KR20230096206A - 아이소프로판올 생산능력이 강화된 재조합 미생물 및 이를 이용한 아이소프로판올의 생산 방법 - Google Patents

아이소프로판올 생산능력이 강화된 재조합 미생물 및 이를 이용한 아이소프로판올의 생산 방법 Download PDF

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고영진
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Abstract

본 발명은 아이소프로판올 생산용 발현 카세트; 상기 발현 카세트를 포함하는 아이소프로판올 생산용 재조합 벡터; 상기 벡터가 도입된 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물; 및 상기 재조합 미생물을 이용한 아이소프로판올 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아이소프로판올 생산경로에 숙신산 우회 대사경로가 도입된 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물은 아이소프로판올의 생산능이 현저히 증가된 효과를 갖는다. 특히, 본 발명의 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물의 경우 기존에 알려진 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 아이소프로판올 생산량 대비 최대 수치보다 약 100배 높은 생산량을 갖는다. 따라서 본 발명의 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물은 아이소프로판올을 효과적으로 생산할 수 있는바, 아이소프로판올이 활용되는 다양한 산업 분야에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 미생물을 이용하면 글루코스를 활용하여 석유를 대체할 수 있는 바이오매스 유래 화학제품 제조를 위한 고부가가치 아이소프로판올 물질을 친환경적으로 생산할 수 있다.

Description

아이소프로판올 생산능력이 강화된 재조합 미생물 및 이를 이용한 아이소프로판올의 생산 방법{Recombinant Microorganism for Enhancing Isopropanol Productivity and Method for Producing Isopropanol Using The Same}
본 발명은 아이소프로판올 생산용 발현 카세트; 상기 발현 카세트를 포함하는 아이소프로판올 생산용 재조합 벡터; 상기 벡터가 도입된 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물; 및 상기 재조합 미생물을 이용한 아이소프로판올 생산 방법에 관한 것이다.
아이소프로판올은 1-프로판올 (1-propanol)의 구조 이성질체이며 중심 탄소에 부착된 수소 중 하나가 히드록시기(-OH)로 치환된 프로판 (propane)이다. 양성자성 용매 (protic solvent)로서의 역할을 하며 2차 지방산 (secondary fatty acid)이자 2차 알코올 (secondary alcohol)이다. 아이소프로판올은 글루코스 (glucose)를 출발물질로 ATP, NADPH 조효소를 사용하는 경로를 통하여 생합성된다.
아이소프로판올은 분자식 C3H8O의 강한 냄새가 나는 무색의 가연성 화학약품이다. 대다수의 아이소프로판올은 무극성 물질을 용해하며 자기 얼룩을 남기지 않고 쉽게 증발하는 특징이 있어 반도체, LCD 등 IT 부품 세정액으로 많이 활용되며, 페인트, 잉크 등의 코팅 또는 산업 공정용 용매로도 사용된다.
발효를 통한 이소프로판올의 생산은 클로스트리디움 베이저링키 (Clostridium beijerinkii)NRRL B592, C. beijerinkii NRRL B593, C. beijerinkii IAM 19015, C. beijerinkii ATCC 14823, C. beijerinkii NCIMB 9581 등 일부 클로스트리듐 균주에서 가능하다. 하지만, 상기의 균주들이 생산하는 이소프로판올의 생산 농도는 매우 낮은 문제점이 있다.
한편, 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰은 그람양성 균주이며 고밀도 성장제한에 적합한 균주로 아이소프로판올을 생산하는데 적합하다고 판단된다. 다만, 기존 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 아이소프로판올 생산은 생산량이 적고 글루코스를 많이 이용하지 않는 문제가 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 아이소프로판올의 생산량을 향상시킬 수 있는 기술을 개발하고자 하였으며, 그 결과 아이소프로판올 생산경로에 숙신산 우회 대사경로를 도입한 재조합 미생물의 경우 아이소프로판올 생산능이 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2013-0129654호 한국등록특허 제10-1284015호
따라서 본 발명의 목적은 아이소프로판올 생산용 제1 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 아이소프로판올 생산용 제2 발현 카세트 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제1 발현 카세트를 포함하는 아이소프로판올 생산용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제2 발현 카세트를 포함하는 아이소프로판올 생산용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 2종의 벡터가 도입된 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 아이소프로판올 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 thlA 유전자; 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 atoD 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 atoA 유전자; 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 adc 유전자; 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 sadh 유전자를 포함하는 아이소프로판올 생산용 제1 발현 카세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 phaA 유전자; 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 oxctA 유전자; 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 oxctB 유전자를 포함하는 아이소프로판올 생산용 제2 발현 카세트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제1 발현 카세트는 유전자 발현 강화 프로모터를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 발현 강화 프로모터는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 L10 프로모터, 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 I16 프로모터 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 H36 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제2 발현 카세트는 Tac 프로모터를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Tac 프로모터는 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 아이소프로판올 생산용 제1 발현 카세트를 포함하는 아이소프로판올 생산용 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아이소프로판올 생산용 제2 발현 카세트를 포함하는 아이소프로판올 생산용 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 2종의 벡터가 도입된 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 아이소프로판올 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 미생물은 소듐 시트레이트 (Sodium Citrate)를 포함하는 배지에서 배양할 수 있다.
본 발명에 따른 아이소프로판올 생산경로에 숙신산 우회 대사경로가 도입된 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물은 아이소프로판올의 생산능이 현저히 증가된 효과를 갖는다. 특히, 본 발명의 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물의 경우 기존에 알려진 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 아이소프로판올 생산량 대비 최대 수치보다 약 100배 높은 생산량을 갖는다. 따라서 본 발명의 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물은 아이소프로판올을 효과적으로 생산할 수 있는바, 아이소프로판올이 활용되는 다양한 산업 분야에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 미생물을 이용하면 글루코스를 활용하여 석유를 대체할 수 있는 바이오매스 유래 화학제품 제조를 위한 고부가가치 아이소프로판올 물질을 친환경적으로 생산할 수 있다.
도 1a 및 1b는 본 발명에서 구축된 재조합 벡터의 백터맵을 나타낸 것이다.
도 2는 아이소프로판올 대사경로 유전자를 도입한 재조합 코리네박테리움 균주의 세포 성장 및 대사산물 생산을 확인한 결과이다(2a: 세포 성장률 및 글루코스 소모량, 2b: 아세톤 생산량, 2c: 아이소프로판올 생산량).
도 3은 아이소프로판올 대사경로 유전자와 함께 발현 강화를 위하여 합성 프로모터를 도입한 재조합 코리네박테리움 균주의 세포 성장 및 대사산물 생산을 확인한 결과이다(3a: 세포 성장률 및 글루코스 소모량, 3b: 아세톤 생산량, 3c: 아이소프로판올 생산량, 3d: 젖산 생산량, 3e: 아세트산 생산량, 3f: 숙신산 생산량).
도 4는 아이소프로판올 대사경로 유전자 및 숙신산 우회경로 관련 유전자를 함께 도입한 재조합 코리네박테리움 균주의 세포 성장 및 대사산물 생산을 확인한 결과이다(4a: 세포 성장률 및 글루코스 소모량, 4b: 아세톤 생산량, 4c: 아이소프로판올 생산량, 4d: 젖산 생산량, 4e: 아세트산 생산량, 4f: 숙신산 생산량).
도 5는 본 발명의 아이소프로판올 생산용 재조합 코리네박테리움 균주의 주요 성분 한정 혼합배지에서의 세포 성장 및 대사산물 생산을 확인한 결과이다(5a: 세포 성장률 및 글루코스 소모량, 5b: 아이소프로판올 생산량).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 thlA 유전자; 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 atoD 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 atoA 유전자; 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 adc 유전자; 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 sadh 유전자를 포함하는 아이소프로판올 생산용 제1 발현 카세트, 및 이를 포함하는 아이소프로판올 생산용 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, thlA 유전자는 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼레이즈 (acetyl-CoA acetyltransferase)를 코딩하는 유전자로서, 본 발명의 thlA 유전자는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum) 균주로 부터 유래될 수 있으며, 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명에 있어서, atoD 유전자는 아세테이트-CoA 트랜스퍼레이즈 서브유닛 알파 (Acetate CoA-transferase subunit alpha)를 코딩하는 유전자로서, 본 발명의 atoD 유전자는 대장균 (Escherichia coli)으로 부터 유래될 수 있으며, 서열번호 2의 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명에 있어서, atoA 유전자는 아세테이트-CoA 트랜스퍼레이즈 서브유닛 베타 (Acetate CoA-transferase subunit beta, atoA)를 코딩하는 유전자로서, 본 발명의 atoA 유전자는 대장균 (Escherichia coli)으로 부터 유래될 수 있으며, 서열번호 3의 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명에 있어서, adc 유전자는 아세토아세테이트 디카복실레이즈 (acetoacetate decarboxylase)를 코딩하는 유전자로서, 본 발명의 adc 유전자는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum) 균주로 부터 유래될 수 있으며, 서열번호 4의 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명에 있어서, sadh 유전자는 아이소프로판올 수소이탈효소 (Secondary alcohol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로서, 본 발명의 sadh 유전자는 클로스트리듐 바이예링키아이 (Clostridium beijerinckii) 균주로 부터 유래될 수 있으며, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 잘 발현이 될 수 있도록 코돈 최적화(codon optimization)할 수 있다. 코돈 최적화된 sadh 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 phaA 유전자; 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 oxctA 유전자; 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 oxctB 유전자를 포함하는 아이소프로판올 생산용 제2 발현 카세트, 및 이를 포함하는 아이소프로판올 생산용 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, phaA 유전자는 베타-케토티올레이즈 (Beta-ketothiolase)를 코딩하는 유전자로서, 본 발명의 phaA 유전자는 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 혹은 쿠프리아비두스 네카토르 (Cupriavidus necator) 균주로 부터 유래될 수 있으며, 서열번호 6의 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명에 있어서, oxctA 유전자는 아세토아세테이트 CoA-트랜스퍼레이즈 (Acetoacetate CoA-transferase)를 코딩하는 유전자로서, 본 발명의 oxctA 유전자는 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 혹은 쿠프리아비두스 네카토르 (Cupriavidus necator) 균주로 부터 유래될 수 있으며, 서열번호 7의 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명에 있어서, oxctB 유전자는 피루브산 탈수소효소 E1 요소 (Pyruvate dehydrogenase E1 component)를 코딩하는 유전자로서, 본 발명의 oxctB 유전자는 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 혹은 쿠프리아비두스 네카토르 (Cupriavidus necator) 균주로 부터 유래될 수 있으며, 서열번호 8의 염기서열로 표시될 수 있다.
본 발명의 상기 제1 발현 카세트는 유전자 발현 강화 프로모터를 더 포함하는 것이 바람직하다.
상기 유전자 발현 강화 프로모터는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 L10 프로모터, 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 I16 프로모터 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 H36 프로모터 등을 예시할 수 있으나, 특별히 이를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 상기 제2 발현 카세트는 Tac 프로모터를 더 포함할 수 있으며, 상기 Tac 프로모터는 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 발현 카세트는 프로모터와 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고 있어서, 프로모터 하류에 작동 가능하게 연결되어 있는 목적단백질을 생산하기 위해 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다. 이와 같은 발현 카세트의 내부 또는 외부에는 상기 목적 단백질의 효율적인 생산을 도울 수 있는 다양한 인자가 포함될 수 있다. 상기 목적 단백질 발현 카세트는 구체적으로, 프로모터 서열 하류에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다.
또한, 유전자의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 8개의 유전자(thlA, atoD, atoA, adc, sadh, phaA, oxctA, oxctB)는 각 유전자에 해당하는 서열번호의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 ‘작동 가능하게 연결’이란 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 유전자 서열과 프로모터 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, ‘본 발명의 발현 카세트’는 숙주 세포의 염색체 내에 삽입되어 재조합 미생물을 제조하는 데 사용될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 있어 상기 발현 카세트를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다. 발현 카세트를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자 조작방법을 사용할수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법이 있다.
본 발명에 있어서, 벡터 (vector)는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.
본 발명에 있어서 재조합 벡터는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator), 인핸서 (enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 2종의 재조합 벡터(제1 발현 카세트를 포함하는 아이소프로판올 생산용 재조합 벡터 및 제2 발현 카세트를 포함하는 아이소프로판올 생산용 재조합 벡터)가 도입된 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 본 발명의 상기 2종의 재조합 벡터(제1 발현 카세트를 포함하는 아이소프로판올 생산용 재조합 벡터 및 제2 발현 카세트를 포함하는 아이소프로판올 생산용 재조합 벡터)로 형질전환된 것을 말한다. 본 발명에서 ‘형질전환’은 본 발명에 따른 프로모터, 또는 추가적으로 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입 하는 것을 의미한다. 또한, 형질전환 된 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2종의 재조합 벡터(제1 발현 카세트를 포함하는 아이소프로판올 생산용 재조합 벡터 및 제2 발현 카세트를 포함하는 아이소프로판올 생산용 재조합 벡터)는 미생물에 순차적으로 도입될 수 있고, 상호 간 순서가 바뀌어 도입될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 아이소프로판올 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물은 코리네박테리움(Clostridium) 속 균주일 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.
본 발명의 아이소프로판올 생산 방법에 있어서, 상기 재조합 미생물은 소듐 시트레이트를 포함하는 배지에서 배양하는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
재료
클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum ATCC 824) 은 엄영순 박사 연구팀(KIST)으로부터 수득하였고; 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha H16) 혹은 쿠프리아비두스 네카토르 (Cupriavidus necator H16(KCTC 1006))는 생물자원센터(KCTC)에서 구입하였으며; pMT-tac 벡터는 실험실에서 자체 제작하였고(대한민국 등록특허 제10-1756338호 참조); pEKEx2 벡터는 우한민 교수 연구팀(성균관대)으로부터 수득하였으며; Bacto Brain Heart Infusion (BHI) 배지는 BD(Becton, Dickinson and Company, di-237500)에서 구입하였다. 참고로, 랄스토니아 유트로파 H16과 쿠프리아비두스 네카토르 H16은 동일한 균주이다.
<실시예 1>
t hlA, atoD, atoA, adc, sadh, phaA, oxctA, oxctB 유전자원 확보
코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 아이소프로판올 대사경로와 관련하여 유전자를 이종발현 및 과발현하였다. 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum ATCC 824) 의 지노믹 DNA (genomic DNA, gDNA)로부터 아세틸 코에이 (acetyl-CoA) 아세틸트랜스퍼라아제 (acetyltransferase)를 코딩하는 유전자 thlA와 아세토아세테이트 디카르복실라아제 (acetoacetate decarboxylase)를 코디하는 유전자 adc를 확보하였다. 대장균 (Escherichia coli)의 gDNA에서 아세테이트 코에이 트랜스퍼라아제 서브유닛 알파 (Acetate CoA-transferase subunit alpha)를 코딩하는 유전자 atoD와 아세테이트 코에이 트랜스퍼라아제 서브유닛 베타 (Acetate CoA-transferase subunit beta)를 코딩하는 유전자 atoA를 확보하였다. 클로스트리듐 바이예링키아이 (Clostridium beijerinckii NRRL B593) 유래의 이소프로판올 디하이드로지네이즈 (Isopropanol dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 sadh는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 잘 발현이 될 수 있도록 코돈 최적화(codon optimization)하였다.
숙신산 대사경로 강화에 관여하는 유전자들의 경우, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha H16) 혹은 쿠프리아비두스 네카토르 (Cupriavidus necator H16) 로 알려진 균주의 gDNA로부터 베타 케토티올라아제 (Beta-ketothiolase)를 코딩하는 유전자 phaA와 아세토아세테이트 코에이 트랜스퍼라아제 (Acetoacetate CoA-transferase)를 코딩하는 유전자 OxctA, 피루베이트 디하이드로지네이즈 E1 성분 (Pyruvate dehydrogenase E1 component)을 코딩하는 유전자 OxctB를 확보하였다.
각각의 유전자는 lacI에 의해 발현이 조절되고 고발현 tac 프로모터를 가지는 pMT-tac 또는 pEKEx2 벡터로 클로닝하기 위하여 벡터의 해당 제한효소 서열을 포함하여 각각의 정, 역방향 프라이머를 합성하였으며, 합성된 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 각 유전자원의 프라이머 정보는 하기 표 1에 제시하였고, 상기 작성된 유전자 순서대로 정, 역방향 프라이머를 나타낸다.
그 결과, 1179bp의 thlA 유전자, 663bp의 atoD 유전자, 651bp의 atoA 유전자, 735bp의 adc 유전자, 합성된 1056bp의 sadh 유전자, 1182bp의 phaA 유전자, 702bp의 OxctA 유전자, 639bp의 OxctB 유전자를 확보하였다. 각각 유전자의 염기서열은 서열번호 1 내지 8에 나타내었다. 한편, 본 발명에서는 도입된 유전자의 발현 강화를 위하여 합성 프로모터로 L10, I16, H36을 사용하였으며, 이들 각각 유전자의 염기서열은 서열번호 9 내지 11로 나타내었다.
유전자 증폭에 사용된 프라이머 서열
프라이머 시퀀스 (5’-> 3’) a) 서열번호
thlA_PstI_F AGACTGCAGATGAAAGAAGTTGTAATAGCTAGTGC 13
thlA_SalI_R TGAGTCGACCTAGCACTTTTCTAGCAATATTGCT 14
atoD_SalI_F ATAGTCGACAAGGAGATATACATGAAAACAAAATTGATGACATTAC 15
atoA_BamHI_R ATAGGATCCTCATAAATCACCCCGTTGCGTATTC 16
adc_BamHI_F ATAGGATCCAAGGAGATATACATGTTAAAGGATGAAGTAATTAAAC 17
adc_KpnI_R TATGGTACCTTACTTAAGATAATCATATATAACTTCAGC 18
sAdh(opt)_KpnI_F TAGGTACCAAGGAGATATACATGAAGGGTTTCGCAATGCTTG 19
sAdh(opt)_SacI_R ATAGAGCTCTTAAAGGATAACCACTGCTTTGATGAGG 20
L10_GA_F TGATTTCATCAGGAATGGGCAGACGGTTATGGTCGC 21
L10_GA_R ACAACTTCTTTCATGGATCCAATCTATCTCCTTCAACAATAAATAAC 22
I16_GA_F TGATTTCATCAGGAATGGAGACACCGCGTGCCCGTTAT 23
I16_GA_R ACAACTTCTTTCATGGATCCCAATAATATCCTGTAGCCCACCACA 24
H36_GA_F CATCAGGAATGGGTCGACTCTATCTGGTGCCCTAAACGG 25
H36_55_R AATGGATCCCATGCTACTCCTACCAACCA 26
PhaA_ClaI_F TCATATCGATATGACTGACGTTGTCATCGTATCCG 27
PhaA_BamHI_R AATGGATCCTTATTTGCGCTCGACTGCCAGC 28
OxctA_GA_F TCGAGCGCAAATAAGGATCCAAGGAGATATAGATGAACAAGGTCTACGCCAGCG 29
OxctA_GA_R GCCATCTATATCTCCTTTTAGCTGGCCGCGCGCACG 30
OxctB_GA_F GCTAAAAGGAGATATAGATGGCATGGACACGTGACGA 31
OxctB_GA_R AAACAGGCGGCCGCGGTACCTTACAGCAGCGGAGCGCCA 32
L10_POX_GA_F AAAACTTTTCGGGATCTCGAGGCAGACGGTTATGGTCGCCG 33
L10_POX_GA_R ACAACGTCAGTCATATCGATAATCTATCTCCTTCAACAATAAATA 34
I16_POX_GA_F AAAACTTTTCGGGATCTCGAGAGACACCGCGTGCCCGTTAT 35
I16_POX_GA_R ACAACGTCAGTCATATCGATCAATAATATCCTGTAGCCCACCACA 36
pMT_H36_GA_F AAACTTTTCGGGATCTCGAGTCTATCTGGTGCCCTAAACGGGGGA 37
pMT_H36_GA_R GATGACAACGTCAGTCATGGATCCCATGCTACTCCTACCAACCAAGGTG 38
a) 밑줄 친 염기서열은 리보솜 결합 부위 (Ribosome binding site, RBS)를 표시한 것임.
<실시예 2>
확보된 t hlA, atoD, atoA, adc, sadh, phaA, oxctA, oxctB 유전자원을 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물 제작
재조합 벡터 구축을 위해 pMTC와 pEKEx2 벡터를 E. coli-C. glutamicum 셔틀벡터로 이용하였으며, pMTC 벡터의 경우 ‘AAGGAGATATAG’, pEKEx2 벡터의 경우 ‘AAGGAGATATAC’를 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site, RBS)로 사용하여 유전자 앞에 삽입하였다. 이때, thlA, atoA, phaA 유전자의 경우, 앞쪽에 프로모터가 존재하거나 유전자와 결합되어 있어 RBS 삽입이 필요하지 않았다. T4 DNA 라이게이션을 위해 삽입 DNA와 벡터 DNA는 적절한 제한 효소(New England Biolab)에 의해 각각 분해된 후 혼합물 형태에서 T4 DNA ligase(Enzynomics)로 연결되었다. Gibson assembly를 위해 삽입 DNA는 요구될 때 DpnI으로 처리하고 벡터 DNA는 적절한 제한 효소에 의해 분해된 후 혼합물 형태에서 Gibson assembly 키트(New England Biolab)로 연결되었다. 재조합 벡터 구축을 위한 모든 실험은 제조업체의 지침에 따라 수행되었다. 본 발명에서 구축된 모든 재조합 벡터는 하기 표 2에서 자세히 정리하였으며, 각각의 벡터맵은 도 1a 및 1b에 나타내었다. 재조합 벡터의 대장균으로의 형질전환은 42℃ 열충격방법으로 수행하였다.
대장균에서 합성된 재조합 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로 이종 발현시키기 위한 형질전환 방법은 다음과 같은 순서로 수행하였다. 극저온(-80℃)에서 보관한 Competent 상태의 코리네박테리움 균주를 15분 동안 천천히 해동시켰다. 그런 다음 목표 유전자를 80 μl의 Competent 세포에 주입하였다. 20분 동안 얼음에서 대기 후, 세포를 전기 천공을 위해 미리 냉각된 0.2cm 큐벳 (Bio-Rad, USA)으로 옮겼다. 전기 천공 법은 2.5kV의 전압과 200Ω의 저항값으로 수행되었다. 이후 세포를 포함한 큐벳에 솔비톨과 글루코오스를 포함하는 BHI(Brain-heart infusion)배지(BHISG) 1ml를 즉시 넣은 후 46℃에서 6분간 열충격 처리를 하였다. 30℃에서 2-3시간 동안 회복한 후, 세포를 카나마이신 (25 mg/L)과 스펙티노마이신 (100 mg/L)이 포함 된 BHISG 배지 한천 플레이트에 뿌린 다음 30℃에서 2-3일 동안 배양하였다.
재조합 미생물의 형질전환 확인을 위해 다음과 같이 colony PCR을 수행하였다. 한 개의 콜로니를 확보한 후 pEKEx2 벡터 확인의 경우 pBL1 origin 부위를, pMTC 벡터 확인의 경우 pCG1 부위를 타겟하여 재조합 벡터의 구축을 확인하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰으로의 형질전환은 상기의 방법과 동일하게 수행하였다. 본 발명에서 구축된 모든 재조합 미생물은 표 3에서 자세히 나타내었다.
본 발명에서 구축된 재조합 벡터
벡터 관련 특성
pEKEx2 Ptac, lacI, KanR, pBL1 ori ; C. glutamicum-E. coli shuttle vector for regulating gene expression
pEKEx2_C pEKEx2 carrying adc gene from Clostridium acetobutylicum ATCC 824
pEKEx2_DAC pEKEx2 carrying atoD, atoA genes from E. Coli and adc gene
pEKEx2_TDAC pEKEx2 carrying thlA gene from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 and atoD, atoA, adc genes
pEKEx2_TDACH pEKEx2 carrying thlA, atoD, atoA, adc genes and sadh gene from Clostridium beijerinckii codon optimized for C. glutamicum
pEKEx2_L10-TDACH pEKEx2 carrying thlA, atoDA, adc, sadh genes with promoter change to PL10
pEKEx2_I16-TDACH pEKEx2 carrying thlA, atoDA, adc, sadh genes with promoter change to PI16
pEKEx2_H36-TDACH pEKEx2 carrying thlA, atoDA, adc, sadh genes with promoter change to PH36
pMTC Ptac, lacI, AmpR, CmR, pCG1 ori ; C. glutamicum-E. coli shuttle vector
pMTC_TDA pMTC carrying thlA, atoD, atoA genes
pMTC_POX pMTC carrying phaA, OxctA, OxctB genes from Ralstonia eutropha
pMTC_L10-POX pMTC carrying phaA, OxctA, OxctB genes with promoter change to PL10
pMTC_I16-POX pMTC carrying phaA, OxctA, OxctB genes with promoter change to PI16
pMTC_H36-POX pMTC carrying phaA, OxctA, OxctB genes with promoter change to PH36
본 발명의 변이 미생물
균주 관련 특성
Escherichia coli DH5α F-, deoR, endA1, gyrA96, hsdR17(rk-mk+), recA1, relA1, supE44, thi-1, Δ(lacZYA-argF)U169, (Phi80lacZdelM15)
C. glutamicum ATCC 13032 Wild-type
TDA / H36-TDACH C. glutamicum ATCC 13032 derivative; [pMTC_TDA with pEKEx2_H36-TDACH]
POX / H36-TDACH C. glutamicum ATCC 13032 derivative; [pMTC_POX with pEKEx2_ H36-TDACH]
L10-POX / H36-TDACH C. glutamicum ATCC 13032 derivative; [pMTC_L10-POX with pEKEx2_ H36-TDACH]
I16-POX / H36-TDACH C. glutamicum ATCC 13032 derivative; [pMTC_I16-POX with pEKEx2_ H36-TDACH]
H36-POX / H36-TDACH C. glutamicum ATCC 13032 derivative; [pMTC_H36-POX with pEKEx2_ H36-TDACH]
<실시예 3>
재조합 미생물을 이용한 아이소프로판올 생산 확인
유전자 클로닝을 위한 대장균의 배양은 5 g/L 효모 추출물, 10 g/L 트립톤 및 10 g/L NaCl로 구성된 LB 배지를 사용하였다. 코리네박테리움 균주의 전배양은 37 g/L BHI 배지, 91 g/L 솔비톨 (Sorbitol) 및 20 g/L 포도당 글루코스로 구성된 영양배지에서 수행하였다. 목표 산물 생산을 위한 본 배양은 15g/L 암모늄 클로라이드 (NH4Cl), 10 g/L 암모늄 설페이트 ((NH4)2SO4), 10 g/L 소듐 시트레이트 (Na3C6H5O7), 40 g/L 포도당 글루코스, 10 g/L 효모 추출물, 1 g/L 요소, 0.5 g/L 포타슘 디하이드로젠 포스페이트 (KH2PO4), 0.5 g/L 제2인산칼륨 (K2HPO4), 1 g/L MgSO4·7H2O, 200 μg/L 비오틴 및 100 μg/L 티아민이 포함된 혼합배지에서 수행되었다. 카나마이신 (25 mg/L), 암피실린 (대장균의 경우 50 mg/L), 클로람페니콜 (대장균의 경우 33 mg/L, 코리네박테리움 글루타미쿰의 경우 10 mg/L)을 필요한 경우 배지에 첨가하였다. 1 mM 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG), 1X trace element (10 g/L Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate, 10 g/L Manganese(Ⅱ) sulfate, 1 g/L Zinc sulfate hepta-hydrate, 0.31 g/L Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate 그리고 0.02 g/L Nickel(Ⅱ) chloride hexahydrate)를 플라스크 배양 시작 시에 각각 첨가하고 회분식 배양을 진행하였다. 혼합 배지 내 아이소프로판올 생산에 주요한 역할을 하는 성분을 찾기 위해 암모늄 클로라이드 (Ammonium chloride)가 제외된 혼합배지와 소듐 시트레이트 (Sodium citrate)가 제외된 혼합배지에서 배양을 진행하였다.
플라스크 배양과정은 다음과 같이 수행되었다. 극저온에서 보관된 모든 야생형 및 재조합 코리네박테리움은 BHISG 한천 플레이트에 스트리킹 (streaking)하고 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 한 개의 콜로니를 20 mL의 BHISG 배지에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 16시간 동안 전 배양하였다. 전 배양된 세포는 50 mL의 CGAF 배지를 포함하는 250 mL 진탕 플라스크 (baffled flask)에 광학밀도 (Optical density, OD) 600 파장 값 1의 농도로 접종되었다. 본 배양은 30℃, 200 rpm에서 48시간 동안 진탕 배양하였다.
세포성장은 UV-vis 분광 광도계 (Mecasys Co., Ltd.)를 사용하여 광학밀도 600 파장 값에서 측정되었다. 세포 내 아이소프로판올, 포도당과 각종 유기산의 측정을 위한 전처리과정은 다음과 같다. 세포만 확보하기 위해 배양액 1 mL는 13000 rpm에서 2분 동안 원심 분리되었다. 세포 추출에서 얻은 상층액으로 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템 (Waters Corporation)을 사용하여 정량 분석하였다.
그 결과는 도 2 내지 5에 자세히 나타내었다.
먼저, 아이소프로판올 대사경로 유전자를 도입한 재조합 코리네박테리움 균주의 세포 성장 및 대사산물 생산을 확인한 결과, pEKEx2_TDAC 벡터가 도입된 코리네박테리움 균주에서는 아세톤이 생산되는 것으로 나타났으며(도 2b 참조), pEKEx2_TDACH 벡터가 도입된 코리네박티리움 균주에서만 0.53 g/L의 아이소프로판올이 생산되는 것을 확인하였다(도 2c 참조).
또한, 아이소프로판올 대사경로 유전자와 함께 발현 강화를 위하여 합성 프로모터를 도입한 재조합 코리네박테리움 균주의 세포 성장 및 대사산물 생산을 확인하였다. 그 결과 기존 tac 프로모터를 사용한 균주 대비 합성 프로모터(L10, I16, H36)를 도입한 균주에서 전반적으로 아이소프로판올의 생산이 증대되는 것으로 나타났다(도 3c 참조). 자세하게는, pEKEx2_L10-TDACH 벡터가 도입된 코리네박테리움 균주에서는 0.53 g/L의 아이소프로판올이 생산되었으며, pEKEx2_I16-TDACH 벡터가 도입된 코리네박테리움 균주에서는 0.7 g/L의 아이소프로판올이 생산되었고, pEKEx2_H36-TDACH 벡터가 도입된 코리네박테리움 균주에서는 0.94 g/L의 아이소프로판올이 생산되는 것으로 나타났다. 이러한 수치는 기존 tac 프로모터를 이용했을 때보다 1.8 배 증가한 수치이다. 한편, 아이소프로판올 이외에 부수적인 대사산물로서 젖산(도 3d 참조), 아세트산(도 3e 참조) 및 숙신산(도 3f 참조)이 생산되었으며, pEKEx2_H36-TDACH 벡터가 도입된 코리네박테리움 균주의 경우 다른 재조합 균주 대비 숙신산이 높게 생산되는 것으로 나타났다.
또한, 아이소프로판올 대사경로 유전자 및 숙신산 우회경로 관련 유전자를 함께 도입한 재조합 코리네박테리움 균주의 세포 성장 및 대사산물 생산을 확인하였다. 그 결과 pEKEx2_H36-TDACH 및 pMTC_POX 2종의 벡터가 도입된 코리네박테리움 균주에서 1.7 g/L의 아이소프로판올이 생산되는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 대조군인 pEKEx2_ H36-TDACH 벡터가 도입된 코리네박테리움 균주(0.76 g/L) 대비 2.24 배 증대된 아이소프로판올 생산량을 보여주었다(도 4c 참조). 상기 재조합 균주의 경우 증대된 아이소프로판올 생산 능력과 더불어, 아세톤의 생산 능력도 증대된 것을 확인할 수 있었다(도 4b 참조). 다만, pEKEx2_H36-TDACH 및 pMTC_L10-POX(또는 pMTC_I16-POX, pMTC_H36-POX) 2종의 벡터가 도입된 코리네박테리움 균주의 경우 각각 0.94, 0.82, 0.74 g/L의 아이소프로판올이 생산되는 것으로 나타나, 실제적으로 pEKEx2_H36-TDACH 벡터가 단독으로 도입된 코리네박테리움 균주 대비 2종의 벡터 도입에 따른 효과의 증대는 보여주지 못하였다. 이러한 결과를 통해, pEKEx2_H36-TDACH 및 pMTC_POX 2종의 벡터가 도입된 코리네박테리움 균주가 아이소프로판올 생산에 최적화되어 있음을 확인할 수 있었다. 한편, 아이소프로판올 이외에 부수적인 대사산물로서 젖산(도 4d 참조), 아세트산(도 4e 참조) 및 숙신산(도 4f 참조)이 생산되었는데, pEKEx2_H36-TDACH 벡터가 단독으로 도입된 코리네박테리움 균주 대비 숙신산이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과를 통해, pEKEx2_H36-TDACH 및 pMTC_POX 2종의 벡터가 도입된 코리네박테리움 균주의 경우 pEKEx2_H36-TDACH 벡터가 단독으로 도입된 코리네박테리움 균주 대비 숙신산 경로의 이용으로 아이소프로판올 생산량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
한편, 도 2a, 3a, 4a, 5a의 결과는 세포 성장과 글루코스 소모량을 나타내는 것으로, 세포의 생장이 아이소프로판올 생산의 저해에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주며 글루코스를 잘 소모하여 아이소프로판올을 생산했음을 의미한다.
또한, 아이소프로판올 생산 코리네박테리움의 주요 성분 한정 혼합배지에서의 세포 성장 및 대사산물 생산을 확인하였다. 참고로, 본 실험에서 사용된 코리네박테리움 균주는 pEKEx2_TDACH 벡터가 도입된 균주이다. 그 결과, 도 5에서 나타낸 바와 같이, 소듐 시트레이트 (sodium citrate) 성분이 없는 경우 아이소프로판올이 생산되지 않는 것으로 나타나, 소듐 시트레이트는 아이소프로판올이 생산에 필수적인 성분임을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> Recombinant Microorganism for Enhancing Isopropanol Productivity and Method for Producing Isopropanol Using The Same <130> NPDC-100398 <160> 38 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence of thlA gene <400> 1 atgaaagaag ttgtaatagc tagtgcagta agaacagcga ttggatctta tggaaagtct 60 cttaaggatg taccagcagt agatttagga gctacagcta taaaggaagc agttaaaaaa 120 gcaggaataa aaccagagga tgttaatgaa gtcattttag gaaatgttct tcaagcaggt 180 ttaggacaga atccagcaag acaggcatct tttaaagcag gattaccagt tgaaattcca 240 gctatgacta ttaataaggt ttgtggttca ggacttagaa cagttagctt agcagcacaa 300 attataaaag caggagatgc tgacgtaata atagcaggtg gtatggaaaa tatgtctaga 360 gctccttact tagcgaataa cgctagatgg ggatatagaa tgggaaacgc taaatttgtt 420 gatgaaatga tcactgacgg attgtgggat gcatttaatg attaccacat gggaataaca 480 gcagaaaaca tagctgagag atggaacatt tcaagagaag aacaagatga gtttgctctt 540 gcatcacaaa aaaaagctga 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gacattgata gccaatgata ccgcgtttgt tgataccggc 180 atcggtccgc tcatcgtcaa tggtcgagtc cgcaaagtga ttgcttcaca tatcggcacc 240 aacccggaaa caggtcggcg catgatatct ggtgagatgg acgtcgttct ggtgccgcaa 300 ggtacgctaa tcgagcaaat tcgctgtggt ggagctggac ttggtggttt tctcacccca 360 acgggtgtcg gcaccgtcgt agaggaaggc aaacagacac tgacactcga cggtaaaacc 420 tggctgctcg aacgcccact gcgcgccgac ctggcgctaa ttcgcgctca tcgttgcgac 480 acacttggca acctgaccta tcaacttagc gcccgcaact ttaaccccct gatagccctt 540 gcggctgata tcacgctggt agagccagat gaactggtcg aaaccggcga gctgcaacct 600 gaccatattg tcacccctgg tgccgttatc gaccacatca tcgtttcaca ggagagcaaa 660 taa 663 <210> 3 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence of atoA gene <400> 3 atggatgcga aacaacgtat tgcgcgccgt gtggcgcaag agcttcgtga tggtgacatc 60 gttaacttag ggatcggttt acccacaatg gtcgccaatt atttaccgga gggtattcat 120 atcactctgc aatcggaaaa cggcttcctc ggtttaggcc cggtcacgac agcgcatcca 180 gatctggtga acgctggcgg gcaaccgtgc ggtgttttac ccggtgcagc 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ctggccaaga tcccggcacc ggaactgggt gccgtggtca tcaaggccgc gctggagcgc 120 gccggcgtca agccggagca ggtgagcgaa gtcatcatgg gccaggtgct gaccgccggt 180 tcgggccaga accccgcacg ccaggccgcg atcaaggccg gcctgccggc gatggtgccg 240 gccatgacca tcaacaaggt gtgcggctcg ggcctgaagg ccgtgatgct ggccgccaac 300 gcgatcatgg cgggcgacgc cgagatcgtg gtggccggcg gccaggaaaa catgagcgcc 360 gccccgcacg tgctgccggg ctcgcgcgat ggtttccgca tgggcgatgc caagctggtc 420 gacaccatga tcgtcgacgg cctgtgggac gtgtacaacc agtaccacat gggcatcacc 480 gccgagaacg tggccaagga atacggcatc acacgcgagg cgcaggatga gttcgccgtc 540 ggctcgcaga acaaggccga agccgcgcag aaggccggca agtttgacga agagatcgtc 600 ccggtgctga tcccgcagcg caagggcgac ccggtggcct tcaagaccga cgagttcgtg 660 cgccagggcg ccacgctgga cagcatgtcc ggcctcaagc ccgccttcga caaggccggc 720 acggtgaccg cggccaacgc ctcgggcctg aacgacggcg ccgccgcggt ggtggtgatg 780 tcggcggcca aggccaagga actgggcctg accccgctgg ccacgatcaa gagctatgcc 840 aacgccggtg tcgatcccaa ggtgatgggc atgggcccgg tgccggcctc caagcgcgcc 900 ctgtcgcgcg 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gacaaggccg gcaacctggt gttccgccgc accgcgcgca acttcaaccc gatgtgcgcc 540 atggcgggca aggtcaccat cgccgaggtc gagcatatcg tcgagaccgg cgagctggac 600 ccggatgaaa tccacctggc cggcatcttc gtgaagcgcc tggtgctgaa caccaccccc 660 gagaaacgca tcgagcagcg caccgtgcgc gcggccagct aa 702 <210> 8 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence of oxctB gene <400> 8 atggcatgga cacgtgacga aatggccgcg cgcgccgcga ccgagctgca ggacggtttc 60 tacgtcaacc tgggcatcgg cctgccgacg ctggtggcca actgggtgcc cgaaggcatg 120 gaagtgtggc tgcagtccga gaacggactg ctgggcatcg gcccgttccc gaccgaggac 180 gaagtcgacg ccgacatgat caacgccggc aagcaaaccg tgacgacgct gccgggctcg 240 tcgatcttct cgtcggccga ctcgttcgcg atgatccgcg gcggccacat caacctggcg 300 atcctgggtg cgatgcaggt cagcgaaaag ggcgacctgg ccaactggat gatcccgggc 360 aagatggtca agggcatggg cggcgcgatg gacctggtcg ccggcgtcgg ccgagtggtg 420 gtgctgatgg aacacaccgc caagaagaag gatggcaccg aggacatcaa gatcctgaag 480 gactgcaacc tgccgctgac cggcgtgggc gtggtcaacc gcatcattac cgacctgggc 540 gtgatcgacg tgaccgacga aggcctgaag ctggtggaaa cggctccggg tgtcagccgc 600 gaggaaatcc aggccaagac tggcgctccg ctgctgtaa 639 <210> 9 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence of L10 promoter <400> 9 gcagacggtt atggtcgccg ctaggtcttg gggagttttg ttcggtagtt atttattgtt 60 gaaggagata gatt 74 <210> 10 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence of I16 promoter <400> 10 agacaccgcg tgcccgttat tctgtggggt gggtatagtt ctctagcgat gtggtgggct 60 acaggatatt attg 74 <210> 11 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence of H36 promoter <400> 11 tctatctggt gccctaaacg ggggaatatt aacgggccca gggtggtcgc accttggttg 60 gtaggagtag catg 74 <210> 12 <211> 154 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence of Tac promoter <400> 12 tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac ggttctggca 60 aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg 120 agcggataac 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27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_PhaA_ClaI_F <400> 27 tcatatcgat atgactgacg ttgtcatcgt atccg 35 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_PhaA_BamHI_R <400> 28 aatggatcct tatttgcgct cgactgccag c 31 <210> 29 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_OxctA_GA_F <400> 29 tcgagcgcaa ataaggatcc aaggagatat agatgaacaa ggtctacgcc agcg 54 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_OxctA_GA_R <400> 30 gccatctata tctcctttta gctggccgcg cgcacg 36 <210> 31 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_OxctB_GA_F <400> 31 gctaaaagga gatatagatg gcatggacac gtgacga 37 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_OxctB_GA_R <400> 32 aaacaggcgg ccgcggtacc ttacagcagc ggagcgcca 39 <210> 33 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_L10_POX_GA_F <400> 33 aaaacttttc gggatctcga ggcagacggt tatggtcgcc g 41 <210> 34 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_L10_POX_GA_R <400> 34 acaacgtcag tcatatcgat aatctatctc cttcaacaat aaata 45 <210> 35 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_I16_POX_GA_F <400> 35 aaaacttttc gggatctcga gagacaccgc gtgcccgtta t 41 <210> 36 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_I16_POX_GA_R <400> 36 acaacgtcag tcatatcgat caataatatc ctgtagccca ccaca 45 <210> 37 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_pMT_H36_GA_F <400> 37 aaacttttcg ggatctcgag tctatctggt gccctaaacg gggga 45 <210> 38 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_pMT_H36_GA_R <400> 38 gatgacaacg tcagtcatgg atcccatgct actcctacca accaaggtg 49

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 thlA 유전자;
    서열번호 2의 염기서열로 표시되는 atoD 유전자;
    서열번호 3의 염기서열로 표시되는 atoA 유전자;
    서열번호 4의 염기서열로 표시되는 adc 유전자; 및
    서열번호 5의 염기서열로 표시되는 sadh 유전자를 포함하는 아이소프로판올 생산용 제1 발현 카세트 .
  2. 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 phaA 유전자;
    서열번호 7의 염기서열로 표시되는 oxctA 유전자; 및
    서열번호 8의 염기서열로 표시되는 oxctB 유전자를 포함하는 아이소프로판올 생산용 제2 발현 카세트 .
  3. 제1항에 있어서,
    상기 카세트는 유전자 발현 강화 프로모터를 더 포함하는, 제1 발현 카세트 .
  4. 제3항에 있어서,
    상기 프로모터는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 L10 프로모터, 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 I16 프로모터 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 H36 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 아이소프로판올 생산용 제1 발현 카세트 .
  5. 제2항에 있어서,
    상기 카세트는 Tac 프로모터를 더 포함하는, 제2 발현 카세트 .
  6. 제5항에 있어서,
    상기 Tac 프로모터는 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 갖는, 제2 발현 카세트 .
  7. 제1항 따른 아이소프로판올 생산용 제1 발현 카세트를 포함하는, 아이소프로판올 생산용 재조합 벡터.
  8. 제2항에 따른 아이소프로판올 생산용 제2 발현 카세트를 포함하는, 아이소프로판올 생산용 재조합 벡터.
  9. 제7항 및 제8항에 따른 벡터가 도입된 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물.
  10. 제9항에 따른 아이소프로판올 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 아이소프로판올 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, 아이소프로판올 생산 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 소듐 시트레이트를 포함하는 배지에서 배양하는, 아이소프로판올 생산 방법.
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