KR101334981B1 - 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 탄화수소의 제조방법 - Google Patents

탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 탄화수소의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알칸을 포함하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 알칸을 포함하는 탄화수소의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 알칸을 포함하는 탄화수소 생산에 적합하도록 개량된 미생물에 지방 아실-acp(fatty acyl-acp)를 유리 지방산(free fatty acid)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 유리 지방산(free fatty acid)을 지방 아실 CoA(fatty acyl- CoA)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 지방 아실 CoA(fatty acyl- CoA)을 지방 알데하이드(fatty aldehyde)으로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방 알데하이드(fatty aldehyde)를 알칸(alkane)으로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 변이 미생물 및 이를 이용하는 것을 특징으로 하는 알칸을 포함하는 탄화수소의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 변이 미생물은 추가적인 대사흐름 조작으로 인한 균주개량에 활용될 가능성이 크므로 알칸을 포함하는 탄화수소의 산업적 생산에 유용하다.

Description

탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 탄화수소의 제조방법 {Microorganism Variants Having Hydrocarbon Producing Ability and Method for Producing Hydrocarbon Using the Same}
본 발명은 알칸을 포함하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 알칸을 포함하는 탄화수소의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 알칸을 포함하는 탄화수소 생산에 적합하도록 개량된 미생물에 지방 아실-acp(fatty acyl-acp)를 유리 지방산(free fatty acid)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 유리 지방산(free fatty acid)를 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)를 지방 알데하이드(fatty aldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방 알데하이드(fatty aldehyde)를 알칸(alkane)으로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 변이 미생물 및 이를 이용하는 것을 특징으로 하는 알칸을 포함하는 탄화수소의 제조방법에 관한 것이다.
최근 고유가와 환경 문제로 인해 미생물을 이용한 바이오연료 생산이 큰 관심을 끌고 있다. 최근 바이오 연료가 화석 연료의 대체 연료로 부상하면서 시장 규모가 매우 빠른 속도로 증가하고 있다. 특히, 알칸은 에너지 밀도, 휘발성 제어, 충분한 옥탄가, 낮은 불순물 등 연료로서 적합한 특성을 가지며, 에탄올 보다 에너지 효율이 높고 휘발유와 더욱 잘 섞이며, 기존의 송유관이나 자동차 엔진 등을 그대로 사용할 수 있다는 장점을 지니고 있다. 따라서, 대체연료로 가장 적합한 알칸을 미생물을 이용하여 대량 생산한다면, 원유 수입 대체 효과 및 온실 가스 배출 감소로 인한 환경적 효과 등을 가져올 수 있다.
현재 상용화되어 있는 휘발유는 한 분자 내에 6개~10개의 탄소를 가지고 있으며, 탄소와 탄소가 직접 연결되어 있는 선형 구조의 탄화수소 화합물인데 직선형과 가지가 있는 형태가 공존한다. 또한 kg당 대략 40MJ의 에너지를 함유하고 있으며 상온, 상압에서 증발하기 쉽고 현저한 인화성을 가진다. 휘발유에서 가장 핵심이 되는 요소는 옥탄가(octane number)이다. 가지가 많은 구조를 갖는 몇몇 탄화수소는 자동차 엔진에서 좀더 부드럽게 연소되는 반면, 가지가 없는 탄소 사슬을 가진 탄화수소는 실린더에서 폭발하여 피스톤을 격렬하게 움직이게 하는 성향이 있으며 이러한 바람직하지 못한 폭발은 자동차에서 노킹현상을 초래하는데 이런 노킹성질을 정량화하는 척도로 가지가 많은 구조를 가진 우수한 연료인 이소옥테인(isooctane:2,2,4-trimethylpentane)을 옥탄가 100으로 잡고, 저질 자동차 연료인 헵테인(heptane)을 옥탄가 0으로 정하는데, 보통의 가솔린은 옥탄가가 87정도이다. 그렇기 때문에 이소옥테인(isooctane)과 같이 가솔린에서 핵심적인 물질인 가지가 많은 탄화수소를 대량생산하는 것이 주요할 것으로 전망되고 있다.
보통 원유(crude oil)에서 가솔린이 차지하는 비율은 단지 25%인데, 이 부분이 연료로서 가장 많이 쓰이는 중요한 부분이다. 따라서 석유화학공장에서는 가솔린의 생산량을 높이기 위하여 끓는점이 높은 부분인 C12에서 C18를 크레킹(Cracking)이란 공정을 통해서, 탄소 수가 적고 끓는점이 낮은 부분으로 생성된다. 이런 관점에서 직접적인 방법으로 가솔린, 즉 C5 에서 C12에 해당하는 물질을 생산하는 방법 외에도 간접적으로 케로신이나 경유에 해당하는 비교적 탄소가 더 많은 물질을 생산했다면, 이를 기존의 정유공장에서의 열적, 촉매적 크레킹(cracking)을 이용해 개질(reforming)할 수 있음을 의미하는 것이다. 미생물을 이용한 탄화수소(hydrocarbons)의 생산 연구는 해양세균(marine bacteria)와 조류(algae)의 세포로부터 탄화수소 유사물질(hydrocarbon-like substances)를 분리(isolation)시키는 연구를 시작으로 가스-액체 크로마토그래피(gas-liquid chromatography)의 발전으로 인해 점차 늘어나기 시작하였다. 미생물을 이용한 탄화수소 생산 연구는 크게 두 가지로 분류할 수 있다. 하나는 세포 내 탄화수소 조성(Intracellular hydrocarbons of microorganism)에 관한 방법이고, 다른 하나는 세포 밖 탄화수소 조성(Extracellular hydrocarbons of microorganism)에 관한 방법이다. 세포 내 생산과 관련하여 미생물의 시스템 그룹(systematic groups)이 매우 다양한데, 보통 건조 질량(dry mass) 기준 0.005에서 2.69% 정도의 수치를 보인다. 이 방법을 통해 탄화수소을 생산할 수 있는 균주로는 시아노 박테리아(cyanobacteria), 혐기성 광 합성 세균(anaerobic phototrophic bacteria), 그람 음성 혐기성 황산환원성 세균(gram-negative anaerobic sulfate-reducing bacteria), 그람 음성 특이적 혐기성 세균(gram-negative facultatively anaerobic bacteria), 효모(yeasts), 균류(fungi) 등이 있는데, 각각의 균주마다 다양한 프로파일(profiles)의 탄화수소를 만들어 낼 수 있으며 프렉션(fraction) 및 프레도미넌스(predominance)가 독특한 특징을 보인다. 세포 밖 생산 관련한 연구 중에서, 롱체인 탄화수소(Long-chain hydrocarbons)의 생산능이 있는 균주로 데술포비브리오(Desulfovibrio)와 클로스트리듐(Clostridium)이 있고, Volatile non-methane hydrocarbons인 이소프렌(isoprene)의 생산능이 있는 균주로 액티노미케테스(actinomycetes), 에틸렌(ethylene)의 생산능이 있는 균주로 아스페르길루스 클라바투스(Aspergillus clavatus) 등이 알려졌다.
따라서, 미생물을 이용한 탄화수소의 산업적인 응용이 가능한 균주 중에서 배양조건 최적화 연구와 탄화수소와 관련된 유전자 및 효소 등 핵심물질연구, 이에 따른 대사흐름에 관한 연구가 진행되고 있다. 그러나 유전자 및 효소 등을 심도 있게 분석하여 대사공학을 적용하는 연구는 충분한 연구가 진행되지 않은 실정이다. 그러므로 산업적 응용이 가능한 균주를 선별하고 목적 탄화수소(target hydrocarbons)생산 관련 유전자를 분석하고, 이들 균주로부터 대사흐름 관련 효소를 분리하여 탄화수소 생산 공정의 최적화를 통해 생산성을 높이려는 보다 근본적인 접근이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 미생물을 이용하여 알칸을 포함하는 탄화수소를 생산하는 새로운 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 지방산(fatty acid)을 기질(substrate)로 하여 알칸으로 전환시키는 대사회로를 새로이 구성하여 알칸을 포함하는 탄화수소 생산에 적합하도록 개량된 변이 미생물을 제작하고, 상기 변이 미생물이 펜타데칸(pentadecane),헵타데칸(heptadecane)을 포함한 가솔린 범위의 알칸(alkane)인 옥테인(octane), 노네인(nonane) 및 노닌(nonene) 생산 등 알칸 생성에 유용하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 알칸을 포함하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이 미생물을 이용한 알칸을 포함하는 탄화수소의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아실 코엔자임 A 디하이드로게나제(acyl coenzyme A dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 DNA-바인딩 전사 듀얼 조절자(DNA-binding transcriptional dual regulator)를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 지방 아실-acp(fatty acyl-acp)를 유리 지방산(free fatty acid)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 유리 지방산(free fatty acid)를 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)를 지방 알데하이드(fatty aldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방 알데하이드(fatty aldehyde)를 알칸(alkane)으로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물 및 그 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 변이 미생물을 배양하여 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소를 생성시킨 다음, 배양액으로부터 탄화수소를 회수하는 것을 특징으로 하는, 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 알칸을 포함하는 탄화수소 생산에 적합하도록 변이시킨 미생물에, 알칸을 제조하는 데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입한 변이 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 변이 미생물은 추가적인 대사흐름 조작으로 인한 균주개량의 가능성이 크므로 알칸을 포함하는 탄화수소의 산업적 생산에 유용하다.
도 1은 알칸을 포함하는 탄화수소 생산에 적합하도록 지방산 대사회로(fatty acid metabolism)가 개량된 미생물에서 알칸을 생합성하는 대사회로를 나타낸 것이다.
도 2는 pTrc99a_luxC_tac_tesA 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 3은 pTac15k_atoDAE_tac_CER1 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 4는 개량된 균주에서 생산된 가솔린 범주 내의 탄화수소를 나타낸다.
도 5는 pTac15k의 개열지도를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 아실 코엔자임 A 디하이드로게나제(acyl coenzyme A dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 DNA-바인딩 전사 듀얼 조절자(DNA-binding transcriptional dual regulator)를 코딩하는 유전자가 결실 또는 약화되어 있고, 지방 아실-acp(fatty acyl-acp)를 유리 지방산(free fatty acid)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 유리 지방산(free fatty acid)를 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)를 지방 알데하이드(fatty aldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방 알데하이드(fatty aldehyde)를 알칸(alkane)으로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물에 관한 것이다.
상기 변이 미생물에 있어서, 알칸을 포함하는 탄화수소의 생성능을 증가시키기 위하여 아실-CoA 신세타제(acyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자의 네이티브 프로모터(native promoter) 및 롱-체인 지방산 외막 트랜스포터(long-chain fatty acid outer membrane transporter)를 코딩하는 유전자의 에테뉴에이터(attenuator)를 포함하는 네이티브 프로모터(native promoter)를 강력한 프로모터(strong promoter)로 추가적으로 치환하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 쇼트-체인 지방산 외막 트랜스포터(short-chain fatty acid outer membrane transporter)를 코딩하는 유전자가 추가적으로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 변이 미생물에 있어서, 알칸을 포함하는 탄화수소의 생성능을 증가시키기 위하여 fabDHG (fabD: malonyl-CoA-[acyl-carrier-protein] transacylase; fabG : 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] reductase; fabH : 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase III) 오페론(operon)의 네이티브 프로모터(native promoter) 및 fabA (beta-hydroxydecanoyl thioester dehydrase) 의 네이티브 프로모터(native promoter)를 강력한 프로모터(strong promoter)로 추가적으로 치환하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 변이 미생물은 아세테이트 키나제 A(acetate kinase A) 효소를 코딩하는 유전자(ackA)가 추가적으로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 여기서 박테리아는 지방산 대사회로를 갖는 박테리아일 수 있는데, 바람직하게는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 대장균인 것을 특징으로 할 수 있고, 글루코즈를 탄소원으로 사용할 수 있는 미생물이면 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 아실 코엔자임 A 디하이드로게나제(acyl coenzyme A dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 fadE 유전자인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 DNA-바인딩 전사 듀얼 조절자(DNA-binding transcriptional dual regulator)를 코딩하는 유전자는 fadR 인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 아실-CoA 신세타제(acyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자는 fadD 인 것을 특징으로 할 수 있고, 추가적으로 도입될 수 있는 쇼트-체인 지방산 외막 트랜스포터(short-chain fatty acid outer membrane transporter)를 코딩하는 유전자는 atoE인 것을 특징으로 할 수 있다. 한편, 상기 롱-체인 지방산 외막 트랜스포터를 코딩하는 유전자는 fadL 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 지방 아실-acp(fatty acyl-acp)를 유리 지방산(free fatty acid)로 전환시키는 효소는 아실-CoA 티오에스테라아제(acyl-CoA thioesterase)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 유리 지방산(free fatty acid)에 CoA를 붙이는 효소는 Escherichia coli 유래의 아세틸-CoA(acetyl-CoA): 아세토아세틸-CoA 트렌스퍼라제(acetoacetyl-CoA transferase) 또는 아실-CoA 신세타제(acyl-CoA synthetase) 인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)를 지방 알데하이드(fatty aldehyde)로 전환시키는 효소는 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyberi) 유래의 지방 아실-CoA 리덕타아제(fatty acyl-CoA reductase)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 지방 알데하이드(fatty aldehyde)를 알칸(alkane)으로 전환시키는 효소는 애기장대(Arabidopsis thaliana col.) 유래의 지방 알데하이드(fatty aldehyde) decarbonylase 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 지방 아실-acp(fatty acyl-acp)를 유리 지방산(free fatty acid)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 tesA(acyl-CoA thioesterase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 유리 지방산(free fatty acid)에 CoA를 붙이는 효소를 코딩하는 유전자는 atoDA 또는 fadD(acyl-coA synthetase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서, atoDA는 atoD(acetyl-CoA : acetoacetyl-CoA transferase alpha subunit)와 atoA(acetyl-CoA : acetoacetyl-CoA transferase beta subunit)로 이루어진다.
상기 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)를 지방 알데하이드(fatty aldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 luxC(fatty acyl-CoA reductase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 지방 알데하이드(fatty aldehyde)를 알칸(alkane)으로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 cer1(fatty aldehyde decarbonylase 1을 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 변이 미생물에 도입되는 재조합 벡터는 강력한 프로모터(strong promoter)를 포함하는 것으로서, luxC, cer1, tesA, atoDAE 유전자를 함유하는 벡터인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 재조합 벡터는 pTrc99a_luxC_tac_tesA, pTac15k_atoDAE_tac_CER1 벡터인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 강력한 프로모터(strong promoter)는 trc 프로모터(trc promoter), tac 프로모터(tac promoter), T7 프로모터(T7 promoter), lac 프로모터(lac promoter) 및 trp 프로모터(trp promoter)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 쓰이는 강력한 프로모터(strong promoter)를 모두 포함할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 아실 코엔자임 A 디하이드로게나제(acyl coenzyme A dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 DNA-바인딩 전사 듀얼 조절자(DNA-binding transcriptional dual regulator)를 코딩하는 유전자를 결실 또는 약화시키고, 지방 아실-acp(fatty acyl-acp)를 유리 지방산(free fatty acid)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 유리 지방산(free fatty acid)를 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자, 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)를 지방 알데하이드(fatty aldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 및 지방 알데하이드(fatty aldehyde)를 알칸(alkane)으로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자를 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법에 관한 것이다.
상기 변이 미생물의 제조방법에 있어서, 알칸을 포함하는 탄화수소의 생성능을 증가시키기 위하여 acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자의 네이티브 프로모터(native promoter) 및 롱-체인 지방산 외막 트랜스포터를 코딩하는 유전자의 에테뉴에이터(attenuator)를 포함하는 네이티브 프로모터(native promoter)를 강력한 프로모터(strong promoter)로 추가적으로 치환시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 더불어 쇼트-체인 지방산 외막 트랜스포터(short-chain fatty acid outer membrane transporter)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 도입시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 변이 미생물의 제조방법에 있어서, 알칸을 포함하는 탄화수소의 생성능을 증가시키기 위하여 fabDHG(fabD: malonyl-CoA-[acyl-carrier-protein] transacylase; fabG : 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] reductase; fabH : 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase III) 오페론(operon)의 네이티브 프로모터(native promoter) 및 fabA(beta-hydroxydecanoyl thioester dehydrase) 오페론(operon)의 네이티브 프로모터(native promoter)를 강력한 프로모터(strong promoter)로 추가적으로 치환시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
더불어, 상기 변이 미생물의 제조방법에 있어서, 아세테이트 키나제 A(acetate kinase A) 효소를 코딩하는 유전자(ackA)를 추가적으로 결실시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물을 배양하여 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소를 생성시킨 다음, 배양액으로부터 탄화수소를 회수하는 것을 특징으로 하는 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 지방산을 알칸으로 전환시키는 대사회로를 새로이 구성하여, 알칸을 포함하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하고, 제조된 변이 미생물이 알칸을 포함하는 탄화수소를 생산할 수 있는지 확인하였다.
본 발명에 따른 알칸을 포함하는 탄화수소 생산에 적합한 변이 미생물은 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)를 스몰 체인 지방 아실-CoA(small chain fatty acyl-CoA)로 전환시키는 효소인 fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase) 유전자 및 지방산 대사회로(fatty acid metabolism)에 관여하는 효소들의 유전자들을 조절하는 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator) 유전자를 약화 또는 결실시킴으로써 얻어진다. 또한, 지방산(fatty acid)에 CoA를 붙이는 fadD(acyl-CoA synthetase) 유전자 및 외부의 fatty acid를 uptake하는 데 관여하는 fadL(long-chain fatty acid outer membrane transporter) 유전자의 프로모터를 강력한 프로모터로 치환시킴으로써 얻어진다.
본 발명에 따른 변이 미생물을 이용하여 알칸을 생산하는 것은, 글루코즈로부터 전환된 지방 아실-acp(fatty acyl-acp)이 티오에스테라아제(thioesterase)에 의해 유리 지방산(free fatty acid)로 전환되고, 지방산은 아실-CoA 신세타제(acyl-CoA synthetase)에 의해 지방 아실-CoA(fatty acy-CoA)로 전환된 다음, 지방 아실-CoA 리덕타아제(fatty acyl-CoA reductase)에 의해 지방 알데히드(fatty aldehyde)로 전환되고 지방 알데히드 디카르보닐레이즈(fatty aldehyde decarbonylase)에 의해 알칸(alkane)으로 전환되는 것으로 추정할 수 있다 (도 1).
본 발명의 일 실시예에서는, 알칸을 포함하는 탄화수소의 생산에 적합한 변이 미생물을 제조하기 위하여 대장균 W3110에서 fadE ( acyl coenzyme A dehydrogenase) 유전자 및 fadR( DNA - binding transcriptional dual regulator) 유전자를 결실시켰다.
글로벌 레귤레이터(global regulator)인 fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator) 유전자는 지방산 대사회로(fatty acid metabolism)에 관여하는 대부분의 유전자를 조절하는 기능을 한다. 글루코즈와 같은 탄소원이 있는 경우에는 fadR 유전자가 지방산 대사회로(fatty acid metabolism)에 관여하는 대부분의 유전자들을 강하게 억제(repression)하고 있는 반면, 글루코즈와 같은 탄소원이 없는 경우에는 fadR이 억제하고 있던 모든 유전자들을 release시키고 지방산을 분해할 수 있게 된다. 따라서, 글루코즈와 같은 탄소원이 있는 조건에서는 fadR 유전자가 지방산 대사회로(fatty acid metabolism)에 관여하는 유전자들을 강하게 억제(repression)함으로써 지방산의 분해가 이루어지지 않기 때문에, 본 발명에서는 fadR 유전자를 결실시킴으로써 글루코즈가 존재하는 조건에서도 지방산의 분해가 이루어질 수 있도록 개량하였다.
fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase) 유전자는 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)를 스몰 체인 지방 아실-CoA(small chain fatty acyl-CoA) 형태인 아세틸-CoA(acetyl-CoA)로 전환시키므로, fadE 유전자를 결실시킴으로써 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)가 아세틸-CoA(acetyl-CoA)로 전환되지 않고 지방 아실 알데하이드(fatty acyl aldehyde)로 전환될 수 있도록 개량하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA) 로부터 지방 알데하이드(fatty aldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 luxC(fatty acyl CoA reductase을 코딩하는 유전자)가 클로닝된 ptrc99a_luxC_tac_CER1 벡터와 지방 아실-acp(fatty acyl-acp)를 유리 지방산(free fatty acid)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 tesA(acyl-CoA thioesterase 를 코딩하는 유전자) 및 지방 알데하이드(fatty aldehyde)를 알칸(alkane)으로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자 cer1(fatty aldehyde decarbonlyase 1을 코딩하는 유전자)가 클로닝된 pTac15k_atoDAE_tac_cer1를 제작한 후, 이를 상기 변이 미생물에 도입시킴으로써 알칸 생성능을 가지는 변이 미생물(WERPLD3110+ptrc99a_luxC_tac_tesA +pTac15k_atoDAE_tac_CER1)을 제작하였다.
또한, 본 발명의 실시예에서는 본 발명에 따라 제조된 변이 미생물을 배양하여 펜타데칸(pentadecane),헵타데칸(heptadecane)을 포함한 가솔린 범위의 알칸(alkane)인 옥테인(octane), 노네인(nonane) 및 노닌(nonene)을 생산하는 것만을 확인하였으나, 펜타데칸 및 헵타데칸 이외에도 미생물에서 생합성 가능한 다양한 탄소를 가진 지방산(fatty acid)로부터 포화, 불포화 탄화수소를 생산할 수 있고, 미생물에서 생합성 가능한 다양한 탄소를 가진 지방산(fatty acid)로부터 생산 가능한 포화, 불포화 탄화수소로는 데칸(decane), 언데칸(undecane), 트리데칸(tridecane) 등을 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 변이 미생물의 배양 및 회수과정은 통상적으로 알려진 배양방법을 사용하여 수행될 수 있고, 본 발명의 실시예에서 사용된 특정 배지 및 특정 배양방법 이외에도 유청(whey), CSL(corn steep liquor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용할 수 있고, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용할 수 있다(Lee et al ., Bioprocess Biosyst . Eng ., 26: 63, 2003; Lee et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 58: 663, 2002; Lee et al ., Biotechnol . Lett., 25: 111, 2003; Lee et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 54: 23, 2000; Lee et al ., Biotechnol . Bioeng ., 72: 41, 2001).
본 발명에서 "탄화수소"란 탄소와 수소로만 이루어져 있는 유기화합물을 통틀어 일컫는 개념으로, 분자구조에 따라 고리모양의 탄화수소와 사슬모양의 탄화수소로 대별되고, 단일결합만으로 구성되어진 포화탄화수소와 이중결합 또는 삼중결합을 함유하고 있는 불포화탄화수소로 구별된다.
본 발명에서 "약화"란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나 일부 염기를 도입시켜 해당유전자에 의해 발현되는 효소의 활성을 감소시키는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로의 일부 또는 상당부분을 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 "결실"이란 해당 유전자의 일부 또는 전체 염기를 변이, 치환 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시켜 해당유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로 해당유전자의 효소가 관여하는 생합성 경로를 차단하는 모든 것을 포함한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 대장균 W3110을 숙주 미생물로 이용하였으나, 다른 대장균이나, 박테리아, 효모 및 곰팡이를 사용하더라도 글루코즈를 탄소원으로 사용할 수 있는 한, 이에 국한되지 않는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다. 또한, 하기 실시예에서는 도입 대상 유전자로 특정 균주 유래의 유전자만을 예시하였으나, 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 그 제한이 없다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
1-1: fadE 유전자의 결실 (WE3110의 제작)
대장균 W3110(ATTC 39936)에서 서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용한 원스텝 불활성(one step inactivation) 방법(Warner et al., PNAS, 6; 97(12): 6640-6645, 2000)을 이용하여, fadE(acyl coenzyme A dehydrogenase) 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.
[서열번호 1] WfadE k/o F :
5'-atgatgattttgagtattctcgctacggttgtcctgctcggcgcgttgttgtgtaggctggagctgcttc -3`
[서열번호 2] WfadE k/o R:
5`-actgggcataagccgagaactccagcccgccgtactcttttttgatgatccatatgaatatcctccttag -3`
1-2: fadR 유전자의 결실 (WER3110의 제작)
실시예 1-1에서 제작된 대장균 WE3110에서, 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용한 원스텝 불활성(one step inactivation) 방법(Warner et al., PNAS, 6; 97(12): 6640-6645, 2000)을 이용하여, fadR(DNA-binding transcriptional dual regulator)유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.
[서열번호 3] WfadR k/o F:
5'-atggtcattaaggcgcaaagcccggcgggtttcgcggaagagtacattatgtgtaggctggagctgcttc-3'
[서열번호 4] WfadR k/o R:
5'-ccggattggcgaaatagtgacgaccaatacgcgtatacagccctttcatcCATATGAATATCCTCCTTAG-3'
1-3: fadD 의 네이티브 프로모터(native promoter)를 tac 프로모터(tac promoter)로 치환(WERPD3110의 제작)
실시예 1-2에서 제작된 대장균 WER3110에서, fadD 유전자의 발현을 강하게 하기위해 강력한 프로모터인 tac 프로모터(tac promoter)로 치환하였다.
이를 위해, 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용해 상기 유전자 제거와 동일한 방법으로, 네이티브 프로모터(native promoter)를 tac 프로모터(tac promoter)로 치환하였다.
[서열번호 5] WfadDpch F:
5'-gtataatcccggccccgcgagagtacaaacagttgtaactgaataattgcCGCGTCATACACATACGATT-3'
[서열번호 6] WfadDpch R:
5'-ttgatctccgtcggaacgtccgcgggataacggttaagccaaaccttcttCATGGTCTGTTTCCTGTGTG-3'
1-4: fadL 의 네이티브 프로모터(native promoter)에 있는 어테뉴에이터 서열(attenuator sequence)의 tac 프로모터(tac promoter)로 치환(WERPDL3110의 제작)
실시예 1-3에서 제작된 대장균 WERPD3110에서, fadD promoter 상에 위치하는 전사조절 기작에 관여하는 어테뉴에이터 서열(attenuator sequence)를 강력한 프로모터인 tac 프로모터(tac promoter)로 치환하였다.
어테뉴에이터 서열(attenuator sequence)의 치환을 위해, 서열번호 7 및 8의 프라이머를 이용해 상기 유전자 제거와 동일한 방법으로, 에테뉴에이터(attenuator)를 포함하는 네이티브 프로모터(native promoter)를 tac 프로모터(tac promoter)로 치환하였다.
[서열번호 7] WfadLpch F:
5'-gaaagtgctgctccagttgttaattctgcaaaatcggataagtgaccgaaCGCGTCATACACATACGATT-3'
[서열번호 8] WfadDLpch R:
5'-actgcgactgcgagagcagactttgtaaacagggttttctggctcatgacCATGGTCTGTTTCCTGTGTG-3'
1-5: ackA 유전자의 결실 (WERAPDL3110의 제작)
실시예 1-4에서 제작된 대장균 WE3110에서, 서열번호 9 및 10의 프라이머를 이용한 원스텝 불활성(one step inactivation) 방법(Warner et al., PNAS, 6; 97(12): 6640-6645, 2000)을 이용하여, ackA(acetate kinase A)유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.
[서열번호 9] WackA k/o F:
5'-atgtcgagtaagttagtactggttctgaactgcggtagttcttcactgaaTAGGTGACACTATAGAACGCG-3'
[서열번호10] WackA k/o R:
5'-tgccgtgcgcgccgtaacgacggatgccgtgctctttgtacaggttgtaaTAGTGGATCTGATGGGTACC-3’
1-6: fabHDG 오페론(operon) 의 네이티브 프로모터(native promoter)를 trc 프로모터(trc promoter)로 치환(WERAPDLB3110의 제작)
실시예 1-5에서 제작된 대장균 WERAPLD3110에서, fabHDG 오페론(operon)으로 이루어진 유전자의 발현을 강하게 하기위해 강력한 프로모터인 trc 프로모터(trc promoter)로 치환하였다.
이를 위해, 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용해 상기 유전자 제거와 동일한 방법으로, 네이티브 프로모터(native promoter)를 trc 프로모터(trc promoter)로 치환하였다.
[서열번호 11] WfabHDGpch F:
5'-gtggtggctactgttattaaagcgttggctacaaaagagcctgacgaggcCGCGTCATACACATACGATT-3'
[서열번호 12] WfabHDGpch R:
5'-gtccgcacttgttcgggcagatagctgccagtaccaataatcttcgtataCATGGTCTGTTTCCTGTGTG-3’
1-7: fabA 오페론(operon) 의 네이티브 프로모터(native promoter)를 trc 프로모터(trc promoter)로 치환(WERAPDLBA3110의 제작)
실시예 1-6에서 제작된 대장균 WERAPLDB3110에서, fabA 오페론(operon)으로 이루어진 유전자의 발현을 강하게 하기위해 강력한 프로모터인 trc 프로모터(trc promoter)로 치환하였다.
이를 위해, 서열번호 13 및 14의 프라이머를 이용해 상기 유전자 제거와 동일한 방법으로, 네이티브 프로모터(native promoter)를 trc 프로모터(trc promoter)로 치환하였다.
[서열번호 13] WfabApch F:
5'-accgttttccatggccattacgttggctgaactggtttattccgaactgaCGCGTCATACACATACGATT-3'
[서열번호 14] WfabApch R:
5'-gcgaccagaggcaagaaggtcttcttttgtataggattcgcgtttatctacCATGGTCTGTTTCCTGTGTG-3'
2-1: pTrc99a_luxC 벡터의 제작
클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyberi) 균주(DSMZ, no.552, German)의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 15와 16의 프라이머로 PCR을 수행하여, fatty acyl CoA reductase를 코딩하는 luxC 유전자 절편을 제작하였다.
[서열번호 15] cklluxC F:
5'-TATAGGTACCATGATAGATTGTTATTCATTGGATG-3'
[서열번호 16] cklluxC R:
5'-TATTGGATCCTTAAATATTTAGACTACACCACGTT-3'
다음으로, 상기 제조된 luxC 절편을 trc 프로모터의 강한 유전자 발현을 진행하는 pTrc99a 플라스미드(Phamacia, Biotech, Uppsala, Sweden)에 제한효소(KpnI 및 BamHI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 luxC절편 및 pTrc99a 플라스미드를 접합시킴으로써, 복제율이 높은(high copy number) 재조합 플라스미드인 pTrc99a_luxC 를 제작하였다
2-2: pTrc99a_luxC_tac_tesA 벡터의 제작
야생형 E.coli (Escherichia coli W3110) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 17와 18의 프라이머로 PCR을 수행하여, 아실-CoA 티오에스테라아제(acyl-CoA thioesterase)를 코딩하는 tesA 유전자 절편을 제작하였다.
[서열번호 17] tesA F:
5'-TATAGAATTCATGATGAACTTCAACAATGT-3'
[서열번호 18] tesA R:
5'-TATTGAGCTCTTATGAGTCATGATTTACTA-3'
다음으로, 상기 제조된 tesA 절편을 trc 프로모터의 강한 유전자 발현을 진행하는 pTrc99a 플라스미드(Phamacia, Biotech, Uppsala, Sweden)에 제한효소(EcoRI 및 SacI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 tesA절편 및 pTrc99a_luxC 플라스미드를 접합시킴으로써, 복제율이 높은(high copy number) 재조합 플라스미드인 pTrc99a_luxC_tac_tesA 를 제작하였다
2-3: pTac15k_atoDAE_tac_CER1 벡터의 제작
pKK223-3(Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)의 trc 프로모터와 전사 터미네이터(trascription terminator) 부분을 pACYC177(NEB, Beverly, MA, USA)에 삽입하여 pTac15K를 제작하였다. pTac15K는 구성적(constitutive) 발현을 위한 발현벡터로, 도 5의 개열지도에 나타난 구성을 가지고 있다. 애기장대(Arabidopsis thaliana col.) 염색체의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 19와 서열번호 20의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이로부터 확보된 CER1 절편을 상기 pTac15k(p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBEL stock, tac 프로모터(tac promoter), 4.0-kb, lap stock)(Zhi-Gang Qian et al., Biotechnology and Bioengineering, 104: 651-654, 2009 and Hiszczyn' ska-Sawicka and Kur, 1997) 플라스미드에 제한효소(SacI 및 kpnI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 CER1 절편 및 pTac15k 플라스미드를 접합시킴으로써, pTac15k_CER1 를 제작하였다.
다음으로, 애기장대(Arabidopsis thaliana col.) 염색체의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 21과 서열번호 22의 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다.
이로부터 확보된 fatB 절편을 pTac15k_CER1 플라스미드에 제한효소(XbaI과 SphI)를 처리한 후, T4 DNA 라이게이즈를 처리하여, 제한효소로 절단된 atoDAE 절편 및 pTac15k_CER1 플라스미드를 접합시킴으로써, pTac15k_atoDAE_tac_CER1 를 제작하였다. 이에 사용된 프라이머쌍들의 염기서열은 아래와 같다.
[서열번호 19] CER1F: 5'-TATAGAGCTCATGGCCACAAAACCAGGAGTCCTCACC-3'
[서열번호 20] CER1R: 5'-TATTGGTACCTTAATGATGTGGAAGGAGGAGAGGC-3'
[서열번호 21] atoDAEF: 5'-GCCATCTAGAATGAAAACAAAATTGATGAC-3'
[서열번호 22] atoDAER: 5'-TATTGCATGCTCAGAACAGCGTTAAACCAA-3'
변이 미생물의 알칸 생성능의 측정
실시예 2-2 및 2-3에서 제작된 pTrc99a_luxC_tac_tesA 및 pTac15k_atoDAE_tac_CER1 플라스미드를 실시예 1-7에서 알칸 생성에 적합하도록 제작한 WERAPDLBA3110에 도입하여 변이 미생물을 제조하였으며, 대장균 W3110(ATTC 39936)을 대조군 균주로 사용하였다. 알칸 생성능을 가지는 변이 미생물들을 엠피실린(ampicillin) 및 카나마이신(kanamycin)이 각각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖ 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주를 10㎖ LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼낸 100㎖ LB를 함유한 250㎖ 플라스크에 글루코즈 (5g/L)를 첨가하고 상기 전배양액 1㎖을 접종하여, 31℃에서 10시간 배양하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g glucose, 13.5g KH2PO4, 4.0 g (NH4)2HPO4, 1.7g citric acid, 1.4g MgSO4ㆍ7H2O, 3g yeast extract, 10㎖ trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO4ㆍ7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.5g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.23g Na2B4O7ㆍ10H2O, 35% HCl 10㎖ 함유)의 성분으로 구성된 배지 2.0 리터를 함유한 5.0 리터 발효기(LiFlus GX, Biotron Inc., Korea)를 121℃에서 15분간 멸균한 후 실온까지 온도를 낮추었다. 1mM의 IPTG를 사용하여 도입 혹은 engineering한 유전자의 발현을 유도하였고, 배양액의 pH는 50%(v/v) NH4OH의 자동 공급(automatic feeding)에 의해 6.8로 유지하였다.
상기 배지중의 글루코즈를 glucose analyzer(STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 글루코즈가 모두 소모되었을 때 세포를 회수하여 증류수로 한 번 씻어낸 후 100 ℃의 건조기에서 24시간 건조하였다. 후에 건조된 균주에 클로로포름(chloroform) 2ml을 첨가하고, 3% (v/v) H2SO4 를 포함하는 메탄올 1 ml 을 첨가한 후, 이 혼합물을 100 ℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 혼합물을 상온까지 식히고, 혼합물에 증류수 1ml을 첨가하여 5분 동안 격렬히 섞어 주어, 유기용매(chloroform) 층과 물(수용액) 층이 분리시키고, 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여, 유기용매 층만 채취하여 가스크로마토그래피(gas chromatography) 분석을 수행함으로써, 생성된 알칸을 측정하였다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 야생형 대장균 W3110에서는 알칸이 생성되지 않은 반면, 본 발명에 따른 변이 미생물에서는 펜타데칸(pentadecane) 및 헵타데칸(heptadecane)이 각각 25mg/L 및 40mg/L 및 가솔린 범위의 알칸(alkane)인 옥테인(octane), 노네인(nonane)그리고 노닌(nonene)이 각각 0.11564 g/L, 0.475 g/L 그리고 0.12276 g/L가 생산되었다.
이 결과로부터, 본 발명에 따른 변이 미생물이 가솔린 범위의 알칸을 성공적으로 생성함을 확인하였다.
변이 미생물의 알칸 생산량(mg/L)
Strain pentadecane
(mg/L)		 heptadecane
(mg/L)		 octane
(mg/L)		 nonane
(mg/L)		 nonene
(mg/L)
W3110 ND1 ND1 ND1 ND1 ND1
WERPLD3110 + pTrc99a_luxC_tac_tesA + pTac15k_atoDAE_tac_CER1 25 40 115.64 475 122.76
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (36)

  1. 당으로부터 지방 아실-acp(fatty acyl-acp) 합성 대사회로를 가지는 미생물에서, (a) 아실 코엔자임 A 디하이드로게나제(acyl coenzyme A dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 DNA-바인딩 전사 듀얼 조절자(DNA-binding transcriptional dual regulator)를 코딩하는 유전자가 결실 또는 약화되어 있고, (b) (i) 지방 아실-acp(fatty acyl-acp)를 유리 지방산(free fatty acid)으로 전환시키는 효소(acyl-CoA thioesterase)를 코딩하는 유전자, (ii) 유리 지방산(free fatty acid)을 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)로 전환시키는 효소(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase 또는 acyl-coA synthetase)를 코딩하는 유전자, (iii) 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)를 지방 알데하이드(fatty aldehyde)로 전환시키는 효소(fatty acyl-CoA reductase)를 코딩하는 유전자 및 (iv) 지방 알데하이드(fatty aldehyde)를 알칸(alkane)으로 전환시키는 효소(fatty aldehyde decarbonylase)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 아실-CoA 신세타제(acyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자의 네이티브 프로모터(native promoter) 및 롱-체인 지방산 외막 트랜스포터(long-chain fatty acid outer membrane transporter)를 코딩하는 유전자의 어테뉴에이터(attenuator)를 포함하는 네이티브 프로모터(native promoter)가 강력한 프로모터(strong promoter)로 추가적으로 치환되어 있고, 쇼트-체인 지방산 외막 트랜스포터(short-chain fatty acid outer membrane transporter)를 코딩하는 유전자가 추가적으로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  3. 제1항에 있어서, fabDHG 오페론(operon)의 네이티브 프로모터(native promoter) 및 fabA 오페론(operon)의 네이티브 프로모터(native promoter)가 강력한 프로모터(strong promoter)로 추가적으로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 아세테이트 키나제 A(acetate kinase A) 효소를 코딩하는 유전자(ackA)가 추가적으로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 박테리아는 지방산 대사회로를 갖는 박테리아인 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 지방산 대사회로를 갖는 박테리아는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 아실 코엔자임 A 디하이드로게나제(acyl coenzyme A dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 fadE 유전자인 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 DNA-바인딩 전사 듀얼 조절자(DNA-binding transcriptional dual regulator)를 코딩하는 유전자는 fadR 유전자인 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제2항에 있어서, 상기 아실-CoA 신세타제(acyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자는 fadD이고, 쇼트-체인 지방산 외막 트랜스포터(short-chain fatty acid outer membrane transporter)를 코딩하는 유전자는 atoE인 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  15. 제2항에 있어서, 상기 롱-체인 지방산 외막 트랜스포터(long-chain fatty acid outer membrane transporter)를 코딩하는 유전자는 fadL인 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 지방 아실-acp(fatty acyl-acp)를 유리 지방산(free fatty acid)으로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 tesA(acyl-CoA thioesterase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 유리 지방산(free fatty acid)을 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 atoDA(acetyl-CoA : acetoacetyl-CoA transferase를 코딩하는 유전자) 또는 fadD(acyl-CoA synthetase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)를 지방 알데하이드(fatty aldehyde)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 luxC(fatty acyl-CoA reductase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  19. 제1항에 있어서, 상기 지방 알데하이드(fatty aldehyde)를 알칸(alkane)으로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자는 CER1(fatty aldehyde decarbonylase 1을 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  20. 제1항 내지 제9항 및 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄화수소는 펜타데칸, 헵타데칸, 옥테인, 노네인 및 노닌으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  21. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 강력한 프로모터(strong promoter)는 trc 프로모터(trc promoter), tac 프로모터(tac promoter), T7 프로모터(T7 promoter), lac 프로모터(lac promoter) 및 trp 프로모터(trp promoter)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물.
  22. 당으로부터 지방 아실-acp(fatty acyl-acp) 합성 대사회로를 가지는 대장균에서, (a) 아실 코엔자임 A 디하이드로게나제(acyl coenzyme A dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(fadE) 및 DNA-바인딩 전사 듀얼 조절자(DNA-binding transcriptional dual regulator)를 코딩하는 유전자(fadR)가 결실 또는 약화되어 있고, (b) 아실-CoA 신세타제(acyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자(fadD)의 네이티브 프로모터(native promoter) 및 롱-체인 지방산 외막 트랜스포터(long-chain fatty acid outer membrane transporter)를 코딩하는 유전자(fadL)의 에테뉴에이터(attenuator)를 포함하는 네이티브 프로모터(native promoter)가 강력한 프로모터(strong promoter)로 치환되어 있으며, (c) (i) 지방 아실-acp(fatty acyl-acp)를 유리 지방산(free fatty acid)으로 전환시키는 효소(acyl-CoA thioesterase), (ii) 유리 지방산(free fatty acid)를 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)로 전환시키는 효소(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase 또는 acyl-coA synthetase), (iii) 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)를 지방 알데하이드(fatty aldehyde)로 전환시키는 효소(fatty acyl-CoA reductase) 및 (iv) 지방 알데하이드(fatty aldehyde)를 알칸(alkane)으로 전환시키는 효소(fatty aldehyde decarbonylase)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 대장균.
  23. 당으로부터 지방 아실-acp(fatty acyl-acp) 합성 대사회로를 가지는 대장균에서, (a) 아실 코엔자임 A 디하이드로게나제(acyl coenzyme A dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 (fadE) 및 DNA-바인딩 전사 듀얼 조절자(DNA-binding transcriptional dual regulator)를 코딩하는 유전자(fadR)가 결실 또는 약화되어 있고, (b) fabDHG 오페론(operon)의 네이티브 프로모터(native promoter) 및 fabA 오페론(operon)의 네이티브 프로모터(native promoter)가 강력한 프로모터(strong promoter)로 치환되어 있으며, (c) (i) 지방 아실-acp(fatty acyl-acp)를 유리 지방산(free fatty acid)으로 전환시키는 효소(acyl-CoA thioesterase), (ii) 유리 지방산(free fatty acid)을 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)로 전환시키는 효소(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase 또는 acyl-coA synthetase), (iii) 지방 아실 CoA(fatty acyl-CoA)를 지방 알데하이드(fatty aldehyde)로 전환시키는 효소(fatty acyl-CoA reductase) 및 (iv) 지방 알데하이드(fatty aldehyde)를 알칸(alkane)으로 전환시키는 효소(fatty aldehyde decarbonylase)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 대장균.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 탄화수소는 펜타데칸, 헵타데칸,옥테인, 노네인 및 노닌으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 탄화수소 생성능을 가지는 변이 대장균.
  25. 당으로부터 지방 아실-acp(fatty acyl-acp) 합성 대사회로를 가지는 미생물에서, (a) 아실 코엔자임 A 디하이드로게나제(acyl coenzyme A dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 DNA-바인딩 전사 듀얼 조절자(DNA-binding transcriptional dual regulator)를 코딩하는 유전자를 결실 또는 약화시키고, (b) (i) 지방 아실-acp(fatty acyl-acp)를 유리 지방산(free fatty acid)으로 전환시키는 효소(acyl-CoA thioesterase)를 코딩하는 유전자, (ii) 유리 지방산(free fatty acid)를 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)로 전환시키는 효소(acetyl-CoA:acetoacetyl-CoA transferase 또는 acyl-coA synthetase)를 코딩하는 유전자, (iii) 지방 아실-CoA(fatty acyl-CoA)를 지방 알데하이드(fatty aldehyde)로 전환시키는 효소(fatty acyl-CoA reductase)를 코딩하는 유전자 및 (iv) 지방 알데하이드(fatty aldehyde)를 알칸(alkane)으로 전환시키는 효소(fatty aldehyde decarbonylase)를 코딩하는 유전자를 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소 생성능을 가지는 지방산 대사회로를 갖는 변이 미생물의 제조방법.
  26. 제25항에 있어서, 아실-CoA 신세타제(acyl-CoA synthetase)를 코딩하는 유전자의 네이티브 프로모터(native promoter) 및 롱-체인 지방산 외막 트랜스포터(long-chain fatty acid outer membrane transporter)를 코딩하는 유전자의 에테뉴에이터(attenuator)를 포함하는 네이티브 프로모터(native promoter)를 강력한 프로모터(strong promoter)로 추가적으로 치환시키고, 쇼트-체인 지방산 외막 트랜스포터(short-chain fatty acid outer membrane transporter)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 도입시키는 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  27. 제25항에 있어서, fabDHG 오페론(operon)의 네이티브 프로모터(native promoter) 및 fabA 오페론(operon)의 네이티브 프로모터(native promoter)를 강력한 프로모터(strong promoter)로 추가적으로 치환시키는 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  28. 제25항에 있어서, 아세테이트 키나제 A(acetate kinase A) 효소를 코딩하는 유전자(ackA)를 추가적으로 결실시키는 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 박테리아는 지방산 대사회로를 갖는 박테리아인 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 지방산 대사회로를 갖는 박테리아는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  32. 제25항에 있어서, 상기 탄화수소는 펜타데칸, 헵타데칸, 옥테인, 노네인 및 노닌으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  33. 제1항 내지 제9항 및 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항의 탄화수소 생성능을 가지는 변이 미생물을 배양하여 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소를 생성시킨 다음, 배양액으로부터 탄화수소를 회수하는 것을 특징으로 하는 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소의 제조방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 탄화수소는 펜타데칸, 헵타데칸, 옥테인, 노네인 및 노닌으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 탄화수소의 제조방법.
  35. 제22항 또는 제 23항의 탄화수소 생성능을 가지는 변이 대장균을 배양하여 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소를 생성시킨 다음, 배양액으로부터 탄화수소를 회수하는 것을 특징으로 하는 알칸, 알켄, 알킨 및 방향족 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 탄화수소의 제조방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 탄화수소는 펜타데칸, 헵타데칸, 옥테인, 노네인 및 노닌으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 탄화수소의 제조방법.






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