KR100971792B1 - Butyryl-CoA를 중간체로 하여 부탄올을 생합성하는 능력을가지는 효모를 이용하여 부탄올을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 acetyl-CoA를 acetoacetyl-CoA로 전환시키는 효소 (THL) 및 butyryl-CoA를 중간체(intermediate)로 하여 부탄올을 생합성하는 능력을 가지는 미생물을 이용하여 부탄올을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기의 미생물에 CoAT (acetyl-CoA:butyryl-CoA CoA-transferase)를 코딩하는 유전자를 도입한 미생물에서, 다양한 방법으로 butyryl-CoA를 생성한 다음 부탄올로 전환시켜 부탄올을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

Butyryl-CoA를 중간체로 하여 부탄올을 생합성하는 능력을 가지는 효모를 이용하여 부탄올을 제조하는 방법{METHOD FOR PREPARING BUTANOL THROUGH BUTYRYL-COA AS AN INTERMEDIATE USING YEAST}

본 발명은 butyryl-CoA를 중간체(intermediate)로 하여 부탄올을 생합성하는 능력을 가지는 효모를 이용하여 부탄올을 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근 고유가 및 환경 문제와 맞물려서 미생물을 이용한 바이오연료 생산이 큰 관심을 끌고 있다. 특히, 바이오부탄올은 바이오에탄올에 비해 산소함유량이 낮아 화석연료와 잘 섞인다는 장점이 있다. 최근 바이오 부탄올이 휘발유의 대체 연료로 부상하면서 시장 규모가 매우 빠른 속도로 증가하고 있다. 미국에서의 연간 바이오 부탄올 시장은 370 million gal에 이르고 있고, 3.75＄/gal의 단가를 형성하고 있다. 특히, 바이오부탄올은 에너지 밀도, 휘발성 제어, 충분한 옥탄가, 낮은 불순물 등 연료로서 적합한 특성을 가지고 있다. 에탄올 보다 휘발유에 더욱 적합한 부탄올을 미생물을 이용하여 대량 생산한다면, 원유 대체 효과 및 온실 가스 배출 감소로 인한 환경적 효과 등을 가져올 수 있다.

부탄올은 Clostridial 균주의 혐기적 ABE (Acetone-Butanol-Ethanol) fermentation에 의해 생물학적 방법으로 생산될 수 있는데 (Jones, D.T. and Woods, D.R., Microbiol. Rev., 50:484, 1986; Rogers, P., Adv. Appl. Microbiol., 31:1, 1986; Lesnik, E.A. et al., Necleic Acids Research, 29: 3583, 2001), 이러한 방법이 1950년대 까지만 해도 40년 이상에 걸쳐 부탄올과 아세톤의 주요 공급원이었다.

Clostridial 균주는 성장 조건이 까다롭고 분자생물학적 tool 및 omics technology 등이 완전히 갖추어져 있지 않아서 추가 균주 개량에 어려움이 있다.

따라서, 이미 에탄올 생산에 탁월한 능력을 보이고 다양한 omics technology가 구비된 효모 등에서의 부탄올 생산이 요구되고 있다. 특히, 대사공학 또는 omics technology 등을 이용한 균주 개발이 전무한 상태이므로 무한한 개발 잠재력이 있다고 하겠다.

Clostridium acetobutylicum에서의 부탄올 생성 pathway는 FIG. 1에 나타난 바와 같다 (Jones, D.T. and Woods, D.R., Microbiol. Rev., 50:484, 1986; Desai, R.P. et al., J. Biotechnol., 71:191, 1999). 바이오 부탄올 생산을 위해 연구되고 있는 대표적인 두 균주 Clostridium 속과 대장균 모두 최종 산물인 부탄올에 대한 내성이 산업화와는 거리를 두고 있다. 한편, 부탄올 생합성 경로를 도입하여 부탄올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 부탄올 생산을 시도한 바 있으나, 그 생성량이 미미하였다 (US 2007/0259410 A1; US 2007/0259411 A1).

효모는 현재 에탄올 발효 산업에 많이 사용되고 있으며, 알코올에 대한 내성이 상당히 높은 특징을 가진다. 일반적으로 대사활성이 높고 성장속도도 빠르며, 낮은 pH나 낮은 온도 및 낮은 수분활성도의 환경에서도 잘 자라는 생리적인 특성은 곰팡이와 같으며 혐기적인 조건에서도 성장하는 종류가 많다는 점이 효모를 이용한 부탄올 생산에 있어서 가장 큰 장점이 될 것으로 기대된다. 하지만, 효모는 일반적인 조건에서는 FIG. 2에 나타낸 바와 같이, 태생적으로 부탄올을 생성하지 못하며, 재조합 효모를 이용한 부탄올 생산을 시도한 바가 있으나, 그 생산량이 미미하였다 (WO 2007/041269 A2).

이에, 본 발명자들은 효모를 이용하여 부탄올을 생산하는 새로운 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 효모에서 다양한 방법으로 중간체인 butyryl-CoA를 생성시키고, 상기 생성된 butyryl-CoA가 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)에 의해 부탄올로 전환되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

발명의 요약

결국, 본 발명의 목적은 효모에서 부탄올 등의 생합성 경로에서 중요한 중간체인 butyryl-CoA를 다양한 경로로 생성한 다음, 이를 중간체로 하여 부탄올을 제조하는 방법 및 부탄올 생합성 능력을 가지는 재조합 효모를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유기산에 CoA moiety를 전달하여 유기산을 유기산-CoA로 전환시키는 기능을 가지는 CoAT (CoA-transferase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 효모 및 상기 재조합 효모를 부티레이트 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA 및 부탄올의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 효모를 부티레이트 생산능을 가지는 미생물과 공동배양하여, 상기 부티레이트 생산능을 가지는 미생물에 의해 부티레이트가 생성되도록 하고, 상기 재조합 효모가 상기 생성된 부티레이트를 이용하여 부탄올을 생성하도록 하는 단계; 및 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 단계를 포함하는 부탄올의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 지방산으로부터 butyryl-CoA를 생합성할 수 있는 효모를 지방산 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA 및 부탄올의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 효모는 자체적으로 발현되어 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)활성을 가지는 AAD를 코딩하는 유전자를 가지고 있거나, AAD를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.

FIG. 1은 Clostridium acetobutylicum에서의 부탄올 생성 pathway를 나타낸 것이다.

FIG. 2는 효모의 butanoate 대사회로 일부를 나타낸 것으로, 점선은 효모에 없는 pathway를 나타낸 것이고, 실선은 효모에 존재하는 pathway를 나타낸 것이다.

FIG. 3은 지방산(fatty acids)으로부터 재조합 효모의 butyryl-CoA pool을 이용한 추정된 부탄올 생성 pathway를 나타낸 것이다.

FIG. 4는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 배지에 있는 butyrate 또는 acetate를 이용하여 세포내의 acetyl-CoA pool을 높여서 부탄올을 생성하는 pathway를 나타낸 것이다.

FIG. 5는 pYUC18 벡터의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

FIG. 6은 pYUC18.adhE1의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

FIG. 7은 pYUC18.adhE1.ctfAB의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예

본 발명에서는 효모에서 butyryl-CoA를 생성하기 위하여 2가지 방안을 모색하였다: (1) THL (acetyl-CoA를 acetoacetyl-CoA로 전환하는 효소)를 코딩하는 유전자를 가지는 효모에 CoAT (CoA transferase)를 코딩하는 유전자를 도입시켜 재조합 효모를 제작하고, 이를 부티레이트를 함유하는 배지에서 배양하여 buttryl-CoA를 생성시키는 방안; 및 (2) 지방산으로부터 효모 자체의 베타-옥시데이션 경로를 이용하여 butyryl-CoA를 생성시키는 방안.

효모는 다양한 fatty acid를 이용하는 beta-oxidation pathway에 의해서 peroxisome 및 cytosol에 short chain length (scl) 및 medium chain length (mcl) acyl-CoA들을 생성할 수 있으나 (Leaf, T.A. et al., Microbiology-Uk, 142:1169, 1996; Carlson, R. et al., J. Biotechnol., 124:561, 2006; Zhang, B. et al., Appl. Environ. Microbiol., 72:536, 2006), 아직 이를 이용한 부탄올 생산에 대한 보고는 없다.

본 발명에서는 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 유래 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adhE1)를 도입시킨 재조합 효모를 제작하고, 상기 2가지 방안에 의해 생성될 것으로 예측되는 중간체인 buttryl-CoA로부터 부탄올이 생성을 시도하였다. 아울러, AAD를 도입하지 않은 효모를 지방산 함유 배지에서 배양할 경우에도 부탄올이 생성되는지 확인하였다.

그 결과, (1) THL을 코딩하는 유전자를 가지는 효모에 CoAT를 코딩하는 유전자와 AAD를 코딩하는 유전자를 도입시킨 재조합 효모를 부티레이트를 함유하는 배지에서 배양할 경우, 부탄올이 생성되는 것을 확인하였다. (2) AAD를 코딩하는 유전자를 도입시킨 재조합 효모를 지방산을 함유하는 배지에서 배양할 경우에도 부탄올이 생성되는 것을 확인하였다. (3) 또한, AAD를 도입하지 않은 효모를 지방산 함유 배지에서 배양할 경우 부탄올이 생성되는 것을 확인하였다. 이는 지방산으로부터 beta-oxidation pathway에 의해 생성된 butyryl-CoA가 자체적으로 발현되는 AAD에 의해 부탄올로 전환된 것을 의미한다. 결국, 본 발명에서 사용된 효모는 자체적으로 발현되어 활성을 가지는 AAD 유전자를 가지고 있다는 것을 간접적으로 확인할 수 있었다.

이 결과로부터 여러가지 경로를 통해 합성된 butyryl-CoA로부터 부탄올을 생성하기 위해서는 자체적으로 발현되어 활성을 가지는 AAD 유전자를 가지고 있는 효모를 이용하거나, 자체적으로 AAD 유전자를 가지고 있지 않은 효모를 이용할 경우에는 AAD를 코딩하는 유전자 (예: Clostridium acetobutylicum ATCC 824 유래 adhE1)를 도입시킨 재조합 효모를 이용하는 것이 가능하다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 유기산에 CoA moiety를 전달하여 유기산을 유기산-CoA로 전환시키는 기능을 가지는 CoAT (CoA-transferase)를 코딩하는 유전 자가 도입되어 있는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 효모 및 상기 재조합 효모를 부티레이트 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA 및 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 효모는 acetyl-CoA를 acetoacetyl-CoA로 전환시키는 효소 (THL)를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 CoAT는 acetyl-CoA:butyryl-CoA CoA-transferase인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 CoAT를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 ctfAB인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

다른 관점에서, 본 발명은 지방산으로부터 butyryl-CoA를 생합성할 수 있는 효모를 지방산 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA 및 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 유래 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(adhE1)가 도입되어 있는 재조합 효모 [S. cerevisea (pYUC18.adhE1)]가 acetyl-CoA 또는 short-, medium-, long-chain fatty acid로부터 자체의 효소들에 의해 중간체인 butyryl-CoA가 생성되는지를 부탄올 생성능으로 확인하고자 하였다. 상기 재조합 효모는 효모 자체에서 생성되는 butyryl-CoA로부터 butyraldehyde를 거쳐 butanol을 제조하기 위하여 제작된 것이다. 즉, 상기 재조합 효모에서 다양한 acyl-CoA (butyryl-CoA, acetyl-CoA 등)를 이용할 경우, butanol의 생성이 가능할 것으로 예측하였고, 나아가 상기 재조합 효모에 도입되어 있거나, 이미 가지고 있는 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)에 의해 butyryl-CoA로부터 butanol이 생성될 것으로 예측하였다 (FIG. 3).

이를 확인하기 위하여, 상기 재조합 효모를 oleic acid/lauric acid 함유 SC-dropout 배지에서 배양한 결과, beta-oxidation pathway로부터 합성된 butyryl-CoA를 포함한 acyl-CoA로부터 부탄올이 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, AAD가 추가 도입되지 않은 균주에서도 부탄올이 생성되는 것을 확인하였다. 이는 상기 재조합 효모 및 자체 AAD 활성을 가지는 효모 내에 존재하는 acyl-CoA 합성에 관여하는 효소들에 의해서 기인한 것으로 추정된다. 즉, 재조합 효모 [S. cerevisea (pYUC18.adhE1)] 및 자체 AAD 활성을 가지는 효모 [S. cerevisea (pYUC18)]를 fatty acid 함유 배지에서 배양하여 부탄올이 생성되는 것은 butyryl-CoA와 같은 scl-acyl-CoA 또는 mcl-acyl-CoA들로 전환시켜 주는 효소 (acyl-CoA synthase)들에 의해 부탄올로 전환된 것으로 추정할 수 있다 (FIG. 3). 상기 효모들에 존재하는 butyryl-CoA와 같은 scl-acyl-CoA 및 mcl-acyl-CoA로 전환시켜 주는 효소 (acyl-CoA synthase)들이 부탄올 생산에 기여함을 본 발명으로부터 확인할 수 있었다 (Marchesini, S. et al., J. Biol. Chem. 278:32596, 2003; Zhang, B. et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:536, 2006).

본 발명의 다른 실시예에서는 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 유래 alcohol/aldehyde dehydrogenase (AAD)를 코딩하는 유전자( adhE1) 및 CoA transferase (CoAT)를 코딩하는 유전자(ctfAB)가 도입되어 있는 재조합 효모가 외부로부터 첨가된 butyrate를 이용하여 세포 내의 butyryl-CoA pool을 높이고, 이를 이용하여 부탄올을 합성할 수 있는지를 확인하고자 하였다. 상기 재조합 효모 [S. cerevisea (pYUC18.adhE1.ctfAB)]는 외부의 butyrate를 이용하여 butyryl-CoA를 만들고, butyraldehyde를 거쳐 butanol을 제조하기 위하여 제작된 것이다. Clostridium acetobutylicum ATCC 824 유래 CoAT 효소는 butyric acid 또는 acetic acid를 acetoacetyl-CoA의 CoA moiety를 butyryl-CoA 또는 acetyl-CoA로 전달해 주는 역할을 하기 때문에, 세포내의 butyryl-CoA의 pool을 높이는데 아주 유리하다 (FIG. 4) (Bermejo, L. et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:1079, 1998). 즉, AAD를 코딩하는 유전자(adhE1)와 CoAT를 코딩하는 유전자(ctfAB)가 도입되어 있는 재조합 효모를 butyrate가 첨가된 배지에서 배양할 경우, 세포 내의 butyryl-CoA pool을 높일 수 있고, 결국 butanol의 생성이 증가할 것으로 예측하였다. 또한, 부티레이트와 지방산을 동시에 함유하는 배지에서 배양할 경우 세포 내의 butyryl-CoA pool을 더욱 높일 수 있고, 결국 butanol의 생성이 더 증가할 것으로 예측하였다 (FIG. 4).

이를 확인하기 위하여, 상기 재조합 효모 [S. cerevisea (pYUC18.adhE1.ctfAB)]를 부티레이트 함유 배지에서 배양한 결과, 부티레이트로부터 butyryl-CoA를 거쳐 부탄올이 생성된 것을 확인할 수 있었다. 이는 상기 재조합 효모 내에 존재하는 butyryl-CoA 생성에 관여하는 CoAT 효소에 의해서 기인한 것으로 추정된다. 상기 재조합 효모에 존재하는 butyrate 또는 acetate를 butyl-CoA 또는 acetyl-CoA로 전환시켜 주는 효소 (CoAT)들이 부탄올 생산에 기여함을 본 발명으로부터 확인할 수 있었다. 아울러, 부티레이트와 지방산을 동시에 함유하는 배지 에서 배양한 경우, 부탄올 생성이 더욱 증가한다는 것을 확인하였다. 이는 부티레이트 및 지방산으로부터 각각 CoAT 효소 및 beta-oxidation pathway를 통해 더 많은 butyryl-CoA가 생합성된 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 지방산은 탄소수가 4-24개인 것을 특징으로 할 수 있고, oleic acid, lauric acid 등을 포함하는 지방산인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 AAD 및 CoAT를 코딩하는 유전자는 각각 Clostridium 속 유래 adhE1 및 ctfAB인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨데, 다른 미생물 유래의 유전자라 할지라도 숙주 효모에 도입발현되어 동일한 효소활성을 나타내는 한 제한이 없다.

한편, 외부에서 직접 부티레이트를 첨가하는 방법 외에도 부티레이트를 제공하기 위하여 co-culture 방법을 이용할 수도 있다. 즉, 부티레이트를 생산할 수 있는 균주와 본 발명의 재조합 효모를 co-culture하여, 부티레이트 생산 균주에 의해 전구체인 부티레이트를 생성하도록 하고, 본 발명의 재조합 효모에 의해 상기 생성된 부티레이트를 butyryl-CoA를 통하여 부탄올로 전환할 수 있다.

전구체를 거쳐 특정 산물을 생산하기 위하여 co-culture하는 예로, Ruminococcus albus와 Wolinella succinogenes의 co-culture 등이 있다. R. albus의 순수 배양을 이용한 글루코스의 발효는 주산물인 아세트산과 더불어 CO₂, H₂, 그리고 에탄올을 최종 산물로 생산하게 된다. 하지만, W. succinogenes와 co-culture 할 경우는 수소가 제거되어 에탄올을 생산하지 않게 된다. 이는 W. succinogenes가 acetyl-CoA로부터 acetate를 생산함으로써 ATP를 형성하고, 이는 곧 R. albus 측면에서 글루코스 몰당 ATP 생산 수율을 높이는 결과를 얻을 수 있다. 즉, R. albus 순수배양에서 보다 W. succinogenes와 co-culture를 통하여 필요한 ATP를 공급 받아 최종 산물인 아세트산을 제조하는데 이용할 수 있다 (Stams, A.J., Antonie Van Leeuwenhoek 66:271, 1994).

부티레이트를 생산할 수 있는 미생물로는 클로스트리듐 속 미생물 들 (Clostridium butyricum, Clostridium beijerinckii, Clostridium acetobutylicum)과 장내 미생물들 (Megasphaera elsdenii, Mitsuokella multiacida) 등이 알려져 있다: (Alam, S. et al., J. Ind. Microbiol., 2:359, 1988; Andel, J.G. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 23:21 26, 1985; Barbeau, J.Y. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 29:447, 1988; Takamitsu, T. et al., J. Nutr., 132:2229, 2002). 따라서, 부티레이트를 생산하는 상기 균주를 본 발명의 재조합 효모와 co-culture할 경우, 상기 균주에 의해 부티레이트가 생성될 것이고, 본 발명의 재조합 효모가 상기 생성된 부티레이트를 이용하여 부탄올을 생성할 수 있을 것이다.

따라서, 또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 재조합 효모를 부티레이트 생산능을 가지는 미생물과 공동배양하여, 상기 부티레이트 생산능을 가지는 미생물에 의해 부티레이트가 생성되도록 하고, 상기 재조합 효모가 상기 생성된 부티레이트를 이용하여 부탄올을 생성하도록 하는 단계; 및 배양액으로부터 부탄올을 회수하 는 단계를 포함하는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.

Co-culture에 이용 가능한 균주로 부티레이트를 생산하는 균주로 상기 클로스트리듐 속과 장내 미생물에 대하여만 언급하였지만, 부티레이트를 생산하고 효모와 co-culture가 가능한 균주라면 그 제한이 없다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 효모로 S. cerevisea 만을 예시하였으나, 다른 효모를 사용하는 것 역시 당업자에게 자명할 것이다. 아울러, 하기 실시예에서는 도입 대상 유전자로 특정 균주 유래인 것만을 예시하였으나, 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 그 제한이 없다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

아울러, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법만을 예시하였으나, 문헌에 보고된 바와 같이, 유청(whey), CSL(corn steep liquor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용하는 것 (Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26:63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25:111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54:23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72:41, 2001)도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: Butyryl-CoA로부터 부탄올을 생성하는 pathway가 도입된 재조합 DNA 제조

부탄올 생합성의 최종 경로에 있는 유전자 C. acetobutylicum ATCC 824 adhE1 (AAD를 코딩하는 유전자)를 증폭하고, pYUC18 발현벡터에 클로닝하여 pYUC18.adhE1 벡터를 수득하였다.

발현벡터 pYUC18은 대장균용 클로닝벡터 pUC18 (Amersham)을 backbone으로 하여 yeast에서 활성을 가지는 복제오리진, 프로모터, 전사종료서열을 삽입하여 제작하였다. pYD1 (Invitrogen)을 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용한 PCR (95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 30초간 서냉복원, 72℃에서 30초간 신장을 한 주기로 하여, 총 30 주기를 반복)을 수행하여, PCR 절편(GAL promoter)을 수득하였다. 같은 방법으로 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, PCR 절편(전사 종료서열, TRP1 ORF, replicon)을 수득하였다. 다시 첫번째 PCR 절편과 두번째 PCR 절편을 동시에 주형으로 하고, 서열번호 1 및 4의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 각각의 PCR 단편이 연결된 최종 PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편을 Hin dIII-SacI으로 절단하고, 동일 효소(HindIII-SacI)로 절단한 pUC18 벡터에 삽입하여 yeast 발현벡터 pYUC18을 제작하였다 (FIG. 5).

[서열번호 1] P1: 5'aaaaaagcttaacaaaagctggctagtacgg-3'

[서열번호 2] P2: 5'ggtacccggggatccgtcgacctgcagtccctatagtgag

tcgtattacagc-3'

[서열번호 3] P3: 5'ctgcaggtcgacggatccccgggtacccagtgtagatgta

acaaaatcgact-3'

[서열번호 4] P4: 5'ctaggagctcctgggtccttttcatcacgt-3'

Clostridium acetobutylicum ATCC 824의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편 (adhE1 유전자)을 PstI-XmaI로 절단하고, 동일한 효소로 제한된 pYUC18 발현벡터에 클로닝하여 pYUC18.adhE1를 제작하였다 (FIG. 6).

[서열번호 5] P5: 5'aaaactgcagaagtgtatatttatgaaagtcacaacag-3'

[서열번호 6] P6: 5'tccccccggggttgaaatatgaaggtttaaggttg-3'

실시예 2: AAD 및 CoAT가 도입된 재조합 DNA 제조

C. acetobutylicum ATCC 824 adhE1 (AAD를 코딩하는 유전자) 및 ctfAB (CoAT를 코딩하는 유전자)를 증폭하고, 실시예 1에서 제작된 pYUC18 발현벡터에 클로닝하여 pYUC18.adhE1.ctfAB 벡터를 수득하였다 (FIG. 7).

Clostridium acetobutylicum ATCC 824의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편 (adhE1-ctfAB 유전자)을 SalI-XmaI로 절단하고, 동일한 효소로 제한된 pYUC18 발현벡터에 클로닝하여 pYUC18.adhE1.ctfAB를 제작하였다 (FIG. 7).

[서열번호 7] P7: 5'tacgcgtcgacaagtgtatatttatgaaagtcacaacag-3'

[서열번호 8] P8: 5'tccccccgggataccggcatgcagtatttctttctaaacag

ccatg-3'

실시예 3: AAD 또는/그리고 CoAT가 도입된 재조합 효모 제조

실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 pYUC18, pYUC18.adhE1 및 pYUC18.adhE1.ctfAB를 각각 S. cerevisea ATCC 208289 균주에 도입한 다음, SC-Trp 선택배지 (Bacto-yeast nitrogen base without amino acids(0.67%, Difco), glucose(2%, CJ), dropout mixture(0.2%, TRP DO supplement, BD Bioscience), Bacto-agar(2%, Difco))에서 콜로니를 선발하여 S. cerevisea (pYUC18), S. cerevisea (pYUC18.adhE1), S. cerevisea (pYUC18.adhE1.ctfAB) 균주를 제작하였다.

실시예 4: 효모에서 지방산 첨가에 의한 부탄올 제조

실시예 3에서 제작된 재조합 효모 S. cerevisea (pYUC18.adhE1)을 배양하여 부탄올의 제조를 시도하였다. 배양에 사용된 기본 배지 조성은 다음과 같다:

Bacto-yeast nitrogen base without amino acids(0.67%, Difco), glucose(2%, CJ), Uracil(20 mg/l, Sigma), L-leucin(100 mg/l, Sigma), L-Histidin(20 mg/l, Sigma). 그리고 기본 배지에 최종 농도 2.5 g/l oleic acid와 최종 농도 2.5 g/l lauric acid를 첨가하였으며, pH는 5.7로 보정하였다.

250 ml 배양 플라스크에 배지 100 ml를 첨가하고, 재조합 효모 S. cerevisea (pYUC18.adhE1)을 접종하고, 30도의 aerobic 및 anaerobic chamber에서 배양하였다. 배양 후, 매 12시간에 각각 시료를 채취하여 Gas-chromatography (GC, Agillent)로 부탄올을 정량하였다.

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, S. cerevisea (pYUC18.adhE1) 균주 뿐만 아니라, S. cerevisea (pYUC18) 균주에서도 부탄올이 생성된 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 배지에 첨가된 지방산이 beta-oxidation을 통하여 butyryl-CoA를 포함한 다양한 acyl-CoA pool로 전환된 다음, 부탄올로 전환된다는 것을 확인할 수 있었다.

표 1

Butanol concentration (mg/l) of supernatants from cultures of S. cerevisea strains challenged with fatty acids (5 g/l)

실시예 5: 재조합 효모에서 부티레이트 첨가에 의한 부탄올 제조

실시예 3에서 제작된 재조합 효모 S. cerevisea (pYUC18.adhE1.ctfAB)를 배양하여 부탄올의 제조를 시도하였다. 배양에 사용된 기본 배지 조성은 실시예 5와 같다. 그리고 기본 배지에 최종 농도 40 mM butyric acid를 첨가하였으며, pH는 5.7로 보정하였다.

250 ml 배양 플라스크에 배지 100 ml를 첨가하고, 재조합 효모 S. cerevisea (pYUC18.adhE1.ctfAB)를 접종하고, 30도의 aerobic 및 anaerobic chamber에서 배양하였다. 배양 후, 매 12시간에 각각 시료를 채취하여 Gas-chromatography (GC, Agillent)로 부탄올을 정량하였다.

그 결과, 표2에 나타난 바와 같이, S. cerevisea (pYUC18) 에서는 부탄올 생산이 관찰되지 않은 반면, S. cerevisea (pYUC18.adhE1.ctfAB) 균주에서는 부탄올이 생성된 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 butyrate를 배지에 첨가하고 CoAT를 도입된 균주를 배양하면 세포내에 butyryl-CoA pool이 증가하고, 이로부터 부탄올이 생성된다는 것을 확인할 수 있었다.

표 2

Butanol concentration (mg/l) of supernatants from cultures of yeast challenged with butyric acid (40 mM)

또한, 부티레이트 첨가된 배지에 추가로 지방산을 첨가하고, 배양한 다음, 부탄올을 정량하였다. 그 결과, 표3에 나타난 바와 같이, 부티레이트 첨가된 배지에 추가로 지방산을 첨가하여 배양한 경우에도 부탄올이 생성되었으며, 재조합 균주 S. cerevisea (pYUC18.adhE1.ctfAB)가 S. cerevisea (pYUC18) 균주보다 더 높은 농도의 부탄올을 생산하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 (1) acyl-CoA synthase의 작용으로 지방산이 분해되어 butyryl-CoA가 만들어지는 대사회로와 (2) CoAT의 작용으로 부티레이트가 butyryl-CoA로 만들어지는 대사회로를 모두 가진 재조합 균주 S. cerevisea (pYUC18.adhE1.ctfAB)가 부탄올 합성에 보다 유리하다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 중간체로써 butyryl-CoA를 생합성하는 대사회로가 부탄올 생산에 중요한 역할을 한다는 것을 확인할 수 있었다.

표 3

Butanol concentration (mg/l) of supernatants from cultures of yeast challenged with butyric acid (20 mM) and fatty acids (5 g/l)

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 효모에서 다양한 방법으로 butyryl-CoA를 제조한 다음, 이를 중간체(intermediate)로 하여 부탄올을 제조하는 방법을 제공하는 효과가 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Biofuelchem Co. <120> METHOD FOR PREPARING BUTANOL THROUGH BUTYRYL-CoA AS AN INTERMEDIATE USING YEAST <130> PP-B0508 <150> US60/900,248 <151> 2007-02-08 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p1 primer <400> 1 aaaaaagctt aacaaaagct ggctagtacg g 31 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p2 primer <400> 2 ggtacccggg gatccgtcga cctgcagtcc ctatagtgag tcgtattaca gc 52 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p3 primer <400> 3 ctgcaggtcg acggatcccc gggtacccag tgtagatgta acaaaatcga ct 52 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p4 primer <400> 4 ctaggagctc ctgggtcctt ttcatcacgt 30 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p5 primer <400> 5 aaaactgcag aagtgtatat ttatgaaagt cacaacag 38 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p6 primer <400> 6 tccccccggg gttgaaatat gaaggtttaa ggttg 35 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p7 primer <400> 7 tacgcgtcga caagtgtata tttatgaaag tcacaacag 39 <210> 8 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p8 primer <400> 8 tccccccggg ataccggcat gcagtatttc tttctaaaca gccatg 46

Claims (26)

1. 유기산에 CoA moiety를 전달하여 유기산을 유기산-CoA로 전환시키는 기능을 가지는 CoAT (CoA-transferase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 유기산-CoA를 중간체로 이용하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 효모.
2. 제1항에 있어서, 상기 CoAT는 acetyl-CoA:butyryl-CoA CoA-transferase인 것을 특징으로 하는 재조합 효모.
3. 제2항에 있어서, 상기 CoAT를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 ctfAB인 것을 특징으로 하는 재조합 효모.
4. 제1항에 있어서, 상기 효모는 acetyl-CoA를 acetoacetyl-CoA로 전환시키는 효소 (THL)를 코딩하는 유전자를 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 효모.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 효모를 부티레이트 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA의 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 배지는 지방산을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA의 제조방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 지방산은 탄소수가 4-24인 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA의 제조방법.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 효모를 부티레이트 함유 배지에서 배양하여 부탄올을 생성시키는 단계; 및 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 단계를 포함하는 부탄올의 제조방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 효모는 자체적으로 발현되어 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase) 활성을 가지는 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 효모는 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 adhE1 또는 adhE2인 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
12. 제8항에 있어서, 상기 배지는 지방산을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 지방산은 탄소수가 4-24인 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 효모를 부티레이트 생산능을 가지는 미생물과 공동배양하여, 상기 부티레이트 생산능을 가지는 미생물에 의해 부티레이트가 생성되도록 하고, 상기 재조합 효모가 상기 생성된 부티레이트를 이용하여 부탄올을 생성하도록 하는 단계; 및

    배양액으로부터 부탄올을 회수하는 단계를 포함하는 부탄올의 제조방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 효모는 자체적으로 발현되어 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)활성을 가지는 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 효모는 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자기 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 adhE1 또는 adhE2인 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
18. 제14항에 있어서, 상기 공동 배양시 배지는 지방산을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 지방산은 탄소수가 4-24인 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
20. 베타-옥시데이션 대사경로를 가지고, 지방산으로부터 butyryl-CoA를 생합성할 수 있는 효모를 지방산 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA의 제조방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 지방산은 탄소수가 4-24인 것을 특징으로 하는 butyryl-CoA의 제조방법.
22. 베타-옥시데이션 대사경로를 가지고, 자체적으로 발현되어 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase) 활성을 가지는 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 가지거나, AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는, 지방산으로부터 butyryl-CoA를 생합성할 수 있는 효모를 지방산 함유 배지에서 배양하여 부탄올을 생성시키는 단계; 및 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 단계를 포함하는 부탄올의 제조방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 지방산은 탄소수가 4-24인 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
24. 삭제
25. 삭제
26. 제22항에 있어서, 상기 AAD (alcohol/aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 adhE1 또는 adhE2인 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.

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