FR2550222A1 - Utilisation conjointe de la fermentation acetonobutylique et de la fermentation alcoolique pour la conversion des plantes sucrieres en un melange de butanol, d'acetone et d'ethanol - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE PRODUCTION D'UN MELANGE DE BUTANOL, D'ACETONE ET D'ETHANOL A PARTIR DE PLANTES SUCRIERES. LE PROCEDE COMPREND DEUX ETAPES, UNE PREMIERE ETAPE D'ENSEMENCEMENT PAR CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM ET UNE DEUXIEME ETAPE D'ENSEMENCEMENT PAR UNE LEVURE PRODUCTRICE D'ETHANOL, LA DEUXIEME ETAPE ETANT MISE EN ROUTE LORSQUE LE PH DU MILIEU DE FERMENTATION DE PREMIERE ETAPE A ATTEINT UNE VALEUR MINIMALE. L'INVENTION S'APPLIQUE EN PARTICULIER A L'OBTENTION DE BUTANOL, D'ACETONE ET D'ETHANOL A PARTIR DE JUS DE BETTERAVES ET DE TOPINAMBOURS.

Description

La fermentation acétonobutylique traditionnellement pratiquée a partir de substrats tels que les melasses ou les farines de céréales, a été adaptée ces dernieres annees par 1 demandeur à la fermentation de plantes sucrières telles que la betterave et le topinambour grace à une sélection des souches et des conditions de culture appropriées.

Une limitation importante de cette fermentation a, de tous temps, eté la faible concentration des produits obtenus acétone butanol et éthanol dont la somme communément appelée mélange ABE, reste géneralement inférieure ou egale à 2 % en poids dans le moût de fermentation en fin de culture. Cette limitation a pu être partiellement surmontée par la sélection de mutants résistants au butanol qui sont capables de produire des mélanges ABE à des concentrations qui dépassent nettement 2 % en poids dans le moût de fermentation comme decrit précédem- ment par le demandeur dans le brevet français n" 82 03980 du 8 mars 1982.Dans les conditions actuelles cependant, il n'est pas possible de fermenter entièrement en ABE des jus obtenus de betteraves ou de topinambours et qui titrent, par exemple, 12 7o en sucres, sans les diluer de façon importante pour les amener à des concentrations de 6 à 7 %.

Cette dilution conduit à des volumes de fermentation importants et grève le coût de la fermentation, de la distillation des vins et du traitement des vinasses.

Le demandeur a trouvé des conditions qui permettent une fermentation, sans dilution préalable, des jus de topinambours ou de betteraves en un mélange ABE en utilisant conjointement les bacteries dUne espèce Clostridium responsables de la fermentation acetonobutylique et une levure productrice d'ethanol. Le butanol produit par Clostridium est cependant toxique pour la fermentation alcoolique, ce qui constitue l'une des raisons qui a, dans le passé, limité le succes des essais de fermentationsmixtes utilisant les deux types d'organismes. Une autre raison de certains résultats infructueux parfois rencontrés a été que les substrats utilisés qui donnaient de bonnes performances en fermentation alcoolique étaient peu favorables à la fermentation acetonobutylique.Le demandeur, apres avoir sélectionné les souches et défini les conditions qui permettent d'obtenir de bonnes performances en fermentation acétonobutylique avec les plantes sucrières, topinambour et betterave, a observé qu'en contrôlant les paramètres qui déterminent l'évolution relative des deux fermentations,(acétonobutylique et alcoolique) température, pH, temps et taux d'ensemencement des moûts de fermentation par Clostridium et par la levure, des résultats satisfaisants pouvaient être obtenus.

En particulier, un abaissement de la température et du pH favorisent la fermentation alcoolique aux dépens de la fermentation acétonobutylique. En particulier, l'échelonnement dans le temps de l'ensemencement du milieu par les deux microorganismes est un paramètre important et des résultats positifs ont été obtenus en ensemençant d'abord le milieu par un Clostridium . La fermentation acétonobutylique comprend une première phase de production d'acides (acidogénèse) pendant laquelle le pH diminue jusqu'à une valeur minimale, suivie d'une seconde phase de production de solvants (butanol et acétone) pendant laquelle le pH remonte.On a maintenant decouvert, comme illustré dans les exemples 1,2 et 3, que la findelaphase d'acidogénese constitue une période favorable pour effectuer le second ensemencement avec la levure productriced'éthanol. Dans ce qui suit, on mentionnera particulièrement Clostridium acetobutylicum qui constitue l'espèce préférée.

En resume les moyens pour l'obtention des meilleurs résultats des fermentations conjointes acetonobutylique et alcoolique consistent à ensemencer d'abord avec Clostridium acetobutylicum à une temperature comprise entre environ 32 et 400 C et plus particulièrément entre environ 34 et 370 C et à un pH initial compris entre environ 6,0 et 7,3 et plus particulierement entre environ 6,4 et 6,9, puis à ensemencer à nouveau avec une levure productrice d'éthanol lorsque le pH est descendu à une valeur proche de sa valeur minimale comprise entre 4,6 et 5,8 et plus particulièrement entre environ 4,9 et 5,6 tout en ajustant la temperature à une valeur comprise entre environ 28 et 360 C et plus particulièrement entre environ 30 et 350 C, la température de deuxième étape etant de préférence inferieure de 1 à 4a à la temperature de première etape.

Dans la description qui précède, on entend, par valeur proche de la valeur minimale de pH, une valeur comprise entre la valeur pHminimum et la valeur pH minimum + 0,2.

Dans le cas de la fermentation sur jus de topinambours, les souches de Clostridium acetobutylicum utilisées fermentent de façon incomplète les oligo-et polyfructanes qui constituent les sucres contenus dans ces jus. La technique classique consiste dans ce cas à pratiquer une hydrolyse par voie acide prealable en fructoseeten glucose de ces jus, par exemple en faisant agir acide sulfurique à pH 2pendant 1 heures 90" C.Cette technique est coûteuse et le demandeur a préféré lui substituer une technique nouvelle mettant en oeuvre l'hydrolyse-simultanée des oligofructanes et la fermentation acétonobutylîque. Le demandeur a en effet observe qu'il était possible d'effectuer cette hydrolyse par voie enzymatique en mettant en oeuvre une préparation d'inulases d'origine fongique ajoutee, habituellement de façon stérile, au moment de l'ensemencement du fermenteur par
Clostridium acetobutylicum , ce qui reduit le coût de l'opération et facilite la conduite au plan industriel. On a egalement observé que la fermentation alcoolique pratiquee avec Saccharomyces cerevisiae par exemple, peut s'effectuer selon un protocole similaire.Cependant, il est connu que certaines autres levures, par exemple Kluyveromyces fragilis, produisent elles mêmes les inulases nécessaires à l'hydrolyse du jus de,topinamboursensuantité suffisante pour fermenter de tels jus de façon satisfaisante sans addition d'autres sources d'inulases.

L'ensemble de ces observations a permis au demandeur d'experimenter avec succès des protocoles permettant la fermentation conjointe enacétone, butanol et ethanol de jus de topinambours non hydrolyses préalablement en mettant en oeuvre Clostridium acetobutylicum d'une part et
Saccharomyces cerevisiae ou Kluyveromyces fragilis d'autre part et des quantités variables d'inulase. La quantited'inulase ajoutée et le moment ou est pratiquée son addition constituent un nouveau paramètre qui peut être mis avantageusement à profit pour contrôler le déroule- ment des deux fermentations effectuees.

Un cas particulièrement intéressant est celui de la fermentation utilisant conjointement Clostridium acetobutylicum et Kluyveromyces fragilis qui peut permettre la fermentation dans de bonnes conditions en ABE et en éthanol de jus de topinambours non hydrolysés sans l'addition d'une source d'inulase, à cause vraisemblablement du fonctionnement de l'inulase produite par Kluyveromyses fragilis comme illustré dans l'exemple 4. La possibilité de fermenter des concentrations de sucres élevées a conduit le demandeur à s'intéresser à la production, à partir de plantes sucrières telles que topinambours ou betteraves, de jus sucres aussi concentrés que possible . La technique de diffusion habituellement utilisée industriellement pour la production de tels jus dans le cas de la betterave entraîne inevitablement une certaine dilution puisque les teneurs en Saccharose des betteraves sucrières se situent entre 16 et 17 YO et que les jus obtenus par diffusion contiennent de 12 à 13 Y de saccharose. Après diverses experimentations, le demandeur a decouvert la possibilite d'effectuer la fermentation acétonobutylique, la fermentation alcoolique et la combinaison de ces deux fermentations sur des broyats aussi bien de betteraves que de topinambours.Cependant l'épaisseur des moûts de fermentation ainsi obtenus nécessitaient l'emploi d'équipements particuliers permettant l'homogeneisation de tels moûts ainsi que l'évacua- tion des gaz produits dans ces fermentations. Des essais ont été effectues avec succès pour réduire les teneurs en matière solide des moûts en agissant sur les constituants des pulpes qui sont en grande partie responsables de la consistance des broyats. On sait que ces pulpes contiennent des quantités importantes de pectines, d'hémicelluloses, et de cellulose ainsi que des protéines et des sels minéraux.

Par exemple une composition pondérale typique des pulpes de betteraves est la suivante i hêmicelluloses : 17,8 % ; pectine : 15,0 % ; cellulose 18,7 % ; protéines : 6,0 % ; cendres : 11,8 %.

Il était concevable que l'addition d'enzymes susceptibles d'hydrolyser, au moins partiellement, certains de ces constituants de la pulpe, puisse avoir un effet favorable sur la fluidite des broyats à fermenter. Les essais effectués avec des enzymes d'origines diverses ont permis d'observer un effet favorable de certaines preparations enzymatiques et tout particulièrement des pectinases, mais aussi de préparations contenant des cellulases et/ou des hémicellulases;; par exemple, un effet très favorable a été observé en employant des préparations enzymatiques produites par le champignon Aspergillus phenicis riche en pectine et en cellobiase et un effet positif a été également observe avec des préparations produites par le champignon
Trichoderma reesei contenant une activité cellulase élevée ainsi que des activites cellobiase et hémicellulase.

La liquéfaction, rapide dans certains cas, des broyats permet ainsi le travail de fermentation avec des moûts de fluidité acceptable dont la manipulation au plan industriel, en particulier pour les opérations de fermentation et de distillation, est beaucoup plus simple que celle des moûtsépais. Comme illustré dans l'exemple 7, les fermentations sur broyats hydrolysés peuvent être effectuées avec un matériel de fermentation conventionnel.

Un avantage particulièrement appréciable de la technique est qu'elle supprime l'étape coûteuse (diffusion ou autre) habituellement pour la préoaration des jus utilisés pour la fermentation. De plus, l'hydrolyse partielle des pulpes augmente la concentration des sucres en solution notamment du glucose, et augmente donc la quantité totale des sucres fermentescibles à partir d'une quantité donnée de substrat initial (betterave ou topinambour). Enfin, on a également observe l'utilisation par la fermentation conjointe ABE/éthanol de composés autres que le glucose,liberés par l'hydrolyse des pulpes probablement les sucres en C5 (arabinose)provenant des hémicelluloses et l'acide galacturonique provenant de la pectine.L'utilisation de ces composés qui constitue donc également une meilleure utilisation de la ressource, semble principalement le fait de la fermentation acetonobutylique car elle a été egalement observée dans des essais de fermentation acetonobutylique pure sur des broyats hydrolyses enzymatiquement. Comme illustre dans l'exemple 8,dans ce dernier cas, la concentration totale des moûts utilisés est suffisamment reduite pour que la fluidité initiale des moûts rende interessante la pratique de l'hydrolyse des broyats simultanément à la fermentation.

Le procédé selon l'invention permet d'obtenir un melange de butanol, d'acétone et d'éthanol dontla composition, par rapport au moût, représente environ 5 à 15 g/l de butanol, 3 à 10 g/l d'acétone et 4 à 35 g/l d'ethanol. Un tel melange est utilisable, par exemple, comme agent compatibilisant pour le mélange de méthanol à une essence ou un gazole pour moteurs ; au contraire 1 'méthanol seul et même le produit obtenu (exemple 2 ci-après) par fermentation ethanolique suivie de fermentation acetonobutylique constituent de mauvais agents compatibilisants.

Exemple 1 (comparatif)
Un jus de diffusion de betteraves semi-fourragere a eté ajusté à une concentration de 110 g/l de saccharose et additionné de 3,5 g (poids sec) par 1 de liqueur de macération de malus ("corn steep liquor"), de 3 g par 1 d'acide acétique et son pH a été ajusté à 6,8 par addition de 7 ml par 1 d'ammoniaque à 20 % (poids/volume).3,8 litres de ce milieu ont eté places dans un fermenteur de laboratoire de 6 1 et l'ensemble a été stérilisé 40 min à 1200 C dans un autoclave puis après refroidissement à 350 C, ensemencé anaérobiquement avec 200 ml d'une préculture de la souche Clostridium acetobutylicum
IFP 904 (ATCC 39058), elle-même préparée dans une fiole d'erlenmeyer contenant le même milieu dans des conditiohs anaérobies à partir d'un tube de conservation de la souche. Après 10 heures de culture, on a constaté que le pH du milieu passait par un minimum égal à 5,2.

Après 40 h de culture, le pH du milieu était de 5,7; la température a été alors ajustée à 320C et un nouvel ensemencement a éte effectué avec une préculture de la souche de levure Kluyveromyces fragilis
CBS 397 préparée sur un milieu constitue par un jus de betterave semi-fourragère à une concentration de 110 g/l en saccharose additionné de 0,5 g/l de phosphate monopotassique et de 0,5 g/l de liqueur de macération de maTs; le pH de ce milieu éte ajusté à 5 avant stérilisation (40 min à 1200 C). Après 40 h d'incubation supplémentaire à 300 C,la culture a été arrêtée et les produits formés dosés.

Les concentrations en butanol, acétone et ethanol dans le moût ont été trouvéeségales respectivement à 12 g/l, 5 g/l et 0,6 g/l.

Cet exemple n'est pas conforme à l'invention parce qu'il illustre le cas d'un arrêt de la première étape trop tardif, après que le pH du milieu soit passé par son minimum.

Exemple 2 (comparatif)
Un jus de diffusion de betteraves semi-fourrageres (concentration en saccharose 110 g/l) a eté utilisé. il a eté additionné de 3,5 g/l de liqueur de macération de maïs et de 0,5 g/l de phosphate monapotassique et son pH a été ajusté à 5,0. 3,8 1 de ce milieu ont été places dans un fermenteur de 6 1, qui a été stérilisé 40 min à 1200 C, puis ensemencé après refroidissement à 300 par unepreculture de Kluyveromyces fragilis préparée comme décrit dans l'exemple 1.La culture a été conduite pendant 15 h à 30"C. La température a été alors portee à 370 C et le pH,qui était alors de 4,9, a été ajusté à 6,7 par addition de 7 ml d'ammoniaque à 20 %. On a effectué ce moment un nouvel ensemencement du fermenteur avec 200 ml d'une preculture de Clostridium acetobutylicum IFP 904 préparée comme dans l'exemple 1. Après 40 h d'incubation supplémentaire a 37 C, les quantités de butanol, d'acétone et d'éthanol mesurées dans le moût ont été trouvées égales à 1,5 g/1, 0,4 g/l et 36 g/l respectivement.

Cet exemple n'est pas conforme à l'invention, parce que ici, l'ordre des étapes est inversé (ensemencement d'abord avec une levure productrice d'éthanol puis ensemencement avec Clostridium acetobutylicum)
Exemple 3 (conforme à l'invention)
On a préparé un fermenteur comme décrit dans l'exemple 1 et on a effectué l'ensemencement initial avec Clostridium acetobutylicum comme decrit dans ce même exemple. Après 10 h de culture à 350 C, le pH s'étant abaissé à sa valeur minimale égale à 5,2, on a amené la température à 320 C et ensemencé avec une préculture de Kluyveromyces fragilis préparée comme dans l'exemple 1. Apres 30 h d'incubation supplémentaire à 300 C, on a dosé dans le moût de fermentation des concentrations de butanol, d'acétone et d' éthanol respectivement égales à 12 g/l, 4 g/l et 7,5 g/l.

Exemple 4 (comparatif)
Un jus de diffusion de topinambours a été ajuste à une concentration de 62,5 g/l de sucres (exprimés en glucose plus fructose),additionné de 3g/l d'acide acétique et ajusté à pH 6,5 par addition de 7,2 ml d'ammoniaÇue à 20 %. 3,8 1 de ce milieu ont été placés dans un fermenteur de laboratoire de 6 1 et stérilisés comme dans l'exemple 1.

Après refroidissement, le milieu a été ensemence anaérobiquement avec 200 ml d'une préculture de Clostridium acetobutylicum IFP 904. Cette préculture avait ete elle-même préparée dans une fiole d'erlenmeyer contenant le même milieu et incubée anaerobiquement pendant 20 h à 35C C après ensemencement avec un tube de conservation de la souche.

Au moment de l'ensemencement du fermenteur par cette preculture, on a également ajouté dans le milieu 80 ml (40 unites) d'une solution d'inulase produite par la société Novo (réf. Novozym 230) que l'on a stérilisée par filtration. Apres 40 h d'incubation a 35C C,on a dose dans le moût de fermentation des concentrations de butanol, d'acétone et d'éthanol respectivement égales à 13,9 g/l, 7,5 g/l et 0,2 g/l.

Cet exemple n'est pas conforme à l'invention puisqu'il ne comprend pas d'ensemencement avec une levure productrice d'ethanol.

Exemple 5 (comparatif)
On a répété la même expérience que dans l'exemple 4 mais en omettant l'addition d'inulase dans le fermenteur. Dans ce cas, les produits dosés dans le moût de fermentation après 40 h de culture ont été respectivement de 10,25 g/l pour le butanol, 4,5 g/l pour l'acétone et 0,1 g/l pour 1' éthanol.

Cet exemple n'est pas conforme à l'invention puisqu'il ne comprend pas d'ensemencement avec une levure productrice d'éthanol
On notera en outre, qu'ici, l'absence d'inulase provoque l'obtention, par rapport à l'exemple 5, de quantités moindres en butanol et acétone.

Exemple 6 (conforme à l'invention)
Un jus de diffusion de topinambours a eté ajuste à une concentration de 7 5 g/l de sucres (exprimés en glucose plus fructose), additionne de 3 g/l d'acide acétique et ajusté à un pH de 6,5 par addition de 7,5 ml d'ammoniaque à 20 %. 3,8 l de ce milieu ont éte placés dans un fermenteur de laboratoire de 6 l et stérilisés comme dans l'exemple 1. Après refroidissement, le milieu a été ensemence anaérobiquement avec 200 ml d'une préculture de Clostridium acétobuti- licum IFP préparée comme dans l'exemple 4 mais en omettant l'addition d'inulase.Après 10 h d'incubation à 350 C, c'est à dire au moment où le pH passe par une valeur minimale égale à 5,3, on a baissé la température à 320 C et on effectué un nouvel ensemencement avec une préculture de Kluyveromyces fragilis preparée comme dans l'exemple 1.

Après 30 h d'incubation supplémentaire, on a dosé dans le fermenteur des concentrations de butanol, d'acétone et d'éthanol respectivement egales à 13,0 g/l, 6,0 g/l et 7,2 g/l.

Cet exemple montre donc qu'en opérant conformement à l'invention, on obtient des quantités convenables en butanol, acétone et éthanol et que, en outre, l'invention permet donc d'omettre l'addition d'inulase souhaitable dans l'art antérieur (voir l'exemple 4) pour obtenir des quantités convenables de butanol et d'acétone.

Si au cours de cet exemple 6, on avait démarré l'ensemencement avec Kluyveromyces fragilis après 20 heures d'incubation à 35 C (ler étape) au moment où le pH est remonte à 5,7, -on aurait alors obtenu des concentrations en butanol, acétone et éthanol respectivement égales à 13 g/l, 5,5 g/l et 0,9 g/i. (Opération non conforme à l'invention).

Par comparaison, les résultats sont donnés pour un essai analogue à la première partie de l'exemple 6 mais en omettant l'étape de fermentation alcoolique. Pour cette essai, on a donc repris les conditions de l'exemple 5 mais en utilisant une concentration initiale en sucres (exprimés en glucose plus fructose) de 75 g/l et on a obtenu des concentrations en butanol, acétone et ethanol respectivement égales a 9,9 g/l, 3,8 g/l et 0,1 g/l Exemple 7
On a prépare un broyat de betteraves en soumettant les racines lavées à l'action d'un broyeur à couteaux et ajusté la concentration en saccharose du broyat à 100 g/l.Ce broyat a été stérilisé 40 min à 1200 C et en saccharose du broyat à 100 g/l. Ce broyat a été stérilisé 40 min à 1200 C et a été soumis a l'action de preparations enzymatiques contenant les activités d'hydrolyse des constituantsdela pulpe une préparation du champignon Aspergillus phenicis QM 329 contenant par ml, 48 unités de cellobiase, 51,6 unités de pectinase et 12,8 unités de xylanase. Une autre preparation utilisée obtenue à partir du champignon Trichoderma reesei contenait par ml 17,9 unités de celloliase, 17,8 unités de pectinase, 406 unités de xylanase et 10 unités de cellulase (activité papier filtre).On utilise ces préparations dans les conditions suivantes :onaajouté par litre de broyat 27 ml de chacune des deux préparations enzymatiques, amene le pH à 3,8 et incubé ce broyat 24 heures à 50 C. On a observé au bout de cette période une fluidisation importante du broyat et une libération de sucres réducteurs égale à 16,5 g/l venant s'ajouter au saccharose déjà contenu dans le broyat. Une analyse des sucres reducteurs libérés par l'hydrolyse de la pulpe a été effectuée separement sur un echantillon de pulpe épuisée c'est à dire séparée du broyat et lavée pour extraire le saccharose.Après hydrolyse dans les mêmes conditions que le broyat, la composition suivante a été trouvée pour ces sucres réducteurs libérés par cette pulpe : 36 % d'acide galacturonique, 28 % de glucose,3,5 % de galactose 13 % de fructose, 19,5 c,4 d'arabinose. La fluidité du broyat complet après hydrolyse a permis de le soumettre à l'action conjointe des fermentations acétonobutylique et alcoolique dans les conditions décrites dans l'exemple 3 (conforme à l'invention), c'est à dire dans les conditions utilises pour un jus (qui ne sont pas utilisables pour un broyat non hydrolysé à la concentration du présent essai).

A la fin de la fermentation, on a dosé dans le moût, des concentrations de butanol, d'acétone et d'éthanol respectivement égales a 12,1, 4,0 et 7,6 g/l. '.

Exemple 8
On a préparé un broyat de topinambours en soumettant les tubercules laves à l'action d'un broyeur à couteaux et ajusté la concentration en sucres du type oligofructanes ou inuline à 75 g/l (exprimes, en glucose plus fructose). Ce broyat a été stérilisé (40 min a 1200 C) et soumis a l'action des préparations enzymatiques decrites dans l'exemple 7 dans les conditions suivantes : 27 ml de chacune des deux préparations enzymatiques ont ete ajoutées par litre de broyat, le pH a eté amene à 3,8 par addition d'acide acétique et le broyat a ete incubé 24 h à 50 C. Au bout de cette periode, le broyat avait subi une fluidisation importante, ce qui a permis de le soumettre à l'action conjointe des fermentations acétonobutylique et alcoolique dans les conditions de exemple 6 c'est a dire dans les conditions utilisées pour un jus. A la fin de la fermentation, on a dose dans le moût, des concentrations de butanol,d'acetone et d'éthanol respectivement égales a 13,0 , 6,5 et 7,5 g/l
Les espèces de Clostridium capables de fournir un melangé acetonobutylique sont bien connues. En plus de Clostridium acetobutylicum qui constitue l'espèce préferée, on peut mentionner, par exemple,
Clostridium roseum et Clostridium felsineum.

Claims (8)

REVENDICATIONS

1 - Procedé de production d'un melange de butanol, d'acétone et

d'ethanol à partir d'un substrat de plantes sucriers, le dit

procedé consistant en ce que

a/ dans une première étape, en vue de produire un melange de

butanol et d'acétone, on procède, entre environ 32 et 40 C,

à la fermentation acétonobutylique du dit substrat par ensemen

cement par un Clostridium capable de fournir ledit mélange,

le pH initial du milieu de fermentation étant compris entre

environ 6,0 et 7,3 et diminuant ensuite jusqu'à une valeur

minimale comprise entre environ 4,6 et 5,8

b/ dans une seconde étape, en vue de produire de l'éthanol, on

procede, entre environ 28 et 36 C, à une fermentation ethano-

lique du substrat provenant de la première etape par ensemence

ment par une levure productrice d'éthanol, le début de cette

deuxieme étape étant réalisé à partir du moment où, en première

étape, le pH a atteint une valeur proche de sa valeur minimale

comprise entre cette valeur minimale et cette valeur minimale +

0,2.

2 - Procédé selon la renvendi cati on 1 dans lequel la deuxième étape

est effectuée à une température inférieure de 1 à 4" C à la

température de première étape.

3 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2 dans lequel la

première etape est effectuée entre 34 et 37 C environ et la

deuxième étape est effectuée entre 30 et 35 C environ.

4 - Procedé selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel le pH

initial de première étape est compris entre 6,4 et 6,9, la dite

valeur minimale de pH à partir ae laquelle est effectuai la deuxième

étape étant comprise entre environ 4,9 et 5,6.

5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel la

levure productrice d'éthanol estKluyveromyces fragilis 6 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel le

substrat est un jus de betterave.

7 - Procedé selon l'une des revendications 1 à 5 dans lequel le

substrat est un jus de topinambour 8 - Procéde selon la revendication 6 dans lequel le substrat est un

broyat de betteraves dont la pulpe a été préalablement hydrolysée

par au moins une preparation enzymatique contenant au moins un

type d'enzymes choisi dans le groupeconstituépar les cellulases,

les hémicellulases , la cellobiase et les pectinases.

9 - Procédé selon la renvendication 7 dans lequel le substrat est un

broyat de topinambours dont la pulpe a été préalablement hydroly

sée par au moins une preparation enzymatique contenant au moins

un type d'enzymes choisi dans le groupe constitué par les

cellulases, les hémicellulases, la cellobiase et les pectinases.

10 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel le

Clostridium est Clostridium acetobutylicum.

Il - Mélange de butanol, d'acétone et d'éthanol obtenu selon l'une

des revendications 1 à 10 dont la composition, par rapport au

moût de fermentation, représente environ 5 à 15 g/l de butanol,

3 à 10 g/l d'acétone et 4 à 35 g/l d'éthanol.