KR20110033086A

KR20110033086A - 부탄올 또는 혼합알코올 생성능 및 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올 또는 혼합 알코올의 제조방법

Info

Publication number: KR20110033086A
Application number: KR1020100092720A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 장유신; 송효학
Original assignee: 한국과학기술원; 지에스칼텍스 주식회사; 바이오퓨얼켐 주식회사
Priority date: 2009-09-22
Filing date: 2010-09-20
Publication date: 2011-03-30
Also published as: KR101284015B1

Abstract

본 발명은 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능 및 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올 또는 혼합 알코올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 부산물인 아세톤은 거의 생산하지 않고, 연료로 이용 가능한 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올 또는 혼합 알코올의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능 및 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물은 숙주 미생물에 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 재조합 변이 미생물은 대사흐름 조작에 의해 아세톤 등의 부산물의 생산이 거의 없을 뿐 아니라, 알코올의 생산성을 향상시킬 수 있어 부탄올 또는 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올의 산업적 생산에 유용하다.

Description

부탄올 또는 혼합알코올 생성능 및 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올 또는 혼합 알코올의 제조방법{Recombinant Mutant Microorganisms Enhanced ability of Producing Butanol or Mixed Alcohol and ability of Removing Acetone and Method for Preparing Butanol or Mixed Alcohol Using the Same}

본 발명은 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능 및 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올 또는 혼합 알코올의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 부산물인 아세톤은 거의 생산하지 않고, 연료로 이용 가능한 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올 또는 혼합 알코올의 제조방법에 관한 것이다.

부탄올, 에탄올, 이소프로판올 등의 알코올은 현재 산업 용매로써 거대한 시장을 형성하고 있다. 바이오 에탄올은 미국 및 브라질에서는 이미 자동차 등의 수송 연료로 사용되고 있으며, 부탄올 및 이소프로판올 또한 앞으로 자동차 등의 수송연료로 사용 가능성이 현실화되고 있어 계속적인 수요 증가가 예상되고 있다. 수송연료로써 부탄올은 가솔린과 비슷한 에너지 밀도를 가지며, 에탄올 및 이소프로판올은 부탄올에 비하여 상대적으로 높은 모터 옥탄가를 가진다. 에탄올 및 이소프로판올 및 부탄올로 구성된 그룹에서 2가지 이상 포함한 혼합 알코올은 순수 부탄올에 비하여 상대적으로 더 높은 옥탄가의 장점을 가지고, 에탄올에 비하여는 상대적으로 더 높은 에너지 밀도의 장점을 가진다. 또한, 이들 혼합 알코올을 동시에 적정 비율로 생산하게 될 경우, 각각을 별도로 생산한 후, 다시 섞는 공정보다 비용적 측면에서 더욱 유리하다.

부탄올(C₄H₉OH)의 전세계 생산량은 약 백십만 톤/년으로 추정된다. 현재 시판되는 부탄올은 모두 화학적 합성으로 생산된 것이다. 부탄올의 화학합성법은 원료를 석유로 하고 있으며 이로부터 얻어진 프로필렌으로부터 합성되는 옥소법(oxo process)이 사용된다. 에탄올(C₂H₅OH)은 예로부터 녹말이나 당류를 발효시키는 방법으로 제조되었으며, 오늘날 주류(酒類)의 대부분은 이 방법으로 제조하고 있다. 공업용 에탄올은 석유로부터 얻은 에틸렌(에텐)을 황산에 흡수시켜 에탄올의 황산에스테르를 만든 후, 이것을 다시 가수분해하여 디에틸에테르와 함께 얻는 방법(황산가수법)과 기상(氣相)에서 에틸렌을 고체인산촉매에 접촉적하여 수증기와 반응시킴으로써 직접 에탄올을 합성하는 방법(직접수화법)으로 제조하고 있다. 이소프로판올 역시 대부분 석유로부터 얻은 프로필렌(propylene)으로부터 직접 수화 또는 황산을 이용한 산화반응을 통해 생산된다.

상술한 바와 같이 지금까지 생산되는 부탄올 및 에탄올 및 이소프로판올의 경우 화학합성법에 의해 대부분 생산되고 있으며, 유가 상승과 환경 문제 야기 등으로 세계 각국에서는 이들 바이오 알코올 연구에 대한 관심이 급속하게 증가되고 있는 상황이나, 아직까지 바이오 부탄올 및 에탄올 및 이소프로판올만을 효율적으로 동시에 생산한 예는 없었다.

발효를 통한 부탄올 및 에탄올 및 이소프로판올의 생산은 Clostridium beijerinkii NRRL B592, C. beijerinkii NRRL B593, C. beijerinkii IAM 19015, C. beijerinkii ATCC 14823, C. beijerinkii NCIMB 9581 등 일부 클로스트리듐 균주에서 가능하다 (Shaheen et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2: 115, 2000). 하지만, 상기의 균주들이 생산하는 부탄올 및 에탄올 및 이소프로판올을 포함한 전체 유기용제 생산 농도는 11.3 g/l (C. beijerinkii NRRL B592), 11.5 g/l (C. beijerinkii NRRL B593), 12.0 g/l (C. beijerinkii IAM 19015), 4.4 g/l (C. beijerinkii ATCC 14823), 3.3 g/l (C. beijerinkii NCIMB 9581)로 매우 낮아 산업적 이용이 불가능하다.

한편, 부탄올 및 아세톤 및 에탄올을 생산하는 C. acetobutylicum ATCC 824 등은 혼합 알코올 생산에 있어서 부산물로 취급되는 아세톤을 동시에 생산하고 있어, 혼합 알코올 생산 산업에 있어서 분리 정제 비용을 상승시키고 carbon yield를 감소시키는 요인으로 작용하고 있다. 아세톤 생산을 감소시키기 위한 선행 연구들에 의하면, 1) aad(알코올/알데히드 탈수소 효소)를 과발현시켜 야생형과의 비교에서 상대적으로 부탄올 및 에탄올 생성량 대비 아세톤 생성 비율이 감소한 보고 (Nair et al., J. Bacteriol., 176:871, 1994); 2) buk 유전자를 불활성화함으로써 상대적으로 부탄올 생산량이 16.7 g/l까지 증가함으로써 아세톤 생산 비율이 감소한 보고(Harris et al., Biotechnol. Bioeng., 67:1, 2000); 3) 무작위 돌연변이로 유발된 돌연변이주 C. beijerinckii BA101 균주를 이용하여 18.6 g/l까지 부탄올 생산량을 증가시킴으로써 아세톤 생산 비율이 감소한 보고 (Ezeji et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 63:653, 2004) 등이 있다. 하지만, 상기의 3가지 예들은 모두 부산물인 아세톤의 농도가 실제로 감소되지 않은 단점이 있다. 아세톤 생성이 감소되거나 차단된 채로 에탄올 및 부탄올을 생성한 예로써, adc(아세토아세트산 탈탄산 효소의 유전자) 제거 (Jiang et al., Metab. Eng. doi:10.1016/j.ymben.2009.06.002, 2009), ctfA(CoA 전달 효소 A의 유전자), ctfB(CoA 전달 효소 B의 유전자) 제거 (WO2008052596, WO2008052973), aad(알코올/알데히드 탈수소 효소의 유전자) 및 ctfAB(CoA 전달 효소 AB의 유전자) 활성에 모두 결함이 있는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 돌연변이주에 aad(Nair et al., J. Bacteriol., 176:5843, 1994) 또는 aad-ctfAB를 도입(PCT/KR2008/007577)한 재조합 변이 미생물을 이용한 경우가 있으나, 부탄올 및 에탄올 혼합물의 최종 농도가 6~16.3 g/l로 낮은 단점이 있어 산업적 이용이 불가능하다. 또한, 대장균에 클로스트리듐으로부터 아세톤 생산경로와 이소프로판올 생산 경로를 도입하여 이소프로판올을 생산한 예(Liao et al., Appl. Environ. Microbiol. 73:7814, 2007; US2008/0293125) 또한 알코올 농도는 5 g/l로 매우 낮으며, 부산물인 아세톤을 약 3.5 g/l 동반하여 생산하는 문제가 있다.

따라서 당업계에서는 아세톤과 같은 부산물의 생성 없이 연료로 바로 이용 가능한 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이들의 혼합 알코올을 고효율로 생산하는 미생물의 개발이 절실하게 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 아세톤과 같은 부산물의 생성 없이 부탄올 또는 혼합 알코올을 고효율로 생산하는 미생물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 증폭 또는 도입시켜 제조한 재조합 변이 미생물이 부탄올 또는 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 등을 포함하는 혼합 알코올을 고농도로 생산하는 반면, 부산물인 아세톤은 거의 생산하지 않는다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법 및 이로부터 제조된 재조합 변이 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 다른 부산물의 생산 없이 부탄올 또는 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 등을 포함하는 혼합 알코올을 고농도로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 숙주 미생물에 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능 및 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG)를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 (A) 부탄올 또는 (B) 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI), 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG), 아세토아세테이트 디카르복실라제(acetoacetate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(adc) 및 CoA 트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfA, ctfB)를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 (A) 부탄올 또는 (B) 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 숙주 미생물에 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG)가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 (A) 부탄올 또는 (B) 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI), 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG), 아세토아세테이트 디카르복실라제(acetoacetate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(adc) 및 CoA 트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfA, ctfB)가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 (A) 부탄올 또는 (B) 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 변이 미생물을 배양하여 부탄올 또는 혼합 알코올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올 또는 혼합 알코올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올 또는 혼합 알코올의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 특정 유전자의 도입 또는 증폭을 통하여 부탄올 또는 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올의 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 재조합 변이 미생물은 대사흐름 조작에 의해 아세톤 등의 부산물의 생산이 거의 없을 뿐 아니라, 알코올의 생산성을 향상시킬 수 있어 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이들의 혼합 알코올의 산업적 생산에 유용하다.

도 1은 변이 클로스트리듐 균주의 주요 부탄올, 에탄올, 아세톤, 아세트산, 부티르산 생산 대사회로 이다.
도 2는 adhI 그리고/또는 hydG를 포함하는 재조합 벡터 pTHL1-Cm-IPA1 및 pTHL1-Cm-IPA2의 유전자 지도이다.

본 발명에서는 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 증폭 또는 도입되어 있는 재조합 변이 미생물이 부산물인 아세톤은 거의 생산하지 않으면서, 부탄올 또는 부탄올을 고수율로 생산할 수 있는지를 확인하고자 하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 아세톤을 이소프로판올로, 또는 부티릴코에이(butyryl-CoA) 및 부틸알데히드(butyraldehyde)를 부탄올로 전환하는 Clostridium beijerinkii NRRL B593 유래의 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)를 코딩하는 유전자를 클로닝하고, 상기 유전자를 1차/2차 아실코에이(acyl CoA) 또는 1차/2차 알데히드(aldehyde)로의 생합성 경로에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자 및/또는 아세톤 생산 대사회로를 가지고 있는 숙주 미생물에 도입시켜 재조합 변이 미생물을 제작하였다. 그리고, 제작된 재조합 변이 미생물이 부산물인 아세톤은 거의 생산하지 않으면서, 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이들의 혼합 알코올을 고수율로 생산한다는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 특정 대사회로를 가지고 있다라고 하는 것은 균주 자체에서 원래부터 가지고 있는 것 뿐만 아니라 재조합, 지놈셔플링(genome shuffling) 등의 기법으로 외래의 유전자를 도입한 것까지 모두 포함한다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 숙주 미생물에 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능 및 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법 및 상기 제조방법으로부터 제조된 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능 및 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 상기 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자는 모두 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 또한 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 기능을 가진다.

상기 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자는 adhI이고, 상기 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자는 hydG인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서는 상기 adhI 및 hydG로 Clostridium beijerinkii NRRL B593 유래인 것만을 예시하였으나, 다른 미생물 유래의 유전자라 할지라도, 도입된 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에서 "생합성 경로"란 해당과정(glycolysis)을 거쳐서 제공된 탄소로부터 목적 화합물이 합성되는 경로만으로 국한하지 않고, 세포내의 특정 대사산물로부터 목적 화합물이 합성되는 경로들을 포괄하는 개념이다.

본 발명에 있어서, 상기 숙주 미생물은 (A) 아세틸코에이(acetyl-CoA) 생합성 경로; (B) 부티릴코에이(butyryl-CoA) 생합성 경로; (C) 아세톤 생합성 경로; (D) 에탄올 생합성 경로; (E) 부탄올 생합성 경로; (F) 이소부탄올 생합성 경로; (G) 프로판올 생합성 경로; 및 (H) 이소프로판올 생합성 경로로 구성된 군에서 선택되는 대사회로중 1개 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 대사회로를 가지는 미생물은 제한없이 숙주 미생물로 이용할 수 있으나, 클로스트리듐 속 미생물을 이용하는 것이 바람직하다.

상기 클로스트리듐 속 미생물로는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 사카로부틸리쿰(Clostridium saccharobutylicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butylicum), 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 타이로부틸리쿰(Clostridium tyrobutylicum), 클로스트리듐 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 등을 예시할 수 있다.

또한, 상기 숙주 미생물은 (A) 아세트산 생합성 경로; (B) 부티르산 생합성 경로; (C) 젖산 생합성 경로; (D) 아세토인 생합성 경로; 및 (E) 수소 생합성 경로로 구성된 군에서 선택되는 생합성 경로중 1개 이상의 생합성 경로가 완전히 차단되거나 조절되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "조절"이란 생합성 경로에 존재하는 효소들 중 1개 이상을 evolution 및 mutation 하거나 생합성 경로에 존재하는 효소의 발현을 조절하는 것을 포괄하는 개념이다.

상기 숙주 미생물로는 본 발명의 일 실시예에서 사용된 megaplasmid (아세토아세트산 탈탄산 효소, CoA 트랜스퍼라제, 알코올/알데하이드 디하이드로제나제를 포함한 127 유전자가 존재함)가 결실되어 있는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 변이주 M5를 숙주 미생물, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 균주, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 부티르산 카이나아제(butyrate kinase) 코딩 유전자가 결실된 buk mutant, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 포스포트랜스아세틸라아제(phosphotransacetylase) 코딩 유전자가 결실된 eutD 또는 pta mutant, evolution을 통하여 높은 농도의 부탄올 및 에탄올을 생산하는 BKM19 균주 등을 예시할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 혼합 알코올은 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 혼합 알코올은 탄소수 2~10의 직쇄 또는 측쇄 알코올, 더욱 상세하게는 에탄올, 이소부탄올, 프로판올, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, tert-부탄올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올 등을 더욱 포함할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG)를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 (A) 부탄올 또는 (B) 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법 및 상기 제조방법으로부터 제조된 (A) 부탄올 또는 (B) 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물에 관한 것이다.

그리고, 본 발명의 일 실시예에서는 아세톤으로의 대사흐름을 증대시키기 위하여 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG) 뿐만 아니라, 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자인 아세토아세테이트 디카르복실라제(acetoacetate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(adc) 및 CoA 트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfA, ctfB)를 증폭 또는 도입시킨 재조합 미생물을 제작하고, 재조합 미생물이 더욱 향상된 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능 및 감소된 아세톤의 생성능을 가지는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 또 다른관점에서, 숙주 미생물에 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 (A) 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능 및 (B) 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법 및 이로부터 재조된 재조합 변이 미생물에 관한 것이다.

상기 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 아세토아세테이트 디카르복실라제(acetoacetate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(adc) 또는 CoA 트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfA, ctfB)인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, 최종 산물로 아세톤을 생산하는 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG)를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법 및 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물에 관한 것이다.

한편, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 숙주 미생물에 adhI 또는 adhI-hydG를 함유하는 재조합벡터 (pTHL1-Cm-IPA1 또는 pTHL1-Cm-IPA2)를 도입하여 재조합 변이 미생물 M5(pTHL1-Cm-IPA1), M5(pTHL1-Cm-IPA2), PTA(pTHL1-Cm-IPA1), PTA(pTHL1-Cm-IPA2), BKM19(pTHL1-Cm-IPA1) 및 BKM19(pTHL1-Cm-IPA2)를 제조한 다음, 이를 배양한 결과, 아세톤이 전혀 생성되지 않거나 거의 생성되지 않으면서 부탄올 또는 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합알코올이 고농도로 생성되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 숙주 미생물에 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 증폭 또는 도입되어 있는 재조합 변이 미생물을 배양한 다음, 배양액으로부터 부탄올 또는 혼합 알코올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올 또는 혼합 알코올의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG)가 증폭 또는 도입되어 있는 재조합 변이 미생물을 배양한 다음, 배양액으로부터 (A) 부탄올 또는 (B) 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올을 회수하는 것을 특징으로 하는 알코올의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자, 숙주 미생물 등은 앞서 기재한 바와 동일하다.

본 발명에 있어서, 재조합 변이 미생물의 배양 및 단일 알코올 및 혼합 알코올 회수 과정은 종래 발효 공업에서 통상적으로 알려진 배양방법 및 알코올의 분리 정제 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 아울러, 상기 (A)부탄올 또는 (B)부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올의 회수는 배양이 완료된 이후에 수행하는 것이 일반적이나, 생산성을 높이기 위하여 gas-stripping 방법(Thaddeus et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 27:207, 2005)등을 이용하여 배양도중에 회수할 수도 있다. 즉, 배양중에 생성된 (A)부탄올 또는 (B)부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올을 회수하면서 계속 배양하는 것도 본 발명의 범위에 속한다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 유전자를 발현시키기 위하여 숙주균주로 특정 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 균주들만을 예시하였으나, 다른 클로스트리듐 속이나 다른 속의 미생물을 사용하더라도, 1차/2차 아실코에이(acyl CoA) 또는 1차/2차 알데히드(aldehyde)로의 생합성 경로에 관여하는 효소들을 코딩하는 유전자 및/또는 아세톤 생산 대사회로를 가지고 있는 숙주 균주에 동일 유전자를 도입하고, 이를 이용하여 부탄올 또는 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 부탄올 생산, 부탄올 및 이소프로판올 생산, 부탄올, 에탄올 및 이소프로판올 생산만을 예시하였으나, 그 외 알코올을 더욱 포함하는 혼합 알코올을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: pTHL1-Cm 벡터 제작

클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 싸이올레이즈(thiolase) 프로모터와 라이보좀 결합 부위(ribosome binding site, RBS)를 포함하는 외래 단백질 발현용 셔틀 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 싸이올레이즈는 세포 생장주기에 크게 영향받지 않고 계속적이고 안정적으로 유전자를 발현시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(Tummala et al., Appl. Environ. Microbiol., 65:3793~3799, 1999). 따라서 본 실시예에서는 싸이올레이즈(NCBI GeneID:1119056) 상단에 위치한 프로모터를 클로닝하여 pIMP-H1del에 삽입하였다. pIMP-H1del은 2개의 HindIII 제한효소 자리를 가지는 pIMP1으로부터 3408번째 염기서열에 존재하는 HindIII site 1개를 제거하고 743번째 염기열에 존재하는 제한효소 자리만 남겨둔 pIMP1을 주형으로 하는 셔틀 벡터이다. 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(ATCC 824) 균주의 total DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 싸이올레이즈 프로모터를 증폭하였다. 증폭된 싸이올레이즈 프로모터 단편들을 정제 및 회수 한 후, HindIII와 PstI 제한효소로 처리한 후, 동일 효소로 처리된 pIMP-H1del 셔틀 벡터와 접합(ligation)함으로써 pTHL1 벡터 제작을 완성하였다.

[서열번호 1]: 5'-GGCCCCAAGCTTAGAATGAAGTTTCTTATGCACAAG-3'

[서열번호 2]: 5'-AAACTGCAGTCTAACTAACCTCCTAAATTTTGATAC-3'

또한, 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머, pSOS95-Cm을 주형으로 PCR을 수행하여 클로람페니콜 저항성 유전자를 증폭하고, 증폭된 클로람페니콜 저항성 유전자 단편들을 정제 및 회수 한 후, HindIII 제한효소로 처리하고, 동일 효소로 처리된 pTHL1 셔틀 벡터와 접합(ligation)함으로써 pTHL1-Cm 벡터 제작을 완성하였다. pSOS95-Cm은 pSOS95 (Nair and Papoutsakis, J. Bacteriol., 176:5843-5846, 1994)에 ATCC 824균주의 thioloase promoter를 cloning하고, 그 down-stream에 chloramphenicol/thiamphenicol 내성 유전자를 cloning함으로써 제작 가능하다.

[서열번호 3]: 5'-CCAAGCTTCGACTTTTTAACAAAATATATTG-3'

[서열번호 4]: 5'-CCAAGCTTGACATTAAAAAAATAAGAGTTACC-3'

실시예 2: 1차/2차 알코올 디하이드로제나제 및/또는 전자전달 단백질(electron-transfer protein)를 발현하는 pTHL1-Cm-IPA1 및 pTHL1-Cm-IPA2 발현벡터의 제작

클로스트리듐 아세토부틸리쿰에서 1차/2차 알코올 디하이드로제나제 및/또는 전자전달 단백질(electron-transfer protein)이 발현될 수 있도록 하기 위해, 실시예 1에서 제작된 pTHL1-Cm 벡터에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제 및/또는 전자전달 단백질(electron-transfer protein)를 코딩하는 유전자를 클로닝하였다.

1차/2차 알코올 디하이드로제나제 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)를 코딩하는 유전자를 가지는 Clostridium beijerinkii NRRL B593의 total DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머를 이용하거나 서열번호 5와 서열번호 7의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 각각 adhI 및 adhI-hydG 단편을 증폭하였다.

[서열번호 5]: 5'-AAAACTGCAGATGAAAGGTTTTGCAATGCTA-3'

[서열번호 6]: 5'-CCCCCGGGGGTGTATAATCCTCCATGATCTATTATG-3'

[서열번호 7]: 5'-CCCCCGGGGGCCTTCTACACATTTAGGATTCTTAC-3'

증폭된 adhI 단편을 PstI과 AvaI 제한효소로 처리한 뒤, 동일효소로 처리된 pTHL1-Cm 벡터와 함께 T4 DNA ligase로 처리하여 접합함으로써 재조합 플라스미드 pTHL1-Cm-IPA1를 제조하였고, 증폭된 adhI-hydG 단편을 PstI과 AvaI 제한효소로 처리한 뒤, 동일효소로 처리된 pTHL1-Cm 벡터와 함께 T4 DNA ligase로 처리하여 접합함으로써 재조합 플라스미드 pTHL1-Cm-IPA2를 제조하였다.

실시예 3: 재조합 변이 미생물을 이용한 부탄올 생산

클로스트리듐 아세토부틸리쿰 M5 균주는 메가플라스미드(아세토아세트산 탈탄산 효소의 유전자, CoA 트랜스퍼라제의 유전자, 알코올/알데하이드 디하이드로제나제의 유전자를 포함하는 유전자가 존재)가 제거된 균주이기 때문에 부탄올, 에탄올, 아세톤을 생산하지 못하는 특징을 가진다. 실시예 2에서 제작된 재조합 벡터 pTHL1-Cm-IPA1과 pTHL1-Cm-IPA2를 각각 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 M5 균주에 도입하여 M5(pTHL1-Cm-IPA1)과 M5(pTHL1-Cm-IPA2) 균주를 제작하였다.

먼저, 바실러스 서브틸리스 파지 (Bacillus subtilis Phage) Φ3T I 메틸트랜스퍼라제(methyltransferase) 발현 벡터, pAN1 (Mermelstein et al., Appl. Environ. Microbiol., 59:1077, 1993)을 함유하는 대장균 TOP10에 실시예 2에서 제작된 재조합 벡터들을 도입하여, 상기 벡터들을 클로스트리듐으로의 형질전환에 적합하도록 메틸레이션을 유도하였다. 이렇게 메틸레이션된 벡터를 대장균으로부터 분리 및 정제하고, 이 벡터를 mega plasmid가 결실되어 있는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 변이주 M5 (Cornillot et al., J. Bacteriol., 179:5442, 1997)에 도입하여 재조합 변이 미생물을 제조하였다. 또한, 클로닝용 벡터로 사용한 pIMP1을 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 M5 균주에 도입하여 M5(pIMP1) 균주를 제조하였다.

형질전환을 위한 M5 competent cell은 다음과 같이 준비하였다. 먼저 10 ml CGM (표 1)에 M5 균주를 접종한 후 OD 0.6이 될 때까지 배양하였다. 이를 이용하여 2X YTG배지 (Bacto Tryptone 16 g, Yeast extract 10 g, NaCl 4 g, Glucose 5 g, 1 리터 당) 60 ml에 10% 접종하여 4-5 시간 동안 배양하였다. 형질전환 버퍼 (EPB, 270 mM sucrose 15 ㎖, 686 mM NaH₂PO₄ 110 ㎕, pH 7.4)로 2번 washing한 후, 2.4 ㎖의 동일 버퍼로 미생물 세포를 현탁시켰다. 이렇게 만들어진 M5 competent cell 600 ㎕와 재조합 플라스미드 DNA 25 ㎕를 섞어서 4 mm 전극을 가진 cuvette에 충진 후 2.5 kV, 25 uF의 조건으로 전기 충격을 가하였다. 즉시, 1 ml의 2X YTG 배지로 현탁하여 3시간 동안 37℃에서 배양한 후, 40 ㎍/ml의 에리스로마이신이 포함된 2X YTG 고체배지에 도말하여 형질전환체 M5(pTHL1-Cm-IPA1) 및 M5(pTHL1-Cm-IPA2)를 선발하였다.

상기의 재조합 변이 미생물 M5(pTHL1-Cm-IPA1) 및 M5(pTHL1-Cm-IPA2)를 배양하여 알코올 생산능을 평가하였다. CGM 배지 10㎖을 함유한 30㎖ 시험관을 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼내어 질소가스를 채운 후 혐기 챔버에서 실온까지 식힌 후 에리트로마이신(erythromycin) 40 ㎍/㎖를 첨가하고, 상기 재조합 변이 미생물들을 접종하여 37℃에서 혐기조건으로 48 시간 동안 배양을 수행하였다. 배양 종료 후, 상등액을 회수하여 생산된 아세톤 및 에탄올과 부탄올 농도를 packed column(Supelco Carbopack^TM B AW/6.6% PEG 20M, 2 m × 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography(Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하였다.

성분	함량 (g/l)
Glucose	80
K₂HPO₄ 3H₂O	0.982
KH₂PO₄	0.75
MgSO₄	0.348
MnSO₄ H₂O	0.01
FeSO₄ 7H₂O	0.01
(NH₄)₂SO₄	2
NaCl	1
Asparagine	2
p-Aminobenzoic acid	0.004
Yeast extract	5

그 결과, 대조군 M5(pTHL1-Cm) 및 재조합균주 실험군 M5(pTHL1-Cm-IPA1)에서는 에탄올 및 부탄올이 전혀 생성되지 않은 반면, 재조합균주 M5(pTHL1-Cm-IPA2)의 경우, 6.5 g/l의 부탄올을 생산하였다. 이로부터 hydG 유전자는 부탄올 생산에 중요한 역할을 한다는 사실을 알 수 있었다.

실시예 4: 재조합 변이 미생물을 이용한 부탄올 및 이소프로판올 혼합 알코올 생산

4-1: mutant loxP site와 항생제 내성 표지를 포함하는 벡터의 제작

클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 경우, 주로 erythromycin 내성 유전자(이하 Em^r)가 vector의 항생제 내성 표지로 이용된다. 이중 교차를 이용한 유전자 결실을 위해서는 이중 교차가 일어난 균주를 선택하기 위해 항생제 내성 표지가 하나 더 필요하다. 따라서 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 thiolase promoter를 이용하여 chloramphenicol/thiamphenicol 내성 표지(이하 Th^r)를 발현하는 pSOS95-Cm을 PCR의 주형으로 이용하였다. pSOS95-Cm은 pSOS95 (Nair and Papoutsakis, J. Bacteriol., 176:5843-5846, 1994)에 ATCC 824균주의 thioloase promoter를 cloning하고, 그 down-stream에 chloramphenicol/thiamphenicol 내성 유전자를 cloning함으로써 제작 가능하다.

또한 이중 교차가 일어나 유전자가 결실된 후, 다른 유전자의 결실을 위하여 삽입된 항생제 내성 표지가 제거되어야 한다. 이를 위해 Th^r을 PCR로 증폭할 때 사용하는 프라이머(primer)에 mutant loxP sequence를 추가하였다. 또한, 벡터에 접합시키기 위해 제한 효소 SphI과 XbaI의 서열 GCATGC와 TCTAGA를 프라이머에 각각 추가하였다. 최종 프라이머 서열은 서열번호 8 및 9와 같다.

[서열번호 8]: 5-'AATTGCATGCTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGT TATCACACGGTTTAA CGACTTAATTACG-3'

[서열번호 9]: 5'-ATATTCTAGAACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTT ATCCATGATTACGAA TTCTATGAGTCGAC-3'

상기 주형과 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하여 mutant loxP site와 Th^r을 모두 포함하는 산물을 얻었다. 이렇게 얻은 PCR 산물과 pUC18 플라스미드를 SphI/XbaI으로 절단한 후, 접합하여 벡터 pMBKOT2를 완성하였다. pMBKOT2는 pMBKOT2의 loxP-Thr-loxP 부분과 homologous arm을 포함하는 KO cassette 제작에 이용된다.

4-2: pCACKO 벡터의 제작

일반적으로 homologous recombination을 이용한 유전자 결실은 세포 내에서 복제되지 않는 플라스미드를 이용하지만, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 경우 DNA 양에 비해 형질전환되는 비율이 대장균보다 극히 낮으며, homologous recombination도 잘 일어나지 않는 것으로 알려져 있으므로 복제 가능한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서 4-1에서 제작된 pMBKOT2와 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에서 복제 가능한 shuttle vector pIMP1 (Nair and Papoutsakis, J. Bacteriol., 176:5843-5846, 1994)을 이용하여 특정유전자를 결실시킬 수 있는 벡터를 제작하였다.

먼저 pIMP1에 있는 제한 효소 서열은 XmaI 외에는 pMBKOT2의 loxP-Th^r-loxP서열의 내부를 자르므로 적합하지 않다. 따라서 pMBKOT2와 pIMP1에 모두 존재하지 않는 제한 효소 서열인 NcoI의 서열을 pIMP1에 추가하였다. pUC18(GenBank ID: L08752.1)에 위치하는 300여개의 염기쌍(L08752.1의 1155..1468)을 주형으로 하고, 하기 서열번호 10과 11을 프라이머로 하여 PCR 증폭을 수행하였다. NcoI염기 서열은 서열번호 10의 프라이머에 포함하였다.

[서열번호 10]: 5'-AAAACTGCAGCCATGGTCGCCAGTTAATAGTTTGCG-3'

[서열번호 11]: 5'-AAAACCCGGGCGCCGCATACACTATTCTCA-3'

얻어진 PCR 산물을 pIMP1과 함께 NcoI/XmaI으로 절단한 후 접합하여 pCACKO 벡터를 제작하고, 이 벡터를 기반으로 하여 유전자 결실 벡터를 제작하였다.

4-3: Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD 균주의 제조

아세테이트 생산 경로에 관여하는 eutD 유전자를 결실시키기 위하여, 각각 서열번호 12와 13, 서열번호 14와 15의 프라이머를 이용하여 eutD의 ORF를 포함하는 각 가닥(NCBI RefSeq ID: NC_003030.1의 1890304..1890770, 1890831..1891380)을 PCR로 증폭하였다. 이 때, 증폭할 서열은 NcoI과 XmaI 서열을 가지지 않도록 주형을 선택하였다. 증폭된 각각의 산물에 포함된 ORF의 두 부분은 서로 중첩되지 않고 방향성이 일치하는 것으로 확인되었다. 또한, 두 가닥 사이에 표지를 삽입하기 위해 loxP-Th^r-loxP를 포함하는 pMBKOT2의 일부를 하기 서열번호 16과 17의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.

[서열번호 12]: 5'-CTAGCCATGGAGCATATGGGAGTGTGCTAAG-3'

[서열번호 13]: 5'-CGGCCAACGCTCGCAGTCAGGTATTATCAT-3'

[서열번호 14]: 5'-GCGAATGGCGAGATGAACTAGCTGATATTGCTATAA-3'

[서열번호 15]: 5'-ACGTCCCGGGCGAGTACAGTTTCATCCTTCATATC-3'

[서열번호 16]: 5'-CTGACTGCGAGCGTTGGCCGATTCAT-3'

[서열번호 17]: 5'-TAGTTCATCTCGCCATTCGCCATTCA-3'

증폭된 3개의 가닥을 주형으로 하고, 서열번호 12와 15의 프라이머를 이용하여, overlapping PCR을 수행하여 하나의 가닥으로 만들었다. 이렇게 만들어진 최종 산물을 4-2에서 제작한 KO 벡터인 pCACKO와 함께 NcoI/XmaI으로 절단한 후 접합하여 pCACKO-eutD 벡터를 제작하고, 이를 methylation 처리한 후 C. actobutylicum ATCC 824 균주에 전기천공법으로 형질 전환하였다. 형질 전환된 균주는 2x YTGS 배지에서 계대 배양하면서 싸이암페니콜(thiamphenicol)이 포함된 2x YTG agar에 plating하였다. plate에서 얻어진 colony는 각각 하기 서열번호 18과 19, 20과 21로 각각 colony PCR을 통하여 eutD ORF 내에 Th^r 마커가 성공적으로 삽입되었는지 확인하였다.

[서열번호 18]: 5'-GAGGATAAAGAATATACGCAGG-3'

[서열번호 19]: 5'-TTGCCGTCCTAAACTCTGAA-3'

[서열번호 20]: 5'-CTTCCTTTGGCAATTCAAGTTC-3'

[서열번호 21]: 5'-GTGGATTATGAAGCGGTGCA-3'

양쪽으로의 재조합이 확실하게 일어난 경우, colony를 배양하여 plating한 후, degeneration test를 통하여 용매 생성에 관여하는 pSOL1이 유실되지 않았음을 확인하였다. 최종 확인된 균주는 2x YTGS 배지에서 30번 이상 계대 배양시킨 후, Th가 포함된 2x YTG agar에 plating 하고, 에리트로마이신(Em, erythromycin)이 포함된 2x YTG agar에 replication하여 Em^r을 나타내지 않는 colony를 여러 개 선택한 후 상기 방법과 마찬가지로 degeneration test를 거쳐서 pSOL1이 유실되지 않은 colony를 최종적으로 선택하였다.

그런 다음, pSOS95del-cre를 최종 선택된 균주에 형질전환시켜 유전자 내에 삽입한 싸이암페니콜 내성 유전자를 제거하고 계대배양을 통해 pSOS95del-cre를 제거하여 싸이암페니콜과 에리트로마이신 등의 항생제에 대해 야생형 균주와 마찬가지로 민감하고, eutD 유전자가 결실된 최종 균주(Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD)를 제조하였다.

4-4: 재조합 변이 미생물 PTA(pTHL1-Cm-IPA1) 및 PTA(pTHL1-Cm-IPA2)의 알코올 생산

클로스트리듐 아세토부틸리쿰 pta (eutD)-결실 재조합 미생물인 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 ΔeutD에 실시예 2에서 제작된 재조합 벡터 pTHL1-Cm-IPA1과 pTHL1-Cm-IPA2를 각각 실시예 3에서와 동일한 일렉트로포레이션 방법으로 도입하여 PTA(pTHL1-Cm-IPA1)과 PTA(pTHL1-Cm-IPA2) 균주를 제작하였다. 상기 pta 결실 mutant 균주는 상동성 재조합에 의한 유전자 결실 방법을 이용하여 제작하였다.

제작된 재조합 변이 미생물 PTA(pTHL1-Cm-IPA1) 및 PTA(pTHL1-Cm-IPA2)은 배양하여 부탄올 및 이소프로판올 혼합 알코올 생산 성능을 평가하였다. CGM 배지 10㎖을 함유한 30㎖ 시험관을 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼내어 질소가스를 채운 후 혐기 챔버에서 실온까지 식힌 후 에리트로마이신(erythromycin) 40 ㎍/㎖를 첨가하고, 상기 재조합 변이 미생물을 접종하여 37℃에서 흡광도(600 nm)가 1.0이 될 때까지 혐기조건에서 전배양을 수행하였다. 상기 동일성분으로 구성된 CGM배지를 200 ㎖을 함유한 500 ㎖ 플라스크를 멸균 후 동일한 처리를 한 후, 상기 전배양액 10 ㎖을 접종하여, 흡광도(600 nm)가 1.0이 될 때까지 37℃, 혐기조건에서 2차 전배양 하였다. 그 후 상기 성분으로 구성된 배지 1.8 l를 함유한 5.0 l 발효기(LiFlus GX, Biotron Inc., Kyunggi-Do, Korea)를 멸균 후, 80℃ 이상에서부터 질소를 0.5 vvm으로 10시간 공급하면서 실온까지 온도를 낮춘 후 에리트로마이신(erythromycin) 40 ㎍/ml을 첨가하고 상기 2차 전배양액 200 ㎖을 접종하여, 32℃, 200 rpm에서 60시간 배양하였다. pH 보정은 암모니아수를 이용하였으며 automatic feeding에 의해 5.0 이상으로 유지하였고, 배양 중에는 질소를 0.2 vvm (air volume/working volume/minute)으로 공급하였다.

상기 배지중의 glucose를 glucose analyzer(model2700 STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하였고, 시간별로 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 아세톤의 농도를 packed column(Supelco Carbopack^TM B AW/6.6% PEG 20M, 2 m × 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography(Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하였다.

그 결과, 재조합균주 PTA(pTHL1-Cm-IPA1)의 경우 12 g/L 부탄올과 4 g/L 이소프로판올을 생산하였고, PTA(pTHL1-Cm-IPA2)의 경우 13 g/L 부탄올과 4 g/L 이소프로판올을 생산하였다.

실시예 5: 재조합 변이 미생물을 이용한 부탄올 및 에탄올 및 이소프로판올 혼합 알코올 생산

Evolution을 통하여 에탄올 및 부탄올을 각각 10 g/l 이상 생산하는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 BKM19 (Clostridium acetobutylicum BKM19, KCTC 11555BP)에 실시예 2에서 제작된 재조합 벡터 pTHL1-Cm-IPA1과 pTHL1-Cm-IPA2를 각각 실시예 3에서와 동일한 일렉트로포레이션 방법으로 도입하여 BKM19(pTHL1-Cm-IPA1)과 BKM19(pTHL1-Cm-IPA2) 균주를 제작하였다. 재조합 미생물 BKM19(pTHL1-Cm-IPA1)과 BKM19(pTHL1-Cm-IPA2)의 배양은 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 하여 그 성능을 평가하였다. 그 결과, 재조합균주 BKM19(pTHL1-Cm-IPA1)의 경우, 14.2 g/L 부탄올, 12.2 g/l 에탄올 및 2.7 g/L 이소프로판올을 생산하였다. 또 다른 재조합균주 BKM19(pTHL1-Cm-IPA2)의 경우, 15.3 g/l 부탄올 및 7 g/l 에탄올 및 4.4 g/l 이소프로판올 혼합 알코올을 생산하였다.

실시예 6: 재조합 플라스미드를 이용한 아세톤의 제거

클로스트리듐 아세토부틸리쿰 균주들은 알코올인 부탄올 및 에탄올 외에도 부산물로써 아세톤을 생산하는 특징을 가진다. 부탄올 및 에탄올은 바이오 연료로 사용가능 하지만, 아세톤은 바이오 연료로 사용이 불가능하다. 이와 같은 경우, 아세톤 생산을 감소시키거나 아세톤을 제거시키는 것이 요구된다. 이러한 문제 해결을 위하여, 실시예 4와 실시예 5에서 제작된 재조합 균주인 PTA(pTHL1-Cm-IPA1), PTA(pTHL1-Cm-IPA2), BKM19(pTHL1-Cm-IPA1), BKM19(pTHL1-Cm-IPA2)를 상기 실시예 4와 같이 배양하여 아세톤 제거 성능을 관찰하였다.

그 결과, 대조군 PTA(pTHL1-Cm)에서는 유기용제 생산기에 접어든 이후 부터는 아세톤의 농도가 점차 증가하여 최종 약 7 g/l까지 생산되었다. 반면, 재조합균주 PTA(pTHL1-Cm-IPA1) 및 PTA(pTHL1-Cm-IPA2)의 경우, 유기용제 생산기에 접어든 이후에도 대조군과 비교되게 아세톤이 생성됨과 동시에 제거되어 최종 농도는 두 균주 모두 약 3~4 g/l 정도가 남았다. 이는 약 50%의 아세톤 제거율을 보인 것이다.

한편, BKM19(pTHL1-Cm-IPA1) 및 BKM19(pTHL1-Cm-IPA2)의 경우는 배양 전 과정을 통하여 아세톤 축적이 관찰되지 않았으며, 최종 농도는 두 균주 모두 0.3~0.4 g/l로 확인되었다. 이는 대조군 BKM19(pTHL1-Cm) 균주가 약 4.4 g/l의 아세톤을 생산하는 것과 비교해 볼 때, 본 발명에 따른 재조합 플라스미드를 이용함으로써 약 91~93%의 아세톤 제거율을 나타낸 것이다.

실시예 7: 이소프로판올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 균주에 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 추가 증폭한 재조합 변이 미생물의 제조

아세톤으로의 대사 흐름을 증대시키기 위하여 C. acetobutylicum ATCC 824의 아세토아세테이트 디카복실라제(adc, acetoacetate decarboxylase) 유전자와 CoA 트랜스퍼라제 (ctfA, ctfB: CoA transferase) 유전자를 셔틀 벡터인 pTHL1-Cm에 클로닝하였다. 이 때, 프로모터는 아세토아세테이트 디카복실라제(acetoacetate decarboxylase) 유전자의 것을 사용하였으며, 각각의 유전자는 그 자체의 RBS를 사용하였다. adc 프로모터는 용매 생성기에서 강하게 발현되는 것으로 알려져 있다 (Tummala et al., Appl. Environ. Microbiol., 65:3793~3799, 1999). 먼저, C. acetobutylicum ATCC 824의 total DNA를 주형으로 하고 서열번호 22와 서열번호 23의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 adc 프로모터와 RBS를 포함하는 adc 유전자 단편을 증폭하였고, C. acetobutylicum ATCC 824의 total DNA를 주형으로 하고 서열번호 24와 서열번호 25의 프라이머를 이용하여 ctfAB 유전자 단편을 증폭하였다.

[서열번호 22]: 5'-ATATGGATCCAAGTGTACTTTTATTTTCGAAAGC-3'

[서열번호 23]: 5'-AATCCCTCCTTTCCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTA-3'

[서열번호 24]: 5'-GTTACCTTAAATGGAAAGGAGGGATTAAAATGAACTCT-3 '

[서열번호 25]: 5'-ATATACGCGTCTAAACAGCCATGGGTCTAAGTT-3'

다음으로 상기 adc 유전자 및 ctfAB 유전자의 PCR 산물을 혼합한 것을 주형으로 하고, 상기 서열번호 22와 서열번호 25의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 adc 유전자와 ctfAB 유전자가 adc 프로모터에 의해 발현되는 인공 아세톤 오페론 가닥을 증폭하였다. 이 증폭된 산물을 BamHI과 MluI 제한효소로 처리한 뒤, 동일 제한 효소로 처리된 pTHL1-Cm 벡터와 함께 T4 DNA ligase로 처리하여 접합함으로써 재조합 플라스미드 pACT를 제조하였다.

그리고, 1차/2차 알코올 디하이드로제나제 유전자와 adc 프로모터, adc 터미네이터(terminator)를 클로닝하였다. 먼저, adc 터미네이터와 EagI 제한 효소 서열을 삽입하기 위해 서열번호 26과 27의 프라이머를 상보적으로 결합시킨 후, 위 산물과 BamHI과 EcoRI 제한 효소로 처리된 pUC18 벡터와 함께 T4 DNA ligase로 처리하여 접합함으로써 재조합 플라스미드 pUCadcT를 제조하였다.

[서열번호 26]: 5'-GATCCACTACGGCCGTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTAA TGC-3'

[서열번호 27]: 5'-AATTGCATTAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAAC TCTTATTTTTACGGCCGTA GTG-3'

그리고, C. acetobutylicum ATCC 824의 total DNA를 주형으로 하고, 서열번호 28과 29를 이용하여 PCR을 수행하여 adc의 RBS를 포함하지 않는 adc 프로모터 단편을 증폭한 후, 증폭된 산물을 제한효소 PstI과 BamHI으로 처리한 뒤, 동일 제한 효소로 처리된 pUCadcT 벡터와 함께 T4 DNA ligase로 처리하여 접합함으로써 재조합 플라스미드 pUCadcPT를 제작하였다.

[서열번호 28]: 5'-ATATCTGCAGAAGTGTACTTTTATTTTCGAAAGC-3'

[서열번호 29]: 5'-ATATGGATCCTAATAATGTTTAGCTTTTCTAACAT-3'

제작된 pUCadcPT에 고유의 RBS를 포함하는 1차/2차 알코올 디하이드로제나제 및 전자전달 단백질 유전자 단편을 삽입하기 위해 C. beijerinckii NRRL B-593의 total DNA를 주형으로 하고 서열번호 30과 31, 그리고 서열번호 30과 32의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 각각 adhI 및 adhI-hydg 단편을 증폭하였다.

[서열번호 30]: 5'-ATAT GGATCC TAAGGAGGAACATATTTTATGAAAG-3'

[서열번호 31]: 5'-ATAT CGGCCG TTATAATATAACTACTGCTTTAATTA-3'

[서열번호 32]: 5'-ATAT CGGCCG TTATTTATCACCTCTGCAACCAC-3'

증폭된 2종류의 산물 각각을 BamHI과 EagI 효소로 처리한 뒤, 동일 제한효소로 처리한 pUCadcPT 벡터와 함께 T4 DNA ligase로 처리하여 접합함으로써 각각 재조합 플라스미드 pSADH1과 pSADH2를 제조하였다.

pACT에 adc 프로모터와 터미네이터가 결합된 1차/2차 알코올 디하이드로제나제 및 전자전달 단백질 유전자를 삽입하기 위해 각각 pSADH1과 pSADH2를 주형으로 하고, 서열번호 33과 34의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 증폭된 2종류의 산물 모두를 SphI과 XmaI 제한 효소로 처리한 후, 동일 제한 효소로 처리한 pACT 벡터와 함께 T4 DNA ligase로 처리하여 접합함으로써 각각 재조합 플라스미드 pIPA3과 pIPA4를 제조하였다.

[서열번호 33]: 5'-CGGGCCTCTTCGCTATTACG-3'

[서열번호 34]: 5'-ATATCCCGGGGGAATTGTGAGCGGATAACA-3'

제작된 pIPA3과 pIPA4는 실시예 3에 기재된 것과 동일한 방법으로 메틸레이션시킨 후, Evolution을 통하여 에탄올 및 부탄올을 각각 10 g/l 이상 생산하는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 BKM19 (Clostridium acetobutylicum BKM19, KCTC 11555BP)에 도입하여 BKM19(pIPA3) 및 BKM19(pIPA4)를 제작하였다.

실시예 8: 이소프로판올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 균주에 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 추가 증폭한 재조합 변이 미생물의 고농도 혼합 알코올 생산

실시예 7에서 제작된 재조합 변이 미생물 BKM19(pIPA3)을 실시예 4와 동일한 방법으로 배양하여 아세톤 제거 및 알코올 생산능을 평가하였다. 그 결과, 아세톤 농도는 아세톤 생합성 회로가 증폭되었음에도 0.5 g/l 선에서 유지되었으며, 에탄올 5.6 g/l, 이소프로판올 5.2 g/l, 부탄올 18.5 g/l로 혼합 알코올의 총 생산량이 29.3 g/l까지 생산됨을 확인하였다. 이 또한, 지금까지 보고된 가장 높은 BEI 농도를 나타내며, 혼합 알코올 중 부탄올의 비율이 높은 특징을 가진다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology GS Caltex Corporation Biofuelchem <120> Recombinant Mutant Microorganisms Enhanced ability of Producing Butanol or Mixed Alcohol and Ability of Removing Acetone and Method for Preparing Butanol or Mixed Alcohol Using the Same <130> P10-B217 <150> KR10-2009-0089826 <151> 2009-09-22 <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ggccccaagc ttagaatgaa gtttcttatg cacaag 36 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aaactgcagt ctaactaacc tcctaaattt tgatac 36 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ccaagcttcg actttttaac aaaatatatt g 31 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccaagcttga cattaaaaaa ataagagtta cc 32 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aaaactgcag atgaaaggtt ttgcaatgct a 31 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cccccggggg tgtataatcc tccatgatct attatg 36 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cccccggggg ccttctacac atttaggatt cttac 35 <210> 8 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aattgcatgc taccgttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcacacg gtttaacgac 60 ttaattacg 69 <210> 9 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atattctaga accgttcgta tagcatacat tatacgaagt tatccatgat tacgaattct 60 atgagtcgac 70 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aaaactgcag ccatggtcgc cagttaatag tttgcg 36 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aaaacccggg cgccgcatac actattctca 30 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctagccatgg agcatatggg agtgtgctaa g 31 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cggccaacgc tcgcagtcag gtattatcat 30 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gcgaatggcg agatgaacta gctgatattg ctataa 36 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 acgtcccggg cgagtacagt ttcatccttc atatc 35 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ctgactgcga gcgttggccg attcat 26 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tagttcatct cgccattcgc cattca 26 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gaggataaag aatatacgca gg 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ttgccgtcct aaactctgaa 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cttcctttgg caattcaagt tc 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gtggattatg aagcggtgca 20 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 atatggatcc aagtgtactt ttattttcga aagc 34 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 aatccctcct ttccatttaa ggtaactctt attttta 37 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gttaccttaa atggaaagga gggattaaaa tgaactct 38 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 atatacgcgt ctaaacagcc atgggtctaa gtt 33 <210> 26 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gatccactac ggccgtaaaa ataagagtta ccttaaatgg taactcttat ttttttaatg 60 c 61 <210> 27 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 aattgcatta aaaaaataag agttaccatt taaggtaact cttattttta cggccgtagt 60 g 61 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 atatctgcag aagtgtactt ttattttcga aagc 34 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 atatggatcc taataatgtt tagcttttct aacat 35 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 atatggatcc taaggaggaa catattttat gaaag 35 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 atatcggccg ttataatata actactgctt taatta 36 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 atatcggccg ttatttatca cctctgcaac cac 33 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 cgggcctctt cgctattacg 20 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 atatcccggg ggaattgtga gcggataaca 30

Claims

숙주 미생물에 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 (A) 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능 및 (B) 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자는 adhI이고, 상기 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자는 hydG인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 adhI 및 hydG는 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii) NRRL B593 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 혼합 알코올은 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 혼합 알코올은 탄소수 2~10의 직쇄 또는 측쇄 알코올을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 (A) 아세틸코에이(acetyl-CoA) 생합성 경로; (B) 부티릴코에이(butyryl-CoA) 생합성 경로; (C) 아세톤 생합성 경로; (D) 에탄올 생합성 경로; (E) 부탄올 생합성 경로; (F) 이소부탄올 생합성 경로; (G) 프로판올 생합성 경로; 및 (H) 이소프로판올 생합성 경로로 구성된 군에서 선택되는 대사회로중 1개 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 (A) 아세트산 생합성 경로; (B) 부티르산 생합성 경로; (C) 젖산 생합성 경로; (D) 아세토인 생합성 경로; 및 (E) 수소 생합성 경로로 구성된 군에서 선택되는 생합성 경로중 1개 이상의 생합성 경로가 완전히 차단되거나 조절되어 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 추가로 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 아세토아세테이트 디카르복실라제(acetoacetate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(adc) 및 CoA 트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfA, ctfB)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG)를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 (A) 부탄올 또는 (B) 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법.
클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI), 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG), 아세토아세테이트 디카르복실라제(acetoacetate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(adc) 및 CoA 트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfA, ctfB)를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 (A) 부탄올 또는 (B) 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물은 (A) 아세트산 생합성 경로; (B) 부티르산 생합성 경로; (C) 젖산 생합성 경로; (D) 아세토인 생합성 경로; 및 (E) 수소 생합성 경로로 구성된 군에서 선택되는 생합성 경로중 1개 이상의 생합성 경로가 완전히 차단되거나 조절되어 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
숙주 미생물에 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 (A) 부탄올 또는 혼합 알코올 생성능 및 (B) 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물.
제15항에 있어서, 상기 부티릴코에이(butyryl-CoA) 또는 부틸알데히드(butylaldehyde)로부터 부탄올을 생산하는데 관여하고, 아세톤으로부터 이소프로판올을 생산하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 변이 미생물.
제16항에 있어서, 상기 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자는 adhI이고, 상기 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자는 hydG인 것을 특징으로 하는 재조합 변이 미생물.
제17항에 있어서, 상기 adhI 및 hydG는 클로스트리듐 바이예링키아이(Clostridium beijerinckii) NRRL B593 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 변이 미생물.
제15항에 있어서, 상기 혼합 알코올은 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 변이 미생물.
제19항에 있어서, 상기 혼합 알코올은 탄소수 2~10의 직쇄 또는 측쇄 알코올을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 변이 미생물.
제15항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 (A) 아세틸코에이(acetyl-CoA) 생합성 경로; (B) 부티릴코에이(butyryl-CoA) 생합성 경로; (C) 아세톤 생합성 경로; (D) 에탄올 생합성 경로; (E) 부탄올 생합성 경로; (F) 이소부탄올 생합성 경로; (G) 프로판올 생합성 경로; 및 (H) 이소프로판올 생합성 경로로 구성된 군에서 선택되는 대사회로중 1개 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 변이 미생물.
제15항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 (A) 아세트산 생합성 경로; (B) 부티르산 생합성 경로; (C) 젖산 생합성 경로; (D) 아세토인 생합성 경로; 및 (E) 수소 생합성 경로로 구성된 군에서 선택되는 생합성 경로중 1개 이상의 생합성 경로가 완전히 차단되거나 조절되어 있는 것임을 특징으로 하는 재조합 변이 미생물.
제15항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 변이 미생물.
제15항에 있어서, 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 추가로 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 변이 미생물.
제24항에 있어서, 상기 아세톤 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 아세토아세테이트 디카르복실라제(acetoacetate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(adc) 및 CoA 트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfA, ctfB)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 변이 미생물.
클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG)가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 (A) 부탄올 또는 (B) 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물.
클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI), 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG), 아세토아세테이트 디카르복실라제(acetoacetate decarboxylase)를 코딩하는 유전자(adc) 및 CoA 트랜스퍼라제(CoA transferase)를 코딩하는 유전자(ctfA, ctfB)가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 (A) 부탄올 또는 (B) 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올 생성능이 증가된 재조합 변이 미생물.
제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물은 (A) 아세트산 생합성 경로; (B) 부티르산 생합성 경로; (C) 젖산 생합성 경로; (D) 아세토인 생합성 경로; 및 (E) 수소 생합성 경로로 구성된 군에서 선택되는 생합성 경로중 1개 이상의 생합성 경로가 완전히 차단되거나 조절되어 있는 것임을 특징으로 하는 재조합 변이 미생물.
제14항 내지 제25항중 어느 한 항의 재조합 변이 미생물을 배양하여 부탄올 또는 혼합 알코올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올 또는 혼합 알코올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올 또는 혼합 알코올의 제조방법.
제26항 내지 제28항중 어느 한 항의 재조합 변이 미생물을 배양하여 (A) 부탄올 또는 (B) 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 (A) 부탄올 또는 (B) 부탄올 및 이소프로판올을 포함하는 혼합 알코올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올 또는 혼합 알코올의 제조방법.
최종 산물로 아세톤을 생산하는 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG)를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법.
최종 산물로 아세톤을 생산하는 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI)를 증폭 또는 도입시키는 것을 특징으로 하는 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물의 제조방법.
최종 산물로 아세톤을 생산하는 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI) 및 전자전달 단백질(electron-transfer protein)을 코딩하는 유전자(hydG)가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물.
최종 산물로 아세톤을 생산하는 클로스트리듐(Clostridium) 속 미생물에 1차/2차 알코올 디하이드로제나제를 코딩하는 유전자(adhI)가 증폭 또는 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 아세톤 제거능이 증가된 재조합 변이 미생물.