JP6310544B2 - β−ケトアシル−ACPシンターゼを用いた脂質の製造方法 - Google Patents
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Description
例えば、炭素数12〜18前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として、また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として、いずれも洗浄剤又は殺菌剤として利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル4級アミン塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤として、ベンザルコニウム型4級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。また、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
(1)宿主に下記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有するタンパク質
(2)得られた形質転換体から脂質を採取する工程
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(c)(a)のタンパク質のアミノ酸配列と91%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有するタンパク質
本発明のβ−ケトアシル−ACPシンターゼ、これをコードする遺伝子、形質転換体、及び製造方法は、脂質、特に脂肪酸の工業的生産に好適に用いることができる。
本発明において、脂質には、中性脂肪、ろう、セラミド等の単純脂質;リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質;及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質が含まれる。
本発明の製造方法には、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、又は、当該タンパク質と機能的に均等なタンパク質をコードする遺伝子を用いる。具体的には、下記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子を用いる。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有するタンパク質
β−ケトアシル−ACPシンターゼは、脂肪酸合成経路においてアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物と同様、藻類の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在し、アセチル−ACPからスタートして炭素鎖の伸長反応を繰り返し、最終的に炭素数16又は18のアシル−ACP(脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリアプロテインとからなる複合体)が合成される。次いで、アシル−ACPチオエステラーゼの作用によってアシル−ACPのチオエステル結合が加水分解され、遊離の脂肪酸が生成する。
脂肪酸合成の第一段階では、アセチル−ACPとマロニルACPとの縮合反応で、アセトアセチルACPが生成する。この反応をβ−ケトアシル−ACPシンターゼが触媒する。次いで、β−ケトアシル−ACPレダクターゼによりアセトアセチルACPのケト基が還元されてヒドロキシブチリルACPが生成する。続いて、β−ヒドロキシアシル−ACPデヒドラーゼによりヒドロキシブチリルACPが脱水され、クロトニルACPが生成する。最後に、エノイル−ACPレダクターゼによりクロトニルACPが還元されて、ブチリルACPが生成する。一連の反応により、アセチル−ACPからアシル基の炭素鎖が2個伸長されたブチリルACPが生成する。以下、同様の反応を繰り返すことで、アシル−ACPの炭素鎖が伸長し、最終的に炭素数16又は18のアシル−ACPが合成される。
タンパク質がβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、前述の非特許文献1に記載の方法によって調製した各種アシル−ACPを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認することができる。
KAS I〜IVは、阻害剤であるセルレニンに対する感受性が異なることが知られている。KAS I及びKAS IIはセルレニンに対して感受性であり、KAS III及びKAS IVはセルレニンに対して非感受性である。
本発明において「中鎖アシル−ACP特異的」とは、β−ケトアシル−ACPシンターゼが、主に炭素数4〜12のアシルACPを基質とし、炭素数14までの中鎖アシルACP合成の伸長反応を触媒することをいう。以下、中鎖アシル−ACP特異的なβ−ケトアシル−ACPシンターゼを、中鎖特異的β−ケトアシル−ACPシンターゼともいう。
また、本発明において、中鎖脂肪酸や中鎖アシル−ACPにおける中鎖とは、アシル基の炭素数が6以上14以下であることをいう。
β−ケトアシル−ACPシンターゼの中鎖アシル−ACP特異性については、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析し、中鎖脂肪酸が増加すること、により確認することができる。また、上記の系に後述する中鎖特異的アシル−ACPチオエステラーゼを共発現することで、中鎖特異的アシル−ACPチオエステラーゼ単独発現時と比較して中鎖脂肪酸が増加すること、により確認することができる。また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、前述の非特許文献1に記載の方法によって中鎖アシル−ACPを基質とした鎖長伸長反応が起こること、により確認することができる。
本発明においてアミノ酸配列及び塩基配列の同一性はLipman-Pearson法(Science,227,1435,(1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウェア開発)のホモロジー解析(homology search)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。
(a1)配列番号58で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
配列番号58のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス ガディタナ(Nannochloropsis gaditana)由来のβ−ケトアシル−ACPシンターゼである。配列番号58のアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列と約90%の同一性を有する。後述の実施例で示されているように、(a1)のβ−ケトアシル−ACPシンターゼも、中鎖アシル−ACPに対して特異性を示し、KAS IVであると考えられる。
また、前記(b)のタンパク質として、前記(a1)のタンパク質のアミノ酸配列に、1又は数個(好ましくは1以上10個以下、より好ましくは1以上5個以下、さらに好ましくは1以上3個以下)の変異を導入したタンパク質も好ましい。
上記変異としては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing overlap extension(SOE)PCR反応(Horton et al.,Gene 77,61−68,1989)を利用した方法、ODA法(Hashimoto-Gotoh et al.,Gene,152,271-276,1995))、Kunkel法(Kunkel,T. A.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1985,82,488)等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット(タカラバイオ社)、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット(Clonetech社)、KOD-Plus-Mutagenesis Kit(東洋紡社)等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
(c)(a)のタンパク質のアミノ酸配列と91%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有するタンパク質
(d)配列番号2で表される塩基配列からなるDNA
(e)(d)のDNAの塩基配列と60%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(d1)配列番号59で表される塩基配列からなるDNA
配列番号59の塩基配列からなる遺伝子は、ナンノクロロプシス ガディタナ由来のβ−ケトアシル−ACPシンターゼ遺伝子である。配列番号59の塩基配列は、配列番号2の塩基配列と約77%の同一性を有する。
(f)(d)のDNAの塩基配列と78%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
本発明の形質転換体は、上述の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子と共に、アシル−ACPチオエステラーゼをコードする遺伝子を、宿主に導入してなるものであることが好ましい。
アシル−ACPチオエステラーゼは、β−ケトアシル−ACPシンターゼ等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル−ACPのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。アシル−ACPチオエステラーゼの作用によって、ACP上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。
そのため、宿主にβ−ケトアシル−ACPシンターゼ遺伝子とアシル−ACPチオエステラーゼ遺伝子を共導入することで、形質転換体の脂質生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
上述のように、前記(a)又は(a1)のタンパク質は中鎖特異的β−ケトアシル−ACPシンターゼであるため、共導入するアシル−ACPチオエステラーゼも、中鎖アシル−ACPに特異的なチオエステラーゼ(以下、「中鎖特異的アシル−ACPチオエステラーゼ」ともいう)であることが好ましい。中鎖特異的アシル−ACPチオエステラーゼを用いることで、中鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。特に、中鎖特異的アシル−ACPチオエステラーゼを元来有していない宿主を形質転換に用いる場合、中鎖特異的アシル−ACPチオエステラーゼの共導入が効果的である。
具体的には、Umbellularia californicaアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank AAA34215.1、配列番号50、これをコードする遺伝子の塩基配列:配列番号51);Cuphea calophylla subsp. mesostemonアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank ABB71581);Cocos nuciferaアシル−ACPチオエステラーゼ(CnFatB3:Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照、配列番号46、これをコードする遺伝子の塩基配列:配列番号47);Cinnamomum camphoraアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank AAC49151.1);Myristica fragransアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank AAB71729);Myristica fragransアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank AAB71730);Cuphea lanceolataアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank CAA54060);Cuphea hookerianaアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank Q39513);Ulumus americanaアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank AAB71731);Sorghum bicolorアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank EER87824);Sorghum bicolorアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank EER88593);Cocos nuciferaアシル−ACPチオエステラーゼ(CnFatB1:Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照);Cocos nuciferaアシル−ACPチオエステラーゼ(CnFatB2:Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照);Cuphea viscosissimaアシル−ACPチオエステラーゼ(CvFatB1:Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照);Cuphea viscosissimaアシル−ACPチオエステラーゼ(CvFatB2:Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照);Cuphea viscosissimaアシル−ACPチオエステラーゼ(CvFatB3:Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照);Elaeis guineensisアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank AAD42220);Desulfovibrio vulgarisアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank ACL08376);Bacteriodes fragilisアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank CAH09236);Parabacteriodes distasonisアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank ABR43801);Bacteroides thetaiotaomicronアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank AAO77182);Clostridium asparagiformeアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank EEG55387);Bryanthella formatexigensアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank EET61113);Geobacillus sp.アシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank EDV77528);Streptococcus dysgalactiaeアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank BAH81730);Lactobacillus brevisアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank ABJ63754);Lactobacillus plantarumアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank CAD63310);Anaerococcus tetradiusアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank EEI82564);Bdellovibrio bacteriovorusアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank CAE80300);Clostridium thermocellumアシル−ACPチオエステラーゼ(GenBank ABN54268);Nannochloropsis oculataアシル−ACPチオエステラーゼ(配列番号48、これをコードする遺伝子の塩基配列:配列番号49);Nannochloropsis gaditanaアシル−ACPチオエステラーゼ(配列番号52、これをコードする遺伝子の塩基配列:配列番号53);Nannochloropsis granulataアシル−ACPチオエステラーゼ(配列番号54、これをコードする遺伝子の塩基配列:配列番号55);Symbiodinium microadriaticumアシル−ACPチオエステラーゼ(配列番号56、これをコードする遺伝子の塩基配列:配列番号57)、等が挙げられる。
また、これらと機能的に均等なタンパク質として、上述したいずれかのアシル−ACPチオエステラーゼのアミノ酸配列と50%以上(好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質も用いることができる。
これらのアシル−ACPチオエステラーゼ及びそれらをコードする遺伝子の配列情報等は、例えば、国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information, NCBI)などから入手することができる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ACPチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ACPチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法(Yuan L, Voelker TA, Hawkins DJ. “Modification of the substrate specificity of an acyl-acyl carrier protein thioesterase by protein engineering” Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Nov 7;92(23), p.10639-10643)によって調製した各種アシル−ACPを基質とした反応を行うことにより、アシル−ACPチオエステラーゼ活性を測定することができる。
本発明の形質転換体は、宿主に前記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる。当該形質転換体では、宿主に比べ、中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産能が有意に向上する。なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア(Escherichia)属に属する微生物やバシラス(Bacillus)属に属する微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、エシェリキア属に属する微生物である大腸菌(Escherichia coli)、バシラス属に属する微生物である枯草菌(Bacillus subtilis)、酵母に属する微生物である赤色酵母(Rhodosporidium toruloides)、又は糸状菌に属する微生物であるモルチエレラ エスピー(Mortierella sp.)が好ましく、大腸菌がより好ましい。
また、前記微生物としては、微細藻類も好ましい。前記微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス(Chlamydomonas)属に属する藻類、クロレラ(Chlorella)属に属する藻類、ファエオダクティラム(Phaeodactylum)属に属する藻類、又はナンノクロロプシス属に属する藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属に属する藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属に属する藻類として具体的には、Nannochloropsis oculata、Nannochloropsis gaditana、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis oceanica、Nannochloropsis atomus、Nannochloropsis maculata、Nannochloropsis granulata、又はNannochloropsis sp.、等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、Nannochloropsis oculata、又はNannochloropsis gaditanaが好ましく、Nannochloropsis oculataがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript(pBS) II SK(-)(Stratagene社製)、pSTV系ベクター(タカラバイオ社製)、pUC系ベクター(宝酒造社製)、pET系ベクター(タカラバイオ社製)、pGEX系ベクター(GEヘルスケア社製)、pCold系ベクター(タカラバイオ社製)、pHY300PLK(タカラバイオ社製)、pUB110(Mckenzie,T. et al.,(1986),Plasmid 15(2);p.93-103)、pBR322(タカラバイオ社製)、pRS403(ストラタジーン社製)、又はpMW218/219(ニッポンジーン社製)が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript II SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
藻類を宿主とする場合には、例えば、P66(Chlamydomonas Center)、P-322(Chlamydomonas Center)、pPha-T1(Yangmin Gong, Xiaojing Guo, Xia Wan, Zhuo Liang, Mulan Jiang, “Characterization of a novel thioesterase (PtTE) from Phaeodactylum tricornutum”, Journal of Basic Microbiology, 2011 December, Volume 51, p.666-672.参照)、又はpJET1(コスモ・バイオ社製)が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver Kilian, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Dec 27;108(52), 2011、の文献記載の方法を参考にして、本発明の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるDNA断片を用いて宿主を形質転換することもできる。このDNA断片としては、例えば、PCR増幅DNA断片や制限酵素切断DNA断片が挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター(タカラバイオ社製)、pBI系ベクター(クロンテック社製)、又はIN3系ベクター(インプランタイノベーションズ社製)が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
具体的なプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター(例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等)、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、又はナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン/クロロフィルa結合タンパク質遺伝子のプロモーターが挙げられる。
また、選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子(アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子)等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法(J.Bacterial.93,1925(1967))、プロトプラスト形質転換法(Mol.Gen.Genet.168,111(1979))、エレクトロポレーション法(FEMS Microbiol.Lett.55,135(1990))又はLP形質転換方法(T.Akamatsu及びJ.Sekiguchi,Archives of Microbiology,1987,146,p.353-357;T.Akamatsu及びH.Taguchi,Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2001,65,4,p.823-829)等を用いることができる。宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Randor Radakovits, et al., Nature Communications, DOI:10.1038/ncomms1688, 2012、に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
次いで、上記で得られた形質転換体を用いて脂質を生産する。
本発明の製造方法は、前記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体から脂質を採取する工程を含む。当該工程は、脂質の生産性向上の観点から、前記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を適切な条件にて培養又は生育して培養物又は生育物を得る工程、及び得られた培養物又は生育物から脂質を採取する工程を含むことが好ましい。ここで、培養物とは、培養した後の培養液及び形質転換体をいい、生育物とは、生育した後の形質転換体をいう。
中鎖脂肪酸の生産性を向上させるため、培地はセルレニンを含有することが好ましい。上述のように、炭素数16又は18のアシル−ACP合成を触媒するKAS I及びKAS IIはセルレニンにより阻害される。一方、中鎖アシル−ACP合成を触媒するKAS IVは、セルレニン非感受性である。形質転換体をセルレニン含有培地で培養又は生育することで、炭素数16又は18のアシル−ACP合成を減少させ、中鎖アシル−ACPの合成を増加させることができる。培地中のセルレニン濃度は、生育に悪影響を与えない濃度であることが好ましい。具体的には、1μM以上が好ましく、10μM以上がより好ましく、そして50μM以下が好ましく、25μM以下がより好ましい。また、1〜50μMが好ましく、10〜50μMがより好ましく、10〜25μMがさらに好ましい。
また、脂質の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、f/2培地、ESM培地、ダイゴIMK培地、L1培地、MNK培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、f/2培地、ESM培地、又はダイゴIMK培地が好ましく、f/2培地、又はダイゴIMK培地がより好ましく、f/2培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、生育性の点から、培地当り1%(vol/vol)以上が好ましく、そして50%(vol/vol)以下が好ましく、10%(vol/vol)以下がより好ましい。また、1〜50%(vol/vol)が好ましく、1〜10%(vol/vol)がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、5〜40℃の範囲である。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、10℃以上が好ましく、15℃以上がより好ましく、そして35℃以下が好ましく、30℃以下がより好ましい。また、好ましくは10〜35℃であり、より好ましくは15〜30℃である。
また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から、100ルクス以上が好ましく、300ルクス以上がより好ましく、1000ルクス以上がさらに好ましく、そして50000ルクス以下が好ましく、10000ルクス以下がより好ましく、6000ルクス以下がさらに好ましい。また、好ましくは100〜50000ルクスの範囲、より好ましくは300〜10000ルクスの範囲、さらに好ましくは1000〜6000ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、24時間のうち明期が8時間以上が好ましく、10時間以上がより好ましく、そして24時間以下が好ましく、18時間以下がより好ましい。また、明期が好ましくは8〜24時間、より好ましくは10〜18時間、さらに好ましくは12時間である。
また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から0.03%(大気条件と同程度)以上が好ましく、0.05%以上がより好ましく、0.1%以上がさらに好ましく、0.3%以上がよりさらに好ましく、そして10%以下が好ましく、5%以下がより好ましく、3%以下がさらに好ましく、1%以下がよりさらに好ましい。また、0.03〜10%が好ましく、より好ましくは0.05〜5%、さらに好ましくは0.1〜3%、よりさらに好ましくは0.3〜1%である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から0.01質量%以上が好ましく、0.05質量%以上がより好ましく、0.1質量%以上がさらに好ましく、そして5質量%以下が好ましく、2質量%以下がより好ましく、1質量%以下がさらに好ましい。また、0.01〜5質量%が好ましく、より好ましくは0.05〜2質量%、さらに好ましくは0.1〜1質量%である。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間(例えば150日程度)行なってもよい。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、3日以上が好ましく、7日以上がより好ましく、そして90日以下が好ましく、30日以下がより好ましい。また、好ましくは3〜90日間、より好ましくは3〜30日間、さらに好ましくは7〜30日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、単純脂質及び誘導脂質から選ばれる1種以上を含んでいることが好ましく、誘導脂質を含んでいることがより好ましく、脂肪酸又はそのエステルを含んでいることがさらに好ましく、脂肪酸又はそのエステルであることがよりさらに好ましい。脂質中に含まれる脂肪酸又はそのエステルは、界面活性剤等への利用性から、中鎖脂肪酸又はそのエステルが好ましく、炭素原子数12〜14の脂肪酸又はそのエステルがより好ましく、炭素原子数12〜14の飽和脂肪酸又はそのエステルがさらに好ましく、炭素原子数12の脂肪酸又はそのエステルがよりさらに好ましく、ラウリン酸又はそのエステルが特に好ましい。これらの高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として利用できる。
(1)宿主に下記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有するタンパク質
(2)得られた形質転換体から脂質を採取する工程
<3> 前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステルである、<1>又は<2>項記載の製造方法。
<4> 前記タンパク質が、中鎖アシル−ACP特異的なβ−ケトアシル−ACPシンターゼである、<1>〜<3>のいずれか1項記載の製造方法。
<5> 前記工程(1)において、宿主に中鎖アシル−ACP特異的なアシル−ACPチオエステラーゼをコードする遺伝子を共導入する、<1>〜<4>のいずれか1項記載の製造方法。
<6> 前記工程(2)が、セルレニンを含有する培地で形質転換体を培養する工程を含む、<1>〜<5>のいずれか1項記載の製造方法。
<7> 前記宿主が微生物又は植物である、<1>〜<6>のいずれか1項記載の製造方法。
<8> 前記微生物が微細藻類である、<7>項記載の製造方法。
<9> 前記微細藻類がナンノクロロプシス(Nannochloropsis)属に属する藻類である、<8>項記載の製造方法。
<10> 前記微生物が大腸菌である、<7>項記載の製造方法。
<12> 宿主に前記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子、及び中鎖アシル−ACP特異的なアシル−ACPチオエステラーゼをコードする遺伝子を共導入して得られる、<11>項記載の形質転換体。
<13> 前記宿主が微生物又は植物である、<11>又は<12>項記載の形質転換体。
<14> 前記微生物が微細藻類である、<13>項記載の形質転換体。
<15> 前記微細藻類がナンノクロロプシス(Nannochloropsis)属に属する藻類である、<14>項記載の形質転換体。
<16> 前記微生物が大腸菌である、<13>項記載の形質転換体。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(c)(a)のタンパク質のアミノ酸配列と91%以上、好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有するタンパク質
<19> 下記(d)又は(f)のDNAからなる遺伝子。
(d)配列番号2で表される塩基配列からなるDNA
(f)(d)のDNAの塩基配列と78%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
<21> 宿主に前記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
<23> 前記脂質が中鎖脂肪酸又はそのエステルである、<22>項に記載の形質転換体の使用。
1.NoKASIV遺伝子導入株
(1)NoKASIV遺伝子の取得、及びNoKASIV遺伝子発現プラスミドの構築
国立環境研究所(NIES)からNannochloropsis oculata NIES-2145株を購入し、使用した。Nannochloropsis oculata NIES-2145株をf/2培地(75mgNaNO3、6mgNaH2PO4・2H2O、0.5μgビタミンB12、0.5μgビオチン、100μgチアミン、10mgNa2SiO3・9H2O、4.4mgNa2EDTA・2H2O、3.16mgFeCl3・6H2O、12μgFeCl3・6H2O、21μgZnSO4・7H2O、180μgMnCl2・4H2O、7μgCuSO4・5H2O、7μgNa2MoO4・2H2O/人工海水1L)で十分培養し、50mlのf/2培地に10%植菌し、25℃、二酸化炭素0.3%で人工気象機にて6日間培養した。培養後に回収したサンプルをマルチビーズショッカーにて破砕し、RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen社製)を用いてRNA精製を行った。得られたtotal RNAから、SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (invitrogen社製)を用いてcDNAライブラリーを作製した。このcDNAを鋳型として、表1に示す配列番号3及び配列番号4のプライマー対を用いたPCR反応により、配列番号2に示すNoKASIV遺伝子のDNA断片を取得した。
また、プラスミドベクターpSTV28(タカラバイオ社製)を鋳型として、表1に示す配列番号5及び6のプライマー対を用いたPCR反応によりpSTV28を増幅し、DpnI(東洋紡株式会社製)処理により鋳型の消化を行った。これら2つの断片を、High Pure PCR Product Purification Kit(Roche Applied Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて融合し、NoKASIV遺伝子発現プラスミドを構築した。
構築したNoKASIV遺伝子発現プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株であるK27株(fadD88)(Overath et al, Eur.J.Biochem.7,559-574,1969)をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたK27株を37℃で一晩静置して得られたコロニーをLBCm液体培地(Bacto Trypton 1%,Yeast Extract 0.5%,NaCl 1%,クロラムフェニコール30μg/mL)1mLに接種し、30℃で一晩培養した。前記培養液20μLを、2mLのOvernight Express Instant TB Medium(Novagen社)に接種し、30℃で振とう培養した。培養24時間後、培養液に含まれる脂質成分を、下記の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。
培養液1mLに、内部標準として1mg/mLの7−ペンタデカノンを50μL添加後、0.5mLのクロロホルム、1mLのメタノール及び10μLの2N塩酸を培養液に添加して激しく攪拌後30分間放置し、その後さらに0.5mLのクロロホルムおよび0.5mLの1.5%KClを添加して攪拌後、3,000rpm、15分遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層(下層)を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、0.5N水酸化カリウム/メタノール溶液0.7mLを添加し、80℃で30分恒温した。続いて1mLの14%三フッ化ホウ素溶液(SIGMA社製)を添加し、80℃にて10分恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各1mL添加し激しく撹拌し、室温にて30分放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
キャピラリーカラム:DB−1 MS 30m×200μm×0.25μm(J&W Scientific)、移動層:高純度ヘリウム、カラム内流量:1.0mL/min、昇温プログラム:100℃(1分間)→10℃/min→300℃(5分間)、平衡化時間:1分間、注入口:スプリット注入(スプリット比:100:1),圧力14.49psi,104mL/min,注入量1μL、洗浄バイアル:メタノール・クロロホルム、検出器温度:300℃
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である7−ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液1リットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
NoKASIV遺伝子導入株及びプラスミドベクターpSTV28導入株(陰性対照)の総脂肪酸量(脂質量)に占める各脂肪酸量の割合を、図1に示す。なお、以下の図中の脂肪酸組成において、Cxとあるのは炭素原子数xの脂肪酸を、Cx:yとあるのは炭素原子数xで二重結合数がyの脂肪酸を表す。また、図中、C18:nの「n」は0〜5の整数を表し、C18:0,C18:1,C18:2,C18:3,C18:4,及びC18:5の脂肪酸の総和を表す。また、C16:nは、C16:0及びC16:1の脂肪酸の総和を表す。
NoKASIV遺伝子及びココヤシ(Cocos nucifera)由来アシル−ACPチオエステラーゼ(CTE)遺伝子を大腸菌K27株(fadD88)に導入した多重形質転換体を作製した。
前記1.で構築したNoKASIV遺伝子発現プラスミドを用いて、CTE遺伝子導入K27株をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。CTE遺伝子導入K27株は、特開2011−250781号公報記載の方法により作製した。CTE遺伝子はプラスミドベクターpMW219(ニッポンジーン製)にクローニングされたものを使用した。CTEのアミノ酸配列を配列番号46に、CTE遺伝子の配列を配列番号47にそれぞれ示す。
形質転換処理をしたK27株を37℃で一晩静置して得られたコロニーをLBCmKm液体培地(Bacto Trypton 1%,Yeast Extract 0.5%,NaCl 1%,クロラムフェニコール30μg/mL、カナマイシン硫酸塩50μg/mL)1mLに接種し、30℃で一晩培養した。前記培養液20μLを、2mLのOvernight Express Instant TB Mediumに接種し、30℃で振とう培養した。培養24時間後、培養液に含まれる脂質成分を、前記1.と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換したCTE遺伝子導入K27株についても同様に実験を行った。
結果を図2に示す。
NoKASIV遺伝子及びナンノクロロプシス オキュラータ(Nannochloropsis oculata)NIES-2145株由来アシル−ACPチオエステラーゼ(NoTE)遺伝子を大腸菌K27株(fadD88)に導入した多重形質転換体を作製した。
(1)NoTE遺伝子の取得、及びNoTE遺伝子発現用プラスミドの構築
Nannochloropsis oculata NIES2145株の全RNAを抽出し、SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(invitrogen社製)を用いて逆転写を行ってcDNAを得た。このcDNAを鋳型として、下記表2に示す配列番号66及び配列番号67のプライマー対を用いたPCR反応により、配列番号49に示す塩基配列からなる遺伝子断片を取得した。また、プラスミドベクターpBluescriptII SK(-)(Stratagene社製)を鋳型として、下記表2に示す配列番号68及び69のプライマー対を用いたPCR反応によりpBluescriptII SK(-)を増幅し、制限酵素DpnI(東洋紡株式会社製)処理により鋳型の消化を行った。これら2つの断片を、High Pure PCR Product Purification Kit(Roche Applied Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて融合し、NoTE遺伝子発現用プラスミドNoTE_1を構築した。なお、この発現プラスミドは、NoTE遺伝子がコードするアミノ酸配列(配列番号48)の1位のN末端側に、プラスミド由来のLacZタンパク質のN末端側1位〜29位のアミノ酸配列と融合させた形で構築した。
構築したNoTE遺伝子発現用プラスミドNoTE_1を用いて、大腸菌K27株をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたK27株を37℃で一晩静置し、得られたコロニーをLBAmp液体培地(Bacto Trypton 1%,Yeast Extract 0.5%,NaCl 1%,アンピシリンナトリウム50μg/mL)1mLに接種し、37℃で一晩培養した。前記培養液20μLを、2mLのOvernight Express Instant TB Medium(Novagen社)に接種し、30℃で振とう培養し、NoTE遺伝子導入K27株を得た。
前記1.で構築したNoKASIV遺伝子発現プラスミドを用いて、NoTE遺伝子導入K27株をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。
形質転換処理をしたK27株を37℃で一晩静置して得られたコロニーをLBCmAmp液体培地(Bacto Trypton 1%,Yeast Extract 0.5%,NaCl 1%,クロラムフェニコール30μg/mL、アンピシリンナトリウム50μg/mL)1mLに接種し、30℃で一晩培養した。前記培養液20μLを、2mLのOvernight Express Instant TB Mediumに接種し、30℃で振とう培養した。培養24時間後、培養液に含まれる脂質成分を、前記1.と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換したNoTE遺伝子導入K27株についても同様に実験を行った。
結果を図3に示す。
前記3.で構築したNoKASIV遺伝子及びNoTE遺伝子導入株を、LBCmAmp液体培地(Bacto Trypton 1%,Yeast Extract 0.5%,NaCl 1%,クロラムフェニコール30μg/mL、アンピシリンナトリウム50μg/mL)1mLに接種し、30℃で一晩培養した。前記培養液20μLを、2mLのOvernight Express Instant TB Mediumに接種し、30℃で振とう培養した。このとき、Overnight Express Instant TB Mediumにセルレニン(和光純薬工業)を終濃度10μMとなるように添加した。培養24時間後、培養液に含まれる脂質成分を、前記1.と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、セルレニンを添加しない培地でもNoKASIV遺伝子及びNoTE遺伝子導入株を同様に培養した。
結果を図4に示す。
(1)BTE遺伝子ナンノクロロプシス発現用プラスミドの構築
特表平7−501924号公報に記載のBTEをコードする遺伝子配列(配列番号51)を人工合成した。合成したDNA断片を鋳型として、表1に示す配列番号7及び8のプライマー対を用いてPCR反応を行い、BTE遺伝子断片を取得した。なお、このDNA断片では、BTE(配列番号50)の葉緑体移行シグナル(N末端の85アミノ酸)に相当する部分を欠損させた。
GenBankに登録されているナンノクロロプシス エスピー(Nannochloropsis sp.)W2J3B株のVCP1(ビオラキサンチン/クロロフィルa結合タンパク質)遺伝子のcomplete cds 配列(Accession number: JF957601.1)より、VCP1プロモーター配列(配列番号39)、VCP1葉緑体移行シグナル配列(配列番号40)、及びVCP1ターミネーター配列(配列番号41)を人工合成した。合成したDNA断片を鋳型として、表1に示す配列番号9及び10のプライマー対、配列番号11及び12のプライマー対、配列番号13及び14のプライマー対を用いてPCR反応を行い、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、VCP1ターミネーター配列をそれぞれ取得した。また、プラスミドベクターpUC19(タカラバイオ社製)を鋳型として、表1に示す配列番号15及び16プライマー対を用いたPCR反応を行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
上記により得られたBTE遺伝子断片、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、及びVCP1ターミネーター配列を、実施例1の1.と同様の方法でプラスミドベクターpUC19に融合し、BTE遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドpUC-vcp1c-BTEを構築した。なお、本プラスミドは、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、BTE遺伝子断片、及びVCP1ターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
NoKASIV遺伝子を鋳型として、表1に示す配列番号19及び20のプライマー対を用いてPCR反応を行うことでNoKASIV遺伝子断片を取得した。次に、Randor Radakovits, et al., Nature Communications, DOI:10.1038/ ncomms1688, 2012、に記載のNannochloropsis gaditana CCMP526株由来ユビキチンプロモーター配列(配列番号45)を人工合成した。合成したDNA断片を鋳型として、表1に示す配列番号21及び22のプライマー対を用いてPCR反応を行い、ユビキチンプロモーターのDNA断片を取得した。これらの増幅断片と、前記で取得したVCP1ターミネーター配列、及びプラスミドベクターpUC19の増幅断片とを前記と同様の方法で融合し、NoKASIV遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドpUC-UEPp-NoKASIVを構築した。
BTE遺伝子発現用プラスミドpUC-vcp1c-BTEを鋳型として、表1に示す配列番号27及び28のプライマー対を用いてPCR反応を行い、当該プラスミド中のVCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、BTE遺伝子断片、及びVCP1ターミネーター配列からなるBTE遺伝子発現用断片を増幅した。また、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドpUC-vcp1c-bleを鋳型として、表1に示す配列番号27及び28のプライマー対を用いてPCR反応を行い、ゼオシン耐性遺伝子発現用断片を増幅した。増幅した両断片を、High Pure PCR Product Purification Kit(Roche Applied Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
約109細胞のナンノクロロプシス オキュラータ(Nannochloropsis oculata)NIES-2145株を、384mMのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したBTE遺伝子発現用断片及びゼオシン耐性遺伝子発現用断片を、約500ngずつ宿主細胞に混和し、50μF、500Ω、2,200v/2mmの条件でエレクトロポレーションを行った。f/2液体培地(75mgNaNO3、6mgNaH2PO4・2H2O、0.5μgビタミンB12、0.5μgビオチン、100μgチアミン、10mgNa2SiO3・9H2O、4.4mgNa2EDTA・2H2O、3.16mgFeCl3・6H2O、12μgFeCl3・6H2O、21μgZnSO4・7H2O、180μgMnCl2・4H2O、7μgCuSO4・5H2O、7μgNa2MoO4・2H2O/人工海水1L)にて24時間回復培養を行った後に、2μg/mLのゼオシン含有f/2寒天培地(f/2液体培地に0.8%寒天を添加)に塗布し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて2〜3週間培養した。得られたコロニーの中から、BTE遺伝子発現用断片を含むものをPCR法により選抜した。
NoKASIV遺伝子発現用プラスミドpUC-UEPp-NoKASIVを鋳型として、表1に示す配列番号29及び28のプライマー対を用いてPCR反応を行い、当該プラスミド中のプロモーター配列、NoKASIV遺伝子及びVCP1ターミネーター配列からなるNoKASIV遺伝子発現用断片を増幅した。また、pUC-TUBp-aphVIIIを鋳型として、表1に示す配列番号30及び28のプライマー対を用いてPCR反応を行い、パラモマイシン耐性遺伝子発現用断片を増幅した。増幅した両断片を、上述の方法で3.で作成したBTE導入株に導入、培養し、得られたコロニーの中から、NoKASIV遺伝子発現用断片を含むものをPCR法により選抜した。
4.で選抜した株を、f/2培地の窒素濃度を15倍、リン濃度を5倍に増強した培地(以下、N15P5培地)50mLに播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて4週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液10mLを、40mLのN15P5培地に植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて振盪培養した。培養3週間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例1と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、3.で得られたBTE遺伝子のみを導入したナンノクロロプシス株についても同様に実験を行った。
結果を図5に示す。
4.で選抜した株を5.と同様の方法で前培養し、10μMのセルレニンを含むN15P5培地に植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて振盪培養した。培養3週間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例1と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、セルレニンを添加しない系についても同様に実験を行った。
結果を図6に示す。
(1)NgKASIV遺伝子の取得、及びNgKASIV遺伝子発現プラスミドの構築
Nannochloropsis gaditana CCMP526株の全9052遺伝子の配列情報を、Colorado School of Mines 及びGenome Project Solutions が提供するナンノクロロプシス・ゲノムプロジェクト(Nannochloropsis Genome Project (http://nannochloropsis.genomeprojectsolutions-databases.com/))から取得した。そのうちの1つであるNga04201遺伝子(配列番号59に示す塩基配列からなる遺伝子、以下NgKASIV)について人工遺伝子の受託合成サービスを利用して取得した。取得した人工遺伝子を鋳型として、表1に示す配列番号31及び32のプライマー対を用いたPCR反応により、配列番号59に示すNgKASIV遺伝子のDNA断片を取得した。なお、配列番号59に示すNgKASIV遺伝子は、配列番号2の遺伝子配列と77%の同一性を示し、配列番号58に示すNgKASIVのアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列と90%の同一性を示す。
また、プラスミドベクターpSTV28(タカラバイオ社製)を鋳型として、表1に示す配列番号5及び6のプライマー対を用いたPCR反応によりpSTV28を増幅し、DpnI(東洋紡株式会社製)処理により鋳型の消化を行った。これら2つの断片を、High Pure PCR Product Purification Kit(Roche Applied Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて融合し、NgKASIV遺伝子発現プラスミドを構築した。
構築したNgKASIV遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例1の1.と同様の方法で、大腸菌K27株を形質転換し、30℃で振とう培養した。培養24時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例1と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。
結果を図7に示す。
NgKASIV遺伝子及びココヤシ(Cocos nucifera)由来アシル−ACPチオエステラーゼ(CTE)遺伝子を大腸菌K27株(fadD88)に導入した多重形質転換体を作製した。
前記1.で構築したNgKASIV遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例1の2.と同様の方法にて大腸菌K27株を形質転換し、30℃で振とう培養した。培養24時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例1と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換したCTE遺伝子導入K27株についても同様に実験を行った。
結果を図8に示す。
NgKASIV遺伝子及びNannochloropsis oculata NIES-2145株由来アシル−ACPチオエステラーゼ(NoTE)遺伝子を大腸菌K27株(fadD88)に導入した多重形質転換体を作製した。
前記1.で構築したNgKASIV遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例1の3.と同様の方法にて大腸菌K27株を形質転換し、30℃で振とう培養した。培養24時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例1と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換したNoTE遺伝子導入K27株についても同様に実験を行った。
結果を図9に示す。
(1)EKASI遺伝子又はEKASII遺伝子発現プラスミドの構築
大腸菌のEKASI遺伝子及びEKASII遺伝子の配列情報を、データベースPEC(Profiling of E.coli Chromosome、www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/pec/)より入手した。大腸菌K27株を、LB培地にて30℃で振とう培養した後、培養液1mlから菌体を回収し、QIAamp DNA Mini Kit(キアゲン社製)を使用し、DNAを取得した。得られたDNAを鋳型として、表1に示す配列番号33及び34のプライマー対、配列番号35及び36のプライマー対を用いたPCR反応により、配列番号63に示すEKASI遺伝子、配列番号65に示すEKASII遺伝子のDNA断片を取得した。なお、配列番号63に示すEKASI遺伝子は、配列番号2の遺伝子配列と49%の同一性を示し、配列番号65に示すEKASII遺伝子は、配列番号2の遺伝子配列と53%の同一性をし、配列番号62に示すEKASIのアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列と約34%の同一性を示し、配列番号64に示すEKASIIのアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列と約45%の同一性を示す。
また、プラスミドベクターpSTV28(タカラバイオ社製)を鋳型として、表1に示す配列番号5及び6のプライマー対を用いたPCR反応によりpSTV28を増幅し、DpnI(東洋紡株式会社製)処理により鋳型の消化を行った。これら2つの断片を、High Pure PCR Product Purification Kit(Roche Applied Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて融合し、EKASI遺伝子発現プラスミド及びEKASII遺伝子発現プラスミドを構築した。
構築したEKASI遺伝子発現プラスミド、EKASII遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例1の1.と同様の方法で、大腸菌K27株を形質転換し、30℃で振とう培養した。培養24時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例1と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。
結果を図10に示す。
EKASI遺伝子又はEKASII遺伝子と、Nannochloropsis oculata NIES-2145株由来アシル−ACPチオエステラーゼ(NoTE)遺伝子を大腸菌K27株(fadD88)に導入した多重形質転換体を作製した。
前記1.で構築したEKASI遺伝子又はEKASII遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例1の3.と同様の方法にて大腸菌K27株を形質転換し、30℃で振とう培養した。培養24時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例1と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換したNoTE遺伝子導入K27株についても同様に実験を行った。
結果を図11に示す。
実施例1の1.と同様の方法で、Nannochloropsis oculata NIES-2145株のcDNAライブラリーを作製した。このcDNAを鋳型として、表1に示す配列番号37及び38のプライマー対を用いたPCR反応により、配列番号61に示すNoKASIorII遺伝子のDNA断片を取得した。なお、配列番号61に示すNoKASIorII遺伝子は、配列番号2の遺伝子配列と59%の同一性を示し、配列番号60に示すNgKASIVのアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列と52%の同一性を示す。
また、プラスミドベクターpSTV28(タカラバイオ社製)を鋳型として、表1に示す配列番号5及び6のプライマー対を用いたPCR反応によりpSTV28を増幅し、DpnI(東洋紡株式会社製)処理により鋳型の消化を行った。これら2つの断片を、High Pure PCR Product Purification Kit(Roche Applied Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて融合し、NoKASIorII遺伝子発現プラスミドを構築した。
構築したNoKASIorII遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例1の1.と同様の方法で、大腸菌K27株を形質転換し、30℃で振とう培養した。培養24時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例1と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。
結果を図12に示す。
NoKASIorII遺伝子と、ココヤシ(Cocos nucifera)由来アシル−ACPチオエステラーゼ(CTE)遺伝子とを大腸菌K27株(fadD88)に導入した多重形質転換体を作製した。
前記1.で構築したNoKASIorII遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例1の2.と同様の方法にて大腸菌K27株を形質転換し、30℃で振とう培養した。培養24時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例1と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換したCTE遺伝子導入K27株についても同様に実験を行った。
結果を図13に示す。
NoKASIorII遺伝子と、Nannochloropsis oculata NIES-2145株由来アシル−ACPチオエステラーゼ(NoTE)遺伝子を大腸菌K27株(fadD88)に導入した多重形質転換体を作製した。
前記1.で構築したNoKASIorII遺伝子発現プラスミドを用いて、実施例1の3.と同様の方法にて大腸菌K27株を形質転換し、30℃で振とう培養した。培養24時間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例1と同様の方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpSTV28で形質転換したNoTE遺伝子導入K27株についても同様に実験を行った。
結果を図14に示す。
1.ClKASIV遺伝子及びBTE遺伝子導入株
ClKASIVをコードする遺伝子配列(配列番号71;Accession number: AJ344250.1;Shutt BS et al., ”Beta- ketoacyl-acyl carrier protein synthase IV: a key enzyme for regulation of medium-chain fatty acid synthesis in Cuphea lanceolata seeds” Planta. 2002 Sep;215 (5) p.847-54)を人工合成した。なお、配列番号71に示すClKASIV遺伝子は、配列番号2の遺伝子配列と49%の同一性を示し、配列番号70に示すNgKASIVのアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列と38.5%の同一性を示す。
合成したDNA断片を鋳型として、配列番号72及び73のプライマー対を用いてPCR反応を行い、ClKASIV遺伝子断片を取得した。
得られたClKASIV遺伝子断片と、実施例2で用いたユビキチンプロモーター配列と、VCP1ターミネーター配列とを、実施例1の1.と同様の方法でプラスミドベクターpUC19に融合し、ClKASIV遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドpUC-UEPp-ClKASIVを構築した。
ClKASIV遺伝子発現用プラスミドpUC-UEPp-ClKASIVを鋳型として、表1に示す配列番号29及び28のプライマー対を用いてPCR反応を行い、当該プラスミド中のプロモーター配列、ClKASIV遺伝子及びVCP1ターミネーター配列からなるClKASIV遺伝子発現用断片を増幅した。また、実施例2の2.に記載のプラスミドpUC-TUBp-aphVIIIを鋳型として、表1に示す配列番号30及び28のプライマー対を用いてPCR反応を行い、パラモマイシン耐性遺伝子発現用断片を増幅した。増幅した両断片を、実施例2の3.と同様の方法で、実施例2の3.で作成したBTE導入株に導入し、培養した。得られたコロニーの中から、ClKASIV遺伝子発現用断片を含むものをPCR法により選抜した。
2.で選抜した株を、f/2培地の窒素濃度を15倍、リン濃度を5倍に増強した培地(以下、N15P5培地)50mLに播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて4週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液10mLを、40mLのN15P5培地に植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて振盪培養した。培養3週間後、培養液に含まれる脂質成分を、実施例1と同様の方法にて解析した。なお、対照として、実施例2の3.で得られたBTE遺伝子のみを導入したナンノクロロプシス株と、実施例2の4.で得られたBTE及びNoKASIV導入ナンノクロロプシス株についても同様に実験を行った。
結果を図15に示す。
1.CTE遺伝子導入用プラスミドの作製
特開2011−250781号公報の実施例1の手法に従い、植物導入用プラスミドp909CTEを構築した。当該プラスミドは、CTE遺伝子がBrassica rapa由来のNapin遺伝子プロモーターにより発現制御され、BTE遺伝子由来の葉緑体移行シグナルペプチドによって葉緑体へと移行するよう設計されたものである。
当該プラスミドが有する、Brassica rapa由来のNapin遺伝子プロモーター配列を配列番号74に、Brassica rapa由来のNapin遺伝子ターミネーター配列を配列番号75に、BTE遺伝子由来の葉緑体移行シグナルペプチドを結合したCTE遺伝子の配列を配列番号76にそれぞれ示す。
下記の手順により、植物導入用ベクターpRI909(タカラバイオ製)が本来保持するカナマイシン耐性遺伝子を、Streptomyces hygroscopicus由来のビアラフォス耐性遺伝子(Bar遺伝子)に置換した。Bar遺伝子は、ホスフィノトリシンアセチル転移酵素をコードする。Streptomyces hygroscopicus由来のビアラフォス耐性遺伝子は、NCBIのGene Bankで開示された形質転換用ベクターpYW310(ACCESSION NO. DQ469641)の配列を参考に、Gene Script社の提供する受託合成サービスを利用して取得した(配列番号77)。人工合成遺伝子をテンプレートとし、PrimeSTAR、配列番号79と80のプライマー対を用いたPCR反応により、Bar遺伝子を増幅した。一方、pRI909をテンプレートとし、PrimeSTAR、配列番号81と82のプライマー対を用いたPCR反応により、pRI909ベクターからカナマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した。両増幅断片をNde IとSpe Iで処理し、ライゲーション反応で連結して、プラスミドpRI909 Barを構築した。
CTE遺伝子導入用プラスミドp909CTEを、インプランタイノベーションズ(株)によるシロイヌナズナ形質転換受託サービスに供し、CTE遺伝子を導入したシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana, Colombia株)の形質転換体を得た。シロイヌナズナは、野生型及び形質転換体を、室温22℃、蛍光灯照明を用いて明期24時間(約4000ルクス)の条件で育成した。約2ヶ月の栽培の後、種子を収穫した。
プラスミドp909Pnapus-NoKASIV-TnapinをAgrobacterium tumefaciens GV3101株に導入し、これを用いてp909CTEを導入したシロイヌナズナを形質転換した。播種後1.5ヶ月程度育成したシロイヌナズナの花序を切除し、さらに6〜7日間育成したものに、プラスミドを導入したアグロバクテリウムを感染させた。得られた種子を、MS寒天培地(100μg/mlクラフォラン、7μg/mlビアラフォスを含む)に播種し、形質転換体を選抜した。得られた形質転換体を室温22℃、蛍光灯照明を用いて明期24時間の条件で育成し、約2ヶ月の栽培の後、種子を収穫した。
シロイヌナズナ種子を、マルチビーズショッカー(安井器械製)を用いて粉砕し、そこに20μlの7-ペンタデカノン(0.5mg/ml メタノール)(内部標準)と20μlの酢酸を添加したクロロホルム0.25ml、メタノール0.5mlを加え、十分に攪拌した後、15分間静置した。さらに、1.5%KCl 0.25mlとクロロホルム0.25mlを添加し、十分に攪拌した後、15分間静置した。室温、1500rpmで5分間遠心分離を行った後、下層部分を採取し、窒素ガスで乾燥した。乾燥したサンプルに、0.5N水酸化カリウム−メタノール溶液を100μl加え、70℃で30分間恒温することによりトリアシルグリセロールを加水分解した。3‐フッ化ホウ素メタノール錯体溶液を0.3ml添加して乾燥物を溶解し、80℃で10分間恒温することにより脂肪酸のメチルエステル化処理を行った。その後、飽和食塩水0.2mlとヘキサン0.3mlを添加し、十分に攪拌した後、30分間静置した。脂肪酸のメチルエステルが含まれるヘキサン層(上層部分)を採取し、ガスクロマトグラフィ(GC)分析に供した。
GC解析は下記の条件で行った。
キャピラリーカラム:DB−1 MS 30m×200μm×0.25μm(J&W Scientific)、移動層:高純度ヘリウム、カラム内流量:1.0mL/min、昇温プログラム:150℃(0.5分間)→320℃(2分間)、平衡化時間:1分間、注入口:スプリット注入(スプリット比:75:1),圧力14.49psi,104mL/min,注入量5μL、洗浄バイアル:メタノール・クロロホルム、検出器温度:300℃
得られたデータを実施例1と同様の方法で解析した。結果を図16に示す。
Claims (13)
- 下記(1)及び(2)の工程を含む脂質の製造方法。
(1)宿主に下記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子、及び中鎖アシル−ACP特異的なアシル−ACPチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有するタンパク質
(2)得られた形質転換体から脂質を採取する工程 - 前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステルである、請求項1記載の製造方法。
- 前記(a)又は(b)のタンパク質が、中鎖アシル−ACP特異的なβ−ケトアシル−ACPシンターゼである、請求項1又は2記載の製造方法。
- 前記工程(2)が、セルレニンを含有する培地で形質転換体を培養する工程を含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記宿主が微生物又は植物である、請求項1〜4のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記微生物が微細藻類である、請求項5記載の製造方法。
- 前記微生物が大腸菌である、請求項5記載の製造方法。
- 宿主に下記(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子、及び中鎖アシル−ACP特異的なアシル−ACPチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有するタンパク質 - 前記宿主が微生物又は植物である、請求項8記載の形質転換体。
- 前記微生物が微細藻類である、請求項9記載の形質転換体。
- 前記微生物が大腸菌である、請求項9記載の形質転換体。
- 下記(a)又は(c)のタンパク質。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(c)(a)のタンパク質のアミノ酸配列と91%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有するタンパク質 - 請求項12記載のタンパク質をコードする遺伝子。
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