JP5925651B2 - チオエステラーゼ改変体を用いた脂質の製造方法 - Google Patents
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Description
(a)配列番号1の112番〜414番までのアミノ酸配列であって、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸以外の1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
また、本発明は、宿主に前記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体(以下、「本発明の形質転換体」ともいう。)に関する。
さらに、本発明は、前記(a)又は(b)のタンパク質(以下、「本発明のチオエステラーゼ改変体」ともいう。)に関する。
本発明において、脂質には、中性脂肪、ろう、セラミド等の単純脂質、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質、脂肪酸、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質が含まれる。
本発明のチオエステラーゼ改変体は、配列番号1に示すココヤシ(Cocos nucifera)由来の野生型チオエステラーゼ(以下、単に野生型チオエステラーゼともいい、CTEとも略記する)のアミノ酸配列を一部改変したアミノ酸配列を有し、チオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。
チオエステラーゼは、トリグリセリドの生合成系に関与する酵素であるアシル‐アシルキャリヤープロテイン(Acyl-ACP)チオエステラーゼであって、葉緑体内や色素体内において脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル‐アシルキャリヤープロテイン(脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリヤープロテインとからなる複合体)のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。チオエステラーゼの作用によって、アシルキャリヤープロテイン上での脂肪酸合成が終了し、遊離した脂肪酸は色素体から輸送されトリグリセリド合成に供される。チオエステラーゼは、基質であるアシル‐アシルキャリヤープロテインを構成する脂肪酸残基の種類によって異なる反応特異性を示すものがあることがわかっており、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
(a)配列番号1の112番〜414番までのアミノ酸配列であって、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸以外の1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
さらに、前記(a)のタンパク質のアミノ酸配列では、配列番号1の112番〜414番までのアミノ酸配列中の、配列番号1の209番目に相当するトリプトファン(Trp;W)が、トレオニン(Thr;T)、グルタミン酸(Glu;E)、及びアラニン(Ala;A)から選ばれるいずれかのアミノ酸で置換されている。
以下、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸が、トレオニンに置換されたチオエステラーゼ改変体をCTE(W209T)、グルタミン酸に置換されたチオエステラーゼ改変体をCTE(W209E)、アラニンに置換されたチオエステラーゼ改変体をCTE(W209A)、とそれぞれ略記する。
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにチオエステラーゼ活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部欠失等により変化した改変体を用いることができる。
なお、改変タンパク質がチオエステラーゼ活性を有することは、基質としてAcyl‐ACPを用いたin vitro活性測定法、例えば、Robert M et al. Plant Cell Physiol.40(2): 155-163 (1999)に記載の方法により確認することができる。
前記(b)のタンパク質において、「1又は数個のアミノ酸」は、脂質生産能向上の観点から、1〜10個であることが好ましく、1〜5個であることがより好ましく、1〜2個であること特に好ましい。
脂質生産能向上の観点から、前記(a)及び(b)のタンパク質として好ましくは、下記(c)及び(d)のタンパク質である。
(c)配列番号1に示すアミノ酸配列において209番目のアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
(d)(c)のアミノ酸配列において、209番目以外の1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
前記(d)のタンパク質において、「1又は数個のアミノ酸」は、脂質生産能向上の観点から、1〜10個であることが好ましく、1〜5個であることがより好ましく、1〜2個であることがさらに好ましい。
前記(a)〜(d)のタンパク質をコードする遺伝子として、下記(e)〜(h)の遺伝子が例示できるが、本発明はこれに限定されるものではない。
(e)配列番号2の334番〜1245番までの塩基配列であって、配列番号2の625番〜627番に相当する塩基がトリプトファンをコードする塩基からトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンをコードする塩基に置換された塩基配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(f)(e)の遺伝子の塩基配列において、配列番号2の625番〜627番に相当する塩基以外の1又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(g)配列番号2に示す塩基配列において、625番〜627番のトリプトファンをコードする塩基がトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(h)(g)の遺伝子の塩基配列において、625番〜627番以外の1又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
前記(f)又は(h)の遺伝子の塩基配列において、「1又は数個の塩基」は、脂質生産能向上の観点から、1〜10個であることが好ましく、1〜5個であることがより好ましく、1〜2個であること特に好ましい。
前記(g)の遺伝子の塩基配列として、トリプトファンをコードする塩基がトレオニンに置換された塩基配列の一例を配列番号4に、グルタミン酸に置換された塩基配列の一例を配列番号6に、アラニンに置換された塩基配列の一例を配列番号8に、それぞれ示す。
野生型チオエステラーゼのアミノ酸配列(配列番号1)及びそれをコードする塩基配列(例えば、配列番号2)は、GenBank等のデータベースから得ることができる(例えばGenBankでは、タンパク質配列;AEM72521.1,mRNA配列:JF338905.1)。得られた配列をもとに、野生型チオエステラーゼをコードする遺伝子を人工合成により取得することができる。遺伝子の人工合成はインビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ココヤシから野生型チオエステラーゼをコードする遺伝子をクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook,David W. Russell,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)]記載の方法等により行うことができる。
部位特異的変異の導入方法としては、例えば、後述する実施例で用いたSplicing overlap extension(SOE)PCR反応(Horton et al.,Gene 77,61−68,1989)を利用した方法、ODA法(Hashimoto-Gotoh et al.,Gene,152,271-276,1995))、又はKunkel法(Kunkel,T. A.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1985,82,488)等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット(タカラバイオ社)、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット(Clonetech社)、又はKOD-Plus-Mutagenesis Kit(東洋紡社)等の市販のキットを利用することもできる。なかでも、本発明においては、部位特異的変異導入が高効率である観点から、Kunkel法によって行うことが好ましい。
PCR反応で増幅したDNAを、メチル化DNAを特異的に切断するDpnI酵素で処理し、これを用いて大腸菌を形質転換し、抗生物質含有プレート培地で選択する。形質転換された大腸菌よりプラスミド抽出することで、目的のアミノ酸変異が導入されたチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を取得することができる。
本発明の形質転換体は、宿主に前記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる。当該形質転換体では、野生型チオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体に比べ、脂質の生産能が有意に向上する。なお、野生型チオエステラーゼ及びチオエステラーゼ改変体の脂肪酸及び脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。
宿主として用いる微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよい。原核生物としては、エシェリキア(Escherichia)属に属する微生物やバシラス(Bacillus)属に属する微生物が挙げられる。真核生物としては、酵母や糸状菌等が挙げられる。なかでも、有用物質の生産性の観点から、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、赤色酵母(Rhodosporidium toruloides)、又はモルチエレラ エスピー(Mortierella sp.)が好ましく、大腸菌又は枯草菌がより好ましく、大腸菌がさらに好ましい。
植物としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、シアノバクテリア(Synechocystis sp.)、クラミドモナス、又はフェオダクチラムが好ましく、シアノバクテリアがより好ましい。
具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript II SK(-)(Stratagene社製)、pUC系ベクター(宝酒造社製)、pET系ベクター(タカラバイオ社製)、pGEX系ベクター(GEヘルスケア社製)、pCold系ベクター(タカラバイオ社製)、pHY300PLK(タカラバイオ社製)、pUB110(Mckenzie,T. et al.,(1986),Plasmid 15(2);p.93-103)、pBR322(タカラバイオ社製)、pRS403(ストラタジーン社製)、又はpMW218/219(ニッポンジーン社製)等を挙げることができる。植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター(タカラバイオ社製)、pBI系ベクター(クロンテック社製)、又はIN3系ベクター(インプランタイノベーションズ社製)等を挙げることができる。藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC系ベクター(宝酒造社製)、pET系ベクター(タカラバイオ社製)、又はpBluescript II SK(-)(Stratagene社製)等を挙げることができる。
特に、大腸菌を宿主とする場合には、pBluescript II SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられ、シロイヌナズナを宿主とする場合には、pRI系ベクター、又はpBI系ベクターが好ましく用いられ、シアノバクテリアを宿主とする場合には、pUC系ベクターが好ましく用いられる。
具体的なプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、アクチンやユビキチン等ハウスキーピング遺伝子のプロモーター、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、又は植物由来Rubiscoプロモーター等が挙げられる。
また、選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子(アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子)等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
上記ベクターにチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって組み込むことにより形質転換に用いる発現ベクターを構築することができる。なお、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子の取得方法については上述した。
また、目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的DNA断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたPCR法等によって、目的DNA断片の導入を確認することもできる。
次いで、上記で得られた形質転換体を用いて脂質を生産する。
本発明の製造方法は、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体から脂質を採取する工程を含む。当該工程は、脂質の生産性向上の観点から、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体を適切な条件にて培養又は生育して培養物又は生育物を得る工程、及び得られた培養物又は生育物から脂質を採取する工程を含むことが好ましい。ここで、培養物とは、培養した後の培養液及び形質転換体をいい、生育物とは、生育した後の形質転換体をいう。
また、脂肪酸及び脂質の生産効率の点から、培地中に、例えばチオエステラーゼの基質或いは脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、単純脂質及び誘導脂質から選ばれる1種以上を含んでいることが好ましく、誘導脂質を含んでいることがより好ましく、脂肪酸又はそのエステルを含んでいることがさらに好ましい。脂質中に含まれる脂肪酸又はそのエステルは、界面活性剤等への利用性から、炭素原子数12〜16の脂肪酸又はそのエステルが好ましく、炭素原子数12〜14の脂肪酸又はそのエステルがより好ましく、ラウリン酸又はそのエステルがさらに好ましい。これらの高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として利用できる。
採取された総脂質成分中の炭素原子数12〜16の脂肪酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは65質量%以上、より好ましくは75質量%以上、さらに好ましくは85質量%以上である。また、採取された総脂質成分中の炭素原子数12〜14の脂肪酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは50質量%以上、より好ましくは55質量%以上、さらに好ましくは60質量%以上である。さらに、採取された総脂質成分中に含まれるラウリン酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは27質量%以上、より好ましくは28質量%以上、さらに好ましくは30質量%以上である。ここで、「採取された総脂質成分」とは、実施例で用いられた方法により算出された総脂質成分をいう。
(a)配列番号1の112番〜414番までのアミノ酸配列であって、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸以外の1又は数個(好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜2個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
<2> 前記宿主が、植物、藻類及び微生物から選択される、<1>項記載の製造方法。
<3> 前記宿主が、シロイヌナズナ、シアノバクテリア及び大腸菌から選択される、<1>又は<2>項記載の製造方法。
<4> 前記脂質がラウリン酸を含む、<1>〜<3>のいずれか1項に記載の製造方法。
<5> 前記脂質中に、ラウリン酸が27質量%以上(好ましくは28質量%以上、より好ましくは30質量%以上)含有される、<1>〜<4>のいずれか1項に記載の製造方法。
<6> 前記宿主が微生物である、<1>〜<5>のいずれか1項に記載の製造方法。
<7> 前記宿主が大腸菌である、<1>〜<6>のいずれか1項に記載の製造方法。
<10> 前記宿主が、植物、藻類及び微生物から選択される、<9>項記載の形質転換体。
<11> 前記宿主が、シロイヌナズナ、シアノバクテリア及び大腸菌から選択される、<9>又は<10>項記載の形質転換体。
<12> 前記宿主が微生物である、<9>〜<11>のいずれか1項に記載の質転換体。
<13> 前記宿主が大腸菌である、<9>〜<12>のいずれか1項に記載の質転換体。
1.野生型チオエステラーゼ(CTE)遺伝子発現プラスミドの構築
配列番号2に示す塩基配列からなる野生型チオエステラーゼをコードする遺伝子を鋳型として、下記表1に示すCTE FW(配列番号9)及びCTE RV(配列番号10)のプライマー対を用いたPCR反応により、野生型チオエステラーゼ遺伝子のDNA断片を取得した。また、プラスミドベクターpMW219(ニッポンジーン社製)を鋳型とし、pMW219 FW(配列番号11)及びpMW219 RV(配列番号12)のプライマー対を用いたPCR反応により、直鎖状にしたpMW219を取得した後、これをDpnI処理した。これら2つのDNA断片をIn-Fusion(登録商標) HD Cloning Kit(Clonthech, Mountain View, California)を用いて連結し、ベクター由来のLacZタンパク質のN末端27アミノ酸と野生型チオエステラーゼ遺伝子断片(配列番号2に示す塩基配列において、334番目から1245番目の塩基配列)が融合する形で野生型チオエステラーゼ遺伝子が発現するプラスミドを構築した。得られたプラスミドは、DNAシークエンス法によって、野生型チオエステラーゼをコードする遺伝子が挿入されていることを確認した。
前記1.で構築した野生型チオエステラーゼ発現プラスミドを鋳型として、下記表1に示すCTE_W209T FW(配列番号13)及びCTE_W209T RV(配列番号14)のプライマー対、CTE_W209E FW(配列番号15)及びCTE_W209E RV(配列番号16)のプライマー対、CTE_W209A FW(配列番号17)及びCTE_W209A RV(配列番号18)、又はCTE_W209D FW(配列番号19)及びCTE_W209D RV(配列番号20)のプライマー対を用いたPCR反応により、配列番号2に示した野生型チオエステラーゼ遺伝子の塩基配列の625〜627番目の塩基TGG(トリプトファン;W)が、ACC(トレオニン;T)、GAG(グルタミン酸;E)、GCC(アラニン;A)、又はGAC(アスパラギン酸;D)へとそれぞれ置換されたチオエステラーゼ改変体CTE(W209T)、CTE(W209E)、CTE(W209A)、CTE(W209D)をコードする遺伝子を含むDNA断片を増幅した。得られたPCR反応溶液をDpnIで処理し、鋳型DNAを消化した後、大腸菌を形質転換して、チオエステラーゼ改変体が発現するプラスミドを構築した。得られたプラスミドは、DNAシークエンス法によって、チオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子が挿入されていることを確認した。
前記で構築した野生型チオエステラーゼ発現プラスミド、チオエステラーゼ改変体発現プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株であるK27株(fadD88)(Overath et al, Eur.J.Biochem.7,559-574,1969)をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたK27株を30℃で一晩静置して得られたコロニーをLBKm液体培地(Bacto Trypton 1%,Yeast Extract 0.5%,NaCl 1%,カナマイシン50μg/mL)1mLに接種し、30℃で12時間振とう培養した。12時間後の培養液を別のLBKm液体培地2.0mLに20μL添加し、30℃で振とう培養し、培養開始から36時間経過した培養液中に含まれている脂質成分を後述の方法にて解析した。また36時間後の培養液の600nmにおける吸光度(OD600)を計測し、培養液に含まれる大腸菌の量を測定した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpMW219にて形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。
培養開始後36時間経過した培養液1mLに、2N塩酸10μL、および内部標準としてメタノールに溶解した7−ペンタデカノン(5mg/mL)を30μL添加した。この液に対してクロロホルム0.5mLとメタノール1mLを添加し、十分に攪拌した後に15分間静置した。さらに、1.5%塩化カリウム水溶液0.5mLとクロロホルム0.5mLを添加し、十分に攪拌した後に15分間静置した。室温、1500rpmで5分間遠心分離を行った後、下層部分を採取し、窒素ガスで乾燥した。乾燥したサンプルに3−フッ化ホウ素メタノール錯体溶液を1mL添加し、80℃で10分間恒温することにより脂肪酸のメチルエステル化処理を行った。その後、飽和食塩水1mLとヘキサン1mLを添加し、十分に攪拌した後に30分間静置した。上層部分を採取し、ガスクロマトグラフィー(Agilent 6890)解析に供した。使用したガスクロマトグラフィーは[キャピラリーカラム:DB−1 MS 30m×200μm×0.25μm(J&W Scientific)、移動相:高純度ヘリウム、カラム内流量:1.0mL/分、昇温プログラム:100℃(1分間)→10℃/分→300℃(5分間)、平衡化時間:1分間、注入口:スプリット注入(スプリット比:100:1),圧力14.49psi,104mL/分,注入量1μL、洗浄バイアル:メタノール・クロロホルム、検出器温度:300℃]の条件で行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。なお、各ピーク面積を内部標準である7−ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液1リットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、算出した各脂肪酸量を、事前に計測した培養液中に含まれる大腸菌量(OD600)で標準化した。また、上記で算出された各脂肪酸生産量を合計して得総脂肪酸生産量(脂質量)算出した。結果を表2に示す。さらに、総脂肪酸生産量に占める各脂肪酸生産量の割合を表3に示した。なお、表2において、各脂肪酸生産量及び総脂肪酸生産量(脂質量)は、野生型チオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体での生産量を1とした相対値で示した。
これに対し、チオエステラーゼ改変体CTE(W209D)を導入した形質転換体では、野生型チオエステラーゼ遺伝子を導入した形質転換体と同程度の脂肪酸生産量に留まった。
Claims (10)
- 宿主に下記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程と、得られた形質転換体から脂質を採取する工程とを含む、脂質の製造方法。
(a)配列番号1の112番〜414番までのアミノ酸配列であって、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸以外の1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質 - 前記宿主が、植物、藻類及び微生物から選択される、請求項1記載の製造方法。
- 前記宿主が、シロイヌナズナ、シアノバクテリア及び大腸菌から選択される、請求項1又は2記載の製造方法。
- 前記脂質がラウリン酸を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記脂質中に、ラウリン酸が27質量%以上含有される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造方法。
- 宿主に下記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
(a)配列番号1の112番〜414番までのアミノ酸配列であって、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸以外の1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質 - 宿主に下記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体。
(a)配列番号1の112番〜414番までのアミノ酸配列であって、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸以外の1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質 - 前記宿主が、植物、藻類及び微生物から選択される、請求項7記載の形質転換体。
- 前記宿主が、シロイヌナズナ、シアノバクテリア及び大腸菌から選択される、請求項7又は8記載の形質転換体。
- 下記(a)又は(b)のタンパク質。
(a)配列番号1の112番〜414番までのアミノ酸配列であって、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸がトリプトファンからトレオニン、グルタミン酸、又はアラニンに置換されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号1の209番目に相当するアミノ酸以外の1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつチオエステラーゼ活性を有するタンパク質
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