CN103975070A - 酰基-酰基载体蛋白(acyl-acp)蜡酯合酶 - Google Patents
酰基-酰基载体蛋白(acyl-acp)蜡酯合酶 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103975070A CN103975070A CN201280057444.8A CN201280057444A CN103975070A CN 103975070 A CN103975070 A CN 103975070A CN 201280057444 A CN201280057444 A CN 201280057444A CN 103975070 A CN103975070 A CN 103975070A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acyl
- host cell
- acp
- wax ester
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010062385 long-chain-alcohol O-fatty-acyltransferase Proteins 0.000 title claims abstract description 313
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 377
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 375
- 101710129019 Long-chain acyl-[acyl-carrier-protein] reductase Proteins 0.000 claims abstract description 237
- 239000004164 Wax ester Substances 0.000 claims abstract description 222
- 235000019386 wax ester Nutrition 0.000 claims abstract description 221
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 135
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 132
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 claims abstract description 85
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 claims abstract description 77
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 325
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 325
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 272
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 247
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 218
- 241000719329 Trentepohlia Species 0.000 claims description 209
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 136
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 131
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 131
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 131
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 119
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 claims description 91
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 79
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 79
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 79
- -1 fatty acid ester Chemical class 0.000 claims description 72
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 claims description 53
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims description 50
- 108700021044 acyl-ACP thioesterase Proteins 0.000 claims description 48
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 48
- 102000005488 Thioesterase Human genes 0.000 claims description 47
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 41
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 38
- 241000159614 Ulothrix Species 0.000 claims description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 241000192707 Synechococcus Species 0.000 claims description 28
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 25
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 22
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 17
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 16
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 16
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 16
- 241000192656 Nostoc Species 0.000 claims description 13
- 241000192584 Synechocystis Species 0.000 claims description 13
- 241000196169 Ankistrodesmus Species 0.000 claims description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 10
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 241000605008 Spirillum Species 0.000 claims description 8
- 241000192542 Anabaena Species 0.000 claims description 7
- 241000192660 Aphanizomenon Species 0.000 claims description 7
- 241000192685 Calothrix Species 0.000 claims description 7
- 241001464427 Gloeocapsa Species 0.000 claims description 7
- 241000192701 Microcystis Species 0.000 claims description 7
- 241000511380 Myxosarcina Species 0.000 claims description 7
- 241000192497 Oscillatoria Species 0.000 claims description 7
- 241000192608 Phormidium Species 0.000 claims description 7
- 241000192511 Pseudanabaena Species 0.000 claims description 7
- 241000192120 Scytonema Species 0.000 claims description 7
- 241000243446 Stigonema Species 0.000 claims description 7
- 241000192118 Trichodesmium Species 0.000 claims description 7
- 241000191366 Chlorobium Species 0.000 claims description 6
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 claims description 6
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 claims description 6
- 238000012505 colouration Methods 0.000 claims description 6
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 claims description 6
- 238000007667 floating Methods 0.000 claims description 6
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 9
- 230000037361 pathway Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 469
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 280
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 188
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 187
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 120
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 73
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 64
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 60
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 58
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 54
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 53
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 43
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 34
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 30
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 30
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 26
- 241000894007 species Species 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 22
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 22
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 22
- 102100027841 Acyl-CoA wax alcohol acyltransferase 2 Human genes 0.000 description 20
- 101710104255 Acyl-CoA wax alcohol acyltransferase 2 Proteins 0.000 description 20
- 101710091608 Probable diacyglycerol O-acyltransferase tgs2 Proteins 0.000 description 20
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 20
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 17
- 230000008859 change Effects 0.000 description 17
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 17
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 17
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 description 16
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 16
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 16
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 15
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 15
- 241000206589 Marinobacter Species 0.000 description 14
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 14
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 14
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 14
- 241000180279 Chlorococcum Species 0.000 description 13
- 125000001924 fatty-acyl group Chemical group 0.000 description 12
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 12
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- QPRQEDXDYOZYLA-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-1-ol Chemical group CCC(C)CO QPRQEDXDYOZYLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 10
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical group CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 description 9
- 241000195615 Volvox Species 0.000 description 9
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000227752 Chaetoceros Species 0.000 description 8
- 241001147476 Cyclotella Species 0.000 description 8
- 241000502321 Navicula Species 0.000 description 8
- 241000195663 Scenedesmus Species 0.000 description 8
- 241001491691 Thalassiosira Species 0.000 description 8
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 7
- 241000199919 Phaeophyceae Species 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 7
- 210000004709 eyebrow Anatomy 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 241000588624 Acinetobacter calcoaceticus Species 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 241000195620 Euglena Species 0.000 description 6
- 241000192128 Gammaproteobacteria Species 0.000 description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 6
- 241000221095 Simmondsia Species 0.000 description 6
- 108020004530 Transaldolase Proteins 0.000 description 6
- 102100028601 Transaldolase Human genes 0.000 description 6
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 6
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 6
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 6
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 6
- IWTBVKIGCDZRPL-LURJTMIESA-N 3-Methylbutanol Chemical group CC[C@H](C)CCO IWTBVKIGCDZRPL-LURJTMIESA-N 0.000 description 5
- 241001607836 Achnanthes Species 0.000 description 5
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 5
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 5
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 5
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 5
- 241000195492 Chroomonas Species 0.000 description 5
- 241000195634 Dunaliella Species 0.000 description 5
- 241001466505 Fragilaria Species 0.000 description 5
- 241000168525 Haematococcus Species 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 241001037825 Hymenomonas Species 0.000 description 5
- 241000936931 Lepocinclis Species 0.000 description 5
- LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N Malonyl CoA Natural products S(C(=O)CC(=O)O)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N 0.000 description 5
- 241000586743 Micractinium Species 0.000 description 5
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical group CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001442227 Nephroselmis Species 0.000 description 5
- 241000180701 Nitzschia <flatworm> Species 0.000 description 5
- 241000199478 Ochromonas Species 0.000 description 5
- 241000546131 Oedogonium Species 0.000 description 5
- 241000196250 Prototheca Species 0.000 description 5
- 241000894422 Pseudochlorella Species 0.000 description 5
- 235000004433 Simmondsia californica Nutrition 0.000 description 5
- 241000206733 Skeletonema Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 5
- 150000002190 fatty acyls Chemical group 0.000 description 5
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical group CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical group CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N malonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 101710146995 Acyl carrier protein Proteins 0.000 description 4
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000206751 Chrysophyceae Species 0.000 description 4
- 241000199912 Crypthecodinium cohnii Species 0.000 description 4
- 241001494742 Dictyocha Species 0.000 description 4
- 102000000476 Fatty Acid Transport Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010055870 Fatty Acid Transport Proteins Proteins 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001501873 Isochrysis galbana Species 0.000 description 4
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 4
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 4
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical group CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001300629 Nannochloropsis oceanica Species 0.000 description 4
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 4
- 241001489223 Saccharomycodes Species 0.000 description 4
- 241000196294 Spirogyra Species 0.000 description 4
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 4
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 4
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 3
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 3
- 244000056139 Brassica cretica Species 0.000 description 3
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 3
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 3
- 108030002325 Carboxylate reductases Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 3
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 3
- 241000186394 Eubacterium Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 240000001549 Ipomoea eriocarpa Species 0.000 description 3
- 235000005146 Ipomoea eriocarpa Nutrition 0.000 description 3
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 101100412856 Mus musculus Rhod gene Proteins 0.000 description 3
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 3
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 3
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- 101100242191 Tetraodon nigroviridis rho gene Proteins 0.000 description 3
- 241001467333 Thraustochytriaceae Species 0.000 description 3
- MUCRYNWJQNHDJH-OADIDDRXSA-N Ursonic acid Chemical compound C1CC(=O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CC[C@@H](C)[C@H](C)[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C MUCRYNWJQNHDJH-OADIDDRXSA-N 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FQCKMBLVYCEXJB-MNSAWQCASA-L atorvastatin calcium Chemical compound [Ca+2].C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1.C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 FQCKMBLVYCEXJB-MNSAWQCASA-L 0.000 description 3
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 3
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 108010083294 ethanol acyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 229940002661 lipitor Drugs 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 3
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710142619 3-hydroxyacyl-[acyl-carrier-protein] dehydratase FabZ Proteins 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010092060 Acetate kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008146 Acetate-CoA ligase Human genes 0.000 description 2
- 108010049926 Acetate-CoA ligase Proteins 0.000 description 2
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 2
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 101100000339 Arabidopsis thaliana ABCG11 gene Proteins 0.000 description 2
- 235000003826 Artemisia Nutrition 0.000 description 2
- 235000003261 Artemisia vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000003595 Aurantiochytrium limacinum Species 0.000 description 2
- 208000016444 Benign adult familial myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 2
- 108010018763 Biotin carboxylase Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N D-ribulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 2
- YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N D-ribulose 1,5-bisphosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 2
- ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N D-threo-2-Pentulose Natural products OCC(O)C(O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 108010001348 Diacylglycerol O-acyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000002148 Diacylglycerol O-acyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 102100036869 Diacylglycerol O-acyltransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108050004099 Diacylglycerol O-acyltransferase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710198510 Enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase [NADH] Proteins 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000195619 Euglena gracilis Species 0.000 description 2
- 241001136487 Eurotium Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 102100036669 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD(+)], cytoplasmic Human genes 0.000 description 2
- 108010041921 Glycerolphosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000206597 Marinobacter hydrocarbonoclasticus Species 0.000 description 2
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 2
- 101100095302 Streptococcus gordonii secA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 2
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 2
- 108700020489 Wax synthase Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 2
- 244000030166 artemisia Species 0.000 description 2
- 235000009052 artemisia Nutrition 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000003653 coastal water Substances 0.000 description 2
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- MWKFXSUHUHTGQN-UHFFFAOYSA-N decan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCO MWKFXSUHUHTGQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 208000016427 familial adult myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 2
- ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N flubendiamide Chemical compound CC1=CC(C(F)(C(F)(F)F)C(F)(F)F)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CC(I)=C1C(=O)NC(C)(C)CS(C)(=O)=O ZGNITFSDLCMLGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- IRHTZOCLLONTOC-UHFFFAOYSA-N hexacosan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCO IRHTZOCLLONTOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N hexan-1-ol Chemical compound CCCCCCO ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 101150075980 psbA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150108659 secA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- HLZKNKRTKFSKGZ-UHFFFAOYSA-N tetradecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCO HLZKNKRTKFSKGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 239000001707 (E,7R,11R)-3,7,11,15-tetramethylhexadec-2-en-1-ol Substances 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001165345 Acinetobacter baylyi Species 0.000 description 1
- 241001156739 Actinobacteria <phylum> Species 0.000 description 1
- 241000611272 Alcanivorax Species 0.000 description 1
- 241000611270 Alcanivorax borkumensis Species 0.000 description 1
- 108010053754 Aldehyde reductase Proteins 0.000 description 1
- 102100027265 Aldo-keto reductase family 1 member B1 Human genes 0.000 description 1
- 102100039239 Amidophosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000091673 Amphiprora Species 0.000 description 1
- 241000611184 Amphora Species 0.000 description 1
- 241000149144 Anabaenopsis Species 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 description 1
- 101100388296 Arabidopsis thaliana DTX51 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100334280 Arabidopsis thaliana FAR3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100334282 Arabidopsis thaliana FAR4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100210353 Arabidopsis thaliana WSD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001495180 Arthrospira Species 0.000 description 1
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 1
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000196313 Asteromonas Species 0.000 description 1
- 101100002068 Bacillus subtilis (strain 168) araR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000616862 Belliella Species 0.000 description 1
- 235000008734 Bergera koenigii Nutrition 0.000 description 1
- 101150095407 Bfar gene Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000255791 Bombyx Species 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241001536324 Botryococcus Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000218459 Carteria Species 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001611009 Chamaesiphon Species 0.000 description 1
- 241000192703 Chlorogloeopsis Species 0.000 description 1
- 241000508318 Chlorogonium Species 0.000 description 1
- 241000531074 Chroococcidiopsis Species 0.000 description 1
- 241001219477 Chroococcus Species 0.000 description 1
- 241000391097 Chrysosphaera Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241001245609 Cricosphaera Species 0.000 description 1
- 241000973888 Crinalium Species 0.000 description 1
- 241000199913 Crypthecodinium Species 0.000 description 1
- 241000195618 Cryptomonas Species 0.000 description 1
- 241000414116 Cyanobium Species 0.000 description 1
- 241001353641 Cyanocystis Species 0.000 description 1
- 241000380046 Cyanospira Species 0.000 description 1
- 241000159506 Cyanothece Species 0.000 description 1
- 241001299740 Cylindrospermopsis Species 0.000 description 1
- 241000565779 Cylindrospermum Species 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000721041 Dactylococcopsis Species 0.000 description 1
- 241000530784 Dermocarpella Species 0.000 description 1
- 241001421462 Desulfatibacillum alkenivorans Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241001454374 Drosophila <fruit fly, subgenus> Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000200106 Emiliania Species 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000354295 Eremosphaera Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101100502354 Escherichia coli (strain K12) fadK gene Proteins 0.000 description 1
- 101150071111 FADD gene Proteins 0.000 description 1
- 241000192601 Fischerella Species 0.000 description 1
- 241000923853 Franceia Species 0.000 description 1
- 241000956293 Fulda Species 0.000 description 1
- 241000968725 Gammaproteobacteria bacterium Species 0.000 description 1
- 241000892911 Geitlerinema Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 241001464794 Gloeobacter Species 0.000 description 1
- 241001134702 Gloeothece Species 0.000 description 1
- 241000589236 Gluconobacter Species 0.000 description 1
- 108010001483 Glycogen Synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000046129 Hahella Species 0.000 description 1
- 241000045411 Hahella chejuensis Species 0.000 description 1
- 241001106237 Halocafeteria Species 0.000 description 1
- 241000549847 Halospirulina Species 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 108010070875 Human Immunodeficiency Virus tat Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 1
- 241000631636 Ishige Species 0.000 description 1
- 241001501885 Isochrysis Species 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000215457 Leptolyngbya Species 0.000 description 1
- 241000890160 Limnobacter Species 0.000 description 1
- 241000913084 Limnothrix Species 0.000 description 1
- 241001134698 Lyngbya Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000947240 Marinobacter adhaerens Species 0.000 description 1
- 241000662215 Marinobacter algicola Species 0.000 description 1
- 241001364934 Marinobacter alkaliphilus Species 0.000 description 1
- 241000356711 Marinobacter arcticus Species 0.000 description 1
- 241001389726 Marinobacter bryozoorum Species 0.000 description 1
- 241000051666 Marinobacter daepoensis Species 0.000 description 1
- 241001625079 Marinobacter excellens Species 0.000 description 1
- 241000051663 Marinobacter flavimaris Species 0.000 description 1
- 241001261755 Marinobacter lipolyticus Species 0.000 description 1
- 241001123647 Marinobacter litoralis Species 0.000 description 1
- 241000947222 Marinobacter lutaoensis Species 0.000 description 1
- 241000482717 Marinobacter maritimus Species 0.000 description 1
- 241001389720 Marinobacter sediminum Species 0.000 description 1
- 241001090148 Marinobacter vinifirmus Species 0.000 description 1
- 241001135624 Marinomonas Species 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000520876 Merismopedia Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- VKEQBMCRQDSRET-UHFFFAOYSA-N Methylone Chemical compound CNC(C)C(=O)C1=CC=C2OCOC2=C1 VKEQBMCRQDSRET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001139348 Microchaete Species 0.000 description 1
- 241000179980 Microcoleus Species 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 241001478792 Monoraphidium Species 0.000 description 1
- 240000002393 Murraya koenigii Species 0.000 description 1
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 241000196305 Nannochloris Species 0.000 description 1
- 241000224474 Nannochloropsis Species 0.000 description 1
- 241000195644 Neochloris Species 0.000 description 1
- 241000059630 Nodularia <Cyanobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000243387 Nostochopsis Species 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241001486857 Oceanobacter Species 0.000 description 1
- 241000908798 Oceanobacter kriegii Species 0.000 description 1
- 241000947832 Oceanospirillaceae Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000514008 Oocystis Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001221669 Ostreococcus Species 0.000 description 1
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 description 1
- 241000407206 Ostrinia scapulalis Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001036353 Parachlorella Species 0.000 description 1
- 241000206766 Pavlova Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 241000206731 Phaeodactylum Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- BLUHKGOSFDHHGX-UHFFFAOYSA-N Phytol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C=CO BLUHKGOSFDHHGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000370518 Phytophthora ramorum Species 0.000 description 1
- 241001060422 Picochlorum Species 0.000 description 1
- 101001135788 Pinus taeda (+)-alpha-pinene synthase, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 241000530769 Planktothrix Species 0.000 description 1
- 241000196317 Platymonas Species 0.000 description 1
- 241000179979 Pleurocapsa Species 0.000 description 1
- 241000722208 Pleurochrysis Species 0.000 description 1
- 241000996896 Pleurococcus Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000192138 Prochlorococcus Species 0.000 description 1
- 241000192141 Prochloron Species 0.000 description 1
- 241000192144 Prochlorothrix Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 241000180717 Pseudoneochloris Species 0.000 description 1
- 241001509341 Pyramimonas Species 0.000 description 1
- 241000195604 Pyrobotrys Species 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 241000582398 Reinekea Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000131970 Rhodospirillaceae Species 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241001575211 Rivularia <snail> Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101100215626 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ADP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000233671 Schizochytrium Species 0.000 description 1
- 241000970913 Schizothrix Species 0.000 description 1
- 244000044822 Simmondsia californica Species 0.000 description 1
- 241000253368 Spirillaceae Species 0.000 description 1
- 241001464990 Stanieria Species 0.000 description 1
- 241000973891 Starria Species 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001148696 Stichococcus Species 0.000 description 1
- 241000863001 Stigmatella aurantiaca Species 0.000 description 1
- 206010042434 Sudden death Diseases 0.000 description 1
- 241001512067 Symploca Species 0.000 description 1
- HNZBNQYXWOLKBA-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofarnesol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)=CCO HNZBNQYXWOLKBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196321 Tetraselmis Species 0.000 description 1
- 241001313706 Thermosynechococcus Species 0.000 description 1
- 241001554087 Thiobacterium Species 0.000 description 1
- 241000157473 Tolypothrix Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 240000000377 Tussilago farfara Species 0.000 description 1
- 235000004869 Tussilago farfara Nutrition 0.000 description 1
- 241000530641 Tychonema Species 0.000 description 1
- 102000006668 UniProt protein families Human genes 0.000 description 1
- 108020004729 UniProt protein families Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241001411205 Viridiella Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 241000235017 Zygosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- RHHGBCYEBPMXAF-BLPRJPCASA-N acetaldehyde;[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-3-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(3r)-3-hydroxy-2,2-dimethyl-4-oxo-4-[[3-oxo-3-(2-sulfanylethylamino)propyl]amino]butyl] hydrogen phosphate Chemical compound CC=O.O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RHHGBCYEBPMXAF-BLPRJPCASA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- BOTWFXYSPFMFNR-OALUTQOASA-N all-rac-phytol Natural products CC(C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)=CCO BOTWFXYSPFMFNR-OALUTQOASA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150044616 araC gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 101150039352 can gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 230000009028 cell transition Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 1
- 235000013409 condiments Nutrition 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 1
- 230000006324 decarbonylation Effects 0.000 description 1
- 238000006606 decarbonylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006477 desulfuration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000023556 desulfurization Effects 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- LQZZUXJYWNFBMV-UHFFFAOYSA-N dodecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCO LQZZUXJYWNFBMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 150000002194 fatty esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000002803 fossil fuel Substances 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 239000000295 fuel oil Substances 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010064177 glutamine synthetase I Proteins 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol group Chemical group OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002532 grape seed extract Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000009569 heterotrophic growth Effects 0.000 description 1
- 244000059217 heterotrophic organism Species 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000000976 ink Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940119170 jojoba wax Drugs 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 1
- 210000000218 midline thalamic nuclei Anatomy 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000003345 natural gas Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000012162 pavlova Nutrition 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- BOTWFXYSPFMFNR-PYDDKJGSSA-N phytol Chemical compound CC(C)CCC[C@@H](C)CCC[C@@H](C)CCC\C(C)=C\CO BOTWFXYSPFMFNR-PYDDKJGSSA-N 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000003161 proteinsynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 102220000832 rs119103279 Human genes 0.000 description 1
- 102200101172 rs28942099 Human genes 0.000 description 1
- 102220013334 rs368367224 Human genes 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 229940082787 spirulina Drugs 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 101150093896 xylS gene Proteins 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
- C12Y102/0108—Long-chain acyl-[acyl-carrier-protein] reductase (1.2.1.80)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/0102—Diacylglycerol O-acyltransferase (2.3.1.20)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01075—Long-chain-alcohol O-fatty-acyltransferase (2.3.1.75)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01084—Alcohol O-acetyltransferase (2.3.1.84)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
- C12Y301/0202—Acyl-CoA hydrolase (3.1.2.20)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/99—Other Carbon-Carbon Lyases (1.4.99)
- C12Y401/99005—Octadecanal decarbonylase (4.1.99.5)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及在经改造以表达酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶的重组宿主细胞中产生蜡酯的非酰基-CoA依赖性方法。本发明方法可在光合微生物中且特别是在蓝细菌中进行。还提供表达酰基-ACP蜡酯合酶和/或形成醇的酰基-ACP还原酶的分离核苷酸分子和载体，表达酰基-ACP蜡酯合酶和任选地形成醇的酰基-ACP还原酶的重组宿主细胞，以及用于通过非酰基-CoA依赖性路径产生蜡酯的系统。
Description
相关申请案的交叉参考
本申请案主张对2011年9月27日申请的标题为“形成脂肪醇的酰基-ACP还原酶(Fatty Alcohol Forming Acyl-ACP Reductases)”的美国临时专利申请案第61/539,640号的优先权益，其是全文以引用方式并入。
参考序列表
本申请案含有参考作为序列表文本文档“60930881_1.1.txt”(大小为138千字节(KB)，创建于2012年2月23日)与本文同时提交的氨基酸序列和/或核酸序列。上文所提到的序列表是依据37C.F.R.§1.52(e)(5)全文以引用方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及生物改造、代谢生物化学和分子生物学领域。具体来说，本发明涉及在重组微生物中产生可用于产生燃料和化学品的脂质，例如蜡酯。
背景技术
全球不断增长的能源需求已导致耗尽化石燃料，其为埋藏的有机物质的可燃地质沉积物，其已转化为原油、煤、天然气或重油。因为化石燃料是通过在地壳中的热量和压力下暴露数亿年以上才形成，所以其为有限的不可再生的资源。此外，人们认为化石燃料的燃烧在全球变暖中起关键作用。因此，业内需要非化石燃料能源。
来自生物来源的烃代表更清洁可持续的替代能源。此外，许多工业(包括塑料和化学品制造商)非常依赖烃在制造工艺中的可用性。目前，富含能量的脂质和脂肪酸(“自然界的石油”)是从植物和动物油分离以产生多种产物例如燃料和油性化学品。最近业内致力于通过成本有效的生物工艺用微生物产生脂肪酸和脂肪酸衍生物。在微生物宿主中产生脂肪酸和/或脂肪酸衍生物的方法阐述于(例如)以下文献中：PCT公开案第WO2007/136762号、第WO2008/119082号、第WO2009/009391号、第WO2009/076559号、第WO2009/111513号、第WO2010/006312号、第WO2010/044960号、第WO2010/118410号、第WO2010/126891号、第WO2011/008535号和第WO2011/019858号以及席尔默(Schirmer)等人，科学(Science)329(5991)：559-562(2010)。
已知游离脂肪酸可对细胞膜造成损伤且因此很难以足以进行大规模生产的量来产生。将脂肪酸还原为诸如蜡酯等更中性的脂质可有助于避免游离脂肪酸毒性。蜡酯相对于诸如乙醇等较短链生物燃料产物具有高能量密度，且可在培养细胞中通过一系列酶促过程来产生。蜡酯在(例如)医学、化妆品和饮食工业中具有多种商业应用。例如，蜡酯可用作蜡烛、化妆品、润滑剂、印刷油墨、溶剂和燃料的组份。
具有从脂肪醇衍生的‘A’链和从酰基-硫酯分子(例如酰基-CoA)衍生的‘B’链的蜡酯是通过脂肪酰基-硫酯底物与脂肪醇之间由蜡酯合酶催化的缩合反应产生。已在(例如)以下物种中鉴别出蜡酯合酶：不动杆菌属(Acinetobacter)(井茂(Ishige)等人，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)68：1192-1195(2002)；卡尔朔伊尔(Kalscheuer)和斯泰因比歇尔(Steinbuchel)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)278：8075-8082(2003)；卡尔朔伊尔等人，应用与环境微生物学72：1373-1379(2006))、海杆菌属(Marinobacter)(何查波(Holtzapple)和施密特-丹纳特(Schmidt-Dannert)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)189：3804-3812(2007))、拟南芥属(Arabidopsis)(李(Li)等人，植物生理学(Plant Physiol.)148：97-107(2008))、牵牛花(petunia)(金(King)等人，植物科学(Planta)226：381-394(2007))、荷荷巴(jojoba)(拉蒂泽巴(Lardizabal)等人，植物生理学122：645-655(2000)和哺乳动物物种(程(Cheng)和罗素(Russell)，生物化学杂志279：37798-37807(2004)；延(Yen)等人，脂质研究杂志(J.Lipid Res.)46：2388-2397(2005))。
脂肪酸酯也可通过蜡酯合酶产生，其为酰基-CoA分子与任何链长度的醇之间的缩合反应的产物。例如，脂肪酸酯可为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丁醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇或戊醇与酰基-CoA分子的缩合产物。在一些情况下，诸如脂肪酸甲基酯(“FAME”)或脂肪酸乙基酯(“FAEE”)等脂肪酸酯可通过将反应中所用的醇(例如，甲醇或乙醇)供应到培养基来产生。类似地，蜡酯可通过将脂肪醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、癸醇、十二醇、十四醇等)供应到表达蜡合酶的宿主微生物的培养基来产生。
然而，如果要完全通过宿主微生物来产生蜡酯，那么宿主微生物必须产生脂肪醇底物。将脂肪酰基-硫酯转化为脂肪醇或脂肪醛的酶一般称为脂肪酰基还原酶(“FAR”)。已在(例如)以下物种中鉴别出FAR：眼虫属(Euglena)(例如，参见提拉万池潘(Teerawanichpan)等人，脂质(Lipids)45：263-273(2010))、拟南芥属(例如，参见罗兰(Rowland)等人，植物生理学142：866-877(2006)；多恩(Doan)等人，植物生理学杂志166：787-796(2009)；和多梅尔格(Domergue)等人，植物生理学153：1539-1554(2010))、蒿属(Artemisia)(例如，参见梅斯(Maes)等人，新植物学家(New Phytol.)189：176-189(2011))、荷荷巴(例如，参见梅茨(Metz)等人，植物生理学122：635-644(2000))、蛾(例如，参见伦纳德(Lienard)等人，国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)107：10955-10960(2010))、蜜蜂(例如，参见提拉万池潘等人，昆虫生物化学和分子生物学(InsectBiochemistry and Molecular Biology)40：641-649(2010))和哺乳动物(例如，参见本初(Honsho)等人，生物化学杂志285：8537-8542(2010))。人们认为某些形成醇的酰基-CoA还原酶可从酰基-CoA直接生成脂肪醇。酰基-CoA到脂肪醇的基于酶的转化还可在二酶两步式反应中进行；在第一步中，形成醛的酰基-CoA还原酶将酰基-CoA还原为脂肪醛，且在第二步中，脂肪醛还原酶将脂肪醛还原为脂肪醇。
通常，为在微生物中产生脂肪酸酯或蜡酯，细胞除了蜡酯合酶以外还需要产生各种酶，且如果蜡酯完全由细胞产生，那么细胞还需要产生生成脂肪醇底物的形成醇的还原酶。例如，在不内源性产生酰基-CoA的宿主中，可能需要引入(例如)编码脂肪酰基硫酯酶的基因以将酰基-酰基载体蛋白(酰基-ACP)转化为游离脂肪酸，且需要引入编码酰基-CoA合成酶的基因以将游离脂肪酸转化为酰基-CoA。例如，蓝细菌不产生酰基-CoA，且迄今为止已测序的蓝细菌基因组不包括编码以下酶的基因：酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA硫酯酶或酰基-CoA合成酶，如已证实最初注释为编码酰基-CoA合成酶的蓝细菌基因编码用于脂肪酸再循环的酰基-ACP合成酶(卡兹马兹克(Kaczmarzyk)和富尔达(Fulda)(2010)植物生理学152：1598-1610)。还将编码脂肪酰基硫酯酶和/或酰基-CoA合成酶的基因添加到天然产生酰基-CoA的宿主生物体中以确保有足够水平的酰基-CoA用于产生蜡酯。然而，引入若干种异源路径组份可能导致难以适当平衡以足以进行大规模生产的高产率产生所需蜡酯终产物的酶表达和活性。此外，诸如游离脂肪酸和脂肪醇等中间体的积累可对宿主细胞具有毒性。
因此，业内仍需要其它可放大规模的有效且经济的产生脂肪酸酯和蜡酯的方法。
发明内容
本发明提供用于产生脂肪酸酯、例如(但不限于)蜡酯的非酰基-CoA依赖性方法。本发明部分基于发明者的以下发现：仅有两个基因的非酰基-CoA依赖性路径可在缺少酰基-CoA的微生物中产生蜡酯。第一基因编码能使用非酰基-CoA底物产生脂肪醇的脂肪酰基还原酶，而第二基因编码能使用非酰基-CoA酰基底物和脂肪醇作为底物产生蜡酯的蜡酯合酶。将所述两个基因引入重组宿主细胞(例如，微生物宿主细胞)，由此容许非酰基-CoA依赖性地产生蜡酯。
本文所揭示的非酰基-CoA依赖性蜡酯生物合成路径可绕过可对宿主细胞具有毒性的酰基-CoA路径中间体、例如游离脂肪酸的生成，由此改良宿主细胞活力。此外，因为非酰基-CoA依赖性路径不需要从游离脂肪酸形成脂肪酰基-CoA底物的ATP依赖性步骤，所以这条路径可比传统的酰基-CoA依赖性路径更能量有效。
由本文所揭示转基因宿主细胞产生的蜡酯合酶可使用除了酰基-CoA以外的底物作为酰基-硫酯底物。例如，蜡酯合酶可使用酰基-ACP作为底物(且因此可在本文中称作“酰基-ACP蜡酯合酶”)。酰基-ACP蜡酯合酶可将短链醇(例如，C1、C2、C3、C4或C5醇)或脂肪醇(例如C6、C7、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24或更长链醇)与酰基-ACP缩合形成脂肪酸酯。与酰基-ACP缩合的醇可由转基因宿主细胞产生或在(例如)培养基中供应到转基因宿主细胞。
发明者在本文中证实，某些来自除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)的蜡酯合酶能在本发明方法中起酰基-ACP蜡酯合酶作用。除烃海杆菌蜡酯合酶的表达以及蓝细菌株系集胞藻属(Synechocystis)PCC6803(其不能天然合成酰基-CoA、脂肪醇或蜡酯)中形成醇的酰基-ACP还原酶Maqu_2220的表达导致非酰基-CoA依赖性蜡酯产生。
本发明提供经遗传改造用于产生一或多种脂肪酸酯的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞含有编码蜡酯合酶的非天然核酸序列，其中所述蜡酯合酶在宿主细胞中表达后能以非酰基-CoA依赖性路径产生脂肪酸酯。例如，重组宿主细胞可包括编码能使用酰基-ACP作为底物的蜡酯合酶的外源基因。
包括编码蜡酯合酶的非天然核酸序列的重组宿主细胞可为不包括编码酰基-CoA合成酶的外源基因的重组宿主细胞。另外或或者，经改造用于产生蜡酯的重组宿主细胞可为如下重组宿主细胞：其不包括编码酰基-CoA合成酶的内源基因，或其具有减弱表达的编码酰基-CoA合成酶的内源基因或编码酰基-CoA合成酶的突变基因，从而使得所述重组宿主细胞产生减少量的酰基-CoA合成酶或活性较低或无活性的酰基-CoA合成酶。在上述实施例中的任一实施例中，宿主细胞可为不产生酰基-CoA的重组宿主细胞。例如，重组宿主细胞可为如下宿主细胞：其不包括外源酰基-CoA合成酶基因，且缺少内源酰基-CoA合成酶基因或具有减弱表达的内源酰基-CoA合成酶基因，从而使得不产生所述酶。
对于上述任一者，另外或或者，包括编码酰基-ACP蜡合酶的非天然核酸序列的重组宿主细胞可为不包括编码酰基-ACP硫酯酶或酰基-CoA硫酯酶的外源基因的细胞。另外，重组宿主细胞可为不表达酰基-ACP硫酯酶和酰基-CoA硫酯酶中的一者或二者或具有其减弱表达的细胞。或者，经改造用于产生脂肪酸酯的宿主细胞可为不包括编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因或编码酰基-CoA硫酯酶的外源基因且进一步不包括编码酰基-CoA合成酶的外源基因的宿主细胞。另外，经改造用于产生脂肪酸酯、例如(但不限于)蜡酯的宿主细胞可为不包括编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因或编码酰基-CoA合成酶的外源基因且具有减弱表达的编码酰基-CoA合成酶的内源基因的宿主细胞。
或者，经改造用于产生脂肪酸酯的宿主细胞可为缺少编码酰基-ACP硫酯酶的内源基因或具有其减弱表达且缺少编码酰基-CoA合成酶的内源基因或具有其减弱表达的宿主细胞，例如宿主细胞可缺少酰基-ACP硫酯酶和酰基-CoA硫酯酶中的一者或二者的内源基因，且可进一步缺少酰基-CoA合成酶的内源基因。所述宿主细胞可用于产生脂肪酸酯(包括但不限于蜡酯)，其中一或多种醇可由宿主细胞产生或提供给宿主细胞以供纳入脂肪酸酯产物中。
在某些实施例中，用于产生蜡酯的转基因微生物包括可使用酰基-ACP作为底物的蜡酯合酶，且进一步包括可使用酰基-ACP作为底物的脂肪酰基还原酶(且因此分别称作“酰基-ACP蜡酯合酶”和“形成醇的酰基-ACP还原酶”)。例如，作为第一步骤，形成醇的酰基-ACP还原酶可将酰基-ACP直接转化为脂肪醇(例如，参见图10)，且作为第二步骤，酰基-ACP蜡酯合酶将所产生的脂肪醇与酰基-ACP缩合形成蜡酯(例如，参见图11)。
因为形成醇的酰基-ACP还原酶能将酰基-ACP直接转化为脂肪醇，且酰基-ACP蜡酯合酶能使用酰基-ACP作为底物与宿主细胞产生的脂肪醇缩合，因此可避免引入若干种酶并平衡其表达水平和/或活性用于产生蜡酯的困难。例如，本文所揭示用于产生蜡酯的微生物可为不包括外源酰基-ACP或酰基-CoA硫酯酶基因中的一者或二者且另外可缺少外源酰基-CoA合成酶基因的微生物。因此，可避免引入这些额外基因(或用于上调内源硫酯酶或酰基-CoA合成酶的改造株系)的步骤。其它优点包括仅诱变两个基因或改变其表达水平比多个基因更易于实现(例如)较高产生水平或不同链长度特异性。
发明者在本文中证实，某些鉴别为形成醇的还原酶的脂肪酰基还原酶(例如那些来自水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)株系VT8和来自济州何氏菌(Hahella chejuensis)株系KCTC2396的还原酶)是泛宿主性的形成醇的脂肪酰基还原酶，其能还原一或多种除了酰基-CoA以外的酰基硫酯底物，且能在本发明方法中起形成醇的酰基-ACP还原酶的作用。先前表征为醛还原酶(例如，参见瓦伦(Wahlen)等人，应用与环境微生物学75：2758-2764(2009)和美国专利公开案第2010/0203614号)的水油海杆菌还原酶(“Maqu_2220”)的氨基酸序列可以基因库(GenBank)登录号ABM19299(SEQ ID NO：2)获得。济州何氏菌还原酶(“Hch_05075”)的氨基酸序列可以基因库登录号YP_436183(SEQID NO：4)获得。
包括编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列和编码如本文所揭示可使用酰基-ACP作为底物的蜡酯合酶的非天然核酸序列的经改造用于产生蜡酯的重组宿主细胞可为不包括编码酰基-CoA合成酶的外源基因的重组宿主细胞。另外，经改造用于产生蜡酯的重组宿主细胞可为不包括编码酰基-CoA合成酶的内源基因或具有减弱表达的编码酰基-CoA合成酶的内源基因的重组宿主细胞。在上述实施例中的任一实施例中，宿主细胞可为不产生酰基-CoA的重组宿主细胞。例如，重组宿主细胞可为如下宿主细胞：其不包括外源酰基-CoA合成酶基因且缺少内源酰基-CoA合成酶基因或具有减弱表达的内源酰基-CoA合成酶基因，从而使得以低水平产生所述酶或不产生所述酶。另外或或者，重组宿主细胞可包括内源酰基-CoA合成酶基因，其中所述基因已突变以使得产生活性较低或无活性的酶。
对于上述任一者，另外或或者，包括编码酰基-ACP蜡合酶的非天然核酸序列和编码酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列的重组宿主细胞可为不包括编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因或编码酰基-Co硫酯酶的外源基因的细胞。另外，重组宿主细胞可为不表达酰基-ACP硫酯酶和酰基-CoA硫酯酶中的一者或二者或具有其减弱表达的细胞。或者，经改造用于产生蜡酯的宿主细胞可为不包括编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因或编码酰基-CoA硫酯酶的外源基因且进一步不包括编码酰基-CoA合成酶的外源基因的宿主细胞。另外，经改造用于产生蜡酯的宿主细胞可为如下宿主细胞：其不包括编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因或编码酰基-CoA合成酶的外源基因，且具有减弱表达的编码酰基-CoA合成酶的内源基因，或表达具有减弱活性的突变体酰基-CoA合成酶。
或者，经改造用于产生蜡酯的宿主细胞可为缺少编码酰基-ACP硫酯酶的内源基因或具有其减弱表达且缺少编码酰基-CoA合成酶的内源基因或具有其减弱表达的宿主细胞。例如，宿主细胞可缺少酰基-ACP硫酯酶和酰基-CoA硫酯酶中的一者或二者的内源基因，且可缺少酰基-CoA合成酶的内源基因。所述宿主细胞可用于产生脂肪酸酯或蜡酯，其中一或多种醇可由宿主细胞产生或提供给宿主细胞以供纳入脂肪酸酯产物中。
在具体实施例中由非天然核酸序列编码的蜡酯合酶可与SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：21的氨基酸序列或与SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21的多肽的功能性片段具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性。例如，由非天然核酸序列编码的蜡酯合酶可为或可包含与SEQ ID NO：19或其功能性片段具有至少85％一致性的多肽，或蜡酯合酶可为或可包含与SEQ ID NO：19或其功能性片段具有至少90％一致性的多肽。蜡酯合酶可为或可包含(例如)SEQ IDNO：19的多肽或其功能性片段。在替代性实例中，由非天然核酸序列编码的蜡酯合酶可为或可包含与SEQ ID NO：21的多肽或其功能性片段具有至少85％一致性的多肽，或蜡酯合酶可为或可包含与SEQ ID NO：21的多肽或其功能性片段具有至少90％一致性的多肽。蜡酯合酶可为或可包含(例如)SEQ ID NO：21的多肽或其功能性片段。
或者或另外，编码蜡酯合酶的核酸序列可与SEQ ID NO：18的核苷酸序列或与其编码SEQ ID NO：19的多肽的功能性片段的一部分具有至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性。例如，核酸序列可包含与SEQ ID NO：18的核苷酸序列或与其编码SEQ ID NO：19的多肽的功能性片段的一部分具有至少85％或至少90％的核苷酸序列。例如，核酸序列可为或可包含SEQ ID NO：18的核苷酸序列。在其它实例中，编码蜡酯合酶的核酸序列可与SEQ IDNO：20的核苷酸序列或与其编码SEQ ID NO：21的多肽的功能性片段的一部分具有至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性。例如，核酸序列可包含与SEQ ID NO：20的核苷酸序列或与其编码SEQ ID NO：21的多肽的功能性片段的一部分具有至少85％或至少90％的核苷酸序列。例如，核酸序列可为或可包含SEQ ID NO：20的核苷酸序列。
对于上述实施例，或者，非天然核酸序列可编码与SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的氨基酸序列或与其编码SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽的功能性片段的一部分具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的多肽。例如，非天然核酸分子可编码与SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的氨基酸序列或与其编码SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽的功能性片段的一部分具有至少至少85％或至少90％的具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的多肽。例如，蜡酯合酶可为或可包含SEQ IDNO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽。在具体实施例中，编码蜡酯合酶的核酸序列可具有至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性与SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42的核苷酸序列或与其编码SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽的功能性片段的一部分。例如，非天然核酸分子可编码与SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42的核苷酸序列或与其编码SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽的功能性片段具有至少至少85％或至少90％的具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的多肽。在一些实施例中，核酸序列是或包含SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42的核苷酸序列。
由非天然核酸分子编码的蜡酯合酶可为重组宿主细胞的异源酶，且任选地编码蜡酯合酶的核酸序列可经密码子优化以供在宿主细胞中表达。在一些实施例中，宿主细胞可为光合宿主细胞，例如藻类细胞，且蜡酯合酶可经密码子优化以供在光合宿主细胞中表达。在一些实施例中，由非天然核酸序列编码的蜡酯合酶可源自海杆菌属、湖沉积杆菌(Limnobacter)、食烷菌(Alcanivorax)、何氏菌(Hahella)、海洋杆菌属(Oceanobacter)、γ-变形菌纲(gammaproteobacterium)或分枝杆菌属(Mycobacterium)。
另外，在上文所提到的任一实施例中，可将编码蜡酯合酶的核酸序列整合到重组宿主细胞的染色体中，且或者或另外，其可存在于重组宿主细胞中的载体中。可将如本文所揭示的宿主生物体中的编码蜡酯合酶的核酸序列可操作连接到启动子和/或增强子。各个替代实施例中的启动子可为相对于蜡酯合酶基因的异源启动子，且可为相对于宿主生物体的异源或同源启动子，可为可调节启动子和/或可为可诱导启动子。
重组宿主细胞、例如段落中阐述的光合宿主细胞除了非天然酰基-ACP蜡酯合酶核酸序列以外还可包括编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列。形成醇的酰基-ACP还原酶可与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：10的氨基酸序列或与这些多肽中任一者的功能性片段具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性。例如，本发明重组宿主细胞可包括编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列，所述还原酶是或包含与SEQ ID NO：2具有至少85％或至少90％一致性的多肽。例如，本发明重组宿主细胞可包括编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列，所述还原酶是或包含SEQ ID NO：2的多肽。或者，本发明重组宿主细胞可包括编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列，所述还原酶是或包含与SEQ ID NO：4具有至少85％或至少90％一致性的多肽。例如，本发明重组宿主细胞可包括编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列，所述还原酶是或包含SEQ ID NO：4的多肽。在其它替代实施例中，本发明重组宿主细胞可包括编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列，所述还原酶是或包含与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10具有至少85％或至少90％一致性的多肽。例如，本发明重组宿主细胞可包括编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列，所述还原酶是或包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10的多肽。
酰基-ACP还原酶可源自海洋细菌，例如海杆菌属、食烷菌、海洋杆菌属、湖沉积杆菌、变形菌纲或何氏菌。如本文所揭示重组宿主细胞中所含的编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列可为(例如)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11的核苷酸序列具有至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列。例如，如本文所揭示重组宿主细胞中所含的编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列可为(例如)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核苷酸序列具有至少85％或至少90％序列一致性的核酸序列。在一些实施例中，编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列可为重组宿主细胞的异源序列，且可任选地经密码子优化以供在光合宿主细胞中表达。形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然基因可存在于载体中，其可任选地为包含酰基-ACP蜡合酶非天然基因的相同载体。编码酰基-ACP还原酶的非天然基因可连接到可操作连接到酰基-ACP蜡合酶基因的相同启动子，或可被可操作连接到不同启动子。可操作连接到非天然酰基还原酶基因和非天然酰基-ACP蜡合酶基因中的一者或二者的启动子可为相对于宿主生物体的异源启动子，且可为可调节启动子，且可任选地为可诱导启动子。在一些实施例中，可将形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然基因和/或酰基-ACP蜡合酶的非天然基因整合到重组宿主细胞的染色体中，或在替代实施例中，一个或两个非天然基因可存在于自主复制的附加体上。
在如本文所提供的重组宿主细胞的各个实施例中，由非天然核酸序列编码的形成醇的酰基-ACP还原酶和酰基-ACP蜡酯合酶二者源自微生物物种，且在一些实施例中，形成醇的酰基-ACP还原酶和酰基-ACP蜡酯合酶中的一者或二者源自原核物种。在一些实例中，形成醇的酰基-ACP还原酶和酰基-ACP蜡酯合酶可源自相同属。例如，在具体实施例中，如本文所提供的重组宿主细胞中的形成醇的酰基-ACP还原酶和酰基-ACP蜡酯合酶可二者都源自相同或不同海杆菌属，或可二者都源自相同或不同的何氏菌、湖沉积杆菌、食烷菌、海洋杆菌属、变形菌纲或分枝杆菌属。
在其它实施例中，经改造用于产生蜡酯的本发明重组宿主细胞除了编码酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列以外还可包括编码形成脂肪醛的还原酶的非天然核酸序列和/或(在一些实施例中)编码形成脂肪醛的还原酶的内源核酸序列。在重组宿主细胞包括形成脂肪醛的内源还原酶的实施例中，可将编码形成脂肪醛的内源还原酶的序列可操作连接到异源启动子，所述异源启动子在一些实施例中可为可调节启动子，例如可诱导启动子。在一些实例性实施例中，重组宿主细胞是蓝细菌且包括编码源自相同或不同蓝细菌的形成脂肪醛的酰基-ACP还原酶的外源基因。
如本文任一实施例中所揭示的重组宿主细胞可为微生物宿主细胞，例如真菌、酵母、不等鞭毛菌、微藻、蓝细菌或真细菌。例如，宿主可为以下物种：酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、子囊菌酵母属(Yarrowia)、红酵母属(Rhodotorula)、罗氏酵母属(Rhorosporidum)、曲霉菌属(Aspergillus)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖壶菌(Schizochytrium)、破囊壶菌目(Thraustochytriales)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、棒杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、诺卡尔菌属(Nocardia)、红球菌属(Rhodococcus)或葡萄糖菌(Gluconobacter)。
如本文任一实施例中所揭示的重组宿主细胞可为光合宿主细胞，例如光合微生物，例如微藻或蓝细菌。例如，在一些实施例中，重组宿主细胞可为以下蓝细菌：阿格门氏藻(Agmenellum)、鱼腥藻属(Anabaena)、项圈藻属(Anabaenopsis)、倒囊藻属(Anacystis)、丝囊藻属(Aphanizomenon)、节螺藻属(Arthrospira)、星球藻属(Asterocapsa)、博氏藻属(Borzia)、眉藻属(Calothrix)、管孢藻属(Chamaesiphon)、拟绿胶蓝细菌属(Chlorogloeopsis)、拟色球藻属(Chroococcidiopsis)、色球藻属(Chroococcus)、发毛针藻属(Crinalium)、蓝细菌、双色藻属(Cyanobium)、蓝囊胞菌属(Cyanocystis)、蓝螺菌属(Cyanospira)、蓝杆藻属(Cyanothece)、柱胞藻属(Cylindrospermopsis)、筒孢藻属(Cylindrospermum)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、小皮果蓝细菌属(Dermocarpella)、侧生藻属(Fischerella)、费氏藻属(Fremyella)、盖特勒氏蓝细菌属(Geitleria)、吉特勒氏线状蓝细菌属(Geitlerinema)、胶菌藻(Gloeobacter)、粘球藻属(Gloeocapsa)、粘杆藻属(Gloeothece)、盐螺旋藻属(Halospirulina)、英加藻属(Iyengariella)、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya)、湖丝藻属(Limnothrix)、鞘丝藻属(Lyngbya)、微鞘藻属(Microcoleus)、微囊藻属(Microcystis)、粘囊藻属(Myxosarcina)、节球藻属(Nodularia)、念珠藻属(Nostoc)、拟念珠藻属(Nostochopsis)、颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、浮丝藻属(Planktothrix)、宽球藻属(Pleurocapsa)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、原绿菌属(Prochloron)、原绿发菌属(Prochlorothrix)、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、胶须藻属(Rivularia)、裂须藻属(Schizothrix)、双歧藻属(Scytonema)、螺旋藻属(Spirulina)、斯塔尼尔蓝菌属(Stanieria)、斯塔尔氏蓝菌属(Starria)、真枝藻属(Stigonema)、束藻属(Symploca)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属、嗜热聚球藻(Thermosynechococcus)、单岐藻属(Tolypothrix)、束毛藻属(Trichodesmium)、常丝藻(Tychonema)或异球藻属(Xenococcusi)。例如，重组光合微生物可为聚球藻属、集胞藻属或嗜热聚球藻。或者，重组光合微生物可为双色藻属、蓝杆藻属或蓝细菌，或另外或者，重组光合微生物可为胶菌藻、鞘丝藻属或立普妥蓝巴(Leptolyngba)。
在替代实施例中，重组宿主细胞可为(例如)以下的真核微藻：曲壳藻属(Achnanthes)、茧形藻属(Amphiprora)、双眉藻属(Amphora)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、星胞藻属(Asteromonas)、金藻(Boekelovia)、保罗氏藻(Borodinella)、葡萄藻属(Botryococcus)、微细绿藻(Bracteococcus)、角毛藻属(Chaetoceros)、四鞭藻属(Carteria)、衣藻属(Chlamydomonas)、绿球藻属(Chlorococcum)、绿梭藻属(Chlorogonium)、小球藻属(Chlorella)、蓝隐藻属(Chroomonas)、金球藻属(Chrysosphaera)、球钙板藻属(Cricosphaera)、隐甲藻属(Crypthecodinium)、隐藻属(Cryptomonas)、小环藻属(Cyclotella)、杜氏藻属(Dunaliella)、捕圆藻属(Ellipsoidon)、球石藻属(Emiliania)、独球藻属(Eremosphaera)、厄诺氏藻属(Ernodesmius)、眼虫属、被刺藻属(Franceia)、脆杆藻属(Fragilaria)、丽丝藻属(Gloeothamnion)、红球藻属(Haematococcus)、嗜盐古菌(Halocafeteria)、膜胞藻属(Hymenomonas)、等鞭金藻(Isochrysis)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、微星藻属(Micractinium)、富油微藻(Monoraphidium)、微绿球藻(Nannochloris)、微拟球藻(Nannochloropsis)、舟形藻属(Navicula)、新绿球藻(Neochloris)、肾鞭藻属(Nephrochloris)、肾藻属(Nephroselmis)、菱形藻属(Nitzschia)、棕鞭藻属(Ochromonas)、鞘藻属(Oedogonium)、卵囊藻属(Oocystis)、蚝球藻属(Ostreococcus)、巴夫藻(Pavlova)、拟小球藻属(Parachlorella)、杜氏亚属盐藻(Pascheria)、褐指藻属(Phaeodactylum)、噬菌体属(Phagus)、匹克氏藻属(Picochlorum)、扁藻属(Platymonas)、颗石藻(Pleurochrysis)、肋球藻属(Pleurococcus)、原壁菌属(Prototheca)、伪小球藻属(Pseudochlorella)、伪新绿球藻(Pseudoneochloris)、塔孢藻(Pyramimonas)、桑椹藻属(Pyrobotrys)、栅藻属(Scenedesmus)、骨条藻属(Skeletonema)、水绵属(Spyrogyra)、裂丝藻属(Stichococcus)、四片藻属(Tetraselmis)、海链藻属(Thalassiosira)、小球藻微藻(Viridiella)或团藻属(Volvox)。在一些实施例中，重组宿主细胞可为硅藻，例如双眉藻属、角毛藻属、小环藻属、舟形藻属、褐指藻属或海链藻属。在一些实施例中，重组宿主细胞可为小球藻属、微拟球藻、栅藻属或四片藻属的物种。
在另一方面中，本发明提供产生脂肪酸酯的方法，其包含以下步骤：在适宜培养基中培养包括编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列的重组宿主细胞，和容许表达编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列以产生脂肪酸酯。例如，宿主细胞可产生可通过由宿主细胞表达的蜡合酶与酰基-ACP缩合的醇，其可为(例如)短链醇(例如，乙醇、丙醇、丁醇、异丁醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇)。或者，本发明提供通过以下方式产生蜡酯的方法：在适宜培养基中培养包括编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列的重组宿主细胞，将至少一种醇供应到培养基中，和容许表达编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列以产生蜡酯。所述醇可为(例如)短链醇或脂肪醇。
本发明还提供通过以下方式产生蜡酯的方法：在适宜培养基中培养包括编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列和编码形成脂肪醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列的重组宿主细胞，且容许表达编码酰基-ACP还原酶和酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列以产生蜡酯。另外，可在不包括醇、例如短链醇或脂肪醇的培养基中培养重组宿主细胞。
用于本文所揭示任一方法中的重组宿主细胞可为如本文所揭示的(例如)不包括编码酰基-CoA合成酶的外源核酸分子的重组宿主细胞。或者或另外，用于产生脂肪酸酯和蜡酯的方法中的重组宿主细胞可为缺少编码酰基-CoA合成酶的内源基因的重组细胞，或者用于所述方法中的重组细胞可为经改造以减弱或消除酰基-CoA产生的细胞。例如，重组宿主细胞可为不产生酰基-CoA和/或不产生酰基-CoA合成酶的细胞。
另外，如本文所揭示，用于所述方法中的宿主细胞可为不包括外源酰基-ACP或外源酰基-CoA硫酯酶基因中的一者或两者的宿主细胞。另外，用于产生脂肪酯或蜡酯的宿主细胞可缺少编码酰基-ACP硫酯酶的内源基因或编码酰基-CoA硫酯酶的内源基因，或在某些实施例中，宿主细胞可具有减弱表达的内源酰基-ACP硫酯酶基因和/或内源酰基-CoA硫酯酶基因，从而使得不产生或以减少量产生所述酶。例如，用于所述方法中的重组宿主细胞可为不产生酰基-ACP硫酯酶或酰基-CoA硫酯酶的宿主细胞。在一些实例中，用于所述方法中的重组宿主细胞可为不产生酰基-ACP硫酯酶或酰基-CoA硫酯酶且不产生酰基-CoA的宿主细胞。在一些实例中，用于所述方法中的重组宿主细胞可为不包括编码酰基-ACP硫酯酶或酰基-CoA硫酯酶的外源基因且不包括编码酰基-CoA合成酶的外源基因的宿主细胞。在一些实例中，用于所述方法中的重组宿主细胞可为不包括编码酰基-ACP硫酯酶或酰基-CoA硫酯酶的内源基因且不包括编码酰基-CoA合成酶的外源基因的宿主细胞。在一些实例中，用于所述方法中的重组宿主细胞可为不包括编码酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA硫酯酶和酰基-CoA合成酶中的任一者的内源或外源基因的宿主细胞。
产生脂肪酸酯或蜡酯的非酰基-CoA依赖性方法可使用具有编码任何酰基-ACP蜡酯合酶、例如本文所述的任一者和(在蜡酯完全由重组宿主细胞产生的方法中)任何形成醇的酰基-ACP还原酶、例如本文所述的任一者的非天然基因的重组细胞。
在具体实施例中，所述方法可使用具有编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然基因的重组细胞，所述酰基-ACP蜡酯合酶与除烃海杆菌WS1(SEQ ID NO：19)或WS2(SEQ IDNO：21)具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性，或与SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。例如，产生诸如蜡酯等脂肪酸酯的方法可包括使用包括编码酰基-ACP蜡酯合酶的基因的改造微生物，所述酰基-ACP蜡酯合酶与除烃海杆菌WS1(SEQ ID NO：19)具有至少85％或90％氨基酸序列一致性。或者，产生诸如蜡酯等脂肪酸酯的方法可包括使用包括编码酰基-ACP蜡酯合酶的基因的改造微生物，所述酰基-ACP蜡酯合酶与除烃海杆菌WS2(SEQ ID NO：21)具有至少85％或90％氨基酸序列一致性。在一些实例中，本发明提供使用由核酸序列编码的酰基-ACP蜡酯合酶产生蜡酯的非酰基-CoA依赖性方法，其与编码WS1(SEQ ID NO：18)或WS2(SEQ ID NO：20)的核酸序列具有至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。例如，产生诸如蜡酯等脂肪酸酯的方法可包括使用包括与除烃海杆菌WS1(SEQ ID NO：18)具有至少85％或90％序列一致性的基因的改造微生物。或者，产生诸如蜡酯等脂肪酸酯的方法可包括使用包括与除烃海杆菌WS2(SEQ ID NO：22)具有至少85％或90％序列一致性的基因的改造微生物。
酰基-ACP蜡酯合酶的一些或所有脂肪醇底物可在包括编码任何形成醇的酰基-ACP还原酶、例如本文所述的任一者的非天然核酸序列的重组宿主细胞中产生。例如，所述方法可使用具有编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然基因的重组细胞，所述形成醇的酰基-ACP还原酶与Maqu_2220(SEQ ID NO：2)或Hch_05075(SEQ ID NO：4)具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性，或与SEQ ID NO：6、8或10的氨基酸序列具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。例如，产生蜡酯的方法可包括使用包括编码形成醇的酰基-ACP还原酶的基因的改造微生物，所述形成醇的酰基-ACP还原酶与Maqu_2220(SEQ ID NO：2)具有至少85％或90％氨基酸序列一致性。或者，产生蜡酯的方法可包括使用包括编码形成醇的酰基-ACP还原酶的基因的改造微生物，所述形成醇的酰基-ACP还原酶与Hch_05075(SEQ ID NO：4)具有至少85％或90％氨基酸序列一致性。例如，产生蜡酯的方法可包括使用包括与Maqu_2220(SEQ ID NO：1)具有至少85％或90％序列一致性的基因的改造微生物。或者，产生蜡酯的方法可包括使用包括与Hch_05075(SEQ ID NO：3)具有至少85％或90％序列一致性的基因的改造微生物。
相对于在所有方面与所述重组宿主细胞相同只是缺少编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列和编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列(如果存在)的对照宿主细胞，重组宿主细胞可产生提高水平的脂肪酸酯或蜡酯。例如，在一些实施例中，相对于缺少编码蜡酯合酶的非天然核酸序列的对照宿主细胞，重组宿主细胞可产生多至少50％之脂肪酸酯。或者或另外，相对于缺少编码蜡酯合酶的非天然核酸序列和酰基-ACP还原酶的非天然编码序列的对照宿主细胞，重组宿主细胞可产生多至少50％之蜡酯。在一些实例中，相对于缺少编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列和编码酰基-ACP还原酶的非天然序列的对照宿主细胞，重组宿主细胞可产生多至少100％之蜡酯。
另外，在所述方法的一些实例中，重组宿主细胞可在约1天到约30天、例如约3天到约15天或约5天到约10天的培养期中产生至少1mg/L、2mg/L、5mg/L或10mg/L蜡酯。另外或或者，重组宿主细胞可在约1天到约30天、例如约3天到约15天或约5天到约10天的培养期中产生少于约1g/L、500mg/L、200mg/L、100mg/L或50mg/L蜡酯。
在本文所提供方法的一些实例中，所述方法包括产生至少一种蜡酯分子，其中从脂肪醇衍生的A链和从酰基底物(例如，酰基-ACP)衍生的B链是由宿主细胞、例如如本文所揭示的重组微生物产生，且A链和B链二者可具有C8-C24的链长度。例如，至少一种通过本文所揭示方法产生的蜡酯分子可具有C12-C18的A链和B链二者。另外但任选地，通过本文所述任一方法产生的蜡酯的至少一部分可由宿主细胞分泌。另外但任选地，所述方法可进一步包括分离蜡酯或蜡酯产物的步骤。
另外但任选地，产生蜡酯的重组宿主细胞还可优选地表达形成脂肪醛的还原酶，例如形成脂肪醛的酰基-ACP还原酶。形成脂肪醛的还原酶可为重组宿主细胞的内源酶，或者可为重组宿主细胞的外源酶。
另外但任选地，可通过(例如)表达或过表达一或多种外源或内源多肽(例如β-酮酰基合成酶、乙酰基-CoA羧化酶、丙二酰CoA:ACP转酰酶、酰基-ACP合成酶或酰基载体蛋白)来上调重组宿主细胞中的酰基-ACP产生。例如，重组宿主细胞可表达或过表达一或多种促进碳固定或提高光合集光效率或促进蜡酯产物分泌的外源或内源多肽，例如核酮糖1，5-二磷酸羧化酶、藻胆蛋白或跨膜转运蛋白。在一些实施例中，重组宿主细胞具有减弱表达的以下酶中的一或多者：甘油-3-磷酸脱氢酶、乙醛CoA脱氢酶、丙酮酸脱氢酶或乙酸盐激酶。
产生蜡酯的重组宿主细胞还可任选地表达跨膜转运蛋白(例如ATP结合盒(ABC)转运蛋白、多药排出蛋白或RND泵)以促进蜡酯分泌。
本发明进一步提供在光合宿主细胞中产生蜡酯的非酰基-CoA依赖性方法。光合宿主细胞能使用无机碳(例如，二氧化碳或碳酸盐或碳酸氢盐化合物)作为碳源，且可由此提供比完全依赖还原碳源和/或较长链碳源的宿主细胞更有效且更成本有效的蜡酯产生方法。
本发明提供产生脂肪酸酯的方法，其包含以下步骤：在适宜培养基中培养包括编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列的光合宿主细胞和容许表达编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列以产生脂肪酸酯。一些实例中的光合宿主细胞可产生一或多种醇(其可为(例如)短链或脂肪醇)用作蜡合酶的底物。适宜培养基可为(例如)不包括大量还原碳源的培养基和/或可为不包括醇(例如短链或脂肪醇)的培养基。
或者，本发明提供通过以下方式产生蜡酯的方法：在适宜培养基中培养包括编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列的重组光合宿主细胞，将至少一种醇供应到培养基，和容许表达编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列以产生蜡酯。所供应醇可为(例如)短链醇或脂肪醇。
本发明还提供通过以下方式产生蜡酯的方法：在适宜培养基中培养包括编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列和编码形成脂肪醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列的光合宿主细胞，且容许表达编码酰基-ACP还原酶和酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列以产生蜡酯。可在不包括所供应醇的培养基中培养光合微生物。另外，可在不包括大量还原碳源(例如醇、糖或有机酸)的培养基中培养重组光合宿主细胞。另外，所述方法可包括在至少一部分培养期中将培养物暴露于光。
光合宿主细胞可包括编码如本文所揭示的任何酰基-ACP蜡酯合酶基因的非天然核酸序列，且可进一步包括编码酰基-ACP还原酶(例如本文所揭示的任一者)的非天然核酸序列。在一些实施例中，本发明的非酰基-CoA依赖性方法是在光合微生物(例如蓝细菌或真核微藻)中实施。在某些实施例中，光合微生物不内源性产生酰基-CoA。
用于产生蜡酯的重组光合宿主细胞可为真核微藻，例如曲壳藻属、茧形藻属、双眉藻属、纤维藻属、星胞藻属、金藻、保罗氏藻、葡萄藻属、微细绿藻、角毛藻属、四鞭藻属、衣藻属、绿球藻属、绿梭藻属、小球藻属、蓝隐藻属、金球藻属、球钙板藻属、隐甲藻属、隐藻属、小环藻属、杜氏藻属、捕圆藻属、球石藻属、独球藻属、厄诺氏藻属、眼虫属、被刺藻属、脆杆藻属、丽丝藻属、红球藻属、嗜盐古菌、膜胞藻属、等鞭金藻、鳞孔藻属、微星藻属、富油微藻、微绿球藻、微拟球藻、舟形藻属、新绿球藻、肾鞭藻属、肾藻属、菱形藻属、棕鞭藻属、鞘藻属、卵囊藻属、蚝球藻属、巴夫藻、拟小球藻属、杜氏亚属盐藻、褐指藻属、噬菌体属、匹克氏藻属、扁藻属、颗石藻、肋球藻属、原壁菌属、伪小球藻属、伪新绿球藻、塔孢藻、桑椹藻属、栅藻属、骨条藻属、水绵属、裂丝藻属、四片藻属、海链藻属、小球藻微藻或团藻属。
本发明方法可有利地在蓝细菌宿主细胞中实施。蓝细菌合成酰基-ACP，但无法天然地制备酰基-CoA、脂肪醇或蜡酯。此外，蓝细菌基因组不包括编码酰基-ACP硫酯酶或酰基-CoA硫酯酶的基因。因此，蓝细菌宿主细胞可通过以下方式经改造以产生蜡酯：引入编码酰基-ACP蜡酯合酶(例如，WS1(SEQ ID NO：19)或WS2(SEQ ID NO：21)，或与WS1或WS2具有至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的蜡酯合酶，或如本文所揭示的其它酶，例如SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43中的任一者)的核酸分子和单一形成醇的酰基-ACP还原酶基因(例如，编码与(例如)Maqu_2220(SEQ ID NO：2)、Hch_05075(SEQ ID NO：4)、MDG893_11561(SEQ ID NO：6)、HP15_810(SEQ ID NO：8)或RED65_09894(SEQ ID NO：10)具有至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的酰基-ACP还原酶，或如本文所揭示的其它酶)，而无需减弱或消除用于酰基-CoA依赖性路径的内源基因(例如硫酯酶或酰基-CoA合成酶)的表达。此外，由于蓝细菌是可利用无机(非还原)碳源(例如CO2)的光合微生物，所以与(例如)依赖必须添加到培养基中的有机碳源(例如糖)的异养细胞相比，经酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶基因转型的蓝细菌可提供更具流线型且能量更有效的用于产生蜡酯的生物系统。
可用作宿主细胞的蓝细菌包括(例如)阿格门氏藻、鱼腥藻属、项圈藻属、倒囊藻属、丝囊藻属、节螺藻属、星球藻属、博氏藻属、眉藻属、管孢藻属、拟绿胶蓝细菌属、拟色球藻属、色球藻属、发毛针藻属、双色藻属、蓝囊胞菌属、蓝螺菌属、蓝杆藻属、柱胞藻属、筒孢藻属、蓝纤维藻属、小皮果蓝细菌属、侧生藻属、费氏藻属、盖特勒氏蓝细菌属、吉特勒氏线状蓝细菌属、胶菌藻、粘球藻属、粘杆藻属、盐螺旋藻属、英加藻属、瘦鞘丝藻属、湖丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、微囊藻属、粘囊藻属、节球藻属、念珠藻属、拟念珠藻属、颤藻属、席藻属、浮丝藻属、宽球藻属、原绿球藻属、原绿菌属、原绿发菌属、假鱼腥藻属、胶须藻属、裂须藻属、双歧藻属、螺旋藻属、斯塔尼尔蓝菌属、斯塔尔氏蓝菌属、真枝藻属、束藻属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻、单岐藻属、束毛藻属、常丝藻或异球藻属。例如，重组光合微生物可为聚球藻属、集胞藻属或嗜热聚球藻。或者，重组光合微生物可为双色藻属、蓝杆藻属或蓝细菌，或另外或者，重组光合微生物可为胶菌藻、鞘丝藻属或立普妥蓝巴。
本发明还提供以非酰基-CoA依赖性方式通过(例如)培养不产生酰基-CoA且表达酰基-ACP蜡酯合酶的重组微生物产生脂肪酸酯的系统，以及使用所述宿主和系统产生的蜡酯。例如，本文提供产生蜡酯的系统，其包括在不包括大量还原碳源的培养基中培养的具有编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列的重组光合微生物，其中在至少一部分产生期中使所述光合微生物暴露于光。另外，光合微生物可进一步包括编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列。任选地，所述系统可进一步包括无机(例如，非还原)碳源，例如CO2、碳酸、碳酸盐或碳酸氢盐。优选实施例中的无机碳源为蜡酯产物的合成提供碳。在一些实例中，光合微生物是蓝细菌。
本发明还提供编码酰基-ACP蜡酯合酶的分离核酸分子、编码形成醇的酰基-ACP还原酶的分离核酸分子以及编码酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶的分离核酸分子。在一些实施例中，分离核酸分子进一步包含来自光合微生物的至少50个核苷酸的另一核酸序列。此外，本发明提供载体和重组宿主细胞，其包含至少一种编码酰基-ACP蜡酯合酶的分离核酸分子或载体，且任选地进一步包含至少一种编码形成醇的酰基-ACP还原酶的分离核酸分子或载体，或包含至少一种编码酰基-ACP蜡酯合酶与形成醇的酰基-ACP还原酶二者的分离核酸分子。
在本发明的另一方面中，提供包括蜡酯的组合物。所述蜡酯是通过本文提供的方法来产生，且可包括一或多种具有链长度为C8-C24的A链和B链二者的蜡酯。在一些实施例中，所述组合物包含至少一种通过本文所揭示方法产生的具有C12-C18的A链和B链二者的蜡酯分子。根据某些实施例，本发明组合物包含不同蜡酯的混合物，其中所述混合物以与通过本发明重组宿主细胞所产生蜡酯类似的比例(例如，在+/-20％内)包含不同蜡酯。另外或或者，根据某些实施例，通过检测组合物中的次要杂质并鉴别其来源为本发明重组宿主细胞，本发明蜡酯组合物可经鉴别是根据本发明方法产生。例如，组合物可含有一或多种核酸分子作为次要组份，其可通过(例如)聚合酶链式反应(PCR)或通过可选序列特异性核酸扩增检测方法来检测，其中核酸分子可具有编码酰基-ACP蜡合酶的至少一部分的对应于SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42等的至少一部分的序列或与其具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列，和/或核酸分子可具有编码酰基-ACP还原酶的至少一部分的对应于SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11等的至少一部分的序列或与其具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。
附图说明
图1显示水油海杆菌株系VT8Maqu_2220酰基-ACP还原酶的氨基酸序列(“Maqu_2220”；SEQ ID NO：2)。
图2显示济州何氏菌株系KCTC2396形成醇的酰基-ACP还原酶的的氨基酸序列(“Hch_05075”；SEQ ID NO：4)。
图3显示栖藻海杆菌(Marinobacter algicola)株系DG893形成醇的酰基-ACP还原酶的氨基酸序列(“MDG893_11561”；SEQ ID NO：6)。
图4显示粘附海杆菌(Marinobacter adhaerens)株系HP15形成醇的酰基-ACP还原酶的氨基酸序列(“HP15_810”；SEQ ID NO：8)。
图5显示海洋杆菌属株系RED65形成醇的酰基-ACP还原酶的氨基酸序列(“RED65_09894”；SEQ ID NO：10)。
图6显示除烃海杆菌株系8798WS1蜡酯合酶的氨基酸序列(“WS1蜡酯合酶”；SEQID NO：19)。
图7显示除烃海杆菌株系8798WS2蜡酯合酶的氨基酸序列(“WS2蜡酯合酶”；SEQID NO：21)。
图8显示海杆菌属株系ELB17蜡酯合酶的氨基酸序列(“ELB17蜡酯合酶”，SEQ IDNO：43)。
图9是脂肪酸衍生物代谢路径的示意图。
图10是从酰基-ACP产生脂肪醇的实例性代谢路径的示意图。
图11是从脂肪醇和酰基-ACP产生蜡酯的两步式代谢路径的示意图。
图12显示用密码子优化的Maqu_2220酰基-ACP还原酶基因构建的整合载体的质粒图(pSGE05075)。RS1-下和RS1-上是指在集胞藻PCC6803的染色体上的整合位点。
图13A)显示光养生长且表达Maqu_2507酰基-CoA还原酶(SEQ ID NO：12)的集胞藻PCC6803的气相色谱色谱图。B)显示光养生长且表达编码密码子优化的Maqu_2220酰基-ACP还原酶(SEQ ID NO：11)的基因的集胞藻PCC6803的气相色谱色谱图。在顶端标记脂质产物的每个峰。
图14显示展示与表达使用酰基-CoA作为底物的Maqu_2507(5076)酰基-CoA还原酶的集胞藻PCC6803相比，表达野生型(5074)和6803密码子优化的(5075)Maqu_2220酰基-ACP还原酶的集胞藻PCC6803的脂肪醇(C16:O-醇和C18:O-醇)的量的图。在任何样品中都没有检测到脂肪醛。
图15显示展示不表达异源酰基-ACP还原酶(“Wt6803”)或表达Hch_05075形成脂肪醇的酰基-ACP还原酶(“何氏菌FAR”)的集胞藻PCC6803的总脂肪醇的图。
图16显示用Maqu_2220酰基-ACP还原酶基因和WS1基因构建的整合载体的质粒图(pSGE05175)。RS1-下和RS1-上是指集胞藻PCC6803的染色体上的整合位点。
图17显示展示表达WS1(SEQ ID NO：19)和Maqu_2220(SEQ ID NO：2)的集胞藻PCC6803(“5175(WS1)”)、表达牵牛花WS(SEQ ID NO：45)和Maqu_2220(SEQ ID NO：2)的集胞藻PCC6803(“5174(牵牛花WS)”)和不表达异源基因的集胞藻PCC6803(“6803阴性对照”)中的蜡酯和脂肪醇产生的图。
具体实施方式
本发明提供在重组宿主细胞中产生蜡酯的非酰基-CoA依赖性方法，以及用于通过非酰基-CoA依赖性路径产生蜡酯的分离核苷酸分子、载体和重组宿主细胞和系统，以及包括通过本发明方法制备的蜡酯的组合物。
所属领域技术人员将了解，本申请案的揭示内容包括实施例的揭示内容，所述实施例包含为方便起见通过参考特定实施例阐述的两个或更多个特征的组合。申请案内的标题只是为了方便读者，并不以任何方式限制本发明或其实施例的范围。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请案都是以引用方式并入本文中，如同明确且个别地指示以引用方式并入每一个别出版物或专利申请案一般。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员一般所了解相同的含义。
在本说明书和实施例通篇中，词语″包含(comprise)″或诸如″包含(comprises)″或″包含(comprising)″等变化形式将理解为暗示包括所述实体、项目或项目组，但不包括任何其它实体、项目或项目组。
除非上下文明确指示其它情况，否则单数冠词“一(a)”、“一(an)”和“所述”包括复数含义。例如，在提到一细胞时，包括多个细胞。
如本文中在诸如“A和/或B”等词组中使用的术语“和/或”计划包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。
术语“形成醇的酰基-ACP还原酶”是指能将酰基-ACP转化为脂肪醇的蛋白质。“形成醇的酰基-CoA还原酶”是能将酰基-CoA转化为脂肪醇的蛋白质“形成醇的脂肪酰基还原酶”是指可将酰基-ACP或酰基-CoA转化为脂肪醇的酶，且包括能使用酰基-ACP和酰基-CoA二者作为底物来产生脂肪醇的“泛宿主性的形成醇的脂肪酰基还原酶”。
“短链醇”是具有1到5个碳原子的醇。短链醇可为直链或具支链。短链醇的非限制性实例包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丁醇、2-甲基丁醇和3-甲基丁醇。
“脂肪醇”是具有式ROH的伯醇，其中R是脂肪族基团，优选地是烷基。R可包含介于约6个与约24个之间的碳原子。脂肪族链可为饱和、单不饱和或多不饱和链。“一或多种脂肪醇”是指一或多种具有不同链长度和/或饱和模式的脂肪醇，例如C16:1脂肪醇、C18:2脂肪醇和C14脂肪醇是具体脂肪醇。
术语“形成醛的酰基还原酶”或“形成醛的还原酶”是指从酰基底物(例如羧酸(例如，游离脂肪酸)、酰基-ACP或酰基-CoA)产生脂肪醛的酶。“形成醛的酰基-ACP还原酶”是指将酰基-ACP转化为脂肪醛的蛋白质。
“脂肪酸酯”是脂肪酸与醇的酯。源自醇的碳链称为A链，且源自脂肪酸(脂肪酸部分可由酰基硫酯提供)的碳链称作B链。脂肪酸酯可具有任何长度的A侧链，例如长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24或24个以上碳。脂肪酸酯可具有任何长度的B侧链，例如长度为4、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24或24个以上碳。脂肪酸酯中A链和B链的长度可独立地变化。例如，甲醇(C1)与C4或更长酰基链(脂肪酸或酰基-硫酯)的缩合可产生脂肪酸甲基酯(“FAME”)，且乙醇与酰基链的缩合可产生脂肪酸乙基酯(“FAEE”)。脂肪醇(C8或以上)与酰基硫酯(C8或更长)的缩合产生蜡酯。
“蜡酯”是脂肪酸与长链脂肪族醇的酯。蜡酯具有从脂肪醇衍生的至少8个碳的A链和从酰基-硫酯衍生的至少8个碳的B链。蜡酯的A链和B链中的碳数可独立地变化。
“蜡酯合酶”或“蜡合酶”是催化脂肪醇与酰基-硫酯(例如酰基-CoA或酰基-ACP)缩合以产生蜡酯的酶。蜡合酶还可缩合短链醇与酰基硫酯以(例如)产生诸如脂肪酸甲基酯或脂肪酸乙基酯等脂肪酸酯。
术语“酰基-ACP蜡酯合酶”或“酰基-ACP蜡合酶”是指能将酰基链从酰基-ACP底物转移到脂肪醇以形成蜡酯的蛋白质。酰基-ACP蜡酯合酶包括仅使用酰基-ACP作为酰基-硫酯底物的蜡酯合酶和能使用除了酰基-ACP以外的其它酰基-硫酯底物(例如，酰基-CoA)的酰基-ACP蜡酯合酶。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，但“肽”在一些情况下可用于指具有不超过约100个氨基酸或不超过约60个氨基酸的多肽。
术语“功能性片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽，其中剩余氨基酸序列与参考序列中的相应位置具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性，且所述多肽保留全长多肽的活性的约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。功能性片段可包含(例如)全长多肽的90％或更低、80％或更低、70％或更低、60％或更低、50％或更低、40％或更低、30％或更低或20％或更低，且可包括(例如)全长多肽的最高约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
本申请案通过在由国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)维护的早已建立且被广泛参考的数据库中使用的标识符揭示且提到核酸和多肽。登录号是在由美国国立卫生研究院(United States National Institutes ofHealth)维护的国家生物技术信息中心网站(ncbi.nlm.nih.gov)可公开获得的序列记录的唯一标识符。″基因信息(GenInfo)标识符″(GI)序列标识号对核苷酸或氨基酸序列具有特异性。如果序列以任一方式变化，那么指定新GI号。可使用序列修正史(Sequence RevisionHistory)工具来追踪在特定基因库记录中出现的序列的不同GI号、版本号和更新日期。基于登录号和GI号检索并获得核酸或基因序列或蛋白质序列为(例如)细胞生物学、生物化学、分子生物学和分子遗传学技术中所熟知。
相对于氨基酸或核苷酸序列的一致性或同源性百分比在本文中定义为，在比对序列以获得最大一致性百分比并引入间隙以实现最大同源性百分比之后，候选序列中与已知多肽一致的氨基酸或核苷酸残基的百分比。在核苷酸或氨基酸序列水平的同源性或一致性可使用业内已知的方法来测定，包括(但不限于)使用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx采用的算法的BLAST(碱基局部比对检索工具(Basic Local Alignment SearchTool))分析(阿特休尔(Altschul)(1997)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25，3389-3402；和卡尔林(Karlin)(1990)，美国国家科学院院刊87，2264-2268)，其经调整用于序列相似性检索。
“Pfam”是由Pfam协会(Pfam Consortium)维护的蛋白质结构域和蛋白质家族的大型集合，且可在若干受资助的万维网站点获得，包括：pfam.sanger.ac.uk/(惠康基金会(Welcome Trust)，桑格学院(Sanger Institute))；pfam.sbc.su.se/(斯德哥尔摩生物信息中心(Stockholm Bioinformatics Center))；pfam.janelia.org/(珍利亚农场(Janelia Farm)，霍华德休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Institute))；pfam.jouy.inra.fr/(国家农业研究院(Institut national de la Recherche Agronomique))；和pfam.ccbb.re.kr/。Pfam的最新版是基于UniProt蛋白质数据库2020_05版的Pfam26.0(2011年11月，13，672个家族)。Pfam结构域和家族是使用多序列比对和隐马尔可夫模型(hidden Markov model，HMM)来鉴别。基于高质量比对的Pfam-A家族是通过使用蛋白质家族的代表性成员的策划种子比对(curated seed alignment)和基于种子比对的剖面隐马尔可夫模型来生成。(除非另外指明，否则所询问蛋白质与Pfam的匹配是Pfam-A匹配。)然后使用所有经鉴别属于所述家族的序列自动生成所述家族的全比对(松哈默(Sonnhammer)等人(1998)核酸研究(Nucleic Acids Research)26：320-322；贝特曼(Bateman)等人(2000)核酸研究26：263-266；贝特曼等人(2004)核酸研究32，数据库专辑(Database Issue)：D138-D141；费恩(Finn)等人(2006)核酸研究数据库专辑34：D247-251；费恩等人(2010)核酸研究数据库专辑38：D211-222)。通过登录pfam数据库(例如，使用任何上文所提到的网站)，可使用HMMER同源性检索软件(例如，HMMER3，hmmer.janelia.org/)针对HMM询问蛋白质序列。将询问蛋白质鉴别为在pfam家族中(或鉴别为具有具体pfam结构域)的显著匹配是其中比特分数(bit score)大于或等于Pfam结构域的集聚阈值的匹配。还可使用期望值(e值)作为在pfam中包括所询问蛋白质或确定所询问蛋白质是否具有具体pfam结构域的准则，其中低e值(远低于1.0，例如低于0.1或低于或等于0.01)代表因偶然而匹配的概率较低。
多肽的“保守变体”是相对于参考多肽具有一或多个保守氨基酸取代的多肽，其中多肽的活性(例如对转录的效应)、对共调节因子或配体的亲和性或DNA结合亲和性与参考多肽没有显著差异。
术语“保守氨基酸取代”或“保守突变”是指用一个胺基酸置换另一个具有共同性质的氨基酸。定义个别氨基酸之间的共同性质的有用方式是分析同源生物体的相应蛋白质之间的氨基酸变化的标准化频率(舒尔茨(Schulz)(1979)蛋白质结构原理(Principles ofProtein Structure)，施普林格出版社(Springer-Verlag))。根据所述分析，可定义氨基酸组，其中组内的氨基酸优先彼此交换，且因此在其对整体蛋白质结构的影响中彼此最为相似(舒尔茨(1979)蛋白质结构原理，施普林格出版社)。以这种方式定义的氨基酸组的实例可包括：“带电荷/极性组”，包括Glu、Asp、Asn、Gln、Lys、Arg和His；“芳香族或环状组”，包括Pro、Phe、Tyr和Trp；以及“脂肪族组”，包括Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Ser、Thr和Cys。在每一组内，还可鉴别亚组。例如，带电荷/极性氨基酸组可细分为多个亚组，包括：“带正电荷亚组”，包含Lys、Arg和His；“带负电荷亚组”，包含Glu和Asp；以及“极性亚组”，包含Asn和Gln。在另一实例中，芳香族或环状组可细分为多个亚组，包括：“氮环亚组”，包含Pro、His和Trp；和“苯基亚组”，包含Phe和Tyr。在另一实例中，脂肪族基团可细分为多个亚组，包括：“大型脂肪族非极性亚组”，包含Val、Leu和Ile；“脂肪族弱极性亚组”，包含Met、Ser、Thr和Cys；以及“小残基亚组”，包含Gly和Ala。保守突变的实例包括上述亚组内氨基酸的氨基酸取代，例如(但不限于)：Lys取代Arg或反之亦然，从而使得可维持正电荷；Glu取代Asp或反之亦然，从而使得可维持负电荷；Ser取代Thr或反之亦然，从而使得可维持游离-OH；以及Gln取代Asn或反之亦然，从而使得可维持游离-NH2。
术语“基因”在广义上用于指核酸分子(通常是DNA，但任选地是RNA)的编码蛋白质或所表达RNA的任何区段。因此，基因包括编码所表达RNA(其可包括多肽编码序列)的序列。基因可进一步包含其表达所需的调节序列。基因可从多种来源获得，包括从目标来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，且可包括经设计以具有所需参数的序列。
术语“核酸”或“核酸分子”是指(例如)DNA或RNA(例如，mRNA)。核酸分子可为双链或单链；单链RNA或DNA可为编码(有义)链或非编码(反义)链。
可分离或纯化本发明核酸分子。如本文所用“经分离”核酸分子或核苷酸序列是指侧翼没有通常在基因或核苷酸序列侧翼(如在基因组序列中)的核苷酸序列的核酸分子或核苷酸序列，且其因此可为重组核酸分子或序列，和/或已完全或部分从其天然环境(例如细胞、组织)移除。例如，已从细胞移除或纯化的核酸分子被视为经分离。在一些情况下，经分离材料将形成组合物(例如，含有其它物质的粗萃取物)、缓冲系统或试剂混合物的一部分。在一些实施例中，核酸分子可经纯化到接近同质性，例如如通过PAGE或诸如HPLC等柱色谱所测定。分离核酸分子或核苷酸序列可包括使用重组DNA技术或使用任何其它适宜方法化学合成的核酸分子或核苷酸序列。载体中含有的核酸也可包括在如本文所用的“经分离”的定义中。本发明经分离DNA分子的活体内和活体外RNA转录物也涵盖于“经分离”核苷酸序列中。
术语“密码子优化的”是指编码蛋白质的核苷酸序列的密码子向具体生物体中优先使用的密码子变化，从而使得所编码蛋白质在目标生物体中有效表达。在一些实施例中，编码蛋白质的核苷酸序列可经密码子优化以获得宿主生物体中蛋白质的最佳产生。如本发明上下文中所使用，本发明的“密码子优化的”基因或核酸分子不需要使每一密码子都改变以符合计划宿主生物体的密码子优先性，也不需要使“密码子优化的”基因或核酸分子的经改变密码子变为目标生物体使用的最普遍密码子。例如，密码子优化的基因可使一或多个密码子变为比初始密码子更常用的密码子，不管其在生物体中是否最常用于编码具体氨基酸。
术语“表达载体”和“表达构筑物”是指已通过人类干预(包括通过重组方式和/或直接化学合成)生成的核酸分子，其具有一系列允许在宿主细胞中转录和/或翻译具体核酸的指定核酸“表达控制元件”。表达载体可为质粒、质粒的一部分、病毒构筑物、核酸片段或诸如此类或其组合。
如本文所用的“表达盒”是指可操作连接到表达控制元件的编码蛋白质或功能性RNA(例如tRNA、短发夹RNA、一或多种微小RNA、核糖体RNA等)的核苷酸序列，所述表达控制元件是(例如)启动子和任选地其它影响基因转录或翻译的核酸序列的任一者或组合，例如(但不限于)转录终止子、核糖体结合位点、剪接位点或剪接识别序列、内含子、增强子、多聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点等。“可操作连锁”或“可操作连接”是指两个核酸序列(例如控制序列(例如启动子)与所连接序列(例如编码蛋白质和/或功能性RNA的序列)之间的功能性连锁。如果启动子可介导基因的转录，那么启动子与核酸序列可操作连锁。源自宿主微生物基因组的核酸序列可与宿主微生物的外源核酸序列可操作连接，其中源自基因组的序列可促进同源重组，从而导致将外源核酸序列插入宿主微生物的基因组中。例如，本发明核酸分子可包括宿主微生物的编码目标蛋白质的外源核酸序列，其中将外源核酸序列可操作连接到源自宿主微生物的容许将外源核酸序列重组到宿主基因组中的序列(例如，以序列为侧翼)。
如本文所用的术语“操纵子”是指在单一调节信号或启动子控制下的一个以上基因的单元。所述基因可转录为(例如)单一mRNA分子。
用于核苷酸序列杂交的“严格性条件”是指培育和洗涤条件，例如温度和缓冲液浓度条件，其允许具体核酸与第二核酸杂交；第一核酸可与第二核酸完全(即，100％)互补，或第一与第二核酸可共享一定程度的小于完全互补的互补性，例如60％、75％、85％、95％或更高。例如，可使用某些区别完全互补核酸与较低互补性核酸的高严格性条件。
在最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology)(2011)约翰威利父子公司(John Wiley&Sons))中解释用于核酸杂交的“高严格性条件”、“中严格性条件”和“低严格性条件”。决定杂交严格性的确切条件不仅取决于洗涤缓冲液的离子强度(例如0.2×SSC、0.1×SSC等)、温度(例如，23℃、42℃、68℃等)和诸如甲酰胺等去稳定剂或诸如SDS等变性剂的浓度，还取决于诸如以下等因素：核酸序列的长度、碱基组成、杂交序列之间的错配百分比和所述序列亚组在其它非一致性序列内出现的频率。因此，高、中或低严格性条件可凭经验来确定。
通过将杂交条件从不发生杂交的严格性水平变为首次观察到杂交的水平，可确定将容许给定序列与样品中的最相似序列杂交的条件。
实例性杂交条件阐述于克劳斯(Krause)(1991)酶学方法(Methods in Enzymology)，200，546-556中。洗涤是其中条件通常经设定以确定杂合体的最低互补性水平的步骤。一般来说，在保持SSC浓度不变的同时，从仅发生同源杂交的最低温度开始，最终洗涤温度每降低一度(℃)，即容许杂交序列之间的最高错配程度增加1％。一般来说，SSC的浓度加倍会使Tm升高。使用这些导则，可依据所寻求的错配水平凭经验确定用于高、中或低严格性的洗涤温度。实例性高严格性条件包括(但不限于)在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中在37℃下杂交，和在0.1×SSC中在60℃下洗涤。严格性逐渐升高的条件的实例包括在杂交后用0.2×SSC和0.1％SDS在约室温下洗涤(低严格性条件)；用0.2×SSC和0.1％SDS在约42℃下洗涤(中严格性条件)；和用0.1×SSC在约68℃下洗涤(高严格性条件)。洗涤可仅使用这些条件中的一种(例如高严格性条件)来实施，洗涤可涵盖两种或更多种严格性条件以提高严格性。最佳条件将依据所涉及的具体杂交反应而变化，且可凭经验确定。
可通过以下方式来确定等效条件：改变如业内已知作为实例给定的一或多种参数，同时维持靶核酸分子与所用引物或探针之间的类似程度的一致性或相似性。例如，可杂交核苷酸序列可用作探针和引物以鉴别包含本发明核酸的生物体和/或分离本发明核酸。
“经纯化”核酸分子或核苷酸序列或蛋白质或多肽序列实质上不含细胞材料和细胞组份。经纯化核酸分子或蛋白质可不含(例如)除了缓冲液或溶剂以外的化学品。“实质上不含”并不计划意指除了新颖核酸分子以外的其它组份是不可检测的。
“重组”或“改造”核酸分子是已通过人类处理改变的核酸分子。作为非限制性实例，重组核酸分子是如下核酸分子，其：1)已在活体外使用(例如)核酸分子的化学或酶促技术合成或修饰(例如，通过使用化学核酸合成，或通过使用用于以下目的的酶：复制、聚合、消化(核酸外切或核酸内切)、连接、反转录、转录、碱基修饰(例如，包括甲基化)或重组(包括同源重组和位点特异性重组))；2)包括在自然界中不连结的连结核苷酸序列，3)已使用分子克隆技术进行改造以使得其相对于天然核酸分子序列缺少一或多个核苷酸，和/或4)已使用分子克隆技术进行处理以使得其相对于天然核酸序列具有一或多个序列变化或重排。作为非限制性实例，cDNA是重组DNA分子，如同是已通过活体外聚合酶反应生成的，或已附接有连接体的，或已整合到载体(例如克隆载体或表达载体)中的任何核酸分子。
在用于生物体时，术语重组、改造或遗传改造是指已通过将异源或重组核酸序列引入生物体中来处理的生物体，且包括基因敲除(knockout)、靶向突变和基因置换、启动子置换、缺失或插入，以及将转基因引入生物体中。可将异源或重组核酸分子整合到重组/遗传改造生物体的基因组中，或在其它情况下不将其整合到重组/遗传改造生物体的基因组中。
如本文所用术语“重组蛋白质”是指通过遗传改造产生的蛋白质。
术语“天然的”和“野生型”是指在自然界中发现的形式。例如，天然或野生型核酸分子、核苷酸序列或蛋白质可存在于天然来源中并从所述天然来源分离，且没有通过人类处理有意修饰。
如本文所用“减弱的”意指数量、程度、强度(intensity)或强度(strength)降低。减弱的基因表达可是指显著降低的所述基因的数量和/或转录比率，或所编码蛋白质的翻译、折叠或组装。减弱的基因可为使所编码蛋白质的产生不可检测的经破坏或缺失基因。
“外源核酸分子”或“外源基因”是指已被引入(“经转型”)到细胞中的核酸分子或基因。经转型细胞可被称作重组细胞，可向其中引入其它外源基因。如果经核酸分子转型的细胞的后代已继承所述外源核酸分子，那么其也被称作“经转型”。相对于所转型细胞，外源基因可来自不同物种(且因此为“异源”)或来自相同物种(且因此为“同源”)。“内源”核酸分子、基因或蛋白质因为其存在于宿主中或由所述宿主天然产生而是天然核酸分子、基因或蛋白质。
术语“异源”在这个方面中在广义上用于指引入宿主细胞中的核酸分子或蛋白质，其中所述核酸分子或蛋白质源自不同株系/生物体。异源基因可在经转型宿主中具有等效性，即通常执行相同或类似功能的基因，或外源异源基因可编码在宿主株系/生物体中不具有内源同系物的蛋白质。在提到基因调节序列或用于维持或处理基因序列的辅助核酸序列(例如5’非翻译区、3’非翻译区、多聚腺苷酸添加序列、内含子序列、剪接位点、核糖体结合位点、内部核糖体进入序列、基因组同源性区域、重组位点等)时，“异源”意指调节序列或辅助序列与在构筑物、基因组、染色体或附加体中与调节或辅助核酸序列并置的基因来自不同来源。因此，即使启动子可源自与其所连接基因相同的物种(或在一些情形中源自相同生物体)，可操作连接到在其天然状态中(即在未遗传改造的生物体的基因组中)未可操作连接的基因的启动子在本文中称作“异源启动子”。
术语“天然”在本文中用于指在宿主中天然存在的核酸序列或氨基酸序列。术语“非天然”在本文中用于指在宿主中并非天然存在的核酸序列或氨基酸序列。已从宿主细胞移除的、经受实验室处理的或引入或再引入宿主细胞的核酸序列或氨基酸序列被视为“非天然”。引入宿主细胞的合成或部分合成基因是“非天然”。非天然基因进一步包括宿主微生物的可操作连接到一或多个已重组到宿主基因组中的异源调节序列的内源基因。
术语“蜡酯组合物”是指包含至少一种蜡酯分子的组合物。蜡酯包括(例如)仅包含蜡酯分子的组合物(即，不含除了蜡酯分子以外的脂肪酸衍生物的组合物)以及包含蜡酯和至少一种其它类型的选自(例如)醇、醛、烯烃、炔烃和烷烃的脂肪酸衍生物的组合物。蜡酯可仅包含一种类型的蜡酯分子或一种以上类型的蜡酯分子。
术语“脂肪醇组合物”是指包含至少一种脂肪醇分子的组合物。脂肪醇组合物包括(例如)仅包含脂肪醇分子的组合物(即，不含除了脂肪醇分子以外的脂肪酸衍生物的组合物)以及包含脂肪醇和至少一种其它类型的选自(例如)醛、酯、烯烃、炔烃和烷烃的脂肪酸衍生物的组合物。脂肪醇组合物可仅包含一种类型的脂肪醇分子或一种以上类型的脂肪醇分子。
如本文所用术语“释放”和“分泌”可互换使用，其是指跨过细胞膜转运物质的主动和/或被动机制。所述转运机制的实例包括(但不限于)被动扩散、梯度扩散、促进扩散、主动转运和其组合。
术语“重组”、“改造”或“遗传改造”在用于宿主细胞时是指已通过将非天然(例如，异源或重组)核酸序列引入宿主细胞中或从宿主细胞缺失天然核酸序列来处理的细胞，且包括(例如)基因敲除；靶向突变和基因置换；启动子置换、缺失或插入；以及将转基因引入宿主细胞中。在一些实施例中，将所引入的非天然核酸分子整合到重组/遗传改造宿主的基因组中。在其它实施例中，不将所引入的非天然核酸分子整合到重组/遗传改造宿主的基因组中。
如本发明上下文中所用术语“转型”、“转染”、“接合”和“转导”计划包含多种所属领域技术人员已知用于将外来核酸(例如，外源DNA)引入宿主细胞中的方法，包括磷酸钙和/或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、自然感受态、化学介导的转移、电穿孔、粒子轰击或诸如此类或其组合。转染可为瞬时或稳定转染(例如，基因组整合)。用于宿主细胞的转型和/或转染的适宜方法的实例可参见(例如)分子克隆-实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(2010)，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)。
术语“培养”是指通过使用所选条件和/或受控条件有意养育一或多种细胞的生长(例如细胞大小、细胞内容物和/或诸如生物分子的产生等细胞活性的增加)和/或繁殖(例如细胞数通过有丝分裂增加)。生长与繁殖二者的组合可称为增殖。所选条件和/或受控条件的非限制性实例可包括使用限定培养基(具有诸如pH、离子强度和/或碳源等已知特征)、指定温度、氧张力、二氧化碳水平、在生物反应器中生长或诸如此类或其组合。
术语“生物反应器”是指其中任选地在悬浮液中，且在悬浮时优选地在水性液体中培养细胞(例如，微藻细胞)的外壳或部分外壳。生物反应器可用于培养细胞经过其生理周期的各个阶段。
代谢路径
脂肪酸生物合成路径在原核生物和真核藻类和高等植物的叶绿体中高度保守。图9绘示细菌中从中心代谢物乙酰基-CoA开始的脂肪酸生物合成路径。脂肪酸生物合成是通过由乙酰基-CoA羧化酶(ACC酶)催化将乙酰基-CoA转化为丙二酰基-CoA来起始。然后由丙二酰基-CoA-ACP转酰酶(FabD)催化将丙二酰基-CoA转化为丙二酰基-ACP。最后，由酶复合体脂肪酸合酶(FAS)催化将丙二酰基-ACP转化为酰基-ACP。脂肪酸合酶复合体通过首先由β-酮酰基-ACP合酶III(例如，FabH)催化缩合丙二酰基-ACP与乙酰基-ACP来起始延伸循环。通过3-酮酰基-ACP还原酶(例如FabG)将通过FabH反应形成的β-酮酰基-ACP(3-酮酰基-ACP)还原为β-羟酰基-ACP(3-羟酰基-ACP)。然后β-羟酰基-ACP脱水酶(例如FabA、FabZ)作用于β-羟酰基-ACP以形成反式-2-烯酰基-ACP，其又通过烯酰基-ACP还原酶(例如Fab I、Fab K、FabL)还原以形成延伸2个碳的酰基-ACP产物。后续循环是通过β-酮酰基-ACP合酶I或II(例如，FabB或FabF)催化的丙二酰基-ACP与酰基-ACP的缩合来起始。重复缩合、还原、脱水和还原的循环，每一循环从丙二酰基-ACP添加两个碳，直到将酰基链通过硫酯酶(例如叶绿体中的FatA或FatB)从ACP裂解以形成游离脂肪酸或通过转酰酶转移到另一分子(例如甘油3-磷酸)为止。
与植物叶绿体不同，蓝细菌不产生游离脂肪酸，且与大肠杆菌(E.coli)和其它异养细菌不同，蓝细菌不产生酰基-CoA。在用共价结合到酰基载体蛋白的酰基链延伸脂肪酸后，酰基转移酶可将酰基链转移到甘油主链以产生膜脂质。
为在蓝细菌中产生诸如蜡酯等脂肪酸衍生物，通常认为需要引入若干种编码用于产生酰基-CoA和将酰基-CoA转化为所需终产物(例如，醇、醛、烷烃、烯烃、脂肪酸酯或蜡酯)的酶的外源基因。如图9中所示，可引入编码硫酯酶(例如，酰基-ACP硫酯酶，3.1.2.20)的基因以水解酰基-ACP硫酯，由此释放游离脂肪酸。可引入酰基-CoA合成酶(例如，6.2.1.3)基因以将游离脂肪酸转化为酰基-CoA。
如果脂肪醛和/或烷烃是所需终产物那么可引入编码形成醛的脂肪醛还原酶(例如，形成醛的酰基-CoA还原酶，1.2.1.42或1.2.1.50；还参见美国专利第6,143,538号)的基因以将酰基-CoA还原为脂肪醛；另外或或者，可引入羧酸还原酶基因(例如，参见WO2010/135624和WO2010/042664)以将游离脂肪酸还原为脂肪醛。此外，可引入一或多种编码脂肪醇氧化酶(例如，1.1.3.20)或脂肪醇脱氢酶(例如，1.1.1.164)的基因以将脂肪醇转化为脂肪醛。可通过引入编码脂肪醛脱羰基酶(例如，4.1.99.5)的基因将脂肪醛进一步处理为烷烃。
如果脂肪醇、烯烃和/或蜡酯是所需终产物那么可引入编码形成醇的脂肪酰基还原酶(例如，形成醇的酰基-CoA还原酶，1.2.1.50)的基因。此外，可引入脂肪醛还原酶基因以将脂肪醛还原为脂肪醇。可通过引入编码脂肪醇脱水酶的基因和/或通过催化脱水将脂肪醇进一步处理为烯烃。蜡酯可通过引入编码蜡酯合酶的基因以催化脂肪醇与脂肪酰基硫酯的缩合来形成(图9)。
如本文所展示，某些酶能将酰基-ACP直接转化为脂肪酸衍生物。例如，如2011年9月27日申请的标题为“形成脂肪醇的酰基-ACP还原酶”的共同受让的美国专利申请案61/539,640中所揭示，某些酰基-ACP还原酶(例如Maqu_2220酰基-ACP还原酶和Hch_05075酰基-ACP还原酶)可将酰基-ACP直接转化为脂肪醇。所述酶在本文中称作“形成醇的酰基-ACP还原酶”。此外，如本发明所体现，现已发现某些蜡酯合酶(例如除烃海杆菌的WS1和WS2)能缩合酰基-ACP与脂肪醇以产生蜡酯。本发明由此提供在仅需要以下两种外源酶的无酰基-CoA路径中产生蜡酯的新方法：形成醇的酰基-ACP还原酶和酰基-ACP蜡酯合酶。
在一些实施例中，酰基-ACP转化为脂肪醇可通过脂肪醛的合成来进行，其中在宿主细胞中表达的形成脂肪醛的还原酶(例如，形成醛的酰基-ACP还原酶)首先将酰基-ACP还原为脂肪醛。例如，在某些实施例中，宿主细胞可经改造以过表达内源形成脂肪醛的酰基-ACP还原酶(例如，通过在酰基还原酶基因附近插入启动子和/或增强子转录控制元件)。在其它实施例中，宿主细胞可经改造以表达外源形成脂肪醛的酰基还原酶。
蜡酯合酶
已发现多种鉴别或表征为酰基转移酶的多肽具有蜡酯合酶活性且在本文中称作蜡合酶或蜡酯合酶，所述多肽包括脂肪酰基转移酶、醇酰基转移酶(AAT，EC2.3.1.84)、醇合酶/酰基-CoA：二酰基甘油酰基转移酶、二酰基甘油O-酰基转移酶或二酰基甘油酰基转移酶(DGAT，EC2.3.1.20)、O-酰基转移酶(例如，长链醇O-脂肪酰基转酰酶(EC2.3.1.75)或酰基-CoA：醇酰基转移酶、膜结合的O-酰基转移酶(MBOAT))、酰基-CoA蜡醇酰基转移酶和双功能蜡酯合酶/酰基-CoA酰基转移酶。酰基-ACP蜡酯合酶可使用酰基-ACP作为酰基供体通过催化酰基-ACP与醇(例如脂肪醇)的反应产生脂肪酸酯(例如蜡酯)。
可使用(例如)业内或本文所揭示的方法来测试蜡酯合酶使用酰基-ACP作为底物的能力。在一些实例中，可利用酰基-ACP底物的蜡酯合酶可被鉴别为具有“蜡酯合酶样酰基-CoA酰基转移酶”Pfam结构域PF03007，其中与所述结构域的匹配的比特分数高于20.6的集聚截止值；且任选地还可具有“未知功能DUF1298蛋白质”Pfam结构域PF06974，其中匹配的比特分数为至少20.7(PF06974的集聚截止值)。利用酰基-ACP的蜡酯合酶还可基于与除烃海杆菌中WS1(SEQ ID NO：19)或WS2(SEQ ID NO：21)的至少(例如)30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列一致性来鉴别。例如，宿主细胞(例如转基因微生物)可包括编码与WS1(SEQ IDNO：19)具有至少85％一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列。在一些实例中，宿主细胞可包括编码与WS1(SEQ ID NO：19)具有至少90％或至少95％一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列。例如，宿主细胞可包括编码SEQ ID NO：19的酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列。或者，宿主细胞(例如转基因微生物)可包括编码与WS2(SEQ ID NO：21)具有至少85％一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列。例如，宿主细胞可包括编码与WS2(SEQ ID NO：21)具有至少90％或至少95％一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列。例如，宿主细胞可包括编码SEQ ID NO：21的酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列。
具有较低一致性程度但具有相当的生物活性(即，与本文所述酰基-ACP蜡酯合酶蛋白质的生物活性相当)的氨基酸序列被认为等效。展示并测量酰基-ACP蜡酯合酶的活性的方法可使用已知分析(例如，US6,492,509；US7,118,896；US7,897,369)，其中可用酰基-ACP取代酰基-CoA底物；或可为检测表达假定酰基-ACP蜡合酶的细胞或细胞裂解物产生的蜡酯的分析，其中所述细胞不产生和/或未提供有酰基-CoA底物(例如，使用(例如)气相色谱-质谱、液相色谱-质谱、薄层色谱等测量蜡酯产生的速率/水平)。
编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列可与SEQ ID NO：18或与SEQ ID NO：18中编码蜡酯合酶的功能性片段的部分具有至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。例如，编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列可与SEQ ID NO：18具有至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％序列一致性。或者，编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列可与SEQ ID NO：20或与SEQ ID NO：20中编码蜡酯合酶的功能性片段的部分具有至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。例如，编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列可与SEQ ID NO：20具有至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％序列一致性。
在一些实施例中，非天然核酸序列编码来自海洋细菌(即，海洋环境中天然存在的细菌)的编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列。在某些实施例中，海洋细菌是海杆菌属物种，例如栖藻海杆菌、碱性海杆菌(M.alkaliphilus)、水油海杆菌、粘附海杆菌、北极海杆菌(M.arcticus)、苔藓虫海杆菌(M.bryozoorum)、济州岛海杆菌(M.daepoensis)、异常海杆菌(M.excellens)、黄海海杆菌(M.flavimaris)、胍多尼斯海杆菌(M.guadonensis)、除烃海杆菌、韩国海杆菌(M.koreenis)、解脂海杆菌(M.lipolyticus)、岸海杆菌(M.litoralis)、绿岛海杆菌(M.lutaoensis)、近海生海杆菌(M.maritimus)、沉积物海杆菌(M.sediminum)、海杆菌ELB17、斯阔伦海杆菌(M.squalenivirans)、强酒海杆菌(M.vinifirmus)等。在其它实施例中，酰基-ACP蜡酯合酶源自海洋细菌，例如以下物种：不动杆菌属、食烷菌(例如，泊库岛食烷菌(A.borkumensis)或食烷菌DG881)、γ-变形菌(gammaproteobacteria)(例如，UPF0089)、济州何氏菌(例如，3839139)或湖沉积杆菌(例如，湖沉积杆菌MED105AT)。
在一些实施例中，非天然核酸序列编码与选自以下的假定蜡酯合酶具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶：
表1.微生物蜡酯合酶基因
例如，非天然基因可编码与SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43具有至少85％、至少90％或至少95％氨基酸序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶。例如，宿主细胞(例如转基因微生物)可包括编码SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的非天然核酸序列。
在一些实施例中，具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的蛋白质可另外具有其它蜡酯合酶活性，例如酰基-CoA蜡酯合酶活性。可评价酰基-ACP蜡合酶活性的具有蜡酯合酶活性的蛋白质可包括(但不限于)不动杆菌M-1蜡酯合酶、乙酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)WS/DGAT、贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADP1蜡酯合酶、荷荷巴蜡酯合酶、小眼虫(Euglena gracilis)蜡酯合酶、微球菌属(Micrococcus)蜡酯合酶、红球菌属蜡酯合酶、分枝杆菌属蜡酯合酶、阿拉伯芥(Arabidiopsis thaliana)WSD1蜡酯合酶、阿拉伯芥GPAT酰基转移酶、调料九里香(Murraya koenigii)蜡酯合酶、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)蜡酯合酶、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)蜡酯合酶、昆虫和哺乳动物蜡酯合酶等。
酰基-ACP还原酶
酰基-ACP还原酶可直接使用酰基-ACP作为产生脂肪醇的底物(参见2011年9月27日申请的标题为“形成脂肪醇的酰基-ACP还原酶”的共同受让的美国专利申请案61/539,640)。在一些实施例中，可用于本发明方法中的形成醇的酰基-ACP还原酶是基于与Maqu_2220(SEQ ID NO：2)、Hch_05075(SEQ ID NO：4)、MDG893_11561(SEQ IDNO：6)、HP15_810(SEQ ID NO：8)或RED65_09894(SEQ ID NO：10)的至少(例如)40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性来鉴别。例如，重组宿主细胞可包括编码与Maqu_2220(SEQ ID NO：2)具有至少85％或至少90％氨基酸序列一致性(例如与Maqu_2220(SEQ ID NO：2)具有至少95％氨基酸序列一致性)的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列。例如，重组宿主细胞可包括编码Maqu_2220(SEQID NO：2)的非天然核酸序列。或者，重组宿主细胞可包括编码与Hch_05075(SEQ ID NO：4)具有至少85％或至少90％氨基酸序列一致性(例如与Hch_05075(SEQ ID NO：4)具有至少95％氨基酸序列一致性)的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列。例如，重组宿主细胞可包括编码Hch_05075(SEQ ID NO：4)的非天然核酸序列。在其它替代实施例中，重组宿主细胞可包括编码与MDG893_11561(SEQ ID NO：6)、HP15_810(SEQ ID NO：8)或RED65_09894(SEQ ID NO：10)具有至少85％或至少90％氨基酸序列一致性(例如与MDG893_11561(SEQ ID NO：6)、HP15_810(SEQ ID NO：8)或RED65_09894(SEQ ID NO：10)具有至少95％氨基酸序列一致性)的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列。例如，重组宿主细胞可包括编码MDG893_11561(SEQ ID NO：6)、HP15_810(SEQ ID NO：8)或RED65_09894(SEQ ID NO：10)的非天然核酸序列。
具有较低一致性程度但具有相当的生物活性(即，与本文所述的形成醇的酰基-ACP还原酶蛋白质的生物活性相当)的氨基酸序列被认为等效。展示并测量形成醇的酰基-ACP还原酶的活性的方法可使用已知分析(例如，US5,403,918；US5,723,747；US6,143,538)，其中可用酰基-ACP取代酰基-CoA底物；或可检测表达假定形成醇的酰基-ACP还原酶的细胞或细胞裂解物产生的脂肪醇，其中所述细胞不产生和/或未提供有酰基-CoA底物(例如，测量脂肪醇产生的速率/水平使用(例如)气相色谱-质谱、液相色谱-质谱、离子色谱-质谱、脉冲电流检测、UV/VIS光谱法等；监测底物还原速率的分光光度法分析；等)。
在一些实施例中，形成醇的酰基-ACP还原酶是由包含与来自水油海杆菌(例如，SEQID NO：2)、济州何氏菌(例如，SEQ ID NO：4)、栖藻海杆菌(例如，SEQ ID NO：6)粘附海杆菌(例如，SEQ ID NO：8)或海洋杆菌属(例如，SEQ ID NO：10)的相应的编码形成醇的还原酶的核酸序列具有至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的序列的核酸分子编码。
在一些实施例中，核酸序列编码与来自海洋细菌(即，在海洋环境中天然存在的细菌)相应的形成醇的酰基-ACP还原酶具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的形成醇的酰基-ACP还原酶。在某些实施例中，海洋细菌是海杆菌属物种，例如栖藻海杆菌、碱性海杆菌、水油海杆菌、粘附海杆菌、北极海杆菌、苔藓虫海杆菌、济州岛海杆菌、异常海杆菌、黄海海杆菌、胍多尼斯海杆菌、除烃海杆菌、韩国海杆菌、解脂海杆菌、岸海杆菌、绿岛海杆菌、近海生海杆菌、沉积物海杆菌、海杆菌ELB17、斯阔伦海杆菌、强酒海杆菌等。在某些实施例中，海洋细菌是诸如以下等物种：凯撒麦氏菌(Meptuniibacter caesariensis)株系MED92、雷恩氏菌(Reinekea)株系MED297、海单胞菌属(Marinomonas)株系MED121、海杆菌属株系ELB17或未命名变形菌纲株系HTCC2207。在某些实施例中，海洋细菌为海洋螺菌目(Oceanospirillilales)，例如海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)，例如海洋杆菌属，例如海洋杆菌属株系RED65、克氏海洋螺菌(Oceanobacter kriegii)或海洋杆菌属株系WH099。
在一些实施例中，编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列与来自诸如以下等生物体的相应的形成醇的酰基-ACP还原酶具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性：酿酒葡萄(Vitis vinifera)(基因库登录号CAO22305.1或CAO67776.1)、裂解烯烃脱硫杆菌(Desulfatibacillum alkenivorans)(基因库登录号NZ_ABII01000018.1)、橙色标桩菌(Stigmatella aurantiaca)(NZ_AAMD01000005.1)、栎树猝死病菌(Phytophthora ramorum)(基因库登录号：AAQXOlOO1 105.1)、西蒙得木(Simmondsia chinensis)(荷荷巴)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)等。
在一些实施例中，编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列与FARJVIac(来自海洋放线细菌株系PHSC20C1)、FARJVC(JCVI_ORF_1096697648832，基因库登录号EDD40059.1；来自海洋宏基因组)、FAR_Fer(JCVI_SCAF_1101670217388；来自在费尔南迪纳岛(加拉帕戈斯群岛，厄瓜多尔)区域的上升流中在12m深度发现的海洋细菌)、FAR Key(JCVI_SCAF_1097205236585，来自在迈阿密西礁岛(佛罗里达)近岸1.7m米深度发现的海洋细菌)和FAR_Gal(JCVI_SCAF_1101670289386，位于伊莎贝拉岛(加拉帕戈斯群岛，厄瓜多尔)的0.1m深度)具有至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性。
在一些实施例中，发现已知或怀疑具有FAR活性、例如形成醇的酰基-CoA还原酶活性的蛋白质另外或或者具有形成醇的酰基-ACP还原酶活性。已知或怀疑具有FAR活性的蛋白质包括(但不限于)Maqu_2220(SEQ ID NO：2)、Hch_05075(SEQ ID NO：4)、MDG893_11561(SEQ ID NO：6)、HP15_810(SEQ ID NO：8)或RED65_09894(SEQ ID NO：10)，且可进一步包括(例如)来自家蚕(Bombyx mmori)的bfar、来自西蒙得木的jjfar、来自小麦(Titicum aestivum)的酰基-CoA还原酶、来自小家鼠(Mus musculus)的mfarl、来自小家鼠的mfar2、来自智人(H.sapiens)的hfar、来自款冬玉米螟(Ostrinia scapulalis)的FARXIII、来自玉米(Z.mays)的MS2或来自阿拉伯芥的MS2、FAR43FAR6、CER4等。
上述蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶以及其编码核酸可用于本文所述产生蜡酯的任一方法中。
产生蜡酯的方法
本发明提供在重组宿主细胞(例如本文所述任一种重组宿主细胞)中产生脂肪酸酯的非酰基-CoA依赖性方法。例如，用于本文所提供方法中的重组宿主细胞包含编码在宿主细胞中表达后能以非酰基-CoA依赖性路径产生蜡酯的蜡酯合酶(例如，酰基-ACP蜡酯合酶)的非天然核酸序列。另外，重组宿主细胞可包含编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列。例如，重组宿主细胞可包含本文所述分离核酸分子和/或载体中的任一者。所述方法可包含以下步骤：在适宜培养基中培养包含编码酰基-ACP蜡合酶的非天然核酸分子的重组宿主细胞；和容许所述非天然核酸序列的表达，其中所述表达导致产生脂肪酸酯或蜡酯。
在这些方法中，培养基可任选地包括醇，例如一或多种具有一到五个碳的短链醇，例如以下醇中的一或多者：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丁醇、2-甲基丁醇或3-甲基丁醇，或一或多种脂肪醇，例如一或多种链长度为6到24个碳的脂肪醇。或者，培养基不包括醇，且重组宿主细胞(其可为(例如)重组微生物)可产生短链醇，例如C2、C3、C4、C5醇，例如乙醇、丙醇、丁醇、异丁醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇或戊醇。蜡合酶可催化重组微生物产生的短链醇与所述微生物产生的酰基-ACP的缩合。
在其它实例中，所述方法包含以下步骤：在适宜培养基中培养重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含在宿主细胞中表达后产生酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列和在宿主细胞中表达后产生形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列，以及容许所述核酸序列的表达，其中所述表达导致产生蜡酯。
这些方法中的适宜培养基可为不包括可由酰基-ACP蜡酯合酶用作底物的醇、例如不包括短链醇或脂肪醇的培养基，且重组宿主细胞可产生蜡酯的A链与B链二者。
在用于产生蜡酯的方法中，重组微生物产生的形成醇的酰基-ACP还原酶和酰基-ACP蜡酯合酶能使用酰基-ACP代替酰基-CoA作为底物或除了酰基-CoA以外使用酰基-ACP作为底物。用于所述方法中的重组宿主细胞可为不包括编码酰基-CoA合成酶的外源基因的宿主细胞。另外，用于所述方法中的重组宿主细胞可具有减弱表达的内源酰基-CoA基因。
例如，酰基-CoA合成酶基因的产生可通过以下中的一者或任一组合来减弱或消除：通过同源重组使用基因靶向敲除构筑物、反义构筑物、RNAi构筑物、shRNA进行基因破坏，或微小RNA的表达。在一些实施例中，宿主细胞可具有减弱或突变的酰基-CoA合成酶基因，从而使得所述酶无活性或活性较低，实质上不被产生，或不被产生。
重组宿主细胞可为不产生酰基-CoA合成酶的细胞。在一些实例中，重组宿主细胞不产生酰基-CoA。例如，重组宿主细胞可为内源性产生酰基-CoA但经改造以消除酰基-CoA产生(例如通过使用同源重组进行基因置换或破坏)的宿主细胞。或者，重组宿主细胞可缺少内源酰基-CoA合成酶基因。例如，重组宿主可为蓝细菌，因为蓝细菌缺少酰基-CoA合成酶基因(卡兹马兹克和富尔达(2010)植物生理学152：1598-1610)且不产生酰基-CoA。
除了上述任一实例以外，重组宿主细胞可为不包括编码酰基-ACP硫酯酶的外源基因或编码酰基-CoA硫酯酶的外源基因的细胞。例如，重组宿主细胞可缺少外源酰基-ACP硫酯酶基因和外源酰基-CoA硫酯酶基因二者。另外，宿主细胞可为不包括编码酰基-ACP硫酯酶的内源基因或编码酰基-CoA硫酯酶的内源基因的细胞，且在具体实施例中，宿主微生物可缺少内源酰基-ACP硫酯酶基因和内源酰基-CoA硫酯酶基因二者；例如，宿主微生物可为蓝细菌。在替代实施例中，宿主细胞可具有减弱的酰基-ACP硫酯酶基因和/或减弱酰基-CoA硫酯酶基因，从而使得所述酶中的一者或二者以降低水平产生，实质上不被产生，或不被产生。
一些实例中的重组宿主细胞可为不表达(例如)酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA硫酯酶和酰基-CoA合成酶的重组宿主细胞。例如，重组宿主细胞可缺少编码酰基-ACP硫酯酶的外源核酸序列、编码酰基-CoA硫酯酶的外源核酸序列和编码酰基-CoA合成酶的外源核酸序列。另外，重组宿主细胞可为不包括酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA硫酯酶或酰基-CoA合成酶中的任一者的内源基因的宿主微生物。例如，重组宿主细胞可为天然缺少酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA硫酯酶或酰基-CoA合成酶的基因的蓝细菌。
如本文所述，本发明方法中所用的重组宿主细胞可包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的任一核酸序列和编码形成醇的酰基-ACP还原酶的任一核酸序列。
例如，重组宿主细胞表达的酰基-ACP蜡酯合酶可包含与SEQ ID NO：19或21的多肽或与所述多肽的功能性片段具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列或基本上由其组成。在一些实例中，本发明方法中所用的重组宿主细胞可包含编码与SEQ ID NO：19具有至少85％或至少90％一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列。或者，本发明方法中所用的重组宿主细胞可包含编码与SEQ ID NO：21具有至少85％或至少90％一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列。例如，所述方法中使用的重组微生物可包括编码SEQ ID NO：18或SEQID NO：20的非天然核酸序列。或者或另外，所述方法中使用的重组微生物可包括编码与SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20或与所述核苷酸序列中编码形成醇的酰基-ACP还原酶的功能性片段的片段具有至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列。例如，重组微生物可包括编码与SEQ ID NO：18具有至少约85％或90％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列。例如，重组微生物可包括编码与SEQ ID NO：20具有至少约85％或90％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列。在某些实施例中，核酸序列包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20的核苷酸序列。
或者，产生蜡酯的宿主株系可包括编码源自水油海杆菌(例如，SEQ ID NO：23；SEQID NO：37)、粘附海杆菌(例如，SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：39)、栖藻海杆菌(例如，SEQ ID NO：41)、海杆菌ELB17(例如，SEQ ID NO：43)、泊库岛食烷菌(例如，SEQ ID NO：27)、γ-变形菌UPF0089(例如，SEQ ID NO：29)、济州何氏菌(例如，SEQ ID NO：31)、食烷菌DG881(例如，SEQ ID NO：33)或湖沉积杆菌MED105(例如，SEQ ID NO：35)的酰基-ACP蜡酯或编码与这些蜡合酶中的任一者具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的酰基-ACP蜡酯合酶的非天然基因。例如，用于产生蜡酯的方法中的宿主株系可包括编码与这些蜡合酶中的任一者具有至少约85％、至少约90％或至少约95％一致性的酰基-ACP蜡酯的非天然基因。
另外，宿主细胞表达的形成醇的酰基-ACP还原酶可包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的多肽或与所述多肽的功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列或基本上由其组成。例如，宿主细胞表达的形成醇的酰基-ACP还原酶可包含与SEQ ID NO：2的多肽具有至少约85％或约90％序列一致性的氨基酸序列或基本上由其组成。或者，宿主细胞表达的形成醇的酰基-ACP还原酶可包含与SEQ ID NO：4的多肽具有至少约85％或约90％序列一致性的氨基酸序列或基本上由其组成。例如，形成醇的酰基-ACP还原酶包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12的氨基酸序列。形成醇的酰基-ACP还原酶可由包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的核苷酸序列或与所述核苷酸序列中编码形成醇的酰基-ACP还原酶的功能性片段的片段具有至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的核酸序列的分离核酸分子编码。例如，核酸序列包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的核苷酸序列。
另外，如果宿主株系包括编码酰基-ACP蜡合酶的非天然基因和编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然基因，那么可将所述核酸序列中的一者或二者整合到重组宿主细胞的染色体中，且可任选地将其可操作连接到启动子和/或增强子(例如，内源启动子和/或增强子，或异源启动子和/或增强子)，所述启动子和/或增强子在一些实施例中可为可调节的。或者或另外，所述核酸序列中的一者或二者存在于重组宿主细胞中的载体中，且可任选地将其可操作连接到启动子和/或增强子(例如，异源启动子和/或增强子)，所述启动子和/或增强子在一些实施例中可为可调节的。在某些实施例中，启动子和/或增强子是可诱导的，且所述方法可进一步包含诱导酰基-ACP蜡酯合酶和/或形成醇的酰基-ACP还原酶表达的步骤。编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列可在同一载体上或可在单独载体上。编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列可任选地可操作连接到相同启动子。或者，编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列可被可操作连接到单独启动子。
编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和/或编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列可相对于重组宿主细胞为异源。编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和/或编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列可任选地经密码子优化以供在重组宿主细胞(例如，上述蓝细菌或真核微藻中的任一物种)中表达。
所述方法中使用的重组宿主细胞可为本文所述的任一重组宿主细胞。重组宿主细胞可为(例如)光合微生物。任选地但优选地，可以光学自养方式培养重组光合微生物以产生蜡酯。在一些实例中，重组宿主细胞可为蓝细菌。在具体实施例中，蓝细菌选自包括(但不限于)以下物种的列表：阿格门氏藻、鱼腥藻属、项圈藻属、倒囊藻属、丝囊藻属、节螺藻属、星球藻属、博氏藻属、眉藻属、管孢藻属、拟绿胶蓝细菌属、拟色球藻属、色球藻属、发毛针藻属、双色藻属、蓝囊胞菌属、蓝螺菌属、蓝杆藻属、柱胞藻属、筒孢藻属、蓝纤维藻属、小皮果蓝细菌属、侧生藻属、费氏藻属、盖特勒氏蓝细菌属、吉特勒氏线状蓝细菌属、胶菌藻、粘球藻属、粘杆藻属、盐螺旋藻属、英加藻属、瘦鞘丝藻属、湖丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、微囊藻属、粘囊藻属、节球藻属、念珠藻属、拟念珠藻属、颤藻属、席藻属、浮丝藻属、宽球藻属、原绿球藻属、原绿菌属、原绿发菌属、假鱼腥藻属、胶须藻属、裂须藻属、双歧藻属、螺旋藻属、斯塔尼尔蓝菌属、斯塔尔氏蓝菌属、真枝藻属、束藻属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻、单岐藻属、束毛藻属、常丝藻或异球藻属。例如，重组光合微生物可为聚球藻属、集胞藻属或嗜热聚球藻。或者，重组光合微生物可为双色藻属、蓝杆藻属或蓝细菌，或另外或者，重组光合微生物可为胶菌藻、鞘丝藻属或瘦鞘丝藻属。
在其它实例中，重组宿主细胞是真核微藻。在具体实施例中，真核微藻选自包括(但不限于)以下物种的列表：曲壳藻属、茧形藻属、双眉藻属、纤维藻属、星胞藻属、金藻、保罗氏藻、葡萄藻属、微细绿藻、角毛藻属、四鞭藻属、衣藻属、绿球藻属、绿梭藻属、小球藻属、蓝隐藻属、金球藻属、球钙板藻属、隐甲藻属、隐藻属、小环藻属、杜氏藻属、捕圆藻属、球石藻属、独球藻属、厄诺氏藻属、眼虫属、被刺藻属、脆杆藻属、丽丝藻属、红球藻属、嗜盐古菌、膜胞藻属、等鞭金藻、鳞孔藻属、微星藻属、富油微藻、微绿球藻、微拟球藻、舟形藻属、新绿球藻、肾鞭藻属、肾藻属、菱形藻属、棕鞭藻属、鞘藻属、卵囊藻属、蚝球藻属、巴夫藻、拟小球藻属、杜氏亚属盐藻、褐指藻属、噬菌体属、匹克氏藻属、扁藻属、颗石藻、肋球藻属、原壁菌属、伪小球藻属、伪新绿球藻、塔孢藻、桑椹藻属、栅藻属、骨条藻属、水绵属、裂丝藻属、四片藻属、海链藻属、小球藻微藻或团藻属。在一些实施例中，重组宿主细胞可为硅藻，例如双眉藻属、角毛藻属、小环藻属、舟形藻属、褐指藻属或海链藻属。在一些实施例中，重组宿主细胞可为小球藻属、微拟球藻、栅藻属或四片藻属的物种。
在一些实施例中，重组宿主细胞将所产生蜡酯的至少一部分分泌到生长培养基中。在某些实施例中，所产生蜡酯的量对所分泌蜡酯的量的比率小于约10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1或1∶1。在具体实施例中，所产生蜡酯的量对所分泌蜡酯的量的比率小于约5∶1、4∶1、3∶1、2∶1或1∶1。重组宿主细胞可表达外源跨膜转运蛋白(例如，ATP结合盒或ABC、转运蛋白或RND泵)以促进蜡酯分泌。在一些实施例中，转运蛋白是由至少一种选自包括(但不限于)以下的群组的基因编码：拟南芥属基因CER5、WBC11、AtMRPS、AmiS2和AtPGP1或来自酵母菌属、果蝇属(Drosophila)、分枝杆菌或哺乳动物的脂肪酸转运蛋白(FATP)基因。在一些实施例中，转运蛋白的表达增加从重组宿主细胞释放的蜡酯的量。在某些实施例中，转运蛋白的表达促进重组宿主细胞中蜡酯的产生。在一些实施例中，蜡酯的分泌可调节。在某些实施例中，蜡酯的分泌可诱导。
本发明的酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶能使用酰基-ACP代替酰基-CoA作为底物或除了酰基-CoA以外使用酰基-ACP作为底物。在一些实施例中，重组宿主细胞不内源性产生酰基-CoA。在其它实施例中，重组宿主细胞内源性产生酰基-CoA但经改造以减弱或消除酰基-CoA产生，或重组宿主细胞产生相对于野生型酶具有降低活性的突变体酰基-CoA合成酶。在某些实施例中，重组宿主细胞不表达(例如)酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA硫酯酶和/或酰基-CoA合成酶。在某些实施例中，重组宿主细胞不表达形成醛的还原酶(例如，形成醛的酰基-CoA还原酶、形成醛的酰基-ACP还原酶或羧酸还原酶)。在具体实施例中，重组宿主细胞不表达非天然(例如外源)的形成醛的还原酶。
在一些实施例中，重组宿主细胞表达外源形成脂肪醛的还原酶，其可为(例如)形成醛的酰基-ACP还原酶。在一些实施例中，重组宿主细胞表达形成脂肪醛的内源还原酶，其可为(例如)形成醛的酰基-ACP还原酶。在某些实施例中，重组宿主细胞经改造以过表达内源形成醛的还原酶，例如通过改造重组宿主细胞以包含可操作连接到编码形成醛的还原酶的内源核酸序列的异源启动子。在某些实施例中，启动子可调节。在具体实施例中，启动子可诱导，且所述方法进一步包含诱导内源形成醛的还原酶的表达的步骤。
因为本发明的酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原使用酰基-ACP作为底物，所以提高重组宿主细胞中的酰基-ACP浓度可促进蜡酯产生。在一些实施例中，在重组宿主细胞中上调酰基-ACP产生。在一些实施例中，在重组宿主细胞中上调碳固定。在某些实施例中，重组宿主细胞表达编码至少一种选自以下的多肽的非天然基因：β-酮酰基合成酶、乙酰基-CoA羧化酶、丙二酰基-CoA:ACP转酰酶、酰基-ACP合成酶、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶、藻胆蛋白(例如，藻青蛋白)、酰基载体蛋白和跨膜转运蛋白。所述多肽可相对于宿主微生物为外源或内源；如果是内源，那么重组宿主细胞可经改造以过表达或过产生内源多肽。在某些实施例中，重组宿主细胞表达编码内源或外源酰基-ACP合成酶的非天然基因且是在培养基中提供的外源游离脂肪酸存在下培养。
使用酰基-ACP作为底物容许省略将酰基-CoA转化为脂肪醇所需要的某些步骤。有利地，不需要将编码催化这些步骤的酶的基因改造到不内源性表达这些酶的重组宿主细胞中。内源性表达这些酶的重组宿主细胞可经改造以减弱或消除其表达。在一些实施例中，重组宿主细胞不经编码以下酶中的至少一种的基因转型：酰基-CoA合成酶、酰基-CoA脱氢酶、酰基-ACP硫酯酶或酰基-CoA硫酯酶；如果所述基因是内源性表达，那么重组宿主细胞可经改造以减弱或消除表达。在一些实施例中，重组宿主细胞经改造以减弱或消除一或多种β-氧化路径酶的表达。在某些实施例中，重组宿主细胞经改造以减弱或消除以下酶中的至少一种的表达：甘油-3-磷酸脱氢酶、乙醛-CoA脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和乙酸盐激酶。在一些实施例中，重组宿主细胞经改造以减弱或消除酰基-ACP合成酶的表达。
可通过重组或非重组方法引入用于减弱或消除已知基因的表达的突变。可通过(例如)使用微小RNA或shRNA构筑物进行的反义序列的破坏、缺失、置换或生成、核酶的生成和/或从业人员已知的其它重组方法来特异性靶向基因。另外或或者，基因的钝化可通过随机突变技术来完成，例如暴露于UV和/或化学诱变剂之后筛选细胞中的成功突变体。另外或或者，所述基因编码的蛋白质可通过细胞内生成适当抗体、细胞内生成肽抑制剂或诸如此类或其某一组合来抑制。
在一些实施例中，所述方法可进一步包含分离所产生脂肪酸酯或蜡酯的步骤。诸如蜡酯等脂肪酸和脂肪酸衍生物可通过所属领域技术人员已知的回收手段(例如通过使用(例如)有机溶剂进行全培养物萃取)从培养基回收。另外或或者，可采用微粒吸附剂。根据回收方法的设计，这些微粒吸附剂可包括(例如)亲脂性微粒和/或离子交换树脂。微粒吸附剂可在所分离培养基中循环，之后经历收集，和/或可使培养基经过含有所述微粒的固定床柱，例如色谱柱。然后可通过(例如)使用适当溶剂从微粒吸附剂洗脱脂肪酸和/或脂肪酸衍生物。在某些实施例中，随后可蒸发溶剂，之后进一步处理所分离脂肪酸、脂肪酸衍生物和脂质以获得可用于多种目的的化学品和/或燃料。蜡酯的分离可与蜡酯的产生同时进行。在一些实施例中，蜡酯的分离是连续的。
在一些实施例中，脂肪酸或脂肪酸衍生物(例如，蜡酯)的回收可通过宿主细胞的匀浆化(例如通过加热、用酸或碱处理、用酶处理、渗透冲击、机械破坏、超声处理、冷冻-解冻等)来促进。在一些实施例中，可用蛋白酶处理含有细胞或细胞碎片的材料以降解污染蛋白质。在消化后，可通过(例如)溶剂萃取、离心和/或过滤从残留的蛋白质、肽片段和氨基酸纯化烃。回收方法可经调整以有效地仅回收所释放的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物、仅回收在细胞内产生并储存的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物，或回收储存的和释放的脂肪酸和/或脂肪酸衍生物二者。
在一些实施例中，本发明方法在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天的培养期中产生至少0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30mg/L的一或多种蜡酯。在某些实施例中，重组宿主细胞产生至少1、2、5或10mg/L蜡酯。在具体实施例中，本发明方法在7天培养期中产生至少1mg/L蜡酯。例如，所述方法可包括培养包括编码蜡酯合酶的非天然核酸序列和编码酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列的光合微生物以及容许所述核酸序列的表达，以使得所述重组光合微生物在7天时间中产生至少约0.5毫克/升蜡酯，例如在7天时间中产生至少约1mg/L、2mg/L、5mg/L或10mg/L蜡酯，或在约1天到约30天的培养期中每天产生平均至少约0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L或2mg/L蜡酯，或在约1天到约30天的培养期中每天产生介于约0.5毫克/升与约500毫克/升之间、或介于约1mg/L与约250mg/L之间、或介于约1mg/L与约100mg/L之间、或介于约2mg/L与约200mg/L之间、或介于约2mg/L与约25mg/L之间、或介于约5mg/L与约100mg/L之间、或介于约2mg/L与约50mg/L之间、或介于约2mg/L与约25mg/L之间、或介于约5mg/L与约25mg/L之间、或介于约5mg/L与约50mg/L之间、或介于约10mg/L与约50mg/L之间、或介于约10mg/L与约100mg/L蜡酯。
在一些实施例中，包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列的重组宿主细胞相对于缺少所述核酸序列的对照宿主细胞产生提高水平(例如，多至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％)的蜡酯。在一些实施例中，包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列和编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列的重组宿主细胞相对于缺少所述非天然核酸序列的对照宿主细胞产生提高水平(例如，多至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％)的蜡酯。
蜡酯包含从脂肪醇衍生的A链和从酰基-CoA衍生的B链(例如，参见图11)。在一些实施例中，本发明方法产生包含至少一种其中A链与B链二者都具有C8-C24链长度的蜡酯分子的蜡酯。在某些实施例中，蜡酯包含至少一种其中A链与B链二者都为C12-C18的蜡酯分子。在某些实施例中，蜡酯中蜡酯的A链和/或B链以任一组合包含(例如)C6、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22或C24的链长度。在一些实施例中，所产生总蜡酯的至少约80重量％、至少约85重量％、至少约90重量％、至少约92重量％、至少约95重量％、至少约97重量％或至少约99重量％是包含C8到C24A链和/或B链的蜡酯。在一些实施例中，所产生总蜡酯的至少约80重量％、至少约85重量％、至少约90重量％、至少约92重量％、至少约95重量％、至少约97重量％或至少约99重量％是包含C10到C20A链和/或B链的蜡酯。在某些实施例中，所产生总蜡酯的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约95％、至少约97％或至少约99％是包含C12到C18A链和/或B链的蜡酯。在具体实施例中，通过本发明方法产生的蜡酯的A链与B链二者具有C8-C24的链长度。在另一具体实施例中，通过本发明方法产生的蜡酯的A链与B链二者具有C12-C18的链长度。
通过本发明方法产生的蜡酯的A链与B链可包含直链、具支链和/或环状链，且可包含饱和、单不饱和和/或多不饱和链。因理解，在提到″Cx脂肪酸″时包括具有″x″个碳原子的饱和和不饱和脂肪酸二者，且在提到″Cx脂肪醇″时包括具有″x″个碳原子的饱和和不饱和脂肪醇二者。
本发明还提供包含根据本发明方法分离的蜡酯的组合物。在某些实施例中，本文所述蜡酯可用于产生燃料组合物。
如本文所述的本发明方法可使用多种核酸分子、载体、多肽、宿主细胞和/或系统来实施。下文章节提供可用于实践本发明方法的这些和其它组份的其它细节。
核酸分子
本文所述的核酸分子和多肽可用于本发明任一方法中，且可包括在本发明的任一载体或宿主细胞中。提供编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸分子和包含酰基-ACP蜡酯合酶或其功能性片段或基本上由其组成的多肽以及编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸分子和包含形成醇的酰基-ACP还原酶或其功能性片段或基本上由其组成的多肽用于产生脂肪酸酯(包括蜡酯)的宿主细胞和方法中。可分离和/或纯化如本文所揭示的核酸分子或多肽。
在一些实施例中，宿主细胞中编码如本文所述酰基-ACP蜡酯合酶的分离或重组核酸分子或序列的表达导致所述宿主细胞的脂肪酸酯(例如，蜡酯)的产生水平高于对照宿主细胞中的产生水平，其中所述对照宿主细胞是在相同条件下培养且在所有方面都与表达分离或重组核酸分子或序列的宿主细胞实质上相同，只是所述对照宿主细胞不表达所述分离或重组核酸分子。在一些所述实施例中，宿主细胞是微生物，且在具体实施例中可为光合微生物。
在一些实施例中，在不包括编码酰基-CoA合成酶的外源基因和/或编码酰基-ACP硫酯酶或酰基-CoA硫酯酶的外源基因的重组微生物中，编码如本文所述的酰基-ACP蜡酯合酶的分离或重组核酸分子或序列的表达导致所述重组微生物的脂肪酸的产生水平高于对照微生物中的产生水平，其中所述对照微生物是在相同条件下培养且在所有方面都与表达分离或重组核酸分子或序列的重组微生物实质上相同，只是对照微生物不表达所述分离或重组核酸分子。在具体实施例中，宿主细胞是光合微生物。
在其它实施例中，宿主细胞中一或多种编码如本文所述的酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶的分离或重组核酸分子或序列的表达导致所述宿主细胞的蜡酯的产生水平高于对照宿主细胞的产生水平，其中所述对照宿主细胞是在相同条件下培养且在所有方面都与表达分离或重组核酸分子或序列的宿主细胞实质上相同，只是所述对照宿主细胞不表达所述分离或重组核酸分子或序列。在一些所述实施例中，宿主细胞是微生物，且在具体实施例中可为光合微生物。
在其它实施例中，在不包括编码酰基-CoA合成酶的外源基因和/或编码酰基-ACP硫酯酶或酰基-CoA硫酯酶的外源基因的重组微生物中，一或多种编码如本文所述的酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶的分离或重组核酸分子或序列的表达导致重组微生物的蜡酯的产生水平高于对照微生物中的产生水平，其中所述对照微生物是在相同条件下培养且在所有方面都与表达分离或重组核酸分子或序列的重组微生物实质上相同，只是所述对照微生物不表达所述分离或重组核酸分子或序列。在具体实施例中，重组微生物是光合微生物。
重组宿主细胞或微生物可包括(例如)编码包含与具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的氨基酸序列或与所述氨基酸序列中具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的多肽的分离核酸分子，且在其中重组宿主细胞或微生物包括形成醇的酰基-ACP还原酶的实施例中，所述重组宿主细胞或微生物可包括编码包含与具有形成醇的酰基-ACP还原酶活性的SEQ ID NO：2、4、6、8或10的氨基酸序列或与氨基酸序列中具有形成醇的酰基-ACP还原酶活性的功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的多肽的分离核酸分子。
编码酰基-ACP合酶的分离或重组核酸分子可包含编码与SEQ ID NO：19的氨基酸序列或与所述多肽的功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的多肽的核酸序列。例如，编码具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的多肽的核酸序列可与SEQ ID NO：19的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约85％序列一致性，或可与SEQ ID NO：19的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约90％序列一致性，或例如可与SEQ ID NO：19的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约95％序列一致性。例如，分离核酸分子可包含编码包含SEQ IDNO：19的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在一些实施例中，本发明提供包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列的分离核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：18的核苷酸序列或与SEQ ID NO：18的核苷酸序列中编码SEQ ID NO：19的酰基-ACP蜡酯合酶的功能性片段的片段具有至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。在一些实施例中，本发明提供编码酰基-ACP蜡酯合酶的分离或重组核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：18的核苷酸序列或与SEQ ID NO：18的核苷酸序列中编码SEQ ID NO：19的酰基-ACP蜡酯合酶的功能性片段的片段具有至少约85％、至少约90％或至少约95％序列一致性。在一些实施例中，本发明提供包含SEQ ID NO：18的核酸序列的分离核酸分子。在某些实施例中，所提供核酸分子中的任一者可进一步包含来自光合生物体的至少约50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000或1500个核苷酸的另一核酸序列。
编码酰基-ACP合酶的分离或重组核酸分子可包含编码与SEQ ID NO：21的氨基酸序列或与所述多肽的功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的多肽的核酸序列。例如，编码与SEQ ID NO：21的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约85％序列一致性，或可与SEQ ID NO：21的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约90％序列一致性，或例如可与SEQ ID NO：21的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约95％序列一致性的具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的多肽的核酸序列。例如，分离核酸分子可包含编码包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在一些实施例中，本发明提供包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列的分离核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：20的核苷酸序列或与SEQ ID NO：20的核苷酸序列中编码SEQ ID NO：21的酰基-ACP蜡酯合酶的功能性片段的片段具有至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。在一些实施例中，本发明提供编码酰基-ACP蜡酯合酶的分离或重组核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：20的核苷酸序列或与SEQ ID NO：20的核苷酸序列中编码SEQ ID NO：21的酰基-ACP蜡酯合酶的功能性片段的片段具有至少约85％、至少约90％或至少约95％序列一致性。在一些实施例中，本发明提供包含SEQID NO：20的核酸序列的分离核酸分子。在某些实施例中，所提供核酸分子中的任一者可进一步包含来自光合生物体的至少约50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000或1500个核苷酸的另一核酸序列。
在一些实施例中，本发明提供分离或重组核酸分子包含编码与SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的氨基酸序列或与SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽的功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的多肽的核酸序列。例如，编码具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的多肽的核酸序列可与SEQID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约85％、至少约90％或至少约95％序列一致性。在一些实施例中，分离或重组核酸分子可包含编码具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的氨基酸序列。在一些其它实施例中，本发明提供包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列的分离核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42的核苷酸序列或与SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42的核苷酸序列中编码SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的功能性片段的片段具有至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。在一些实施例中，本发明提供包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的核苷酸序列的分离核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42的序列具有至少约85％、至少约90％或至少约95％一致性，其中所述核酸序列编码具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的多肽。在一些实施例中，本发明提供包含SEQ ID NO：22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42的核苷酸序列的分离核酸分子，其中所述核酸序列编码具有酰基-ACP蜡酯合酶活性的多肽。在某些实施例中，所提供核酸分子中的任一者可进一步包含来自光合生物体的至少约50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000或1500个核苷酸的另一核酸序列。
在一些实施例中，本发明涵盖编码酰基-ACP蜡酯合酶的缺失突变体的核酸分子，其中一或多个氨基酸已从所述蛋白质缺失。在一个实施例中，所编码多肽具有454、453、452、451、450、449、448、447、446或445个或更少残基，且具有与SEQ ID NO：19的相应氨基酸序列至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在另一实施例中，所编码多肽具有472、471、470、469、468、467、466、465、464或463个或更少残基，且具有与SEQ ID NO：21的相应氨基酸序列至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在其它实施例中，所编码多肽从N-和/或C-末端缺少至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，且具有与SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的相应氨基酸序列至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。
本发明还提供包含编码与包含来自SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的至少约20、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个氨基酸残基的连续序列的片段具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列的核酸序列的分离核酸分子。所述片段和片段变体可用作(例如)探针和引物。在某些实施例中，所述探针和引物可选择性地与编码本文所述多肽的核酸分子杂交。在某些实施例中，所述片段编码当在重组宿主细胞中表达时保留全长蛋白质的酰基-ACP蜡酯合酶活性的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％的多肽。在具体实施例中，所述片段是功能性片段。
此外，本发明提供编码SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的氨基酸序列的变体或其片段的核酸分子。变体可为天然或非天然变体，例如通过各种诱变剂和诱变方法诱导的变体。在一些实施例中，核酸分子编码蜡酯合酶的变体，其中至少一个氨基酸残基已被插入参考序列的N-和/或C-末端和/或参考序列内。在一些实施例中，在参考序列的N-和/或C-末端和/或在参考序列内已缺失至少一个氨基酸残基。在一些实施例中，核酸分子可编码变体，其可为通过(例如)同源重组或定点或PCR诱变含有预定突变的序列；其它物种的相应蛋白质；等位基因或其它天然变体；和/或其中所述蛋白质已通过化学、酶促或其它适当方式经除了天然氨基酸以外的部分共价修饰的衍生物。
在经改变序列实质上抑制与蛋白质相关的生物功能时，取代、插入或缺失可对蛋白质造成不良影响。在某些实施例中，酰基-ACP蜡酯合酶的变体可具有与衍生出所述变体的酰基-ACP蜡酯合酶(例如，WS1(SEQ ID NO：19)、WS2(SEQ ID NO：21)或SEQ IDNO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的其它蜡酯合酶多肽)的活性相比，降低不超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的活性。在一些实施例中，表达酰基-ACP蜡酯合酶变体的宿主细胞产生的蜡酯的量不小于表达衍生出所述变体的酰基-ACP蜡酯合酶(例如，WS1(SEQ ID NO：19)、WS2(SEQ ID NO：21)或SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的其它蜡酯合酶多肽)的宿主细胞产生的蜡酯的量的约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％或75％。
本发明还提供酰基-ACP蜡酯合酶的与参考多肽相比具有提高活性的片段和变体。在某些实施例中，酰基-ACP蜡酯合酶片段或变体可具有与衍生出所述变体的酰基-ACP蜡酯合酶(例如，WS1(SEQ ID NO：19)或WS2(SEQ ID NO：21)或SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的相关蜡酯合酶多肽)的活性相比，增加至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的活性。在某些实施例中，表达片段或变体的宿主细胞产生的蜡酯的量是表达衍生出所述片段或变体的蜡酯合酶(例如，WS1(SEQ ID NO：19)、WS2(SEQ ID NO：21)或SEQ ID NO：23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的相关蜡酯合酶多肽)的宿主细胞产生的蜡酯的量的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。
编码形成醇的酰基-ACP还原酶的分离或重组核酸分子可包含编码与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的形成醇的酰基-ACP还原酶的功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的具有形成醇的酰基-ACP还原酶活性的多肽的核酸序列。
例如，编码具有形成醇的酰基-ACP还原酶活性的多肽的核酸序列可与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约85％序列一致性，或可与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约90％序列一致性，或例如可与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约95％序列一致性。例如，分离核酸分子可包含编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在一些实施例中，本发明提供包含编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列的分离核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的核苷酸序列中编码SEQ ID NO：2的形成醇的酰基-ACP还原酶的功能性片段的片段具有至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。在一些实施例中，本发明提供编码形成醇的酰基-ACP还原酶的分离或重组核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1的核苷酸序列中编码SEQ ID NO：2的形成醇的酰基-ACP还原酶的功能性片段的具有至少约85％、至少约90％或至少约95％序列一致性。在一些实施例中，本发明提供包含编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列的分离核酸分子，其中所述分离核酸分子包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。在某些实施例中，所提供分离核酸分子中的任一者可进一步包含来自光合生物体的至少约50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000或1500个核苷酸的另一核酸序列。
在另一实例中，编码具有形成醇的酰基-ACP还原酶活性的多肽的核酸序列可与SEQID NO：4的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约85％序列一致性，或可与SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约90％序列一致性，或例如可与SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约95％序列一致性。例如，分离核酸分子可包含编码包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在一些实施例中，本发明提供包含编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列的分离核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3的核苷酸序列中编码SEQ ID NO：4的形成醇的酰基-ACP还原酶的功能性片段的片段具有至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。在一些实施例中，本发明提供编码形成醇的酰基-ACP还原酶的分离或重组核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：3的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3的核苷酸序列中编码SEQ ID NO：4的形成醇的酰基-ACP还原酶的功能性片段的片段具有至少约85％、至少约90％或至少约95％序列一致性。在一些实施例中，本发明提供包含编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列的分离核酸分子，其中所述分离核酸分子包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。在某些实施例中，所提供分离核酸分子中的任一者可进一步包含来自光合生物体的至少约50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000或1500个核苷酸的另一核酸序列。
例如，编码具有形成醇的酰基-ACP还原酶活性的多肽的核酸序列可与SEQ ID NO：6、8或10的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约85％序列一致性，或可与SEQ ID NO：6、8或10的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约90％序列一致性，或例如可与SEQID NO：6、8或10的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约95％序列一致性。例如，分离核酸分子可包含编码包含SEQ ID NO：6、8或10的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。在一些实施例中，本发明提供包含编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列的分离核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：5、7或9的核苷酸序列或与SEQ ID NO：5、7或9的核苷酸序列中编码SEQ ID NO：6、8或10的形成醇的酰基-ACP还原酶的功能性片段的片段具有至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。在一些实施例中，本发明提供编码形成醇的酰基-ACP还原酶的分离或重组核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：5、7或9的核苷酸序列或与SEQID NO：5、7或9的核苷酸序列中编码SEQ ID NO：6、8或10的形成醇的酰基-ACP还原酶的功能性片段的片段具有至少约85％、至少约90％或至少约95％序列一致性。在一些实施例中，本发明提供包含编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列的分离核酸分子，其中所述分离核酸分子包含SEQ ID NO：5、7或9的核苷酸序列。在某些实施例中，所提供分离核酸分子中的任一者可进一步包含来自光合生物体的至少约50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000或1500个核苷酸的另一核酸序列。
在一些实施例中，本发明涵盖形成醇的酰基-ACP还原酶的缺失突变体，其中核酸分子编码其中一或多个氨基酸已从蛋白质缺失的还原酶蛋白质。在一个实施例中，所述多肽具有512、511、510、509、508、507、506、505、504或503个或更少残基，且具有与SEQ ID NO：2的相应氨基酸序列至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在另一实施例中，所述多肽具有504、503、502、501、500、499、498、497、496或495个或更少残基，且具有与SEQ ID NO：4的相应氨基酸序列至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在另一实施例中，所述多肽具有511、510、509、508、507、506、505、504、503或502个或更少残基，且具有与SEQ ID NO：6的相应氨基酸序列至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在另一实施例中，所述多肽具有511、510、509、508、507、506、505、504、503或502个或更少残基，且具有与SEQ ID NO：8的相应氨基酸序列至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在另一实施例中，所述多肽具有513、512、511、510、509、508、507、506、505或504个或更少残基，且具有与SEQ ID NO：10的相应氨基酸序列至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。在其它实施例中，所述多肽从N-和/或C-末端缺少至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，且具有与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的相应氨基酸序列至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列。
本发明还提供包含编码与包含来自SEQ ID NO：2、4、6、8或10的至少约20、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个氨基酸残基的连续序列的片段具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列的核酸序列的分离核酸分子。所述片段和片段变体可用作探针和引物。在某些实施例中，所述探针和引物可选择性地与编码本文所述多肽的核酸分子杂交。在某些实施例中，所述片段编码当在重组宿主细胞中表达时保留全长蛋白质的形成醇的酰基-ACP还原酶活性的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％的多肽。在具体实施例中，所述片段是功能性片段。
此外，本发明提供SEQ ID NO：2、4、6、8或10的氨基酸序列或其片段的变体。变体可为天然和/或非天然变体，例如通过各种诱变剂和诱变方法诱导的变体。在一些实施例中，至少一个氨基酸残基已被插入参考序列的N-和/或C-末端和/或参考序列内。在一些实施例中，在参考序列的N-和/或C-末端和/或在参考序列内已缺失至少一个氨基酸残基。在一些实施例中，在参考序列内至少一个氨基酸残基已被取代。在一些实施例中，变体可为通过(例如)同源重组或定点或PCR诱变含有预定突变的序列；其它物种的相应蛋白质；等位基因或其它天然变体；和/或其中所述蛋白质已通过化学、酶促或其它适当方式经除了天然氨基酸以外的其它部分共价修饰的衍生物。
在经改变序列实质上抑制与蛋白质相关的生物功能时，取代、插入或缺失可对蛋白质造成不良影响。在某些实施例中，形成醇的酰基-ACP还原酶的变体可具有与衍生出所述变体的形成醇的酰基-ACP还原酶(例如，Maqu_2220(SEQ ID NO：2)、Hch_05075(SEQ ID NO：4)、MDG893_11561(SEQ ID NO：6)、HP15_810(SEQ ID NO：8)或RED65_09894(SEQ ID NO：10))的活性相比，降低不超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的活性。在一些实施例中，表达形成醇的酰基-ACP还原酶变体的宿主细胞产生的脂肪醇的量不小于表达衍生出所述变体的形成醇的酰基-ACP还原酶(例如，Maqu_2220(SEQ ID NO：2)、Hch_05075(SEQ ID NO：4)、MDG893_11561(SEQ ID NO：6)、HP15_810(SEQ ID NO：8)或RED65_09894(SEQ ID NO：10))的宿主细胞产生的脂肪醇的量的约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％或75％。
本发明还提供形成醇的酰基-ACP还原酶的与参考多肽相比具有提高活性的片段和变体。在某些实施例中，片段或变体可具有与衍生出所述变体的形成醇的酰基-ACP还原酶(例如，Maqu_2220(SEQ ID NO：2)、Hch_05075(SEQ ID NO：4)、MDG893_11561(SEQ ID NO：6)、HP15_810(SEQ ID NO：8)或RED65_09894(SEQ ID NO：10))的活性相比，增加至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的活性。在某些实施例中，表达片段或变体的宿主细胞产生的脂肪醇的量是表达衍生出所述片段或变体的形成醇的酰基-ACP还原酶(例如，Maqu_2220(SEQ ID NO：2)、Hch_05075(SEQ ID NO：4)、MDG893_11561(SEQ ID NO：6)、HP15_810(SEQ ID NO：8)或RED65_09894(SEQ IDNO：10))的宿主细胞产生的脂肪醇的量的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％。
在一些实施例中，本发明提供分离核酸分子，其除了编码与SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的氨基酸序列或与SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43中任一者的具有蜡酯合酶活性的功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的蜡酯合酶的核酸序列以外，还包含编码与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的具有形成醇的酰基-ACP还原酶活性的功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列。在一些实施例中，本发明提供分离核酸分子，其除了编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列(其中所述核酸序列与SEQ IDNO：18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42的核苷酸序列或与SEQ IDNO：18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42的核苷酸序列中编码SEQID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的酰基-ACP蜡酯合酶的功能性片段的片段具有至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性)以外，还包含编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列，其中所述核酸序列与SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的核苷酸序列中编码SEQ ID NO：2、4、6、8或10的形成醇的酰基-ACP还原酶的功能性片段的片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。在一些实施例中，本发明提供包含编码酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列的分离核酸分子，其中所述分离核酸分子以任一组合包含SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42的核苷酸序列和SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的核苷酸序列。在某些实施例中，所提供核酸分子中的任一者可进一步包含来自光合生物体的至少约50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000或1500个核苷酸的另一核酸序列。
本发明还提供在高严格性杂交条件(例如选择性杂交条件)下与本文所述核苷酸序列杂交的核酸分子。杂交探针包括以碱基特异性方式与核酸互补链结合的合成寡核苷酸。适宜探针包括多肽核酸，如尼尔森(Nielsen)(1991)科学，254，1497-1500中所述。在一些实施例中，本发明核酸分子可通过在(例如)高严格性条件下特异性杂交来检测和/或分离。
在具体实施例中，上述或下述核酸分子中的任一者可进一步包含来自光合生物体的至少约50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000或1500个核苷酸的另一核酸序列。
其它修饰
本发明还提供本发明核苷酸序列的其它变体。在一些实施例中，核苷酸序列变体编码如本文所述多肽的片段或变体。在一些实施例中，核苷酸序列变体是天然变体。在其它实施例中，核苷酸序列变体是非天然变体，例如通过各种诱变剂和诱变方法诱导的变体。在某些实施例中，核苷酸序列变体是天然与非天然变体的组合。给定核酸序列可根据(例如)标准诱变或人工进化或结构域交换方法来修饰以产生经修饰序列。加速进化方法阐述于(例如)施特默尔(Stemmer)(1994)自然(Nature)370，389-391；和施特默尔(1994)美国国家科学院院刊91，10747-10751。所表达核酸和多肽的化学或酶促改变可通过标准方法来执行。例如，可通过添加磷酸基、甲基、脂质、糖、肽或有机或无机化合物，通过包括经修饰核苷酸或氨基酸或诸如此类来修饰序列。
对于重组蛋白质的最佳表达，在一些情况下，可有益地采用具有要转型的宿主细胞优先使用的密码子的产生mRNA的编码序列(“密码子优化”)。因此，对于转基因的增强表达，转基因的密码子使用可与其中需要表达所述转基因的生物体的特定密码子偏爱相匹配。对微藻中表达的基因进行重编码的方法阐述于(例如)美国专利第7,135,290号中。相信可用于此效应的准确机制有很多，但可包括适当平衡可用氨基酰化tRNA池与细胞中合成的蛋白质，且在满足此需要时与转基因信使RNA(mRNA)的更有效翻译偶联。在一些实施例中，仅一部分密码子变化以反映宿主微生物的优选密码子使用。在某些实施例中，一或多个密码子变为并不一定是宿主微生物中编码具体氨基酸的最优选密码子的密码子。可在(例如)基因库的密码子使用数据库获得关于密码子优化的其它信息。编码序列可经密码子优化以供在所选用于表达的宿主生物体中进行所需产物的最佳产生。在某些实施例中，编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和/或编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列经密码子优化以供在光合微生物(例如蓝细菌或真核微藻)中表达。
在一些实施例中，本发明核酸分子编码包含酰基-ACP蜡酯合酶或形成醇的酰基-ACP还原酶的融合蛋白质。本发明核酸分子可或者或另外编码包含酰基-ACP还原酶的融合蛋白质。例如，本发明核酸可包含编码以下蛋白质的多核苷酸序列：与酰基-ACP蜡酯合酶和/或形成醇的酰基-ACP还原酶序列融合的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或其部分、硫氧还蛋白或其部分、麦芽糖结合蛋白或其部分、聚组氨酸(例如His6)、聚HN、聚赖氨酸、血凝素标签序列、HSV-Tag和/或HIV-Tat的至少一部分。
在一些实施例中，本发明核酸分子包含其它非编码序列，例如3′和5′非编码序列(例如，包括调节序列)。
核酸构筑物
在一些实施例中，本发明的分离核酸分子可包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列二者。编码酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列可为本文所述核酸序列中的任一者。
在某些实施例中，编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列可被可操作连接到相同启动子和/或增强子。例如，在具体实施例中，两个基因(编码形成醇的酰基-ACP还原酶和酰基-ACP蜡酯合酶)可经组织作为操纵子，其中(例如)在5’到3’方向上，启动子序列之后是编码形成醇的酰基-ACP还原酶的序列，之后是编码酰基-ACP蜡酯合酶的序列。在操纵子的替代配置中，在5’到3’方向上，启动子序列之后是编码酰基-ACP蜡酯合酶的序列，之后是编码形成醇的酰基-ACP还原酶的序列。在一些实施例中，分离核酸分子可包括两个或更多个串联排列的基因，其中所述分离核酸分子在基因的上游不包括在计划宿主微生物中操作的启动子序列。在这些实施例中，无启动子操纵子可经设计以供整合(例如，同源重组)到可包括启动子序列的宿主基因组的位点中，从而使得合成操纵子可通过宿主微生物基因组中的启动子来转录调节。此外，操纵子可经设计以供整合(例如，同源重组)到可包括增强子序列的宿主基因组的位点中，从而使得所引入操纵子可通过宿主微生物基因组中的增强子来转录调节。在包括形成醇的酰基-ACP还原酶和酰基-ACP蜡酯合酶基因的操纵子的上述任一实施例中，可在分离核酸分子中包括一或多种其它调节序列，例如可在任一基因编码序列的上游包括用于促进翻译的序列，且可任选地在合成操纵子的3’端或3’端附近包括转录终止子。
除了酰基-ACP蜡酯合酶基因和形成醇的酰基-ACP还原酶基因以外，可任选地在如本文所提供的合成操纵子中包括一或多种其它基因，其中所述一或多种其它基因可包括(例如)一或多种编码蜡酯合成路径的酶或蛋白质的基因和/或一或多种编码可促进蜡酯合成的酶或蛋白质的基因，一或多种可促进光合作用或碳固定的基因，和/或一或多种报道基因或可选标记。
在一些实施例中，编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列可被可操作连接到不同启动子和/或转录增强子。启动子和增强子可为(例如)本文所述启动子和转录增强子中的任一者。
本发明还包含构筑物，其包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的分离核酸分子、编码形成醇的酰基-ACP还原酶的分离核酸分子和/或编码酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶的分离核酸分子。本发明核酸构筑物可包含如本文所述的编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列中的任一者和/或编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列中的任一者，且可进一步包括调节或介导核苷酸序列的转录、翻译或将核苷酸序列整合到宿主基因组中的序列。在一些实施例中，本发明提供表达构筑物，其包含一或多种促进酰基-ACP蜡酯合酶和/或形成醇的酰基-ACP还原酶的表达的序列。例如，编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和/或编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列可被可操作连接到表达构筑物或“表达盒”中的启动子。在一些实施例中，启动子可调节，例如可诱导。
在其中核酸构筑物不含与编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和/或编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列可操作连锁的启动子的实施例中，一个或两个编码酶的核酸序列可被转型到宿主细胞中，从而使得其通过(例如)同源重组、位点特异性整合和/或载体整合可操作连接到宿主细胞的内源启动子。在一些实施例中，核酸构筑物中包括的用于介导同源重组到宿主基因组中的宿主基因组序列可包括可调节核酸构筑物中酰基-ACP蜡酯合酶基因和/或形成醇的酰基-ACP还原酶基因的表达的基因调节序列(例如启动子序列)。在所述实施例中，构筑物的转基因由此可操作连接到宿主微生物的内源启动子。在一些实施例中，编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列可操作连接到宿主微生物的相同内源启动子。在其它实施例中，编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列可操作连接到不同的宿主内源启动子。在一些实施例中，内源启动子是组成型启动子，或内源启动子可为可调节(例如可诱导)启动子。
可操作连接到编码本发明酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和/或编码本发明的形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列的启动子可相对于蜡酯合酶或酰基-ACP还原酶基因为异源启动子。在一些实施例中，启动子可为可诱导启动子，即，响应具体刺激介导可操作连接的基因转录的启动子。所述启动子可有利于(例如)使对宿主细胞生长的任何有害效应最小化和/或使脂肪醇组合物和/或蜡酯的产生最大化。可诱导启动子可响应(例如)光或暗或高温或低温，和/或可响应特定化合物。可诱导启动子可为(例如)ara启动子、lac启动子、tet启动子(例如美国专利第5,851,796号)、trp启动子或包括ara、tet、trp和/或lac启动子的一或多个部分的杂合启动子。启动子序列可来自任何生物体，前提是其在宿主生物体中起作用。在某些实施例中，可诱导启动子是通过以下方式来形成：将来自已知可诱导启动子的一或多个部分或结构域融合到可在宿主细胞中操作的不同启动子的至少一部分，以(例如)赋予在宿主物种中操作的启动子可诱导性。
在一些实施例中，编码本发明酰基-ACP蜡酯合酶和/或本发明的形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列可操作连接到在原核生物(例如蓝细菌)中起作用的启动子，包括(但不限于)lac、tac和trc启动子以及衍生物(例如(但不限于)可通过添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导的trcE和trcY启动子)、天然与转座子源或细菌染色体源抗生素抗性基因(例如新霉素磷酸转移酶、氯霉素乙酰转移酶、大观霉素腺苷转移酶等或其组合)结合的启动子、与各种异源细菌和天然蓝细菌基因结合的启动子、来自病毒和噬菌体的启动子、合成启动子或其组合。在某些实施例中，启动子是蓝细菌启动子，例如secA(分泌；受细胞的氧化还原状态控制)、rbc(核酮糖二磷酸羟化酶(Rubisco)操纵子)、psaAB(PSI反应中心蛋白；光调节)、NtcA或glnA启动子和psbA(PSII的D1蛋白质；光可诱导)。在一些实施例中，包括蓝细菌启动子或其部分的构筑物可重组到蓝细菌宿主细胞的基因组中，从而使得编码酰基还原酶的核酸序列、编码蜡合酶的核酸序列或二者可操作连接到宿主基因组中的蓝细菌启动子。在一些实施例中，启动子受含氮化合物调节，例如nar、ntc、nir或nrt启动子。在一些实施例中，启动子受磷酸盐(例如，pho或pst启动子)或镍(例如，nrs启动子)调节。用于蓝细菌中的启动子还可从天然启动子修饰，且包括天然启动子的组合，包括(但不限于)本文所揭示的启动子。在一些实施例中，启动子选自多个物种(包括真细菌和蓝细菌)的原核启动子，例如araC或pBAD启动子、rha启动子、Pm启动子、xylS启动子、nir启动子、nar启动子、pho启动子、tet启动子、cys启动子、金属硫蛋白启动子、ftf启动子、gln启动子、热休克启动子、低温可诱导启动子或病毒启动子。上述启动子是实例性启动子且没有限制性。
众多种转录终止子可用于本发明任一载体中。可能的终止子的实例可包括(但不限于)psbA、psaAB、rbc、secA、T7外壳蛋白、rrnB和诸如此类和其组合。
在某些实施例中，包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列和/或编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列的载体经设计以供转型到蓝细菌中。在具体实施例中，载体允许编码酰基-ACP蜡酯合酶的序列和/或编码形成醇的酰基-ACP还原酶的序列与蓝细菌基因组同源重组。
本发明分离核酸分子可包括载体(例如(但不限于)表达载体)中本文所揭示的编码形成醇的酰基-ACP还原酶或酰基-蜡酯合酶中的一或多者的序列。载体可包括(例如)以下中的一或多者：1)用于核酸序列在一或多种宿主(其可包括或可不包括产生宿主)中增殖的复制起点；2)一或多种可选标记；3)一或多种报道基因；4)一或多种表达控制序列，例如(但不限于)启动子序列、增强子序列、终止子序列、促进翻译的序列等；和/或5)一或多种促进将核酸序列整合到宿主基因组中的序列，例如一或多种与宿主微生物的一或多个核苷酸序列具有同源性的序列。
在一些实施例中，转型载体可包括可选标记，例如(但不限于)药物抗性基因、除草剂抗性基因、代谢酶和/或宿主存活所需因子(例如，营养缺陷标记)或诸如此类或其组合。可任选地基于在抗生素和/或其它可选标记存在下在缺少抗性盒或营养缺陷标记的细胞无法生长的条件下生长的能力来选择经转型细胞。另外或或者，载体上可存在非可选标记(例如，报道基因)，例如编码荧光蛋白或生成可检测反应产物的酶的基因。
在一些实施例中，载体是整合载体，其包括一或多种促进将目标基因或基因表达盒整合到宿主细胞基因组中的序列。例如，用于转型宿主细胞的整合载体可包括至少一种与宿主细胞基因组中的序列具有同源性的至少约50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1200或至少1500个核苷酸的序列，以容许通过同源重组将基因或基因表达盒整合到宿主细胞基因组中。在一些实例中，基因或基因表达盒的侧翼是与宿主染色体区域同源的序列以促进将目标基因整合到宿主染色体中。另外或或者，整合载体可包括一或多种促进位点特异性重组或随机整合的序列，例如(但不限于)重组酶、整合酶或转座酶识别的序列。在一些实施例中，整合载体可进一步包括编码重组酶、整合酶或转座酶的基因。在某些实施例中，整合载体经设计以促进将酰基-ACP蜡酯合酶基因、形成醇的酰基-ACP还原酶基因或二者整合到蓝细菌中。在具体实施例中，载体促进在蓝细菌(例如，在集胞藻PCC6803中)中的RS1位点或RS2位点整合。
可通过常规转型和/或转染技术将载体引入宿主细胞(例如，本文所述的任一宿主细胞)中。例如，蓝细菌可通过任何适宜方法来转型，包括(例如)天然DNA摄取(臧(Zang)(2007)微生物学杂志(J.Microbiol.)45，241-245)；接合(沃尔克(Wolk)等人(1984)美国国家科学院院刊81：1561-1565)；转导；玻璃珠转型(冯(Feng)(2009)分子生物学报告(Mol.Biol.Rep.)36，1433-9)；碳化硅须晶转型(杜那荷(Dunahay)(1997)分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)62，503-9)；生物弹道学(克罗特(Kroth)(2007)分子生物学方法390，257-267)；电穿孔(路德维希(Ludwig)(2008)应用分子生物学和生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)78，729-35)；激光介导的转型(WO2009/140701)；任选地在用细胞壁降解酶处理细胞后(佩龙(Perrone)(1998)细胞分子生物学(Mol.Biol.Cell)9，3351-3365)，在以下中的任一者存在下或在用其预处理之后与DNA一起培育：聚(酰胺胺)树枝状聚合物(帕苏帕蒂(Pasupathy)(2008)生物技术杂志(Biotechnol.J.)3，1078-82)、聚乙二醇(欧努马(Ohnuma)(2008)植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)49，117-120)、阳离子脂质(Muradawa(2008)生物科学与生物工程杂志(J.Biosci.Bioeng.)105，77-80)、葡聚糖、磷酸钙和/或氯化钙(门德斯-阿尔瓦雷斯(Mendez-Alvarez)(1994)细菌学杂志176，7395-7397)；或诸如此类或其组合。另外或或者，例如在移除或破坏藻类细胞壁后，可在藻类细胞上执行土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转型(库玛尔(Kumar)(2004)植物科学(Plant Sci.)166，731-738)。
上述载体可用于如本文所述产生蜡酯的任一方法中。
重组宿主细胞
本发明还提供包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列的重组宿主细胞。在一些实施例中，重组宿主细胞进一步包含编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列。在一些实施例中，核酸序列进一步包含来自光合生物体的至少50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1200或1500个核苷酸的另一核酸序列。重组宿主细胞可包含(例如)上述编码蜡酯合酶(例如，酰基-ACP蜡酯合酶)或形成醇的还原酶(例如，形成醇的酰基-ACP还原酶)或编码蜡酯合酶和形成醇的还原酶二者的分离核酸分子中的任一者。重组宿主细胞可包含(例如)本文所述任一载体。在一些实施例中，编码蜡酯合酶的核酸序列是重组宿主细胞的非天然序列。在一些实施例中，编码形成醇的还原酶的核酸序列是重组宿主细胞的非天然序列。
在某些实施例中，本发明提供经遗传改造以供产生脂肪酸酯的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含编码在宿主细胞中表达后能以非酰基-CoA依赖性路径产生脂肪酸酯的蜡酯合酶的非天然核酸序列。在一些实施例中，蜡酯合酶能使用酰基-ACP作为底物。在一些实施例中，重组宿主细胞进一步包含编码形成醇的还原酶的非天然核酸序列。在一些实施例中，形成醇的还原酶能使用酰基-ACP作为底物。在具体实施例中，重组宿主细胞在编码蜡酯合酶的非天然核酸序列和编码形成醇的还原酶的非天然核酸序列(如果存在)在宿主细胞中表达后以非酰基-CoA依赖性路径产生蜡酯。
在某些实施例中，本发明提供经遗传改造以供以二基因路径从酰基-ACP产生蜡酯的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列和编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列。在具体实施例中，重组宿主细胞在宿主细胞中表达后以二基因路径从酰基-ACP产生蜡酯。在一些实施例中，本发明的形成醇的酰基-ACP还原酶是微生物酰基-ACP还原酶，和/或本发明的酰基-ACP蜡酯合酶是微生物蜡酯合酶。在一些实施例中，本发明的形成醇的酰基-ACP还原酶和本发明的酰基-ACP蜡酯合酶二者具有原核来源。在一些实施例中，本发明的形成醇的酰基-ACP还原酶是海杆菌属的酰基-ACP还原酶，和/或本发明的酰基-ACP蜡酯合酶是海杆菌属的蜡酯合酶。
在一些实施例中，重组宿主细胞是哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞(例如，解脂子囊菌酵母(Y.lipolytica)或酿酒酵母(S.cerevisiae))、真菌细胞、丝状真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞(例如，大肠杆菌)。例如，宿主细胞作为非限制性实例可为以下物种：酵母菌属、裂殖酵母属、假丝酵母属、子囊菌酵母属、红酵母属、罗氏酵母属、曲霉菌属、毕赤酵母属、裂殖壶菌、破囊壶菌目、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、棒杆菌属、假单胞菌属、节杆菌属、诺卡尔菌属、红球菌属或葡萄糖菌。
在一些实施例中，重组宿主细胞是重组微生物。在一些实施例中，重组宿主细胞是任何原核微生物，包括(但不限于)真细菌、古细菌、绿色非硫细菌、紫色非硫细菌或蓝细菌。在一些实施例中，重组宿主细胞是光合宿主细胞(例如光合微生物)。在某些实施例中，光合微生物是蓝细菌。已知蓝细菌不产生酰基-CoA，且基于对基因组已测序的蓝细菌基因的分析已确定，这些物种缺少酰基-CoA合成酶基因(卡兹马兹克和富尔达(2010)植物生理学152：1598-1610)。已知多种蓝细菌且已使用分子生物学技术对其进行处理，包括基因组已经完全测序的单细胞蓝细菌集胞藻PCC6803和细长聚球藻PCC7942。在一些实施例中，蓝细菌选自(例如)阿格门氏藻、鱼腥藻属、项圈藻属、倒囊藻属、丝囊藻属、节螺藻属、星球藻属、博氏藻属、眉藻属、管孢藻属、拟绿胶蓝细菌属、拟色球藻属、色球藻属、发毛针藻属、双色藻属、蓝囊胞菌属、蓝螺菌属、蓝杆藻属、柱胞藻属、筒孢藻属、蓝纤维藻属、小皮果蓝细菌属、侧生藻属、费氏藻属、盖特勒氏蓝细菌属、吉特勒氏线状蓝细菌属、胶菌藻、粘球藻属、粘杆藻属、盐螺旋藻属、英加藻属、瘦鞘丝藻属、湖丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、微囊藻属、粘囊藻属、节球藻属、念珠藻属、拟念珠藻属、颤藻属、席藻属、浮丝藻属、宽球藻属、原绿球藻属、原绿菌属、原绿发菌属、假鱼腥藻属、胶须藻属、裂须藻属、双歧藻属、螺旋藻属、斯塔尼尔蓝菌属、斯塔尔氏蓝菌属、真枝藻属、束藻属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻、单岐藻属、束毛藻属、常丝藻或异球藻属。例如，宿主微生物可为聚球藻属、嗜热聚球藻或集胞藻属。或者，重组光合微生物可为双色藻属、蓝杆藻属或蓝细菌，或另外或者，重组光合微生物可为胶菌藻、鞘丝藻属或立普妥蓝巴。在一些实施例中，蓝细菌株系是集胞藻属。
在某些实施例中，光合微生物是选自(例如)以下的真核微藻：曲壳藻属、茧形藻属、双眉藻属、纤维藻属、星胞藻属、金藻、保罗氏藻、葡萄藻属、微细绿藻、角毛藻属、四鞭藻属、衣藻属、绿球藻属、绿梭藻属、小球藻属、蓝隐藻属、金球藻属、球钙板藻属、隐甲藻属、隐藻属、小环藻属、杜氏藻属、捕圆藻属、球石藻属、独球藻属、厄诺氏藻属、眼虫属、被刺藻属、脆杆藻属、丽丝藻属、红球藻属、嗜盐古菌、膜胞藻属、等鞭金藻、鳞孔藻属、微星藻属、富油微藻、微绿球藻、微拟球藻、舟形藻属、新绿球藻、肾鞭藻属、肾藻属、菱形藻属、棕鞭藻属、鞘藻属、卵囊藻属、蚝球藻属、巴夫藻、拟小球藻属、杜氏亚属盐藻、褐指藻属、噬菌体属、匹克氏藻属、扁藻属、颗石藻、肋球藻属、原壁菌属、伪小球藻属、伪新绿球藻、塔孢藻、桑椹藻属、栅藻属、骨条藻属、水绵属、裂丝藻属、四片藻属、海链藻属、小球藻微藻或团藻属。在一些实施例中，重组宿主细胞可为硅藻，例如双眉藻属、角毛藻属、小环藻属、舟形藻属、褐指藻属或海链藻属。在一些实施例中，重组宿主细胞可为小球藻属、微拟球藻、栅藻属或四片藻属的物种。
在一些实施例中，重组宿主细胞包含与SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42的核苷酸序列或与所述核苷酸序列中编码酰基-ACP蜡酯合酶的功能性片段的片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列。在某些实施例中，编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列包含SEQ ID NO：18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或42的核苷酸序列。在某些实施例中，编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列源自(例如)海杆菌属、湖沉积杆菌、食烷菌、何氏菌、变形菌纲、海洋杆菌属或分枝杆菌属。在一些实施例中，重组宿主细胞表达与包含SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的氨基酸序列的多肽或与所述多肽的功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶。在某些实施例中，酰基-ACP蜡酯合酶包含SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽或基本上由其组成。在一些实施例中，重组宿主细胞包含包括可操作连接到启动子的编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列的载体。在某些实施例中，启动子可调节。在具体实施例中，启动子可诱导。在一些实施例中，重组宿主细胞是光合宿主细胞(例如光合微生物)。
在某些实施例中，重组宿主细胞进一步包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的核苷酸序列或与所述核苷酸序列中编码形成醇的酰基-ACP还原酶的功能性片段的片段具有至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列。在某些实施例中，编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的核苷酸序列。在某些实施例中，核酸序列源自海洋细菌，例如海杆菌属或何氏菌。在一些实施例中，重组宿主细胞表达与包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的氨基酸序列的多肽或与所述多肽的功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的形成醇的酰基-ACP还原酶。在某些实施例中，形成醇的酰基-ACP还原酶包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10的多肽或基本上由其组成。在一些实施例中，重组宿主细胞包含包括可操作连接到启动子的编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列的载体。在某些实施例中，启动子可调节。在具体实施例中，启动子可诱导。载体可为包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列的相同载体，或其可为单独载体。可操作连接到编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列的启动子可为可操作连接到编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列的相同启动子，或其可为单独启动子。在一些实施例中，重组宿主细胞是光合宿主细胞(例如光合微生物)。
在一些实施例中，重组宿主细胞包含编码一种以上蜡酯合酶的核酸序列。在某些实施例中，包含编码一种以上酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列的重组宿主细胞。在某些实施例中，重组宿主细胞以任一组合包含编码与SEQ ID NO：19的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列；编码与SEQ ID NO：21的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列；与编码SEQ ID NO：23的酰基-ACP蜡酯合酶的核苷酸序列或其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的核酸序列；编码与SEQ ID NO：25的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列；编码与编码SEQ ID NO：27的酰基-ACP蜡酯合酶的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列；编码与SEQ ID NO：29的氨基酸序列或其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列；编码与SEQ ID NO：29的氨基酸序列或与其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列；编码与SEQ ID NO：33的氨基酸序列或与其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列；编码与SEQ ID NO：35的氨基酸序列或与其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列；编码与SEQ ID NO：37的氨基酸序列或与其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列；编码与SEQ ID NO：39的氨基酸序列或与其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列；编码与SEQ ID NO：41的氨基酸序列或与其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列；和/或编码与SEQ ID NO：43的氨基酸序列或与其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的酰基-ACP蜡酯合酶的核酸序列。
在一些实施例中，重组宿主细胞包含编码一种以上形成醇的还原酶的核酸序列。在某些实施例中，重组宿主细胞包含编码一种以上形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列。在某些实施例中，重组宿主细胞以任一组合包含编码与SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列；编码与SEQ ID NO：4的氨基酸序列或与其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列；编码与SEQ ID NO：6的氨基酸序列或与其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列；编码与SEQ IDNO：8的氨基酸序列或与其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列；和/或编码与SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与其功能性片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列。
在一些实施例中，重组宿主细胞是光合宿主细胞，且编码酰基-ACP蜡酯合酶和/或形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列经密码子优化以供在所述光合宿主细胞中表达。
在一些实施例中，重组宿主细胞表达微生物(例如，原核)的形成醇的酰基-ACP还原酶和微生物(例如，原核)的酰基-ACP蜡酯合酶。
在一些实施例中，重组宿主细胞表达至少一种形成醇的酰基-ACP还原酶和至少一种源自相同属(例如海杆菌属或何氏菌)物种的酰基-ACP蜡酯合酶。
在一些实施例中，表达酰基-ACP蜡酯合酶的重组宿主细胞的脂肪酸酯的量大于不表达酰基-ACP蜡酯合酶的对照宿主细胞。在一些实施例中，表达酰基-ACP蜡酯合酶的重组宿主细胞的培养物产生的脂肪酸酯的量比不表达酰基-ACP蜡酯合酶的对照宿主细胞产生的蜡酯的量大至少约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％或1000％。
在一些实施例中，表达酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶的重组宿主细胞产生的蜡酯的量大于不表达酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶的对照宿主细胞。在一些实施例中，表达酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶的重组宿主细胞的培养物产生的蜡酯的量比不表达酰基-ACP蜡酯合酶和形成醇的酰基-ACP还原酶的对照宿主细胞产生的蜡酯的量大至少约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％或1000％。
在某些实施例中，表达酰基-ACP蜡酯合酶和任选地形成醇的酰基-ACP还原酶的重组宿主细胞表达至少一种在蜡酯生物合成路径中起作用的其它重组或外源基因，或过表达另一内源基因。所述另一基因可由与编码酰基-ACP蜡酯合酶的核酸分子和/或编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸分子相同的核酸分子编码，或所述另一基因可由单独核酸分子或由同一核酸分子编码。如果两种或更多种基因由同一核酸分子编码(例如，在同一表达载体上)，那么每一基因的表达可任选地独立地由相同或不同启动子和/或增强子调节。在某些实施例中，另一基因可提高蜡酯产生的速率和/或水平。另外和/或或者，另一基因可(例如)提高蜡酯前体(例如酰基-ACP和脂肪醇)的浓度，降低酰基-ACP、脂肪醇或蜡酯转化为对细胞有毒的其它产物(例如其它脂肪酸衍生物，或脂肪醇或蜡酯裂解产物)或低级脂肪醇和/或蜡酯的量。在某些实施例中，由另一基因编码的多肽选自(例如)以下中的一或多种酶：脂肪酸合酶复合体(例如，β-酮酰基-ACP合酶、3-酮酰基-ACP还原酶、β-羟酰基-ACP脱水酶、烯酰基-ACP还原酶等)、乙酰基-CoA羧化酶、丙二酰基-CoA:ACP转酰酶、酰基载体蛋白或酰基-ACP合成酶。另外或或者，表达形成醇的酰基-ACP还原酶的重组宿主细胞可表达核酮糖1，5-二磷酸羧化酶和/或藻胆蛋白(例如，藻青蛋白)。
在某些实施例中，重组宿主细胞不经改造以表达外源酰基-CoA，例如不包括编码酰基-CoA合成酶的外源基因。在某些实施例中，重组宿主细胞不内源性产生酰基-CoA。在其它实施例中，重组宿主细胞内源性产生酰基-CoA但经改造以减弱或消除酰基-CoA产生。例如，如果重组宿主细胞是大肠杆菌或另一细菌，那么宿主细胞可经改造以减弱或消除fadD和/或fadK酰基-CoA合成酶基因或其同源物的表达。此外，另外或或者，重组宿主细胞可具有编码酰基-CoA合成酶的突变基因，从而使得重组宿主产生具有降低活性或无活性的酰基-CoA合成酶。例如，在一些情况下，酰基-CoA表达或活性的降低或消除可通过下调利用酰基-CoA的脂肪酸降解路径来改良蜡酯产率。在其它实施例中，重组宿主细胞内源性产生酰基-CoA并通过酰基-CoA依赖性和非酰基-CoA依赖性路径二者生成蜡酯。
在某些实施例中，重组宿主细胞不包括酰基-ACP硫酯酶和酰基-CoA硫酯酶中的任一者的外源基因。在某些实施例中，重组宿主细胞不表达(例如)酰基-ACP硫酯酶或酰基-CoA硫酯酶。宿主细胞可为缺少酰基-ACP硫酯酶和酰基-CoA硫酯酶中的一者或二者的内源基因的细胞。宿主细胞可具有减弱表达的编码酰基-ACP硫酯酶和酰基-CoA硫酯酶中的一者或二者的内源基因。
在某些实施例中，重组宿主细胞不表达酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA硫酯酶或酰基-CoA合成酶中的任一者。例如，宿主可缺少酰基-ACP硫酯酶或酰基-CoA硫酯酶中任一者的内源基因，和/或宿主可具有减弱表达的酰基-ACP硫酯酶或酰基-CoA硫酯酶中任一者的基因。另外，宿主细胞可缺少酰基-CoA合成酶的内源基因或可具有减弱表达的编码酰基-CoA合成酶的内源基因。例如，宿主细胞可为缺少酰基-CoA硫酯酶、酰基-CoA硫酯酶和酰基-CoA合成酶的内源基因的微生物(例如蓝细菌)。
在某些实施例中，重组宿主细胞不表达形成醛的还原酶(例如，酰基-CoA还原酶、形成醛的酰基-ACP还原酶或羧酸还原酶)。在具体实施例中，重组宿主细胞不表达非天然(例如外源)形成醛的还原酶。
在一些实施例中，重组宿主细胞可经改造以表达外源跨膜转运蛋白以促进蜡酯分泌。例如，重组宿主细胞可包括编码ATP结合盒(ABC)转运蛋白或RND泵的非天然基因。在一些实施例中，转运蛋白的序列与拟南芥属基因CER5、WBC11、AtMRPS、AmiS2和AtPGP1或来自酵母菌属、果蝇属、分枝杆菌或哺乳动物物种的脂肪酸转运蛋白(FATP)基因编码的转运蛋白至少80％一致。
上述重组宿主细胞可用于本文所述产生蜡酯的任一方法中。
系统
本发明还提供用于产生脂肪酸酯的非酰基-CoA依赖性系统。在一些实施例中，所述系统包含重组宿主细胞，其包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列和编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列。在某些实施例中，重组宿主细胞不包括编码酰基-CoA合成酶的外源基因。在某些实施例中，重组宿主细胞不产生酰基-CoA。重组宿主细胞可为(例如)本文所述重组宿主细胞中的任一者且可包含本文所述的核酸分子和/或载体中的任一者。在一些实施例中，重组宿主细胞是重组光合微生物且是在不包括大量还原碳源的培养基中培养。在一些实施例中，在至少一部分产生期中使重组光合微生物暴露于光。
重组光合微生物可以混合营养方式使用光和还原碳源二者生长，或可光养培养。在光养培养时，光合微生物可有利地使用光作为能源。光合微生物可使用“无机”或非还原碳源来合成生物分子。通常，“非还原碳源”可呈以下形式：CO2(二氧化碳)、碳酸、碳酸氢盐、碳酸盐、酸式碳酸盐或诸如此类或其组合，其既不能进一步氧化用于可持续能量，也不能被宿主细胞用作还原力来源。在具体实施例中，无机碳实质上是培养基中存在的唯一碳源。在这些实施例中，如果在光养生长的宿主细胞的培养基中存在有机(还原)碳源或化合物，那么其一般无法被细胞吸收和/或代谢用于能量或用作合成生物分子的碳源，和/或以不足以为细胞培养物的生长或有机分子的产生提供可持续能量的量存在。
可根据本发明方法用作宿主细胞的微生物可在世界各地的不同位置和环境中发现。不受理论限制，人们观察到，可能由于其与其它物种隔离和/或其进化趋异，用于脂质和/或烃成份的最佳生长和生成的具体生长培养基可变。在一些情形中，微生物的某些株系可能由于一些抑制性组份的存在或微生物的具体株系需要的一些必需营养要求不存在而无法在具体生长培养基中生长。
一般可从多种来源获得固体和液体生长培养基，也可从其获得适用于多种宿主细胞类型的具体培养基的制备说明书。例如，各种淡水和盐水培养基为业内所熟知，例如在巴尔桑蒂(Barsanti)(2005)藻类：解剖学、生物化学和生物技术(Algae：Anatomy，Biochemistry&Biotechnology)，CRC出版社中关于用于培养藻类的培养基和方法所述的培养基。
培养方法可包括诱导本文所述的具体基因表达，用于产生脂肪酸酯，例如蜡酯(例如，酰基-ACP蜡酯合酶基因和任选地形成醇的酰基-ACP还原酶基因)，和/或用于调节微生物中的代谢路径。诱导表达可包括向培养物中添加营养素或化合物，从培养基移除一或多种组份，增加或减少光和/或提高或降低温度，和/或其它促进目标基因表达的处理。所述处理可主要取决于可操作连接到目标基因的启动子的性质。
在本发明的一些实施例中，可在生物反应器中培养重组宿主细胞。生物反应器可为在异养生长和繁殖方法中的使用提供多种优点。为产生用于食物中的生物质，优选地使微生物在液体中(例如在悬浮培养物中)大量发酵。诸如钢发酵罐等生物反应器可适应极大培养体积(可在本发明各个实施例中使用40,000升和更大容量的生物反应器)。生物反应器通常还可容许控制一或多个培养条件，例如温度、pH、氧张力、二氧化碳水平和诸如此类以及其组合。生物反应器通常可使用(例如)附接到管道的端口来配置，以容许气态组份(例如CO2、富含CO2的空气、氧和/或氮)接触(例如，鼓泡通过)液体培养物。其它培养参数(例如培养基的pH、痕量元素和/或营养素的身份和/或浓度、其它培养基成份的身份和/或浓度或诸如此类或其组合)通常可使用生物反应器更容易地处理。
在一些实施例中，细胞(例如，光合微生物)可在生物反应器中培养，所述生物反应器配备有天然或人工光源(“光生物反应器”)，和/或可具有一或多个对光(包括日光)足够透明的壁以使得能进行、促进和/或维持可接受的微生物生长。对于蜡酯的产生，重组宿主细胞可另外或或者在摇瓶、试管、小瓶、微量滴定盘、皮氏培养皿(petri dish)或诸如此类或其组合中培养。
遗传改造的光合微生物也可在(例如)池塘、渠道、沟渠、水沟、沟槽或诸如此类或其组合中生长。如使用标准生物反应器时，可将包括(但不限于)空气、富含CO2的空气、烟道气等或其组合的无机碳源供应到培养物。在供应烟道气和/或其它除了CO2以外可含有CO的无机碳源时，可能需要对所述来源进行预处理以使得引入(光)生物反应器中的CO水平不会对微生物的生长和/或存活构成危险和/或致死剂量。在一些实施例中，碳源是非还原碳源，例如(例如(但不限于)CO2、碳酸氢盐、碳酸盐和诸如此类)。在一些实施例中，碳源不提供脂肪酸酯或蜡酯产生中的能源。
在一些实施例中，本发明系统产生的脂肪酸酯或蜡酯被重组宿主细胞分泌到培养基中。另外或或者，可从重组宿主细胞萃取脂肪酸酯或蜡酯。在一些实施例中，使用本文所述方法分离脂肪酸酯或蜡酯。
在一些实施例中，本发明系统通过培养本文所述的重组宿主细胞导致在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天的培养期中产生至少0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、11mg/L、12mg/L、13mg/L、14mg/L、15mg/L、16mg/L、17mg/L、18mg/L、19mg/L、20mg/L、21mg/L、22mg/L、23mg/L、24mg/L、25mg/L、26mg/L、27mg/L、28mg/L、29mg/L或30mg/L脂肪酸酯或蜡酯。
使用本文所提供方法产生的脂肪酸酯可具有6到14个碳、例如12到18个碳的B链。使用本文所提供方法产生的蜡酯可具有6到14个碳、例如12到18个碳的A链和6到14个碳、例如12到18个碳的B链。
如本文所述的本发明系统可使用多种核酸分子、载体、多肽和/或宿主细胞。在一些实施例中，所述系统使用一或多种本文所述的核酸分子、载体、多肽和/或宿主细胞。此外，所述系统可用于执行本文所述的任一产生蜡酯的方法。
应理解，本发明的揭示内容扩展到根据本发明各个方面的方法、产物和系统，其包含一或多种本文通过参考本发明的某些实施例讨论的特征与一或多种本文通过参考本发明的某些其它实施例讨论的其它特征的组合。
另外或或者，本发明可包括以下实施例中的一或多个。
实施例
实施例1：一种经遗传改造以供产生脂肪酸酯的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含编码在宿主细胞中表达后能以非酰基-CoA依赖性路径产生脂肪酸酯的蜡酯合酶的非天然核酸序列，其中所述重组宿主细胞不包括编码酰基-ACP硫酯酶的外源核酸分子、编码酰基-CoA硫酯酶的外源核酸分子和/或编码酰基-CoA合成酶的外源核酸分子，且任选地不包括上文所列示外源核酸分子中的任一者。
实施例2：根据实施例1所述的重组宿主细胞，其中所述蜡酯合酶能使用酰基-ACP作为底物，另外其中所述蜡酯合酶包含与SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽或与SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽的功能性片段具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的多肽。
实施例3：一种经遗传改造以供产生蜡酯的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含：
编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列，任选地其中所述酰基-ACP蜡酯合酶与SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43的多肽或与SEQID NO：19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41或43中的任一者编码的多肽的功能性片段具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性，和
编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列，任选地其中所述形成醇的酰基-ACP还原酶包含与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的多肽或与SEQ ID NO：2、4、6、8或10中的任一者编码的多肽的功能性片段具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的多肽；
其中所述重组宿主细胞不包括编码酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA硫酯酶和/或酰基-CoA合成酶的外源核酸分子，且任选地其中所述重组宿主细胞不包括编码酰基-ACP硫酯酶的外源核酸分子、编码酰基-CoA硫酯酶的外源核酸分子和编码酰基-CoA合成酶的外源核酸分子。
实施例4：根据前述实施例中的任一实施例所述的重组宿主细胞，其中满足以下条件中的任一者：
(a)所述宿主细胞缺少编码酰基-ACP硫酯酶的外源核酸序列，所述宿主细胞缺少编码酰基-CoA硫酯酶的外源核酸序列，且所述宿主细胞缺少编码酰基-CoA合成酶的外源核酸序列；
(b)所述宿主细胞具有减弱表达的编码酰基-ACP硫酯酶的内源核酸序列、编码酰基-CoA硫酯酶的内源核酸序列和编码酰基-CoA合成酶的内源核酸序列中的一或多者，或在所述内源核酸序列中具有使所编码酶的活性降低的突变；
(c)所述宿主细胞不表达酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA硫酯酶和酰基-CoA合成酶中的一或多者；
(d)所述宿主细胞不表达酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA硫酯酶和酰基-CoA合成酶中的任一者；
(e)所述宿主细胞不包含编码酰基-ACP硫酯酶的内源核酸序列、编码酰基-CoA硫酯酶的内源核酸序列或编码酰基-CoA合成酶的内源核酸序列；
(f)所述宿主细胞不包含编码任一酰基-ACP硫酯酶的内源核酸序列、编码酰基-CoA硫酯酶的内源核酸序列和编码酰基-CoA合成酶的内源核酸序列。任选地，满足条件(a)和(b)。任选地，满足条件(a)和(c)。任选地，满足条件(a)和(d)。任选地，满足条件(a)和(e)。任选地，满足条件(a)和(f)。任选地，满足条件(b)和(c)。任选地，满足条件(b)和(d)。任选地，满足条件(b)和(e)。任选地，满足条件(b)和(f)。任选地，满足条件(c)和(d)。任选地，满足条件(c)和(e)。任选地，满足条件(c)和(f)。任选地，满足条件(d)和(e)。任选地，满足条件(d)和(f)。任选地，满足条件(e)和(f)。任选地，满足条件(a)、(b)和(c)。任选地，满足条件(a)、(b)和(d)。任选地，满足条件(a)、(b)和(e)。任选地，满足条件(a)、(b)和(f)。任选地，满足条件(a)、(c)和(d)。任选地，满足条件(a)、(c)和(e)。任选地，满足条件(a)、(c)和(f)。任选地，满足条件(a)、(d)和(e)。任选地，满足条件(a)、(d)和(f)。任选地，满足条件(a)、(e)和(f)。任选地，满足条件(b)、(c)和(d)。任选地，满足条件(b)、(c)和(e)。任选地，满足条件(b)、(c)和(f)。任选地，满足条件(b)、(d)和(e)。任选地，满足条件(b)、(d)和(f)。任选地，满足条件(b)、(e)和(f)。任选地，满足条件(c)、(d)和(e)。任选地，满足条件(c)、(d)和(f)。任选地，满足条件(c)、(e)和(f)。任选地，满足条件(d)、(e)和(f)。任选地，满足条件(a)、(b)、(c)和(d)。任选地，满足条件(a)、(b)、(c)和(e)。任选地，满足条件(a)、(b)、(c)和(f)。任选地，满足条件(a)、(b)、(d)和(e)。任选地，满足条件(a)、(b)、(d)和(f)。任选地，满足条件(a)、(b)、(e)和(f)。任选地，满足条件(a)、(c)、(d)和(e)。任选地，满足条件(a)、(c)、(d)和(f)。任选地，满足条件(a)、(c)、(e)和(f)。任选地，满足条件(a)、(d)、(e)和(f)。任选地，满足条件(b)、(c)、(d)和(e)。任选地，满足条件(b)、(c)、(d)和(f)。任选地，满足条件(b)、(c)、(e)和(f)。任选地，满足条件(b)、(d)、(e)和(f)。任选地，满足条件(b)、(d)、(e)和(f)。任选地，满足条件(a)、(b)、(c)、(d)和(e)。任选地，满足条件(a)、(b)、(c)、(d)和(f)。任选地，满足条件(a)、(b)、(c)、(e)和(f)。任选地，满足条件(a)、(b)、(d)、(e)和(f)。任选地，满足条件(a)、(b)、(d)、(e)和(f)。任选地，满足条件(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)。
实施例5：根据前述实施例中的任一实施例所述的重组宿主细胞，其中满足以下条件中的任一者：
(a)所述蜡酯合酶和/或所述形成醇的酰基-ACP还原酶(如果存在)是重组宿主细胞的异源酶，任选地其中所述编码蜡酯合酶的核酸序列和/或所述编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列(如果存在)经密码子优化以供在所述宿主细胞中表达
(b)将所述编码蜡酯合酶的核酸序列和/或所述编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列整合到所述重组宿主细胞的基因组中
(c)所述编码蜡酯合酶的核酸序列和/或所述编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列存在于所述重组宿主细胞中的一或多个载体中。任选地，满足条件(a)和(b)。任选地，满足条件(a)和(c)。任选地，满足条件(b)和(c)。任选地，满足条件(a)、(b)和(c)。
实施例6：根据前述实施例中的任一实施例所述的重组宿主细胞，其中所述编码蜡酯合酶的核酸序列和/或所述编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列(如果存在)可操作连接到启动子和/或增强子，其中所述启动子和/或增强子可任选地为宿主细胞的异源启动子和/或增强子，且其中所述启动子和/或增强子可任选地可调节，且任选地可诱导。
实施例7：根据前述实施例中的任一实施例所述的重组宿主细胞，其中所述蜡酯合酶和/或所述形成醇的酰基-ACP还原酶来自微生物或原核物种，任选地其中所述蜡酯合酶和所述酰基-ACP还原酶中的一者或二者源自海杆菌属、湖沉积杆菌、食烷菌、何氏菌、变形菌纲或分枝杆菌属。
实施例8：根据实施例3到7中任一实施例所述的重组宿主细胞，其中所述编码蜡酯合酶的非天然核酸序列和所述编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列二者存在于所述宿主细胞中且二者源自同一属，所述属可任选地为海杆菌属或何氏菌属。
实施例9：根据前述实施例中的任一实施例所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含编码外源形成脂肪醛的酰基-ACP还原酶的核酸序列和/或编码内源形成脂肪醛的酰基-ACP还原酶的核酸序列，其中所述核酸序列可被可操作连接到启动子，其中所述启动子和/或增强子可任选地是所述宿主细胞的异源启动子和/或增强子，且其中所述启动子和/或增强子(或任选地二者)可任选地可调节，且任选地可诱导。
实施例10：根据前述实施例中的任一实施例所述的重组宿主细胞，其中在所述重组宿主细胞中上调酰基-ACP产生。
实施例11：根据前述实施例中的任一实施例所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞表达或产生至少一种外源多肽，或过表达或过产生至少一种内源多肽，所述酶选自β-酮酰基合成酶；乙酰基-CoA羧化酶；丙二酰CoA:ACP转酰酶；酰基-ACP合成酶；核酮糖1，5-二磷酸羧化酶；藻胆蛋白；酰基载体蛋白；和跨膜转运蛋白。
实施例12：根据前述实施例中的任一实施例所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞具有减弱表达的酰基-ACP合酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、乙醛CoA脱氢酶、丙酮酸脱氢酶，或乙酸盐激酶。
实施例13：根据前述实施例中的任一实施例所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞是微生物宿主细胞，例如真菌、酵母、不等鞭毛菌、微藻、蓝细菌或真细菌。
实施例14：根据实施例13所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞是以下物种：酵母菌属、裂殖酵母属、假丝酵母属、子囊菌酵母属、红酵母属、罗氏酵母属、曲霉菌属、毕赤酵母属、裂殖壶菌、破囊壶菌目、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、棒杆菌属、假单胞菌属、节杆菌属、诺卡尔菌属、红球菌属或葡萄糖菌。
实施例15：根据实施例1到12中任一实施例所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞是光合宿主细胞，任选地其中所述重组宿主细胞是(a)光合微生物；(b)蓝细菌；(c)阿格门氏藻、鱼腥藻属、项圈藻属、倒囊藻属、丝囊藻属、节螺藻属、星球藻属、博氏藻属、眉藻属、管孢藻属、拟绿胶蓝细菌属、拟色球藻属、色球藻属、发毛针藻属、双色藻属、蓝囊胞菌属、蓝螺菌属、蓝杆藻属、柱胞藻属、筒孢藻属、蓝纤维藻属、小皮果蓝细菌属、侧生藻属、费氏藻属、盖特勒氏蓝细菌属、吉特勒氏线状蓝细菌属、胶菌藻、粘球藻属、粘杆藻属、盐螺旋藻属、英加藻属、瘦鞘丝藻属、湖丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、微囊藻属、粘囊藻属、节球藻属、念珠藻属、拟念珠藻属、颤藻属、席藻属、浮丝藻属、宽球藻属、原绿球藻属、原绿菌属、原绿发菌属、假鱼腥藻属、胶须藻属、裂须藻属、双歧藻属、螺旋藻属、斯塔尼尔蓝菌属、斯塔尔氏蓝菌属、真枝藻属、束藻属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻、单岐藻属、束毛藻属、常丝藻或异球藻属；(d)真核微藻；或(e)曲壳藻属、茧形藻属、双眉藻属、纤维藻属、星胞藻属、金藻、保罗氏藻、葡萄藻属、微细绿藻、角毛藻属、四鞭藻属、衣藻属、绿球藻属、绿梭藻属、小球藻属、蓝隐藻属、金球藻属、球钙板藻属、隐甲藻属、隐藻属、小环藻属、杜氏藻属、捕圆藻属、球石藻属、独球藻属、厄诺氏藻属、眼虫属、被刺藻属、脆杆藻属、丽丝藻属、红球藻属、嗜盐古菌、膜胞藻属、等鞭金藻、鳞孔藻属、微星藻属、富油微藻、微绿球藻、微拟球藻、舟形藻属、新绿球藻、肾鞭藻属、肾藻属、菱形藻属、棕鞭藻属、鞘藻属、卵囊藻属、蚝球藻属、巴夫藻、拟小球藻属、杜氏亚属盐藻、褐指藻属、噬菌体属、匹克氏藻属、扁藻属、颗石藻，、肋球藻属、原壁菌属、伪小球藻属、伪新绿球藻、塔孢藻、桑椹藻属、栅藻属、骨条藻属、水绵属、裂丝藻属、四片藻属、海链藻属、小球藻微藻或团藻属。
实施例16：一种产生脂肪酸酯的方法，其包含以下步骤：在适宜培养基中培养根据前述实施例中任一实施例所述的重组宿主细胞，和容许表达编码蜡酯合酶的非天然核酸序列和(如果存在)编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列，其中所述表达导致产生所述脂肪酯。
实施例17：根据实施例16所述的方法，其中所述适宜培养基包含至少一种短链醇或至少一种脂肪醇。
实施例18：根据实施例16所述的方法，其中所述重组宿主细胞包含编码蜡合酶的非天然核酸序列和编码酰基-ACP还原酶形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列，其中所述适宜培养基不包含短链醇或脂肪醇。
实施例19：根据实施例18所述的方法，其中所述蜡酯包含从脂肪醇衍生的A链和从酰基-ACP衍生的B链二者，所述二者的链长度为C8到C24，任选地链长度为C12到C18。
实施例20根据实施例16到19中任一实施例所述的方法，其中所述重组宿主细胞是光合宿主细胞、任选地光合微生物，其中所述适宜培养基不包括大量还原碳源，另外其中在至少一部分培养期中使所述重组光合宿主细胞暴露于光。
实施例21：根据前述实施例中任一实施例所述的微生物或方法，其中所述重组宿主细胞产生相对于缺少所述编码蜡酯合酶的核酸序列的对照宿主细胞提高水平的脂肪酸酯，或产生相对于缺少所述编码蜡酯合酶的核酸序列和所述编码酰基-ACP还原酶的序列(如果存在)的对照宿主细胞提高水平的所述蜡酯，其中所述重组宿主细胞任选地产生相对于所述对照宿主细胞多至少50％或100％的所述蜡酯，且其中所述重组宿主细胞任选地产生至少1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL或10mg/mL蜡酯。
实施例22：根据实施例16到21中任一实施例所述的方法，其中所述宿主细胞分泌所产生脂肪酸酯或蜡酯的至少一部分。
实施例23：根据实施例16到22中任一实施例所述的方法，其进一步包含分离所述所产生脂肪酸酯或蜡酯的步骤。
实施例24：一种包含根据实施例23所述的方法分离的蜡酯的组合物，其中所述蜡酯包含从脂肪醇衍生的A链和从酰基-ACP衍生的B链二者，所述二者的链长度为C8到C24，或任选地为C12到C18。
实施例25：一种系统，其执行根据实施例16到24中任一实施例所述的方法。
为更好地理解本发明，阐述以下实例。这些实例仅用于阐释性目的且不应视为以任何方式限制本发明的范围。
实例
实例1：用于在集胞藻PCC6803中表达形成醇的酰基-ACP还原酶的构筑物
通过DNA2.0(门洛帕克(Menlo Park)，加利福尼亚州)化学合成具有密码子优化的Maqu_2220序列(SEQ ID NO：11)；编码已知使用酰基-CoA作为底物的还原酶的水油海杆菌基因的序列Maqu_2507(SEQ ID NO：12)；或野生型Hch_05075基因序列(SEQ IDNO：3)的核酸分子。将Maqu_2220基因(野生型(SEQ ID NO：1)和密码子优化的(SEQ IDNO：11)形式)、Maqu_2507还原酶基因(SEQ ID NO：12)和Hch_05075基因(SEQ ID NO：3)个别地克隆到pSGE05141“RS1”整合载体中(图12)。不添加启动子将基因克隆在“RS1-上”(SEQ ID NO：14)与“RS1-下”(SEQ ID NO：15)集胞藻属基因组DNA序列之间。跨越序列2298515到2300500(基因组序列登录号AP012205.1；GI：339272262)且用于同源重组的集胞藻属基因组的RS1着陆区(landing region)包括氧化还原酶家族的slr0338基因(NAD结合罗斯曼(Rossman)折叠；NCBI蛋白质登录号BAA10046；gi：1001423)且位于slr0168(假设性开放读码框；NCBI蛋白质登录号BAA10047；gi：1001424)的近端。“RS1-上”序列包括slr0338基因上游序列的约830个核苷酸，以及slr0338基因5’端的约158个核苷酸。这个序列下游的基因的克隆(如图12中所绘示)可容许来自“RS1-上”基因组序列的基因表达序列介导还原酶转基因的转录。
为将Maqu_2220野生型和密码子优化的基因、Maqu_2507基因和济州何氏菌Hch_05075基因引入蓝细菌中，在BG-11培养基中将集胞藻PCC6803细胞培养到OD(730nm)为约0.7-0.9。使约10mL培养物以约2000g旋转下降15分钟，然后将细胞沉淀再悬浮于1mL新鲜BG-11培养基中。用约100ng整合载体对300μL细胞的等份试样进行转型。将细胞在光(80μE)下培育约6小时，然后铺到小孔(Minipore)过滤器上并置于不含抗生素的BG-11琼脂平板顶部上。将平板在约30℃和约80μE光下培育约24小时。然后将过滤器转移到含有20μg/mL卡那霉素的新鲜BG-111.5％琼脂平板上并培养7天。选取集胞藻PCC6803菌落并涂斑到新琼脂平板上。
表2：用于蓝细菌的ATCC616培养基BG-11
实例2：表达形成醇的酰基-ACP还原酶的集胞藻PCC 6803株系的脂肪醇产生
使经Maqu_2220野生型基因、Maqu_2220密码子优化的基因或密码子优化的基因或Maqu_2507基因转型的集胞藻PCC6803的培养物生长用于测试脂肪醇产生。将每一克隆的三个不同菌落板块接种到含有10mL BG-11液体培养基和50μg/ml卡那霉素的20mL玻璃闪烁瓶中。不包括大量还原碳源的BG-11培养基支持集胞藻属的光学自养生长。用滤绵带覆盖培养物。将闪烁瓶在约30℃下以约5％环境CO2和约200rpm连续振荡在约70μE光下培育7天。然后将5mL的每种培养物以约5000rpm旋转下降，并再悬浮于0.4mL水中，然后通过己烷/硫酸溶剂系统萃取以萃取中性脂质。
实例3：表达形成醇的酰基-ACP还原酶的集胞藻PCC6803的气相色谱
通过气相色谱分析如上文所述生长的集胞藻PCC6803株系的脂肪醇产生。
使用菌种分配器和2.0mL离心管将0.5mL212-300μm酸洗玻璃珠添加到样品。随后，添加50μL50％H2SO4和100μL5M NaCl。将样品置于2010型SPEX GenoGrinder中并以1000rpm珠磨5min以溶解细胞。在珠磨后，添加2mL己烷，给小瓶加盖，并以1000rpm重复珠磨5min。然后将样品在多管涡旋器上以1000rpm涡旋30min，然后以2500rpm涡旋30sec。之后，将样品以2000rpm离心4min。将0.5mL己烷(上)层转移到2.0mL GC小瓶中，且添加50μL内标物(1mg/mL1-十五醇，在CH2Cl2中)以获得100μg/mL的内标物终浓度。然后将小瓶涡旋并通过GC/MS-SCAN/SIM加以分析。GC运行条件如下：1.4mL/min H2以100℃炉温保持0.5min，然后以20℃/min斜升到270℃并保持1min。将溶剂延迟设定为4.3min。在设定为280℃的入口上进行1μL注射，所述入口利用3∶1分流且含有具有玻璃棉的去活化的单一鹅颈管衬垫。GC柱是安捷伦(Agilent)HP-5MS，30m×0.25mm×0.25μm。质谱仪的扫描范围设定为35-275的m/z，所监测SIM离子为55.0和41.0，且使用10ms采样时间。通过2-200μg/mL的5点式校准曲线对分析物进行量化。图13A显示经Maqu_2507酰基-CoA还原酶基因转型的集胞藻属的萃取的GC迹线，其显示无脂肪醇峰，且图13B显示表达密码子优化的Maqu_2220基因(SEQ ID NO：11)的转型体的GC迹线，其显示C16和C18脂肪醇的峰。
图14显示，缺少酰基-CoA的集胞藻属中野生型(5074个分离物)和密码子优化的(5075个分离物)Maqu_2220DNA二者的表达都导致产生C16和C18醇。与之相比，Maqu_2507DNA(5076个分离物)的表达不导致产生任何可检测的醇，表明对照Maqu_2507还原酶(SEQ ID NO：13)在不产生酰基-CoA的物种集胞藻属的7天的培养中不产生可检测水平的脂肪醇。
实例4：表达形成醇的酰基-ACP还原酶的集胞藻PCC6803株系中的脂肪醇产生
在1％CO2存在下在约80μE光下振荡的125mL玻璃烧瓶中，使包含Hch_05075基因的集胞藻PCC6803细胞在25mL BG-11培养基中生长10天。使整个培养物旋转下降并再悬浮于0.4mL水中，然后通过己烷/硫酸溶剂系统萃取以萃取中性脂质。作为对照，通过相同方法培养并萃取缺少还原酶基因构筑物的集胞藻PCC6803株系。
图15展示表达Hch_05075还原酶基因(“何氏菌FAR”；SEQ ID NO：3)的集胞藻PCC6803的脂肪醇的产生，且在未转型宿主株系(“Wt6803”)中未检测到产生脂肪醇。
实例5：表达形成醇的酰基-ACP还原酶和酰基-ACP蜡酯合酶的集胞藻PCC6803
中的蜡酯产生
为测量表达形成脂肪醇的酰基-ACP还原酶和酰基-ACP蜡酯合酶的光合宿主细胞中的非酰基-CoA依赖性蜡酯产生，用具有以下的序列的载体对集胞藻PCC6803进行转型：(1)Maqu_2220和WS1(提供二基因构筑物的核酸序列作为SEQ ID NO：46)，和(2)Maqu_2220和矮牵牛(Petunia x hybrida)酰基转移酶(“牵牛花WS”；基因库登录号AAZ08051.1；提供二基因构筑物的核酸序列作为SEQ ID NO：47)。已显示牵牛花WS可在经改造除了牵牛花WS以外还表达酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA合成酶和形成醇的还原酶的集胞藻属中产生蜡酯，如2011年9月27日申请的标题为“形成脂肪醇的酰基-ACP还原酶”的共同受让的美国临时专利申请案61/539,640中所显示。图16提供二基因载体图，其中WS1是蜡酯合酶基因。在每一构筑物中，来自trcE启动子(SEQ ID NO：48)的核糖体结合位点定位于酰基-ACP还原酶基因的5’和蜡酯合酶基因的5’处(在图16中标为“rbs”)。如同在实例1中，将二基因操纵子克隆到没有启动子的载体中；将操纵子插入其中的基因组序列可能包括负责操纵子表达的启动子。用于同源重组的着陆区是集胞藻属基因组“RS1”区，其包括氧化还原酶家族的基因slr0338(NAD结合罗斯曼折叠)和slr0168(假设性开放读码框)。
对来自从鱼塘分离的海杆菌属野生型株系的Maqu_2220的gDNA进行PCR扩增，所述鱼塘在位于南加利福尼亚索尔顿湖北部的太平洋水场养殖场(Pacific Aquafarms)。蜡酯合酶和Maqu_2220都是通过DNA2.0合成并化学克隆到载体中。对在BG-11培养基中生长到OD(730nm)为约0.7-0.9的集胞藻PCC6803细胞执行转型。使约10mL集胞藻PCC6803培养物以约2000g旋转下降约15分钟。将所得细胞沉淀再悬浮于约1mL新鲜BG-11培养基中。然后用约100ng整合载体对约300μL细胞的等份试样进行转型。
将经转型细胞在光(约80μE)下培育约6小时。随后，将细胞铺到小孔过滤器上并置于不含抗生素的BG11琼脂平板顶部上。将平板在约30℃和约80μE光下培育约24小时。然后将过滤器转移到含有约10μg/mL卡那霉素的新鲜BG11琼脂平板上并生长约7天。
选取集胞藻PCC6803菌落(在含有约10μg/mL卡那霉素的约1.5％琼脂BG-11平板上生长)并分别接种到含有约1.5mL BG-11液体培养基和约10μg/ml卡那霉素的4mL玻璃闪烁瓶中。使用未转型集胞藻PCC6803(“6803wt”)作为对照。用滤绵带覆盖培养物以容许呼吸。将闪烁瓶与约5％CO2一起在约30℃和约200rpm连续振荡下在约80μE光下培养7天。在培养期过程中，培养物的体积通过蒸发减小到约1mL。
在培养期结束时，使培养物以约2000rpm旋转下降，倾析培养基并将0.4mL水添加回管中。然后将管涡旋，且使用玻璃吸量管将混合物添加到4mL玻璃小瓶中。向这个小瓶中添加0.5mL212-300μm酸洗玻璃珠、50μL50％H2SO4和100μL5M NaCl。将小瓶加盖并使用珠磨器(2010型SPEX GenoGrinder)溶解细胞。再添加2mL己烷，并重复珠磨，之后将样品在多管涡旋器上以1000rpm涡旋30min，然后以2500rpm涡旋30sec。之后，以2000rpm将样品离心4min。将0.5mL己烷(上)层转移到2.0mL GC小瓶中，并添加50μL内标物(1mg/mL6-酮胆甾烷醇，在甲苯中)以获得100μg/mL的最终内标物浓度。然后将小瓶涡旋并通过HPLC-ELSD(高效液相色谱-蒸发光散射检测器)加以分析。使用配备有二元泵和ES工业(ES Industries)Chormegasphere SI-60150mm×4.6mm，10μm孔柱的安捷伦1200系列HPLC和以下溶剂系统：洗脱液A：己烷；洗脱液B：己烷/异丙醇/乙酸乙酯/异丙醇中的10％甲酸，比率为80∶10∶10∶1。使用20μL注射，流速设定为2mL/min，柱室设定为40℃，且溶剂梯度以98％洗脱液A、2％洗脱液B开始，并经9分钟运行斜升到最高2％洗脱液A、98％洗脱液B。将ELSD设定为30℃，3.5巴N2，且使用为5的增益。通过1.5-100μg/mL的8点式校准曲线对分析物进行量化。
如图17中所示，具有Maqu_2220的WS1的表达导致产生脂肪醇和蜡酯(“5175(WS1)”)。与之相比，具有Maqu_2220的牵牛花WS的表达导致产生脂肪醇但不产生蜡酯(“5174(牵牛花WS)”)。未转型宿主株系不展现产生脂肪醇或蜡酯(“6803阴性对照”)。因为集胞藻PCC6803不产生酰基-CoA，这些数据显示，除烃海杆菌WS1蜡酯合酶而不是牵牛花蜡酯合酶使用酰基-ACP作为与脂肪醇形成蜡酯的缩合反应中的酰基-硫酯底物。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种经遗传改造以供从酰基-酰基载体蛋白ACP产生脂肪酸酯的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列和编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列，且另外其中所述重组宿主细胞不表达以下酶中的一者或一者以上：
a)外源酰基-ACP硫酯酶；
b)外源酰基-CoA硫酯酶；和
c)外源酰基-CoA合成酶。
2.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞不包括编码酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA硫酯酶或酰基-CoA合成酶中的任一者的外源核酸序列。
3.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞不内源性产生酰基-CoA。
4.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞经改造以减弱或消除酰基-CoA产生。
5.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述蜡酯合酶与选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQID NO：41和SEQ ID NO：43组成的群组的多肽或与所述多肽中任一者的功能性片段具有至少50％序列一致性。
6.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述蜡酯合酶包含与SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21的所述多肽或与所述多肽的功能性片段具有至少85％序列一致性的多肽。
7.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述形成醇的酰基-ACP还原酶与选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10组成的群组的多肽或与所述多肽中任一者的功能性片段具有至少50％序列一致性。
8.根据权利要求7所述的重组宿主细胞，其中所述形成醇的酰基-ACP还原酶包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或与所述多肽的功能性片段具有至少85％序列一致性的多肽。
9.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中将编码所述蜡酯合酶的所述核酸序列、编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列或编码所述蜡酯合酶的所述核酸序列和编码所述形成醇的酰基-ACP还原酶的所述核酸序列二者整合到所述重组宿主细胞的染色体中。
10.根据权利要求9所述的重组宿主细胞，其中将编码所述蜡酯合酶的所述核酸序列和编码所述形成醇的酰基-ACP还原酶的所述核酸序列可操作连接到相同启动子。
11.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是光合微生物。
12.根据权利要求11所述的重组宿主细胞，其中所述光合微生物是蓝细菌。
13.根据权利要求12所述的重组宿主细胞，其中所述光合微生物是阿格门氏藻、鱼腥藻属、项圈藻属、倒囊藻属、丝囊藻属、节螺藻属、星球藻属、博氏藻属、眉藻属、管孢藻属、拟绿胶蓝细菌属、拟色球藻属、色球藻属、发毛针藻属、蓝细菌、双色藻属、蓝囊胞菌属、蓝螺菌属、蓝杆藻属、柱胞藻属、筒孢藻属、蓝纤维藻属、小皮果蓝细菌属、侧生藻属、费氏藻属、盖特勒氏蓝细菌属、吉特勒氏线状蓝细菌属、胶菌藻、粘球藻属、粘杆藻属、盐螺旋藻属、英加藻属、瘦鞘丝藻属、湖丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、微囊藻属、粘囊藻属、节球藻属、念珠藻属、拟念珠藻属、颤藻属、席藻属、浮丝藻属、宽球藻属、原绿球藻属、原绿菌属、原绿发菌属、假鱼腥藻属、胶须藻属、裂须藻属、双歧藻属、螺旋藻属、斯塔尼尔蓝菌属、斯塔尔氏蓝菌属、真枝藻属、束藻属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻、单岐藻属、束毛藻属、常丝藻或异球藻属。
14.一种用于产生蜡酯的方法，其包含以下步骤：
a)在适宜培养基中培养根据权利要求1所述的重组宿主细胞；和
b)容许表达编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列和编码蜡酯合酶的非天然核酸序列，其中所述表达引起产生所述蜡酯。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述适宜培养基不包括醇。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述重组宿主细胞不内源性产生酰基-CoA。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述重组宿主细胞相对于缺少所述编码蜡酯合酶的核酸序列的对照宿主细胞产生提高水平的所述蜡酯。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述蜡酯包含至少一种蜡酯分子，其中从脂肪醇衍生的A链和从酰基-ACP衍生的B链二者的链长度为C8到C24。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述蜡酯包含至少一种蜡酯分子，其中所述A链和所述B链二者都是C12到C18。
20.根据权利要求14所述的方法，其中至少一部分所产生的蜡酯是由所述宿主细胞分泌。
21.根据权利要求14所述的方法，其中所述宿主细胞是光合微生物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述光合微生物是蓝细菌。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述蓝细菌是阿格门氏藻、鱼腥藻属、项圈藻属、倒囊藻属、丝囊藻属、节螺藻属、星球藻属、博氏藻属、眉藻属、管孢藻属、拟绿胶蓝细菌属、拟色球藻属、色球藻属、发毛针藻属、双色藻属、蓝囊胞菌属、蓝螺菌属、蓝杆藻属、柱胞藻属、筒孢藻属、蓝纤维藻属、小皮果蓝细菌属、侧生藻属、费氏藻属、盖特勒氏蓝细菌属、吉特勒氏线状蓝细菌属、胶菌藻、粘球藻属、粘杆藻属、盐螺旋藻属、英加藻属、瘦鞘丝藻属、湖丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、微囊藻属、粘囊藻属、节球藻属、念珠藻属、拟念珠藻属、颤藻属、席藻属、浮丝藻属、宽球藻属、原绿球藻属、原绿菌属、原绿发菌属、假鱼腥藻属、胶须藻属、裂须藻属、双歧藻属、螺旋藻属、斯塔尼尔蓝菌属、斯塔尔氏蓝菌属、真枝藻属、束藻属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻、单岐藻属、束毛藻属、常丝藻或异球藻属。
24.根据权利要求14所述的方法，其中所述适宜培养基不包含大量还原碳源。
25.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述酰基-ACP蜡酯合酶能以非酰基-CoA依赖性路径产生脂肪酸酯。
26.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞不包含编码酰基-ACP硫酯酶的内源核酸序列、编码任一酰基-CoA硫酯酶的内源核酸序列或编码酰基-CoA合成酶的内源核酸序列。
Claims (26)
1.一种经遗传改造以供从酰基-酰基载体蛋白ACP产生脂肪酸酯的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含编码酰基-ACP蜡酯合酶的非天然核酸序列，且另外其中所述重组宿主细胞不表达以下酶中的一或多者：
a)外源酰基-ACP硫酯酶；
b)外源酰基-CoA硫酯酶；和
c)外源酰基-CoA合成酶。
2.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞不包括编码酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA硫酯酶或酰基-CoA合成酶中的任一者的外源核酸序列。
3.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞不内源性产生酰基-CoA。
4.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞经改造以减弱或消除酰基-CoA产生。
5.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述蜡酯合酶与选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQID NO：41或SEQ ID NO：43组成的群组的多肽或与所述多肽中任一者的功能性片段具有至少50％序列一致性。
6.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述蜡酯合酶包含与SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：21的所述多肽或与所述多肽的功能性片段具有至少85％序列一致性的多肽。
7.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞进一步包含编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列。
8.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞不包括编码酰基-ACP硫酯酶、酰基-CoA硫酯酶或酰基-CoA合成酶中的任一者的外源核酸序列。
9.根据权利要求7所述的重组宿主细胞，其中所述形成醇的酰基-ACP还原酶与选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10组成的群组的多肽或与所述多肽中任一者的功能性片段具有至少50％序列一致性。
10.根据权利要求9所述的重组宿主细胞，其中所述形成醇的酰基-ACP还原酶包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或与所述多肽的功能性片段具有至少85％序列一致性的多肽。
11.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中将编码所述蜡酯合酶的所述核酸序列、编码形成醇的酰基-ACP还原酶的核酸序列或编码所述蜡酯合酶的所述核酸序列和编码所述形成醇的酰基-ACP还原酶的所述核酸序列二者整合到所述重组宿主细胞的染色体中。
12.根据权利要求11所述的重组宿主细胞，其中将编码所述蜡酯合酶的所述核酸序列和编码所述形成醇的酰基-ACP还原酶的所述核酸序列可操作连接到相同启动子。
13.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是光合微生物。
14.根据权利要求13所述的重组宿主细胞，其中所述光合微生物是蓝细菌。
15.根据权利要求14所述的重组宿主细胞，其中所述光合微生物是阿格门氏藻、鱼腥藻属、项圈藻属、倒囊藻属、丝囊藻属、节螺藻属、星球藻属、博氏藻属、眉藻属、管孢藻属、拟绿胶蓝细菌属、拟色球藻属、色球藻属、发毛针藻属、蓝细菌、双色藻属、蓝囊胞菌属、蓝螺菌属、蓝杆藻属、柱胞藻属、筒孢藻属、蓝纤维藻属、小皮果蓝细菌属、侧生藻属、费氏藻属、盖特勒氏蓝细菌属、吉特勒氏线状蓝细菌属、胶菌藻、粘球藻属、粘杆藻属、盐螺旋藻属、英加藻属、瘦鞘丝藻属、湖丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、微囊藻属、粘囊藻属、节球藻属、念珠藻属、拟念珠藻属、颤藻属、席藻属、浮丝藻属、宽球藻属、原绿球藻属、原绿菌属、原绿发菌属、假鱼腥藻属、胶须藻属、裂须藻属、双歧藻属、螺旋藻属、斯塔尼尔蓝菌属、斯塔尔氏蓝菌属、真枝藻属、束藻属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻、单岐藻属、束毛藻属、常丝藻或异球藻属。
16.一种用于产生蜡酯的方法，其包含以下步骤：
a)在适宜培养基中培养根据权利要求7所述的重组宿主细胞；和
b)容许表达编码形成醇的酰基-ACP还原酶的非天然核酸序列和编码蜡酯合酶的非天然核酸序列，其中所述表达引起产生所述蜡酯。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述适宜培养基不包括醇。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述重组宿主细胞不内源性产生酰基-CoA。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述重组宿主细胞相对于缺少所述编码蜡酯合酶的核酸序列的对照宿主细胞产生提高水平的所述蜡酯。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述蜡酯包含至少一种蜡酯分子，其中从脂肪醇衍生的A链和从酰基-ACP衍生的B链二者的链长度为C8到C24。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述蜡酯包含至少一种蜡酯分子，其中所述A链和所述B链二者都是C12到C18。
22.根据权利要求16所述的方法，其中至少一部分所产生的蜡酯是由所述宿主细胞分泌。
23.根据权利要求16所述的方法，其中所述宿主细胞是光合微生物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述光合微生物是蓝细菌。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述蓝细菌是阿格门氏藻、鱼腥藻属、项圈藻属、倒囊藻属、丝囊藻属、节螺藻属、星球藻属、博氏藻属、眉藻属、管孢藻属、拟绿胶蓝细菌属、拟色球藻属、色球藻属、发毛针藻属、双色藻属、蓝囊胞菌属、蓝螺菌属、蓝杆藻属、柱胞藻属、筒孢藻属、蓝纤维藻属、小皮果蓝细菌属、侧生藻属、费氏藻属、盖特勒氏蓝细菌属、吉特勒氏线状蓝细菌属、胶菌藻、粘球藻属、粘杆藻属、盐螺旋藻属、英加藻属、瘦鞘丝藻属、湖丝藻属、鞘丝藻属、微鞘藻属、微囊藻属、粘囊藻属、节球藻属、念珠藻属、拟念珠藻属、颤藻属、席藻属、浮丝藻属、宽球藻属、原绿球藻属、原绿菌属、原绿发菌属、假鱼腥藻属、胶须藻属、裂须藻属、双歧藻属、螺旋藻属、斯塔尼尔蓝菌属、斯塔尔氏蓝菌属、真枝藻属、束藻属、聚球藻属、集胞藻属、嗜热聚球藻、单岐藻属、束毛藻属、常丝藻或异球藻属。
26.根据权利要求16所述的方法，其中所述适宜培养基不包含大量还原碳源。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161539640P | 2011-09-27 | 2011-09-27 | |
| US61/539,640 | 2011-09-27 | ||
| PCT/US2012/027899 WO2013048557A1 (en) | 2011-09-27 | 2012-03-06 | Acyl-acp wax ester synthases |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103975070A true CN103975070A (zh) | 2014-08-06 |
Family
ID=47911679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201280057444.8A Pending CN103975070A (zh) | 2011-09-27 | 2012-03-06 | 酰基-酰基载体蛋白(acyl-acp)蜡酯合酶 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8921090B2 (zh) |
| EP (2) | EP2753701B1 (zh) |
| CN (1) | CN103975070A (zh) |
| AU (1) | AU2012316749B2 (zh) |
| BR (1) | BR112014007115A2 (zh) |
| ES (1) | ES2678647T3 (zh) |
| IL (1) | IL231584A0 (zh) |
| MX (1) | MX355504B (zh) |
| PT (1) | PT2753701T (zh) |
| WO (2) | WO2013048557A1 (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105385647A (zh) * | 2014-09-02 | 2016-03-09 | 赢创德固赛有限公司 | 脂肪酸酯的生产 |
| CN108779444A (zh) * | 2016-03-04 | 2018-11-09 | 道达尔炼油化学公司 | 生产脂肪酸的方法 |
| US11345938B2 (en) | 2017-02-02 | 2022-05-31 | Cargill, Incorporated | Genetically modified cells that produce C6-C10 fatty acid derivatives |
| US11408013B2 (en) | 2013-07-19 | 2022-08-09 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2707747T3 (es) * | 2009-09-25 | 2019-04-04 | Reg Life Sciences Llc | Producción de derivados de ácidos grasos |
| EP2655648B1 (en) * | 2010-12-23 | 2018-01-17 | ExxonMobil Research and Engineering Company | Genetically engineered microorganisms comprising 4-hydroxybenzoyl-coa thioesterases, methods of using the same for producing free fatty acids and fatty acid derivatives and 4-hydroxybenzoyl-coa thioesterases |
| WO2012135668A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Exxonmobil Research And Engineering Company | Metabolic pathway targeting by transcription factor overexpression |
| US8962299B2 (en) | 2012-02-29 | 2015-02-24 | Exxonmobil Research And Engineering Company | Four-gene pathway for wax ester synthesis |
| WO2014015278A1 (en) * | 2012-07-20 | 2014-01-23 | Codexis, Inc. | Production of fatty alcohols from engineered microorganisms |
| KR20150040359A (ko) | 2012-08-10 | 2015-04-14 | 오피엑스 바이오테크놀로지스, 인크. | 지방산 및 지방산 유도된 산물의 생산을 위한 미생물 및 방법 |
| CN104955944B (zh) * | 2012-09-14 | 2021-03-09 | 基因组股份公司 | 具有改善的酯合酶特性的酶变体 |
| BR112015020904A2 (pt) | 2013-03-15 | 2017-10-10 | Genomatica Inc | microrganismos e métodos para produção de butadieno e compostos relacionados por assimilação de formiato |
| US20150119601A1 (en) | 2013-03-15 | 2015-04-30 | Opx Biotechnologies, Inc. | Monofunctional mcr + 3-hp dehydrogenase |
| WO2014190251A1 (en) | 2013-05-24 | 2014-11-27 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for producing (3r)-hydroxybutyl (3r)-hydroxybutyrate |
| WO2015010103A2 (en) | 2013-07-19 | 2015-01-22 | Opx Biotechnologies, Inc. | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
| EP3074504B1 (en) | 2013-11-25 | 2024-12-25 | Genomatica, Inc. | Methods for enhancing microbial production of specific length fatty alcohols in the presence of methanol |
| US10513713B2 (en) | 2014-04-30 | 2019-12-24 | The Regents Of The University Of California | Modified host cells having tolerance to α-olefins |
| AU2015315168B2 (en) | 2014-09-09 | 2021-07-29 | Lumen Bioscience, Inc. | Targeted mutagenesis in spirulina |
| EP3173478A1 (en) * | 2015-11-25 | 2017-05-31 | Evonik Degussa GmbH | Biotechnological production of omega-functionalised carboxylic acids and esters thereof |
| CN112299562A (zh) * | 2019-07-29 | 2021-02-02 | 仲恺农业工程学院 | 利用酵母分泌物促进微藻降解碳、氮、磷的方法 |
| JP2023549539A (ja) * | 2020-11-13 | 2023-11-27 | バークレー ファーメンテイション サイエンス インコーポレーテッド | 遺伝子学的に改変された酵母細胞およびこれの使用の方法 |
| CN117229963B (zh) * | 2023-09-21 | 2024-03-22 | 东北林业大学 | 一株防治核桃焦叶症的韩国假单胞菌ybz2及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110000125A1 (en) * | 2009-06-30 | 2011-01-06 | Codexis, Inc. | Production of fatty alcohols with fatty alcohol forming acyl-coa reductases (far) |
| US20110072714A1 (en) * | 2009-09-25 | 2011-03-31 | Ls9, Inc. | Production of fatty acid derivatives |
Family Cites Families (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5254466A (en) | 1989-11-06 | 1993-10-19 | Henkel Research Corporation | Site-specific modification of the candida tropicals genome |
| US5298421A (en) | 1990-04-26 | 1994-03-29 | Calgene, Inc. | Plant medium-chain-preferring acyl-ACP thioesterases and related methods |
| US5403918A (en) | 1991-02-22 | 1995-04-04 | Calgene, Inc. | Fatty acyl reductase |
| WO1992014816A1 (en) | 1991-02-22 | 1992-09-03 | Calgene, Inc. | Seed plant fatty acyl reductase proteins and genes |
| US5411879A (en) | 1991-02-22 | 1995-05-02 | Calgene Inc. | Fatty acyl reductases |
| US5723747A (en) | 1991-02-22 | 1998-03-03 | Calgene, Inc. | Wax esters in transformed plants |
| US5455167A (en) | 1991-05-21 | 1995-10-03 | Calgene Inc. | Medium-chain thioesterases in plants |
| US5654495A (en) | 1992-10-30 | 1997-08-05 | Calgene, Inc. | Production of myristate in plant cells |
| US6492509B1 (en) | 1994-06-23 | 2002-12-10 | Calgene Llc | Fatty acyl-CoA: fatty alcohol acyltransferases |
| US5851796A (en) | 1995-06-07 | 1998-12-22 | Yale University | Autoregulatory tetracycline-regulated system for inducible gene expression in eucaryotes |
| US6143538A (en) | 1997-02-20 | 2000-11-07 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Fatty acyl-CoA reductase |
| WO2002099111A2 (en) | 2001-06-07 | 2002-12-12 | National Research Council Of Canada | Anther-specific taa1 genes encoding fatty acyl co-a reductases, and uses thereof |
| EP1481073B1 (en) | 2002-03-01 | 2009-11-11 | Monsanto Technology LLC | Wax ester synthase dna sequence, protein and uses thereof |
| US7135290B2 (en) | 2003-04-12 | 2006-11-14 | Solazyme, Inc. | Methods and compositions for evolving hydrogenase genes |
| EP1752532A1 (en) | 2005-08-09 | 2007-02-14 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | Extracellular polyhydroxyalkanoates produced by genetically engineered microorganisms |
| WO2008100251A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-21 | Ls9, Inc. | Modified microorganism uses therefor |
| BRPI0712205A2 (pt) | 2006-05-19 | 2012-02-22 | Ls9, Inc. | Microorganismo, geneticamente modificado e métodos para produção melhorada de ácidos graxos, alcoís graxos, ésteres e cera de ácidos graxos usados em composições biocombustíveis, método para se obter um derivado de ácido graxo, composições biocombustíveis e biocombustiveis |
| US8110670B2 (en) | 2006-05-19 | 2012-02-07 | Ls9, Inc. | Enhanced production of fatty acid derivatives |
| CN101617039A (zh) | 2006-10-20 | 2009-12-30 | 代表亚利桑那大学的亚利桑那校董会 | 经修饰的蓝细菌 |
| CA2678915C (en) | 2007-03-28 | 2019-04-09 | Ls9, Inc. | Enhanced production of fatty acid derivatives |
| KR101523255B1 (ko) | 2007-06-01 | 2015-05-29 | 솔라짐, 인코포레이티드 | 미생물에서 오일의 생성 |
| WO2009006430A1 (en) | 2007-06-29 | 2009-01-08 | The Regents Of The University Of California | Host cells and methods for producing fatty acid derived compounds |
| WO2009009391A2 (en) | 2007-07-06 | 2009-01-15 | Ls9, Inc. | Systems and methods for the production of fatty esters |
| US7897369B2 (en) | 2007-08-27 | 2011-03-01 | Regents Of The University Of Minnesota | Isoprenoid wax ester synthases, isoprenoid acyl CoA-synthetases, and uses thereof |
| BRPI0821508B1 (pt) | 2007-12-11 | 2018-12-26 | Synthetic Genomics Inc | cultura celular compreendendo uma cianobactéria recombinante da espécie synechococcus elongatus e método para converter carbono inorgânico em ácidos graxos. |
| CA2728285A1 (en) | 2008-03-03 | 2009-09-11 | Joule Unlimited, Inc. | Engineered co2 fixing microorganisms producing carbon-based products of interest |
| US8048654B2 (en) | 2010-06-09 | 2011-11-01 | Joule Unlimited Technologies, Inc. | Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of fatty acids and esters |
| US9487790B2 (en) | 2008-03-31 | 2016-11-08 | Kuehnle Agrosystems, Inc. | Nuclear based expression of genes for production of biofuels and process co-products in algae |
| WO2009140701A2 (en) | 2008-05-16 | 2009-11-19 | Synthetic Genomics, Inc. | Delivery into cells using ultra-short pulse lasers |
| WO2009140695A1 (en) | 2008-05-16 | 2009-11-19 | Ls9, Inc. | Methods and compositions for producing hydrocarbons |
| WO2010011754A2 (en) * | 2008-07-22 | 2010-01-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Continuous production and excretion of waxy products from photosynthetic organisms |
| US20110218354A1 (en) | 2008-09-19 | 2011-09-08 | President And Fellows Of Harvard College | Photoautotrophic Adipogenesis Technology (Phat) |
| AU2009302325A1 (en) | 2008-10-07 | 2010-04-15 | Ls9, Inc. | Method and compositions for producing fatty aldehydes |
| EP2358864B8 (en) | 2008-10-23 | 2017-09-13 | Lumen Bioscience, Inc. | Modified photosynthetic microorganisms for producing triglycerides |
| CA3146669A1 (en) | 2008-10-28 | 2010-06-03 | Genomatica, Inc. | Methods for producing a fatty alcohol in a host cell |
| US20100151112A1 (en) | 2008-11-28 | 2010-06-17 | Solazyme, Inc. | Novel Triglyceride and Fuel Compositions |
| CN105647842A (zh) | 2008-12-23 | 2016-06-08 | Reg生命科学有限责任公司 | 硫酯酶相关的方法和组合物 |
| WO2010078584A1 (en) * | 2009-01-05 | 2010-07-08 | Arizona Board Of Regents | Cyanobacterium that produces neutral lipids |
| US20100203614A1 (en) | 2009-02-12 | 2010-08-12 | Utah State University | Fatty aldehyde reductase |
| WO2010118410A1 (en) | 2009-04-10 | 2010-10-14 | Ls9, Inc. | Production of fatty acid derivatives |
| BRPI1015313B1 (pt) | 2009-04-27 | 2021-06-01 | Genomatica, Inc. | Método fermentativo para produzir um éster de ácido graxo empregando um microorganismo geneticamente modificado e método para a produção de ésteres de ácidos graxos |
| US20100298612A1 (en) | 2009-05-22 | 2010-11-25 | Codexis, Inc. | Engineered biosynthesis of fatty alcohols |
| US8956834B2 (en) | 2009-06-29 | 2015-02-17 | Synthetic Genomics, Inc. | Acyl-ACP thioesterase genes and uses therefor |
| US7794969B1 (en) | 2009-07-09 | 2010-09-14 | Joule Unlimited, Inc. | Methods and compositions for the recombinant biosynthesis of n-alkanes |
| US8633002B2 (en) | 2009-08-11 | 2014-01-21 | Synthetic Genomics, Inc. | Microbial production of fatty alcohols |
| WO2011066137A1 (en) | 2009-11-24 | 2011-06-03 | Schering Corporation | Substituted biaryl derivatives and methods of use thereof |
| US20110150841A1 (en) | 2009-12-16 | 2011-06-23 | University Of Washington | Secretion System and Methods for its Use |
| US8980613B2 (en) | 2010-04-06 | 2015-03-17 | Matrix Genetics, Llc | Modified photosynthetic microorganisms for producing lipids |
| AU2011266953B2 (en) | 2010-06-18 | 2014-09-18 | Technical University Of Denmark | Production of Biodiesel by yeast from lignocellulose and glycerol |
| US20140004580A1 (en) | 2010-12-20 | 2014-01-02 | Matrix Genetics, Llc | Modified photosynthetic microorganisms for producing lipids |
| WO2012087676A2 (en) | 2010-12-23 | 2012-06-28 | Exxonmobil Research And Enginnering Company | Production of fatty acids and fatty acid derivatives by recombinant microorganisms expressing polypeptides having lipolytic activity |
| EP2655648B1 (en) | 2010-12-23 | 2018-01-17 | ExxonMobil Research and Engineering Company | Genetically engineered microorganisms comprising 4-hydroxybenzoyl-coa thioesterases, methods of using the same for producing free fatty acids and fatty acid derivatives and 4-hydroxybenzoyl-coa thioesterases |
| WO2012154329A1 (en) * | 2011-04-01 | 2012-11-15 | Ls9, Inc. | Methods and compositions for improved production of fatty acids and derivatives thereof |
| US8962299B2 (en) | 2012-02-29 | 2015-02-24 | Exxonmobil Research And Engineering Company | Four-gene pathway for wax ester synthesis |
-
2012
- 2012-03-06 CN CN201280057444.8A patent/CN103975070A/zh active Pending
- 2012-03-06 MX MX2014003670A patent/MX355504B/es active IP Right Grant
- 2012-03-06 EP EP12835320.8A patent/EP2753701B1/en not_active Not-in-force
- 2012-03-06 AU AU2012316749A patent/AU2012316749B2/en active Active
- 2012-03-06 PT PT128353208T patent/PT2753701T/pt unknown
- 2012-03-06 ES ES12835320.8T patent/ES2678647T3/es active Active
- 2012-03-06 WO PCT/US2012/027899 patent/WO2013048557A1/en active Application Filing
- 2012-03-06 BR BR112014007115A patent/BR112014007115A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-03-06 US US13/413,426 patent/US8921090B2/en active Active
- 2012-09-27 WO PCT/US2012/057671 patent/WO2013049423A1/en active Application Filing
- 2012-09-27 EP EP12835668.0A patent/EP2761012B1/en not_active Not-in-force
- 2012-09-27 US US13/629,492 patent/US9017975B2/en active Active
-
2014
- 2014-03-19 IL IL231584A patent/IL231584A0/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110000125A1 (en) * | 2009-06-30 | 2011-01-06 | Codexis, Inc. | Production of fatty alcohols with fatty alcohol forming acyl-coa reductases (far) |
| US20110072714A1 (en) * | 2009-09-25 | 2011-03-31 | Ls9, Inc. | Production of fatty acid derivatives |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LU X等: "A perspective:photosynthetic production of fatty acid-based biofuels in genetically engineered cyanobacteria", 《BIOTECHNOL ADV.》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11408013B2 (en) | 2013-07-19 | 2022-08-09 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
| US12129506B2 (en) | 2013-07-19 | 2024-10-29 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
| CN105385647A (zh) * | 2014-09-02 | 2016-03-09 | 赢创德固赛有限公司 | 脂肪酸酯的生产 |
| CN108779444A (zh) * | 2016-03-04 | 2018-11-09 | 道达尔炼油化学公司 | 生产脂肪酸的方法 |
| US11345938B2 (en) | 2017-02-02 | 2022-05-31 | Cargill, Incorporated | Genetically modified cells that produce C6-C10 fatty acid derivatives |
| US12123045B2 (en) | 2017-02-02 | 2024-10-22 | Cargill, Incorporated | Genetically modified cells that produce C6-C10 fatty acid derivatives |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20130078684A1 (en) | 2013-03-28 |
| AU2012316749B2 (en) | 2017-06-29 |
| AU2012316749A2 (en) | 2014-09-04 |
| MX2014003670A (es) | 2014-04-30 |
| EP2753701B1 (en) | 2018-05-02 |
| BR112014007115A2 (pt) | 2017-04-25 |
| ES2678647T3 (es) | 2018-08-14 |
| PT2753701T (pt) | 2018-08-10 |
| US9017975B2 (en) | 2015-04-28 |
| AU2012316749A1 (en) | 2014-04-10 |
| US8921090B2 (en) | 2014-12-30 |
| EP2753701A1 (en) | 2014-07-16 |
| IL231584A0 (en) | 2014-05-28 |
| EP2761012B1 (en) | 2017-08-09 |
| EP2753701A4 (en) | 2015-04-08 |
| US20130078686A1 (en) | 2013-03-28 |
| EP2761012A4 (en) | 2015-04-15 |
| WO2013049423A1 (en) | 2013-04-04 |
| EP2761012A1 (en) | 2014-08-06 |
| MX355504B (es) | 2018-04-19 |
| WO2013048557A1 (en) | 2013-04-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103975070A (zh) | 酰基-酰基载体蛋白(acyl-acp)蜡酯合酶 | |
| CN104126013B (zh) | 通过脱氢酶的表达来改良脂肪酸合成的细胞系统和方法 | |
| EP2448955B1 (en) | Acyl-acp thioesterase genes and uses therefor | |
| US8530207B2 (en) | Photosynthetic microorganisms comprising exogenous prokaryotic acyl-ACP thioesterases and methods for producing fatty acids | |
| EP2464722B1 (en) | Microbial production of fatty alcohols | |
| US9187726B2 (en) | Culturing a microorganism in a medium with an elevated level of a carboxylate counterion source | |
| US8846370B2 (en) | Genetically engineered microorganisms comprising 4-hydroxybenzoyl-coa thioesterases and methods of using the same for producing free fatty acids and fatty acid derivatives | |
| US8962299B2 (en) | Four-gene pathway for wax ester synthesis | |
| EP2814972B1 (en) | Enhanced production of fatty acids and fatty acid derivatives by recombinant microorganisms | |
| US20170267984A1 (en) | Chlorophyllase overproduction to enhance photosynthetic efficiency | |
| EP2820029A1 (en) | Four-gene pathway for wax ester synthesis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140806 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |