JP2016214183A - 脂質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】特定の炭素数の脂肪酸、又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法を提供する。【解決手段】下記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を宿主に導入して得た形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｄ）前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｆ）前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質【選択図】なし
Description
本発明は、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の製造方法、並びにこれに用いる形質転換体及びβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼに関する。
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１種であり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質（油脂）は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤又は殺菌剤に利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤に日常的に利用されている。さらに、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
例えば、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤又は殺菌剤に利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤に日常的に利用されている。さらに、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体ではアセチル−ＡＣＰ（acyl-carrier-protein）を出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリアプロテインとからなる複合体）が合成される。この脂肪酸合成経路に関与する酵素のうち、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（β-Ketoacyl-acyl-carrier-protein synthase、以下「ＫＡＳ」ともいう）はアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物では、ＫＡＳ Ｉ、ＫＡＳ ＩＩ、ＫＡＳ ＩＩＩ、ＫＡＳ ＩＶ、のそれぞれ機能が異なる４種のＫＡＳが存在することが知られている。このうち、ＫＡＳ ＩＩＩは鎖長伸長反応の開始段階で働き、炭素数２のアセチル−ＡＣＰを炭素数４のアシル−ＡＣＰに伸長する。それ以降の伸長反応には、ＫＡＳ Ｉ、ＫＡＳ ＩＩ、及びＫＡＳ ＩＶが関与する。ＫＡＳ Ｉは主に炭素数１６のパルミトイル−ＡＣＰまでの伸長反応に関与し、ＫＡＳ ＩＩは主に炭素数１８のステアロイルＡＣＰまでの伸長反応に関与する。一方、ＫＡＳ ＩＶは炭素数６〜１４の中鎖アシル−ＡＣＰまでの伸長反応に関与するといわれている。ＫＡＳ ＩＶについては、植物でもあまり知見が得られておらず、クフェア（Cuphea）などの中鎖脂肪酸を蓄積する植物に特有のＫＡＳとされている（特許文献１、及び非特許文献１参照）。
Dehesh K．et al.，The Plant Journal，1998，vol．15(3)，p．383-390
本発明は、特定の炭素数の脂肪酸、又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法を提供することを課題とする。
また本発明は、特定の炭素数の脂肪酸、又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた形質転換体を提供することを課題とする。
また本発明は、特定の炭素数の脂肪酸、又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた形質転換体を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、カリフォルニアベイ（Umbellularia californica）及びクスノキ（Cinnamomum camphora）からそれぞれ新たな植物由来のＫＡＳを同定した。そして、これらを用いて宿主を形質転換したところ、形質転換体では特定の炭素数の脂肪酸の生産性が向上することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
本発明は、下記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を宿主に導入して得た形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性（以下、「ＫＡＳ活性」ともいう）を有するタンパク質
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性（以下、「ＫＡＳ活性」ともいう）を有するタンパク質
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質
また本発明は、宿主に前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体に関する。
また本発明は、前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）に関する。
さらに本発明は、前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つをコードする遺伝子に関する。
また本発明は、前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）に関する。
さらに本発明は、前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つをコードする遺伝子に関する。
本発明の脂質の製造方法によれば、特定の炭素数の脂肪酸、又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
また本発明の形質転換体は、特定の炭素数の脂肪酸、又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
また本発明の形質転換体は、特定の炭素数の脂肪酸、又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
本明細書における「脂質」は、中性脂肪、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
また本明細書において、脂肪酸や脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数ｘで二重結合の数がｙであることを表す。「Ｃｘ」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において、脂肪酸や脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数ｘで二重結合の数がｙであることを表す。「Ｃｘ」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
本発明の形質転換体は、下記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子（以下、「ＫＡＳ遺伝子」ともいう）で形質転換されている。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質（前記タンパク質（ａ）と機能的に均等なタンパク質）
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質（前記タンパク質（ｃ）と機能的に均等なタンパク質）
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質（前記タンパク質（ｅ）と機能的に均等なタンパク質）
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質（前記タンパク質（ａ）と機能的に均等なタンパク質）
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質（前記タンパク質（ｃ）と機能的に均等なタンパク質）
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質（前記タンパク質（ｅ）と機能的に均等なタンパク質）
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、アメリカのSierra Seed Supply社より入手したカリフォルニアベイの種子由来のＫＡＳ（以下、「BKAS431」ともいう）である。配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質は、アメリカのSierra Seed Supply社より入手したカリフォルニアベイの種子由来のＫＡＳ（以下、「BKAS1082」ともいう）である。配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質は、花王和歌山工場内より採取したクスノキの種子由来のＫＡＳ（以下、「KKAS250」ともいう）である。
ＫＡＳは、脂肪酸合成経路においてアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体では、アセチル−ＡＣＰを出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰが合成される。次いで、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、「ＴＥ」ともいう）の作用によってアシル−ＡＣＰのチオエステル結合が加水分解され、遊離の脂肪酸が生成する。
脂肪酸合成の第一段階では、アセチル−ＡＣＰとマロニルＡＣＰとの縮合反応により、アセトアセチルＡＣＰが生成する。この反応をＫＡＳが触媒する。次いで、β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼによりアセトアセチルＡＣＰのケト基が還元されてヒドロキシブチリルＡＣＰが生成する。続いて、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼによりヒドロキシブチリルＡＣＰが脱水され、クロトニルＡＣＰが生成する。最後に、エノイル−ＡＣＰレダクターゼによりクロトニルＡＣＰが還元されて、ブチリルＡＣＰが生成する。これら一連の反応により、アセチル−ＡＣＰからアシル基の炭素鎖が２個伸長されたブチリルＡＣＰが生成する。以下、同様の反応を繰り返すことで、アシル−ＡＣＰの炭素鎖が伸長し、最終的に炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰが合成される。
ＫＡＳは、脂肪酸合成経路においてアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在する。葉緑体では、アセチル−ＡＣＰを出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰが合成される。次いで、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、「ＴＥ」ともいう）の作用によってアシル−ＡＣＰのチオエステル結合が加水分解され、遊離の脂肪酸が生成する。
脂肪酸合成の第一段階では、アセチル−ＡＣＰとマロニルＡＣＰとの縮合反応により、アセトアセチルＡＣＰが生成する。この反応をＫＡＳが触媒する。次いで、β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼによりアセトアセチルＡＣＰのケト基が還元されてヒドロキシブチリルＡＣＰが生成する。続いて、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼによりヒドロキシブチリルＡＣＰが脱水され、クロトニルＡＣＰが生成する。最後に、エノイル−ＡＣＰレダクターゼによりクロトニルＡＣＰが還元されて、ブチリルＡＣＰが生成する。これら一連の反応により、アセチル−ＡＣＰからアシル基の炭素鎖が２個伸長されたブチリルＡＣＰが生成する。以下、同様の反応を繰り返すことで、アシル−ＡＣＰの炭素鎖が伸長し、最終的に炭素数１６又は１８のアシル−ＡＣＰが合成される。
本明細書において「ＫＡＳ活性」とは、アセチル−ＡＣＰやアシル−ＡＣＰと、マロニルＡＣＰとの縮合反応を触媒する活性を意味する。
タンパク質がＫＡＳ活性を有することは、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、各種アシル−ＡＣＰを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
タンパク質がＫＡＳ活性を有することは、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、各種アシル−ＡＣＰを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
ＫＡＳはその基質特異性によってＫＡＳ Ｉ、ＫＡＳ ＩＩ、ＫＡＳ ＩＩＩ、又はＫＡＳ ＩＶに分類される。ＫＡＳ ＩＩＩは、炭素数２のアセチル−ＡＣＰを基質とし、炭素数２から４の伸長反応を触媒する。ＫＡＳ Ｉは、主に炭素数４から１６の伸長反応を触媒し、炭素数１６のパルミトイル−ＡＣＰを合成する。ＫＡＳ ＩＩは、主に炭素数１６から１８の伸長反応を触媒し、炭素数１８のステアロイルＡＣＰを合成する。ＫＡＳ ＩＶは炭素数６から１４の伸長反応を触媒し、中鎖アシル−ＡＣＰを合成する。
後述の実施例で示すように、前記タンパク質（ａ）（BKAS431）は、炭素数１６の脂肪酸に対する基質特異性を有し、これを選択的に合成する。よって前記タンパク質（ａ）及び（ｂ）は、ＫＡＳ Ｉであると考えられる。
また、前記タンパク質（ｃ）（BKAS1082）及びタンパク質（ｅ）（KKAS250）は後述の実施例で示すように、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有する。よって前記タンパク質（ｃ）〜（ｆ）は、ＫＡＳ ＩＶであると考えられる。ここで前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列は、前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列と９８．７％の同一性を有する。なお本明細書において「中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性」とは、ＫＡＳが、主に炭素数４〜１２のアシルＡＣＰを基質とし、炭素数１４までの中鎖アシルＡＣＰ合成の伸長反応を触媒することをいう。また本明細書において「中鎖」とは、アシル基の炭素数が６以上１４以下であることをいう。
ＫＡＳの基質特異性については、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。また、上記の系に後述するＴＥを共発現させ、ＴＥ単独を発現させた場合の脂肪酸組成と比較することにより確認できる。また、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を、宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
後述の実施例で示すように、前記タンパク質（ａ）（BKAS431）は、炭素数１６の脂肪酸に対する基質特異性を有し、これを選択的に合成する。よって前記タンパク質（ａ）及び（ｂ）は、ＫＡＳ Ｉであると考えられる。
また、前記タンパク質（ｃ）（BKAS1082）及びタンパク質（ｅ）（KKAS250）は後述の実施例で示すように、中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有する。よって前記タンパク質（ｃ）〜（ｆ）は、ＫＡＳ ＩＶであると考えられる。ここで前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列は、前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列と９８．７％の同一性を有する。なお本明細書において「中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性」とは、ＫＡＳが、主に炭素数４〜１２のアシルＡＣＰを基質とし、炭素数１４までの中鎖アシルＡＣＰ合成の伸長反応を触媒することをいう。また本明細書において「中鎖」とは、アシル基の炭素数が６以上１４以下であることをいう。
ＫＡＳの基質特異性については、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。また、上記の系に後述するＴＥを共発現させ、ＴＥ単独を発現させた場合の脂肪酸組成と比較することにより確認できる。また、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を、宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
前記タンパク質（ｂ）において、ＫＡＳ活性の点から、前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列との同一性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（ｂ）として、前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列に、１又は数個（例えば１個以上７３個以下、好ましくは１個以上４９個以下、より好ましくは１個以上２５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
前記タンパク質（ｄ）において、ＫＡＳ活性の点から、前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列との同一性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（ｄ）として、前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列に、１又は数個（例えば１個以上８６個以下、好ましくは１個以上５７個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、さらに好ましくは１個以上１２個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
前記タンパク質（ｆ）において、ＫＡＳ活性の点から、前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列との同一性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（ｆ）として、前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列に、１又は数個（例えば１個以上８６個以下、好ましくは１個以上５７個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、さらに好ましくは１個以上１２個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing overlap extension（SOE）-PCR反応を利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（商品名、タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（商品名、Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（商品名、東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
前記タンパク質（ｄ）において、ＫＡＳ活性の点から、前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列との同一性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（ｄ）として、前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列に、１又は数個（例えば１個以上８６個以下、好ましくは１個以上５７個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、さらに好ましくは１個以上１２個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
前記タンパク質（ｆ）において、ＫＡＳ活性の点から、前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列との同一性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上がさらに好ましい。また、前記タンパク質（ｆ）として、前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列に、１又は数個（例えば１個以上８６個以下、好ましくは１個以上５７個以下、より好ましくは１個以上２９個以下、さらに好ましくは１個以上１２個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing overlap extension（SOE）-PCR反応を利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（商品名、タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（商品名、Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（商品名、東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
前記ＫＡＳ遺伝子の一例として、下記ＤＮＡ（ｇ）〜（ｌ）のいずれかからなる遺伝子が挙げられる。
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｉ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｊ）前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｋ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｌ）前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｉ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｊ）前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｋ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｌ）前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列と８５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
配列番号２の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。配列番号４の塩基配列は、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。配列番号６の塩基配列は、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。
前記ＤＮＡ（ｈ）において、ＫＡＳ活性の点から、前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列との同一性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましい。また前記ＤＮＡ（ｈ）として、配列番号２で表される塩基配列において１又は数個（例えば１個以上２１８個以下、好ましくは１個以上１４５個以下、より好ましくは１個以上７３個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
前記ＤＮＡ（ｊ）において、ＫＡＳ活性の点から、前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列との同一性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましい。また前記ＤＮＡ（ｊ）として、配列番号４で表される塩基配列において１又は数個（例えば１個以上２５６個以下、好ましくは１個以上１７１個以下、より好ましくは１個以上８６個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
前記ＤＮＡ（ｌ）において、ＫＡＳ活性の点から、前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列との同一性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましい。また前記ＤＮＡ（ｌ）として、配列番号６で表される塩基配列において１又は数個（例えば１個以上２５６個以下、好ましくは１個以上１７１個以下、より好ましくは１個以上８６個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
前記ＤＮＡ（ｊ）において、ＫＡＳ活性の点から、前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列との同一性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましい。また前記ＤＮＡ（ｊ）として、配列番号４で表される塩基配列において１又は数個（例えば１個以上２５６個以下、好ましくは１個以上１７１個以下、より好ましくは１個以上８６個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
前記ＤＮＡ（ｌ）において、ＫＡＳ活性の点から、前記ＤＮＡ（ｋ）の塩基配列との同一性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましい。また前記ＤＮＡ（ｌ）として、配列番号６で表される塩基配列において１又は数個（例えば１個以上２５６個以下、好ましくは１個以上１７１個以下、より好ましくは１個以上８６個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
ＫＡＳ遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１、３又は５に示すアミノ酸配列又は配列番号２、４又は６に示す塩基配列に基づいて、ＫＡＳ遺伝子を人工的に合成できる。ＫＡＳ遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、カリフォルニアベイやクスノキのゲノムからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell，Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
本発明の形質転換体は、前記ＫＡＳ遺伝子に加えて、ＴＥをコードする遺伝子（以下、「ＴＥ遺伝子」ともいう）を宿主に導入してなるものが好ましい。
ＴＥは、ＫＡＳ等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。ＴＥの作用によってＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。そのため、宿主にＫＡＳ遺伝子とＴＥ遺伝子を共導入することで、形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
本発明で用いることができるＴＥは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性（以下、「ＴＥ活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「ＴＥ活性」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
ＴＥは、ＫＡＳ等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。ＴＥの作用によってＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。そのため、宿主にＫＡＳ遺伝子とＴＥ遺伝子を共導入することで、形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
本発明で用いることができるＴＥは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性（以下、「ＴＥ活性」ともいう）を有するタンパク質であればよい。ここで「ＴＥ活性」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
ＴＥは、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のＴＥが存在していることが知られている。よってＴＥは、生体内での脂肪酸組成を決定する重要なファクターであると考えられている。また、ＴＥをコードする遺伝子を元来有していない宿主を形質転換に用いる場合、ＴＥをコードする遺伝子、好ましくは中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＴＥをコードする遺伝子の共導入が効果的である。このような遺伝子を共導入することで、脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
本発明で用いることができるＴＥは、通常のＴＥや、それらと機能的に均等なタンパク質から、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。
具体的には、Umbellularia californicaのＴＥ（GenBank AAA34215.1）；Cuphea calophylla subsp．mesostemonのＴＥ（GenBank ABB71581）；Cinnamomum camphoraのＴＥ（GenBank AAC49151.1）；Myristica fragransのＴＥ（GenBank AAB71729）；Myristica fragransのＴＥ（GenBank AAB71730）；Cuphea lanceolataのＴＥ（GenBank CAA54060）；Cuphea hookerianaのＴＥ（GenBank Q39513）；Ulumus americanaのＴＥ（GenBank AAB71731）；Sorghum bicolorのＴＥ（GenBank EER87824）；Sorghum bicolorのＴＥ（GenBank EER88593）；Cocos nuciferaのＴＥ（CnFatB1：Jing et al．BMC Biochemistry 2011，12:44参照）；Cocos nuciferaのＴＥ（CnFatB2：Jing et al．BMC Biochemistry 2011，12:44参照）；Cuphea viscosissimaのＴＥ（CvFatB1：Jing et al．BMC Biochemistry 2011，12:44参照）；Cuphea viscosissimaのＴＥ（CvFatB2：Jing et al．BMC Biochemistry 2011，12:44参照）；Cuphea viscosissimaのＴＥ（CvFatB3：Jing et al．BMC Biochemistry 2011，12:44参照）；Elaeis guineensisのＴＥ（GenBank AAD42220）；Desulfovibrio vulgarisのＴＥ（GenBank ACL08376）；Bacteriodes fragilisのＴＥ（GenBank CAH09236）；Parabacteriodes distasonisのＴＥ（GenBank ABR43801）；Bacteroides thetaiotaomicronのＴＥ（GenBank AAO77182）；Clostridium asparagiformeのＴＥ（GenBank EEG55387）；Bryanthella formatexigensのＴＥ（GenBank EET61113）；Geobacillus sp.のＴＥ（GenBank EDV77528）；Streptococcus dysgalactiaeのＴＥ（GenBank BAH81730）；Lactobacillus brevisのＴＥ（GenBank ABJ63754）；Lactobacillus plantarumのＴＥ（GenBank CAD63310）；Anaerococcus tetradiusのＴＥ（GenBank EEI82564）；Bdellovibrio bacteriovorusのＴＥ（GenBank CAE80300）；Clostridium thermocellumのＴＥ（GenBank ABN54268）；Cocos nuciferaのＴＥ（CnFatB3：Jing et al．BMC Biochemistry 2011，12:44参照、配列番号７、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号８）；Nannochloropsis oculataのＴＥ（配列番号９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１０）；Nannochloropsis gaditanaのＴＥ（配列番号１１、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１２）；Nannochloropsis granulataのＴＥ（配列番号１３、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１４）；Symbiodinium microadriaticumのＴＥ（配列番号１５、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１６）、等が挙げられる。また、これらと機能的に均等なタンパク質として、上述したいずれかのＴＥのアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＴＥ活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、上述したいずれかのＴＥのアミノ酸配列に１又は数個（例えば１個以上１４７個以下、好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上５９個以下、さらに好ましくは１個以上３０個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、かつＴＥ活性を有するたタンパク質も用いることができる。
前記ＴＥの中でも、Umbellularia californicaのＴＥ、Cocos nuciferaのＴＥ、Cinnamonum camphorumのＴＥ、Elaeis guineensisのＴＥ、Cuphea種のＴＥ、Nannochloropsis oculataのＴＥ、Nannochloropsis gaditanaのＴＥ、Nannochloropsis granulataのＴＥ、Symbiodinium microadriaticumのＴＥ、これらのＴＥのアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＴＥ活性を有するタンパク質、又はこれらのＴＥのアミノ酸配列に１又は数個（例えば１個以上１４７個以下、好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上５９個以下、さらに好ましくは１個以上３０個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、かつＴＥ活性を有するタンパク質が好ましい。
これらのＴＥ及びそれらをコードする遺伝子の配列情報等は、例えば、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information，NCBI）などから入手することができる。
具体的には、Umbellularia californicaのＴＥ（GenBank AAA34215.1）；Cuphea calophylla subsp．mesostemonのＴＥ（GenBank ABB71581）；Cinnamomum camphoraのＴＥ（GenBank AAC49151.1）；Myristica fragransのＴＥ（GenBank AAB71729）；Myristica fragransのＴＥ（GenBank AAB71730）；Cuphea lanceolataのＴＥ（GenBank CAA54060）；Cuphea hookerianaのＴＥ（GenBank Q39513）；Ulumus americanaのＴＥ（GenBank AAB71731）；Sorghum bicolorのＴＥ（GenBank EER87824）；Sorghum bicolorのＴＥ（GenBank EER88593）；Cocos nuciferaのＴＥ（CnFatB1：Jing et al．BMC Biochemistry 2011，12:44参照）；Cocos nuciferaのＴＥ（CnFatB2：Jing et al．BMC Biochemistry 2011，12:44参照）；Cuphea viscosissimaのＴＥ（CvFatB1：Jing et al．BMC Biochemistry 2011，12:44参照）；Cuphea viscosissimaのＴＥ（CvFatB2：Jing et al．BMC Biochemistry 2011，12:44参照）；Cuphea viscosissimaのＴＥ（CvFatB3：Jing et al．BMC Biochemistry 2011，12:44参照）；Elaeis guineensisのＴＥ（GenBank AAD42220）；Desulfovibrio vulgarisのＴＥ（GenBank ACL08376）；Bacteriodes fragilisのＴＥ（GenBank CAH09236）；Parabacteriodes distasonisのＴＥ（GenBank ABR43801）；Bacteroides thetaiotaomicronのＴＥ（GenBank AAO77182）；Clostridium asparagiformeのＴＥ（GenBank EEG55387）；Bryanthella formatexigensのＴＥ（GenBank EET61113）；Geobacillus sp.のＴＥ（GenBank EDV77528）；Streptococcus dysgalactiaeのＴＥ（GenBank BAH81730）；Lactobacillus brevisのＴＥ（GenBank ABJ63754）；Lactobacillus plantarumのＴＥ（GenBank CAD63310）；Anaerococcus tetradiusのＴＥ（GenBank EEI82564）；Bdellovibrio bacteriovorusのＴＥ（GenBank CAE80300）；Clostridium thermocellumのＴＥ（GenBank ABN54268）；Cocos nuciferaのＴＥ（CnFatB3：Jing et al．BMC Biochemistry 2011，12:44参照、配列番号７、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号８）；Nannochloropsis oculataのＴＥ（配列番号９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１０）；Nannochloropsis gaditanaのＴＥ（配列番号１１、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１２）；Nannochloropsis granulataのＴＥ（配列番号１３、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１４）；Symbiodinium microadriaticumのＴＥ（配列番号１５、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１６）、等が挙げられる。また、これらと機能的に均等なタンパク質として、上述したいずれかのＴＥのアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＴＥ活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、上述したいずれかのＴＥのアミノ酸配列に１又は数個（例えば１個以上１４７個以下、好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上５９個以下、さらに好ましくは１個以上３０個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、かつＴＥ活性を有するたタンパク質も用いることができる。
前記ＴＥの中でも、Umbellularia californicaのＴＥ、Cocos nuciferaのＴＥ、Cinnamonum camphorumのＴＥ、Elaeis guineensisのＴＥ、Cuphea種のＴＥ、Nannochloropsis oculataのＴＥ、Nannochloropsis gaditanaのＴＥ、Nannochloropsis granulataのＴＥ、Symbiodinium microadriaticumのＴＥ、これらのＴＥのアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＴＥ活性を有するタンパク質、又はこれらのＴＥのアミノ酸配列に１又は数個（例えば１個以上１４７個以下、好ましくは１個以上１１９個以下、より好ましくは１個以上５９個以下、さらに好ましくは１個以上３０個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、かつＴＥ活性を有するタンパク質が好ましい。
これらのＴＥ及びそれらをコードする遺伝子の配列情報等は、例えば、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information，NCBI）などから入手することができる。
ＴＥは、基質となるアシル−ＡＣＰの脂肪酸鎖長及び不飽和度に対して特異性を有する。したがって、導入するＴＥの種類を変えることによって、シアノバクテリアに所望の鎖長や不飽和度の遊離脂肪酸を生産させることができる。
例えば、Umbellularia californica由来のＴＥは炭素数１２のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は主にラウリン酸（C12:0）などの炭素数１２の遊離脂肪酸である。また、Cinnamonum camphorum及びCocos nuciferaのＴＥは炭素数１４のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は主にミリスチン酸（C14:0）などの炭素数１４の遊離脂肪酸である。また、Escherichia coli K-12株のＴＥは、炭素数１６又は１８のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は主にパルミチン酸（C16:0）、パルミトレイン酸（C16:1）、ステアリン酸（C18:0)、オレイン酸（C18:1）、リノール酸（C18:2）、リノレン酸（C18:3）などの炭素数１６又は１８の遊離脂肪酸である。
例えば、Umbellularia californica由来のＴＥは炭素数１２のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は主にラウリン酸（C12:0）などの炭素数１２の遊離脂肪酸である。また、Cinnamonum camphorum及びCocos nuciferaのＴＥは炭素数１４のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は主にミリスチン酸（C14:0）などの炭素数１４の遊離脂肪酸である。また、Escherichia coli K-12株のＴＥは、炭素数１６又は１８のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は主にパルミチン酸（C16:0）、パルミトレイン酸（C16:1）、ステアリン酸（C18:0)、オレイン酸（C18:1）、リノール酸（C18:2）、リノレン酸（C18:3）などの炭素数１６又は１８の遊離脂肪酸である。
本発明においてＴＥ活性は、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にＴＥ遺伝子を連結した融合遺伝子を、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したＴＥ遺伝子が発現する条件下で細胞を培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にＴＥ遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入したＴＥ遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan L．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1995，vol．92(23)，p．10639-10643）に従い各種アシル−ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより確認できる。
本発明の形質転換体は、宿主に前記ＫＡＳ遺伝子を導入して得られる。当該形質転換体は、宿主自体に比べ、特定の炭素数の脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上する。また、当該形質転換体では、脂質中の脂肪酸組成が宿主に比べ改変される。なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
本発明の形質転換体は、前記ＫＡＳ遺伝子を常法により前記宿主に導入することで得られる。具体的には、前記ＫＡＳ遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現用ベクターを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
前記ＫＡＳ遺伝子に加えて前記ＴＥ遺伝子も導入した形質転換体も、常法により作製できる。
前記ＫＡＳ遺伝子に加えて前記ＴＥ遺伝子も導入した形質転換体も、常法により作製できる。
形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、微生物、藻類、微細藻類、植物体、及び動物体が挙げられる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、植物であることがより好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属の微生物やバシラス（Bacillus）属の微生物等の原核生物、酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂肪酸の生産性の観点から、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又はモルチエレラ・エスピー（Mortierella sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
前記微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ（Chlorella）属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又はナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、西洋アブラナ（Brassica napus）、アブラナ（Brassica rapa）、ココヤシ（Cocos nucifera）、パーム（Elaeis guineensis）、クフェア、ダイズ（Glycine max）、トウモロコシ（Zea mays）、イネ（Oryza sativa）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、クスノキ（Cinnamomum camphora）、又はヤトロファ（Jatropha curcas）が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属の微生物やバシラス（Bacillus）属の微生物等の原核生物、酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂肪酸の生産性の観点から、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、又はモルチエレラ・エスピー（Mortierella sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
前記微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ（Chlorella）属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又はナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、西洋アブラナ（Brassica napus）、アブラナ（Brassica rapa）、ココヤシ（Cocos nucifera）、パーム（Elaeis guineensis）、クフェア、ダイズ（Glycine max）、トウモロコシ（Zea mays）、イネ（Oryza sativa）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、クスノキ（Cinnamomum camphora）、又はヤトロファ（Jatropha curcas）が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
遺伝子発現用プラスミドベクターの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、pUC系ベクター（タカラバイオ社製）、pBluescript（pBS） II SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T．et al.,（1986）,Plasmid 15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、pMW218/219（ニッポンジーン社製）、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、IN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Yangmin Gong，Xiaojing Guo，Xia Wan，Zhuo Liang，Mulan Jiang，“Characterization of a novel thioesterase（PtTE）from Phaeodactylum tricornutum”，Journal of Basic Microbiology，2011 December，Volume 51，p.666-672.参照）、及びpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。本発明において、宿主としてシロイヌナズナを用いる場合、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、pUC系ベクター（タカラバイオ社製）、pBluescript（pBS） II SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T．et al.,（1986）,Plasmid 15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、pMW218/219（ニッポンジーン社製）、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、IN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Yangmin Gong，Xiaojing Guo，Xia Wan，Zhuo Liang，Mulan Jiang，“Characterization of a novel thioesterase（PtTE）from Phaeodactylum tricornutum”，Journal of Basic Microbiology，2011 December，Volume 51，p.666-672.参照）、及びpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。本発明において、宿主としてシロイヌナズナを用いる場合、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
また、前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、及びナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターが挙げられる。本発明で宿主としてシロイヌナズナを用いる場合、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーターを好ましく用いることができる。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
また、形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。形質転換方法としては、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。
また、形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。形質転換方法としては、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。
本発明の形質転換体は、特定の炭素数の脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産性が宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物又は生育物から脂質を回収すれば、効率のよく脂質を製造することができる。ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいい、「生育物」とは生育した後の形質転換体をいう。
本発明の形質転換体の培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
大腸菌を宿主として用いる場合、形質転換体の培養は、例えば、ＬＢ培地又はOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養することができる。
また、シロイヌナズナを宿主として用いる場合、形質転換体の培養は、例えば、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培することができる。
藻類を宿主として用いる場合、培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。培地に接種する形質転換体の量は適宜選択することができ、生育性の点から培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。なお形質転換体の培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
大腸菌を宿主として用いる場合、形質転換体の培養は、例えば、ＬＢ培地又はOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養することができる。
また、シロイヌナズナを宿主として用いる場合、形質転換体の培養は、例えば、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培することができる。
藻類を宿主として用いる場合、培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。培地に接種する形質転換体の量は適宜選択することができ、生育性の点から培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。なお形質転換体の培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
形質転換体が生産した脂質を回収する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物、生育物又は形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物、生育物又は形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
本発明の製造方法により得られる脂質は、その利用性の点から、単純脂質及び誘導脂質から選ばれる１種以上を含んでいることが好ましく、誘導脂質を含んでいることがより好ましく、脂肪酸又はそのエステルを含んでいることがさらに好ましく、脂肪酸又はそのエステルであることがよりさらに好ましい。
本発明の製造方法により得られる脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、形質転換体、形質転換体の製造方法、タンパク質、遺伝子、及び脂質生産性の向上方法を開示する。
＜１＞下記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を宿主に導入して得た形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質
＜２＞前記タンパク質（ｂ）が、前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列に、１又は数個、好ましくは１個以上７３個以下、より好ましくは１個以上４９個以下、さらに好ましくは１個以上２５個以下、特に好ましくは１個以上１０個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１＞項記載の方法。
＜３＞前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｇ）又は（ｈ）からなる遺伝子である、前記＜１＞又は＜２＞項記載の方法。
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、の同一性を有する塩基配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜４＞前記タンパク質（ａ）及び（ｂ）がＫＡＳ Ｉである、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の方法。
＜５＞前記タンパク質（ｄ）が、前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列に、１又は数個、好ましくは１個以上８６個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、さらに好ましくは１個以上２９個以下、特に好ましくは１個以上１２個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１＞項記載の方法。
＜６＞前記タンパク質（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｉ）又は（ｊ）からなる遺伝子である、前記＜１＞又は＜５＞項記載の方法。
（ｉ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｊ）前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、の同一性を有する塩基配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜７＞前記タンパク質（ｃ）及び（ｄ）がＫＡＳ ＩＶである、前記＜１＞、＜５＞及び＜６＞のいずれか１項記載の方法。
＜８＞前記タンパク質（ｆ）が、前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列に、１又は数個、好ましくは１個以上８６個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、さらに好ましくは１個以上２９個以下、特に好ましくは１個以上１２個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１＞項記載の方法。
＜９＞前記タンパク質（ｅ）又は（ｆ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｋ）又は（ｌ）からなる遺伝子である、前記＜１＞又は＜８＞項記載の方法。
（ｋ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｌ）前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、の同一性を有する塩基配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜１０＞前記タンパク質（ｅ）及び（ｆ）がＫＡＳ ＩＶである、前記＜１＞、＜８＞及び＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞前記宿主が微生物又は植物、好ましくはシロイヌナズナ、である、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞アグロバクテリウムを用いて前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を宿主としてのシロイヌナズナに導入し、前記形質転換体を作製した、前記＜１１＞項記載の方法。
＜１３＞形質転換体が生産した脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質をシロイヌナズナの種子から採取する、前記＜１２＞項記載の方法。
＜１４＞ＴＥをコードする遺伝子、好ましくは中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＴＥをコードする遺伝子、が前記宿主にさらに導入されている、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
＜１５＞前記ＴＥが、Umbellularia californicaのＴＥ、Cocos nuciferaのＴＥ、Cinnamonum camphorumのＴＥ、Elaeis guineensisのＴＥ、Cuphea種のＴＥ、Nannochloropsis oculataのＴＥ、Nannochloropsis gaditanaのＴＥ、Nannochloropsis granulataのＴＥ、及びSymbiodinium microadriaticumのＴＥからなる群より選ばれる少なくとも１種のＴＥである、前記＜１４＞項記載の方法。
＜３＞前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｇ）又は（ｈ）からなる遺伝子である、前記＜１＞又は＜２＞項記載の方法。
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｈ）前記ＤＮＡ（ｇ）の塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、の同一性を有する塩基配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜４＞前記タンパク質（ａ）及び（ｂ）がＫＡＳ Ｉである、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の方法。
＜５＞前記タンパク質（ｄ）が、前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列に、１又は数個、好ましくは１個以上８６個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、さらに好ましくは１個以上２９個以下、特に好ましくは１個以上１２個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１＞項記載の方法。
＜６＞前記タンパク質（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｉ）又は（ｊ）からなる遺伝子である、前記＜１＞又は＜５＞項記載の方法。
（ｉ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｊ）前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、の同一性を有する塩基配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜７＞前記タンパク質（ｃ）及び（ｄ）がＫＡＳ ＩＶである、前記＜１＞、＜５＞及び＜６＞のいずれか１項記載の方法。
＜８＞前記タンパク質（ｆ）が、前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列に、１又は数個、好ましくは１個以上８６個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、さらに好ましくは１個以上２９個以下、特に好ましくは１個以上１２個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１＞項記載の方法。
＜９＞前記タンパク質（ｅ）又は（ｆ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｋ）又は（ｌ）からなる遺伝子である、前記＜１＞又は＜８＞項記載の方法。
（ｋ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｌ）前記ＤＮＡ（ｉ）の塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、の同一性を有する塩基配列からなり、かつＫＡＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜１０＞前記タンパク質（ｅ）及び（ｆ）がＫＡＳ ＩＶである、前記＜１＞、＜８＞及び＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞前記宿主が微生物又は植物、好ましくはシロイヌナズナ、である、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞アグロバクテリウムを用いて前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を宿主としてのシロイヌナズナに導入し、前記形質転換体を作製した、前記＜１１＞項記載の方法。
＜１３＞形質転換体が生産した脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質をシロイヌナズナの種子から採取する、前記＜１２＞項記載の方法。
＜１４＞ＴＥをコードする遺伝子、好ましくは中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＴＥをコードする遺伝子、が前記宿主にさらに導入されている、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
＜１５＞前記ＴＥが、Umbellularia californicaのＴＥ、Cocos nuciferaのＴＥ、Cinnamonum camphorumのＴＥ、Elaeis guineensisのＴＥ、Cuphea種のＴＥ、Nannochloropsis oculataのＴＥ、Nannochloropsis gaditanaのＴＥ、Nannochloropsis granulataのＴＥ、及びSymbiodinium microadriaticumのＴＥからなる群より選ばれる少なくとも１種のＴＥである、前記＜１４＞項記載の方法。
＜１６＞宿主に前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体。
＜１７＞宿主に前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を導入する、形質転換体の製造方法。
＜１８＞前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を宿主に導入し、得られた形質転換体の脂質の生産性を向上させる、宿主の脂質生産性の向上方法。
＜１９＞前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を宿主に導入し、得られた形質転換体が生産する脂質中の脂肪酸組成を改変する、宿主が生産する脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
＜１７＞宿主に前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を導入する、形質転換体の製造方法。
＜１８＞前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を宿主に導入し、得られた形質転換体の脂質の生産性を向上させる、宿主の脂質生産性の向上方法。
＜１９＞前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を宿主に導入し、得られた形質転換体が生産する脂質中の脂肪酸組成を改変する、宿主が生産する脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
＜２０＞前記タンパク質（ｂ）が、前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列に、１又は数個、好ましくは１個以上７３個以下、より好ましくは１個以上４９個以下、さらに好ましくは１個以上２５個以下、特に好ましくは１個以上１０個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１６＞〜＜１９＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２１＞前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子が、前記ＤＮＡ（ｇ）又は（ｈ）からなる遺伝子である、前記＜１６＞〜＜２０＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２２＞前記タンパク質（ａ）及び（ｂ）がＫＡＳ Ｉである、前記＜１６＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２３＞前記タンパク質（ｄ）が、前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列に、１又は数個、好ましくは１個以上８６個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、さらに好ましくは１個以上２９個以下、特に好ましくは１個以上１２個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１６＞〜＜１９＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２４＞前記タンパク質（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子が、前記ＤＮＡ（ｉ）又は（ｊ）からなる遺伝子である、前記＜１６＞〜＜１９＞及び＜２３＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法前記＜１＞又は＜５＞項記載の方法。
＜２５＞前記タンパク質（ｃ）及び（ｄ）がＫＡＳ ＩＶである、前記＜１６＞〜＜１９＞、＜２３＞及び＜２４＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２６＞前記タンパク質（ｆ）が、前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列に、１又は数個、好ましくは１個以上８６個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、さらに好ましくは１個以上２９個以下、特に好ましくは１個以上１２個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１６＞〜＜１９＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２７＞前記タンパク質（ｅ）又は（ｆ）をコードする遺伝子が、前記ＤＮＡ（ｋ）又は（ｌ）からなる遺伝子である、前記＜１６＞〜＜１９＞及び＜２６＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２８＞前記タンパク質（ｅ）及び（ｆ）がＫＡＳ ＩＶである、前記＜１６＞〜＜１９＞、＜２６＞及び＜２７＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２９＞前記宿主が微生物又は植物、好ましくはシロイヌナズナ、である、前記＜１６＞〜＜２８＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜３０＞アグロバクテリウムを用いて前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を宿主としてのシロイヌナズナに導入し、前記形質転換体を作製した、前記＜２９＞項記載の形質転換体又は方法。
＜３１＞ＴＥをコードする遺伝子、好ましくは中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＴＥをコードする遺伝子、が前記宿主にさらに導入されている、前記＜１６＞〜＜３０＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜３２＞前記ＴＥが、Umbellularia californicaのＴＥ、Cocos nuciferaのＴＥ、Cinnamonum camphorumのＴＥ、Elaeis guineensisのＴＥ、Cuphea種のＴＥ、Nannochloropsis oculataのＴＥ、Nannochloropsis gaditanaのＴＥ、Nannochloropsis granulataのＴＥ、及びSymbiodinium microadriaticumのＴＥからなる群より選ばれる少なくとも１種のＴＥである、前記＜３１＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２１＞前記タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子が、前記ＤＮＡ（ｇ）又は（ｈ）からなる遺伝子である、前記＜１６＞〜＜２０＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２２＞前記タンパク質（ａ）及び（ｂ）がＫＡＳ Ｉである、前記＜１６＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２３＞前記タンパク質（ｄ）が、前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列に、１又は数個、好ましくは１個以上８６個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、さらに好ましくは１個以上２９個以下、特に好ましくは１個以上１２個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１６＞〜＜１９＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２４＞前記タンパク質（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子が、前記ＤＮＡ（ｉ）又は（ｊ）からなる遺伝子である、前記＜１６＞〜＜１９＞及び＜２３＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法前記＜１＞又は＜５＞項記載の方法。
＜２５＞前記タンパク質（ｃ）及び（ｄ）がＫＡＳ ＩＶである、前記＜１６＞〜＜１９＞、＜２３＞及び＜２４＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２６＞前記タンパク質（ｆ）が、前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列に、１又は数個、好ましくは１個以上８６個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、さらに好ましくは１個以上２９個以下、特に好ましくは１個以上１２個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記＜１６＞〜＜１９＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２７＞前記タンパク質（ｅ）又は（ｆ）をコードする遺伝子が、前記ＤＮＡ（ｋ）又は（ｌ）からなる遺伝子である、前記＜１６＞〜＜１９＞及び＜２６＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２８＞前記タンパク質（ｅ）及び（ｆ）がＫＡＳ ＩＶである、前記＜１６＞〜＜１９＞、＜２６＞及び＜２７＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜２９＞前記宿主が微生物又は植物、好ましくはシロイヌナズナ、である、前記＜１６＞〜＜２８＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜３０＞アグロバクテリウムを用いて前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を宿主としてのシロイヌナズナに導入し、前記形質転換体を作製した、前記＜２９＞項記載の形質転換体又は方法。
＜３１＞ＴＥをコードする遺伝子、好ましくは中鎖アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有するＴＥをコードする遺伝子、が前記宿主にさらに導入されている、前記＜１６＞〜＜３０＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜３２＞前記ＴＥが、Umbellularia californicaのＴＥ、Cocos nuciferaのＴＥ、Cinnamonum camphorumのＴＥ、Elaeis guineensisのＴＥ、Cuphea種のＴＥ、Nannochloropsis oculataのＴＥ、Nannochloropsis gaditanaのＴＥ、Nannochloropsis granulataのＴＥ、及びSymbiodinium microadriaticumのＴＥからなる群より選ばれる少なくとも１種のＴＥである、前記＜３１＞のいずれか１項記載の形質転換体又は方法。
＜３３＞前記タンパク質（ａ）〜（ｆ）。
＜３４＞前記＜３３＞項記載のタンパク質のいずれか１つをコードする遺伝子。
＜３４＞前記＜３３＞項記載のタンパク質のいずれか１つをコードする遺伝子。
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１に示す。
ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１に示す。
（調製例１）ココヤシのcDNAの調製
ココヤシ固形胚乳を液体窒素で凍結した後、マルチビーズショッカー（安井器械製）を用いて破砕した。破砕した固形胚乳にフェノール／クロロホルム、及び50mM Tris-HCl（pH9）を添加して混合し、7500rpmで10分間遠心操作を行い、上清を回収した。回収した上清に再度同様のフェノール／クロロホルム処理を行った。上層を回収し、これに対してエタノール沈殿操作を行い、そこに含まれる核酸成分を精製した。
RNA成分の精製のために、RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Valencia，California製）を用いた。エタノール沈殿後の核酸ペレットに、1M DTTを1/100容量添加したRLT Bufferを加えてボルテックスしたものを、QIA shredder spin columnにアプライした。以降はキット添付のマニュアルに従って操作を行い、最終的に脱イオン水（dH2O）でココヤシ由来のtotal RNAを溶出した。
得られたRNA溶液に対し、DNaseI（サーモサイエンティフィック社製）をバッファーとともに添加し、1時間37℃にて処理を行った。その後、フェノール／クロロホルム処理及びエタノール沈殿処理を行い、ココヤシ胚乳由来RNA溶液を調製した。
続いて、PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit（商品名、タカラバイオ社製）を用いて、得られたRNAからココヤシのcDNAを調製した。
ココヤシ固形胚乳を液体窒素で凍結した後、マルチビーズショッカー（安井器械製）を用いて破砕した。破砕した固形胚乳にフェノール／クロロホルム、及び50mM Tris-HCl（pH9）を添加して混合し、7500rpmで10分間遠心操作を行い、上清を回収した。回収した上清に再度同様のフェノール／クロロホルム処理を行った。上層を回収し、これに対してエタノール沈殿操作を行い、そこに含まれる核酸成分を精製した。
RNA成分の精製のために、RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Valencia，California製）を用いた。エタノール沈殿後の核酸ペレットに、1M DTTを1/100容量添加したRLT Bufferを加えてボルテックスしたものを、QIA shredder spin columnにアプライした。以降はキット添付のマニュアルに従って操作を行い、最終的に脱イオン水（dH2O）でココヤシ由来のtotal RNAを溶出した。
得られたRNA溶液に対し、DNaseI（サーモサイエンティフィック社製）をバッファーとともに添加し、1時間37℃にて処理を行った。その後、フェノール／クロロホルム処理及びエタノール沈殿処理を行い、ココヤシ胚乳由来RNA溶液を調製した。
続いて、PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit（商品名、タカラバイオ社製）を用いて、得られたRNAからココヤシのcDNAを調製した。
（調製例２）カリフォルニアベイのcDNAの調製
アメリカのSierra Seed Supply社より入手したカリフォルニアベイの種子を液体窒素で凍結した後、乳鉢と乳房を用いて破砕した。破砕した組織からFruit Mate（商品名、タカラバイオ社製）及びNucleoSpin RNA plant（商品名、タカラバイオ社製）を用いてRNAを抽出した。
続いて、PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit（商品名、タカラバイオ社製）を用いて、得られたRNAからカリフォルニアベイのcDNAを調製した。
アメリカのSierra Seed Supply社より入手したカリフォルニアベイの種子を液体窒素で凍結した後、乳鉢と乳房を用いて破砕した。破砕した組織からFruit Mate（商品名、タカラバイオ社製）及びNucleoSpin RNA plant（商品名、タカラバイオ社製）を用いてRNAを抽出した。
続いて、PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit（商品名、タカラバイオ社製）を用いて、得られたRNAからカリフォルニアベイのcDNAを調製した。
（調製例３）クスノキのcDNAの調製
花王和歌山工場内より採取したクスノキの種子を液体窒素で凍結した後、乳鉢と乳房を用いて破砕した。破砕した組織からFruit Mate（商品名、タカラバイオ社製）及びNucleoSpin RNA plant（商品名、タカラバイオ社製）を用いてRNAを抽出した。
続いて、PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit（商品名、タカラバイオ社製）を用いて、得られたRNAからクスノキのcDNAを調製した。
花王和歌山工場内より採取したクスノキの種子を液体窒素で凍結した後、乳鉢と乳房を用いて破砕した。破砕した組織からFruit Mate（商品名、タカラバイオ社製）及びNucleoSpin RNA plant（商品名、タカラバイオ社製）を用いてRNAを抽出した。
続いて、PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit（商品名、タカラバイオ社製）を用いて、得られたRNAからクスノキのcDNAを調製した。
（調製例４）ココヤシ由来のＴＥ遺伝子発現用プラスミドの構築
PowerPlant DNA Isolation Kit（商品名、MO BIO Laboratories社製，USA）を用いて、茨城県潮来市で採取したアブラナ及び栃木県益子町で採取したアブラナからそれぞれゲノムDNAを抽出した。
茨城県潮来市で採取したアブラナのゲノムDNAをテンプレートとし、DNAポリメラーゼPrimeSTAR（商品名、タカラバイオ社製）、並びに表１に示すプライマーNo．1（配列番号２２）及びプライマーNo．2（配列番号２３）を用いてPCRを行い、Napin遺伝子のプロモーターを増幅した。
また、栃木県益子町で採取したアブラナのゲノムDNAをテンプレートとし、DNAポリメラーゼPrimeSTAR（商品名、タカラバイオ社製）、並びに表１に示すプライマーNo．3（配列番号２４）及びプライマーNo．4（配列番号２５）を用いてPCRを行い、Napin遺伝子のターミネーターを増幅した。
増幅を確認したPCR産物をテンプレートとし、Napin遺伝子のプロモーターは表１に示すプライマーNo．5（配列番号２６）及びプライマーNo．6（配列番号２７）を、Napin遺伝子のターミネーターは表１に示すプライマーNo．3（配列番号２４）及びプライマーNo．7（配列番号２８）を用いて、それぞれ再度PCRを行った。このようにして、Napin遺伝子のプロモーター配列の断片（配列番号１７）と、Napin遺伝子のターミネーター配列の断片（配列番号１８）をそれぞれ作製した。
増幅したこれらの遺伝子断片をそれぞれMighty TA-cloning Kit（商品名、タカラバイオ社製）で処理した後、pMD20-Tベクター（商品名、タカラバイオ社製）にライゲーション反応により挿入した。このようにして、Napin遺伝子のプロモーター領域を導入したプラスミドpPNapin1、及びNapin遺伝子のターミネーター領域を導入したpTNapin1をそれぞれ構築した。
PowerPlant DNA Isolation Kit（商品名、MO BIO Laboratories社製，USA）を用いて、茨城県潮来市で採取したアブラナ及び栃木県益子町で採取したアブラナからそれぞれゲノムDNAを抽出した。
茨城県潮来市で採取したアブラナのゲノムDNAをテンプレートとし、DNAポリメラーゼPrimeSTAR（商品名、タカラバイオ社製）、並びに表１に示すプライマーNo．1（配列番号２２）及びプライマーNo．2（配列番号２３）を用いてPCRを行い、Napin遺伝子のプロモーターを増幅した。
また、栃木県益子町で採取したアブラナのゲノムDNAをテンプレートとし、DNAポリメラーゼPrimeSTAR（商品名、タカラバイオ社製）、並びに表１に示すプライマーNo．3（配列番号２４）及びプライマーNo．4（配列番号２５）を用いてPCRを行い、Napin遺伝子のターミネーターを増幅した。
増幅を確認したPCR産物をテンプレートとし、Napin遺伝子のプロモーターは表１に示すプライマーNo．5（配列番号２６）及びプライマーNo．6（配列番号２７）を、Napin遺伝子のターミネーターは表１に示すプライマーNo．3（配列番号２４）及びプライマーNo．7（配列番号２８）を用いて、それぞれ再度PCRを行った。このようにして、Napin遺伝子のプロモーター配列の断片（配列番号１７）と、Napin遺伝子のターミネーター配列の断片（配列番号１８）をそれぞれ作製した。
増幅したこれらの遺伝子断片をそれぞれMighty TA-cloning Kit（商品名、タカラバイオ社製）で処理した後、pMD20-Tベクター（商品名、タカラバイオ社製）にライゲーション反応により挿入した。このようにして、Napin遺伝子のプロモーター領域を導入したプラスミドpPNapin1、及びNapin遺伝子のターミネーター領域を導入したpTNapin1をそれぞれ構築した。
前記プラスミドpPNapin1をテンプレートとし、PrimeSTAR、並びに表１に示すプライマーNo．8（配列番号２９）及びプライマーNo．9（配列番号３０）を用いてPCRを行い、両末端に制限酵素認識配列を付加したプロモーター配列を増幅した。また、前記プラスミドpTNapin1をテンプレートとし、PrimeSTAR、並びに表１に示すプライマーNo．10（配列番号３１）及びプライマーNo．11（配列番号３２）を用いてPCR反応を行い、ターミネーター配列を増幅した。
増幅したPCR産物は、Mighty TA-cloning Kit（商品名、タカラバイオ社製）を用いて処理した後、pMD20-Tベクターにライゲーション反応により挿入し、プラスミドpPNapin2及びプラスミドpTNapin2をそれぞれ構築した。プラスミドpPNapin2を制限酵素SalIとNotIで、プラスミドpTNapin2を制限酵素SmaIとNotIでそれぞれ処理し、SalIとSmaIで処理したpRI909ベクター（タカラバイオ社製）にライゲーション反応で連結し、プラスミドp909PTnapinを構築した。
増幅したPCR産物は、Mighty TA-cloning Kit（商品名、タカラバイオ社製）を用いて処理した後、pMD20-Tベクターにライゲーション反応により挿入し、プラスミドpPNapin2及びプラスミドpTNapin2をそれぞれ構築した。プラスミドpPNapin2を制限酵素SalIとNotIで、プラスミドpTNapin2を制限酵素SmaIとNotIでそれぞれ処理し、SalIとSmaIで処理したpRI909ベクター（タカラバイオ社製）にライゲーション反応で連結し、プラスミドp909PTnapinを構築した。
次に、カリフォルニア・ベイ由来のＴＥ（以下、BTEとも略記する）遺伝子の葉緑体移行シグナルペプチドをコードする遺伝子（配列番号１９）を、Invitrogen社（Carlsbad，California）の提供する受託合成サービスを利用して取得した。取得した遺伝子配列を含むプラスミドをテンプレートとし、PrimeSTAR、並びに表１に示すプライマーNo．12（配列番号３３）及びプライマーNo．13（配列番号３４）を用いてPCRを行い、シグナルペプチドをコードする遺伝子断片を増幅した。Mighty TA-cloning Kit（商品名、タカラバイオ社製）を用いて、増幅した遺伝子断片の両末端にデオキシアデニン（dA）を付加した後、pMD20-Tベクター（タカラバイオ社製）にライゲーション反応により挿入し、プラスミドpSignalを構築した。構築したプラスミドpSignalを制限酵素NotIで処理し、プラスミドp909PTnapinのNotIサイトにライゲーション反応で連結し、プラスミドp909PTnapin-Sを得た。
調製例１で調製したココヤシ胚乳由来のcDNAをテンプレートとし、制限酵素PrimeSTAR MAX（商品名、タカラバイオ社製）、並びに表１に示すプライマーNo．14（配列番号３５）及びプライマーNo．15（配列番号３６）を用いてPCRを行い、ココヤシ由来のＴＥ（以下、CTEとも略記する）をコードする遺伝子断片（配列番号８）を増幅した。
また、前記p909PTnapin-Sをテンプレートとし、表１に示すプライマーNo．16（配列番号３７）及びプライマーNo．17（配列番号３８）を用いて、p909PTnapin-Sの直鎖状断片を増幅した。
また、前記p909PTnapin-Sをテンプレートとし、表１に示すプライマーNo．16（配列番号３７）及びプライマーNo．17（配列番号３８）を用いて、p909PTnapin-Sの直鎖状断片を増幅した。
前記CTE遺伝子断片と前記の直鎖状p909PTnapin-S断片とを、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit（商品名、クロンテック社製）を用いてIn-fusion反応により連結し、プラスミドp909CTEを構築した。当該プラスミドp909CTEは、CTE遺伝子の発現がアブラナ由来のNapin遺伝子のプロモーターにより制御され、発現したCTE遺伝子がBTE遺伝子由来の葉緑体移行シグナルペプチドによって葉緑体へと移行するよう設計されている。
（調製例５）ＫＡＳ遺伝子発現用プラスミドの構築
NCBIのGene Bankで開示された形質転換用ベクターpYW310（ACCESSION NO．DQ469641）の配列を参考に、Streptomyces hygroscopicus由来のホスフィノトリシンアセチル転移酵素をコードするビアラフォス耐性遺伝子（Bar遺伝子、配列番号２０）をGene Script社の提供する受託合成サービスを利用して取得した。
合成したBar遺伝子をテンプレートとし、PrimeSTAR、並びに表１に示すプライマーNo．18（配列番号３９）及びプライマーNo．19（配列番号４０）を用いてPCRを行い、Bar遺伝子を増幅した。一方、pRI909をテンプレートとし、PrimeSTAR、並びに表１に示すプライマーNo．20（配列番号４１）及びプライマーNo．21（配列番号４２）を用いてPCR反応を行い、pRI909ベクターからカナマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した。これらの遺伝子断片断片をNdeI及びSpeIで処理し、ライゲーション反応で連結して、ベクターpRI909が本来保持するカナマイシン耐性遺伝子をBar遺伝子に置換したプラスミドpRI909Barを構築した。
NCBIのGene Bankで開示された形質転換用ベクターpYW310（ACCESSION NO．DQ469641）の配列を参考に、Streptomyces hygroscopicus由来のホスフィノトリシンアセチル転移酵素をコードするビアラフォス耐性遺伝子（Bar遺伝子、配列番号２０）をGene Script社の提供する受託合成サービスを利用して取得した。
合成したBar遺伝子をテンプレートとし、PrimeSTAR、並びに表１に示すプライマーNo．18（配列番号３９）及びプライマーNo．19（配列番号４０）を用いてPCRを行い、Bar遺伝子を増幅した。一方、pRI909をテンプレートとし、PrimeSTAR、並びに表１に示すプライマーNo．20（配列番号４１）及びプライマーNo．21（配列番号４２）を用いてPCR反応を行い、pRI909ベクターからカナマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した。これらの遺伝子断片断片をNdeI及びSpeIで処理し、ライゲーション反応で連結して、ベクターpRI909が本来保持するカナマイシン耐性遺伝子をBar遺伝子に置換したプラスミドpRI909Barを構築した。
NCBIのGene Bankに開示されたBrassica napus napin Promoter（ACCESSION NO．EU416279）の配列を参考に、西洋アブラナの種子で発現するNapinプロモーター（配列番号２１）をGene Script社の提供する受託合成サービスを利用して取得した。
合成したNapinプロモーターをテンプレートとし、表１に示すプライマーNo．22（配列番号４３）及びプライマーNo．23（配列番号４４）を用いてPCRを行い、Napinプロモーターを増幅した。また、プラスミドpRI909Barをテンプレートとし、表１に示すプライマーNo．24（配列番号４５）及びプライマーNo．25（配列番号４６）を用いてPCRを行い、pRI909Barの直鎖状断片を増幅した。さらに、プラスミドp909CTEをテンプレートとし、表１に示すプライマーNo．26（配列番号４７）及びプライマーNo．27（配列番号４８）を用いてPCRを行い、CTE-Tnapin配列を増幅した。これらの遺伝子断片を、調製例４と同様にIn-fusion反応を行い、プラスミドp909Pnapus-CTE-Tnapinを構築した。
合成したNapinプロモーターをテンプレートとし、表１に示すプライマーNo．22（配列番号４３）及びプライマーNo．23（配列番号４４）を用いてPCRを行い、Napinプロモーターを増幅した。また、プラスミドpRI909Barをテンプレートとし、表１に示すプライマーNo．24（配列番号４５）及びプライマーNo．25（配列番号４６）を用いてPCRを行い、pRI909Barの直鎖状断片を増幅した。さらに、プラスミドp909CTEをテンプレートとし、表１に示すプライマーNo．26（配列番号４７）及びプライマーNo．27（配列番号４８）を用いてPCRを行い、CTE-Tnapin配列を増幅した。これらの遺伝子断片を、調製例４と同様にIn-fusion反応を行い、プラスミドp909Pnapus-CTE-Tnapinを構築した。
前記プラスミドp909Pnapus-CTE-Tnapinをテンプレートとし、表１に示すプライマーNo．28（配列番号４９）及びプライマーNo．29（配列番号５０）を用いてPCRを行い、遺伝子断片を増幅した。また、カリフォルニアベイの種子由来cDNAをテンプレートとし、表１に示すプライマーNo．30（配列番号５１）及びプライマーNo．31（配列番号５２）を用いてPCRを行い、BKAS431をコードする遺伝子断片（配列番号２）を増幅した。これらの遺伝子断片をIn-fusion反応により連結し、p909Pnapus-BKAS431-Tnapinを構築した。
同様に、表１に示すプライマーNo．32（配列番号５３）とプライマーNo．33（配列番号５４）を用いてBKAS1082をコードする遺伝子断片（配列番号４）を増幅し、p909Pnapus-BKAS431-TnapinのBKAS431遺伝子をBKAS1082遺伝子に代えた、p909Pnapus-BKAS1082-TnapinをIn-fusion反応により構築した。
さらに、クスノキ種子由来cDNAをテンプレートとし、表１に示すプライマーNo．34（配列番号５５）とプライマーNo．35（配列番号５６）を用いてPCRを行い、KKAS250をコードする遺伝子断片（配列番号６）を増幅した。そして、p909Pnapus-BKAS431-TnapinのBKAS431遺伝子をKKAS250遺伝子に代えた、p909Pnapus-KKAS250-TnapinをIn-fusion反応により構築した。
同様に、表１に示すプライマーNo．32（配列番号５３）とプライマーNo．33（配列番号５４）を用いてBKAS1082をコードする遺伝子断片（配列番号４）を増幅し、p909Pnapus-BKAS431-TnapinのBKAS431遺伝子をBKAS1082遺伝子に代えた、p909Pnapus-BKAS1082-TnapinをIn-fusion反応により構築した。
さらに、クスノキ種子由来cDNAをテンプレートとし、表１に示すプライマーNo．34（配列番号５５）とプライマーNo．35（配列番号５６）を用いてPCRを行い、KKAS250をコードする遺伝子断片（配列番号６）を増幅した。そして、p909Pnapus-BKAS431-TnapinのBKAS431遺伝子をKKAS250遺伝子に代えた、p909Pnapus-KKAS250-TnapinをIn-fusion反応により構築した。
（調製例６）形質転換体の作製
、インプランタイノベーションズ社によるシロイヌナズナの形質転換受託サービスにより、前記プラスミドp909CTEを用いて、CTE遺伝子を導入したシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana，Colombia株）の形質転換体を得た。得られたシロイヌナズナの形質転換体（WT::CTE）、及び野生型シロイヌナズナ（WT）を、22℃、蛍光灯照明を用いて明期24時間（約4000ルクス）の条件で育成した。約2ヶ月の栽培の後、種子を収穫した。
、インプランタイノベーションズ社によるシロイヌナズナの形質転換受託サービスにより、前記プラスミドp909CTEを用いて、CTE遺伝子を導入したシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana，Colombia株）の形質転換体を得た。得られたシロイヌナズナの形質転換体（WT::CTE）、及び野生型シロイヌナズナ（WT）を、22℃、蛍光灯照明を用いて明期24時間（約4000ルクス）の条件で育成した。約2ヶ月の栽培の後、種子を収穫した。
このようにして得られたp909CTEを導入したシロイヌナズナWT::CTEを親株として、以降の形質転換実験を行った。
前記プラスミドp909Pnapus-BKAS431-Tnapin、p909Pnapus-BKAS1082-Tnapin、及びp909Pnapus-KKAS250-Tnapinを導入したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）GV3101株を用い、p909CTEを導入したシロイヌナズナWT::CTEに対して形質転換操作を行った。播種後1.5ヶ月程度育成したシロイヌナズナの花序を切除後6-7日間育成して再形成された花序に各プラスミドを導入したアグロバクテリウムを感染させた。
アグロバクテリウム感染処理後1-2か月程度育成して得られた種子を、MS寒天培地（100μg/mLクラフォラン、7μg/mLビアラフォスを含む）に播種し、形質転換体（WT::CTE::BKAS431、WT::CTE::BKAS1082、WT::CTE::KKAS250）を選抜した。選抜した形質転換体を22℃、蛍光灯照明を用いて明期24時間の条件で育成し、約2ヶ月の栽培の後、種子を収穫した。
前記プラスミドp909Pnapus-BKAS431-Tnapin、p909Pnapus-BKAS1082-Tnapin、及びp909Pnapus-KKAS250-Tnapinを導入したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）GV3101株を用い、p909CTEを導入したシロイヌナズナWT::CTEに対して形質転換操作を行った。播種後1.5ヶ月程度育成したシロイヌナズナの花序を切除後6-7日間育成して再形成された花序に各プラスミドを導入したアグロバクテリウムを感染させた。
アグロバクテリウム感染処理後1-2か月程度育成して得られた種子を、MS寒天培地（100μg/mLクラフォラン、7μg/mLビアラフォスを含む）に播種し、形質転換体（WT::CTE::BKAS431、WT::CTE::BKAS1082、WT::CTE::KKAS250）を選抜した。選抜した形質転換体を22℃、蛍光灯照明を用いて明期24時間の条件で育成し、約2ヶ月の栽培の後、種子を収穫した。
（試験例１）シロイヌナズナの種子からの脂質の抽出、及び脂質のメチルエステル化
得られた各シロイヌナズナ種子を、マルチビーズショッカー（安井器械社製）で粉砕した。この粉砕物に、7-ペンタデカノン（0.5mg/mLメタノール）20μL（内部標準）と酢酸20μLを添加したクロロホルム0.25mL、及びメタノール0.5mlを加え、十分に攪拌し、１５分間静置した。さらに、1.5％KCl 0.25mLとクロロホルム0.25mLを添加して十分に攪拌し、１５分間静置した。室温、1500rpmで5分間遠心分離を行った後、下層部分を採取し、窒素ガスで乾燥した。
乾燥したサンプルに、0.5Ｎ水酸化カリウム−メタノール溶液100μLを加え、70℃で３０分間恒温することによりトリアシルグリセロールを加水分解した。さらに、3‐フッ化ホウ素メタノール錯体溶液を0.3mL添加して乾燥物を溶解し、８０℃で１０分間恒温することにより脂肪酸のメチルエステル化処理を行った。その後、飽和食塩水0.2mLとヘキサン0.3mLを添加して十分に攪拌し、３０分間静置した。脂肪酸のメチルエステルが含まれるヘキサン層（上層部分）を採取し、下記条件のガスクロマトグラフィ（GC）分析に供した。
得られた各シロイヌナズナ種子を、マルチビーズショッカー（安井器械社製）で粉砕した。この粉砕物に、7-ペンタデカノン（0.5mg/mLメタノール）20μL（内部標準）と酢酸20μLを添加したクロロホルム0.25mL、及びメタノール0.5mlを加え、十分に攪拌し、１５分間静置した。さらに、1.5％KCl 0.25mLとクロロホルム0.25mLを添加して十分に攪拌し、１５分間静置した。室温、1500rpmで5分間遠心分離を行った後、下層部分を採取し、窒素ガスで乾燥した。
乾燥したサンプルに、0.5Ｎ水酸化カリウム−メタノール溶液100μLを加え、70℃で３０分間恒温することによりトリアシルグリセロールを加水分解した。さらに、3‐フッ化ホウ素メタノール錯体溶液を0.3mL添加して乾燥物を溶解し、８０℃で１０分間恒温することにより脂肪酸のメチルエステル化処理を行った。その後、飽和食塩水0.2mLとヘキサン0.3mLを添加して十分に攪拌し、３０分間静置した。脂肪酸のメチルエステルが含まれるヘキサン層（上層部分）を採取し、下記条件のガスクロマトグラフィ（GC）分析に供した。
＜ガスクロマトグラフィ（GC）条件＞
カラム：DB1-MS（J&W Scientific，Folsom，California）
分析装置：6890（Agilent technology，Santa Clara，California）
カラムオーブン温度：１５０℃保持０．５分→１５０〜３２０℃（２０℃/分昇温）→３２０℃保持２分
注入口検出器温度：３００℃
注入法：スプリットモード（スプリット比＝７５：１）
サンプル注入量：5μL
カラム流速：0.3ml/min コンスタント
検出器：FID
キャリアガス：水素
メイクアップガス：ヘリウム
カラム：DB1-MS（J&W Scientific，Folsom，California）
分析装置：6890（Agilent technology，Santa Clara，California）
カラムオーブン温度：１５０℃保持０．５分→１５０〜３２０℃（２０℃/分昇温）→３２０℃保持２分
注入口検出器温度：３００℃
注入法：スプリットモード（スプリット比＝７５：１）
サンプル注入量：5μL
カラム流速：0.3ml/min コンスタント
検出器：FID
キャリアガス：水素
メイクアップガス：ヘリウム
GC解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。なお、種子中の各脂質に対応するGCのピークは、各脂肪酸の標準品のメチルエステルの保持時間により同定した。また、各ピーク面積を内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、解析に供した全種子中に含まれる全脂肪酸量に対する各脂肪酸量の割合を算出した。その結果を表２に示す。なお、表２において、野生型及については１ラインの値を、その他については独立した３ラインの平均値を示した。
表２に示すように、野生型の種子に比べ、CTE遺伝子のみを導入した形質転換体WT::CTEの種子ではＣ１２：０脂肪酸量が約３％、Ｃ１４：０脂肪酸量が約１３％、Ｃ１６：０脂肪酸量が約１５％増加した。
一方、CTE遺伝子とBKAS431遺伝子を導入した形質転換体WT::CTE::BKAS431では、形質転換体WT::CTEと比べて、Ｃ１６：０脂肪酸量とＣ１８：ｎ脂肪酸量が増加した。しかし、Ｃ１２：０脂肪酸量とＣ１４：０脂肪酸量が減少した。
さらに、CTE遺伝子とBKAS1082遺伝子を導入した形質転換体WT::CTE::BKAS1082、並びにCTE遺伝子とKKAS250遺伝子を導入した形質転換体WT::CTE::KKAS250では、形質転換体WT::CTEと比べて、Ｃ１２：０脂肪酸量が増加し、Ｃ１６：０脂肪酸量が減少した。
一方、CTE遺伝子とBKAS431遺伝子を導入した形質転換体WT::CTE::BKAS431では、形質転換体WT::CTEと比べて、Ｃ１６：０脂肪酸量とＣ１８：ｎ脂肪酸量が増加した。しかし、Ｃ１２：０脂肪酸量とＣ１４：０脂肪酸量が減少した。
さらに、CTE遺伝子とBKAS1082遺伝子を導入した形質転換体WT::CTE::BKAS1082、並びにCTE遺伝子とKKAS250遺伝子を導入した形質転換体WT::CTE::KKAS250では、形質転換体WT::CTEと比べて、Ｃ１２：０脂肪酸量が増加し、Ｃ１６：０脂肪酸量が減少した。
以上のように、本発明で規定するＫＡＳ遺伝子を宿主に導入することで、特定の炭素数の脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、特定の脂肪酸の生産性を向上させることができる。
（試験例２）BKAS431、BKAS1082及びKKAS250の同定
BLASTプログラム（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）によるホモロジーサーチを用いて、前記BKAS431、BKAS1082及びKKAS250の同定を行った。
その結果、BKAS431はＫＡＳ Ｉとしてアノテーションされた。前述のように、ＫＡＳ Ｉはアシル−ＡＣＰを炭素数１６まで伸長させる。これは、前記表２に示した、BKAS431遺伝子を導入することでＣ１６：０脂肪酸量が増加した結果と一致する。
一方、BKAS1082及びKKAS250はＫＡＳ ＩＩとしてアノテーションされた。なお、前述のように、ＫＡＳ ＩＩは炭素数１６のアシル−ＡＣＰを炭素数１８のアシル−ＡＣＰへ変換する反応を触媒する酵素である。しかしこのアノテーションの結果は、BKAS1082遺伝子又はKKAS250遺伝子を導入することでＣ１２：０などの中鎖脂肪酸量が増加するという、前記表２に示す結果とは一致しない。これらの結果は、植物のＫＡＳについての従来の知見が不十分であり、中鎖脂肪酸の生成に関与するＫＡＳ ＩＶ遺伝子がほとんど同定されていないためと考えられる。
BLASTプログラム（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）によるホモロジーサーチを用いて、前記BKAS431、BKAS1082及びKKAS250の同定を行った。
その結果、BKAS431はＫＡＳ Ｉとしてアノテーションされた。前述のように、ＫＡＳ Ｉはアシル−ＡＣＰを炭素数１６まで伸長させる。これは、前記表２に示した、BKAS431遺伝子を導入することでＣ１６：０脂肪酸量が増加した結果と一致する。
一方、BKAS1082及びKKAS250はＫＡＳ ＩＩとしてアノテーションされた。なお、前述のように、ＫＡＳ ＩＩは炭素数１６のアシル−ＡＣＰを炭素数１８のアシル−ＡＣＰへ変換する反応を触媒する酵素である。しかしこのアノテーションの結果は、BKAS1082遺伝子又はKKAS250遺伝子を導入することでＣ１２：０などの中鎖脂肪酸量が増加するという、前記表２に示す結果とは一致しない。これらの結果は、植物のＫＡＳについての従来の知見が不十分であり、中鎖脂肪酸の生成に関与するＫＡＳ ＩＶ遺伝子がほとんど同定されていないためと考えられる。
Claims (10)
- 下記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を宿主に導入して得た形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質 - アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が前記宿主にさらに導入されている、請求項１記載の製造方法。
- 前記宿主が植物である、請求項１又は２記載の製造方法
- 前記宿主がシロイヌナズナである、請求項３記載の製造方法。
- 宿主に下記タンパク質（ａ）〜（ｆ）のいずれかをコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質 - アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が前記宿主にさらに導入されている、請求項５記載の形質転換体。
- 前記宿主が植物である、請求項５又は６記載の形質転換体
- 前記宿主がシロイヌナズナである、請求項７記載の形質転換体。
- 下記タンパク質（ａ）〜（ｆ）。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）前記タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）前記タンパク質（ｅ）のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ活性を有するタンパク質 - 請求項９記載のタンパク質のいずれか１つをコードする遺伝子。
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| JP2018099107A (ja) * | 2016-12-19 | 2018-06-28 | 花王株式会社 | 脂質の製造方法 |
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| JP2003501063A (ja) * | 1999-06-09 | 2003-01-14 | カルジーン エルエルシー | 新規基質特異性に関するβ−ケトアシルＡＣＰシンターゼの加工 |
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