WO2019069969A1 - 脂質の製造方法 - Google Patents

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WO2019069969A1
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彰人 川原
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    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method of producing lipids.
  • the present invention also relates to an acyl-ACP thioesterase variant used in the method, a gene encoding the same, and a transformant into which the gene has been introduced.
  • Fatty acids are one of the main components of lipids, and constitute lipids (oil and fats) such as triacylglycerol produced in the living body by ester bond with glycerin.
  • fatty acids are substances that are stored and used as energy sources in many animals and plants. Fatty acids and lipids stored in animals and plants are widely used for food or industrial use. For example, derivatives of higher alcohols obtained by reducing higher fatty acids having about 12 to 18 carbon atoms are used as surfactants. Alkyl sulfate ester salts, alkyl benzene sulfonates and the like are used as anionic surfactants.
  • polyoxyalkylene alkyl ethers, alkyl polyglycosides and the like are used as nonionic surfactants. And all these surfactants are used as cleaning agents, germicides and the like.
  • the same cationic surfactants such as alkylamine salts and mono- or dialkyl quaternary ammonium salts, which are derivatives of the same higher alcohols, are routinely used as fiber treatment agents, hair rinse agents, bactericidal agents and the like.
  • benzalkonium-type quaternary ammonium salts are routinely used as germicides, preservatives and the like.
  • vegetable fats and oils are also used as raw materials for biodiesel fuel.
  • medium-chain fatty acids having 8 or 10 carbon atoms are used for health food and etching agents.
  • alcohol derivatives obtained by reducing medium-chain fatty acids having 8 or 10 carbon atoms are also used as raw materials for cosmetics, industrial agents such as surfactants, plasticizers, and the like.
  • acyl-ACP acyl carrier protein
  • bayberry Umbellularia californica (California bay)
  • Methods for accumulating fatty acids Patent Document 1, Non-patent Document 1
  • TE acyl-ACP
  • TE acyl carrier protein thioesterase
  • the transformant obtained by introducing into the host a gene encoding TE derived from a plant belonging to the genus Cuphea, such as Cuphea palustris or Cuphea hookeriana It is known that the productivity of medium-chain fatty acids having 8 or 10 carbon atoms is improved.
  • an amino acid sequence obtained by deleting the signal sequence on the N-terminal side from wild-type TE derived from Kuffera palustris consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 48;
  • a TE variant in which specific amino acid substitutions have been made at amino acid positions 172 to 221 or positions corresponding thereto in an amino acid sequence with high identity to the amino acid sequence shown in 1. Then, it is described that the productivity of medium-chain fatty acids having 8 or 10 carbon atoms is improved by introducing a gene encoding such a TE variant into a host such as E. coli or cyanobacteria.
  • a transformant into which a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of the following proteins (A) to (C) has been introduced is cultured to produce a fatty acid or a lipid consisting thereof: It relates to a method of producing a lipid.
  • A An amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the group consisting of the following (A-1) to (A-11) in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1, and an acyl-ACP thioesterase activity
  • C A protein having an amino acid sequence of the protein (A) or (B) and having an acyl-ACP thioesterase activity.
  • A-1 The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • Threonine at position 251 of SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine.
  • Threonine at position 251 of SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine.
  • A-4) The threonine at position 251 of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine.
  • A-5) Tryptophan at position 254 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • A-6) Tryptophan at position 254 of SEQ ID NO: 1 is substituted with tyrosine.
  • A-7) Leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted for methionine.
  • A-8) Leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted for valine.
  • A-9) Leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine.
  • A-10) A valine at position 266 of SEQ ID NO: 1 is substituted with a cysteine.
  • A-11 Tryptophan at position 271 of SEQ ID NO: 1 is substituted with tyrosine.
  • B-1) The amino acid at a position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • (B-2) The amino acid at a position corresponding to position 251 of SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine.
  • (B-3) The amino acid at a position corresponding to position 251 of SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine.
  • (B-4) The amino acid at a position corresponding to position 251 of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine.
  • (B-5) The amino acid at a position corresponding to position 254 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • (B-6) The amino acid at a position corresponding to position 254 of SEQ ID NO: 1 is substituted with tyrosine.
  • the present invention relates to a medium chain produced by culturing a transformant into which a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of the proteins (A) to (C) has been introduced and which is produced in cells of the transformant.
  • the present invention relates to a method for producing a lipid, which improves the productivity of a fatty acid or a lipid comprising the same.
  • the present invention relates to total fatty acids produced in the cells of transformants by culturing transformants into which a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of proteins (A) to (C) has been introduced.
  • the present invention relates to a method for modifying fatty acid composition, which increases the proportion of medium-chain fatty acids in
  • the present invention also relates to the proteins (A) to (C).
  • the present invention also relates to genes encoding the proteins (A) to (C).
  • the present invention relates to a transformant comprising a gene encoding the proteins (A) to (C).
  • the present invention relates to a method for producing a lipid, which improves the productivity of medium-chain fatty acid or a lipid comprising the same.
  • the present invention also relates to the provision of a transformant which improves productivity of medium-chain fatty acids or lipids comprising the same and which can be suitably used in the method.
  • the present invention relates to the provision of a novel TE variant and a gene encoding the same, which is suitable for the use of the above-mentioned method and transformant.
  • fatty acids are also produced in medium-chain fatty acid production using transformants such as E. coli or cyanobacteria, into which a gene encoding TE derived from a plant belonging to the genus Kufea has been introduced. Attempts have been made to improve the production volume of The inventors focused on such a technique, focusing on a site for introducing an amino acid substitution into wild-type TE derived from a plant belonging to the genus Cupea in order to improve the productivity of medium-chain fatty acids.
  • productivity of a medium-chain fatty acid or a lipid containing the same as a component can be improved.
  • the transformant of the present invention is excellent in the productivity of medium-chain fatty acids or lipids containing this as a component.
  • the acyl-ACP thioesterase variant of the present invention and the gene encoding the same can be suitably used for the production of medium-chain fatty acids or lipids consisting thereof.
  • lipid is a simple lipid such as neutral lipid (monoacylglycerol (MAG), diacylglycerol (DAG), triacylglycerol (TAG), etc.), wax, ceramide etc .; phospholipid, glycolipid, sulfo And complex lipids such as lipids; and derived lipids such as fatty acids (free fatty acids), alcohols and hydrocarbons derived from these lipids.
  • Fatty acids that are generally classified as derived lipids refer to fatty acids themselves and mean "free fatty acids”.
  • the fatty acid moiety or the moiety of the acyl group in simple lipids and complex lipid molecules is referred to as "fatty acid residue".
  • fatty acid is used as a generic term for "free fatty acid” and "fatty acid residue”.
  • fatty acid or a lipid containing the same as a component generally uses “free fatty acid” and “lipid having the relevant fatty acid residue”.
  • the “fatty acid composition” means the weight ratio of each fatty acid to the weight of total fatty acid (total fatty acid) obtained by summing the free fatty acid and fatty acid residue as fatty acid. The weight (production amount) of fatty acid and fatty acid composition can be measured by the method used in the examples.
  • Cx: y in the notation of fatty acid and an acyl group constituting the fatty acid means that the number of carbon atoms is x and the number of double bonds is y.
  • Cx represents a fatty acid having a carbon number of x or an acyl group.
  • identity of base sequences and amino acid sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, vol. 227, p. 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing analysis with Unit size to compare (ktup) of 2 using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win.
  • stringent conditions include, for example, the method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press].
  • composition of 1 ⁇ SSC 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0
  • 0.5% SDS 0.5% SDS
  • 5 ⁇ denhardt 100 mg / mL herring sperm DNA
  • upstream indicates not a position from the translation initiation point but a region following the 5 ′ side of the gene or region that is taken as an object.
  • downstream indicates a region that continues to the 3 ′ side of the gene or region that is taken as an object.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 is a part of the amino acid sequence of wild-type TE derived from Kuffera palustris consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 48.
  • a site presumed to be a signal sequence (amino acid sequence of 2-position 57 of SEQ ID NO: 48) is removed from the full length of the amino acid sequence of wild type TE. That is, in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1, amino acids 1 to 57 are removed from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 48, and a protein synthesis initiation amino acid (methionine) is added to the N terminus of the amino acid at position 58 There is.
  • TEs derived from plants belonging to the genus Cupea have high substrate specificity to medium-chain acyl-ACP having 8 or 10 carbon atoms, and the productivity of medium-chain fatty acids having 8 or 10 carbon atoms in the transformant is improved are preferably used.
  • the above-mentioned (A-1) to (A-11) and the above-mentioned (A-1) to (A-11) can be used for wild-type TE derived from Cupharas tritus having substrate specificity for medium-chain acyl-ACP having 8 or 10 carbon atoms.
  • the TE variant of the present invention subjected to such amino acid substitution is more improved in substrate specificity for medium-chain acyl-ACP as compared to wild-type TE.
  • transduced the gene which codes TE variant of this invention is excellent in productivity of medium-chain fatty acid.
  • a wild-type TE derived from cuprea pulstoris and a TE variant to which an amino acid mutation has been applied are collectively referred to as “CpTE”.
  • Patent documents 2 and 3 show that when amino acid substitution is carried out in the region of positions 172 to 221 in the amino acid sequence of CpTE (the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1), the TE variant has substrate specificity for medium-chain acyl-ACP. It discloses that the nature improves.
  • the portions disclosed in Patent Documents 2 and 3 as disclosed in (A-1) to (A-11) and (B-1) to (B-11), the portions disclosed in Patent Documents 2 and 3 and Make amino acid substitutions at different sites.
  • a gene encoding at least one protein (acyl-ACP thioesterase variant) selected from the group consisting of the above-mentioned proteins (A) to (C) is introduced to promote its expression.
  • the acyl-ACP thioesterase variant (hereinafter also referred to as “TE variant”) has an amino acid sequence in which a portion of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has been modified, and , Also referred to as “TE activity”).
  • intermediate chain means that the number of carbon atoms in the acyl group is 8 or more and 10 or less, preferably 8 or 10 carbon atoms.
  • productivity of fatty acid and lipid of the transformant can be measured by the method used in the examples.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence from the N-terminal side of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 48 excluding the amino acid sequence from 2 to 57, and position 1 of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO. And corresponds to the amino acid sequence of positions 58 to 411.
  • SEQ ID NO: 48 is the amino acid sequence of wild-type TE derived from Cupea pulstoris.
  • the region of positions 58 to 411 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 is known to be important for functioning as TE and a region sufficient for exhibiting TE activity.
  • TE is an enzyme involved in the biosynthetic system of fatty acids and their derivatives (such as triacylglycerol (triglyceride)).
  • the enzyme is an acyl-ACP (an acyl group as a fatty acid residue and an acyl group as an intermediate of fatty acid biosynthesis process) in a plastid such as chloroplast in plants and algae and in the cytoplasm in bacteria, fungi and animals.
  • the thioester bond of the complex consisting of an acyl carrier protein is hydrolyzed to produce free fatty acid.
  • TE fatty acid synthesis on ACP is completed, and the cut-out fatty acid is subjected to synthesis of triacylglycerol and the like.
  • TE contains multiple TEs having different reaction specificities depending on the number of carbon atoms and the number of unsaturated bonds of the acyl group (fatty acid residue) constituting the substrate acyl-ACP. It is considered to be an important factor that determines the fatty acid composition in vivo.
  • TE activity refers to the activity of hydrolyzing the thioester bond of acyl-ACP.
  • the amino acid sequence of the protein (A) is based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid at a specific position in the amino acid sequence is any one of (A-1) to (A-11) above. It is substituted as shown.
  • the TE variant defined as protein (A) improves the specificity for medium chain acyl-ACP. That is, the TE variant of protein (A) selectively utilizes medium-chain acyl-ACP as a substrate as compared to wild-type TE, and the activity to hydrolyze it is improved.
  • the amino acid sequence of the protein (A) is the amino acid of the above (A-1) from the viewpoint of improving the specificity to the medium chain acyl-ACP and improving the productivity of the medium chain fatty acid or the lipid composed of this It is preferred to have a substitution.
  • TE variants having amino acid substitutions may be abbreviated as shown below.
  • CpTE (L257I) or L257I a TE variant in which leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine (I).
  • CpTE (T251R) or T251R a TE variant in which threonine (T) at position 251 of SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine (R).
  • CpTE (T251K) or T251K a TE variant in which threonine (T) at position 251 of SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine (K).
  • CpTE (T251H) or T251H a TE variant in which threonine (T) at position 251 of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine (H).
  • CpTE (W254I) or W254I Tryptophan (W) at position 254 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine (I).
  • CpTE (W254Y) or W254Y a TE variant in which tryptophan (W) at position 254 of SEQ ID NO: 1 is substituted with tyrosine (Y).
  • CpTE (L257M) or L257M a TE variant in which leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with methionine (M).
  • CpTE (L257V) or L257V a TE variant in which leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with valine (V).
  • CpTE (L257F) or L257F a TE variant in which leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine (F).
  • CpTE (V266C) or V266C substitution of valine (V) at position 266 of SEQ ID NO: 1 with cysteine (C).
  • CpTE (W271Y) or W271Y a TE variant in which tryptophan (W) at position 271 of SEQ ID NO: 1 is substituted with tyrosine (Y).
  • the protein (A) is selected from the group consisting of the following (D-1) to (D-8) in addition to at least one amino acid substitution selected from the group consisting of (A-1) to (A-11) It is preferred to have at least one amino acid substitution. When these amino acid substitutions are included, the specificity for medium-chain acyl-ACP and the productivity of medium-chain fatty acids or lipids composed thereof are further improved.
  • the protein (A) more preferably has an amino acid substitution of (A-1) and at least one amino acid substitution selected from the group consisting of (D-1) to (D-8) below: It is more preferable to have the amino acid substitution of (A-1), and one amino acid substitution selected from the group consisting of (D-1) to (D-8) below.
  • a valine at position 106 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • D-2 Asparagine at position 108 of SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine.
  • D-3) Asparagine at position 108 of SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine.
  • D-4) The valine at position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • D-5 The valine at position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with methionine.
  • D-6) The valine at position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with leucine.
  • D-7) The valine at position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine.
  • D-8 The cysteine at position 118 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • amino acid substitutions (D-1) to (D-8) may be abbreviated as follows.
  • V106I valine (V) at position 106 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine (I).
  • N108K Asparagine (N) at position 108 of SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine (K).
  • N108R Asparagine (N) at position 108 of SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine (R).
  • V110I valine (V) at position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine (I).
  • V110M valine (V) at position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with methionine (M).
  • V110L valine (V) at position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with leucine (L).
  • V110F valine (V) at position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine (F).
  • C118I A cysteine (C) at position 118 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine (I).
  • the protein (A) more preferably has an amino acid substitution selected from the group consisting of the following (A-1_D-1) to (A-1_D-8).
  • A-1_D-1 The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, and the valine at position 106 is substituted with isoleucine, respectively.
  • A-1_D-2) The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, and the asparagine at position 108 is substituted with lysine.
  • A-1_D-3 The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, and the asparagine at position 108 is substituted with arginine.
  • A-1_D-4 The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, and the valine at position 110 is substituted with isoleucine.
  • A-1_D-5) The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, and the valine at position 110 is substituted with methionine.
  • A-1_D-6 The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, and the valine at position 110 is substituted with leucine.
  • A-1_D-7 The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, and the valine at position 110 is substituted with phenylalanine.
  • A-1_D-8 The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine and the cysteine at position 118 is substituted with isoleucine.
  • the protein (B) is based on an amino acid sequence having an identity of 85% or more to the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1, and has TE activity. Similar to protein (A), protein (B) also has improved specificity for medium-chain acyl-ACP.
  • the amino acid sequence encoding an enzyme protein does not necessarily show enzyme activity unless the entire region sequence is conserved, and even a region which does not affect enzyme activity even if the amino acid sequence changes. It is known to exist. In a region which is not essential for such enzyme activity, even if mutations such as deletion, substitution, insertion or addition of amino acids are introduced, the original activity of the enzyme can be maintained. Also in the present invention, a protein in which the TE activity is thus retained and in which the amino acid sequence is partially mutated can be used.
  • the identity to the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 is 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, 93% or more from the point of TE activity More preferably, 94% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 96% or more is more preferable, 97% or more is more preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • one or more eg, 1 to 53, preferably 1 to 35, more preferably 1 to 28
  • it is 1 or more and 24 or less, more preferably 1 or more and 21 or less, more preferably 1 or more and 17 or less, more preferably 1 or more and 14 or less, more preferably 1 or more and 10 or less
  • amino acid mutations are different from the above-mentioned amino acid substitutions (B-1) to (B-11).
  • the amino acid sequence of protein (B) has the same amino acid substitution as the amino acid substitution in protein (A) in the amino acid sequence having 85% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. That is, the amino acid sequence of protein (B) has at least at least one amino acid substitution selected from the group consisting of (B-1) to (B-11) above.
  • the amino acid at the position corresponding to position 251 of SEQ ID NO: 1 is preferably or usually threonine.
  • the amino acid at the position corresponding to position 254 of SEQ ID NO: 1 is preferably or usually tryptophan.
  • the amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 is preferably or usually leucine.
  • the amino acid at the position corresponding to position 266 of SEQ ID NO: 1 is preferably or usually valine.
  • the amino acid at the position corresponding to position 271 of SEQ ID NO: 1 is preferably or usually tryptophan.
  • amino acid sequence of protein (B) preferably has the amino acid substitution of (B-1) above.
  • the protein (B) is selected from the group consisting of the following (E-1) to (E-8) in addition to at least one amino acid substitution selected from the group consisting of (B-1) to (B-11) It is preferred to have at least one amino acid substitution. When these amino acid substitutions are included, the specificity for medium-chain acyl-ACP and the productivity of medium-chain fatty acids or lipids composed thereof are further improved.
  • the protein (B) more preferably has an amino acid substitution of (B-1) and at least one amino acid substitution selected from the group consisting of (E-1) to (E-8) below: It is more preferable to have the amino acid substitution of (B-1), and one amino acid substitution selected from the group consisting of the following (E-1) to (E-8).
  • E-1 The amino acid at a position corresponding to position 106 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • E-2 The amino acid at a position corresponding to position 108 of SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine.
  • E-3 The amino acid at a position corresponding to position 108 of SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine.
  • E-4 The amino acid at a position corresponding to position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • E-5 The amino acid at a position corresponding to position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with methionine.
  • E-6 The amino acid at a position corresponding to position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with leucine.
  • the amino acid at the position corresponding to position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine.
  • E-8) The amino acid at a position corresponding to position 118 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • the amino acid at the position corresponding to position 106 of SEQ ID NO: 1 is preferably or usually valine.
  • the amino acid at the position corresponding to position 108 of SEQ ID NO: 1 is preferably or usually asparagine.
  • the amino acid at the position corresponding to position 110 of SEQ ID NO: 1 is preferably or usually valine.
  • the amino acid at the position corresponding to position 118 of SEQ ID NO: 1 is preferably or usually cysteine.
  • the protein (B) more preferably has an amino acid substitution selected from the group consisting of (B-1_E-1) to (B-1_E-8) below.
  • B-1_E-1 The amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually leucine) corresponds to isoleucine, the amino acid at the position corresponding to position 106 (preferably or usually valine) to isoleucine , Each replaced.
  • B-1_E-2) The amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually leucine) corresponds to isoleucine, the amino acid at the position corresponding to position 108 (preferably or asparagine) to lysine , Each replaced.
  • the amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 corresponds to isoleucine, the amino acid at the position corresponding to position 108 (preferably or asparagine) to arginine , Each replaced.
  • the amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually leucine) is an isoleucine, the amino acid at a position corresponding to position 110 (preferably or usually valine) is an isoleucine , Each replaced.
  • (B-1_E-5) The amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually leucine) is isoleucine, the amino acid at the position corresponding to position 110 (preferably or usually valine) is methionine , Each replaced.
  • (B-1_E-6) The amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually leucine) corresponds to isoleucine, the amino acid at the position corresponding to position 110 (preferably or usually valine) to leucine , Each replaced.
  • (B-1_E-7) The amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually leucine) corresponds to isoleucine, the amino acid at the position corresponding to position 110 (preferably or usually valine) to phenylalanine , Each replaced.
  • (B-1_E-8) The amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually leucine) corresponds to isoleucine, the amino acid at the position corresponding to position 118 (preferably or usually cysteine) to isoleucine , Each replaced.
  • the "corresponding position” or “corresponding region” in the amino acid sequence or the base sequence compares the target amino acid sequence with the reference sequence, and gives the largest homology to the conserved amino acid residues present in each amino acid sequence.
  • EBI Japan Bioin
  • the protein (C) contains the amino acid sequence of the protein (A) or (B) as a part of its amino acid sequence, and exhibits TE activity.
  • the amino acid at the N-terminus of the protein (C) is preferably methionine or leucine encoded by the initiation codon.
  • sequences other than the amino acid sequence of the protein (A) or (B) can be appropriately selected as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • an amino acid sequence consisting of an arbitrary position range from 1 to 57 of SEQ ID NO: 48, or one or more (preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less) amino acid sequences And more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5 and more preferably 1 to 3).
  • Mutations include amino acid deletions, substitutions, insertions or additions. These sequences are preferably added to the N-terminal side of the amino acid sequence of the protein (A) or (B).
  • the protein (C) may be a protein consisting of an amino acid sequence in which the N-terminal side is deleted at any position of 2-position 57 of SEQ ID NO: 48 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 48.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which a signal peptide involved in transport or secretion of the protein is added to the amino acid sequence of the protein (A) or (B) is also preferable.
  • That the protein has TE activity means that, for example, a DNA in which a gene encoding the protein is linked downstream of a promoter that functions in a host cell such as E. coli is introduced into a host cell deficient in a fatty acid degradation system and introduced.
  • the culture can be carried out under conditions where the gene is expressed, and the change in fatty acid composition in the host cell or culture solution can be confirmed by analysis using a method such as gas chromatography analysis. At this time, it is possible to confirm that the specificity for medium-chain acyl-ACP is improved by comparing the ratio of medium-chain fatty acids to the total amount of fatty acids with a system in which wild-type TE is expressed.
  • a DNA in which a gene encoding the protein is linked downstream of a promoter that functions in a host cell such as E. coli is introduced into the host cell, and the cell is cultured under the conditions where the introduced gene is expressed.
  • a promoter that functions in a host cell such as E. coli
  • a method of introducing a mutation into an amino acid sequence for example, a method of introducing a mutation into a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence can be mentioned.
  • site-directed mutagenesis can be mentioned. Specific methods for introducing site-directed mutations include methods using SOE-PCR, ODA methods, Kunkel methods and the like.
  • commercially available kits such as Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Km kit (Takara Bio Inc.), TransformerTM Site-Directed Mutagenesis kit (Clonetech), KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.) may be used. it can.
  • the target gene after giving random gene mutations, the target gene can also be obtained by evaluating the activity and analyzing the gene by an appropriate method.
  • the proteins (A) to (C) can be obtained by a conventional chemical method, genetic engineering method or the like.
  • a protein derived from a natural product can be obtained by isolation, purification and the like from cuprea pulse tris.
  • the above-mentioned proteins (A) to (C) can be obtained by artificially chemically synthesizing based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 1.
  • the proteins (A) to (C) may be produced as recombinant proteins by genetic recombination techniques.
  • the TE gene described later can be used.
  • plants, such as kufaa puls tris can be obtained from private or public preservation institutions, such as a research institute.
  • TE variant gene As a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of the above-mentioned proteins (A) to (C) (hereinafter also referred to as "TE variant gene” or “CpTE variant gene”), The gene which consists of any one of (c) is mentioned.
  • the DNA sequence consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 shown below the DNA sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 Code
  • the nucleotide sequence encoding the aforementioned signal sequence corresponds to positions 1 to 171 of SEQ ID NO: 49.
  • C has a base sequence of the DNA (a) or (b) (preferably, the base sequence of the DNA (a) or (b) excluding the initiation codon) and encodes a protein having TE activity DNA.
  • A-1 The base at position 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding isoleucine.
  • A-2 The base at positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding arginine.
  • A-3) The base at positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding lysine.
  • A-4 The base at positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding histidine.
  • A-5) The base at positions 760 to 762 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding isoleucine.
  • A-6 The base at position 760 to 762 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding tyrosine.
  • A-7 The base at position 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding methionine.
  • A-8) The base at position 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding valine.
  • A-9) The base at position 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding phenylalanine.
  • A-10) The base at positions 796 to 798 in SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding cysteine.
  • B-4 A base at a position corresponding to positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding histidine.
  • B-5) A base at a position corresponding to positions 760 to 762 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding isoleucine.
  • B-6 A base at a position corresponding to positions 760 to 762 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding tyrosine.
  • B-7) A base at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding methionine.
  • a base at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding valine.
  • B-9) Substitution of a base acid at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 to a base encoding phenylalanine.
  • B-10) A base at a position corresponding to positions 796 to 798 in SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding cysteine.
  • B-11 A base at a position corresponding to positions 811 to 813 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a tyrosine-encoding base.
  • the base sequence of DNA (a) has a base substitution corresponding to the amino acid substitution which the amino acid sequence of protein (A) has.
  • base substitution (a-1), (a-2), (a-3), (a-4), (a-5), (a-6), (a-7), ( a-8), (a-9), (a-10) and (a-11) are respectively the amino acid substitutions (A-1), (A-2), (A-3) and (A-4).
  • the base sequence of DNA (b) also has a base substitution corresponding to the amino acid substitution of the amino acid sequence of protein (B).
  • base substitution (b-1), (b-2), (b-3), (b-4), (b-5), (b-6), (b-7), ( b-8), (b-9), (b-10) and (b-11) are respectively the amino acid substitutions (B-1), (B-2), (B-3) and (B-4). , (B-5), (B-6), (B-7), (B-8), (B-9), (B-10) and (B-11).
  • the DNA (a) is selected from the group consisting of the following (d-1) to (d-8) in addition to at least one base substitution selected from the group consisting of (a-1) to (a-11) It is preferred to have at least one base substitution.
  • the DNA (a) is more preferably a base substitution of (a-1) and at least one base substitution selected from the group consisting of (d-1) to (d-8) below: .
  • D-1 The base at positions 316 to 318 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding isoleucine.
  • D-2) The base at positions 322 to 324 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding lysine.
  • the DNA (a) more preferably has a base substitution selected from the group consisting of the following (a-1_d-1) to (a-1_d-8).
  • A-1_d-1 The bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 are substituted with a base encoding isoleucine, and the bases at positions 316 to 318 are substituted with a base encoding isoleucine, respectively.
  • A-1_d-2) The bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 are substituted with the bases encoding isoleucine, and the bases at positions 322 to 324 are substituted with the bases encoding lysine, respectively.
  • A-1_d-3 The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 are substituted with the base encoding isoleucine, and the bases at positions 322 to 324 are substituted with the base encoding arginine, respectively.
  • A-1_d-4 The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 are substituted with the bases encoding isoleucine, and the bases at positions 328 to 330 are substituted with the bases encoding isoleucine, respectively.
  • A-1_d-5 The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 are substituted with the bases encoding isoleucine, and the bases at positions 328 to 330 are substituted with the bases encoding methionine, respectively.
  • A-1_d-6 The bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 are substituted with the bases encoding isoleucine, and the bases at positions 328 to 330 are substituted with the bases encoding leucine, respectively.
  • A-1_d-7 The bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 are substituted with the bases encoding isoleucine, and the bases at positions 328 to 330 are substituted with the bases encoding phenylalanine, respectively.
  • A-1_d-8 The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 are substituted with the bases encoding isoleucine, and the bases at positions 352 to 354 are substituted with the bases encoding isoleucine, respectively.
  • the identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is 70% or more, preferably 75% or more, preferably 80% or more, and more preferably 85% or more 90% or more is more preferable, 92% or more is more preferable, 93% or more is more preferable, 94% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 96% or more is more preferable, 97% or more is more preferable 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the DNA (b) one or more (for example, 1 or more and 320 or less, preferably 1 or more and 267 or less, more preferably 1 or more and 213 or less, in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 Preferably it is 1 or more and 160 or less, more preferably 1 or more and 106 or less, more preferably 1 or more and 85 or less, more preferably 1 or more and 74 or less, more preferably 1 or more and 64 or less, more Preferably 1 or more and 53 or less, more preferably 1 or more and 42 or less, more preferably 1 or more and 32 or less, more preferably 1 or more and 21 or less, more preferably 1 or more and 10 or less) Also preferred is a DNA encoding the above-mentioned protein (A) or (B) in which a base is deleted, substituted, inserted or added and which has TE activity.
  • the mutations of these base sequences are different from the above-mentioned base substitutions (b-1) to (b-11). Furthermore, as the DNA (b), the protein (A) or (B) which hybridizes with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA (a) under stringent conditions and has TE activity is encoded. DNA is also preferred.
  • the DNA (b) is selected from the group consisting of the following (e-1) to (e-8) in addition to at least one base substitution selected from the group consisting of (b-1) to (b-11) It is preferred to have at least one base substitution. In the present invention, it is more preferable that the DNA (b) has a base substitution of (b-1) and at least one base substitution selected from the group consisting of the following (e-1) to (e-8): .
  • (E-1) A base at a position corresponding to positions 316 to 318 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding isoleucine.
  • E-6 A base at a position corresponding to positions 328 to 330 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a leucine encoding base.
  • E-7) A base at a position corresponding to positions 328 to 330 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding phenylalanine.
  • E-8) A base at a position corresponding to positions 352 to 354 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding isoleucine.
  • the DNA (b) more preferably has a base substitution selected from the group consisting of the following (b-1_e-1) to (b-1_e-8).
  • B-1_e-1) The base at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and the base at a position corresponding to positions 316 to 318 is a base encoding isoleucine Replace.
  • B-1_e-2) The base at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and the base at a position corresponding to positions 322 to 324 is a base encoding lysine Replace.
  • the base at a position corresponding to positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and the base at a position corresponding to positions 322 to 324 is a base encoding arginine Replace.
  • the base at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and the base at a position corresponding to positions 328 to 330 is a base encoding isoleucine Replace.
  • the base at a position corresponding to positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and the base at a position corresponding to positions 328 to 330 is a base encoding methionine Replace.
  • the base at a position corresponding to positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and the base at a position corresponding to positions 328 to 330 is a base encoding leucine Replace.
  • a base at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and a base at a position corresponding to positions 328 to 330 is a base encoding phenylalanine Replace.
  • the base at a position corresponding to positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and the base at a position corresponding to positions 352 to 354 is a base encoding isoleucine Replace.
  • the DNA (c) contains the base sequence of the DNA (a) or (b) as a part of its base sequence, and encodes a protein exhibiting TE activity.
  • the base sequence at the 5 'end of the DNA (c) is preferably a start codon encoding methionine (ATG) or leucine (TTG).
  • ATG start codon encoding methionine
  • TGT leucine
  • base sequences other than the base sequence of the DNA (a) or (b) can be appropriately selected as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • one or several (preferably 1 or more and 60 or less, more preferably 1 or more and 45 or less, preferably 1 or more) of the arbitrary nucleotide sequence of positions 1 to 171 of SEQ ID NO: 49 or this nucleotide sequence A nucleotide sequence or the like into which a mutation of not less than 30 and more preferably not less than 1 and not more than 15 and more preferably not less than 1 and not more than 9 can be mentioned. Mutations include base deletion, substitution, insertion or addition. These sequences are preferably added to the 5 'side of the base sequence of the DNA (a) or (b).
  • the DNA (c) may be a DNA consisting of a nucleotide sequence in which the 5 'side is deleted at any position from the 4-position to the 171-position in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 49.
  • a nucleotide sequence encoding a signal peptide involved in protein transport and secretion is added to the 5 'side of the nucleotide sequence of the DNA (a) or (b).
  • Examples of methods for introducing mutations such as deletions, substitutions, insertions and additions into the nucleotide sequence include, for example, site-directed mutagenesis.
  • a method using Splicing overlap extension (SOE) PCR Gene, 1989, vol. 77, p. 61-68
  • an ODA method Gene, 1995, 152, 271). 27
  • Kunkel method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, p. 488) and the like.
  • kits such as Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Km kit (Takara Bio Inc.), TransformerTM Site-Directed Mutagenesis kit (Clonetech), KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.) may be used. it can.
  • a target gene after giving random gene mutations, a target gene can be obtained by evaluating enzyme activity and performing gene analysis by an appropriate method.
  • a gene encoding a CpTE variant can be obtained by conventional genetic engineering techniques.
  • a CpTE variant gene can be artificially synthesized based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the synthesis of the CpTE variant gene can use, for example, a service such as Invitrogen.
  • they can be obtained by cloning from Cuper puls Tris.
  • it can be carried out according to the method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)].
  • the transformant of the present invention can be prepared by introducing the CpTE variant gene into a host in a conventional manner. Specifically, it can be prepared by preparing a recombinant vector or gene expression cassette capable of expressing the CpTE variant gene in a host cell, and introducing this into a host cell to transform the host cell.
  • the host of the transformant can be appropriately selected from those usually used.
  • Hosts that can be used in the present invention include microorganisms (including algae and microalgae), plants, and animals.
  • the microorganism may be either prokaryotic, eukaryotic, Escherichia (Escherichia) microorganisms belonging to the genus or Bacillus (Bacillus) microorganisms of the genus of Synechocystis (Synechocystis) microorganism of the genus, Synechococcus (Synechococcus) genus cyanobacteria such as Prokaryotes, or eukaryotic microbes such as yeast and filamentous fungi.
  • E. coli Escherichia coli
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • red yeast Rhodosporidium toruloides
  • Mortierella sp. Mortierella sp.
  • cyanobacteria are preferable from the viewpoint of lipid productivity, and E. coli or cyanobacteria are preferable. More preferable.
  • algae and microalgae algae of Chlamydomonas genus, algae of Chlorella ( Chlorella ) genus, algae of Phaeodactylum genus, or Nannochlorosis from the viewpoint that genetic recombination techniques are established Algal algae are preferred, and algae of the genus Nannochloropsis are more preferred.
  • Nannochloropsis oculata Nannochloropsis gaditana ( Nannochloropsis gaditana ), Nannochloropsis salina ( Nannochloropsis salina ), Nannochloropsis osianica ( Nannochloropsis oceanica ), Nannochlor There may be mentioned P. atos ( Nannochloropsis atomus ), N. nankochloropsis maculata ( Nannochloropsis maculata ), N. nannochloropsis granulata ( Nannochloropsis granulata ), N. nannochloropsis sp.
  • Nannochloropsis oculata or Nannochloropsis gaditana is preferable, and Nannochloropsis oculata is more preferable.
  • Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana
  • Brassica napus Brassica napus
  • Brassica Brassica rapa
  • Cocos nucifera Palm
  • Palm Elaeis guineensis
  • Qufa and Soybean ( Glycine max )
  • corn Zea mays
  • rice Oryza sativa
  • sunflower Helianthus annuus
  • camphor tree Cinnamomum camphora
  • jatropha curcas is preferable, and Arabidopsis thaliana is more preferable.
  • the host is preferably a microorganism, more preferably E. coli or cyanobacteria, from the viewpoint of production efficiency and availability of the obtained lipid.
  • the cyanobacteria blue bacteria
  • the cyanobacteria that can be preferably used in the present invention are a group of eubacteria, which have the ability to produce oxygen by photosynthesis and to fix CO 2 .
  • Cyanobacteria are a group of prokaryotes that carry out photosynthesis with chlorophyll. Cyanobacteria are rich in diversity, and even if they look only at the cell shape, they are unicellular such as Synechocystis sp. PCC 6803 or Anabaena sp ( Nabaena sp) which forms heterocyst and fixes nitrogen. .)
  • There are filamentous ones such as PCC7120 in which multiple cells are linked like a cord, or spiral or branched ones.
  • the growth environment is also thermophilic such as Thermosynechococcus elongatus BP-1 isolated from Beppu Hot Spring, Synechococcus sp. CC9311 which is marine and inhabited in the coastal area. Or, species adapted to various conditions, such as Synechococcus sp. WH8102, which inhabit the open sea, can be seen.
  • Microcystis aeruginosa those having gas vesicles and capable of producing toxins, and phycobilisomes that do not have thylakoids and are collecting antennas Gloeobacter violaceus PCC 7421 bound to the plasma membrane, or a marine americ agent with chlorophyll d as the major (> 95%) photosynthetic pigment, as in common photosynthetic organisms
  • Other examples include Cryochloris marina ( Acaryochloris marina ).
  • Cryochloris marina Acaryochloris marina
  • cyanobacteria photosynthetically immobilized carbon dioxide is converted to acetyl-CoA through a number of enzymatic reaction processes.
  • Synechocystis (Synechocystis) genus Synechococcus (Synechococcus) genus Thermo Synechococcus (Thermosynechococcus) genus Torikodesumiumu (Trichodesmium) genus, Akari Ok Loris (Acaryochloris) genus Kurokosufaera (Crocosphaera) genus, and Anabaena ( Anabaena ) cyanobacteria are included.
  • Synechocystis sp. PCC 6803 Synechocystis sp. PCC 7509
  • Synechocystis sp. PCC 6714 Synechococcus elongatus sp. M.
  • erythraeium Trichodesmium erythraeum IMS 101, Acariochloris mariana ( Acaryochloris mariana ) MBIC 11017, Crocosphaera watsonii ( Crocosphaera watsonii ) WH8501, and Anabaena sp.
  • Synechococcus elongatus sp. PCC7942 is more preferred, Synechococcus elongatus sp. PCC 7942 is even more preferred.
  • cyanobacteria preferably lose the function of acyl-ACP synthetase (hereinafter also referred to as “aas”).
  • aas is one of enzymes involved in fatty acid synthesis, and has a function of forming a thioester bond in an ATP-dependent manner using free fatty acid and ACP protein as a substrate to produce acyl-ACP. It is known that loss of aas function in cyanobacteria promotes accumulation and secretion of fatty acids (see Plant Physiology, 2010, vol. 152 (3), p. 1598-1610).
  • a gene encoding a protein of interest can be introduced into a host, and a vector capable of expressing the gene of interest in host cells If it is for example, a vector having an expression control region such as a promoter or a terminator depending on the type of host used can be used, and a vector having an origin of replication, a selection marker or the like can be used. In addition, it may be a vector such as a plasmid that can be autonomously propagated / replicated extrachromosomally, or it may be a vector integrated into a chromosome.
  • expression vectors that can be preferably used in the present invention include pBluescript (pBS) II SK (-) (Stratagene) and pSTV vectors (Takara Bio) when using a microorganism as a host.
  • pBluescript pBS II SK (-) (Stratagene)
  • pSTV vectors Tekara Bio
  • pUC vector Takara Shuzo
  • pET vector Takara Bio
  • pGEX vector GE Healthcare
  • pCold vector Tikara Bio
  • pHY300 PLK Takara Bio
  • pUB110 paka 110 1986, Plasmid 15 (2), p.
  • pBR322 manufactured by Takara Bio Inc.
  • pRS 403 manufactured by Stratagene
  • pMW 218/219 manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.
  • pRI vector manufactured by Takara Bio Inc.
  • pBI vectors manufactured by Clontech Co., Ltd.
  • IN3 vectors manufactured by Implanta Innovations, Inc.
  • pUC19 Tropa Bio Inc.
  • P66 Chlamydomonas Center
  • P-322 Cholamydomonas Center
  • pPha-T1 Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51) , p. 666-672
  • pJET1 manufactured by Cosmo Bio Inc.
  • the host is an algae belonging to the genus Nannochlorosis
  • pUC19, pPha-T1, or pJET1 is preferably used.
  • the host is an algae belonging to the genus Nannochloropsis, referring to the method described in “Procedures of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108 (52)”, the target gene is referred to.
  • the host can also be transformed using a DNA fragment (gene expression cassette) consisting of a promoter and a terminator.
  • pRI vectors manufactured by Takara Bio Inc.
  • pBI vectors manufactured by Clontech
  • IN3 vectors manufactured by Implanta Innovations
  • pRI vectors or pBI vectors are preferably used.
  • this DNA fragment include a DNA fragment amplified by the PCR method and a DNA fragment cleaved by a restriction enzyme.
  • the introduction of a gene encoding a protein of interest into the vector can be carried out by conventional methods such as restriction enzyme treatment and ligation.
  • the type of promoter that regulates the expression of the gene encoding the target protein incorporated into the expression vector can also be appropriately selected according to the type of host used.
  • the promoter that can be preferably used in the present invention can be inducible by the addition of lac promoter, trp promoter, tac promoter, trc promoter, T7 promoter, SpoVG promoter, isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Promoters for various derivatives, Rubisco operon (rbc), PSI reaction center protein (psaAB), PSII D1 protein (psbA), cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter, housekeeping gene promoter (eg, tubulin promoter, actin promoter, ubiquitin promoter) etc.), rape or oilseed rape derived Napin gene promoter, a plant-derived Rubisco promoters, Nannochloropsis from the genus violaxanthin / chlorophyll a binding protein gene promote
  • oleosin-like protein LDSP lipid droplet surface protein
  • LDSP lipid droplet surface protein
  • the promoter of the rrnA operon gene encoding ribosomal RNA can be appropriately selected according to the type of host to be used.
  • selectable markers which can be preferably used in the present invention, ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, blasticidin S
  • drug resistance genes such as resistance genes, bialaphos resistance genes, zeocin resistance genes, paromomycin resistance genes, and hygromycin resistance genes.
  • deletion of a gene related to auxotrophy can also be used as a selection marker gene.
  • the transformation method can be appropriately selected from conventional methods according to the type of host used. For example, transformation methods using calcium ions, general competent cell transformation methods, protoplast transformation methods, electroporation methods, LP transformation methods, methods using Agrobacterium, particle gun methods, etc. may be mentioned. .
  • Selection of transformants into which the target gene fragment has been introduced can be performed by using a selection marker or the like.
  • the drug resistance obtained by a transformant can be used as an index.
  • introduction of a target DNA fragment can also be confirmed by PCR using a genome as a template.
  • the CpTE variant gene introduced into various hosts is preferably codon optimized in accordance with the codon usage in the host used.
  • Information on codons used by various organisms is available from Codon Usage Database (www. Kazusa. Or. Jp / codon /).
  • the transformant of the present invention has productivity of medium-chain fatty acid or a lipid composed of this as compared with the wild strain itself, in particular, medium-chain fatty acid occupying in the total fatty acid or total lipid produced or this
  • the proportion of the component lipids is significantly improved.
  • the fatty acid composition in the produced lipid is altered.
  • the transformant of the present invention may be a fatty acid or lipid having a specific number of carbon atoms, in particular a medium-chain fatty acid or a lipid consisting thereof, preferably a fatty acid having 8 to 10 carbon atoms or a component thereof , More preferably a fatty acid having 8 or 10 carbon atoms or a lipid consisting thereof, more preferably a saturated fatty acid having 8 or 10 carbon atoms (caprylic acid, capric acid) or a lipid consisting thereof Can be suitably used for the production of
  • those into which a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of the proteins (A) to (C) has been introduced are also referred to as “transformants”.
  • those into which a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of the proteins (A) to (C) has not been introduced are also referred to as "host” or "wild strain”.
  • the productivity of medium-chain fatty acid or a lipid containing the same as a component is improved as compared with a host in which expression of the above-mentioned proteins (A) to (C) is not promoted. Therefore, if the transformant of the present invention is cultured under appropriate conditions and then medium-chain fatty acids or lipids consisting thereof are recovered from the culture or growth obtained, medium-chain fatty acids or components thereof Can be produced efficiently.
  • the term "culture” refers to a culture solution and a transformant after being cultured, and "growth” refers to a transformant after growth.
  • the culture conditions for the transformant of the present invention can be appropriately selected depending on the host, and culture conditions usually used for the host can be used. Further, from the viewpoint of the production efficiency of fatty acid, for example, glycerol, acetic acid, glucose or the like may be added to the medium as a precursor involved in the fatty acid biosynthesis system.
  • E. coli When E. coli is used as a host, E. coli can be cultured, for example, in LB medium or Overnight Express Instant TB Medium (Novagen) at 30 to 37 ° C. for 0.5 to 1 day.
  • BG-11 medium J. Gen. Microbiol., 1979, vol. 111, p. 1-61
  • a medium Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1980, vol. 77, p. 6052-6056
  • AA medium Plant Physiol., 1955, vol. 30, p.
  • the culture period for lipid production may be such that fatty acid accumulates at a high concentration under conditions in which the cells sufficiently grow, for example, 7 to 45 days, preferably 10 to 30 days, more preferably 14 It is preferable to perform aeration and agitation culture or shaking culture for -21 days.
  • cultivation of Arabidopsis thaliana is carried out, for example, 1 to 2 under soil temperature conditions of 20 to 25 ° C., continuous irradiation with white light or light conditions such as 16 hours of light period and 8 hours of dark period It can be grown monthly.
  • the medium When algae is used as a host, the medium may be one based on natural seawater or artificial seawater, or a commercially available culture medium may be used. Specific examples of the medium include f / 2 medium, ESM medium, Daigo IMK medium, L1 medium, MNK medium and the like. Among them, from the viewpoint of lipid productivity improvement and nutrient concentration, f / 2 medium, ESM medium, or Digo IMK medium is preferable, f / 2 medium or Digo IMK medium is more preferable, and f / 2 medium is more preferable. preferable.
  • a nitrogen source, a phosphorus source, metal salts, vitamins, trace metals and the like can be appropriately added to the culture medium for promoting the growth of algae and improving the productivity of fatty acids.
  • the amount of algae to be inoculated into the culture medium can be appropriately selected, and from the viewpoint of viability, 1% (vol / vol) or more per culture medium is preferable. Further, the upper limit thereof is preferably 50% (vol / vol) or less, and more preferably 10% (vol / vol) or less.
  • the numerical range of the amount of algae to be inoculated is preferably 1 to 50% (vol / vol), and more preferably 1 to 10% (vol / vol).
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of algae, but is usually in the range of 5 to 40 ° C. From the viewpoint of promoting the growth of algae, improving the productivity of fatty acids, and reducing the production cost, 10 ° C. or higher is preferable, and 15 ° C. or higher is more preferable. Moreover, 35 degrees C or less is preferable, and, as for the upper limit, 30 degrees C or less is more preferable.
  • the numerical range of the culture temperature is preferably 10 to 35 ° C., more preferably 15 to 30 ° C. Moreover, it is preferable to perform culture
  • the light irradiation may be any condition that allows photosynthesis, and may be artificial light or sunlight.
  • the illuminance at the time of light irradiation is preferably 100 lux or more, more preferably 300 lux or more, and still more preferably 1000 lux or more, from the viewpoint of promoting the growth of algae and improving the productivity of fatty acids. Further, the upper limit thereof is preferably 50000 lux or less, more preferably 10000 lux or less, and still more preferably 6000 lux or less.
  • the numerical range of the illuminance at the time of light irradiation is preferably in the range of 100 to 50000 lux, more preferably in the range of 300 to 10000 lux, and still more preferably in the range of 1000 to 6000 lux.
  • the light irradiation interval is not particularly limited, but from the same viewpoint as described above, it is preferably performed in a light and dark cycle, and a light period of 24 hours is preferably 8 hours or more, more preferably 10 hours or more. Moreover, 24 hours or less are preferable and, as for the upper limit, 18 hours or less are more preferable.
  • the numerical range of the light period is preferably 8 to 24 hours, more preferably 10 to 18 hours, further preferably 12 hours.
  • the algae is preferably cultured in the presence of a gas containing carbon dioxide to enable photosynthesis, or in a medium containing a carbonate such as sodium hydrogen carbonate.
  • the concentration of carbon dioxide in the gas is not particularly limited, but is preferably 0.03% (equivalent to atmospheric conditions) or more, more preferably 0.05% or more, from the viewpoint of promoting growth and improving the productivity of fatty acids. 1% or more is more preferable, 0.3% or more is still more preferable.
  • the upper limit thereof is preferably 10% or less, more preferably 5% or less, still more preferably 3% or less, and still more preferably 1% or less.
  • the numerical range of the concentration of carbon dioxide is preferably 0.03 to 10%, more preferably 0.05 to 5%, still more preferably 0.1 to 3%, still more preferably 0.3 to 1%.
  • the concentration of the carbonate is not particularly limited, but when sodium bicarbonate is used, for example, from the viewpoint of promoting growth and improving the productivity of fatty acids, 0.01% by mass or more is preferable, 0.05% by mass or more is more preferable, and 0. 1 mass% or more is further more preferable. Moreover, 5 mass% or less is preferable, 2 mass% or less is more preferable, and 1 mass% or less is further more preferable.
  • the numerical range of the concentration of sodium hydrogen carbonate is preferably 0.01 to 5% by mass, more preferably 0.05 to 2% by mass, and still more preferably 0.1 to 1% by mass.
  • the culture time is not particularly limited, and may be performed for a long time (for example, about 150 days) so that algal cells which accumulate lipid at high concentration can be grown at high concentration. 3 days or more are preferable and 7 days or more are more preferable. Moreover, 90 days or less are preferable and, as for the upper limit, 30 days or less are more preferable. The numerical range of the culture period is preferably 3 to 90 days, more preferably 3 to 30 days, and still more preferably 7 to 30 days.
  • cultivation may be any of aeration stirring culture, shaking culture, or stationary culture, and from a viewpoint of aeration improvement, aeration stirring culture or shaking culture is preferable, and aeration stirring culture is more preferable.
  • lipid components can be isolated by filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, chloroform / methanol extraction, hexane extraction, ethanol extraction, etc. It can be separated and recovered.
  • oil is recovered from the culture or the growth product by compression or extraction, and then general purification such as degumming, deacidification, decolorization, dewaxing, deodorization, etc. is performed to obtain a lipid. be able to.
  • a fatty acid can be obtained by hydrolyzing the isolated lipid.
  • methods for isolating fatty acids from lipid components include a method of treating at a high temperature of about 70 ° C. in an alkaline solution, a method of treating with lipase, or a method of decomposing using high pressure hot water.
  • a transformant prepared using E. coli that has lost the function of the ⁇ -oxidation pathway, which is a fatty acid degradation pathway, or a cyanobacteria that has lost the function of aas the produced lipid is extracellular. Secreted. Therefore, there is no need to destroy the cells to recover lipid, and cells remaining after lipid recovery can be repeatedly used for lipid production.
  • the lipid manufactured in the manufacturing method of this invention contains a fatty acid or a fatty acid compound from the point of the availability, and it is more preferable that a fatty acid or a fatty acid ester compound is contained.
  • the fatty acid ester compound is preferably at least one selected from the group consisting of MAG, DAG and TAG, more preferably TAG.
  • the fatty acid or fatty acid ester compound contained in the lipid is preferably a medium-chain fatty acid or a fatty acid ester compound thereof from the viewpoint of availability to surfactants and the like and from a nutritional point of view.
  • fatty acids having 8 to 10 carbon atoms or fatty acid ester compounds thereof are preferable, fatty acids having 8 or 10 carbon atoms or fatty acid ester compounds thereof are more preferable, and saturated fatty acids having 8 or 10 carbon atoms More preferred is caprylic acid, capric acid) or a fatty acid ester compound thereof.
  • the fatty acid ester compound is preferably a simple lipid or a complex lipid, more preferably a simple lipid, and still more preferably triacylglycerol, from the viewpoint of productivity.
  • the lipid obtained by the production method of the present invention is used as a food, and also used as a plasticizer, an emulsifier such as cosmetics, a detergent such as soap or detergent, a fiber treatment agent, a hair rinse agent, or a germicide or a preservative Can.
  • the present invention further discloses the following method for producing lipid, method for modifying fatty acid composition of produced lipid, protein, gene, recombinant vector or DNA cassette, and transformant and method for producing the same Do.
  • a lipid which is produced by culturing a transformant into which a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of the following proteins (A) to (C) has been introduced to produce a fatty acid or a lipid composed thereof: Manufacturing method.
  • (A) At least one amino acid substitution selected from the group consisting of the following (A-1) to (A-11), preferably an amino acid substitution of (A-1), in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1
  • a protein consisting of an amino acid sequence and having TE activity.
  • a group consisting of the following (B-1) to (B-11) A protein consisting of an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected, preferably an amino acid substitution of (B-1), and having TE activity.
  • A-1 The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • Threonine at position 251 of SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine.
  • Threonine at position 251 of SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine.
  • A-4) The threonine at position 251 of SEQ ID NO: 1 is substituted with histidine.
  • A-5) Tryptophan at position 254 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • A-6 Tryptophan at position 254 of SEQ ID NO: 1 is substituted with tyrosine.
  • A-7) Leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted for methionine.
  • A-8) Leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted for valine.
  • A-9) Leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine.
  • A-10) A valine at position 266 of SEQ ID NO: 1 is substituted with a cysteine.
  • (A-11) Tryptophan at position 271 of SEQ ID NO: 1 is substituted with tyrosine.
  • B-1 An amino acid (preferably or usually leucine) at a position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • B-2 An amino acid at a position corresponding to position 251 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually threonine) is substituted with arginine.
  • (B-3) The amino acid (preferably or usually threonine) at a position corresponding to position 251 of SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine.
  • (B-4) The amino acid at the position corresponding to position 251 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually threonine) is substituted with histidine.
  • (B-5) The amino acid (preferably or usually tryptophan) at a position corresponding to position 254 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • (B-6) The amino acid (preferably or usually tryptophan) at a position corresponding to position 254 of SEQ ID NO: 1 is substituted with tyrosine.
  • (B-7) Substitution of an amino acid (preferably or usually leucine) at a position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 with methionine.
  • a medium-chain fatty acid or a medium-chain fatty acid produced by culturing a transformant into which a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of the proteins (A) to (C) has been introduced A method for producing a lipid, which improves the productivity of a lipid comprising this as a component.
  • a transformant into which a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of the proteins (A) to (C) has been introduced is cultured to account for the total fatty acid produced in the cells of the transformant.
  • a method of altering the fatty acid composition which increases the proportion of medium chain fatty acids.
  • the protein (B) has one or more, preferably one or more, preferably one or more and 53 or less, more preferably one or more and 35 or less, more preferably one or more in the amino acid sequence of the protein (A) 28 or less, more preferably 1 or more and 24 or less, more preferably 1 or more and 21 or less, more preferably 1 or more and 17 or less, more preferably 1 or more and 14 or less, more preferably 1 or more 10 or less, more preferably 1 or more and 7 or less, more preferably 1 or more and 3 or less amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and the above (B-1) to (B-11)
  • the method according to any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 3> which is a protein having at least one amino acid substitution selected from the group consisting of: preferably an amino acid substitution of (B-1).
  • ⁇ 5> At least one amino acid substitution (preferably, the amino acid substitution of (A-1) above) selected from the group consisting of the following (D-1) to (D-8): And at least one amino acid substitution selected from the group consisting of (1) to (D-8), and the protein (B) is selected from the group consisting of the following (E-1) to (E-8) Said ⁇ 1> having at least one amino acid substitution (preferably, the amino acid substitution of (B-1) above, and at least one amino acid substitution selected from the group consisting of the following (E-1) to (E-8)) The method according to any one of ⁇ 4>.
  • D-1) A valine at position 106 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • E-1 The amino acid (preferably or usually valine) at a position corresponding to position 106 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • E-2 The amino acid (preferably or usually asparagine) at a position corresponding to position 108 of SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine.
  • E-3 The amino acid at the position corresponding to position 108 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually asparagine) is substituted with arginine.
  • E-4 The amino acid (preferably or usually valine) at a position corresponding to position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • E-5 An amino acid (preferably or usually valine) at a position corresponding to position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with methionine.
  • E-6 The amino acid (preferably or usually valine) at a position corresponding to position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with leucine.
  • E-7 The amino acid (preferably or usually valine) at a position corresponding to position 110 of SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine.
  • E-8) The amino acid (preferably or usually cysteine) at a position corresponding to position 118 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • the protein (A) has an amino acid substitution selected from the group consisting of the following (A-1_D-1) to (A-1_D-8), and the protein (B) has the following (B-1_E)
  • A-1_D-1) The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, and the valine at position 106 is substituted with isoleucine, respectively.
  • A-1_D-2 The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, and the asparagine at position 108 is substituted with lysine.
  • A-1_D-3 The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, and the asparagine at position 108 is substituted with arginine.
  • A-1_D-4) The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, and the valine at position 110 is substituted with isoleucine.
  • A-1_D-5 The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, and the valine at position 110 is substituted with methionine.
  • A-1_D-6 The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, and the valine at position 110 is substituted with leucine.
  • A-1_D-7 The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine, and the valine at position 110 is substituted with phenylalanine.
  • A-1_D-8 The leucine at position 257 of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine and the cysteine at position 118 is substituted with isoleucine.
  • B-1_E-1) The amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually leucine) corresponds to isoleucine, the amino acid at the position corresponding to position 106 (preferably or usually valine) to isoleucine , Each replaced.
  • (B-1_E-2) The amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually leucine) corresponds to isoleucine, the amino acid at the position corresponding to position 108 (preferably or asparagine) to lysine , Each replaced.
  • (B-1_E-3) The amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually leucine) corresponds to isoleucine, the amino acid at the position corresponding to position 108 (preferably or asparagine) to arginine , Each replaced.
  • (B-1_E-4) The amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually leucine) is an isoleucine, the amino acid at a position corresponding to position 110 (preferably or usually valine) is an isoleucine , Each replaced.
  • (B-1_E-5) The amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually leucine) is isoleucine, the amino acid at the position corresponding to position 110 (preferably or usually valine) is methionine , Each replaced.
  • (B-1_E-6) The amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually leucine) corresponds to isoleucine, the amino acid at the position corresponding to position 110 (preferably or usually valine) to leucine , Each replaced.
  • (B-1_E-7) The amino acid at the position corresponding to position 257 of SEQ ID NO: 1 (preferably or usually leucine) corresponds to isoleucine, the amino acid at the position corresponding to position 110 (preferably or usually valine) to phenylalanine , Each replaced.
  • the gene encoding at least one protein selected from the group consisting of the proteins (A) to (C) is a gene comprising any one of the following DNAs (a) to (c): The method according to any one of 1> to ⁇ 6>.
  • a DNA comprising a base sequence and encoding a protein having TE activity.
  • (C) has a base sequence of the DNA (a) or (b) (preferably, the base sequence of the DNA (a) or (b) excluding the initiation codon) and encodes a protein having TE activity DNA.
  • A-1 The base at position 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding isoleucine.
  • A-2) The base at positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding arginine.
  • A-3) The base at positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding lysine.
  • A-4) The base at positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding histidine.
  • A-5) The base at positions 760 to 762 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding isoleucine.
  • A-6) The base at position 760 to 762 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding tyrosine.
  • A-7) The base at position 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding methionine.
  • A-8 The base at position 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding valine.
  • A-9) The base at position 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding phenylalanine.
  • A-10) The base at positions 796 to 798 in SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding cysteine.
  • A-11 Substitution of bases at positions 811 to 813 of SEQ ID NO: 2 with a base encoding tyrosine.
  • B-1) A base at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding isoleucine.
  • B-2) A base at a position corresponding to positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding arginine.
  • B-3 A base at a position corresponding to positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding lysine.
  • B-4 A base at a position corresponding to positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding histidine.
  • B-5) A base at a position corresponding to positions 760 to 762 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding isoleucine.
  • B-6 A base at a position corresponding to positions 760 to 762 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding tyrosine.
  • B-7 A base at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding methionine.
  • B-8 A base at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding valine.
  • B-9) Substitution of a base acid at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 to a base encoding phenylalanine.
  • B-10 A base at a position corresponding to positions 796 to 798 in SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding cysteine.
  • B-11 A base at a position corresponding to positions 811 to 813 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a tyrosine-encoding base.
  • the DNA (b) has one or more, preferably one or more, preferably one or more and 320 or less, more preferably one or more and 267 or less, more preferably one or more, in the base sequence of the DNA (a) 213 or less, more preferably 1 or more and 160 or less, more preferably 1 or more and 106 or less, more preferably 1 or more and 85 or less, more preferably 1 or more and 74 or less, more preferably 1 or more 64 or less, more preferably 1 or more and 53 or less, more preferably 1 or more and 42 or less, more preferably 1 or more and 32 or less, more preferably 1 or more and 21 or less, more preferably 1 or more At least one base substitution selected from the group consisting of (b-1) to (b-11) in which 10 or fewer bases are deleted, substituted, inserted or added, preferably (b-1) salt Under stringent conditions with a DNA consisting of a nucleotide sequence having a substitution and encoding the protein (A) or (B) having
  • At least one base substitution selected from the group consisting of the following (d-1) to (d-8) (preferably the base substitution of the (a-1), and the following (d):
  • at least one base substitution selected from the group consisting of -1) to (d-8) and the DNA (b) is selected from the group consisting of the following (e-1) to (e-8)
  • the above ⁇ 7> having at least one base substitution preferably, the base substitution of the above (b-1) and at least one base substitution selected from the group consisting of the following (e-1) to (e-8): Or the method according to ⁇ 8>.
  • D-1) The base at positions 316 to 318 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding isoleucine.
  • D-2 The base at positions 322 to 324 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding lysine.
  • D-3 The base at positions 322 to 324 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding arginine.
  • D-4 The base at positions 328 to 330 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding isoleucine.
  • D-5 The base at positions 328 to 330 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding methionine.
  • D-6 The base at positions 328 to 330 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding leucine.
  • (D-7) The base at positions 328 to 330 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding phenylalanine.
  • (D-8) The base at positions 352 to 354 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding isoleucine.
  • (E-1) A base at a position corresponding to positions 316 to 318 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding isoleucine.
  • (E-2) The base at a position corresponding to positions 322 to 324 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding lysine.
  • the DNA (a) has a base substitution selected from the group consisting of the following (a-1_d-1) to (a-1_d-8), and the DNA (b) has the following (b-1_e)
  • A-1_d-1) The bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 are substituted with a base encoding isoleucine, and the bases at positions 316 to 318 are substituted with a base encoding isoleucine, respectively.
  • A-1_d-2 The bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 are substituted with the bases encoding isoleucine, and the bases at positions 322 to 324 are substituted with the bases encoding lysine, respectively.
  • A-1_d-3 The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 are substituted with the base encoding isoleucine, and the bases at positions 322 to 324 are substituted with the base encoding arginine, respectively.
  • A-1_d-4 The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 are substituted with the bases encoding isoleucine, and the bases at positions 328 to 330 are substituted with the bases encoding isoleucine, respectively.
  • A-1_d-5) The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 are substituted with the bases encoding isoleucine, and the bases at positions 328 to 330 are substituted with the bases encoding methionine, respectively.
  • A-1_d-6) The bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 are substituted with the bases encoding isoleucine, and the bases at positions 328 to 330 are substituted with the bases encoding leucine, respectively.
  • A-1_d-7 The bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 are substituted with the bases encoding isoleucine, and the bases at positions 328 to 330 are substituted with the bases encoding phenylalanine, respectively.
  • A-1_d-8 The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 are substituted with the bases encoding isoleucine, and the bases at positions 352 to 354 are substituted with the bases encoding isoleucine, respectively.
  • B-1_e-1 The base at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and the base at a position corresponding to positions 316 to 318 is a base encoding isoleucine Replace.
  • B-1_e-2) The base at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and the base at a position corresponding to positions 322 to 324 is a base encoding lysine Replace.
  • the base at a position corresponding to positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and the base at a position corresponding to positions 322 to 324 is a base encoding arginine Replace.
  • the base at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and the base at a position corresponding to positions 328 to 330 is a base encoding isoleucine Replace.
  • the base at a position corresponding to positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and the base at a position corresponding to positions 328 to 330 is a base encoding methionine Replace.
  • the base at a position corresponding to positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and the base at a position corresponding to positions 328 to 330 is a base encoding leucine Replace.
  • a base at a position corresponding to positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and a base at a position corresponding to positions 328 to 330 is a base encoding phenylalanine Replace.
  • the base at a position corresponding to positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 2 is a base encoding isoleucine, and the base at a position corresponding to positions 352 to 354 is a base encoding isoleucine Replace.
  • ⁇ 11> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, wherein the transformant is a microorganism transformant.
  • the microorganism is Escherichia coli.
  • the microorganism is a cyanobacteria.
  • the fatty acid or lipid is a medium-chain fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, preferably a fatty acid having 8 to 10 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 8 or 10 carbon atoms or a fatty acid ester thereof.
  • the protein (A) is at least one amino acid substitution selected from the group consisting of (D-1) to (D-8) (preferably, the amino acid substitution of (A-1), and the above (D) And at least one amino acid substitution selected from the group consisting of (1) to (D-8), and the protein (B) is selected from the group consisting of the above (E-1) to (E-8) Said ⁇ 15> having at least one amino acid substitution (preferably, the amino acid substitution of (B-1) above, and at least one amino acid substitution selected from the group consisting of (E-1) to (E-8) above) The protein according to the item.
  • the protein (A) has an amino acid substitution selected from the group consisting of (A-1_D-1) to (A-1_D-8), and the protein (B) has the above-mentioned (B-1_E)
  • ⁇ 18> A gene encoding the protein according to any one of ⁇ 15> to ⁇ 17>.
  • ⁇ 19> A gene consisting of any one of the DNAs (a) to (c).
  • the DNA (a) is at least one base substitution selected from the group consisting of (d-1) to (d-8) (preferably, the base substitution of (a-1) above, and the above-mentioned (d) And at least one base substitution selected from the group consisting of -1) to (d-8), and the DNA (b) is selected from the group consisting of the above (e-1) to (e-8)
  • the ⁇ 19> having at least one base substitution (preferably, the base substitution of the above (b-1), and the at least one base substitution selected from the group consisting of the above (e-1) to (e-8))
  • the gene according to the item is at least one base substitution selected from the group consisting of (d-1) to (d-8) (preferably, the base substitution of (a-1) above, and the above-mentioned (d) And at least one base substitution selected from the group consisting of -1) to (d-8), and the DNA (b) is selected from the group consisting of the above (e-1) to (e-8)
  • the DNA (a) has a base substitution selected from the group consisting of (a-1_d-1) to (a-1_d-8), and the DNA (b) has the above-mentioned (b-1_e)
  • ⁇ 22> A recombinant vector or a DNA cassette containing the gene according to any one of ⁇ 18> to ⁇ 21>.
  • ⁇ 23> A transformant comprising the gene according to any one of ⁇ 18> to ⁇ 22>, a recombinant vector or a DNA cassette.
  • ⁇ 24> A method for producing a transformant, wherein the gene, the recombinant vector or the DNA cassette according to any one of ⁇ 18> to ⁇ 22> is introduced into a host.
  • ⁇ 25> The transformant according to the above ⁇ 23> or ⁇ 24>, which is a transformant of a microorganism, or a method for producing the same.
  • ⁇ 26> The transformant according to ⁇ 25>, wherein the microorganism is E. coli, or a method for producing the same.
  • ⁇ 27> The transformant according to ⁇ 25>, wherein the microorganism is a cyanobacteria, or a method for producing the same.
  • ⁇ 28> A protein, gene, recombinant vector or DNA cassette according to any one of the above ⁇ 15> to ⁇ 27>, a transformant, or a method for producing a transformant, for producing a lipid, Use of the transformant.
  • the lipid is a medium-chain fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, preferably a fatty acid having 8 to 10 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 8 or 10 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof.
  • Example 1 Production of lipid by E. coli into which CpTE variant has been introduced (1) Construction of plasmid for CpTE gene expression Using pBS-SK (-) plasmid (manufactured by Agilent Technologies) as a template, the primer pBS-F described in Table 1 Then, PCR was performed using the primer pBS-R to amplify pBS-SK (-) linear DNA sequence. In addition, the TE gene (Qubanka palustris) (GenBank: U38188.1, SEQ ID NO: 49) was artificially synthesized.
  • CpTE gene A fragment of the TE gene of SEQ ID NO: 2, (hereinafter also referred to as "CpTE gene") was amplified.
  • pBS-SK (-) linear DNA sequence and a fragment of CpTE gene are mixed, cloned by In-Fusion (registered trademark) PCR cloning method (Clontech), and lacO promoter of pBS-SK (-) plasmid
  • In-Fusion registered trademark
  • PCR cloning method Clontech
  • lacO promoter of pBS-SK (-) plasmid A plasmid pBS-CpTE was obtained in which the base sequence of the CpTE gene was inserted downstream of
  • PCR is performed using the plasmid pBS-CpTE as a template and any one of the primers CpTE_W254I-F and CpTE_W254Y-F shown in Table 1 and a primer pair of the primer CpTE_W254-R, and the base shown in SEQ ID NO: 2
  • Gene fragments in which the base sequence at positions 760 to 762 in the sequence was modified were obtained respectively.
  • any one of primers CpTE_L257I-F, CpTE_L257M-F, CpTE_L257V-F and CpTE_L257F-F shown in Table 1 and a primer pair of CpTE_L257-R and a primer CpTE_L257-R are used.
  • PCR was performed to obtain gene fragments in which the base sequence at positions 769 to 771 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 was modified.
  • PCR is performed using the above plasmid pBS-CpTE as a template and the primer pair of primer CpTE_V266C-F shown in Table 1 and primer CpTE_V266-R, and the nucleotide sequence of positions 796 to 798 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 A modified gene fragment was obtained.
  • PCR is performed using the above plasmid pBS-CpTE as a template and the primer pair of primer CpTE_W271Y-F and primer CpTE_W271-R shown in Table 1, and the nucleotide sequence of positions 811 to 813 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 A modified gene fragment was obtained.
  • PCR is performed using the above plasmid pBS-CpTE as a template and the primer pair of primer CpTE_M174I-F shown in Table 1 and primer CpTE_M174-R, and the nucleotide sequence of positions 520 to 522 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • the modified gene fragments were obtained respectively.
  • CpTE_W254Y, pBS-CpTE_L257I, pBS-CpTE_L257M, pBS-CpTE_L257V, pBS-CpTE_L257F, pBS-CpTE_V266C, pBS-CpTE_W271Y, pBS-CpTE_M174I were respectively constructed.
  • the following bases were substituted among the base sequences shown in SEQ ID NO: 2.
  • pBS-CpTE_T251R The base encoding threonine (T) at position 251 of SEQ ID NO: 1 was replaced with the base CGT encoding arginine (R).
  • pBS-CpTE_T251K The base encoding threonine (T) at position 251 of SEQ ID NO: 1 was replaced with the base AAA encoding lysine (K).
  • pBS-CpTE_T251H The base encoding threonine (T) at position 251 of SEQ ID NO: 1 was replaced with the base CAT encoding histidine (H).
  • pBS-CpTE_W254I The base encoding tryptophan (W) at position 254 of SEQ ID NO: 1 was replaced with the base ATT encoding isoleucine (I).
  • pBS-CpTE_W254Y The base encoding tryptophan (W) at position 254 of SEQ ID NO: 1 was replaced with the base TAT encoding tyrosine (Y).
  • pBS-CpTE_L257I The base encoding leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 was replaced with the base ATT encoding isoleucine (I).
  • pBS-CpTE_L257M The base encoding leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 was replaced with the base ATG encoding methionine (M).
  • pBS-CpTE_L257V The base encoding leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 was replaced with the base GTT encoding valine (V).
  • pBS-CpTE_L257F The base encoding leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 was replaced with the base TTT encoding phenylalanine (F).
  • pBS-CpTE_V266C The base encoding valine (V) at position 266 of SEQ ID NO: 1 was replaced with the base TGT encoding cysteine (C).
  • pBS-CpTE_W271Y A base encoding tryptophan (W) at position 271 of SEQ ID NO: 1 was replaced with a base TAT encoding tyrosine (Y).
  • pBS-CpTE_M174I The base encoding methionine (M) at position 174 of SEQ ID NO: 1 was replaced with the base ATT encoding isoleucine (I).
  • PCR was performed using the plasmid pBS-CpTE_L257I as a template and the primer pair of the primers CpTE_V106I-F and CpTE_V106-R shown in Table 1, and added to positions 769 to 771 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 A gene fragment in which the base sequence at position 318 was also modified was obtained.
  • PCR is performed using the plasmid pBS-CpTE_L257I as a template and any one of the primers CpTE_N108R- and CpTE_N108K-F shown in Table 1 and a primer pair of the primers CpTE_N108-R, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 1 gene fragments in which the base sequences of positions 322 to 324 were also modified were obtained, respectively.
  • any one of the primers CpTE_V110I-F, CpTE_V110M-F, CpTE_V110L-F and CpTE_V110F-F shown in Table 1 and a primer pair of the primers CpTE_V110-R shown PCR was performed to obtain gene fragments in which in addition to positions 769 to 771 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, the base sequence at positions 328 to 330 was also modified.
  • PCR is performed using the plasmid pBS-CpTE_L257I as a template and the primer pair of the primers CpTE_C118I-F and CpTE_C118-R shown in Table 1, and added to positions 769 to 771 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 A gene fragment in which the base sequence at positions 352 to 354 was also modified was obtained.
  • CpTE variant gene expression plasmid pBS-CpTEL257IV106I, pBS-CpTEL257IN108K, pBS-CpTEL257IN108R, pBS-CpTEL257IV110I, pBS- CpTEL257IV110M, pBS-CpTEL257IV110L, pBS-CpTEL257IV110F, and pBS-CpTEL257IC118I were respectively constructed. In these plasmids, the following bases were substituted among the base sequences shown in SEQ ID NO: 2.
  • pBS-CpTEL 257 IV 106 I The base encoding leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 is replaced with the base ATT encoding isoleucine (I), and the base encoding valine (V) at position 106 is isoleucine (I ) Was substituted for the base ATT encoding).
  • pBS-CpTEL 257 IN 108 K The base encoding leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 is replaced with the base ATT encoding isoleucine (I), and the base encoding asparagine (N) at position 108 is lysine (K ) Was substituted for the base AAA encoding.
  • pBS-CpTEL 257 IN 108 R The base encoding leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 is replaced with the base ATT encoding isoleucine (I), the base encoding asparagine (N) at position 108 is arginine (R) ) Was substituted for the base CGT encoding.
  • pBS-CpTEL 257 IV 110 I The base encoding leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 is replaced with the base ATT encoding isoleucine (I), and the base encoding valine (V) at position 110 is isoleucine (I ) Was substituted for the base ATT encoding).
  • pBS-CpTEL 257 IV 110 M The base encoding leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 is replaced with the base ATT encoding isoleucine (I), and the base encoding valine (V) at position 110 is methionine (M ) Was substituted for the base ATG encoding.
  • pBS-CpTEL 257 IV 110 L The base encoding leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 is replaced with the base ATT encoding isoleucine (I), and the base encoding valine (V) at position 110 is leucine (L ) Was substituted for the base TTA encoding.
  • pBS-CpTEL 257 IV 110 F A base encoding leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 is replaced with a base ATT encoding isoleucine (I), a base encoding valine (V) at position 110 is phenylalanine (F ) Was substituted for the base TTT encoding.
  • pBS-CpTEL 257 IC 118 I The leucine (L) -encoding base at position 257 of SEQ ID NO: 1 is replaced with the base ATT encoding isoleucine (I), and the base encoding 118-position cysteine (C) is isoleucine (I) ) Was substituted for the base ATT encoding).
  • the E. coli mutation is carried out using the above-mentioned CpTE gene expression plasmid and various CpTE variant gene expression plasmids.
  • the strain K27 strain (fadD88) (Eur. J. Biochem., 1969, vol. 7, p. 559-574) was transformed by the competent cell transformation method.
  • the transformed K27 strain was allowed to stand overnight at 30 ° C., and the resulting colony was inoculated into 1 mL of LBAmp liquid medium (Bacto Trypton 1%, Yeast Extract 0.5%, NaCl 1%, ampicillin sodium 50 ⁇ g / mL) The cells were cultured at 30 ° C. overnight. 2 ⁇ L of this culture broth was inoculated into 2 mL of Overnight Express Instant TB Medium (Novagen), and cultured with shaking at 30 ° C. After 24 hours of culture, lipid components contained in the culture solution were analyzed by the following method.
  • the obtained fatty acid ester was subjected to gas chromatography analysis.
  • gas chromatography analysis was carried out under the following conditions using 7890A (Agilent Technologies).
  • Capillary column DB-1 MS (30 m x 200 m x 0.25 m, manufactured by J & W Scientific)
  • Mobile phase High purity helium column
  • Internal flow rate 1.0 mL / min
  • Temperature rising program 70 ° C holding 1 minute ⁇ 70 to 200 ° C. (20 ° C./min temperature rising) ⁇ 200 to 320 ° C.
  • the fatty acid ester was identified by subjecting the same sample to gas chromatograph mass spectrometric analysis under the same conditions. From the peak area of waveform data obtained by gas chromatography analysis, the amount of methyl ester of each fatty acid was quantified. Correction between samples was performed by comparing each peak area with the peak area of 7-pentadecanone which is an internal standard, and the amount of each fatty acid contained in 1 L of culture and the total amount thereof were calculated.
  • the amounts of C8 fatty acid and C10 fatty acid of the transformant into which the wild type CpTE gene or L257I gene has been introduced are respectively 1, and the amounts of C8 fatty acid and C10 fatty acid of the transformant into which the CpTE variant gene has been introduced are each relative Indicated by the value.
  • the results are shown in Tables 3 and 4.
  • the results in Tables 3 and 4 are the average of the results of three independent cultures and chromatographic analysis.
  • the CpTE variant gene of the present invention was compared with the amount of C8 fatty acid and C10 fatty acid produced in the transformant in which the wild type CpTE gene was introduced and the wild type CpTE was expressed.
  • the amount of C8 fatty acid and C10 fatty acid produced was significantly increased in the transformant introduced.
  • the W254I gene 2.25 folds when introducing WDR, 1.46 times when introducing W254Y gene, 6.80 times when introducing L257I gene, 2.10 times when introducing L257M gene, 3.58 times when introducing L257V gene, L257F gene
  • the amount of C8 fatty acid production increased by 1.55 times in the case of introduction of V, 1.37 times in the case of introduction of the V266C gene, and 3.09 times in the case of introduction of the W271Y gene.
  • the amount of C10 fatty acid produced is also 2.41 times when the T251R gene is introduced, 1.58 times when the T251K gene is introduced, and 2.23 times when the T251H gene is introduced, as compared to when the wild type CpTE gene is introduced.
  • the W254I gene 3.17 times, when the W254Y gene is introduced, 1.68 times, when the L257I gene is introduced, 10.06 times, when the L257M gene is introduced, 2.23 times, when the L257V gene is introduced, 3.10 times
  • the L257F gene was introduced 1.53 times, the V266C gene was introduced 1.57 times, and the W271 Y gene was introduced 4.04 times.
  • CpTE in which the increase in the production amount of C8 fatty acid and C10 fatty acid was remarkable, is selected from the group consisting of (D-1) to (D-8) above.
  • the amounts of C8 fatty acid and C10 fatty acid produced were further increased.
  • the L257IV110I gene was introduced 1.40 times when the L257IV106I gene was introduced, 1.32 times when the L257IN108K gene was introduced, and 1.20 times when the L257IN108R gene was introduced compared to when the L257I gene was introduced.
  • L257IV110M gene introduced 1.52 fold
  • L257IV110L gene introduced 1.76 fold
  • L257IV110F gene introduced 1.75 fold
  • L257 IC118I gene introduced 1.21 fold
  • C8 fatty acid production amount Increased further.
  • the amount of C10 fatty acid produced is also 1.17 times when the L257IV106I gene is introduced, 1.24 times when the L257IN108K gene is introduced, 1.37 times when the L257IN108R gene is introduced, L257IV110M as compared to when the L257I gene is introduced.
  • the gene was introduced it was further increased by 1.45 times
  • the L257IV110F gene was introduced it was further increased 2.15 times.
  • CpTE_M174I the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 disclosed in Patent Document 3 (US Patent Application Publication No. 2011/0202083).
  • the amount of C8 fatty acid and C10 fatty acid of the transformant into which the gene encoding the CpTE variant has been introduced is 1, respectively, and the amounts of C8 fatty acid and C10 fatty acid of the transformant into which the L257I gene has been introduced are calculated as relative values. did.
  • the results are shown in Table 5.
  • Patent Document 3 describes that the production amount of C8 fatty acid is improved in a transformant into which the CpTE_M174I gene has been introduced.
  • the production amount of C8 fatty acid was improved by 1.78 times as compared with such transformants.
  • the amount of C10 fatty acid produced also increased by 2.25 times. From this result, the transformant into which the CpTE_L257I gene has been introduced is particularly effective for the production of C8 fatty acid and C10 fatty acid.
  • Example 2 Production of lipid by cyanobacteria introduced with CpTE variant (1) Inactivation of aas gene and construction of plasmid for CpTE variant gene expression From genomic DNA of a wild strain of Synechococcus elongatus sp. PCC7942 strain PCR was performed using primer pUC118 / 0918up-F and primer 0918down / pUC118-R described in Table 2 to amplify a fragment (2864 bp, SEQ ID NO: 50) containing Synpcc7942_0918 gene (aas gene).
  • the amplified fragment is inserted between Hin cII sites of pUC118 plasmid (Takara Bio Inc.) using In-Fusion (registered trademark) PCR cloning method (Clontech), and pUC118-Synpcc7942_0918 plasmid in which Synpcc7942_0918 gene (aas gene) is incorporated.
  • the spectinomycin resistance marker gene (SEQ ID NO: 51) fragment (hereinafter also referred to as "sp fragment") was obtained.
  • sp fragment The spectinomycin resistance marker gene (SEQ ID NO: 51) fragment.
  • PCR was performed using the pUC118-Synpcc7942_0918 plasmid as a template and the primers 0918up-R and 0918down-F described in Table 2, and the 927 bp region between the coding regions of the Synpcc7942_0918 gene (aas gene) was deleted.
  • a linear DNA fragment was obtained.
  • PUC118-Synpcc7942_0918 containing the DNA sequence of Synpcc 794_2_0918 gene coding region into which the above linear DNA fragment and the sp fragment were linked using In-Fusion (registered trademark) PCR cloning method (Clontech) and the sp fragment was inserted.
  • PCR was performed using the pUC118-Synpcc7942_0918 :: sp plasmid as a template and the primer 0918up-R and primer Sp-F described in Table 2 to linearize the pUC118-Synpcc7942_0918 :: sp plasmid.
  • PCR was performed using a pair to amplify a fragment of the TE gene (CpTE gene) derived from Kupfer puls tris from which the chloroplast translocation signal and the presumed sequence were removed.
  • the linearized pUC118-Synpcc7942_0918 sp plasmid, Ptrc fragment, and a fragment of CpTE gene are mixed, cloned by In-Fusion (registered trademark) PCR cloning method (Clontech), and coded for Synpcc7942_0918 gene.
  • the plasmid pUC118-Synpcc7942_0918 :: Ptrc-CpTE-sp was obtained by inserting the Ptrc fragment, the CpTE gene fragment and the sp fragment in this order between the regions.
  • the obtained gene fragment and the plasmid pUC118-Synpcc7942_0918 :: Ptrc-CpTE-sp were cloned by In-Fusion (registered trademark) PCR cloning method (Clontech), and CpTE variant gene expression plasmid pUC118-Synpcc7942_0918 :: Ptrc-CpTE_L257I-sp was obtained.
  • the gene fragment pBS-CpTE_L257I the following bases were substituted among the base sequences shown in SEQ ID NO: 2.
  • pBS-CpTE_L257I The base encoding leucine (L) at position 257 of SEQ ID NO: 1 was replaced with the base ATT encoding isoleucine (I).
  • the ⁇ p 918 :: CpTE and ⁇ 0918 :: CpTE_L257I strains were obtained, respectively, in which a CpTE gene or a construct for expressing a CpTE variant gene was introduced into the aas region on the genome of the Synechococcus elongatus sp. PCC 7942 strain. .
  • a rotary shaker 120 rpm at 30 ° C. under constant illumination (60 ⁇ E ⁇ m ⁇ 2 ⁇ sec ⁇ 1 ) in a 50 mL Erlenmeyer flask to which 25 mL of BG-11 medium having the composition shown in the following Table 6 was added.
  • Spectinomycin was added to the BG-11 medium to a concentration of 25 ⁇ g / mL.
  • the obtained fatty acid methyl ester was subjected to gas chromatography analysis in the same manner as in Example 1.
  • the results are shown in Table 7.
  • the result of Table 7 is an average value of the result of 3 independent culture and chromatography analysis.
  • the transformant into which the CpTE variant gene of the present invention has been introduced has C8 fatty acid
  • the production amount increased 2.97 times
  • the production amount of C10 fatty acid increased 5.10 times, respectively.

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Abstract

下記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。(Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記（Ａ－１）～（Ａ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル－ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。(Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列において、下記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル－ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。(Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。(Ａ－１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに置換。(Ａ－２）配列番号１の２５１位のスレオニンがアルギニンに置換。(Ａ－３）配列番号１の２５１位のスレオニンがリジンに置換。(Ａ－４）配列番号１の２５１位のスレオニンがヒスチジンに置換。(Ａ－５）配列番号１の２５４位のトリプトファンがイソロイシンに置換。(Ａ－６）配列番号１の２５４位のトリプトファンがチロシンに置換。(Ａ－７）配列番号１の２５７位のロイシンがメチオニンに置換。(Ａ－８）配列番号１の２５７位のロイシンがバリンに置換。(Ａ－９）配列番号１の２５７位のロイシンがフェニルアラニンに置換。(Ａ－１０）配列番号１の２６６位のバリンがシステインに置換。(Ａ－１１）配列番号１の２７１位のトリプトファンがチロシンに置換。(Ｂ－１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。(Ｂ－２）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。(Ｂ－３）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。(Ｂ－４）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換。(Ｂ－５）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。(Ｂ－６）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。(Ｂ－７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。(Ｂ－８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がバリンに置換。(Ｂ－９）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。(Ｂ－１０）配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸がシステインに置換。(Ｂ－１１）配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。

Description

脂質の製造方法
　本発明は、脂質の製造方法に関する。
　また本発明は、当該方法に用いるアシル-ACPチオエステラーゼ改変体、これをコードする遺伝子、及び該遺伝子を導入した形質転換体に関する。
　脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質（油脂）を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
　例えば、炭素原子数１２～１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤や殺菌剤等に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体であるアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤、毛髪リンス剤、殺菌剤等に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤等に日常的に利用されている。さらに、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
　また、炭素原子数が８や１０の中鎖脂肪酸は、健康食品への利用や、エッチング剤に利用されている。また炭素原子数が８や１０の中鎖脂肪酸を還元して得られるアルコール誘導体は、化粧品や、界面活性剤、可塑剤などの工業用原料としても利用されている。
　このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素原子数に依存するため、脂肪酸の炭素原子数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。
　例えば、ゲッケイジュ（Umbellularia californica（California bay））由来のアシル-ACP（アシルキャリヤプロテイン）チオエステラーゼ（以下単に、「TE」ともいう）をコードする遺伝子を宿主に導入することにより、炭素原子数１２の脂肪酸を蓄積させる方法（特許文献１、非特許文献１）等が提案されている。
　また、クフェア・パルストリス（Cuphea palustris）やクフェア・フッケリアナ（Cuphea hookeriana）などのクフェア（Cuphea）属に属する植物由来のTEをコードする遺伝子を宿主に導入することにより、得られた形質転換体における炭素原子数が８又は１０の中鎖脂肪酸の生産性が向上することが知られている。そして、特許文献２及び３には、配列番号４８で示されるアミノ酸配列からなるクフェア・パルストリス由来の野生型TEからN末側のシグナル配列を削除したアミノ酸配列（配列番号１）、若しくは配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列において、１７２位～２２１位若しくはこれらに相当する位置で特定のアミノ酸置換を行ったTE改変体が開示されている。そして、このようなTE改変体をコードする遺伝子を大腸菌やシアノバクテリアなどの宿主に導入することで、炭素原子数が８又は１０の中鎖脂肪酸の生産性が向上することが記載されている。
　近年、太陽光やバイオマスなどの再生可能エネルギー源を利用し、シアノバクテリアや大腸菌を培養することで脂肪酸を含むバイオケミカルスを生産する方法が注目されている。例えば、シアノバクテリアを用いて生産されるバイオ燃料として、エタノール（非特許文献２）、イソブタノール（非特許文献３）、脂肪酸（非特許文献４）などが報告されている。
国際公開第９２／２０２３６号 米国特許第５，９５５，３２９号明細書 米国特許出願公開第２０１１／００２０８８３号明細書
Science, 1992, vol. 257(5066), p. 72-74 Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65:523-528 Nat. Biotechnol., 2009, vol. 27, p. 1177-1180 Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2011, vol. 108(17), p. 6899-6904
　本発明は、下記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
 
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記（Ａ－１）～（Ａ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列において、下記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
 
（Ａ－１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに置換。
（Ａ－２）配列番号１の２５１位のスレオニンがアルギニンに置換。
（Ａ－３）配列番号１の２５１位のスレオニンがリジンに置換。
（Ａ－４）配列番号１の２５１位のスレオニンがヒスチジンに置換。
（Ａ－５）配列番号１の２５４位のトリプトファンがイソロイシンに置換。
（Ａ－６）配列番号１の２５４位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ａ－７）配列番号１の２５７位のロイシンがメチオニンに置換。
（Ａ－８）配列番号１の２５７位のロイシンがバリンに置換。
（Ａ－９）配列番号１の２５７位のロイシンがフェニルアラニンに置換。
（Ａ－１０）配列番号１の２６６位のバリンがシステインに置換。
（Ａ－１１）配列番号１の２７１位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ｂ－１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｂ－２）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
（Ｂ－３）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
（Ｂ－４）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換。
（Ｂ－５）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｂ－６）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
（Ｂ－７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
（Ｂ－８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がバリンに置換。
（Ｂ－９）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
（Ｂ－１０）配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸がシステインに置換。
（Ｂ－１１）配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法に関する。
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸に占める中鎖脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法に関する。
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）に関する。
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）をコードする遺伝子に関する。
　さらに本発明は、前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）をコードする遺伝子を含んでなる、形質転換体に関する。
　本発明の上記及び他の特徴及び利点は、下記の記載からより明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
　本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法の提供に関する。
　また本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、前記方法に好適に用いることができる形質転換体の提供に関する。
　さらに本発明は、前記方法及び形質転換体の使用に好適な、新規TE改変体及びこれをコードする遺伝子の提供に関する。
　特許文献２及び３などでも報告されているように、クフェア属に属する植物由来のTEをコードする遺伝子を導入した大腸菌やシアノバクテリアなどの形質転換体を用いた中鎖脂肪酸の生産においても、脂肪酸の生産量の向上が試みられている。
　本発明者はこのような技術に関して、中鎖脂肪酸の生産性を向上させるためにクフェア属に属する植物由来の野生型のTEにアミノ酸置換を導入する部位に着目し、検討を行った。その結果、特許文献２及び３などで開示されている部位とは異なる部位でアミノ酸置換を行ったTE改変体の利用が、中鎖脂肪酸の生産に有効であることを見出した。
　本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
　本発明の脂質の製造方法によれば、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
　また本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
　さらに本発明のアシル-ACPチオエステラーゼ改変体、及びこれをコードする遺伝子は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産に好適に用いることができる。
　本明細書における「脂質」は、中性脂質（モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸（遊離脂肪酸）、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
　一般に誘導脂質に分類される脂肪酸は、脂肪酸そのものを指し、「遊離脂肪酸」を意味する。本発明では単純脂質及び複合脂質分子中の脂肪酸部分又はアシル基の部分を「脂肪酸残基」と表記する。そして、特に断りのない限り、「脂肪酸」は「遊離脂肪酸」と「脂肪酸残基」の総称として用いる。
　また本明細書において、「脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質」は、「遊離脂肪酸」と「当該脂肪酸残基を有する脂質」を総称して用いる。更に本明細書において、「脂肪酸組成」とは、前記遊離脂肪酸と脂肪酸残基を脂肪酸と見做して合計した全脂肪酸（総脂肪酸）の重量に対する各脂肪酸の重量割合を意味する。脂肪酸の重量（生産量）や脂肪酸組成は、実施例で用いた方法により測定できる。
　また本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Cx:y」とあるのは、炭素原子数xで二重結合の数がyであることを表す。「Cx」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
　さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit　size　to　compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
　また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
　さらに本明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
　配列番号１で示されるアミノ酸配列は、配列番号４８で示されるアミノ酸配列からなるクフェア・パルストリス由来の野生型のTEのアミノ酸配列の一部である。配列番号１で示されるアミノ酸配列では、野生型のTEのアミノ酸配列の全長から、シグナル配列（配列番号４８の２位～５７位のアミノ酸配列）と推定される部位が除かれている。すなわち配列番号１で示されるアミノ酸配列は、配列番号４８で示されるアミノ酸配列から１位～５７位のアミノ酸が除かれ、５８位のアミノ酸のＮ末端にタンパク質合成開始アミノ酸（メチオニン）が付加されている。クフェア属に属する植物由来のTEは、炭素原子数が８又は１０の中鎖アシル-ACPに対する基質特異性が高く、形質転換体における炭素原子数が８又は１０の中鎖脂肪酸の生産性の向上に好適に用いられる。
　本発明では、炭素原子数が８又は１０の中鎖アシル-ACPに対する基質特異性を有するクフェア・パルストリス由来の野生型のTEに対して、前記（Ａ－１）～（Ａ－１１）並びに（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）のいずれかのアミノ酸置換を行う。このようなアミノ酸置換を行った本発明のTE改変体は、野生型のTEと比較して、中鎖アシル-ACPに対する基質特異性がより向上する。そして、本発明のTE改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体は、中鎖脂肪酸の生産性に優れる。
　なお、本明細書において、クフェア・パルストリス由来の野生型のTEと、これにアミノ酸変異を施したTE改変体をまとめて、「CpTE」ともいう。
　特許文献２及び３は、CpTEのアミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列）において、１７２位～２２１位の領域でアミノ酸置換を行うと、TE改変体の、中鎖アシル-ACPに対する基質特異性が向上することを開示している。
　これに対して、本発明では前記（Ａ－１）～（Ａ－１１）並びに（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）で規定しているように、特許文献２及び３に開示の部位とは異なる部位でのアミノ酸置換を行う。
　本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質（アシル-ACPチオエステラーゼ改変体）をコードする遺伝子が導入され、その発現が促進されている。本発明の形質転換体を培養することで、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が向上する。
　前記アシル-ACPチオエステラーゼ改変体（以下、「TE改変体」ともいう）は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有し、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性（以下、「TE活性」ともいう）を有するタンパク質である。
　なお、本明細書において「中鎖」とは、アシル基の炭素原子数が８以上１０以下、好ましくは炭素原子数が８又は１０であることをいう。また、形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
　配列番号１で示されるアミノ酸配列は、配列番号４８で示されるアミノ酸配列のＮ末側から２位～５７位のアミノ酸配列を除いたものであり、配列番号４８で示されるアミノ酸配列の１位、並びに５８位～４１１位のアミノ酸配列に対応する。ここで、配列番号４８は、クフェア・パルストリス由来の野生型のTEのアミノ酸配列である。配列番号４８のアミノ酸配列中５８位～４１１位の領域が、TEとして機能するために重要で、TE活性を示すために十分な領域であることが知られている。すなわち、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、TE活性にとって十分な領域を有するため、TE活性を有し、TEとして機能する。
　TEは、脂肪酸やその誘導体（トリアシルグリセロール（トリグリセリド）等）の生合成系に関与する酵素である。当該酵素は、植物体や藻類では葉緑体等の色素体内において、細菌や真菌、動物体では細胞質内において、脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル-ACP（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリヤプロテインとからなる複合体）のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する。TEの作用によって、ACP上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。TEには、基質であるアシル-ACPを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のTEが存在していることが知られており、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
　本明細書において、「TE活性」とは、アシル-ACPのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
　前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を基本とし、当該アミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸が、前記（Ａ－１）～（Ａ－１１）のいずれかで示すように置換されている。
　タンパク質（Ａ）として規定するTE改変体では、中鎖アシル-ACPに対する特異性が向上する。すなわちタンパク質（Ａ）のTE改変体は、野生型のTEと比較して、基質として中鎖アシル-ACPを選択的に利用し、これを加水分解する活性が向上する。
　中鎖アシル-ACPへの特異性を向上させ、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる観点から、タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列は、前記（Ａ－１）のアミノ酸置換を有することが好ましい。
　本明細書においては、アミノ酸置換を有するTE改変体を下記に示すように略記することがある。
 
CpTE(L257I)又はL257I：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）がイソロイシン（Ｉ）に置換されたTE改変体。
CpTE(T251R)又はT251R：配列番号１の２５１位のスレオニン（Ｔ）がアルギニン（Ｒ）に置換されたTE改変体。
CpTE(T251K)又はT251K：配列番号１の２５１位のスレオニン（Ｔ）がリジン（Ｋ）に置換されたTE改変体。
CpTE(T251H)又はT251H：配列番号１の２５１位のスレオニン（Ｔ）がヒスチジン（Ｈ）に置換されたTE改変体。
CpTE(W254I)又はW254I：配列番号１の２５４位のトリプトファン（Ｗ）がイソロイシン（Ｉ）に置換。
CpTE(W254Y)又はW254Y：配列番号１の２５４位のトリプトファン（Ｗ）がチロシン（Ｙ）に置換されたTE改変体。
CpTE(L257M)又はL257M：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）がメチオニン（Ｍ）に置換されたTE改変体。
CpTE(L257V)又はL257V：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）がバリン（Ｖ）に置換されたTE改変体。
CpTE(L257F)又はL257F：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）がフェニルアラニン（Ｆ）に置換されたTE改変体。
CpTE(V266C)又はV266C：配列番号１の２６６位のバリン（Ｖ）がシステイン（Ｃ）に置換。
CpTE(W271Y)又はW271Y：配列番号１の２７１位のトリプトファン（Ｗ）がチロシン（Ｙ）に置換されたTE改変体。
　前記タンパク質（Ａ）は、（Ａ－１）～（Ａ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換に加えて、下記（Ｄ－１）～（Ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有することが好ましい。これらのアミノ酸置換を有する場合、中鎖アシル-ACPへの特異性と、中鎖脂肪酸若しくはこれを構成成分とする脂質の生産性が、一層向上する。
　本発明において、前記タンパク質（Ａ）は、（Ａ－１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｄ－１）～（Ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有することがより好ましく、（Ａ－１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｄ－１）～（Ｄ－８）からなる群より選ばれる１つのアミノ酸置換を有することがより好ましい。
 
（Ｄ－１）配列番号１の１０６位のバリンがイソロイシンに置換。
（Ｄ－２）配列番号１の１０８位のアスパラギンがリジンに置換。
（Ｄ－３）配列番号１の１０８位のアスパラギンがアルギニンに置換。
（Ｄ－４）配列番号１の１１０位のバリンがイソロイシンに置換。
（Ｄ－５）配列番号１の１１０位のバリンがメチオニンに置換。
（Ｄ－６）配列番号１の１１０位のバリンがロイシンに置換。
（Ｄ－７）配列番号１の１１０位のバリンがフェニルアラニンに置換。
（Ｄ－８）配列番号１の１１８位のシステインがイソロイシンに置換。
　本明細書において、前記（Ｄ－１）～（Ｄ－８）のアミノ酸置換を、下記のように略記することがある。
 
V106I：配列番号１の１０６位のバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換。
N108K：配列番号１の１０８位のアスパラギン（Ｎ）がリジン（Ｋ）に置換。
N108R：配列番号１の１０８位のアスパラギン（Ｎ）がアルギニン（Ｒ）に置換。
V110I：配列番号１の１１０位のバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換。
V110M：配列番号１の１１０位のバリン（Ｖ）がメチオニン（Ｍ）に置換。
V110L：配列番号１の１１０位のバリン（Ｖ）がロイシン（Ｌ）に置換。
V110F：配列番号１の１１０位のバリン（Ｖ）がフェニルアラニン（Ｆ）に置換。
C118I：配列番号１の１１８位のシステイン（Ｃ）がイソロイシン（Ｉ）に置換。
　本発明において前記タンパク質（Ａ）は、下記（Ａ－１＿Ｄ－１）～（Ａ－１＿Ｄ－８）からなる群より選ばれるアミノ酸置換を有することがより好ましい。
 
（Ａ－１＿Ｄ－１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１０６位のバリンがイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ａ－１＿Ｄ－２）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１０８位のアスパラギンがリジンに置換。
（Ａ－１＿Ｄ－３）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１０８位のアスパラギンがアルギニンに、それぞれ置換。
（Ａ－１＿Ｄ－４）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ａ－１＿Ｄ－５）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがメチオニンに、それぞれ置換。
（Ａ－１＿Ｄ－６）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがロイシンに、それぞれ置換。
（Ａ－１＿Ｄ－７）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがフェニルアラニンに、それぞれ置換。
（Ａ－１＿Ｄ－８）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１８位のシステインがイソロイシンに、それぞれ置換。
　タンパク質（Ｂ）は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列を基本とし、かつ、TE活性を有する。タンパク質（Ｂ）もタンパク質（Ａ）と同様、中鎖アシル-ACPへの特異性が向上する。
　一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにTE活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
　前記タンパク質（Ｂ）において、TE活性の点から、配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性は８５％以上であり、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がより好ましい。
　また、前記タンパク質（Ｂ）として、配列番号１で示されるアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上５３個以下、好ましくは１個以上３５個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつTE活性を有するタンパク質が挙げられる。なお、これらのアミノ酸変異は、前記アミノ酸置換（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）とは異なる。
　さらに、タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列中に、タンパク質（Ａ）におけるアミノ酸置換と同様のアミノ酸置換を有している。すなわち、タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列は少なくとも、前記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。
　ここで、配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、スレオニンである。配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、トリプトファンである。配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、ロイシンである。配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、バリンである。さらに、配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、トリプトファンである。
　上述したタンパク質（Ａ）と同様、タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列も、前記（Ｂ－１）のアミノ酸置換を有することが好ましい。
　前記タンパク質（Ｂ）は、（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換に加えて、下記（Ｅ－１）～（Ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有することが好ましい。これらのアミノ酸置換を有する場合、中鎖アシル-ACPへの特異性と、中鎖脂肪酸若しくはこれを構成成分とする脂質の生産性が、一層向上する。
　本発明において、前記タンパク質（Ｂ）は、（Ｂ－１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｅ－１）～（Ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有することがより好ましく、（Ｂ－１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｅ－１）～（Ｅ－８）からなる群より選ばれる１つのアミノ酸置換を有することがより好ましい。
 
（Ｅ－１）配列番号１の１０６位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｅ－２）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
（Ｅ－３）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
（Ｅ－４）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
（Ｅ－５）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
（Ｅ－６）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がロイシンに置換。
（Ｅ－７）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
（Ｅ－８）配列番号１の１１８位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
 
　ここで、配列番号１の１０６位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、バリンである。配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、アスパラギンである。配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、バリンである。さらに、配列番号１の１１８位に相当する位置のアミノ酸は、好ましくは又は通常、システインである。
　本発明において前記タンパク質（Ｂ）は、下記（Ｂ－１＿Ｅ－１）～（Ｂ－１＿Ｅ－８）からなる群より選ばれるアミノ酸置換を有することがより好ましい。
 
（Ｂ－１＿Ｅ－１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０６位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－２）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がリジンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－３）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がアルギニンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－４）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－５）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がメチオニンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－６）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がフェニルアラニンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、システイン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
　アミノ酸配列または塩基配列における「相当する位置」または「相当する領域」は、目的アミノ酸配列を参照配列と比較し、各アミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のリップマン－パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Clustal Wマルチプルアラインメントプログラム（Nucleic Acids Res., 1994, vol. 22, p. 4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Clustal Wは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute:EBI, [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ, [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
　前記タンパク質（Ｃ）は、そのアミノ酸配列の一部として前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を含んでおり、かつTE活性を示す。なお、前記タンパク質（Ｃ）のＮ末端のアミノ酸は、開始コドンでコードされるメチオニン又はロイシンであることが好ましい。
　前記タンパク質（Ｃ）を構成するアミノ酸配列中、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列以外の配列としては、本発明の効果を損なわない範囲で適宜選択することができる。例えば、配列番号４８の１位～５７位の任意の位置範囲からなるアミノ酸配列、又はこのアミノ配列に１個又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下）の変異が導入されたアミノ酸配列、等が挙げられる。変異としては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。これらの配列は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列のＮ末側に付加されることが好ましい。
　あるいは、前記タンパク質（Ｃ）として、配列番号４８に示すアミノ酸配列において、配列番号４８の２位～５７位の任意の位置でＮ末側が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、前記タンパク質（Ｃ）として、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列に、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も好ましい。
　前記タンパク質がTE活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。この時、総脂肪酸量に占める中鎖脂肪酸の割合を、野生型TEを発現させた系と比較することで、中鎖アシル-ACPに対する特異性が向上していることを確認できる。
　また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1995, vol. 92(23), p. 10639-10643）によって調製した各種アシル-ACPを基質とした反応を行うことにより、TE活性を測定することができる。
　アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCRを利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
　前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、クフェア・パルストリスから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するTE遺伝子を用いることができる。
　なお、クフェア・パルストリス等の植物は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。
　前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子（以下、「TE改変体遺伝子」又は「CpTE改変体遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ａ）～（ｃ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。ここで、下記に示す配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡは、配列番号２で示される塩基配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（クフェア・パルストリス由来の野生型TE）をコードする。なお、前述のシグナル配列（配列番号４８の１位～５７位のアミノ酸配列）をコードする塩基配列は、配列番号４９の１～１７１位に相当する。
 
（ａ）配列番号２で示される塩基配列において、下記（ａ－１）～（ａ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列において、下記（ｂ－１）～（ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列（好ましくは、開始コドンを除いた前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列）を有し、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
 
（ａ－１）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ａ－２）配列番号２の７５１位～７５３位の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ａ－３）配列番号２の７５１位～７５３位の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ａ－４）配列番号２の７５１位～７５３位の塩基がヒスチジンをコードする塩基に置換。
（ａ－５）配列番号２の７６０位～７６２位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ａ－６）配列番号２の７６０位～７６２位の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（ａ－７）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ａ－８）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がバリンをコードする塩基に置換。
（ａ－９）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ａ－１０）配列番号２の７９６位～７９８位の塩基がシステインをコードする塩基に置換。
（ａ－１１）配列番号２の８１１位～８１３位の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－２）配列番号２の７５１位～７５３位に相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－３）配列番号２の７５１位～７５３位に相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｂ－４）配列番号２の７５１位～７５３位に相当する位置の塩基がヒスチジンをコードする塩基に置換。
（ｂ－５）配列番号２の７６０位～７６２位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－６）配列番号２の７６０位～７６２位に相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－７）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－８）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がバリンをコードする塩基に置換。
（ｂ－９）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基酸がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１０）配列番号２の７９６位～７９８位に相当する位置の塩基がシステインをコードする塩基に置換。
（ｂ－１１）配列番号２の８１１位～８１３位に相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
　ＤＮＡ（ａ）の塩基配列は、タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列が有するアミノ酸置換に相当する塩基置換を有する。具体的には、塩基置換（ａ－１）、（ａ－２）、（ａ－３）、（ａ－４）、（ａ－５）、（ａ－６）、（ａ－７）、（ａ－８）、（ａ－９）、（ａ－１０）及び（ａ－１１）はそれぞれ、前記アミノ酸置換（Ａ－１）、（Ａ－２）、（Ａ－３）、（Ａ－４）、（Ａ－５）、（Ａ－６）、（Ａ－７）、（Ａ－８）、（Ａ－９）、（Ａ－１０）及び（Ａ－１１）に対応する。
　ＤＮＡ（ｂ）の塩基配列も同様に、タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列が有するアミノ酸置換に相当する塩基置換を有する。具体的には、塩基置換（ｂ－１）、（ｂ－２）、（ｂ－３）、（ｂ－４）、（ｂ－５）、（ｂ－６）、（ｂ－７）、（ｂ－８）、（ｂ－９）、（ｂ－１０）及び（ｂ－１１）はそれぞれ、前記アミノ酸置換（Ｂ－１）、（Ｂ－２）、（Ｂ－３）、（Ｂ－４）、（Ｂ－５）、（Ｂ－６）、（Ｂ－７）、（Ｂ－８）、（Ｂ－９）、（Ｂ－１０）及び（Ｂ－１１）に対応する。
　前記ＤＮＡ（ａ）は、（ａ－１）～（ａ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換に加えて、下記（ｄ－１）～（ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有することが好ましい。本発明において前記ＤＮＡ（ａ）は、（ａ－１）の塩基置換、並びに下記（ｄ－１）～（ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換、を有することがより好ましい。
 
（ｄ－１）配列番号２の３１６位～３１８位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｄ－２）配列番号２の３２２位～３２４位の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｄ－３）配列番号２の３２２位～３２４位の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｄ－４）配列番号２の３２８位～３３０位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｄ－５）配列番号２の３２８位～３３０位の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｄ－６）配列番号２の３２８位～３３０位の塩基がロイシンをコードする塩基に置換。
（ｄ－７）配列番号２の３２８位～３３０位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｄ－８）配列番号２の３５２位～３５４位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
　本発明において前記ＤＮＡ（ａ）は、下記（ａ－１＿ｄ－１）～（ａ－１＿ｄ－８）からなる群より選ばれる塩基置換を有することがより好ましい。
 
（ａ－１＿ｄ－１）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３１６位～３１８位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ－１＿ｄ－２）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２２位～３２４位の塩基がリジンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ－１＿ｄ－３）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２２位～３２４位の塩基がアルギニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ－１＿ｄ－４）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位～３３０位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ－１＿ｄ－５）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位～３３０位の塩基がメチオニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ－１＿ｄ－６）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位～３３０位の塩基がロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ－１＿ｄ－７）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位～３３０位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ－１＿ｄ－８）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３５２位～３５４位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
　前記ＤＮＡ（ｂ）において、TE活性の点から、配列番号２で示される塩基配列との同一性は７０％以上であり、７５％以上が好ましく、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がより好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｂ）として、配列番号２で示される塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上３２０個以下、好ましくは１個以上２６７個以下、より好ましくは１個以上２１３個以下、より好ましくは１個以上１６０個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上８５個以下、より好ましくは１個以上７４個以下、より好ましくは１個以上６４個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１０個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつTE活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡも好ましい。なお、これらの塩基配列の変異は、前記塩基置換（ｂ－１）～（ｂ－１１）とは異なる。
　さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつTE活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡも好ましい。
　前記ＤＮＡ（ｂ）は、（ｂ－１）～（ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換に加えて、下記（ｅ－１）～（ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有することが好ましい。本発明において前記ＤＮＡ（ｂ）は、（ｂ－１）の塩基置換、並びに下記（ｅ－１）～（ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換、を有することがより好ましい。
 
（ｅ－１）配列番号２の３１６位～３１８位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｅ－２）配列番号２の３２２位～３２４位に相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｅ－３）配列番号２の３２２位～３２４位に相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｅ－４）配列番号２の３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｅ－５）配列番号２の３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｅ－６）配列番号２の３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がロイシンをコードする塩基に置換。
（ｅ－７）配列番号２の３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｅ－８）配列番号２の３５２位～３５４位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
　本発明において前記ＤＮＡ（ｂ）は、下記（ｂ－１＿ｅ－１）～（ｂ－１＿ｅ－８）からなる群より選ばれる塩基置換を有することがより好ましい。
 
（ｂ－１＿ｅ－１）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３１６位～３１８位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－２）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２２位～３２４位に相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－３）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２２位～３２４位に相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－４）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－５）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－６）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－７）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－８）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３５２位～３５４位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
　前記ＤＮＡ（ｃ）は、その塩基配列の一部として前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を含んでおり、かつTE活性を示すタンパク質をコードする。なお、前記ＤＮＡ（ｃ）の5'末端の塩基配列は、メチオニン(ATG)又はロイシン(TTG)をコードする開始コドンであることが好ましい。
　前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列中、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列以外の塩基配列としては、本発明の効果を損なわない範囲で適宜選択することができる。例えば、配列番号４９の１位～１７１位の任意の塩基配列、又はこの塩基配列に１又は数個（好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上９個以下）の変異が導入された塩基配列、等が挙げられる。変異としては、塩基の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。これらの配列は、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列の5'側に付加されることが好ましい。
　あるいは、前記ＤＮＡ（ｃ）として、配列番号４９に示す塩基配列において、配列番号４９の４位～１７１位の任意の位置で5'側が欠失した塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。また、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドをコードする塩基配列が、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列の5'側に付加されることが好ましい。
　塩基配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing　overlap　extension（SOE）PCR（Gene, 1989, vol. 77, p. 61-68）を利用した方法、ＯＤＡ法（Gene，1995，152，271-276）、Kunkel法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, p. 488）等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
　CpTE改変体をコードする遺伝子（CpTE改変体遺伝子）は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいてCpTE改変体遺伝子を、人工的に合成できる。CpTE改変体遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、クフェア・パルストリスからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
　前記CpTE改変体遺伝子を常法により宿主に導入することで、本発明の形質転換体を作製することができる。具体的には、前記CpTE改変体遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
　形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物体、及び動物体が挙げられる。
　前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属の微生物やバシラス（Bacillus）属の微生物、シネコシスティス（Synechocystis）属の微生物、シネココッカス（Synechococcus）属のシアノバクテリア等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、モルチエレラ・エスピー（Mortierella sp．）、又はシアノバクテリアが好ましく、大腸菌又はシアノバクテリアがより好ましい。
　藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ（Chlorella）属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis sp．）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
　前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、西洋アブラナ（Brassica napus）、アブラナ（Brassica rapa）、ココヤシ（Cocos nucifera）、パーム（Elaeis guineensis）、クフェア、ダイズ（Glycine max）、トウモロコシ（Zea mays）、イネ（Oryza sativa）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、クスノキ（Cinnamomum camphora）、又はヤトロファ（Jatropha curcas）が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
　製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物が好ましく、大腸菌又はシアノバクテリアがより好ましい。
　本発明で好ましく用いることができるシアノバクテリア（藍色細菌）は真正細菌の一群であり、光合成によって酸素を産生し、ＣＯ２を固定化する能力を有する。シアノバクテリアは、クロロフィルを用いた光合成を行う原核生物の一群である。シアノバクテリアは多様性に富んでおり、細胞の形状のみを見ても、シネコシスティス・エスピー（Synechocystis sp．）PCC6803のような単細胞性のもの、ヘテロシストを形成し窒素固定を行うアナベナ・エスピー（Anabaena sp．）PCC7120のように多細胞がヒモ状に繋がっている糸状性のもの、又はらせん状や分岐状のもの等がある。生育環境についても、別府温泉から単離されたサーモシネココッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongatus）BP-1のような好熱性のもの、海洋性で沿岸部に生息するシネココッカス・エスピー（Synechococcus sp．）CC9311、又は外洋に生息するシネココッカス・エスピーWH8102など、様々な条件に適応した種が見られる。また、種独自の特徴を持つものとして、ミクロシスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）のように、ガス小胞を持ち毒素を産生することのできるものや、チラコイドを持たず集光アンテナであるフィコビリソームが原形質膜に結合しているグロイオバクター・ビオラセウス（Gloeobacter violaceus）PCC7421、又は一般的な光合成生物のようにクロロフィルａでなくクロロフィルｄを主要な（＞９５％）光合成色素として持つ海洋性のアクリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina）なども挙げられる。シアノバクテリアでは、光合成により固定された二酸化炭素は多数の酵素反応プロセスを経てアセチル－ＣｏＡへと変換される。
　本発明では、あらゆる種類のシアノバクテリアを用いることができる。例えば、シネコシスティス（Synechocystis）属、シネココッカス（Synechococcus）属、サーモシネココッカス（Thermosynechococcus）属、トリコデスミウム（Trichodesmium）属、アカリオクロリス（Acaryochloris）属、クロコスファエラ（Crocosphaera）属、及びアナベナ（Anabaena）属のシアノバクテリアが挙げられる。このうち、シネコシスティス属、シネココッカス属、サーモシネココッカス属又はアナベナ属のシアノバクテリアが好ましく、シネコシスティス属又はシネココッカス属のシアノバクテリアがより好ましい。また本発明で用いる宿主としては、シネコシスティス・エスピーPCC6803、シネコシスティス・エスピーPCC7509、シネコシスティス・エスピーPCC6714、シネココッカス・エロンガタスエスピー（Synechococcus elongatus sp．）PCC7942、サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1、トリコデスミウム・エリスラエウム（Trichodesmium erythraeum）IMS101、アカリオクロリス・マリアナ（Acaryochloris mariana）MBIC11017、クロコスファエラ・ワトソニー（Crocosphaera watsonii）WH8501、及びアナベナ・エスピー（Anabaena sp．）PCC7120がより好ましく、シネコシスティス・エスピーPCC6803及びシネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942がより好ましく、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942がさらに好ましい。
　また、シアノバクテリアは、アシル-ACPシンテターゼ（以下、「aas」ともいう）の機能を喪失していることが好ましい。aasの機能を喪失させたシアノバクテリアを用いた場合、形質転換体が生産した脂質の分泌能を向上させることができる。ここで「aas」とは脂肪酸合成に関わる酵素の１種であって、遊離脂肪酸とACPタンパク質を基質として、ＡＴＰ依存的にチオエステル結合を形成し、アシル-ACPを産生する機能を有する。シアノバクテリアにおいてaasの機能を喪失させることで脂肪酸の蓄積及び分泌が促進されることが知られている（Plant Physiology, 2010, vol. 152(3), p. 1598-1610参照）。
　遺伝子発現用プラスミド又は遺伝子発現用カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で目的の遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、使用する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
　本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS） II SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（1986，Plasmid 15（2），p．93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、pMW218/219（ニッポンジーン社製）、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、及びIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript II SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。また、宿主がシアノバクテリアの場合は、pUC系ベクターが好ましく用いられる。
　藻類又は微細藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51, p. 666-672参照）、及びpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。
　植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、及びIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
　このＤＮＡ断片としては、例えば、PCR法により増幅したDNA断片や制限酵素で切断したDNA断片が挙げられる。目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
　前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)）、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ(lipid droplet surface protein)遺伝子のプロモーター（PLOS Genetics, 2012;8(11):e1003064. doi: 10.1371）、及びリボゾームRNAをコードするrrnAオペロン遺伝子のプロモーターが挙げられる。
　また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
　形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。
　目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的DNA断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたPCR法等によって、目的DNA断片の導入を確認することもできる。
　各種宿主に導入するCpTE改変体遺伝子は、使用する宿主におけるコドン使用頻度にあわせてコドンを至適化されることが好ましい。各種生物が使用するコドンの情報は、Codon Usage Database（www.kazusa.or.jp/codon/）などから入手可能である。
　本発明の形質転換体は、野生株自体に比べ、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性、特に、生産される全脂肪酸中又は全脂質中に占める中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の割合が有意に向上する。またその結果、本発明の形質転換体では、生産される脂質中の脂肪酸組成が改変される。そのため、本発明の形質転換体は、特定の炭素原子数の脂肪酸又は脂質、特に中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素原子数８以上１０以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の飽和脂肪酸（カプリル酸、カプリン酸）又はこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
　以下、本明細書において、前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子が導入させたものを「形質転換体」ともいう。これに対して、前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子が導入させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
　本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）の発現が促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物又は生育物から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率よく製造することができる。ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいい、「生育物」とは生育した後の形質転換体をいう。
　本発明の形質転換体の培養条件は、宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はグルコース等を添加してもよい。
　宿主として大腸菌を用いる場合、大腸菌の培養は、例えば、ＬＢ培地又はOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）で、３０～３７℃、０．５～１日間培養することができる。
　宿主としてシアノバクテリアを用いる場合、BG-11培地（J. Gen. Microbiol., 1979, vol. 111, p. 1-61）、Ａ培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1980, vol. 77, p. 6052-6056）、ＡＡ培地（Plant Physiol., 1955, vol. 30, p. 366-372）など、シアノバクテリアの培養に通常用いられる培地を用いて、液体培養又はその変法により実施することができる。脂質生産のための培養期間としては、十分に菌体が増殖した条件で脂肪酸が高濃度に蓄積するように行えばよく、例えば、７～４５日間、好ましくは１０～３０日間、より好ましくは１４～２１日間、通気攪拌培養又は振とう培養がすることが好適である。
　また、宿主としてシロイヌナズナを用いる場合、シロイヌナズナの培養は、例えば、土壌で温度条件２０～２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１～２か月間栽培することができる。
　宿主として藻類を用いる場合、培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
　培地に接種する藻類の量は適宜選択することができ、生育性の点から、培地当り１％（vol/vol）以上が好ましい。また、その上限値は５０％（vol/vol）以下が好ましく、１０％（vol/vol）以下がより好ましい。接種する藻類の量の数値範囲は、１～５０％（vol/vol）が好ましく、１～１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５～４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、１０℃以上が好ましく、１５℃以上がより好ましい。またその上限値は３５℃以下が好ましく、３０℃以下がより好ましい。培養温度の数値範囲は、好ましくは１０～３５℃であり、より好ましくは１５～３０℃である。
　また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、１００ルクス以上が好ましく、３００ルクス以上がより好ましく、１０００ルクス以上がさらに好ましい。またその上限値は、５００００ルクス以下が好ましく、１００００ルクス以下がより好ましく、６０００ルクス以下がさらに好ましい。光照射時の照度の数値範囲は、好ましくは１００～５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００～１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００～６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期は８時間以上が好ましく、１０時間以上がより好ましい。またその上限値は、２４時間以下が好ましく、１８時間以下がより好ましい。明期の数値範囲は、好ましくは８～２４時間、より好ましくは１０～１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
　また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３％（大気条件と同程度）以上が好ましく、０．０５％以上がより好ましく、０．１％以上がさらに好ましく、０．３％以上がよりさらに好ましい。またその上限値は、１０％以下が好ましく、５％以下がより好ましく、３％以下がさらに好ましく、１％以下がよりさらに好ましい。二酸化炭素の濃度の数値範囲は、０．０３～１０％が好ましく、０．０５～５％がより好ましく、０．１～３％がさらに好ましく、０．３～１％がよりさらに好ましい。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１質量％以上が好ましく、０．０５質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましい。またその上限値は、５質量％以下が好ましく、２質量％以下がより好ましく、１質量％以下がさらに好ましい。炭酸水素ナトリウムの濃度の数値範囲は、０．０１～５質量％が好ましく、０．０５～２質量％がより好ましく、０．１～１質量％がさらに好ましい。
　培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。３日以上が好ましく、７日以上がより好ましい。またその上限値は、９０日以下が好ましく、３０日以下がより好ましい。培養期間の数値範囲は、好ましくは３～９０日間、より好ましくは３～３０日間、さらに好ましくは７～３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気撹拌培養又は振とう培養が好ましく、通気撹拌培養がより好ましい。
　培養物又は生育物から脂質を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物又は生育物から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物又は生育物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
　また、脂肪酸分解経路であるβ-酸化経路の機能を喪失させた大腸菌、若しくはaasの機能を喪失させたシアノバクテリアを宿主として作製した形質転換体を用いた場合、生産された脂質は細胞外に分泌される。よって、脂質を回収するために菌体を破壊する必要がなく、脂質回収後に残った細胞を繰り返し脂質生産に使用することができる。
　本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。前記脂肪酸エステル化合物は、ＭＡＧ、ＤＡＧ及びＴＡＧからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、ＴＡＧがより好ましい。
　脂質中に含まれる脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物は、界面活性剤等への利用性や栄養学的観点から、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物が好ましい。具体的には、炭素原子数８以上１０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物が好ましく、炭素原子数８若しくは１０のの脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素原子数８若しくは１０の飽和脂肪酸（カプリル酸、カプリン酸）又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましい。
　脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、トリアシルグリセロールがさらにより好ましい。
　本発明の製造方法により得られる脂質は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
　上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、生産される脂質の脂肪酸組成を改変する方法、タンパク質、遺伝子、組換えベクター若しくはＤＮＡカセット、並びに形質転換体及びその作製方法を開示する。
＜１＞下記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
 
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記（Ａ－１）～（Ａ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは（Ａ－１）のアミノ酸置換、を有するアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列において、下記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは（Ｂ－１）のアミノ酸置換、を有するアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列（好ましくは、合成開始アミノ酸を除いた前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列）を有し、かつTE活性を有するタンパク質。
 
（Ａ－１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに置換。
（Ａ－２）配列番号１の２５１位のスレオニンがアルギニンに置換。
（Ａ－３）配列番号１の２５１位のスレオニンがリジンに置換。
（Ａ－４）配列番号１の２５１位のスレオニンがヒスチジンに置換。
（Ａ－５）配列番号１の２５４位のトリプトファンがイソロイシンに置換。
（Ａ－６）配列番号１の２５４位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ａ－７）配列番号１の２５７位のロイシンがメチオニンに置換。
（Ａ－８）配列番号１の２５７位のロイシンがバリンに置換。
（Ａ－９）配列番号１の２５７位のロイシンがフェニルアラニンに置換。
（Ａ－１０）配列番号１の２６６位のバリンがシステインに置換。
（Ａ－１１）配列番号１の２７１位のトリプトファンがチロシンに置換。
（Ｂ－１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに置換。
（Ｂ－２）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、スレオニン）がアルギニンに置換。
（Ｂ－３）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、スレオニン）がリジンに置換。
（Ｂ－４）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、スレオニン）がヒスチジンに置換。
（Ｂ－５）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、トリプトファン）がイソロイシンに置換。
（Ｂ－６）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、トリプトファン）がチロシンに置換。
（Ｂ－７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がメチオニンに置換。
（Ｂ－８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がバリンに置換。
（Ｂ－９）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がフェニルアラニンに置換。
（Ｂ－１０）配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がシステインに置換。
（Ｂ－１１）配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、トリプトファン）がチロシンに置換。
＜２＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法。
＜３＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸に占める中鎖脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
＜４＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上３５個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上３個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、前記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは（Ｂ－１）のアミノ酸置換、を有するタンパク質である、前記＜１＞～＜３＞のいずれか１項記載の方法。
＜５＞前記タンパク質（Ａ）が、下記（Ｄ－１）～（Ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換（好ましくは前記（Ａ－１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｄ－１）～（Ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換）を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、下記（Ｅ－１）～（Ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換（好ましくは前記（Ｂ－１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｅ－１）～（Ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換）を有する、前記＜１＞～＜４＞のいずれか１項記載の方法。
 
（Ｄ－１）配列番号１の１０６位のバリンがイソロイシンに置換。
（Ｄ－２）配列番号１の１０８位のアスパラギンがリジンに置換。
（Ｄ－３）配列番号１の１０８位のアスパラギンがアルギニンに置換。
（Ｄ－４）配列番号１の１１０位のバリンがイソロイシンに置換。
（Ｄ－５）配列番号１の１１０位のバリンがメチオニンに置換。
（Ｄ－６）配列番号１の１１０位のバリンがロイシンに置換。
（Ｄ－７）配列番号１の１１０位のバリンがフェニルアラニンに置換。
（Ｄ－８）配列番号１の１１８位のシステインがイソロイシンに置換。
（Ｅ－１）配列番号１の１０６位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに置換。
（Ｅ－２）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がリジンに置換。
（Ｅ－３）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がアルギニンに置換。
（Ｅ－４）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに置換。
（Ｅ－５）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がメチオニンに置換。
（Ｅ－６）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がロイシンに置換。
（Ｅ－７）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がフェニルアラニンに置換。
（Ｅ－８）配列番号１の１１８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、システイン）がイソロイシンに置換。
＜６＞前記タンパク質（Ａ）が、下記（Ａ－１＿Ｄ－１）～（Ａ－１＿Ｄ－８）からなる群より選ばれるアミノ酸置換を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、下記（Ｂ－１＿Ｅ－１）～（Ｂ－１＿Ｅ－８）からなる群より選ばれるアミノ酸置換を有する、前記＜１＞～＜５＞のいずれか１項記載の方法。
 
（Ａ－１＿Ｄ－１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１０６位のバリンがイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ａ－１＿Ｄ－２）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１０８位のアスパラギンがリジンに置換。
（Ａ－１＿Ｄ－３）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１０８位のアスパラギンがアルギニンに、それぞれ置換。
（Ａ－１＿Ｄ－４）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ａ－１＿Ｄ－５）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがメチオニンに、それぞれ置換。
（Ａ－１＿Ｄ－６）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがロイシンに、それぞれ置換。
（Ａ－１＿Ｄ－７）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１０位のバリンがフェニルアラニンに、それぞれ置換。
（Ａ－１＿Ｄ－８）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに、１１８位のシステインがイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０６位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－２）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がリジンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－３）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がアルギニンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－４）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－５）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がメチオニンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－６）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がフェニルアラニンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｅ－８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１８位に相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、システイン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
＜７＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）～（ｃ）のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜１＞～＜６＞のいずれか１項記載の方法。
 
（ａ）配列番号２で示される塩基配列において、下記（ａ－１）～（ａ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換、好ましくは（ａ－１）の塩基置換、を有する塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列と同一性が７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列において、下記（ｂ－１）～（ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換、好ましくは（ｂ－１）の塩基置換、を有する塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列（好ましくは、開始コドンを除いた前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列）を有し、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
 
（ａ－１）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ａ－２）配列番号２の７５１位～７５３位の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ａ－３）配列番号２の７５１位～７５３位の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ａ－４）配列番号２の７５１位～７５３位の塩基がヒスチジンをコードする塩基に置換。
（ａ－５）配列番号２の７６０位～７６２位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ａ－６）配列番号２の７６０位～７６２位の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（ａ－７）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ａ－８）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がバリンをコードする塩基に置換。
（ａ－９）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ａ－１０）配列番号２の７９６位～７９８位の塩基がシステインをコードする塩基に置換。
（ａ－１１）配列番号２の８１１位～８１３位の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－２）配列番号２の７５１位～７５３位に相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－３）配列番号２の７５１位～７５３位に相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｂ－４）配列番号２の７５１位～７５３位に相当する位置の塩基がヒスチジンをコードする塩基に置換。
（ｂ－５）配列番号２の７６０位～７６２位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－６）配列番号２の７６０位～７６２位に相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－７）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－８）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がバリンをコードする塩基に置換。
（ｂ－９）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基酸がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１０）配列番号２の７９６位～７９８位に相当する位置の塩基がシステインをコードする塩基に置換。
（ｂ－１１）配列番号２の８１１位～８１３位に相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
＜８＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上３２０個以下、より好ましくは１個以上２６７個以下、より好ましくは１個以上２１３個以下、より好ましくは１個以上１６０個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上８５個以下、より好ましくは１個以上７４個以下、より好ましくは１個以上６４個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加され、前記（ｂ－１）～（ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換、好ましくは（ｂ－１）の塩基置換、を有する塩基配列からなり、かつTE活性を有する前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、、前記（ｂ－１）～（ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換、好ましくは（ｂ－１）の塩基置換、を有し、かつTE活性を有する前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡ、である、前記＜７＞項記載の方法。
＜９＞前記ＤＮＡ（ａ）が、下記（ｄ－１）～（ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換（好ましくは前記（ａ－１）の塩基置換、並びに下記（ｄ－１）～（ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換）を有し、前記ＤＮＡ（ｂ）が、下記（ｅ－１）～（ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換（好ましくは前記（ｂ－１）の塩基置換、並びに下記（ｅ－１）～（ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換）を有する、前記＜７＞又は＜８＞項記載の方法。
 
（ｄ－１）配列番号２の３１６位～３１８位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｄ－２）配列番号２の３２２位～３２４位の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｄ－３）配列番号２の３２２位～３２４位の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｄ－４）配列番号２の３２８位～３３０位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｄ－５）配列番号２の３２８位～３３０位の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｄ－６）配列番号２の３２８位～３３０位の塩基がロイシンをコードする塩基に置換。
（ｄ－７）配列番号２の３２８位～３３０位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｄ－８）配列番号２の３５２位～３５４位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｅ－１）配列番号２の３１６位～３１８位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｅ－２）配列番号２の３２２位～３２４位に相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｅ－３）配列番号２の３２２位～３２４位に相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｅ－４）配列番号２の３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｅ－５）配列番号２の３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｅ－６）配列番号２の３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がロイシンをコードする塩基に置換。
（ｅ－７）配列番号２の３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｅ－８）配列番号２の３５２位～３５４位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
＜１０＞前記ＤＮＡ（ａ）が、下記（ａ－１＿ｄ－１）～（ａ－１＿ｄ－８）からなる群より選ばれる塩基置換を有し、前記ＤＮＡ（ｂ）が、下記（ｂ－１＿ｅ－１）～（ｂ－１＿ｅ－８）からなる群より選ばれる塩基置換を有する、前記＜７＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
 
（ａ－１＿ｄ－１）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３１６位～３１８位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ－１＿ｄ－２）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２２位～３２４位の塩基がリジンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ－１＿ｄ－３）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２２位～３２４位の塩基がアルギニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ－１＿ｄ－４）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位～３３０位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ－１＿ｄ－５）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位～３３０位の塩基がメチオニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ－１＿ｄ－６）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位～３３０位の塩基がロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ－１＿ｄ－７）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３２８位～３３０位の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ａ－１＿ｄ－８）配列番号２の７６９位～７７１位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に３５２位～３５４位の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－１）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３１６位～３１８位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－２）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２２位～３２４位に相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－３）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２２位～３２４位に相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－４）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－５）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－６）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－７）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位に相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｅ－８）配列番号２の７６９位～７７１位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３５２位～３５４位に相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
＜１１＞前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、前記＜１＞～＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞前記微生物が大腸菌である、前記＜１１＞項記載の方法。
＜１３＞前記微生物がシアノバクテリアである、前記＜１１＞項記載の方法。
＜１４＞前記脂肪酸又は脂質が、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数８以上１０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の飽和脂肪酸（カプリル酸、カプリン酸）又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１＞～＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
＜１５＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）。
＜１６＞前記タンパク質（Ａ）が、前記（Ｄ－１）～（Ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換（好ましくは前記（Ａ－１）のアミノ酸置換、並びに前記（Ｄ－１）～（Ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換）を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、前記（Ｅ－１）～（Ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換（好ましくは前記（Ｂ－１）のアミノ酸置換、並びに前記（Ｅ－１）～（Ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換）を有する、前記＜１５＞項記載のタンパク質。
＜１７＞前記タンパク質（Ａ）が、前記（Ａ－１＿Ｄ－１）～（Ａ－１＿Ｄ－８）からなる群より選ばれるアミノ酸置換を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、前記（Ｂ－１＿Ｅ－１）～（Ｂ－１＿Ｅ－８）からなる群より選ばれるアミノ酸置換を有する、前記＜１５＞又は＜１６＞項記載のタンパク質。
＜１８＞前記＜１５＞～＜１７＞のいずれか１項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜１９＞前記ＤＮＡ（ａ）～（ｃ）のいずれか１つからなる遺伝子。
＜２０＞前記ＤＮＡ（ａ）が、前記（ｄ－１）～（ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換（好ましくは前記（ａ－１）の塩基置換、並びに前記（ｄ－１）～（ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換）を有し、前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記（ｅ－１）～（ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換（好ましくは前記（ｂ－１）の塩基置換、並びに前記（ｅ－１）～（ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換）を有する、前記＜１９＞項記載の遺伝子。
＜２１＞前記ＤＮＡ（ａ）が、前記（ａ－１＿ｄ－１）～（ａ－１＿ｄ－８）からなる群より選ばれる塩基置換を有し、前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記（ｂ－１＿ｅ－１）～（ｂ－１＿ｅ－８）からなる群より選ばれる塩基置換を有する、前記＜１９＞又は＜２０＞項記載の遺伝子。
＜２２＞前記＜１８＞～＜２１＞のいずれか１項記載の遺伝子を含有する、組換えベクター又はＤＮＡカセット。
＜２３＞前記＜１８＞～＜２２＞のいずれか１項記載の遺伝子、組換えベクター又はＤＮＡカセットを含んでなる、形質転換体。
＜２４＞前記＜１８＞～＜２２＞のいずれか１項記載の遺伝子、組換えベクター又はＤＮＡカセットを宿主に導入する、形質転換体の作製方法。
＜２５＞前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、前記＜２３＞又は＜２４＞項記載の形質転換体、又はその作製方法。
＜２６＞前記微生物が大腸菌である、前記＜２５＞項記載の形質転換体、又はその作製方法。
＜２７＞前記微生物がシアノバクテリアである、前記＜２５＞項記載の形質転換体、又はその作製方法。
＜２８＞脂質を製造するための、前記＜１５＞～＜２７＞のいずれか１項記載のタンパク質、遺伝子、組換えベクター若しくはＤＮＡカセット、形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜２９＞前記脂質が、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数８以上１０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の飽和脂肪酸（カプリル酸、カプリン酸）又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜２８＞項記載の使用。
　以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１及び２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
実施例１　CpTE改変体を導入した大腸菌による脂質の製造
（１）CpTE遺伝子発現用プラスミドの構築
　pBS-SK(-)プラスミド（アジレント・テクノロジー社製）を鋳型とし、表１記載のプライマーpBS-F及びプライマーpBS-Rを用いてＰＣＲを行い、pBS-SK(-)線状DNA配列を増幅した。
　さらに、クフェア・パルストリス由来のTE遺伝子（GenBank: U38188.1、配列番号４９）を人工的に合成した。合成したDNA配列を鋳型とし、表１記載のプライマーpBS/CpTE-F及びプライマーCpTE/pBS-Rを用いてＰＣＲを行い、葉緑体移行シグナルと推定される配列を除去したクフェア・パルストリス由来のTE遺伝子（配列番号２、以下、「CpTE遺伝子」ともいう）の断片を増幅した。
　次いで、前記pBS-SK(-)線状DNA配列、及びCpTE遺伝子の断片を混合し、In-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）によりクローニングし、pBS-SK(-)プラスミドのlacOプロモーターの下流にCpTE遺伝子の塩基配列が挿入されたプラスミドpBS-CpTEを得た。
（２）CpTE改変体遺伝子発現用プラスミドの構築
　前記プラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_T251R-F、プライマーCpTE_T251K-F及びプライマーCpTE_T251H-Fのいずれか１つと、プライマーCpTE_T251-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列（CpTE遺伝子の塩基配列）の７５１～７５３位の塩基配列を改変した遺伝子断片をそれぞれ取得した。
　また、前記プラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_W254I-F及びプライマーCpTE_W254Y-Fのいずれか１つと、プライマーCpTE_W254-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７６０～７６２位の塩基配列を改変した遺伝子断片をそれぞれ取得した。
　また、前記プラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_L257I-F、プライマーCpTE_L257M-F、プライマーCpTE_L257V-F及びプライマーCpTE_L257F-Fのいずれか１つと、プライマーCpTE_L257-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７６９～７７１位の塩基配列を改変した遺伝子断片をそれぞれ取得した。
　また、前記プラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_V266C-Fと、プライマーCpTE_V266-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７９６～７９８位の塩基配列を改変した遺伝子断片を取得した。
　また、前記プラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_W271Y-Fと、プライマーCpTE_W271-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の８１１～８１３位の塩基配列を改変した遺伝子断片を取得した。
　さらに、前記プラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_M174I-Fと、プライマーCpTE_M174-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の５２０～５２２位の塩基配列を改変した遺伝子断片をそれぞれ取得した。
　これらの遺伝子断片を用いて、In-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）によりクローニングし、CpTE改変体遺伝子発現用プラスミドpBS-CpTE_T251R、pBS-CpTE_T251K、pBS-CpTE_T251H、pBS-CpTE_W254I、pBS-CpTE_W254Y、pBS-CpTE_L257I、pBS-CpTE_L257M、pBS-CpTE_L257V、pBS-CpTE_L257F、pBS-CpTE_V266C、pBS-CpTE_W271Y、pBS-CpTE_M174Iをそれぞれ構築した。
　これらのプラスミドにおいて、配列番号２に示す塩基配列のうち、下記の塩基を置換した。
pBS-CpTE_T251R：配列番号１の２５１位のスレオニン（Ｔ）をコードする塩基を、アルギニン（Ｒ）をコードする塩基ＣＧＴに置換した。
pBS-CpTE_T251K：配列番号１の２５１位のスレオニン（Ｔ）をコードする塩基を、リジン（Ｋ）をコードする塩基ＡＡＡに置換した。
pBS-CpTE_T251H：配列番号１の２５１位のスレオニン（Ｔ）をコードする塩基を、ヒスチジン（Ｈ）をコードする塩基ＣＡＴに置換した。
 
pBS-CpTE_W254I：配列番号１の２５４位のトリプトファン（Ｗ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換した。
pBS-CpTE_W254Y：配列番号１の２５４位のトリプトファン（Ｗ）をコードする塩基を、チロシン（Ｙ）をコードする塩基ＴＡＴに置換した。
 
pBS-CpTE_L257I：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換した。
pBS-CpTE_L257M：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、メチオニン（Ｍ）をコードする塩基ＡＴＧに置換した。
pBS-CpTE_L257V：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、バリン（Ｖ）をコードする塩基ＧＴＴに置換した。
pBS-CpTE_L257F：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、フェニルアラニン（Ｆ）をコードする塩基ＴＴＴに置換した。
 
pBS-CpTE_V266C：配列番号１の２６６位のバリン（Ｖ）をコードする塩基を、システイン（Ｃ）をコードする塩基ＴＧＴに置換した。
 
pBS-CpTE_W271Y：配列番号１の２７１位のトリプトファン（Ｗ）をコードする塩基を、チロシン（Ｙ）をコードする塩基ＴＡＴに置換した。
 
pBS-CpTE_M174I：配列番号１の１７４位のメチオニン（Ｍ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換した。
　前記プラスミドpBS-CpTE_L257Iを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_V106I-F及びプライマーCpTE_V106-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７６９～７７１位に加えて、３１６～３１８位の塩基配列も改変した遺伝子断片を取得した。
　また、前記プラスミドpBS-CpTE_L257Iを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_N108R-及びプライマーCpTE_N108K-Fのいずれか１つと、プライマーCpTE_N108-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７６９～７７１位に加えて、３２２～３２４位の塩基配列も改変した遺伝子断片をそれぞれ取得した。
　また、前記プラスミドpBS-CpTE_L257Iを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_V110I-F、プライマーCpTE_V110M-F、プライマーCpTE_V110L-F及びプライマーCpTE_V110F-Fのいずれか１つと、プライマーCpTE_V110-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７６９～７７１位に加えて、３２８～３３０位の塩基配列も改変した遺伝子断片をそれぞれ取得した。
　さらに、前記プラスミドpBS-CpTE_L257Iを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_C118I-F及びプライマーCpTE_C118-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７６９～７７１位に加えて、３５２～３５４位の塩基配列も改変した遺伝子断片を取得した。
　これらの遺伝子断片を用いて、In-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）によりクローニングし、CpTE改変体遺伝子発現用プラスミドpBS-CpTEL257IV106I、pBS-CpTEL257IN108K、pBS-CpTEL257IN108R、pBS-CpTEL257IV110I、pBS-CpTEL257IV110M、pBS-CpTEL257IV110L、pBS-CpTEL257IV110F、pBS-CpTEL257IC118Iをそれぞれ構築した。
　これらのプラスミドにおいて、配列番号２に示す塩基配列のうち、下記の塩基を置換した。
pBS-CpTEL257IV106I：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１０６位のバリン（Ｖ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換した。
 
pBS-CpTEL257IN108K：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１０８位のアスパラギン（Ｎ）をコードする塩基を、リジン（Ｋ）をコードする塩基ＡＡＡに置換した。
pBS-CpTEL257IN108R：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１０８位のアスパラギン（Ｎ）をコードする塩基を、アルギニン（Ｒ）をコードする塩基ＣＧＴに置換した。
 
pBS-CpTEL257IV110I：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１１０位のバリン（Ｖ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換した。
pBS-CpTEL257IV110M：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１１０位のバリン（Ｖ）をコードする塩基を、メチオニン（Ｍ）をコードする塩基ＡＴＧに置換した。
pBS-CpTEL257IV110L：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１１０位のバリン（Ｖ）をコードする塩基を、ロイシン（Ｌ）をコードする塩基ＴＴＡに置換した。
pBS-CpTEL257IV110F：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１１０位のバリン（Ｖ）をコードする塩基を、フェニルアラニン（Ｆ）をコードする塩基ＴＴＴに置換した。
 
pBS-CpTEL257IC118I：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換し、１１８位のシステイン（Ｃ）をコードする塩基を、イソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換した。
（３）遺伝子発現用プラスミドの大腸菌への導入、及び得られた形質転換体を用いた脂質の製造
　前述のCpTE遺伝子発現用プラスミド、並びに各種CpTE改変体遺伝子発現用プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株であるK27株（fadD88）（Eur. J. Biochem., 1969, vol. 7, p. 559-574）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたK27株を３０℃で一晩静置し、得られたコロニーをLBAmp液体培地（Bacto Trypton 1%, Yeast Extract 0.5%, NaCl 1%, アンピシリンナトリウム５０μg/mL）１ｍＬに接種し、３０℃で一晩培養した。この培養液２μＬを、２ｍＬのOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）に接種し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、下記の方法にて解析した。
（４）大腸菌培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
　培養液１ｍＬに、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノンを２５μＬ添加後、２Ｎ塩酸１０μＬ及びヘキサン２ｍＬを添加して激しく攪拌し、３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行った。パスツールピペットにてヘキサン層（上層）を新しい蓋付きねじ口試験管に回収した。得られたヘキサン層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）１ｍＬを添加し、８０℃にて３０分間恒温した。その後、ヘキサン及び飽和食塩水を各１ｍＬ添加して激しく撹拌し、室温にて３０分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
　得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。ガスクロマトグラフィーは、７８９０Ａ（Agilent Technologies）を用いて、下記の条件下で解析を実施した。
（解析条件）
キャピラリーカラム：DB-1 MS（30m×200μm×0.25μm、J＆W Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
カラム内流量：1.0mL/分
昇温プログラム：70℃保持１分間→70～200℃（20℃/分昇温）→200～320℃（50℃/分昇温）→320℃保持５分間
平衡化時間：１分間
注入口：スプリット注入（スプリット比：１００：１）
圧力１４．４９ｐｓｉ、１０４ｍＬ／分
注入量：１μＬ
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出器温度：３００℃
　また、脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
　ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養1Lあたりに含まれる各脂肪酸の量及びこれらの合計量を算出した。
　さらに、野生型のCpTE遺伝子若しくはL257I遺伝子を導入した形質転換体のＣ８脂肪酸量及びＣ１０脂肪酸量をそれぞれ１とし、CpTE改変体遺伝子を導入した形質転換体のＣ８脂肪酸量及びＣ１０脂肪酸量をそれぞれ相対値で示した。
　その結果を表３及び４に示す。なお表３及び４の結果は、独立した３回の培養とクロマトグラフィー解析の結果の平均値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　表３から明らかなように、野生型のCpTE遺伝子を導入し野生型のCpTEを発現させた形質転換体でのＣ８脂肪酸及びＣ１０脂肪酸の生産量と比較して、本発明のCpTE改変体遺伝子を導入した形質転換体ではＣ８脂肪酸及びＣ１０脂肪酸の生産量がいずれも大きく増加した。
　具体的には、野生型のCpTE遺伝子を導入した場合と比べて、T251R遺伝子を導入した場合は1.96倍、T251K遺伝子を導入した場合は1.36倍、T251H遺伝子を導入した場合は1.81倍、W254I遺伝子を導入した場合は2.32倍、W254Y遺伝子を導入した場合は1.46倍、L257I遺伝子を導入した場合は6.80倍、L257M遺伝子を導入した場合は2.10倍、L257V遺伝子を導入した場合は3.58倍、L257F遺伝子を導入した場合は1.55倍、V266C遺伝子を導入した場合は1.37倍、W271Y遺伝子を導入した場合は3.09倍、Ｃ８脂肪酸の生産量が増加した。
　またＣ１０脂肪酸の生産量についても、野生型CpTE遺伝子を導入した場合と比べて、T251R遺伝子を導入した場合は2.41倍、T251K遺伝子を導入した場合は1.58倍、T251H遺伝子を導入した場合は2.23倍、W254I遺伝子を導入した場合は3.17倍、W254Y遺伝子を導入した場合は1.68倍、L257I遺伝子を導入した場合は10.06倍、L257M遺伝子を導入した場合は2.23倍、L257V遺伝子を導入した場合は3.10倍、L257F遺伝子を導入した場合は1.53倍、V266C遺伝子を導入した場合は1.57倍、W271Y遺伝子を導入した場合は4.04倍、それぞれ増加した。
　さらに表４から明らかなように、Ｃ８脂肪酸及びＣ１０脂肪酸の生産量の増加が顕著であったCpTE(L257I)に対して、前記（Ｄ－１）～（Ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を行うことで、Ｃ８脂肪酸及びＣ１０脂肪酸の生産量がいずれも一層増加した。
　具体的には、L257I遺伝子を導入した場合と比べて、L257IV106I遺伝子を導入した場合は1.40倍、L257IN108K遺伝子を導入した場合は1.32倍、L257IN108R遺伝子を導入した場合は1.20倍、L257IV110I遺伝子を導入した場合は1.18倍、L257IV110M遺伝子を導入した場合は1.52倍、L257IV110L遺伝子を導入した場合は1.76倍、L257IV110F遺伝子を導入した場合は1.75倍、L257IC118I遺伝子を導入した場合は1.21倍、Ｃ８脂肪酸の生産量がさらに増加した。
　またＣ１０脂肪酸の生産量についても、L257I遺伝子を導入した場合と比べて、L257IV106I遺伝子を導入した場合は1.17倍、L257IN108K遺伝子を導入した場合は1.24倍、L257IN108R遺伝子を導入した場合は1.37倍、L257IV110M遺伝子を導入した場合は1.45倍、L257IV110L遺伝子を導入した場合は1.74倍、L257IV110F遺伝子を導入した場合は2.15倍、それぞれさらに増加した。
　以上のように、形質転換体の宿主として大腸菌を用いた場合、本発明で規定するアミノ酸変異を導入したCpTE改変体を利用することで、中鎖脂肪酸の生産性を飛躍的に向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、中鎖脂肪酸の生産性を向上させることができる。
　さらに、特許文献３（米国特許出願公開第２０１１／００２０８８３号明細書）で開示されているCpTE_M174I（配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１７４位のメチオニン（Ｍ）がイソロイシン（Ｉ）に置換されたCpTE改変体）をコードする遺伝子を導入した形質転換体のＣ８脂肪酸量及びＣ１０脂肪酸量をそれぞれ１とし、L257I遺伝子を導入した形質転換体のＣ８脂肪酸量及びＣ１０脂肪酸量をそれぞれ相対値で算出した。その結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　CpTE_M174I遺伝子を導入した形質転換体ではＣ８脂肪酸の生産量が向上することが、特許文献３に記載されている。このような形質転換体と比較しても、表５から明らかなように、CpTE_L257I遺伝子を導入した場合Ｃ８脂肪酸の生産量が1.78倍向上した。さらに、Ｃ１０脂肪酸の生産量についても、2.25倍も増加した。
　この結果から、CpTE_L257I遺伝子を導入した形質転換体は、Ｃ８脂肪酸及びＣ１０脂肪酸の生産には特に有効である。
実施例２　CpTE改変体を導入したシアノバクテリアによる脂質の製造
（１）aas遺伝子の不活性化及びCpTE改変体遺伝子発現用プラスミドの構築
　シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株の野生株のゲノムＤＮＡより、表２記載のプライマーpUC118/0918up-F及びプライマー0918down/pUC118-Rを用いてＰＣＲを行い、Synpcc7942_0918遺伝子（aas遺伝子）を含む断片（2864bp、配列番号５０）を増幅した。増幅した断片をpUC118プラスミド（タカラバイオ社製）のHincIIサイト間にIn-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）を用いて挿入し、Synpcc7942_0918遺伝子（aas遺伝子）を組み込んだpUC118-Synpcc7942_0918プラスミドを取得した。
　pDG1726プラスミド（Gene, 1995, vol. 167, p. 335-336）を鋳型として、表２記載のプライマー0918up/spr-F（配列番号）及びspr/0918down-R（配列番号）を用いてＰＣＲを行い、スペクチノマイシン耐性マーカー遺伝子（配列番号５１）断片（以下、「ｓｐ断片」ともいう）を取得した。
　次に、前記pUC118-Synpcc7942_0918プラスミドを鋳型として、表２記載のプライマー0918up-R及びプライマー0918down-Fを用いてＰＣＲを行い、Synpcc7942_0918遺伝子（aas遺伝子）のコード領域間の927bp領域が削除された直鎖状のＤＮＡ断片を取得した。
　前記の直鎖状ＤＮＡ断片と前記ｓｐ断片とをIn-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）を用いて結合し、ｓｐ断片が挿入されたSynpcc7942_0918遺伝子コード領域のＤＮＡ配列を含むpUC118-Synpcc7942_0918::spプラスミドを得た。
　前記pUC118-Synpcc7942_0918::spプラスミドを鋳型とし、表２記載のプライマー0918up-R及びプライマーSp-Fを用いてＰＣＲを行い、pUC118-Synpcc7942_0918::spプラスミドを線状化した。
　次に、pTrc99Aクローニングプラスミド（NCBI Accession number：M22744）の配列より人工合成したtrcプロモーター配列を鋳型とし、表２記載のプライマー0918up/Ptrc-F及びプライマーPtrc-Rを用いてＰＣＲを行い、trcプロモーター断片（Ptrc断片、配列番号５２）を増幅した。
　実施例１で人工的に合成したクフェア・パルストリス由来のTE遺伝子（GenBank: U38188.1）のDNA配列を鋳型とし、表２記載のプライマーPtrc/CpTE-F及びプライマーCpTE/spr-Rのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、葉緑体移行シグナルと推定される配列を除去したクフェア・パルストリス由来のTE遺伝子（CpTE遺伝子）の断片を増幅した。
　次いで、前述の、線状化したpUC118-Synpcc7942_0918::spプラスミド、Ptrc断片、及びCpTE遺伝子の断片を混合し、In-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）によりクローニングし、Synpcc7942_0918遺伝子のコード領域間に、Ptrc断片、CpTE遺伝子の断片及びｓｐ断片をこの順で挿入した、プラスミドpUC118-Synpcc7942_0918::Ptrc-CpTE-spを得た。
（２）CpTE改変体遺伝子発現用プラスミドの構築
　実施例１で作製したプラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーCpTE_L257I-F及びプライマーCpTE_L257-Rのプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の７６９～７７１位の塩基配列を改変した遺伝子断片pBS-CpTE_L257Iを取得した。
　得られた遺伝子断片と、前記プラスミドpUC118-Synpcc7942_0918::Ptrc-CpTE-spとを用いて、In-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）によりクローニングし、CpTE改変体遺伝子発現プラスミドpUC118-Synpcc7942_0918::Ptrc-CpTE_L257I-spを得た。
　なお前記遺伝子断片pBS-CpTE_L257Iにおいて、配列番号２に示す塩基配列のうち、下記の塩基を置換した。
 
pBS-CpTE_L257I：配列番号１の２５７位のロイシン（Ｌ）をコードする塩基をイソロイシン（Ｉ）をコードする塩基ＡＴＴに置換した。
（３）遺伝子発現用プラスミドのシアノバクテリアへの導入、及び得られた形質転換体を用いた脂質の製造
　前述のCpTE遺伝子発現用プラスミド及びCpTE改変体遺伝子発現用プラスミドを用いて、自然形質転換法によりシネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株を形質転換し、スペクチノマイシン耐性により目的の遺伝子が導入された株を選抜した。
　このようにしてシネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株のゲノム上のaas領域中に、CpTE遺伝子又はCpTE改変体遺伝子発現用コンストラクトを導入した、Δ0918::CpTE株及びΔ0918::CpTE_L257I株をそれぞれ取得した。
　下記表６に示す組成のBG-11培地25mLを加えた50mL三角フラスコ中で、一定の照明下（60μE・m-2・sec-1）、３０℃にてロータリーシェーカー（120rpm）を用いて、初発菌体濃度をＯＤ730＝０．２に設定し、前記形質転換体の培養を２週間行った。なおBG-11培地には、スペクチノマイシンを25μg/mLの濃度となるよう添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
培養終了後、培養液２５ｍＬにNaH2PO4　１ｇ、及び内部標準として7-ペンタデカノン（1mg/mL）２５μLを添加した。この液にヘキサン10mLを添加し、十分に攪拌し、１０分間静置した。室温、2500rpmで10分間遠心分離を行った後、上層部分をナス型フラスコに採取した。遠心分離した下層にさらにヘキサン5mLを添加して攪拌し、遠心分離を２回行い、減圧濃縮を行うことで乾燥サンプルを得た。
　乾燥サンプルに14%三フッ化ホウ素溶液（ＳＩＧＭＡ社製）1mLを添加し、８０℃にて３０分恒温した。その後、ヘキサン及び飽和食塩水を各1mL添加し激しく撹拌し、室温にて３０分放置した。そして、上層のヘキサン層を回収し、脂肪酸メチルエステルを得た。
　得られた脂肪酸メチルエステルを、実施例１と同様の方法に従いガスクロマトグラフィー解析に供した。その結果を表７に示す。なお表７の結果は、独立した３回の培養とクロマトグラフィー解析の結果の平均値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　表７に示すように、野生型のCpTE遺伝子を導入した形質転換体でのＣ８脂肪酸及びＣ１０脂肪酸の生産量と比較して、本発明のCpTE改変体遺伝子を導入した形質転換体ではＣ８脂肪酸の生産量は２．９７倍、Ｃ１０脂肪酸の生産量は５．１０倍も、いずれも大きく増加した。
　このように、形質転換体の宿主としてシアノバクテリアを用いた場合であっても、本発明で規定するアミノ酸変異を導入したCpTE改変体を利用することで、中鎖脂肪酸の生産性を飛躍的に向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、中鎖脂肪酸の生産性を向上させることができる。
　以上のように、本発明で規定するTE改変体をコードする遺伝子を宿主に導入することで、中鎖脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、中鎖脂肪酸の生産性を向上させることができる。
　本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
　本願は、２０１７年１０月６日に日本国で特許出願された特願２０１７－１９６２３７に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。

Claims (18)

  1. 　下記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
     
    （Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記（Ａ－１）～（Ａ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列において、下記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
     
    （Ａ－１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに置換。
    （Ａ－２）配列番号１の２５１位のスレオニンがアルギニンに置換。
    （Ａ－３）配列番号１の２５１位のスレオニンがリジンに置換。
    （Ａ－４）配列番号１の２５１位のスレオニンがヒスチジンに置換。
    （Ａ－５）配列番号１の２５４位のトリプトファンがイソロイシンに置換。
    （Ａ－６）配列番号１の２５４位のトリプトファンがチロシンに置換。
    （Ａ－７）配列番号１の２５７位のロイシンがメチオニンに置換。
    （Ａ－８）配列番号１の２５７位のロイシンがバリンに置換。
    （Ａ－９）配列番号１の２５７位のロイシンがフェニルアラニンに置換。
    （Ａ－１０）配列番号１の２６６位のバリンがシステインに置換。
    （Ａ－１１）配列番号１の２７１位のトリプトファンがチロシンに置換。
    （Ｂ－１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－２）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
    （Ｂ－３）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
    （Ｂ－４）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換。
    （Ｂ－５）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－６）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
    （Ｂ－７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
    （Ｂ－８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がバリンに置換。
    （Ｂ－９）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
    （Ｂ－１０）配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸がシステインに置換。
    （Ｂ－１１）配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
  2. 　下記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される炭素原子数が８又は１０の中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法。
     
    （Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記（Ａ－１）～（Ａ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列において、下記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
     
    （Ａ－１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに置換。
    （Ａ－２）配列番号１の２５１位のスレオニンがアルギニンに置換。
    （Ａ－３）配列番号１の２５１位のスレオニンがリジンに置換。
    （Ａ－４）配列番号１の２５１位のスレオニンがヒスチジンに置換。
    （Ａ－５）配列番号１の２５４位のトリプトファンがイソロイシンに置換。
    （Ａ－６）配列番号１の２５４位のトリプトファンがチロシンに置換。
    （Ａ－７）配列番号１の２５７位のロイシンがメチオニンに置換。
    （Ａ－８）配列番号１の２５７位のロイシンがバリンに置換。
    （Ａ－９）配列番号１の２５７位のロイシンがフェニルアラニンに置換。
    （Ａ－１０）配列番号１の２６６位のバリンがシステインに置換。
    （Ａ－１１）配列番号１の２７１位のトリプトファンがチロシンに置換。
    （Ｂ－１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－２）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
    （Ｂ－３）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
    （Ｂ－４）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換。
    （Ｂ－５）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－６）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
    （Ｂ－７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
    （Ｂ－８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がバリンに置換。
    （Ｂ－９）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
    （Ｂ－１０）配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸がシステインに置換。
    （Ｂ－１１）配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
  3. 　下記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で生産される全脂肪酸に占める炭素原子数が８又は１０の中鎖脂肪酸の割合を増加させる、脂肪酸組成を改変する方法。
     
    （Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記（Ａ－１）～（Ａ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列において、下記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
     
    （Ａ－１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに置換。
    （Ａ－２）配列番号１の２５１位のスレオニンがアルギニンに置換。
    （Ａ－３）配列番号１の２５１位のスレオニンがリジンに置換。
    （Ａ－４）配列番号１の２５１位のスレオニンがヒスチジンに置換。
    （Ａ－５）配列番号１の２５４位のトリプトファンがイソロイシンに置換。
    （Ａ－６）配列番号１の２５４位のトリプトファンがチロシンに置換。
    （Ａ－７）配列番号１の２５７位のロイシンがメチオニンに置換。
    （Ａ－８）配列番号１の２５７位のロイシンがバリンに置換。
    （Ａ－９）配列番号１の２５７位のロイシンがフェニルアラニンに置換。
    （Ａ－１０）配列番号１の２６６位のバリンがシステインに置換。
    （Ａ－１１）配列番号１の２７１位のトリプトファンがチロシンに置換。
    （Ｂ－１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－２）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
    （Ｂ－３）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
    （Ｂ－４）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換。
    （Ｂ－５）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－６）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
    （Ｂ－７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
    （Ｂ－８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がバリンに置換。
    （Ｂ－９）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
    （Ｂ－１０）配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸がシステインに置換。
    （Ｂ－１１）配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
  4. 　前記タンパク質（Ａ）が、下記（Ｄ－１）～（Ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、下記（Ｅ－１）～（Ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
     
    （Ｄ－１）配列番号１の１０６位のバリンがイソロイシンに置換。
    （Ｄ－２）配列番号１の１０８位のアスパラギンがリジンに置換。
    （Ｄ－３）配列番号１の１０８位のアスパラギンがアルギニンに置換。
    （Ｄ－４）配列番号１の１１０位のバリンがイソロイシンに置換。
    （Ｄ－５）配列番号１の１１０位のバリンがメチオニンに置換。
    （Ｄ－６）配列番号１の１１０位のバリンがロイシンに置換。
    （Ｄ－７）配列番号１の１１０位のバリンがフェニルアラニンに置換。
    （Ｄ－８）配列番号１の１１８位のシステインがイソロイシンに置換。
    （Ｅ－１）配列番号１の１０６位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｅ－２）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
    （Ｅ－３）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
    （Ｅ－４）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｅ－５）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
    （Ｅ－６）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がロイシンに置換。
    （Ｅ－７）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
    （Ｅ－８）配列番号１の１１８位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
  5. 　前記タンパク質（Ａ）が、前記（Ａ－１）のアミノ酸置換、並びに前記（Ｄ－１）～（Ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、前記（Ｂ－１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｅ－１）～（Ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換、を有する、請求項４記載の方法。
  6. 　前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　前記微生物が大腸菌である、請求項６記載の製造方法。
  8. 　前記微生物がシアノバクテリアである、請求項６記載の製造方法。
  9. 　前記脂肪酸又は脂質が、炭素原子数が８又は１０の中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
  10. 　下記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）。
     
    （Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記（Ａ－１）～（Ａ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性が８５％以上のアミノ酸配列において、下記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル-ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
     
    （Ａ－１）配列番号１の２５７位のロイシンがイソロイシンに置換。
    （Ａ－２）配列番号１の２５１位のスレオニンがアルギニンに置換。
    （Ａ－３）配列番号１の２５１位のスレオニンがリジンに置換。
    （Ａ－４）配列番号１の２５１位のスレオニンがヒスチジンに置換。
    （Ａ－５）配列番号１の２５４位のトリプトファンがイソロイシンに置換。
    （Ａ－６）配列番号１の２５４位のトリプトファンがチロシンに置換。
    （Ａ－７）配列番号１の２５７位のロイシンがメチオニンに置換。
    （Ａ－８）配列番号１の２５７位のロイシンがバリンに置換。
    （Ａ－９）配列番号１の２５７位のロイシンがフェニルアラニンに置換。
    （Ａ－１０）配列番号１の２６６位のバリンがシステインに置換。
    （Ａ－１１）配列番号１の２７１位のトリプトファンがチロシンに置換。
    （Ｂ－１）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－２）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
    （Ｂ－３）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
    （Ｂ－４）配列番号１の２５１位に相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換。
    （Ｂ－５）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－６）配列番号１の２５４位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
    （Ｂ－７）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
    （Ｂ－８）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がバリンに置換。
    （Ｂ－９）配列番号１の２５７位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
    （Ｂ－１０）配列番号１の２６６位に相当する位置のアミノ酸がシステインに置換。
    （Ｂ－１１）配列番号１の２７１位に相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
  11. 　前記タンパク質（Ａ）が、下記（Ｄ－１）～（Ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、下記（Ｅ－１）～（Ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項１０に記載のタンパク質。
     
    （Ｄ－１）配列番号１の１０６位のバリンがイソロイシンに置換。
    （Ｄ－２）配列番号１の１０８位のアスパラギンがリジンに置換。
    （Ｄ－３）配列番号１の１０８位のアスパラギンがアルギニンに置換。
    （Ｄ－４）配列番号１の１１０位のバリンがイソロイシンに置換。
    （Ｄ－５）配列番号１の１１０位のバリンがメチオニンに置換。
    （Ｄ－６）配列番号１の１１０位のバリンがロイシンに置換。
    （Ｄ－７）配列番号１の１１０位のバリンがフェニルアラニンに置換。
    （Ｄ－８）配列番号１の１１８位のシステインがイソロイシンに置換。
    （Ｅ－１）配列番号１の１０６位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｅ－２）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
    （Ｅ－３）配列番号１の１０８位に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
    （Ｅ－４）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｅ－５）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
    （Ｅ－６）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がロイシンに置換。
    （Ｅ－７）配列番号１の１１０位に相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
    （Ｅ－８）配列番号１の１１８位に相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
  12. 　前記タンパク質（Ａ）が、前記（Ａ－１）のアミノ酸置換、並びに前記（Ｄ－１）～（Ｄ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、前記タンパク質（Ｂ）が、前記（Ｂ－１）のアミノ酸置換、並びに下記（Ｅ－１）～（Ｅ－８）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換、を有する、請求項１１記載のタンパク質。
  13. 　請求項１０～１２のいずれか１項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
  14. 　請求項１３記載の遺伝子を含有する、組換えベクター又はＤＮＡカセット。
  15. 　請求項１３又は１４記載の遺伝子、組換えベクター又はＤＮＡカセットを含んでなる、形質転換体。
  16. 　前記形質転換体が、微生物の形質転換体である、請求項１５に記載の形質転換体。
  17. 　前記微生物が大腸菌である、請求項１６に記載の形質転換体。
  18. 　前記微生物がシアノバクテリアである、請求項１６に記載の形質転換体。
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