CN113717913A - 螺旋藻中的靶向诱变 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及螺旋藻中的靶向诱变。本公开描述了用于在螺旋藻(节旋藻)中产生稳定的靶向突变的技术以及具有稳定的靶向突变的螺旋藻。

Description

螺旋藻中的靶向诱变
本申请是申请日为2015年9月9日、申请号为201580048316.0、发明名称为“螺旋藻中的靶向诱变”的发明专利申请的分案申请。
优先权要求
本申请要求2014年9月9日提交的美国临时专利申请号62/047,811的优先权，所述专利申请以引用的方式整体并入本文。
序列表
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且特此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是M077-0017PCT_ST25.txt。所述文本文件是约73KB，在2015年9月9日创建，并且通过EFS-Web以电子版形式提交。
技术领域
本发明一般涉及螺旋藻中的靶向诱变。
背景技术
蓝细菌(也称为蓝绿藻)是光合生物，其使用叶绿素A和水来减少二氧化碳并产生含能量的化合物。螺旋藻是自由漂浮的丝状蓝细菌，其包括属种钝顶节旋藻(Arthrospiraplatensis)和极大节旋藻(Arthrospira maxima)。这两种属种先前被分类在螺旋藻属中，但现在被分类在节旋藻属中。然而，术语“螺旋藻”仍在使用中。
蓝细菌通常适于遗传操作。然而，用于螺旋藻的遗传工程化工具是有限的。用于遗传操作的许多技术基于将外源(外来)遗传物质引入细菌细胞中。细胞必须处于“感受态”状态，以从周围环境中吸收遗传物质。一些类型的细菌能够天然地吸收遗传物质。这些类型的细菌被称为具有“天然感受态”。更通常地，通过使细胞暂时可渗透遗传物质来诱导“人工感受态”。用于通过增加外部细胞膜的渗透性来引入人工感受态的技术包括在化学溶液中孵育、热休克和使细胞经受电场的电穿孔。处于感受态状态的细胞(其摄取外源遗传物质并将新的遗传物质并入其基因组中)据称已经经历了“转化”。
螺旋藻长期以来被认为难以通过将DNA随机整合至螺旋藻染色体中来转化，并且申请人不知道声称通过将DNA靶向引入至特异性预定染色体位置中来修饰螺旋藻基因组的任何报道。使用电穿孔来引入氯霉素抗性基因的尝试在某些电穿孔条件下已产生氯霉素抗性，但是所述转化不稳定(即不能维持氯霉素抗性)。用通过使用电穿孔偶联至强启动子的氯霉素抗性基因转化螺旋藻的随后尝试获得在氯霉素存在下生长12个月的细胞，但是所述方法仅允许氯霉素抗性基因位于螺旋藻染色体中的随机(非靶向)位置处，且甚至外源DNA的这种随机整合并未最终证明。最近，使用大气和室温等离子体(ARTP)已在钝顶螺旋藻(S.platensis)(钝顶节旋藻(A.platensis))中实现了随机诱变。然而，随机诱变并非通过引入外源遗传物质来转化螺旋藻细胞，而是在基因组中的随机位点处引入突变。对于如何将外源DNA稳定地引入至蓝细菌(特别是螺旋藻)中的预定染色体位置的了解的缺乏被认为是与其他生物体如大肠杆菌或酵母相比，关于利用蓝细菌的挑战。虽然随机诱变存在一定水平的成功，但这项研究还突出了用于通过引入和表达外源基因来使钝顶螺旋藻突变的有效系统的持续缺乏。此外，以上所述的技术都未试图将靶向突变引入至螺旋藻基因组的特异性预定区域。
仍然需要在螺旋藻中有效地产生稳定转化体的技术。此外，还需要允许在螺旋藻基因组中靶向引入突变的技术。
发明内容
本公开描述用于将稳定的靶向突变引入至螺旋藻的基因组的技术。本公开还描述被修饰成含有稳定靶向突变的螺旋藻。另外，本公开描述用于使用已被修饰为包含一个或多个稳定靶向突变的螺旋藻来制造目标产物的技术。
本公开描述通过使螺旋藻与渗透稳定剂接触、使螺旋藻与具有同源臂的载体接触并且在螺旋藻中诱导人工感受态来在螺旋藻中产生靶向突变的方法。在一个实施方案中，所述螺旋藻可以是钝顶节旋藻NIES-39或节旋藻属种PCC 8005。渗透稳定剂可以是但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其任何组合。载体可以是DNA载体、线性载体、环状载体、单链多核苷酸或双链多核苷酸。在一个实施方案中，载体可以是例如pApl-pilA/aadA质粒。
在一个实施方案中，同源臂可以是相同长度。在一个实施方案中，同源臂可以是不同长度。同源臂中的一者或两者可以是至少约500bp、至少约1000bp、至少约1500bp或至少约2000bp。
在一个实施方案中，人工感受态可通过用于在原核细胞中引入人工感受态的任何已知技术来诱导，所述技术包括在含有二价阳离子的溶液中孵育、电穿孔和超声。
在一个实施方案中，所述方法还可包括使螺旋藻与pH值平衡剂接触。螺旋藻可在所述螺旋藻与载体接触之前或之后由pH值平衡剂接触。在一个实施方案中，在与pH值平衡剂接触后螺旋藻的pH值是约7.0至约8.0。
本公开描述包含至少一个稳定的靶向突变的螺旋藻。在一个实施方案中，螺旋藻是钝顶节旋藻、钝顶节旋藻NIES-39或极大节旋藻。在一个实施方案中，稳定的靶向突变被遗传至少5代、至少10代、至少20代、至少30代、至少40代或至少50代。突变可以是对基因组的任何类型的改变，包括基因的至少一部分的缺失或破坏、内源基因的另一拷贝的插入或外源基因的添加。在一个实施方案中，靶向突变可包括添加外源蛋白质结构域，包括翻译后修饰位点、蛋白质稳定化结构域、细胞定位信号和蛋白质-蛋白质相互作用结构域。在一个实施方案中，靶向突变包括添加未翻译成蛋白质的核酸序列，包括但不限于非编码RNA分子、基因调控元件、启动子、调控蛋白质结合位点、RNA结合位点、核糖体结合位点、转录终止子或RNA稳定化元件。
本公开还描述一种螺旋藻细胞，其由于通过用至少一种DNA构建体转化螺旋藻细胞来在至少一种蛋白质的基因座处引入修饰而缺乏所述蛋白质，所述DNA构建体包含与所述基因座的至少一部分同源的序列以及在所述基因座处的所述修饰和所述DNA构建体的整合，所述螺旋藻细胞另外能够以其天然方式起作用。
附图简述
图1示出被设计为靶向钝顶节旋藻菌株NIES-39中的pilA基因座(NIES39_C03030)的左同源臂和右同源臂。
图2示出用于钝顶节旋藻菌株NIES-39中的靶向诱变的pApl-pilA/aadA质粒。图2的质粒具有核苷酸序列SEQ ID NO:1。
图3A示出在钝顶节旋藻菌株NIES-39中的pilA基因座(NIES39_C03030)处同源重组的示意图，其中图2的质粒含有氨基糖苷腺苷酰转移酶基因(aadA)。还示出标记为A、B、C、D、E、F和G的五个PCR引物位点。
图3B示出对于野生型钝顶节旋藻和用图2的质粒转化后的钝顶节旋藻两者，用引物C/E、A/D和B/C PCR扩增的结果。
图3C示出在野生型钝顶节旋藻中用pilA基因序列的引物F/GPCR扩增以及在用含有aadA的载体转化后的钝顶节旋藻中缺乏扩增的结果。
图4示出用于节旋藻属种PCC 8005中的靶向诱变的pApl-pilA8005/aadA质粒。图4的质粒具有核苷酸序列SEQ ID NO:2。
图5A示出在节旋藻属种PCC 8005中的pilA基因座处同源重组的示意图，其中图4的质粒含有氨基糖苷腺苷酰转移酶基因(aadA)。还示出标记为H、I和J的三个PCR引物位点。
图5B示出对于野生型节旋藻属种PCC 8005和用图4的质粒转化后的节旋藻属种PCC 8005两者，用引物H/I和H/J PCR扩增的结果。
图6示出用于试图在钝顶节旋藻菌株NIES-39中通过靶向诱变引入crtW和crtZ基因以使钝顶节旋藻能够合成虾青素的pApl-NS1/Prs-crtW-crtZ质粒。图6的质粒具有核苷酸序列SEQ ID NO:3。
图7示出用于在钝顶节旋藻菌株NIES-39中通过靶向诱变引入cpcA和cpcB基因以将这两种基因的另外拷贝添加至节旋藻的pApl-NS1/aadA-cpcBA质粒。这产生过度产生C-藻蓝蛋白的节旋藻菌株。图7的质粒具有核苷酸序列SEQ ID NO:4。
图8A–8C示出相较于野生型钝顶节旋藻，在用图7的质粒转化的钝顶节旋藻菌株NIES-39中C-藻蓝蛋白产生的改进。图8D示出转化的钝顶节旋藻具有类似于野生型钝顶节旋藻的生长速率。
图9A示出来自经转化以过度产生C-藻蓝蛋白的钝顶节旋藻菌株NIES-39的蛋白质提取的更深蓝色以及来自野生型钝顶节旋藻菌株NIES-39的更浅蓝色蛋白质提取。
图9B是示出来自转化的钝顶节旋藻菌株NIES-39和野生型钝顶节旋藻菌株NIES-39的蛋白质提取之间的吸收差异的曲线图。转化的钝顶节旋藻菌株NIES-39在620nm下具有比野生型菌株更大的吸收。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但描述说明性方法和材料。出于本发明的目的，下文定义以下术语。
冠词“一个/种(a/an)”在本文中用来指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，“至少一个”)。举例来说，“要素”意指一个要素或多于一个要素。
贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包括一个所述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其他步骤或要素或任何其他组步骤或要素。
如本文所用，术语“具有(having)”、“具有(has)”、“含有(contain)”、“包括(including)”、“包括(includes)”、“包括(include)”和“具有(have)”具有与上文提供的“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprise)”相同的开放性意义。
“由……组成”意味着包括且不限于，无论在短语“由……组成”后的是什么。因此，短语“由……组成”指示所列出的要素是所需的或强制性的，并且可不存在其他要素。
“基本上由……组成”意味着包括在所述短语后列出的任何要素，并且限于不干扰或影响针对所列出要素的在本公开中指定的活动或动作的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”指示所列出要素是所需的或强制性的，但其他要素是任选的并且取决于它们是否影响所列出要素的活动或动作而可存在或可不存在。
“约”意指量(quantity)、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量(amount)、重量或长度与参考量(quantity)、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量(amount)、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
本说明书使用数值范围来量化与本发明有关的某些参数。应理解，当提供数值范围时，此类范围应被解释成为仅叙述所述范围的下限值的权利要求限制以及仅叙述所述范围的上限值的权利要求限制提供字面支持。例如，公开的10至100的数字范围为叙述“大于10”(没有上界)的权利要求和叙述“小于100”(没有下界)的权利要求提供字面支持，并且为端点10和100提供字面支持且包括端点10和100。
本说明书使用具体数值来量化与本发明有关的某些参数，其中所述具体数值不是数值范围的明确部分。应理解，本文提供的每个具体数值应被解释成为宽范围、中间范围和窄范围提供字面支持。与每个具体数值相关的宽范围是所述数值加上和减去所述数值的60％，四舍五入为两位有效数字。与每个具体数值相关的中间范围是所述数值加上和减去所述数值的30％，四舍五入为两位有效数字。与每个具体数值相关的窄范围是所述数值加上和减去所述数值的15％，四舍五入为两位有效数字。这些宽数值范围、中间数值范围和窄数值范围不仅应该应用于具体值，而且应该应用于这些具体值之间的差异。
“基因”意指在染色体上占据特定基因座并且由转录和/或翻译调控序列和/或编码区和/或非翻译序列(即，内含子，5’和3’非翻译序列)组成的遗传单位，无论此类调控序列是否与编码序列和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不一定限于，启动子序列、终止子、翻译调控序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点以及基因座控制区。
如本文所用的叙述“多核苷酸”或“核酸”指代mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。所述术语通常是指长度为至少10个碱基的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。所述术语包括DNA和RNA的单链形式和双链形式。
如本文所用，术语“DNA”包括已被分离为不含特定物种的总基因组DNA的DNA分子。因此，编码多肽的DNA区段是指包含一个或多个编码序列、然而基本上分离为远离或者纯化为不含从其获得DNA区段的物种的总基因组DNA的DNA区段。术语“DNA区段”和“多核苷酸”内包括DNA区段和此类区段的较小片段，以及重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体、病毒等。
关于多核苷酸，术语“外源的”是指不天然存在于野生型细胞或生物体中、但通常通过分子生物学技术引入细胞中的多核苷酸序列。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体、质粒和/或人造核酸构建体。关于多核苷酸，术语“内源的”或“天然的”是指可在给定野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸序列。包含与未修饰的载体等的多核苷酸序列组合的内源多核苷酸序列的载体、质粒或其他人造构建体作为整体是外源多核苷酸，并且还可称为包含内源多核苷酸序列的外源多核苷酸。此外，从第一生物体分离并通过分子生物学技术转移至第二生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是相对于第二生物体的“外源”多核苷酸。
多核苷酸可包含天然序列(例如，编码本文所述的蛋白质的内源序列)，或可包含这种序列的变体或片段或生物功能等效物。多核苷酸变体可包含一种或多种如本文进一步描述的取代、添加、缺失和/或插入，优选以使得所编码多肽的酶活性相对于未修饰的多肽或参考多肽基本上未降低。对所编码多肽的酶活性的影响通常可如本文所描述和本领域中所已知来评估。
如本领域技术人员将理解，本公开的多核苷酸序列可包括基因组序列、基因组外序列和质粒编码的序列以及表达或可适于表达蛋白质、多肽、肽等的更小的工程化的基因区段。此类区段可以是天然分离的，或通过人工合成修饰的。
多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA分子(基因组、cDNA或合成)或RNA分子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于本发明的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必连接至其他分子和/或支撑材料。
“编码序列”意指有助于基因的多肽产物的编码的任何核酸序列。相比之下，术语“非编码序列”是指对基因的多肽产物的编码无作用的任何核酸序列。
术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关联的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则是匹配的。或者，在核酸之间可存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。
两个序列(无论是核酸序列还是氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配的数目除以较短序列的长度且乘以100。用于核酸序列的近似比对由Smith-Waterman算法提供。Smith-Waterman算法可通过使用已知的评分矩阵(例如，由Dayhoff开发的评分矩阵)而应用于氨基酸序列并且通过任何熟知的技术如Gribskov方法标准化。用以确定序列同一性百分比的这种算法的一种执行程序由Genetics Computer Group(Madison,Wis.)在“BestFit”实用程序中提供。用于这种方法的默认参数描述于威斯康星序列分析程序包手册(Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual)，第8版(1995)(可从Genetics Computer Group,Madison,Wis.获得)中。用于计算序列之间的同一性或相似性百分比的其他合适的程序通常是本领域中已知的，例如以默认参数使用的由爱丁堡大学(University of Edinburgh)版权保护、由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发且由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,Calif.)分售的MPSRCH程序包，以及BLAST。这些程序的详情可在以下互联网地址找到：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。
“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物以及所述聚合物的变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可包括酶多肽或“酶”，其通常催化各种化学反应(即，增加各种化学反应的速率)。编码本申请的蛋白质和酶的示例性核苷酸序列涵盖全长参考多核苷酸，以及这些基因或其转录物或这些转录物的DNA拷贝的全长或基本上全长核苷酸序列的部分。核苷酸序列的部分可编码保留参考多肽的生物活性的多肽部分或区段。
“转化”是指由于外源核苷酸摄取和并入宿主细胞基因组产生的细胞中稳定可遗传的改变；还指外源基因从一个生物体转移到另一个生物体的基因组中。外源核苷酸可包含对靶生物体而言外来的基因或存在于野生型生物体中的核苷酸序列的添加。
“靶向突变”是指基因组的DNA序列中在预定(指定)基因组位置处的变化。在一些情况下，靶向突变将涉及在预定基因组位置处引入预定(指定)DNA序列改变。在其他情况下，靶向突变将涉及在预定基因组位置处引入随机DNA序列改变。
“稳定的”当描述由转化引起的遗传修饰的结果时是指在细胞群体的至少一部分中维持十代或更多代或等于或大于修饰的生物体的平均世代时间的十倍的时间长度的遗传修饰。
“感受态”是指细胞从周围环境吸收细胞外核苷酸的能力。细胞可以是“天然感受态”或“人工感受态”。天然感受态细胞能够在自然条件下从其周围环境吸收核苷酸。通过将人工感受态细胞暴露于通常不天然存在的条件(包括在二价阳离子溶液中孵育、热休克、电穿孔和超声)来使所述细胞被动地可渗透细胞外核苷酸。
术语“野生型”和“天然存在的”可互换使用来指当从天然存在的来源分离时具有生物体、基因或基因产物(例如，多肽)的特征的所述生物体、基因或基因产物。野生型生物体、基因或基因产物是在群体中最经常观察到的生物体、基因或基因产物，并且因此任意设计成“正常”或“野生型”形式。
如本文所用，“螺旋藻”与“节旋藻”同义。节旋藻属包括57种物种，其中22种是当前在分类学上接受的。因此，在无进一步指定下提及“螺旋藻”或“节旋藻”包括提及以下物种中的任一种：紫晶节旋藻(A.amethystine)、A.ardissonei、阿根廷节旋藻(A.argentina)、巴拉克里什南节旋藻(A.balkrishnanii)、A.baryana、包氏节旋藻(A.boryana)、布朗节旋藻(A.braunii)、短节节旋藻(A.breviarticulata)、短节旋藻(A.brevis)、短曲节旋藻(A.curta)、A.desikacharyiensis、蕈形节旋藻(A.funiformis)、纺锤节旋藻(A.fusiformis)、加纳节旋藻(A.ghannae)、巨大节旋藻(A.gigantean)、戈氏螺旋藻(A.gomontiana)、戈氏螺旋藻粗状变种(A.gomontiana var.crassa)、印度节旋藻(A.indica)、钝顶节旋藻强氏变种(A.jenneri var.platensis)、强氏节旋藻Stizenberger(A.jenneri Stizenberger)、强氏节旋藻紫色变型(A.jenneri f.purpurea)、乔希节旋藻(A.joshii)、坎纳节旋藻(A.khannae)、疏松节旋藻(A.laxa)、宽松节旋藻(A.laxissima)、宽松节旋藻(A.laxissima)、A.leopoliensis、大型节旋藻(A.major)、A.margaritae、马氏节旋藻(A.massartii)、马氏节旋藻印度变种(A.massartii var.indica)、极大节旋藻(A.maxima)、孟氏节旋藻(A.meneghiniana)、极小节旋藻缢缩变种(A.miniatavar.constricta)、极小节旋藻(A.miniata)、极小节旋藻极尖变型(A.miniataf.acutissima)、那不勒斯节旋藻(A.neapolitana)、诺氏节旋藻(A.nordstedtii)、大洋节旋藻(A.oceanica)、奥氏节旋藻(A.okensis)、透明节旋藻(A.pellucida)、钝顶节旋藻(A.platensis)、钝顶节旋藻非缢缩变种(A.platensis var.non-constricta)、钝顶节旋藻颗粒变种(A.platensis f.granulate)、钝顶节旋藻小型变型(A.platensis f.minor)、钝顶节旋藻小型变种(A.platensis var.tenuis)、桑氏节旋藻(A.santannae)、塞氏节旋藻(A.setchellii)、斯库雅节旋藻(A.skujae)、旋状节旋藻小型变型(A.spirulinoidesf.tenuis)、旋状节旋藻(A.spirulinoides)、盐泽节旋藻(A.subsalsa)、精细节旋藻(A.subtilissima)、弱细节旋藻(A.tenuis)、极细节旋藻(A.tenuissima)、以及变色节旋藻(A.versicolor)。
本申请中引用的所有文献和类似的材料(包括专利、专利申请、文章、书籍、论文和因特网网页)出于任何目的以引用的方式明确地整体并入。当引入的参考文献中的术语的定义与本申请中提供的定义不同时，以本申请中提供的定义为准。
螺旋藻中的靶向突变
在本发明的一方面，具有同源臂的载体由处于感受态状态的螺旋藻细胞吸收，并且随后整合至细胞的一个或多个染色体中。由同源臂的序列引导的同源重组由于基因组的原始核酸序列与同源臂之间的载体区域的核酸序列之间的差异而改变细胞的基因组。
本公开描述本发明人已知的用于在螺旋藻中诱导感受态的第一技术。螺旋藻不是天然感受态的，并且本文公开的技术实现其中用于转化螺旋藻的先前技术失败的转化。螺旋藻中存在的高水平的核酸内切酶先前被认为使得转化不可能。电穿孔一直被限于产生感受态细胞持续仅短时间段，这是由于当经受电穿孔时螺旋藻细胞溶解的倾向。然而，在适当渗透稳定剂存在下通过电穿孔转化实现了先前通过其他技术不可能的转化。
在转化之前，可用渗透稳定剂培养和洗涤螺旋藻。螺旋藻可在用于蓝细菌生长的任何合适的培养基(如SOT培养基)中培养。SOT培养基包含NaHCO3 1.68g、K2HPO4 50mg、NaNO3 250mg、K2SO4 100mg、NaCl 100mg、MgSO4·7H2O 20mg、CaCl2·2H2O 4mg、FeSO4·7H2O1mg、Na2EDTA·2H2O 8mg、A5溶液0.1mL以及蒸馏水99.9mL。A5溶液包含H3BO3 286mg、MnSO4·5H2O)217mg、ZnSO4·7H2O 22.2mg、CuSO4·5H2O 7.9mg、Na2MoO4·2H2O 2.1mg以及蒸馏水100mL。培养可在振荡下(例如，100–300rpm)在高于室温的温度下(例如，25℃–37℃)和在连续照射下(例如，20–2,000、50–500或100–200μmol光子m-2s-1)发生。可在750nm下的光密度达到预定阈值(例如，OD750为0.3-2.0、0.5–1.0或0.6–0.8)时收获生长细胞。可通过离心将一定体积的收获细胞浓缩，然后再悬浮于pH值平衡剂和盐的溶液中。pH值平衡剂可以是维持螺旋藻的存活力同时将培养基的pH值保持介于6与9pH之间、介于6.5与8.5pH之间或介于7与8pH之间的任何合适的缓冲液。合适的pH值平衡剂包括HEPES、HEPES-NaOH、磷酸钠或磷酸钾缓冲液以及TES。盐溶液可以是浓度介于50mM与500mM之间、介于100mM与400mM之间或介于200mM与300mM之间的NaCl。在一个实施方案中，介于1-50mL之间的1-100mM pH值平衡剂可用于中和pH值。
通过离心收集的细胞可用渗透稳定剂洗涤且任选地用盐溶液(例如1-50mL的0.1-100mM NaCl)洗涤。任何量的培养物可通过离心浓缩。在一个实施方案中，可离心5-500mL之间的培养物。渗透稳定剂可以是在电穿孔期间使螺旋藻的细胞完整性稳定的任何类型的渗透平衡剂。在一个实施方案中，渗透稳定剂可以是糖(例如w/v0.1％–25％)，如葡萄糖或蔗糖。在一个实施方案中，渗透稳定剂可以是简单多元醇(例如v/v 1％–25％)，包括甘油(glycerine/glycerin/glycerol)。在一个实施方案中，渗透稳定剂可以是聚醚，包括(例如w/v 0.1％–20％)聚乙二醇(PEG)、聚(氧乙烯)或聚(环氧乙烷)(PEO)。PEG或PEO可具有200至10,000、1000至6000或2000至4000的任何分子量。在一个实施方案中，可使用pH值平衡剂或缓冲剂来代替渗透稳定剂或者除了渗透稳定剂之外还可使用pH值平衡剂或缓冲剂。
本公开还描述通过经由将载体引入至感受态细胞同源重组来在螺旋藻中产生靶向突变。人工感受态可通过以上所述的电穿孔技术或通过用于在螺旋藻中产生感受态的任何其他已知或未来技术而产生。用于在螺旋藻中引入人工感受态的已知技术包括电穿孔(有或无渗透稳定剂和有或无pH值平衡剂)、在含有二价阳离子的溶液中孵育和超声。当诱导人工感受态时，使螺旋藻细胞与载体接触。例如，可在电穿孔之前将载体与螺旋藻细胞的溶液混合。
电穿孔可在0.1-、0.2-或0.4-cm电穿孔杯中在介于0.6与10kV/cm之间、介于2.5与6.5kV/cm之间或介于4.0与5.0kV/cm之间；介于1与100μF之间、介于30与70μF之间或介于45与55μF之间；且介于10与500mΩ之间、介于50与250mΩ之间或介于90与110mΩ之间下进行。在一个实施方案中，电穿孔可在4.5kV/cm、50μF和100mΩ下进行。
在电穿孔后，可在基于通过用质粒成功转化而赋予的抗性来选择的一种或多种抗生素存在下生长细胞。电穿孔后培养可在降低的照射水平(例如5–500、10–100或30–60μmol光子m-2s-1)下进行。培养也可在振荡(例如100-300rpm)下进行。培养基中抗生素的水平可介于5与100μg/mL之间。电穿孔后培养可持续1-5天或更长时间。通过抗生素抗性鉴别的成功转化体可在1周至1个月的时间过程内在板上或在补充有0.1-2.0μg适当抗生素的5-100mL SOT培养基中选择。
“载体”意指多核苷酸分子，优选源自例如质粒、噬菌体、酵母或病毒的DNA分子，多核苷酸可插入或克隆至其中。载体可含有一个或多个合成核苷酸或核酸类似物。载体可含有一个或多个独特限制性位点。载体可以是当引入宿主细胞中时，整合至基因组中且连同它已整合至其中的染色体一起复制的载体。这种载体可包含允许重组至宿主染色体的特定所需位点中的一个或多个特异性序列。这些特异性序列可与存在于野生型基因组中的序列同源。载体系统可包含单个载体或质粒、两个或更多个载体或质粒，其中一些提高靶向诱变或转座的效率。载体的选择通常将取决于载体与所述载体待引入其中的宿主细胞的相容性。载体可包含报道基因，如绿色荧光蛋白(GFP)，其可与一个或多个编码的多肽框内融合，或单独表达。载体还可包含阳性选择标记，如可用于选择合适转化体的抗生素抗性基因。载体还可包含阴性选择标记，如II型硫酯酶(tesA)基因或枯草芽孢杆菌结构基因(sacB)。使用报道基因或标记允许鉴别已经用载体成功转化的那些细胞。
在一个实施方案中，载体包含一个或两个与邻近靶向基因座的螺旋藻基因组的DNA序列同源的同源臂。同源臂的序列可与所述同源臂所互补的螺旋藻基因组的区域相同或相似。如本文所用的“同源性”或“同源的”包括同源的相同序列和同源的不相同序列。同源的不相同序列是指与第二序列具有一定程度的序列同一性、但其序列与第二序列的序列不相同的第一序列。例如，包含突变基因的野生型序列的多核苷酸与所述突变基因的序列是同源的，并且是不相同的。如本文所用，两个同源的不相同序列之间的同源性程度足以允许利用标准细胞机制在其间产生同源重组。两个同源的不相同序列可以是任何长度，并且它们的非同源性程度可小至单个核苷酸(例如，对于引入靶向同源重组的基因组点突变而言)或大至10个或更多千碱基(例如，对于在染色体中的预定基因座处插入基因而言)。包含同源的不相同序列的两种多核苷酸不需要是相同长度。例如，可使用介于20与10,000个核苷酸或核苷酸对之间的外源多核苷酸(即，载体多核苷酸)。
可通过比较两个序列(多核苷酸或氨基酸)之间的同一性百分比来确定两个序列表征为同源的相同序列或同源的不相同序列。同源的相同序列具有100％序列同一性。同源的的不相同序列可具有大于80％、大于85％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的序列同一性。
同源臂可以是允许位点特异性同源重组的任何长度。同源臂可以是介于约2000bp与500bp之间(包括之间的所有整数值)的任何长度。例如，同源臂可以是约2000bp、约1500bp、约1000bp或约500bp。在具有两个同源臂的实施方案中，所述同源臂可以是相同或不同长度。因此，两个同源臂中的每一个可以是介于约2000bp与500bp之间(包括之间的所有整数值)的任何长度。例如，两个同源臂中的每一个可以是约2000bp、约1500bp、约1000bp或约500bp。
与一个或两个(即，在之间)同源臂相邻的载体部分通过同源重组修饰螺旋藻基因组中的靶向基因座。用于其他生物体中的同源重组的技术是通常已知的(参见例如，Kriegler,1990,Gene transfer and expression:a laboratory manual,StocktonPress)。修饰可改变靶向基因座的长度，包括核苷酸的缺失或核苷酸的添加。添加或缺失可具有任何长度。修饰也可改变靶向基因座中的核苷酸的序列而不改变长度。靶向基因座可以是螺旋藻基因组的任何部分，包括编码区、非编码区和调控序列。在一个实施方案中，突变可缺失基因，从而产生敲除生物体。在一个实施方案中，突变可添加用作报道分子或标记(例如，GFP或抗生素抗性)的基因。在一个实施方案中，突变可添加外源基因。在一个实施方案中，突变可添加在外源启动子(例如，强启动子、诱导型启动子等)控制下的内源基因。
用于上述靶向诱变的载体可通过将载体主链与插入序列组装来产生。载体可通过任何已知或之后开发的技术来产生，所述技术包括限制酶消化，然后连接或Gibson组装。Gibson组装可通过将将成为载体主链的部分的DNA序列与核外切酸酶、DNA聚合酶和DNA连接酶组合，然后在50℃下孵育1小时来进行。可选择载体主链以与靶生物体相容。对于螺旋藻，合适的载体主链包括但不限于DNA质粒。载体主链可通过用适当的限制性核酸内切酶处理来从连续环转化为线性形式。将由此形成的末端用碱性磷酸酶处理以除去5'-磷酸端基，以使得载体可在不首先并入插入片段的情况下不在DNA连接酶反应中重组连续环。
插入序列包含一个或两个同源臂和核苷酸序列，所述同源臂和核苷酸序列由于插入物的核苷酸序列与螺旋藻的野生型基因组序列之间的差异而修饰螺旋藻的基因座。插入序列包含与目标基因座相邻的一个或两个侧翼区，所述侧翼区对应于与螺旋藻基因组的区域同源的同源臂和不同于螺旋藻基因组的部分。插入序列的与螺旋藻的野生型核苷酸序列不同的部分由于那些差异而导致螺旋藻基因组的修饰。修饰可包括但不限于点突变、基因的添加、调控元件的添加、编码区的添加、非编码区的添加、基因的缺失、基因的一部分的缺失或调控元件的缺失。一般来说，众所周知，强大肠杆菌启动子在蓝细菌中工作良好。如果靶生物体的序列是已知的，则可使用公开的序列来设计具有同源臂的插入序列。已对几种螺旋藻菌株进行了测序，如钝顶节旋藻NIES-39。如果所述序列不是已知的，则可使用PCR和合适的引物来扩增含有目标基因座的基因组的一部分。随后可使用本领域的技术人员已知的技术来多此区域进行测序。在一个实施方案中，所述基因组的扩增区域可用于进行重叠延伸PCR以产生缺失。在一个实施方案中，所述基因组的扩增区域可用在一个位置中切割核苷酸序列的限制性核酸内切酶消化并且连接至已用相容末端制备的插入核苷酸序列。
将插入序列用一种或多种限制性核酸内切酶消化以产生与载体主链的末端相容的末端。或者，将与载体主链的末端区域相同的短序列(例如，16–25bp)添加至插入序列的末端，并且通过Gibson组装法将这两个片段环化。插入序列的长度将是对目标基因座的修饰的长度和侧翼区的长度。例如，如果修饰序列的长度是500bp并且希望各自2000bp的两个同源臂，则所述序列的整个长度将是4500bp。不管编码序列本身的长度何，在本发明中用作载体的多核苷酸序列都可与其他序列如启动子、转录终止子、另外的限制酶位点、多克隆位点、其他编码区段等组合，以使得它们的总长度可显著变化。因此，预期可使用几乎任何长度的多核苷酸片段，其中总长度优选仅通过容易制备和在预期重组核苷酸方案中使用来限制。
说明性应用
中性脂质(蜡酯和甘油三酯)产生
在一个实施方案中，螺旋藻可被修饰以使中性脂质(包括蜡酯和/或甘油三酯)的产生增加超出由在相同条件下生长的野生型螺旋藻产生的水平。甘油三酯和蜡酯可用作生物燃料和/或各种特殊化学品的生产中的原料。例如，可使甘油三酯经受酯交换反应，其中醇与甘油三酯油(如在植物油、动物脂肪、回收的油脂中包含的那些)反应以产生生物柴油如脂肪酸烷基酯。此类反应还产生作为副产物的甘油，其可被纯化以用于制药和化妆品工业中。甘油三酯或三酰甘油(TAG)主要由用三种脂肪酸酯化的甘油组成，并且在氧化时比碳水化合物或蛋白质产生更多的能量。甘油三酯为大多数真核生物体提供能量储存的重要机制。在哺乳动物中，TAG被合成并储存在几种细胞类型中，包括脂肪细胞和肝细胞。与真核生物相反，除了不动杆菌属的某些成员之外，原核生物中甘油三酯产生的观察一直限于某些放线菌，如分枝杆菌属、诺卡氏菌属、红球菌属和链霉菌属的成员。
某些生物体可在生物燃料的生产中用作中性脂质的来源。例如，真核藻类天然地产生甘油三酯作为能量存储分子，并且某些生物燃料相关技术目前集中于使用藻类作为生物燃料的原料。藻类是光合生物体，并且使用产生甘油三酯的生物体如藻类提供由阳光、水、CO2、大量营养素和微量营养素产生生物柴油的能力。
与藻类类似，包括螺旋藻的蓝细菌物种可从光合作用获得能量，从而利用叶绿素A和水来还原CO2。然而，螺旋藻缺乏参与中性脂质合成的必需酶。向蓝细菌添加外源基因增加脂质产生。上述技术可用于通过靶向同源重组将基因添加至螺旋藻。因此，本公开中描述的技术提供将已知增加蓝细菌中的甘油三酯和蜡酯产生的基因的方式，所述基因如编码二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、磷脂酸磷酸酶、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、醛形成酰基-ACP还原酶(AAR)、醇形成脂肪酰基-辅酶A还原酶和醇形成脂肪酰基-ACP还原酶(FAR)。上述技术还可用于添加编码与野生型DGAT、磷脂酸磷酸酶和/或ACCase多核苷酸序列不同、但仍具有DGAT酶活性、磷脂酸磷酸酶酶活性和/或ACCase酶活性的多肽序列的基因或多核苷酸序列的部分。
酰基ACP还原酶(AAR)催化酰基-ACP还原成酰基醛，也称为脂肪醛。这些酶还被称为脂肪酰基ACP还原酶(FAR)。脂肪醛可充当通过FAR或长链醇脱氢酶(ADH)进行脂肪醇生物合成的底物。酰基-ACP还原酶的一个实例是来自细长聚球藻(S.elongatus)的PCC7942_orf1594。已使用来自TIGRRAM数据库的隐马尔可夫模型(hidden Markov model)蛋白质家族模式TIGR045058(醛形成长链脂肪酰基ACP还原酶)和TIGR04059(长链脂肪醛脱羰基酶)鉴别了蓝细菌中的AAR基因(或FAR基因)的家族。
根据一种非限制性理论，某些实施方案可与FAR或ADH结合使用AAR以增加脂肪醇的合成，所述脂肪醇然后可并入到蜡酯中，其主要是通过本文所述的表达DGAT(且因此产生蜡酯)的光合微生物。因此，AAR可用于本文所述的任何实施方案中，如产生增加水平的游离脂肪醇的那些，其中希望将这些游离脂肪醇转变为蜡酯。如上所述，然后可通过DGAT将这些游离脂肪醇酯化成脂肪酸(呈酰基-ACP的形式)以产生蜡酯。
某些实施方案涉及使用过度表达的AAR来增加脂肪醇的合成，且由此增加产生蜡酯的菌株(例如，表达DGAT的菌株)中蜡酯的产生。例如，某些实施方案可与脂肪酰基还原酶和DGAT组合利用AAR。这些实施方案然后可进一步利用ACP、ACCase或两者和/或本文所述的对糖原产生和储存或糖原分解的任何修饰。
脂肪酰基还原酶(FAR)催化酰基-ACP或酰基-COA两步还原为酰基醇，也称为脂肪醇。第一步骤通过酰基醛中间体进行，所述中间体然后在第二步骤中转化为脂肪醇。这些相同的酶还可将脂肪醛直接还原为脂肪醇(即仅步骤二)。在这种情况下，它们有时被称为脂肪醛还原酶。脂肪醇可充当通过DGAT进行的蜡酯生物合成的底物。许多脂肪酰基还原酶的特征在于三个保守的序列元件。存在NADPH结合基序(具有利用NADP的酶的催化位点的特征的基序)和保守的C末端结构域(称为雄性不育2结构域，其具有未知的功能)。
根据一种非限制性理论，某些实施方案可使用脂肪酰基还原酶来增加脂肪醇的合成，所述脂肪醇然后可并入到蜡酯中，其主要是通过本文所述的表达DGAT(且因此产生蜡酯)的光合微生物。因此，脂肪酰基还原酶可用于本文所述的任何实施方案中，如产生增加水平的游离脂肪醇的那些，其中希望将这些游离脂肪醇转变为蜡酯。如上所述，然后可通过DGAT将这些游离脂肪醇酯化成脂肪酸(呈酰基-ACP的形式)以产生蜡酯。
某些实施方案涉及使用过度表达的脂肪酰基还原酶来增加脂肪醇的合成，且由此增加产生蜡酯的菌株(例如，表达DGAT的菌株)中蜡酯的产生。例如，某些实施方案可利用脂肪酰基还原酶，可能与酰基-ACP还原酶和DGAT组合。这些实施方案然后可进一步利用ACP、ACCase或两者和/或本文所述的对糖原产生和储存或糖原分解的任何修饰。
二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)是O-酰基转移酶超家族的成员，其以油酰基-辅酶A依赖性方式酯化固醇或二酰基甘油。DGAT尤其酯化二酰基甘油，并且这种酯化代表在植物、真菌和哺乳动物中产生三酰甘油的最终酶促步骤。具体地说，DGAT负责将酰基从酰基辅酶A转移至1,2-二酰基甘油(DAG)的sn-3位以形成三酰甘油(TAG)。DGAT可以是贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylii)不动杆菌ADP1二酰基甘油酰基转移酶(AtfA)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)DGAT、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas Shigelloides)DGAT或泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)DGAT。因此，在一个实施方案中，DGAT蛋白包含SEQ ID NO:5、6或7中任一个中所列出的序列。SEQ ID NO:5是不动杆菌属DGAT的序列。SEQID NO:6是天蓝色链霉菌DGAT的序列。SEQ ID NO:7是泊库岛食烷菌DGAT的序列。在植物和真菌中，DGAT与膜和脂质体级分相关。在催化TAG中，DGAT主要用于储存用作能量储备的碳。然而，在动物中，DGAT的作用更复杂。DGAT不仅在脂蛋白组装和血浆三酰甘油浓度的调控中起作用，而且还参与二酰基甘油水平的调控(Biochemistry of Lipids,Lipoproteins andMembranes 171-203)。DGAT蛋白可在宿主细胞中利用多种酰基底物，包括脂肪酰基-辅酶A和脂肪酰基-ACP分子。此外，当受到DGAT酶作用时所述酰基底物可具有不同的碳链长度和饱和度，但是DGAT可证明针对某些分子的优先活性。
如本文所用的“磷脂酸磷酸酶”基因包括可从任何细胞来源获得的编码氨基酸的任何多核苷酸序列(如蛋白质、多肽或肽)，其展示在酶反应性条件下催化磷脂酸(PtdOH)的去磷酸化、从而产生二酰基甘油(DAG)和无机磷酸盐的能力，并且还包括具有这种能力的磷脂酸磷酸酶序列的任何天然存在或非天然存在的变体。示例性磷脂酸磷酸酶基因包括但不限于酵母磷脂酸磷酸酶，包括酿酒酵母磷脂酸磷酸酶(yPah1)。Pah1编码的PAP1酶存在于细胞的细胞质和细胞膜部分中，并且其与细胞膜的缔合在本质上是外周的。如从已经从酵母中纯化的多种形式的PAP1所预期，pah1Δ突变体仍然含有PAP1活性，从而表明存在另外的一种或多种编码具有PAP1活性的酶的基因。在一个实施方案中，磷酸酯磷酸酶基因(Pah1)包含在SEQ ID NO:8中所列出的序列。
如本文所用，“乙酰辅酶A羧化酶”基因包括可从任何细胞来源获得的编码氨基酸的任何多核苷酸序列(如蛋白质、多肽或肽)，其展示在酶反应性条件下催化乙酰辅酶A羧化以产生丙二酰辅酶A的能力，并且还包括具有这种能力的乙酰辅酶A羧化酶序列的任何天然存在或非天然存在的变体。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是生物素依赖性酶，其催化乙酰辅酶A的不可逆羧化以通过其两种催化活性，生物素羧化酶(BC)和羧基转移酶(CT)产生丙二酰辅酶A。生物素羧化酶(BC)结构域催化反应的第一步骤：与生物素羧基载体蛋白(BCCP)结构域共价连接的生物素辅基的羧化。在所述反应的第二步骤中，羧基转移酶(CT)结构域催化羧基从(羧基)生物素转移至乙酰-辅酶A。通过乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)形成丙二酰辅酶A代表脂肪酸合成的约定步骤，因为丙二酰辅酶A除了充当脂肪酸的前体之外没有代谢作用。由于这一原因，乙酰辅酶A羧化酶代表脂肪酸合成中的关键酶。ACCase可以是酿酒酵母乙酰辅酶A羧化酶(yACC1)、小麦(Triticum aestivum)ACCase或聚球藻属种(Synechococcussp.)PCC 7002ACCAse。在一个实施方案中，ACCase基因包含在SEQ ID NO:9中所列出的序列。
具体地说，磷脂酸磷酸酶催化二酰基甘油分子(甘油三酯的直接前体)的产生，并且DGAT酶通过将二酰基甘油前体转化为甘油三酯来催化甘油三酯合成的最终步骤。增加的细胞内ACCase活性有助于增加的脂肪酸产生，因为这种酶催化脂肪酸合成的“约定步骤”。具体地说，ACCase催化脂肪酸合成前体分子丙二酰辅酶A的产生。
编码具有所需酶活性的多肽的基因或核苷酸可通过在同源臂之间具有编码DGAT、磷脂酸磷酸酶、ACCase的核苷酸序列或具有DGAT酶活性、磷脂酸磷酸酶活性或ACCase酶活性的多核苷酸序列的载体引入至螺旋藻基因组，所述同源臂靶向螺旋藻基因组的特定基因座。载体可以是适合于螺旋藻的转化的任何载体，包括以上所述的载体。载体的多核苷酸可进行密码子优化以用于在螺旋藻中表达。载体可包含与添加的基因相关的启动子。启动子可以是诱导型启动子。如本领域的技术人员将理解，在一些情况下产生具有非天然存在的密码子的编码多肽的核苷酸序列可能是有利的。例如，可选择特定原核或真核宿主偏好的密码子以增加蛋白质表达的速率或产生具有合乎需要的性质(如比由天然存在的序列产生的转录物的半衰期更长的半衰期)的重组RNA转录物。此类核苷酸通常被称为“密码子优化的”。
在一个实施方案中，特异性基因座是被载体的核苷酸序列置换的基因。调控元件如与置换的基因相关的启动子可用于指导来自载体的核苷酸序列的转录。在一个实施方案中，特异性基因座可以是螺旋藻基因组的非编码区。载体的同源臂之间的核苷酸序列可包含调控元件，如与编码具有所需酶活性的多肽的基因或核苷酸一起引入螺旋藻基因组中的启动子。由于野生型螺旋藻通常不编码甘油三酯合成所必需的酶，所以本公开中描述的技术提供将具有DGAT活性、磷脂酸磷酸酶活性和/或ACCase酶活性的外源基因添加至螺旋藻以增加脂质产生的方式。
减少的糖原产生
在一个实施方案中，与在相同条件下生长的野生型螺旋藻相比，螺旋藻可被修饰以累积减少量的糖原。通过减少所产生的糖原的量，由蓝细菌同化的碳涉及其他基于碳的产物如脂质和/或脂肪酸的合成。蓝细菌中糖原生物合成基因的缺失降低糖原累积。
通过在蓝细菌中阻断、破坏或下调天然糖原合成和储存途径(例如通过基因突变或缺失)，所得到的光合微生物菌株增加碳流入其他生物合成途径。其他生物合成途径的实例包括现有途径，如现有的脂质生物合成途径，或通过遗传工程话引入的途径，如脂肪酸或甘油三酯生物合成途径。缺失与糖原合成相关的基因的这种修饰可与以上所述的修饰组合以添加与甘油三酯合成相关的外源基因。以上所述的技术可用于缺失与包含葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶(glgC)基因、葡萄糖磷酸变位酶(pgm)基因或糖原合酶(glgA)基因的螺旋藻中的糖原合成和/或储存途径相关的一种或多种基因的全部或一部分。还考虑使所得到的多肽有或无降低的酶活性水平的葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶(glgC)基因、葡萄糖磷酸变位酶(pgm)基因或糖原合酶(glgA)基因的一部分的缺失。减少的糖原合成和/或累积可在应激条件如减少的氮下生长的螺旋藻中更显著。
糖原是葡萄糖的多糖，其在大多数细胞(包括动物和细菌细胞)中充当碳和能量储存的手段。更具体地说，糖原是含有约90％α-1,4-糖苷键联和10％α-1,6键联的非常大的支化葡萄糖均聚物。特别是对于细菌，呈α-1,4-聚葡萄糖形式的糖原的生物合成和储存代表应对环境中的短暂饥饿条件的重要策略。
糖原生物合成涉及几种酶的作用。例如，细菌糖原生物合成通常通过以下一般步骤发生：(1)由磷酸葡萄糖变位酶(Pgm)催化的葡萄糖-1-磷酸的形成，随后(2)由葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶(GlgC)催化的由ATP和葡萄糖1-磷酸合成ADP-葡萄糖，随后(3)将葡糖基部分从ADP-葡萄糖转移至由糖原合酶(GlgA)催化的预先存在的α-1,4葡聚糖引物。糖原合成的后一步骤通常通过利用ADP-葡萄糖作为葡糖基供体来延长α-1,4-糖苷链而发生。
在细菌中，糖原合成的主要调控步骤在ADP-葡萄糖合成或上述步骤(2)的水平下发生，上述步骤(2)是由葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶(GlgC)(也称为ADP-葡萄糖焦磷酸化酶)催化的反应。相比之下，哺乳动物糖原合成中的主要调控步骤在糖原合酶水平下发生。如本文所示，通过改变光合微生物(如蓝细菌)的糖原合成途径中的调控和/或其他活性组分，且由此减少糖原的生物合成和储存，否则原本可储存为糖原的碳可用于合成其他基于碳的储存分子，如脂质、脂肪酸和甘油三酯。
在一个实施方案中，螺旋藻表达减少量的磷酸葡萄糖变位酶基因。在具体实施方案中，其可包含磷酸葡萄糖变位酶基因中的突变或缺失，所述基因包括任何其调控元件(例如，启动子、增强子、转录因子、阳性或阴性调控蛋白等)。由基因pgm编码的葡萄糖磷酸变位酶(Pgm)通常通过酶结合的中间体葡萄糖1,6-二磷酸来催化葡萄糖1-磷酸可逆转化成葡萄糖-6-磷酸。尽管此反应是可逆的，但葡萄糖-6-磷酸的形成是显著有利的。
在一个实施方案中，修饰的螺旋藻表达减少量的葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶(glgC)基因。在某些实施方案中，其可包含glgC基因(包括任何其调控元件)中的突变或缺失。由glgC基因编码的酶(例如，EC 2.7.7.27)通常通过催化以下化学反应来参与淀粉、糖原和蔗糖代谢：
ATP+α-D-葡萄糖1-磷酸→二磷酸+ADP-葡萄糖
因此，这种酶的两种底物是ATP和α-D-葡萄糖-1-磷酸，而其两种产物是二磷酸和ADP-葡萄糖。glgC编码的酶催化植物中的淀粉生物合成以及细菌中的糖原生物合成中的第一关键和限速步骤。它是调控植物和细菌中的储存多糖累积的酶位点，从而被变构活化或被能量通量的代谢物抑制。
由glgC基因编码的酶属于转移酶家族，特别是转移含磷核苷酸基团的那些转移酶(即，核苷酸转移酶)。这种酶类别的系统名称通常被称为ATP：α-D-葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶。常用的其他名称包括ADP葡萄糖焦磷酸化酶、葡萄糖1-磷酸腺苷酰转移酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase)、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(adenosine diphosphoglucose pyrophosphorylase)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ADP-葡萄糖合酶、ADP-葡萄糖合成酶、ADPG焦磷酸化酶以及ADP:α-D-葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶。
在一个实施方案中，螺旋藻表达减少量的糖原合酶基因。在具体实施方案中，其可包含糖原合酶基因(包括任何其调控元件)中的缺失或突变。糖原合酶(GlgA)(也称为UDP-葡萄糖-糖原葡糖基转移酶)是催化UDP-葡萄糖和(1,4-α-D-葡萄基)n的反应以产生UDP和(1,4-α-D-葡萄基)n+1的糖基转移酶。糖原合酶是α-保留葡糖基转移酶，其使用ADP-葡萄糖来将另外的葡萄糖单体并入到生长的糖原聚合物上。基本上，GlgA催化将过量葡萄糖残基逐一转化成聚合链以储存为糖原的最后步骤。
通常，根据序列、糖供体特异性和调控机制的差异，已将糖原合酶或α-1,4-葡聚糖合酶分成两个家族，动物/真菌糖原合酶和细菌/植物淀粉合酶。然而，详细的序列分析、预测的二级结构比较和线程(threading)分析显示这两个家族在结构上相关，并且获得动物/真菌合酶的一些结构域以满足那些细胞类型的特定调控要求。
已经针对某些细菌糖原合酶建立了晶体结构。这些结构显示所报道的糖原合酶折叠成如在糖原磷酸酶和糖基转移酶超家族的其他糖基转移酶中组构的两个罗斯曼(Rossmann)折叠结构域，其中在包括催化中心的两个结构域之间具有深裂缝。这种糖原合酶的N-末端结构域的核心由在两侧上由七个α-螺旋侧接的九链、主要平行的中心β-折叠组成。C-末端结构域(残基271-456)显示具有六链平行β-折叠和九个α-螺旋的类似折叠。此结构域的最后一个α-螺旋在位置457-460处经历扭结，其中蛋白质的最后17个残基(461-477)交叉至N-末端结构域并继续为α-螺旋，这是糖基转移酶的典型特征。
这些结构还显示，糖原合酶的整体折叠和活性位点结构与糖原磷酸化酶的总体折叠和活性位点结构非常相似，后者在碳水化合物储备的动员中起关键作用，从而表明共同催化机制和可比较的底物-结合性质。然而，与糖原磷酸化酶相比，糖原合酶具有更宽的催化裂隙，其被预测在催化循环期间经历重要的结构域间“封闭”运动。
已经针对某些GlgA酶建立了晶体结构。这些研究表明，GlgA的N-末端催化结构域类似于结合二核苷酸的罗斯曼折叠，并且C末端结构域采用参与协同变构调控和独特寡聚化的左手平行β螺旋。此外，调控因子结合位点与活性位点之间的连通涉及酶的若干不同区域，包括N末端、葡萄糖-1-磷酸结合位点和ATP结合位点。
葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶(glgC)、磷酸葡萄糖变位酶(pgm)和/或糖原合酶(glgA)基因可使用具有同源臂的载体全部或部分地缺失，所述同源臂靶向给定基因的上游和下游侧翼区并且与螺旋藻基因组重组以除去同源臂之间的区域中的核苷酸或用不同的序列(如报道基因或标记基因)置换核苷酸。鉴于载体序列中存在报道基因或标记(如药物选择性标记)，可容易地分离、鉴别和表征含有所述基因缺失的螺旋藻细胞。作为一个实例，选择和分离可包括使用本领域中已知的抗生素抗性标记(例如，卡那霉素、壮观霉素和链霉素)。这种基于可选择载体的重组方法不需要限于靶向上游和下游侧翼区，而且还可靶向给定基因内的内部序列，只要所述基因被赋予“非功能性”即可。缺失参与糖原合成的所有或部分基因不会伤害螺旋藻的生长，但是减少糖原的产生。
修饰的类胡萝卜素产生
类胡萝卜素可由包括螺旋藻的蓝细菌从脂肪和其他碱性有机代谢结构单元产生。类胡萝卜素在光合作用中起作用以保护光合系统的其他组分免受氧化应激。类胡萝卜素也可提供各种黄色至红色色素沉着色调。可通过减少某些基因的表达、增加某些基因的表达和/或引入外源基因来修饰蓝细菌中的类胡萝卜素生物合成。
含有crtG(2,2′-β-胡萝卜素羟化酶)的缺失的蓝细菌导致玉米黄质的合成和累积增加，同时保持典型的指数生长速率。此外，已经证明crtR(3,3’-β-胡萝卜素羟化酶)或crtZ(类胡萝卜素-3,3'-羟化酶)的表达导致在大肠杆菌菌株中产生玉米黄质，其中引入参与β-胡萝卜素合成的一系列基因，crtE、crtB、crtI和crtY。在一个实施方案中，crtR基因包含在SEQ ID NO:10中所列出的序列。在一个实施方案中，crtZ基因来自短波单胞菌属种(Brevundimonas sp.)SD212且包含在SEQ ID NO:11中所列出的序列。
另外，crtW(β-胡萝卜素加氧酶)和crtZ(类胡萝卜素-3,3'-羟化酶)的引入导致虾青素和角黄素在蓝细菌中的合成和累积。在一个实施方案中，crtW基因来自短波单胞菌属种SD212且包含在SEQ ID NO:12中所列出的序列。
本公开中描述的技术可用于敲除或赋予crtG的非功能性螺旋藻基因。另外，本公开中描述的技术可用于在天然螺旋藻启动子控制下或在包括强启动子和诱导型/阻遏型启动子的外源启动子控制下将crtR、crtZ和crtW基因添加至螺旋藻基因组。在一个实施方案中，调控crtW和crtZ基因的表达的启动子可以是紧密调控的启动子，以使得在不存储诱导的情况下，没有或基本上没有外源基因的表达。
例如，为了产生类胡萝卜素，修饰的螺旋藻可含有过度表达的类胡萝卜素羟化酶(例如，β-胡萝卜素羟化酶)。在这些和相关实施方案中，可通过使修饰的光合微生物经受应激条件如但不限于氮缺乏来进一步增加类胡萝卜素产生。一种示例性类胡萝卜素羟化酶由钝顶节旋藻NIES39_R00430的crtR编码。另一种示例性类胡萝卜素羟化酶由菠萝泛菌(Pantoea ananatis)的crtZ编码。还包括其同源物或横向同源物、其功能等效物及其片段或变体。功能等效物可包括具有向β-胡萝卜素添加羟基的能力的类胡萝卜素羟化酶。这些和相关实施方案可进一步与本文所述的内源性糖原路径基因(例如，钝顶节旋藻中的glgC)的表达和/或活性降低组合，以使碳远离糖原产生并朝向类胡萝卜素分流。
修饰的藻蓝蛋白和/或藻红蛋白产生
在一个实施方案中，螺旋藻可被修饰以使藻蓝蛋白和/或藻红蛋白的产生增加超出由在相同条件下生长的野生型螺旋藻产生的水平。与其胆汁三烯生色团相关的藻蓝蛋白和藻红蛋白分别是用于化妆品、食品和医学成像工业中的天然存在的蓝色和红色色素。这些色素分子可从蓝细菌中纯化。
许多蓝细菌的一种显著特征是称为藻胆蛋白体的大量光捕获结构。藻胆蛋白体(其给予蓝细菌其颜色多样性)占细胞蛋白质的达60％。这些大量蛋白质结构将能量直接转移至光合反应中心以用于光化学。
吸收光用于光化学的藻胆蛋白体中的色素分子是称为胆汁三烯的线性四吡咯分子。所有胆汁三烯通过半胱氨酸硫醚键联与藻胆蛋白共价结合。藻胆蛋白体中存在三种主要类别的藻胆蛋白；别藻蓝蛋白(AP)、藻蓝蛋白(PC)和藻红蛋白(PE)。每个类别包含形成异二聚体的α和β亚基。所述异二聚体的α和β亚基两者均可结合一种或多种胆汁三烯色素。
包含藻胆蛋白体的主要结构组分可细分为两组；“核心”亚结构和“杆”亚结构。在聚球藻属种菌株中，核心亚结构由两个由几种类型的藻胆蛋白和核心接头蛋白构成的圆柱体组成。杆亚结构由PCα和PCβ异二聚体的六聚体组成。这些异六聚体中的平均三个通过接头蛋白连接，并且堆叠在核心亚结构上。
上述技术可用于通过靶向同源重组将基因添加至螺旋藻。本公开中描述的技术提供添加已知编码藻蓝蛋白或藻红蛋白的基因的方式。上述技术还可用于添加编码与野生型藻蓝蛋白或藻红蛋白不同、但仍然具有与胆汁三烯生色团缔合的能力的多肽序列的基因或多核苷酸序列的部分。
实施例
现在将通过以下实施例来说明本公开的某些实施方案。然而，本公开可以许多不同的形式实施，并且不应被解释为限于本文所阐述的实施例；相反，提供这些实施例以使得本公开将是详尽且完整的，并且将本公开的范围完整地传达给本领域的技术人员。
实施例1
将从国立环境研究所(National Institute for Environmental Studies)(日本)的微生物培养物保藏中心(Microbial Culture Collection)获得的钝顶节旋藻NIES-39细胞在振荡下在连续照射下在SOT培养基中培养。当在750nm处的光密度达到0.6-0.8时，从60mL培养物中以1,500x g持续10分钟收获细胞，并且将所述细胞再悬浮于30mL的pH值平衡剂和盐溶液中。在相同条件下通过离心收集细胞，并且用聚醚渗透稳定剂洗涤三次。将细胞悬浮液在渗透稳定剂中稀释两次，且然后以1,500x g离心5分钟，并且将细胞悬浮液的总体积调整至2mL。
图1示出钝顶节旋藻的靶向基因座。所述基因座包含pilA基因(编码菌毛蛋白)。还示出了钝顶节旋藻基因组的对应于左同源臂和右同源臂的区域。所述左同源臂与目标基因座的“左”端(5’-末端)相邻，并且所述右同源臂与目标基因座的“右”端(3’-端)相邻。在此实施例中，左同源臂和右同源臂长约2000bp。
图2示出使用Gibson组装方法，通过组装含有载体主链、左同源臂、右同源臂和氨基糖苷腺苷酰转移酶基因(aadA)的四个PCR片段产生的pApl-pilA/aadA质粒。然后将此质粒用于转化钝顶节旋藻。pApl-pilA/aadA质粒包含置于同源臂之间的aadA。aadA赋予对壮观霉素和链霉素的抗性。因此，与此质粒同源重组用aadA基因置换pilA基因。所述质粒还含有在大肠杆菌中的AmpR启动子和复制起点(ori)控制下的AmpR基因(氨苄青霉素抗性)。将2.5μg的此质粒与200μL的细胞悬浮液混合。就在与所述质粒混合之后，使用Gene PulserXcellTM微生物系统(Bio-Rad,USA)对细胞进行电穿孔。
在电穿孔后，将细胞在SOT培养基中在减少的照射下在无振动的情况下生长48小时，然后转移至补充有链霉素的SOT培养基中。在选择用于转化细胞的培养基中存在链霉素。每隔几天更换含有链霉素的培养基，以维持抗生素的功效。在链霉素培养基中生长后，将细胞在具有链霉素和壮观霉素的SOT培养基中培养。
图3A是用包含在pApl-pilA/aadA质粒中的氨基糖苷腺苷酰转移酶(aadA)基因取代钝顶节旋藻中的pilA基因的开放阅读框的示意图。在成功的同源重组后，pilA基因被aadA基因置换。同源臂在示意图中以粗线示出。鉴别了与钝顶节旋藻基因组结合的三种引物A、B和C，并且鉴别了与质粒中的aadA基因结合的两种引物D和E。设计了引物A和C以通过存在于含aadA质粒上的同源臂以外的DNA聚合酶起始DNA合成。因此，引物A和C结合至钝顶节旋藻基因组的在转化后保持不变的区域。引物A具有SEQ ID NO:13。引物C具有SEQ IDNO:14。引物B结合至pilA基因上游的同源臂。引物B具有SEQ ID NO:15。引物D和E分别结合至aadA基因的上游端和下游端。引物D具有SEQ ID NO:16。引物E具有SEQ ID NO:17。
图3B示出在用如上所述的pApl-pilA/aadA质粒(ΔpilA)转化后，比较野生型钝顶节旋藻(WT)和钝顶节旋藻的用不同引物对的组合进行的聚合酶链式反应(PCR)的结果。在链霉素和壮观霉素中生长后收获的煮沸细菌的上清液用作PCR模板。在以下条件下进行PCR：对于具有引物B和C的反应混合物，在98℃下初始变性1分钟以及在98℃下变性30秒、每次循环在71℃-0.1℃下退火15秒和在72℃下延伸1.5分钟的35次循环，随后在72℃下最终延伸2分钟，然后冷却至4℃；对于具有剩余引物的反应混合物，在98℃下初始变性1分钟，随后在98℃下变性30秒、在66℃下退火15秒和在72℃下延伸1分钟的35次循环，随后在72℃下最终延伸2分钟并且冷却至4℃。使用两对引物(C/E和A/D)证实了aadA整合至靶向基因座中。凝胶上的梯状运行具有在5kb、1.5kb和500bp下的突出条带。在WT上未检测到使用C/E引物对的扩增，但在ΔpilA上确实产生在2.2kb下的强条带。类似地在WT上未检测到使用A/D引物对的扩增，但在ΔpilA上确实产生在2.1kb下的强条带。使用引物B和C允许跨越pilA或aadA的基因组序列的PCR扩增。WT样品(含有pilA)的扩增产生比转化的样品ΔpilA(含有aadA)的扩增(约3.4kb)稍短的PCR产物(3.1kb)。这证实了预期，因为aadA序列比pilA序列长约300-bp。PCR结果证明内源pilA基因被aadA基因置换。
图3C示出使用与pilA基因互补的引物F和G的PCR未能扩增来自在补充有链霉素和壮观霉素的SOT培养基中生长的转化细胞的任何DNA，从而表明pilA基因的每个拷贝在存在抗生素的情况下生长的培养物中被置换。然而，用引物F和G扩增扩增了来自在无抗生素的SOT培养基中生长的WT的340-bp序列，从而证实引物F和G在扩增pilA基因方面是有效的。引物F具有SEQ ID NO:18。引物G具有SEQ ID NO:19。此凝胶上的梯状运行具有在5kb、1.5kb和500bp下的突出条带。
实施例2
节旋藻属种PCC 8005细胞从保持在巴斯德研究所(Pasteur Institut)(巴黎)的蓝细菌实验室保藏中心(Laboratory Collection of Cyanobacteria)中的蓝细菌的牧草培养物保藏中心(PCC)获得，并且在SOT培养基中在连续照射下在振荡下培养三天。在三天期间，将细胞在新鲜的SOT培养基中稀释3或4次。将细胞保持在上述条件下，直到在750nm处的光密度达到所需水平。然后从所述培养物以3,200x g收获细胞10分钟。除去上清液，并且将细胞悬浮在pH值平衡剂和盐溶液中以中和pH。在相同条件下离心后，用1-50mL的0.1-100mM NaCL和渗透稳定剂洗涤细胞三次，且然后转移至两个1.5mL聚丙烯微量离心管(例如，
Figure BDA0003247618660000321
管)中。将1.5mL微量离心管在室温下以3,200x g离心5分钟，并且丢弃上清液。将细胞悬浮液在NaCL和渗压剂溶液中两倍稀释，然后再次以3,200x g离心5分钟。除去上清液，且将细胞悬浮液的总体积调整至450μl。
图4示出通过使用Gibson组装方法以连接含有载体主链、左同源臂、右同源臂和编码氨基糖苷腺苷酰转移酶的aadA的四个PCR片段产生的pApl-pilA8005/aadA质粒(SEQ IDNO:2)。在pApl-pilA8005/aadA质粒中，aadA位于右同源臂与左同源臂之间，所述同源臂含有与节旋藻属种PCC 8005中的pilA开放阅读框上游和下游发现的基因组序列相同的序列。左同源臂是2.0kb，并且右同源臂是1.0kb。aadA赋予对壮观霉素和链霉素的抗性。因此，在节旋藻属种PCC 8005与此质粒之间的同源重组用aadA基因置换节旋藻属种PCC 8005的pilA基因。pApl-pilA8005/aadA质粒还含有编码β-内酰胺酶(AmpR)的操纵子，所述操纵子在来自大肠杆菌的AmpR启动子和复制起点(ori)控制下赋予氨苄青霉素抗性。
将400μL的悬浮细胞与0.1–20μg的pApl-pilA8005/aadA质粒混合，并且转移至电穿孔杯中。就在混合之后，使用Gene Pulser XcellTM微生物系统(Bio-Rad,USA)电穿孔系统进行电穿孔。
在电穿孔后，将1mL的SOT培养基添加至所述杯中，然后将细胞和SOT培养基转移至含有9mL SOT培养基的50mL聚丙烯锥形离心管(例如，
Figure BDA0003247618660000331
管)中。将细胞在减少的照射下在30℃下孵育。在链霉素和壮观霉素存在下选择通过抗生素抗性鉴别的成功转化体。
图5A是用包含在pApl-pilA8005/aadA质粒中的氨基糖苷腺苷酰转移酶(aadA)基因取代节旋藻属种PCC 8005中的pilA基因的开放阅读框的示意图。在成功的同源重组后，pilA基因被aadA基因置换。同源臂在示意图中示出为阴影框。鉴别了结合至节旋藻属种PCC8005基因组的两种引物H和I，并且鉴别了结合至所述质粒中的aadA基因的一种引物J。引物H通过存在于pApl-pilA8005/aadA质粒上的同源臂以外的DNA聚合酶起始DNA合成。因此，引物H结合至节旋藻属种PCC 8005基因组的在转化后保持不变的区域。引物H具有SEQ ID NO:20。引物I结合至pilA基因上游的同源臂。引物I具有SEQ ID NO:21。引物J具有SEQ ID NO:22。
图5B示出对从在抗生素存在下培养的细胞提取的DNA进行的PCR的结果。用引物对H/I和H/J对野生型节旋藻属种PCC 8005(WT)和用pApl-pilA8005/aadA质粒转化、从而产生pilA(ΔpilA)的缺失之后的节旋藻属种PCC 8005进行PCR。在实施例1中的以上所述的条件下进行PCR。因为在野生型节旋藻属种PCC 8005中不存在引物J的退火位点，所以H/J引物对将仅在含有从转化的细胞提取的DNA的反应混合物中产生扩增，从而表明节旋藻属种PCC8005的pilA被aadA置换。使用两对引物(H/I和H/J)并且通过在1％w/v琼脂糖凝胶上运行PCR产物比较所述结果来证实aadA整合至靶向基因座中。
用引物对H/I扩增从野生型节旋藻属种PCC 8005提取的DNA显示2.5kb与3kb之间的条带，从而表明pilA基因的存在。如所预期，用H/J引物对扩增WT节旋藻属种PCC 8005不产生任何条带，因为在无转化的情况下，aadA不存在于节旋藻属种PCC 8005基因组中。当用H/I引物对或H/J引物对扩增时，从转化的细胞提取的DNA产生PCR产物。当在来自转化的细胞的DNA上使用H/I引物时，存在大约3kb的条带，其略大于由野生型节旋藻属种PCC 8005的H/I引物对扩增产生的条带。这证明含有aadA的染色体被完全分离，因为aadA比pilA长大约300bp。与WT细胞不同，转化的细胞也用H/J引物对扩增，从而产生略高于2kb的条带。PCR结果证明内源pilA基因被aadA基因置换，并且aadA基因在所有染色体拷贝上复制。
实施例3
使用来自实施例2的程序修饰钝顶节旋藻NIES-39，以将编码β-胡萝卜素3,3’-羟化酶(CrtZ)和β-胡萝卜素4,4’-酮醇酶(CrtW)的外源基因引入内源NIES39_Q01220基因座。钝顶节旋藻不天然地合成虾青素，但是crtZ和crtW的引入提供能够合成这种有价值的类胡萝卜素的生物合成途径。crtZ基因从菠萝泛菌(SEQ ID NO:23)获得，并且crtW基因从短波单胞菌属种SD212(SEQ ID NO:24)获得。这两种基因已被证实在细长聚球藻PCC7942中起作用，并且被密码子优化以用于在蓝细菌中表达。
产生pApl-NS1/Prs-crtW-crtZ质粒以将crtZ和crtW引入到钝顶节旋藻中。所述质粒包含连接至核糖开关的诱导型trc启动子下游的aadA基因以及crtZ和crtW基因。图6示出pApl-NS1/Prs-crtW-crtZ质粒(SEQ ID NO:3)的设计。所述质粒通过实施例1中描述的相同技术产生。
除使用pApl-NS1/Prs-crtW-crtZ质粒代替来自实施例1的pApl-pilA/aadA质粒外，初始地如实施例1中所述进行电穿孔和培养技术。在所述变化之后，转化不成功。不受理论束缚，据信CrtW和CrtZ在蓝细菌中的表达破坏可抑制细胞生长的光系统。理论上，所选择的启动子在诱导不存在的情况下不能充分抑制crtZ和crtW基因的表达。因此，CrtW和CrtZ蛋白的存在可能阻止任何转化的细胞生长。用能够抑制生长的基因转化可取决于非常严格地调控基因表达的启动子设计。启动子、插入基因与转化成功之间的相互作用是进一步研究的领域。
实施例4
通过添加编码C-藻蓝蛋白α和β亚基的cpcA和cpcB基因的另外拷贝来修饰钝顶节旋藻NIES-39。WT钝顶节旋藻NIES-39仅具有单组这些基因。增加这些内源基因的拷贝数增加了蓝色C-藻蓝蛋白的合成。cpcA(SEQ ID NO:25)和cpcB(SEQ ID NO:26)基因从WT钝顶节旋藻NIES-39获得。
通过在实施例1中描述的技术来产生用于将cpcB和cpcA引入钝顶节旋藻中的质粒。图7示出pApl-NS1/aadA-cpcBA质粒(SEQ ID NO:4)的示意图。所述质粒含有低拷贝p15A复制起点、pilA启动子(pilA开放阅读框上游的a168-bp序列)、aadA、以及从cpcB上游278-bp至基因座NIES39_Q01220的中间中的cpcA的3’端范围内的基因组序列(SEQ ID NO:27)。插入位点的1.5-kb侧翼区是将外源基因操纵子整合至靶向基因座(即NIES39_Q01220)中的左同源臂和右同源臂。
使用实施例3中所描述的方案，用pApl-NS1/aadA-cpcBA质粒转化钝顶节旋藻NIES-39。
在转化后，携带cpcB和cpcA的第二拷贝的菌株在与其亲本菌株(即钝顶节旋藻NIES-39)相同的条件下在160mL SOT培养基中生长。每隔一天从12mL的每种培养物中收获细胞，以定量C-藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的量。将收集的细胞再悬浮于5mL的100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)中，并且在室温下以3,200x g离心5分钟。将沉淀悬浮于2.5mL的100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)中；并且将700μl的悬浮细胞转移到预定比例的PVDF(聚偏氟乙烯或聚偏二氟乙烯)膜上。在所述膜上用水(15–20mL x 2)充分洗涤细胞，并且在烘箱中干燥过夜，以计算干生物质的重量。将悬浮于100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)中的剩余细胞储存在-80℃下，并且在相同的100mM磷酸钠缓冲液中稀释至2.0mg干细胞重量/mL缓冲液。通过在30℃下轻轻搅拌将细胞溶解过夜，并且在4℃下以16,000x g离心30分钟。将上清液转移至新管中，并且在相同条件下再次离心。将上清液稀释在100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)中，并且以5-nm间隔在450nm与750nm之间测量光密度，以证实不包括叶绿素和类胡萝卜素。使用澄清的细胞溶解产物在620nm和650nm的光密度来计算C-藻蓝蛋白(Cpc)和别藻蓝蛋白(Apc)的含量。使用等式ODλ＝CCpc x Eλ,Cpc+CApc x Eλ,Apc(其中λ等于620或650nm)来计算C-藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的浓度，其中CCpc是C-藻蓝蛋白的浓度(mg/mL)，Eλ,Cpc是C-藻蓝蛋白的消光系数，CApc是别藻蓝蛋白的浓度(mg/mL)，Eλ,Apc是别藻蓝蛋白的消光系数，并且OD(光密度)是吸光度。这一等式的用途描述于Yoshikawa和Belay(2008)J.AOAC Int中。
图8A-D是比较转化为包含cpcA和cpcB各自的总计两个拷贝的钝顶节旋藻NIES-39(虚线)和WT钝顶节旋藻NIES-39(实线)的藻蓝蛋白产生和生长的图。所有图的误差条显示来自三次独立实验的标准偏差。如上所述，每隔一天，即在第2天、第4天和第6天从培养物中收获细胞。所有图8A-D的数据从在相同条件下生长的细胞中收集。
图8A示出作为干生物质的百分比测量的Cpc和Apc产生。与WT菌株(实线)相比，转化的菌株(虚线)具有比Cpc多大约3％-5％的其生物质。对于两种菌株，Cpc的百分比在第4天达到峰值，然后降低。Apc的水平在转化的菌株中比在WT菌株中低约1％。
表1显示作为纯藻蓝蛋白和粗藻蓝蛋白进一步分析的作为干生物质的百分比的藻蓝蛋白水平。
干生物质％
Figure BDA0003247618660000371
表1
使用以下等式来计算纯藻蓝蛋白：
Figure BDA0003247618660000372
粗藻蓝蛋白表示所有藻胆蛋白色素并且使用以下等式来计算：
Figure BDA0003247618660000373
图8B示出作为总可溶性蛋白质的百分比测量的Cpc和Apc产生。对于WT菌株(实线)和转化的菌株(虚线)，Cpc的百分比随时间增加。与WT菌株相比，转化的菌株具有比Cpc多大约5％的其总可溶性蛋白质。对于两种菌株，Apc水平较低且相对稳定，其中与WT菌株相比，转化的菌株具有比Apc少约1％的总可溶性蛋白。
图8C示出每升细胞培养物以藻蓝蛋白的克数计的总Cpc和Apc产生。在所有时间点，转化的菌株(虚线)的总Cpc产生多于WT菌株(实线)的总Cpc产生，并且差异随时间增加。Apc水平也随时间增加，但WT菌株产生比转化的菌株更高的Apc水平。Cpc和Apc的含量取决于生长期而变化，但是在所有时间点和在所有条件下，转化的菌株比WT菌株积累50％-100％更大量的Cpc和更少的Apc。
图8D比较WT菌株和转化的菌株的生长。转化的菌株(虚线)在第0-4天以与WT菌株(实线)相同的速率生长，并且在第6天仅稍微更慢。
实施例5
为了分析来自WT钝顶节旋藻NIES-39和以上所述的转化的菌株的提取物，将两种菌株在SOT培养基的50L光生物反应器中培养以获得足以用于蛋白质提取的生物质。使用滤筒浓缩培养物，然后通过以3,000x g离心10分钟来收获细胞。然后将浓缩的细胞冻干。将来自两种菌株中的每一种的2克干燥生物质悬浮于20mL水中，并且以3,200x g离心5分钟以收集溶胀生物质。除去上清液，并且将沉淀悬浮于20mL水中。在相同条件下离心后，然后通过重复移液将沉淀悬浮于80mL的20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)中，并且在室温下轻轻搅拌30分钟。使用Qsonica超声仪Q700在室温下在50％的最大振幅下持续30秒进行超声处理两次。在超声处理后，将悬浮的细胞在室温下连续搅拌过夜。为了从细胞溶解产物中回收水溶性提取物，将样品在4℃下在10,000x g下离心30分钟一次，然后在16,000x g下离心两次。将72ml来自每种细胞溶解产物的上清液转移至玻璃烧杯中，将45mL的在20mM磷酸钠(pH 6.5)中的100％饱和硫酸铵逐渐滴入所述烧杯中，其中在4℃下轻轻搅拌澄清的细胞提取物。将细胞溶解产物和硫酸铵的混合物搅拌1小时，通过在4℃下以16,000x g离心30分钟来回收沉淀的蛋白质。将沉淀用20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)悬浮以将总体积调整至50ml，并且在4℃下使用Slide-A-Lyzer盒相对于2L的20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)进行透析。将外缓冲液交换三次(3小时，过夜，然后4小时)。将样品在4℃下以16,000x g离心30分钟，并且将回收的上清液在相同条件下再次离心。
图9A是示出从两种菌株的最终离心回收的上清液具有不同蓝色强度的照片。含有WT钝顶节旋藻NIES-39的管900具有浅蓝色；并且含有用pApl-NS1/aadA-cpcBA质粒转化的菌株的管902具有更深的蓝色。C-藻蓝蛋白具有强烈的蓝色，其中单一可见吸光度最大值为约620nm。因此，预期更深的蓝色来自过度产生C-藻蓝蛋白的菌株的上清液。
图9B是示出转化的菌株(实线)与WT菌株(虚线)之间的吸收差异的图。两种菌株均展示约620nm的吸光度峰。转化的菌株的峰值吸光度是大约0.60cm-1，并且WT菌株的峰值是大约0.35cm-1。这定量地证实了图9A中所示的定性颜色差异。C-藻蓝蛋白提取物的质量可通过藻620nm下的光密度(OD620)与在280nm下的光密度(OD280)的比率来确定。更高的比率指示可适合用于较高价值用途如化妆品而不是较低价值用途如食品级染料的更高C-藻蓝蛋白产率和纯度。图9B中的图示出转化的菌株的OD620/OD280比值是2.5，而WT菌株的OD620/OD280比值是1.8。这表明来自转化的菌株的回收上清液的高40％的C-藻蓝蛋白浓度。
说明性实施方案
实施方案1是一种螺旋藻，其包含至少一个稳定的靶向突变。
实施方案2是如实施方案1、4-11或25中任一项所述的螺旋藻，其中所述螺旋藻是钝顶节旋藻或极大节旋藻。
实施方案3是如实施方案1、2、4-11或25中任一项所述的螺旋藻，其中所述螺旋藻是钝顶节旋藻NIES-39或节旋藻属种PCC 8005。
实施方案4是如实施方案1-3、5-11或25中任一项所述的螺旋藻，其中所述稳定的靶向突变被遗传至少10代。
实施方案5是如实施方案1-4、6-11或25中任一项所述的螺旋藻，其中所述稳定的靶向突变被整合至所述螺旋藻的染色体中。
实施方案6是如实施方案1-5、7-11或25中任一项所述的螺旋藻，其中所述靶向突变包括基因的至少一部分的缺失或破坏。
实施方案7是如实施方案1-6或8-11中任一项所述的螺旋藻，其中所述靶向突变包括内源基因的另一拷贝的添加或外源基因的添加。
实施方案8是如实施方案1-7、10或11中任一项所述的螺旋藻，其中所述靶向突变包括基因调控元件的添加。
实施方案9是实施方案8的螺旋藻，其中所述基因调控元件是启动子、调控蛋白结合位点、RNA结合位点、核糖体结合位点、或RNA稳定性元件。
实施方案10是如实施方案1-9或11中任一项所述的螺旋藻，其中所述靶向突变包括外源蛋白质结构域的添加。
实施方案11是实施方案10的螺旋藻，其中所述外源蛋白质结构域是磷酸化位点、稳定性结构域、蛋白质靶向结构域或蛋白质-蛋白质相互作用结构域。
实施方案12是一种在螺旋藻中产生靶向突变的方法，所述方法包括：使所述螺旋藻与渗透稳定剂接触；使所述螺旋藻与具有同源臂的载体接触；并且在所述螺旋藻中诱导人工感受态。
实施方案13是如实施方案12或15-24中任一项所述的方法，其中所述螺旋藻是钝顶螺旋藻。
实施方案14是如实施方案12或15-24中任一项所述的方法，其中所述螺旋藻是钝顶节旋藻NIES-39或节旋藻属种PCC 8005。
实施方案15是如实施方案12-24中任一项所述的方法，其中所述渗透稳定剂是聚乙二醇、乙二醇、甘油、葡萄糖或蔗糖中的至少一种。
实施方案16是如实施方案12-24中任一项所述的方法，其中所述载体是DNA载体、线性载体、环状载体、单链多核苷酸或双链多核苷酸。
实施方案17是如实施方案12-24中任一项所述的方法，其中所述载体包括具有SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的载体。
实施方案18是如实施方案12-24中任一项所述的方法，其中所述同源臂中的至少一个是至少500bp。
实施方案19是如实施方案12-24中任一项所述的方法，其中所述同源臂中的至少一个是至少1000bp。
实施方案20是如实施方案12-24中任一项所述的方法，其中所述同源臂中的至少一个是至少2000bp。
实施方案21是如实施方案12-20和22-24中任一项所述的方法，其中所述人工感受态通过在含有二价阳离子的溶液中孵育、通过电穿孔或通过超声来诱导。
实施方案22是如实施方案12-24中任一项所述的方法，其还包括使所述螺旋藻与pH值平衡剂接触。
实施方案23是根据实施方案22或24中任一项所述的方法，其中使所述螺旋藻与所述pH值平衡剂接触在使所述螺旋藻与所述载体接触之前进行。
实施方案24是根据实施方案22或23中任一项所述的方法，其中含有所述螺旋藻和所述pH值平衡剂的培养基的pH值是约7至约8。
实施方案25是一种螺旋藻，其由于通过用至少一种DNA构建体转化所述螺旋藻来在至少一种蛋白质的基因座处引入修饰而缺乏所述蛋白质，所述DNA构建体包含与所述基因座的至少一部分同源的序列以及在所述基因座处的所述修饰和所述DNA构建体的整合，所述螺旋藻另外能够以其天然方式起作用。
实施方案26是一种螺旋藻，其由于通过用至少一种DNA构建体转化所述螺旋藻来在靶向基因座处引入编码藻蓝蛋白的外源基因而包含所述外源基因，所述DNA构建体包含与所述靶向基因座的至少一部分同源的序列以及在所述基因座处的所述外源基因和所述DNA构建体的整合，所述螺旋藻相对于野生型螺旋藻产生数量增加的藻蓝蛋白并且在多个传代中维持所述转化。
序列表
<110> 流明生物科学公司
<120> 螺旋藻中的靶向诱变
<130> M077-0017USP1
<160> 27
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 6994
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有同源臂以及针对Asd (GGCGCGCC)和EcoRI (GAATTC)的限制性位点的包含addA基因的pApl-pilA质粒主链
<400> 1
gaattcacat acgcggccgc ctgggccttg agctcgaatt tcctgcatta atgaatcggc 60
caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 120
tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 180
cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 240
aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 300
gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 360
agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 420
cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 480
cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 540
ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 600
gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 660
tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga 720
acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 780
tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 840
attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 900
gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 960
ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 1020
taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 1080
ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 1140
ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 1200
gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 1260
ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 1320
gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 1380
tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 1440
atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 1500
gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 1560
tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 1620
atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 1680
agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 1740
ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 1800
tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 1860
aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 1920
tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 1980
aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 2040
accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc 2100
gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 2160
gcttgtctgt aagcggatgc caagcttgca tgcctgcagg tggcgcgccg aatgacgcta 2220
acagcaggac ctatattggg aattaggttg aggagtccgg cgagaatggc attggcgaaa 2280
attaagggga ctctcagtat ccacaagccg actactgtta gtagggtgac accaatcatg 2340
ttgagtaagg caccgattag ccaacgacct agggctattt cgcaagtatc gagaatgtcg 2400
ttcattcgcc ttcggtaaaa ggcgggaatt agttgtaagc tgctgcgacg gtaggcttgg 2460
gggtcggcta aaagcatgag ggtgaggacg aggattaata agatgctgac taatccttct 2520
actgtggttc cgacgacgac cccaaaaccg ccgattaatt gattgctgag ggcttgggct 2580
tgttggataa tttgttcgat gcggatctgt ctcaggtcgc gactgacttc tgatagatat 2640
tcccgtaagg gtccgttgag gtcggtgcgt aaatagtcaa ttaacaggtt cagcagcttt 2700
agaccttgtt cgagaccggc ggggacctgt ttggctagtt gttctaattg gttgattagg 2760
ggggggacta ccaataaaaa gccgatggta atccctaaga agaatagact aatggatagg 2820
aagacggcaa gcgatcgcgg tagtttcaga cgctggaatt gacgggtgag acggtttaag 2880
gcggtggcta ggacgacggc ggcgaaaatc atcagcaggg cttgtttaat ccgccacagg 2940
atgtatatag cgattaagaa agctgtgaag cctatccatg tacctagggt cattgcgact 3000
gttgagggtg agagaatttg cttttctaca ggcgatcgcc tgtacaatag ttatctatca 3060
tagaatacta gattctgtgg tgggattcca ccaaagccag ccagctacct atgacgcaac 3120
ccagatatga tgaacaggaa aatatatctc gccacgcagc ggtagatgaa ggatgctgcg 3180
aggatatgga acgaaaatat gggtggaatc ttgtgcgaat tgaggtaacc tcagatccta 3240
tccttgaggt tgattgcgta tttctgggga aaacggagtt tcctcggccc tataatgaaa 3300
ctgataagga ggaagattga tgcgaaaata catcattttt cgggctgata agggtgaacc 3360
tggttggaaa gaacgtaaac tccaacatac ccagggttta actagaattt tggctgaaca 3420
tttcgactct tctgatcaac ctattcctga gttgggatat cgaccgaggg agtttattcg 3480
tattgatggg ttgcataatc ccactgaaca tggctacagc acccattatc gtcagggtga 3540
ctgggaagta actagggtag aaagttactc tcctgatgtg tctatggctg agtttgatat 3600
gatcgtgatt tgcttttgca aatatagccc tgttaatggt cctgtgcaac ctatgccaga 3660
gcgtcgagtg tctgtagatg ggttcgctgg ggatgagaag cggttggagc aatggcacga 3720
gtcccaaaag aaaccgactg aggtttagtt ggtccccggt ttgcttattt gactagccag 3780
attcgccacg acaacagaac cgccagcagg gaagagggga atagaaccgc gaaaagagcg 3840
atcgcattgg tttcgggaat ggcgaaattt ggcccgccat atttgatcag taaggatagc 3900
cctagggata ggatcaggat tttggccacc aataacagtt tgttgtccat ttatatatag 3960
gatgcgatgg gatgcgatcg cctatatttt accaattggt ggcggcctta accccctaag 4020
ccctatgtct gacacccagt caccccaacc gccttagtcg gtattcccca ctgggtgggc 4080
gatacacgat ttcccggaaa aattgaaaaa aaattttgtg gcaggtgata tgatttgcga 4140
tcgaggtggg taagttagaa ctacagaaaa caaataacct catttcaccc cgaggagaac 4200
gaattatgag ggaagcggtg atcgccgaag tatcgactca actatcagag gtagttggcg 4260
tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg 4320
atggcggcct gaagccacac agtgatattg atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg 4380
atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg accttttgga aacttcggct tcccctggag 4440
agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt 4500
ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg 4560
caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa 4620
gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag cggcggagga actctttgat ccggttcctg 4680
aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact 4740
gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa 4800
ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc 4860
agtatcagcc cgtcatactt gaagctagac aggcttatct tggacaagaa gaagatcgct 4920
tggcctcgcg cgcagatcag ttggaagaat ttgtccacta cgtgaaaggc gagatcacca 4980
aggtagtcgg caaataacag ataatctagc agtttaggtt tcagatggag tcagctaggg 5040
tctttaaccc catcgtcaac tataagatgg agagatggca tacggtgaca ctgttaaagc 5100
cataactata ttgctcttgt tgataaaatc agaaactgag gccacttgag agtattgtaa 5160
ataggtagta cagtagtgct acctattttg ttttaaaata actaattgag tttatcgctg 5220
ggactatggt tgataatcag atgtcggaaa agcagaatat tttatcagca gaagctgata 5280
tttacttgca taaaagggat tatcaacaag cagccatttt atatgaacaa gccatcaatc 5340
tcaatcccga ctataaatat aattactgga aactggggtt aaccctgctg ctacaggagc 5400
gggaggaaga agcccagacc acctggctgg tggcgatgag tgatggagac ccagaacaga 5460
ttgaccagtg gacgatagac ttactcgagg tgctatcatc agaagccgat gcacgaacct 5520
ccgccgaaga ctattccgtg gcttggggga ttcgccaaca cattttagaa ataaaccccc 5580
atggtattga taatatatta aagttaattg atttgtcaat taccctgaca acctataccg 5640
gaaatgagat cgcagaatat ggactggttc ccttactgca acaggagtcc atcaatgtca 5700
atccagattt actactgcac ctgtggaaaa aactcctagt tgtagatgca attaatcccc 5760
tatctctgga attgggagag gcggtgatta accatcttgg tgagcaaccg gagtttgtca 5820
ctagcttaat ccctaaatta tacgatattg cctattcctt tggtgaaata ggtatagcca 5880
agggctatgg agagttgttg ttgaacctgg caccgcatca tcaagagttg ctgagggctc 5940
tggctcaatt ttgtattcaa ttaaccgagt atgaccatgg cattgaatat gccagacgtt 6000
cctatcatct cactgaatcc ccagatcagc aagccctgga tagcaatttt atgatcagtg 6060
gtctgatgtc tcaaggggga tgcacaaagc aagtgcgaga ggtggtcaac catcaggaat 6120
cattgctgga tgctatgctg aaagacccgc ccctagactt gggaactggg gttatgcaat 6180
tatataatac cagctttttc tttccttatg ttagagattc acctgctgtc aactcacaaa 6240
taaaagccca agttgctcaa atttgccaag ccaacttaga aacggctcag gcagaaaata 6300
tcgccacata tcaagcccgg aatttacaga aacgccatca atccgcgacc aatcaacccc 6360
taaaaattgg ttatatatct tattgtttcc ggcggcattc tgtgggttgg atatctcgct 6420
ggttatttca acatcacgat cgcgataaat ttgaaattta tgcctatatg attggggcag 6480
aaaatcgaca agatgctctc caaaactggt atgcagaaca agccaacaag tcttatcaat 6540
atggaatagt aagcacagaa gttgccgagc aaatttctga agaccagatt gatattctca 6600
ttgatttaga tagcctgaca ttaaccaata cctgcgccat tatggcactt aaacccgcac 6660
ctgtacaagt cacctggttg ggatgggatg cctctgctat acccaccgtt gactatttta 6720
ttgctgaccc ctatgttttg ccagaaaatg cccaggatta ttactcagaa accatctggc 6780
gactacctca aacctatgtg gccgtcggtg gcttcgaggt cggcattccc agtttgcgaa 6840
gagaggatat caatattccc gaaaatgcca ttgtttattt taccgcccaa agggggccga 6900
aatacaaccc agaactagcc caattgcaaa tgcaaattct gaaacaagta cccaatagtt 6960
atttggtaat taagggattc gataaagagc aatc 6994
<210> 2
<211> 5967
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含由同源臂侧接的aadA基因的pApl-pilA8005/aadA质粒
<400> 2
gcctgggcct tgagctcgaa tttcctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 60
ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 120
cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 180
ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 240
aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 300
cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 360
cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 420
gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 480
tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 540
cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 600
ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 660
gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc 720
gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 780
accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 840
ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 900
tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 960
aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 1020
taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 1080
gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 1140
agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 1200
cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 1260
tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 1320
gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 1380
agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 1440
gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 1500
atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 1560
gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 1620
tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 1680
atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 1740
agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 1800
gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 1860
cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 1920
tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 1980
ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca 2040
ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac 2100
ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat 2160
gccaagcttg catgcctgca ggtggcgcga acagaagacg accaacactt tctccctgat 2220
gggttgcgcc ctgatcaatg tcctttaaac cctgatacgt tcttcaaccg tcgaacctag 2280
tccaaccgag tagcccataa ctgaccaccc tatttaatca tgttgcattc tgagcggaac 2340
catgttcaac cccaaactat cccccaagtt ctcccggtcc agtgaatctg gctacaccct 2400
gcttgagtcc atcatggcta tggtggtggt cagcatcctg atggtcggca tttctccggt 2460
gttgggtttt gccttcgcca cacgggtaca ggctcggcgc atagaactag ccagcagagc 2520
cgctaacagt tatatcagtg ctgtccgtac tgacccaacc aataccaact tggtgctgtt 2580
caatcccagt gaccggaacg ctggaccaac tgcaactggt agcttgaact gtggggctgg 2640
tcgagcctgt accaccccag ccaacttgtt ctgtgtggat aatgacggaa gtgggggatg 2700
tgaaaccgat agccccacgg atatgattgt tcagggaatt ggcataaatg agtgtagcga 2760
cgagctagag aatggttatc agttgattgt cagggtgtat cgtgctgacg catttgccca 2820
atcgggacaa ctagaggggg ctaatgatga cgggtctagt aatttagcga gttcccgagt 2880
cggtttagga aaccccagag accccctagt gcaggtgcga accgagatta gccccactag 2940
caccagttcc tttgggagtt tacgtgaccg tttagcagga tgcagttctg acgatgaagg 3000
ggattaatag gtttggtgat ggttcccatg gagtgcaaaa gtaagattat cccggtagag 3060
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<211> 8117
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含aadA基因、crtW、crtZ、和同源臂的pApl-NS1/Prs-crtW-crtZ质粒
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<211> 8146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有p15A复制起点的包含aadA、cpcA和
cpcB基因的pApl-NS1/aadA-cpcBA质粒主链
<400> 4
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gaatttgtcc actacgtgaa aggcgagatc accaaggtag tcggcaaata actagctggc 2520
ctggaagggt gggaaagtgt taacaactgg ttgacaatat tccgcttttc caggtcttgt 2580
cgaagtacgc ggaccgttga aggggtgaga aggaaggcga atgttgattt atgaagtttg 2640
attaacattt gtatcaaaat ataaaattct tctcataaac cctgtacaat cttttaagat 2700
ttcggaaagt gttctaggat actgaagaaa tgaaccacgg ggcaattgtt aaaagccttt 2760
gtcgatggtt cgccccggaa ggggtcttag gaggtgacac cgatggattg attgtcgtga 2820
tcattcatgg tgtgtccaat cccaactcaa ctctaagcaa gtcaacaagt aggagataaa 2880
tccatgtttg atgccttcac caaggtggtt tctcaagctg atactcgcgg cgaaatgctg 2940
agtacagctc aaatcgatgc tctgagccaa atggttgctg aaagcaacaa acgtttggat 3000
tctgttaacc gcattaccag caacgcttcc accattgttt ccaacgctgc tcgttctttg 3060
ttcgcagagc aaccccaact gattgctccc ggtggaaacg cctacaccag ccgtcgtatg 3120
gctgcttgct tgcgtgacat ggaaatcatc ctgcgctatg taacctacgc tgtgtttgct 3180
ggcgatgcaa gtgttctcga agatcgttgc ttgaacggtt tgcgtgaaac ttacctggct 3240
ttgggaactc ccggttcttc cgttgctgtc ggtgttggca aaatgaaaga agctgctctg 3300
gcgatcgtta acgatcccgc aggtatcact cctggtgatt gtagcgcttt ggcttcagaa 3360
atcgctggtt actttgaccg tgctgctgca gcagtttcct aatcaagcag atccatagca 3420
tataacaatt gaaacagttt agctgaagtc taagtgactg gacttctgtt tgttacctaa 3480
ttttttgtaa accaatcggg agataactcg agaatgaaaa cccccctaac cgaagcagtt 3540
tctatcgctg attcccaagg tcgtttccta agcagcaccg aaatccaagt agcttttggc 3600
cgttttcgtc aagccaaagc tggtctggaa gctgctaaag ctttgacctc taaagctgat 3660
agtctgatca gtggtgctgc ccaagcagtg tacaacaagt tcccctacac cacccaaatg 3720
cagggaccta actacgcggc agaccaacgc ggtaaggaca aatgtgctcg tgacataggc 3780
tactacctgc ggatggtaac ttattgcctg attgctggtg gaactggccc catggatgag 3840
tacctgattg ccggtattga tgaaatcaac cggactttcg agctttctcc aagctggtac 3900
attgaagccc tgaaatacat caaagctaac cacggtttgt ctggtgacgc tgctgttgaa 3960
gctaactcct acctcgacta cgcgatcaac gccctgagct agactagtca tcgagctagc 4020
aagcttggcc ggatccggcc ggatccggag tttgtagaaa cgcaaaaagg ccatccgtca 4080
ggatggcctt ctgcttaatt tgatgcctgg cagtttatgg cgggcgtcct gcccgccacc 4140
ctccgggccg ttgcttcgca acgttcaaat ccgctcccgg cggatttgtc ctactcagga 4200
gagcgttcac cgacaaacaa cagataaaac gaaaggccca gtctttcgac tgagcctttc 4260
gttttatttg atgcctggca gttccctact ctcgactacg ggtattgatg tggcgacggc 4320
tgttcaaaat tggggcggcg gttcttctca acctcaacct acttccacag ctaaaagtct 4380
caaatcttcc cgcactaatg gtcaagctgt tcgccgcact aatggcgcag cacctaagcc 4440
agaagatact acacaaagcc tacagagcga ggttaaacaa ctacttgatc atgtcgcaca 4500
aaatactaag aataatgctg aggctgaaga ggcgatcgcc caggctttgc gacagtatcc 4560
taacctcaag cgtcgtttac agatgctttt taagtctcag ggaactcagg cgatccgaaa 4620
tatgtttaat caccctacta tctacatccc taccgctatg ctgcaaatgt ggctagaaca 4680
ggattagagc gtattccccc ccctctcgtc tagggtgggg gatctgtctc tgtaactgta 4740
tatgcacaaa atggcgtttt tgtcaataag ccgaaaaatg gaccccgctt ttaaccccaa 4800
aactcgtgca tcgccagttt tattttttgg taagataata attataaccg cgacaaaata 4860
agggttttag cctttatttt tggaaataga cacagtaagc ccttgggtgc gatttccttg 4920
agcataccat aacccccata atctcgtcaa ctttttgcga ggtatttgcc ataaaattgt 4980
attaattctt aacaatattt taaaaataaa atctatctag ccgtataaat tagtaaaatt 5040
tatgtaattt cccgattgag ggggtggggt gtgggggggt ttatagtcaa attaatgtga 5100
ttggatctca tttaacctct gacgtactac ttgcatatcc tgccacatta accatttagg 5160
tttaccaaca tctcgcgagg aatttctgag taggtatgca gggtgaaaaa tcggcataca 5220
ttgacgacct tcccactgaa accactgacc gcgaatttta gtaatcgggc gtttatctcc 5280
tagaatagac ttaactgcag tcgccccagt taggaggata atttgaggat taatgaggcg 5340
gatttgttct aatagataag gcttacaggc ttggagttct gaagcggttg gggtgcgatt 5400
ttccggggga cgacagcgga tagcattaga aatataaact tcggtatctg tactcagtcc 5460
tacggagtct aaaatattat caagaagttt tccagatcta ccgacaaacg gaagaccttg 5520
ttcatcttca tgttgtcctg gtgcttctcc gataatcata atgggggcgg tggggttccc 5580
tcgaccaatc acagcatgag tgcggttttt tccaagttca cagcgcgagc acctattaca 5640
atgatcggca atttgtgcga gagtttgata ggttcccggc ggtatgggag tcttggcatt 5700
ttggggaatt tcttctaggt caaaatctac cgacttaggg gattgtaatg ggtcttgatt 5760
aacactaaga atatcgaaca ggctgagttg ttgggaattc acatacgcgg ccgcctgggc 5820
cttgagctcg aatttcctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 5880
tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 5940
gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 6000
cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaatagcgg 6060
agtgtatact ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg 6120
caggagaaaa aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc 6180
ttcctcgctc actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta 6240
cgaacggggc ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg 6300
gccgcggcaa agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga 6360
cgctcaaatc agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 6420
ggcggctccc tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt cattccgctg 6480
ttatggccgc gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc 6540
caagctggac tgtatgcacg aaccccccat tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa 6600
ctatcgtctt gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag cagccactgg 6660
taattgattt agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa actgaaagga 6720
caagttttgg tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc 6780
agagaacctt cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta 6840
cgcgcagacc aaaacgatct caagaagatc atcttattaa gattatcaaa aaggatcttc 6900
acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 6960
acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 7020
tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 7080
ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 7140
ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 7200
tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 7260
aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 7320
ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 7380
ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 7440
gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 7500
gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 7560
cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 7620
actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 7680
ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 7740
tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 7800
ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 7860
agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 7920
aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc 7980
attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg 8040
cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct 8100
tgtctgtaag cggatgccaa gcttgcatgc ctgcaggtgg cgcgcc 8146
<210> 5
<211> 458
<212> PRT
<213> 贝氏不动杆菌种
<400> 5
Met Arg Pro Leu His Pro Ile Asp Phe Ile Phe Leu Ser Leu Glu Lys
1 5 10 15
Arg Gln Gln Pro Met His Val Gly Gly Leu Phe Leu Phe Gln Ile Pro
20 25 30
Asp Asn Ala Pro Asp Thr Phe Ile Gln Asp Leu Val Asn Asp Ile Arg
35 40 45
Ile Ser Lys Ser Ile Pro Val Pro Pro Phe Asn Asn Lys Leu Asn Gly
50 55 60
Leu Phe Trp Asp Glu Asp Glu Glu Phe Asp Leu Asp His His Phe Arg
65 70 75 80
His Ile Ala Leu Pro His Pro Gly Arg Ile Arg Glu Leu Leu Ile Tyr
85 90 95
Ile Ser Gln Glu His Ser Thr Leu Leu Asp Arg Ala Lys Pro Leu Trp
100 105 110
Thr Cys Asn Ile Ile Glu Gly Ile Glu Gly Asn Arg Phe Ala Met Tyr
115 120 125
Phe Lys Ile His His Ala Met Val Asp Gly Val Ala Gly Met Arg Leu
130 135 140
Ile Glu Lys Ser Leu Ser His Asp Val Thr Glu Lys Ser Ile Val Pro
145 150 155 160
Pro Trp Cys Val Glu Gly Lys Arg Ala Lys Arg Leu Arg Glu Pro Lys
165 170 175
Thr Gly Lys Ile Lys Lys Ile Met Ser Gly Ile Lys Ser Gln Leu Gln
180 185 190
Ala Thr Pro Thr Val Ile Gln Glu Leu Ser Gln Thr Val Phe Lys Asp
195 200 205
Ile Gly Arg Asn Pro Asp His Val Ser Ser Phe Gln Ala Pro Cys Ser
210 215 220
Ile Leu Asn Gln Arg Val Ser Ser Ser Arg Arg Phe Ala Ala Gln Ser
225 230 235 240
Phe Asp Leu Asp Arg Phe Arg Asn Ile Ala Lys Ser Leu Asn Val Thr
245 250 255
Ile Asn Asp Val Val Leu Ala Val Cys Ser Gly Ala Leu Arg Ala Tyr
260 265 270
Leu Met Ser His Asn Ser Leu Pro Ser Lys Pro Leu Ile Ala Met Val
275 280 285
Pro Ala Ser Ile Arg Asn Asp Asp Ser Asp Val Ser Asn Arg Ile Thr
290 295 300
Met Ile Leu Ala Asn Leu Ala Thr His Lys Asp Asp Pro Leu Gln Arg
305 310 315 320
Leu Glu Ile Ile Arg Arg Ser Val Gln Asn Ser Lys Gln Arg Phe Lys
325 330 335
Arg Met Thr Ser Asp Gln Ile Leu Asn Tyr Ser Ala Val Val Tyr Gly
340 345 350
Pro Ala Gly Leu Asn Ile Ile Ser Gly Met Met Pro Lys Arg Gln Ala
355 360 365
Phe Asn Leu Val Ile Ser Asn Val Pro Gly Pro Arg Glu Pro Leu Tyr
370 375 380
Trp Asn Gly Ala Lys Leu Asp Ala Leu Tyr Pro Ala Ser Ile Val Leu
385 390 395 400
Asp Gly Gln Ala Leu Asn Ile Thr Met Thr Ser Tyr Leu Asp Lys Leu
405 410 415
Glu Val Gly Leu Ile Ala Cys Arg Asn Ala Leu Pro Arg Met Gln Asn
420 425 430
Leu Leu Thr His Leu Glu Glu Glu Ile Gln Leu Phe Glu Gly Val Ile
435 440 445
Ala Lys Gln Glu Asp Ile Lys Thr Ala Asn
450 455
<210> 6
<211> 446
<212> PRT
<213> 天蓝色链霉菌
<400> 6
Met Thr Pro Asp Pro Leu Ala Pro Leu Asp Leu Ala Phe Trp Asn Ile
1 5 10 15
Glu Ser Ala Glu His Pro Met His Leu Gly Ala Leu Gly Val Phe Glu
20 25 30
Ala Asp Ser Pro Thr Ala Gly Ala Leu Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ala
35 40 45
Arg Ala Pro Ala Val Pro Gly Leu Arg Met Arg Ile Arg Asp Thr Trp
50 55 60
Gln Pro Pro Met Ala Leu Arg Arg Pro Phe Ala Phe Gly Gly Ala Thr
65 70 75 80
Arg Glu Pro Asp Pro Arg Phe Asp Pro Leu Asp His Val Arg Leu His
85 90 95
Ala Pro Ala Thr Asp Phe His Ala Arg Ala Gly Arg Leu Met Glu Arg
100 105 110
Pro Leu Glu Arg Gly Arg Pro Pro Trp Glu Ala His Val Leu Pro Gly
115 120 125
Ala Asp Gly Gly Ser Phe Ala Val Leu Phe Lys Phe His His Ala Leu
130 135 140
Ala Asp Gly Leu Arg Ala Leu Thr Leu Ala Ala Gly Val Leu Asp Pro
145 150 155 160
Met Asp Leu Pro Ala Pro Arg Pro Arg Pro Glu Gln Pro Pro Arg Gly
165 170 175
Leu Leu Pro Asp Val Arg Ala Leu Pro Asp Arg Leu Arg Gly Ala Leu
180 185 190
Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Asp Ile Gly Ala Ala Ala Ala Leu Ser
195 200 205
Thr Leu Asp Val Arg Ser Ser Pro Ala Leu Thr Ala Ala Ser Ser Gly
210 215 220
Thr Arg Arg Thr Ala Gly Val Ser Val Asp Leu Asp Asp Val His His
225 230 235 240
Val Arg Lys Thr Thr Gly Gly Thr Val Asn Asp Val Leu Ile Ala Val
245 250 255
Val Ala Gly Ala Leu Arg Arg Trp Leu Asp Glu Arg Gly Asp Gly Ser
260 265 270
Glu Gly Val Ala Pro Arg Ala Leu Ile Pro Val Ser Arg Arg Arg Pro
275 280 285
Arg Ser Ala His Pro Gln Gly Asn Arg Leu Ser Gly Tyr Leu Met Arg
290 295 300
Leu Pro Val Gly Asp Pro Asp Pro Leu Ala Arg Leu Gly Thr Val Arg
305 310 315 320
Ala Ala Met Asp Arg Asn Lys Asp Ala Gly Pro Gly Arg Gly Ala Gly
325 330 335
Ala Val Ala Leu Leu Ala Asp His Val Pro Ala Leu Gly His Arg Leu
340 345 350
Gly Gly Pro Leu Val Ser Gly Ala Ala Arg Leu Trp Phe Asp Leu Leu
355 360 365
Val Thr Ser Val Pro Leu Pro Ser Leu Gly Leu Arg Leu Gly Gly His
370 375 380
Pro Leu Thr Glu Val Tyr Pro Leu Ala Pro Leu Ala Arg Gly His Ser
385 390 395 400
Leu Ala Val Ala Val Ser Thr Tyr Arg Gly Arg Val His Tyr Gly Leu
405 410 415
Leu Ala Asp Ala Lys Ala Val Pro Asp Leu Asp Arg Leu Ala Val Ala
420 425 430
Val Ala Glu Glu Val Glu Thr Leu Leu Thr Ala Cys Arg Pro
435 440 445
<210> 7
<211> 457
<212> PRT
<213> 泊库岛食烷菌
<400> 7
Met Lys Ala Leu Ser Pro Val Asp Gln Leu Phe Leu Trp Leu Glu Lys
1 5 10 15
Arg Gln Gln Pro Met His Val Gly Gly Leu Gln Leu Phe Ser Phe Pro
20 25 30
Glu Gly Ala Gly Pro Lys Tyr Val Ser Glu Leu Ala Gln Gln Met Arg
35 40 45
Asp Tyr Cys His Pro Val Ala Pro Phe Asn Gln Arg Leu Thr Arg Arg
50 55 60
Leu Gly Gln Tyr Tyr Trp Thr Arg Asp Lys Gln Phe Asp Ile Asp His
65 70 75 80
His Phe Arg His Glu Ala Leu Pro Lys Pro Gly Arg Ile Arg Glu Leu
85 90 95
Leu Ser Leu Val Ser Ala Glu His Ser Asn Leu Leu Asp Arg Glu Arg
100 105 110
Pro Met Trp Glu Ala His Leu Ile Glu Gly Ile Arg Gly Arg Gln Phe
115 120 125
Ala Leu Tyr Tyr Lys Ile His His Ser Val Met Asp Gly Ile Ser Ala
130 135 140
Met Arg Ile Ala Ser Lys Thr Leu Ser Thr Asp Pro Ser Glu Arg Glu
145 150 155 160
Met Ala Pro Ala Trp Ala Phe Asn Thr Lys Lys Arg Ser Arg Ser Leu
165 170 175
Pro Ser Asn Pro Val Asp Met Ala Ser Ser Met Ala Arg Leu Thr Ala
180 185 190
Ser Ile Ser Lys Gln Ala Ala Thr Val Pro Gly Leu Ala Arg Glu Val
195 200 205
Tyr Lys Val Thr Gln Lys Ala Lys Lys Asp Glu Asn Tyr Val Ser Ile
210 215 220
Phe Gln Ala Pro Asp Thr Ile Leu Asn Asn Thr Ile Thr Gly Ser Arg
225 230 235 240
Arg Phe Ala Ala Gln Ser Phe Pro Leu Pro Arg Leu Lys Val Ile Ala
245 250 255
Lys Ala Tyr Asn Cys Thr Ile Asn Thr Val Val Leu Ser Met Cys Gly
260 265 270
His Ala Leu Arg Glu Tyr Leu Ile Ser Gln His Ala Leu Pro Asp Glu
275 280 285
Pro Leu Ile Ala Met Val Pro Met Ser Leu Arg Gln Asp Asp Ser Thr
290 295 300
Gly Gly Asn Gln Ile Gly Met Ile Leu Ala Asn Leu Gly Thr His Ile
305 310 315 320
Cys Asp Pro Ala Asn Arg Leu Arg Val Ile His Asp Ser Val Glu Glu
325 330 335
Ala Lys Ser Arg Phe Ser Gln Met Ser Pro Glu Glu Ile Leu Asn Phe
340 345 350
Thr Ala Leu Thr Met Ala Pro Thr Gly Leu Asn Leu Leu Thr Gly Leu
355 360 365
Ala Pro Lys Trp Arg Ala Phe Asn Val Val Ile Ser Asn Ile Pro Gly
370 375 380
Pro Lys Glu Pro Leu Tyr Trp Asn Gly Ala Gln Leu Gln Gly Val Tyr
385 390 395 400
Pro Val Ser Ile Ala Leu Asp Arg Ile Ala Leu Asn Ile Thr Leu Thr
405 410 415
Ser Tyr Val Asp Gln Met Glu Phe Gly Leu Ile Ala Cys Arg Arg Thr
420 425 430
Leu Pro Ser Met Gln Arg Leu Leu Asp Tyr Leu Glu Gln Ser Ile Arg
435 440 445
Glu Leu Glu Ile Gly Ala Gly Ile Lys
450 455
<210> 8
<211> 2595
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的酿酒酵母磷脂酸磷酸酶(PAH1)
<400> 8
atggaattcc aatatgttgg tcgggctttg ggtagtgtta gtaaaacgtg gtcgagtatc 60
aaccccgcca ccctgagcgg cgctatcgat gtcattgtcg tggaacaccc cgatggccgg 120
ctcagttgta gccccttcca tgtgcgcttt ggtaaattcc agattctgaa acccagccaa 180
aagaaagtcc aggtctttat taacgagaaa ctgtcgaata tgcccatgaa actctcggat 240
agcggcgagg cgtacttcgt ttttgagatg ggtgatcaag tgacggatgt cccggatgaa 300
ctgctcgtct cgccggtcat gagtgccacg agtagtccgc cccaatcgcc ggaaacctcg 360
attctcgaag gcggtaccga aggcgagggc gaaggtgaga atgaaaataa gaaaaaggaa 420
aagaaggtgt tggaggagcc cgactttctg gacattaatg acaccggtga cagcggcagc 480
aagaacagtg agacgacggg ttcgctctcg ccgaccgaaa gtagtacgac gacgccgccc 540
gatagcgtcg aggaacgcaa gttggtcgaa caacggacca agaattttca gcaaaagctg 600
aataagaaac tgaccgaaat ccatattccg agcaaattgg acaataacgg tgatttgctc 660
ctggacaccg agggttataa gccgaataaa aacatgatgc acgacacgga tattcagctg 720
aagcaattgc tcaaggatga gttcggtaac gatagcgata tttcgagctt catcaaagaa 780
gacaagaatg gcaacattaa aatcgtgaac ccctatgagc atttgaccga tttgagtccc 840
ccgggtacgc ccccgaccat ggccacgagt ggcagtgtcc tgggcttgga tgcgatggag 900
agtggttcga cgctgaacag cttgagcagc agcccgagcg gcagtgacac cgaggatgag 960
acgagcttta gcaaggaaca gtcgtcgaag agtgaaaaaa cgtcgaagaa aggcaccgcg 1020
ggttcgggtg aaacggagaa acgctacatc cgcacgatcc ggctcacgaa tgatcagctg 1080
aaatgcctca acttgacgta cggtgaaaat gacttgaaat ttagtgttga ccatggcaaa 1140
gccattgtga ccagcaaatt gtttgtctgg cgctgggacg tccccatcgt tatcagcgac 1200
attgacggta cgattacgaa aagtgatgcg ctgggccacg tcctcgccat gatcggcaaa 1260
gattggaccc atctcggcgt cgctaagctg ttcagtgaga tctcgcgcaa cggttacaat 1320
atcctgtacc tgaccgcgcg ctcggccggt caggctgaca gtacccgctc gtatctccgc 1380
agtattgagc agaacggtag caagctcccg aacggccccg tcattctgag ccccgatcgg 1440
accatggctg ccctgcgccg ggaggtgatt ctgaaaaagc ccgaagtctt taaaatcgct 1500
tgcttgaacg atatccgctc gctctatttc gaagactcgg ataacgaagt ggacacggag 1560
gaaaagagca cgccgttttt cgcgggcttt ggcaatcgga tcaccgatgc gctcagctat 1620
cggacggtcg gcatcccgag tagccgcatc ttcacgatta acacggaagg cgaggtgcac 1680
atggagctgc tcgagctcgc cggttaccgg agtagctata tccatatcaa cgaactggtc 1740
gatcacttct tcccgccggt gagcctggac tcggtcgatc tgcgcacgaa cacgagcatg 1800
gtcccgggca gcccgccgaa ccgcaccctg gataactttg atagcgaaat caccagtggc 1860
cgcaagacgt tgtttcgcgg taatcaggag gaaaaattca cggacgtcaa cttttggcgc 1920
gatccgttgg tggacatcga caacctctcg gatatcagta acgatgattc ggacaatatt 1980
gatgaagaca ccgatgtgag ccaacagtcg aacatcagcc gcaaccgcgc taactcggtc 2040
aagacggcca aggtgaccaa ggctccgcag cggaatgtgt cgggcagtac gaataacaat 2100
gaagttctgg ctgcgagtag tgatgttgaa aatgccagtg acttggttag cagccactcg 2160
agtagcggct cgacccccaa caagtcgacg atgagtaagg gtgatatcgg caaacaaatc 2220
tatctggaac tgggctcgcc cttggcgagt cccaaactcc ggtatctgga cgatatggat 2280
gatgaggact cgaactataa tcgcaccaag agccgccggg ctagtagcgc cgctgctacc 2340
agcatcgaca aggagtttaa aaagctcagt gtgagtaaag ctggcgctcc cacccgcatc 2400
gttagcaaga tcaacgtgtc gaatgatgtg cacagtttgg gcaacagtga taccgaaagc 2460
cggcgggaac agagcgtcaa tgaaaccggt cgcaatcagt tgccgcacaa tagtatggat 2520
gataaggatt tggattcgcg ggtgagtgac gagttcgatg acgatgagtt tgatgaagat 2580
gagtttgagg attag 2595
<210> 9
<211> 6936
<212> DNA
<213> 小麦
<400> 9
atgggatcca cacatttgcc cattgtcggc cttaatgcct cgacaacacc atcgctatcc 60
actattcgcc cggtaaattc agccggtgct gcattccaac catctgcccc ttctagaacc 120
tccaagaaga aaagtcgtcg tgttcagtca ttaagggatg gaggcgatgg aggcgtgtca 180
gaccctaacc agtctattcg ccaaggtctt gccggcatca ttgacctccc aaaggagggc 240
acatcagctc cggaagtgga tatttcacat gggtccgaag aacccagggg ctcctaccaa 300
atgaatggga tactgaatga agcacataat gggaggcatg cttcgctgtc taaggttgtc 360
gaattttgta tggcattggg cggcaaaaca ccaattcaca gtgtattagt tgcgaacaat 420
ggaagggcag cagctaagtt catgcggagt gtccgaacat gggctaatga aacatttggg 480
tcagagaagg caattcagtt gatagctatg gctactccag aagacatgag gataaatgca 540
gagcacatta gaattgctga tcaatttgtt gaagtacccg gtggaacaaa caataacaac 600
tatgcaaatg tccaactcat agtggagata gcagtgagaa ccggtgtttc tgctgtttgg 660
cctggttggg gccatgcatc tgagaatcct gaacttccag atgcactaaa tgcaaacgga 720
attgtttttc ttgggccacc atcatcatca atgaacgcac taggtgacaa ggttggttca 780
gctctcattg ctcaagcagc aggggttccg actcttcctt ggggtggatc acaggtggaa 840
attccattag aagtttgttt ggactcgata cctgcggaga tgtataggaa agcttgtgtt 900
agtactacgg aggaagcact tgcgagttgt cagatgattg ggtatccagc catgattaaa 960
gcatcatggg gtggtggtgg taaagggatc cgaaaggtta ataacgacga tgatgtcaga 1020
gcactgttta agcaagtgca aggtgaagtt cctggctccc caatatttat catgagactt 1080
gcatctcaga gtcgacatct tgaagttcag ttgctttgtg atcaatatgg caatgtagct 1140
gcgcttcaca gtcgtgactg cagtgtgcaa cggcgacacc aaaagattat tgaggaagga 1200
ccagttactg ttgctcctcg cgagacagtg aaagagctag agcaagcagc aaggaggctt 1260
gctaaggctg tgggttatgt tggtgctgct actgttgaat atctctacag catggagact 1320
ggtgaatact attttctgga acttaatcca cggttgcagg ttgagcatcc agtcaccgag 1380
tggatagctg aagtaaactt gcctgcagct caagttgcag ttggaatggg tatacccctt 1440
tggcaggttc cagagatcag acgtttctat ggaatggaca atggaggagg ctatgacatt 1500
tggagggaaa cagcagctct tgctactcca tttaacttcg atgaagtgga ttctcaatgg 1560
ccaaagggtc attgtgtagc agttaggata accagtgagg atccagatga cggattcaag 1620
cctaccggtg gaaaagtaaa ggagatcagt tttaaaagca agccaaatgt ttgggcctat 1680
ttctctgtta agtccggtgg aggcattcat gaatttgctg attctcagtt tggacatgtt 1740
tttgcatatg gagtgtctag agcagcagca ataaccaaca tgtctcttgc gctaaaagag 1800
attcaaattc gtggagaaat tcattcaaat gttgattaca cagttgatct cttgaatgcc 1860
tcagacttca aagaaaacag gattcatact ggctggctgg ataacagaat agcaatgcga 1920
gtccaagctg agagacctcc gtggtatatt tcagtggttg gaggagctct atataaaaca 1980
ataacgagca acacagacac tgtttctgaa tatgttagct atctcgtcaa gggtcagatt 2040
ccaccgaagc atatatccct tgtccattca actgtttctt tgaatataga ggaaagcaaa 2100
tatacaattg aaactataag gagcggacag ggtagctaca gattgcgaat gaatggatca 2160
gttattgaag caaatgtcca aacattatgt gatggtggac ttttaatgca gttggatgga 2220
aacagccatg taatttatgc tgaagaagag gccggtggta cacggcttct aattgatgga 2280
aagacatact tgttacagaa tgatcacgat ccttcaaggt tattagctga gacaccctgc 2340
aaacttcttc gtttcttggt tgccgatggt gctcatgttg aagctgatgt accatatgcg 2400
gaagttgagg ttatgaagat gtgcatgccc ctcttgtcac ctgctgctgg tgtcattaat 2460
gttttgttgt ctgagggcca gcctatgcag gctggtgatc ttatagcaag acttgatctt 2520
gatgaccctt ctgctgtgaa gagagctgag ccatttaacg gatctttccc agaaatgagc 2580
cttcctattg ctgcttctgg ccaagttcac aaaagatgtg ccacaagctt gaatgctgct 2640
cggatggtcc ttgcaggata tgatcacccg atcaacaaag ttgtacaaga tctggtatcc 2700
tgtctagatg ctcctgagct tcctttccta caatgggaag agcttatgtc tgttttagca 2760
actagacttc caaggcttct taagagcgag ttggagggta aatacagtga atataagtta 2820
aatgttggcc atgggaagag caaggatttc ccttccaaga tgctaagaga gataatcgag 2880
gaaaatcttg cacatggttc tgagaaggaa attgctacaa atgagaggct tgttgagcct 2940
cttatgagcc tactgaagtc atatgagggt ggcagagaaa gccatgcaca ctttattgtg 3000
aagtcccttt tcgaggacta tctctcggtt gaggaactat tcagtgatgg cattcagtct 3060
gatgtgattg aacgcctgcg ccaacaacat agtaaagatc tccagaaggt tgtagacatt 3120
gtgttgtctc accagggtgt gagaaacaaa actaagctga tactaacact catggagaaa 3180
ctggtctatc caaaccctgc tgtctacaag gatcagttga ctcgcttttc ctccctcaat 3240
cacaaaagat attataagtt ggcccttaaa gctagcgagc ttcttgaaca aaccaagctt 3300
agtgagctcc gcacaagcat tgcaaggagc ctttcagaac ttgagatgtt tactgaagaa 3360
aggacggcca ttagtgagat catgggagat ttagtgactg ccccactgcc agttgaagat 3420
gcactggttt ctttgtttga ttgtagtgat caaactcttc agcagagggt gatcgagacg 3480
tacatatctc gattatacca gcctcatctt gtcaaggata gtatccagct gaaatatcag 3540
gaatctggtg ttattgcttt atgggaattc gctgaagcgc attcagagaa gagattgggt 3600
gctatggtta ttgtgaagtc gttagaatct gtatcagcag caattggagc tgcactaaag 3660
ggtacatcac gctatgcaag ctctgagggt aacataatgc atattgcttt attgggtgct 3720
gataatcaaa tgcatggaac tgaagacagt ggtgataacg atcaagctca agtcaggata 3780
gacaaacttt ctgcgacact ggaacaaaat actgtcacag ctgatctccg tgctgctggt 3840
gtgaaggtta ttagttgcat tgttcaaagg gatggagcac tcatgcctat gcgccatacc 3900
ttcctcttgt cggatgaaaa gctttgttat ggggaagagc cggttctccg gcatgtggag 3960
cctcctcttt ctgctcttct tgagttgggt aagttgaaag tgaaaggata caatgaggtg 4020
aagtatacac cgtcacgtga tcgtcagtgg aacatataca cacttagaaa tacagagaac 4080
cccaaaatgt tgcacagggt gtttttccga actcttgtca ggcaacccgg tgcttccaac 4140
aaattcacat caggcaacat cagtgatgtt gaagtgggag gagctgagga atctctttca 4200
tttacatcga gcagcatatt aagatcgctg atgactgcta tagaagagtt ggagcttcac 4260
gcgattagga caggtcactc tcatatgttt ttgtgcatat tgaaagagcg aaagcttctt 4320
gatcttgttc ccgtttcagg gaacaaagtt gtggatattg gccaagatga agctactgca 4380
tgcttgcttc tgaaagaaat ggctctacag atacatgaac ttgtgggtgc aaggatgcat 4440
catctttctg tatgccaatg ggaggtgaaa cttaagttgg acagcgatgg gcctgccagt 4500
ggtacctgga gagttgtaac aaccaatgtt actagtcaca cctgcactgt ggatatctac 4560
cgtgaggttg aagatacaga atcacagaaa ctagtatacc actctgctcc atcgtcatct 4620
ggtcctttgc atggcgttgc actgaatact ccatatcagc ctttgagtgt tattgatctg 4680
aaacgttgct ccgctagaaa caacagaact acatactgct atgattttcc gttggcattt 4740
gaaactgcag tgcagaagtc atggtctaac atttctagtg acaataaccg atgttatgtt 4800
aaagcaacgg agctggtgtt tgctcacaag aatgggtcat ggggcactcc tgtaattcct 4860
atggagcgtc ctgctgggct caatgacatt ggtatggtag cttggatctt ggacatgtcc 4920
actcctgaat atcccaatgg caggcagatt gttgtcatcg caaatgatat tacttttaga 4980
gctggatcgt ttggtccaag ggaagatgca ttttttgaaa ctgttaccaa cctagcttgt 5040
gagaggaggc ttcctctcat ctacttggca gcaaactctg gtgctcggat cggcatagca 5100
gatgaagtaa aatcttgctt ccgtgttgga tggtctgatg atggcagccc tgaacgtggg 5160
tttcaatata tttatctgac tgaagaagac catgctcgta ttagcgcttc tgttatagcg 5220
cacaagatgc agcttgataa tggtgaaatt aggtgggtta ttgattctgt tgtagggaag 5280
gaggatgggc taggtgtgga gaacatacat ggaagtgctg ctattgccag tgcctattct 5340
agggcctatg aggagacatt tacgcttaca tttgtgactg gaaggactgt tggaatagga 5400
gcatatcttg ctcgacttgg catacggtgc attcagcgta ctgaccagcc cattatccta 5460
actgggtttt ctgccttgaa caagcttctt ggccgggaag tgtacagctc ccacatgcag 5520
ttgggtggcc ccaaaattat ggcgacaaac ggtgttgtcc atctgacagt ttcagatgac 5580
cttgaaggtg tatctaatat attgaggtgg ctcagctatg ttcctgccaa cattggtgga 5640
cctcttccta ttacaaaatc tttggaccca cctgacagac ccgttgctta catccctgag 5700
aatacatgcg atcctcgtgc tgccatcagt ggcattgatg atagccaagg gaaatggttg 5760
gggggcatgt tcgacaaaga cagttttgtg gagacatttg aaggatgggc gaagtcagtt 5820
gttactggca gagcgaaact cggagggatt ccggtgggtg ttatagctgt ggagacacag 5880
actatgatgc agctcatccc tgctgatcca ggccagcttg attcccatga gcgatctgtt 5940
cctcgtgctg ggcaagtctg gtttccagat tcagctacta agacagcgca ggcaatgctg 6000
gacttcaacc gtgaaggatt acctctgttc atccttgcta actggagagg cttctctggt 6060
ggacaaagag atctttttga aggaatcctt caggctgggt caacaattgt tgagaacctt 6120
agggcataca atcagcctgc ctttgtatat atccccaagg ctgcagagct acgtggaggg 6180
gcttgggtcg tgattgatag caagataaat ccagatcgca ttgagttcta tgctgagagg 6240
actgcaaagg gcaatgttct cgaacctcaa gggttgatcg agatcaagtt caggtcagag 6300
gaactccaag agtgcatggg taggcttgat ccagaattga taaatctgaa ggcaaagctc 6360
cagggagtaa agcatgaaaa tggaagtcta cctgagtcag aatcccttca gaagagcata 6420
gaagcccgga agaaacagtt gttgcctttg tatactcaaa ttgcggtacg gttcgctgaa 6480
ttgcatgaca cttcccttag aatggctgct aagggtgtga ttaagaaggt tgtagactgg 6540
gaagattcta ggtcgttctt ctacaagaga ttacggagga ggatatccga ggatgttctt 6600
gcgaaggaaa ttagaggtgt aagtggcaag cagttttctc accaatcggc aatcgagctg 6660
atccagaaat ggtacttggc ctctaaggga gctgaaacag gaagcactga atgggatgat 6720
gacgatgctt ttgttgcctg gagggaaaac cctgaaaact accaggagta tatcaaagaa 6780
cccagggctc aaagggtatc tcagttgctc tcagatgttg cagactccag tccagatcta 6840
gaagccttgc cacagggtct ttctatgcta ctagagaaga tggatcctgc aaagagggaa 6900
attgttgaag actttgaaat aaaccttgta aagtaa 6936
<210> 10
<211> 996
<212> DNA
<213> 聚球藻PCC7942
<400> 10
atgtcagagg ctcaaacgcc cctgacagta ccgaagaagt ttcttggtgc tccaggaggc 60
ttcaacccca ccgtcgcact cttcttggca ggttatacct gcgcggcgct ctcagttttg 120
gggtactggt gctggagttg gccccactgg ctatctttcc ttctgagtgt cacagcctta 180
catttggtag gcaccgtcat tcacgatgcc tctcataatg tggctcacgc cagtcgcatt 240
ctgaatgcga ttttgggaca tggcagtgca ctattgctgg gctttacttt tccggtgttt 300
acgcgggttc acctgcaaca tcacgcccac gtcaacgatc ccaagaacga tcccgaccac 360
atcgtttcca cctttgggcc gctgtggttg atcgcaccgc gcttcttcta tcacgagatc 420
tatttcttcc agcgccgcct ttggaagaaa tttgaattac tcgaatggtt cctcagtcgc 480
gctgtggtca tcggcatctt tgcctgcggc gtcaagtttg gcttcctggg cttcctgatg 540
aactactggc tggctccagc cttggtcgtt ggcattgccc taggactctt cttcgactat 600
ttaccccacc gccccttcca agagcgcaac cgctggcgca atgcacgggt ctatcccggt 660
caggtgatga acatcctgat catgggtcag aactatcacc tgatccatca cctctggcca 720
tcgatcccct ggtatctcta ccgaccggcc taccacgcta ccaagccgtt gttggaccta 780
cgccagtcgc cgcaaacgct cgggattctc tccagcaaaa aagatttctg gaactttatc 840
tacgacgttt tcatcggcat ccgcattcac caatcgcacg aggctgagcc gcagagctcc 900
gtcgttcctg aaacgaagtc gagtgaatca gccgttctcg caaaagctcc gatgtctgcc 960
acagaagact ctcgtgagcc agccttgacg aagtag 996
<210> 11
<211> 486
<212> DNA
<213> 短波单胞菌属种SD212
<400> 11
atggcctggc tgacgtggat cgcgctgttc ctgaccgcct ttttgggcat ggaggcgttc 60
gcctggatca tgcaccgcta tgtgatgcac ggtttcctgt ggtcctggca ccgcagccat 120
catgagccgc acgatcaccc cctggagaag aacgacctgt tcgccgtggt cttcgccgcc 180
ccggccatcg tcatggtggc cgtgggtctg cacctgtggc cctgggccct gccggtcggc 240
ctggggatca cggcctatgg gatggtctat ttcttcttcc acgacggcct ggtgcaccgg 300
cggttcccga cgggcttttc cgggcggtcc ggcttctgga cgcggcgcat ccaggcgcac 360
cgtctgcatc acgccgtgcg cacgcgcgaa ggctgcgtct ccttcggctt tctgtgggtg 420
cggtcggcgc gggcgctgaa ggccgaactg gctcagaagc ggggctcttc cagcagcggc 480
gcctga 486
<210> 12
<211> 735
<212> DNA
<213> 短波单胞菌属种SD212
<400> 12
atgaccgccg ccgtcgccga gccccgcatc gtcccgcgcc agacctggat cggtctgacc 60
ctggcgggaa tgatcgtggc gggatggggg agcctgcacg tctacggcgt ctattttcac 120
cgctggggca cctccagtct ggtgatcgtc ccggcgatcg tagcggtcca gacctggttg 180
tcggtcggcc ttttcatcgt cgcccatgac gccatgcacg gctccctggc gccgggacgg 240
ccgcggctga acgccgcagt cggccggctg accctggggc tctatgcggg cttccgcttc 300
gatcggctga agacggcgca ccacgcccac cacgccgcgc ccggcacggc cgacgacccg 360
gacttttacg ccccggcgcc ccgcgccttc cttccctggt tcctgaactt ctttcgcacc 420
tatttcggct ggcgcgagat ggcggtcctg accgccctgg tcctgatcgc cctcttcggc 480
ctgggggcgc ggccggccaa tctcctgacc ttctgggccg cgccggccct gctttcagcg 540
cttcagctct tcaccttcgg cacctggctg ccgcaccgcc acaccgacca gccgttcgcc 600
gacgcccacc acgcccgcag cagcggctac ggccccgttc tttccctgct cacctgcttc 660
cacttcggcc gccaccacga acaccacctc accccctggc ggccctggtg gcgtttgtgg 720
cgcggcgagt cttga 735
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 同源臂以外的钝顶节旋藻基因组的引物
<400> 13
actactaatg tggctttcca ggg 23
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 同源臂以外的钝顶节旋藻的引物
<400> 14
gtaaattagc gcgatgggtt tg 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pilA基因上游的同源臂的引物
<400> 15
gttggagcaa tggcacgagt c 21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aadA基因上游端的引物
<400> 16
atgacgccaa ctacctctga tag 23
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aadA基因下游端的引物
<400> 17
gtatcagccc gtcatacttg aa 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pilA基因的引物
<400> 18
gacggtggtt tcaccttaat cg 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pilA基因的引物
<400> 19
tgctgtagta cctacccaga cc 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
cataccctgc tgtgtggcaa 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
cgggtgatat ctttggtggt g 21
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
gtacaaatgt acggccagca ac 22
<210> 23
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的菠萝泛菌β-胡萝卜素3,3'-羟化酶
(crtZ)
<400> 23
atgctgtgga tttggaacgc gctgatcgtg tttgtcacag tcatcgggat ggaagttatt 60
gccgccttgg cacacaaata catcatgcac ggctggggct ggggatggca tctgtctcac 120
cacgaacccc gcaaaggcgc tttcgaagtc aatgatctgt atgctgtcgt gtttgcagcc 180
ctgagcattt tgctcatcta cctgggctcg accggtatgt ggccgttgca atggattggt 240
gccggcatga ccgcctacgg tctgctgtat ttcatggtgc acgatggcct ggtccatcaa 300
cggtggcctt ttcggtatat tccccgaaag ggctacctga agcgcctata tatggcccat 360
cgaatgcatc acgcagtccg ggggaaggaa gggtgtgtga gttttgggtt tctatatgct 420
cccccgttgt cgaaactgca agcaaccctg cgtgagcgtc atggcgctcg cgctggggcg 480
gcgcgggacg cgcaaggggg cgaagatgaa ccggcatcgg ggaaataa 528
<210> 24
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的短波单胞菌属种SD212β-胡萝卜素
4,4'-酮醇酶(crtW)
<400> 24
atgacggctg cggtcgctga gccgcgaatc gtgcctcgtc aaacctggat cgggctcaca 60
cttgcaggga tgattgtggc aggctggggg agtcttcacg tctatggagt ctactttcat 120
cgctggggga caagtagcct cgttattgtg ccagcaatcg tggctgtcca gacctggctc 180
agtgtgggcc tattcattgt cgcacacgac gctatgcacg ggtcgctggc gccgggtcgg 240
cctcgcctaa acgcagccgt aggcagactc accttagggc tctatgccgg tttccgattt 300
gatcgcctta aaacggccca ccacgcacat cacgccgccc ccggtactgc cgatgaccct 360
gatttctacg ccccagcacc gcgagcgttt ttgccttggt tcctcaactt ctttcgcact 420
tactttggct ggcgtgagat ggctgttctg acagctttag tcctaatagc cttgtttggt 480
ttgggtgccc ggccggcaaa tcttctcacg ttctgggcag ctccggcgct gttaagtgct 540
ctacagctat tcacttttgg cacgtggctg ccgcaccgcc acactgatca gccttttgcg 600
gacgcccacc atgctcggtc ttccggttac ggcccggtgc tcagcctgct tacctgtttt 660
cactttggtc ggcaccacga acaccatctg acaccgtggc gcccctggtg gcggctatgg 720
<210> 25
<211> 489
<212> DNA
<213> 钝顶节旋藻
<400> 25
atgaaaaccc ccctaaccga agcagtttct atcgctgatt cccaaggtcg tttcctaagc 60
agcaccgaaa tccaagtagc ttttggccgt tttcgtcaag ccaaagctgg tctggaagct 120
gctaaagctt tgacctctaa agctgatagt ctgatcagtg gtgctgccca agcagtgtac 180
aacaagttcc cctacaccac ccaaatgcag ggacctaact acgcggcaga ccaacgcggt 240
aaggacaaat gtgctcgtga cataggctac tacctgcgga tggtaactta ttgcctgatt 300
gctggtggaa ctggccccat ggatgagtac ctgattgccg gtattgatga aatcaaccgg 360
actttcgagc tttctccaag ctggtacatt gaagccctga aatacatcaa agctaaccac 420
ggtttgtctg gtgacgctgc tgttgaagct aactcctacc tcgactacgc gatcaacgcc 480
ctgagctag 489
<210> 26
<211> 519
<212> DNA
<213> 细长黑果菊(Athroisma gracile)
<400> 26
atgtttgatg ccttcaccaa ggtggtttct caagctgata ctcgcggcga aatgctgagt 60
acagctcaaa tcgatgctct gagccaaatg gttgctgaaa gcaacaaacg tttggattct 120
gttaaccgca ttaccagcaa cgcttccacc attgtttcca acgctgctcg ttctttgttc 180
gcagagcaac cccaactgat tgctcccggt ggaaacgcct acaccagccg tcgtatggct 240
gcttgcttgc gtgacatgga aatcatcctg cgctatgtaa cctacgctgt gtttgctggc 300
gatgcaagtg ttctcgaaga tcgttgcttg aacggtttgc gtgaaactta cctggctttg 360
ggaactcccg gttcttccgt tgctgtcggt gttggcaaaa tgaaagaagc tgctctggcg 420
atcgttaacg atcccgcagg tatcactcct ggtgattgta gcgctttggc ttcagaaatc 480
gctggttact ttgaccgtgc tgctgcagca gtttcctaa 519
<210> 27
<211> 1406
<212> DNA
<213> 钝顶节旋藻
<400> 27
ttgaaggggt gagaaggaag gcgaatgttg atttatgaag tttgattaac atttgtatca 60
aaatataaaa ttcttctcat aaaccctgta caatctttta agatttcgga aagtgttcta 120
ggatactgaa gaaatgaacc acggggcaat tgttaaaagc ctttgtcgat ggttcgcccc 180
ggaaggggtc ttaggaggtg acaccgatgg attgattgtc gtgatcattc atggtgtgtc 240
caatcccaac tcaactctaa gcaagtcaac aagtaggaga taaatccatg tttgatgcct 300
tcaccaaggt ggtttctcaa gctgatactc gcggcgaaat gctgagtaca gctcaaatcg 360
atgctctgag ccaaatggtt gctgaaagca acaaacgttt ggattctgtt aaccgcatta 420
ccagcaacgc ttccaccatt gtttccaacg ctgctcgttc tttgttcgca gagcaacccc 480
aactgattgc tcccggtgga aacgcctaca ccagccgtcg tatggctgct tgcttgcgtg 540
acatggaaat catcctgcgc tatgtaacct acgctgtgtt tgctggcgat gcaagtgttc 600
tcgaagatcg ttgcttgaac ggtttgcgtg aaacttacct ggctttggga actcccggtt 660
cttccgttgc tgtcggtgtt ggcaaaatga aagaagctgc tctggcgatc gttaacgatc 720
ccgcaggtat cactcctggt gattgtagcg ctttggcttc agaaatcgct ggttactttg 780
accgtgctgc tgcagcagtt tcctaatcaa gcagatccat agcatataac aattgaaaca 840
gtttagctga agtctaagtg actggacttc tgtttgttac ctaatttttt gtaaaccaat 900
cgggagataa ctcgagaatg aaaacccccc taaccgaagc agtttctatc gctgattccc 960
aaggtcgttt cctaagcagc accgaaatcc aagtagcttt tggccgtttt cgtcaagcca 1020
aagctggtct ggaagctgct aaagctttga cctctaaagc tgatagtctg atcagtggtg 1080
ctgcccaagc agtgtacaac aagttcccct acaccaccca aatgcaggga cctaactacg 1140
cggcagacca acgcggtaag gacaaatgtg ctcgtgacat aggctactac ctgcggatgg 1200
taacttattg cctgattgct ggtggaactg gccccatgga tgagtacctg attgccggta 1260
ttgatgaaat caaccggact ttcgagcttt ctccaagctg gtacattgaa gccctgaaat 1320
acatcaaagc taaccacggt ttgtctggtg acgctgctgt tgaagctaac tcctacctcg 1380
actacgcgat caacgccctg agctag 1406

Claims (7)

1.一种非天然存在的、稳定的转化体螺旋藻，其包含：
a.至少一种在预定基因组位置并入螺旋藻基因组的外源核苷酸序列，
其中靶向整合的所述外源核苷酸序列与一核苷酸区域相邻，所述核苷酸区域与包含在用于同源重组转化所述细胞的载体中的核苷酸同源臂是同源的。
2.一种非天然存在的、稳定的转化体螺旋藻，其包含：
a.至少一种在预定基因组位置的、来自螺旋藻基因组的基因组核苷酸序列的缺失，
其中所述基因组核苷酸序列的缺失在相邻于一核苷酸区域处发生，所述核苷酸区域与包含在用于同源重组转化所述细胞的载体中的核苷酸同源臂是同源的。
3.如权利要求1所述的螺旋藻，其中所述外源核苷酸序列选自外源基因、开放阅读框、外显子、启动子、增强子、基因调控元件或编码蛋白质结构域的外源核苷酸。
4.如权利要求3所述的螺旋藻，其中所述基因调控元件是启动子、调控蛋白结合位点、RNA结合位点、核糖体结合位点、或RNA稳定性元件。
5.如权利要求3所述的螺旋藻，其中所述编码蛋白质结构域的外源核苷酸编码包含：
a)磷酸化位点；
b)稳定性结构域；
c)蛋白质靶向结构域；或
d)蛋白质-蛋白质相互作用结构域。
6.如权利要求3所述的螺旋藻，其中所述外源基因编码藻蓝蛋白。
7.如权利要求2所述的螺旋藻，其中所述基因组核苷酸序列的缺失是：
a)基因或其片段的缺失；
b)外显子或其片段的缺失
c)开放阅读框或其片段的缺失；
d)终止子的缺失；
e)调控元件的缺失；
f)增强子或其片段的缺失；或
g)启动子的缺失。
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