WO2015194628A1 - 脂質の製造方法 - Google Patents

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WO2015194628A1
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amino acid
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protein
acid sequence
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達郎 尾崎
猛 斎藤
忠弘 小澤
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花王株式会社
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12Y301/02014—Oleoyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase (3.1.2.14), i.e. ACP-thioesterase
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing lipids.
  • the present invention also relates to an acyl-ACP thioesterase variant used in the method, a gene encoding the same, and a transformant into which the gene has been introduced.
  • Fatty acids are one of the main constituents of lipids, and constitute lipids such as triacylglycerol produced by ester bonds with glycerin in vivo. In many animals and plants, fatty acids are also stored and used as energy sources. Fatty acids and lipids stored in animals and plants are widely used for food or industry. For example, derivatives of higher alcohols obtained by reducing higher fatty acids having about 12 to 18 carbon atoms are used as surfactants. Alkyl sulfate esters and alkylbenzene sulfonates are used as anionic surfactants. Polyoxyalkylene alkyl ethers, alkyl polyglycosides, and the like are used as nonionic surfactants.
  • Alkylamine salts and mono- or dialkyl quaternary amine salts which are derivatives of the same higher alcohols, are routinely used for fiber treatment agents, hair rinse agents or disinfectants.
  • Benzalkonium-type quaternary ammonium salts are routinely used as bactericides and preservatives.
  • higher alcohols having about 18 carbon atoms are useful as plant growth promoters.
  • fatty acids and lipids are widely used, and therefore, attempts have been made to improve the productivity of fatty acids and lipids in vivo in plants and the like. Furthermore, since the use and usefulness of fatty acids depend on the number of carbon atoms, attempts have been made to control the number of carbon atoms of fatty acids, that is, the chain length. For example, a method of accumulating fatty acids having 12 carbon atoms by introducing acyl-ACP (acyl carrier protein) thioesterase derived from bay ( Umbellularia californica (California bay)) has been proposed (Patent Document 1, Non-Patent Document 1). Yes.
  • acyl-ACP acyl carrier protein
  • the present invention relates to a method for producing lipid, wherein a transformant obtained by introducing a gene encoding any one of the following proteins (A) to (C) into a host is cultured to produce lipid.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which at least one of glycine at position 203 and valine at position 204 is substituted with tryptophan in the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1.
  • (B) In the amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1, the amino acid at the position corresponding to position 203 of SEQ ID NO: 1 and the amino acid at the position corresponding to position 204 A protein comprising an amino acid sequence in which at least one is substituted with tryptophan and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • (C) A protein having the amino acid sequence of the protein (A) or (B) and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • the present invention also relates to the proteins (A) to (C).
  • the present invention also relates to a gene encoding any one of the proteins (A) to (C).
  • the present invention also relates to a transformant obtained by introducing the gene into a host.
  • Nannochloropsis-Okyurata Nannochloropsis oculata derived acyl -ACP thioesterase (hereinafter, also referred to as "NoTE”) (SEQ ID NO: 1), Nannochloropsis-Gaditana (Nannochloropsis Gaditana) derived acyl -ACP thioesterase (Hereinafter also referred to as “NgTE”) amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) and amino acid sequence (sequence also referred to as “NgrTE”) of acyl-ACP thioesterase derived from Nannochloropsis granulata (hereinafter also referred to as “NgrTE”) It is the figure which compared number 49).
  • the present invention provides an acyl-ACP thioesterase variant in which the amino acid sequence of a wild-type acyl-ACP thioesterase derived from an algae belonging to the genus Nannochloropsis is modified, and a method for producing a lipid using the same. .
  • the present invention also provides a gene encoding the acyl-ACP thioesterase variant.
  • the present invention also provides a transformant in which the gene is introduced and the fatty acid composition of the produced lipid is changed.
  • the present inventors have studied acyl-ACP thioesterases derived from algae belonging to the genus Nannochloropsis, obtained wild-type acyl-ACP thioesterases derived from Nannochloropsis oculata, and introduced mutations into this amino acid sequence Thus, a plurality of acyl-ACP thioesterase variants were obtained. As a result of transformation using these, in some of the transformants, a specific number of carbon atoms in the total fatty acid component in the lipid was compared with the transformant into which wild-type acyl-ACP thioesterase was introduced. It has been found that the fatty acid content of is significantly improved. The present invention has been completed based on this finding.
  • the transformant of the present invention is superior in the ability to produce a fatty acid having a specific carbon number, compared to a transformant into which a wild-type acyl-ACP thioesterase derived from an algae belonging to the genus Nannochloropsis has been introduced.
  • the method for producing a lipid of the present invention using the transformant is particularly excellent in the productivity of a fatty acid having a specific carbon number and a lipid containing these as a constituent component.
  • the acyl-ACP thioesterase variant of the present invention, a gene encoding the same, a transformant, and a method for producing a lipid can be suitably used for industrial production of fatty acids and lipids having a specific carbon number.
  • the “lipid” in the present specification includes simple lipids, complex lipids and derived lipids. Specifically, fatty acids, fatty alcohols, hydrocarbons (alkanes, etc.), neutral lipids (triacylglycerols, etc.) ), Wax, ceramide, phospholipid, glycolipid, sulfolipid and the like.
  • “Cx: y” in the notation of fatty acids and acyl groups constituting the fatty acids represents a fatty acid or acyl group having x carbon atoms and y double bonds.
  • “Cx fatty acid” and “Cx acyl” represent a fatty acid or acyl group having x carbon atoms, respectively.
  • acyl-ACP thioesterase is also simply referred to as “TE”
  • a gene encoding TE is also referred to as “acyl-ACP thioesterase gene” or “TE gene”.
  • acyl-ACP thioesterase variant of the present invention the gene encoding the acyl-ACP thioesterase variant, a transformant using the gene, and a method for producing lipids will be described in order.
  • Acyl-ACP thioesterase variant The protein of the present invention (hereinafter also referred to as “acyl-ACP thioesterase variant” or “TE variant”) has a partially modified amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • a protein having ACP thioesterase activity hereinafter also referred to as “TE activity”
  • TE activity A protein having ACP thioesterase activity
  • Acyl-ACP thioesterase is an enzyme involved in the biosynthesis system of fatty acids and derivatives thereof (such as triacylglycerol (triglyceride)).
  • the enzyme contains acyl-ACP (an acyl group that is a fatty acid residue), which is an intermediate in the process of fatty acid biosynthesis, in plastids such as chloroplasts in plants and algae, and in the cytoplasm in bacteria, fungi, and animals. Hydrolysis of the thioester bond of a complex comprising an acyl carrier protein) produces free fatty acids.
  • the fatty acid synthesis on the ACP is completed by the action of TE, and the cut fatty acid is used for synthesis of triacylglycerol and the like.
  • TE has a plurality of TEs having different reaction specificities depending on the number of carbon atoms and the number of unsaturated bonds of the acyl group (fatty acid residue) constituting the substrate acyl-ACP. . Therefore, TE is considered to be an important factor that determines the fatty acid composition in vivo.
  • acyl-ACP thioesterase activity refers to the activity of hydrolyzing the thioester bond of acyl-ACP.
  • TE variant of the present invention include the following proteins (A) to (C).
  • a protein comprising an amino acid sequence in which at least one of glycine at position 203 and valine at position 204 is substituted with tryptophan in the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1.
  • B In the amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1, the amino acid at the position corresponding to position 203 of SEQ ID NO: 1 and the amino acid at the position corresponding to position 204 A protein comprising an amino acid sequence in which at least one is substituted with tryptophan and having TE activity.
  • C A protein having the amino acid sequence of the protein (A) or (B) and having TE activity.
  • SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence of TE (NoTE) derived from Nannochloropsis oculata NIES2145, which is an algae belonging to the genus Nannochloropsis.
  • NoTE TE
  • the present inventors have found that the region at positions 128 to 287 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is important for functioning as TE and is sufficient for exhibiting TE activity. That is, the protein consisting of the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 has TE activity.
  • the protein (A) has a region sufficient for this TE activity and functions as TE.
  • the amino acid sequence of the protein (A) is based on the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1, which is a sufficient region for TE activity, and an amino acid at a specific position in the sequence is further substituted.
  • SEQ ID NO: 1 an amino acid at a position described later in SEQ ID NO: 1 is substituted
  • at least one selected from the group consisting of acyl-ACP having a specific carbon number, particularly C8 acyl-ACP, C10 acyl-ACP, and C12 acyl-ACP The specificity of the species for acyl-ACP is improved.
  • the TE variant of the present invention comprises acyl-ACP having a specific carbon number as a substrate (specifically, C8 acyl-ACP, C10 acyl-ACP, and C12 acyl-ACP) as a substrate compared to wild-type TE.
  • the activity of hydrolyzing at least one acyl-ACP selected from the group is improved.
  • the amino acid at position 203 is glycine and the amino acid at position 204 is valine.
  • glycine at position 203 in SEQ ID NO: 1 is substituted with tryptophan, and valine at position 204 is substituted with tryptophan or phenylalanine.
  • Glycine at position 203 and valine at position 204 in SEQ ID NO: 1 More preferably, each is substituted with tryptophan.
  • a TE variant having a specific amino acid substitution may be abbreviated as follows.
  • NoTE (G203W) a TE variant derived from Nannochloropsis oculata in which glycine (Gly; G) at position 203 of SEQ ID NO: 1 was replaced with tryptophan (Trp; W).
  • TE variant derived from Chloropsis oculata a TE variant derived from Nannochloropsis oculata in which glycine (Gly; G) at position 203 of SEQ ID NO: 1 was replaced with tryptophan (Trp; W).
  • the protein (A) may have amino acid substitutions at positions other than positions 203 and 204 of SEQ ID NO: 1.
  • the protein (A) is substituted with at least one amino acid selected from the group consisting of the following (Ca-1) to (Cg-1) It is preferable to further have.
  • (Ca-1) Replacing leucine (Leu; L) at position 143 of SEQ ID NO: 1 with proline (Pro; P).
  • (Cb-1) Replacing histidine (His; H) at position 146 of SEQ ID NO: 1 with asparagine (Asn; N) or serine (Ser; S).
  • Cc-1) Replacing glycine (Gly; G) at position 160 of SEQ ID NO: 1 with alanine (Ala; A).
  • Cd-1) Methionine (Met; M) at position 202 of SEQ ID NO: 1 is substituted with phenylalanine (Phe; F), histidine (His; H), leucine (Leu; L), glutamine (Gln; Q), or valine ( Replaced with Val; V).
  • Ce-1) Replacing glycine (Gly; G) at position 212 of SEQ ID NO: 1 with proline (Pro; P).
  • the glycine at position 203 and the valine at position 204 in SEQ ID NO: 1 are each substituted with tryptophan, and one or two selected from the group consisting of the above (Ca-1) to (Cg-1) More preferably, it has two amino acid substitutions.
  • the protein (A) has one or two amino acid substitutions selected from the group consisting of (Ca-1) to (Cg-1), wherein valine at position 204 of SEQ ID NO: 1 is substituted with tryptophan. More preferably.
  • the protein (B) is based on an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1, and has TE activity.
  • an amino acid sequence encoding an enzyme protein does not necessarily indicate enzyme activity unless the sequence of the entire region is conserved, and there are regions that do not affect enzyme activity even if the amino acid sequence changes. It is known to exist. In such a region that is not essential for enzyme activity, the original activity of the enzyme can be maintained even if a mutation such as amino acid deletion, substitution, insertion or addition is introduced.
  • a protein that retains TE activity and is partially mutated in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 can also be used.
  • the identity of an amino acid sequence and a base sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, vol. 227, p. 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing analysis with a unit size to compare (ktup) of 2 using a homology search program of genetic information software Genetyx-Win (software development).
  • the amino acid sequence of the protein (B) is the same as the amino acid substitution in the protein (A) in the amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1.
  • Has a substitution That is, the amino acid sequence of the protein (B) has an amino acid substitution in which at least one of the amino acid at the position corresponding to position 203 of SEQ ID NO: 1 and the amino acid at the position corresponding to position 204 is substituted with tryptophan.
  • the amino acid sequence of the protein (B) is substituted with tryptophan at the position corresponding to position 203 of SEQ ID NO: 1, and the amino acid at the position corresponding to position 204 is tryptophan or phenylalanine.
  • the amino acid at the position corresponding to position 203 and the amino acid at the position corresponding to position 204 of SEQ ID NO: 1 are each replaced with tryptophan.
  • the protein (B) may have an amino acid substitution at a position other than the positions corresponding to positions 203 and 204 of SEQ ID NO: 1.
  • the protein (B) preferably further has at least one amino acid substitution selected from the group consisting of the following (Ca-2) to (Cg-2).
  • Ca-2) The amino acid at the position corresponding to position 143 of SEQ ID NO: 1 was replaced with proline.
  • Cb-2 The amino acid at the position corresponding to position 146 of SEQ ID NO: 1 was substituted with asparagine or serine.
  • Cc-2) The amino acid at the position corresponding to position 160 of SEQ ID NO: 1 was substituted with alanine.
  • the protein (B) is one selected from the group consisting of (Ca-2) to (Cg-2) in which amino acids at positions corresponding to positions 203 and 204 of SEQ ID NO: 1 are substituted with tryptophan, respectively. Or it is more preferred to have two amino acid substitutions.
  • the protein (B) has one or two amino acids selected from the group consisting of (Ca-2) to (Cg-2), wherein the amino acid at the position corresponding to position 204 of SEQ ID NO: 1 is substituted with tryptophan. More preferably, it has two amino acid substitutions.
  • the “corresponding position” or “corresponding region” in an amino acid sequence or base sequence is the largest in the conserved amino acid residues present in each amino acid sequence by comparing the target amino acid sequence with the reference sequence. It can be determined by aligning the sequences so as to confer homology.
  • the alignment can be performed using known algorithms, the procedures of which are known to those skilled in the art. For example, the alignment can be performed manually based on the above-mentioned Lipman-Pearson method or the like, or the Clustal W multiple alignment program (Thompson, JD et al, Nucleic Acids Res., 1994, vol. 22, p. 4673-4680) with default settings.
  • Clustal W is, for example, the European Bioinformatics Institute (EBI, [www.ebi.ac.uk/index.html]) and the Japan DNA Data Bank (DDBJ, [DDBJ, [ It can be used on the website of www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]).
  • EBI European Bioinformatics Institute
  • DDBJ Japan DNA Data Bank
  • SEQ ID NO: 3 is TE (NgTE) derived from Nannochloropsis gadytana CCMP526 strain.
  • SEQ ID NO: 49 is TE derived from Nannochloropsis granulata strain NIES2588 (NgrTE).
  • a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 49 or a partial sequence thereof is called “wild type TE”, and a protein consisting of an amino acid sequence in which the amino acid sequence of wild type TE is partially mutated is referred to as “TE modification”.
  • the body A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 49 or a partial sequence thereof is called “wild type TE”, and a protein consisting of an amino acid sequence in which the amino acid sequence of wild type TE is partially mutated is referred to as “TE modification”.
  • the amino acid sequence of positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of positions 115 to 274 of SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of positions 126 to 285 of SEQ ID NO: 49 are higher than each other. Have identity. The identity between the amino acid sequence of positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of positions 115 to 274 of SEQ ID NO: 3 is about 91%. Further, the identity between the amino acid sequence of positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of positions 126 to 285 of SEQ ID NO: 49 is about 98%.
  • the region of positions 115 to 274 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the region of positions 126 to 285 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 are also important for functioning as TE, and have TE activity.
  • the inventors have confirmed that this is a sufficient area to show. Therefore, a protein consisting of the amino acid sequence of positions 115 to 274 of SEQ ID NO: 3 and a protein consisting of the amino acid sequence of positions 126 to 285 of SEQ ID NO: 49 also have TE activity.
  • the protein (B) is preferably the following protein (Ba) or (Bb).
  • Ba A protein having an amino acid sequence in which at least one of glycine at position 190 and valine at position 191 in SEQ ID NO: 3 is substituted with tryptophan in the amino acid sequence at positions 115 to 274 of SEQ ID NO: 3, and has TE activity .
  • Bb a protein having an amino acid sequence in which at least one of glycine at position 201 and valine at position 202 of SEQ ID NO: 49 is substituted with tryptophan in the amino acid sequence at positions 126 to 285 of SEQ ID NO: 49, and having TE activity .
  • glycine at position 203 valine at position 204, leucine at position 143, histidine at position 146, glycine at position 160, methionine at position 202, glycine at position 212, asparagine at position 213, proline at position 281 of SEQ ID NO: 1.
  • Glycine at position 201 of SEQ ID NO: 49 valine at position 202, leucine at position 141, histidine at position 144, glycine at position 158, methionine at position 200, glycine at position 210, asparagine at position 211, and position 279 at position 279.
  • proline also in the amino acid sequences of the proteins (Ba) and (Bb), these amino acids are preferably substituted in the same manner as the protein (A).
  • the protein (Ba), like the protein (A), has improved specificity for acyl-ACP having a specific carbon number.
  • the amino acid sequence of the protein (Ba) has about 90% identity with the amino acid sequence of the protein (A). Therefore, in the protein (B), the identity with respect to the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 is preferably 86% or more, more preferably 88% or more, and 90% or more. More preferably.
  • the amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1 or several (preferably 1 to 8, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 5) of amino acid sequence from position 115 to position 274 of SEQ ID No. 3, or amino acid sequence from position 126 to position 285 of SEQ ID NO: 49
  • An amino acid sequence in which 4 amino acids, more preferably 1 to 3, and even more preferably 1 to 2 amino acids are deleted, substituted, inserted, or added is also preferable.
  • Examples of a method for introducing mutation such as deletion, substitution, insertion, addition, etc. into the amino acid sequence include a method of introducing mutation into the base sequence encoding the amino acid sequence. A method for introducing a mutation into the base sequence will be described later.
  • the protein (C) contains the amino acid sequence of the protein (A) or (B) as part of its amino acid sequence and exhibits TE activity.
  • the amino acid sequences constituting the protein (C) include, for example, any amino acid sequence other than the 128th to 287th positions of SEQ ID NO: 1, 3 or any amino acid sequence other than positions 115 to 274, any amino acid sequence other than positions 126 to 285 of SEQ ID NO: 49, or one or several of these sequences (preferably 1 to 20 and more preferably 1 to 15 or less, more preferably 1 to 10 or less, still more preferably 1 to 5 or less, and still more preferably 1 to 3 or less.
  • Mutations include amino acid deletions, substitutions, insertions or additions. These sequences are preferably added to the N-terminal side of the amino acid sequence of the protein (A) or (B).
  • the protein (C) is also preferably a protein comprising an amino acid sequence in which a signal peptide involved in protein transport or secretion is added to the amino acid sequence of the protein (A) or (B). Examples of signal peptide addition include addition of a chloroplast translocation signal peptide to the N-terminus.
  • the protein (C) is preferably the amino acid sequence of positions 1 to 127 of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of positions 49 to 127 of SEQ ID NO: 1, on the N-terminal side of the amino acid sequence of the protein (A), The amino acid sequence of positions 58 to 127 of No. 1, the amino acid sequence of positions 78 to 127 of SEQ ID No. 1, the amino acid sequence of positions 87 to 127 of SEQ ID No. 1, and the amino acid sequence of positions 88 to 127 of SEQ ID No.
  • amino acid sequence of positions 98 to 127 of SEQ ID NO: 1, amino acid sequence of positions 108 to 127 of SEQ ID NO: 1, amino acid sequence of positions 118 to 127 of SEQ ID NO: 1, or one or several of these sequences Preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more and 10 or less, still more preferably 1 or more and 5 or less, and even more preferably Is properly amino acid mutation (deletion of amino acids of one or more 3 or less), substitution, insertion or addition) the amino acid sequence has been introduced, a protein consists added in the amino acid sequence.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or positions 49 to 287, 58 to 287, 78 to 287, 87 to 287, 88 to 287, 88 to 287, 98 to 287 of SEQ ID NO: 1, It has been confirmed by the present inventors that a protein comprising an amino acid sequence at positions 108 to 287, or positions 118 to 287 has TE activity.
  • the protein (C) is preferably the amino acid sequence of positions 36 to 114 of SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence of positions 45 to 114 of SEQ ID NO: 3 on the N-terminal side of the amino acid sequence of the protein (Ba).
  • positions 36 to 274, positions 45 to 274, positions 55 to 274, positions 65 to 274, positions 75 to 274, positions 85 to 274, positions 95 to 274, or 105 It has been confirmed by the present inventors that a protein consisting of the amino acid sequence at positions 274 to 274 has TE activity.
  • the protein (C) is preferably the amino acid sequence of positions 1 to 125 of SEQ ID NO: 49 and the amino acid sequence of positions 35 to 125 of SEQ ID NO: 49 on the N-terminal side of the amino acid sequence of the protein (Bb). , Amino acid sequence of positions 55 to 125 of SEQ ID NO: 49, amino acid sequence of positions 85 to 125 of SEQ ID NO: 49, or one or several of these sequences (preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 Amino acid mutation (amino acid deletion, substitution, insertion) of 15 or more, 15 or less, more preferably 1 or more and 10 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, and even more preferably 1 or more and 3 or less.
  • the protein (C) is preferably tryptophan in which at least one of the amino acid at the position corresponding to position 203 and the amino acid at the position corresponding to position 204 of SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 49 It is a protein having an amino acid sequence substituted with and having TE activity. Furthermore, the protein (C) has the amino acid substitution described above in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 49, and positions 1 to 127 of SEQ ID NO: 1, positions 1 to 114 of SEQ ID NO: 3, or a sequence It may be a protein consisting of an amino acid sequence deleted at the N-terminal side at any position from positions 1-125 of number 49.
  • the TE variant of the present invention has TE activity, for example, by introducing a fusion gene in which a TE gene is linked downstream of a promoter that functions in a host cell such as Escherichia coli into a host cell deficient in the fatty acid degradation system. It is possible to confirm by culturing under the condition that the TE gene is expressed and analyzing the change in the fatty acid composition in the host cell or the culture solution using a method such as gas chromatography analysis. In this case, by comparing the ratio of the fatty acid having a specific carbon number in the total amount of fatty acids with the system in which wild-type TE is expressed, the change in specificity for acyl-ACP having a specific carbon number in the TE variant can be achieved.
  • a TE variant can be obtained by using a TE gene obtained by cloning from Nannochloropsis oculata by a genetic recombination technique.
  • Nannochloropsis oculata are The culture collection of algae at University of Texas at Austin (UTEX), National Institute for Environmental Studies (NIES), National Center for Marine Algae and They can be obtained from Microbiota (NCMA: formerly CCMP), Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP), Australian National Algae Culture Collection (CSIRO), and the like.
  • the gene of the present invention is a gene encoding any one of the proteins (A) to (C).
  • An example of a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a base sequence of a gene encoding wild type TE derived from Nannochloropsis oculata strain NIES2145.
  • the base sequence from position 382 to position 864 of SEQ ID NO: 2 encodes the amino acid sequence from position 128 to position 287 of SEQ ID NO: 1.
  • An example of a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is a base sequence of a gene encoding wild-type TE derived from Nannochloropsis gadytana CCMP526 strain.
  • the base sequence from position 343 to position 825 of SEQ ID NO: 4 encodes the amino acid sequence from position 115 to position 274 of SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence from position 343 to position 825 of SEQ ID NO: 4 has about 76% identity with the base sequence from position 382 to position 864 of SEQ ID NO: 2.
  • An example of a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 49 is a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 50.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 50 is a base sequence of a gene encoding wild type TE derived from Nannochloropsis granulata NIES2588 strain.
  • the base sequence from position 376 to position 858 of SEQ ID NO: 50 encodes the amino acid sequence from position 126 to position 285 of SEQ ID NO: 49.
  • the base sequence from positions 376 to 858 of SEQ ID NO: 50 has about 93% identity with the base sequence from positions 382 to 864 of SEQ ID NO: 2.
  • any one of the proteins (A) to (C) include a gene consisting of any one of the following DNAs (A1) to (C1).
  • the present invention is not limited to these.
  • (A1) DNA comprising a nucleotide sequence in which at least one of the nucleotides from positions 607 to 609 and nucleotides from positions 610 to 612 in the nucleotide sequence from position 382 to position 864 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding tryptophan .
  • (B1) In the base sequence having 70% or more identity with the base sequence at positions 382 to 864 of SEQ ID NO: 2, the base at positions corresponding to positions 607 to 609 of SEQ ID NO: 2 and positions 610 to 612 DNA consisting of a base sequence in which at least one of the corresponding bases is substituted with a base encoding tryptophan, and encoding a protein having TE activity.
  • (C1) DNA encoding a protein having the base sequence of DNA (A1) or (B1) and having TE activity.
  • the gene consisting of the DNA (A1) is a gene encoding the protein (A).
  • the base sequence of the gene consisting of the DNA (A1) is a base in which nucleotides 607 to 609 in SEQ ID NO: 2 are substituted with bases encoding tryptophan, and bases in positions 610 to 612 encode tryptophan. Alternatively, it is preferably substituted with a base encoding phenylalanine, more preferably the bases at positions 607 to 609 and bases at positions 610 to 612 of SEQ ID NO: 2 are each replaced with a base encoding tryptophan. .
  • the base sequence of the gene consisting of the DNA (A1) may have base substitutions at positions other than the bases at positions 607 to 609 and positions 610 to 612 in SEQ ID NO: 2.
  • the DNA (A1) preferably further has at least one base substitution selected from the group consisting of the following (C1a-1) to (C1g-1).
  • C1a-1) The bases at positions 427 to 429 in SEQ ID NO: 2 were replaced with bases encoding proline.
  • C1b-1) The bases at positions 436 to 438 of SEQ ID NO: 2 were replaced with bases encoding asparagine or serine.
  • C1c-1) The bases at positions 478 to 480 in SEQ ID NO: 2 were replaced with bases encoding alanine.
  • C1d-1 The base at positions 604 to 606 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding phenylalanine, histidine, leucine, glutamine, or valine.
  • C1e-1) The bases at positions 634 to 636 of SEQ ID NO: 2 were replaced with bases encoding proline.
  • C1f-1) The base at positions 637 to 639 in SEQ ID NO: 2 was replaced with a base encoding tyrosine.
  • C1g-1) The base at positions 841 to 843 of SEQ ID NO: 2 was replaced with a base encoding glutamine.
  • the bases at positions 607 to 609 and bases at positions 610 to 612 of SEQ ID NO: 2 are substituted with bases encoding tryptophan, respectively, and (C1a-1) More preferably, it has one or two base substitutions selected from the group consisting of: (C1g-1).
  • the bases at positions 610 to 612 of SEQ ID NO: 2 are substituted with bases encoding tryptophan, and from (C1a-1) to (C1g-1) More preferably, it has one or two base substitutions selected from the group consisting of:
  • the gene consisting of the DNA (B1) is a gene having a base substitution corresponding to the amino acid substitution of the protein (B).
  • bases at positions corresponding to positions 607 to 609 of SEQ ID NO: 2 are substituted with bases encoding tryptophan, and bases at positions corresponding to positions 610 to 612 are present. It is preferably substituted with a base encoding tryptophan or phenylalanine, and the bases at positions corresponding to positions 607 to 609 and the positions corresponding to positions 610 to 612 of SEQ ID NO: 2 are bases encoding tryptophan, respectively. More preferably, it is substituted.
  • the base sequence of the gene comprising DNA (B1) has base substitutions at positions other than the bases corresponding to positions 607 to 609 and positions corresponding to positions 610 to 612 of SEQ ID NO: 2. May be.
  • the DNA (B1) preferably further has at least one base substitution selected from the group consisting of the following (C1a-2) to (C1g-2).
  • C1a-2) The bases at positions corresponding to positions 427 to 429 in SEQ ID NO: 2 were replaced with bases encoding proline.
  • C1b-2) The bases at positions corresponding to positions 436 to 438 of SEQ ID NO: 2 were substituted with bases encoding asparagine or serine.
  • C1c-2 The base at the position corresponding to positions 478 to 480 of SEQ ID NO: 2 was substituted with a base encoding alanine.
  • C1d-2) The base at the position corresponding to positions 604 to 606 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding phenylalanine, histidine, leucine, glutamine, or valine.
  • C1e-2) The bases at positions corresponding to positions 634 to 636 of SEQ ID NO: 2 were replaced with bases encoding proline.
  • C1f-2) The base at the position corresponding to positions 637 to 639 in SEQ ID NO: 2 was replaced with a base encoding tyrosine.
  • C1g-2) The bases at positions corresponding to positions 841 to 843 of SEQ ID NO: 2 were replaced with bases encoding glutamine.
  • the positions corresponding to the bases at positions 607 to 609 and bases at positions 610 to 612 in SEQ ID NO: 2 are substituted with bases encoding tryptophan, respectively, More preferably, it has one or two base substitutions selected from the group consisting of C1a-2) to (C1g-2).
  • bases corresponding to positions 610 to 612 of SEQ ID NO: 2 are substituted with bases encoding tryptophan, and (C1a-2) to (C1g More preferably, it has one or two base substitutions selected from the group consisting of -2.
  • the gene consisting of DNA (B1) is preferably the following gene consisting of DNA (B1a) or (B1b).
  • (B1a) consisting of a nucleotide sequence in which at least one of the nucleotides at positions 568 to 570 and nucleotides at positions 571 to 573 in the nucleotide sequence of positions 343 to 825 of SEQ ID NO: 4 is substituted with a base encoding tryptophan; And a DNA encoding a protein having TE activity.
  • Bases 634 to 636, bases 637 to 639, bases 841 to 843 are respectively bases 601 to 603, bases 604 to 606 of SEQ ID NO: 50, Bases at positions 421 to 423, bases at positions 430 to 432, bases at positions 472 to 474, bases at positions 598 to 600, bases at positions 628 to 630, bases at positions 631 to 633, positions 835 Corresponds to the base at position ⁇ 837. Also in the base sequences of the DNAs (B1a) and (B1b), these bases are preferably substituted in the same manner as the base sequence of the DNA (A1).
  • the identity of SEQ ID NO: 2 with respect to the nucleotide sequence from position 382 to position 864 is preferably 72% or more, more preferably 74% or more, and even more preferably 76% or more.
  • the base sequence having 70% or more identity with the base sequence of positions 382 to 864 of SEQ ID NO: 2 is the base sequence of positions 382 to 864 of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 1 or several (preferably 1 to 20, more preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10) in the nucleotide sequence of positions 343 to 825 of SEQ ID NO: 50 or the nucleotide sequence of positions 376 to 858 of SEQ ID NO: 50 (Preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) of base sequences in which a base is deleted, substituted, inserted or added is also preferred.
  • methods for introducing mutations such as deletion, substitution, insertion and addition into the base sequence include site-specific mutagenesis.
  • Specific methods for introducing site-specific mutations include a method using Splicing overlap extension (SOE) PCR, ODA method, Kunkel method and the like. Also, commercially available kits such as Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Km Kit (Takara Bio), Transformer TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Clonetech), KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo) may be used. it can. Moreover, after giving a random gene mutation, the target gene can also be obtained by performing enzyme activity evaluation and gene analysis by an appropriate method.
  • the DNA (C1) includes the base sequence of the DNA (A1) or (B1) as part of its base sequence.
  • Examples of the base sequence other than the base sequence of the DNA (A1) or (B1) in the base sequence of the DNA (C1) include, for example, any base sequence other than the positions 382 to 864 of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 Any base sequence other than positions 343 to 825, any base sequence other than positions 376 to 858 of SEQ ID NO: 50, or one or several of these sequences (preferably 1 to 20 and more preferably 1 to 15 or less, more preferably 1 to 10 or less, still more preferably 1 to 5 or less, and still more preferably 1 to 3 or less). Mutations include base deletions, substitutions, insertions or additions.
  • sequences are preferably added to the 5 ′ end side of the base sequence of the DNA (A1) or (B1).
  • a base sequence encoding a signal peptide involved in protein transport and secretion is also preferred. Examples of the signal peptide include those described for the protein (C).
  • the base sequence encoding the signal peptide is preferably added to the 5 ′ end side of the base sequence of the DNA (A1) or (B1).
  • the base sequence of the DNA (C1) is preferably the base sequence of positions 1 to 381 of SEQ ID NO: 2 and the positions of positions 145 to 381 of SEQ ID NO: 2 on the 5 ′ end side of the base sequence of the DNA (A1).
  • Base sequence base sequence from position 172 to 381 of SEQ ID NO: 2, base sequence from position 232 to 381 of SEQ ID NO: 2, base sequence from position 259 to 381 of SEQ ID NO: 2, position 262 to 381 of SEQ ID NO: 2
  • Base sequence from position 292 to position 381 of SEQ ID NO: 2 base sequence from position 322 to position 381 of SEQ ID NO: 2, base sequence from position 352 to position 381 of SEQ ID NO: 2, or 1 to these sequences
  • several preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more and 10 or less, still more preferably 1 or more and 5 or less, and even more preferably 1 3 or more Base mutation (base deletion in), substitution, insertion or
  • the base sequence of the DNA (C1) is preferably the base sequence of positions 106 to 342 of SEQ ID NO: 4 and the positions 133 to 342 of SEQ ID NO: 4 on the 5 ′ end side of the base sequence of the DNA (B1a).
  • nucleotide sequence insertion or addition are introduced, a nucleotide sequence that is added.
  • SEQ ID NO: 4 positions 106 to 825, positions 133 to 825, positions 163 to 825, positions 193 to 825, positions 223 to 825, positions 253 to 825, positions 283 to 825, or 313
  • the present inventors have confirmed that the protein encoded by the nucleotide sequence from position 825 to position 825 has TE activity.
  • the base sequence of the DNA (C1) is preferably a base sequence of positions 1 to 375 of SEQ ID NO: 50 and positions 103 to 375 of SEQ ID NO: 50 on the 5 ′ end side of the base sequence of the DNA (B1b).
  • Base sequence from position 163 to position 375 of SEQ ID NO: 50, base sequence from position 253 to position 375 of SEQ ID NO: 50, or one or several of these sequences (preferably 1 or more and 20 or less, More preferably, it is 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more and 10 or less, still more preferably 1 or more and 5 or less, and still more preferably 1 or more and 3 or less.
  • Substitution, insertion or addition is a base sequence to which is added.
  • the protein encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50 or the nucleotide sequence of positions 103 to 858, 163 to 858, or 253 to 858 of SEQ ID NO: 50 has TE activity. Have been confirmed.
  • the DNA (C1) is preferably a base at a position corresponding to positions 607 to 609 and a position corresponding to positions 610 to 612 of SEQ ID NO: 2 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 50.
  • the DNA comprises a base sequence in which at least one of the bases is substituted with a base encoding tryptophan, and encodes a protein having TE activity.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 50 has the above-mentioned base substitution, and positions 1 to 381 of SEQ ID NO: 2, positions 1 to 342 of SEQ ID NO: 4, or sequence It may be a DNA consisting of a nucleotide sequence in which the 5 ′ end is deleted at any position from position 1 to 375 of number 50.
  • the base sequence of the wild-type TE gene cloned from Nannochloropsis oculata strain NIES2145 (the base sequence represented by SEQ ID NO: 2) is expressed as In-Fusion ( The product is incorporated into a vector using a registered trademark HD Cloning Kit (Clonthech, Mountain View, California).
  • a DNA fragment is amplified by PCR using an oligonucleotide containing a nucleotide sequence encoding as a primer.
  • a heat denaturation reaction for converting a double-stranded DNA into a single strand is performed at 98 ° C. for 10 seconds, and an annealing reaction for hybridizing the primer pair to the single-stranded DNA is performed at 55 ° C.
  • an extension reaction for allowing DNA polymerase to act is performed at 72 ° C. for about 30 seconds, and these are defined as one cycle for 30 cycles.
  • the DNA amplified by the PCR reaction is treated with a Dpn I enzyme that specifically cleaves methylated DNA, and E. coli is transformed with this enzyme and selected on a plate medium containing antibiotics. By extracting a plasmid from the transformed E. coli, a gene encoding a TE variant into which the target amino acid mutation has been introduced can be obtained.
  • the transformant of the present invention is obtained by introducing a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) into a host.
  • the transformant Compared with the transformant into which a wild type TE gene derived from an algae belonging to the genus Nannochloropsis is introduced, the transformant has the ability to produce lipids having a specific carbon number, particularly C8 fatty acid, C10 fatty acid, or C12 fatty acid and The ability to produce lipids containing as a constituent is significantly improved.
  • the fatty acid composition in the lipid produced changes by improving the productivity of the fatty acid of the specific carbon number mentioned above.
  • the ability of the host or transformant to produce fatty acids and lipids can be measured by the method used in the examples.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing a TE gene encoding a TE variant into a host by an ordinary genetic engineering method. Specifically, it can be prepared by preparing an expression vector or gene expression cassette capable of expressing a gene encoding a TE variant in a host cell, introducing the vector into a host cell, and transforming the host cell. .
  • the host for the transformant can be appropriately selected from those usually used.
  • Examples of the host that can be used in the present invention include microorganisms (including algae and microalgae), plants, and animals. From the viewpoint of production efficiency and availability of the obtained lipid, the host is preferably a microorganism or a plant, and more preferably a microorganism.
  • the microorganism may be either a prokaryotic organism or a eukaryotic organism, and a prokaryotic organism such as a microorganism belonging to the genus Escherichia or a microorganism belonging to the genus Bacillus , or a eukaryotic microorganism such as a yeast or filamentous fungus. Can do.
  • Escherichia coli Bacillus subtilis , red yeast ( Rhodosporidium toruloides ), and Mortierella sp. are preferred from the viewpoint of lipid productivity, and Escherichia coli is more preferred.
  • Escherichia coli is more preferred.
  • Chlamydomonas Chlamydomonas
  • Chlorella Chlorella
  • Faye Oda Kuti ram Phaeodactylum
  • Nan'nokuroro Algae of the genus Psis are preferred, and algae of the genus Nannochloropsis are more preferred.
  • Nannochloropsis oculata examples include Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis gaditana, Nannochloropsis salina , Nannochloropsis oceanica , Nannochloropsis oceanica , Nannochloropsis atomus ), Nannochloropsis maculata , Nannochloropsis granulata, Nannochloropsis sp.
  • Nannochloropsis oculata or Nannochloropsis gaditana is preferable, and Nannochloropsis oculata is more preferable.
  • the plant body is preferably Arabidopsis thaliana , rapeseed, coconut palm, palm, coffea, or jatropha, more preferably Arabidopsis , from the viewpoint of high lipid content in the seed.
  • the vector (plasmid) that serves as the parent of the gene expression vector may be any vector that can introduce a gene encoding a TE variant into a host and can express the gene in a host cell.
  • a vector having an expression regulatory region such as a promoter or terminator according to the type of host to be introduced, and a vector having a replication origin or a selection marker can be used.
  • it may be a vector that autonomously grows and replicates outside the chromosome, such as a plasmid, or a vector that is integrated into the chromosome.
  • an expression vector that can be preferably used in the present invention, when a microorganism is used as a host, for example, pBluescript (pBS) II SK (-) (Stratagene), pSTV vector (Takara Bio), pUC vector (Takara Shuzo), pET vector (Takara Bio), pGEX vector (GE Healthcare), pCold vector (Takara Bio), pHY300PLK (Takara Bio), pUB110 ( Mckenzie, T.
  • pBluescript (pBS) II SK (-) Stratagene
  • pSTV vector Takara Bio
  • pUC vector Takara Shuzo
  • pET vector Takara Bio
  • pGEX vector GE Healthcare
  • pHY300PLK Tikara Bio
  • pUB110 Mckenzie, T.
  • pBluescript II SK ( ⁇ ) or pMW218 / 219 is preferably used.
  • pUC19 manufactured by Takara Bio Inc.
  • P66 Cholamydomonas Center
  • P-322 Cholamydomonas Center
  • pPha-T1 see Non-Patent Document 2
  • pJET1 Cosmo Bio
  • a host when the host is an algae belonging to the genus Nannochloropsis, pUC19, pPha-T1, or pJET1 is preferably used.
  • the host is an algae belonging to the genus Nannochloropsis, the literature description of Oliver Kilian, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Dec 27; 108 (52), 2011
  • a host can also be transformed with a DNA fragment (gene expression cassette) comprising the gene, promoter and terminator of the present invention.
  • the DNA fragment include a DNA fragment amplified by PCR and a DNA fragment cleaved with a restriction enzyme.
  • a pRI vector manufactured by Takara Bio Inc.
  • a pBI vector manufactured by Clontech
  • an IN3 vector manufactured by Implanta Innovations
  • the host is Arabidopsis thaliana
  • pRI vectors or pBI vectors are preferably used.
  • Expression control regions such as promoters and terminators used in expression vectors and gene expression cassettes can also be appropriately selected according to the type of host and vector used.
  • promoters that can be preferably used in the present invention include, for example, lac promoter, trp promoter, tac promoter, trc promoter, T7 promoter, SpoVG promoter, cauliflower mozil virus 35 SRNA promoter, housekeeping gene promoter (for example, tubulin promoter, Actin promoter, ubiquitin promoter, etc.), rapeseed-derived Napin gene promoter, plant-derived Rubisco promoter, or violaxanthin / chlorophyll a-binding protein gene promoter derived from the genus Nannochloropsis.
  • the type of selection marker for confirming that the gene encoding the target protein has been incorporated can be appropriately selected according to the type of host or vector used.
  • Selectable markers that can be preferably used in the present invention include ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, blasticidin S Examples include drug resistance genes such as resistance genes, bialaphos resistance genes, zeocin resistance genes, paromomycin resistance genes, or hygromycin resistance genes. Furthermore, it is also possible to use a gene defect associated with auxotrophy as a selection marker gene.
  • An expression vector used for transformation can be constructed by incorporating a gene encoding the TE variant into the vector by a usual technique such as restriction enzyme treatment or ligation.
  • the transformation method can be appropriately selected from conventional methods according to the type of host and vector used. For example, a method using calcium ions, a general competent cell transformation method (J. Bacterial. 93, 1925 (1967)), a protoplast transformation method, an electroporation method or an LP transformation method can be used. .
  • transformation can also be performed using the electroporation method described in Randor Radakovits, et al., Nature Communications, DOI: 10.1038 / ncomms1688, 2012, and the like.
  • ⁇ Selection of transformant introduced with target gene fragment> can be performed by using a selection marker or the like.
  • a drug resistance gene acquired by a transformant as a result of introduction of a drug resistance gene into a host cell together with a target DNA fragment at the time of transformation can be used as an indicator.
  • the introduction of the target DNA fragment can also be confirmed by PCR method using a genome as a template.
  • the method for producing a lipid of the present invention includes a step of culturing a transformant introduced with a gene encoding a TE variant and producing a lipid. From the viewpoint of improving the productivity of lipid, the step comprises culturing a transformant introduced with a gene encoding a TE variant under appropriate conditions to obtain a culture, and lipid from the obtained culture. Preferably, the step of collecting is included.
  • culturing a transformant refers to culturing and growing a microorganism, algae, a plant, an animal, and cells and tissues thereof. Cultivation is also included. Further, the “culture” includes the transformant itself after culturing in addition to the culture solution of the transformant.
  • the culture conditions can be appropriately selected depending on the host of the transformant.
  • glycerol, acetic acid, malonic acid, or the like may be added to the medium as a TE substrate or a precursor involved in the fatty acid biosynthesis system.
  • culturing is performed at 30 to 37 ° C. for 0.5 to 1 day in an LB medium or Overnight Express Instant TB Medium (Novagen). It is done.
  • a transformant using Arabidopsis as a host, it is cultivated for 1 to 2 months in soil under a temperature condition of 20 to 25 ° C. and under a light condition such as continuous irradiation with white light or a light period of 16 hours and a dark period of 8 hours. Can be mentioned.
  • the host of the transformant is algae
  • the following medium and culture conditions can be used.
  • a medium based on natural seawater or artificial seawater may be used, or a commercially available medium may be used.
  • Specific examples of the medium include f / 2 medium, ESM medium, Daigo IMK medium, L1 medium, and MNK medium.
  • f / 2 medium, ESM medium, or Daigo IMK medium is preferable, f / 2 medium or Daigo IMK medium is more preferable, and f / 2 medium is further included. preferable.
  • the amount of algae inoculated on the medium is not particularly limited, but is preferably 1 to 50% (vol / vol), more preferably 1 to 10% (vol / vol) per medium from the viewpoint of growth.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of algae, but it is usually in the range of 5 to 40 ° C. From the viewpoint of promoting the growth of algae, improving the productivity of fatty acids, and reducing the production cost, the temperature is preferably 10 to 35 ° C, more preferably 15 to 30 ° C.
  • the light irradiation may be performed under conditions that allow photosynthesis, and may be artificial light or sunlight.
  • the illuminance during light irradiation is preferably in the range of 100 to 50000 lux, more preferably in the range of 300 to 10000 lux, and still more preferably in the range of 1000 to 6000 lux, from the viewpoint of promoting the growth of algae and improving the productivity of fatty acids. It is.
  • the light irradiation interval is not particularly limited, but from the same viewpoint as described above, it is preferably performed in a light / dark cycle, and the light period in 24 hours is preferably 8 to 24 hours, more preferably 10 to 18 hours, More preferably, it is 12 hours.
  • the concentration of carbon dioxide in the gas is not particularly limited, but is preferably 0.03 (similar to atmospheric conditions) to 10%, more preferably 0.05 to 5%, from the viewpoint of promoting growth and improving the productivity of fatty acids.
  • the concentration of the carbonate is not particularly limited.
  • sodium bicarbonate it is preferably 0.01 to 5% by mass, more preferably 0.05 to 2% by mass, from the viewpoint of promoting growth and improving the productivity of fatty acids. More preferably, the content is 0.1 to 1% by mass.
  • the culture time is not particularly limited, and may be performed for a long period of time (for example, about 150 days) so that algal bodies that accumulate lipids at a high concentration can grow at a high concentration.
  • the culture period is preferably 3 to 90 days, more preferably 3 to 30 days, and even more preferably 7 to 30 days.
  • culture cultivation may be any of aeration stirring culture, shaking culture, or stationary culture, and a shaking culture is preferable from a viewpoint of an improvement in aeration.
  • a method for collecting the lipid produced by the transformant a method usually used for isolating lipid components and the like in a living body, for example, filtration, centrifugation, cell filtration from the above-mentioned culture or transformant.
  • examples thereof include a method of isolating and recovering lipid components by crushing, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, chloroform / methanol extraction method, hexane extraction method, ethanol extraction method, or the like.
  • oil can be recovered from the culture or transformant by pressing or extraction, and then subjected to general purification such as degumming, deoxidation, decolorization, dewaxing, and deodorization to obtain lipids. .
  • a fatty acid can be obtained by hydrolyzing the isolated lipid.
  • the method for isolating the fatty acid from the lipid component include a method of treating at a high temperature of about 70 ° C. in an alkaline solution, a method of treating with lipase, a method of decomposing using high-pressure hot water, and the like.
  • the TE variant of the present invention has an improved specificity for acyl-ACP having a specific carbon number, for example, C8 acyl-ACP, C10 acyl-ACP, or C12 acyl-ACP, compared to wild-type TE.
  • the content of fatty acids having a specific carbon number such as C8 fatty acid, C10 fatty acid, C12 fatty acid in the total fatty acid component, compared to the transformant introduced with wild-type TE.
  • the production method of the present invention using the transformant can be suitably used for the production of specific carbon number lipids, in particular, C8 fatty acid, C10 fatty acid, or C12 fatty acid and lipids containing this as a constituent component.
  • the lipid produced in the production method of the present invention is preferably a fatty acid and a lipid comprising this as a constituent, more preferably a fatty acid or an ester thereof, from the viewpoint of its availability.
  • the fatty acid or ester thereof contained in the lipid is preferably a C8 to C16 fatty acid or ester thereof, more preferably a C12 to C14 fatty acid or ester thereof, and more preferably a C12 fatty acid or ester thereof from the viewpoint of availability to a surfactant or the like. More preferred is lauric acid or an ester thereof.
  • the content of the C12 fatty acid with respect to the total fatty acid content in the collected total lipid component is preferably 3% by mass or more from the viewpoint of use as a surfactant.
  • collected total lipid component refers to the total lipid component calculated by the method used in the examples.
  • Fatty acids and lipids obtained by the production method of the present invention and transformants are used as food, as emulsifiers for cosmetics, detergents such as soaps and detergents, fiber treatment agents, hair rinse agents, or bactericides and preservatives. Can be used.
  • the present invention further discloses the following lipid production method, transformant, transformant production method, protein, gene, fatty acid composition modification method, and lipid productivity improvement method.
  • a method for producing lipids wherein a transformant obtained by introducing a gene encoding any one of the following proteins (A) to (C) into a host is cultured to produce lipids.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which at least one of glycine at position 203 and valine at position 204 is substituted with tryptophan in the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1.
  • (B) In the amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1, the amino acid at the position corresponding to position 203 of SEQ ID NO: 1 and the amino acid at the position corresponding to position 204 A protein comprising an amino acid sequence in which at least one is substituted with tryptophan and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • (C) A protein having the amino acid sequence of the protein (A) or (B) and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • the identity with the amino acid sequence at positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1 is 86% or more, preferably 88% or more, more preferably 90% or more, ⁇ 1 > The manufacturing method of description.
  • the protein (B) is an amino acid sequence of positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1, an amino acid sequence of positions 115 to 274 of SEQ ID NO: 3, or an amino acid sequence of positions 126 to 285 of SEQ ID NO: 49.
  • a protein having an acyl-ACP thioesterase activity comprising an amino acid sequence in which at least one of the amino acid at position 203 corresponding to SEQ ID NO: 1 and the amino acid at position corresponding to position 204 in SEQ ID NO: 1 is substituted with tryptophan.
  • ⁇ 4> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the protein (B) is the following protein (Ba) or (Bb).
  • ⁇ 5> In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 49, at least one of the amino acid at the position corresponding to position 203 and the amino acid at the position corresponding to position 204 in SEQ ID NO: 1 is the protein (C) is tryptophan.
  • a protein comprising a substituted amino acid sequence deleted at the N-terminal side at any position from positions 1 to 127 of SEQ ID NO: 1, positions 1 to 114 of SEQ ID NO: 3, or positions 1 to 125 of SEQ ID NO: 49; The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>.
  • the protein (C) is located on the N-terminal side of the amino acid sequence of the protein (A), the amino acid sequence at positions 1 to 127 of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence at positions 49 to 127 of SEQ ID NO: 1, The amino acid sequence of positions 58 to 127 of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of positions 78 to 127 of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of positions 87 to 127 of SEQ ID NO: 1, and the amino acids of positions 88 to 127 of SEQ ID NO: 1 Sequence, amino acid sequence from positions 98 to 127 of SEQ ID NO: 1, amino acid sequence from positions 108 to 127 of SEQ ID NO: 1, amino acid sequence from positions 118 to 127 of SEQ ID NO: 1, or one or several of these sequences 1 or more, preferably 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, still more preferably 1 or more and 10 or less, still more preferably 1 or more and 5 or less, and even more preferably 1 ⁇ 1> to ⁇
  • the protein (C) is located on the N-terminal side of the amino acid sequence of the protein (Ba), the amino acid sequence at positions 36 to 114 in SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence at positions 45 to 114 in SEQ ID NO: 3, The amino acid sequence of positions 55 to 114 of SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of positions 65 to 114 of SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of positions 75 to 114 of SEQ ID NO: 3, the amino acids of positions 85 to 114 of SEQ ID NO: 3 Sequence, amino acid sequence from position 95 to position 114 in SEQ ID NO: 3, amino acid sequence from position 105 to position 114 in SEQ ID NO: 3, or one or several, preferably from 1 to 20 in these sequences, more preferably 1 to 15 amino acids, more preferably 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids, and still more preferably 1 to 3 amino acids are deleted, substituted, or inserted.
  • the protein (C) has an amino acid sequence of positions 1 to 125 of SEQ ID NO: 49, an amino acid sequence of positions 35 to 125 of SEQ ID NO: 49 on the N-terminal side of the amino acid sequence of the protein (Bb), The amino acid sequence of positions 55 to 125 of SEQ ID NO: 49, the amino acid sequence of positions 85 to 125 of SEQ ID NO: 49, or one or several, preferably 1 to 20, preferably 1 15 or less, more preferably 1 or more and 10 or less, still more preferably 1 or more and 5 or less, and still more preferably 1 or more and 3 or less amino acids have been deleted, substituted, inserted or added Any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 5>, which is a protein consisting of an amino acid sequence to which the sequence is added and
  • the glycine at position 203 of SEQ ID NO: 1 or the amino acid at a position corresponding thereto is tryptophan
  • the valine at position 204 of SEQ ID NO: 1 or an amino acid at a position corresponding thereto The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein is substituted with tryptophan or phenylalanine, preferably tryptophan.
  • Ca A leucine at position 143 of SEQ ID NO: 1 or an amino acid at a position corresponding thereto is substituted with proline.
  • Cb Histidine at position 146 of SEQ ID NO: 1 or an amino acid at a position corresponding thereto is substituted with asparagine or serine.
  • Cc Glycine at position 160 in SEQ ID NO: 1 or an amino acid at a position corresponding thereto is substituted with alanine.
  • Cd The methionine at position 202 of SEQ ID NO: 1 or the amino acid at a position corresponding thereto is substituted with phenylalanine, histidine, leucine, glutamine, or valine.
  • amino acid sequence of the proteins (A) to (C) is selected from the group consisting of the above (Ca) to (Cg), wherein valine at position 204 of SEQ ID NO: 1 or a corresponding position is substituted with tryptophan
  • Glycine at position 203 of SEQ ID NO: 1 or an amino acid at a position corresponding thereto is substituted with tryptophan, and valine at position 204 or an amino acid at a position corresponding thereto is replaced with phenylalanine.
  • Glycine at position 203 and valine at position 204 of SEQ ID NO: 1 or amino acids at positions corresponding thereto are substituted with tryptophan, and leucine at position 143 or an amino acid at positions corresponding thereto is replaced with proline.
  • Glycine at position 203 and valine at position 204 of SEQ ID NO: 1 or amino acids at positions corresponding thereto are substituted with tryptophan, and glycine at position 160 or amino acids at positions corresponding thereto is substituted with alanine.
  • Glycine at position 203 and valine at position 204 of SEQ ID NO: 1 or amino acids at positions corresponding thereto are substituted with tryptophan, and glycine at position 212 or amino acids at positions corresponding thereto are replaced with proline.
  • Glycine at position 203 and valine at position 204 of SEQ ID NO: 1 or amino acids at positions corresponding thereto are substituted with tryptophan, and asparagine at position 213 or an amino acid at positions corresponding thereto is replaced with tyrosine.
  • Glycine at position 203 and valine at position 204 of SEQ ID NO: 1 or amino acids at positions corresponding thereto are tryptophan, glycine at position 160 or amino acids at positions corresponding thereto are alanine, and asparagine at position 213 or The amino acid at the corresponding position is replaced with tyrosine.
  • Glycine at position 190 and valine at position 191 of SEQ ID NO: 3 or amino acids at positions corresponding thereto are substituted with tryptophan.
  • a valine at position 204 of SEQ ID NO: 1 or an amino acid at a position corresponding thereto is substituted with tryptophan, and a histidine at position 146 or an amino acid at a position corresponding thereto is replaced with asparagine or serine.
  • the valine at position 204 of SEQ ID NO: 1 or the amino acid at the position corresponding thereto is replaced with tryptophan, and the methionine at position 202 or the amino acid at the position corresponding thereto is replaced with phenylalanine, histidine, leucine, glutamine, or valine.
  • a valine at position 204 of SEQ ID NO: 1 or an amino acid at a position corresponding thereto is substituted with tryptophan, and a proline at position 281 or an amino acid at a position corresponding thereto is replaced with glutamine.
  • a valine at position 204 of SEQ ID NO: 1 or an amino acid at a position corresponding thereto is tryptophan, a methionine at position 202 or an amino acid at a position corresponding thereto is histidine, and a proline at position 281 or a position corresponding thereto Amino acid replaced with glutamine.
  • any one of the proteins (A) to (C) is a gene consisting of any one of the following DNAs (A1) to (C1): The manufacturing method of any one of>.
  • (A1) DNA comprising a nucleotide sequence in which at least one of the nucleotides from positions 607 to 609 and nucleotides from positions 610 to 612 in the nucleotide sequence from position 382 to position 864 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a base encoding tryptophan .
  • (B1) In the base sequence having 70% or more identity with the base sequence at positions 382 to 864 of SEQ ID NO: 2, the base at positions corresponding to positions 607 to 609 of SEQ ID NO: 2 and positions 610 to 612
  • C1 DNA encoding a protein having the base sequence of DNA (a) or (b) and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • the identity with respect to the nucleotide sequence of positions 382 to 864 of SEQ ID NO: 2 is 72% or more, preferably 74% or more, more preferably 76% or more, ⁇ 14> The manufacturing method of description.
  • the DNA (B1) is a nucleotide sequence of positions 382 to 864 of SEQ ID NO: 2, a nucleotide sequence of positions 343 to 825 of SEQ ID NO: 4, or a nucleotide sequence of positions 376 to 858 of SEQ ID NO: 50
  • One or several, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, even more preferably 1 to 3 bases are deleted.
  • At least one of the base at the position corresponding to positions 607 to 609 and the base at the position corresponding to positions 610 to 612 of SEQ ID NO: 2 is a base encoding tryptophan.
  • ⁇ 17> The production method according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 16>, wherein the DNA (B1) is the following DNA (B1a) or (B1b).
  • (B1a) A base in which at least one of the bases at positions 568 to 570 and bases at positions 571 to 573 in SEQ ID NO: 4 is substituted with a base encoding tryptophan in the base sequence at positions 343 to 825 in SEQ ID NO: 4.
  • (B1b) A base in which at least one of the bases at positions 601 to 603 and bases at positions 604 to 606 in SEQ ID NO: 50 is substituted with a base encoding tryptophan in the base sequence at positions 376 to 858 in SEQ ID NO: 50
  • the DNA (C1) is a base at a position corresponding to positions 607 to 609 and a base at positions corresponding to positions 610 to 612 in SEQ ID NO: 2, in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 50 At least one of them is substituted with a base encoding tryptophan, and the 5 ′ terminal is missing at any position from positions 1 to 381 of SEQ ID NO: 2, positions 1 to 342 of SEQ ID NO: 4, or positions 1 to 375 of SEQ ID NO: 50
  • the production method according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 17>, wherein the production method is DNA comprising a lost base sequence.
  • the DNA (C1) has a nucleotide sequence of positions 1 to 381 of SEQ ID NO: 2 and a nucleotide sequence of positions 145 to 381 of SEQ ID NO: 2 on the 5 ′ end side of the nucleotide sequence of the DNA (A1).
  • Nucleotide sequence from position 172 to 381 of SEQ ID NO: 2, nucleotide sequence from position 232 to 381 of SEQ ID NO: 2, nucleotide sequence from position 259 to 381 of SEQ ID NO: 2, position 262 to 381 of SEQ ID NO: 2 Base sequence, base sequence from positions 292 to 381 of SEQ ID NO: 2, base sequence from positions 322 to 381 of SEQ ID NO: 2, base sequence from positions 352 to 381 of SEQ ID NO: 2, or one or a number of these sequences 1 or more, preferably 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, still more preferably 1 or more and 10 or less, still more preferably 1 or more and 5 or less, and even more preferably 1 or more and 3 Or less bases deleted, Any one of the above ⁇ 14> to ⁇ 18>, which is a DNA comprising a base sequence to which an exchanged, inserted or added base sequence has been added and which encodes a protein having acyl-ACP thioeste
  • the DNA (C1) has a nucleotide sequence of positions 106 to 342 of SEQ ID NO: 4 and a nucleotide sequence of positions 133 to 342 of SEQ ID NO: 4 on the 5 ′ end side of the nucleotide sequence of the DNA (B1a).
  • nucleotide sequence of positions 163 to 342 of SEQ ID NO: 4, the nucleotide sequence of positions 193 to 342 of SEQ ID NO: 4, the nucleotide sequence of positions 223 to 342 of SEQ ID NO: 4, and the nucleotide sequences of positions 253 to 342 of SEQ ID NO: 4 1 or several, preferably 1 or more, preferably 20 or less, more preferably a base sequence, a base sequence of positions 283 to 342 of SEQ ID NO: 4, a base sequence of positions 313 to 342 of SEQ ID NO: 4, or these sequences Is 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more and 10 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, and still more preferably 1 or more and 3 or less, base deletion, substitution, insertion or From the added base sequence Ri, and a DNA encoding a protein having an acyl -ACP thioesterase activity, the ⁇ 14> - the production method according to any one of ⁇
  • the DNA (C1) has a nucleotide sequence of positions 1 to 375 of SEQ ID NO: 50 and a nucleotide sequence of positions 103 to 375 of SEQ ID NO: 50 on the 5 ′ end side of the nucleotide sequence of the DNA (B1b).
  • the bases at positions 607 to 609 of SEQ ID NO: 2 or the bases corresponding thereto are the bases coding for tryptophan, and positions 610 to 612 of SEQ ID NO: 2.
  • (C1c) The bases at positions 478 to 480 of SEQ ID NO: 2 or the bases corresponding thereto are substituted with bases encoding alanine.
  • (C1d) The base at positions 604 to 606 of SEQ ID NO: 2 or the base corresponding thereto is substituted with a base encoding phenylalanine, histidine, leucine, glutamine, or valine.
  • (C1e) The base at positions 634 to 636 of SEQ ID NO: 2 or the base corresponding thereto is substituted with a base encoding proline.
  • (C1f) The base at positions 637 to 639 in SEQ ID NO: 2 or the base corresponding thereto is substituted with a base encoding tyrosine.
  • the base at positions 841 to 843 in SEQ ID NO: 2 or the base corresponding thereto is substituted with a base encoding glutamine.
  • the nucleotide sequences of the DNAs (A1) to (C1) are the nucleotides at positions 607 to 609 of SEQ ID NO: 2 or the positions corresponding thereto and the nucleotides at positions 610 to 612 or the positions corresponding thereto.
  • (3-1) The nucleotides at positions 607 to 609 and nucleotides at positions 610 to 612 in SEQ ID NO: 2 or the bases corresponding to these are substituted with bases encoding tryptophan.
  • (4-1) The nucleotides at positions 607 to 609 of SEQ ID NO: 2 or the bases corresponding to these nucleotides encode tryptophan, the bases at positions 610 to 612 or the bases corresponding thereto are phenylalanine. Substitution with the coding base.
  • Bases at positions 607 to 609 and bases at positions 610 to 612 or corresponding positions in SEQ ID NO: 2 are bases encoding tryptophan; The base at the position corresponding to is replaced with a base encoding proline.
  • Bases at positions 607 to 609 and bases at positions 610 to 612 of SEQ ID NO: 2 or bases corresponding to these are bases encoding tryptophan, or bases at positions 478 to 480 or this The base at the position corresponding to is substituted with a base encoding alanine.
  • Bases at positions 607 to 609 and bases at positions 610 to 612 of SEQ ID NO: 2 or bases corresponding to these bases encode tryptophan, bases at positions 637 to 639, or these The base at the position corresponding to is replaced with a base encoding tyrosine.
  • (9-1) Bases at positions 607 to 609 and bases at positions 610 to 612 of SEQ ID NO: 2 or bases corresponding to these are bases encoding tryptophan, or bases at positions 478 to 480 or these The base at the position corresponding to is replaced with a base encoding alanine, and the base at positions 637 to 639 or the base corresponding to these is replaced with a base encoding tyrosine.
  • the bases at positions 610 to 612 of SEQ ID NO: 2 or the positions corresponding thereto are tryptophan-encoding bases, the bases at positions 604 to 606 or the positions corresponding thereto are phenylalanine, Substitution with a base encoding histidine, leucine, glutamine, or valine.
  • the nucleotides at positions 610 to 612 of SEQ ID NO: 2 or the bases corresponding to these bases encode tryptophan, the bases at positions 841 to 843 or the bases corresponding thereto are glutamine. Substitution with the coding base.
  • ⁇ 27> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 26>, wherein the host is a microorganism.
  • the microorganism is a microalgae, preferably an algae belonging to the genus Nannochloropsis.
  • the microorganism is Escherichia coli.
  • the lipid comprises a fatty acid having 8, 10, or 12 carbon atoms or an ester thereof.
  • ⁇ 31> The content of the fatty acid having 8, 10, or 12 carbon atoms in the lipid is increased as compared with a lipid collected from a transformant introduced with a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • ⁇ 32> A protein defined in any one of (A) to (C) above.
  • ⁇ 33> The protein according to ⁇ 32>, wherein the protein is any one of the proteins defined by the production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 13>.
  • ⁇ 34> A gene encoding the protein according to ⁇ 32> or ⁇ 33>.
  • ⁇ 35> A gene comprising any one of the DNAs defined in (A1) to (C1) above.
  • ⁇ 36> The gene according to ⁇ 34> or ⁇ 35>, wherein the DNA is any one of DNAs defined by the production method according to any one of ⁇ 14> to ⁇ 26>.
  • ⁇ 37> A recombinant vector containing the gene according to any one of ⁇ 34> to ⁇ 36>.
  • ⁇ 38> A transformant obtained by introducing the gene according to any one of ⁇ 34> to ⁇ 36> or the recombinant vector according to ⁇ 37> into a host.
  • ⁇ 39> A method for producing a transformant, wherein the gene according to any one of ⁇ 34> to ⁇ 36> or the recombinant vector according to ⁇ 37> is introduced into a host.
  • the microorganism is a microalgae, preferably an algae belonging to the genus Nannochloropsis.
  • ⁇ 42> The transformant according to ⁇ 40> or the method for producing the same, wherein the microorganism is Escherichia coli.
  • ⁇ 43> Use of the transformant according to any one of ⁇ 38> to ⁇ 42> or a transformant obtained by the method for producing a transformant for producing a lipid.
  • ⁇ 44> The use according to ⁇ 43>, wherein the lipid comprises a fatty acid having 8 to 10 or 12 carbon atoms or an ester thereof.
  • ⁇ 45> Fatty acid in lipid produced by the transformant obtained by introducing the gene according to any one of ⁇ 34> to ⁇ 36> or the recombinant vector according to ⁇ 37> above into a host
  • ⁇ 46> A method for improving lipid productivity, wherein the gene according to any one of ⁇ 34> to ⁇ 36> or the recombinant vector according to ⁇ 37> is introduced into a host.
  • ⁇ 47> The method according to ⁇ 45> or ⁇ 46>, wherein the lipid comprises a fatty acid having 8, 8, or 12 carbon atoms or an ester thereof.
  • Productivity of fatty acids having 8, 10 or 12 carbon atoms wherein the gene according to any one of ⁇ 34> to ⁇ 36> or the recombinant vector according to ⁇ 37> is introduced into a host. How to improve.
  • Example 1 Production of lipid by E. coli introduced with a gene encoding NoTE variant (1) Acquisition of NoTE gene and construction of NoTE expression plasmid Nannochloropsis oculata NIES2145 strain (NIES National Institute for Environmental Studies (NIES)) Total RNA was obtained and reverse transcription was performed using SuperScript TM III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR (manufactured by Invitrogen) to obtain cDNA. Using this cDNA as a template, a gene fragment consisting of the nucleotide sequence of positions 262 to 864 of SEQ ID NO: 2 was obtained by PCR using the primer pair of primer numbers 5 and 6 shown in Table 1.
  • pBluescriptII SK (-) was amplified by PCR using the plasmid vector pBluescriptII SK (-) (manufactured by Stratagene) as a template and the primer pair of primer number 7 and primer number 8 shown in Table 1, and the restriction enzyme Dpn I
  • the mold was digested by treatment (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). These two fragments were purified using High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science) and then fused using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to construct NoTE expression plasmid NoTE_262. .
  • This plasmid NoTE_262 removes amino acid residues 1 to 87 from the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and upstream from the N-terminal 1st position of the LacZ protein derived from the plasmid vector pBluescriptII SK (-) It was constructed to express a protein in which the amino acid residue at position 29 was fused.
  • “NoTE — 262” is the nucleotide sequence encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence of positions 88 to 287 of SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence of positions 262 to 864 of SEQ ID NO: 2 is the plasmid.
  • NoTE variant expression plasmid PCR was performed using the above plasmid NoTE_262 as a template and any one of the primers Nos. 9 to 12 shown in Table 1 and the primer pair of No. 13, and SEQ ID No. 2 Gene fragments obtained by mutating part of the nucleotides at positions 262 to 864 of the nucleotide sequence shown in FIG. Using these gene fragments, various NoTE variant expression plasmids (NoTE_262 (G203W), NoTE_262 (V204W), NoTE_262 (G203W + V204W), NoTE_262 (G203W + V204F)) were constructed by the same method as above. did. In these plasmids, the codons at the following sites are modified with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • NoTE_262 G203W: The codon encoding glycine at position 203 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with a codon (TGG) encoding tryptophan.
  • NoTE_262 V204W: A codon encoding valine at position 204 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with a codon (TGG) encoding tryptophan.
  • NoTE_262 (G203W + V204W): Codon encoding glycine at position 203 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan (TGG), and codon encoding valine at position 204 encodes tryptophan Each is replaced by a codon (TGG).
  • NoTE_262 (G203W + V204F): Codon encoding glycine at position 203 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan (TGG), and codon encoding valine at position 204 encodes phenylalanine Each is replaced by a codon (TTT).
  • the primer pair of primer number 14 and primer number 15 shown in Table 1 the primer pair of primer number 16 and primer number 17, the primer pair of primer number 18 and primer number 19 PCR was performed using the primer pair of primer No. 20 and primer No. 21, respectively, and gene fragments obtained by mutating part of the bases at positions 262 to 864 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 were obtained.
  • NoTE_262 (WW + L143P): Codon encoding glycine at position 203 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan (TGG), and codon encoding valine at position 204 encodes tryptophan In the codon (TGG), a codon encoding leucine (L) at position 143 is replaced with a codon (CCT) encoding proline.
  • NoTE_262 (WW + G160A): Codon encoding glycine at position 203 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan (TGG), and codon encoding valine at position 204 encodes tryptophan In the codon (TGG), a codon encoding glycine at position 160 is replaced with a codon encoding alanine (GCT).
  • NoTE_262 (WW + G212P): Codon encoding glycine at position 203 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan (TGG), and codon encoding valine at position 204 encodes tryptophan In the codon (TGG), the codon encoding glycine at position 212 is substituted with the codon (CCA) encoding proline.
  • NoTE_262 (WW + N213Y):
  • the codon encoding glycine at position 203 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan (TGG), and the codon encoding valine at position 204 encodes tryptophan In the codon (TGG), the codon encoding asparagine at position 213 is replaced with the codon (TAC) encoding tyrosine.
  • PCR was performed using the plasmid NoTE_262 (WW + N213Y) as a template and the primer pair of primer number 16 and primer number 17 shown in Table 1, and nucleotides 262 to 864 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 were used.
  • a gene fragment obtained by mutating a part of was obtained.
  • a NoTE variant expression plasmid (NoTE_262 (WW + G160A + N213Y)) was constructed in the same manner as described above.
  • NoTE_262 (WW + G160A + N213Y): Codon encoding glycine at position 203 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is codon (TGG) encoding tryptophan, and codon encoding valine at position 204 is tryptophan Codon encoding (TGG), codon encoding glycine at position 160 is a codon encoding alanine (GCT), and codon encoding asparagine at position 213 is a codon encoding tyrosine (Y) (TAC). Has been replaced.
  • Nitrogen gas was blown into the resulting chloroform layer to dryness, 0.7 mL of 0.5N potassium hydroxide / methanol solution was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 1 mL of 14% boron trifluoride solution (manufactured by SIGMA) was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 1 mL each of hexane and saturated saline was added and stirred vigorously, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and the upper hexane layer was recovered to obtain a fatty acid ester.
  • ⁇ Gas chromatography conditions Capillary column: DB-1 MS (30 m ⁇ 200 ⁇ m ⁇ 0.25 ⁇ m, manufactured by J & W Scientific) Mobile phase: Flow in high-purity helium column: 1.0 mL / min Temperature rising program: 100 ° C. (1 minute) ⁇ 10 ° C./min ⁇ 300° C. (5 minutes) Equilibration time: 1 minute Inlet: Split injection (split ratio: 100: 1) Pressure: 14.49 psi, 104 mL / min Injection volume: 1 ⁇ L Washing vial: Methanol / chloroform Detector temperature: 300 ° C
  • the fatty acid ester was identified by subjecting the sample to gas chromatograph mass spectrometry analysis under the same conditions.
  • the amount of methyl ester of each fatty acid was quantified from the peak area of the waveform data obtained by gas chromatography analysis.
  • Each peak area was compared with the peak area of 7-pentadecanone, which is an internal standard, to correct between samples, and the amount of each fatty acid per liter of culture solution was calculated.
  • the sum total of each fatty acid amount was made into the total fatty acid amount, and the ratio of each fatty acid amount to the total fatty acid amount was calculated. The results are shown in Table 5.
  • Fatty acid composition (% TFA)” represents the ratio of the amount of each fatty acid to the weight of the total fatty acid.
  • C17: 0 ⁇ ” and “C19: 0 ⁇ ” represent cis-9,10-methylen-hexadecanoic acid and cis-11,12-methylen-octadecanoic acid, respectively.
  • C12: n represents the sum of C12: 1 and C12: 0 fatty acids
  • C12: n (% TFA)” represents the ratio of the amount of C12: n fatty acids to the total fatty acid weight.
  • plasmid NoTE_262 (G203W + V204W) constructed so that both amino acids at positions 203 and 204 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted with tryptophan, and positions 203 and 204 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • Transformants introduced with plasmids NoTE_262 (G203W + V204F) constructed so that the amino acids at the positions were substituted with tryptophan and phenylalanine, respectively, and transformants introduced with NoTE_262 (G203W) and NoTE_262 (V204W), respectively.
  • the content of C10 fatty acids and C12 fatty acids in the total amount of fatty acids further increased.
  • NoTE_262 (WW + L143P), NoTE_262 (WW) constructed such that amino acids at other specific positions are substituted with specific amino acids.
  • + G160A), NoTE_262 (WW + G212P), and NoTE_262 (WW + N213Y) introduced transformants, C10 fatty acids and C12 fatty acids occupying the total amount of fatty acids compared to transformants introduced NoTE_262 (G203W + V204W) The content of was further increased.
  • the C10 fatty acid and C12 occupying the total amount of fatty acids compared to the transformant strain into which NoTE_262 (WW + G160A) or NoTE (WW + N213Y) was introduced.
  • the fatty acid content was further increased.
  • Example 2 Production of lipid by Escherichia coli into which a gene encoding a NoTE variant from which the N-terminal of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was deleted was constructed (1) Construction of NoTE variant expression plasmid The plasmid NoTE_262 prepared in Example 1 And NoTE — 262 (G203W + V204W) as a template, PCR was performed using the primer pair of primer number 22 and primer number 8 shown in Table 1, and the nucleotide sequence of positions 382 to 864 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 was used. And a gene fragment obtained by mutating a part of the bases at positions 382 to 864 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 were obtained.
  • NoTE_382 is the nucleotide sequence encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence of positions 128 to 287 of SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence of positions 382 to 864 of SEQ ID NO: 2 is the plasmid.
  • the codon at the following site is modified with respect to the base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • NoTE_382 (G203W + V204W): Codon encoding glycine at position 203 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan (TGG), and codon encoding valine at position 204 encodes tryptophan Each is replaced by a codon (TGG).
  • Example 3 Manufacture of lipid by E. coli introduced with gene encoding NgTE variant (1) Acquisition of NgTE gene and construction of expression plasmid of NgTE Acyl-ACP derived from Nannochloropsis gaditana consisting of amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 A gene encoding thioesterase (NgTE gene, SEQ ID NO: 4) was obtained using a contracted synthesis service for artificial genes. Using the NgTE gene as a template, a gene fragment consisting of the nucleotide sequence from position 253 to position 825 of SEQ ID NO: 4 was obtained by PCR using the primer pair of primer number 23 and primer number 24 shown in Table 1.
  • the obtained gene fragment was fused to the pBluescriptII SK (-) vector in the same manner as in Example 1 to construct a wild type NgTE expression plasmid NgTE_253.
  • This plasmid NgTE — 253 removes the amino acid residues 1 to 84 from the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and upstream from the N-terminal 1 to the N-terminal side of the LacZ protein derived from the plasmid vector pBluescriptII SK ( ⁇ ) It was constructed to express a protein in which the amino acid residue at position 29 was fused.
  • NgTE_253 is the nucleotide sequence encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence of positions 85 to 274 of SEQ ID NO: 3, and the nucleotide sequence of positions 253 to 825 of SEQ ID NO: 4 is the plasmid.
  • NgTE variant expression plasmid PCR was performed using the plasmid NgTE_253 as a template and the primer pair of primer number 25 and primer number 26 shown in Table 1, and positions 253 to 825 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 A gene fragment obtained by mutating a part of the base at the position was obtained. Using the obtained gene fragment, an NgTE variant expression plasmid (NgTE_253 (G190W + V191W)) was constructed in the same manner as in Example 1. In the plasmid NgTE_253 (G190W + V191W), the codon at the following site is modified with respect to the base sequence of SEQ ID NO: 4.
  • NgTE_253 (G190W + V191W): The codon encoding glycine at position 190 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 encodes tryptophan and the base encoding valine at position 191 encodes tryptophan Each is replaced by a codon (TGG).
  • NgTE_253 (G190W) constructed such that the amino acids at positions 190 and 191 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 were substituted with tryptophan, compared to a transformant introduced with a wild-type NgTE_253 expression plasmid.
  • the ratio of C12 fatty acid (C12: n) in the total fatty acid amount was significantly increased.
  • Example 4 Production of Lipid by Nannochloropsis Oculata Introduced Gene Encoding NoTE Variant (1) Construction of NoTE Variant Expression Plasmid Plasmids NoTE_262, NoTE_262 (G203W + V204F), and NoTE_262 produced in Example 1 PCR is performed using (G203W + V204W) as a template and the primer pair of primer number 27 and primer number 28 shown in Table 2, and a gene fragment comprising the nucleotide sequence of positions 262 to 864 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 And a gene fragment obtained by mutating a part of the nucleotides at positions 262 to 864 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • VCP1 violaxanthin / chlorophyll a binding protein gene of Nannochloropsis sp. W2J3B strain registered in GenBank
  • VCP1 promoter sequence SEQ ID NO: 29
  • VCP1 chloroplast transition signal sequence SEQ ID NO: 30
  • VCP1 terminator sequence SEQ ID NO: 31
  • VCP1 promoter sequence a VCP1 chloroplast transition signal sequence, and a VCP1 terminator sequence.
  • PCR was performed using the plasmid vector pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.) as a template and the primer pair of primer number 38 and primer number 39 shown in Table 2 to amplify the plasmid vector pUC19.
  • the NoTE gene fragment, VCP1 promoter sequence, VCP1 chloroplast transfer signal sequence, and VCP1 terminator sequence obtained above were fused to the plasmid vector pUC19 in the same manner as in Example 1, and the NoTE expression plasmid NoTE_262_Nanno and NoTE Plasmids NoTE_262 (G203W + V204F) _Nanno and NoTE_262 (G203W + V204W) _Nanno for expression of the variant were constructed, respectively.
  • These plasmids are composed of a VUC1 promoter sequence, a VCP1 chloroplast translocation signal sequence, a NoTE gene fragment (wild type or modified type), a NoTE gene expression sequence linked in the order of a VCP1 terminator sequence, and a pUC19 vector sequence.
  • the plasmid has the base sequence of positions 262 to 864 of SEQ ID NO: 2 as the base sequence encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence of positions 88 to 287 of SEQ ID NO: 1.
  • the codon at the following site is modified with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • NoTE_262 (G203W + V204F) _Nanno Codon encoding glycine at position 203 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan-encoding codon (TGG), and codon encoding valine at position 204 encodes phenylalanine Is replaced by a codon (TTT).
  • NoTE_262 (G203W + V204W) _Nanno Codon encoding glycine at position 203 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan (TGG), and codon encoding valine at position 204 encodes tryptophan Each codon (TGG) is substituted.
  • This expression plasmid comprises a zeocin resistance gene expression sequence linked in the order of a tubulin promoter sequence, a zeocin resistance gene, a VCP1 terminator sequence, and a pUC19 vector sequence.
  • Nannochloropsis oculata strain NIES2145 obtained from National Institute for Environmental Studies (NIES)
  • NIES2145 obtained from National Institute for Environmental Studies
  • 384 mM sorbitol solution to completely remove the salt, and used as a host cell for transformation Using.
  • About 500 ng of the NoTE gene expression DNA fragment (wild type or modified type) and zeocin resistance gene expression DNA fragment amplified above are mixed with the host cell, and electroporation is performed under the conditions of 50 ⁇ F, 500 ⁇ , and 2,200 v / 2 mm. Performed.
  • the mixture was applied to a 2 ⁇ g / mL zeocin-containing f / 2 agar medium, and cultured at 25 ° C. in a 0.3% CO 2 atmosphere under 12 h / 12 h light / dark conditions for 2 to 3 weeks. From the obtained colonies, those containing a NoTE gene expression fragment were selected by the PCR method. The strains were selected, 15 times the nitrogen concentration of the f / 2 medium, medium enhanced the phosphorus concentration 5 times (hereinafter, N15P5 medium) were seeded in 20mL, 25 °C, 0.3% CO 2 atmosphere, 12h / The mixture was cultured with shaking for 12 weeks under light / dark conditions to prepare a preculture solution.
  • n represents an integer of 0 to 5.
  • C18: n the composition is C18: 0, C18: 1, C18: 2, C18: 3. Represents the sum of C18: 4 and C18: 5 fatty acids.
  • NoTE_262 (G203W + V204F) _Nanno and NoTE_262 (G203W + V204W) constructed such that at least one of the amino acids at positions 203 and 204 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with tryptophan
  • the ratio of C12: 0 fatty acid and C14: 0 fatty acid in the total fatty acid amount was significantly increased as compared with the transformant into which the NoTE_262 expression plasmid was introduced.
  • Example 5 Production of lipid by Escherichia coli introduced with gene encoding NoTE variant (1) Construction of NoTE multiple variant expression plasmid Primer numbers shown in Table 3 using plasmid NoTE_262 (V204W) prepared in Example 1 as a template 51 and primer number 52, primer number 51 and primer number 53 primer pair, primer number 54 and primer number 55 primer pair, primer number 54 and primer number 56 primer pair, primer number 54 and primer number 57 PCR was performed using the primer pair, the primer pair of primer number 54 and primer number 58, the primer pair of primer number 54 and primer number 59, and the primer pair of primer number 60 and primer number 61, respectively, and position 262 of SEQ ID NO: 2 864th base Each gene fragment was obtained by mutating a part of.
  • NoTE_262 (V204W + H146N): Codon encoding valine at position 204 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan (TGG) and codon encoding histidine at position 146 encodes asparagine Each is replaced by a codon (AAC).
  • NoTE_262 (V204W + H146S): Codon encoding valine at position 204 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan (TGG) and codon encoding histidine at position 146 encodes serine Each is replaced by a codon (TCA).
  • NoTE_262 (V204W + M202F): Codon encoding valine at position 204 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is codon (TGG) encoding tryptophan, and codon encoding methionine at position 202 is phenylalanine (F) Is replaced with a codon (TTC) coding for.
  • NoTE_262 (V204W + M202H): Codon encoding valine at position 204 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan (TGG), and codon encoding methionine at position 202 encodes histidine Each is replaced with a codon (CAT).
  • NoTE_262 (V204W + M202L): The codon encoding valine at position 204 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan (TGG), and the codon encoding methionine at position 202 encodes leucine Each is replaced by a codon (CTA).
  • NoTE_262 (V204W + M202Q): Codon encoding valine at position 204 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan (TGG), and codon encoding methionine at position 202 encodes glutamine Each is replaced by a codon (CAA).
  • NoTE_262 (V204W + M202V): Codon encoding valine at position 204 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan (TGG) and codon encoding methionine at position 202 encodes valine Each is replaced with a codon (GTA).
  • NoTE_262 (V204W + P281Q): Codon encoding valine at position 204 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes tryptophan-encoding codon (TGG), and codon encoding proline at position 281 encodes glutamine Each is replaced by a codon (CAG).
  • NoTE_262 V204W + P281Q
  • PCR was performed using the primer pair of primer number 54 and primer number 56 shown in Table 3, and a part of bases at positions 262 to 864 of SEQ ID NO: 2 A gene fragment mutated was obtained.
  • a NoTE variant expression plasmid NoTE_262 (V204W + M202H + P281Q)
  • the codon at the following site is modified with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • NoTE_262 (V204W + M202H + P281Q): A codon encoding valine at position 204 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a codon (TGG) encoding tryptophan, and a codon encoding methionine at position 202 is histidine. In the coding codon (CAT), the codon coding for proline at position 281 is replaced with the codon coding for glutamine (CAG).
  • the proportion of C12 fatty acid in the total fatty acid amount of each mutant was significantly increased as compared with the transformant introduced with the plasmid NoTE_262.
  • the transformant into which the plasmid NoTE_262 (V204W + H146N) and the plasmid NoTE_262 (V204W + H146S) were constructed so that the amino acid at position 146 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was substituted In addition, it was confirmed that C8 fatty acid production was hardly confirmed in the transformants into which NoTE_262 (V204W) was introduced.
  • Example 6 Production of Lipid by Nannochloropsis Oculata Introduced Gene Encoding NoTE Variant
  • the pUC19 vector containing the VCP1 promoter sequence, VCP1 chloroplast transfer signal sequence, and VCP1 terminator sequence prepared in Example 4 was used as a template, and the primer pair of primer number 32 shown in Table 2 and primer number 62 shown in Table 3 was used. PCR was performed to amplify the NoTE expression cassette (fragment consisting of VCP1 promoter sequence, VCP1 chloroplast transition signal sequence, wild type or modified NoTE sequence, VCP1 terminator sequence).
  • zeocin resistance gene expression plasmid prepared in Example 4 as a template
  • PCR was performed using the primer pair of primer number 39 shown in Table 2 and primer number 63 shown in Table 3, and a zeocin resistance gene expression cassette (tube)
  • a fragment consisting of a phosphorus promoter sequence, a zeocin resistance gene, a VCP1 terminator sequence) and a pUC19 sequence was amplified.
  • NoTE expression cassette, a zeocin resistance gene expression cassette and a pUC19 sequence fragment were fused in the same manner as in Example 1, and a drug resistance linked NoTE expression plasmid (NoTE expression cassette and zeocin resistance gene expression cassette linked) NoTE_262_Nanno (zeo), NoTE_262 (G203W) _Nanno (zeo), NoTE_262 (V204W) _Nanno (zeo), and NoTE_262 (G203W + V204W) _Nanno (zeo)) were constructed.
  • the codon at the following site is modified with respect to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • NoTE_262 (G203W) _Nanno (zeo) constructed such that the glycine at position 203 of amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with tryptophan, and constructed so that the valine at position 204 is replaced with tryptophan.
  • NoTE_262 (V203W) _Nanno (zeo) NoTE_262 was introduced in each transformant introduced with NoTE_262 (G203W + V204W) _Nanno (zeo) constructed so that both amino acids at positions 203 and 204 were replaced with tryptophan
  • the content of C10 fatty acid, C12 fatty acid, and C14 fatty acid in the total fatty acid amount was significantly increased.
  • Example 7 Production of lipid by Escherichia coli introduced with a gene encoding NoTE variant with altered N-terminal length
  • Construction of NoTE variant expression plasmid with altered N-terminal length Nannochloropsis Using the cDNA of Oculata NIES2145 as a template, PCR was performed using any one of the primer numbers 64 to 69 shown in Table 4 and the primer number 22 shown in Table 1 and the primer pair of primer number 6 shown in Table 1.
  • NoTE expression plasmids NoTE_1, NoTE_172, NoTE_232, NoTE_292, NoTE_322, NoTE_352, NoTE_382 with different N-terminal lengths were constructed in the same manner as in Example 1.
  • “NoTE_1”, “NoTE_172”, “NoTE_232”, “NoTE_292”, “NoTE_322”, “NoTE_352”, and “NoTE_382” are positions 1 to 287 and 57 to 287 of SEQ ID NO: 1, respectively.
  • nucleotide sequences encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of positions 127-287, positions 1-864 of SEQ ID NO: 2, This means that the plasmid has the nucleotide sequence at positions 172 to 864, 232 to 864, 292 to 864, 322 to 864, 352 to 864, and 382 to 864.
  • a transformant in which the productivity of a fatty acid having a specific carbon number is improved can be produced by introducing a gene encoding a protein defined in the present invention into a host. And the productivity of a specific fatty acid can be improved by culturing this transformant.

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Abstract

　宿主に下記（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体を培養して脂質を生産させる、脂質の製造方法。 （Ａ）配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列において、２０３位のグリシン及び２０４位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。 （Ｂ）配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。 （Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。

Description

脂質の製造方法
　本発明は、脂質の製造方法に関する。また、本発明は当該方法に用いるアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ改変体、これをコードする遺伝子、及び当該遺伝子を導入した形質転換体に関する。
　脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
　例えば、炭素数１２～１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤又は殺菌剤に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体であるアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤に日常的に利用されている。さらに、炭素数１８前後の高級アルコールは植物の成長促進剤としても有用である。
　このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたり、そのため植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素数に依存するため、脂肪酸の炭素数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。例えば、ゲッケイジュ（Umbellularia　californica（California　bay））由来のアシル－ＡＣＰ（アシルキャリヤープロテイン）チオエステラーゼの導入により炭素数１２の脂肪酸を蓄積させる方法（特許文献１、非特許文献１）等が提案されている。
　近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しない。そのため藻類は、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。
　藻類の脂質合成メカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。例えば、上述のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼについても、現在のところ、藻類由来のものはほとんど報告されておらず、珪藻網等でわずかに報告例があるのみである（例えば、非特許文献２）。
国際公開第９２／２０２３６号パンフレット
Voelker　TA，et　al.，Science，1992，vol．257(5066)，p．72-74 Yangmin　Gong，et　al.，Journal　of　Basic　Microbiology，2011，vol．51，p．666-672
　本発明は、宿主に下記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体を培養して脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
（Ａ）配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列において、２０３位のグリシン及び２０４位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
　また、本発明は、前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）に関する。
　また、本発明は、前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子に関する。
　また、本発明は、宿主に前記遺伝子を導入して得られた形質転換体に関する。
ナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis　oculata）由来のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、「NoTE」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号１）、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis　gaditana）由来のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、「NgTE」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号３）、及びナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis　granulata）由来のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、「NgrTE」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号４９）を比較した図である。
　本発明は、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類由来の野生型アシル－ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列を改変した、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ改変体、及びこれを用いた脂質の製造方法を提供する。また、本発明は、前記アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を提供する。また、本発明は、当該遺伝子を導入し、生産される脂質の脂肪酸組成を変化させた形質転換体を提供する。
　本発明者らは、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼについて研究を行い、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来の野生型アシル－ＡＣＰチオエステラーゼを取得し、このアミノ酸配列に変異を導入して、複数のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ改変体を得た。そして、これらを用いて形質転換を行った結果、いくつかの形質転換体において、野生型アシル－ＡＣＰチオエステラーゼを導入した形質転換体と比較して、脂質中の総脂肪酸成分における特定の炭素数の脂肪酸の含有率が有意に向上することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
　本発明の形質転換体は、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来の野生型アシル－ＡＣＰチオエステラーゼを導入した形質転換体に比べ、特定の炭素数の脂肪酸の生産能に優れる。当該形質転換体を用いた本発明の脂質の製造方法は、特定の炭素数の脂肪酸及びこれらを構成成分とする脂質の生産性に特に優れる。本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ改変体、これをコードする遺伝子、形質転換体、及び脂質の製造方法は、特定の炭素数の脂肪酸及び脂質の工業的生産に好適に用いることができる。
　本明細書における「脂質」には、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質が含まれ、具体的には、脂肪酸、脂肪族アルコール類、炭化水素類（アルカン等）、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等が含まれる。
　また本明細書において、脂肪酸や脂肪酸を構成するアシル基の表記で「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数ｘで二重結合の数がｙの脂肪酸やアシル基を表す。また、「Ｃｘ脂肪酸」や「Ｃｘアシル」はそれぞれ、炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
　以下本明細書において、「アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ」を単に「TE」ともいい、TEをコードする遺伝子を「アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子」又は「TE遺伝子」ともいう。
　以下、本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ改変体、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子及びこれを用いた形質転換体、並びに脂質の製造方法について順に説明する。
１．アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ改変体
　本発明のタンパク質（以下、「アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ改変体」又は「TE改変体」ともいう）は、配列番号１に示すアミノ酸配列の一部が改変され、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性（以下、「TE活性」ともいう）を有するタンパク質、及び当該タンパク質と機能的に均等なタンパク質である。
　アシル－ＡＣＰチオエステラーゼは、脂肪酸やその誘導体（トリアシルグリセロール（トリグリセリド）等）の生合成系に関与する酵素である。当該酵素は、植物体や藻類では葉緑体等の色素体内において、細菌・真菌や動物体では細胞質内において、脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル－ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリヤープロテインとからなる複合体）のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する。TEの作用によって、ＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。TEには、基質であるアシル－ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のTEが存在していることが知られている。よってTEは、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
　本明細書で記載する「アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性」とは、アシル－ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
　本発明のTE改変体として、具体的には以下のタンパク質（Ａ）～（Ｃ）が挙げられる。
 
（Ａ）配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列において、２０３位のグリシン及び２０４位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつTE活性を有するタンパク質。
　配列番号１は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のTE（NoTE）のアミノ酸配列である。
　本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列中、１２８位～２８７位の領域がTEとして機能するために重要で、TE活性を示すために十分な領域であることを見出した。すなわち、配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列からなるタンパク質は、TE活性を有する。
　前記タンパク質（Ａ）は、このTE活性にとって十分な領域を有し、TEとして機能する。
　前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列は、TE活性にとって十分な領域である配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列を基本とし、さらに当該配列中の特定の位置のアミノ酸が置換されている。配列番号１において後述する位置のアミノ酸を置換したTE改変体では、特定の炭素数のアシル－ＡＣＰ、特にＣ８アシル－ＡＣＰ、Ｃ１０アシル－ＡＣＰ、及びＣ１２アシル－ＡＣＰからなる群より選ばれる少なくとも１種のアシル－ＡＣＰ、に対する特異性が向上する。すなわち、本発明のTE改変体は、野生型TEと比べて、基質として特定の炭素数のアシル－ＡＣＰ（具体的には、Ｃ８アシル－ＡＣＰ、Ｃ１０アシル－ＡＣＰ、及びＣ１２アシル－ＡＣＰからなる群より選ばれる少なくとも１種のアシル－ＡＣＰ）を選択的に利用し、これを加水分解する活性が向上する。
　前記タンパク質（Ａ）において、配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列中、２０３位と２０４位のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されている。配列番号１に示す野生型TEでは、２０３位のアミノ酸はグリシン、２０４位のアミノ酸はバリンである。
　特定の炭素数のアシル－ＡＣＰ、特にＣ８アシル－ＡＣＰ、Ｃ１０アシル－ＡＣＰ、及びＣ１２アシル－ＡＣＰからなる群より選ばれる少なくとも１種のアシル－ＡＣＰ、への特異性を向上させる観点から、前記タンパク質（Ａ）において、配列番号１の２０３位のグリシンがトリプトファンに置換され、２０４位のバリンがトリプトファン又はフェニルアラニンに置換されていることが好ましく、配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリンがそれぞれトリプトファンに置換されていることがより好ましい。
　本明細書においては、特定のアミノ酸置換を有するTE改変体を以下のように略記することがある。
NoTE(G203W)：配列番号１の２０３位のグリシン（Gly；Ｇ）がトリプトファン（Trp；Ｗ）に置換された、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のTE改変体。
NoTE(G203W+V204F)：配列番号１の２０３位のグリシン（Gly；Ｇ）がトリプトファン（Trp；Ｗ）に、２０４位のバリン（Val；Ｖ）がフェニルアラニン（Phe；Ｆ）置換された、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のTE改変体。
　さらに前記タンパク質（Ａ）は、配列番号１の２０３位及び２０４位以外の位置にアミノ酸置換を有していてもよい。例えば、特定の炭素数のアシル－ＡＣＰへの特異性を向上させる観点から、前記タンパク質（Ａ）は、下記（Ｃａ－１）～（Ｃｇ－１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに有することが好ましい。
 
（Ｃａ－１）配列番号１の１４３位のロイシン（Leu；Ｌ）をプロリン（Pro；Ｐ）に置換。
（Ｃｂ－１）配列番号１の１４６位のヒスチジン（His；Ｈ）をアスパラギン（Asn；Ｎ）又はセリン（Ser；Ｓ）に置換。
（Ｃｃ－１）配列番号１の１６０位のグリシン（Gly；Ｇ）をアラニン（Ala；Ａ）に置換。
（Ｃｄ－１）配列番号１の２０２位のメチオニン（Met；Ｍ）をフェニルアラニン（Phe；Ｆ）、ヒスチジン（His；Ｈ）、ロイシン（Leu；Ｌ）、グルタミン（Gln；Ｑ）、又はバリン（Val；Ｖ）に置換。
（Ｃｅ－１）配列番号１の２１２位のグリシン（Gly；Ｇ）をプロリン（Pro；Ｐ）に置換。
（Ｃｆ－１）配列番号１の２１３位のアスパラギン（Asn；Ｎ）をチロシン（Tyr；Ｙ）に置換。
（Ｃｇ－１）配列番号１の２８１位のプロリン（Pro；Ｐ）をグルタミン（Gln；Ｑ）に置換。
　前記タンパク質（Ａ）は、配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリンがそれぞれトリプトファンに置換され、さらに前記（Ｃａ－１）～（Ｃｇ－１）からなる群より選ばれる１つ又は２つのアミノ酸置換を有することがより好ましい。あるいは、前記タンパク質（Ａ）は、配列番号１の２０４位のバリンがトリプトファンに置換され、さらに前記（Ｃａ－１）～（Ｃｇ－１）からなる群より選ばれる１つ又は２つのアミノ酸置換を有することがより好ましい。
　前記タンパク質（Ｂ）は、配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を基本とし、かつ、TE活性を有する。
　一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにTE活性が保持され、かつ配列番号１で示すアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
　本明細書において、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（homology　search）プログラムを用いて、Unit　size　to　compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
　さらに、前記タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列中に、前記タンパク質（Ａ）におけるアミノ酸置換と同様のアミノ酸置換を有している。すなわち、前記タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列では、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸置換を有している。
　上述した前記タンパク質（Ａ）と同様、前記タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列も、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに置換され、２０４位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファン又はフェニルアラニンに置換されていることが好ましく、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸がそれぞれトリプトファンに置換されていることがより好ましい。
　さらに、前記タンパク質（Ｂ）は、配列番号１の２０３位及び２０４位に相当する位置以外の位置にアミノ酸置換を有していてもよい。例えば前記タンパク質（Ｂ）は、下記（Ｃａ－２）～（Ｃｇ－２）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに有することが好ましい。
 
（Ｃａ－２）配列番号１の１４３位に相当する位置のアミノ酸をプロリンに置換。
（Ｃｂ－２）配列番号１の１４６位に相当する位置のアミノ酸をアスパラギン又はセリンに置換。
（Ｃｃ－２）配列番号１の１６０位に相当する位置のアミノ酸をアラニンに置換。
（Ｃｄ－２）配列番号１の２０２位に相当する位置のアミノ酸をフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンに置換。
（Ｃｅ－２）配列番号１の２１２位に相当する位置のアミノ酸をプロリンに置換。
（Ｃｆ－２）配列番号１の２１３位に相当する位置のアミノ酸をチロシンに置換。
（Ｃｇ－２）配列番号１の２８１位に相当する位置のアミノ酸をグルタミンに置換。
　前記タンパク質（Ｂ）は、配列番号１の２０３位及び２０４位に相当する位置のアミノ酸がそれぞれトリプトファンに置換され、さらに前記（Ｃａ－２）～（Ｃｇ－２）からなる群より選ばれる１つ又は２つのアミノ酸置換を有することがより好ましい。あるいは、前記タンパク質（Ｂ）は、配列番号１の２０４位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに置換され、さらに前記（Ｃａ－２）～（Ｃｇ－２）からなる群より選ばれる１つ又は２つのアミノ酸置換を有することがより好ましい。
　本明細書で記載する、アミノ酸配列又は塩基配列における「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的アミノ酸配列を参照配列と比較し、各アミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のLipman-Pearson法等に基づいて手作業で行うこともできるし、Clustal　Wマルチプルアラインメントプログラム（Thompson，J．D．et　al，Nucleic　Acids　Res.，1994，vol．22，p．4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うこともできる。Clustal　Wは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European　Bioinformatics　Institute：EBI，[www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ，[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
　配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列として、配列番号３の１１５位～２７４位のアミノ酸配列、及び配列番号４９の１２６位～２８５位のアミノ酸配列が挙げられる。配列番号３は、ナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来のTE（NgTE）である。配列番号４９は、ナンノクロロプシス・グラニュラータNIES2588株由来のTE（NgrTE）である。
　なお、配列番号１，３，４９に示したアミノ酸配列又はその部分配列からなるタンパク質を「野生型TE」といい、野生型TEのアミノ酸配列が一部変異したアミノ酸配列からなるタンパク質を「TE改変体」という。
　図１に示すように、配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列、配列番号３の１１５位～２７４位のアミノ酸配列、及び配列番号４９の１２６位～２８５位のアミノ酸配列は、互いに高い同一性を有する。配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列と配列番号３の１１５位～２７４位のアミノ酸配列との同一性は約９１％である。また、配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列と配列番号４９の１２６位～２８５位のアミノ酸配列との同一性は約９８％である。
　配列番号１と同様、配列番号３のアミノ酸配列における１１５位～２７４位の領域、及び配列番号４９のアミノ酸配列における１２６位～２８５位の領域も、TEとして機能するために重要で、TE活性を示すために十分な領域であることが、本発明者らによって確認されている。したがって、配列番号３の１１５位～２７４位のアミノ酸配列からなるタンパク質、及び配列番号４９の１２６位～２８５位のアミノ酸配列からなるタンパク質も、TE活性を有する。
　前記タンパク質（Ｂ）としては、下記タンパク質（Ｂａ）又は（Ｂｂ）が好ましい。
 
（Ｂａ）配列番号３の１１５位～２７４位のアミノ酸配列において、配列番号３の１９０位のグリシン及び１９１位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質。
（Ｂｂ）配列番号４９の１２６位～２８５位のアミノ酸配列において、配列番号４９の２０１位のグリシン及び２０２位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質。
　図１に示すように、配列番号１の２０３位のグリシン、２０４位のバリン、１４３位のロイシン、１４６位のヒスチジン、１６０位のグリシン、２０２位のメチオニン、２１２位のグリシン、２１３位のアスパラギン、２８１位のプロリンはそれぞれ、配列番号３の１９０位のグリシン、１９１位のバリン、１３０位のロイシン、１３３位のヒスチジン、１４７位のグリシン、１８９位のメチオニン、１９９位のグリシン、２００位のアスパラギン、２６８位のプロリンに相当する。
　また、配列番号１の２０３位のグリシン、２０４位のバリン、１４３位のロイシン、１４６位のヒスチジン、１６０位のグリシン、２０２位のメチオニン、２１２位のグリシン、２１３位のアスパラギン、２８１位のプロリンはそれぞれ、配列番号４９の２０１位のグリシン、２０２位のバリン、１４１位のロイシン、１４４位のヒスチジン、１５８位のグリシン、２００位のメチオニン、２１０位のグリシン、２１１位のアスパラギン、２７９位のプロリンに相当する。
　前記タンパク質（Ｂａ）及び（Ｂｂ）のアミノ酸配列においても、これらのアミノ酸が前記タンパク質（Ａ）と同様に置換されていることが好ましい。
　前記タンパク質（Ｂａ）は、前記タンパク質（Ａ）と同様、特定の炭素数のアシル－ＡＣＰへの特異性が向上する。前記タンパク質（Ｂａ）のアミノ酸配列は、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と９０％程度の同一性を有する。このことから、前記タンパク質（Ｂ）において、配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列に対する同一性は、８６％以上であることが好ましく、８８％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。
　また、前記タンパク質（Ｂ）において、配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列、配列番号３の１１５位～２７４位のアミノ酸配列、又は配列番号４９の１２６位～２８５位のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１～８個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、よりさらに好ましくは１～３個、よりさらに好ましくは１～２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列も好ましい。
　なお、アミノ酸配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法については、後述する。
　前記タンパク質（Ｃ）は、そのアミノ酸配列の一部として前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を含んでおり、かつTE活性を示す。
　前記タンパク質（Ｃ）を構成するアミノ酸配列中、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列以外の配列としては、例えば、配列番号１の１２８位～２８７位以外の任意のアミノ酸配列、配列番号３の１１５位～２７４位以外の任意のアミノ酸配列、配列番号４９の１２６位～２８５位以外の任意のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１以上２０個以下、より好ましくは１以上１５個以下、さらに好ましくは１以上１０個以下、よりさらに好ましくは１以上５個以下、よりさらに好ましくは１以上３個以下）の変異が導入されたアミノ酸配列、等が挙げられる。変異としては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。これらの配列は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列のＮ末端側に付加されることが好ましい。
　また、前記タンパク質（Ｃ）として、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列に、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も好ましい。シグナルペプチドの付加の例としては、葉緑体移行シグナルペプチドのＮ末端への付加等が挙げられる。
　前記タンパク質（Ｃ）として好ましくは、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号１の１位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の４９位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の５８位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の７８位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の８７位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の８８位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の９８位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の１０８位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の１１８位～１２７位のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸変異（アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加）が導入されたアミノ酸配列、が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。なお、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の４９位～２８７位、５８位～２８７位、７８位～２８７位、８７位～２８７位、８８位～２８７位、９８位～２８７位、１０８位～２８７位、若しくは１１８位～２８７位のアミノ酸配列からなるタンパク質が、TE活性を有することは本発明者らにより確認されている。
　また、前記タンパク質（Ｃ）として好ましくは、前記タンパク質（Ｂａ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号３の３６位～１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の４５位～１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の５５位～１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の６５位～１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の７５位～１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の８５位～１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の９５位～１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の１０５位～１１４位のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸変異（アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加）が導入されたアミノ酸配列、が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。なお、配列番号３の３６位～２７４位、４５位～２７４位、５５位～２７４位、６５位～２７４位、７５位～２７４位、８５位～２７４位、９５位～２７４位、若しくは１０５位～２７４位のアミノ酸配列からなるタンパク質が、TE活性を有することは本発明者らにより確認されている。
　また、前記タンパク質（Ｃ）として好ましくは、前記タンパク質（Ｂｂ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号４９の１位～１２５位のアミノ酸配列、配列番号４９の３５位～１２５位のアミノ酸配列、配列番号４９の５５位～１２５位のアミノ酸配列、配列番号４９の８５位～１２５位のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸変異（アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加）が導入されたアミノ酸配列、が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。なお、配列番号４９のアミノ酸配列、又は配列番号４９の３５位～２８５位、５５位～２８５位、若しくは８５位～２８５位のアミノ酸配列からなるタンパク質が、TE活性を有することは本発明者らにより確認されている。
　また、前記タンパク質（Ｃ）として好ましくは、配列番号１、３又は４９に示すアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質である。
　さらに、前記タンパク質（Ｃ）として、配列番号１、３又は４９に示すアミノ酸配列において、前述のアミノ酸置換を有し、配列番号１の１～１２７位、配列番号３の１～１１４位、又は配列番号４９の１～１２５位の任意の位置でＮ末端側が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
　本発明のTE改変体がTE活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にTE遺伝子を連結した融合遺伝子を脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したTE遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。この場合、総脂肪酸量に占める特定の炭素数の脂肪酸の割合を、野生型TEを発現させた系と比較することで、TE改変体で特定の炭素数のアシル－ＡＣＰに対する特異性の変化を確認できる。
　また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にTE遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入したTE遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan　L．et　al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1995，vol．92(23)，p．10639-10643）によって調製した各種アシル－ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、TE活性を測定することができる。
　本発明のタンパク質の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的手法又は遺伝子工学的手法等により得ることができる。また、化学合成によりタンパク質合成を行ってもよく、遺伝子組み換え技術により組換えタンパク質を作製してもよい。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータからクローニングによって取得したTE遺伝子を遺伝子組み換え技術により改変したものを用いることで、TE改変体を得ることができる。
　また、ナンノクロロプシス・オキュラータ等のナンノクロロプシス属に属する藻類は、The　culture　collection　of　algae　at　University　of　Texas　at　Austin　(UTEX)、独立行政法人国立環境研究所(NIES)、National　Center　for　Marine　Algae　and　Microbiota　(NCMA：旧CCMP)、Culture　Collection　of　Algae　and　Protozoa　(CCAP)、Australian　National　Algae　Culture　Collection（CSIRO）等から入手できる。
２．アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子
　本発明の遺伝子は、前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子である。
　配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の例として、配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。配列番号２に示す塩基配列は、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来の野生型TEをコードする遺伝子の塩基配列である。配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列は、配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列をコードする。
　配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の例として、配列番号４に示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。配列番号４に示す塩基配列は、ナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来の野生型TEをコードする遺伝子の塩基配列である。配列番号４の３４３位～８２５位の塩基配列は、配列番号３の１１５位～２７４位のアミノ酸配列をコードする。配列番号４の３４３位～８２５位までの塩基配列は、配列番号２の３８２位～８６４位までの塩基配列と約７６％の同一性を有する。
　配列番号４９に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の例として、配列番号５０に示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。配列番号５０に示す塩基配列は、ナンノクロロプシス・グラニュラータNIES2588株由来の野生型TEをコードする遺伝子の塩基配列である。配列番号５０の３７６位～８５８位の塩基配列は、配列番号４９の１２６位～２８５位のアミノ酸配列をコードする。配列番号５０の３７６位～８５８位の塩基配列は、配列番号２の３８２位～８６４位までの塩基配列と約９３％の同一性を有する。
　前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子の具体例として、下記ＤＮＡ（Ａ１）～（Ｃ１）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。しかし、本発明はこれらに限定されるものではない。
 
（Ａ１）配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列において、６０７位～６０９位の塩基及び６１０位～６１２位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ１）配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列において、配列番号２の６０７位～６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位～６１２位に相当する位置の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ１）前記ＤＮＡ（Ａ１）又は（Ｂ１）の塩基配列を有し、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　前記ＤＮＡ（Ａ１）からなる遺伝子は、前記タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子である。
　前記ＤＮＡ（Ａ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６０７位～６０９位の塩基（コドン）がトリプトファンをコードする塩基に置換され、６１０位～６１２位の塩基がトリプトファンをコードする塩基又はフェニルアラニンをコードする塩基に置換されていることが好ましく、配列番号２の６０７位～６０９位の塩基及び６１０位～６１２位の塩基がそれぞれトリプトファンをコードする塩基に置換されていることがより好ましい。
　さらに、前記ＤＮＡ（Ａ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６０７位～６０９位の塩基及び６１０位～６１２位以外の位置に塩基置換を有していてもよい。例えば、前記ＤＮＡ（Ａ１）は、下記（Ｃ１ａ－１）～（Ｃ１ｇ－１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換をさらに有することが好ましい。
 
（Ｃ１ａ－１）配列番号２の４２７位～４２９位の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｂ－１）配列番号２の４３６位～４３８位の塩基がアスパラギン又はセリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｃ－１）配列番号２の４７８位～４８０位の塩基がアラニンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｄ－１）配列番号２の６０４位～６０６位の塩基がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｅ－１）配列番号２の６３４位～６３６位の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｆ－１）配列番号２の６３７位～６３９位の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｇ－１）配列番号２の８４１位～８４３位の塩基がグルタミンをコードする塩基に置換。
　前記ＤＮＡ（Ａ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６０７位～６０９位の塩基及び６１０位～６１２位の塩基がそれぞれトリプトファンをコードする塩基に置換され、さらに前記（Ｃ１ａ－１）～（Ｃ１ｇ－１）からなる群より選ばれる１つ又は２つの塩基置換を有することがより好ましい。あるいは、前記ＤＮＡ（Ａ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６１０位～６１２位の塩基がトリプトファンをコードする塩基に置換され、さらに前記（Ｃ１ａ－１）～（Ｃ１ｇ－１）からなる群より選ばれる１つ又は２つの塩基置換を有することがより好ましい。
　前記ＤＮＡ（Ｂ１）からなる遺伝子は、前記タンパク質（Ｂ）が有するアミノ酸置換に相当する塩基置換を有する遺伝子である。
　前記ＤＮＡ（Ｂ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６０７位～６０９位に相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に置換され、６１０位～６１２位に相当する位置の塩基がトリプトファン又はフェニルアラニンをコードする塩基に置換されていることが好ましく、配列番号２の６０７位～６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位～６１２位に相当する位置の塩基がそれぞれトリプトファンをコードする塩基に置換されていることがより好ましい。
　さらに、前記ＤＮＡ（Ｂ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６０７位～６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位～６１２位に相当する位置以外の位置に塩基置換を有していてもよい。例えば、前記ＤＮＡ（Ｂ１）は、下記（Ｃ１ａ－２）～（Ｃ１ｇ－２）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換をさらに有することが好ましい。
 
（Ｃ１ａ－２）配列番号２の４２７位～４２９位に相当する位置の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｂ－２）配列番号２の４３６位～４３８位に相当する位置の塩基がアスパラギン又はセリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｃ－２）配列番号２の４７８位～４８０位に相当する位置の塩基がアラニンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｄ－２）配列番号２の６０４位～６０６位に相当する位置の塩基がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｅ－２）配列番号２の６３４位～６３６位に相当する位置の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｆ－２）配列番号２の６３７位～６３９位に相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｇ－２）配列番号２の８４１位～８４３位に相当する位置の塩基がグルタミンをコードする塩基に置換。
　前記ＤＮＡ（Ｂ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６０７位～６０９位の塩基及び６１０位～６１２位の塩基に相当する位置がそれぞれトリプトファンをコードする塩基に置換され、さらに前記（Ｃ１ａ－２）～（Ｃ１ｇ－２）からなる群より選ばれる１つ又は２つの塩基置換を有することがより好ましい。あるいは、前記ＤＮＡ（Ｂ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６１０位～６１２位に相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に置換され、さらに前記（Ｃ１ａ－２）～（Ｃ１ｇ－２）からなる群より選ばれる１つ又は２つの塩基置換を有することがより好ましい。
　前記ＤＮＡ（Ｂ１）からなる遺伝子としては、下記ＤＮＡ（Ｂ１ａ）又は（Ｂ１ｂ）からなる遺伝子が好ましい。
 
（Ｂ１ａ）配列番号４の３４３位～８２５位の塩基配列において、５６８位～５７０位の塩基及び５７１位～５７３位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ１ｂ）配列番号５０の３７６位～８５８位の塩基配列において、６０１位～６０３位の塩基及び６０４位～６０６位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　配列番号２の６０７位～６０９位の塩基、６１０位～６１２位の塩基、４２７位～４２９位の塩基、４３６位～４３８位の塩基、４７８位～４８０位の塩基、６０４位～６０６位の塩基、６３４位～６３６位の塩基、６３７位～６３９位、８４１位～８４３位の塩基の塩基はそれぞれ、配列番号４の５６８位～５７０位の塩基、５７１位～５７３位の塩基、３８８位～３９０位の塩基、３９７位～３９９位の塩基、４３９位～４４１位の塩基、５６５位～５６７位の塩基、５９５位～５９７位の塩基、５９８位～６００位の塩基、８０２位～８０４位の塩基に相当する。
　また、配列番号２の６０７位～６０９位の塩基、６１０位～６１２位の塩基、４２７位～４２９位の塩基、４３６位～４３８位の塩基、４７８位～４８０位の塩基、６０４位～６０６位の塩基、６３４位～６３６位の塩基、６３７位～６３９位、８４１位～８４３位の塩基の塩基はそれぞれ、配列番号５０の６０１位～６０３位の塩基、６０４位～６０６位の塩基、４２１位～４２３位の塩基、４３０位～４３２位の塩基、４７２位～４７４位の塩基、５９８位～６００位の塩基、６２８位～６３０位の塩基、６３１位～６３３位の塩基、８３５位～８３７位の塩基に相当する。
　前記ＤＮＡ（Ｂ１ａ）及び（Ｂ１ｂ）の塩基配列においても、これらの塩基が前記ＤＮＡ（Ａ１）の塩基配列と同様に置換されていることが好ましい。
　前記ＤＮＡ（Ｂ１）において、配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列に対する同一性は、７２％以上が好ましく、７４％以上がより好ましく、７６％以上がさらに好ましい。
　また、前記ＤＮＡ（Ｂ１）において、配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列は、配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列、配列番号４の３４３位～８２５位の塩基配列、又は配列番号５０の３７６位～８５８位の塩基配列において１又は数個（好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列も好ましい。
　塩基配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing　overlap　extension（SOE）PCRを利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed　Mutagenesis　System　Mutan-SuperExpress　Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer　TM　Site-Directed　Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis　Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
　前記ＤＮＡ（Ｃ１）は、その塩基配列の一部として前記ＤＮＡ（Ａ１）又は（Ｂ１）の塩基配列を含む。
　前記ＤＮＡ（Ｃ１）の塩基配列中、前記ＤＮＡ（Ａ１）又は（Ｂ１）の塩基配列以外の塩基配列としては、例えば、配列番号２の３８２位～８６４位以外の任意の塩基配列、配列番号４の３４３位～８２５位以外の任意の塩基配列、配列番号５０の３７６位～８５８位以外の任意の塩基配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１以上２０個以下、より好ましくは１以上１５個以下、さらに好ましくは１以上１０個以下、よりさらに好ましくは１以上５個以下、さらに好ましくは１以上３個以下）の変異が導入された塩基配列、等が挙げられる。変異としては、塩基の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。これらの配列は、前記ＤＮＡ（Ａ１）又は（Ｂ１）の塩基配列の5’末端側に付加されることが好ましい。
　また、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドをコードする塩基配列も好ましい。シグナルペプチドとしては、前記タンパク質（Ｃ）で述べたものが挙げられる。シグナルペプチドをコードする塩基配列は、前記ＤＮＡ（Ａ１）又は（Ｂ１）の塩基配列の5'末端側に付加されることが好ましい。
　前記ＤＮＡ（Ｃ１）の塩基配列として好ましくは、前記ＤＮＡ（Ａ１）の塩基配列の5'末端側に、配列番号２の１位～３８１位の塩基配列、配列番号２の１４５位～３８１位の塩基配列、配列番号２の１７２位～３８１位の塩基配列、配列番号２の２３２位～３８１位の塩基配列、配列番号２の２５９位～３８１位の塩基配列、配列番号２の２６２位～３８１位の塩基配列、配列番号２の２９２位～３８１位の塩基配列、配列番号２の３２２位～３８１位の塩基配列、配列番号２の３５２位～３８１位の塩基配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下）の塩基変異（塩基の欠失、置換、挿入又は付加）が導入された塩基配列、が付加された塩基配列である。なお、配列番号２の塩基配列、又は配列番号２の１４５位～８６４位、１７２位～８６４位、２３２位～８６４位、２５９位～８６４位、２６２位～８６４位、２９２位～８６４位、３２２位～８６４位、若しくは３５２位～８６４位の塩基配列がコードするタンパク質が、TE活性を有することは本発明者らにより確認されている。
　また、前記ＤＮＡ（Ｃ１）の塩基配列として好ましくは、前記ＤＮＡ（Ｂ１ａ）の塩基配列の5'末端側に、配列番号４の１０６位～３４２位の塩基配列、配列番号４の１３３位～３４２位の塩基配列、配列番号４の１６３位～３４２位の塩基配列、配列番号４の１９３位～３４２位の塩基配列、配列番号４の２２３位～３４２位の塩基配列、配列番号４の２５３位～３４２位の塩基配列、配列番号４の２８３位～３４２位の塩基配列、配列番号４の３１３位～３４２位の塩基配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下）の塩基変異（塩基の欠失、置換、挿入又は付加）が導入された塩基配列、が付加された塩基配列である。なお、配列番号４の１０６位～８２５位、１３３位～８２５位、１６３位～８２５位、１９３位～８２５位、２２３位～８２５位、２５３位～８２５位、２８３位～８２５位、若しくは３１３位～８２５位の塩基配列がコードするタンパク質が、TE活性を有することは本発明者らにより確認されている。
　また、前記ＤＮＡ（Ｃ１）の塩基配列として好ましくは、前記ＤＮＡ（Ｂ１ｂ）の塩基配列の5'末端側に、配列番号５０の１位～３７５位の塩基配列、配列番号５０の１０３位～３７５位の塩基配列、配列番号５０の１６３位～３７５位の塩基配列、配列番号５０の２５３位～３７５位の塩基配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下）の塩基変異（塩基の欠失、置換、挿入又は付加）が導入された塩基配列、が付加された塩基配列である。なお、配列番号５０の塩基配列、又は配列番号５０の１０３位～８５８位、１６３位～８５８位、若しくは２５３位～８５８位の塩基配列がコードするタンパク質が、TE活性を有することは本発明者らにより確認されている。
　また、前記ＤＮＡ（Ｃ１）として好ましくは、配列番号２、４又は５０に示す塩基配列において、配列番号２の６０７位～６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位～６１２位に相当する位置の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
　さらに、前記ＤＮＡ（Ｃ１）として、配列番号２、４又は５０に示す塩基配列において、前述の塩基置換を有し、配列番号２の１～３８１位、配列番号４の１～３４２位、又は配列番号５０の１～３７５位の任意の位置で5'末端側が欠失した塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。
　TE改変体をコードする遺伝子の調製方法の一例としては、まず、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株よりクローニングした野生型TE遺伝子の塩基配列（配列番号２で示される塩基配列）を、In-Fusion（登録商標）　HD　Cloning　Kit（Clonthech，Mountain　View，California）を用いてベクターに組み込む。次いで、得られたベクターＤＮＡを鋳型にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列において配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸又は２０４位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅する。ここで、ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９８℃で１０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５℃で約１０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を７２℃で約３０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを３０サイクル行うことが挙げられる。
　ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡを、メチル化ＤＮＡを特異的に切断するDpnＩ酵素で処理し、これを用いて大腸菌を形質転換し、抗生物質含有プレート培地で選択する。形質転換された大腸菌よりプラスミド抽出することで、目的のアミノ酸変異が導入されたTE改変体をコードする遺伝子を取得することができる。
３．形質転換体
　本発明の形質転換体は、宿主に前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子を導入して得られる。当該形質転換体では、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来の野生型TE遺伝子を導入した形質転換体に比べ、特定の炭素数の脂質の生産能、特にＣ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、又はＣ１２脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産能が有意に向上する。また、当該形質転換体では、野生型TE遺伝子を導入した形質転換体と比べ、前述した特定の炭素数の脂肪酸の生産性が向上することにより、生産される脂質中の脂肪酸組成が変化する。なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。
　本発明の形質転換体は、TE改変体をコードするTE遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することで得られる。具体的には、TE改変体をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
　形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物体、又は動物体が挙げられる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましい。
　前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属の微生物やバシラス（Bacillus）属の微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、大腸菌（Escherichia　coli）、枯草菌（Bacillus　subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium　toruloides）、モルチエレラ・エスピー（Mortierella　sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
　前記藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ（Chlorella）属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis　salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis　oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis　atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis　maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis　sp．）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
　前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis　thaliana）、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
　遺伝子発現ベクターの母体となるベクター（プラスミド）としては、TE改変体をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
　本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS）　II　SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T.　et　al.,（1986）,Plasmid　15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript　II　SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
　藻類又は微細藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas　Center）、P-322（Chlamydomonas　Center）、pPha-T1（非特許文献２参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver　Kilian，et　al.，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences　of　the　United　States　of　America，Dec　27;108(52)，2011、の文献記載の方法を参考にして、本発明の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片や制限酵素で切断したＤＮＡ断片が挙げられる。
　植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
　発現ベクターや遺伝子発現カセットに用いるプロモーターやターミネーター等の発現調節領域も、使用する宿主やベクターの種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、又はナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターが挙げられる。
　また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主やベクターの種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
　上記ベクターに前記TE改変体をコードする遺伝子を、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって組み込むことにより形質転換に用いる発現ベクターを構築することができる。
　形質転換方法としては、使用する宿主やベクターの種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法又はLP形質転換方法等を用いることができる。宿主としてナンノクロロプシス属の藻類を用いる場合、Randor　Radakovits,　et　al.，Nature　Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012、等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
　目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
４．脂質の製造方法
　本発明の脂質の製造方法は、TE改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂質を生産させる工程を含む。当該工程は、脂質の生産性向上の観点から、TE改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体を適切な条件にて培養して培養物を得る工程、及び得られた培養物から脂質を採取する工程を含むことが好ましい。なお、本明細書で記載する「形質転換体を培養する」とは、微生物、藻類、植物体、動物体、及びそれらの細胞や組織を培養、生育することをいい、植物体を土壌等で栽培することも含まれる。また、「培養物」には、形質転換体の培養液に加えて、培養等した後の形質転換体そのものも含まれる。
　培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができる。
　また、脂質の生産効率の点から、培地中に、例えばTEの基質或いは脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
　培養条件の１例として、大腸菌を宿主として用いた形質転換体の場合、ＬＢ培地又はOvernight　Express　Instant　TB　Medium（Novagen社）で、３０～３７℃、０．５～１日間培養を行うことが挙げられる。
　また、シロイヌナズナを宿主として用いた形質転換体の場合、土壌で温度条件２０～２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１～２か月間栽培を行うことが挙げられる。
　形質転換体の宿主が藻類の場合、以下の培地及び培養条件を用いることができる。
　培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
　培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、生育性の点から、培地当り１～５０％（vol/vol）が好ましく、１～１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５～４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０～３５℃であり、より好ましくは１５～３０℃である。
　また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１００～５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００～１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００～６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８～２４時間、より好ましくは１０～１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
　また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）～１０％が好ましく、より好ましくは０．０５～５％、さらに好ましくは０．１～３％、よりさらに好ましくは０．３～１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１～５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５～２質量％、さらに好ましくは０．１～１質量％である。
　培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３～９０日間、より好ましくは３～３０日間、さらに好ましくは７～３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
　形質転換体が産生した脂質を採取する方法としては、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法、例えば、前述の培養物や形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物や形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
　本発明のTE改変体は、野生型TEと比べ、特定の炭素数のアシル－ＡＣＰ、例えば、Ｃ８アシル－ＡＣＰ、Ｃ１０アシル－ＡＣＰ、又はＣ１２アシル－ＡＣＰに対する特異性が向上する。その結果、当該改変体を導入した形質転換体では、野生型TEを導入した形質転換体と比べて、総脂肪酸成分におけるＣ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、Ｃ１２脂肪酸など、特定の炭素数の脂肪酸の含有率が増加する。そのため、当該形質転換体を用いた本発明の製造方法は、特定の炭素数脂質、特にＣ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、又はＣ１２脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産に好適に用いることができる。
　本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質であることが好ましく、脂肪酸又はそのエステルを含んでいることがさらに好ましい。脂質中に含まれる脂肪酸又はそのエステルは、界面活性剤等への利用性から、Ｃ８～Ｃ１６の脂肪酸又はそのエステルが好ましく、Ｃ１２～Ｃ１４の脂肪酸又はそのエステルがより好ましく、Ｃ１２脂肪酸又はそのエステルがさらに好ましく、ラウリン酸又はそのエステルがよりさらに好ましい。
　採取された総脂質成分中の総脂肪酸量に対するＣ１２脂肪酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは３質量％以上である。ここで、「採取された総脂質成分」とは、実施例で用いられた方法により算出された総脂質成分をいう。
　本発明の製造方法、形質転換体により得られる脂肪酸や脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
　上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、形質転換体、形質転換体の作製方法、タンパク質、遺伝子、脂肪酸組成の改変方法及び脂質生産性の向上方法を開示する。
＜１＞宿主に下記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体を培養して脂質を生産させる、脂質の製造方法。
 
　（Ａ）配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列において、２０３位のグリシン及び２０４位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
　（Ｂ）配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
　（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
＜２＞前記タンパク質（Ｂ）において、配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列との同一性が８６％以上、好ましくは８８％以上、より好ましくは９０％以上、である、前記＜１＞項記載の製造方法。
＜３＞前記タンパク質（Ｂ）が、配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列、配列番号３の１１５位～２７４位のアミノ酸配列、又は配列番号４９の１２６位～２８５位のアミノ酸配列に１又は数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～４個、さらに好ましくは１～３個、さらに好ましくは１～２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、前記＜１＞又は＜２＞項記載の製造方法。
＜４＞前記タンパク質（Ｂ）が、下記タンパク質（Ｂａ）又は（Ｂｂ）である、前記＜１＞～＜３＞のいずれか１項記載の製造方法。
 
　（Ｂａ）配列番号３の１１５位～２７４位のアミノ酸配列において、配列番号３の１９０位のグリシン及び１９１位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
　（Ｂｂ）配列番号４９の１２６位～２８５位のアミノ酸配列において、配列番号４９の２０１位のグリシン及び２０２位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
＜５＞前記タンパク質（Ｃ）が、配列番号１、３又は４９に示すアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換され、配列番号１の１～１２７位、配列番号３の１～１１４位、又は配列番号４９の１～１２５位の任意の位置でＮ末端側が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質である、前記＜１＞～＜４＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜６＞前記タンパク質（Ｃ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号１の１位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の４９位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の５８位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の７８位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の８７位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の８８位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の９８位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の１０８位～１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の１１８位～１２７位のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、前記＜１＞～＜５＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜７＞前記タンパク質（Ｃ）が、前記タンパク質（Ｂａ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号３の３６位～１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の４５位～１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の５５位～１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の６５位～１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の７５位～１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の８５位～１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の９５位～１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の１０５位～１１４位のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、前記＜１＞～＜５＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜８＞前記タンパク質（Ｃ）が、前記タンパク質（Ｂｂ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号４９の１位～１２５位のアミノ酸配列、配列番号４９の３５位～１２５位のアミノ酸配列、配列番号４９の５５位～１２５位のアミノ酸配列、配列番号４９の８５位～１２５位のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、前記＜１＞～＜５＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜９＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）において、配列番号１の２０３位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに、配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファン又はフェニルアラニン、好ましくはトリプトファン、にそれぞれ置換されている、前記＜１＞～＜８＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜１０＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）が、さらに下記（Ｃａ）～（Ｃｇ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、前記＜１＞～＜９＞のいずれか１項記載の製造方法。
 
　（Ｃａ）配列番号１の１４３位のロイシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がプロリンに置換。
　（Ｃｂ）配列番号１の１４６位のヒスチジン又はこれに相当する位置のアミノ酸がアスパラギン又はセリンに置換。
　（Ｃｃ）配列番号１の１６０位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がアラニンに置換。
　（Ｃｄ）配列番号１の２０２位のメチオニン又はこれに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンに置換。
　（Ｃｅ）配列番号１の２１２位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がプロリンに置換。
　（Ｃｆ）配列番号１の２１３位のアスパラギン又はこれに相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
　（Ｃｇ）配列番号１の２８１位のプロリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がグルタミンに置換。
＜１１＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）のアミノ酸配列が、配列番号１の２０３位のグリシン又はこれに相当する位置及び２０４位のバリン又はこれに相当する位置がそれぞれトリプトファンに置換され、前記（Ｃａ）～（Ｃｇ）からなる群より選ばれる１つ又は２つのアミノ酸置換を有する、前記＜１０＞項記載の製造方法。
＜１２＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）のアミノ酸配列が、配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置がトリプトファンに置換され、前記（Ｃａ）～（Ｃｇ）からなる群より選ばれる１つ又は２つのアミノ酸置換を有する、前記＜１０＞項記載の製造方法。
＜１３＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）のアミノ酸配列が、下記(1)～(14)のいずれか１つで規定するアミノ酸置換を有する、前記＜１＞～＜１２＞のいずれか１項記載の製造方法。
 
　(1)配列番号１の２０３位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに置換。
　(2)配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに置換。
　(3)配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリン又はこれらに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに置換。
　(4)配列番号１の２０３位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに、２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
　(5)配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリン又はこれらに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに、１４３位のロイシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がプロリンに置換。
　(6)配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリン又はこれらに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに、１６０位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がアラニンに置換。
　(7)配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリン又はこれらに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに、２１２位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がプロリンに置換。
　(8)配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリン又はこれらに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに、２１３位のアスパラギン又はこれに相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
　(9)配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリン又はこれらに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに、１６０位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がアラニンに、２１３位のアスパラギン又はこれに相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
　(10)配列番号３の１９０位のグリシン及び１９１位のバリン又はこれらに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに置換。
　(11)配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに、１４６位のヒスチジン又はこれに相当する位置のアミノ酸がアスパラギン、又はセリンに置換。
　(12)配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに、２０２位のメチオニン又はこれに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンに置換。
　(13)配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに、２８１位のプロリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がグルタミンに置換。
　(14)配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに、２０２位のメチオニン又はこれに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに、２８１位のプロリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がグルタミンに置換。
＜１４＞前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（Ａ１）～（Ｃ１）のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜１＞～＜１３＞のいずれか１項記載の製造方法。
 
　（Ａ１）配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列において、６０７位～６０９位の塩基及び６１０位～６１２位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
　（Ｂ１）配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列において、配列番号２の６０７位～６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位～６１２位に相当する位置の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　（Ｃ１）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１５＞前記ＤＮＡ（Ｂ１）において、配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列に対する同一性が７２％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは７６％以上、である、前記＜１４＞項記載の製造方法。
＜１６＞前記ＤＮＡ（Ｂ１）が、配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列、配列番号４の３４３位～８２５位の塩基配列、又は配列番号５０の３７６位～８５８位の塩基配列において１又は数個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、よりさらに好ましくは１～３個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列において、配列番号２の６０７位～６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位～６１２位に相当する位置の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１４＞又は＜１５＞項記載の製造方法。
＜１７＞前記ＤＮＡ（Ｂ１）が下記ＤＮＡ（Ｂ１ａ）又は（Ｂ１ｂ）である、前記＜１４＞～＜１６＞のいずれか１項記載の製造方法。
 
　（Ｂ１ａ）配列番号４の３４３位～８２５位の塩基配列において、配列番号４の５６８位～５７０位の塩基及び５７１位～５７３位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　（Ｂ１ｂ）配列番号５０の３７６位～８５８位の塩基配列において、配列番号５０の６０１位～６０３位の塩基及び６０４位～６０６位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１８＞前記ＤＮＡ（Ｃ１）が、配列番号２、４又は５０に示す塩基配列において、配列番号２の６０７位～６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位～６１２位に相当する位置の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換され、配列番号２の１～３８１位、配列番号４の１～３４２位、又は配列番号５０の１～３７５位の任意の位置で5'末端側が欠失した塩基配列からなるＤＮＡである、前記＜１４＞～＜１７＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜１９＞前記ＤＮＡ（Ｃ１）が、前記ＤＮＡ（Ａ１）の塩基配列の5'末端側に、配列番号２の１位～３８１位の塩基配列、配列番号２の１４５位～３８１位の塩基配列、配列番号２の１７２位～３８１位の塩基配列、配列番号２の２３２位～３８１位の塩基配列、配列番号２の２５９位～３８１位の塩基配列、配列番号２の２６２位～３８１位の塩基配列、配列番号２の２９２位～３８１位の塩基配列、配列番号２の３２２位～３８１位の塩基配列、配列番号２の３５２位～３８１位の塩基配列、又はこれらの配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列、が付加された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１４＞～＜１８＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜２０＞前記ＤＮＡ（Ｃ１）が、前記ＤＮＡ（Ｂ１ａ）の塩基配列の5'末端側に、配列番号４の１０６位～３４２位の塩基配列、配列番号４の１３３位～３４２位の塩基配列、配列番号４の１６３位～３４２位の塩基配列、配列番号４の１９３位～３４２位の塩基配列、配列番号４の２２３位～３４２位の塩基配列、配列番号４の２５３位～３４２位の塩基配列、配列番号４の２８３位～３４２位の塩基配列、配列番号４の３１３位～３４２位の塩基配列、又はこれらの配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下、の塩基の欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１４＞～＜１８＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜２１＞前記ＤＮＡ（Ｃ１）が、前記ＤＮＡ（Ｂ１ｂ）の塩基配列の5'末端側に、配列番号５０の１位～３７５位の塩基配列、配列番号５０の１０３位～３７５位の塩基配列、配列番号５０の１６３位～３７５位の塩基配列、配列番号５０の２５３位～３７５位の塩基配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下、の塩基の欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１４＞～＜１８＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜２２＞前記ＤＮＡ（Ａ１）～（Ｃ１）において、配列番号２の６０７位～６０９位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に、配列番号２の６１０位～６１２位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がトリプトファン又はフェニルアラニンをコードする塩基、好ましくはトリプトファンをコードする塩基、に置換されている、前記＜１４＞～＜２１＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜２３＞前記ＤＮＡ（Ａ１）～（Ｃ１）が、さらに下記（Ｃ１ａ）～（Ｃ１ｇ）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する、前記＜１４＞～＜２２＞のいずれか１項記載の製造方法。
 
　（Ｃ１ａ）配列番号２の４２７位～４２９位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
　（Ｃ１ｂ）配列番号２の４３６位～４３８位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がアスパラギン又はセリンをコードする塩基に置換。
　（Ｃ１ｃ）配列番号２の４７８位～４８０位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がアラニンをコードする塩基に置換。
　（Ｃ１ｄ）配列番号２の６０４位～６０６位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンをコードする塩基に置換。
　（Ｃ１ｅ）配列番号２の６３４位～６３６位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
　（Ｃ１ｆ）配列番号２の６３７位～６３９位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
　（Ｃ１ｇ）配列番号２の８４１位～８４３位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がグルタミンをコードする塩基に置換。
＜２４＞前記ＤＮＡ（Ａ１）～（Ｃ１）の塩基配列が、配列番号２の６０７位～６０９位の塩基又はこれに相当する位置の塩基及び６１０位～６１２位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がそれぞれトリプトファンをコードする塩基に置換され、前記（Ｃ１ａ）～（Ｃ１ｇ）からなる群より選ばれる１つ又は２つの塩基置換を有する、前記＜２３＞項記載の製造方法。
＜２５＞前記ＤＮＡ（Ａ１）～（Ｃ１）の塩基配列が、配列番号２の６１０位～６１２位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に置換され、前記（Ｃ１ａ）～（Ｃ１ｇ）からなる群より選ばれる１つ又は２つの塩基置換を有する、前記＜２３＞項記載の製造方法。
＜２６＞前記ＤＮＡ（Ａ１）～（Ｃ１）の塩基配列が、下記(1-1)～(14-1)のいずれか１つで規定する塩基置換を有する、前記＜１４＞～＜２５＞のいずれか１項記載の製造方法。
 
　(1-1)配列番号２の６０７位～６０９位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に置換。
　(2-1)配列番号２の６１０位～６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に置換。
　(3-1)配列番号２の６０７位～６０９位の塩基及び６１０位～６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基それぞれがトリプトファンをコードする塩基に置換。
　(4-1)配列番号２の６０７位～６０９位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に、６１０位～６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
　(5-1)配列番号２の６０７位～６０９位の塩基及び６１０位～６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基それぞれがトリプトファンをコードする塩基に、４２７位～４２９位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
　(6-1)配列番号２の６０７位～６０９位の塩基及び６１０位～６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基それぞれがトリプトファンをコードする塩基に、４７８位～４８０位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がアラニンをコードする塩基に置換。
　(7-1)配列番号２の６０７位～６０９位の塩基及び６１０位～６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基それぞれがトリプトファンをコードする塩基に、６３４位～６３６位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
　(8-1)配列番号２の６０７位～６０９位の塩基及び６１０位～６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基それぞれがトリプトファンをコードする塩基に、６３７位～６３９位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
　(9-1)配列番号２の６０７位～６０９位の塩基及び６１０位～６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基それぞれがトリプトファンをコードする塩基に、４７８位～４８０位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がアラニンをコードする塩基に、６３７位～６３９位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
　(10-1)配列番号４の５６８位～５７０位の塩基及び５７１位～５７３位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基それぞれがトリプトファンをコードする塩基に置換。
　(11-1)配列番号２の６１０位～６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に、４３６位～４３８位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がアスパラギン、又はセリンをコードする塩基に置換。
　(12-1)配列番号２の６１０位～６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に、６０４位～６０６位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンをコードする塩基に置換。
　(13-1)配列番号２の６１０位～６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に、８４１位～８４３位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がグルタミンをコードする塩基に置換。
　(14-1)配列番号２の６１０位～６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に、６０４位～６０６位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がヒスチジンをコードする塩基に、８４１位～８４３位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がグルタミンをコードする塩基に置換。
＜２７＞前記宿主が微生物である、前記＜１＞～＜２６＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜２８＞前記微生物が微細藻類、好ましくはナンノクロロプシス属に属する藻類、である、前記＜２７＞項記載の製造方法。
＜２９＞前記微生物が大腸菌である、前記＜２７＞項記載の製造方法。
＜３０＞前記脂質が炭素数８、１０、若しくは１２の脂肪酸又はそのエステルを含む、前記＜１＞～＜２９＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜３１＞前記脂質中の炭素数８、１０、又は１２の脂肪酸の含有率が、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体から採取された脂質と比べて増加している、前記＜１＞～＜３０＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜３２＞前記（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つで規定されるタンパク質。
＜３３＞前記タンパク質が、前記＜１＞～＜１３＞のいずれか１項に記載の製造方法で規定するタンパク質のいずれか１つである、前記＜３２＞項記載のタンパク質。
＜３４＞前記＜３２＞又は＜３３＞項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜３５＞前記（Ａ１）～（Ｃ１）で規定するいずれか１つのＤＮＡからなる遺伝子。
＜３６＞前記ＤＮＡが、前記＜１４＞～＜２６＞のいずれか１項に記載の製造方法で規定するＤＮＡのいずれか１つである、前記＜３４＞又は＜３５＞項記載の遺伝子。
＜３７＞前記＜３４＞～＜３６＞のいずれか１項記載の遺伝子を含有する、組換えベクター。
＜３８＞前記＜３４＞～＜３６＞のいずれか１項記載の遺伝子、又は前記＜３７＞項記載の組換えベクターを宿主に導入してなる、形質転換体。
＜３９＞前記＜３４＞～＜３６＞のいずれか１項記載の遺伝子、又は前記＜３７＞項記載の組換えベクターを宿主に導入する、形質転換体の作製方法。
＜４０＞前記宿主が微生物である、前記＜３８＞又は＜３９＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４１＞前記微生物が微細藻類、好ましくはナンノクロロプシス属に属する藻類、である、前記＜４０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４２＞前記微生物が大腸菌である、前記＜４０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４３＞脂質を製造するための、前記＜３８＞～＜４２＞のいずれか１項記載の形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜４４＞前記脂質が炭素数８、１０、若しくは１２の脂肪酸又はそのエステルを含む、前記＜４３＞項記載の使用。
＜４５＞宿主に前記＜３４＞～＜３６＞のいずれか１項記載の遺伝子、又は前記＜３７＞項記載の組換えベクターを導入し、得られた形質転換体が生産する脂質中の脂肪酸組成を改変する、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
＜４６＞宿主に前記＜３４＞～＜３６＞のいずれか１項記載の遺伝子、又は前記＜３７＞項記載の組換えベクターを導入する、脂質の生産性を向上させる方法。
＜４７＞前記脂質が炭素数８、１０、若しくは１２の脂肪酸又はそのエステルを含む、前記＜４５＞又は＜４６＞項記載の方法。
＜４８＞宿主に前記＜３４＞～＜３６＞のいずれか１項記載の遺伝子、又は前記＜３７＞項記載の組換えベクターを導入する、炭素数８、１０、又は１２の脂肪酸の生産性を向上させる方法。
　以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１～４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例１　NoTE改変体をコードする遺伝子を導入した大腸菌による脂質の製造
（１）NoTE遺伝子の取得、及びNoTE発現プラスミドの構築
　ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（独立行政法人国立環境研究所(NIES)より入手）の全ＲＮＡを抽出し、SuperScript（商標）III　First-Strand　Synthesis　SuperMix　for　qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってcDNAを得た。このcDNAを鋳型として、表１に示すプライマー番号５及びプライマー番号６のプライマー対を用いたPCRにより、配列番号２の２６２位～８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片を取得した。また、プラスミドベクターpBluescriptII　SK(-)（Stratagene社製）を鋳型として、表１に示すプライマー番号７及びプライマー番号８のプライマー対を用いたPCRによりpBluescriptII　SK(-)を増幅し、制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。これら２つの断片を、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion　HD　Cloning　Kit（Clontech社製）を用いて融合し、NoTE発現プラスミドNoTE_262を構築した。このプラスミドNoTE_262は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側１位～８７位のアミノ酸残基を除去し、その上流にプラスミドベクターpBluescriptII　SK(-)由来のLacZタンパク質のＮ末端側１位～２９位のアミノ酸残基が融合したタンパク質を発現させるように構築した。
　なお、以下のプラスミド表記において、「NoTE_262」は、配列番号１の８８位～２８７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列として、配列番号２の２６２位～８６４位の塩基配列をプラスミドが有することを意味する。
（２）NoTE改変体発現プラスミドの構築
　前記プラスミドNoTE_262を鋳型として、表１に示すプライマー番号９～１２のいずれか１つのプライマーと、プライマー番号１３のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の２６２位～８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片をそれぞれ取得した。これらの遺伝子断片を用いて、前記手法と同様の手法により、各種NoTE改変体発現プラスミド（NoTE_262(G203W)、NoTE_262(V204W)、NoTE_262(G203W+V204W)、NoTE_262(G203W+V204F)）をそれぞれ構築した。これらのプラスミドは、配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。
(i)NoTE_262(G203W)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に置換されている。
(ii)NoTE_262(V204W)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に置換されている。
(iii)NoTE_262(G203W+V204W)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、それぞれ置換されている。
(iv)NoTE_262(G203W+V204F)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがフェニルアラニンをコードするコドン（TTT）に、それぞれ置換されている。
　続いて、前記プラスミドNoTE_262(G203W+V204W)を鋳型として、表１に示すプライマー番号１４及びプライマー番号１５のプライマー対、プライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対、プライマー番号１８及びプライマー番号１９のプライマー対、プライマー番号２０及びプライマー番号２１のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の２６２位～８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片をそれぞれ取得した。これらの遺伝子断片を用いて、前記手法と同様の手法により、各種NoTE改変体発現プラスミド（NoTE_262(WW+L143P)、NoTE_262(WW+G160A)、NoTE_262(WW+G212P)、NoTE_262(WW+N213Y)）をそれぞれ構築した。これらのプラスミドは、配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。
(v)NoTE_262(WW+L143P)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、１４３位のロイシン（Ｌ）をコードするコドンがプロリンをコードするコドン（CCT）に、それぞれ置換されている。
(vi)NoTE_262(WW+G160A)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、１６０位のグリシンをコードするコドンがアラニンをコードするコドン（GCT）に、それぞれ置換されている。
(vii)NoTE_262(WW+G212P)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２１２位のグリシンをコードするコドンがプロリンをコードするコドン（CCA）に、それぞれ置換されている。
(viii)NoTE_262(WW+N213Y)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２１３位のアスパラギンをコードするコドンがチロシンをコードするコドン（TAC）に、それぞれ置換されている。
　さらに、前記プラスミドNoTE_262(WW+N213Y)を鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の２６２位～８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片を取得した。この遺伝子断片を用いて、前記手法と同様の手法により、NoTE改変体発現プラスミド（NoTE_262(WW+G160A+N213Y)）を構築した。
(ix)NoTE_262(WW+G160A+N213Y)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、１６０位のグリシンをコードするコドンがアラニンをコードするコドン（GCT）に、２１３位のアスパラギンをコードするコドンがチロシン（Ｙ）をコードするコドン（TAC）に、それぞれ置換されている。
（３）発現プラスミドの大腸菌への導入、大腸菌培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
　前記各種NoTE改変体発現プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株（K27株（fadD88）、Overath　et　al.，Eur．J．Biochem.，1969，vol．7，p．559-574参照）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。得られた形質転換体を３０℃で一晩静置し、得られたコロニーをLBAmp液体培地（Bacto　Trypton　1%，Yeast　Extract　0.5%，NaCl　1%，アンピシリンナトリウム50μg/mL）１ｍＬに接種し、３０℃で一晩培養した。この培養液２μＬを、２ｍＬのOvernight　Express　Instant　TB　Medium（Novagen社）に接種し、３０℃で振とう培養した。２４時間の培養後、培養液に含まれる脂質成分を、下記に示す方法にて分析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpBluescriptII　SK(-)で形質転換した大腸菌K27株、及び前述の野生型NoTE発現プラスミド（NoTE_262）で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。
＜脂質成分の分析方法＞
　培養液１ｍＬに、内部標準として１ｍｇ/ｍＬの7-ペンタデカノン５０μＬを添加後、クロロホルム０．５ｍＬ、メタノール１ｍＬ及び２Ｎ塩酸１０μＬを培養液に添加して激しく攪拌し、３０分間放置した。その後さらに、クロロホルム０．５ｍＬ及び１．５％ＫＣｌ０．５ｍＬを添加して攪拌し、３，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
　得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分間恒温した。続いて１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）１ｍＬを添加し、８０℃にて１０分間恒温した。その後、ヘキサン及び飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分間放置し、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
　下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
キャピラリーカラム：DB-1　MS（３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ、J＆W　Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
カラム内流量：１．０ｍＬ／分
昇温プログラム：１００℃（１分間）→１０℃／分→３００℃（５分間）
平衡化時間：１分間
注入口：スプリット注入（スプリット比：１００：１）
圧力：１４．４９ｐｓｉ，１０４ｍＬ／分
注入量：１μＬ
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出器温度：３００℃
　脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
　ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１リットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
　その結果を表５に示す。なお、以下の表において、「ＴＦＡ」は総脂肪酸量を、「脂肪酸組成（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸量の割合を示す。また、「Ｃ１７：０Δ」及び「Ｃ１９：０Δ」はそれぞれ、cis-9,10-Methylen-hexadecanoic　acid及びcis-11,12-Methylen-octadecanoic　acidを表す。さらに「Ｃ１２：ｎ」は、Ｃ１２：１とＣ１２：０の脂肪酸の総和を表し、「Ｃ１２：ｎ（％ＴＦＡ）」は、総脂肪酸の重量に対するＣ１２：ｎの脂肪酸量の割合を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すように、前記プラスミドNoTE_262を導入した形質転換体と比べ、配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位と２０４位のアミノ酸の少なくとも一方をトリプトファンに置換されるように構築したNoTE改変体を導入した形質転換体では、総脂肪酸量に占めるＣ１０脂肪酸及びＣ１２脂肪酸（Ｃ１２：ｎ）の割合が有意に増加した。
　また、配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位と２０４位のアミノ酸の両方がトリプトファンに置換されるように構築したプラスミドNoTE_262(G203W+V204W)、及び配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位と２０４位のアミノ酸がそれぞれトリプトファン及びフェニルアラニンに置換されるように構築したプラスミドNoTE_262(G203W+V204F)、をそれぞれ導入した形質転換体では、NoTE_262(G203W)及びNoTE_262(V204W)をそれぞれ導入した形質転換体と比べ、総脂肪酸量に占めるＣ１０脂肪酸及びＣ１２脂肪酸の含有率がさらに増加した。
　さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位と２０４位のアミノ酸に加えて、他の特定の位置のアミノ酸を特定のアミノ酸に置換されるように構築したNoTE_262(WW+L143P)、NoTE_262(WW+G160A)、NoTE_262(WW+G212P)、NoTE_262(WW+N213Y)を導入した形質転換体では、NoTE_262(G203W+V204W)を導入した形質転換体と比べ、総脂肪酸量に占めるＣ１０脂肪酸及びＣ１２脂肪酸の含有率がさらに増加した。特に、NoTE_262(WW+G160A+N213Y)を導入した形質転換体では、NoTE_262(WW+G160A)やNoTE(WW+N213Y)を導入した形質転換体株と比べ、総脂肪酸量に占めるＣ１０脂肪酸及びＣ１２脂肪酸の含有率が一層増加した。
実施例２　配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端を削除したNoTE改変体をコードする遺伝子を導入した大腸菌による脂質の製造
（１）NoTE改変体発現プラスミドの構築
　実施例１で作製した前記プラスミドNoTE_262及びNoTE_262(G203W+V204W)をそれぞれ鋳型として、表１に示すプライマー番号２２及びプライマー番号８のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の３８２位～８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、及び配列番号２に示す塩基配列の３８２位～８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片をそれぞれ取得した。これらの遺伝子断片を用いて、実施例１と同様の手法により、NoTE発現プラスミド（NoTE_382）、及びNoTE改変体発現プラスミド（NoTE_382(G203W+V204W)）をそれぞれ構築した。
　なお、以下のプラスミド表記において、「NoTE_382」は、配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列として、配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列をプラスミドが有することを意味する。
　また、前記プラスミドNoTE_382(G203W+V204W)は、配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。
(x)NoTE_382(G203W+V204W)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、それぞれ置換されている。
（２）発現プラスミドの大腸菌への導入、大腸菌培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
　実施例１と同様の方法で、前記プラスミドNoTE_382(G203W+V204W)を大腸菌へ導入して培養を行い、培養液に含まれる脂質成分の分析を行った。また、陰性対象として、前記プラスミドNoTE_382についても同様の実験を行った。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、NoTEのＮ末端のアミノ酸を１２７残基削除した場合においても、野生型NoTE_382発現用プラスミドを導入した形質転換体と比べ、配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位と２０４位のアミノ酸をトリプトファンに置換されるように構築したNoTE_382(G203W+V204W)を導入した形質転換体では、総脂肪酸量に占めるＣ１０脂肪酸及びＣ１２脂肪酸（Ｃ１２：ｎ）の割合が有意に増加した。
実施例３　NgTE改変体をコードする遺伝子を導入した大腸菌による脂質の製造
（１）NgTE遺伝子の取得、及びNgTE発現プラスミドの構築
　配列番号３に示すアミノ酸配列からなるナンノクロロプシス・ガディタナ由来アシル－ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子（NgTE遺伝子、配列番号４）を、人工遺伝子の受託合成サービスを利用して取得した。
　前記NgTE遺伝子を鋳型として、表１に示すプライマー番号２３及びプライマー番号２４のプライマー対を用いたPCRにより、配列番号４の２５３位～８２５位の塩基配列からなる遺伝子断片を取得した。得られた遺伝子断片を、実施例１と同様の方法でpBluescriptII　SK(-)ベクターに融合し、野生型NgTE発現プラスミドNgTE_253を構築した。このプラスミドNgTE_253は、配列番号３に示すアミノ酸配列のＮ末端側１位～８４位のアミノ酸残基を除去し、その上流にプラスミドベクターpBluescriptII　SK(-)由来のLacZタンパク質のＮ末端側１位～２９位のアミノ酸残基が融合したタンパク質を発現させるように構築した。
　なお、以下のプラスミド表記において、「NgTE_253」は、配列番号３の８５位～２７４位のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列として、配列番号４の２５３位～８２５位の塩基配列をプラスミドが有することを意味する。
（２）NgTE改変体発現プラスミドの構築
　前記プラスミドNgTE_253を鋳型として、表１に示すプライマー番号２５及びプライマー番号２６のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号４に示す塩基配列の２５３位～８２５位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片を取得した。得られた遺伝子断片を用いて、実施例１と同様の手法により、NgTE改変体発現プラスミド（NgTE_253(G190W+V191W)）を構築した。
　なお、前記プラスミドNgTE_253(G190W+V191W)は、配列番号４の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。
(xi)NgTE_253(G190W+V191W)：配列番号３に示すアミノ酸配列の１９０位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、１９１位のバリンをコードする塩基がトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、それぞれ置換されている。
（３）発現プラスミドの大腸菌への導入、大腸菌培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
　実施例１と同様の方法で、前記プラスミドNgTE_253(G190W+V191W)を大腸菌へ導入して培養を行い、培養液に含まれる脂質成分の分析を行った。また、陰性対象として、前記プラスミドNgTE_253についても同様の実験を行った。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示すように、野生型NgTE_253発現用プラスミドを導入した形質転換体と比べ、配列番号３に示すアミノ酸配列の１９０位と１９１位のアミノ酸をトリプトファンに置換されるように構築したNgTE_253(G190W+V191W)を導入した形質転換体では、総脂肪酸量に占めるＣ１２脂肪酸（Ｃ１２：ｎ）の割合が有意に増加した。
実施例４　NoTE改変体をコードする遺伝子を導入したナンノクロロプシス・オキュラータによる脂質の製造
（１）NoTE改変体発現プラスミドの構築
　実施例１で作製したプラスミドNoTE_262、NoTE_262(G203W+V204F)、及びNoTE_262(G203W+V204W)を鋳型として、表２に示すプライマー番号２７及びプライマー番号２８のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の２６２位～８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、及び配列番号２に示す塩基配列の２６２位～８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片をそれぞれ取得した。
　GenBankに登録されているナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis　sp.）W2J3B株のVCP1（ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質）遺伝子のcomplete　cds配列（Accession　number：JF957601.1）より、VCP1プロモーター配列（配列番号２９）、VCP1葉緑体移行シグナル配列（配列番号３０）、及びVCP1ターミネーター配列（配列番号３１）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示すプライマー番号３２及びプライマー番号３３のプライマー対、プライマー番号３４及びプライマー番号３５のプライマー対、並びにプライマー番号３６及びプライマー番号３７のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、及びVCP1ターミネーター配列をそれぞれ取得した。また、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表２に示すプライマー番号３８及びプライマー番号３９のプライマー対を用いたPCRを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
　上記により得られたNoTE遺伝子断片、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、及びVCP1ターミネーター配列を、実施例１と同様の方法でプラスミドベクターpUC19に融合し、NoTE発現用プラスミドNoTE_262_Nanno、並びにNoTE改変体発現用プラスミドNoTE_262(G203W+V204F)_Nanno及びNoTE_262(G203W+V204W)_Nannoをそれぞれ構築した。なおこれらのプラスミドは、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、NoTE遺伝子断片（野生型又は改変型）、及びVCP1ターミネーター配列の順に連結したNoTE遺伝子発現用配列と、pUC19ベクター配列からなる。
　なお、前記プラスミドは、配列番号１の８８位～２８７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列として、配列番号２の２６２位～８６４位の塩基配列をプラスミドが有する。
　また、前記NoTE改変体発現用プラスミドは、配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。
(xii)NoTE_262(G203W+V204F)_Nanno：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがフェニルアラニンをコードするコドン（TTT）に、それぞれ置換されている。
(xiii)NoTE_262(G203W+V204W)_Nanno：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、それぞれ置換されている。
（２）ゼオシン耐性遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドの構築
　ゼオシン耐性遺伝子（配列番号４０）、及び文献（Randor　Radakovits,　et　al.，Nature　Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012）記載のナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号４１）を人工合成した。
　合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示すプライマー番号４２及びプライマー番号４３のプライマー対、並びにプライマー番号４４及びプライマー番号４５のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ取得した。これらの増幅断片と、前記VCP1ターミネーター配列、及びプラスミドベクターpUC19の増幅断片を、実施例１と同様の方法で融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列の順に連結したゼオシン耐性遺伝子発現用配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（３）各種NoTE発現プラスミド及びゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドのナンノクロロプシスへの導入
　前記発現プラスミドNoTE_262_Nanno、NoTE_262(G203W+V204F)_Nanno、及びNoTE_262(G203W+V204W)_Nannoを鋳型として、表２に示すプライマー番号４６とプライマー番号４７のプライマー対を用いてPCRを行い、当該プラスミド中のNoTE遺伝子発現用配列を増幅した。
　また、前記ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表２に示すプライマー番号４８とプライマー番号４７のプライマー対を用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現用配列を増幅した。
　増幅したＤＮＡ断片を、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
　約１×１０９細胞のナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（独立行政法人国立環境研究所(NIES)より入手）を、ソルビトール溶液３８４ｍＭで洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したNoTE遺伝子発現用ＤＮＡ断片（野生型又は改変型）及びゼオシン耐性遺伝子発現用ＤＮＡ断片を、約５００ｎｇずつ宿主細胞と混和し、５０μＦ、５００Ω、２，２００ｖ／２ｍｍの条件でエレクトロポレーションを行った。
　ｆ／２液体培地（NaNO3　７５ｍｇ、NaH2PO4・2H2O　６ｍｇ、ビタミンＢ１２　０．５μｇ、ビオチン　０．５μｇ、チアミン　１００μｇ、Na2SiO3・9H2O　１０ｍｇ、Na2EDTA・2H2O　４．４ｍｇ、FeCl3・6H2O　３．１６ｍｇ、FeCl3・6H2O　１２μｇ、ZnSO4・7H2O　２１μｇ、MnCl2・4H2O　１８０μｇ、CuSO4・5H2O　７μｇ、Na2MoO4・2H2O　７μｇ／人工海水１Ｌ）にて２４時間回復培養を行った。その後に、２μｇ／ｍＬのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、０．３％CO2雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２～３週間培養した。得られたコロニーの中から、NoTE遺伝子発現用断片を含むものをＰＣＲ法により選抜した。選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、Ｎ１５Ｐ５培地）２０ｍＬに播種し、２５℃、０．３％CO2雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液２ｍＬを、１８ｍＬのＮ１５Ｐ５培地に植継ぎ、２５℃、０．３％CO2雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２週間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株についても同様に実験を行った。
（４）ナンノクロロプシス培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
　培養後実施例１と同様の方法で、培養液に含まれる脂質成分の分析を行った。結果を表８に示す。なお、表８において、「ｎ」は、０～５の整数を表し、例えば「Ｃ１８：ｎ」と記載した場合には、組成がＣ１８：０，Ｃ１８：１，Ｃ１８：２，Ｃ１８：３，Ｃ１８：４，及びＣ１８：５の各脂肪酸の総和を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位と２０４位のアミノ酸の少なくとも一方をトリプトファンに置換されるように構築したNoTE_262(G203W+V204F)_Nanno、及びNoTE_262(G203W+V204W)_Nannoを導入した形質転換体では、NoTE_262発現用プラスミドを導入した形質転換体と比べ、総脂肪酸量に占めるＣ１２：０脂肪酸、及びＣ１４：０脂肪酸の割合が有意に増加した。
実施例５　NoTE改変体をコードする遺伝子を導入した大腸菌による脂質の製造
（１）NoTE多重改変体発現プラスミドの構築
　実施例１で作製したプラスミドNoTE_262(V204W)を鋳型として、表３に示すプライマー番号５１とプライマー番号５２のプライマー対、プライマー番号５１とプライマー番号５３のプライマー対、プライマー番号５４とプライマー番号５５のプライマー対、プライマー番号５４とプライマー番号５６のプライマー対、プライマー番号５４とプライマー番号５７のプライマー対、プライマー番号５４とプライマー番号５８のプライマー対、プライマー番号５４とプライマー番号５９のプライマー対、並びにプライマー番号６０とプライマー番号６１のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、配列番号２の２６２位～８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片をそれぞれ取得した。これらの遺伝子断片を用いて、前記手法と同様の手法により、各種NoTE改変体発現プラスミド（NoTE_262(V204W+H146N)、NoTE_262(V204W+H146S)、NoTE_262(V204W+M202F)、NoTE_262(V204W+M202H)、NoTE_262(V204W+M202L)、NoTE_262(V204W+M202Q)、NoTE_262(V204W+M202V)、NoTE_262(V204W+P281Q)）をそれぞれ構築した。これらのプラスミドは、配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。
(xiv)NoTE_262(V204W+H146N)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、１４６位のヒスチジンをコードするコドンがアスパラギンをコードするコドン（AAC）に、それぞれ置換されている。
(xv)NoTE_262(V204W+H146S)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、１４６位のヒスチジンをコードするコドンがセリンをコードするコドン（TCA）に、それぞれ置換されている。
(xvi)NoTE_262(V204W+M202F)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０２位のメチオニンをコードするコドンがフェニルアラニン（F）をコードするコドン（TTC）に、それぞれ置換されている。
(xvii)NoTE_262(V204W+M202H)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０２位のメチオニンをコードするコドンがヒスチジンをコードするコドン（CAT）に、それぞれ置換されている。
(xviii)NoTE_262(V204W+M202L)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０２位のメチオニンをコードするコドンがロイシンをコードするコドン（CTA）に、それぞれ置換されている。
(xix)NoTE_262(V204W+M202Q)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０２位のメチオニンをコードするコドンがグルタミンをコードするコドン（CAA）に、それぞれ置換されている。
(xx)NoTE_262(V204W+M202V)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０２位のメチオニンをコードするコドンがバリンをコードするコドン（GTA）に、それぞれ置換されている。
(xxi)NoTE_262(V204W+P281Q)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２８１位のプロリンをコードするコドンがグルタミンをコードするコドン（CAG）に、それぞれ置換されている。
　続いて、前記プラスミドNoTE_262(V204W+P281Q)を鋳型として、表３に示すプライマー番号５４とプライマー番号５６のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２の２６２位～８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片を取得した。この遺伝子断片を用いて、前記手法と同様の手法により、NoTE改変体発現プラスミド（NoTE_262(V204W+M202H+P281Q)）を構築した。このプラスミドは、配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。
(xxii)NoTE_262(V204W+M202H+P281Q): 配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０２位のメチオニンをコードするコドンがヒスチジンをコードするコドン（CAT）に、２８１位のプロリンをコードするコドンがグルタミンをコードするコドン（CAG）に、それぞれ置換されている。
（２）発現プラスミドの大腸菌への導入、大腸菌培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
　実施例１と同様の方法で、前記発現プラスミドを大腸菌へ導入して培養を行い、培養液に含まれる脂質成分の分析を行った。また、比較対象として、前記発現プラスミドNoTE_262、NoTE_262(V204W)についても同様の実験を行った。結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９に示すように、前記プラスミドNoTE_262を導入した形質転換体と比べ、いずれの変異体も総脂肪酸量に占めるＣ１２脂肪酸の割合が有意に増加した。
　また、配列番号１に示すアミノ酸配列の１４６位のアミノ酸が置換されるように構築した、プラスミドNoTE_262(V204W+H146N)及びプラスミドNoTE_262(V204W+H146S)をそれぞれ導入した形質転換体では、NoTE_262導入株やNoTE_262(V204W)をそれぞれ導入した形質転換体ではほとんど存在を確認できなかったＣ８脂肪酸の生産が確認された。
　さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをトリプトファンに、２０２位のメチオニンや２８１位のプロリンを他のアミノ酸にそれぞれ置換されるように構築したプラスミドを導入した形質転換体では、NoTE_262(V204W)を導入した形質転換体と比べ、総脂肪酸量に占めるＣ１２脂肪酸の含有率がさらに増加した。
実施例６　NoTE改変体をコードする遺伝子を導入したナンノクロロプシス・オキュラータによる脂質の製造
（１）NoTE改変体発現プラスミドの構築
　実施例１で作製したプラスミドNoTE_262、NoTE_262(G203W)、NoTE_262(V204W)、及びNoTE_262(G203W+V204W)を鋳型として、表２に示すプライマー番号２７及びプライマー番号２８のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の２６２位～８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、及び配列番号２に示す塩基配列の２６２位～８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片をそれぞれ取得した。
　実施例４で作製したVCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、及びVCP1ターミネーター配列を含むpUC19ベクターを鋳型とし、表２に示すプライマー番号３２及び表３に示すプライマー番号６２のプライマー対を用いたPCRを行い、NoTE発現カセット（VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、野生型又は改変型NoTE配列、VCP1ターミネーター配列からなる断片）を増幅した。
　続いて、実施例４で作製したゼオシン耐性遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表２に示すプライマー番号３９及び表３に示すプライマー番号６３のプライマー対を用いたPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列）及びpUC19配列からなる断片を増幅した。
　前記NoTE発現カセットと、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット及びpUC19配列からなる断片を、実施例１と同様の方法で融合し、NoTE発現カセットとゼオシン耐性遺伝子発現カセットが連結した薬剤耐性連結型NoTE発現プラスミド（NoTE_262_Nanno(zeo)、NoTE_262(G203W)_Nanno(zeo)、NoTE_262(V204W)_Nanno(zeo)、及びNoTE_262(G203W+V204W)_Nanno(zeo)）をそれぞれ構築した。前記NoTE発現プラスミドは、配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。
(xxiii)NoTE_262(G203W)_Nanno(zeo)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に置換されている。
(xxiv)NoTE_262(V204W)_Nanno(zeo)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に置換されている。
(xxv)NoTE_262(G203W+V204W)_Nanno(zeo)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、それぞれ置換されている。
（２）各種NoTE発現プラスミドのナンノクロロプシスへの導入、形質転換体の培養、培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
　前記発現プラスミドNoTE_262_Nanno(zeo)、NoTE_262(G203W)_Nanno(zeo)、NoTE_262(V204W)_Nanno(zeo)、及びNoTE_262(G203W+V204W)_Nanno(zeo)を鋳型として、表２に示すプライマー番号４６とプライマー番号４７のプライマー対を用いてPCRを行い、NoTE遺伝子発現カセットとゼオシン耐性遺伝子発現カセットが連結した断片を増幅した。
　実施例４と同様の方法で、得られたＤＮＡ断片を精製し、エレクトロポレーション法によりナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株に導入した。
（３）ナンノクロロプシス培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
　実施例４と同様の方法で、形質転換体の選抜及び培養を行い、培養液に含まれる脂質成分の分析を行った。なお、脂質抽出の際に用いるヘキサンの量は０．５ｍＬとした。結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列２０３位のグリシンをトリプトファンに置換されるように構築したNoTE_262(G203W)_Nanno(zeo)、２０４位のバリンをトリプトファンに置換されるように構築したNoTE_262(V203W)_Nanno(zeo)、２０３位と２０４位のアミノ酸をともにトリプトファンに置換されるように構築したNoTE_262(G203W+V204W)_Nanno(zeo)をそれぞれ導入した形質転換体では、NoTE_262を導入した形質転換体と比べ、総脂肪酸量に占めるＣ１０脂肪酸、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸の含有率が有意に増加した。
実施例７　Ｎ末端長を変更したNoTE改変体をコードする遺伝子を導入した大腸菌による脂質の製造
（１）Ｎ末端長を変更したNoTE改変体発現プラスミドの構築
　実施例１で調製したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のcDNAを鋳型として、表４に示すプライマー番号６４～６９及び表１に示すプライマー番号２２のいずれか１つのプライマーと、表１に示すプライマー番号６のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２の１～８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、配列番号２の１７２～８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、配列番号２の２３２～８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、配列番号２の２９２～８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、配列番号２の３２２～８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、配列番号２の３５２～８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、配列番号２の３８２～８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、をそれぞれ取得した。これらの遺伝子断片を用いて、実施例１と同様の方法により、Ｎ末端長を変更したNoTE発現プラスミドNoTE_1、NoTE_172、NoTE_232、NoTE_292、NoTE_322、NoTE_352、NoTE_382、をそれぞれ構築した。
　なお、以下のプラスミド表記において、「NoTE_1」、「NoTE_172」、「NoTE_232」、「NoTE_292」、「NoTE_322」、「NoTE_352」、「NoTE_382」はそれぞれ、配列番号１の１～２８７位、５７～２８７位、７７～２８７位、９７～２８７位、１０７～２８７位、１１７～２８７位、１２７～２８７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列として、それぞれ配列番号２の１～８６４位、１７２～８６４位、２３２～８６４位、２９２～８６４位、３２２～８６４位、３５２～８６４位、３８２～８６４位の塩基配列をプラスミドが有することを意味する。
　これらのプラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１０及びプライマー番号１３のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２の１～８６４位、１７２～８６４位、２３２～８６４位、２９２～８６４位、３２２～８６４位、３５２～８６４位、３８２～８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片をそれぞれ取得した。これらの遺伝子断片を用いて、実施例１と同様の方法によりＮ末端長を変更したNoTE改変体発現プラスミドNoTE_1(V204W)、NoTE_172(V204W)、NoTE_232(V204W)、NoTE_292(V204W)、NoTE_322(V204W)、NoTE_352(V204W)、NoTE_382(V204W)、をそれぞれ構築した。
　これらのプラスミド(xxvi)NoTE_1(V204W)、(xxvii)NoTE_172(V204W)、(xxviii)NoTE_232(V204W)、(xxix)NoTE_292(V204W)、(xxx)NoTE_322(V204W)、(xxxi)NoTE_352(V204W)、(xxxii)NoTE_382(V204W)はいずれも配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。
(xxvi)～(xxxii)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に置換されている。
（２）発現プラスミドの大腸菌への導入、大腸菌培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
　実施例１と同様の方法で、前記プラスミドNoTE_1(V204W)、NoTE_172(V204W)、NoTE_232(V204W)、NoTE_292(V204W)、NoTE_322(V204W)、NoTE_352(V204W)、NoTE_382(V204W)をそれぞれ大腸菌へ導入して培養を行い、培養液に含まれる脂質成分の分析を行った。また、陰性対象として、前記プラスミドNoTE_1、NoTE_172、NoTE_232、NoTE_292、NoTE_322、NoTE_352、NoTE_382についてもそれぞれ同様の実験を行った。結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表１１に示すように、NoTEのＮ末端のアミノ酸を種々の長さに変更した場合においても、野生型NoTE発現用プラスミドを導入した形質転換体と比べ、配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のアミノ酸をトリプトファンに置換されるように構築したNoTE改変体発現用プラスミドを導入した形質転換体では、総脂肪酸量に占めるＣ１０脂肪酸及びＣ１２脂肪酸（Ｃ１２：ｎ）の割合が有意に増加した。
　以上のように、本発明で規定するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することで、特定の炭素数の脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、特定の脂肪酸の生産性を向上させることができる。

Claims (17)

  1. 　宿主に下記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体を培養して脂質を生産させる、脂質の製造方法。
     
    （Ａ）配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列において、２０３位のグリシン及び２０４位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
  2. 　前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）において、配列番号１の２０３位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに、配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファン又はフェニルアラニンに、それぞれ置換されている、請求項１記載の製造方法。
  3. 　前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）において、配列番号１の２０３位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸及び２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに置換されている、請求項１又は２記載の製造方法。
  4. 　前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）が、さらに下記（Ｃａ）～（Ｃｇ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項１～３のいずれか１項記載の製造方法。
     
    　（Ｃａ）配列番号１の１４３位のロイシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がプロリンに置換。
    　（Ｃｂ）配列番号１の１４６位のヒスチジン又はこれに相当する位置のアミノ酸がアスパラギン又はセリンに置換。
    　（Ｃｃ）配列番号１の１６０位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がアラニンに置換。
    　（Ｃｄ）配列番号１の２０２位のメチオニン又はこれに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンに置換。
    　（Ｃｅ）配列番号１の２１２位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がプロリンに置換。
    　（Ｃｆ）配列番号１の２１３位のアスパラギン又はこれに相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
    　（Ｃｇ）配列番号１の２８１位のプロリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がグルタミンに置換。
  5. 　前記タンパク質（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（Ａ１）～（Ｃ１）のいずれか１つからなる遺伝子である、請求項１～４のいずれか１項記載の製造方法。
     
    　（Ａ１）配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列において、６０７位～６０９位の塩基及び６１０位～６１２位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
    　（Ｂ１）配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列において、配列番号２の６０７位～６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位～６１２位に相当する位置の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    　（Ｃ１）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  6. 　前記宿主が微生物である、請求項１～５のいずれか１項記載の製造方法。
  7. 　前記微生物が微細藻類である、請求項６記載の製造方法。
  8. 　前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項７記載の製造方法。
  9. 　前記微生物が大腸菌である、請求項６記載の製造方法。
  10. 　前記脂質が炭素数８、１０、若しくは１２の脂肪酸又はそのエステルを含む、請求項１～９のいずれか１項記載の製造方法。
  11. 　下記（Ａ）～（Ｃ）のいずれか１つで規定されるタンパク質。
     
    （Ａ）配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列において、２０３位のグリシン及び２０４位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）配列番号１の１２８位～２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
  12. 　請求項１１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
  13. 　下記（Ａ１）～（Ｃ１）で規定するいずれか１つのＤＮＡからなる遺伝子。
     
    　（Ａ１）配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列において、６０７位～６０９位の塩基及び６１０位～６１２位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
    　（Ｂ１）配列番号２の３８２位～８６４位の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列において、配列番号２の６０７位～６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位～６１２位に相当する位置の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    　（Ｃ１）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  14. 　請求項１２又は１３記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
  15. 　請求項１２若しくは１３記載の遺伝子、又は請求項１４記載の組換えベクターを、宿主に導入してなる形質転換体。
  16. 　宿主に請求項１２若しくは１３記載の遺伝子、又は請求項１４記載の組換えベクターを導入し、得られた形質転換体が生産する脂質中の脂肪酸組成を改変する、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
  17. 　宿主に請求項１２若しくは１３記載の遺伝子、又は請求項１４記載の組換えベクターを導入する、炭素数８、１０、又は１２の脂肪酸の生産性を向上させる方法。
     
     
     
     
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