n z im a tio e s te ra s a y 20 pl de so lu c ió n de sus tra to . La so luc ió n de su s tra to con tien e M U -6 S -P a lm -p -G lc 0 ,64 m M , d itio tre ito l (D T T ) 15 m M , T riton X -100 al 0 ,375 % (p /v ) y 0,1 U de p -g lu co s id a sa de a lm e n d ra s en tam pó n fo s fa to /c itra to de M c llva in , pH 4,0. La m ezc la de rea cc ió n se in cuba d u ra n te 1 hora a 37 °C. S e añad e p -g lu co s id a sa de a lm e n d ra exó g e n a para h id ro liza r el p ro du c to in te rm e d io de reacc ión , M U -6 -tio -p -g lu có s id o , cua n tita tiva m en te . La reacc ión de h id ró lis is fina liza con la ad ic ión de 200 pl de ca rb o n a to de sod io 0 ,5 M, pH 10,7, que con tiene T rito n X -100 al 0 ,025 % y la f lu o re sce n c ia de la 4 -m e tilu m b e life ro n a (M U ) libe ra da se m ide en un flu o ró m e tro (Aex = 372, Aem 445 nm).

Ensayo de lisofosfolipasa:

S e p repa ra una m ezc la de reacc ión que con tiene 10 pl de t io e s te ra sa m ezc lad a con 10 pl de 1 -o leo ilfo s fa tid ile ta n o la m in a 3 m M , 25 pl de T ris -H C l 100 m M (pH 7 ,0 ) y 5 pl de E D T A 5 m M . La reacc ión fin a liza con la ad ic ió n de 1,5 m l de C H C h: C H ³O H (1: 2), seg u ido de la ad ic ió n de agua para lle va r el vo lu m e n acu oso to ta l a 0 ,9 ml. D espués , la fase o rg á n ica se an a liza po r c ro m a to g ra fía de capa fina ju n to con pa tro ne s a d ecu ad os , u tilizan do p lacas p re p a ra d a s con 40 g de ge l de s ílice H su sp e n d id o en 95 m l de te tra b o ra to de sod io 1 m M . El s is tem a d iso lve n te co n s is te en C H C l.³:C H ³O H :H ²O (95 :35 :5 ).

Ensayo de sustrato de proteasa:

S e p re pa ra una m ezc la de reacc ión que con tien e 10 pl de e n z im a m ezc lad a con 800 pl de T ris -H C l 12,5 m M (pH 8 ,0 ) que co n tie n e T ritó n X -100 al 0 ,25 % y 10 |jl de C b z -P h e -O N p d isu e lto en D M S O . El p -n itro fen o l libe ra do a tra vé s de la esc is ión del sus tra to se m ide c o n tro la n d o la a b so rb a n c ia a 405 nm.

Ensayo de hidrólisis de acil-PNP graso:

En p r im e r lugar, se p re pa ra una so luc ió n de rea c tivo que co n tie n e T riton X -100 al 2 % en fo s fa to de sod io 50 m M , pH 7 ,0 y C i²-p -n itro fe n o l (a c il-P N P ) 10 m M en ace tona . D espués, se p re pa ra una so luc ió n de tra b a jo de C ¹²-P N P m e zc la n d o 600 j l de C ¹²-P N P 10 m M en un ta m p ó n fo s fa to de 9 ,4 ml.

El en sayo se rea liza añad ien do , a cada poc illo de una p laca de 96 poc illos , 40 j l de la so luc ió n de tra b a jo de ac il-PN P , seg u ido de la ráp ida ad ic ión de 40 j l de enz im a . La so luc ión se m ezc la du ran te 15 se g un do s y el cam b io de a b so rb a n c ia se lee a 405 nm en un le c to r de p lacas de m ic ro titu lac ión a una te m p e ra tu ra de 25 °C.

Formación de éster a partir de tioéster:

S e p re p a ra una m e zc la de rea cc ió n que co n tie n e e n z im a tio e s te ra s a 1,5 jM , m ir is to il-C o A 100 jM , m e tan o l a l 10 % (v /v ) y fo s fa to de sod io 50 m M , a un pH de 7,0. La m ezc la de reacc ión se in cub a du ran te 1 hora a 20 °C y fina liza con la a d ic ió n de H C l 1 N pa ra d is m in u ir el pH a a p ro x im a d a m e n te 2 ,5. La m ezc la se e x tra e con un m ism o vo lu m e n de a ce ta to de e tilo y la can tidad de é s te r g ra so p ro d u c id a se d e te rm in a m e d ia n te G C -M S u o tros m é to d o s e s tá n d a r ta le s com o G C -F ID , LC -M S , o c ro m a to g ra fía en cap a fina.

Formación de éster a partir de éster:

S e p re pa ra una m ezc la de reacc ión que con tiene e n z im a tio e s te ra sa 1,5 jM , la u ro il-C o A 300 jM , m e tan o l al 10 % (v /v ) y fo s fa to de sod io 50 m M , a un pH de 7,0. La m ezc la de reacc ión se in cub a du ran te 1 hora a 20 °C y fina liza con la a d ic ió n de H C l 1 N pa ra d is m in u ir e l pH a a p ro x im a d a m e n te 2 ,5. La m e zc la se e x tra e con un m ism o vo lu m e n de a ce ta to de e tilo y la can tida d de lauril é s te r p ro du c ida se de te rm in a m ed ia n te G C -M S u o tros m é tod os e s tá n d a r ta le s com o G C -F ID , LC -M S , o c ro m a to g ra fía en cap a fina.

Las e xp res ione s cé lu la " tra n s fo rm a d a " o "tra n s fo rm a d a de m an e ra estab le ", se re fie ren a una cé lu la que tien e una se cu e n c ia de p o lin u c le ó tid o s no na tiva (h e te ró lo g a ) in te g ra da en su g e no m a o com o un p lásm ido ep iso m a l que se co n se rva d u ran te al m en os dos ge ne rac io ne s .

La e xp res ión "p ro te ín a tra n s p o rta d o ra " se re fie re a una p ro te ína que fac ilita el m o v im ie n to de uno o m ás co m p u e s to s de n tro y /o fue ra de un o rg an ism o u o rgánu lo . En a lgu nos aspec tos , el h o sp e d a d o r de p roducc ión e xp resa rá fu n c io n a lm e n te una se cu e n c ia de A D N exó g e n a que cod ifica una p ro te ína tra n s p o rta d o ra de ca se te s de un ión a A T P (A B C , ATP-Binding Cassette) de m odo que d icho h o s p e d a d o r e xp o rte el d e riva d o de ác ido g ra so al m ed io de cu ltivo . Las p ro te ínas tra n sp o rta d o ra s de A B C se en cue n tran en m uchos o rg an ism os, ta le s com o Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thaliana, Alcaligenes eutrophus (p o s te rio rm e n te ren om b rado com o Ralstonia eutropha) o R h od ococcu s e ry th ro p o lis . C o m o e je m p lo s no lim ita tivo s de p ro te ín a s tra n s p o rta d o ra s de A B C se in c luye n C E R 5, A tM R P 5 , A m iS 2 y A tP G P 1. En un a sp e c to p re fe rid o , la p ro te ín a tra n s p o rta d o ra de A B C es C E R 5 (p o r e jem p lo , A Y 734542 ). En o tros asp ec tos , la p ro te ína tra n sp o rta d o ra es una p ro te ína de sa lida s e le cc io n a d a de: A crA B , T o lC o A c rE F de E. coli o tll1618 , t ll1619 y t ll0139 de Thermosynechococcus elongatus BP-1. En asp e c to s ad ic io na le s , la p ro te ína tra n s p o rta d o ra es una p ro te ín a tra n s p o rta d o ra de ác ido s g ra so s (F A T P , fatty acid transport protein) s e le c c io n a d a de Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Mycobacterium tuberculosis o Saccharomyces cerevisiae o de cu a lq u ie ra de las F A TP de m am ífe ros con oc idas en la m a te ria . Las p ro te ínas tra n sp o rta d o ra s son útiles, por e jem p lo , para m e jo ra r la sec re c ió n o libe ra c ió n de p ro du c to s que de otro m od o no son cap ace s de se c re ta r e sp o n tá n e a m e n te el p roducto . T am b ién son ú tiles cu a n d o las cé lu las ho sp e d a d o ra s g e n o m a n ip u la d a s son capaces de s e c re ta r o lib e ra r e s p o n tá n e a m e n te el p roducto , a u nq ue lo libe ren le n tam e n te o de m an e ra in com p le ta . En esas c ircu n s ta n c ia s , las p ro te ínas tra n s p o rta d o ra s pu ed en m e jo ra r la sec re c ió n al a c e le ra r la e ta pa de sec re c ió n o lle va r a cab o la sec re c ió n hasta su fina liza c ió n .

En el p re sen te d o cum e n to , los té rm in o s "va ria n te " y "m u ta n te " se u tilizan in d is tin tam en te .

Un "ve c to r" se re fie re a una co n s tru cc ió n p o lin u c le o tíd ica d ise ñ a d a pa ra in tro d u c ir p o lin u c le ó tid o s en uno o m ás tipo s de cé lu las . Los ve c to re s inc luyen ve c to re s de c lonac ión , ve c to re s de exp res ión , ve c to re s lanzadera , p lásm idos, ca se te s y s im ila res . En a lg u n o s aspec tos , la co n s tru cc ió n p o lin u c le o tíd ica co m p re n d e una s e cu e n c ia p o lin u c le o tíd ica que co d ifica una tio e s te ra sa (p o r e jem p lo , una t io e s te ra s a p re cu rso ra o m ad u ra ) que está un ida o p e ra tiva m e n te a una p ro secu enc ia a d ecu ad a (p o r e jem p lo , una p ro se cu e n c ia se c re to ra ) cap az de e fe c tu a r la exp res ión del po lin u c le ó tid o o gen en un h o sp e d a d o r adecuado .

U na "ce ra " es una su s ta n c ia que com p ren de , al m en os en parte, és te res g rasos. En d e te rm in a d o s aspec tos , un é s te r g raso tien e un lado A y un lado B, c o m p re n d ie n d o cada uno de e llos ca d e n a s de c a rb o n o m e d ia n a s y la rgas. A d e m á s de és te res grasos, una cera puede co m p re n d e r o tros co m p on en te s . P o r e jem p lo , una ce ra puede co m p re n d e r h id ro ca rbu ros , és te res de este ro l, a lde h ído s a lifá ticos, a lcoh o le s , ce tonas , be ta -d ice ton as , tr ia c ilg lic e ro le s y s im ila res . N o rm a lm e n te , una ce ra es un só lido a te m p e ra tu ra am b ie n te , po r e jem p lo , a 20 °C.

"T ip o s ilves tre " s ign ifica , en el con tex to de un gen o una p ro te ína , una se cu e n c ia de p o lin u c le ó tid o s o de p ro te ínas que se p ro du ce en la na tu ra leza . En a lgu nos aspec tos , la secu en c ia de t ip o s ilves tre se re fie re a una secu en c ia de in te rés que es un pu n to de pa rtida para el d iseño de p ro te ínas m ed ia n te in ge n ie ría gené tica .

Producción de derivados de ácidos grasos

De acu e rd o con un asp ec to de la p resen te d ivu lg ac ión , las nuevas tio e s te ra s a s se exp resa n en una cé lu la h o sp e d a d o ra que es cap az de tra n s fo rm a r una fue n te de ca rb on o en un de riva do de ác ido graso . La d ivu lg ac ión se re fie re a dos a sp e c to s d is tin tos : (1) el d e scu b rim ie n to de que pu ede u tiliza rse una t io e s te ra s a m u tan te para o p tim iza r y /o "d ise ñ a r" una com p o s ic ió n de de riva do de ác ido g ra so para h a ce r que d ichas co m p o s ic io n e s sean m ás ú tiles y que d ife re n te s m u ta c io n e s p ro po rc ion en d ife ren te s p ro p ieda de s d iana ; y (2) el d e scu b rim ie n to de que la t io e s te ra sa ac tu a rá en una cé lu la h o sp e d a d o ra re co m b in a n te para p ro d u c ir d ire c ta m e n te p ro du c to s de é s te r graso, sin la p re se n c ia de una e n z im a ce ra s in ta sa o é s te r s in tasa .

De a cu e rd o con un aspecto , las com p o s ic io n e s de de riva dos de ác ido s g rasos p ro du c ida s según los m é todos, los ve c to re s y las cé lu la s del p re sen te do cum e n to , tie n e n p ro p ie d a d e s m o d ifica d a s o a lte rad as en com p a ra c ió n con los d e riva d o s de ác ido s g rasos p ro du c ido s u tilizan do cé lu las ho sp e d a d o ra s que no com p ren den las va r ia n te s de t io e s te ra sa de la d ivu lg ac ión . P o r e jem p lo , com o ta m b ié n se d e sc rib e en el p re sen te d o cum e n to , u tilizan do las tio e s te ra s a s de la p re sen te d ivu lg ac ión , es pos ib le d e s a rro lla r p ro ceso s de fa b rica c ió n que p ro du zcan de riva dos de ác ido s grasos, que, en com p a ra c ió n con un p ro ceso s im ila r que im p liq ue una t io e s te ra sa de t ip o s ilves tre , tien e pe rfile s de com p o s ic ió n a lte rados , po r e jem p lo , po rcen ta jes a lte rad os de una serie de, o de un g ru po ac ilo de long itud de cadena de ca rb on o espec ífica , g ru po s ac ilo sa tu ra do s o in sa tu ra dos , pos ic ión de in sa tu ra c ion es , g rupos ac ilo ram ificados , pos ic ión de ram ificac ió n , g ru po s h id ro x ilo -ac ilo , g ru po s ce to -ac ilo , p ropo rc ión de és te res o ác idos g ra sos lib res en el p roducto , p ropo rc ión de de riva dos de ác ido s g rasos de cadena corta (p o r e jem p lo , C8, Cg, C ¹⁰, C ¹¹, C ¹², C ¹³y /o C ¹⁴) fren te a cadena la rga (p o r e jem p lo , C ¹⁵, Cía, C ¹⁷, C ¹⁸, C igy /o C ²⁰), o re n d im ie n to de de riva dos de ác ido s g rasos. P o r co n s ig u ie n te , pu eden g e n o m a n ip u la rs e p ro d u c to s con d ive rsa s p ro p ie d a d e s de sea b le s , de ta l m an e ra que te n g a n nú m ero s de cetano , índ ices de oc tano , e s ta b ilid a d ox ida tiva , lub ric idad , pun tos de in flam ac ión , v isco s id a d , p u n tos de e b u llic ión , pu n tos de fus ió n , p u n tos de flu idez , p u n tos de e n tu rb a m ie n to , pu n to de o b s tru cc ió n de l filtro en frío , ca ra c te rís tica s de flu jo en frío , a ro m a tic id a d y /o nú m ero s de yo d o op tim iza dos .

Los d e riva d o s de ác ido s g ra sos son ú tiles com o, o com o c o m p o n e n te s de, b io co m b u s tib le s y p ro du c to s qu ím icos e sp ec ia lizad os . Los de riva d o s de ác ido s g rasos y los p ro du c to s fa b rica d o s a pa rtir de e llos inc luyen com b ustib les , ad itivo s de com b ustib le , a le a c io n e s de com b us tib le , d e te rg e n te s y te n s io a c tivo s , co m p le m e n to s nu tric iona les , po lím eros , ree m p la zos de pa ra fina , lu b rica n tes , d iso lve n tes , p ro du c to s para el cu ida do pe rsona l, ad itivo s de p ro ce sa m ie n to de caucho , in h ib id o res de co rros ión , e m u ls io na n tes , p lás ticos, te jido s , cosm é ticos , p ro du c to s de pape l, recu b rim ien to s , líqu id os para la m e ta lu rg ia , d ie lé c tricos , en g ra sa n te s y e m o lie n tes . Los m é to d o s y co m p o s ic io n e s d e s v e la d o s en es te d o cu m e n to p e rm iten la p ro d u cc ió n de d e riva d o s de á c id o s g ra so s con p u n tos de ram ificac ió n , n ive les de sa tu ra c ió n y long itud de la cad en a de ca rbono , pa rticu la res . Los m é tod os y co m p o s ic io n e s de este d o cu m e n to ta m b ié n pe rm iten la p ro du cc ión de una m a yo r p ro po rc ión de és te res g ra sos fren te a o tros p roduc tos , o com o a lte rna tiva , una m e n o r p ro po rc ión de éste res g ra so s fre n te a o tros p roductos, de p e n d ie n d o de si es d e se a b le un m a yo r re n d im ie n to p ro p o rc io n a l o po rcen tu a l de és te re s g ra sos o un m e n o r re n d im ie n to p ro p o rc io n a l o po rcen tu a l de és te res grasos. E spe c íficam en te , po r e jem p lo , los m é tod os y c o m p o s ic io n e s de este d o cum e n to pe rm iten la p ro du cc ión de una m a yo r p ro po rc ión de és te res de ác ido s g ra sos fre n te a ác ido s g ra sos lib res, o en o tras pa lab ras, pe rm iten un m a yo r ren d im ie n to p ro p o rc io n a l o po rcen tu a l de é s te re s de ác ido s g ra sos fre n te a ác idos g ra sos lib res. C o m o a lte rna tiva , po r e jem p lo , los m é tod os y com p o s ic io n e s de este d o cu m e n to pe rm iten la p ro d u cc ió n de una p ro po rc ión m ás pe q u e ñ a de és te re s de ác ido s g ra sos fre n te a ác ido s g ra so s lib res, cu a n d o no se desean g ra n d e s ca n tid a d e s de és te re s de ác ido s g rasos. A s im ism o , los m é tod os y c o m p o s ic io n e s de este d o cu m e n to pe rm iten la p ro du cc ión de un re n d im ie n to m e jo rad o de de riva d o s de ác ido s grasos.

C o m o e je m p lo s no lim ita tivo s de m ic ro o rg a n ism o s que pueden u tiliza rse com o ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión para p ro d u c ir de riva dos de ác idos g ra sos se inc luyen c ia no bac te rias , a lgas, bacte rias , le vad u ras u hongos fila m en to sos . O tro s e jem p los no lim itan te s de ho sp e d a d o re s de p roducc ión ad e cu a d o s in c luyen cé lu las ve g e ta le s , an im a le s o hum anas.

Los h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión d e sc rito s en es te do cu m e n to , pu ed en p ro d u c ir a lco h o le s (de cad en a corta , cad en a la rga , ram ificada o insa tu ra da ). D ichos a lcoh o le s pueden u tiliza rse d ire c ta m e n te com o co m b u s tib le s o pueden u tiliza rse para c re a r un é s te r graso. Los és te res g rasos, so los o en com b in ac ió n con o tros de riva dos de ác idos g ra sos de sc rito s en el p resen te do cu m e n to , ta m b ié n son ú tiles com o co m b u s tib le s o com o c o m p o n e n te s de com b us tib les .

De m an era s im ila r, los h id ro ca rb u ro s p ro d u c id o s a p a rtir de los h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión d e sc rito s en el p re sen te do cu m e n to , pu ed en u tiliza rse co m o b io co m b u s tib le s o com o c o m p o n e n te s de b io co m b u s tib le s . D ichos co m b u s tib le s ba sad os en h id ro ca rb u ro s pueden d ise ñ a rse pa ra que con teng an co n te n e r pu n tos de ram ificac ió n , g ra do s de sa tu ra c ió n d e fin id o s y lo ng itude s de ca rb o n o esp ec íficas , u tilizan do las en se ñ a n za s p ro p o rc io n a d a s en este do cu m e n to . C u a n d o se u tilizan com o b io co m b u s tib le s so los o en co m b in a c ió n con o tros d e riva d o s de ác ido s grasos, los h id ro ca rbu ros pueden co m b in a rse con ad itivo s a d ecu ad os u o tros co m b u s tib le s tra d ic io n a le s (p o r e jem p lo , a lcoh o le s , d iése l p ro ce d e n te de tr ig lic é r id o s y co m b u s tib le s ba sa d o s en pe tró leo).

El nú m ero de ce ta n o (N C ), la v isco s id a d , el pun to de fu s ió n y el c a lo r de com b us tió n de d ive rso s és te res g ra sos se han ca ra c te riza d o en K no the , Fuel P roce ss in g T e ch n o lo g y 86 :1059 -1070 , 2005. Un h o sp e d a d o r de p roducc ión puede g e n o m a n ip u la rs e para p ro d u c ir cu a lq u ie ra de los é s te re s g ra sos d e sc rito s en Knothe, u tilizan do las e n se ñ a n za s p ro p o rc io n a d a s en este docum en to .

I. Producción de derivados de ácidos grasos y modificaciones para mejorar la producción/rendimiento El h o s p e d a d o r de p ro du cc ión u tilizado para p ro d u c ir a c il-C o A y /o d e riva d o s de ác ido s g ra sos pued e m o d ifica rse de fo rm a re co m b in a n te para que in c luya se cu e n c ia s de p o lin u c le ó tid o s que sob re e xp re se n pép tidos . P o r e jem p lo , el h o s p e d a d o r de p roducc ión puede m o d ifica rse para a u m e n ta r la p roducc ión de a c il-C o A y re d u c ir el ca ta b o lism o de d e riva d o s de ác ido s g ra sos y de p ro du c to s in te rm e d io s en la ruta b ios in té tica de ác idos grasos, o para re d u c ir la in h ib ic ión po r re tro a lim e n ta c ió n en pun tos e sp e c ífico s de la ru ta b ios in té tica de ác idos grasos. A d e m á s de m o d ifica r los ge ne s d e sc rito s en el p re se n te do cu m e n to , se pu ed en d e d ic a r re cu rso s c e lu la re s a d ic io n a le s pa ra s o b re p ro d u c ir ác ido s g rasos. P o r e jem p lo , las ru tas de lac ta to , su cc in a to y /o ace ta to p u ed en a te nua rse , y la a ce til-C o A ca rb ox ilasa (acc) puede sob re e xp re sa rse . Las m od ifica c io n e s en el h o sp e d a d o r de p ro du cc ión de sc ritas en el p resen te d o cu m e n to pu ed en re a liza rse a tra v é s de a lte ra c io n e s g e nó m icas , ad ic ión de s is te m a s de e xp res ión reco m b in an te , o co m b in a c io n e s de las m ism as. P o r e jem p lo , una o m ás t io e s te ra sa s en d ó g e n a s de un h o s p e d a d o r de p roducc ión p a rticu la r pueden m o d ifica rse u tilizan do té c n ic a s ad e cu a d a s de m od o que el t io é s te r m u ta n te te n g a al m en os una p ro p ieda d a lte ra d a en c o m p a ra c ió n con el p re cu rso r de t io e s te ra s a e n dó ge no , o de m o d o que la cé lu la h o sp e d a d o ra m u e s tre al m en os una p rop iedad a lte rada , en com p a ra c ió n con la m ism a cé lu la ho spe d a d o ra an tes de que esté su je ta a las e ta pas de a lte rac ión genóm ica .

Las ru tas b ios in té ticas de ác idos g ra sos im p lica da s se ilus tran en las FIGS. 2-5. Los s ig u ie n tes su b a p a rta d o s A -G de sc rib en las e ta pas en estas rutas. D ive rsas e n z im a s ca ta lizan d ive rsas e ta pas en la ruta. P o r con s ig u ie n te , cada e ta pa es un po s ib le lu g a r para la so b re e xp re s ió n de l gen pa ra p ro d u c ir m ás una o m ás e n z im a s y, po r lo tan to , im p u ls a r la p ro du cc ión de m ás ác idos g ra sos y de riva d o s de ác ido s grasos. T am b ién pueden añ a d irse genes que cod ifiq uen las en z im a s ne cesa rias para la ru ta de m an e ra re co m b in a n te a un h o s p e d a d o r de p ro du cc ión que ca re zca de d ich a s enz im as. P o r ú ltim o, para a u m e n ta r la p ro du cc ión de los p ro du c to s de sea do s , las e ta pas que co m p e tiría n con la ru ta que co n d u ce a la p ro du cc ión de ác ido s g ra sos y de riva dos de ác ido s g ra sos pueden a te n u a rse o b loquea rse .

De acu e rd o con las d ivu lg a c io n e s de este do cu m e n to , un exp erto en la m a te ria puede u tiliz a r las tio e s te ra s a s de la d ivu lg a c ió n para p re p a ra r m ic ro o rg a n ism o s que p roduzcan d e riva d o s de ác ido s g ra sos y para fa b ric a r d ive rsos d e riva d o s de ác ido s g ra sos u tiliza n d o d icho s m ic ro o rg a n ism o s , en dond e d icho s de riva dos de ác ido s g ra sos tienen p ro p ieda de s a lte rad as . T a m b ié n es pos ib le p re p a ra r m ic ro o rg a n ism o s que p ro du zcan d icho s d e riva d o s de ác idos g ra sos de m a n e ra m ás e ficaz al te n e r los n ive les de ren d im ien to , p ro du c tiv ida d o títu lo desea do s , du ran te las fe rm e n ta c io n e s .

A. Acetil-CoA - Malonil-CoA a Acil-ACP

La ác ido g ra so s in ta sa (F A S ) es un g ru po de pé p tid o s que c a ta liza el in ic io y el a la rg a m ie n to de las ca d e n a s de ac ilo (M a rra kch i e t al., B io che m ica l S oc ie ty , 30 :1050 -1055 , 2002 ). La p ro te ína tra n s p o rta d o ra de ac ilo (A C P ), ju n to con las en z im a s de la ru ta FAS, con tro la n la long itud , el g ra do de sa tu ra c ió n y la ram ificac ió n de los ác ido s grasos p ro du c ido s . Las e ta pas de es ta ru ta están c a ta liza d a s po r e n z im a s de las fa m ilia s de genes de la b ios ín tes is de ác ido s g ra sos (fab) y a c e til-C o A ca rb o x ila sa (acc). D e pe nd ien do de l p ro du c to deseado , uno o m ás de estos genes pueden e s ta r a te n u a d o s o sob ree xp resa do s .

I. R u ta b ios in té tica de ác ido s g rasos: a ce til-C o A o m a lo n il-C o A a ac il-A C P

La ru ta b io s in té tica de ác ido s g ra sos en el h o s p e d a d o r de p ro du cc ión u tiliza la a ce til-C o A y m a lo n il-C o A precu rso ras . Las e ta pas de esta ru ta están ca ta liza d a s po r en z im a s de las fa m ilia s de genes de la b ios ín tes is de ác ido s g rasos (fab) y a c e til-C o A c a rb o x ila sa (acc). E sta ru ta se de sc rib e en H eath e t al., P rog. L ip id Res., 40 (6 ):467 -97 , 2001. La a ce til-C o A ca rb o x ila sa (Acc, una e n z im a con m ú ltip le s su b u n id a d e s co d ifica d a po r cua tro genes d is tin tos , accABCD) ca rb o x ila la a ce til-C o A para fo rm a r m a lon il-C o A . La m a lon il-C o A : A C P tra n s a c ila s a (F a b D ) tra n s fie re el g ru po m a lo n a to a A C P para fo rm a r m a lon il-A C P . D espués, se p roduce una reacc ión de con d e n sa c ió n , donde la m a lo n il-A C P se fu s io n a con la ace til-C o A , dando com o resu ltad o la p -ce to ac il-A C P . La p -ce to a c il-A C P s in ta sa III (F a b H ) in ic ia el c ic lo FAS, m ie n tras que la p -ce to a c il-A C P s in ta sa I (F a b B ) y la p -ce to a c il-A C P s in ta sa II (F abF ) es tán im p lica d a s en c ic los pos te rio res .

A co n tin u a c ió n , se rep ite un c ic lo de e ta p a s ha s ta o b te n e r un á c id o g ra so sa tu ra d o de lo ng itud a p rop iad a . En p rim er lugar, la N A D P H reduce la p -ce to a c il-A C P para fo rm a r p -h id ro x ia c il-A C P . Esta e tapa la ca ta liza la p -ce to a c il-A C P red u c ta sa (FabG ). D espués, la p -h id ro x ia c il-A C P se de sh id ra ta para fo rm a r tra n s -2 -e n o il-A C P . La p -h id ro x ia c il-A C P d e s h id ra ta s a /is o m e ra s a (F a b A ) o la p -h id ro x ia c il-A C P d e s h id ra ta sa (F abZ ) ca ta liza n esta e tapa . La tra n s -2 -e n o ilA C P re d u c ta sa I, II o III (F ab I, FabK , o FabL , re sp e c tiva m e n te ) d e p e n d ie n te de N A D P H , red uce la tra n s -2 -e n o il-A C P para fo rm a r ac il-A C P . Los c ic los po s te rio res se in ic ian a tra vé s de la co n d e n sa c ió n de m a lon il-A C P con ac il-A C P m ed ia n te la p -ce to a c il-A C P s in ta sa I o la p -ce to a c il-A C P s in ta sa II (F abB o FabF, resp ec tiva m en te ).

II. M od ifica c ió n de la ru ta b io s in té tica de ác ido s g ra sos para a u m e n ta r la p ro du cc ión de ac il-A C P

Los o rg a n ism o s ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión pueden g e n o m a n ip u la rse para s o b re p ro d u c ir a ce til-C o A y m a lo n il-C oA . D ichos o rg a n ism o s ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión inc luyen cé lu las ve g e ta le s , an im a les o hum anas. C om o h o sp e d a d o re s de p roducc ión pueden u tiliza rse m ic ro o rg a n ism o s ta le s com o c ia n o b a c te ria s , a lgas, bacterias, le va d u ra s u hongos fila m en to sos . C om o e je m p lo s no lim ita tivos de m ic ro o rg a n ism o s que pueden u tiliza rse com o h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión se in c luyen E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Candida lipolytica, Synechococcus, Synechocystis, Clamydomonas, Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins, Acinetobacter sp. cepa M-1, Candida lipolytica, y o tros m ic ro o rg a n ism o s o lea g in oso s . P ara o b te n e r una m a y o r p ro du cc ión de a ce til-C o A /m a lo n il-C o A /á c id o s g ra sos y d e riva d o s de ác ido s g rasos, se pueden h a ce r va r ia s m od ifica c io n e s d ife ren te s , ya sea en co m b in a c ió n o in d iv idu a lm e n te , en el h o s p e d a d o r de p roducc ión .

P o r e jem p lo , para a u m e n ta r la p ro d u cc ió n de ace til-C o A , en un h o sp e d a d o r de p ro du cc ión puede exp resa rse uno o m ás de los s ig u ie n te s genes: pdh, panK, aceEF (que cod ifica el co m p o n e n te E 1p d e s h id ro g e n a sa y el com p o n e n te E 2p d ih id ro lip o a m id a a c iltra n s fe ra sa de los com p le jos de p iruva to y 2 -o xo g lu ta ra to de sh id ro g e n a sa ), fabH, fabD, fabG, acpP y fabF. En o tros e jem p los , en el h o s p e d a d o r de p ro du cc ión pueden exp re sa rse ge ne s a d ic io n a le s que co d ifica n a c il-C o A re d u c ta sa s g ra sas y a ld e h id o de sca rb o x ila sa s . En la m a te ria se sabe que puede co n s tru irse un p lásm id o que con te n g a uno o m ás de los genes m e n c io n a d o s a n te rio rm en te , to d o s e llos ba jo el con tro l de un p ro m o to r co n s titu tivo , o de o tro m odo, con tro la b le . En los p a ré n te s is se in d ica n los n ú m e ro s de reg is tro de G e n B a n k e je m p la re s de estos genes: pdh (B A B 34380 , A A C 73227 , A A C 73226 ), panK ( tam b ién con oc ido com o coaA, A A C 76952 ), aceEF (A A C 73227 , A A C 73226 ), fabH (A A C 74175 ), fabD (A A C 74176 ), fabG (A A C 74177 ), acpP (A A C 74178 ) y fab F (A A C 74179 ).

A d ic io n a lm e n te , los n ive les de exp res ión de fadE, gpsA, ldhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA y /o ackB, pueden a te n u a rse o in ac tiva rse en el m ic ro o rg a n ism o g e n o m a n ip u la d o m ed ia n te tra n s fo rm a c ió n con p lásm idos co n d ic io n a lm e n te re p lica tivo s o no re p lica tivo s que con tienen m u ta c io n e s nu las o po r de le c ión de los genes c o rre sp o n d ie n te s , o su s titu ye n d o las s e cu e n c ia s p ro m o to ra s o p o tenc iad o ras . En los p a rén te s is se ind ican los nú m ero s de reg is tro de G e n B a n k e je m p la re s de estos genes: fadE (A A C 73325 ), gspA (A A C 76632 ), ldhA (A A C 74462 ), pflb (A A C 73989 ), adhE (A A C 74323 ), pta (A A C 75357 ), poxB (A A C 73958 ), ackA (A A C 75356 ) y ackB (B A B 81430 ). Los ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión g e n o m a n ip u la d o s re su lta n te s tie n e n n ive les de p ro du cc ión de ace til-C o A au m e n ta d o s cua nd o se cu ltivan en un e n to rno ap rop iado .

A d e m á s , la so b re p ro d u cc ió n de m a lo n il-C o A puede ve rse a fe c ta d a g e n o m a n ip u la n d o el h o s p e d a d o r de p roducc ión co m o se d e sc rib e a n te rio rm e n te con accABCD (p o r e jem p lo , nú m ero de reg is tro A A C 73296 de G en B ank, EC 6.4.1.2 ) in c lu ido en el p lásm id o s in te tiza d o de novo. La s o b re p ro d u cc ió n de ác ido s g ra sos puede rea liza rse in c luye nd o a d ic io n a lm e n te un gen que cod ifica la lipasa (p o r e jem p lo , núm eros de reg is tro C A A 89087 y C A A 98876 de G e n B a n k ) en el p lá sm id o s in te tiza d o de novo.

C o m o resu ltad o , en a lg u n o s e jem p los , una a c e til-C o A ca rb o x ila sa se s o b re e x p re s a pa ra a u m e n ta r su c o n ce n tra c ió n in tra ce lu la r en al m en os a p ro x im a d a m e n te 2 vece s , al m en os a p ro x im a d a m e n te 5 vece s o al m enos a p ro x im a d a m e n te 10 vece s , con resp ec to a los n ive les de exp re s ió n na tivos.

A d e m á s , para a u m e n ta r la can tida d de a c il-C o A d ispon ib le , puede u tiliza rse un m u tan te D 311 E P lsB (p o r e jem p lo , nú m ero de reg is tro A A C 77011 de G enB ank).

A d e m á s , la so b re e xp re s ió n de un gen sfa (s u p re s o r de FabA , po r e jem p lo , nú m ero de reg is tro A A N 79592 de G e n B a n k ) puede in c lu irse en el h o sp e d a d o r de p ro du cc ión para a u m e n ta r la p ro du cc ión de ác idos grasos m o n o in sa tu ra d o s (R o cke t al., J. B ac te rio logy , 178 :5382 -5387 , 1996).

B. Acil-ACP y/o Acil-CoA a éster graso utilizando tioesterasa

En un m od e lo típ ico de p ro ceso m ic ro b ia n o de s ín tes is de á c id o s g rasos, la a c e til-C o A y la m a lo n il-C o A se tra n s fo rm a n a tra vé s de una se rie de e ta pas para fo rm a r las cad en as de ac il-A C P . después , la A c il-A C P se tra n s fo rm a , m ed ia n te una se rie de e ta pas en z im á tica s a lte rna tivas , a d ive rso s p ro du c to s fina les , in c luye nd o d e riva d o s de ác ido s grasos. P o r e jem p lo , no rm a lm e n te , la a c il-A C P se tra n s fo rm a en é s te re s g ra sos m ed ia n te las re a cc io n e s co n se cu tiva s co m b in a d a s de una tio e s te ra sa , una a c il-C o A lig a sa /s in te ta sa y una é s te r s in tasa . Una lim itac ió n al uso com e rc ia l de es ta s e n z im a s en una ru ta m e ta b ó lica es la ne ces idad de p ro d u c ir el sus tra to de acil C o A g ra so a p a rtir de un p re cu rso r de ac il A C P graso , que requ ie re al m e n o s dos e ta pas e n z im á tica s y el gasto de e n e rg ía m e ta b ó lica de dos en laces fo s fo a n h íd rid o s . La p roducc ión d irec ta de és te res g ra sos con t io e s te ra sa m itiga la pé rd ida de A T P ca u sa d a po r es ta s dos e ta pas en z im á ticas . R e c ie n te m e n te se ha d e m o s tra d o que las lipasas (cuyo sus tra to de "a lcoh o l" na tu ra l es el ag ua ) ta m b ié n pueden u tiliza rse in vitro pa ra c a ta liza r la reacc ión de tra n s e s te r if ic a c ió n que p ro d u ce el b iod iése l (es decir, la tra n s fo rm a c ió n de tr ia c il g licé rid o y m e tan o l en é s te r m e tílico de ác ido g raso y g lice ro l). S in em bargo , las lipasa s son g e n e ra lm e n te tó x ica s en las cé lu la s cua nd o se p roducen in tra ce lu la rm en te .

A p e sa r de te n e r una e sp e c ific id a d p u b licad a po r el agua , la p re se n te d ivu lg a c ió n d e sc rib e el d e scu b rim ie n to de que, en p re sen c ia de una can tidad su fic ie n te de a lcoho l, el a lcoh o l puede lle g a r a s e r un sus tra to a ce p tab le para una tio e s te ra sa . En este caso , las t io e s te ra sa s pueden c a ta liz a r la a lcoh o lis is de los p ro du c to s in te rm e d io s de las en z im a s de ac ilo graso , al igua l que hace una lipasa in vitro. P or tan to , en las co n d ic io n e s ad ecu ad as , puede u tiliza rse una en z im a que ace p te un é s te r g ra so com o sus tra to para fo rm a r un p ro du c to in te rm e d ia rio de en z im a g ra sa que po s te rio rm e n te se esc inda po r h id ró lis is o tra n se s te r if ica c ió n para s in te tiz a r és te res de ác ido s grasos d e s e a d o s si se p ro p o rc io n a un n ive l s u fic ie n te de un a lcoh o l a d e cu a d o pa ra a c tiv a r la a lcoh o lis is . C o m o e jem p los de en z im a s que tien en esta cap ac idad , que pueden p ro d u c ir é s te re s d ire c ta m e n te a p a rtir de ac il-A C P se inc luyen , ad e m á s de tio e s te ra sa s , a c iltran s fe rasas , lipasas, es te ra sas y p ro teasas. Las t io e s te ra sa s ú tiles pueden se r t io e s te ra sa s na tu ra les y/o p re cu rso ra s com o se de fine en el p resen te d o cum e n to , o pueden s e r tio e s te ra sa s m u tan tes p re pa rada s según se de sve la en el p re sen te do cum e n to . Un exp erto hab itua l en la m a te ria es capaz de d e te rm in a r la co n ve n ie n c ia de u tiliza r una e n z im a p a rticu la r pa ra p ro d u c ir d ire c ta m e n te é s te re s g ra sos a p a rtir de A c il-A C P . P o r e jem p lo , los e n sa yo s p ro p o rc io n a d o s en el E je m p lo 32 son ú tiles pa ra d e te rm in a r la p ro du cc ión d irec ta de éste r.

S egún este asp e c to de la d ivu lg ac ión , la t io e s te ra sa puede u tiliza rse para p ro d u c ir d ire c ta m e n te é s te re s g ra sos en p re se n c ia o en au se n c ia de una é s te r s in ta sa y /o una ac il C o A lig a sa /s in te ta sa grasa . P o r e jem p lo , la exp res ión de una t io e s te ra s a que puede c a ta liz a r la p ro du cc ión d irec ta de és te res g ra so s en una cepa ho spe d a d o ra re co m b in a n te , pued e u tiliza rse pa ra c o m p le m e n ta r la p ro d u cc ió n de é s te r g ra so do n d e la cep a ta m b ié n exp re sa una é s te r s in tasa . A d ic io n a lm e n te , la exp res ión de una t io e s te ra s a que puede c a ta liz a r la p ro du cc ión d irec ta de éste res g ra sos en una cé lu la h o sp e d a d o ra reco m b in an te , puede u tiliza rse dond e no hay exp res ión de é s te r s in ta sa o ésta e xp res ión es baja.

P uede u tiliza rse una t io e s te ra sa m u tan te que se ha m od ifica do para que te n g a p ro p ieda de s a lte ra d a s en c o m p a ra c ió n con la t io e s te ra s a p recu rso ra .

C. Acil-ACP a ácido graso

I. R u ta b ios in té tica de ác ido s g rasos: a c il-A C P a ác ido s g rasos

T a l com o se ha de sc rito an te rio rm e n te , la a c e til-C o A y la m a lo n il-C o A se p rocesan en va ria s e ta pas para fo rm a r ca d e n a s de ac il-A C P . La e n z im a sn -g lice ro l-3 -fo s fa to a c iltra n s fe ra sa (P lsB ) ca ta liza la tra n s fe re n c ia de un grupo ac ilo de ac il-A C P o a c il-C o A a la po s ic ió n sn-1 de l g lice ro l-3 -fo s fa to . P o r tan to , la P lsB es una e n z im a reg u lado ra c la ve en la s ín tes is de fos fo líp ido s , que fo rm a de la ru ta de los ác ido s g rasos. La inh ib ic ión de P lsB con du ce a un au m e n to en los n ive les de ac il-A C P de cadena larga, cuya re tro a lim e n ta c ió n in h ib irá e ta pas te m p ra n a s en la ruta, que im p lica genes ta le s com o , po r e jem p lo , accABCD, fabHy fabl. El d e sa co p la m ie n to de esta reg u lac ió n , por e jem p lo , po r so b re e xp re s ió n de tio e s te ra sa , co n d u ce a una m a yo r p ro du cc ión de ác ido s grasos.

II. M od ifica c ión de la ruta b ios in té tica de ác ido s g rasos para p ro d u c ir los tip o s d e sea do s o las p ro po rc ion es d e se a d a s de ác ido s g ra sos

S egún la p re sen te d ivu lg ac ión , la tio e s te ra s a e xp resa da tien e p ro p ie d a d e s a lte rad as en com p a ra c ió n con la t io e s te ra s a na tiva o e n d ó ge na en la cepa ho spe da dora . P a ra d is e ñ a r un h o s p e d a d o r de p ro du cc ión para la p ro du cc ión de una po b lac ión h o m og éne a de de riva dos de ác ido s grasos, uno o m ás genes en d ó g e n o s pueden a te n u a rse o de le c ion a rse fu n c io n a lm e n te y, com o resu ltado , pueden e xp re sa rse una o m ás t io e s te ra sa s según la d ivu lg ac ión . P o r e jem p lo , a te n u a n d o una tio e s te ra s a C ¹⁸(p o r e jem p lo , nú m ero s de reg is tro A A C 73596 y P 0A D A 1 de G en B ank), que u tiliza C ¹⁸: ¹-A C P , y exp re sa n d o una tio e s te ra s a a lte rada que tien e una m a y o r e sp ec ific ida d po r y/o ac tiv ida d (p o r e jem p lo , v e lo c id a d ca ta lítica ) con re sp e c to a sus tra to s C ¹⁰(es decir, sus tra to s que com p ren den , cada uno de e llos, una long itud de 10 ca rb o n o s en la cad en a de ca rb on os), pu ed en p ro du c irse de riva dos de ác ido s g ra sos C ¹⁰(es decir, d e riva d o s de ác ido s g ra sos que com p ren den , cada uno de e llos, una long itud de 10 ca rb o n o s en la cad en a de ca rb on os). Esto da com o resu ltad o una po b lac ión m ás ho m o g é n e a de de riva d o s de ác ido s g rasos que tie n e n un a u m en to en ác idos g ra sos que tien en una lo ng itud de 10 ca rb on os en la cadena . En otro e jem plo , a te n u a n d o tio e s te ra s a s en d ó g e n a s que p roducen ác ido s g ra sos n o -C ¹²y exp re sa n d o una tio e s te ra sa a lte rad a que tie n e una m a yo r e sp ec ific ida d po r y /o ac tiv idad (es decir, v e lo c id a d ca ta lítica ) con resp ec to a su s tra to s C ¹², pueden p ro du c irse de riva dos de ác ido s g rasos C ¹². En otro e jem p lo , a te n u a n d o t io e s te ra sa s en d ó g e n a s que p roducen á c id o s g ra so s no C ¹⁴y e x p re s a n d o una tio e s te ra s a a lte ra d a que te n g a una m a y o r e sp e c ific id a d po r y /o ac tiv id a d (es decir, v e lo c id a d ca ta lítica ) con resp ec to a sus tra to s C ¹⁴, pueden p ro du c irse d e riva d o s de ác ido s g ra sos C ¹⁴. En otro e jem p lo , en la m ezc la de l p ro du c to puede o b tene rse un re n d im ie n to p ro p o rc io n a l m ás a lto de d e riva d o s de ác idos g ra so s de ca d e n a co rta (p o r e jem p lo , C8, Cg, C ¹⁰, C ¹¹, C ¹², C ¹³y /o C ¹⁴) fre n te a o tros d e riva d o s de á c id o s g ra so s de cad en a no corta. En otro e jem p lo m ás, en la m ezc la del p ro du c to ta m b ié n puede o b tene rse un ren d im ien to p ro p o rc io n a l m ás ba jo de de riva dos de ác ido s g ra sos de cadena co rta (p o r e jem p lo , C8, Cg, C ¹⁰, C ¹¹, C ¹², C ¹³y/o C ¹⁴) fren te a o tros de riva dos de ác ido s g ra sos no de cadena corta . En un e jem p lo a d ic io na l, exp re sa n d o una t io e s te ra s a a lte ra d a que te n g a ve lo c id a d ca ta lítica y /o p ro d u cc ió n o re n d im ie n to m e jo rad os in vivo, puede p ro du c irse un rendimiento más alto y/o mejorado de derivados de ácidos grasos libres. En otro ejemplo más, aplicando una o más de ciertas mutantes de tioesterasa puede producirse un rendimiento proporcional o porcentual de ésteres grasos más alto o más bajo frente a otros productos, tales como ácidos grasos libres. La sobreproducción de acetil-CoA, malonil-CoA y ácidos grasos puede verificarse utilizando métodos conocidos en la materia, por ejemplo, por precursores radiactivos, HPLC, LC-Ms y GC-MS posteriores a la lisis celular.

En un aspecto alternativo, una tioesterasa de la divulgación puede expresarse dentro de la cepa hospedadora en combinación con una tioesterasa endógena. En otro aspecto alternativo, una o más tioesterasas endógenas pueden modificarse utilizando técnicas de alteración genómica adecuadas que son conocidas por los expertos en la materia, de modo que las tioesterasas mutantes tengan al menos una propiedad alterada en comparación con los precursores de tioesterasa endógenos, y/o de tal manera que la célula hospedadora presente al menos una propiedad alterada en comparación con la célula hospedadora antes de que se apliquen dichas técnicas de alteración genómica.

D. Ácidos grasos en Acil-CoA

I. Transformación de ácidos grasos en acil-CoA

La acil-CoA sintasa (ACS) esterifica ácidos grasos libres a acil-CoA mediante un mecanismo de dos etapas. En primer lugar, el ácido graso libre se transforma en un producto intermedio de acil-AMP (un adenilato) a través de la pirofosforolisis de ATP. Después, el carbono carbonilo activado del adenilato se acopla al grupo tiol de CoA, liberando AMP y el producto final acil-CoA. Véase Shockey et al., Plant Physiol. 129:1710-1722, 2002.

La enzima ACS FadD de E. coli y la proteína de transporte de ácidos grasos Fadl normalmente son componentes importantes de un sistema de absorción de ácidos grasos. Fadl actúa como mediador en el transporte de ácidos grasos en la célula bacteriana, y FadD actúa como mediador en la formación de ésteres de acil-CoA. Cuando no se dispone de otra fuente de carbono, las bacterias absorben los ácidos grasos exógenos y se transforman en ésteres de acil-CoA, que se unen al factor de transcripción FadR y desreprimen la expresión de los genes fad que codifican proteínas responsables del transporte (Fadl), la activación (FadD) y la p-oxidación (FadA, FadB, FadE y FadH) de los ácidos grasos. Cuando se dispone de fuentes de carbono alternativas, las bacterias sintetizan ácidos grasos tales como las acil-ACP, que después se utilizan para la síntesis de fosfolípidos, en lugar de servir como sustratos para la p-oxidación. Por tanto, la acyl-CoA y la acyl-ACP son fuentes independientes de ácidos grasos que conducen a diferentes productos finales. Véase Caviglia et al., J. Biol. Chem., 279(12):1163-1169, 2004.

II. Modificación de la ruta biosintética de ácidos grasos para aumentar la transformación de ácidos grasos a acil-CoA

Los hospedadores de producción pueden genomanipularse utilizando péptidos que se sabe que producen ácidos grasos de diversas longitudes que pueden transformarse en acil-CoA. Un método para producir derivados de ácidos grasos implica aumentar la expresión de, o expresar formas más activas de, uno o más péptidos de acil-CoA sintasa (EC 6.2.1.-).

En la Tabla 1 se muestra una lista de acil-CoA sintasas que pueden expresarse para producir acil-CoA y derivados de ácidos grasos. Estas acil-CoA sintasas pueden examinarse para optimizar cualquier ruta que utilice acil-CoA grasas como sustratos. Utilizando técnicas de bioinformática y genes sintéticos, pueden expresarse genes fadD heterólogos en cepas de producción y evaluar su capacidad para producir biodiésel y posiblemente biocrudo.

Tabla 1: Acil-CoA sintasas

co n tin u a c ió n

En fun c ión de su g rado de s im ilitud con fadD de E. coli, se s e le cc io n a ro n los s ig u ie n te s genes h o m ó logo s para s in te tiza rse y eva lua rse :

fadDD35 de M. tuberculosis H R 7 R v [N P _217021 ].

yh fL de B. subtilis [N P _388908 ].

fadD1 de P. aeruginosa PAO1 [N P _251989 ].

h o m ó logo de fadD, que cod ifica Faa3p de Saccharomyces cerevisiae [N P _012257 ].

C o m o a c il-C o A s in ta sa s de ác ido s g ra sos a d ic io n a le s de o rg a n ism o s euca rio tas , que pu ed en u tiliza rse para p ro d u c ir ac il-C oA , a s í com o de riva dos de ác idos g rasos, se inc luyen las d e sc rita s en S h o cke y e t al., P la n t P hys io l., 129: 1710 -1722 , 2002 (Arabidopsis), C a v ig lia e t al., J. B iol. C hem ., 279: 1163 -1169 , 2004 (ra ta ) y en K no ll e t al., J. Biol. C hem ., 269(23): 16348-56 , 1994 (le vad u ra ). En la té cn ica se conocen se cu e n c ia s gé n icas que cod ifican estas s in te tasas . V éase , po r e jem p lo , Jo h n so n e t al., J. B io l. C hem ., 269: 18037 -18046 , 1994; S h o cke y e t al., P lan t P hys io l., 129: 1710 -1722, 2002 ; B la ck e t al., J. B iol. C hem ., 267: 25513 -25520 , 1992. E stas a c il-C o A s in ta sas eu ca rio tas , a p e sa r de ca re c e r de a lta ho m o lo g ía con s e cu e n c ia s FadD de E. coli, pu ed en co m p le m e n ta r la ac tiv idad de FadD en F adD in ac tiva dos de E. coli.

A. Acyl-CoA en alcohol graso

1. T ra n s fo rm a c ió n de a c il-C o A en a lcoh o l g raso

La a c il-C o A se reduce a un a lde h ído g ra so m ed ia n te una a c il-C o A red u c ta sa de pe n d ie n te de N A D H (p o r e jem p lo , A cr1 ). D espués, el a lde h ído g raso se reduce a un a lco h o l g ra so m ed ia n te una a lco h o l d e sh id ro g e n a sa d e pe nd ien te de N A D P H (p o r e jem p lo , Y qhD ). C om o a lte rna tiva , la a c il-C o A re d u c ta sa fo rm a d o ra de a lcoh o l g ra so (F A R ) ca ta liza la reducc ión de una a c il-C o A en un a lcoh o l g raso y C oA S H . La FAR utiliza N A D H o N A D P H com o un c o fa c to r en esta red ucc ión de cua tro e lec tron es . A u n q u e las rea cc io nes de FA R que ge ne ran a lcoh o l p roceden a tra vé s de un p ro d u c to r in te rm ed io de a ldeh ído , no se libe ra un a ld e h íd o libre. P or tan to , las FAR fo rm a d o ra s de a lcoh o l son d is tin ta s de las e n z im a s que llevan a cabo red u cc io n e s de dos e lec tron es de a c il-C o A y que p roducen a lde h ído g ra so libre com o producto . (V éa se C heng y R usse ll, J. Biol. C hem ., 279 (36 ):37789 -37797 , 2004 ; M etz e t al., P lan t P hys io l., 122 :635-644 , 2000).

2. M od ifica c ión de las ru tas b io s in té tica s de ác ido s g ra sos para a u m e n ta r la tra n s fo rm a c ió n de a c il-C o A en a lcoho l g ra so

Los h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión pueden g e n o m a n ip u la rse u tiliza n d o po lip ép tido s c o n o c id o s para p ro d u c ir a lcoh o le s g ra so s a p a rtir de ac il-C o A . Un m é to d o pa ra p ro d u c ir a lco h o le s g ra so s im p lica a u m e n ta r la e xp re s ió n de, o e xp re sa r fo rm a s m ás ac tiva s de, a c il-C o A re d u c ta sa s fo rm a d o ra s de a lcoh o l g ra so (c o d ific a d a s po r un gen ta l co m o acr1, EC 1.2.1.50 /1.1.1 ), a c il-C o A re d u c ta sa s (E C 1.2.1.50 ) y /o a lcoh o l d e sh id ro g e n a sa s (E C 1.1.1.1).

Los alcoholes grasos se describen a menudo como tensioactivos basados en hidrocarburos. También sirven como componentes adecuados de tensioactivos. Para la producción de tensioactivos, el hospedador de producción se modifica para que produzca un tensioactivo a partir de una fuente de carbono renovable. Dicho hospedador de producción incluye una primera secuencia de polinucleótidos exógena que codifica una proteína capaz de transformar un ácido graso en un aldehído graso y una segunda secuencia de polinucleótidos exógena que codifica una proteína capaz de transformar un aldehído graso en un alcohol. En algunos ejemplos, la primera secuencia de polinucleótidos exógena codifica una reductasa de ácido graso. En un ejemplo, la segunda secuencia de polinucleótidos exógena codifica la aldehído reductasa microsomal de mamífero o la aldehído deshidrogenasa de cadena larga. En un ejemplo adicional, la primera y la segunda secuencia de polinucleótidos exógena son de Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins, Acinetobacter sp. cepa M-1 o Candida lipolytica. En un aspecto, la primera y la segunda secuencia de polinucleótidos heteróloga forman un complejo multienzimático de Acinetobacter sp. cepa M-1 o de Candida lipolytica.

Como fuentes adicionales de secuencias de ADN heterólogas que codifican proteínas transformadoras de ácidos grasos a alcoholes de cadena larga que pueden utilizarse en la producción de tensioactivos se incluyen, pero sin limitación, Mortierella alpina (ATCC 32222), Cryptococcus curvatus, (denominado también Apiotricum curvatum), Alcanivorax jadensis (T9T = DSM 12718 = At c C 700854), Acinetobacter sp. HO1-N (ATCC 14987) y Rhodococcus opacus (PD630 DSMZ 44193).

En un ejemplo, el derivado de ácido graso es un producto tensioactivo saturado o insaturado que, en la cadena de carbono, tiene una longitud de aproximadamente 6 a aproximadamente 36 átomos de carbono, de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 átomos de carbono, de aproximadamente 10 a aproximadamente 26 átomos de carbono, de aproximadamente 12 a aproximadamente 20 átomos de carbono, o de aproximadamente 12 a aproximadamente 16 átomos de carbono. En otro ejemplo, el producto tensioactivo tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 18 átomos de carbono, o de aproximadamente 12 a aproximadamente 14 átomos de carbono en la cadena de carbono.

Los hospedadores de producción adecuados para producir tensioactivos incluyen microorganismos eucariotas o procariotas. Como hospedadores de producciones ejemplares se incluyen Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins, Acinetobacter sp. cepa M-1, Arabidopsis thaliana, Candida lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, cianobacterias, tales como, Synechocystis spp. y Synechococcus spp., algas, tales como, Clamydomonas, y bacterias de E. coli genomanipuladas para sobreexpresar acetil-CoA carboxilasa. También pueden utilizarse hospedadores de producción que demuestran una capacidad innata para sintetizar altos niveles de precursores de tensioactivos en forma de lípidos y aceites, tales como Rhodococcus opacus, Arthrobacter AK 19, Rhodotorula glutinins, E. coli, genomanipuladas para expresar acetil CoA carboxilasa, y otras cianobacterias oleaginosas, bacterias, levaduras y hongos.

B. Alcoholes grasos a ésteres grasos

Los hospedadores de producción pueden genomanipularse utilizando polipéptidos conocidos para producir ésteres grasos de diversas longitudes. Un método para producir ésteres grasos incluye aumentar la expresión de, o expresar formas más activas de, uno o más péptidos de alcohol O-acetiltransferasa (Ec 2.3.1.84). Estos péptidos catalizan la acetilación de un alcohol al transformar una acetil-CoA y un alcohol en una CoA y un éster. En algunos ejemplos, los péptidos de alcohol O-acetiltransferasa pueden expresarse junto con péptidos de tioesterasa seleccionados, péptidos FAS, y péptidos formadores de alcohol graso, permitiendo así controlar las longitudes de la cadena de carbono, los niveles de saturación y los grados de ramificación. En algunos casos, el operón bkd puede coexpresarse para producir precursores de ácidos grasos ramificados.

Tal como se usa en el presente documento, los péptidos de alcohol O-acetiltransferasa incluyen péptidos en la clasificación de enzimas número EC 2.3.1.84, así como cualquier otro péptido capaz de catalizar la transformación de una acetil-CoA y un alcohol para formar una CoA y un éster. Adicionalmente, un experto en la materia apreciará que los péptidos de alcohol O-acetiltransferasa también pueden catalizar otras reacciones.

Por ejemplo, algunos péptidos de alcohol O-acetiltransferasa pueden aceptar otros sustratos además de los alcoholes grasos y/o tioésteres de acetil-CoA, tales como otros alcoholes y otros tioésteres de acil-CoA. Por lo tanto, también se incluyen dichos péptidos de alcohol O-acetiltransferasa no específicos o de divergencias específicas. Diversas secuencias peptídicas de alcohol O-acetiltransferasa están disponibles al público. En la técnica se conocen ensayos para medir la actividad de los péptidos de alcohol O-acetiltransferasa. Además, las O-aciltransferasas pueden genomanipularse para impartir nuevas actividades y/o especificidades para el grupo acilo donador o el grupo alcohol aceptor. Las enzimas genomanipuladas pueden generarse a través de estrategias lógicas y evolutivas bien documentadas.

C. Acil-CoA a Ésteres Grasos

1. Producción de ésteres grasos

Los és te res g ra sos se s in te tizan m ed ia n te una ac il-C oA : a lcoh o l a c iltra n s fe ra sa g rasa (p o r e jem p lo , é s te r s in tasa), que co n ju g a un a lco h o l g ra so de ca d e n a la rga con una a c il-C o A g ra sa m e d ia n te un e n la ce éste r. Las é s te r s in ta sa s y los genes co d ifica n te s son co n o c id o s a p a rtir de la p lan ta de jo jo b a y la bacte ria . Acinetobacter sp. cepa ADP1 (a n te rio rm e n te Acinetobacter calcoaceticus ADP1). La é s te r s in ta sa ba c te ria na es una e n z im a b ifu nc iona l, que m ue s tra ac tiv ida d é s te r s in ta sa y la cap ac idad de fo rm a r tr ia c ilg lice ro le s a p a rtir de sus tra to s de d ia c ilg lice ro l y ac il-C o A g ra sas (ac tiv ida d ac il-C oA : d ig lice ro l a c iltra n s fe ra sa (D G A T )). El gen wax/dgat cod ifica ta n to la é s te r s in tasa co m o la D G A T. V éa se C heng et al., J. Biol. C hem ., 279 (36 ):37798 -37807 , 2004; K a lsch e u e r y S te in bu che l, J. Biol. C hem ., 278 :8075 -8082 , 2003. Las é s te r s in ta sa s ta m b ié n pu eden u tiliza rse pa ra p ro d u c ir c ie rto s és te re s g ra so s que pu ed en u tiliza rse com o com b us tib le , ta l com o b iod iése l, com o se d e sc rib e en este docum e n to .

2. M od ifica c ión de la ruta b ios in té tica de ác ido s g ra sos para p ro d u c ir é s te re s g ra sos u tiliza n d o é s te r s in ta sa

La p ro du cc ión de és te res g rasos, in c luye nd o ceras, a p a rtir de a c il-C o A y a lcoh o le s , puede g e n o m a n ip u la rse u tilizan do po lip é p tid o s con oc idos . Un m étod o para p ro d u c ir é s te re s g ra sos in c luye a u m e n ta r la exp res ión de, o e x p re s a r fo rm as m ás ac tiva s de, una o m ás é s te r s in ta sas (E C 2.3.1.20 , 2.3.1.75 ). D ive rsas se cu e n c ia s pep tíd icas de é s te r s in ta sa están d isp o n ib le s al púb lico . En la pa ten te de E s tad os U n idos N° 7.118.896 , se p ro po rc ion an m é tod os para d e te rm in a r la ac tiv ida d de la é s te r s in tasa .

En de te rm in a d o s aspec tos , si el p ro du c to de sea do es un b io co m b u s tib le basado en éste r, puede m o d ifica rse un h o s p e d a d o r de p ro du cc ión de ta l m a n e ra que p ro d u zca un é s te r a p a rtir de una fue n te de ene rg ía renovab le . D icho h o s p e d a d o r de p ro du cc ión in c luye genes e xó ge no s que cod ifica n una é s te r s in ta sa que se exp resa para co n fe r ir a d icho h o s p e d a d o r de p ro d u cc ió n la ca p a c id a d de s in te tiz a r un é s te r graso , sa tu ra do , in sa tu ra d o o ra m ifica d o a p a rtir de una fuen te de e n e rg ía renovab le . En a lgu nos aspec tos , el o rg a n ism o ta m b ié n puede e x p re s a r genes que co d ifica n las s ig u ie n tes p ro te ínas e jem p la re s : e lo n g a sa s de ác ido s g rasos, a c il-C o A red uc tasa s , ac iltran s fe rasas , é s te r s in tasas, ac il tra n s fe ra sa s grasas, d iac ilg lice ro l a c iltran s fe rasas , t io e s te ra sa s y/o a c il-co A a lcoho l a c iltra n s fe ra s a s de cera . En un a sp e c to a lte rn a tivo , el o rg a n is m o e xp re sa un gen que co d ifica una é s te r s in ta sa /a c il-C o A :d ia c ilg lice ro l a c iltra n s fe ra sa b ifunc iona l. P o r e jem p lo , la é s te r s in ta sa /a c il-C o A :d ia c ilg lice ro l a c iltra n s fe ra sa b ifu nc iona l pu ede se le cc io n a rse de los co m p le jo s m u ltie n z im á tico s de Simmondsia chinensis, Acinetobacter sp. cepa ADP1 (a n te rio rm e n te Acinetobacter calcoaceticus ADP1), Alcanivorax borkumensis, Pseudomonas aeruginosa, Fundibacter jadensis, Arabidopsis thaliana o Alcaligenes eutrophus (p o s te rio rm e n te ren o m b ra d a com o Ralstonia eutropha). En un aspecto , para p ro d u c ir és te res, ta le s com o é s te re s de cera o grasos, las ác ido g raso e longasas, a c il-C o A red uc tasa s o cera s in tasas, se ob tienen y /o p roceden de un com p le jo m u ltie n z im á tico de Alcaligenes eutrophus (p o s te rio rm e n te re n o m b ra d a com o Ralstonia eutropha) o de o tros o rg a n ism o s c o n o c id o s en la b ib liog ra fía .

C o m o fu e n te s ad ic io n a le s de s e cu e n c ia s de A D N he te ró lo g a s que cod ifica n p ro te ínas de s ín tes is de é s te r ú tiles en la p ro du cc ión de és te res g ra sos se inc luyen , pero sin lim itac ión , Mortierella alpina (p o r e jem p lo , A T C C 32222), Cryptococcus curvatus (tam b ién d e n o m in a d a Apiotricum curvatum), Alcanivorax jadensis (p o r e jem p lo , T 9T =D S M 12718 = A T C C 700854 ), Acinetobacter sp. HO1-N, (p o r e jem p lo , A T C C 14987) y Rhodococcus opacus (p o r e jem p lo , P D 630 , D S M Z 44193).

Los h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión ú tiles para p ro d u c ir és te res g ra sos pueden se r m ic ro o rg a n ism o s e u ca rio tas o p ro ca rio tas . C o m o e je m p lo s no lim ita n te s de h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión para p ro d u c ir és te res g ra sos se inc luyen Saccharomyces cerevisiae, Synechococcus, Synechocystis, Clamydomonas, Candida lipolytica, E. coli, Arthrobacter AK19, Rhodotorula glutinins, Acinetobacter sp. cepa M-1, Candida lipolytica, y o tros m ic ro o rg a n ism o s o lea g in oso s .

En un e jem p lo , se u tiliza la é s te r s in ta sa de Acinetobacter sp. ADP1 en el lo cus A A O 17391 (de sc rita en K a lsch e u e r y S te in bu che l, J. B io l. C hem ., 278: 8075 -8082 , 2003 ). En o tro e jem p lo , se u tiliza la é s te r s in ta sa de Simmondsia chinensis en el lo cus A A D 38041.

En d e te rm in a d o s aspec tos , los és te res p ro d u c id o s según los m é to d o s y las com p o s ic io n e s de este do cu m e n to , se sec re ta n o libe ran de las cé lu la s h o sp e d a d o ra s y, po r lo tan to , pueden recu p e ra rse ex tra ce lu la rm e n te . O p c io n a lm e n te , pu e d e u tiliza rse un e x p o rta d o r de és te res , ta l co m o un m ie m bro de la fa m ilia de FA TP , pa ra fa c ilita r la libe ra c ió n de é s te re s en el e n to rn o ex tra ce lu la r. Un e je m p lo no lim ita n te de un e x p o rta d o r de é s te r a d e cu a d o es la p ro te ína tra n s p o rta d o ra de ác ido s g ra sos (ca d e n a la rga ) C G 7400 -P A , iso fo rm a A , de Drosophila melanogaster, en el lo cus N P _524723.

D. Acil-ACP, Acil-CoA a Hidrocarburo

1. H id ro ca rb u ro s de m ic ro o rg a n ism o s pa rticu la res

S e con oce un con ju n to d ive rso de m ic ro o rg a n ism o s que p roducen h id ro ca rbu ros , ta le s com o a lcanos, o le fin as e iso p re no ide s . M uch os de estos h id ro ca rb u ro s p roceden de la b ios ín tes is de ác ido s g rasos. La p ro du cc ión de estos h id ro ca rb u ro s puede co n tro la rse c o n tro la n d o los genes aso c ia d o s con la b ios ín tes is de ác ido s g rasos en los h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión na tivos.

P o r e jem p lo , la b ios ín tes is de h id ro ca rb u ro s en la espec ie de a lga Botryococcus braunii se p ro du ce m ed ia n te la d e sca rb o n ila c ió n de a ld e h id o s grasos. Los a ld e h id o s g rasos se p ro du cen po r la re d u cc ió n de ac il tio é s te re s g rasos m ed ia n te una e n z im a ta l com o la a c il-C o A red uc tasa grasa . P o r tan to , la e s truc tu ra de los a lcan os fin a le s puede c o n tro la rse g e n o m a n ip u la n d o la espec ie B. braunii pa ra e xp re sa r ge ne s esp ec íficos , ta le s com o los de las t io e s te ra sa s , que con tro la n la lo ng itud de la ca d e n a de los ác ido s g ra sos que se can a liza n en b ios ín tes is de a lcanos. La exp res ión de las en z im a s que p ro du cen la b ios ín tes is de ác ido s g ra sos de cad en a ram ificada en B. braunii da rá lu g a r a la p ro du cc ión de a lcan os de cad en a ram ificada . La in tro d u cc ió n de genes que a fe c ta n a la p ro du cc ión de ác ido s g ra sos de sa tu ra d o s da rá com o resu ltad o la p ro du cc ión de o le finas . Las co m b in a c io n e s ad ic io n a le s de estos ge ne s pueden p ro p o rc io n a r un con tro l ad ic io n a l sob re la e s tru c tu ra fina l de los h id ro ca rb u ro s que se p roduc irán . P ara p ro d u c ir n ive les m ás a lto s de h id ro ca rb u ro s na tivos o g e n o m a n ip u la d o s , los ge ne s im p lica d o s en la b ios ín tes is de ác ido s g ra sos y sus p re cu rso re s , o en la d e g ra d a c ió n de o tros p ro du c to s , pu ed en exp re sa rse , s o b re e x p re s a rs e o a te nua rse . C ada una de es ta s e s tra te g ia s pu ede a p lica rse a la p ro du cc ión de a lcan os en Vibrio fumissii cep a M1 y en o tras cepas de Vibrio fumissii, que p roducen a lcan os a tra vé s de la red ucc ión de a lcoh o le s grasos. A d e m á s de Vibrio fumissii, pueden u tiliza rse o tros o rg a n ism o s p ro d u c to re s de a lca n o s que u tilizan la ru ta de los ác ido s grasos. C a da uno de estas e s tra te g ia s ta m b ié n puede ap lica rse a la p ro du cc ión de o le finas p ro du c ida s po r cepas de Micrococo leuteus, Stenotrophomonas maltofila, y m ic ro o rg a n ism o s re lac io na do s . E stos m ic ro o rg a n ism o s p roducen o le fin a s de ca d e n a la rga que p ro ced en de la co n d e n sa c ió n de cab eza a ca b e za de p re cu rso re s de ác ido s g ra sos . El con tro l de la e s truc tu ra y el n ive l de los p re cu rso re s de ác ido s g ra sos u tilizan do los m é tod os d e sc rito s en este d o cu m e n to da rán com o resu lta d o la fo rm a c ió n de o le fin as de d ife re n te s lo ng itude s de cadena , ca ra c te rís tica s de ra m ifica c ió n y n ive le s de sa tu rac ión .

Las c ia n o b a c te ria s ta m b ié n pueden u tiliza rse com o ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión ad e cu a d o s para la p ro du cc ión de d e riva d o s de ác ido s g ra sos ta le s com o a lcoh o le s g rasos , és te res g ra sos e h id ro ca rbu ros . P o r e jem p lo , Synechocystis sp. P C C 6803 y Synechococcus elongatusPCC7942 pueden s e rv ir com o h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión y pueden g e n o m a n ip u la rse u tilizan do té cn ica s de b io log ía m o le cu la r c o n ve n c io n a le s (Thiel, G e n e tic ana lys is o f cya n o b a c te ria , en T H E M O L E C U L A R B IO L O G Y O F C Y A N O B A C T E R IA , A D V A N C E S IN P H O T O S Y N T H E S IS A N D R E S P IR A T IO N 581-611 (K lu w e r A c a d e m ic P ub lishe rs ), 1994; K oksh a ro va y W o lk , A pp l. M icrob io l. B io techno l., 58: 123-137 , 2002. Los genes de b ios ín tes is de ác ido s g ra sos pueden id en tifica rse y a is la rse fá c ilm e n te en estos o rg an ism os.

A s im ism o , m uchas c ia n o b a c te ria s son p ro du c to ras na tu ra les de h id ro ca rbu ros , ta le s com o he p tad eca no , y po r lo ta n to con tien en genes de b ios ín tes is de h id ro ca rb u ro s que pueden d e s re g u la rse y so b re e xp re sa rse ju n to con la m an ip u la c ión de sus ge ne s de b ios ín tes is de ác ido s grasos, para a u m e n ta r la p ro du cc ión de h id ro ca rbu ros .

A d ife ren c ia de o tras bacte rias , a lgu nas c ia n o b a c te ria s (p o r e jem p lo , Synechocystis sp. P C C 6803 ) co n tie n e n ác idos g ra sos p o liin sa tu ra d o s en sus líp ido s (M ura ta , P la n t C e ll P hys io l., 33: 933 -941 , 1992), y po r lo ta n to tie n e n la cap ac idad in trínse ca de p ro d u c ir d e riva d o s de ác ido s g ra sos po liin sa tu rad os . Lo que es m ás im portan te , las c ia n o b a c te ria s son o rg a n ism o s fo to s in té tico s que s in te tizan to d o el ca rb o n o c e lu la r reco g iend o luz s o la r y fija nd o d ióx id o de carbono . P o r lo tan to , los de riva dos de ác ido s g ra sos p ro du c ido s en c ia n o b a c te ria s , p roceden d ire c ta m e n te de C O ².

2. P rod ucc ión de h id ro ca rb u ro s a p a rtir de la red ucc ión de a lcoh o le s p rim arios

Los h id ro ca rbu ros ta m b ié n pueden p ro du c irse u tilizan do o x id o rre d u c ta sa s e vo lu c io n a d a s para la reducc ión de a lco h o le s p rim arios . S e con oce la u tilizac ión de a lcoh o le s g rasos p rim a rio s para p ro d u c ir a lcan os en m ic ro o rg a n ism o s , ta le s com o Vibrio fumissii M1. V éase , po r e jem p lo , Park, J. B acte rio l., 187 :1426 -1429 , 2005. Un e je m p lo de una o x id o rre d u c ta sa que puede u tiliza rse para p ro d u c ir h id ro ca rb u ro s a p a rtir de a lco h o le s g ra sos es la o x id o rre d u c ta sa d e pe nd ien te de N A D (P )H . Las o x id o rre d u c ta sa s s in té ticas de p e n d ie n te s de N A D (P )H pueden p ro du c irse u tilizan do g e n o m a n ip u la c ió n evo lu tiva y pueden exp re sa rse en ho sp e d a d o re s de p roducc ión para p ro d u c ir d e riva d o s de ác ido s grasos.

Los exp e rtos en la té cn ica conocen y lleva a la p rá c tica el p ro ceso de "co n ve rtir" una a lcoh o l red u c ta sa g rasa para te n e r la ac tiv idad de se a d a (K o lkm a n y S tem m er, Nat. B io techno l., 19 :423 -8, 2001 ; N ess et al., A dv. P ro te in C hem ., 55 :261 -92 , 2000; M in shu ll y S tem m er, C urr. O pin . C hem . B io l., 3 :284 -90 , 1999; H u ism an y G ray, C urr. Opin. B io te chn o l., 13 :352-8 , 2002; p u b licac ión de pa ten te de E s tad os U n idos n.° 2006 /0195947.

U na b ib lio teca de o x id o rre d u c ta sa s de p e n d ie n te s de N A D (P )H se ge ne ra m ed ia n te m é to d o s es tánda r, ta le s com o P C R p ro p e n sa a error, m u ta g é n e s is a le a to ria e sp ec ífica de sitio , m u ta g é n e s is de sa tu ra c ió n e sp e c ífica de sitio o m u ta g é n e s is e sp ec ífica d irig ida a s itio . A d ic io n a lm e n te , puede c rea rse una b ib lio teca m ed ia n te el "b a ra ja d o " de s e cu e n c ia s co d ifica n te s de la o x id o rre d u c ta sa d e p e n d ie n te de N A D (P )H de o rigen na tu ra l. La b ib lio te ca se exp resa en un h o sp e d a d o r de p ro du cc ión adecu ad o , ta l com o E. coli. Las co lo n ia s in d iv id u a le s que exp resan un m ie m bro d ife re n te de la b ib lio teca de o x id o rre d u c ta sa se an a lizan de spu és para d e te rm in a r la exp res ión de una o x id o rre d u c ta sa que pued e c a ta liz a r la red ucc ión de un a lcoh o l graso.

P o r e jem p lo , cad a cé lu la puede e n sa ya rse com o una b io tra n s fo rm a c ió n de cé lu la s com p le ta s , un e x tra c to ce lu la r, o una célula permeabilizada. También pueden analizarse enzimas purificadas de la célula. Las alcohol reductasas grasas se identifican mediante un control espectrofotométrico o fluorométrico de la oxidación dependiente de alcohol graso de NAD(P)H. La producción de alcanos se controla mediante GC-MS, TLC u otros métodos adecuados.

Una oxidorreductasa identificada de esta manera se utiliza para producir alcanos, alquenos e hidrocarburos ramificados relacionados. Esto se logra ya sea in vitro o in vivo. Este último se logra expresando el gen de la alcohol reductasa grasa evolucionado en un organismo que produce alcoholes grasos, como los que se describen en el presente documento. Los alcoholes grasos actúan como sustratos para la alcohol reductasa, que produce alcanos. Otras oxidorreductasas también pueden genomanipularse para catalizar esta reacción, como las que utilizan hidrógeno molecular, glutatión, FADh u otras coenzimas reductoras.

3. Conversión de acil-ACP a cetona y/u olefinas

La proteína transportadora de acilos, acil-ACP, puede transformarse en una cetona y/o en una olefina interna mediante la acción de enzimas condensadoras de acilo, como se describe en la Publicación PCT n.° 2008/147781 A2. Como se describe en la publicación '781, los péptidos condensadores de acilo incluyen péptidos que son capaces de catalizar la condensación de acil-ACP, acil-CoA, acil-AMP, ácidos grasos, y sus mezclas, utilizando los métodos descritos en la misma. En algunos aspectos, estos péptidos condensadores de acilo tienen una alta, media o baja especificidad de sustrato. En determinados ejemplos, los péptidos condensadores de acilo son más específicos de sustrato y solo aceptarán sustratos de una longitud de cadena específica. Adicionalmente, un experto habitual en la materia apreciará que algunos péptidos condensadores de acilo también catalizarán otras reacciones. En la publicación '781 se desvelan ejemplos de enzimas condensadoras de acilo. Además, la publicación '781 describe proteínas de adenilación, deshidratasas y deshidrogenasas que pueden utilizarse en la producción de hidrocarburos tales como olefinas internas.

Los organismos recombinantes pueden genomanipularse utilizando polinucleótidos y proteínas, por ejemplo, los divulgados en la publicación '781, para producir hidrocarburos y cetonas alifáticas que tienen características estructurales definidas (por ejemplo, grado de ramificación, niveles de saturación, o longitudes de la cadena de carbono). Un método para producir hidrocarburos implica aumentar la expresión de, o expresar formas más activas de, una o más enzimas condensadoras de acilo (enzimas que condensan dos o más de acil-CoA, acil-ACP, acil-AMP, acil-éster, ácido graso, o mezclas de los mismos). Un experto en la materia apreciará que los productos producidos a partir de dichas reacciones de condensación varían dependiendo de la cadena de acilo que se condensa. Los productos que pueden producirse incluyen, por ejemplo, hidrocarburos y productos intermedios de hidrocarburo, tales como cetonas alifáticas. Las cetonas alifáticas, los hidrocarburos y los productos intermedios de hidrocarburo pueden genomanipularse para tener características específicas de la cadena de carbono expresando diversas enzimas o atenuando la expresión de diversas enzimas en el organismo recombinante. Según la presente divulgación, las tioesterasas mutantes de la divulgación pueden utilizarse para manipular el intervalo de longitudes de la cadena de carbono de las especies de acilo. Por tanto, utilizando una tioesterasa mutante que tenga una especificidad o selectividad de sustrato particular, es posible influir en las reacciones posteriores para dar como resultado un perfil de producto de olefina o cetona predeterminado.

4. Transformación de ácido graso a aldehido

Los ácidos grasos resultantes de la escisión de tioesterasa pueden transformarse en un aldehido mediante la acción del gen de la ácido carboxílico reductasa. Los aldehidos pueden ser productos útiles en sí mismos o pueden servir como sustratos para otras reacciones de catálisis enzimática, por ejemplo, en la producción de alcoholes grasos mediante una reacción enzimática de alcohol deshidrogenasa, o en la producción de alcanos mediante una reacción enzimática de descarboxilasas. Según las composiciones y los métodos desvelados en el presente documento, los sustratos de ácidos grasos de la ácido carboxílico reductasa pueden manipularse para lograr un perfil de producto predeterminado en el producto de aldehído o alcohol graso.

E. Liberación de derivados de ácidos grasos - con o sin proteínas transportadoras

Como se describe en este documento, los derivados de ácidos grasos producidos según los métodos, las composiciones, los vectores y las células hospedadoras de este documento, pueden secretarse o liberarse espontáneamente para permitir la recuperación extracelular de los productos derivados de ácidos grasos. La velocidad de la secreción espontánea puede ser o no lo suficientemente rápida, y el nivel de liberación puede ser o no lo suficientemente completo. Por lo tanto, opcionalmente, las proteínas transportadoras pueden utilizarse para facilitar la exportación de derivados de ácidos grasos fuera del hospedador de producción. Se sabe que las proteínas transportadoras y de salida excretan una gran variedad de compuestos, y que pueden modificarse naturalmente para que sean selectivas para tipos de derivados de ácidos grasos particulares. Son ejemplos no limitantes de proteínas transportadoras adecuadas las proteínas transportadoras de casetes de unión a ATP (ABC), las proteínas de salida y las proteínas transportadoras de ácidos grasos (FATP, fatty acid transporter proteins). Como ejemplos no limitantes adicionales de proteínas transportadoras adecuadas se incluyen las proteínas transportadoras de ABC de organismos tales como Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thaliana, Alcaligenes eutrophus y Rhodococcus erythropolis. Como ejemplos de proteínas transportadoras de ABC se incluyen CER5, AtMRP5, AmiS2 o AtPGP1.

En un a sp ec to p re fe rido , la p ro te ína tra n s p o rta d o ra de A B C es una C E R 5 (p o r e jem p lo , A Y 734542 )). Los ve c to re s que con tien en genes que exp resan p ro te ínas tra n sp o rta d o ra s ad e cu a d a s pueden in se rta rse en ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión de p ro te ín a s para a u m e n ta r o im p u lsa r la libe ra c ió n de d e riva d o s de ác ido s grasos.

La p ro du cc ión de p ro du c to s d e riva d o s de ác ido s g ra sos seg ún la p re sen te d ivu lg a c ió n no req u ie re la m od ifica c ió n de la p ro te ína tra n s p o rta d o ra o de sa lid a y es po s ib le se le c c io n a r ho sp e d a d o re s de p ro d u cc ió n po r su capac idad e n d ó ge na pa ra lib e ra r d e riva d o s de ác ido s g rasos. A s im ism o , s im p lem e n te c o n s tru ye n d o cé lu la s h o spe da do ra s seg ún la p re se n te d ivu lg a c ió n , po r e jem p lo , p ro du c to s d e riva d o s de ác ido s g ra so s que, de o tra m anera , se sab e que no se secre tan , pueden se c re ta rse o libe ra rse e sp o n tá n e a m e n te . La e fica c ia de la p ro du cc ión y libe rac ión del p ro d u c to en el ca ldo de fe rm e n ta c ió n puede e xp re sa rse com o una re lac ió n en tre el p ro du c to in tra c e lu la r y el p ro d u c to ex trace lu la r. En a lgu nos e jem p los , la re lac ión puede s e r de a p ro x im a d a m e n te 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 o 1:50.

II. Selección de las características de la cadena de carbono de los derivados de ácidos grasos

D e riva d o s de ác ido s g ra sos con pu n tos de ram ificac ió n , n ive les de sa tu ra c ió n , lo n g itu d e s de la ca d e n a de c a rb o n o y ca ra c te rís tica s de é s te r p a rticu la re s pu ed en p ro d u c irse seg ún se desee . C o m o h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión pueden se le cc io n a rse m ic ro o rg a n ism o s que, de m an e ra na tu ra l, p ro du cen d e riva d o s pa rticu la re s y, en c ie rta s c ircu ns tan c ias , las en z im a s en d ó g e n a s en su in te rio r pueden m a n ip u la rse para p ro d u c ir d e riva d o s de ác ido s g ra sos de ca ra c te rís tica s deseab les . C om o a lte rna tiva , los genes que exp resa n e n z im a s que p roduc irán de riva dos de ác ido s g ra sos pa rticu la re s pueden in se rta rse a d e cu a d a m e n te en m ic ro o rg a n ism o s h o sp e d a d o re s de p roducc ión .

En a lgu nos e jem p los , la exp res ión de genes FA S exógenos , que se o rig in an a p a rtir de d ife ren te s esp ec ies o v a r ia n te s g e n o m a n ip u la d a s , pued e rea liza rse en un h o sp e d a d o r de p ro du cc ión , da n d o com o resu lta d o la b ios ín tes is de á c id o s g ra sos que son e s tru c tu ra lm e n te d ife re n te s (p o r e jem p lo , en long itudes , n ive le s de ram ificac ió n , g ra do s de in sa tu ra c ión , e tc .) a los de l h o sp e d a d o r de p ro du cc ión nativo. E stos p ro du c to s gé n icos h e te ró logo s ta m b ié n pueden se le cc io n a rse o g e n o m a n ip u la rse para que no se vean a fe c ta dos po r los m e ca n ism o s reg u la d o re s na tu ra les en las cé lu la s h o sp e d a d o ra s de p ro du cc ión , y com o ta l p e rm itir el con tro l de la p ro d u cc ió n de l p ro d u c to c o m e rc ia l deseado . P o r e jem p lo , las e n z im a s FA S de Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces spp., Ralstonia, Rhodococcus, Corynebacteria, Brevibacteria, Mycobacteria, le vad u ras o lea g in osa s , o s im ila res , pueden exp resa rse en un h o s p e d a d o r de p ro du cc ión adecu ad o . La exp res ión de d ich a s en z im a s exó ge na s a lte ra rá la e s truc tu ra del á c id o g ra so p roduc ido .

C u an do un h o sp e d a d o r de p roducc ión se g e n o m a n ip u la para p ro d u c ir un ác ido g raso con un n ive l de insa tu rac ión , ram ificac ió n , o lo ng itud de la cad en a de ca rbono , esp ec íficos , el ác ido g raso g e n o m a n ip u la d o resu ltan te puede u tiliza rse en la p ro du cc ión de de riva d o s de ác ido s g rasos. Los d e riva dos de ác ido s g ra sos g e ne rado s a pa rtir de d icho s h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión pueden m os tra r las ca ra c te rís tica s de l á c id o g ra so ge no m a n ip u la d o .

P or e jem p lo , un h o sp e d a d o r de p ro du cc ión pued e g e n o m a n ip u la rs e pa ra c re a r á c id o s g ra sos ra m ifica d o s de cad en a corta , que de spu és el h o sp e d a d o r de p ro du cc ión puede u tiliza r para p ro d u c ir a lcoh o le s g ra sos ra m ifica d o s de ca d e n a corta . De m an e ra s im ila r, g e n o m a n ip u la n d o un h o sp e d a d o r de p ro du cc ión pued e p ro du c irse un h id ro ca rbu ro para p ro d u c ir un ác ido g raso que te n g a un n ive l de ram ificac ió n , in sa tu ra c ión , y /o lo ng itud de la cad en a de carbono de fin id o s y p ro du c ien do a s í una po b lac ión de h id ro ca rbu ros hom og éne a . P ara m e jo ra r la h o m og ene id ad del p ro du c to resu ltan te pueden em p le a rse e ta pas ad ic io na le s . P o r e jem p lo , cu a n d o se desea un a lcoh o l in sa tu ra do , un é s te r g ra so o un h id ro ca rbu ro , el o rg a n ism o h o s p e d a d o r de p ro d u cc ió n puede g e n o m a n ip u la rse pa ra p ro d u c ir n ive le s ba jos de á c id o s g ra sos sa tu ra do s , y a d e m á s pued e m o d ifica rse para e xp re sa r una d e sa tu ra sa ad ic io n a l y as í d is m in u ir la p ro du cc ión de p ro du c to sa tu rado .

A. Grupos ramificados y cíclicos

1. G e n o m a n ip u la c ió n de d e riva d o s de ác ido s g ra sos ra m ifica d o s y c íc lico s

Los ác ido s g ra sos son p ro du c to s in te rm e d io s c lave en la p ro du cc ión de d e riva d o s de ác ido s g rasos. U tilizando á c id o s g ra sos ram ificado s o c íc lico s pueden p re p a ra rse de riva dos de ác ido s g ra sos que con teng an pun tos de ram ificac ió n , g ru po s c íc lico s y co m b in a c io n e s de los m ism os.

P o r e jem p lo , E. coli p ro du ce de m an e ra na tu ra l ác ido s g ra sos de cad en a linea l (aFA s, de l ing lés straigt chain fatty acids). P ara g e n o m a n ip u la r E. coli pa ra p ro d u c ir ác idos g ra sos de cadena ram ificada (b rFA , del ing lés branched chain fatty acids), va r io s genes que p ro po rc ion an p re cu rso res ram ificado s (p o r e jem p lo , un operón bkd ) pueden in tro d u c irse en el h o s p e d a d o r de p ro d u cc ió n y e xp re sa rse pa ra p e rm itir el in ic io de la b io s ín te s is de á c id o s g ra so s a p a rtir de p re c u rs o re s ra m ifica d o s (p o r e jem p lo , fabH). Las fa m ilia s de ge ne s bkd, ilv, icm y fab pu ed en e xp re sa rse o s o b re e xp re sa rse para p ro d u c ir d e riva dos de ác idos g ra sos de cad en a ram ificada . De m an era s im ila r, para p ro du c ir ác ido s g ra sos c íc licos, los genes que p ro po rc ion an p re cu rso res c íc lico s pueden in tro d u c irse en el h o sp e d a d o r de p ro d u cc ió n y e xp re sa rse pa ra p e rm itir el in ic io de la b io s ín te s is de ác ido s g ra sos a p a rtir de p re cu rso re s c íc licos . Las fa m ilia s de ge ne s ans, chc y plm pueden e xp re sa rse o s o b re e xp re sa rse para p ro d u c ir ác ido s g ra sos cíc licos.

A d ic io n a lm e n te , un h o sp e d a d o r de p ro du cc ión puede g e n o m a n ip u la rse para e xp re sa r genes que cod ifiq uen p ro te ín a s para el a la rg a m ie n to de los b rF A (p o r e jem p lo , genes que co d ifica n la A C P , FabF, e tc .) y /o d e le c io n a r o a te n u a r los co rre sp o n d ie n te s genes de E. coli que n o rm a lm e n te con du cen a sFA s. En este sen tido , genes e n d ó g e n o s que co m p e tiría n con los ge ne s in tro d u c id o s (p o r e jem p lo , fabH,fabF) se d e le c io n a n o a tenúan .

La a c il-C o A ram ificada (p o r e jem p lo , 2 -m e til-b u tir il-C o A , iso va le ril-C o A , iso bu tir il-C o A , e tc .) son los p re cu rso re s de brFA . En la m ayo ría de los m ic ro o rg a n ism o s que con tien en brFA, los b rF A se s in te tizan en dos e ta pas a pa rtir de a m in o á c id o s ra m ifica d o s (p o r e jem p lo , iso leu c in a , le uc in a o v a lin a ) (K ad en a , M icrob io l. R ev., 55 :288 , 1991). Un h o s p e d a d o r de p ro du cc ión puede g e n o m a n ip u la rse para e x p re s a r o so b re e x p re s a r una o m ás de las e n z im a s im p lica d a s en estas dos e ta pas para p ro d u c ir brFA s, o para s o b re p ro d u c ir los brFA. P o r e jem p lo , el h o sp e d a d o r de p ro du cc ión puede te n e r una en z im a e n d ó ge na que pueda re a liza r una e tapa que con du zca un brFA , po r lo tan to , so lo los ge ne s que cod ifica n las e n z im a s im p lica da s en la seg u n d a e tapa deben in tro d u c irse de fo rm a reco m b in an te . Las t io e s te ra s a s m u ta n te s de la d ivu lg ac ión pueden g e n o m a n ip u la rse pa ra te n e r una o m ás p ro p ieda de s a lte radas, po r e jem p lo , e sp e c ific id a d a lte ra d a y /o ac tiv ida d (p o r e jem p lo , ve lo c id a d ca ta lítica ) au m en ta da , con resp ec to a los co m p u e s to s de a c il-C o A o a c il-A C P de cad en a ram ificada o c íc lica de sc rito s en el p re sen te do cu m e n to . P or co n s ig u ie n te , pueden fa b rica rse cé lu la s re co m b in a n te s p ro d u c to ra s de d e riva d o s de ác ido s g ra sos para p ro d u c ir p re fe re n te m e n te un p ro d u c to de riva d o de ác ido s g ra sos d e se a d o de ca d e n a ra m ifica d a o c íc lica que pued e te n e r un a lto v a lo r co m o p ro du c to fina l.

2. F o rm ac ión de ác ido s g ra sos ra m ifica d o s y d e riva d o s de ác ido s g ra sos ram ificado s

La p rim era e ta pa en la fo rm a c ió n de b rF A es la p ro du cc ión de los a -c e to á c id o s c o rre sp o n d ie n te s m ed ia n te una a m in o á c id o a m in o tra n s fe ra sa de cad en a ram ificada . Los ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión pueden in c lu ir e n d ó g e n a m e n te g e n e s que co d ifica n d icha s e n z im a s, o de m an e ra a lte rna tiva , d ich o s g e n e s pu ed en in tro d u c irse de m an e ra reco m b in an te . E. coli, po r e jem p lo , exp resa de fo rm a e n dó ge na d icha enz im a , IlvE (E C 2.6.1.42 ; n.° de reg is tro Y P _ 026247 de G e n B a n k ). En a lg u n o s h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión , una a m in o tra n s fe ra s a de a m in o á c id o s h e te ró loga de cadena ram ificada no puede exp resa rse . S in em bargo , si la enz im a IlvE de E. coli o cu a lq u ie r otra a m in o tra n s fe ra sa de am in o á c id o s de cadena ram ificada (p o r e jem p lo , IlvE de Lactococcus lactis (n .° de reg is tro A A F 34406 de G en B ank), IlvE de Pseudomonas putida (n .° de reg is tro de G e n B a n k N P _ 745648 ) o IlvE de Streptomyces co e lico lo r(N ú m e ro de reg is tro N P _ 629657 de G en B ank)), no es endó ge na , puede in tro du c irse . Si la reacc ión de la a m in o tra n s fe ra sa es lim itan te de la v e lo c id a d en la b ios ín tes is de b rF A en el o rg an ism o h o sp e d a d o r de p ro du cc ión se lecc io na do , en to n ce s la a m in o tra n s fe ra sa pued e so b ree xp resa rse .

La seg un da e tapa es la d e sca rb o x ila c ió n ox id a tiva de los a -c e to á c id o s a la c o rre sp o n d ie n te a c il-C o A de cadena ram ificada . E s ta rea cc ió n pued e c a ta liza rla un c o m p le jo de a -ce to ác ido d e s h id ro g e n a s a de ca d e n a ra m ifica d a (bkd; EC 1.2.4.4 ). (D e no ya et al., J. B acte rio l., 177: 3504, 1995), que con s ta de las su b u n id a d e s E 1 a /p (d e sca rb ox ilasa ), E2 (d ih id ro lip o il tra n s a c ila s a ) y E3 (d ih id ro lip o il de sh id ro g e n a sa ). E stos co m p le jo s de a -ce to ác ido d e sh id ro g e n a sa de cad en a ram ificada son s im ila re s a los com p le jos de p iruva to y a -c e to g lu ta ra to d e sh id rog en asa . C ada m ic ro o rg a n ism o que posee los b rF A y /o que crece en am in o á c id o s de cad en a ram ificada , puede u tiliza rse com o fue n te pa ra a is la r genes bkd para la exp res ión en ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión ta le s com o , po r e jem p lo , E. coli. A s im ism o , E. coli t ie n e el c o m p o n e n te E3 com o pa rte de su co m p le jo p iruva to d e sh id ro g e n a sa (cod ifica do , po r e jem p lo , po r lpd, (E C 1.8.1.4 ), n.° de reg is tro N P _ 414658 de G en B ank), po r lo tan to , puede s e r su fic ie n te para e x p re s a r so lo los genes E1 a /p y E2 bkd. La T ab la 2 en u m e ra e jem p los no lim itan te s de ge ne s bkdde va rios m ic ro o rg a n ism o s que pueden in tro d u c irse de fo rm a re co m b in a n te y exp resa rse en un h o sp e d a d o r de p roducc ión pa ra p ro p o rc io n a r p re cu rso re s de a c il-C o A de cad en a ram ificada . C o m o ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión tam b ién pu ed en u tiliza rse m ic ro o rg a n ism o s que tie n e n d icho s ge ne s bkd.

Tabla 2: Genes B k d de^ microor anismos seleccionados

co n tin u a c ió n

En otro e jem p lo , en un h o sp e d a d o r de p roducc ión , puede fa b rica rse iso bu tiril-C o A , po r e jem p lo en E. coli, a tra vé s de la coe xp re s ió n de una c ro to n il-C o A red u c ta sa (C cr, EC 1.6.5.5 , 1.1.1.1 ) e is o b u tir il-C o A m u tasa (sub un ida d g ra nd e Icm A, EC 5.4.99.2 ; su b u n id a d pe queña Icm B, EC 5.4.99.2 ) (H an y R eyno lds , J. B acte rio l., 179 :5157 , 1997). La c ro to n il-C o A es un p ro d u c to in te rm e d io en la b io s ín te s is de á c id o s g ra so s en E. coli y o tros m ic ro o rg a n ism o s . En la Tabla 3 se o frecen e je m p lo s no lim itan te s de genes ccr e icm de m ic ro o rg a n ism o s se lecc io na do s .

r i m

A d e m á s de la exp res ión de los genes bkd, el in ic io de la b ios ín tes is de b rF A utiliza p -ce to a c il-p ro te ín a s in ta sa III tra n s p o rta d o ra de ac ilo (FabH , EC 2.3.1.41 ) con e sp ec ific ida d para las a c il-C o A de cad en a ram ificada (L i et al., J. B ac te rio l., 187 :3795 -3799 , 2005). En la Tabla 4 se en um e ran e jem p los no lim itan te s de d ichas e n z im a s F a b H . Los genes fabH im p lica do s la b ios ín tes is de ác ido s g rasos de cu a lq u ie r m ic ro o rg a n ism o que con teng a b rF A pueden exp re sa rse en un h o sp e d a d o r de p ro du cc ión . Las en z im a s Bkd y FabH de ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión que no p ro du cen b rF A de m an era na tu ra l puede que no sop orten la p ro du cc ión de brFA, po r lo tan to , Bkd y FabH pueden exp re sa rse de fo rm a reco m b in an te . V e c to re s que con tienen los genes bkd y fabH pueden in se rta rse en d icho h o s p e d a d o r de p ro du cc ión . De m a n e ra s im ila r, el n ive l e n d ó g e n o de la p ro du cc ión de Bkd y FabH pued e que no sea su fic ie n te para p ro d u c ir brFA, po r lo tan to , pueden sob re e xp re sa rse . A d ic io n a lm e n te , o tros co m p o n e n te s de la ruta de la b io s ín te s is de ác ido s g ra sos pu ed en exp re sa rse o sob re e xp re sa rse , ta le s co m o las p ro te ínas tra n sp o rta d o ra s de ac ilo (A C P ) y la p -ce to a c il-p ro te ín a s in ta sa II tra n s p o rta d o ra de ac ilo (co d ifica d a po r fabf EC 2.3.1.41 ) (en la Tabla 4 se e n u m e ra n e je m p lo s no lim ita n te s de ca n d id a to s ). A d e m á s de e x p re s a r es to s genes, a lg u n o s ge ne s en la ru ta de la b ios ín tes is de ác ido s g ra sos e n dó ge nos pueden a te n u a rse en el h o s p e d a d o r de p roducc ión . Los genes que co d ifica n e n z im a s que c o m p ite n po r el su s tra to (o su s tra to s ) con las e n z im a s de la ru ta que dan co m o resu lta d o la p ro du cc ión de brFA, pueden a te n u a rse para a u m e n ta r la p ro du cc ión de brFA . P o r e jem p lo , en E. coli los c a n d id a to s que in te rfie ren m ás p ro b a b le m e n te con la b ios ín tes is de fabH son los genes fabH (n .° de reg is tro N P _ 415609 de G e n B a n k ) y /o fabF (n .° de reg is tro N P _ 415613 de G enB ank).

Tabla 4: fa b H ACP fa b F enes de microor anismos seleccionados con brFA

co n tin u a c ió n

C o m o se ha m e n c io n a d o an te rio rm e n te , pueden p ro du c irse a lcoh o le s de cad en a ram ificada m ed ia n te la co m b in a c ió n de genes de exp res ión que soportan la s ín tes is de b rF A y la s ín tes is de a lcoho l. P o r e jem p lo , cua nd o un gen que co d ifica una a lcoh o l reduc tasa , ta l com o acrl de Acinetobacter baylyi A D P 1 , se co e xp re sa con un operón bkd en una cé lu la h o spe da do ra de E. coli, la cé lu la h o spe da do ra puede s in te tiz a r iso pe n tan o l, iso bu ta no l o 2 -m e til bu tano l. De m a n e ra s im ila r, cua nd o el gen acrl se coe xp re sa con los genes ccr/icm en una cé lu la h o sp e d a d o ra de E. coli, la cé lu la h o sp e d a d o ra pued e s in te tiz a r isobu tano l.

3. F o rm ac ión de ác ido s g ra sos c íc lico s y d e riva d o s de ác ido s g ra sos c íc licos

P ara tra n s fo rm a r un h o sp e d a d o r de p roducc ión , ta l com o una bacte ria E. coli, en un o rg a n ism o cap az de s in te tiza r ác ido s g ra sos w c íc lico s (c iFA ), un gen que p ro p o rc io n a la c ic lo h e x ilc a rb o n il-C o A (C H C -C o A ) p re cu rso ra c íc lica (C ro pp e t al., N a tu re B io tech ., 18: 980 -983 , 2000), se in tro du ce y se exp resa en el h o sp e d a d o r de p ro du cc ión . Una co n ve rs ió n s im ila r es pos ib le pa ra o tros ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión , po r e jem p lo , bacte rias , le vad u ras y hongos fila m en to sos .

C o m o e je m p lo s no lim ita tivo s de ge ne s que p ro p o rc io n a n C H C -C o A en E. coli se inc luyen : ansJ, ansk, ansL, chcA y ansM de l g ru po de genes de a n sa trie n in a de Streptomyces collinus (C hen et al., Eur. J. B iochem ., 261: 98-107, 1999), o plmJ, plmK, plml, chcA y plmM del g ru po de genes de fo s la c to m ic in a B de Streptomyces sp. HK803 (P a la n ia p p a n et al., J. Biol. C hem ., 278: 35552 -35557 , 2003 ) ju n to con el gen chcb (P a tton et al., B iochem ., 39: 7595 -7604 , 2000 ) de S. collinus, S. avermitilis o S. coelicolor (véa se la Tabla 5 para los núm eros de reg is tro de G en B ank). Los genes e n u m e ra d o s a n te rio rm e n te en Tabla 4 pueden exp resa rse de spu és para pe rm itir el in ic io y el a la rg a m ie n to de ác ido s g ra sos w c íc licos. C om o a lte rna tiva , los genes ho m ó lo g o s pueden a is la rse de m ic ro o rg a n ism o s que p roducen cyF A y e xp re sa rse en E. coli.

-

Los genes e n u m e ra d o s en la Tabla 4 (fabh, A C P y fabF) son su fic ie n te s pa ra p e rm itir el in ic io y el a la rg a m ie n to de ác ido s g ra sos w c íc lico s po rque no rm a lm e n te tien en una am p lia esp ec ific ida d de sustra to . Si la coe xp re s ión de a lgu no de estos genes con los genes ansJKLM/chcAB o pmlJKLM/chcAB de la Tabla 5 no p ro du ce cyF A , en tonces pueden a is la rse ho m ó lo g o s fabH, ACP y /o fabF de m ic ro o rg a n ism o s que p roducen c yF A (p o r e jem p lo , u tilizando ce b a d o re s de P C R de g e n e ra d o s o son da s de se cu e n c ia s de A D N h e te ró lo g a s ) y pueden coe xp re sa rse . La Tabla 6 en u m e ra e je m p lo s no lim ita tivo s de m ic ro o rg a n ism o s que con tien en ác ido s g ra sos w cíc licos.

T l : E m l n limi iv mi r r ni m n i n n i r í li

B. Saturación

Los ác ido s g ra sos son p ro du c to s in te rm e d io s c lave en la p ro d u cc ió n de d e riva d o s de ác ido s g rasos. Los g ra do s de sa tu ra c ió n en d e riva d o s de ác ido s g ra sos pueden con tro la rse re g u land o los g ra do s de sa tu ra c ió n de los p roduc tos in te rm e d io s de ác idos grasos. Las fa m ilia s de genes sfa, gns y fab pueden e xp re sa rse o so b re e xp re sa rse para c o n tro la r la sa tu ra c ió n de ác ido s grasos.

Los ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión pueden g e n o m a n ip u la rse pa ra p ro d u c ir ác ido s g ra sos in sa tu ra dos g e n o m a n ip u la n d o el h o sp e d a d o r de p ro du cc ión para so b re e x p re s a r fabb o ha c iendo c re ce r el h o s p e d a d o r de p ro du cc ión a ba ja s te m p e ra tu ra s (p o r e jem p lo , m en os de 37 °C ). FabB tien e p re fe re n c ia p o r c is -53 de ce n o il-A C P , y da co m o re su lta d o la p ro du cc ión de ác ido s g ra sos in sa tu ra d o s en E. coli. La so b re e xp re s ió n de l gen fabB da com o resu lta d o la p ro du cc ión de un p o rcen ta je s ig n ifica tivo de ác ido s g ra sos in sa tu ra d o s (de M endoza e t al., J. Biol. C hem ., 258 :2098 -101 , 1983). El gen fabB puede in se rta rse y exp resa rse en ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión que no tie n e n el gen de fo rm a na tu ra l. E stos ác ido s g ra sos in sa tu ra d o s pueden u tiliza rse com o p ro du c to s in te rm e d io s en los h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión que están g e n o m a n ip u la d o s pa ra p ro d u c ir d e riva d o s de ác ido s g rasos, ta le s com o a lco h o le s g rasos, és te re s g rasos, ceras, o le finas, a lcanos, y s im ila res.

C o m o a lte rna tiva , rep reso res de la b ios ín tes is de ác ido s grasos, po r e jem p lo , un re p re so r (n.° de reg is tro N P _ 418398 de G e n B a n k ) co d ifica d o po r fabR pueden de le c io n a rse . E sto ta m b ié n da rá com o resu lta d o una m a yo r p ro du cc ión de ác ido s g ra sos in sa tu ra d o s en E. coli (Z han g e t al., J. Biol. C hem ., 277 :15558 , 2002 ). P ueden e fe c tu a rse d e le c io n e s s im ila re s en o tro s h o sp e d a d o re s de p ro d u cc ió n . S e pu ede lo g ra r un a u m e n to a d ic io n a l en los ác ido s g ra sos insa tu ra dos , po r e jem p lo , po r so b re e xp re s ió n de fabM (que cod ifica la trans -2 , c is -3 -d e ce n o il-A C P iso m erasa , n.° de reg is tro D A A 05501 de G e n B a n k ) y e xp re s ió n co n tro la d a de fabk (qu e co d ifica la tra n s -2 -e n o il-A C P red u c ta sa II, n.° de reg is tro N P _ 357969 de G e n B a n k ) de Streptococcus pneumoniae (M a rra kch i et al., J. Biol. C hem ., 277: 44809 , 2002 ), m ie n tra s fab l se d e le c io n a de E. coli(que co d ific a la tra n s -2 -e n o il-A C P red uc tasa , n.° de reg is tro N P _ 415804 de G en B ank). A d ic io n a lm e n te , para a u m e n ta r el po rcen ta je de é s te re s g ra sos in sa tu ra dos , el h o s p e d a d o r de p ro du cc ión ta m b ié n puede so b re e x p re s a r fabB (que co d ifica la p -ce to a c il-A C P s in ta sa I, n.° de reg is tro B A A 16180 de G en B ank, (E C 2.3.1.41 ), sfa (qu e cod ifica un su p re so r de fabA n.° de reg is tro A A C 44390 de G en B ank), y gnsA y gnsB (am b os cod ifica n su p re so re s m u tan tes nu los secG, n.° de reg is tro A B D 18647.1 de G e n B a n k y n.° de reg is tro A A C 74076.1 de G e n B ank , resp e c tiva m e n te ). En a lg u n o s e jem p los, el gen e n d ó g e n o fabF pued e a te nua rse , a u m e n ta n d o a s í el po rcen ta je de pa lm ito le a to (C ¹⁶.¹) p roduc ido .

Las t io e s te ra sa s m u tan tes de la d ivu lg ac ión pueden g e n o m a n ip u la rse para te n e r p ro p ieda de s a lte radas , por e jem p lo , e sp e c ific id a d a lte rad a y /o ac tiv idad a u m en ta da , con resp ec to a los co m p u e s to s de a c il-C o A o ac il-A C P su s titu id o s o no su s titu id o s que se p re pa ran com o se de sc rib e en el p re se n te do cu m e n to . P o r co n s ig u ie n te , la cé lu la re co m b in a n te p ro d u c to ra de d e riva d o s de ác ido s g ra sos pued e fa b rica rse para p ro d u c ir p re fe re n te m e n te un pe rfil de sa tu ra c ió n d e se a d o en un p ro du c to de riva d o de ác ido s g ra sos que puede te n e r un a lto v a lo r com o p ro du c to fina l. C. Longitudes de cadena y características de éster

1. L o ng itud es de cad en a y p ro du cc ión de ca d e n a s im p ares

Los m é tod os d e sc rito s en el p re sen te d o cu m e n to pe rm iten la p ro du cc ión de é s te re s g ra sos y de riva dos de ác idos g ra sos de d ife re n te s lo ng itude s de cad en a s e le cc io n a n d o una t io e s te ra s a m u tan te ad ecu ad a que te n g a esp ec ific ida d y /o se le c tiv id a d po r un sus tra to de una lo ng itud de cad en a de ca rb o n o esp ec ífica . E xp re sa n d o las tio e s te ra sa s esp ec íficas , se pueden p ro d u c ir ác ido s g ra sos y de riva dos de ác ido s g ra sos que tien en lo ng itude s de cad en a de ca rb o n o d e sea da s . En a lg u n o s asp ec tos , una t io e s te ra s a e n d ó g e n a pued e m u ta rse u tiliza n d o té c n ic a s de a lte rac ión g e n ó m ica con oc idas . O, un gen que cod ifica una t io e s te ra s a p a rticu la r puede in tro d u c irse de m an e ra h e te ró loga en un h o s p e d a d o r de p ro du cc ión de ta l m an era que se p roduzca un ác ido graso o un de riva do de ác ido g raso de una lo ng itud de cad en a de ca rb on o pa rticu la r. En d e te rm in a d o s aspec tos , se su p rim e la exp res ión de t io e s te ra sa s en dó g e n a s . Las t io e s te ra s a s m u ta n te s de la d ivu lg a c ió n pu ed en g e n o m a n ip u la rse para te n e r p ro p ie d a d e s a lte radas , po r e jem p lo , e sp e c ific id a d a lte ra d a y /o ac tiv ida d au m en ta da , con re sp e c to a las lo n g itu d e s de ca d e n a e sp e c ífica s de los co m p u e s to s a c il-C o A o ac il-A C P de sc rito s en el p resen te do cu m e n to . P o r con s ig u ie n te , la cé lu la reco m b in an te que p ro du ce los de riva dos de ác ido s g ra sos puede fa b rica rse pa ra p ro d u c ir p re fe re n te m e n te un p ro du c to de riva do de ác ido s g ra sos con la lo ng itud de cad en a de se a d a y /o con un v a lo r a lto com o p ro du c to fina l.

En un aspecto , el de riva do de ác ido g raso con tiene una cadena de ca rb o n o de a p ro x im a d a m e n te 4 a 36 á to m o s de ca rb on o , de a p ro x im a d a m e n te 6 a 32 á to m o s de carbono , de a p ro x im a d a m e n te 10 a 30 á to m o s de ca rbono , de a p ro x im a d a m e n te 10 a 18 á to m o s de carbono , de a p ro x im a d a m e n te 24 a 32 á to m o s de carbono , de a p ro x im a d a m e n te 26 a 30 á to m o s de carbono , de a p ro x im a d a m e n te 26 a 32 á to m o s de carbono , de a p ro x im a d a m e n te 5 a 10 á to m o s de ca rbono , de a p ro x im a d a m e n te 10 a 16 á to m o s de c a rb o n o o de a p ro x im a d a m e n te 12 a 18 á to m o s de carbono . En un asp ec to a lte rna tivo , el de riva do de ác ido g raso con tiene una cad en a de ca rb on o m e n o r de a p ro x im a d a m e n te 20 á to m o s de ca rbono , m e n o r de a p ro x im a d a m e n te 18 á tom os de ca rbono , o m e n o r de a p ro x im a d a m e n te 16 á tom os de carbono . En otro aspecto , el p ro du c to de é s te r g raso es un p ro d u c to de é s te r g ra so sa tu ra d o o in sa tu ra d o que tie n e un co n te n id o de á to m o s de ca rb o n o en tre 24 y 46 á to m o s de ca rbono . En un aspecto , el p roduc to de é s te r g raso tien e un co n ten ido de á tom os de ca rb on o en tre 24 y 32 á to m o s de ca rbono . En o tro aspec to , el p ro d u c to de é s te r g ra so t ie n e un co n te n id o de ca rb o n o de 14 y 20 ca rb on os . En o tro aspec to , el é s te r g ra so es el é s te r m etílico de C ^{1 8 1}. En o tro aspecto , el é s te r g ra so es el é s te r e tílico de Cm-i. En o tro aspec to , el é s te r g ra so es el é s te r m e tílico de Cm-i. En o tro a sp e c to m ás, el é s te r g ra so es oc ta d e c il é s te r de octano l.

C ie rtos m ic ro o rg a n ism o s p roducen p re fe re n te m e n te ác ido s g ra sos y de riva dos de ác ido s g ra sos de cad en a de ca rb o n o pa r o im par. P o r e jem p lo , E. coli n o rm a lm e n te p roduce ác ido s g ra sos y és te res e tílico s de ác ido s g rasos (F A E E ) de cad en a de ca rb on o par. S o rp re n d e n te m e n te , los m é to d o s de sve la d o s en el p resen te d o cu m e n to pueden u tiliza rse para a lte ra r esa p ro du cc ión . P o r e jem p lo , en c ie rta s c irc u n s ta n c ia s puede c re a rse una E. coli pa ra p ro d u c ir ác ido s g ra sos y F A E E de cad en a de ca rb o n o im par.

2. C a ra c te rís tica s de é s te r

Un é s te r in c luye n o rm a lm e n te lo pu e d e d e n o m in a rs e co m o un lado "A " y un lado "B ". El lado B pu ed e c o n trib u ir con un ác ido g ra so p ro du c ido a p a rtir de s ín te s is de novo en el o rg a n ism o h o sp e d a d o r de p ro du cc ión . En a lgunos asp ec tos , en los que el h o s p e d a d o r de p ro du cc ión se g e n o m a n ip u la a d ic io n a lm e n te pa ra p re p a ra r a lcoho les, in c lu ye n d o a lcoh o le s g rasos, el lado A ta m b ié n es p ro du c ido po r el o rg a n is m o h o s p e d a d o r de p ro du cc ión . En o tros a sp e c to s m ás, el lado A puede s e r p ro p o rc io n a d o po r el m ed io de cu ltivo . S e le cc io n a n d o los genes de t io e s te ra sa desea do s , el lado B (y el lado A cuando se fa b rica n a lcoh o le s g ra sos ) puede d iseñ a rse para te n e r c ie rtas ca ra c te rís tica s d e sea b le s de la cad en a de ca rbono . E stas ca ra c te rís tica s inc luyen , po r e jem p lo , pun tos de ram ificac ió n , pun tos de in sa tu ra c ió n y lo ng itude s de cad en a de ca rb o n o de sea da s . P o r ta n to , las t io e s te ra sa s m u tan tes de la d ivu lg ac ión pueden g e n o m a n ip u la rse para te n e r p ro p ieda de s a lte radas , po r e jem p lo , esp ec ific ida d a lte ra d a y /o ac tiv idad au m en ta da , con resp ec to a la p re fe ren c ia po r a c e p ta r c ie rto s co m p u e s to s de a c il-C o A o ac il-A C P com o una cad en a la te ra l A com o se de sc rib e en el p resen te do cu m e n to . P o r con s ig u ie n te , la cé lu la re co m b in a n te p ro d u c to ra de d e riva d o s de ác ido s g ra sos pued e fa b rica rse de m an e ra que p ro d u zca p re fe re n te m e n te un p ro du c to de riva d o de ác ido s g ra sos d e se a d o que sea v a lio s o com o p ro du c to fina l.

C u a n d o se se le cc io n a n ge ne s de t io e s te ra s a pa rticu la res , los lados A y B te n d rá n ca ra c te rís tica s de cad en a de c a rb o n o s im ila re s cuando am b os sean a p o rtad os po r el h o sp e d a d o r de p roducc ión u tilizan do p ro du c to s in te rm ed ios de la v ía b ios in té tica de ác ido s g rasos. P o r e jem p lo , al m enos a p ro x im a d a m e n te el 50 %, 60 %, 70 % o u 80 % de los és te res g ra sos p ro du c ido s te n d rá lados A y B cuya lo ng itud va ríe en a p ro x im a d a m e n te 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 14 ca rb on os . El lado A y el lado B ta m b ié n pu ed en m o s tra r n ive les de ram ificac ió n y sa tu ra c ió n s im ila res.

A d e m á s de p ro d u c ir a lcoh o le s g ra sos a p o rtad os al lado A, el h o sp e d a d o r de p ro du cc ión puede p ro d u c ir o tros a lco h o le s de cad en a co rta ta le s co m o e tano l, p ropano l, iso p ro pan o l, Isob u tano l y bu tano l para su in co rp o ra c ió n en el lado A u tiliza n d o té c n ic a s b ien c o n o c id a s en la m a te ria . P o r e jem p lo , el o rg a n ism o h o sp e d a d o r de p ro d u cc ió n puede p ro d u c ir bu tano l. P ara c re a r cé lu las p ro d u c to ra s de bu tano l, la cepa LS 9001, po r e jem p lo , puede g e n o m a n ip u la rse a d ic io n a lm e n te pa ra e xp re sa r atoB (a ce til-C o A a ce tiltra n s fe ra sa ) de Escherichia coli K12, p -h id ro x ib u tir il-C o A d e sh id ro g e n a sa de Butyrivibrio fibrisolvens, c ro to n a sa de Clostridium beijerinckii, bu tir il C o A d e sh id ro g e n a sa de Clostridium beijerinckii, a ld e h íd o d e sh id ro g e n a sa (A L D H ) de ac ilac ión de C o A de Cladosporium fulvum y adhE que co d ifica una a ld e h íd o a lco h o l d e s h id ro g e n a s a de Clostridium acetobutylicum en el v e c to r de e xp re s ió n p B A D 24 ba jo el s is tem a p ro m o to r prpBCDE. P ara p ro d u c ir bu tano l u o tros a lcoh o le s de cadena corta , o tros o rg an ism os h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión pu ed en m o d ifica rse de m an e ra s im ila r. P or e jem p lo , en un h o s p e d a d o r de p roducc ión pued e p ro du c irse e ta no l u tiliza n d o los m é to d o s de sc rito s po r K a lsch e u e r e t al., M ic ro b io lo gy , 152 :2529 -2536 , 2006.

III. Ingeniería genética de cepas de producción para aumentar/mejorar la producción/rendimiento de derivados de ácidos grasos

En una célula hospedadora de producción, utilizando técnicas conocidas en la materia, pueden introducirse de forma estable o transitoria secuencias de polinucleótidos heterólogas implicadas en una ruta biosintética para la producción de derivados de ácidos grasos. Como ejemplos no limitativos de dichas técnicas se incluyen electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada con DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, conjugación, transducción e integración genómica. Para la transformación estable, una secuencia de a Dn puede incluir además un marcador de selección, incluyendo, por ejemplo, marcadores de resistencia a antibióticos, y genes que complementan deficiencias auxotróficas. Por otro lado, los polinucleótidos endógenos implicados en la ruta biosintética para la producción de derivados de ácidos grasos también pueden mutarse utilizando técnicas de alteración genómica conocidas. Estas estrategias pueden aplicarse individualmente o en combinación.

Diversos aspectos del presente documento utilizan un vector de expresión que incluye una secuencia de ADN heteróloga que codifica una proteína implicada en una ruta metabólica o biosintética. Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero sin limitación, vectores víricos (tales como vectores de baculovirus), vectores de fagos (tales como vectores de bacteriófagos), plásmidos, fagémidos, cósmidos, fósmidos, cromosomas bacterianos artificiales, vectores víricos (por ejemplo, vectores víricos basados en virus variolovacunal, poliovirus, adenovirus, virus adenoasociados, SV40, virus del herpes simple, y similares), cromosomas artificiales basados en P1, plásmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura, y cualquier otro vector para hospedadores de producción específicos de interés (tales como E. coli, Pseudomonas pisum y Saccharomyces cerevisiae).

Los vectores de expresión útiles pueden incluir uno o más genes marcadores de selección para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedadoras de producción transformadas. Un gen marcador de selección codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de células hospedadoras que crecen en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedadoras de producción no transformadas con el vector que contiene el gen marcador de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos o a otras toxinas (por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina); (b) complementan deficiencias auxotróficas; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos (por ejemplo, el gen que codifica el racemato de D-alanina de Bacilli). En aspectos alternativos, el gen marcador de selección uno que codifica dihidrofolato reductasa o confiere resistencia a neomicina (para su uso en cultivos de células eucariotas), o uno que confiere resistencia a tetraciclina o ampicilina (para su uso en una célula hospedadora de producción procariota, tal como en E. coli).

En el vector de expresión, la secuencia de ADN que codifica el gen en la ruta biosintética está unida operativamente a una secuencia de control de expresión apropiada (por ejemplo, promotores, potenciadores, y similares) para dirigir la síntesis del producto génico codificado. Dichos promotores pueden obtenerse de fuentes microbianas o víricas, incluyendo, por ejemplo, de CMV y SV40. Dependiendo del hospedador de producción/sistema de vector utilizado, en el vector de expresión se puede utilizar cualquier número de elementos de control de transcripción y traducción adecuados, incluidos promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de transcripción, y similares. Véase, por ejemplo, Bitter et al., Methods in Enzymology, 153:516-544, 1987.

Como promotores adecuados para su uso en células hospedadoras procariotas se incluyen, pero sin limitación, promotores capaces de reconocer polimerasas de T4, T3, Sp6 y T7, los promotores Pr y Pl del bacteriófago lambda, los promotores de E. coli, trp, recA, de choque térmicolacZ, los promotores de alfa-amilasa y específicos de sigma de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, promotores de Streptomyces, el promotor int del bacteriófago lambda, el promotor bla del gen de beta-lactamasa de pBR322 y el promotor CAT del gen de cloranfenicol acetil transferasa. Los promotores procariotas se revisan en Glick, J. Indust. Microbiol., 1:277, 1987; Watson et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4a Ed. (1987), Benjamin Cummins (1987); y en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Los ejemplos no limitantes de promotores eucariotas adecuados para su uso en un hospedador de producción eucariota son de origen vírico e incluyen el promotor del gen de metalotioneína I de ratón (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:273, 1982); el promotor TK del virus del herpes (McKnight, Cell, 31:355, 1982); el promotor temprano de SV40 (Benoist et al., Nature, 290:304, 1981); el promotor de citomegalovirus (Foecking et al., Gene, 45:101, 1980); el promotor del gen gal4 de levadura (Johnston et al., PNAS (EE. UU.), 79:6971, 1982; Silver et al., PNAS (u Sa ), 81:5951, 1984); y el IgG promotor (Orlandi et al., PNAS (EE. UU.), 86:3833, 1989).

El hospedador de producción puede genomanipularse (modificarse mediante ingeniería genética) con una secuencia génica heteróloga que codifica un producto génico de la ruta biosintética que está unido operativamente a un promotor inducible. Los promotores inducibles son conocidos en la técnica. Como ejemplos no limitativos de promotores inducibles adecuados se incluyen promotores que son afectados por proteínas, metabolitos, o productos químicos. Estos incluyen, pero sin limitación: un promotor del virus de la leucemia bovina, un promotor de la metalotioneína, un promotor de MMTV inducible por dexametasona, un promotor de SV40, un promotor polIII de MRP, un promotor de CMV inducible por tetraciclina (tal como el promotor de CMV inmediato temprano humano) así como los operones trp y lac.

En a lgu nos e jem p los , un h o sp e d a d o r de p ro du cc ión se g e n o m a n ip u la con una secu en c ia gén ica h e te ró loga que co d ifica un p ro du c to gén ico de la ruta b ios in té tica que está un ido o p e ra tiva m e n te a un p ro m o to r con s titu tivo . Los p ro m o to re s con s titu tivo s a d ecu ad os son con oc idos en la té c n ic a e inc luyen el p ro m o to r ta rd ío p rinc ip a l de a d e n o v iru s con s titu tivo , un p ro m o to r co n s titu tivo de M P S V , o un p ro m o to r co n s titu tivo de C M V .

En a lg u n o s e jem p los, un h o s p e d a d o r de p ro du cc ión m o d ifica d o es uno que es tá g e n o m a n ip u la d o con una secu en c ia g é n ica exógena que c o d ifica una so la p ro te ína im p lica da en una ru ta de b ios ín tes is . En o tros aspec tos , un h o s p e d a d o r de p ro du cc ión m o d ifica d o es uno que es tá g e n o m a n ip u la d o con s e cu e n c ia s de genes e xó ge no s que cod ifica n dos o m ás p ro te ín a s im p lica d a s en una ruta de b ios ín tes is , po r e jem p lo , la p rim e ra y seg un da e n z im a s en una ru ta b ios in té tica .

C u a n d o un h o sp e d a d o r de p ro du cc ión se g e n o m a n ip u la para e xp re sa r dos o m ás p ro te ínas im p lica d a s en una ruta b ios in té tica , es tas se cu e n c ia s gé n icas pueden e s ta r co n te n id a s en un so lo v e c to r de exp res ión o en ve c to re s de e xp res ión d is tin tos . C u an do esas s e cu e n c ia s gé n icas están co n te n id a s en un so lo v e c to r de exp res ión , en a lgu nos asp ec tos , las se cu e n c ia s de p o lin u c le ó tid o s esta rán un idas o p e ra tiva m e n te a un e le m e n to de con tro l com ún en do nde d icho e lem e n to con tro la la exp res ión de to d a s las se cu e n c ia s gé n icas que cod ifican las p ro te ínas de la ruta b io s in té tica en el ún ico v e c to r de exp res ión (p o r e jem p lo , un p rom otor).

C u a n d o un h o s p e d a d o r de p ro du cc ión m o d ifica d o se g e n o m a n ip u la con s e cu e n c ia s de A D N he te ró lo g a s que cod ifica n dos o m ás p ro te ínas im p lica da s en una ruta de b ios ín tes is , una de las se cu e n c ia s de A D N puede e s ta r un id a o p e ra tiva m e n te a un p ro m o to r induc ib le , y una o m ás de las s e cu e n c ia s de A D N pueden e s ta r un idas o p e ra tiva m e n te a un p ro m o to r con s titu tivo .

En a lgu nos aspec tos , la co n ce n tra c ió n in tra ce lu la r (es decir, la co n cen tra c ión en el h o sp e d a d o r de p roducc ión g e n o m a n ip u la d o ) de un p ro du c to in te rm ed io de una ruta b ios in té tica , puede a u m e n ta rse para re fo rza r m ás el re n d im ie n to de l p ro du c to fina l. La c o n ce n tra c ió n in tra ce lu la r de l p ro du c to in te rm ed io puede a u m e n ta rse de va ria s m aneras , in c luye nd o , pe ro sin lim itac ión , el a u m e n to de la co n ce n tra c ió n en el m ed io de cu ltivo de un sus tra to para una ruta b ios in té tica ; el a u m e n to de la ac tiv ida d ca ta lítica de una en z im a que es a c tiva en la ru ta b ios in té tica ; el a u m e n to de la ca n tid a d in tra c e lu la r de un su s tra to (p o r e je m p lo ,u n su s tra to p r im a rio ) pa ra una e n z im a qu e es a c tiva en la ru ta b ios in té tica ; y s im ila res.

En a lg u n o s e jem p los , el d e riva d o de ác ido g ra so o p ro d u c to in te rm e d io se p ro d u ce en e l c ito p la sm a de l h o s p e d a d o r de p ro du cc ión . La co n ce n tra c ió n c ito p la sm á tica se puede a u m e n ta r de va ria s m aneras, in c luye nd o , pero sin lim itac ión , unión del ác ido g raso a la coe nz im a A para fo rm a r un a c il-C o A tioé s te r. A d ic io n a lm e n te , la con cen tra c ión de a c il-C o A se puede a u m e n ta r al a u m e n ta r la b io s ín te s is de C o A en la cé lu la , ta l co m o m e d ia n te la so b re e xp re s ió n de ge ne s a s o c ia d o s con la b io s ín te s is de p a n to te n a to (p o r e jem p lo , panD) o in a c tiva c ió n de ge ne s a so c ia d o s con la b ios ín tes is de g lu ta tió n (p o r e jem p lo , g lu ta tió n s in tasa).

En el c ro m o so m a de l h o sp e d a d o r de p ro du cc ión pu ed en in tro d u c irse o a lte ra rse s e cu e n c ia s regu lado ras , se cu e n c ia s cod ifica n tes , y c o m b in a c io n e s de las m ism as. En a lgu nos e jem p los , la in te g ra c ión de la secu en c ia reco m b in an te de sea da en la se cu e n c ia ge n ó m ica del h o sp e d a d o r de p roducc ión no requ ie re el uso de un m a rca d o r de se lecc ión ta l com o un an tib ió tico . En a lgunos e jem p los , las a lte rac ione s g e n ó m ica s in c luyen el cam b io de la secu en c ia de con tro l de los genes d iana al re e m p la za r el p ro m o to r (o los p ro m o to re s ) na tivo con un p ro m o to r que es in sen s ib le a la regu lac ión . E x is ten n u m e ro sa s e s tra te g ia s para h a ce r esto . P o r e jem p lo , V a lle y F lo res, en M e tho ds Mol. Biol., 267 :113 -122 , 2006 , de sc rib en un m é tod o basado en P C R para so b re e x p re s a r genes c ro m o só m ico s en E. coli. O tra e s tra te g ia se basa en el uso de o lig o n u c le ó tid o s m o n o ca te n a rio s pa ra c re a r m u ta c io n e s e sp e c ífica s d ire c ta m e n te en el c rom o som a , u tiliza n d o la té c n ic a d e sa rro lla d a po r C o u rt e t al., P N A S (U S A ), 100 :15748 -15753 , 2003. E sta té cn ica se basa en el uso de la so b re e x p re s ió n de la p ro te ína B eta de l b a c te rió fa g o la m bd a pa ra p o te n c ia r la re co m b in a c ió n gené tica . C o m o v e n ta ja s de es ta e s tra te g ia se inc luyen que pu eden u tiliza rse o lig o n u c le ó tid o s s in té ticos de 70 bases de lo ng itud (o m ás) para c re a r m u tac ion es , in se rc io n e s y d e le c ion es pun tua les , e lim in a n d o a s í cu a lq u ie r e ta pa de c lo na c ión . A s im ism o , el s is te m a es lo s u fic ie n te m e n te e ficaz com o para que no sean n e cesa rios m a rca d o re s para a is la r las m u ta c io n e s deseadas .

C on esta e s tra te g ia , la reg ión reg u la d o ra de un gen pued e ca m b ia rse pa ra c re a r un p ro m o to r m ás fu e rte y /o e lim in a r el s itio de un ión de un rep reso r. P o r con s ig u ie n te , en el o rg a n ism o h o sp e d a d o r de p ro du cc ión puede s o b re e xp re sa rse un gen deseado .

IV. Fermentación

A. Maximización de la eficacia de producción

La p ro d u cc ió n y el a is la m ie n to de d e riv a d o s de ác ido s g ra sos pu eden m e jo ra rse e m p le a n d o té c n ic a s e sp e c ífica s de fe rm e n ta c ió n . Un m étod o para m a x im iz a r la p ro du cc ión al m ism o tie m p o que reduce costes, es a u m e n ta r el p o rce n ta je de la fu e n te de ca rb o n o que se tra n s fo rm a en p ro du c to s de h id roca rbu ro .

D u ran te los c ic los de v id a ce lu la res no rm a les , el ca rb o n o se u tiliza en las fu n c io n e s ce lu la re s para p ro d u c ir líp idos, sacá rid os , p ro te ínas, ác ido s o rg á n ico s y p o lin u c le ó tid o s . La red ucc ión de la can tidad de ca rb on o ne cesa ria para las a c tiv id a d e s re la c io n a d a s con el c rec im ien to , pu ede a u m e n ta r la e fica c ia de la tra n s fo rm a c ió n de la fu e n te de ca rbono a la p ro du cc ión . E sto pu ede rea liza rse cu ltiva n d o p rim e ro los m ic ro o rg a n is m o s a una de ns idad deseada , lo cua l se rea liza en el p ico de la fase lo ga rítm ica de cu ltivo . D espués, para d e te n e r el c re c im ie n to de las cé lu las , pueden a p ro ve ch a rse genes del pun to de con tro l de rep licac ión . E spe c íficam en te , para a c tiva r genes aso c ia dos a la fase es ta c ion a ria , pueden u tiliza rse m e ca n ism o s de pe rcep c ión de cu ó ru m (quorum sensing mechanisms), (según lo rev isad o en C am illi y B ass le r, S c ience , 311 :1113 , 2006; V en tu ri, F E M S M icrob io . R ev., 30 :274 -291 ,2006 ; y R ead ing y S pe ran d io , B M C M icrob io l. Lett., 254: 1-11,2006).

G enes que pueden a c tiva rse para d e te n e r la re p lica c ió n y el c re c im ie n to c e lu la r en E. coli in c luye n genes umuDC, cuya so b re e xp re s ió n d e tie n e la p ro g re s ión de la fase e s ta c io n a ria al c re c im ie n to e x p o n e n c ia l (M u rli e t al., J. o f B act., 182 :1127 , 2000 ). U m u C es una A D N p o lim e ra sa que pu ede lle va r a cab o la s ín te s is de tra n s le s ió n sob re le s ion es no co d ifica n te s - la base m e cá n ica de la m a yo ría de las m u ta g é n e s is U V y qu ím ica . Los p ro du c to s gé n icos umuDC se u tilizan para el p ro ceso de s ín tes is de tra n s le s ió n y ta m b ié n s irven com o pun tos de con tro l de da ño s en secu en c ias de po lin u c le ó tid o s . Los p ro du c to s ge né ticos umuDC in c luyen U m uC , U m uD , um uD ', U m u D '²C, U m u D '²y /o U m u D ². M ie n tras tan to , los genes p ro du c to res de p ro du c to pueden ac tiva rse , m in im iza nd o as í la ne ces idad de u tiliza r ru tas de rep lica c ió n y m a n te n im ie n to m ie n tras se p ro du ce el de riva d o de ác ido graso . Los m ic ro o rg a n ism o s h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión ta m b ié n pueden g e n o m a n ip u la rse para e xp re sa r umuC y /o umuD de E. coli en p B A D 24 ba jo el s is te m a p ro m o to r prpBCDE a tra v é s de la s ín te s is de novo de es to s ge ne s con los ge ne s de p ro du cc ión de l p ro du c to fina l ap rop iad os .

El po rcen ta je de c a rb o n e s de e n tra da tra n s fo rm a d o s en é s te re s g ra sos o en p ro du c to s de h id ro ca rbu ro es un in d u c to r de costes. C u an to m ás e ficaz sea el p ro ceso (es decir, cua n to m a yo r sea el po rcen ta je de ca rb o n e s de e n tra da tra n s fo rm a d o s en és te res g ra sos o p ro du c to s de h id ro ca rbu ro , m en os cos toso será el p roceso . P ara las fu e n te s de ca rb o n o que con tien en ox íg e n o (p o r e jem p lo , g lu co sa y o tras fu e n te s ba sad as en h id ra to s de ca rbono), el o x íg eno se libe ra en fo rm a de d ióx id o de ca rbono . P o r cada 2 á tom os de o x íg eno libe rados , ta m b ié n se libe ra un á to m o de ca rb on o , lo que con du ce a una e fica c ia m e ta b ó lica te ó ric a m áx im a de a p ro x im a d a m e n te 34 % (p /p ) (pa ra p ro du c to s d e riva dos de ác ido s grasos). S in em bargo , esta cifra, cam b ia para o tros p ro du c to s de h id ro ca rbu ro y fu e n te s de ca rbono . Las e fica c ia s típ ica s en la b ib liog ra fía son a p ro x im a d a m e n te <5 %. Los ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión g e n o m a n ip u la d o s para p ro d u c ir p ro du c to s de h id ro ca rbu ros , pueden te n e r una e fica c ia s u p e rio r a a p ro x im a d a m e n te 1 %, p o r e jem p lo , una e fica c ia m a y o r que a p ro x im a d a m e n te 3 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % o 30 % . En un e jem p lo , los h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión m os tra rá n una e fica c ia de a p ro x im a d a m e n te 10 % a a p ro x im a d a m e n te 25 %. En o tros e jem p los, d icho s h o spe da do re s de p ro du cc ión m os tra rá n una e fica c ia de a p ro x im a d a m e n te 25 % a a p ro x im a d a m e n te 30 %. En o tros e jem p los , d ichos ho sp e d a d o re s de p roducc ión m os tra ra n una e fica c ia > 30 %.

El h o s p e d a d o r de p ro du cc ión puede g e n o m a n ip u la rse ad ic io n a lm e n te para e xp re sa r ce lu lo so m a s reco m b in an te s , com o los desc ritos en la so lic itud P C T nú m ero P C T /U S 2007 /003736 , lo que puede p e rm itir al p ro d u c to r de p ro du cc ión u tiliza r m a te ria l ce lu ló s ico com o fue n te de ca rb on o . P o r e jem p lo , el h o s p e d a d o r de p ro du cc ión puede g e n o m a n ip u la rse a d ic io n a lm e n te para e x p re s a r in ve rta sa s (E C 3.2.1.26 ) pa ra que la s a ca ro sa pued a u tiliza rse com o fu e n te de carbono .

De m a n e ra s im ila r, el h o sp e d a d o r de p ro d u cc ió n pued e g e n o m a n ip u la rs e u tiliza n d o las e n se ñ a n za s d e sc rita s en las p a te n te s de EE. UU. Nos. 5 000 000; 5 028 539; 5 424 202; 5 482 846; y 5 602 030, de m od o que el h o s p e d a d o r de p ro du cc ión pu eda a s im ila r el ca rb o n o de m an e ra e fica z y u tiliza r m a te ria le s c e lu ló s ico s com o fu e n te s de carbono . En un e jem p lo , la cám a ra de fe rm e n ta c ió n con tien e un c ic lo /m e zc la de fe rm e n ta c ió n que está e x p e rim e n ta n d o una red ucc ión con tinua . En este caso , se crea un e n to rno re d u c to r es tab le . El eq u ilib rio de e le c tro n e s se m an tien e g ra c ia s a la libe ra c ió n de d ióx id o de ca rb on o (en fo rm a gaseosa). Los e s fu e rzos para a u m e n ta r el equ ilib rio en tre N A D /H y N A D P /H ta m b ié n pu ed en fa c ilita r la e s ta b iliza c ió n de l eq u ilib rio e lec trón ico .

La d ispo n ib ilida d de N A D P H in tra ce lu la r ta m b ié n puede m e jo ra rse g e n o m a n ip u la n d o el h o sp e d a d o r de p roducc ión para e xp re sa r una N A D H :N A D P H tra n sh id ro g e n a sa . La exp res ión de una o m ás N A D H :N A D P H tra n sh id ro g e n a sa s tra n s fo rm a el N A D H p ro du c ido en la g lucó lis is en N A D P H , lo que m e jo ra la p roducc ión de de riva dos de ác idos grasos.

B. Producción de hidrocarburos a pequeña escala

P ara la p ro du cc ión de p ro du c to s de h id ro ca rb u ro s a pe queña esca la , cé lu la s BL21 (D E 3 ) de E. coli que llevan p B A D 24 (con res is te nc ia a am p ic ilin a y la ruta de s ín tes is del p ro du c to fina l), as í com o pU M V C 1 (con res is te nc ia a ka n a m ic in a y el s is tem a de s o b re e x p re s ió n de a ce til C o A /m a lo n il C o A ) se in cub an d u ra n te la no che en m a tra ce s de 2 litro s a 37 °C, a g ita n d o a> 200 rpm en 500 m l de m ed io LB c o m p le m e n ta d o con 75 pg /m l de a m p ic ilin a y 50 pg /m l de kan am ic ina hasta que los cu ltivos a lcancen una D O ⁶⁰⁰de> 0,8. D e spués de a lc a n z a r una D O ⁶⁰⁰de> 0,8, las cé lu la s se co m p le m e n ta n con p ro p iona to de sod io 25 mM (a pH 8 ,0 ) para a c tiv a r los s is te m a s gé n icos g e n o m a n ip u la d o s para la p ro du cc ión y para d e te n e r la p ro life ra c ió n c e lu la r m ed ia n te la a c tiva c ió n de las p ro te ínas U m u C y U m uD . La e ta pa de indu cc ión se rea liza du ran te 6 ho ras a 30 °C. D e spu és de la incubac ión , el m ed io se exa m in a pa ra d e te rm in a r el p ro du c to de h id ro ca rb u ro u tilizan do G C -M S .

C. Producción de hidrocarburos a gran escala

P ara la p ro du cc ión de p ro du c to s a g ran esca la , los ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión g e n o m a n ip u la d o s se cu ltivan en lo tes de 10 litros, 100 litros, o m ás g randes ; se fe rm en tan ; y se inducen para e xp re sa r los p ro du c to s de sea do s ba sá n d o se en los ge ne s e sp e c ífico s c o d ifica d o s en los p lásm id os a p ro p ia d o s en los m ism os.

P o r e jem p lo , cé lu las BL21 (D E 3 ) de E. coli que llevan pB A D 24 (con res is te nc ia a am p ic ilin a y la ruta de s ín tes is del p ro du c to fina l), a s í com o pU M VC 1 (con res is te nc ia a kan am ic ina y el s is tem a de so b re e xp re s ió n de ace til C o A /m a lo n il C oA ), se in cub an a pa rtir de un cu ltivo de sem illa de 500 m l du ran te un c ic lo de fe rm e n ta c ió n de 10 litros (o un cu ltivo de sem illa de 5 litros para una fe rm e n ta c ió n de 100 litros) en un m ed io LB (s in g lice ro l) que con tien e k a n a m ic in a 50 pg /m l y a m p ic ilin a 75 pg /m l a 37 °C, que se ag ita a> 200 rpm hasta que el cu ltivo a lcanza una D O ⁶⁰⁰de> 0,8, un p roceso que no rm a lm e n te du ra a p ro x im a d a m e n te 16 horas. El m ed io de fe rm e n ta c ió n se co m p le m e n ta de m an e ra c o n tin u a d a para m a n te n e r una c o n ce n tra c ió n de fo s fa to de sod io de 25 m M , a pH 8,0, para a c tiv a r los s is te m a s g é n ico s g e n o m a n ip u la d o s para la p ro d u cc ió n y para d e te n e r la p ro life ra c ió n c e lu la r m e d ia n te la a c tiva c ió n de las p ro te ínas U m uC y U m uD . El m ed io ta m b ié n se c o m p le m e n ta de m a n e ra c o n tin u a d a con g lucosa para m a n te n e r una c o n ce n tra c ió n de 25 g /100 ml.

D e spu és de la p rim e ra hora de inducc ión , una a lícu o ta de no m ás del 10 % del vo lu m e n c e lu la r to ta l, se re tira cada hora y se de ja re p o s a r sin ag itac ión , lo que a su ve z pe rm ite que el p ro du c to (o p ro d u c to s ) de h id ro ca rb u ro sub an a la sup e rfic ie , e x p e rim e n ta n d o una se p a ra c ió n de fase e sp on tá ne a . El com p o n e n te de h id ro ca rb u ro se recoge y la fase a cu osa vu e lve a la cám a ra de reacc ión . La cám a ra de rea cc ió n fu n c io n a de m an e ra con tinu ad a . C u ando la D O ⁶⁰⁰cae po r de ba jo de a p ro x im a d a m e n te 0,6, las cé lu la s se ree m p la za n con un nu evo lo te de cu ltivo a p a rtir de un cu ltivo de sem illa .

P a ra la p ro d u cc ió n de é s te re s de cera , los é s te re s de ce ra se a ís lan , se lavan rá p id a m e n te en H C l 1 M y re to rn an a un pH 7 a tra vé s de un lavado e xh a u s tivo con ag ua destilada .

V. Procesamiento de postproducción

Los de riva dos de ác ido s g rasos p ro du c ido s d u ran te la fe rm e n ta c ió n pueden sep a ra rse de los m ed io s de fe rm e n ta c ió n . P ara s e p a ra r d e riva d o s de ác ido s g ra sos de m ed io s acu o so s puede u tiliza rse cu a lq u ie r té cn ica con oc ida . Un p ro ceso de se p a ra c ió n e je m p la r es un p roceso de se p a ra c ió n de dos fa se s (b ifás ico ). E ste p roceso im p lica la fe rm e n ta c ió n de los ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión g e n o m a n ip u la d o s en con d ic io n e s su fic ie n te s para p ro d u c ir un de riva d o de ác ido graso , p e rm itien do re co g e r el de riva d o en una fase o rg án ica , y la sep a ra c ión de la fase o rg á n ica del ca ldo de fe rm e n ta c ió n acuoso . Este m é tod o puede lle va rse a la p rá c tica en e n to rno s de fe rm e n ta c ió n ta n to en lo tes com o en fe rm e n ta c ió n con tinua .

La se p a ra c ió n b ifá s ica a p ro ve ch a la re la tiva in m isc ib ilida d de los de riva dos de ác ido s g ra sos para fa c ilita r la sep a ra c ió n . " In m is c ib ilid a d " se re fie re a la in ca p a c id a d re la tiva de un co m p u e s to para d iso lve rse en ag ua y se de fine y /o d e te rm in a m e d ia n te el c o e fic ie n te de rep a rto de los co m p u e s to s . Un e xp e rto ha b itu a l en la m a te ria a p re c ia rá que e lig ie n d o un ca ldo de fe rm e n ta c ió n y una fase o rgán ica de m an era que el de riva do de ác ido g ra so que se p roduce te n g a un a lto v a lo r logP, el de riva d o de ác ido g ra so se s e p a ra rá en la fase o rg á n ica en el rec ip ie n te de fe rm e n ta c ió n , in c luso a c o n ce n tra c io n e s bajas.

Los d e riva d o s de ác ido s g ra sos p ro d u c id o s según las co m p o s ic io n e s , los vec to re s , las cé lu las y los m é tod os de sc rito s en este docum e n to , se rán re la tiva m e n te in m isc ib le s en el ca ldo de fe rm e n ta c ió n , as í com o en el c itop la sm a . P or lo tan to , el de riva d o de ác ido g raso se reco ge rá en una fase o rg án ica ya sea in tra ce lu la rm e n te y/o e x tra ce lu la rm e n te . La re co g id a de los p ro du c to s en la fase o rg á n ica d ism in u irá el im p ac to de los d e riva d o s de ác ido s g ra sos sob re la fun c ión ce lu la r, y p e rm itirá al h o s p e d a d o r de p ro d u c to r p ro d u c ir una m a yo r can tidad de p roducto d u ra n te m ás tiem po.

Los a lcoh o le s grasos, los és te res g rasos, las ce ra s y los h id ro ca rb u ro s p ro du c ido s se g ú n las d ivu lg a c io n e s de este do cum e n to , pe rm iten la p ro du cc ión de com p ue s to s h o m og éne os en los que al m en os a p ro x im a d a m e n te el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 % de los a lcoh o le s g rasos, és te res g ra sos y ceras p ro du c ido s a d e cu a d a m e n te , tien en lo ng itude s de cad en a de ca rb o n o que va ría n en m en os de a p ro x im a d a m e n te 6, m en os de a p ro x im a d a m e n te 4 o m en os de a p ro x im a d a m e n te 2 ca rbonos . E stos co m p u e s to s ta m b ié n pueden p ro du c irse de m odo que te n g a n un g rado de sa tu ra c ió n re la tiva m e n te un ifo rm e , po r e jem p lo , al m en os a p ro x im a d a m e n te el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 % de los a lcoh o le s g rasos, és te res g rasos, h id ro ca rb u ro s y ceras, es tán m on o in sa tu ra d o s , d iin sa tu ra d o s o tr iin sa tu ra d o s . E stos co m p u e s to s pueden u tiliza rse d ire c ta m e n te com o p ro du c to s o c o m p o n e n te s de p roduc tos , po r e jem p lo , com o co m b u s tib le s , de te rge n tes , lub rican tes , ad itivo s para el cu id a d o pe rsona l, c o m p le m e n to s s u p le m e n to s etc. E s tos c o m p u e s to s ta m b ié n pueden u tiliza rse co m o m ate ria prim a para rea cc io nes p o s te rio res para p re p a ra r o tros p roductos, inc luyendo , po r e jem p lo , tra n se s te rif ica c ió n , h id ro gen ac ión , c ra q u e o ca ta lítico (m e d ia n te h id ro gen ac ión , p iró lis is , o am bas), o rea cc io nes de epox idac ión .

Los a lcoh o le s g rasos, los és te res g rasos , las ce ra s y los h id ro ca rb u ro s p ro d u c id o s según las co m p o s ic io n e s , los vec to re s , las cé lu la s y los m é tod os d ivu lg ad os en este d o cu m e n to con tienen n ive les ba jos de e le m e n to s no e sp e ra d o s o no desea do s , in c luye nd o , pero sin lim itac ión , m e ta les pesados. En a lgu nos aspec tos , los a lcoh o le s g rasos, los és te res g rasos, las ce ras y los h id ro ca rbu ros p ro du c ido s com o se de sc rib e en el p resen te docum en to , con tien en a d e cu a d a m e n te m en os de a p ro x im a d a m e n te 50 ppm de a rsén ico ; m en os de a p ro x im a d a m e n te 300 ppm de ca lc io ; m en os de a p ro x im a d a m e n te 200 ppm de c lo ro; m en os de a p ro x im a d a m e n te 50 ppm de coba lto ; m en os de a p ro x im a d a m e n te 50 ppm de cob re ; m en os de a p ro x im a d a m e n te 300 ppm de h ie rro ; m en os de a p ro x im a d a m e n te 2 % en peso de agua; m enos de a p ro x im a d a m e n te 50 ppm de p lom o; m en os de a p ro x im a d a m e n te 50 ppm de m an ga neso ; m en os de a p ro x im a d a m e n te 0 ,2 ppm de m ercu rio ; m en os de a p ro x im a d a m e n te 50 ppm de m o libdeno ; m en os de a p ro x im a d a m e n te 1 % en peso de n itró ge no ; m en os de a p ro x im a d a m e n te 200 ppm de po tas io ; m en os de a p ro x im a d a m e n te 300 ppm de sod io ; m en os de a p ro x im a d a m e n te 3 % en peso de azu fre ; m en os de 50 ppm de cinc; y /o m en os de 700 ppm de fósfo ro .

En a lg u n o s asp ec tos , los a lcoh o le s g rasos, los és te res g rasos, las ce ra s y los h id ro ca rb u ro s p ro du c ido s según las d ivu lg a c io n e s de este d o cum e n to , con tienen en tre a p ro x im a d a m e n te 50 % y a p ro x im a d a m e n te 90 % de carbono; en tre a p ro x im a d a m e n te 5 % y a p ro x im a d a m e n te 25 % de h id rógeno ; o en tre a p ro x im a d a m e n te 5 % y a p ro x im a d a m e n te 25 % de ox ígeno . En o tros a sp e c to s de las rea liza c io nes , los a lco h o le s g rasos, los é s te re s grasos, las ceras y los h id ro ca rb u ro s p ro du c ido s com o se de sc rib e en este d o cum e n to , con tien en en tre a p ro x im a d a m e n te 65 % y a p ro x im a d a m e n te 85 % de ca rbono ; en tre a p ro x im a d a m e n te 10 % y a p ro x im a d a m e n te 15 % de h id rógeno ; o en tre a p ro x im a d a m e n te 10 % y a p ro x im a d a m e n te 20 % de oxígeno .

VI. Composiciones de combustible

C o m o se d e sve la en el p re se n te do cu m e n to , c ie rto s d e riv a d o s de ác ido s g ra so s fa b ric a d o s seg ún los m é to d o s y las c o m p o s ic io n e s d e sc rito s en el p resen te do cu m e n to , poseen d ive rsa s ca ra c te rís tica s v e n ta jo sa s para su uso com o co m b u s tib le . Un e xp e rto en la m a te ria a p re c ia rá que, d e p e n d ie n d o de l p ro p ó s ito p re v is to de l co m b u s tib le , d ife re n te s d e riva d o s de ác ido s g ra sos pueden te n e r v e n ta ja s en co m p a ra c ió n con o tros de riva dos de ác ido s g rasos. P or e jem p lo , los d e riva dos de ác idos g ra sos ra m ifica d o s pueden s e r m ás d e sea b le s com o co m b u s tib le s para a u to m ó v ile s o co m o c o m p o n e n te s de c o m b u s tib le s pa ra a u to m ó v ile s que es tá n de s tin a d o s a su uso en c lim a s fríos. De m an e ra s im ila r, en d e te rm in a d a s ap lica c io ne s , puede s e r v e n ta jo s o p ro d u c ir un co m b u s tib le que esté m ás o m en os o x ig e n a d o o m ás o m en os sa tu rado .

U tiliza n d o los m é todos de sc ritos en el p re sen te docum e n to , pueden p ro d u c irse co m b u s tib le s que com p ren dan d e riva d o s de ác ido s g ra sos re la tiva m e n te h o m o g é n e o s que, al m ism o tie m p o , te n g a n las ca ra c te rís tica s /cu a lid a d e s desea da s . D ichos co m b u s tib le s ba sad os en d e riva d o s de ác ido s g ra sos pueden ca ra c te riza rse po r la hue lla de ca rb o n o y po r su fa lta de im purezas , en com p a ra c ió n con los co m b u s tib le s de riva dos del pe tró leo o el b iod iese l de riva d o de tr ig licé rid o s , ta m b ié n resu lta s e r una ven ta ja . Los co m b u s tib le s ba sados en de riva dos de ác idos g rasos pueden c o m b in a rse con o tros co m b u s tib le s o ad itivos de com b u s tib le para p ro d u c ir co m b u s tib le s que te n g a n las p ro p ieda de s deseadas .

Los ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión y los m é tod os de sve la d o s en el p re sen te d o cu m e n to pueden u tiliza rse para p ro d u c ir á c id o s g ra so s lib res y és te re s g rasos. En a lg u n o s asp ec tos , los h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión y los m é tod os d e sve la d o s en el p re sen te d o cu m e n to pueden u tiliza rse para p ro d u c ir un títu lo o re n d im ie n to m ás alto y /o m e jo rado de d e riva d o s de ác ido s grasos, in c luye nd o , po r e jem p lo , ác ido s g rasos lib res y /o é s te re s g rasos. En a lgu nos aspec tos , el po rcen ta je de ác ido s g rasos lib res en el p roducto p ro du c ido po r el h o sp e d a d o r de p roducc ión es de al m en os a p ro x im a d a m e n te 1 %, po r e jem p lo , de al m en os a p ro x im a d a m e n te 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 % , 15 % , 20 % o 25 % . En a lgu nos aspec tos , el po rcen ta je de és te res g rasos en el p ro du c to p ro du c ido po r el h o s p e d a d o r de p ro du cc ión es de al m en os a p ro x im a d a m e n te 50 %, po r e jem p lo , de al m en os a p ro x im a d a m e n te 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 %. En a lgu nos aspec tos , la re lac ión de é s te re s g ra sos a ác idos g ra sos lib res en el p ro d u c to p roduc ido po r el h o sp e d a d o r de p ro du cc ión es de a p ro x im a d a m e n te 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 5:1, 2:1 o 1:1. En d e te rm in a d o s asp ec tos , el é s te r g ra so p ro d u c id o po r el h o s p e d a d o r de p ro du cc ión es d o d e ca n o a to de e tilo , tr id e c a n o a to de etilo , te tra d e c a n o a to de e tilo , p e n ta d e ca n o a to de etilo , c /s -9 -h e xa d e ce n o a to de etilo, h e xa d e ca n o a to de etilo, he p ta d e ca n o a to de etilo , c /s -11 -o c ta d e ce n o a to de etilo , o c ta d e ca n o a to de etilo, o co m b in a c io n e s de los m ism os. En o tros asp ec tos d e te rm in ado s , el é s te r g ra so p ro d u c id o po r la p ro du cc ión es el d o d e ca n o a to de m etilo , tr id e c a n o a to de m etilo , te tra d e c a n o a to de m etilo , p e n ta d e ca n o a to de m etilo , c/s-9-h e xa d e ce n o a to de m etilo , h e xa d e ca n o a to de m etilo , he p ta d e ca n o a to de m etilo , c /s -11 -o c ta d e ce n o a to de m etilo , o c ta d e c a n o a to de m e tilo , o co m b in a c io n e s de los m ism os. En c ie rto s a sp e c to s de re a liza c io n e s , el ác ido g ra so lib re p ro d u c id o po r el h o sp e d a d o r de p ro du cc ión es ác ido d o de can o ico , ác ido te tra d e ca n o ico , ác ido pen tad eca no ico , ác ido c /s -9 -h e xa d e ce n o ico , ác ido he xad eca no ico , ác ido c /s -11 -o c tade cen o ico , o c o m b in a c io n e s de los m ism os.

Los ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión y los m é tod os de sve la d o s en el p re sen te d o cu m e n to pueden u tiliza rse para p ro d u c ir d ife ren te s p ro p o rc io n e s de ác idos g ra sos lib res y é s te re s g rasos. En a lgunos aspec tos , la p ro po rc ión de ác ido s g ra sos lib res en el p ro d u c to se pu ede m o d ifica r de a cu e rd o con los m é todos , las c o m p o s ic io n e s , los ve c to re s y las cé lu la s d e sc rito s en el p re se n te d o cu m e n to de ta l m an e ra que la p ro po rc ión es m a yo r o m e n o r en co m p a ra c ió n con los és te res g ra sos que se p ro du cen . En c ie rto s asp ec tos re lac io na do s , la p ro po rc ión de é s te re s g ra sos en el p ro du c to ta m b ié n se puede m o d ifica r según las d ivu lg a c io n e s de este docum e n to , de m odo que la p ropo rc ión sea m a yo r o m e n o r en com p ara c ión con los o tros p roductos, po r e jem p lo , los á c id o s g rasos libres, que se p roducen . En o tros asp ec tos d e te rm in ado s , el re n d im ie n to p ro po rc ion a l de l de riva d o de ác ido g raso con c ie rta s lo ng itude s de ca d e n a de ca rb o n o se pued e a u m e n ta r o d ism inu ir.

A. Huella de carbono

Los de riva dos de ác idos g ra sos p ro du c ido s b io ló g ica m e n te rep rese n tan una nueva fu e n te de com b us tib les , ta les com o a lcoho les , d iese l y gaso lina . Los b io co m b u s tib le s fa b rica d o s de acu e rd o con los m é tod os y co m p o s ic io n e s d e sc rito s en este d o cu m e n to no se han p ro d u c id o hasta ah o ra a p a rtir de fu e n te s ren ova b le s y son nuevas c o m p o s ic io n e s de m a te ria . E stos nuevos co m b u s tib le s se pueden d is tin g u ir de los co m b u s tib le s de riva d o s de ca rb o n o pe tro qu ím ico b a sán do se en la dob le hu e lla iso tó p ica de ca rbono . A d ic io n a lm e n te , la fuen te esp e c ífica de ca rb o n o de o rigen b io ló g ico (p o r e jem p lo , g luco sa fren te a g lice ro l) se puede d e te rm in a r m ed ia n te la dob le hue lla iso tó p ica de ca rb o n o (véa se la P a te n te de E s tad os U n ido s N° 7 169 588, en pa rticu la r, de la col. 4, línea 31, a la col.

6, línea 8).

Los de riva dos de ác ido s g rasos y los b io co m b u s tib le s aso c ia dos , los p ro du c to s qu ím icos y las m ezc las , se pueden d is tin g u ir de sus hom ó logo s p ro ced en te s de p ro du c to s p e tro qu ím icos ba sán do se en el 14C (fM) y en la dob le hue lla iso tó p ica de carbono .

Los de riva dos de ác ido s g ra sos de sc ritos en el p re sen te do cu m e n to tien en u tilidad en la p ro du cc ión de b io co m b u s tib le s y p ro du c to s qu ím icos . Los nuevos p ro du c to s ba sad os en d e riva d o s de ác ido s g rasos p ro p o rc io n a d o s po r la p resen te d ivu lg a c ió n se pueden d is tin g u ir ad ic io n a lm e n te b a sán do se en la do b le hue lla iso tó p ica de ca rb on o de aq ue llo s m a te ria le s de riva dos e xc lu s iva m e n te de fu e n te s pe tro qu ím icas . La ca p ac idad de d is tin g u ir es tos p ro du c to s es b e ne fic iosa para el ras treo de es to s m a te ria le s en el com e rc io . P or e jem p lo , los c o m b u s tib le s o p ro du c to s q u ím ico s que co m p re n d e n pe rfile s de isó to po s de ca rb o n o ta n to "n u e vo s" com o "v ie jo s " se pu ed en d is tin g u ir de los c o m b u s tib le s y p ro du c to s qu ím ico s fa b rica d o s de m a te ria le s "v ie jo s". P o r tan to , los p re sen te m a te ria le s pueden se g u irse o "ra s tre a rse " en el co m e rc io o pueden id e n tifica rse en el co m e rc io com o un b io co m b u s tib le b a sán do se en su perfil ún ico. A de m ás , o tros m a te ria le s c o m p e tid o re s pueden id e n tifica rse com o d e riva d o s b io ló g icos o d e riva d o s de una fu e n te pe troqu ím ica .

En a lgu nos e jem p los , se fa b ric a una co m p o s ic ió n de b ioco m bus tib le , que in c luye un de riva d o de ác ido g ra so que tie n e un v a lo r 813C de a p ro x im a d a m e n te -10 ,9 a a p ro x im a d a m e n te -15 ,4 , en do nde el de riva do de ác ido graso rep rese n ta al m en os a p ro x im a d a m e n te el 85 % de l m a te ria l de o rigen b io ló g ico (es decir, p ro ced en te de un recu rso ren o va b le ta l com o, po r e jem p lo , m a te ria le s ce lu ló s ico s y a zú ca re s ) en la com p os ic ión . En o tros e jem p los , la co m p o s ic ió n de b io co m b u s tib le in c luye un de riva d o de ác ido g ra so que tie n e la fó rm u la :

X -(C H (R ))nC H 3

en la que

X = C H ³, -C H ²O R ¹; -C (O )O R 2; o -C (O )N R 3R4;

R = para cad a n, in d e p e n d ie n te m e n te ausen te , una H, o un g ru po a lifá tico in ferio r;

n = un nú m ero en te ro de a p ro x im a d a m e n te 8 a a p ro x im a d a m e n te 34, p re fe re n te m e n te un nú m ero en te ro de a p ro x im a d a m e n te 10 a a p ro x im a d a m e n te 24;

R 1, R2, R3, R4 = se se le cc io n a n in d e p e n d ie n te m e n te de un H o un a lq u ilo in ferio r.

N o rm a lm e n te , cua nd o R es un g ru po a lifá tico in fe rio r, R rep rese n ta un g rupo a lqu ilo in fe rio r o a lq u e n ilo in fe rio r ram ificado , no ra m ifica d o o c íc lico . Los g ru po s R e je m p la re s inc luyen , sin lim itac ión , m etilo , isop rop ilo , isobu tilo , sec-butilo , c ic lope n ten ilo , y s im ila res . El de riva do de ác ido g ra so se ca ra c te riza ad em á s po r te n e r un v a lo r 513C de a p ro x im a d a m e n te -10 ,9 a a p ro x im a d a m e n te -15 ,4 , y el de riva d o de ác ido g raso rep rese n ta al m enos a p ro x im a d a m e n te el 85 % de l m a te ria l de o rigen b io ló g ico en la com p os ic ión . En a lgu nos e jem p los , el de riva do de ác ido g ra so en la co m p o s ic ió n de l b io co m b u s tib le se c a ra c te riza po r te n e r una fra cc ió n de l ca rb o n o m od e rn o (fM 14C) de al m en os a p ro x im a d a m e n te 1,003, 1 ,010 o 1,5.

B. Impurezas

Los de riva dos de ác ido s g rasos p re pa rado s según las d ivu lg a c io n e s del p resen te d o cum e n to , son ú tiles com o co m p o n e n te s de, o para la fa b rica c ió n de, b ioco m bus tib le s , a s í com o otros p ro du c to s q u ím ico s in du s tria le s . Estos d e riva d o s de ác ido s g ra sos están fa b ric a d o s d ire c ta m e n te a p a rtir de á c id o s g ra so s y no de l p ro ce sa m ie n to q u ím ico de los tr ig licé rid o s . P o r con s ig u ie n te , los co m b u s tib le s y o tros p ro du c to s q u ím ico s in d u s tr ia le s que com p re n d e n los d e riva d o s de ác ido s g ra so s d e sve la d o s a m en ud o con tie n e n m en os im p u reza s con las que n o rm a lm e n te se asoc ian , po r e jem p lo , los p ro du c to s de riva d o s de tr ig lic é r id o s ta le s com o co m b u s tib le s de riva dos de ace ites y g rasas veg e ta les .

Los b io co m b u s tib le s p ro ced en te s de ác ido s g ra sos c rud os p re pa rado s según las d ivu lg a c io n e s del p resen te d o c u m e n to (a n te s de m e z c la r el d e r iva d o de ác ido g raso con o tros co m b u s tib le s com o los c o m b u s tib le s ba sa d o s en pe tró le o ) con tienen m en os ca ta liza d o re s de tra n se s te r if ica c ió n que el d iése l basado en pe tró leo u otro b iod iese l p ro d u c id o m ed ia n te una o m ás e ta p a s de tra n s e s te r if ic a c ió n . El d e riva d o de á c id o g ra so pued e c o n te n e r m en os que a p ro x im a d a m e n te 2 ,0 % , po r e jem p lo , m en os que a p ro x im a d a m e n te 1 ,5 % , 1 ,0 % , 0 ,5 % , 0 ,3 % , 0,1 %, 0 ,05 % o 0 % de un c a ta liz a d o r de tra n se s te r if ica c ió n o una im p u reza resu lta n te de un c a ta liz a d o r de tra n se s te rif ica c ió n . C o m o e je m p lo s no lim itan te s de ca ta liza d o re s de tra n se s te r if ica c ió n se in c luyen ca ta liza d o re s de h id róx ido , ta le s com o N aO H , KO H y L iO H ; y c a ta liza d o re s ác idos, ta le s com o ca ta liza d o re s de ác ido m in e ra l y ca ta liza d o re s de ác ido de Lew is. C om o e je m p lo s no lim ita tivo s de c a ta liza d o re s e im p u reza s resu ltan te s de c a ta liza d o re s de tra n s e s te r if ic a c ió n se in c luye n es taño , p lom o, m ercu rio , cadm io , c inc, titan io , c ircon io , ha fn io , boro, a lum in io , fós fo ro , a rsé n ico , an tim on io , b ism uto , ca lc io , m ag ne s io , es tronc io , uran io , po tas io , sod io , litio, y co m b in a c io n e s de los m ism os.

Los b io co m b u s tib le s p ro ced en te s de ác ido s g ra sos c rud os p re pa rado s según las d ivu lg a c io n e s del p resen te d o cu m e n to (a n te s de m e zc la r los d e riva d o s de á c id o s g ra so s con uno o m ás co m b u s tib le s ) tie n d e n a te n e r un pun to de ge lifica c ió n bajo, esp e c ia lm e n te cuando el p roduc to de riva d o de ác ido g raso com p ren de un é s te r e tílico C m ¹o un é s te r e tílico C ¹⁸: ¹, en co m p a ra c ió n con los pu n tos de ge lifica c ió n de o tros t ip o s de b ioco m bus tib le s .

De m an e ra s im ila r, los b io co m b u s tib le s p ro ced en te s de ác ido s g ra sos c rud os p re p a ra d o s según las d ivu lg ac ion es de l p re sen te d o cu m e n to (an tes de m e z c la r e l(los ) d e riva d o (s ) de ác ido s g ra so s con uno o m ás com b us tib les , com o los d iése l ba sad os en pe tró leo u o tros b iod iése l), con tien en m en os g lice ro l (o g lice rin a ) que los b ioco m bus tib le s fa b rica d o s con tr ig licé rid o s . El o los de riva dos de ác ido s g ra sos pueden co n te n e r m en os que a p ro x im a d a m e n te 2 ,0 % , po r e jem p lo , m en os que a p ro x im a d a m e n te 1 ,5 % , 1 ,0 % , 0 ,5 % , 0 ,3 % , 0,1 %, 0 ,05 % o 0 % en peso de g lice ro l.

Los b io co m b u s tib le s c rud os p ro ced en te s de los d e riva d o s de ác ido s g ra sos de l p resen te d o cu m e n to tam b ién con tien en m en os a lco h o l(e s ) lib re (s), (p o r e jem p lo , a lcoh o le s que se u tilizan para c re a r el és te r) que los b iod iése l fa b rica d o s con tr ig licé rid o s . Esto se debe en pa rte a la e fica c ia de la u tilizac ión de los a lcoh o le s po r parte de los h o sp e d a d o re s de p roducc ión de la p re sen te d ivu lg ac ión . P o r e jem p lo , el de riva do (o de riva d o s ) de ác ido s grasos puede co n te n e r m en os que a p ro x im a d a m e n te 2 ,0 %, 1,5 %, 1,0 %, 0 ,5 %, 0 ,3 %, 0,1 %, 0 ,05 % o 0 % en peso de a lcoh o l libre.

El b io co m b u s tib le p ro ced en te de los de riva dos de ác idos g ra sos de sve lado s , puede c a ra c te riza rse ad ic io n a lm e n te po r su ba ja co n ce n tra c ió n de azu fre en co m p a ra c ió n con el d ié se l d e riva d o de pe tró leo . El b io co m b u s tib le de riva d o de los d e riva d o s de ác ido s g ra sos en este d o cu m e n to pued e te n e r m en os que a p ro x im a d a m e n te 2 ,0 %, po r e jem p lo , m en os que a p ro x im a d a m e n te 1,5 %, 1,0 %, 0 ,5 %, 0 ,3 %, 0,1 %, 0 ,05 % o 0 % en peso de azu fre .

C. Aditivos y composiciones de combustible

Los a d itivo s de co m b u s tib le se u tilizan pa ra m e jo ra r el re n d im ie n to de un c o m b u s tib le o m otor. P o r e jem p lo , pueden u tiliza rse a d itivo s de co m b u s tib le para a lte ra r los p u n tos de c o n g e la c ió n /g e lifica c ió n , los p u n tos de e n tu rb a m ie n to , la lub ric idad , la v isco s id a d , la es ta b ilida d ox ida tiva , ca lidad de ign ic ión , los n ive les de oc ta no y los pun tos de ign ic ión . En los E s tados U n idos, to d o s los ad itivo s de co m b u s tib le deben e s ta r re g is tra d o s en la A g e n c ia de P ro tecc ión A m b ie n ta l. Los nom bres de los ad itivo s de co m b u s tib le y las co m p a ñ ía s que com e rc ia liza n los ad itivo s de co m b u s tib le es tán d isp o n ib le s al púb ico co n ta c ta n d o con la E P A o v is ita n d o el s itio w e b de la agenc ia . Un experto h a b itu a l en la m a te ria ap re c ia rá que los d e riva d o s de ác ido s g ra sos de sc ritos en el p re sen te d o cu m e n to pueden m e zc la rse con uno o m ás a d itivo s de co m b u s tib le para im p a rtir una ca lida d deseada .

Los d e riva dos de ác ido s g ra sos de sc ritos en el p re sen te d o cu m e n to pueden fo rm u la rse en ad itivo s de com b us tib le ad ecu ad os , lo que m e jo ra el ren d im ien to de los co m b u s tib le s o m otores. P o r e jem p lo , los de riva d o s de ác idos g ra sos de sc rito s en el p resen te d o cu m e n to pueden fo rm u la rse com o m e jo ra d o re s de la lub ric idad , que im parten p ro p ieda de s de sea b le s , ta le s com o p ro te cc ió n con tra el de sga s te a las pa rtes de l m otor. P o r co n s ig u ie n te , se p ro po rc io n a n com p o s ic io n e s ad itivas que com p ren den los de riva dos de ác ido s g ra sos p ro du c ido s según las d ivu lg a c io n e s de l p resen te do cu m e n to . En o tro e jem p lo , los d e riva d o s de ác ido s g ra sos de sc rito s en el p re sen te d o cu m e n to pu ed en fo rm u la rse com o in h ib id o res de la corros ión .

Los d e riva d o s de ác ido s g ra sos d e sc rito s en el p re se n te d o cu m e n to pu ed en m e zc la rse con o tros c o m b u s tib le s ta le s com o uno o m ás b iod iése l de riva dos de tr ig licé rid o s , d ive rso s a lcoh o le s , ta le s com o e ta no l y bu tano l, y p roduc tos d e riva d o s del pe tró leo , ta le s com o la ga so lina o el d iése l. En de te rm in a d a s c ircu n s ta n c ia s , se p roduce un de riva do de á c id o g ra so con un pu n to de ge lifica c ió n ba jo , ta l com o un e s te r e tílico C ¹⁶: ¹o un e s te r e tílico C ¹⁸: ¹. E ste de riva do de á c id o g ra so de pun to de ge lifica c ió n ba jo puede m ezc la rse con uno o m ás b iod iése l fa b rica d o s de tr ig licé rid o s pa ra re d u c ir el pun to de g e lif ica c ió n de l c o m b u s tib le re su lta n te cu a n d o se c o m p a ra con un co m b u s tib le que con tien e so lo uno o m ás b io d ie se l fa b rica d o s de tr ig licé rid o s . De m an era s im ila r, un de riva d o de ác ido graso , com o un é s te r e tílico C ¹⁶: ¹o é s te r e tílico un C ¹⁸: ¹, puede m ezc la rse con un d iése l p ro ced en te de pe tró le o pa ra p ro p o rc io n a r una m ezc la que con te n g a al m en os a p ro x im a d a m e n te , y con frecue nc ia , m ás que a p ro x im a d a m e n te , 5 % en peso de b iod iése l. En a lgu nos e jem p los , la m ezc la de com b u s tib le in c luye al m en os a p ro x im a d a m e n te 10 % , 15 % , 20 % , 30 %, 40 %, 50 % y 60 % en peso de l de riva d o de ác ido graso.

En a lg u n o s asp ec tos , la co m p o s ic ió n de c o m b u s tib le pu ede c o m p re n d e r adem ás un co m b u s tib le s in té tico . C u a lq u ie r co m b u s tib le s in té tico ob te n id o de carbón , gas na tu ra l o b iom asa , puede u tiliza rse ad e cu a d a m e n te . En un aspecto ad ic iona l, el co m b u s tib le s in té tico co m p re n d e un co m b u s tib le b a sad o en F isch e r-T ro p sch , un co m b u s tib le b a sad o en B erg ius , un co m b u s tib le b a sad o en M ob il, un co m b u s tib le b a sad o en K arrick , o una com b in ac ió n de e llos . En o tros a sp e c to s ad ic io na le s , el co m b u s tib le s in té tico co m p re n d e un co m b u s tib le ba sad o en ca rbón a líqu idos (co m b u s tib le ba sad o en C TL, Coal-To-Liquids), un co m b u s tib le ba sado en gas a líqu idos (co m b u s tib le basado en G TL, Gas-To-Liquids), un co m b u s tib le ba sado en b iom asa a líqu id os (co m b u s tib le ba sado en BTL), un co m b u s tib le ba sad o en ca rb ón y b iom asa a líqu idos (co m b u s tib le basado en C B TL, Coal and Biomass-To-Liquids), o una com b in ac ió n de los m ism os. En un a sp e c to e jem p la r, el co m b u s tib le s in té tico c o m p re n d e un co m b u s tib le ba sado en F ische r-T ro psch . La can tidad de co m b u s tib le s in té tico en la com p o s ic ió n de co m b u s tib le de sve la d a en el p resen te d o cu m e n to puede s e r de a p ro x im a d a m e n te 5 % a a p ro x im a d a m e n te 90 %, de a p ro x im a d a m e n te 5 % a a p ro x im a d a m e n te 80 %, de a p ro x im a d a m e n te 5 % a a p ro x im a d a m e n te 70 %, de a p ro x im a d a m e n te 5 % a a p ro x im a d a m e n te 60 % o de a p ro x im a d a m e n te 5 % a a p ro x im a d a m e n te 50 %.

En un a sp ec to de te rm in ado , se puede p re p a ra r una com p o s ic ió n de b io co m b u s tib le que in c luya al m enos a p ro x im a d a m e n te 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90% o 95% de un de riva do de ác ido g ra so que in c luya una ca d e n a de ca rb o n o que es 8: 0, 10: 0, 12: 0, 14: 0, 14: 1, 16: 0, 16: 1, 18: 0, 18: 1, 18: 2, 18: 3, 20: 0, 20: 1, 20: 2, 20: 3, 22: 0, 22: 1 o 22: 3. D ichas c o m p o s ic io n e s de b io co m b u s tib le pueden in c lu ir a d ic io n a lm e n te al m en os un ad itivo se le cc io n a d o de un ad itivo que reduce el pun to de e n tu rb a m ie n to que puede d is m in u ir el pun to de e n tu rb a m ie n to a una te m p e ra tu ra m e n o r de a p ro x im a d a m e n te 5 °C o m e n o r de a p ro x im a d a m e n te 0 °C; un te n s io a c tivo ; una m ic ro em u ls ió n ; al m en os a p ro x im a d a m e n te 5 % , 10 % , 15 % , 20 % , 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de co m b u s tib le d iese l de tr ig licé rid o s ; una ga so lin a ob ten ida de pe tró leo ; o un co m b u s tib le d iese l de pe tró leo .

En a lgu nos aspec tos , la com p o s ic ió n de co m b u s tib le que com p ren de los és te res g ra sos p ro du c ido s según los m é todos, los ve c to re s , las cé lu las y las c o m p o s ic io n e s de la p resen te inven c ión com p ren den a d e m á s uno o m ás a d itivo s para co m b u s tib le s d iése l. Los ad itivo s ad e cu a d o s son, de sea b le m en te , aq u e llo s que p ro po rc ion an un re n d im ie n to m e jo ra d o pero ta m b ié n co m p a tib ilid a d con los c o m p o n e n te s en la co m p o s ic ió n del co m b u s tib le y d isp o s itivo s que están aso c ia d o s n o rm a lm e n te con m o to res d iese l. C o m o e jem p los ilu s tra tivo s de o tros a d itivo s de co m b u s tib le a d e cu a d o s se inc luyen m e jo ra d o re s de ign ic ión o m e jo ra d o re s de l nú m ero de ce tano , de te rge n tes , d isp e rsa n te s , ag en te s a n tide sga s te , m o d ifica d o re s de l índ ice de v isco s id a d , m o d ifica d o re s de la fricc ión , m e jo ra d o re s de la lub ric idad , es ta b ilizan te s , an tiox idan tes , in h ib id o res de co rro s ión , b ioc idas, d e sa c tiva d o re s de m e ta les y pe qu eñ as c a n tid a d e s de o tros ad itivo s opc io na les , inc luyendo , sin lim itac ión , a n tie sp u m a n te s y se llado res . En asp e c to s pa rticu la res , a m en ud o se añ ad en m e jo ra d o re s de ign ic ión o m e jo ra d o re s del nú m ero de ce ta no para m e jo ra r el ren d im ien to de l m o to r d iese l. Los m e jo rad o re s e je m p la re s del índ ice de ce ta no in c luye n n itra to de 2 '-e tilh e x ilo y o tros n itra tos de a lqu ilo . Los m e jo rad o re s del índ ice de ce ta no pueden añ a d irse a una co m p o s ic ió n de co m b u s tib le en una can tida d que es de a p ro x im a d a m e n te 0,01 % en peso a a p ro x im a d a m e n te 1,0 % en peso, po r e jem p lo , de a p ro x im a d a m e n te 0 ,05 % en peso a a p ro x im a d a m e n te 0 ,5 % en peso, basado en el peso to ta l de la co m p o s ic ió n de com b ustib le .

En d e te rm in a d o s aspec tos , en la com p o s ic ió n de co m b u s tib le que c o m p re n d e el é s te r g ra so p ro du c ido según las p re sen te s d ivu lg a c io n e s , pueden in c lu irse d ive rso s de te rg e n te s y /o d isp e rsa n te s para a so c ia r y d is p e rs a r o e lim in a r d e p ó s ito s d a ñ in o s de las p iezas de l m o to r d iése l. Los d e te rg e n te s a d e cu a d o s co m p re n d e n n o rm a lm e n te una cab eza p o la r que com p ren de una sa l m e tá lica de un co m p u e s to o rg án ico á c id o y una la rga co la h id ró fo ba . C o m o e jem p los de de te rg e n te s se in c luye n sa les b o ra tad as de ca rb on a to , sa les bo ra tad as de su lfona to , que están p re fe ren te m en te sob re b a sa d a s . V éanse , po r e jem p lo , las pa ten tes de E s tados U n idos n.° 4 744 920 y 4 965 003. C om o e je m p lo s de d isp e rsa n te s se inc luyen , sin lim itac ión , d isp e rsa n te s ca rb ox ílicos , d isp e rsa n te s de succ in im ida , d isp e rsa n te s de am in a y d isp e rsa n te s de M ann ich . V éa nse , po r e jem p lo , las p a te n te s de E E .U U . n.° 3 172 892, 3 438 757, 3 980 569 y 6 165 235. Los d isp e rsa n te s pueden e s ta r p re sen te s en la com p o s ic ió n de co m b u s tib le en una can tida d de a p ro x im a d a m e n te 0,01 % en peso a a p ro x im a d a m e n te 0,1 % en peso, po r e jem p lo , de 0 ,03 a a p ro x im a d a m e n te 0 ,05 % en peso, ba sado en el peso to ta l de la co m p o s ic ió n de com b ustib le .

En d e te rm in a d o s a sp ec tos , a la c o m p o s ic ió n de co m b u s tib le pu eden añ a d irse a g e n te s a n tid e sg a s te , inc luyendo , po r e jem p lo , sa les m e tá lica s de d ih id ro ca rb il d itio fos fa to , para p ro p o rc io n a r be ne fic ios ta n to de an tid e sg a s te com o a n tiox idan tes . V éase , po r e jem p lo , la p a ten te de E E .U U . n.° 5 898 023.

En asp e c to s pa rticu la res , la can tida d de m e jo ra d o r de la lub ric ida d en la com p o s ic ió n de com b u s tib le puede v a r ia r de a p ro x im a d a m e n te 1 ppm a a p ro x im a d a m e n te 50 000 ppm , po r e jem p lo , de a p ro x im a d a m e n te 10 p p m a a p ro x im a d a m e n te 20 000 ppm , o de a p ro x im a d a m e n te 25 ppm a a p ro x im a d a m e n te 10 000 ppm . Los e jem p los no lim ita n te s de m e jo rad o re s de la lu b ric ida d in c luye n é s te re s y ác ido s g rasos , que pu ed en o no s e r los m ism o s que los p ro d u c id o s según los m é tod os d e sc rito s en es te docum e n to .

En asp ec tos pa rticu la res , la can tidad de e s ta b ilizan te s , que m e jo ra la e s ta b ilida d de a lm a ce n a m ie n to de la com p o s ic ió n de com b us tib le , puede v a r ia r de a p ro x im a d a m e n te 0,001 % en peso a a p ro x im a d a m e n te 2 % en peso, po r e jem p lo , de a p ro x im a d a m e n te 0,01 % en peso a a p ro x im a d a m e n te 1 % en peso, basado en el peso to ta l de la co m p o s ic ió n de com b us tib le . Un e s ta b iliza n te e je m p la r es una am ina p rim a ria de a lq u ilo te rc ia rio .

Los a n tio x id a n te s im p iden la fo rm a c ió n de depó s itos de go m a en los co m p o n e n te s del s is te m a de com b u s tib le d e b ido a la ox id a c ió n de los co m b u s tib le s en el a lm a ce n a m ie n to y /o inh iben la fo rm a c ió n de co m p u e s to s de pe róx ido en c ie rta s com p o s ic io n e s de com b us tib le . La can tidad de a n tio x id a n te s puede v a r ia r de a p ro x im a d a m e n te 0,001 % en peso a a p ro x im a d a m e n te 5 % en peso, po r e jem p lo , de a p ro x im a d a m e n te 0,01 % en peso a a p ro x im a d a m e n te 1 % en peso, ba sad o en el peso to ta l de la co m p o s ic ió n de com b ustib le .

Los in h ib id o res de co rro s ión p ro tegen los m e ta les fe rro so s en los s is te m a s de m ane jo de com b us tib le , ta le s com o tu b e ría s y ta n q u e s de a lm a ce n a m ie n to , de la co rro s ión . T a m b ié n se sab e que c ie rto s in h ib id o res de co rro s ión im p arten lub ric ida d ad ic iona l, y com o ta le s son p a rticu la rm e n te a d e cu a d o s cua nd o se de se a una lu b ric idad ad ic iona l. El in h ib id o r de co rro s ión puede e s ta r p resen te en la com p os ic ión de co m b u s tib le en una can tida d de a p ro x im a d a m e n te 0,001 % en peso a a p ro x im a d a m e n te 5 % en peso, po r e jem p lo , de a p ro x im a d a m e n te 0,01 % en peso a a p ro x im a d a m e n te 1 % en peso, b a sad o en el peso to ta l de la co m p o s ic ió n de com bustib le .

Los b ioc id as se u tilizan pa ra c o m b a tir el c re c im ie n to m ic ro b ia n o en la co m p o s ic ió n de com b us tib le , que pueden es ta r p re sen te en la co m p o s ic ió n de com b u s tib le a una con cen tra c ión de a p ro x im a d a m e n te 0,001 % en peso a a p ro x im a d a m e n te 5 % en peso, po r e jem p lo , de a p ro x im a d a m e n te 0,01 % en peso a a p ro x im a d a m e n te 1 % en peso, b a sad o en el peso to ta l de la co m p o s ic ió n de com b ustib le .

Los d e sa c tiva d o re s de m e ta les sup rim en los e fe c to s ca ta lítico s que tien en a lgu nos m e ta les , pa rticu la rm e n te el cob re , sob re la ox idac ión de com b ustib le , que puede es ta r p re sen te s en la com p os ic ión de co m b u s tib le en una ca n tid a d de a p ro x im a d a m e n te 0,001 % en peso a a p ro x im a d a m e n te 5 % en peso, po r e jem p lo , de 0,01 % en peso a a p ro x im a d a m e n te 1 % en peso, b a sad o en el peso to ta l de la com p o s ic ió n de com b ustib le .

A d e m á s , pueden añ a d irse m e jo ra d o re s de v isco s id a d , que son n o rm a lm e n te m a te ria le s po lim é rico s de pesos m o le cu la re s p ro m ed io en nú m ero de a p ro x im a d a m e n te 5 000 a a p ro x im a d a m e n te 250 000, y m o d ifica d o re s de fr icc ió n , que son no rm a lm e n te co m p u e s to s o rg a n o -m o lib d e n o que con tien en azu fre , en pe qu eñ as can tidades . T a m b ié n pueden añ a d irse in h ib id o re s de espum a , que inc luyen n o rm a lm e n te po lím e ro s de m e ta c rila to de a lqu ilo o po lím e ro s de d im e til s ilic io , a la com p o s ic ió n de com b us tib le en una can tida d m e n o r de a p ro x im a d a m e n te 10 ppm . A s im ism o , pueden añ ad irse se lla d o re s para g a ra n tiza r un se llad o e la s to m é rico ad ecu ad o e im p e d ir que en la co m p o s ic ió n de co m b u s tib le pueda in c lu irse un m al se llad o p rem aturo .

Ejemplos

Los s ig u ie n tes e je m p lo s ilus tran la g e n o m a n ip u la c ió n de h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión para p ro d u c ir de riva dos e sp e c ífico s de ác idos g rasos. En las f ig u ra s se ilu s tran ru tas b io s in té tica s im p lica d a s en la p roducc ión de de riva dos de ác ido s grasos.

P o r e jem p lo , La FIG. 3 es un d iag ram a de la ru ta FAS que rep rese n ta las e n z im a s d ire c ta m e n te im p lica da s en la s ín tes is de ac il-A C P . P ara a u m e n ta r la p ro du cc ión de d e riva dos de ác idos g rasos, com o ceras, é s te re s grasos, a lco h o le s g ra sos e h id ro ca rbu ros , una o m ás de las en z im a s de sc ritas en este d o cum e n to pueden so b re e xp re sa rse o m u ta rse pa ra re d u c ir la in h ib ic ión po r re tro a lim e n ta c ió n , con el fin de a u m e n ta r la ca n tid a d de a c il-A C P p roduc ida . A d ic io n a lm e n te , e n z im a s que m e tab o lizan los p ro du c to s in te rm e d io s para fa b ric a r p ro du c to s ba sados en ác ido s no g ra sos (por e jem p lo , rea cc io nes se cu n d a ria s ) pueden d e le c io n a rse o a te nua rse fu n c io n a lm e n te pa ra a u m e n ta r el flu jo de ca rb on o a tra vé s de la ruta de b io s in té tica ác ido s g ra sos (FA S ). En los s ig u ie n tes e jem p los , se de scriben m uch os h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión que se han m o d ifica d o para a u m e n ta r la p ro du cc ión de ác ido s grasos.

Las FIG. 4 y 5 rep rese n tan ru tas b ios in té ticas que pueden g e n o m a n ip u la rse para p re p a ra r és te res g rasos y a lco h o le s grasos, re sp ec tiva m en te . La tra n s fo rm a c ió n de cada sus tra to (p o r e jem p lo , a ce til-C o A , m a lon il-C o A , ac il-A C P , ác ido g ra so y ac il-C o A ) en cada p ro du c to (p o r e jem p lo , ace til-C o A , m a lon il-C o A , ac il-A C P , ác ido graso , ac il-C oA , a ld e h íd o s g rasos , és te re s g ra so s y a lco h o le s g ra so s ) pu ede re a liza rse u tiliza n d o va rio s p o lip é p tid o s d ife re n te s que son m ie m bros de las c la ses de en z im a s ind icadas.

Los s ig u ie n te s e jem p los de sc rib en m ic ro o rg a n ism o s que se han g e n o m a n ip u la d o o que pueden g e n o m a n ip u la rse para p ro d u c ir a lco h o le s g rasos, é s te re s g ra sos e h id ro ca rb u ro s esp ec íficos .

EJEMPLO 1. CONSTRUCCIÓN DE HOSPEDADORES DE PRODUCCIÓN

Un h o sp e d a d o r de p ro du cc ión e je m p la r es LS 9001. LS9001 se p ro du jo m o d ifica n d o C41 (D E 3 ) a p a rtir de la s o b re e xp re s ió n (S a in t B eaus ine , F ranc ia ) a la in ac tiva c ión de l gen fad E (a c il-C o A d e sh id rog en asa ).

En resum en , la cepa in ac tiva da fadE de E. coli se p re pa ró u tilizan do los ce b a d o re s Y a fV _ N o tI e Iv ry_O l para a m p lif ic a r a p ro x im a d a m e n te 830 pb de fad E en d irecc ión 5' y los ceb ad o res L p ca f ol y Lp ca R _ B a m para a m p lif ica r a p ro x im a d a m e n te 960 pb de fadE en d irecc ión 3'. P ara c re a r una con s tru cc ió n para la de le c ión en m arco del gen fadE com p le to , se u tilizó P C R con sup e rp os ic ión . La con s tru cc ió n de de le c ión fad E se c lo nó en el p lásm id o pK O V 3 se n s ib le a tem p e ra tu ra , que co n te n ía un gen sacB para la se lecc ió n po r co n tra s te y se rea lizó una de lec ión c ro m o só m ica de fadE según el m é tod o de L in k e t al., J. B act. 179 :6228 -6237 , 1997. La cep a resu lta n te no fue capaz de d e g ra d a r ác ido s g ra sos y a c il-C o A g rasos. En el p resen te d o cu m e n to es ta cepa in ac tiva da se de no m in a E. coli (D E 3, FadE).

O tra cepa de de lec ión FadE, M G 1655, se con s tru yó según los p ro ce d im ie n to s desc ritos po r D a tse nko et al., P N A S (U S A ), 97: 6640 -6645 (2000 ), con las m o d ifica c io n e s que se d e sc rib e n a co n tin u a c ió n . Los dos c e b a d o re s u tiliza d o s para c re a r la de le c ión fue ron :

Del-fadE-F: 5 ’-A A A A A C A G C A A C A A T G T G A G C T T T G T T G T A A T T A T A T T G T A A A C A T A T T G A T T C C G G G G A T C C G T C G A C C ; (S E Q ID N O :69 ) y

Del-fadE-R: 5 ’-A A A C G G A G C C T T T C G G C T C C G T T A T T C A T T T A C G C G G C T T C A A C T T T C C T G T A G G C T G G A G C T G C T T C (S E Q ID N O :70).

C a d a uno de los c e b a d o re s D e l-fa d E -F y D e l-fad E -R , co n tie n e n 50 ba ses de h o m o lo g ía con el gen fadE de E. coli y se u tiliza ro n para a m p lif ic a r el case te de re s is te n c ia a ka n a m ic in a del p lásm id o pK D 13 po r P C T com o se describe . El p ro du c to de la P C R resu ltan te se u tilizó para tra n s fo rm a r cé lu la s M G 1655 de E. coli e le c tro co m p e te n te s que con tien en pK D 46. Las cé lu las se in du je ron p re v ia m e n te con a ra b inosa d u ran te 3-4 ho ras com o de sc rib e Datsenko, c itad o a n te rio rm en te . D e spués de 3 ho ras de c re c im ie n to en un m ed io S O C a 37 °C, las cé lu las se sem b ra ro n en p laca s de a g a r Lu ria que con ten ían 50 pg /m l de kan am ic ina . Las co lo n ia s res is te n tes se a is la ron de spu és de una in cu b a c ió n d u ra n te la noche a 37 °C. La in te rrup c ión del gen fadE se con firm ó en a lgu nas de las co lo n ia s m ed ia n te am p lif ica c ió n po r P C R u tiliza n d o los fadE-L2 y fadE-R1, que se d iseñ a ron para f la n q u e a r el gen fadE .

fadE-L2 5 ’-C G G G C A G G T G C T A T G A C C A G G A C (S E Q ID N O :71); y

fadE -R 1 5 ’-C G C G G C G T T G A C C G G C A G C C T G G (S E Q ID N O :72 )

D e sp u é s de c o n firm a r la d e le c ió n a p ro p ia d a de fadE, se u tilizó una c o lo n ia pa ra re tira r el m a rc a d o r K m Ru tiliza n d o el p lá sm id o pC P 20. La cepa resu lta n te se d e n o m in ó M G 1655 (AfadE).

Los ho sp e d a d o re s con el gen fad E d e le c io n a d o se som e tie ro n a a jus tes ad ic io na le s . S e in tro du jo un p lásm ido que llevab a los cua tro genes que e ran re sp o n sa b le s de la ac tiv idad de la a c e til-C o A c a rb o x ila sa en E. coli (accA, accb accC y acd, N ú m eros de R e g is tro de G en B ank: N P _ 414727 , N P _417721 , N P _ 417722 , N P _ 416819 , EC 6.4.1.2 ). Los genes accABCD se c lo n a ro n en dos e ta pas com o op e ro n e s b ic is trón icos en los s itio s Ncol/HindIII y Ndel/AvrlI de pA C Y C D uet-1 (N o vag en , M ad ison , W I), y el p lásm id o resu ltan te se de no m in ó pA S 004.126. C om o a lte rna tiva , el h o s p e d a d o r de p ro du cc ión se g e n o m a n ip u ló para e x p re s a r accABCD de Lactobacillus plantarum.

O tra s m o d ifica c io n e s que se inc luye ron en un h o sp e d a d o r de p ro d u cc ió n in c luye ron lo s igu ien te : s o b re e xp re s ió n de aceEF (que cod ifica el co m p o n e n te E1p d e sh id ro g e n a sa y el co m p o n e n te E 2p d ih id ro lip o a m id a a c iltra n s fe ra sa de los com p le jos de p iruva to y 2 -o xo g lu ta ra to de sh id ro g e n a sa ); y fabH/fabD/fabG/acpP/fabF (que cod ifica FA S ) de E. coli, Nitrosomonas europaea (A T C C 19718), Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces spp, Ralstonia, Rhodococcus, Corynebacteria, Brevibacteria, Mycobacteria y le vad u ras o lea g in osa s . De m an era sim ilar, se g e n o m a n ip u la ro n ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión para e xp re sa r accABCD (que co d ifica la ace til C o A ca rb ox ilasa ) de Pisum savitum. S in em bargo , cuando el h o sp e d a d o r de p ro du cc ión ta m b ié n p ro du c ía bu tano l, se de scub rió que era m en os de se a b le e x p re s a r el ho m ó lo g o de Pisum savitum.

En a lg u n o s h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión , los ge ne s se in ac tiva ron o a te n u a ro n u tiliza n d o el m é tod o de Link, e t al., J. B ac te rio l. 179 :6228 -6237 , 1997. Los genes que se in a c tiva ro n o a te nua ron , in c lu ye ro n g p sA (que co d ifica la sng lice ro l 3 -fo s fa to d e sh id ro g e n a sa b ios in té tica , n.° de reg is tro N P _ 418065 de G e n B ank , EC: 1.1.1.94); ldhA (que cod ifica la lac ta to de sh id ro g e n a sa , n.° de reg is tro N P _ 415898 de G en B ank, EC: 1.1.1.28); pflb (que cod ifica la fo rm a to a ce tiltra n s fe ra sa 1, n.° de reg is tro P 09373 de G en B ank, EC: 2.3.1.54 ); adhE (que cod ifica la a lcoho l de sh id ro g e n a sa , n.° de reg is tro C A A 47743 de G en B ank, EC: 1.1.1.1 , 1.2.1.10); pta (que co d ifica la fo s fo tra n sa ce tila sa , n.° de reg is tro N P _ 416800 de G e n B ank , EC: 2.3.1.8 ); poxB (qu e co d ifica la p iruva to ox ida sa , n.° de reg is tro N P _ 415392 de G e n B ank , EC: 1.2.2.2 ); ackA (que cod ifica la a ce ta to c inasa , n ú m ero de reg is tro N P _ 416799 de G en B ank, EC: 2.7.2.1 ), y co m b in a c io n e s de los m ism os.

De m a n e ra s im ila r, para la de le c ión de fadE, se in tro du jo la m u ta c ió n P lsB [D 311 E ] en LS9001 para a te n u a r plsB. E sta m u tac ión d ism inu yó la can tidad de ca rb on o de sv ia do a la p ro du cc ión de fo s fo líp id o s . S e creó un a le lo que c o d ific a b a P ls B [D 311 E ] re e m p la za n d o e l co d ó n G A C pa ra el a sp a rta to 311 con un cod ón G A A para el g lu tam a to . El a le lo a lte ra d o se p re pa ró po r s ín te s is g é n ica y el a le lo de tip o s ilve s tre p lsB c ro m o só m ico se ca m b ió po r el a le lo plsB [D 311 E ] m u tan te u tiliza n d o el m é tod o de Link et al. (véa se an te rio rm en te ).

EJEMPLO 2. MODIFICACIONES EN HOSPEDADORES DE PRODUCCIÓN

P ara la e xp res ión de d ive rsa s p ro te ín a s que se u tilizan en la s ín te s is de d e riva d o s de ác ido s grasos, se con s tru ye ro n los s ig u ie n te s p lásm idos . Las co n s tru cc io n e s se p re pa ra ron u tiliza n d o m é tod os e s tá n d a r de b io lo g ía m o lecu la r. T odo s los genes c lo n a d o s se pus ie ron ba jo el con tro l de p ro m o to re s in du c ib les po r IP TG (p o r e jem p lo , un p ro m o to r de T7, un p ro m o to r tac o un p ro m o to r lac).

El gen 'tesA (gen de tio e s te ra s a A, nú m ero de reg is tro N P _ 415027 de G en B ank, sin se cu e n c ia líd e r (S E Q ID NO: 31 ) (C ho y C ronan, J. B iol. C hem ., 270 :4216 -9 , 1995, EC: 3.1.1.5 , 3.1.2.-)) de E. coli, se c lonó en un v e c to r pE TD uet-1 d ige rido con Ndel/AvrlI (el v e c to r pE TD uet-1 de sc rito en el p re sen te do cu m e n to está d ispo n ib le en N ovagen , M ad ison , W I). Los genes que cod ifica n t io e s te ra sa s (T E ) ve g e ta le s de tipo FatB de Umbellularia californica, Cuphea hookeriana y Cinnamonum alcanfor (N ú m e ro s de R e g is tro de G enB ank: U cF a tB 1 = A A A 34215 , C h F a tB 2 = A A C 49269 , C h F a tB 3 = A A C 72881 , C cF a tB = A A C 49151 ) se c lo na ron in d iv id u a lm e n te en tre s ve c to re s d ife ren te s : (i) pE T D ue t-1 d ig e rid o con NdeI/AvrII; (ii) p B lu e s c rip t KS+ d ig e rid o con XhoI/HindIII (S tra ta g e n e , La Jo lla , CA, para c re a r p ro te ínas de fus ió n la cZ ::T E N -te rm ina les ); y (iii) pM A L -c2 X d ige rido con XbaI/HindIII (N e w E ng land Lab, Ipsw ich , M A ) (p a ra c re a r fu s io n e s malE::TE n -te rm ina les ). El gen fadD (que cod ifica la a c il-C o A s in ta sa ) de E. coli se c lo nó en un d e riva d o de pC D F D ue t-1 d ig e rid o con NcoI/HindIII, que c o n te n ía el gen acr1 (a c il-C o A red uc tasa ) de Acinetobacter baylyi A D P 1 de n tro de sus s itio s NdeI/AvrII.

La Tabla 7 p ro p o rc io n a un resu m en de los p lásm id os ge n e ra d o s para c re a r va rio s ho sp e d a d o re s de p roducc ión e jem p la re s .

T l 7: R m n l mi iliz n l h r r i n

Un exp erto en la m a te ria a p rec ia rá que para o b te n e r cep as s im ila re s pueden u tiliza rse d ife ren te s p lásm id os y m o d ifica c io n e s ge nó m icas .

Los plásmidos de expresión seleccionados contenían replicones y marcadores de resistencia a antibióticos compatibles para producir un sistema de expresión de cuatro plásmidos.

En algunos aspectos de realizaciones, LS9001 puede cotransformarse con: (i) cualquiera de los plásmidos que expresan TE; (ii) el plásmido que expresa fadD, que también expresa acrl; y (iii) el plásmido de expresión de éster sintasa.

Como será obvio para un experto en la materia, cuando LS9001 se induce con IPTG, la cepa resultante producirá concentraciones más altas de alcoholes grasos a partir de fuentes de carbono tales como glucosa.

EJEMPLO 3. PRODUCCIÓN DE ALCOHOL GRASO EN LA CEPA DE E. C O L IR E C O M B IN A N T E

En un hospedador de producción, se produjeron alcoholes grasos expresando de manera exógena un gen de tioesterasa y un gen de acil-CoA reductasa. De manera más específica, los plásmidos pCDFDuet-1-fadD-acr1 (acil-CoA reductasa) y pETDuet-1-'TesA (tioesterasa) se transformaron en la cepa LS9001 de E. coli y los transformantes correspondientes se seleccionaron utilizando placas LB complementadas con espectinomicina 100mg/l y carbenicilina 50 mg/l. Cuatro transformantes de LS9001/pCDFDuet-1-fadD-acr1 se inocularon independientemente en 3 ml de un medio M9 complementado con carbenicilina 50 mg/l y espectinomicina 100 mg/l. Las muestras que contenían los transformantes se cultivaron a 25 °C en un agitador (agitación a aproximadamente 250 rpm) hasta que alcanzaron una DO600 de 0,5. A continuación, se transfirieron 1,5 ml de cada muestra a un matraz de 250 ml que contenía 30 ml del medio M9 descrito anteriormente. El cultivo resultante se cultivó a 25 °C en un agitador hasta que alcanzó una DO600 de entre 0,5-1,0. Después, se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM. El cultivo celular continuó durante 40 horas.

Después, las células se centrifugaron y se sedimentaron a 4000 rpm. El sedimento celular se suspendió en 1,0 ml de metanol. Después, se mezclaron 3 ml de acetato de etilo con las células suspendidas, seguido de la adición de 3 ml de H2O. A continuación, la mezcla se sometió a utrasonido durante 20 minutos. La muestra resultante se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos. Después, la fase orgánica (la fase superior), que contenían el(los) alcohol(es) graso(s), se sometió a análisis de GC/Ms . El título de alcohol total (incluido el tetradecanol, hexadecanol, hexadecenol y octadecenol) fue de aproximadamente 1-10 mg/l. Cuando una cepa de E. coli que llevaba solo vectores vacíos, se cultivaba en las mismas condiciones y siguiendo el mismo protocolo, se obtenía un título de alcoholes grasos de solo 0,2-0,5 mg/l.

EJEMPLO 4. PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS GRASOS (FA) Y ÉSTERES ETILICOS DE ÁCIDOS GRASOS (FAEE) QUE CONTIENEN C

ONO IMPARES SIN METALES PESADOS

1. Producción de la muestra de biodiesel # 23-30

La muestra de biodiesel # 23-30 ("muestra # 23-30") se produjo mediante cultivo en biorreactor de una cepa de E. coli (C41 DE3 AfaaE AfabR 'TesA fadD adplws) genomanipulada para producir ésteres grasos. Para la expansión del cultivo se utilizó un protocolo de inóculo de dos fases. La primera fase consistió en la inoculación de un medio de LB 50 ml (complementado con carbenicilina 100 pg/l y espectinomicina 100 pg/l) en un matraz de agitación deflector de 250 ml con un vial de 1 ml de material congelado de la cepa de E. coli de producción de éster. Este matraz de semilla se incubó a 37 °C durante aproximadamente 7 horas (DO600 final = 4,5, pH 6,7), después de lo cual se transfirieron 3 ml del cultivo primario a cada uno de tres matraces deflectores de 2 l que contenían medio F1 mínimo tamponado 350 ml que también contenía carbenicilina 100 pg/l y espectinomicina 100 pg/l. El tampón del matraz de agitación utilizado fue Bis-Tris propano a una concentración final de 200 mM (pH 7,2). Estos matraces secundarios se incubaron a 37 °C durante aproximadamente 18 horas (DO600 final = 12, pH 5,5) y los contenidos se utilizaron para inocular tres biorreactores de 14 l con un volumen inicial de 6,5 litros de medio F1 mínimo tamponado después de la inoculación. Estos biorreactores también contenían carbenicilina 100 pg/l y espectinomicina 100 g/l.

Estos biorreactores de 14 l se cultivaron inicialmente a 37 °C, y los niveles de oxígeno disuelto se mantuvieron al 30 % de saturación, utilizando los bucles en cascada de agitación y enriquecimiento de oxígeno. El pH de la mezcla de fermentación se mantuvo a 7,2, utilizando H2SO41 M y gas amoniaco anhidro. Cuando se agotó la carga de glucosa original de 5 g/l en el medio basal, se inició un suministro de nutrientes en cada biorreactor que consistía principalmente en glucosa al 43 % (p/v). Después, la velocidad de suministro de la solución de glucosa se ajustó manualmente durante el ciclo de fermentación para mantener la glucosa residual a un valor bajo (pero no nulo) durante el ciclo de fermentación. Cuando la DO600 de los cultivos llegó a un valor de 30, los cultivos se indujeron con una concentración final de IPTG de 1 mM. En este punto de inducción, la temperatura de cultivo del biorreactor se redujo a 30 °C, y al cultivo se añadieron aproximadamente 15 ml/l (basándose en un volumen de 6,5 a 7 litros) de etanol y en todo momento se controló mediante HPLC. Para mantener las concentraciones residuales a aproximadamente 20 ml/l, se añadió etanol adicional periódicamente a los biorreactores. Los contenidos de los biorreactores se recogieron después de aproximadamente 60 horas de cultivo, con aproximadamente 10 l del caldo recogido de cada uno de los tres biorreactores.

Estos caldos recogidos se combinaron y se extrajeron con un volumen equivalente de acetato de etilo con agitación a te m p e ra tu ra am b ie n te du ran te dos horas. D espués, los ex trac to s de ca ldo se ce n trifu g a ro n (3 500 rpm , 30 m in u to s ) para se p a ra r las capas líqu idas, seg u ido de la e lim in ac ión de la capa o rg án ica para su po s te rio r p ro ce sa m ie n to . El ace ta to de e tilo se e lim in ó cas i p o r c o m p le to (< 0 ,3 % res idu a l, según lo d e te rm in a d o po r G C /F ID ) de la capa o rg á n ica u tilizan do eva p o ra c ió n ro ta to ria (B üch i, R -200 ), d e ja ndo a p ro x im a d a m e n te 90 m l de un líqu ido de c o lo r oscu ro o lea g in oso . A este líqu ido se le d e n o m in ó m ue s tra #23 -30.

2. C u a n tifica c ió n de F A y F A E E en la m ue s tra # 23 -30

U tiliza n d o un s is te m a A g ile n t 5975 B M S D eq u ipad o con una co lum n a D B -5 de 30 m x 0 ,25 m m (p e lícu la de 0 ,10 |jm ), se rea lizó G C -M S . La te m p e ra tu ra de la c o lu m n a fue iso té rm ica de 3 m in u to s a 100 °C. La te m p e ra tu ra de la co lum n a se p ro g ra m ó para a u m e n ta r de 100 °C a 320 °C a una ve lo c id a d de 20 °C /m in . C u an do se a lcan zó la te m p e ra tu ra fina l de 320 °C, la c o lu m n a p e rm a n e c ió iso té rm ica d u ra n te 5 m in u to s a esa te m p e ra tu ra . El v o lu m e n de in ye cc ió n fu e de 1 j l . E l gas po rta do r, he lio , se libe ró a 1,3 m l/m in . El e sp e c tró m e tro de m asa s e s ta b a e q u ip a d o con una fue n te de io n izac ión po r im p ac to de e lec trones . La te m p e ra tu ra de la fu e n te de io n iza c ió n se es ta b le c ió a 300 °C. Los pa trones de FA E E (p o r e jem p lo , d o d e ca n o a to de etilo , te tra d e c a n o a to de etilo, c is -9 -h e xa d e ce n o a to de etilo , h e xa d e ca n o a to de e tilo , o c ta d e ca n o a to de e tilo , to d o s> 99 % ); los pa tro ne s de é s te r m e tílico de ác ido graso (F A M E ) (p o r e jem p lo , d o d e ca n o a to de m etilo , te tra d e c a n o a to de m etilo , pe n ta d e ca n o a to de m etilo , cis-9-h e xa d e ce n o a to de m etilo , h e xa d e ca n o a to de m etilo , c is -11 -o c ta d e ce n o a to de m etilo , to d o s> 99 % ); tr im e tils ilil d ia z o m e ta n o (T M S D , 2 M en hexano); ác ido c lo rh íd rico (37 % ); m e ta n o l (> 99 ,9 % ); y a ce ta to de e tilo (> 99 ,9 % ) se ad q u ir ie ro n en S ig m a -A ld rich y se ap lica ron sin pu rifica c ión previa .

La m u e s tra # 23 -30 se d e riva tizó a ñ a d ie n d o tr im e tils ili ld ia z o m e ta n o (T M S D ) 50 j l , H C l 8 j l y m e tan o l 36 j l a 1 m l de m ue s tra (1 m g /m l en a ce ta to de e tilo). La m ezc la se in cubó a te m p e ra tu ra am b ie n te d u ra n te 1 hora.

A n te s de la cua n tifica c ión , se id en tifica ron los FA E E y FA M E en la m ue stra # 23 -30 u tilizan do dos m é todos . En p r im e r lugar, el t ie m p o de re te n c ió n de G C de ca d a c o m p u e s to se c o m p a ró con e l t ie m p o de re ten c ió n de un pa trón con oc ido . En s e g u n d o lugar, la id e n tifica c ió n de cad a co m p u e s to se c o n firm ó e m p a re ja n d o el e sp e c tro de m asa s del c o m p u e s to con un e sp e c tro de m asas e s tá n d a r en la b ib lio teca de esp e c tro s de m asas.

C u an do se d ispo n ía de un pa trón para un FA E E o un FA M E , la cua n tifica c ión de FA E E o FA M E se de te rm in a b a ge n e ra n d o una cu rva de ca lib ra c ió n (co n ce n tra c ió n fre n te a la resp ue s ta del in s tru m en to ). D espués, se ob tuvo una re lac ió n linea l en tre la resp u e s ta de l in s tru m e n to y la co n ce n tra c ió n de ana lito . La co n ce n tra c ió n de l co m p u e s to en la m ue s tra se d e te rm in ó to m a n d o su resp u e s ta de l in s tru m e n to y re fir ié n d o se a la cu rva de ca lib rac ión .

C u a n d o un pa trón para un FA E E no es ta ba d ispo n ib le , se u tilizab a una resp ue s ta de in s tru m e n to p ro m ed io para d e te rm in a r las c o n ce n tra c io n e s de l com p ue s to . La pend ien te y la in te rse cc ió n de to d a s las cu rva s de ca lib ra c ió n e x is te n te s se p ro m ed ia ro n . De es to s p ro m ed ios , se d e te rm in ó una re lac ión linea l en tre la c o n ce n tra c ió n y la resp u e s ta de l in s tru m en to . D espués, las co n ce n tra c io n e s de co m p u e s to s d e sco n o c id o s se d e te rm in a ron re la c io n a n d o las resp ue s ta s del in s tru m en to con la re lac ión linea l en tre la resp ue s ta del in s tru m e n to y la c o n ce n tra c ió n u tilizan do la Ecuación 1.

Ecuación 1: c o n ce n tra c ió n = (re sp u e s ta del in s tru m en to - in te rcep ta c ión p ro m e d io )/p e n d ie n te p ro m ed io D e sp u é s de id e n tific a r y cu a n tif ic a r el FA M A , la co n ce n tra c ió n de los ác ido s g ra sos lib res a so c ia d o s se d e te rm in ó en fu n c ió n de la co n c e n tra c ió n de F A M E y de la re lac ió n de peso m o le c u la r de F A con re sp e c to a FA M E . P o r ú ltim o, la c o n ce n tra c ió n de F A E E y FA en m g/l se tra n s fo rm ó en p o rce n ta je en la m ue s tra de b iod iése l (% p/p).

En la Tabla 8 se en um e ran las co n ce n tra c io n e s de F A E E y F A en la m u e s tra # 23 -30. La c o n ce n tra c ió n to ta l de F A E E y FA fue de 80 ,7 %. El resto de los co m p u e s to s d e sco n o c id o s pueden an a liza rse po r el m é tod o LC /M S /M S . Los co m p o n e n te s p rinc ip a les de la m ue stra # 23 -30 fue ro n p e n ta d e ca n o a to de etilo, c is -9 -h e xa d e ce n o a to de etilo, h e xa d e ca n o a to de e tilo y c is -11 -o c ta d e ce n o a to de etilo.

T l : P r n FAEE FA n l m r 2 -

n in i n

S o rp re n d e n te m e n te , la m ue s tra # 23 -30 co n te n ía F A y F A E E im pares.

3. A n á lis is e lem e n ta l cua n tita tivo de la m u e s tra # 23 -30

S e sa b e qu e los m e ta le s pe sad os en ven en an los c a ta liza d o re s u tilizad os en el c ra q u e o ca ta lítico . P ara m e d ir los n ive le s de m e ta le s pe sad os en la m ue s tra # 23 -30 , la m u e s tra # 23 -30 se e n v ió a los la b o ra to rio s G a lb ra ith , Inc., pa ra el a n á lis is cu a n tita tivo e lem e n ta l de a rsén ico , ca lc io , ca rb on o , c lo ro , coba lto , cobre, h id ró gen o , h ierro , ag ua de Karl F isher, p lom o, m an ga neso , m agnes io , m ercu rio , m o libd en o , n itrógeno, po tas io , sod io , azu fre , cinc, o x íg eno y fós fo ro . Los m é to d o s p re p a ra to r io s y a n a lít ico s se d e sc rib e n a co n tin u a c ió n . Los re su lta d o s s e m u e s tra n en la Tabla 9 . T o d a s las ca n tid a d e s in d ica da s en la Tabla 9 e s tu v ie ro n por de b a jo de l n ive l de cu a n tifica c ió n (LO Q , level of quantitation) e xce p to para el c a rb o n o (73 ,38 %), c lo ro (91 ppm ), h id ró g e n o (12,1 %), ag ua de Karl F ish e r (0 ,998 %), m e rcu rio (0 ,057 ppm ), o x íg e n o (14 ,53 % ) y fó s fo ro (343 ppm ). P o r lo tan to , la m ue s tra # 23 -30 no c o n te n ía n ive les a lto s de m e ta les p e sa d o s de in te rés.

M é tod o G -52 : R e v 6: D iges tión con m ic ro o n d a s d e m u e s tra s pa ra a n á lis is d e m e ta les

En un rec ip ie n te de m ic ro o n d a s se pesó una can tida d ap ro p ia d a de m u e s tra de ce rca de 0,001 g. D espués, se a ñ a d ie ro n los re a c tivo s a p ro p ia d o s al re c ip ie n te d e m ic ro ond as . Si se o b s e rv a b a una rea cc ió n v is ib le , se d e ja b a qu e la rea cc ió n ce sa ra a n te s de ta p a r el rec ip ien te . de spu és , el rec ip ie n te se s e lló y se co locó en el m ic ro o n d a s de a cu e rd o con las in s tru cc io n e s de l fa b rica n te . La te m p e ra tu ra de cad a re c ip ie n te a lca n zó un m ín im o de 180± 10 °C en 5 m inu tos . Se m a n tu vo a un m ín im o de 180 ± 10 °C d u ra n te 10 m inu tos. A l fina l de l p ro g ra m a de m ic ro ond as , los re c ip ie n te s se d e ja ro n e n fria r d u ra n te un m ín im o de 5 m in u tos a n tes de re tira rlos . Los re c ip ie n te s se d e s ta p a ro n y se tra n s fir ie ro n a m a tra ce s v o lu m é tr ic o s pa ra su an á lis is m e d ia n te la té c n ic a ad ecu ad a .

M étod o G -55 , R e v 3: B om b a de com b us tió n de o x íg eno P a rr para la d e te rm in a c ió n de h a ló gen os

Las m u e s tra s se p e sa ro n en una co p a de co m b u s tió n y se a ñ a d ió ace ite m in e ra l co m o a u x ilia r de c o m b u s tió n . P ara las m e d ic io n e s de c lo ro (C I) y b ro m o (B r), se a ñ a d ió una so lu c ió n de pe ró x id o de h id ró g e n o al 1 % a la bom ba . Para las m e d ic io n e s de azu fre (S), se a ñ a d ió una so luc ió n de h id ró x id o de so d io 0,01 N. La m u e s tra y la cop a se se lla ro n en una bo m ba de co m b u s tió n de ox íg e n o P a rr ju n to con una so luc ió n a b so rb e n te adecu ad a . La bo m ba se pu rgó con ox ígeno , D espués, se p re su rizó a 25 -30 a tm de pres ión de ox ígeno , y se encend ió . A con tinu ac ió n , los con ten ido s de la bo m ba se m ezc la ron b ien y se tra n s fir ie ro n a un v a s o de p re c ip ita d o s para su p o s te rio r aná lis is .

M é tod o G -30B , R e v 7: D iges tió n de cen iza h ú m ed a de co m p u e s to s in o rg á n ico s y o rg án icos para an á lis is de m e ta les La m ue stra se ca rb o n izó u tilizan do H ²S O ⁴. Si se an a lizan los m e ta les que fo rm an su lfa tos inso lub les , se u tilizan H C O ⁴y H N O ³para ca rb o n iz a r el m a te ria l o rg án ico . D e sp u é s de c a rb o n iza r la m uestra , se añ ad ió H N O ³y la m ue stra se so m e tió a re flu jo pa ra s o lu b iliz a r los m e ta le s p re sen te s . Si la so luc ió n se vo lv ía tu rb ia , se a ñ a d ía H C l para a yu d a r a c o m p le ta r la d ige s tión . S e pu ede u sa r HF si el s ilic io e s ta ba p re se n te en la m uestra , pero so lo si el s ilic io no e ra un a n a lito de in te rés. T odo el HF u tilizad o es ta ba res trin g id o a rec ip ie n tes de T e flón . El d ige rido tra n sp a re n te se tra n s fir ió c u a n tita tiva m e n te a un m a traz vo lu m é tr ic o de C lase A y se llevó a un v o lu m e n fina l. D espués, la m ue s tra se ana lizó .

M é tod o M E -4 A R e v 2: D e te rm in a c ió n de a n io n e s su p rim id o s po r c ro m a to g ra fía de iones

M é tod o S -300 R e v 7: D e te rm in a c ió n de ag ua po r titu la c ió n cou lo m é trica (K arl F ische r)

E ste m é to d o com b in ó la t itu la c ió n c o u lo m é trica con la de K arl F ische r. La m u e s tra se m ezc ló con una m ezc la de a m in a -m e ta n o l que con ten ía p re d o m in a n te m e n te iones e yod o (I-) y d ióx id o de azu fre . El yod o p ro du c ido en el án od o a tra vé s de la e lec tró lis is se de jó re a cc io n a r con agua. En d icho s casos, el yod o se p ro du jo en p ropo rc ión d irec ta a la can tidad de e lec tric id ad según la Ley de Faraday. A de m ás , dado que 1 m ol de agua reacc iona e s te q u io m é tr ica m e n te con ¹m ol de yodo , ¹m g de agua era eq u iva le n te a 10,71 cu lom b ios de e lec tric id ad . U tiliza n d o es te p rinc ip io , El m e d id o r de hu m edad d e te rm in ó la ca n tid a d de ag ua d ire c ta m e n te a p a rtir de l nú m ero de cu lo m b io s n e cesa rios para la e lec tró lis is . Este p ro ced im ie n to in c luyó ta n to la in tro du cc ión d irec ta com o una té cn ica de tra ta m ie n to p re v io con vap o rizado r.

co n tin u a c ió n

M é tod o E 16-2 , rev 9 (T ra za d o E 16 -2A ): D e te rm in a c ió n de azu fre u tiliza n d o el a n a liz a d o r S C -432 D R de LE C O El a n a liz a d o r de a zu fre S C -432 D R es un in s tru m e n to in fra rro jo no d ispe rs ivo , co n tro la d o d ig ita lm en te , d ise ñ a d o para m e d ir e l co n te n id o de a zu fre en una va rie d a d de m a te ria le s o rg á n ico s e in o rg án icos . La m ue s tra se q u em ó a 1350 ± 50 °C en una a tm ós fe ra de o x íg eno puro. El azu fre se ox idó a d ióx id o de azu fre y se cu a n tificó po r ab so rc ió n de in fra rro jo . El S C -432 D R e s ta ba e q u ip a d o con dos de tec to res , una cé lu la de in fra rro jo de a lto y ba jo a lcance .

M étod o M E -2, R e v 14: D e te rm in a c ió n de ca rbono , h id ró gen o y n itrógeno

E ste in s tru m e n to q u em a la m ue stra en oxíg eno puro a 950 °C en con d ic io n e s es tá ticas para p ro d u c ir p ro du c to s de co m b u s tió n de C O ², H²O y N ². El P E -240 an a liza a u to m á tica m e n te estos p ro du c to s en un a n a liza d o r de co n d u c tiv id a d té rm ica en es tado e s ta c io n a rio de au to in teg rac ión . P ara a yu d a r a la com b ustió n , puede añ a d irse a n h íd r id o tú n g s tico . P ara m u e s tra s d ifíc iles de quem ar, puede em p le a rse un t ie m p o de co m b u s tió n p ro lo n g a d o (p o r e jem p lo , m od o de q u em a difíc il).

co n tin u a c ió n

M étod o M E -70 , R e v 4: E sp e c tro m e tría de em is ión a tó m ica de p lasm a aco p la d o in d u c tiva m e n te

E s te m é to d o d e sc rib e d e te rm in a c io n e s de e le m e n to s m ú ltip le s po r IC P -A E S u tiliza n d o s is te m a s ó p tico s s im u ltá n e o s y v isu a liza c ió n ax ia l o rad ia l de l p lasm a. El in s tru m e n to m ide los esp e c tro s de em is ión ca ra c te rís tico s por e sp e c tro m e tría óp tica . Las m ue s tra s se ne bu liza ron y el ae roso l resu ltan te se tra n sp o rtó a la a n to rcha de p lasm a. Los esp e c tro s de em is ión e sp e c ífico s de e lem e n to se p ro du je ro n m ed ia n te p lasm a aco p la d o in d u c tiva m e n te a ra d io fre cu e n c ia . Los e sp ec tros se d isp e rsa ro n m ed ia n te un e sp e c tró m e tro de re jilla y las in te n s id a d e s de las líne as de em is ión se co n tro la ron con d isp o s itivo s fo to se n s ib le s . P ara la de te rm in a c ió n de l o ligo e lem en to , fue ne cesa rio re a liza r una co rre cc ión de fon do . El fo n d o se m id ió a d yace n te a las líneas de ana lito en las m ue s tra s d u ran te el aná lis is . La pos ic ión se le cc io n a d a para la m ed ic ión de in tens idad de fondo , en uno o am b os lados de la línea an a lítica , se d e te rm in ó po r la com p le jid a d de l esp ec tro a d ya ce n te a la línea de ana lito . En un m odo de an á lis is , la po s ic ió n u tilizada debe s e r lo m ás libre pos ib le de la in te rfe ren c ia esp e c tra l y debe re fle ja r el m ism o cam b io en la in te ns idad de fo n d o que se p roduce en la long itud de onda de l an a lito m ed ida . La co rre cc ión de fo n d o no es ne ce sa ria en los caso s de e n sa n ch a m ie n to de líneas donde una m ed ic ió n de co rre cc ió n de fo n d o d e g ra da ría rea lm en te el resu ltad o ana lítico .

M étod o E 80-2 , R e v 4: D e te rm in a c ió n de m ercu rio (té cn ica a u to m a tiza d a de v a p o r frío )

E ste p ro ce d im ie n to se basa en el m é tod o E P A S W 846 7471A . La ab so rc ión a tó m ica de v a p o r frío se basa en la te o ría g e ne ra l de la a b so rc ión a tóm ica , que sos tie ne que los á tom os lib res de l ana lito ab so rben e n e rg ía de una fue n te de lá m pa ra que es p ro po rc ion a l a la c o n ce n tra c ió n de ana lito . A l u tiliza r una lá m pa ra que con tiene el m eta l a m ed ir, la lo ng itud de on da exac ta ne cesa ria para la a b so rc ión se p ro du jo y las in te rfe re n c ia s se redu je ron con s id e ra b le m e n te . La a b so rc ió n a tó m ica de v a p o r frío u tiliza es te p rinc ip io , y los á to m o s de m ercu rio se libe ra ron al re d u c ir los iones de m ercu rio con c lo ru ro de estaño (II) (S n C l)²). El gas n itrógeno tra n sp o rta b a los á tom os a través de una cé lu la óp tica , con la lá m p a ra Hg en un ex trem o y el d e te c to r en el o tro ex trem o . D eb ido a que se e m p le ó el m é tod o de v a p o r frío , en lu g a r de un m é todo de llam a, los com p ue s to s o rg án icos no d ige rido s fue ro n una p re o cu p a c ió n de in te rfe ren c ia , d e b ido a su am p lia band a de lo n g itu d e s de onda de abso rc ión .

Tabla 9 : Análisis elemental cuantitativo de la muestra # 23-30

co n tin u a c ió n

EJEMPLO 5. PRODUCCIÓN Y LIBERACIÓN DE ALCOHOL GRASO DEL HOSPEDADOR DE PRODUCCIÓN

acrl (que cod ifica la a c il-C o A red uc tasa ) se exp resó en E. coli cu ltiva d a con g lu co sa com o ún ica fu e n te de ca rb o n o y ene rg ía . E. coli p rodu jo pe qu eñ as can tida de s de a lcoh o le s g ra sos ta le s com o d o de can o l (C ¹²: ⁰-O H ), te tra d e ca n o l (C ¹⁴: ⁰-O H ) y h e xa d e ca n o l (C ¹⁶: ⁰-O H ). En o tras m uestras , FadD (a c il-C o A s in ta sa ) se exp resó ju n to con acrl en E. coli. S e ob se rvó un a u m e n to de c in co ve ce s en la p ro du cc ión de a lcoh o l graso.

En o tras m ue stra s , en un p lá sm id o que lle vab a accABCD co n s tru id o com o se de sc rib e en E JE M P L O 1, acrl, fadd y accABCD (a c e til-C o A ca rb ox ilasa ), se exp resa ron ju n to con d ive rsa s t io e s te ra sa s (T E ) in d iv id u a le s en E. coli C41 (D E 3 ) de tipo s ilves tre y en una E. coli C41 (D E 3 AfadE, una cepa que ca re c ía de a c il-C o A de sh id ro g e n a sa ). Esto d io lu g a r a a u m e n to s ad ic io n a le s en la p ro d u cc ió n de a lcoh o l g raso y en la m o d u la c ió n de los pe rfiles de a lcoh o le s g ra so s (véa se la FIG. 6). P o r e jem p lo , la so b re e xp re s ió n de 'T e sA (p E T D u e t-1 - 'T e s A ) de E. colien este s is te m a o b tu vo un au m e n to de a p ro x im a d a m e n te 60 ve ce s de C ¹²: ⁰-O H , C ¹⁴:⁰-O H y C m ⁰-O H , s ie nd o C ¹⁴: ⁰-O H el p rinc ipa l a lcoh o l graso . S e o b tuvo un resu lta d o m uy s im ila r cuando se exp resó la en z im a C h F a tB 3 (F a tB 3 de Cuphea hookeriana en p M A L -c2X -T E cu ). C u an do se exp resó la en z im a UcFatB1 (FatB1 de Umbellularia californica en pM A L -c2 X -T E u c ), la p ro du cc ión de a lcoh o l g ra so au m e n tó a p ro x im a d a m e n te 20 ve ce s y C ¹²: ⁰-O H era el a lcoho l g ra so p re do m ina n te .

La exp res ión de C h F a tB 3 y UcFatB1 ta m b ié n con du jo a la p ro du cc ión de ca n tid a d e s s ig n ifica tiva s de los a lcoho les g ra sos in sa tu ra d o s C ¹⁶: ¹-O H y C ¹⁴: ¹-O H , re sp e c tiva m e n te . T a m b ié n se en co n tra ro n a lcoh o le s g ra sos en el s o b re n a d a n te de m u e s tra s ge n e ra d a s a p a rtir de la e xp res ión de 'tesA. A 37 °C, se en co n tra ro n can tida de s a p ro x im a d a m e n te ig ua les de a lcoh o le s g ra sos en el so b re n a d a n te y en el sed im e n to ce lu la r. M ie n tras que a 25 °C, se en co n tró que a p ro x im a d a m e n te el 25 % de los a lco h o le s g ra sos e s ta ba en el so b ren ada n te . V é a se la FIG. 7.

EJEMPLO 6. PRODUCCIÓN DE ALCOHOL GRASO UTILIZANDO UNA VARIEDAD DE ACYL-COA REDUCTASAS

E ste e je m p lo d e sc rib e la p ro d u cc ió n de a lco h o l g ra so u tiliza n d o una va rie d a d de a c il-C o A reduc tasas . Los a lco h o le s g ra sos pueden s e r el p ro du c to fina l. C o m o a lte rna tiva , las cé lu la s ho sp e d a d o ra s de p ro du cc ión pueden g e n o m a n ip u la rse para e xp re s a r/s o b re e x p re s a r a d ic io n a lm e n te é s te r s in ta sa s para p ro d u c ir é s te re s grasos.

C a da uno de los cua tro genes que co d ifica b a las a c il-C o A re d u c ta sa s g ra sas (Tabla 10) de d ive rsa s fue n tes , se o p tim izó con co d o n e s para su exp re s ió n en E. coli y se s in te tizó en C o don D ev ices, Inc. (C a m brid ge , M A). C a da uno de los genes s in te tiza d o s se c lonó com o un fra g m e n to Ndel-AvrII en el v e c to r p C D F D u e t-1 -fa d D (de sc rito en el E je m p lo 2). C ada uno de los p lá sm id o s que llevaban es to s ge ne s de a c il-C o A re d u c ta sa con el gen fadD de E. coli, se tra n s fo rm ó en la cep a C41 (D E ) de E. coli (a d q u ir id a en O ve r-e xp re ss io n ).

Las cep as re co m b in a n te s se cu ltiva ro n en 3 m l de un ca ldo LB (c o m p le m e n ta d o con e sp e c tin o m ic in a 100 m g /l) a 37 °C du ran te la noche. A 30 m l de un m ed io M 9 rec ien te (que co n te n ía e sp e c tin o m ic in a 100 m g /l) se tra n s fir ie ro n 0 ,3 m l de l cu ltivo no c tu rn o y se cu ltiva ro n a 25 °C. C u a n d o los cu ltivos a lca n za ro n una D O ⁶⁰⁰de 0,5, se añ ad ió IP TG 1 m M . A cad a cu ltivo se le su m in is tró el 0,1 % de uno de los tre s ác ido s g ra sos d isu e lto s en H ²O a un pH de 7,0. Los tre s ác ido s g ra sos s u m in is tra d o s fue ro n d o d e ca n o a to de sod io , m iris ta to de sod io o pa lm ita to de sod io . C om o con tro l, ta m b ié n se inc luyó un cu ltivo sin la ad ic ión de ác ido g raso . D e sp u é s de la in du cc ión , los cu ltivos se de ja ron c re c e r a la m ism a te m p e ra tu ra d u ran te 40 ho ras m ás a 25 °C.

La cu a n tif ica c ió n del re n d im ie n to de a lcoh o l g ra so al fina l de la fe rm e n ta c ió n se rea lizó u tilizan do G C -M S com o se de sc rib e a n te rio rm e n te en los E JE M P L O S 3 y /o 4. En la T a b la 11 se m u e s tra el a lcoh o l g ra so re su lta n te p ro d u c id o a p a rtir de l ác ido g ra so co rre sp o n d ie n te . Los resu ltad os in d ica n que las tres a c il-C o A red uc tasa s , A cr1 , A crM y B m F A R , pu d ie ron tra n s fo rm a r los tres ác ido s g rasos en los co rre sp o n d ie n te s a lcoh o le s grasos. Los resu ltad os ta m b ié n ind ican que hF A R y J jF A R te n ía n ac tiv ida d cua nd o los su s tra to s eran m iris ta to y pa lm ita to . S in em bargo , ha b ía poca o n ing una ac tiv ida d cua nd o el sus tra to era d o de can oa to . m FAR 1 y m F A R 2 so lo de m os tra ro n baja ac tiv ida d con m iris ta to y no m ostra ro n ac tiv ida d con los o tros dos ác ido s grasos.

Tabla 10: Acil-CoA reductasas

Tabla 11: Producción de alcohol raso

EJEMPLO 7. ESTERES GRASOS DE CADENA MEDIA

Las a lcoh o l ace til tra n s fe ra sa s (A A Ts, EC 2.3.1.84 ), re sp o n sa b le s de la p roducc ión de ace ta to de ac ilo en d ive rsas p lan tas, pu ed en u tiliza rse pa ra p ro d u c ir é s te re s g ra so s de lo ng itud de ca d e n a m ed ia , ta le s com o o c ta n o a to de octilo , o c ta n o a to de dec ilo , d e ca n o a to de dec ilo , y s im ila re s . Los és te re s g ra sos , s in te tiza d o s a p a rtir de a lcoh o l de cad en a m ed ia (ta l com o C6 y Ce) y la a c il-C o A o los ác ido s g ra sos de cad en a m ed ia (ta l com o C6 y Ce) tien en pu n tos de fus ió n re la tiva m e n te ba jos. P o r e jem p lo , el h e xa n o a to de hex ilo tie n e un pun to de fu s ió n de a p ro x im a d a m e n te -55 °C y el o c ta n o a to de oc tilo tien e un pu n to de fus ió n de a p ro x im a d a m e n te - 18 ° C a a p ro x im a d a m e n te - 17 ° C. Los pu n tos de fus ió n ba jos de es to s co m p u e s to s los hacen ad e cu a d o s para su uso com o b ioco m bustib le s .

En este e jem p lo , un gen SAAT que cod ifica una t io e s te ra sa se coe xp re só en un h o s p e d a d o r de p ro du cc ión E. coli C41 (D E 3, FadE) (com o se de sc rib e en la S o lic itud In te rn ac io na l P C T /U S 08 /058788 ) con fadD de E. coli y acrl (a lco h o l red u c ta sa de A. baylyi A D P 1 ). En el ca ld o de fe rm e n ta c ió n se p ro p o rc io n ó ác ido o c ta no ico . E s to d io lu g a r a la p ro du cc ión de oc ta n o a to de octilo . De m an e ra s im ila r, cua nd o el gen de é s te r s in ta sa de A. baylyi A D P 1 se e xp re só en el h o s p e d a d o r de p ro du cc ión en lu ga r de l gen SAAT, se p ro du jo oc ta n o a to de octilo .

a tra vé s de D N A 2.0 (M en lo Park, C A 94025), se s in te tizó un gen SAAT reco m b in an te . La secu en c ia de A D N s in te tiza d a se basó en la s e cu e n c ia g é n ica p u b licad a (n .° de reg is tro A F 193789 de G e n B a n k ), pero se m od ificó para e lim in a r el s itio NcoI. El gen SAAT s in te tiza d o (co m o un fra g m e n to BamHI-HindlII) se c lo nó en pR S E T B (Inv itrog en , C a rlsba d , C a lifo rn ia ), linea lizado con B am H I y HindIII. El p lá sm id o resu ltan te , p H Z 1.63 A se c o tra n s fo rm ó en un h o s p e d a d o r de p ro du cc ión de E. coli con pA S 004.114 B , que llevab a un gen fadD de E. coli y un gen acrl de A. baylyi A D P 1. Los tra n s fo rm a n te s se cu ltiva ro n en 3 m l de un m e d io M 9 q u e c o n te n ía g lu co sa al 2 %. D e sp u é s de la in du cc ión con IP TG y de la ad ic ió n de ác ido o c ta n o ico al 0 ,02 %, se de jó c re e r el cu ltivo a 25 °C du ran te 40 horas. D espués , se a ñ ad ie ro n 3 m l de ace ta to de ace tilo a to d o el cu ltivo y se m ezc ló va ria s ve ce s con un m ezc lad o r. La fase de a ce ta to de ace tilo se an a lizó po r G C /M S .

S o rp re n d e n te m e n te , en el e x tra c to de ace ta to de ace tilo no se ob se rvó a ce ta to de ac ilo . S in em b a rg o , se ob se rvó o c ta n o a to de octilo . S in em bargo , la cepa de con tro l sin el gen SAAT (C 41 (D E 3 , A fa d E )/p R S E T B p A S 004.114 B ) no p ro du jo o c ta n o a to de octilo . A s im ism o , la cep a (C 41 (D E 3 , A fa d E )/p H z 1.43 B p A S 004.114 B ) en la que el gen de la é s te r s in ta sa de A. baylyi A D P 1 era llevad o po r pH Z1.43 , p ro du jo o c ta n o a to de octilo (véa nse las Figs 8A-D). El ha lla zgo de que la ac tiv id a d de SAAT p ro du ce o c ta n o a to de oc tilo hace po s ib le p ro d u c ir é s te re s g ra sos de cad en a m ed ia , ta le s com o o c ta n o a to de oc tilo y d e ca n o a to de octilo , que tie n e n p u n tos de fus ió n ba jos y que son ad e cu a d o s para su uso com o b io co m b u s tib le s y pa ra re e m p la za r b iod iese l ba sado en trig licé rido s .

EJEMPLO 8. PRODUCCIÓN DE ÉSTERES GRASOS EN LA CEPA LS9001 DE E. C O L I

A tra vé s de la g e n o m a n ip u la c ió n de l h o s p e d a d o r de p ro du cc ión E. coli pa ra e xp re sa r una a c il-C o A reduc tasa , una t io e s te ra s a y una é s te r s in ta sa fo rm a d o ra de a lcoh o l graso , se p ro du je ro n és te re s g rasos. P o r tan to , el h o sp e d a d o r de p ro d u cc ió n p ro du jo ta n to el lado A co m o el lado B de l é s te r y la e s tru c tu ra de am b os la do s se v io in flu e n c ia d a po r la e xp res ión de l gen de tioe s te rasa .

La cepa LS9001 se tra n s fo rm ó con p lásm id os que llevaban un gen de é s te r s in ta sa de A. baylyi A D P 1 (p lá sm id o pH Z1.43 ), un gen de t io e s te ra s a de Cuphea hookeriana (p lá sm id o p M A L -c2 X -T e ch ) y un gen fadD de E. coli (p lá sm id o p C D F D ue t-1 -fad ).

El p lá sm id o pH Z 1.43 que lle vab a la é s te r s in ta sa (W S a d p l, n.° de reg is tro A A 017391 de G en B ank, EC 2.3.175 ), se co n s tru yó de la s ig u ie n te m anera . en p rim e r lugar, el gen de W s a d p l se a m p lificó con los s ig u ie n tes ceb ad o res u tilizando , com o m o lde , la s e cu e n c ia de A D N ge n ó m ico de A. baylyi A D P 1 :

W S a d p 1 _ N d e I, 5 '-T C A T A T G C G C C C A T T A C A T C C G -3 ' (S E Q ID NO: 35); y

W S a d p 1 _ A v r, 5 '-T C C T A G G A G G G C T A A T T T A G C C C T T T A G T T -3 ' (S E Q ID N O :36).

D espués, el p ro du c to de la P C R se d ig irió con Ndel y A vrII y se c lo nó en pC O L A D u e t-1 para d a r pH Z 1.43. D espués, el p lá sm id o que llevab a wSadpl se c o tra n s fo rm ó en la cepa LS 9001 de E. coli con p E T D u e t-1 'T e sA y p C D F D u e t-1 -fadD-acrl, y los tra n s fo rm a n te s se se le cc io n a ro n en p lacas LB co m p le m e n ta d a s con ka n a m ic in a 50 m g/l, c a rb e n ic ilin a 50 m g/l y e sp e c tin o m ic in a 100 mg/l.

S e in ocu la ro n tres tra n s fo rm a n te s en 3 m l de LB K C S (ca ldo LB co m p le m e n ta d o con kan am ic ina 50 mg/l, c a rb e n ic ilin a 50 m g/l, e s p e c tin o m ic in a 100 m g/l y g lu co sa 10 g /l) y se in cub ó a 37 °C en un a g ita d o r (a g ita c ió n a 250 rpm ). C u an do los cu ltivos a lca n za ro n una D O ⁶⁰⁰de a p ro x im a d a m e n te 0,5, 1,5 m l de cad a cu ltivo se tra n s fir ie ro n a m a tra ce s de 250 m l q u e co n te n ía n 50 m l/l de LB K C S . D espués , los m a tra ce s se in cu b a ro n en un a g ita d o r (250 rpm ) a 37 °C hasta que el cu ltivo a lcanzó una D O ⁶⁰⁰de a p ro x im a d a m e n te 0 ,5 a a p ro x im a d a m e n te 1,0. D espués, se añ ad ió IP TG a una co n ce n tra c ió n fina l de 1 m M . Los cu ltivos in du c ido s se in cub a ron a 37 °C en un a g ita d o r (250 rpm ) d u ra n te o tras 40 -48 horas.

Los cu ltivos se tra n s fir ie ro n de sp u é s a tu b o s cón ico s de 50 m l y las cé lu la s se ce n trifu g a ro n a 3 500 X g du ran te a p ro x im a d a m e n te 10 m inu tos. C ada uno de los se d im e n to s ce lu la res se m ezc ló de spu és con 5 m l de ace ta to de etilo . Los ex trac to s de ace ta to de e tilo se an a liza ro n con G C /M S . El títu lo de és te res g ra sos (in c lu ido s C ¹⁶C ¹⁶, C ¹⁴:¹C-i⁶, C 'i⁸;'iC'i⁸;¹, C ²C ¹⁴, C ²C ¹⁶, C ²C-i⁶:¹, C-|⁶C-|^6:1and C ²C-|⁸:¹) fue de a p ro x im a d a m e n te 10 m g/l. C u ando una cepa de E. coli que so lo llevab a v e c to re s v a c ío s se cu ltivó en las m ism as co n d ic io n e s y s ig u ie n d o el m ism o p ro toco lo , so lo se e n co n tra ro n 0 ,2 m g/l de és te re s g ra sos en el ex trac to de a ce ta to de etilo.

EJEMPLO 9. PRODUCCIÓN Y LIBERACIÓN DE ESTER ETÍLICO GRASO DEL HOSPEDADOR DE PRODUCCION

La cep a LS 9001 se tra n s fo rm ó con p lá sm id o s que llevab an un gen de é s te r s in ta sa de A. baylyi (p lá sm id o pH Z1.43 ), un gen de t io e s te ra s a de Cuphea hookeriana (p lá sm id o p M A L -c2 X -T E cu ) y un gen fadD de E. coli (p lá sm id o pC D F D ue t-1 -fadD).

E sta cep a re co m b in a n te se cu ltivó a 25 °C en 3 m l de un m ed io M 9 que co n te n ía ka n a m ic in a 50 m g/l, ca rb en ic ilina 100 m g/l y e sp e c tin o m ic in a 100 m g/l. D espués de la in du cc ión con IPTG , el m ed io se a jus tó a una con cen tra c ión fina l de e ta no l al 1 % y g lu co sa al 2 %.

El cu ltivo se de jó c re ce r du ran te 40 ho ras de spu és de la in ducc ión con IPTG . Las cé lu la s se sep a ra ron del m ed io ag o ta d o m ed ia n te c e n trifu g a c ió n a 3 500 X g d u ran te 10 m inu tos . El se d im e n to c e lu la r se resu sp e n d ió con 3 m l del m ed io M9. La su sp e n s ió n c e lu la r y el m e d io a g o ta d o se e x tra je ro n de spu és con 1 vo lu m e n de a ce ta to de etilo . Las fa se s de a ce ta to de e tilo resu ltan te s de la su sp e n s ió n ce lu la r y el so b re n a d a n te se so m e tie ro n a an á lis is G C -M S . El é s te r e tílico C ¹⁶fue la e sp e c ie de é s te r m ás p ro m in e n te pa ra es ta tio e s te ra s a y el 20 % de l é s te r g ra so p ro d u c id o se libe ró de la cé lu la . V é a se la FIG . 9. Una cepa de con tro l C 41 (D E 3 , AfadE) de E. coli que con ten ía pC O LA D ue t-1 (v e c to r v a c ío pa ra el gen de é s te r s in ta sa ), p M A L -c2 X -T E u c (que c o n te n ía fatB de U. california) y p C D F D u e t-1 -fa d D (gen FadD de E. coli), no p ro du jo ca n tid a d e s d e te c ta b le s de és te re s e tílico s de á c id o s g rasos. Los é s te re s de ác idos g ra sos se cua n tif ica ro n u tiliza n d o é s te r e tílico y ác ido p a lm ítico co m e rc ia l com o re fe renc ia .

T a m b ié n se p re pa ra ron é s te re s g rasos u tilizan do los m é tod os de sc ritos en el p re sen te do cum e n to , excep to que se añ ad ió m e tan o l o iso p ro p a n o l al ca ldo de fe rm e n ta c ió n . S e p ro du je ro n los é s te re s g ra sos esperados .

EJEMPLO 8. LA INFLUENCIA DE DIVERSAS TIOESTERASAS SOBRE LA COMPOSICIÓN DE ÉSTERES ETILICOS GRASOS PRODUCIDOS EN CEPAS DE E. C O L I RECOMBINANTES.

Las t io e s te ra sa s F a tB 3 (C. hookeriana) 'T e sA (E. coli) y F a tB (U. California) se exp re sa ro n s im u ltá n e a m e n te con é s te r s in ta sa (de A. baylyi). S e con s tru yó un p lásm ido , pH Z1.61 , que co m p re n d ía un esq u e le to pC D FD ue t-1 (N o vag en , M ad iso n , W I) con el gen fadD, a tra v é s de l re e m p la zo de l fra g m e n to Notl-AvrlI (q u e llevab a el gen acrl) con el fra g m e n to Notl-Avrll de pH Z 1.43 de ta l m an e ra que fadD y la é s te r s in ta sa ADP1 es taban en un p lásm ido y cad a una de las se cu e n c ia s co d ifica n te s es ta ba ba jo el con tro l de un p ro m o to r deT7 d is tin to . La con s tru cc ió n de pH Z1.61 h izo pos ib le u tiliza r un s is te m a de dos p lásm id os en lu g a r de l s is te m a de tre s p lásm idos . D espués, pH Z1.61 se c o tra n s fo rm ó en la cep a C 41 (D E 3 , FadE) de E. coli con uno de los p lásm id os , lle va n d o ca d a uno de e llos un gen de t io e s te ra s a d ife re n te com o se de sc rib e en el p re sen te docum e n to .

Los és te res e tílico s de ác ido s g ra sos to ta le s (tan to en el s o b re n a d a n te com o en el líqu ido e tílico de ác ido s g rasos in tra ce lu la r) p ro du c ido s po r es tos tra n s fo rm a n te s se eva lu a ron u tilizan do la té cn ica de sc rita en el p resen te do cum e n to . En Tabla 12, se resum en los títu lo s y la co m p o s ic ió n de los é s te re s e tílico s de ác ido s grasos.

Tabla 12: Títulos (mg/l) y composición de ésteres etílicos de ácidos grasos mediante C41(DE3, A fa d E ) de E.

c o l i recombinante/ HZ1.61 lásmidos ue llevan dversos enes de tioesterasa.

EJEMPLO 9. USO DE DIVERSAS ÉSTER SINTASAS PARA PRODUCIR BIOCOMBUSTIBLE

B a sá n d o se en s e cu e n c ia s de p o lin u c le ó tid o s c o rre sp o n d ie n te s c o m u n ica d a s en el G e n B a n k N C B I, se s in te tiza ro n cua tro genes co d ifica n te s de é s te r s in ta sas con pe qu eñ as m od ifica c ion es . E stas m od ifica c io n e s inc luyen la e lim in a c ió n de los s itio s de re s tr ic c ió n in te rn o s Ncol, Ndel, Hindlll y A vrll s in in tro d u c ir o tros c a m b io s en la se cu e n c ia de a m in o á c id o s co rre sp o n d ie n te . C ada uno de los cua tro genes de in te rés se s in te tiza ro n con un sitio Ndel en el e x tre m o 5 'y un s itio A v rll en el e x tre m o 3'. Las s e cu e n c ia s se c lo n a ro n de spu és en el s itio NdeI y A v rll de pC O LA D ue t-1 (N o va g e n e ) para p ro d u c ir p H Z 1.97 -376 , pH Z 1.97 -377 , pH Z1.97 /a tfA 1 y p H Z 1.97 /a tfA 2. En Tabla 13 s ig u ie n te , se en um e ran los p lásm id os que llevan cada uno de los cua tro genes de in te rés ju n to con los re sp e c tivo s nú m ero s de reg is tro de G e n B a n k y de G e n P e p tid e .

Tabla 13: Ester sintasas

Cada uno de los cuatro plásmidos se transformó en la cepa C41 (DE3, AfadEAfabR)/pETDuet-1-'TesA + pCDFDuet-1-fadD de E. coli. Se seleccionaron tres transformantes de cada transformación para estudios de fermentación para determinar sus habilidades para sintetizar ésteres etílicos de ácidos grasos. La etapa de fermentación se realizó como se describe en el EJEMPLO 6, pero a dos temperaturas diferentes, 25 °C o 37 °C. La cepa C41 (DE3, AfadEAfabR)/pETDuet-1-’TesA + pCDFDuet-1-fadD+pHZ1.43 (que expresa la ADP1 éster sintasa) se utilizó como control positivo y la cepa C41 (De 3, AfadEAfabR)/pETDuet-1-'TesA pCDFDuet-1 -fadD como control negativo.

La expresión de cada uno de los cuatro genes de éster sintasa en la cepa de E. coli con actividad fadE y fabRy atenuada y sobreexpresión de 'tesA y fadD, permitió que cada cepa produjera aproximadamente 250 mg/l de FAe E a 25 °C. Esta fue la misma cantidad producida por el control positivo que expresaba la ADP1 éster sintasa. En cambio, la cepa de control negativo produjo menos de 50 mg/l de FAEE en las mismas condiciones a 25 °C (véase, la FIG. 10). La composición de acilo graso de FAEE producida a partir de estas cuatro éster sintasas fue similar a la de las ADP1 éster sintasas (véase, la FIG. 11).

Los resultados de las fermentaciones realizadas a 37 °C indicaron que las cepas que llevaban pHZ1.97_aftA2 y las que llevaban pHZ1.97_376 produjeron más FAEE que el control positivo que llevaba pHZ1.43 (véase, la FIG. 12). Las cepas que llevaban pHZ1.97_aftA2 y las que llevaban pHZ1.97_376 también produjeron una gran cantidad de ácido graso libre (véase, la FIG. 13). Mientras que la cepa que llevaba pHZ.143 no acumuló ácido graso libre. Los resultados demostraron que estas cuatro éster sintasas eran capaces de aceptar etanol y una amplia gama de acil-CoA como sustratos.

EJEMPLO 12. USO DE ÉSTER SINTASA EUCARIOTA PARA PRODUCIR BIOCOMBUSTIBLE

Este ejemplo describe la clonación y expresión de una éster sintasa de Saccharomyces cerevisiae. Los plásmidos se generaron utilizando técnicas de biología molecular convencionales.

Tabla 14: Plásmidos con e e b l

Para expresar los diversos plásmidos, se utilizó un hospedador de producción C41 (DE3 AfadE) de E. coli. Se cultivaron células de E. coli en un medio mínimo M9 (que contenía 6 g/l de Na²HPO⁴, 3 g/l de KH²PO⁴, 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH⁴Cl, 1 mg/l de tiamina (vit. B1), MgSO⁴1 mM, CaCh 0,1 mM, glucosa al 0,4 % (p/v) o al 2 % (p/v)). Todas las soluciones madre de ácidos grasos se prepararon disolviendo la sal sódica o potásica del ácido graso en agua destilada desinoizada a pH 7,0. La solución madre de ácido octanoico se adquirió en Sigma, St. Louis, MO.

Las fermentaciones se realizaron utilizando la cepa C41 (DE3 AfadE) que contenía los plásmidos pCDFDuet-1-acr1, pMAL-c2X-TEuc (ucFatB) y pGL10.59 (eebl). La cepa control fue C41 (DE3 AfadE) que llevaba pCDFDuet-1-acr1, pMAL-c2X-TEuc, y el vector vacío pCOLADuet-1. Cada una de las tres colonias de cada transformación se utilizó para inocular un cultivo iniciador de M9 glucosa al 0,4% complementado con carbenicilina (100|jg/ml), espectinomicina (100 jg/m l) y kanamicina (50 jg/ml). Los cultivos se dejaron crecer a 37 °C durante la noche. Los cultivos de producción se establecieron produciendo una dilución 1: 100 de cultivo iniciador para inocular 3 ml de medio M9 glucosa al 0,4 %. Los cultivos de producción se dejaron crecer a 37 °C hasta alcanzar una DO⁶⁰⁰= 0,6 antes de inducirse con IPTG 1 mM, se suministró etanol al 1 % y se cultivó durante 40 horas más a 25 °C. Los cultivos celulares completos se extrajeron con un mismo volumen de acetato de etilo mediante agitación en vórtex (con una agitadora vorticial) durante 30 segundos. La fase orgánica se tomó y se examinó en el GC/MS utilizando el método alkane_1_splitless_ctc.m para la detección de FAEE, que se describe anteriormente en el EJEMPLO 4, parte 2, "Cuantificación de FA y FAEE en la muestra # 23-30".

No se detectaron picos de FAEE en las muestras. Para determinar si eebl se expresaba correctamente, los cultivos inducidos con IPTg y los no inducidos con IPTG, se analizaron por SDS-PAGe . No se detectó ninguna banda correspondiente al tamaño de Eeb1 (de aproximadamente 52 kDa). Esto sugirió que, en este sistema de plásmido particular, Eeb1 no se expresa bien.

Se realizaron experimentos de expresión adicionales utilizando un vector de expresión diferente. El gen se clonó en el vector pMALc2x, que expresaba la proteína diana como una fusión a proteínas de unión a maltosa (MBP, del inglés maltose binding protein). El análisis por SDS-PAGE de los lisados de células completos reveló que los cultivos inducidos con IPTG 1 mM produjeron una banda de tamaño apropiado correspondiente a la fusión Eeb1-MBP (de aproximadamente 92 kDa). En las células no inducidas la banda no estaba presente. Este experimento se describió en detalle en la Solicitud Internacional No. PCT/US08/058788.

La actividad enzimática de Eeb1 se evaluó utilizando la cepa C41 (DE3 AfadE) de E. coli que llevaba los plásmidos pCDFDuet-1-acr1 y pGL10.104 (eeb1). Una cepa C41 (d E3 AfadE) con pCDFDuet-1-acr1 y pMALc2x sirvió como cepa de control. Se seleccionaron tres colonias de cada transformación y cada una de ellas se utilizó para inocular un cultivo iniciador durante la noche de medio M9 glucosa al 0,4 % complementado con carbenicilina (100 |jg/ml) y espectinomicina (100|jg/ml). Se utilizó una dilución 1: 100 del cultivo iniciador para inocular 10 ml de cultivos de producción en medio M9 glucosa al 0,4 %. Los cultivos de producción se dejaron crecer a 37 °C hasta alcanzar una DO⁶⁰⁰= 0,4 - 0,5 antes de la inducción con IPTG 1 mM. A cada uno de los cultivos se les suministró aproximadamente etanol al 1 %, ácido octanoico (a aproximadamente 0,01 % o a aproximadamente 0,02 % del volumen final) y/o ácido decanoico (a aproximadamente 0,02 % del volumen final). Las fermentaciones prosiguieron durante 24 horas a 25 °C. Las extracciones se llevaron a cabo añadiendo al cultivo un volumen 1/10 de HCl 12 M y un mismo volumen de acetato de etilo y agitando en vórtex durante 30 segundos. Las muestras se analizaron mediante GC/MS como se describe anteriormente.

Los datos de GC/MS revelaron que puede detectarse un pico correspondiente al éster etílico del ácido octanoico para las células que expresan eebl y suministrando ácido octanoico y etanol. La cepa de control de vector también mostró un pico de C²C⁸, aunque sea un pico más pequeño que el de las células que expresan eeb1.

Las células a las que se suministró ácido decanoico al 0,02 % no crecieron bien; por lo tanto, se realizaron los siguientes estudios utilizando ácido decanoico al 0,01 % o al 0,005 %. Para probar la capacidad de Eeb1 para utilizar alcoholes distintos al etanol en la síntesis de ésteres de ácidos grasos, se realizaron fermentaciones utilizando la misma cepa: C41 (DE3 AfadE) con pCDFDuet-1-acr1 y pGL10.104. Las células se cultivaron como se describió anteriormente. En la inducción, a las células se las suministró ácido octanoico al 0,02 % junto con metanol, etanol, propanol o isopropanol al 1 %. A las células también se las suministró ácido decanoico al 0,01 % o 0,005 % y etanol al 1 %. Se permitió que las fermentaciones continuaran después de la inducción durante 24 horas a 25 °C. Para preparar el análisis por GC/MS, los cultivos se centrifugaron para separar el sedimento y el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en un mismo volumen de medio M9 glucosa al 0,4% reciente. Tanto los sedimentos resuspendidos como las muestras de sobrenadante se extrajeron como se describe anteriormente y se analizaron mediante GC/MS.

Todas las muestras de sobrenadante contenían grandes cantidades de ácido graso pero no ésteres de ácido graso detectables. De manera similar, las muestras de sedimento de control de vector no contenían picos de éster de ácido graso, según lo determinado utilizando GC/MS. Sin embargo, células a las que se suministró ácido graso C¹⁰, mostraron picos que se identificaron como representativos de ácido decanoico.

Las muestras de sedimento procedentes de las células que expresan Eeb1 y a las que se suministró ácido graso C8 y propanol o etanol, mostraron picos pequeños correspondientes a ésteres de propilo o etilo. En las células a las que se suministró metanol o isopropanol, no se detectó ningún pico. Los cultivos a los que se suministró un ácido graso C¹⁰y etanol al 0,01 % o al 0,005 %, también produjeron FAEE C²C¹⁰, pero se encontró FAEE en las muestras de sedimento.

Los resultados indicaron que Eeb1 era capaz de sintetizar FAEE utilizando ácidos octanoico o decanoico, y que también podía utilizar metanol para generar el éster metílico octanoico. Sin embargo, estos compuestos eran muy volátiles y, como tales, los datos de GC/MS podrían no haber reflejado con precisión los verdaderos títulos. Para medir con mayor precisión la formación de productos, se utilizó una capa de hexadecano para facilitar la captura de FAEE más volátiles.

La actividad de Eeb1 con respecto a los sustratos de ácidos grasos se evaluó utilizando la cepa C41 (DE3 AfadE) con pCDFDuet-1-acr1 y pGL10.104, a la que se suministró ácidos grasos de diferentes longitudes de cadena. Las células se cultivaron como se describe anteriormente, pero para promover un mejor crecimiento celular después de la inducción, se indujeron a una DO600=0,8-0,9. En este punto, a las células se las suministró etanol al 1 % y un ácido graso C8 al 0,02 % o una combinación al 0,01 % de los siguientes ácidos grasos: C¹⁰, C¹², C¹⁴y C¹⁶. A los cultivos a los que se les suministró ácidos grasos C8 o C¹⁰, se cubrieron con un volumen total de hexadecano al 20 %. Las fermentaciones se llevaron a cabo durante 24 horas más a 25 °C después de la inducción. Para el análisis de los productos, se extrajeron cultivos completos (sin separar el sobrenadante del sedimento) como se describe en el presente documento, con un volumen 1/10 de HCl y un mismo volumen (al volumen de cultivo) de acetato de etilo. Las muestras tratadas con hexadecano se inyectaron directamente en el GC/MS utilizando el programa hex_1_splitless_ctc.m, que se describe anteriormente en el EJEMPLO 4, parte 2, "Cuantificación de FA y FAEE en la muestra # 23-30".

Ninguno de los controles de vector tenía picos de FAEE detectables. Para las células a las que se suministró C8 y C¹⁰, en las muestras de hexadecano, se detectaron picos grandes de C²C⁸y de C²C¹⁰, pero no en las muestras de acetato de etilo. Esto demostró que el hexadecano fue capaz de atrapar satisfactoriamente los FAEE volátiles. Para el resto de las m ue s tra s de a ce ta to de etilo, se d e tec ta ron p icos pe qu eñ os para los FA E E C ²C ¹²y C ²C ¹⁴, pero no pa ra F A E E C ²C ¹⁶. P o r tan to , Eeb1 g e n e ra é s te re s e tílico s u tiliza n d o á c id o s g ra sos con lo n g itu d e s de ca d e n a de C8 a C ¹⁴. Eeb1 fa vo re c ió a los ác ido s g ra sos C ⁸y C ¹⁰sob re los ác ido s g ra sos de cad en a m ás larga.

EJEMPLO 13. INTEGRACIÓN GENÓMICA DE SECUENCIAS RECOMBINANTES PARA FABRICAR UNA CEPA HOSPEDADORA QUE SOBREEXPRESE LOS GENES F A B A Y/O F A B B DE E. C O LI.

S e sabe que el p ro d u c to de l gen fabR ac tú a co m o un re p re so r de la e xp res ión de los ge ne s faba y fabB. T a m b ié n se sabe que F adR fu n c io n a com o un a c tiv a d o r de los m ism os genes. El FabR y las se cu e n c ia s de un ión con sen so e sp e ra d a s fu e ro n p u b lica d a s p re v ia m e n te po r Z h a n g e t al., J. B iol. Chem. 277: 15558 -15565 , 2002. En la FIG. 14 se m ue s tra n las s e cu e n c ia s de un ión co n se n so y sus ub ica c io n e s re la tiva s a los ge ne s faba y fabB de E. coli.

S e creó una cepa fabR in ac tiva da de E. coli. P a ra a m p lif ic a r a p ro x im a d a m e n te 1 000 pb de fabR en d irecc ió n 5' se u tiliza ron los ceb ad o res T rm A _ R _ N o tI y F abR _F O P y para a m p lif ic a r a p ro x im a d a m e n te 1 000 pb de fabR en d ire cc ió n 3' se u tiliza ro n los c e b a d o re s S th A _ F _ B a m y F a b R _ R O P . P ara c re a r una c o n s tru cc ió n para la de le c ió n en m arco del gen fabR completo, se a p licó PC R con sup e rp os ic ión . La con s tru cc ió n pa ra la de le c ión de fabR se c lonó en un p lásm id o pK O V 3 sen s ib le a tem p e ra tu ra , que con ten ía S acB para la se lecc ió n po r con tras te . S e rea lizó una de le c ión c ro m o só m ica de fabR según el m é tod o de sc rito en L ink et al., J. B act., 179 :6228 -6237 , 1997.

Tabla 15: cebadores de fa b R in a c t iv a d o s

EJEMPLO 14. CONSTRUCCION DE HOSPEDADORES DE PRODUCCION

La Tabla 16 id e n tifica los ho m ó lo g o s de c ie rto s genes d e sc rito s en el p re sen te d o cu m e n to , que se sabe que se exp resa n en m ic ro o rg a n ism o s que p roducen b iod iése l, a lco h o le s g ra sos e h id ro ca rbu ros . Para a u m e n ta r la p ro du cc ión de ác ido s g ra sos y, po r lo tan to , la p ro du cc ión de h id ro ca rb u ro s en h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión , ta les com o los id e n tifica d o s en la Tabla 16, pueden e xp re sa rse en ge ne s he te ró logo s , ta le s com o los de E. coli.

Un e xp e rto h a b itu a l en la m a te ria a p re c ia rá que u tiliza n d o los m é to d o s d e sc rito s en el p re se n te do cu m e n to , ta m b ié n pu ed en exp re sa rse , so b re e x p re s a rs e o a te n u a rse ge ne s que son e n d ó g e n o s a los m ic ro o rg a n ism o s p ro p o rc io n a d o s en laTabla 16. A de m ás , los genes que se d e sc rib e n en la Tabla 16 pueden exp resa rse , s o b re e xp re sa rse o a te n u a rse en ho sp e d a d o re s de p ro du cc ión que p roducen h id ro ca rb u ro s de m an e ra e n d ó ge na para p e rm itir la p ro du cc ión de h id ro ca rb u ro s e sp e c ífico s con lo ng itud de cadena de ca rbono , pu n tos de sa tu ra c ió n y pu n tos de ra m ifica c ió n de fin idos.

co n tin u a c ió n

co n tin u a c ió n

co n tin u a c ió n

co n tin u a c ió n

co n tin u a c ió n

Los nú m ero s de reg is tro de la T a b la 16 son de l G e n B ank , V e rs ió n 159.0 de l 15 de ab ril de 2007 , los n ú m e ro s EC de la T a b la 16 son de la K E G G , V e rs ió n 42.0 de ab ril de 2007 (m á s a c tu a liza c io n e s d ia ria s hasta el 9 de m ayo de 2007 in c lus ive ), los resu ltad os de la cepa E a273 de Erwinia amylovora se ob tu v ie ro n en el ce n tro de se cu e n c ia c ió n de S anger, la se cu e n c ia a le a to ria se co m p le tó el 9 de m ayo de 2007 , las po s ic io ne s de Erwinia rep rese n tan ub ica c ion es en el p s e u d o c ro m o so m a de S ange r, las se cu e n c ia s de Vibrio furnisii M1 son de l p s e u d o c ro m o so m a V FM 1, co n s tru cc ió n v2, del 28 de se p tie m b re de 2006, e in c luye el gen com p le to , y ta m b ié n puede in c lu ir la secu en c ia flan qu ea n te .

EJEMPLO 15. CEPAS DE PRODUCCIÓN EJEMPLARES ADICIONALES

La Tabla 17 p ro p o rc io n a cep as de p ro du cc ión e jem p la re s ad ic io na le s . S e de sc rib en dos e je m p lo s de ru tas b io s in té tica s para la p ro du cc ión de ác ido s grasos, a lcoh o le s g ra sos y és te res de cera . P o r e jem p lo , La Tabla 17 p ro p o rc io n a los e jem p los 1 y 2 que p roducen ác ido s grasos. La cepa h o sp e d a d o ra de p ro du cc ión u tilizad a para p ro d u c ir ác ido s g rasos en el e jem p lo 1 es una cé lu la h o sp e d a d o ra de p ro du cc ión que está g e n o m a n ip u la d a para te n e r las a c tiv id a d e s en z im á tica s s in té ticas deseadas . C a da "x" m arca los genes c o rre la c io n a d o s con las ac tiv ida des , po r e jem p lo , a c tiv id a d e s de a ce til-C o A ca rb ox ilasa , t io e s te ra sa y a c il-C o A s in tasa . Las cé lu las h o sp e d a d o ra s de p ro du cc ión pueden s e le cc io n a rse de bac te rias , le vad u ras y hongos . S egún lo d ispu es to en Tabla 17, u tilizan do los ge ne s e xó g e n o s ind icados, pu ed en c rea rse h o sp e d a d o re s de p ro du cc ión ad ic iona les .

EJEMPLO 16. USO DE ACIL-COA SINTASAS ADICIONALES PARA SOBREPRODUCIR ACIL-COA

H o m o lo g o s a fadD de E. coli pueden e xp re sa rse en E. coli s in te tiza n d o ge ne s o p tim iza d o s po r co d o n e s basándose en una secu en c ia de sea da de M. tuberculosisHR7Rv (N P _ 217021 , F adD D 35), B. subtilis (N P _ 388908 , Y hfL), Saccharomyces cerevisiae (N P _ 012257 , F aa3 p ) o P. aeruginosa PAO 1 (N P _ 251989 ). P ueden d ise ñ a rse genes s in té tico s para in c lu ir sa lie n te s N co I y HindII com p a tib les . D espués , las a c il-C o A s in ta sas pueden c lo n a rse en un v e c to r pT rcH is2 d ige rido con NcoI/HindIII ( Inv itrog en C orp., C a rlsba d , C a lifo rn ia ) com o se de sc rib e a n te rio rm e n te y exp re sa rse en la cepa M G 1655 AfadE de E. coli. La exp res ión en E. coli puede c o n d u c ir a un a u m en to de la p ro du cc ión de ac il-C oA .

T a m b ié n pueden p ro du c irse d e riva d o s de ác ido s g rasos, ta l com o FA E E , m ed ia n te la c o tra n s fo rm a c ió n de la cepa M G 1655 AfadE de E. coli con d ive rsa s a c il-C o A s in ta sas en el v e c to r pT rcH is2 con un p lásm id o com p a tib le p ro ce d e n te de pC L1920 , que co n tie n e el gen tio é s te r de Cuphea hookeriana con o sin una é s te r s in ta sa de A. baylyi. El h o sp e d a d o r de p ro du cc ión resu ltan te p ro du c irá FA E E cuando se cu ltive en un m ed io que con teng a e tano l com o se de sc rib e a n te rio rm en te .

EJEMPLO 17. USO DE ACIL COA SINTASAS ADICIONALES PARA SOBREPRODUCIR ACIL-COA

S e co n o ce n se cu e n c ia s de A D N o s e cu e n c ia s de p ro te ín a s de m uch os h o m ó lo g o s de F adD de E. coli. S in em bargo , so lo se han d e sc rito las p ro p ie d a d e s b io q u ím ica s de a lg u n a s de e llas . V éase , po r e jem p lo , K no ll e t al., J. Biol. C hem .

269 (23 ):16348 -56 , 1994; S h o cke y et al., P lan t P hys io l. 132: 1065 -1076, 2003. A s im ism o , se d e sco n o ce su ca p a c id a d para e xp re sa rse en una fo rm a a c tiva a n ive le s s u fic ie n te m e n te a lto s para fine s com e rc ia les . P ara e xp lo ra r la po s ib ilidad de u tiliza r a c il-C o A s in ta sas h e te ró loga s para la p ro du cc ión de éste res, se c lona ron va rio s genes de a c il-C o A s in ta sa y se exp resa ron de la s ig u ie n te m anera . A u n q u e este e jem p lo de sc rib e la tra n s fo rm a c ió n del h o s p e d a d o r de p ro du cc ión con p lásm id os d is tin to s para los genes de tio e s te ra sa , é s te r s in ta sa y a c il-C o A s in tasa , es to s genes pueden , com o a lte rna tiva , in co rp o ra rse en un so lo p lásm id o para tra n s fo rm a r el h o sp e d a d o r de p roducc ión .

1. C o ns trucc ión de l p lásm id o pO P -80

P ara s o b re e x p re s a r los genes, a tra v é s de la d ige s tión de l p lásm id o p C L1920 con las en z im a s de res tricc ión A flII y S fo I (N e w E ng land B ioLabs Inc. Ipsw ich, MA), se con s tru yó un p lásm id o de ba jo núm ero de cop ia s basado en el v e c to r com e rc ia l p C L 1920 (L e rn e r e Inouye, N A R 18: 4631 , 1990 ) que llevab a un p ro m o to r tra n s c r ip c io n a l fue rte . A tra v é s de es ta d ig e s tió n , se c rea ron tre s fra g m e n to s de se c u e n c ia s de A D N . El fra g m e n to de 3737 pb se p u rif icó en ge l u tilizan do un kit de p u rifica c ión en gel (Q iagen , Inc. V a len c ia , CA). En pa ra le lo , un fra g m e n to que con ten ía el p ro m o to r trc y la reg ión lacldel p lá sm id o co m e rc ia l pT rcH is2 (Inv itrog en , C a rlsbad , C A ) se a m p lificó m ed ia n te PCR u tiliza n d o los ceb ad o res LF302: 5 '-A T A T G A C G T C G G C A T C C G C T T A C A G A C A -3 '(S E Q ID N O :41); y LF303: 5 '-A A T T C T T A A G T C A G G A G A G C G T T C A C C G A C A A -3 '(S E Q ID N O :42). E stos dos ce b a d o re s ta m b ié n in tro du je ro n s itio s de re c o n o c im ie n to pa ra las e n z im a s de re s tr ic c ió n Z ra I (g a c g tc ) y A flII (c ttaag ), re sp e c tiva m e n te , al fina l de los p ro d u c to s de la PCR . D espués de la a m p lifica c ió n , los p ro du c to s de la P C R se p u rifica ro n u tilizan do un kit de pu rifica c ión po r P C R (Q iagen , Inc. V a len c ia , C A ) y se d ig ir ie ro n con Z ra I y A flII s ig u ie nd o las con d ic ion es re co m e n d a d a s po r el fa b rica n te (N e w E ng land B io La bs Inc., Ipsw ich, M A). D e sp u é s de la d ige s tión , el p ro du c to de la P C R se pu rificó en ge l y se ligó con el fra g m e n to de 3737 pb de la se cu e n c ia de A D N p ro ce d e n te de pC L1920.

D e sp u é s de la tra n s fo rm a c ió n con la m ezc la de ligam ien to en T O P 10 cé lu la s q u ím ica m e n te co m p e te n te s (Inv itrogen , C a rlsbad , CA), los tra n s fo rm a n te s se se lecc io na ron en p lacas de a g a r Luria que con ten ían esp e c tin o m ic in a 100 |jg /m l. M uchas co lo n ia s fu e ro n v is ib le s de sp u é s de una in cub ac ió n du ran te la noche a 37 °C . Los p lásm idos p re sen te s en es ta s co lo n ia s se pu rifica ron , se a n a liza ro n con e n z im a s de res tricc ión , y d e sp u é s se se cu e n c ia ro n . Se c o n se rvó un p lásm id o p ro du c ido de esta m anera , de no m in a d o pO P -80 , y se u tilizó para e x p e rim e n to s ad ic iona les . En la F igu ra 16 se m u e s tra un m ap a de pO P -80.

S e ve rific a ro n las se cu e n c ia s de A D N de las reg io nes re leva n tes de l p lásm id o pO P -80. S e e n co n tró que en las u n io n e s d o n d e los 2 fra g m e n to s e s ta ban ligad os fa lta ban de 3 a 4 bases en cada extrem o . E sto fue p ro ba b le m en te ca u sa d o po r una ac tiv ida d de e xo n u c le a sa que c o n ta m in a una de las e n z im a s de res tricc ión . E ra p ro ba b le que estas pe qu eñ as d e le c io n e s no a fe c ta ran n ing una fun c ión im p o rtan te del p lásm ido . El p lásm id o resu ltan te se u tilizó en to d o s los e x p e rim e n to s de exp res ión d e sc rito s en este e jem p lo . La secu en c ia com p le ta de l p lásm ido se de sve la com o S E C ID NO: 1 en la FIG.17.

2. C lona c ió n de fadD35 de Tuberculosis micobacteriana H R 7R v

A tra vé s de D N A 2.0 Inc. (M en lo Park, CA), se s in te tizó un gen de E. coli o p tim iza d o con codones , u tilizan do com o pun to de pa rtida la secu en c ia de p ro te ínas del gen fadD35 d e po s itad a en el N C BI con el núm ero de reg is tro N P _217021 de G e n B ank . El gen s in té tico c o n te n ía un s itio N coI e xc lu s ivo en el ex tre m o 5' y un s itio E coR I e xc lu s ivo en el e x trem o 3'. El gen s in té tico se p ro p o rc io n ó a tra vé s de D N A 2.0 Inc. c lo n a d o en el p lásm ido pJ201 :16084. El gen fad35 se libe ró de este p lásm id o m ed ia n te d ige s tión con NcoI y EcoR I. La se cu e n c ia de este fra g m e n to se m u e s tra en la S E C ID NO: 2 en la FIG. 18. El fra g m e n to de s e c u e n c ia de A D N re su lta n te q u e se d e sve la en la S E C ID N°: 2 se ligó con pO P -80 , que p re v ia m e n te se d ig irió con NcoI y E coR I. La m ezc la de lig a m ie n to se tra n s fo rm ó en cé lu la s T O P 10 qu ím ica m e n te com p e ten te s (Inv itrog en , C a rlsbad , CA), que de spu és se co loca ron en p lacas de a g a r Lu ria que con ten ían e sp e c tin o m ic in a 100 pg /m l y se in cubó a 37 °C du ran te la noche . Las co lo n ia s que ap a re c ie ro n al d ía s ig u ie n te se e xp lo ra ro n y se iden tificó una cepa que co n te n ía el p lásm id o co rrec to . El p lásm id o se de no m inó pD S9.

3. C lona c ió n de fadD1 de Pseudomonas aeruginosa PAO1

A tra vé s de D N A 2.0 Inc. (M en lo Park, CA), se s in te tizó un gen de E. coli o p tim iza d o con codones , u tilizan do com o pun to de pa rtida la secu en c ia de p ro te ínas del gen fadDI de p o s ita d a en el N C BI con el n.° de reg is tro N P _ 251989 de G en B ank. El gen s in té tico con ten ía un s itio BspH I ún ico en el ex trem o 5 'y un s itio EcoR I ún ico en el ex trem o 3'. El gen s in té tico fue p ro p o rc io n a d o a tra v é s de A D N 2.0 , Inc. y se c lo nó en el p lá sm id o p J201 :16083. El gen fadDI se libe ró de este p lásm id o m ed ia n te d ige s tión con BspH I y E coR I. La secu en c ia de este fra g m e n to se m ue s tra en la S E C ID NO: 3 en la FIG . 19. El fra g m e n to de se cu e n c ia de A D N resu ltan te de S E Q ID NO: 3 se ligó con pO P -80, que p re v ia m e n te se d ig irió con NcoI y E coR I. La m ezc la de ligam ien to se tra n s fo rm ó en cé lu la s T O P 10 q u ím ica m e n te co m p e te n te s (Inv itrog en , C a rlsbad , CA), que d e sp u é s se co loca ron en p lacas de a g a r Lu ria que co n ten ían e sp e c tin o m ic in a 100 pg /m l y se incubó a 37 °C d u ran te la noche. Las co lon ias que a p a re c ie ro n al d ía s ig u ie n te se exp lo ra ron . S e id en tificó una cepa que co n te n ía el p lá sm id o co rrecto . El p lásm id o se d e n o m in ó pD S8.

4. C lona c ió n de yhfL de Bacillus subtilis

El gen yhfL se a m p lificó po r P C R u tiliza n d o B a c illu s subtilis La secu en c ia de A D N c ro m o s ó m ic o I168 com o m o lde , y dos ce b a d o re s d iseñ ado s en base a la secu en c ia de A D N de p o s ita d a en N C BI con el núm ero de acce so de G e n B a n k N C _000964. Las s e cu e n c ia s de los 2 c e b a d o re s fue ron :

B syh fL B spH IF : 5 '-C A T C A T G A A T C T T G T T T C -3 ' (S E Q ID N O :4) (FIG. 20)

B syh fL E coR : 5 '-C G G A A T T C T T A T T G G G G C A A A A T A T C -3 ' (S E Q ID N O :5 ) (FIG. 21)

E stos dos ce b a d o re s in tro du je ro n un sitio de re co n o c im ie n to B spH I en el e x trem o 5 'y un sitio de reco n o c im ie n to E coR I en el ex tre m o 3'. El p ro du c to de la P C R se c lonó d ire c ta m e n te en el v e c to r pC R -B lu n t II-T O P O u tiliza n d o el kit de c lo n a c ió n de P C R Z e ro B lu n t T O P O (Inv itrog en , C a rlsba d , C A). A l p lásm id o que llevab a el gen yhfL se le d e n o m in ó pD S 1. P ara s u b c lo n a r el gen yhfL, el p lásm ido pDS1 se d ig irió con BspH I y E coR I. El fra g m e n to de se cu e n c ia de A D N re su lta n te S E Q ID NO: 6 (FIG. 22) se pu rificó en gel y se c lonó en pO P -80 , que p re v ia m e n te se d ig irió con N coI y E coR I. A l p lásm id o que llevab a el gen yhfL de B. subtilis c lo n a d o en pO P -80 se le d e n o m in ó pD S4.

5. C lona c ió n de faa3p de Saccharomyces cerevisiae (N P 012257 )

El gen faa3p gen se a m p lificó po r P C R u tilizan do com o m o lde la secu en c ia de A D N c ro m o só m ico co m e rc ia l de Saccharomyces cerevisiae A T C C 204508 D (A m e rica n T yp e C u ltu re C o lle c tion , M an assa s , V A ) y dos c e b a d o re s que se d ise ñ a ro n b a sán do se en la secu en c ia de A D N de p o s ita d a en el N C BI con el n.° de reg is tro N C _001141 de G en B ank. Las s e cu e n c ia s de los dos c e b a d o re s fue ron :

S c faa 3pP c iF : 5 '-C G A C A T G T C C G A A C A A C A C -3 ' (S E Q ID N O :7 ) (FIG. 23)

S c faa 3pP c iI: 5 '-G C A A G C T T C T A A G A A T T T T C T T T G -3 ' (S E Q ID N O :8) (FIG. 24)

E stos dos ce b a d o re s in tro du je ro n en un s itio de re co n o c im ie n to Pci I en el ex tre m o 5' y en un s itio de re co n o c im ie n to H ind III en el ex tre m o 3'.

El p ro du c to de la P C R se c lo nó d ire c ta m e n te en el v e c to r p C R -B lu n t II-T O P O u tilizan do el k it de c lo n a c ió n de PC R Z e ro B lu n t T O P O (Inv itrog en , C a rlsbad , CA). A l p lásm id o que llevaba el gen faa3p se le de no m in ó pD S2. Para s u b c lo n a r el gen faa3p, el p lásm id o pD S 2 se d ig ir ió con PciI y H ind III. El fra g m e n to de se cu e n c ia de A D N (S E Q ID NO: 9) (FIG. 25) se p u rif icó en ge l y se c lo n ó en pO P -80 , qu e p re v ia m e n te se d ig ir ió con N coI y H ind III. A l p lá sm id o que llevab a el gen faa3p de S. ce re v is ia e c lo na do en pO P -80 se le d e n o m in ó pD S5.

6. C lona c ió n de ZP 01644857 de Stenotrophomonas maltofila R 551 -3

La secu en c ia gén ica es tru c tu ra l de la p ro te ína Z P _ 01644857 está d ispo n ib le en el N C BI com o pa rte del locus N Z _ A A V Z 01000044. El gen se a m p lificó po r P C R u tilizan do com o m o lde la se cu e n c ia de A D N c ro m o só m ico de Stenotrophomonas maltofila R 551 -3 y dos ce b a d o re s d ise ñ a d o s b a sán do se en la se cu e n c ia de A D N de po s itad a . Las s e cu e n c ia s de los dos ce b a d o re s fue ron :

S m p rk59 B sp F : 5 '-A G T C A T G A G T C T G G A T C G -3 ' (S E Q ID N O :10 ) (FIG. 26)

S m p rk59 H in d R : 5 '-G G A A G C T T A C G G G G C G G G C G -3 ' (S E Q ID N O :11 ) (FIG. 27)

E stos dos ceb ad o res in tro du je ro n un s itio de re co n o c im ie n to B spH I en el ex trem o 5' y en un s itio de reco no c im ie n to H ind III en el ex tre m o 3'.

El p ro du c to de la P C R se c lo nó d ire c ta m e n te en el v e c to r p C R -B lu n t II-T O P O u tilizan do el k it de c lo n a c ió n de PC R Z e ro B lu n t T O P O (Inv itrog en , C a rlsbad , CA). A l p lásm id o que llevab a el gen que cod ifica la p ro te ína Z P _ 01644857 se le de no m inó pD S3. P ara fa c ilita r la sub c lo nac ión ad ic io na l del gen, se e lim inó un s itio in te rno de B spH I m ed ian te m u ta g é n e s is d irig ida u tilizan do el c e b a d o r P rkB sp: 5 '-G C G A A C G G C C T G G T C T T T A T G A A G T T C G G T G G -3 '(S E Q ID NO: 12) (FIG. 28) y el k it de m u ta g é n e s is d irig ida a m ú ltip le s s itio s de Q u ikC h a n g e (S tra tag ene , La Jo lla , CA). D e sp u é s de co rro b o ra r la m u tac ión a p ro p ia d a po r se cu e n c ia c ió n de A D N , el p lásm id o resu ltan te se d ig ir ió con BspH I y H indIII, y se de no m inó pD S 6. El fra g m e n to de secu en c ia de A D N se pu rificó en gel y se c lonó en pO P -80 p re v ia m e n te d ig e rid o con N coI y H ind III. A l p lásm id o que lle vab a el gen que co d ifica la p ro te ína Z P _ 01644857 c lo n a d o en pO P -80 se le de no m inó pD S 7. En la FIG. 29 (S E C ID NO: 13) se d e sve la la secu en c ia de p ro te ínas de Z P _01644857.

7. C o ns trucc ión de ce p a s para p ro d u c ir é s te re s grasos.

U na cepa BL21 (D E 3 ) de E. coli se tra n s fo rm ó p rim e ro con el p lásm id o p E T D u e t-1 -'T e sA (de sc rito en E JE M P L O 2 ) que lle vab a el gen 'tesA de E. coligen, y con el p lásm id o p H Z 1.97 (d e sc rito en el E JE M P L O 9) que llevab a el gen atfA2 de é s te r s in te tasa , re sp e c tiva m e n te . A m b o s ge ne s e s ta ban ba jo el con tro l de un p ro m o to r de T 7 in d u c ib le con IP TG . D os tra n s fo rm a n te s in d e p e n d ie n te s que llevab an am b os p lásm idos , se tra n s fo rm a ro n con cada uno de los p lá sm id o s re co m b in a n te s que lle vab an los ge ne s fadD he te ró logo s , y se se le cc io n a ro n en p lacas de a g a r Lu ria que co n ten ían ca rb e n ic ilin a 100 pg /m l, ka n a m ic in a 50 pg /m l y e sp e c tin o m ic in a 100 pg /m l. T res co lo n ia s in de p e n d ie n te s que llevab an los tres p lá sm id o s se eva lu a ro n con resp e to a la p ro du cc ión de é s te re s grasos.

8. A n á lis is de és te re s g ra sos p ro du c ido s u tiliza n d o Z P 01644857 de Stenotrophomonas maltofila R 551 -3

P ara e va lu a r el uso de la p ro te ína Z P _ 01644857 de Stenotrophomonas maltofila R 551 -3 en un h o sp e d a d o r de p ro d u cc ió n pa ra p ro d u c ir és te re s g rasos , una cep a BL21 (D E 3 ) de E. coli se tra n s fo rm ó con el p lá sm id o p E T D u e t-1 -'T e sA (d e sc rito en el E JE M P L O 2 ) que llevab a el gen tesA de E. coli, con el p lásm ido p H Z 1.97 (d e sc rito en el E JE M P L O 9) que llevab a el gen atfA2 de la e s te r s in te ta sa y con el p lásm id o pD S 7 que llevab a el gen que co d ifica la p ro te ína Z P _ 01644857 (d e sc rito a n te rio rm e n te en el p re se n te e je m p lo ). E ste h o sp e d a d o r de p ro du cc ión se fe rm e n tó pa ra p ro d u c ir és te re s g ra sos com o se de sc rib e en el E JE M P L O 4. C om o con tro l, se u tilizó una se g u n d a cepa de BL21 (D E 3 ) A fad E de E. coli que c o n te n ía los p lásm id os pE T D u e t-1 -'T esA , p H Z 1.97 y p C L1920 com o h o sp e d a d o r de p ro du cc ión pa ra p ro d u c ir é s te re s grasos.

La tabla 18 a co n tin u a c ió n ind ica los re n d im ie n to s de é s te r g ra so de es to s h o sp e d a d o re s de p roducc ión .

EJEMPLO 18. REGULACION NEGATIVA DE BETA-OXIDACION

E ste e jem p lo de sc rib e la c rea c ió n de una cepa M G 1655 AfadE AydiO de E. coli.

La d e g ra dac ión de los ác idos g ra sos se puede e lim in a r o a te n u a r a te n u a n d o cu a lq u ie ra de las rea cc io nes e n z im á tica s de p -o x id ac ió n de sc rita s en el p re sen te d o cu m e n to (véa se la FIG. 2 ). P o r e jem p lo , la cepa M G 1655 FadE de E. coli, pued e g e n o m a n ip u la rse ad ic io n a lm e n te u tilizan do ce b a d o re s para a m p lif ic a r ydiO en d irecc ió n 5' y ce b a d o re s a d ic io n a le s para a m p lif ic a r ydiO en dirección 3'. D espués , para c re a r una con s tru cc ió n para la de lec ión en m arco de l gen ydiO com p le to , pued e u tiliza rse P C R con sup e rp os ic ión . La co n s tru cc ió n de de le c ión ydiO se c lonó de sp u é s en un p lásm ido pK O V 3 sen s ib le a tem p e ra tu ra , que co n te n ía un gen sacB pa ra la se lecc ió n po r con tras te . después , se rea lizó una de le c ión c ro m o só m ica de ydiO según el m é tod o de L ink et al., J. Bact. 179 :6228 -6237 , 1997. La cepa re su lta n te no será capaz de d e g ra d a r ác idos g ra sos ni ac il-C o A grasa . P o r e jem p lo , en C a m p b e ll et al., Mol. M icrob io l. 47: 793-805 , 2003 se d e scrib en m é tod os ad ic io na le s para g e n e ra r un dob le gen in ac tiva do de fa d E e ydiO .

T a m b ié n es po s ib le im p e d ir la d e g ra dac ión de los ác ido s g ra sos se le cc io n a n d o o em p le a n d o un h o sp e d a d o r de p ro du cc ión que no co n te n g a la ru ta de p ox ida c ión . P o r e jem p lo , se han se cu e n c ia d o va ria s esp ec ies de Streptococcus y no se han e n co n tra d o ge ne s de p ox idac ión .

EJEMPLO 19. IDENTIFICACIÓN DE ÉSTER SINTASAS ADICIONALES

E ste e je m p lo p ro p o rc io n a é s te r s in ta sa s ad ic io n a le s y m é tod os de uso de d icha s s in ta sa s para la p ro du cc ión de é s te re s grasos.

U tiliza n d o p ro g ra m ac ió n b io in fo rm á tica , se id en tifica ron é s te r s in ta sa s ad ic io na le s . E stas é s te r s in ta sas con tienen m o tivos que d ifie ren de o tros m o tivos con oc idos , ta le s com o los m o tivos en con tra do s en A D P 1. En la s igu ien te Tabla 19 se ind ican las d ife re n c ia s en los m otivos.

Las se cu e n c ia s id e n tifica d a s pueden c lo n a rse u tilizan do té cn ica s de b io log ía m o le c u la r con ven c ion a les . Estas s e cu e n c ia s pueden e xp re sa r u tilizan do los v e c to re s d e sc rito s en el p re sen te d o cu m e n to y se u tilizan para fa b ric a r d ive rso s é s te re s g rasos. Los m o tivo s ta m b ié n pueden u tiliza rse para id e n tifica r o tras é s te r s in tasas.

EJEMPLO 20. CARACTERIZACIÓN DEL PRODUCTO

P ara ca ra c te r iz a r y cu a n tif ic a r los a lcoh o le s g ra sos y los és te res g rasos, se u tilizó c ro m a to g ra fía de gases (G C, s ig las del ing lés gas chromatography) aco p lada con de tecc ió n de e sp ec tros de m asas (M S, mass spectra) de im p ac to e lec trón ico . Las m u e s tra s de a lcoh o l g ra so se d e riva tiza ro n p rim e ro con un exceso de N -tr im e tils ilil (T M S ) im idazo l para a u m e n ta r la sen s ib ilidad de la de tecc ión . Los és te res g ra sos no req u irie ro n de riva tizac ió n . Los d e riva d o s de a lcoh o l g ra so -T M S y de és te res g ra sos se d iso lv ie ro n en un d iso lve n te vo lá til a p rop iad o , ta l com o , por e jem p lo , ace ta to de etilo.

Las m ue s tra s se a n a liza ro n en una co lu m n a c a p ila r D P -5 de 30 m u tilizan do el s ig u ie n te m é todo . D e spu és de una in ye cc ió n s in d iv is ió n de 1 pl en la c o lu m n a de G C /M S , la e s tu fa se m a n tu vo a una te m p e ra tu ra de 100 °C d u ra n te 3 m inu tos. La te m p e ra tu ra se e levó g ra d u a lm e n te a 320 °C a una v e lo c id a d de 20 °C /m in u to . la es tu fa se m an tu vo a una te m p e ra tu ra de 320 °C d u ran te 5 m in u tos m ás. El cau da l de l gas p o rta d o r he lio fue de 1,3 m l/m inu to . El cu a d ru p o lo de M S e fe c tu ó un ba rrido de 50 a 550 m /z. Los t ie m p o s de re ten c ió n y los p a tro n e s de fra g m e n ta c ió n de los p icos de p ro du c to se co m p a ra ro n con re fe re nc ias a u té n tica s para c o n firm a r la id en tidad de los picos.

P o r e jem p lo , el é s te r e tílico de l á c id o h e xa d e ca n o ico se e luyó a los 10 ,18 m in u tos (F IG s. 15A-B). El ion p re c u rs o r de 284 un id ade s de m asa se ob se rvó fác ilm en te . M ás ab u n d a n te s fue ro n los iones se cu n d a rio s p ro du c ido s du ran te la fra g m e n ta c ió n de m asa . El ion s e cu n d a rio m ás fre cu e n te fue de 80 un id ade s de m asa . El a lcoh o l graso h e xa d e ca n o l-T M S d e riva tiza d o se e luyó a los 10 ,29 m in u tos y se ob se rvó el ion p re cu rso r de 313. El ion m ás fre cu e n te fu e el ion M -14 de 299 un id ade s de m asa.

La cua n tifica c ión se rea lizó in ye c ta n d o d ive rsa s c o n ce n tra c io n e s de las re fe re nc ias a u tén tica s ap ro p ia d a s u tilizando el m é tod o de G C /M S com o se de sc rib e en el p re sen te docum e n to . Esta in fo rm ac ió n se u tilizó para g e n e ra r una cu rva pa trón con resp u e s ta (re cu e n to to ta l de iones in te g ra d o s ) fre n te a con cen tra c ión .

EJEMPLO

CACIÓN Y RECLASIFICACIÓN DE UN MICROORGANISMO PERTENECIENTE AL

GENERO J E O T G A L IC O C C U S QUE ES UN PRODUCTOR DE a-OLEFINA

A n te r io rm e n te se co m u n icó que Micrococcus candicans A T C C 8456 s in te tiza b a h id ro ca rb u ro s a lifá tico s con lo ng itude s de cad en a de c a rb o n o que v a ria b a n de C-is a C ²⁰(M o rrison e t al., J. B acte rio l. 108 :353-358 , 1971). Para id e n tifica r los h id ro ca rb u ro s p ro du c ido s po r esta cepa, cé lu las A T C C 8456 se cu ltiva ron en 15 m l de m ed io T S B Y E (ca ld o de so ja tr íp tic o al 3 % ex trac to de le vad u ra al 0 ,5 % ), du ran te 40 -48 ho ras a 30 °C. Las cé lu la s de 5 m l de cu ltivo se se d im e n ta ro n , se re s u sp e n d ie ro n en 1 m l de m e tano l, se so m e tie ro n a u tra so n id o d u ra n te 30 m in u tos y se e x tra je ro n con 4 ml de hexano. T ra s e v a p o ra rse el d iso lve n te , las m u e s tra s se re su sp e n d ie ro n en he xano 0,1 ml y se a n a liza ro n po r G C -M S . Los h id ro ca rb u ro s se id en tifica ron com o las s ig u ie n te s a -o le fin a s : 15 -m e til-1 -h e p ta d e ce n o (a-C ¹⁸), 16 -m e til-1 -h e p ta d e ce n o (i-C-m), 1 -n on ade cen o (n-C-ig), 17 -m e til-1 -n o n a d e ce n o (a -C ²⁰) y 18 -m e til-1 -n o n a d e ce n o (¡-C ²⁰) (véa se la FIG.34 (i= iso , a= an te iso , n = cad en a linea l) y la FIG.36).

B a sá n d o se en los s ig u ie n te s an á lis is , se d e te rm in ó que a n te r io rm e n te las cé lu la s A T C C 8456 se hab ían id e n tifica d o e rró n e a m e n te com o pe rte n e c ie n te s al géne ro Micrococci. La c la s ificac ión filo g e n é tica de A T C C 8456 se vo lv ió a e va lu a r am p lif ica n d o y s e cu e n c ia n d o el gen de A R N r 16s parc ia l u tiliza n d o los ce b a d o re s E ubac27 y 1492R (véase D eLong e t al., P N A S 89: 5685, 1992). La se cu e n c ia de A R N r 16s de A T C C 8456 se an a lizó u tilizan do el p rog ram a c la s if ic a d o r de l R iboso m a l D a tabase P ro je c t II (h ttp ://rd p .c m e .m s u .e d u /in d e x .js p ). B asá nd ose en este an á lis is , la cepa se iden tificó com o pe rte ne c ien te al género . Jeotgalicoccus. El ge ne ro Jeotgalicoccus se ha descrito a n te rio rm e n te (Ju n g -H o o n e t al., Int. J. Syst. Evol. M icrob io l. 53 :595 -602 , 2003).

S e rea lizó un an á lis is ad ic io na l u tilizan do el con te n id o de G C de A T C C 8456. Jeotgalicoccus es una bac te ria g ra m p o s itiva con ba jo co n ten ido en G C re la c io n a d a con el género . Staphylococcus (véa se la figu ra 37). P o r oto lado las b a c te ria s de gé ne ro Micrococcus son ba c te ria s g ra m p o s itiva s con a lto co n ten ido en G C . S e secu en c ia ro n los ex tre m o s de va rio s c lo ne s de una b ib lio te ca de cósm ido s de A D N ge nó m ico de A T C C 8456. B asá nd ose en una se cu e n c ia de A D N de a p ro x im a d a m e n te 4 000 pb, se d e te rm in ó que el co n te n id o de G C era de a p ro x im a d a m e n te un 36 %. Las b ú sq u e d a s de s e cu e n c ia s de n u c le ó tid o s en una base de da tos de p ro te ínas no re d u n d a n te s reve la ron que to d a s las s e cu e n c ia s que co inc id en con una e n tra da en la base de d a to s fue ro n s im ila re s a las p ro te ínas de ba c te ria s g ra m p o s itiva s con ba jo co n te n id o en G C , ta le s com o esp ec ies pe rte n e c ie n te s a los géne ros Staphylococcus o Bacillus, pe ro no esp e c ie s p e rte n e c ie n te s al g é ne ro Micrococcus.

A con tinu ac ió n , se rea lizó un an á lis is ho lo g e n ó m ico de A T C C 8456. B asá nd ose en una secu en c ia de A D N de a p ro x im a d a m e n te 2.1 MB, se d e te rm in ó que el co n te n id o ho lo g e n ó m ico de G C era de a p ro x im a d a m e n te 36 ,7 %. En cam b io , se sabe que las ba c te ria s de l géne ro Micrococcus tien en ge no m as con alto co n ten ido en G C , por e jem p lo , el ge no m a de Micrococcus luteus N C TC 2665 tien e un co n te n id o de G C de 72 ,9 % (n .° de reg is tro A B L Q 01000001 -68 de G en B ank). B asá nd ose en el an á lis is de con ten ido de G C , se de te rm in ó que el m ic ro o rg a n ism o A T C C 8456 no p e rte n e c ía al g é ne ro Micrococcus.

T a m b ié n se e xa m in a ron o tras cepas de Jeotgalicoccus para d e te rm in a r si p roduc ían a -o le fin a s . SE e xa m in a ron las s ig u ie n te s cepas de Jeotgalicoccus: Jeotgalicoccus halotolerans D S M Z 17274, Jeotgalicoccus psychrophilus D S M Z 19085 y Jeotgalicoccus pinnipedalis D S M Z 17030. C ada cepa se cu ltivó en 15 m l de m e d io T S B Y E (ca ldo de so ja tr íp tic o al 3 % e x tra c to de le v a d u ra al 0 ,5 % ) y los h id ro ca rb u ro s se a is la ro n y se a n a liza ro n p o r G C -M S com o se d e sc rib ió an te rio rm e n te . Las tre s cep as p ro du je ro n a -o le fin a s s im ila re s a las p ro du c ida s po r A T C C 8456 (las F IG S 34B , 34C y 34D rep rese n tan tra z a d o s de Gc -MS de h id ro ca rb u ro s p ro du c ido s po r cé lu la s D S M Z 17274 de Jeotgalicoccus halotolerans, cé lu las D S M Z 17030 de Jeotgalicoccus pinnipedalis y cé lu las D S M Z 19085 de Jeotgalicoccus psychrophilus, resp e c tiva m e n te ). E stos da tos ind ican que la ca p a c id a d pa ra p ro d u c ir a -o le fin a s está m uy e x te n d id a en tre el g é ne ro Jeotgalicoccus.

EJEMPLO 22. PRODUCCIÓN DE NIVELES AUMENTADOS DE OLEFINAS Y a-OLEFINAS NO PRODUCIDOS NORMALMENTE POR CELULAS ATCC 8456 UTILIZANDO SUMINISTRO DE ACIDOS GRASOS

Los ác ido s g ra sos ác ido e ico sa n o ico (ác ido g raso de cad en a linea l C ²⁰), ác ido 16 -m etil oc ta d e ca n o ico y ác ido 17-m e til o c ta d e ca n o ico (ác ido s g ra sos de cadena ram ificada C ¹⁹), se id e n tifica ro n com o c o m p o n e n te s de líp ido s de cé lu la s A T C C 8456. S e de du jo que es to s ác ido s g ra sos e ran los p re cu rso re s d irec tos, de sp u é s de la de sca rb o x ila c ió n , para la b ios ín tes is de 1 -n on ade cen o , 15 -m e til-1 -h e p ta d e ce n o y 16 -m e til-1 -he p tad ecen o , re sp e c tiva m e n te . Con el fin de m e jo ra r la p ro d u cc ió n de a -o le fin a y p ro d u c ir o le fin as que no rm a lm e n te no p roducen las cé lu la s A T C C 8456, se rea liza ron e xp e rim e n to s de sum in is tro de ác ido s g ra sos com o se de sc rib e a con tinu ac ió n . En 15 m l de un m ed io T S B Y E (que co n te n ía ca ldo de so ja tríp tico al 3 % ex trac to de le vad u ra al 0 ,5 % ), se cu ltiva ro n cé lu la s A T C C 8456. A l m ed io de cu ltivo se añ ad ie ro n ác ido s g ra sos a una c o n ce n tra c ió n fina l de 0 ,5 g/l (0 ,05 % ). D e spués de c re c e r d u ran te 40 -48 ho ras a 30 °C, se sed im e n ta ron cé lu las de 5 m l de cu ltivo , se resu sp e n d ie ro n en m e tan o l 1 ml, se som e tie ro n a u traso n ido du ran te 30 m in u tos y se ex tra je ro n con hexano 4 ml. T ras e v a p o ra rse el d iso lve n te , las m u e s tra s se re su sp e n d ie ro n en h e xan o 0,1 ml y se a n a liza ro n po r G C -M S .

C u a n d o a los cu ltivos se les sum in is tró ác ido e icosa no ico , se ob se rvó un au m e n to en la p ro du cc ión de 1-no na d e ce n o de a p ro x im a d a m e n te 18 ve ce s (véa se la FIG . 38A ; los tra za d o s ne gro s rep rese n tan que no hay su m in is tro de ác ido s g ra so s y los g rise s rep re se n ta n que ha y su m in is tro de á c id o s g rasos). C u a n d o a los cu ltivo s se les su m in is tró ác ido es te á rico o ác ido pa lm ítico , se o b se rvó un au m e n to en la p ro du cc ión de las a -o le fin a s 1-p e n tad ece no y 1 -h ep ta de ceno , re sp e c tiva m e n te (véa se la FIG . 38B). N o rm a lm e n te , las cé lu las A T C C 8456 no p ro du cen estas o le finas. E sto in d icó que los ác ido s g ra sos e ran los p re cu rso res d irec tos de las a -o le fin a s y que las ba c te ria s de l géneroJeotgalicoccus pod ían u tiliza rse para tra n s fo rm a r e n z im á tica m e n te in vivo ác ido s g ra sos en a -o le finas.

C o m o a lte rna tiva , a las cé lu las de Jeotgalicoccus en rep oso se las puede s u m in is tra r d ive rso s ác ido s g ra sos para o b te n e r resu ltad os s im ila res.

EJEMPLO 23. SINTESIS IN V IT R O DE a-OLEFINAS UTILIZANDO EXTRACTOS CELULARES Y PROTEÍNAS PURIFICADAS PARCIALMENTE

S e u tilizó un ex trac to a c e lu la r de A T C C 8456 para tra n s fo rm a r los ác ido s g ra sos lib res en a -o le fin a s . El ex trac to a c e lu la r se gene ró u tilizan do el s ig u ie n te p ro ced im ie n to : cé lu la s A T C C 8456 se cu ltiva ron en un m ed io T S B Y E (que co n te n ía ca ldo de so ja tríp tico al 3 % ex trac to de le vadura al 0 ,5 % ) a 30 °C d u ran te 24 ho ras con ag itac ión . D espués , las cé lu la s se se d im e n ta ro n de l cu ltivo m e d ia n te ce n trifu g a c ió n a 3 700 rpm d u ra n te 20 m inu tos. D espués, el se d im e n to c e lu la r se resu sp e n d ió en ta m p ó n T ris 50 m M , pH 7,5 con N aC l 0,1 M y d itio tre ito l 2 ,0 m M a una c o n ce n tra c ió n de 0,1 g /m l de cé lu las . A esta susp en s ión ce lu la r, se añ ad ie ro n 200 un id a d e s /m l de lisos ta fina (S ig m a ) en h ie lo . La reacc ión de lis is c e lu la r co n tin u ó du ran te 30 m inu tos . D espués, las cé lu la s se som e tie ro n a u tra so n id o a 12 W en h ie lo d u ra n te tre s c ic los de 1,5 se g u n d o s de u traso n ido se g u id o de 1,5 se g u n d o s de reposo . El u ltra so n id o du ró un to ta l de 9 seg un do s . E ste p ro ce d im ie n to se rep itió 5 v e c e s con un in te rva lo de 1 m in u to e n tre los c ic los de u ltra son ido . D espués , las cé lu las lisada s se som e tie ro n a ce n trifu g a c ió n a 12 000 rpm d u ra n te 10 m in u tos para s e d im e n ta r los de sech os ce lu la res . El so b ren ada n te (e x tra c to a c e lu la r) se e lim in ó y se u tilizó para la tra n s fo rm a c ió n de ác ido s g ra sos lib res en a -o le finas .

D e spu és de o b te n e r el ex trac to ace lu la r, los ác ido s g rasos libres, ác ido es te á rico y ác ido e icosa no ico , se tra n s fo rm a ro n en a -o le fin a s u tilizan do el ex trac to a c e lu la r com o se de sc rib e m ás ade lan te . En p rim e r lugar, se p re pa ró una d iso lu c ió n m ad re al 5 % de es te a ra to de sod io o de po tas io en una so luc ió n de T e rg ito l al 1 % (S igm a, St. Louis, MO). A con tinu ac ió n , a 1 m l del ex trac to a ce lu la r se añ ad ie ro n 6 pl de la d iso lu c ió n m ad re a te m p e ra tu ra am b ie n te pa ra o b te n e r una c o n ce n tra c ió n fina l de sa l de ác ido g ra so lib re de 1 m M . La reacc ión se llevó a cabo a te m p e ra tu ra am b ie n te d u ran te 3 ho ras. Las a -o le fin a s se recu p e ra ro n a ñ ad ien do a la m ezc la 200 pl de a ce ta to de etilo , ag itan do b re vem e n te en vó rtex , ce n trifu g a n d o b re vem e n te , y de spu és e lim in a n d o la fase o rgán ica . Las a -o le fin as se id en tifica ron y /o se de te c ta ro n m ed ia n te G C /M S .

La FIG. 39 m ue s tra los tra za d o s de G C /M S de los p ro du c to s resu ltan te s . En la m ue stra 1, no se añ ad ió ác ido esteárico al extracto acelular. En la muestra 2, el extracto acelular se reemplazó con tampón Tris 50 mM, pH 7,5, con cloruro de sodio 0,1 M al que se añadió ácido esteárico. En la muestra, se añadió ácido esteárico al extracto acelular. Al cabo de 7,62 minutos el pico tuvo el mismo tiempo de retención y los mismos espectros de masas que el 1-heptadeceno (Sigma). Cuando se añadió ácido eicosanoico en condiciones similares, se formó 1-nonadeceno.

Al hervir el extracto acelular se elimina la producción de a-olefinas después de la adición de ácidos grasos libres. Este dato sugirió firmemente que el catalizador ATCC 8456 estaba basado en proteínas.

El extracto acelular ATCC 8456 no requirió co-factores adicionales para producir a-olefinas. Cuando el extracto acelular se complementó con diversos cofactores en concentraciones de 1 mM, no se observó ningún aumento en la síntesis de a-olefina. Los cofactores examinados fueron NAD+, NADP+, NADH, NADPH, FADH2, SAM, ATP y CoA. Además, se examinó el Mg2+, pero a una concentración de 10 mM. La necesidad de cofactor también se probó dializando el extracto acelular con una membrana de 10 kDa de corte durante 1,5 horas en un volumen que era 200 veces mayor que el volumen del extracto celular utilizando un tampón de diálisis: Tris 50 mM, pH 7,5 con cloruro de sodio 0,1 mM. Después de la diálisis, no se observó disminución en la síntesis de a-olefina. Adicionalmente, cuando a la mezcla de reacción se la añadió EDTA 10 mM a pH 7,5, no se observó disminución en la síntesis de a-olefina.

Adicionalmente, el extracto de ATCC 8456 acelular se enriqueció precipitando con sulfato de amonio. En primer lugar, al extracto acelular se le añadió suficiente sulfato de amonio para llevar la concentración de sulfato de amonio a una saturación del 50 % (p/v). La mezcla se agitó suavemente en hielo durante 60 minutos y después se centrifugó a 13000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante se recuperó y se añadió sulfato de amonio adicional para llevar la concentración de sulfato de amonio al 65 % (p/v). La mezcla se dejó mezclar en hielo durante 60 minutos y se centrifugó de nuevo durante 30 minutos. El sobrenadante se desechó. Después, el sedimento se resuspendió en tampón Tris 50 mM, pH 7,5, con cloruro sódico 0,1 M. Esta mezcla se dializó después en el tampón mencionado anteriormente para eliminar el sulfato de amonio. El extracto acelular tratado con sulfato de amonio tenía la misma actividad sintetizadora de a-olefina que el extracto acelular.

EJEMPLO 24. PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA QUE TRANSFORMA ÁCIDOS GRASOS EN a-OLEFINAS

Para aislar la proteína necesaria para la producción de a-olefina de las células ATCC 8456, se llevó a cabo el siguiente procedimiento de purificación de proteínas. En primer lugar, se cultivaron 6 l de células ATCC 8456 en un medio TSBYE a 30 °C durante 24 horas con agitación. Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 3700 rpm durante 20 minutos a 4 °C, y el sobrenadante se desechó. El sedimento celular se resuspendió en una solución de 100 ml de Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 0,1 M, DTT 2,0 mM e inhibidores de proteasa bacteriana. Después, la suspensión celular se pasó una vez a través de una prensa francesa a una presión de 30000 psi. A continuación, la suspensión celular se sometió a utrasonido como se describe en el Ejemplo 3 para cortar el ADN. El extracto acelular se centrifugó a 10000 rpm durante 60 minutos a 4 °C. Después se eliminó el sobrenadante y se añadió sulfato de amonio a una concentración final de 50 % (p/v). La mezcla se agitó suavemente a 4°C durante 60 minutos y después se centrifugó a 10000 rpm durante 30 minutos. Después, se eliminó el sobrenadante y se añadió más sulfato de amonio a una saturación de 65 % (p/v). La mezcla se agitó nuevamente durante 60 minutos a 4 °C y se centrifugó a 10000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante se desechó. El sedimento restante se resuspendió en 50 ml de Tris 50 mM, pH 8,0 y DTT 2,0 mM.

La mezcla se pasó a través de una columna HiTrap SP de 5 ml (GE Healthcare) a 3 ml/min y a 4 °C. Como gradiente de elución se utilizaron los siguientes tampones: tampón A, que contenía Tris 50 mM, pH 8,0 y DTT 2,0 mM; tampón B, que contenía Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 1,0 M y DTT 2,0 mM. Después de cargar la columna con la mezcla, la columna se lavó con tampón B al 40 %. A continuación, se llevó a cabo un gradiente de 20 minutos de tampón B al 40 % a tampón B al 100 % a 3,0 ml/min. Se recogieron fracciones de 5 ml durante el gradiente de elución. Se probó la actividad de cada fracción como se describe en el Ejemplo 3. Las fracciones que contenían una actividad de producción de a-olefina eluyeron normalmente a una concentración de NaCl que variaba entre 600 y 750 mM. Después, las fracciones que contenían actividad se agruparon y se dializaron en un tampón A.

La fracción de proteína dializada se cargó después en una columna ResourceQ (GE Healthcare) de 1 ml a 4 ml/min a una temperatura de 4 °C. El tampón B utilizado con la columna HiTrap SP también se utilizó para la columna ResourceQ. Se ejecutó un gradiente de elución de 7 minutos entre tampón B al 0 % y tampón B al 25 % a 4 ml/min. Se recogieron fracciones de 1,5 ml y se sometieron a ensayo para determinar su actividad. Las fracciones activas eluyeron a concentraciones de NaCl que variaban entre 150 y 200 mM. Después, las fracciones que contenían actividad se agruparon y se concentraron con un concentrador de proteínas Millipore Amicon (4 ml y tamaño de exclusión de 10 kDa) a aproximadamente 50 pl. La concentración de proteínas aproximada se determinó con un ensayo de Bradford (Bio-Rad). Las concentraciones finales de proteína variaban entre aproximadamente 5 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml. Después, se cargaron 30 pl de proteína en un gel SDS PAGe (Invitrogen) junto con un marcador de peso molecular de proteína apropiado. El gel se tiñó con la tinción Simple Safe de Coomassie (Invitrogen). La FIG. 40 muestra un gel representativo. Se observaron dos bandas de proteínas intensas a 50 kDa y a 20 kDa.

P ara d e te rm in a r la id en tidad de las b a nd as de p ro te ínas , las b a nd as se e sc in d ie ro n de l gel, se d ig ir ie ro n con tr ip s in a y se a n a liza ro n u tiliza n d o LC /M S /M S . Los da tos de la L C /M S /M S se a n a liza ro n u tiliza n d o el p ro g ra m a M a sco t (M ann e t al., A na l. C hem . 66 :4390 -4399 , 1994). El g e n o m a de A T C C 8456 se secu en c ió . Los da tos g e n ó m ico s se u tiliza ron para in te rp re ta r los da tos de LC /M S /M S y para d e te rm in a r la id en tidad de las bandas de p ro te ínas. La banda de 50 kD a tu vo una fu e rte co in c id e n c ia con la O R F 880. La pu n tua c ió n de l p ro g ra m a M asco t as ig n a d a a esta co in c id e n c ia fue de 919, una p u n tu a c ió n alta . A s im is m o , la O R F 880 t ie n e un peso m o le c u la r p re v is to de 48 367 Da. Las se cu e n c ia s de nu c le ó tido s y de a m in o á c id o s de la orf880 se p resen tan en las FIGs. 41A y 41B, resp ec tiva m en te .

EJEMPLO 25. EXPRESIÓN HETEROLÓGA DE O R F 880 DE ATCC 8456 D E J E O T G A L IC O C C U S EN E. C O L I La O rf880 de A T C C 8456 de Jeotgalicoccus se iden tificó com o una de las dos p ro te ínas p rinc ip a les en una fracc ió n de e n z im a a lta m en te pu rifica d a que ca ta liza la tra n s fo rm a c ió n de ác ido s g ra sos lib res en a -o le fin a s . El A D N g e n ó m ico que co d ifica A T C C 8456 _ o rf880 se c lo nó en p C D F -D u e tl ba jo el con tro l de l p ro m o to r de T7, y E. coli se tra n s fo rm ó con d ive rso s vec to re s , com o se de sc rib e a con tinu ac ió n . Las cé lu las de E. coli se cu ltiva ro n y los h id ro ca rb u ro s p ro du c ido s po r las cé lu la s se an a liza ro n com o se de sc rib e en el E je m p lo 23. C u an do se sum in is tró ác ido e s te á rico al 0 ,05 % a los cu ltivos de E. coli tra n s fo rm a d o s con el v e c to r que con ten ía 8456 _o rf880 , la e xp res ión de 8456 _ o rf880 con du jo a la fo rm a c ió n de 1 -h ep ta de ceno en E. coli (véa se la FIG. 42, q u em u es tra tra z a d o s de G C /M S de a -o le fin a s de E. coli ya sea s in (n e g ro ) o con (g ris ) e xp re s ió n de 8456 _ o rf880 exp re s ió n ). En cam b io , la ad ic ión de ác ido es te á rico al 0 05 % a los cu ltivos de E. coli tra n s fo rm a d o s con un con tro l de v e c to r (que no c o n te n ía A T C C _ o rf880 ) no d io co m o re su lta d o la p ro d u cc ió n de 1 -h ep ta de ceno . E sto de m o s tró que 8456 _ o rf880 s in te tizó a -o le fin a s a p a rtir de ác ido s g ra sos lib res en un h o s p e d a d o r he te ró lo g o de E. coli. E s te resu lta d o ind ica que la b io s ín te s is de a -o le fin a pued e re a liza rse en o rg a n ism o s he te ró logo s . A d ic io n a lm e n te , cu a n d o a cé lu la s de E. coli, que exp re sa b a n la p ro te ína 8456 _o rf880 , se las sum in is tra b a ác ido pa lm ítico al 0 ,05 % o ác ido e ico sa n o ico al 0 ,05 %, se o b se rva b a la p ro du cc ión de 1 -p e n ta d e ce n o o 1 -n on ade cen o , resp ec tiva m en te .

EJEMPLO 26. SÍNTESIS IN V ITR O DE a-OLEFINAS QUE UTILIZAN ORF880 EXPRESADA DE MANERA HETEROLOGA EN E. C O L I Y PURIFICADAS DE DICHA BACTERIA

El A D N g e n ó m ico que c o d ifica la A T C C 8456 _ o rf880 se c lo n ó en los s it io s N d e l y X h o l de l v e c to r p E T 15 b (N o vag en ) ba jo el co n tro l de un p ro m o to r de T 7 pa ra la exp res ión y pu rifica c ión de E. coli. E ste p lá sm id o exp resó una ve rs ión de 8456_orf880 e tiq u e ta d a en el ex tre m o N con His.

U na cepa BL21 (D E 3 )de E. coli ( In v itro g e n ) se tra n s fo rm ó con pE T 15b -O R F 880 u tilizan do té cn ica s h a b itu a le s de tra n s fo rm a c ió n qu ím ica . La e xp re s ió n de la p ro te ín a se llevó a cab o in o cu la n d o p rim e ro una c o lo n ia de la cep a de E. coli en 5 m l de m e d io LB co m p le m e n ta d o con ca rb e n e c ilin a 100 m g/l y ag ita n d o du ran te la noche a 37 °C para p ro d u c ir un cu ltivo in ic iado r. E ste cu ltivo in ic ia d o r se u tilizó para in o cu la r 1 l de un m ed io LB c o m p le m e n ta d o con c a rb e n e c ilin a 100 m g/l. El cu ltivo se ag itó a 37 °C hasta que a lcanzó un v a lo r de D O ⁶⁰⁰de 0,6. El cu ltivo se co locó en h ie lo d u ra n te 10 m in u to s a n te s de a ñ a d ir IP TG a una c o n c e n tra c ió n fina l de 250 pM . D espués , el c u ltivo se ag itó a 18°C d u ra n te a p ro x im a d a m e n te 18 ho ras. El cu ltivo se ce n trifu g ó d e sp u é s a 3 700 rpm d u ra n te 20 m in u to s a 4 °C. El se d im e n to se resu spe nd ió en 30 m l de ta m p ó n que con ten ía tam pó n de fo s fa to de sod io 100 m M a pH 7,2 co m p le m e n ta d o con B ac te ria l P ro te a se A rre s t (G B io sc ie n ce s ). Las cé lu las se som e tie ro n a u traso n ido a 12 W en h ie lo du ran te 9 seg un do s con 1,5 se g un do s de u tra so n id o se g u id o de 1,5 se g u n d o s de reposo . Este p ro ced im ie n to se rep itió 5 ve ce s con in te rva los de 1 m in u to en tre cada c ic lo de u ltra son ido s . El ex trac to a c e lu la r se ce n trifu g ó a 10 000 rpm du ran te 30 m in u tos a 4 °C. S e añ ad ie ro n 5 ml de N i-N T A (Q ia g e n ) al so b re n a d a n te y la m ezc la se ag itó su a ve m e n te a 4 °C. La susp en s ión se pasó a tra vé s de una co lu m n a para e lim in a r la res ina de l lisado . La res ina se lavó de sp u é s con 30 m l de ta m p ó n que c o n te n ía ta m p ó n de fo s fa to de sod io 100 m M a pH 7,2 e im idazo l 30 mM. P o r ú ltim o, la p ro te ína se e luyó con 15 m l de ta m p ó n de fo s fa to de sod io 100 m M a pH 7 ,2 m ás im idazo l 250 m M . La so luc ió n de p ro te ína se d ia lizó con 200 vo lú m e n e s de ta m p ó n de fo s fa to de sod io 100 m M a pH 7,2. La co n ce n tra c ió n de p ro te ína se de te rm in ó u tilizan do el e n sayo de B rad fo rd (B io -R ad ). Se ob tuv ie ron 125 pg /m l de p ro te ína .

P ara e n s a y a r in vitro la e sp e c ific id a d de O R F 880 po r su s tra to s de ác ido graso , se p re pa ra ron sa les de p o tas io de los s ig u ie n te s ác ido s grasos: ác ido te tra d e ca n o ico , ác ido h e xad eca no ico , ác ido oc ta d e ca n o ico , ác ido e ico sa n o ico y ác ido be hé n ico (S igm a). Las so luc io ne s de ác idos g ra sos se p re pa ra ron con e tano l al 2 % y so luc ió n de T e rg ito l al 2 % (S igm a, St. Louis, M O ) a una c o n ce n tra c ió n fina l de 20 mM.

S e de te rm in a ro n los p a rám e tro s c in é tico s de la reacc ión y p ro du cc ión de de sca rb o x ila c ió n . S e p repa ró una m ezc la de rea cc ió n de 200 pl que c o n te n ía los s ig u ie n te s rea cc io n a n te s : 1 ,25 pM de O R F 880 , 200 pM de o c ta d e ca n o a to de po tas io , 200 pl de d itio tre ito l y ta m p ó n de fo s fa to de sod io 100 m M a pH 7,2. La m ezc la de reacc ión se in cubó a te m p e ra tu ra a m b ie n te y los pun tos de t ie m p o se to m a ro n po r d u p licad o en tre 5 m in u to s y 120 m inu tos . La reacc ión se d e sa c tivó y se ex tra jo a ñ a d ie n d o 100 pl de a ce ta to de e tilo que co n te n ía 1 -o c ta de cen o a 5 m g/l co m o re fe re n c ia in te rna . Las m ue s tra s se an a liza ro n u tilizan do G C /M S u tilizan do el m é tod o de a lcano 1 sin d iv is ión , u tilizan do los s ig u ie n te s pa rám e tro s : t ie m p o de e jecu c ión : 20 m in; co lum na : H P -5 -M S P a rt No. 19091S -433E (lo ng itud de 30 m etros; D .I.: o rific io es trech o de 0 ,25 m m ; pe lícu la : 0 ,25 pM ); m uestra : ex tracc ión e s tá n d a r con ace ta to de etilo; in yecc ión : en tra da de 1 pl de A g ile n t 6850 ; en trada : 300 °C sin d iv is ión ; gas po rtado r: he lio ; flu jo : 1,3 m l/m in ; tem p.

de la estufa: 100 °C durante 5 min, de 320 a 20 °C/min, 320 durante 5 min; det: Agilent 5975B VL MSD; temperatura del det.: 300 °C; barrido: 50-500 M/Z. Las curvas de calibración se generaron utilizando 1-heptadeceno disuelto en acetato de etilo. Basándose en este análisis, se determinó que la producción del producto era lineal de 5 minutos a 60 minutos.

Para ensayar las velocidades de reacción de diferentes sustratos de ácidos grasos, se prepararon las siguientes mezclas de reacción de 200 pl: 1,0 pM de enzima ORF 880, 200 pM de una sal de ácido graso de prueba, 200 pl de ditiotreitol y tampón de fosfato de sodio 100 mM a pH 7,2. Las reacciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente y los puntos de tiempo se tomaron por triplicado a los 20 minutos y a los 47 minutos utilizando los procedimientos de extracción y análisis descritos anteriormente. Las curvas de referencia se generaron utilizando patrones químicos disponibles. En algunos casos, los patrones químicos no estaban disponibles. En esas circunstancias, por ejemplo, se utilizó cis-9-heneicoseno como referencia para 1-heneicoseno y 9-tricoseno como referencia para 1-tricoseno. Las actividades se calcularon tomando la diferencia entre las concentraciones promedio de a-olefina para cada sustrato a los 47 minutos y 20 minutos y después dividiendo la diferencia entre 27 minutos. Los resultados se resumen en la Tabla 20.

Tabla 20: Actividad de ORF880 con diferentes sustratos de ácidos rasos

Estos resultados demuestran que la ORF880 expresada de manera heteróloga fue capaz de transformar in vitrosustratos de ácidos grasos en olefinas. Estos datos también muestran que la ORF880 tenía una mayor actividad cuando el ácido hexadecanoico era el sustrato de ácido graso.

EJEMPLO 27. PRODUCCIÓN DE a-OLEFINAS A PARTIR DE GLUCOSA POR EXPRESIÓN HETEROLÓGICA DE O R F 880 DE ATCC 8456 DE JEOTGALICOCCUS EN LA CEPA MG1655 A F a d D DE E. C O L I

1. Construcción de la cepa de deleción fadD

El gen fadD de la cepa MG1655 de E. coli, se delecionó utilizando el sistema de rojo lambda (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 97: 6640-6645, 2000) como se indica a continuación:

El gen de cloranfenicol acetiltransferasa de pKD3 se amplificó utilizando los cebadores fad1:5'-TAACCGGCGTCTGACGACTGACTTAACGCTCAGGCTTTATTGTCCACTTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3' (SEQ ID NO: 43); y fad2: 5'-CATTTGGGGTTGCGATGACGACGAACACGCATTTTAGAGGTGAAGAATTGCATAT-GAATATCCTCc Tt Ta GTTCC-3 '(SEQ ID NO: 44). Este producto de PCR se sometió a electroporación en MG1655 de E. coli (pKD46). Las células se sembraron en placas con L-cloranfenicol (30 pg/ml) (L-Cm) y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Se seleccionaron colonias individuales y se sembraron en otra placa con L-Cm y se cultivaron a 42 °C. Después, estas colonias se parchearon en placas de L-Cm y L-carbenicilina (100mg/ml) (L-Cb) y se cultivaron a 37 °C durante la noche. Las colonias que fueron CmR y CbS se evaluaron adicionalmente mediante PCR para garantizar que el producto de la PCR estaba insertado en el sitio correcto. La verificación por PCR se realizó en lisados de colonias de estas bacterias utilizando los cebadores fadF: 5'-CGTCCGTGGTAATCATTTGG-3'(SEQ ID NO:45); y fadR: 5'-TCGCAACCTTTTCGTTGG-3'(SEQ ID NO:46). El tamaño esperado de la deleción AfadD::Cm fue de aproximadamente 1200 pb (FIG. 10). El gen de resistencia a cloranfenicol se eliminó utilizando un plásmido auxiliar FLP como se describe en Datsenko et al. Proc. Natl Acad Sci. USA. 97: 6640-6645, 2000. La verificación por PCR de la deleción se realizó con cebadores los cebadores fadF y fadR. La cepa MG1655 AfadD no pudo crecer en placas de agar oleato M9 (oleato como fuente de carbono). Tampoco pudo crecer en medio líquido M9 oleato.

2. Expresión de ATCC 8456 orf880 de Jeotgalicoccus en la cepa MG1655 AfadD de E. coli

El ADN genómico que codifica la ATCC 8456_orf880, que se optimizó con codones para la expresión en E. coli, se clonó en el vector OP80 (derivado de pCL1920) bajo el control de un promotor Ptrc y la cepa MG1655 AfadD de E. coli se transformó con el vector resultante. Las células de E. coli se cultivaron a 37 °C en un medio mineral M9 complementado con uracilo 20 pg/ml y espectinomicina 100 pg/ml. La glucosa (1 %, p/v) fue la única fuente de carbono y energía. Cuando el cultivo alcanzó una DO600 de 0,8 a 1,0, se añadió IPTG (1 mM) y se cambió a una temperatura de 25 °C. Después de crecer durante 18 a 24 horas más a 25 °C, se sedimentaron células de 10 ml de cultivo, se resuspendieron en metanol 1 ml, se sometieron a utrasonido durante 30 minutos y se extrajeron con 4 ml de hexano. T ras eva p o ra rse el d iso lve n te , las m ue s tra s se re su sp e n d ie ro n en he xano 0,1 m l y se a n a liza ro n po r G C -M S. A d ife ren c ia del con tro l so lo con vec to r, las cé lu la s de E. coli tra n s fo rm a d a s con el v e c to r que lle vab a la o rf880 p ro du je ro n las a -o le fin a s 1 -p en ta de ceno y h e p tad eca d ie no . E s te resu ltad o ind ica que la exp res ión de O R F 880 co n fie re a E. coli la ca p a c id a d de b io s in te tiz a r a -o le fin a s cua nd o se cu ltiva en g lucosa , y que los p re cu rso re s d irec tos son los ác ido s g ra sos m ás a b u n d a n te s en E. coli, co n c re ta m e n te , ác ido h e xa d e ca n o ico y á c id o v a c c é n ic o (á c id o 11-c is -o c ta d e ce n o ico ).

EJEMPLO 28. Identificación de homólogos de ácido carboxílico reductasa (CAR, C a rb o x y lic A c id R e d u c ta s e ) La ác ido ca rb o x ílico red u c ta sa (C A R ) de la cepa N R R L 5646 de Nocardia sp. puede re d u c ir ác ido s ca rb o x ílico s en co rre sp o n d ie n te s a ld e h id o s sin en z im a s ac tiva d o ra s d is tin tas , ta le s com o a c il-C o A s in ta sas (Li e t al., J. B acte rio l.

179 :3482 -3487 , 1997; H e e t al., A pp l. E nv iron . M ic rob io l. 70 :1874 -1881 ,2004 )). U na bú squ ed a con B LA S T u tilizan do la secu en c ia de a m in o á c id o s de N R R L 5646 C A R (n.° de reg is tro A A R 91681 de G e n p e p t) com o secu en c ia de con su lta , id e n tificó a p ro x im a d a m e n te 20 s e cu e n c ia s ho m ó loga s . S e e va lu a ro n tre s ho m ó logo s , com o se in d ica en la Tabla 21, con resp ec to a su cap ac idad para tra n s fo rm a r in vivo ác ido s g ra sos en a ld e h id o s g ra sos cua nd o se exp re sa b a n en E. coli. A n ive l de secu en c ia de nuc leó tidos , carA, carB y fadD9, d e m os tra ro n una hom o log ía de 62 ,6 %, 49 ,4 % y 60 ,5 %, re sp ec tiva m en te , con el gen car (A Y 495697 ) de la cepa N R R L 5646 de Nocardia sp.. A n ive l de am ino ác id os , C A R A , C A R B y FadD 9, d e m os tra ro n una id en tidad de 62 ,4 % , 59 ,1 % y 60 ,7 % , re sp ec tiva m en te , con C A R de la cepa N R R L 5646 de Nocardia sp..

Tabla 21: Proteínas similares a CAR secuencias codificantes corres ondientes.

EJEMPLO 29. EXPRESION DE HOMOLOGOS DE CAR EN E. C O L I

1. Construcción de plásmidos

P ara e xp re sa r los genes que co d ifica n los h o m ó logo s de C A R e n u m e ra d o s en la s ig u ie n te Tabla 22, se co n s tru ye ro n tres p lásm id os de exp res ión de E. coli. En p rim e r lugar, a p a rtir de A D N ge nó m ico de la espec ie Mycobacterium tuberculosis H 37 R v (o b te n id a en la U n ive rs ida d de B ritish C o lu m b ia y V a n co u ve r, BC C a n a d á ) se a m p lificó fadD9 u tilizan do los ce b a d o re s fad D 9F y F adD R (véa se la Tabla 22). El p ro du c to de la P C R se clonó p rim e ro en P C R -b lu n t (In v itro g e n ) y de spu és se libe ró com o un fra g m e n to N de I-A vrII. El fra g m e n to N d e I-A vrII se c lo nó de sp u é s e n tre los s itio s N del y A v rlI de pA C Y C D u et-1 (N o vo g e n ) para g e n e ra r pA C Y C D u et-1 -fadD9. Los ge ne s carA y carb se a m p lif ica ro n a p a rtir de l A D N g e n ó m ico de la e sp e c ie Mycobacterium smegmatis M C 2 155 (o b te n id a en la A T C C (At Cc 23037 D -5 )) u tilizan do los ce b a d o re s C A R M C a F y C A R M C a R o C A R M C b F y C A R M C b R , re sp e c tiva m e n te (vé a se la Tabla 22). C a da p ro d u c to de P C R se c lo nó p rim e ro en P C R -b lu n t y d e sp u é s se libe ró co m o un fra g m e n to N d e I-A v rII. D espués , ca d a uno de los do s fra g m e n to s se s u b c lo n ó e n tre los s itio s N del y A vrII de pA C Y C D uet-1 (N o vo g e n ) pa ra g e n e ra r p A C Y C D U E T -c a rA y pA C Y C D U E T -ca rB .

2. E va lua c ión de la p ro du cc ión de a ld e h id o s g ra sos

Los p lá sm id o s que co d ifica n los ho m ó lo g o s de C A R (p A C Y C D U E T -fa d D 9 , p A C Y C D U E T -c a rA y pA C Y C D U E T -ca rB ), se co tra n s fo rm a ro n po r sep a ra do en la cepa C41 (D E 3, AfadE) de E. coli (d e sc rita en el d o cum e n to P C T /U S 08 /058788 ) ju n to con p E T D u e t-1 - 'T e s A (descrita en el d o cu m e n to P C T /U S 08 /058788 ).

Los tra n s fo rm a n te s de E. coli se cu ltiva ro n en 3 m l de un m ed io LB c o m p le m e n ta d o con ca rb e n ic ilin a (100 m g /l) y c lo ra n fe n ico l (34 m g /l) a 37 °C. D e sp u é s de c u ltiv a r d u ra n te una noche , l 5 j l de c u ltivo se tra n s fir ie ro n a 2 m l de un m ed io LB rec ien te c o m p le m e n ta d o con ca rb e n ic ilin a y c lo ran fe n ico l. D e sp u é s de 3 ,5 ho ras de cu ltivo , se tra n s fir ie ro n 2 m l de cu ltivo a un m a traz de 125 m l que c o n te n ía 20 m l de un m e d io M 9 con g lucosa al 2 % y con ca rb e n ic ilin a y c lo ran fe n ico l. C u an do la D O ⁶⁰⁰de l cu ltivo a lcan zó un v a lo r de 0,9, a cada m a traz se le añ ad ió 1 m M de IPTG . D e spu és de 20 ho ras de cu ltivo a 37 °C, a cada m a traz se a ñ ad ie ro n 20 m l de ace ta to de e tilo (con ác ido acé tico al 1 % v /v ) pa ra e x tra e r los co m p u e s to s o rg á n ico s p ro d u c id o s d u ra n te la fe rm e n ta c ió n . El e x tra c to c ru d o de ace ta to de e tilo se a n a lizó d ire c ta m e n te con G C / M S co m o se d e sc rib e a co n tin u a c ió n . La c o e x p re s ió n de las 'T e s A sin líd e r y de c u a lq u ie ra de los tre s genes car en E. coli d io lu g a r a la p ro du cc ión de a ld e h id o g ra so de tec tab le . En una fe rm e n ta c ió n , L S 9001 /p A C Y C D U E T ca rB p E T D u e t-1 - 'T e s A p ro du jo un p ro m e d io de 120 m g/l de a ld e h id o s g rasos. Los tie m p o s de re ten c ió n fue ro n : 6 959 m in u tos para d o de can a l, 8 247 m in u tos para 7 -te tra d e ce n a l, 8 37 m inu tos pa ra te tra d e ca n a l, 9 433 m in u tos para 9 -h exa dece na l, 9 545 m in u to s para h e xad eca na l y 10 945 m in u tos para 11 oc ta dece na l. La p re sen c ia de g randes ca n tid a d e s de a ld e h id o s g rasos es co h e re n te con que C A R es una ác ido g ra so red u c ta sa g e n e ra d o ra de a ld e h id o (A F A R , aldehyde-generating fatty acid reductase). Este m e ca n ism o es d ife re n te al de las a c il-C o A red uc tasa s g ra sas (FA R , fatty acyl-CoA reductases) g e ne rado ras de a lcoho l, por e jem p lo , J jF A R , y a c il-C o A re d u c ta sa s g rasas, ta l com o A cr1.

3. P re fe re nc ias de sus tra to de los ho m ó lo g o s de C A R

S e o b se rva ro n d is tin tas p re fe re n c ia s de sus tra to s en tre los tre s ho m ó lo g o s de C A R eva lu ado s . FadD 9 exh ib ió gran p re fe re n c ia po r ác idos g ra sos C ¹²en re lac ión con o tros ác ido s g ra sos con lo ng itude s de cad en a de carbono su p e rio re s a 12. T a n to C a rA com o C a rB d e m o s tra ro n una ga m a de sus tra to s m ás am p lia que FadD 9.

4. C u a n tifica c ió n e id en tificac ió n de a ld e h id o s g ra sos

S e rea lizó un e x p e rim e n to G C -M S u tilizan do un s is tem a A g ile n t 5975 B M S D eq u ip a d o con una co lu m n a D B -5 de 30 m x 0 ,25 m m (p e lic u la de 0 ,10 jm ) . La te m p e ra tu ra de la co lu m n a fue iso té rm ica de 3 m in u tos a 100 °C. La co lu m n a se p rog ram ó para a u m e n ta r de 100 °C a 320 °C a una ve lo c id a d de 20 °C /m in . C u an do se a lcan zó la te m p e ra tu ra fina l, la co lu m n a pe rm a n e c ió iso té rm ica du ran te 5 m in u to s a 320 °C . El v o lu m e n de in yecc ió n fue de 1 j l . El gas po rtado r, he lio , se libe ró a 1,3 m l/m in . El e sp e c tró m e tro de m asa s es ta ba eq u ip a d o con una fue n te de io n iza c ió n po r im p ac to de e lec tron es . La te m p e ra tu ra de la fue n te de io n iza c ió n se fijó a 300 °C.

A n te s de la cua n tifica c ión , se id en tifica ron d ive rso s a ld e h id o s u tilizan do dos m é todos . En p rim e r lugar, el t ie m p o de re tenc ión de G C de cada com p ue s to se com p aró con el t ie m p o de re tenc ión de un pa trón conoc ido , ta l com o lauril a ld e h id o (do de cana l). En se g u n d o lugar, la id en tificac ió n de cada co m p u e s to se con firm ó e m p a re ja n d o el esp ec tro de m asa s de l co m p u e s to con un esp e c tro de m asa s pa trón en la b ib lio te ca de esp e c tro s de m asas.

EJEMPLO 30. PRODUCCIÓN DE ALCOHOL GRASO POR EXPRESIÓN HETEROLÓGA DE HOMÓLOGOS DE CAR EN LA CEPA MG1655 (DE3, A F A D D ) D E E . C O L I

1. C o n s tru cc ió n de la cepa de de le c ión fadD

El gen fadD de la cep a M G 1655 de E. coli, se d e le c io n ó u tiliza n d o el s is tem a de ro jo la m bd a (D a tse n ko e t al., P N A S (EE . U U .) 97: 6640 -6645 , 2000 ) co m o se in d ica a co n tin u a c ió n : El gen de c lo ra n fe n ico l a c e tiltra n s fe ra s a de pK D 3 se a m p lif icó con los ce b a d o re s fad1: 5 '-T A A C C G G C G T C T G A C G A C T G A C T T A A C G C T C A G G C T T T A T T G T C C A C T T T G T G T A G G C T G G A G C T G C T T C G -3 ' (S E Q ID N O :43); y fad2: 5 '-C A T T T G G G G T T G C G A T G A C G A C G A A C A C G C A T T T T A G A G G T G A A G A A T T G C A T A T G A A T A T C C T C C T T T A G T T C C -3 ' (S E Q ID N O :44). E ste p ro du c to de P C R se so m e tió a e le c tro p o ra c ió n en M G 1655 de E. coli (pK D 46 ). Las cé lu la s se sem b ra ro n en p lacas con L -c lo ra n fe n ico l (30 jg /m l) (L -C m ) y se cu ltiva ro n du ran te la noche a 37 °C. S e se lecc io na ron co lon ias in d iv id u a le s y se sem b ra ro n en otra p laca con L -C m y se cu ltiva ron a 42 °C. D espués, es tas co lon ias se pa rche a ron en p lacas de L -C m y L -ca rb e n ic ilin a (100 m g /m l) (L -C b ) y se cu ltiva ro n a 37 °C d u ran te la noche. Las co lo n ia s que fue ro n C m R y C b S se eva lu a ro n a d ic io n a lm e n te m ed ia n te P C R para g a ra n tiz a r que el p ro du c to de la P C R e s ta ba in se rtad o en el s itio co rrec to . La v e r ifica c ió n po r P C R se rea lizó en lisado s de co lo n ia s de estas ba c te ria s u tilizan do los ce b a d o re s fadF : 5 '-C G T C C G T G G T A A T C A T T T G G -3 '(S E Q ID N O :45); y fadR : 5 '-T C G C A A C C T T T T C G T T G G -3 '(S E Q ID N O :46). El ta m a ñ o esp e ra d o de la de le c ión AAadD::Cm fue de a p ro x im a d a m e n te 1 200 pb. El gen de re s is te n c ia a c lo ra n fe n ico l se e lim in ó u tiliza n d o un p lásm id o a u x ilia r FLP com o se de sc rib e en D a tse nko e t al., Proc. Natl. A cad . Sci. USA, 97 :6640 -6645 , 2000. La v e rifica c ió n po r PCR de la de le c ión se rea lizó u tiliza n d o los ce b a d o re s fad F and fadR . La cepa M G 1655 AfadD no pudo c re c e r en p lacas de a g a r o lea to M 9 (o lea to com o fue n te de ca rbono). T a m p o co pudo c re c e r en m ed io liq u id o M 9 o lea to . El d e fec to de l c re c im ie n to se c o m p le m e n tó con un gen fad D de E. coli fadD sum in is tra d o en trans (en pC L1920 -P trc ).

2. C o n s tru cc ió n de la cep a M G 1655 (D E 3 , A fa d D )

P ara g e n e ra r una cepa sen s ib le a T7, se u tilizó el k it de liso g e n iza c ió n ADE3 (N o vag en ), que está d ise ñ a d o pa ra la in te g ra c ión e sp e c ifica de s itio de l p ro fa go ADE3 en un c ro m o so m a h o s p e d a d o r de E. coli, de ta l m an e ra que el hospedador lisogenizado puede utilizarse para expresar genes diana clonados en vectores de expresión T7. ADE3 es un fago recombinante que lleva el gen clonado para la ARN polimerasa de T7 bajo el control de lacUV5. En resumen, la cepa hospedadora se cultivó en un medio LB complementado con maltosa al 0,2 %, MgSO410 mM y antibióticos, a una temperatura de 37 °C, hasta alcanzar una DOaoo de 0,5. A continuación, los fagos ADE3 108 ufp, un fago auxiliar 108 ufp y un fago de selección 108 ufp, se incubaron con 10 pl de células hospedadoras. La mezcla de hospedador/fago se incubó a 37 °C durante 20 minutos para permitir que el fago se adsorbiera en el hospedador. Por último, la mezcla se transfirió con una pipeta a una placa con LB complementado con antibióticos. La mezcla se extendió uniformemente utilizando perlas de revestimiento, y las placas se invirtieron en las placas y se incubaron a 37 °C durante la noche.

Los candidatos lisógenos de ADE3 se evaluaron con respecto a su capacidad para soportar el crecimiento del fago examinador T7. El fago examinador T7 es un mutante por deleción del fago T7 que es completamente defectuoso a menos que la célula hospedadora proporcione la ARN polimerasa de T7 activa. El fago examinador T7 fabrica placas muy grandes en auténticos lisógenos de ADE3 en presencia de IPTG, mientras que en ausencia de inductor se observan placas mucho más pequeñas. El tamaño relativo de las placas en ausencia de IPTG es una indicación de la expresión a nivel basal de la ARN polimerasa de T7 en el lisógeno, y puede variar ampliamente entre diferentes acervos de células hospedadoras.

Para determinar la presencia de DE3 lisogénica, se utilizó el siguiente procedimiento. En primer lugar, cultivaron colonias candidatas en medios LB complementados con maltosa al 0,2%, MgSO4 10 mM y antibióticos, a una temperatura de 37 °C, hasta alcanzar una DO600 de 0,5. Después, una alícuota de fago examinador T7 se diluyó en tampón de dilución de fagos 1X hasta un título de 2 x 103 ufp/ml. En tubos duplicados, se mezclaron 100 pl de células hospedadoras con 100 pl de fago diluido. La mezcla de hospedador/fago se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir que el fago se adsorbiera en el hospedador. A continuación, a cada tubo que contenía el hospedador y el fago se añadieron 3 ml de agarosa superior fundida. Para evaluar la inducción de la ARN polimerasa de T7, el contenido de un duplicado se colocó en una placa con LB y el otro duplicado en una placa con Lb complementado con IPTG (isopropil-b-tiogalactopiranósido) 0,4 mM. Las placas se dejaron reposar sin cambios durante 5 minutos hasta que la agarosa superior se endureció. A continuación, las placas se invirtieron a 30 °C durante una noche.

3. Construcción de la cepa MG1655 (DE3, AfadD. v¡gB::kan)

La cepa yjgB inactivada, MG1655(DE3, AfadD. yjgB::kan), se construyó utilizando el siguiente protocolo del sistema de rojo lambda (Datsenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU 97:6640-6645, 2000):

El gen resistente a kanamicina de pKD13 se amplificó con los cebadores yjgBRn: 5'-GCGCCTCAGATCAGCGCTGCGAATGATTTTCAAAAATCGGCTTTCAACACTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3'SEQ ID NO:53); e yjgBFn: 5'-CTGCCATGCTCTACACTTCCCAAACAACACCAGAGAAGGACCAAAAAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3'(SEQ ID NO:54). Después, el producto de la PCR se sometió a electroporación en MG1655 (DE3, AfadD)/pKD46 de E. coli. Las células se sembraron en placas con kanamicina (50 pg/ml) (L-Kan) y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Se seleccionaron colonias individuales y se sembraron en otra placa con L-Kan y se cultivaron a 42 °C. Después, estas colonias se parchearon en placas de L-Kan y carbenicilina (100mg/ml) (L-Cb) y se cultivaron a 37 °C durante la noche. Las colonias que fueron kanR y CbS se evaluaron adicionalmente mediante PCR para garantizar que el producto de la PCR estaba insertado en el sitio correcto. La verificación por PCR se realizó en lisados de colonias de estas bacterias utilizando los cebadores BF: 5'-GTGCTGGCGATACGACAAAACA-3'(SEQ ID NO:55); y BR: 5'-CCCCGCCCTGCCATGCTCTACAC-3'(SEQ ID NO:56). El tamaño esperado de la cepa yjgB::kan inactivada era de aproximadamente 1450 pb.

4. Evaluación de FadD en la producción de alcohol graso utilizando MG1655 (DE3, AfadD) tensión

En el Ejemplo 2, se utilizó una cepa de deleción, para la producción de aldehido graso y alcohol graso a partir de 'TesA, homólogos de CAR y alcohol deshidrogenasa(s) endógena(s) en E. coli. Para demostrar que los homólogos de CAR utilizaron ácidos grasos en lugar de acil-CoA como sustrato, el gen que codifica la acil-CoA sintasa en E. coli (fadD) se delecionó para que los ácidos grasos producidos no se activaran con CoA. La cepa MG1655 (DE3, AfadD) E. coli, se transformó con pETDuet-1-'TesA y pACYCDuet-1-carB. Los transformantes se evaluaron para determinar la producción de alcohol graso utilizando los métodos descritos en este documento. Estos transformantes produjeron aproximadamente 360 mg/l de alcoholes grasos (dodecanol, dodecenol, tetradecanol, tetradecenol, cetilo, hexadecenol y octadecenol).

YjgB es una alcohol deshidrogenasa. Para confirmar que YjgB era una alcohol deshidrogenasa responsable de transformar aldehidos grasos en sus alcoholes grasos correspondientes, pETDuet-1-'TesA y pACYCDuet-1-fadD9 se transformaron conjuntamente en MG1655 (DE3, AfadD) o MG1655 (De 3, AfadD. yjgB::kan). Al mismo tiempo, MG1655(DE3, AfadD. yjgB::kan) se transformó con pETDuet-1-’tesA-yjgB y pACYCDuet-1 -fadD9.

Los transformantes de E. coli se cultivaron en 3 ml de un medio LB complementado con carbenicilina (100 mg/l) y c lo ra n fe n ico l (34 m g /l) a 37 °C. D espués de cu ltivo du ran te la noche, 15 |jl de cu ltivo se tra n s fir ie ro n a 2 m l de un m ed io LB rec ien te c o m p le m e n ta d o con c a rb e n ic ilin a y c lo ra n fe n ico l. D e spu és de 3 ,5 ho ras de cu ltivo , 2 m l de cu ltivo se tra n s fir ie ro n a un m a traz de 125 m l que co n te n ía 20 m l de un m ed io M 9 que con ten ía g luco sa al 2 % , c a rb e n ic ilin a y c lo ran fe n ico l. C u a n d o la D O ⁶⁰⁰de l cu ltivo a lcanzó un v a lo r de 0,9, a cad a m a traz se le añ ad ió 1 mM de IPTG . D e sp u é s de 20 ho ras de cu ltivo a 37 °C, a cada m a traz se le a ñ a d ie ro n 20 ml de a ce ta to de e tilo (con ác ido acé tico al 1 %, v /v ) para e x tra e r los a lcoh o le s g ra sos p ro du c ido s du ran te la fe rm e n ta c ió n . El e x tra c to c rud o de a ce ta to de e tilo se a n a lizó d ire c ta m e n te u tilizan do G C /M S com o se de sc rib e en el p re sen te docum e n to .

La cep a yjgB in ac tiva da p ro du jo una acu m u la c ió n s ig n ifica tiva de d o d e ca n a l y un títu lo de a lcoh o l g ra so m ás bajo. La e xp res ion de yjgB de l p lásm ido pE T D u e t-1 -'te sA -y jg B en la cepa yjgB in ac tiva da e lim in ó de m an e ra e ficaz la a cu m u la c ió n de do d e ca n a l. Los da tos in d ica ro n que Y jg B pa rtic ip ó en la tra n s fo rm a c ió n de d o d e c a n a l en d o d e ca n o l y que pod ía ha be r o tra (s ) a lcoh o l d e sh id ro g e n a sa (s ) en E. coli pa ra tra n s fo rm a r o tros a ld e h id o s en a lcoh o le s . En la cepa yjgB in ac tiva da se acu m u ló d o de can a l, pero con el p lá sm id o de exp re s ió n yjgB, no se o b se rvó ni en la cep a de t ip o s ilves tre (M G 1655 (D E 3 , AfadD)) ni en la cep a yjgB inactivada .

EJEMPLO 31. GENERACIÓN DE UNA BIBLIOTECA DE ’TesA

En este e jem p lo , se de sc rib e n m é to d o s para p re p a ra r una b ib lio te ca m u tan te de 'TesA . Un v e c to r de exp res ión ad e cu a d o , ta l com o p A C Y C -'T e sA que co d ifica 'TesA , la T e sA tru n c a d a que ca re ce de un pé p tid o seña l, p e rm ite la p ro du cc ión de la p ro te ína 'T e sA en la cepa ho spe da do ra . El p lásm id o p A C Y C -'T e sA in c luye la secu en c ia de 'tesA ba jo la reg u lac ió n de un p ro m o to r trc, un te rm in a d o r de tra n sc rip c ió n , un origen de rep lica c ió n p15a, un m arco a b ie rto de le c tu ra que cod ifica lacIq, y el gen de la b e ta la c ta m a sa de res is te nc ia a an tib ió ticos .

En la FIG. 58 se p ro p o rc io n a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la p ro te ína 'T e sA (S E Q ID NO: 31).

El k it de M u ta g é n e s is Q u ikC h a n g e (S tra ta g e n e ) pe rm ite c o n s tru ir fá c ilm e n te una gran can tidad de m u tan tes . El uso de este k it para c o n s tru ir cad a m u ta n te de 'T e sA co m ie n za con dos ce b a d o re s co m p le m e n ta rio s que con tie n e n una o m ás bases no e m p a re ja d a s n e cesa rias para c a m b ia r el am in o á c id o co d ifica d o a la pos ic ión deseada . Los ce b a d o re s tien en una long itud de 25 -45 nuc leó tidos , y una te m p e ra tu ra de fus ió n >78 °C ca lcu la d a u tilizan do la fó rm u la :

Tm = 81 ,5 0,41 (% de G C ) 675 /N

do nde Tm es la te m p e ra tu ra de fus ió n (melting), el % de G C es el po rcen ta je de res tos que hay en el c e b a d o r que son g u a n o s in a o c itid ina y N es el nú m ero de nu c le ó tido s que hay en el cebador. P o r e jem p lo , para m u ta r el ác ido asp á rtico en el resto 9 a a sp a ra g in a , se u tiliza ron los ceb ad o res C A C G T T A T T G A T T C T G G G T A A T A G C C T G A G C G C C G G G T A T C G (S E Q ID N O :57 ) y C G A T A C C C G G C G C T C A G G C T A T T A C C C A G A A T C A A T A A C G T G (S E Q ID N O :58), ind ica nd o las bases sub raya das el cod ón que se cam b ió .

Los c e b a d o re s se u tiliza ro n en una rea cc ió n en ca d e n a de la p o lim e rasa u tilizando , co m o m o lde , pA C Y C -'T e sA , con el s ig u ie n te p ro g ra m a de c ic los de tem p e ra tu ra : 1 m inu to a 95 °C; se g u id o de 18 c ic los de 50 se g un do s a 95 °C, 50 se g u n d o s a 60 °C y 5 se g un do s a 68 °C; y 7 m in u tos a 68 °C. Los p ro du c to s de reacc ión se d ig irie ron de spués u tiliza n d o la e n z im a de res tricc ión Dpnl, para d e g ra d a r se le c tiva m e n te el A D N m o lde m e tilado . D espués , el A D N re s ta n te se tra n s fo rm ó en E. coli pa ra el a is lam ien to de c lones de p lásm idos, que de spu és se secu en c ia ro n para v e r if ic a r que se hab ían ob te n id o las su s titu c io n e s deseadas.

EJEMPLO 32. ENSAYOS

En los s ig u ie n tes E jem plos, se describen en sayo s para d e te rm in a r el co n ten ido de p ro te ínas, los n ive les de ác idos g ra sos lib res y la h id ró lis is de los sus tra to s de ac il-P N P y ac il-C oA . A con tinu ac ió n ta m b ié n se exponen en sayo s e sp e c ífico s u tilizad os en este docum e n to .

1. E nsa yo para d e te rm in a r el co n te n id o de p ro te ína en lisados ce lu la res

P ara la ca ra c te riza c ión , se p re pa ra ron lisado s ce lu la re s de cu ltivos de exp res ión E. coli que p ro du cen v a ria n te s de 'TesA . P a ra g e n e ra r los cu ltivo s de e xp re s ió n , los cu ltivos de s ie m b ra se cu ltiva ro n d u ran te la noche a 37 °C en un m ed io LB que co n te n ía g lu co sa al 1 % (p /v ) y c a rb e n ic ilin a 100 jg /m l. Los cu ltivo s de s ie m bra se d ilu ye ro n 1: 100 en el m ism o m ed io y se cu ltiva ro n du ran te 3 ho ras a 37 °C con ag itac ión (200 rpm ). D espués, una parte a lícu o ta de 40 j l de cad a cu ltivo se a ñ a d ió a 360 j l de m e d io LS9-1 (d e sc rito a c o n tin u a c ió n ) c o m p le m e n ta d o con ca rb e n ic ilin a 100 jg /m l y se cu ltivó en una p laca de cu ltivo de 96 poc illos . D e spu és de 3 ho ras m ás de cu ltivo , se añ ad ió p -D -1 -t io g a la c to p ira n ó s id o (IP TG , a una co n ce n tra c ió n fina l de 1 m M ) y B is -T ris p ro p a n o (pH 7,0, a una co n ce n tra c ió n fina l de 0,1 M), y se de jó que los cu ltivos c rec ie ran du ran te la noche.

Los se d im e n to s ce lu la re s se reco g ie ron m ed ia n te ce n trifu g a c ió n de los cu ltivos de e xp res ión (10 m in u tos a 3 500 rpm ). El m ed io de c re c im ie n to se de sech ó y los se d im e n to s ce lu la res se con se rva ro n a -80 °C. P ara p re pa ra r ex tra c to s so lub les , los se d im e n to s ce lu la res c o n g e la d o s se lisa ron en el reac tivo B u g B u s te r al 50 % (E M D B io sc ie nces , Cat. 70584 -4 ) en fo s fa to de sod io 25 m M , pH 7,0. D e spu és de 40 m in u tos de ag itac ión , los lisados ce lu la re s se ac la ran m ed ia n te ce n trifu g a c ió n (10 m inu tos a 3 500 rpm ). La co n ce n tra c ió n de p ro te ína en el s o b re n a d a n te de l lisado c e lu la r se m ide de sp u é s u tilizan do un e n sayo ba sado en ác ido b ic in co n ín ico (B C A , bicinchoninic acid), según el p ro toco lo p ro p o rc io n a d o po r el fa b rica n te (T he rm o S c ien tific , Cat. n.° 23225). D espués, el s o b re n a d a n te se u tiliza en los e n sa yo s d e sc rito s a con tinu ac ió n .

M edio :

S o lu c ió n S a lin a 5x C o n ce n tra c ió n fina l 1X

Na2HPO4 30 g ⁶g/l

K H 2 P O 4 15 g 3 g/l

NaCI 2 ,5 g 0 ,5 g/l

NH4Cl 5 g ₁g/l

dH2O hasta 1l

T ia m in a (V ita m in a B 1) 10 m g /m l 1 m g/l

M gSO 4 1 M 1 m M

C a C l21 M 0,1 m M

g lu co sa al 20 % 2 ,00 %

ag ua esté ril

ura c ilo 20 m g/m l < 20 pg /m l pH a lto

o lig o e le m e n to s 1000x 1x

P ara m ed io s de 1 l de LS9-1 con g lu co sa al 1,0 %:

200 ml de so luc ió n sa lina 5x

T ia m in a (B 1 ) 100 pl

M g S O ⁴1 ml

C a C l2100 pl

50 ml de g lu co sa al 20 %

o lig o e le m e n to s 1 ml

U ra c ilo 1 ml

A g u a hasta 1 l (p re v ia m e n te he cha en 750 m l)

S o luc ión de TM (e s te riliza d a con filtro):

FeC la-⁶H ²O 27 g/l

ZnC l2-4H 2O 2 g/l

C a C l²- ⁶H ²O 2 g/l

N a ²M o O ⁴- ²H ²O 2 g/l

CuSO 4-5H 2O 9 g/l

H ³B O ³0 ,5 g/l

H C l co n ce n tra d o 100 m l/l

c .s de agua M illi-Q

2. A n á lis is de ác ido s g ra sos libres

S e p ro d u je ro n v a ria n te s de 'T e s A en c u ltivo s de exp res ión de E. coli y se a n a liza ro n los ác ido s g ra sos lib res p ro du c ido s po r los cu ltivos. P ara g e n e ra r los cu ltivos de exp res ión , los cu ltivos de s ie m bra se cu ltiva ro n p rim ero d u ra n te la no che a 37 °C en un m ed io con LB que c o n te n ía g lu co sa al 1 % (p /v ) y c a rb e n ic ilin a 100 pg /m l, y de spu és se d ilu ye ro n 1: 100 en el m ism o m ed io y se cu ltiva ro n d u ra n te 3 ho ras a 37 °C con ag ita c ió n (200 rpm ). D espués , se a ñ a d ie ro n 40 pl de cad a cu ltivo a 360 pl de m e d io LS9-1 c o m p le m e n ta d o con ca rb e n ic ilin a 100 pg /m l, y se cu ltivó en una p laca de cu ltivo de 96 poc illos . D e sp u é s de 3 ho ras m ás de cu ltivo , se a ñ a d ió p -D -1 -tio g a la c to p ira n ó s id o (IP TG , a una c o n ce n tra c ió n fina l de 1 m M ) y B is -T ris p ro pa no (pH 7,0, a una c o n ce n tra c ió n fina l de 0,1 M), y se de jó que los cu ltivos c re c ie ra n d u ra n te la noche.

D espués , los cu ltivos se a c id ifica ro n con HC l 1 N a un pH fina l de a p ro x im a d a m e n te 2 ,5 y de sp u é s se e x tra je ro n con a ce ta to de e tilo 600 pl. Los ác ido s g ra sos lib res en la fase o rg á n ica se de riva tiza ro n con h id ró x ido de te tra m e tila m o n io (T M A H ) para g e n e ra r los re sp e c tivo s és te res m e tílicos , que de spu és se a n a liza ro n en un c ro m a tó g ra fo de ga ses e q u ip a d o con un d e te c to r de io n iza c ió n de llam a.

3. Ensayo de hidrólisis de acil-PNP graso

En este sistema de ensayo, las soluciones reactivas utilizadas fueron:

Tritón X-100 al 1,2 % en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0

2. Acil-para-nitrofenol (acil-PNP) 10 mM en acetona

Para preparar una solución de trabajo de acil-PNP, se añadieron 600 pl de solución de reserva de acil-PNP a 9,4 ml de tampón fosfato y se mezclaron bien.

El ensayo se realizó añadiendo 40 pl de la solución de trabajo de acil-PNP a cada pocillo de una placa de 96 pocillos, seguido de la rápida adición de 40 pl de lisado celular aclarado. Las soluciones se mezclaron durante 15 segundos y el cambio de absorbancia se leyó a 405 nm en un lector de placas de microtitulación a 25 °C. La actividad esterasa se expresó como la relación de (AA405/seg)mut/(AA405/seg)ts, donde (AA405/seg)mut fue el cambio en la absorbancia a 405 nm por segundo en muestras que contenían 'TesA mutante y (AA405/seg)ts fue el cambio en la absorbancia a 405 nm por segundo en muestras que contenían 'TesA de tipo silvestre.

4. Ensayo de hidrólisis de acil-CoA

En este sistema de ensayo, las soluciones reactivas utilizadas fueron:

Acil-coenzima A (acil-CoA) 10 mM en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0

fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0, monobromobimano (MBB) 50 mM (Novagen, cat. N° 596105) en acetonitrilo. Para preparar la solución de trabajo de acil-CoA, se añadieron 0,5 ml de solución de reserva de acil-CoA y 0,5 ml de solución de reserva de MBB a 29 ml de tampón fosfato y después se mezcló.

El ensayo se realizó añadiendo 60 pl de la solución de trabajo de acil-CoA a cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos, seguido de la rápida adición de 40 pl de lisado celular aclarado. Después de mezclar durante 15 segundos, el progreso de la reacción se controló mediante fluorescencia (Aex=380 nm, Aem=480 nm) en un lector de placas de microtitulación a 25 °C. La actividad acil-CoA tioesterasa se expresó como la relación de (AUFR/seg)mut/(AUFR/seg)ts, donde (AUFR/seg)mut fue el cambio en unidades de fluorescencia relativa (UFR) por segundo en muestras que contenían 'TesA mutante y (AUFR/seg)ts fue el cambio en unidades de fluorescencia relativa por segundo en muestras que contenían 'TesA de tipo silvestre.

5. Aplicación de la Metodología de la puntuación Z

Siguiendo la metodología de puntuación Z, se realizó una determinación de la puntuación Z de la siguiente manera. La puntuación Z para una muestra se define como el número de desviaciones estándar en que la señal de la muestra difiere de la media de la señal de la población de control. La puntuación Z se ha utilizado para clasificar los mutantes según propiedades de interés como, por ejemplo, por ejemplo, especificidad de longitud de la cadena del sustrato, preferencia relativa por enlaces éster sobre tioéster, preferencia relativa por enlaces tioéster sobre enlaces éster, y la proporción o el porcentaje de éster producido. La puntuación Z se mide utilizando el siguiente cálculo:

Z = (valor de la muestra - promedio del control)/Desviación estándar de los controles El control positivo utilizado para generar la biblioteca de 'TseA mutante de este documento fue 'TseA de tipo silvestre.

En una distribución normal, aproximadamente el 2,1 % de los datos comprenderán 2 o más desviaciones estándar por encima de la media, y aproximadamente el 0,1 % de los datos comprenderán 3 o más desviaciones estándar por encima de la media. Por lo tanto, para definir clases de datos cada vez más estrictas que es improbable que ocurran por azar, se utilizan puntuaciones Z de 2 o mayores, de 3 o mayores, de -2 o menores, de -3 o menores y así sucesivamente.

Aquellas variantes que tenían una puntuación Z mayor de 3 se marcaron por tener un rendimiento mejorado en términos de preferencia por sustratos de ciertas longitudes de cadena y/o velocidad catalítica. Además, se marcaron aquellas variantes que tenían una puntuación Z mayor de 3, bajo otras circunstancias, por proporcionar un rendimiento proporcional o porcentual mejorado para los ésteres grasos frente a los ácidos grasos libres. Adicionalmente, se marcaron aquellas variantes que tenían una puntuación Z de -3 o menor, incluso en otras circunstancias, por proporcionar un rendimiento proporcional o porcentual reducido para los ésteres grasos frente a los ácidos grasos libres.

Los números de especificidad de sustrato se definen como la pendiente cinética de un mutante dado para un sustrato, dividido entre el total de las pendientes cinéticas para los tres sustratos estudiados en el ensayo p Np (C¹⁰, C¹², C¹⁴), donde la pendiente cinética es la velocidad inicial observada para la hidrólisis de un sustrato de éster dado.

P o r e jem p lo , para ca lc u la r un núm ero de e sp e c ific id a d de sus tra to pa ra C ¹⁰:

E sp e cS u s C ¹⁰= P e n d ie n te M u tan te C ¹⁰/ (P e n d ie n te M u tan te C ¹⁰+ C ¹²+ C ¹⁴)

A con tinu ac ió n se ca lcu ló una pun tua c ió n Z de esp ec ific ida d de sus tra to . P rim e ro se ca lcu ló el p rom ed io (P ro m .) y las d e sv ia c io n e s e s tá n d a r (D E ) de los núm eros de e sp ec ific ida d del sus tra to pa ra los c o n tro le s p o s itivo s (p a ra cada p laca ) y se a p licó la s ig u ie n te fó rm u la :

P un tuac ión Z E sp e cS u s M u tan te C ¹⁰= (E sp e cS u sM u ta n te C ¹⁰-P ro m E s p e c S u s )/D E E s p e c S u s

C o m o o tro e jem p lo , para ca lcu la r un nú m ero de esp ec ific ida d de éster:

E s p e c É s te r = P e n d ien te M u tan te C ¹⁴-P N P / P e n d ien te M u tan te C ¹⁴-C o A

A con tinu ac ió n se ca lcu ló una pu n tua c ió n Z de e sp ec ific ida d de éste r. P rim e ro se ca lcu la ron las de sv ia c ion es p ro m e d io y e s tá n d a r de los nú m ero s de esp ec ific ida d de é s te r para los co n tro le s pos itivos (pa ra cada p laca ) y se a p licó la s ig u ie n te fó rm u la :

p u n tua c ió n Z de e sp ec ific ida d de é s te r m u tan te = (E s p e c É s te r M u tan te - P ro m E s p e c É s te r)/D E E s p e c É s te r Se d e fin ie ro n a q u e lla s v a r ia n te s que te n ía n una p u n tu a c ió n Z de e sp e c ific id a d de é s te r m a y o r q u e 3 y se m arca ro n con p re fe re n c ia para el é s te r sob re el t io é s te r, y /o com o ac tiv idad (es decir, v e lo c id a d c a ta lític a ) m e jo ra d a con re sp e c to é s te r sob re tioé s te r. A q u e lla s va r ia n te s que ten ía n una pu n tua c ió n Z de E spe c ific idad de É s te r m e n o r que -3 se m arca ron con p re fe re n c ia pa ra el t io é s te r sob re el éster.

EJEMPLO 33. ANÁLISIS DE ÁCIDOS GRASOS LIBRES DE LAS VARIANTES DE ’TesA

En este e jem p lo , se p ro po rc ion an resu ltad os de e n sayo que id en tifican d ive rsa s p ro p ieda de s de las va r ia n te s de 'TesA . El an á lis is se rea lizó u tilizan do los m é tod os de sc ritos a n te rio rm e n te en el E je m p lo 32. En las ta b la s de las FIGS. 45 y 46, las m u ta c io n e s se p re sen ta n u tilizan do "có d ig o s de va ria n te ", cad a uno de los cua le s p ro p o rc io n a el a m in o á c id o de t ip o s ilvestre , seg u ido de la po s ic ión en la se cu e n c ia de am ino ác id os , seg u ido de l am in o á c id o de re e m p la zo (p o r e jem p lo , "S 10 A " in d ica que, en es ta v a r ia n te en pa rticu la r, en la se cu e n c ia de a m in o á c id o s la se rina que está en la po s ic ió n 10 se ha re e m p la za d o po r a lan ina ).

EJEMPLO 34. ANALISIS DE LAS VARIANTES DE ’TesA

En las FIGs. 45 y 46, se p ro po rc ion an los resu ltad os del en sayo de las v a ria n te s de 'TesA . El an á lis is se rea lizó u tiliza n d o los m é to d o s de sc rito s a n te rio rm e n te en el E je m p lo 32. C o m o se m ue s tra en la FIG. 45, se a n a liz a ro n los n ive le s de ac tiv id a d en su s tra to s C ¹⁰, C ¹²y C ¹⁴y las e s p e c ific id a d e s de sustra to .

La FIG. 45 re p re se n ta los índ ices de ren d im ien to de c ie rta s va r ia n te s 'T e sA de la b ib lio teca de m u tan tes 'TesA , que d e m o s tró un re n d im ie n to m e jo rad o en c o m p a ra c ió n con la e n z im a de tipo s ilves tre . Las FIGs. 45A-B rep rese n tan los índ ices de ren d im ie n to de los m u tan tes 'T e sA en té rm in o s de e sp e c ific id a d para sus tra to s de c ie rta s lo ng itude s de cadena.

La FIG. 46A m ue s tra m u ta n te s 'T e s A que p ro po rc io n a ro n un m a yo r re n d im ie n to p ro p o rc io n a l o po rcen tu a l de és te re s g ra so s fre n te a ác ido s g ra sos lib res. La FIG. 46B m ue s tra m u tan tes 'T e sA que p ro po rc ion a ro n un ren d im ien to p ro p o rc io n a l o p o rcen tu a l red uc ido de é s te re s g ra sos fren te a ác ido s g ra sos lib res. En la ta b la so lo se ilustran m u ta n te s con p u n tu a c io n e s Z sup e rio res a 3 y no se inc luyen o tro s m u tan tes con m e n o r ac tiv idad . A p e sa r de la p re se n ta c ió n de los da tos, se a firm a que una pu n tua c ió n Z m ás ba ja puede id e n tifica r m u ta n te s va lio so s y el lím ite de p u n tua c ió n Z de 3 p ro p o rc io n a d o en la FIG. 45 no p re te nd e lim ita r el a lcan ce de la invenc ión .

Los re su lta d o s se rep rese n tan g rá fica m e n te en to d a la long itud de la m o lécu la 'T e sA en las FIGs. 57A-C.

1. A c tiv id a d de p ro du cc ión de ác ido s g ra sos para V a ria n te s de 'T e sA

Los resu ltad os del en sayo para la ac tiv idad de p ro du cc ión de ác ido s g ra sos en las va r ia n te s de 'T e sA se rea lizan u tilizan do los m é tod os d e sc rito s a n te rio rm e n te en el E je m p lo 32.

2. E nsa yo de A c il-P N P G raso de las V a ria n te s de 'T e sA

En la FIG. 45 se p ro po rc ion an los resu ltad os del e n sayo para la ac tiv idad de ac il-P N P graso de las va r ia n te s de 'TesA . El an á lis is se rea lizó u tilizan do los m é tod os d e sc rito s a n te rio rm e n te en el E je m p lo 32.

3. A n á lis is de A c y l-C o A de las V a ria n te s de 'T e sA

En la FIG. 45 se p ro p o rc io n a n los resu ltad os del e n sayo para la ac tiv ida d de a c il-C o A de las va r ia n te s de 'TesA . El an á lis is se rea lizó u tiliza n d o los m é to d o s d e sc rito s a n te rio rm e n te en el E je m p lo 32.

4. P re fe re n c ia po r T io é s te r (A c il-C o A ) sob re E s te r (A c il-P N P )

Los resu ltad os del en sayo para la ac tiv idad de a c il-C o A y la ac tiv ida d de ac il-P N P de las va r ia n te s de 'T e sA se rea liza ron u tiliza n d o los m é to d o s d e sc rito s a n te rio rm e n te en el E je m p lo 32.

5. P re fe re nc ia po r E s te r (A c il-C o A ) sob re T io é s te r (A c il-C oA )

EJEMPLO 35. PRODUCCIÓN DIRECTA DE ÉSTERES GRASOS EN AUSENCIA DE ÉSTER SINTASA En este e jem p lo , se de m ue s tra la cap ac idad de 'T e sA para c a ta liza r in vitro la tra n s e s te r if ic a c ió n de una ac il-C o A g ra sa en el c o rre sp o n d ie n te é s te r g raso en p re sen c ia de un a lcoho l. La e n z im a 'T e sA de E. coli se exp resó de m an e ra reco m b in an te y se pu rificó hasta la h o m og ene id ad com o una p ro te ín a m a rca d a con 6 H is tid in as (6x H is) en el e x trem o N. En pa rticu la r, el gen 'TesA que cod ifica la e n z im a tio e s te ra sa I de E. coli (S E Q ID NO: 31 de la FIG.

58) se in se rtó en un v e c to r p E T 15 -b (N o vag en ), q u e lle vab a una e tiq u e ta 6 x H is en el e x tre m o N y pa ra la e xp res ión se tra n s fo rm ó en cé lu las B L21-D E 3. Las cé lu las se cu ltiva ro n en m ed io LB a 37 °C, a 200 rpm , hasta a lc a n z a r una D O ⁶⁰⁰de 1,0, se in d u je ro n con IP T G 0 ,5 m M (fina l), y de spu és se de jó que c rec ie ran a 28 °C d u ran te 5 ho ras m ás. D e sp u é s de la re co g id a a 6 000 rpm , el se d im e n to se re su sp e n d ió en 40 m l de T r is -H C l 100 m M , pH 7,4, se som e tió a u ltra son ido y se cen trifu g ó a 10 000 rpm du ran te 20 m inu tos. El lisado ac la ra do se ap licó de spu és a una co lum na de un ión a H is (C a lb io ch e m ) y la p ro te ín a se pu rificó s ig u ie n d o las in s tru cc io n e s del fa b rica n te . D espués, la p ro te ína e lu id a se d ia lizó en un ta m p ó n que c o n te n ía fo s fa to de sod io 25 m M , pH 7 ,2 y g lice ro l a l 10 % pa ra su co n se rva c ió n y uso. S e d e te rm in ó la ac tiv ida d t io e s te ra s a de la e n z im a 'T e s A pu rificada .

La ca tá lis is de a c il-C o A g ra sa a é s te r g ra so po r 'T e sA im p lica un a ta que nuc le ó filo po r un a lcoh o l en el cen tro c a rb o n ilo p o s te r io r a la sa lida de l g ru po de co e n z im a A de l s itio ac tivo . La ta s a de tra n s e s te r if ic a c ió n e sp o n tá n e a del ác ido pa lm ítico po r e ta no l en a u se n c ia de 'T e sA se a n a liz ó pa ra d e m o s tra r que el e ta no l puede re e m p la z a r al agua com o el nuc le ó filo para fo rm a r é s te re s g ra sos en lu g a r de ác ido s grasos.

P o r con s ig u ie n te , se incubó una a lícu o ta de ác ido p a lm ítico (C ¹⁶-C O O H ) (S ig m a ) 4 m M (a p ro x im a d a m e n te 1 m g /m l) con c a n tid a d e s va r ia b le s de e ta no l d u ra n te d ife ren te s pe río do s de t ie m p o a te m p e ra tu ra am b ien te . Las m u e s tra s se e x tra je ro n con una re lac ión vo lu m é tr ica 1: 1 de ace ta to de e tilo y el ex trac to se an a lizó u tilizan do G C -M S para d e te c ta r la p re se n c ia de p a lm ita to de etilo . Los re su lta d o s se m ue s tra n m ás a d e la n te en la T a b la 23, que in d ica que la tra n s e s te r if ic a c ió n esp o n tá n e a en tre e ta n o l y ác ido pa lm ítico se p roduce a una ta sa de tra n s fo rm a c ió n in fe rio r a 0,01 m o l/m o l de ác ido pa lm ítico .

Tabla 23

S e a n a lizó la ta sa de tra n s e s te r if ic a c ió n in vitro ca ta liza da po r 'T e sA so b re el sus tra to de pa lm ito il-C o A . Las re a cc io n e s se lleva ron a cabo a te m p e ra tu ra am b ie n te d u ran te 1 hora en un ta m p ó n que con ten ía 100 pM de pa lm ito il-C o A : 100 pM de ta m p ó n fo s fa to pH 7,0 y B S A 1 m M , ya sea en p re se n c ia o au se n c ia de 1,5 pM de 'T e sA p u rifica da . Las co n ce n tra c io n e s de e ta no l va ria ro n en tre 0 -60 % (v/v). S e u tilizó una re lac ión vo lu m é tr ica 1: 1 de ace ta to de e tilo pa ra la in a c tiva c ió n y ex tra cc ió n p o s te rio res . La fo rm a c ió n de p a lm ita to de e tilo se co n tro ló u tilizan do G C -M S . La ta b la 24 resu m e los resu ltados.

Tabla 24

Los re su lta d o s ind ican que las t io e s te ra sa s 'T e sA ca ta liza n de m an e ra e ficaz la tra n s e s te r if ic a c ió n de una ac il-C oA , pa lm ito il-C o A , en pa lm ita to de e tilo en p re sen c ia de e tano l. El re n d im ie n to m á x im o ob te n id o fue de 23 ,5 m o l/m o l de pa lm ito il-C o A .

D ado que los ren d im ien to s para la tra n s fo rm a c ió n esp o n tá n e a de ác ido pa lm ítico en é s te r pa lm ítico son e x tre m a d a m e n te ba jos en com p a ra c ió n con los o b ten ido s en p re sen c ia de 'T e sA (es decir, lo que ind ica un au m e n to > 1 ,000 vece s ), la tra n s fo rm a c ió n se p ro du ce e n z im á tica m e n te . B asá nd ose en n u e s tro s da tos, los re n d im ie n to s m áx im os de tra n se s te rif ica c ió n se p rodu je ron a n ive les de e tano l (v /v ) de 10 -20 % . Las c o n c e n tra c io n e s m ás a lta s de a lcoh o l in fluyen de m an e ra ad ve rsa sob re la e s ta b ilida d y/o ac tiv ida d de la e n z im a y, po r lo tan to , dan com o resu lta d o re n d im ie n to s de é s te r m ás bajos.

A p a rtir de e s to s resu ltad os , se llegó a la c o n c lu s ió n de que la t io e s te ra s a pued e c a ta liz a r la e s te rifica c ió n d irec ta de un sus tra to de a c il-C o A en p re sen c ia de a lcoho l. S e rá pos ib le m o d ific a r el p ro du c to de é s te r ca m b ia n d o el a lcoho l (p o r e jem p lo , u tiliza n d o m etano l, p ro pa no l o b u tano l) y /o la c o n ce n tra c ió n de a lcoho l.

EJEMPLO 36. PRODUCCIÓN IN V IV O DE ESTERES GRASOS POR TIOESTERASA

En este e jem p lo , se in ves tig ó la ca p ac idad de 'T e sA para p ro d u c ir és te res in vivo en a u se n c ia de é s te r s in tasa e xp re sa d a de m an e ra he te ró loga . La fo rm a c ió n de é s te r en au sen c ia de una é s te r s in ta sa exp resa da de m anera h e te ró lo g a se ob se rvó en la ce p a M G 1655 (AfadE) de E. coli, que ta m b ié n lle vab a un operón a rtific ia l que con ten ía 'tesA y fadD ba jo el con tro l de un p ro m o to r trc, ju n to con un gen m a rc a d o r de kan am ic ina . El o p e ró n se in te g ró en el c rom o som a , in te rru m p ie n d o el gen lacZ na tivo. Esta cepa se p robó en una fe rm e n ta c ió n con m a traz de ag itac ión u tiliza n d o m ed io s que co m p re n d ía n N a ²H P O ⁴6 g/l, K H ²P O ⁴3 g/l, N aC l 0.5 g/l , N H 4 C l 1 g/l, t ia m in a 1 m g/l, M g S O ⁴1 m M , C aC l 0,1 m M , co m p le m e n ta d o s con N H 4C l ad ic io na l (1 g/l a d ic io na l), ta m p ó n B is -T ris (0 ,2 M), T riton X -100 (0,1 % v /v ) y o lig o e le m e n to s (F e C l^{3 - 6}H ²O 27 m g/l, Z n C l²- ⁴H ²O 2 m g/l, C a C l²- ⁶H ²O 2 m g/l, N a ²M oO ⁴- ²H ²O 2 m g/l, C u S O ⁴- ⁵H ²O 1.9 m g/l, H ³B O ³0 ,5 m g/l, HC l c o n ce n tra d o 100 m l/l).

S e in ocu ló un c u ltivo de p re -sem illa de a n tib ió tic o s LB con un ra sp a d o de una so lu c ió n de re se rva de g lice ro l o de una so la co lon ia . S e cu ltivó du ran te 6 a 8 ho ras hasta a lc a n z a r una D O ⁶⁰⁰> 1,0. S e in ocu ló un m ed io de fe rm e n ta c ió n m ás g luco sa al 2 % (p /v ) a n tib ió tico s d u ran te la noche en el cu ltivo de sem illa con el cu ltivo de p re sem illa de LB al 4 % (v/v). S e p re pa ra ron cu ltivos de p ro du cc ión de m ed io de fe rm e n ta c ió n 15 m l g luco sa al 3 % (p /v ) an tib ió ticos , en m a trace s de ag ita c ió n d e fle c to re s de 125 ml. S e u tilizó una can tidad ap rop iad a de cu ltivo de s ie m b ra du ran te la noche para in o cu la r el cu ltivo de p ro du cc ión de m an era que la D O ⁶⁰⁰in ic ia l en el m a traz de cu ltivo de p ro du cc ión fue ra de a p ro x im a d a m e n te 0,5. S e de jó que el cu ltivo de los m a trace s a lcan zase un v a lo r de D O ⁶⁰⁰de 1,0, m om e n to en el cual, los cu ltivos se in du je ro n con IP TG 1 m M (c o n c e n tra c ió n fin a l) y se les sum in is tró m e tan o l o e ta no l (a l 2% v /v). S e pe rm itió que los c ic los de fe rm e n ta c ió n con tin u a ra n du ran te el t ie m p o in d ica do de sp u é s de la inducc ión . T o d a s las e ta pas de cu ltivo se rea liza ron a 32 °C con ag itac ión a 200 rpm.

S e rea liza ron e x tra cc io n e s com p le ta s de ca ldo u tilizan do un p ro ce d im ie n to e s tá n d a r de m ic ro e x tra cc ió n . En resum en , se tra n s fir ie ro n 500 pl de ca ldo a un tu b o de m ic ro ce n trífu g a , a los que se a ñ ad ie ro n 100 pl de H C l 1 M. Los cu ltivos ac id ifica d o s se ex tra je ro n con 500 pl de a ce ta to de e tilo , se ag itó en vó rte x du ran te 5 m in u tos y se ce n trifu g ó a v e lo c id a d m áx im a du ran te 1 m inu to . La capa o rg á n ica se an a lizó u tiliza n d o G C -F ID para la c u a n tif ica c ió n s im u ltá n e a de é s te r m e tílico de ác ido g ra so (F A M E ) y de ác ido g raso lib re (F F A ) y la cua n tifica c ión s im u ltá n e a de é s te r e tílico de ác ido g ra so (F A E E ) y de la FFA.

En m u e s tra s que con te n ía n F A E E y FFA, los F FA se d e riva tiza ro n con B is (tr im e tils ilil) tr if lu o ro a ce ta m id a an tes de la cua n tifica c ión .

La cepa M G 1655 (AfadE) pT rc -'T e sA _ fa d D , que se cu ltivó y a la qu e se s u m in is tró m e ta n o l al 2 % en la inducc ión , p ro du jo un to ta l de F A M E de 2 g/l a las 24 ho ras y un to ta l de F A M E de 3 ,5 g/l al fina l de la fe rm e n ta c ió n a las 48 ho ras (F IG . 48). S e de tec ta ron ca n tid a d e s m ín im a s de FFA, en to ta l a p ro x im a d a m e n te 100 m g/l. Los cu ltivos alcanzaron su mayor densidad, DO600 de aproximadamente 11, después de 24 horas y no continuaron creciendo durante las 24 horas siguientes. La productividad específica se calculó en aproximadamente 200 mg/l/DO a las 24 horas y en aproximadamente 300 mg/l/DO a las 48 horas. Estos datos indican que, con la sobreexpresión de 'tesA y fadD , incluso en ausencia de una cera sintasa, se observó la producción de FAMe .

Para evaluar la capacidad de FadD o 'TesA para producir FAME de manera independiente, se realizó una segunda fermentación probando dos cepas de E. c o li diferentes que llevaban plásmidos con cualquiera de fadD , 'tesA o tanto fa d D como 'tesA . Todos los plásmidos estaban basados en pACYC y la expresión estaba dirigida por un promotor trc . Se probaron tres cepas MG1655 (A fa d E ) diferentes, una con plásmido que solo expresaba fadD , otra con un plásmido que solo expresaba 'tesA y la tercera con 'tesA y fadD , estando 'tesA localizado aguas arriba de fadD . Se probaron dos cepas C41 (A fadE ), ambas llevando 'tesA y fadD , pero con los genes en diferente orden respecto al promotor. Estas cepas se cultivaron en los medios descritos anteriormente y recibieron metanol al 2 % en la inducción y se cultivaron durante 25 horas más después de la inducción. La cepa que solo expresaba fa d D no produjo ningún FAME mientras que la cepa que expresaba 'tesA produjo solo aproximadamente 150 mg/l de FAME (FIG. 49). Tener tanto 'TesA como fa d D mejora la producción de FAME sobre tener solo 'TesA. Las dos cepas C41 produjeron un aumento adicional en la producción de FAME, como se observa en la cepa que lleva un plásmido en el que fa d D está aguas arriba de 'tesA , sobre la cepa que expresa 'tesA y fa d D en el orden opuesto. Esto sugirió que una mayor expresión de FadD mejoró la capacidad de 'TesA para producir ésteres. Dado que 'TesA puede escindir tanto acil-ACP como acil-CoA, es probable que la producción de acil-CoA por FadD permita que los FFA generados por 'TesA se reciclen nuevamente a la tioesterasa para que vuelvan a transformarse en FFA por hidrólisis o que se lleven a FAME por alcoholisis. El examen de los títulos de FFA lleva a la conclusión de que solo la cepa que expresa 'TesA produjo cantidades significativas de FFA, mientras las cepas que expresan fa d D apenas producen FFA (FIG.

50).

'TesA se probó con respecto a su capacidad para utilizar etanol para la formación directa de éster etílico de ácidos grasos (FAEE). Se probaron las dos cepas MG1655 (A fad E ) del experimento descrito anteriormente, la cepa que sobreexpresa fa d D y la que sobreexpresa 'TesA. En este experimento también se incluyó la cepa MG1655 (A fad E ) con el operón ’te sA _ fa d D integrado bajo el control de un promotor trc. Todas las cepas se cultivaron utilizando el protocolo descrito anteriormente. En la inducción, todas las cepas recibieron metanol al 2 % (v/v) o etanol al 2 % (v/v). Además, la cepa MG1655 (A fa d E ) + fa d D recibió ácido graso C14: 0 al 0,05% (p/v) para garantizar que hubiera suficiente sustrato de ácido graso libre disponible para FadD para catalizar la posible reacción de alcoholisis. Las fermentaciones se dejaron continuar durante 24 horas.

En estas condiciones de fermentación, de nuevo, FadD solo no pudo producir el FAME C1C140 ni el FAEE C2C140 necesarios, lo que indica que FadD no fue suficiente para la formación de éster (FIG. 51). Sin embargo, 'TesA solo fue capaz de producir FAEE y como antes, la sobreexpresión de 'te s A y fa d D aumenta la producción global de FAEE sobre la que tiene 'tesA solo. Mientras que los títulos globales de FAEE fueron más bajos que los títulos de FAME, estos datos demuestran que 'TesA también puede utilizar etanol además de metanol para la formación de ésteres grasos. El análisis de la formación de FFA en estas condiciones de fermentación indica que las cepas se comportaron de manera similar con el suministro de etanol así como con el suministro de metanol (FIG. 52).

El FFA presente en las muestras de fadD fué aportado casi en su totalidad por el suministro de FFA C140 durante la fermentación. La cepa que expresa 'tesA produjo una gran cantidad de FFA, mientras que la cepa que expresa 'tesA y fa d D mostró muy poca acumulación de FFA. En presencia de 'TesA, solo se observó una transformación de 14 % de FFA a FAME o de 2,3 % de FFA a FAEE. En presencia de 'TesA y FadD, se observó una transformación de casi 100% de FFA a FAME o FAEE. Estos datos sugieren que 'TesA es necesaria y suficiente para la formación del éster de alcohol de ácido graso, pero la sobreexpresión de FadD junto con 'TesA es importante para aumentar la formación de FAME y FAEE.

Los resultados anteriores sugieren que 'TesA de E. co lipu ed e producir FAME y FAEE cuando recibe los alcoholes apropiados durante la fermentación. Para determinar si esta es una función exclusiva de 'TesA de E. coli, se investigó la capacidad de otras tioesterasas expresadas de manera heteróloga para producir los FAME. Se sobreexpresaron homólogos de 'TesA de las especies P h o to rh a b d u s lu m in e sce n s y Vibrio H a rv e y i junto con una TesB de la especie P h o to b a c te riu m p ro fu n d u m a partir de plásmidos basados en pACYC en la cepa MG1655 (A fa d E ) y se probaron junto con la cepa de sobreexpresión 'TesA de E. c o li de las fermentaciones anteriores. Las fermentaciones realizadas en matraces de agitación se llevaron a cabo en medios de fermentación y se dejó que prosiguieran durante 24 horas después de la inducción. Los resultados indicaron que los dos homólogos de 'TesA también fueron capaces de generar FAME (FIG. 53). 'TesA de la especie P. lu m in is c e n te s produjo FAME a un nivel comparable al de 'TesA de la especie E. coli, mientras que 'TesA de la especie V. H a rv e y i fue capaz de producir mucho más FAME que 'TesA de E. coli. Al observar los títulos de FFA, 'TesA de P. lu m in e s c e n s produjo menos FFA que 'TesA de E. coli, pero nuevamente, 'TesA de V. h a rv e y i produjo títulos de FFA mucho más altos en comparación con su homólogo E. c o li (FIG. 54). Curiosamente, 'TesA de V. h a rv e y i fue muy activa y fue capaz de producir títulos más altos de FAME y FFA que la cepa de control que expresa 'TesA de E. c o li; además, su tasa de transformación de FFA a FAME fue superior al 30 % en comparación con el 14 % de 'TesA de E. coli. Adicionalmente, a pesar de producir títulos totales de FAME más bajos, la cepa que expresa 'TesA de P. lu m in e s c e n s mostró que FAME constituía más del 60 % del título total de FAME FFA.

1. A c tiv id a d de é s te r s in ta sa en o tros ho m ó lo g o s de 'T e sA

Los ho m ó lo g o s de 'T e sA de Escherichia coli, Pectobacterium atrosepticum, Photobacterium profundum, Photorhabdus luminescens, Pseudomonas putida, y Vibrio Harveyi se c lo na ron en el v e c to r de exp re s ió n pA C Y C ba jo el con tro l de un p ro m o to r trc. T oda s las s e cu e n c ia s se c lo na ron com o genes tru n c a d o s que ca rec ían de una se cu e n c ia pe p tíd ica seña l, para lo g ra r la exp res ión c itop la sm á tica . En la T ab la 26 se m u e s tra n las se cu e n c ia s de A D N y de a m in o á c id o s de los ho m ó logo s . En la T a b la 27 se m u e s tra un a lin e a m ie n to de las s e cu e n c ia s de am ino ác id os .

Los p lá sm id o s se tra n s fo rm a ro n en M G 1655 AfadE de E. coli y se cu ltiva ro n du ran te la noche a 37 °C en p lacas de a g a r LB q u e co n te n ía n ca rb e n ic ilin a 100 pg /m l. S e se le cc io n a ro n c o lo n ia s in d iv id u a le s y se cu ltiva ro n a 37 °C en un ca ldo LB que con ten ía g luco sa al 1 % (p /v ) y ca rb e n ic ilin a 100 pg /m l hasta a lc a n z a r una D O ⁶⁰⁰con un v a lo r de 1,0. D espués , se d ilu ye ro n 200 pl de l cu ltivo en 1,8 ml de un m ed io M 9 que c o n te n ía c a rb e n ic ilin a 100 pg /m l. D e spu és de c u ltiv a r los cu ltivo s d u ra n te 3 ho ras a 37 °C, se añ ad ió IP TG (a una con cen tra c ión fina l de 1 m M ), as í com o ta m p ó n B is -T ris P rop an o (0,1 M, pH 7 ,0 ) y m e tan o l (2 % v/v).

D e sp u é s de 20 ho ras de c u ltivo a 37 °C, se e x tra jo 1 m l de c u ltivo m e d ia n te la ad ic ió n de 100 pl de H C l 1 N y 250 pl de a ce ta to de etilo . En la so luc ió n de ace ta to de e tilo se in c luyó un pa trón in te rno de ác ido g ra so lib re C20.

Los ác ido s g ra sos y los és te res m e tílico s se a n a liza ro n en un c ro m a tó g ra fo de ga ses T race G C U ltra (T he rm o E le c tro n C o rp ) eq u ipad o con un d e te c to r de io n iza c ió n de llam a. La can tidad to ta l de ác ido g raso lib re (F F A ) y de é s te r m e tílico de ác ido g ra so (F A M E ) p roduc ida , va rió en tre los ho m ó lo g o s e s tu d ia d o s (véa se la FIG.60).

'T e sA de E. coli p ro du jo un to ta l de a p ro x im a d a m e n te 300 m g/l de p ro du c to s grasos, m ie n tra s que el ho m ó logo de Pseudomonas putida g e ne ró casi 4 ve ce s esa can tida d . La p ro po rc ión de F A M E p ro du c ida ta m b ié n de p e n d ía de la e xp re s ió n de l h o m ó lo g o de 'TesA . M ie n tra s que so lo el 3 % de l p ro d u c to to ta l g e n e ra d o po r 'T e sA de Pseudomonas putida fu e FA M E , m ás de l 25 % de l p ro d u c to to ta l g e n e ra d o po r 'T e sA deVibrio Harveyi e ra FA M E . E s tos re su lta d o s ind ican que la fo rm a c ió n de é s te r es tá ca ta liza d a e in flu e n c ia d a po r 'TesA , en lu g a r de se r un p ro ceso pu ram en te q u ím ico que no se ve a fe c ta d o po r la enz im a . De e llo se de duce que esta ac tiv ida d es una fu n c ió n de la secu en c ia de a m in o á c id o s de la en z im a y que puede g e n o m a n ip u la rse para a u m e n ta r o d is m in u ir la p ro pe ns ió n para la p ro du cc ión de éster.

P a ra d e te rm in a r si la so b re e xp re s ió n de F adD au m e n ta ría los títu lo s de FA M E , los p lásm id os se tra n s fo rm a ro n en M G 1655 AfadE de E. coli que llevab a el gen fadD en el p lásm ido pC L1920 , ba jo el con tro l de un p ro m o to r trc. Las cé lu la s tra n s fo rm a d a s se cu ltiva ron d u ran te la noche a 37 °C en p lacas de a g a r LB que con ten ían ca rb en ic ilina 100 pg /m l y e sp e c tin o m ic in a 100 pg /m l. S e se le cc io n a ro n co lon ias in d iv id u a le s y se cu ltiva ro n a 37 °C en ca ldo LB que co n te n ía g luco sa al 1 % (p/v), ca rb e n ic ilin a 100 pg /m l y e sp e c tin o m ic in a 100 pg /m l hasta que la D O ⁶⁰⁰a lcanzó un v a lo r de a p ro x im a d a m e n te 1,0. D espués , se d iluye ron 200 pl de l cu ltivo en 1,8 m l de un m ed io M 9 que con ten ía c a rb e n ic ilin a 100 pg /m l y e sp e c tin o m ic in a 100 pg /m l. D espués de c u ltiv a r los cu ltivo s d u ran te 3 ho ras a 37 °C, se añ ad ió IP TG (a una co n ce n tra c ió n fina l de 1 m M ), a s í com o ta m p ó n B is -T ris P ro p a n o (0,1 M, pH 7 ,0 ) y m e tan o l (2 % v/v).

D e sp u é s de 20 ho ras de c u ltivo a 37 °C, se e x tra jo 1 m l de cu ltivo m e d ia n te la ad ic ió n de 100 pl de H C l 1 N y 250 pl de a ce ta to de etilo . En la so luc ió n de ace ta to de e tilo se in c luyó un pa trón in te rno de ác ido g ra so lib re C ²⁰.

Los ác ido s g ra sos y los és te res m e tílico s se a n a liza ro n en un c ro m a tó g ra fo de ga ses T race G C U ltra (T he rm o E le c tro n C o rp ) e q u ipad o con un d e te c to r de ion izac ión de llam a. C om o se ob se rvó a n te rio rm e n te con 'T e sA de E. coli, la c o e x p re s ió n de F adD a u m e n tó la p ro po rc ión de F A M E p ro d u c id a pa ra to d o s los h o m ó lo g o s p ro b a d o s (véa se la F IG . 61). P o r lo tan to , la co e xp re s ió n de una a c il-C o A s in ta sa ju n to con h o m ó lo g o s de 'T e s A pu ede u tiliza rse para a u m e n ta r la p ro du cc ión de éste r. C u riosa m en te , el títu lo to ta l de F FA m ás F A M E p ro du c ido po r 'T e sA de P. putida fue m uch o m e n o r cua nd o se coe xp re só FadD . Esto sug ie re que 'T e sA de P. putida puede se r m ás e sp ec ífica para los sus tra to s de ac il-A C P que los de ac il-C oA , y que puede c o e xp re sa rse con una é s te r s in ta sa u o tra t io e s te ra sa con m a yo r ac tiv ida d fre n te a las a c il-C o A pa ra a u m e n ta r aún m ás la p ro du cc ión de éster.

2. S ín tes is de é s te r m e jo rad a m ed ia n te una 'T e sA M utan te

C o m o se ha m en c io n a d o an te rio rm e n te , los es tu d io s de h o m ó logo s de 'T e sA han in d ica d o que la ac tiv idad de é s te r s in ta sa en ' T e sA en un rasg o g e no m an ipu lab le ; es decir, para m e jo ra r la p ro du cc ión de é s te re s pueden rea liza rse ca m b io s en la se cu e n c ia de am in o á c id o s de la enz im a . P ara este fin, se con s tru yó un m u tan te de 'T e sA de E. coli con ac tiv id a d é s te r s in ta sa po tenc iad a . R e e m p la za n d o S er10 , el res to de se rin a nu c le ó fila en el s itio a c tivo de 'TesA , con c is te ín a pa ra g e n e ra r el m u ta n te S 10 C p ro d u ce una e n z im a 'T e s A m e jo rad a que p ro d u ce una m a yo r p ro po rc ión de FAM E.

Los p lásm id os que cod ifican 'T e sA de E. coli de t ip o s ilvestre , el m u tan te S 10C , o sin 'TesA , se tra n s fo rm a ro n en M G 1655 AfadE de E. coli y se cu ltiva ro n d u ra n te la no che a 37 °C en p laca s de a g a r LB que co n te n ía n ca rb e n ic ilin a 100 pg /m l. S e se le cc io n a ro n co lo n ia s ind iv idu a le s y se cu ltiva ron du ran te la noche a 37 °C en un ca ldo LB que contenía glucosa al 1 % (p/v) y carbenicilina 100 pg/ml. Después, los cultivos se diluyeron 1: 100 en un medio LB reciente complementado con glucosa al 1 % (p/v) y carbenicilina 100 pg/ml y se cultivaron a 37 °C hasta alcanzar una DO600 de aproximadamente 1,0. Después, se diluyeron 200 pl del cultivo en 1,8 ml de un medio M9 que contenía carbenicilina 100pg/ml. Después de cultivar los cultivos durante 3 horas a 37 °C, Se añadió IPTG (concentración final 1 mM), así como tampón Bis-Tris Propano (0,1 M, pH 7,0) y metanol (2 % v/v).

Después de 20 horas de cultivo a 37 °C, se extrajo 1 ml de cultivo mediante la adición de 100 pl de HCl 1 N y 250 pl de acetato de etilo. En la solución de acetato de etilo se incluyó un patrón interno de ácido graso libre C20.

Los ácidos grasos y los ésteres metílicos se analizaron en un cromatógrafo de gases Trace GC Ultra (Thermo Electron Corp) equipado con un detector de ionización de llama. La cantidad total de ácido graso libre (f Fa ) y de éster metílico de ácido graso (FAME) producida, fue mayor en cultivos de 'TesA de E. co lide tipo silvestre (316 mg/l) en comparación con los del mutante S10C (136 mg /l), pero la proporción de FAME en S10C (47 %) fue mayor que la observada con 'TesA de tipo silvestre (9 %). Esto demuestra que la secuencia de 'TesA puede modificarse para que influya en la proporción de ésteres producidos (véase la FIG. 62).

(co n tin u a c ió n )

(c o n tin u a c ió n )

(c o n tin u a c ió n )

(c o n tin u a c ió n )

(c o n tin u a c ió n )

co n tin u a c ió n

EJEMPLO 37. PRODUCCION DE FAME EN AUSENCIA DE UNA CERA SINTASA EN FERMENTADORES E ste e je m p lo d e m ue s tra que, para p ro d u c ir és te re s de ác ido s g ra sos a esca la com e rc ia l, un p ro ce so com o el que se de sc rib e a n te rio rm e n te en el e je m p lo 36, pued e m e jo ra rse seg ún la p re sen te d ivu lg ac ión .

Las cé lu la s de una rese rva co n g e la d a se rea v iva ro n en un ca ld o LB d u ra n te 4 -8 ho ras y d e sp u é s se cu ltiva ro n en un m ed io de fin id o que con ten ía : 1,5 g/l de K H ²P O ⁴, 4 ,54 g/l de K ²H P O ⁴tr ih id ra to , 4 g/l de (N H ⁴)²S O ⁴, 0.15 g/l de M g S O ⁴he p tah id ra to , 20 g/l de g lucosa , 200 mM de ta m p ó n B is -T ris (pH 7,2), 1,25 y 1,25 m l/l de una so luc ió n de v itam ina s . La so luc ió n de o lig o e le m e n to s c o n te n ía 27 g/l de F e C h ■ ⁶H ²O, 2 g/l de Z n C l²■ ⁴H ²O, 2 g/l de C a C l²■ ⁶H ²O, 2 g/l de N a ²M o O ⁴■ ²H ²O, 1,9 g/l de C u S O ⁴■ ⁵H ²O, 0 ,5 g /l de H ³B O ³, y 100 m l/l de H C l con cen tra do . La so luc ió n de v ita m in a c o n te n ía 0 ,42 g/l de rib o fla v ina , 5 ,4 g /l de á c id o p a n to tén ico , 6 g/l de n iac ina , 1,4 g /l de p ir ido x in a , 0 ,06 g/l de b io tin a y 0 ,04 g /l de ác ido fó lico .

S e u tiliza ron 100 m l de un cu ltivo que crec ió d u ra n te la noche para in o cu la r 2 litros del m ism o m ed io , pero so lo con 2 g/l de g lucosa , en un fe rm e n ta d o r a tem p e ra tu ra , pH, ag itac ión , v e n tila c ió n y o x íg eno d isue lto m uy con tro lados . Las con d ic io n e s en el fe rm e n ta d o r fue ro n 32 °C, pH 6,8 y un n ive l de o x íg eno d isue lto (O D ) igua l al 30 % de sa tu ra c ió n . El pH se m an tu vo con la ad ic ión de N H ⁴O H , que ta m b ié n actuó com o una fu e n te de n itrógeno para el c re c im ie n to ce lu la r. C u an do la g luco sa in ic ia l cas i se hab ía con sum ió , se p ro p o rc io n ó al fe rm e n ta d o r un sum in is tro que co n te n ía g luco sa al 60 % , 3 ,9 g/l de M gS O 4 he p ta h id ra to y 10 m l/l de la so luc ión de o ligo e lem en tos . La v e lo c id a d de l su m in is tro se con fig u ró para que co in c id ie se c o in c id ir con la v e lo c id a d de c re c im ie n to c e lu la r para im p e d ir la a cu m u lac ió n de g lu co sa en el fe rm e n ta d o r. A l im p e d ir la a cu m u lac ió n de g lucosa , fue pos ib le re d u c ir o e lim in a r la fo rm a c ió n de su b p ro d u c to s ta le s com o ace ta to , fo rm ia to y e tano l, que de o tro m odo p ro du ce la ba c te ria E. coli. D u ran te las p rim e ras 16 -24 horas, el sum in is tro se p ro p o rc io n ó exp o n e n c ia lm e n te , lo que pe rm itía que las cé lu la s c re c ie se n una v e lo c id a d de c re c im ie n to es tab le . U na v e z q u e la ve lo c id a d de l su m in is tro a lca n zó un m áx im o de sea do (de 6 a 10 g de g lu co sa /l de fe rm e n ta d o r/h ) se m a n tu vo a ese n ive l du ran te el res to del c ic lo de fe rm e n ta c ió n . En las p rim eras fase s de l c rec im ien to , la p ro du cc ión de FA M E se in du jo m ed ia n te la ad ic ión de IPTG 1 m M y 25 m l/l de m e tan o l puro. La fe rm e n ta c ió n se de jó c o n tin u a r d u ra n te un p e río do de 3 días. S e a ñ a d ió m etano l va ria s ve ce s du ran te el c ic lo para re p o n e r lo que las cé lu la s habían con sum ido , pero sob re tod o lo que se había pe rd ido po r eva po rac ió n en el gas libe rado . Las ad ic io ne s se u tiliza ron para m a n te n e r la co n ce n tra c ió n de m e tano l en el ca ldo de fe rm e n ta c ió n en tre 10 y 30 m l/l, para g a ra n tiz a r una p roducc ión e fica z ev itando al m ism o tie m p o la in h ib ic ión de l c re c im ie n to ce lu la r.

La p ro g re s ión de la fe rm e n ta c ió n fu e se g u id a po r m ed ic io ne s de D O 600 (d e n s id a d óp tica a 600 nm ), de c o n su m o de g lu co sa y de p ro du cc ión de éster.

El co n su m o de g lucosa a lo la rgo de la fe rm e n ta c ió n se an a lizó m ed ia n te c ro m a to g ra fía líqu id a de a lta pres ión (H P LC ). El an á lis is de H P LC se rea lizó según los m é to d o s c o m ú n m e n te u tilizad os en la té cn ica para c ie rtos azú ca re s y ác ido s o rgán icos , u tilizando , po r e jem p lo , las s ig u ie n te s con d ic ion es : S erie H P LC A g ile n t 1200 con d e te c to r de índ ice de re fracc ión ; C o lum na : A m in e x H P X -87H , 300 m m x 7 ,8 m m ; te m p e ra tu ra de la co lum n a : 35 °C; fase m óvil: H ²S O ⁴0,01 M (acuoso ); cauda l: 0 ,6 m l/m in ; v o lu m e n de inyecc ión : 20 pl.

La p ro du cc ión de é s te re s m e tílico s y e tílicos de ác ido s g ra sos se an a lizó m ed ia n te c ro m a to g ra fía de ga ses con d e te c to r de io n iza c ió n de llam a (G C -F lD , s ig la s de l in g lé s gas chromatography with a flame ionization detector). Las m u e s tra s del ca ldo de fe rm e n ta c ió n se ex tra je ro n con ace ta to de e tilo en una p ro po rc ión de 1:1 vo l/vo l. D espués a g ita r in te n sa m e n te en vó rtex , las m u e s tra s se ce n trifu g a ro n y la fase o rg á n ica se an a lizó m ed ia n te c ro m a to g ra fía de ga se s (G C ). Las co n d ic io n e s de reacc ión fue ro n las s igu ien tes :

Instrumento: Trace GC Ultra, Thermo Electrón Corporation con detector de ionización de llama (FID);

Columna: DB-1 (difenilsiloxano al 1 %; dimetil siloxano al 99 %) CO1 UFM 1/0,1/5 01 DET de Thermo Electron Corporation, fase pH 5, FT: 0,4 |jm, longitud 5m, id: 0,1 mm;

Condiciones de entrada: 250 °C sin división, según la concentración de la muestra se utilizó el método de división 1/25 de 3,8 minutos con un flujo dividido de 75 ml/min;

Gas portador, caudal: Helio, 3,0 ml/min;

Temperatura del bloque: 330 °C;

Temperatura de la estufa: 50 °C durante 0,5 minutos; de 100 °C/minuto a 330 °C; 330 °C durante 0,5 minutos; Temperatura del detector: 300 °C;

Volumen de inyección: 2 jl;

Tiempo de ciclo/caudal: 6,3 min/3,0 ml/min (método sin división), 3,8 min/1,5 ml/min (método con división 1/25), 3,04 min/1,2 ml/min (método con división 1/50).

Este protocolo se aplicó en ciclos de fermentación de dos cepas diferentes: ID1 (MG1655 AfadE::PTRc tesA-fadD) e IDG5 (MG1655 AfadE AfhuA Aadh Aldh ApflB :: Ptrc tesA, PAGT5LfadD), ninguno de las cuales contenía el gen que codifica una sintasa de éster. Las células se indujeron 4 horas después de la inoculación mediante una adición de IPTG, y se suministró metanol a los fermentadores para proporcionar el alcohol para la producción de los FAME. En experimentos distintos, los cultivos recibieron glucosa a dos velocidades de suministro máximas diferentes: 6 y 10 g/l/h.

Con ambas cepas y con cada velocidad de suministro de glucosa, los cultivos indicaron una preferencia por la producción de Fa m E sobre los ácidos grasos libres, como se muestra en las FIGs 63 y 64. En fermentaciones de 70 horas, ID1 produjo aproximadamente 19 g/l de FAME y menos de 1 g/l de FFA cuando recibía el suministro a una velocidad de 6 g/l/ h, y produjo 28 g/l de FAME y aproximadamente 1 g/l de FFA cuando lo recibía a 10 g/l/h. IDG5 produjo 20 g/l FAME y menos de 1 g/l de FFA a una velocidad de suministro más baja y produjo 25 g/l de FAME y aproximadamente 10 g/l de FFA a una velocidad de suministro más alta.

EJEMPLO 38. IDENTIFICACIÓN DE TIOESTERASAS NATURALES BASADA EN RESULTADOS DE GENOMANIPULACIÓN DE PROTEINAS PARA DETERMINAR PROPIEDADES ALTERADAS

Los experimentos de genomanupulación con la enzima 'TesA de E. coli realizados en el presente documento son útiles para identificar muchos restos de aminoácidos, cuyas mutaciones conducen a propiedades alteradas. 'TesA es una enzima que pertenece a la familia SGNH, una amplia categoría de enzimas. Es probable que, en la producción de biodiesel, también puedan utilizarse otros homólogos de 'TesA utilizando las rutas descritas en este documento. Este ejemplo identifica homólogos de 'TesA con propiedades posiblemente alteradas en comparación con 'TesA. El método se describe a continuación.

Utilizando la estrategia que se describe a continuación se identificaron homólogos de 'TesA.

Esquema E. coli secuencia de la proteína TesA

BLAST utilizando la base de datos nr, límite del valor E 10, máximo de aciertos 500, matriz de puntuación BLOSUM62 utilizando todos los

restantes parámetros predeterminados el programa Discovery Studio (Accelrys, CA)

Lista de homólogos

-Eliminar las secuencias que no contengan restos de sitios activos correspondientes a Ser10, Asp154, His157 de TesA de E. coli

-Alineamiento de secuencias múltiple con alineamiento por pares

rápido, matriz de puntuación BLOSUM, penalización por apertura de

hueco-10, penalización por extensión de hueco-0,05, utilizando todos

los restantes parámetros predeterminados el programa Discovery

Studio (Accelrys, CA)

Lista final de homólogos

Identifica homólogos que contengan sustituciones correspondientes a

posiciones identificadas en la exploración de TesA

Ejemplos de homólogos que contienen

sustituciones identificadas en la

exploración de TesA

En la FIG. 55 se m ue stra n los ho m ó lo g o s con su s titu c io n e s en las p o s ic io n e s co rre sp o n d ie n te s a las id e n tifica d a s en la exp lo rac ió n de 'TesA . T am b ién se m uestran la ID del ho m ó logo y el a lin e a m ie n to de secu en c ias ce rca de las p o s ic io n e s de in te rés.

EQUIVALENTES

A u n q u e en el p re sen te do cu m e n to se de sve lan e xp líc ita m e n te e jem p los e sp e c ífico s de las in ve n c io n e s en cuestión , la a n te r io r m em o ria d e sc rip tiva y los e je m p lo s del p re sen te d o cu m e n to son ilu s tra tivo s y no res tric tivos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una e n z im a tio e s te ra s a g e n o m a n ip u la d a q u e tra n s fo rm a un su s tra to de a c il-A C P C 10, C 12 o C 14 en un d e riva d o de ác ido g raso con una m a yo r ac tiv ida d en co m p a ra c ió n con la tio e s te ra sa de t ip o s ilve s tre que tie n e la secu en c ia de a m in o á c id o s p re se n ta d a com o S E C ID NO: 31, en dond e la t io e s te ra sa g e n o m a n ip u la d a

(a ) p rocede una t io e s te ra s a p re cu rso ra que com p ren de una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que es al m en os 90 % id én tica a la S E C ID NO: 31; y

(b) t ie n e una sus titu c ión co rre sp o n d ie n te a una sus titu c ión s e le cc io n a d a de:

i) D 45A , D 45C , D 45E , D45F, D 45G , D 45H , D45I, D 45K , D 45L , D 45M , D 45P , D 45Q , D 45S , D 45T , D45V, D 45W ;

ii) N 73A , N 73C , N 73G , N 73H , N 73I, N 73L, N 73P , N 73R , N 73S , N 73T , N 73V , N 73W ;

iii) G 78A , G 78C , G 78D , G 78E , G 78F, G 78M , G 78N , G 78P , G 78Q , G 78R , G 78S , G 78T , G 78V , G 78Y ; iv) Q 80A , Q 80E , Q 80G , Q 80L, Q 80M , Q 80S , Q 80W , Q 80Y ;

v ) E 101A , E 101D , E 101G , E 101L , E 101M , E 101P , E 101S , E 101T , E 101V ;

v i) R 108A , R 108C , R 108D , R 108E , R 108F , R 108G , R 108H , R 108 I, R 108L, R 108M , R 108R , R 108S , R 108V, R 108W , R 108Y ;

v ii) A 111C , A 111E , A 111L , A 111M , A 111N , A 111P , A 111Q , A 111R , A 111S , A 111V , A 111W , A 111Y ;

v iii) Y 117A , Y 117C , Y 117D , Y 117E , Y 117G , Y 117H , Y 1171 , Y 117L , Y 117M , Y 117N , Y 117P , Y 117Q , Y 117R , Y 117S , Y 117T , Y 117V , Y 117W ;

ix) N 118A , N 118C , N 118E , N 118F , N 118G , N 118H , N 118 I, N 118K , N 118L, N 118M , N 118P , N 118Q , N 118S, N 118T , N 118V , N 118W ;

x ) S 122A , S 122C , S 122D , S 122E , S 122F , S 122G , S 122I, S 122L , S 122M , S 122P , S 122R , S 122V , S 122W , S 122Y ;

x i) Y 145A , Y 145C , Y 145D , Y 145E , Y 145G , Y 145I, Y 145L , Y 145M , Y 145N , Y 145Q , Y 145R , Y 145S , Y 145T , Y 145W ;

x ii) Q 152A , Q 152D , Q 152E , Q 152F , Q 152H , Q 152I, Q 152K , Q 152L , Q 152N , Q 152R , Q 152S , Q 152T , Q 152V , Q 152Y ;

x iii) V 178A , V 178F , V 178G , V 178L , V 178R , V 178S , V 178T , V 178W ;

en la S E Q ID NO: 31, en do n d e la m e tio n in a es tá en la po s ic ió n 0 y la a la n in a es tá en la po s ic ió n 1 de la S E C ID NO: 31.

2. La t io e s te ra sa g e n o m a n ip u la d a de la re iv ind ica c ión 1, en donde: (a) el resto de am in o á c id o en la pos ic ión 45 es a la n in a o va lina ; (b) el res to de am in o á c id o en la po s ic ión 73 es c is te ín a o va lina ; (c) el res to de a m in o á c id o en la p o s ic ió n 78 es m e tio n ina ; (d) el res to de a m in o á c id o en la po s ic ió n 80 es trip tó fa n o ; (e ) el res to de a m in o á c id o en la po s ic ió n 101 es le uc ina , a lan ina o va lina ; (f) el res to de a m in o á c id o en la pos ic ión 108 es trip tó fa n o ; (g) el res to de a m in o á c id o en la po s ic ió n 111 es tiro s in a o tr ip tó fa no ; (h ) el res to de a m in o á c id o en la po s ic ión 117 es a rg in ina ; (i) el res to de a m in o á c id o en la po s ic ión 122 es a rg in ina ; (j) el resto de a m in o á c id o en la po s ic ió n 145 es a lan ina , c is te ína , ác ido a sp á rtico , ác ido g lu tám ico , iso leu c in a , leuc ina , m e tion ina , g lu tam ina , a rg in ina , se rin a o tre o n in a ; (k) el res to de a m in o á c id o en la po s ic ión 152 es a rg in ina ; o (I) el resto de a m in o á c id o en la po s ic ió n 178 es tre o n in a o trip tó fa no .

3. La t io e s te ra s a g e n o m a n ip u la d a de la re iv in d ica c ió n 2, en dond e el res to de a m in o á c id o en la po s ic ió n 73 es una c is te ín a , e l res to de a m in o á c id o en la p o s ic ió n 101 es leuc ina , e l res to de a m in o á c id o en la po s ic ió n 111 es tiros ina , el res to de a m in o á c id o en la pos ic ión 145 es c is te ína , o el resto de a m in o á c id o en la pos ic ión 178 es treon ina .

4. La t io e s te ra s a g e n o m a n ip u la d a de la re iv ind ica c ión 2, en dond e el res to de a m in o á c id o en la po s ic ión 111 es tiros ina , o el res to de a m in o á c id o en la pos ic ión 145 es c is te ína .

5. La t io e s te ra sa g e n o m a n ip u la d a de la re iv ind ica c ión 2, en donde el resto de am in o á c id o en 78 es m e tion ina , el res to de am in o á c id o en la pos ic ión 108 es tr ip tó fa no , o el res to de am in o á c id o en la pos ic ión 145 es c is te ín a o leucina.

6. Un po lin u c le ó tid o que cod ifica la t io e s te ra sa g e n o m a n ip u la d a según una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 5.

7. El po lin u c le ó tid o de la re iv ind ica c ión 6, en dond e la secu en c ia de p o lin u c le ó tid o s es al m en os 95 % id én tica a la S E C ID NO: 32.

8. Un v e c to r de exp res ión que co m p re n d e el po lin u c le ó tid o de la re iv ind ica c ión 6 o 7, un ido o p e ra tiva m e n te a un p rom otor.

9. U na cé lu la h o s p e d a d o ra q u e c o m p re n d e el p o lin u c le ó tid o de la re iv in d ica c ió n 6 o 7 o el v e c to r de e xp re s ió n de la re iv in d ica c ió n 8.

10. Un m é to d o pa ra p ro d u c ir una co m p o s ic ió n de d e riva d o s de á c id o s g ra sos C 10, C 12 o C 14, que co m p re n d e (a) c u ltiv a r la cé lu la h o spe da do ra de la re iv ind ica c ión 9 en co n d ic io n e s de cu ltivo ap ro p ia d a s para la exp res ión de la t io e s te ra sa ge no m a n ip u la d a , y (b) re cu p e ra r la co m p o s ic ió n de d e riva d o s de ác ido s grasos.