JP2010517562A - ブチリル−CoAを中間体として酵母を用いてブタノールを製造する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ブタノール生合成の最終経路にある遺伝子クロストリジウム・アセトブチリクムATCC824adhE1(AADをコードする遺伝子)を増幅し、pYUC18発現ベクターにクローニングしてpYUC18.adhE1ベクターを得た。
[配列番号1]P1:5’−aaaaaagcttaacaaaagctggctagtacgg−3’
[配列番号2]P2:5’−ggtacccggggatccgtcgacctgcagtccctatagtgag
tcgtattacagc−3’
[配列番号3]P3:5’−ctgcaggtcgacggatccccgggtacccagtgtagatgtaacaaaatcgact−3’
[配列番号4]P4:5’−ctaggagctcctgggtccttttcatcacgt−3’
[配列番号5]P5:5’−aaaactgcagaagtgtatatttatgaaagtcacaacag−3’
[配列番号6]P6:5’−tccccccggggttgaaatatgaaggtttaaggttg−3’
クロストリジウム・アセトブチリクムATCC824adhE1(AADをコードする遺伝子)及びctfAB(CoATをコードする遺伝子)を増幅し、実施例1において製作されたpYUC18発現ベクターにクローニングしてpYUC18.adhE1.ctfABベクターを得た(図7)。
[配列番号7]P7:5’−tacgcgtcgacaagtgtatatttatgaaagtcacaacag−3’
[配列番号8]P8:5’−tccccccgggataccggcatgcagtatttctttctaaacagccatg−3’
実施例1及び実施例2において製造されたpYUC18、pYUC18.adhE1及びpYUC18.adhE1.ctfABをそれぞれサッカロマイセス・セレビシエATCC208289菌株に導入した後、SC−Trp選択培地(Bacto-yeast nitrogen base without amino acids(0.67%、Difco)、グルコース(2%、CJ)、ドロップアウト混合物(0.2%、TRPDO supplement、BD Bioscience)、Bacto-agar(2%、Difco))においてコロニーを選抜してサッカロマイセス・セレビシエ(pYUC18)、サッカロマイセス・セレビシエ(pYUC18.adhE1)、サッカロマイセス・セレビシエ(pYUC18.adhE1.ctfAB)菌株を製作した。
実施例3において製作された組換え酵母サッカロマイセス・セレビシエ(pYUC18.adhE1)を培養してブタノールの製造を試みた。培養に使用された基本培地組成は、下記の通りである:Bacto-yeast nitrogen base without amino acids(0.67%、Difco)、グルコース(2%、CJ)、ウラシル(20mg/l、シグマ社)、L−ロイシン(100mg/l、シグマ社)、L−ヒスチジン(20mg/l、シグマ社)。なお、基本培地に最終濃度2.5g/lオレイン酸と最終濃度2.5g/lラウリン酸を添加し、pHは5.7に補正した。
実施例3において製作された組換え酵母サッカロマイセス・セレビシエ(pYUC18.adhE1.ctfAB)を培養してブタノールの製造を試みた。培養に使用された基本培地組成は、実施例5と同様である。なお、基本培地に最終濃度40mM酪酸を添加し、pHは5.7に補正した。
Claims (26)
- 有機酸にCoA部分を転移して有機酸を有機酸−CoAに転換する機能を有するCoAT(CoAトランスフェラーゼ)をコードする遺伝子が導入されているブタノール生成能を有する組換え酵母。
- 前記CoATはアセチル−CoA:ブチリル−CoA CoA−トランスフェラーゼであることを特徴とする請求項1に記載の組換え酵母。
- 前記CoATをコードする遺伝子はクロストリジウム属由来ctfABであることを特徴とする請求項1に記載の組換え酵母。
- 前記酵母は、アセチル−CoAをアセトアセチル−CoAに転換する酵素(THL)をコードする遺伝子を有していることを特徴とする請求項1に記載の組換え酵母。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換え酵母をブチレート含有培地において培養することを含むブチリル−CoAの製造方法。
- 前記培地は脂肪酸をさらに含むことを特徴とする請求項5に記載のブチリル−CoAの製造方法。
- 前記脂肪酸は炭素数が4−24個であることを特徴とする請求項6に記載のブチリル−CoAの製造方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換え酵母をブチレート含有培地において培養してブタノールを生成するステップ;及び培養液よりブタノールを回収するステップを含むブタノールの製造方法。
- 前記酵母は、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(AAD)活性を有するアルデヒド・デヒドロゲナーゼ(AAD)をコードする遺伝子を自発的に発現していることを特徴とする請求項8に記載のブタノールの製造方法。
- 前記酵母は、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(AAD)をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項8に記載のブタノールの製造方法。
- 前記アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(AAD)をコードする遺伝子はクロストリジウム属由来のadhE1またはadhE2であることを特徴とする請求項10に記載のブタノールの製造方法。
- 前記培地は脂肪酸をさらに含むことを特徴とする請求項8に記載のブタノールの製造方法。
- 前記脂肪酸は炭素数が4−24個であることを特徴とする請求項12に記載のブタノールの製造方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換え酵母をブチレート産生能を有する微生物と共培養して、前記ブチレート産生能を有する微生物によりブチレートが生成されるようにし、前記組換え酵母が前記生成されたブチレートを用いてブタノールを生成するようにするステップと、培養液からブタノールを回収するステップと、を含むブタノールの製造方法。
- 前記酵母は、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(AAD)活性を有するアルデヒド・デヒドロゲナーゼ(AAD)をコードする遺伝子を自発的に発現していることを特徴とする請求項14に記載のブタノールの製造方法。
- 前記酵母は、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(AAD)をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項14に記載のブタノールの製造方法。
- 前記アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(AAD)をコードする遺伝子はクロストリジウム属由来のadhE1またはadhE2であることを特徴とする請求項16に記載のブタノールの製造方法。
- 前記培地は脂肪酸をさらに含むことを特徴とする請求項14に記載のブタノールの製造方法。
- 前記脂肪酸は炭素数が4−24個であることを特徴とする請求項18に記載のブタノールの製造方法。
- 脂肪酸からブチリル−CoAを生合成可能な酵母を脂肪酸含有培地において培養することを含むブチリル−CoAの製造方法。
- 前記脂肪酸は炭素数が4−24個であることを特徴とする請求項20に記載のブチリル−CoAの製造方法。
- 脂肪酸からブチリル−CoAを生合成可能な酵母を脂肪酸含有培地において培養してブタノールを生成するステップ;及び培養液よりブタノールを回収するステップを含むブタノールの製造方法。
- 前記脂肪酸は炭素数が4−24個であることを特徴とする請求項22に記載のブタノールの製造方法。
- 前記酵母は、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(AAD)活性を有するアルデヒド・デヒドロゲナーゼ(AAD)をコードする遺伝子を自発的に発現していることを特徴とする請求項22に記載のブタノールの製造方法。
- 前記酵母は、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(AAD)をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項24に記載のブタノールの製造方法。
- 前記アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(AAD)をコードする遺伝子はクロストリジウム属由来のadhE1またはadhE2であることを特徴とする請求項25に記載のブタノールの製造方法。
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