JP6568718B2 - 脂質の製造方法 - Google Patents
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- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01041—Beta-ketoacyl-acyl-carrier-protein synthase I (2.3.1.41)
Description
例えば、炭素数12〜18前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤又は殺菌剤に利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル4級アミン塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型4級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤に日常的に利用されている。さらに、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
そのためシアノバクテリアは外来DNAを細胞内に導入することで微生物学的な物質生産に利用可能であることから、バイオ燃料などの物質の生産用宿主として注目されている。
また本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性及び生産される全脂肪酸の生産性を向上させた、シアノバクテリアの形質転換体を提供することを課題とする。
本発明者らはまず、中鎖脂肪酸の生産性及び生産される脂肪酸の総量を向上させるために宿主に導入するKASとして、藻類の1種であるナンノクロロプシス(Nannochloropsis)属の藻類のKASに着目した。そして、ナンノクロロプシス属の藻類のKASをシアノバクテリアに導入して形質転換体を作製したところ、形質転換体が生産する中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性及び生産される脂肪酸の総量が有意に向上することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)前記タンパク質(a)のアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性(以下、「KAS活性」ともいう)を有するタンパク質
また本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性及び生産される全脂肪酸の生産性に優れる。
また本明細書において、脂肪酸や脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Cx:y」とあるのは、炭素原子数xで二重結合の数がyであることを表す。「Cx」は炭素原子数xの脂肪酸やアシル基を表す。
さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法(Science,1985,vol.227,p.1435-1441)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)タンパク質(a)のアミノ酸配列と60%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質(前記タンパク質(a)と機能的に均等なタンパク質)
KASは、脂肪酸合成経路においてアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物と同様、藻類の脂肪酸合成経路も葉緑体に局在する。葉緑体では、アセチル−ACPを出発物質とし、炭素鎖の伸長反応が繰り返され、最終的に炭素数16又は18のアシル−ACPが合成される。次いで、アシル−ACPチオエステラーゼ(以下、「TE」ともいう)の作用によってアシル−ACPのチオエステル結合が加水分解され、遊離の脂肪酸が生成する。
脂肪酸合成の第一段階では、アセチル−ACPとマロニルACPとの縮合反応により、アセトアセチルACPが生成する。この反応をKASが触媒する。次いで、β−ケトアシル−ACPレダクターゼによりアセトアセチルACPのケト基が還元されてヒドロキシブチリルACPが生成する。続いて、β−ヒドロキシアシル−ACPデヒドラーゼによりヒドロキシブチリルACPが脱水され、クロトニルACPが生成する。最後に、エノイル−ACPレダクターゼによりクロトニルACPが還元されて、ブチリルACPが生成する。これら一連の反応により、アセチル−ACPからアシル基の炭素鎖が2個伸長されたブチリルACPが生成する。以下、同様の反応を繰り返すことで、アシル−ACPの炭素鎖が伸長し、最終的に炭素数16又は18のアシル−ACPが合成される。
タンパク質がKAS活性を有することは、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養し、宿主細胞内又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。あるいは、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、各種アシル−ACPを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
前記タンパク質(a)は、後述の実施例で示すように、中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有する。よって前記タンパク質(a)は、KAS IVであると考えられる。ここで「中鎖アシル−ACPに対する基質特異性」とは、KASが、主に炭素数4〜12のアシルACPを基質とし、炭素数14までの中鎖アシルACP合成の伸長反応を触媒することをいう。また本明細書において「中鎖」とは、アシル基の炭素数が6以上14以下であることをいう。
KASの中鎖アシル−ACPに対する基質特異性については、例えば、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を、脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化を常法により分析することで確認できる。また、上記の系に後述する中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するTEを共発現させ、中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するTE単独を発現させた場合の脂肪酸組成と比較することにより確認できる。また、宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を、宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件下で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、中鎖アシル−ACPを基質とした鎖長伸長反応を行うことにより確認できる。
(a1)配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ナンノクロロプシス・ガディタナ(Nannochloropsis gaditana)CCMP526由来のKASである。配列番号3のアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列と約90%の同一性を有する。
また、前記タンパク質(b)として、前記タンパク質(a)又は(a1)のアミノ酸配列に、1又は数個(例えば1個以上184個以下、好ましくは1個以上138個以下、より好ましくは1個以上92個以下、さらに好ましくは1個以上46個以下、特に好ましくは1個以上42個以下、最も好ましくは1個以上23個以下)のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加したタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing overlap extension(SOE)-PCR反応を利用した方法、ODA法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット(商品名、タカラバイオ社)、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット(商品名、Clonetech社)、KOD-Plus-Mutagenesis Kit(商品名、東洋紡社)等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
(d)配列番号2で表される塩基配列からなるDNA
(e)前記DNA(d)の塩基配列と60%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質をコードするDNA
配列番号2の塩基配列は、配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。
(d1)配列番号4で表される塩基配列からなるDNA
配列番号4の塩基配列は、配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。配列番号4で表される塩基配列は、配列番号2で表される塩基配列と約77%の同一性を有する。
TEは、KAS等の脂肪酸合成酵素によって合成されたアシル−ACPのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。TEの作用によってACP上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。そのため、宿主にKAS遺伝子とTE遺伝子を共導入することで、形質転換体の脂質の生産性、特に脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
本発明で用いることができるTEは、アシル−ACPチオエステラーゼ活性(以下、「TE活性」ともいう)を有するタンパク質であればよい。ここで「TE活性」とは、アシル−ACPのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
上述のように、前記タンパク質(a)又は(b)は中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するKASである。よって共導入するTEも、中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するTEをコードする遺伝子であることが好ましい。中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するTEを用いることで、中鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。特に、中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するTEをコードする遺伝子を元来有していない宿主を形質転換に用いる場合、中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するTEをコードする遺伝子の共導入が効果的である。
具体的には、Cuphea calophylla subsp. mesostemonのTE(GenBank ABB71581);Cinnamomum camphoraのTE(GenBank AAC49151.1);Myristica fragransのTE(GenBank AAB71729及びAAB71730);Cuphea lanceolataのTE(GenBank CAA54060);Cuphea hookerianaのTE(GenBank Q39513);Ulumus americanaのTE(GenBank AAB71731);Sorghum bicolorのTE(GenBank EER87824);Sorghum bicolorのTE(GenBank EER88593);Cocos nuciferaのTE(CnFatB1:Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照);Cocos nuciferaのTE(CnFatB2:Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照);Cuphea viscosissimaのTE(CvFatB1:Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照);Cuphea viscosissimaのTE(CvFatB2:Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照);Cuphea viscosissimaのTE(CvFatB3:Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照);Elaeis guineensisのTE(GenBank AAD42220);Desulfovibrio vulgarisのTE(GenBank ACL08376);Bacteriodes fragilisのTE(GenBank CAH09236);Parabacteriodes distasonisのTE(GenBank ABR43801);Bacteroides thetaiotaomicronのTE(GenBank AAO77182);Clostridium asparagiformeのTE(GenBank EEG55387);Bryanthella formatexigensのTE(GenBank EET61113);Geobacillus sp.のTE(GenBank EDV77528);Streptococcus dysgalactiaeのTE(GenBank BAH81730);Lactobacillus brevisのTE(GenBank ABJ63754);Lactobacillus plantarumのTE(GenBank CAD63310);Anaerococcus tetradiusのTE(GenBank EEI82564);Bdellovibrio bacteriovorusのTE(GenBank CAE80300);Clostridium thermocellumのTE(GenBank ABN54268);Arabidopsis thalianaのTE;Bradyrhizobium japonicumのTE;Brassica napusのTE;Cinnamonum camphorumのTE;Capsicum chinenseのTE;Cuphea hookerianaのTE;Cuphea lanceolataのTE;Cuphea palustrisのTE;Coriandrum sativum L.のTE;Carthamus tinctoriusのTE;Cuphea wrightiiのTE;Gossypium hirsutumのTE;Garcinia mangostanaのTE;Helianthus annuusのTE;Iris germanicaのTE;Iris tectorumのTE;Triticum aestivumのTE;Ulmus AmericanaのTE;Escherichia coliのTE;Cocos nuciferaのTE(CnFatB3:Jing et al. BMC Biochemistry 2011, 12:44参照、配列番号5、これをコードする遺伝子の塩基配列:配列番号6);Nannochloropsis oculataのTE(配列番号7、これをコードする遺伝子の塩基配列:配列番号8);Umbellularia californicaのTE(GenBank AAA34215.1、配列番号9、これをコードする遺伝子の塩基配列:配列番号10);Nannochloropsis gaditanaのTE(配列番号11、これをコードする遺伝子の塩基配列:配列番号12);Nannochloropsis granulataのTE(配列番号13、これをコードする遺伝子の塩基配列:配列番号14);Symbiodinium microadriaticumのTE(配列番号15、これをコードする遺伝子の塩基配列:配列番号16)、等が挙げられる。また、これらと機能的に均等なタンパク質として、上述したいずれかのTEのアミノ酸配列と50%以上(好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質も用いることができる。あるいは、上述したいずれかのTEのアミノ酸配列に1又は数個(例えば1個以上147個以下、好ましくは1個以上119個以下、より好ましくは1個以上59個以下、さらに好ましくは1個以上30個以下)のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、かつTE活性を有するタンパク質も用いることができる。
前記TEの中でも、中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するTEが好ましく、Umbellularia californicaのTE、Cocos nuciferaのTE、Cinnamonum camphorumのTE、Nannochloropsis oculataのTE、Nannochloropsis gaditanaのTE、Nannochloropsis granulataのTE、Symbiodinium microadriaticumのTE、これらのTEのアミノ酸配列と50%以上(好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を示すTE活性を有するタンパク質、又はこれらのTEのアミノ酸配列に1又は数個(例えば1個以上147個以下、好ましくは1個以上119個以下、より好ましくは1個以上59個以下、さらに好ましくは1個以上30個以下)のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、かつ中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を示すTE活性を有するタンパク質が好ましい。
これらのTE及びそれらをコードする遺伝子の配列情報等は、例えば、国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information, NCBI)などから入手することができる。
例えば、Umbellularia californica由来のTE(UcTE)は炭素数12のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は主にラウリン酸(C12:0)などの炭素数12の遊離脂肪酸である。また、Cinnamonum camphorum及びCocos nuciferaのTEは炭素数14のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は主にミリスチン酸(C14:0)などの炭素数14の遊離脂肪酸である。また、Escherichia coli K-12株のTEは、炭素数16又は18のアシル基に基質特異性を有し、生成する遊離脂肪酸は主にパルミチン酸(C16:0)、パルミトレイン酸(C16:1)、ステアリン酸(C18:0)、オレイン酸(C18:1)、リノール酸(C18:2)、リノレン酸(C18:3)などの炭素数16又は18の遊離脂肪酸である。
シアノバクテリアは多様性に富んでおり、細胞の形状のみを見ても、シネコシスティス・エスピー(Synechocystis sp.)PCC6803のような単細胞性のもの、ヘテロシストを形成し窒素固定を行うアナベナ・エスピー(Anabaena sp.)PCC7120のように多細胞がヒモ状に繋がっている糸状性のもの、又はらせん状や分岐状のもの等がある。
生育環境についても、別府温泉から単離されたサーモシネココッカス・エロンガタス(Thermosynechococcus elongatus)BP-1のような好熱性のもの、海洋性で沿岸部に生息するシネココッカス・エスピー(Synechococcus sp.)CC9311、又は外洋に生息するシネココッカス・エスピーWH8102など、様々な条件に適応した種が見られる。
また、種独自の特徴を持つものとして、ミクロシスティス・エルギノーサ(Microcystis aeruginosa)のように、ガス小胞を持ち毒素を産生することのできるものや、チラコイドを持たず集光アンテナであるフィコビリソームが原形質膜に結合しているグロイオバクター・ビオラセウス(Gloeobacter violaceus)PCC7421、又は一般的な光合成生物のようにクロロフィルaでなくクロロフィルdを主要な(>95%)光合成色素として持つ海洋性のアクリオクロリス・マリナ(Acaryochloris marina)なども挙げられる。
前記KAS遺伝子に加えて前記TE遺伝子も導入した形質転換体も、常法により作製できる。
本発明で好ましく用いることができる発現ベクターとしては、pUC系ベクター(タカラバイオ社製)、pBluescript(pBS) II SK(-)(Stratagene社製)、pSTV系ベクター(タカラバイオ社製)、pET系ベクター(タカラバイオ社製)、pGEX系ベクター(GEヘルスケア社製)、pCold系ベクター(タカラバイオ社製)、pHY300PLK(タカラバイオ社製)、pUB110(Mckenzie,T. et al.,(1986),Plasmid 15(2);p.93-103)、pBR322(タカラバイオ社製)、pRS403(ストラタジーン社製)、pMW218/219(ニッポンジーン社製)、pRI系ベクター(タカラバイオ社製)、pBI系ベクター(クロンテック社製)、及びIN3系ベクター(インプランタイノベーションズ社製)が挙げられる。このうち、pUC系ベクターがより好ましい。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、及びゲンタマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
またシアノバクテリアに導入する異種遺伝子は、シアノバクテリアにおけるコドン使用頻度にあわせてコドンを至適化されることが好ましい。各種生物が使用するコドンの情報は、Codon Usage Database(www.kazusa.or.jp/codon/)から入手可能である。
また、形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。形質転換方法としては、自然形質転換法、エレクトロポレーション法、及び接合法が挙げられる。
ここで「aas」とは脂肪酸合成に関わる酵素の1種であって、遊離脂肪酸とACPタンパク質を基質として、ATP依存的にチオエステル結合を形成し、アシル−ACPを産生する機能を有する。シアノバクテリアにおいてaasの機能を喪失させることで脂肪酸の蓄積及び分泌が促進されることが知られている(Plant Physiology,2010,vol.152(3),p.1598-1610参照)。
aasの機能を喪失させるための手段としては、タンパク質の機能の喪失に通常使用される手段から適宜選択することができる。例えば、aasをコードする遺伝子(以下、「aas遺伝子」ともいう)を欠失又は不活性化させる方法、aas遺伝子の転写を阻害する変異を導入する方法、aas遺伝子の転写産物の翻訳を阻害する方法、aasを特異的に阻害する阻害剤を投与する方法などが挙げられる。前記aas遺伝子を欠失又は不活性化させる手段としては、aas遺伝子の塩基配列上の1個以上の塩基に対する突然変異の導入、aas遺伝子の塩基配列に対して別の塩基配列の置換又は挿入、aas遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。aas遺伝子の転写を阻害する変異を導入する手段としては、aas遺伝子のプロモーター領域に対する突然変異導入や、別の塩基配列での置換若しくは挿入による当該プロモーターの欠失又は不活性化が挙げられる。上記突然変異導や、塩基配列の置換若しくは挿入のための具体的な手法としては、紫外線照射や部位特異的変異導入、相同組換え法、SOE(splicing by overlap extension)−PCR法などを挙げることができる。転写産物の翻訳を阻害する手段としては、マイクロRNAによるRNA干渉を挙げることができる。aasの特異的阻害剤としては、aasやその受容体又はリガンドに特異的な抗体が挙げられる。
本発明では、シアノバクテリアのaasの機能を喪失させるために、シアノバクテリアのaas遺伝子を欠失又は不活性化させる方法がより好ましい。なお、シアノバクテリアのaasのアミノ酸配列、aas遺伝子の位置やその塩基配列の情報は、CyanoBase(genome.microbedb.jp/cyanobase/)やNCBIデータベース([www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/]又は[www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/])から取得することができる。
また前記aas遺伝子としては、シネコシスティス・エスピーPCC6803のSlr1609遺伝子(NCBI Gene ID:953643)、シネコシスティス・エスピーPCC7509のSyn7509DRAFT_00010940遺伝子(GenBank ID:ELR87398.1)、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942のSynpcc7942_0918遺伝子(配列番号46)、サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1のTll1301遺伝子、トリコデスミウム・エリスラエウムIMS101のTery_1829遺伝子、アカリオクロリス・マリアナMBIC11017のAM1_5562遺伝子及びAM1_2147遺伝子、クロコスファエラ・ワトソニーWH8501のCwat_5663遺伝子、アナベナ・エスピーPCC7120のAlr3602遺伝子等が知られている。本明細書における「aas遺伝子」には、前記遺伝子、これら遺伝子の塩基配列との同一性が40%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは60%以上、さらに好ましくは70%以上、特に好ましくは80%以上、最も好ましくは90%以上、であり、かつアシル−ACPの合成能を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及びこれら遺伝子の塩基配列に、1又は数個、通常1個以上1170個以下、好ましくは1個以上975個以下、より好ましくは1個以上780個以下、さらに好ましくは1個以上585個以下、特に好ましくは1個以上390個以下、最も好ましくは1個以上195個以下、の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつアシル−ACPの合成能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を包含する。
あるいは、シアノバクテリアのゲノム上における、遺伝子導入を行ってもシアノバクテリアに影響を与えないニュートラルサイトにTE遺伝子を導入してもよい。
脂質生産のための培養期間としては、十分に菌体が増殖した条件で脂肪酸が高濃度に蓄積するように行えばよく、例えば、7〜45日間、好ましくは10〜30日間、より好ましくは14〜21日間、通気攪拌培養又は振とう培養がすることが好適である。
また、aasの機能を喪失させた形質転換体を用いた場合、生産された脂質は細胞外に分泌される。よって、脂質を回収するために菌体を破壊する必要がなく、脂質回収後に残った細胞を繰り返し脂質生産に使用することができる。
本発明の製造方法により得られる脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)前記タンパク質(a)のアミノ酸配列と60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは91%以上、最も好ましくは95%以上、の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質
<3>前記タンパク質(b)が、前記タンパク質(a)又は(a1)のアミノ酸配列に、1又は数個、例えば1個以上184個以下、好ましくは1個以上138個以下、より好ましくは1個以上92個以下、さらに好ましくは1個以上46個以下、特に好ましくは1個以上42個以下、最も好ましくは1個以上23個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記<1>又は<2>項記載の方法。
<4>前記タンパク質(a)又は(b)をコードする遺伝子が、下記DNA(d)又は(e)からなる遺伝子である、前記<1>〜<3>のいずれか1項記載の方法。
(d)配列番号2で表される塩基配列からなるDNA
(e)前記DNA(d)の塩基配列と60%以上、好ましくは65%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは75%以上、よりさらに好ましくは78%以上、よりさらに好ましくは80%以上、特に好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上、の同一性を有する塩基配列からなり、かつKAS活性を有するタンパク質をコードするDNA
<5>前記DNA(e)が、配列番号4で表される塩基配列からなるDNAである、前記<4>項記載の方法。
<6>前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステルである、前記<1>〜<5>のいずれか1項記載の方法。
<7>前記タンパク質(a)又は(b)が、中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するKASである、前記<1>〜<6>のいずれか1項記載の方法。
<8>中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するTEをコードする遺伝子が前記シアノバクテリアにさらに導入されている、前記<1>〜<7>のいずれか1項記載の方法。
<9>前記TEが、Cocos nuciferaのTE、Cinnamonum camphorumのTE、Nannochloropsis oculataのTE、Umbellularia californicaのTE、Nannochloropsis gaditanaのTE、Nannochloropsis granulata、及びSymbiodinium microadriaticumのTEからなる群より選ばれる少なくとも1種のTEである、前記<8>項記載の方法。
<10>前記シアノバクテリアが、シネコシスティス属、シネココッカス属、サーモシネココッカス属、トリコデスミウム属、アカリオクロリス属、クロコスファエラ属、及びアナベナ属からなる群より選ばれるシアノバクテリア、好ましくはシネコシスティス属又はシネココッカス属のシアノバクテリア、より好ましくはシネココッカス属のシアノバクテリア、である、前記<1>〜<9>のいずれか1項記載の方法。
<11>前記シアノバクテリアにおいてaasの機能が喪失している、前記<1>〜<10>のいずれか1項記載の方法。
<12>前記シアノバクテリアにおいてaas遺伝子を欠失又は不活性化させた、前記<11>項記載の方法。
<13>前記aas遺伝子が、Slr1609遺伝子、Syn7509DRAFT_00010940遺伝子、Synpcc7942_0918遺伝子、Tll1301遺伝子、Tery_1829遺伝子、AM1_5562遺伝子、AM1_2147遺伝子、Cwat_5663遺伝子、Alr3602遺伝子、これら遺伝子の塩基配列との同一性が40%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは60%以上、さらに好ましくは70%以上、特に好ましくは80%以上、最も好ましくは90%以上でありかつアシル−ACPの合成能を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及びこれら遺伝子の塩基配列に、1又は数個、通常1個以上1170個以下、好ましくは1個以上975個以下、より好ましくは1個以上780個以下、さらに好ましくは1個以上585個以下、特に好ましくは1個以上390個以下、最も好ましくは1個以上195個以下、の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつアシル−ACPの合成能を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる群より選ばれる、より好ましくはSlr1609遺伝子、Syn7509DRAFT_00010940遺伝子、Synpcc7942_0918遺伝子、Tll1301遺伝子、Tery_1829遺伝子、AM1_5562遺伝子、AM1_2147遺伝子、Cwat_5663遺伝子又はAlr3602遺伝子、である、前記<12>項記載の方法。
<14>BG-11培地を用いて前記形質転換体を培養する、前記<1>〜<13>のいずれか1項記載の方法。
<15>生産させた脂質を前記基質転換体の細胞外に分泌させる、前記<1>〜<14>のいずれか1項記載の方法。
<16>ラウリン酸及びミリスチン酸の生産性を向上させる、前記<1>〜<15>のいずれか1項記載の方法。
<18>シアノバクテリアに前記タンパク質(a)又は(b)をコードする遺伝子を導入する、形質転換体の製造方法。
<19>前記タンパク質(a)又は(b)をコードする遺伝子をシアノバクテリアに導入し、得られた形質転換体の脂質の生産性を向上させる、シアノバクテリアの脂質生産性の向上方法。
<21>前記タンパク質(b)が、前記タンパク質(a)又は(a1)のアミノ酸配列に、1又は数個、例えば1個以上184個以下、好ましくは1個以上138個以下、より好ましくは1個以上92個以下、さらに好ましくは1個以上46個以下、特に好ましくは1個以上42個以下、最も好ましくは1個以上23個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたタンパク質である、前記<17>〜<20>のいずれか1項記載の形質転換体又は方法。
<22>前記タンパク質(a)又は(b)をコードする遺伝子が、前記DNA(d)又は(e)からなる遺伝子である、前記<17>〜<21>のいずれか1項記載の形質転換体又は方法。
<23>前記DNA(e)が、配列番号4で表される塩基配列からなるDNAである、前記<22>項記載の形質転換体又は方法。
<24>前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステルである、前記<17>〜<23>のいずれか1項記載の形質転換体又は方法。
<25>前記タンパク質(a)又は(b)が、中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するKASである、前記<17>〜<24>のいずれか1項記載の形質転換体又は方法。
<26>中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するTEをコードする遺伝子が前記シアノバクテリアにさらに導入されている、前記<17>〜<25>のいずれか1項記載の形質転換体又は方法。
<27>前記TEが、Cocos nuciferaのTE、Cinnamonum camphorumのTE、Nannochloropsis oculataのTE、Umbellularia californicaのTE、Nannochloropsis gaditanaのTE、Nannochloropsis granulata、及びSymbiodinium microadriaticumのTEからなる群より選ばれる少なくとも1種のTEである、前記<26>項記載の形質転換体又は方法。
<28>前記シアノバクテリアが、シネコシスティス属、シネココッカス属、サーモシネココッカス属、トリコデスミウム属、アカリオクロリス属、クロコスファエラ属、及びアナベナ属からなる群より選ばれるシアノバクテリア、好ましくはシネコシスティス属又はシネココッカス属のシアノバクテリア、より好ましくはシネココッカス属のシアノバクテリア、である、前記<17>〜<27>のいずれか1項記載の形質転換体又は方法。
<29>前記シアノバクテリアにおいてaasの機能が喪失している、前記<17>〜<28>のいずれか1項記載の形質転換体又は方法。
<30>前記シアノバクテリアにおいてaas遺伝子を欠失又は不活性化させた、前記<29>項記載の形質転換体又は方法。
<31>前記aas遺伝子が、Slr1609遺伝子、Syn7509DRAFT_00010940遺伝子、Synpcc7942_0918遺伝子、Tll1301遺伝子、Tery_1829遺伝子、AM1_5562遺伝子、AM1_2147遺伝子、Cwat_5663遺伝子、Alr3602遺伝子、これら遺伝子の塩基配列との同一性が40%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは60%以上、さらに好ましくは70%以上、特に好ましくは80%以上、最も好ましくは90%以上でありかつアシル−ACPの合成能を有するポリペプチドをコードする遺伝子、及びこれら遺伝子の塩基配列に、1又は数個、通常1個以上1170個以下、好ましくは1個以上975個以下、より好ましくは1個以上780個以下、さらに好ましくは1個以上585個以下、特に好ましくは1個以上390個以下、最も好ましくは1個以上195個以下、の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつアシル−ACPの合成能を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる群より選ばれる、より好ましくはSlr1609遺伝子、Syn7509DRAFT_00010940遺伝子、Synpcc7942_0918遺伝子、Tll1301遺伝子、Tery_1829遺伝子、AM1_5562遺伝子、AM1_2147遺伝子、Cwat_5663遺伝子又はAlr3602遺伝子、である、前記<30>項記載の形質転換体又は方法。
<32>生産させた脂質を前記基質転換体の細胞外に分泌させる、前記<17>〜<31>のいずれか1項記載の形質転換体又は方法。
<33>ラウリン酸及びミリスチン酸の生産性を向上させる、前記<17>〜<32>のいずれか1項記載の形質転換体又は方法。
ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表1に示す。
(1)aas遺伝子の不活性化及びTE遺伝子の導入を行った株の構築
シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942株の野生株のゲノムDNAより、表1記載のプライマーpUC118/0918up-F(配列番号24)及び0918down/pUC118-R(配列番号25)を用いSynpcc7942_0918遺伝子(aas遺伝子)を含む断片(2864bp、配列番号47)を増幅した。増幅した断片をpUC118プラスミド(タカラバイオ株式会社)のHincIIサイト間にIn-Fusion(登録商標)PCRクローニング法(Clontech)を用いて挿入し、Synpcc7942_0918遺伝子(aas遺伝子)を組み込んだpUC118-Synpcc7942_0918プラスミドを取得した。
また、表1記載のプライマー0918up/PpsbA1-F(配列番号31)及びPpsbA1/UcTE-R(配列番号32)を用いてPCRを行い、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942由来psbA1遺伝子のプロモーター領域断片(配列番号18)を増幅した。
さらに、Liu X.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011,vol.108,p.6899-6904に記載されているシネコシスティス・エスピーPCC6803にあわせてコドンを最適化した配列を合成した。合成したcDNAを鋳型とし、これを表1記載のプライマーUcTE-F(配列番号33)及びUcTE/spr-R(配列番号34)を用いてPCRを行い、ウンベリラリア・カリフォルニカ由来のTE遺伝子(以下、「UcTE遺伝子」ともいう、配列番号19)の断片を増幅した。
シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942の野生株のゲノムDNAを鋳型として、表1記載のpUC118/NS1up-F(配列番号35)とNS1up/Kmr-R(配列番号36)のプライマーセットを用いて、ニュートラルサイトNS1領域の上流断片(NS1up断片、配列番号20)を増幅した。また、前記ゲノムDNAを鋳型として、表1記載のKmr/NS1down-F(配列番号37)とNS1down/pUC118-R(配列番号38)のプライマーセットを用いて、ニュートラルサイトNS1領域の下流断片(NS1down断片、配列番号21)を増幅した。さらに、pJH1プラスミド(Trieu-Cuot P et al.,Gene,1983,vol.23,p.331-341)を鋳型として、表1記載のプライマーKmr-F(配列番号39)及びKmr-R(配列番号40)を用いてPCRを行い、カナマイシン耐性マーカー遺伝子断片(Km断片:配列番号22)を増幅した。
また、表1記載のプライマー0918up/PrrnA-F(配列番号42)及びPrrnA-R(配列番号43)を用いてPCRを行い、シネココッカス・エロンガタスエスピーPCC7942由来rrnAオペロン遺伝子のプロモーター領域断片(配列番号23)をPCR増幅した。
さらに、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のKAS遺伝子(NoKASIV遺伝子、配列番号2)のcDNAライブラリーをナンノクロロプシス・オキュラータNIES-2145株より作製した。そして作製したcDNAライブラリーを鋳型として、表1記載のプライマーPrrnA/NoKASIV-F(配列番号44)及びNoKASIV/kmr-R(配列番号45)を用いてPCRを行い、NoKASIV遺伝子断片を増幅した。
下記表2に示す組成のBG-11培地25mLを加えた50mL三角フラスコ中で、一定の照明下(60μE・m-2・sec-1)、30℃にてロータリーシェーカー(120rpm)を用いて、初発菌体濃度をOD730=0.2に設定し、前記形質転換体の培養を2週間行った。なおBG-11培地には、形質転換体の種類に応じて、スペクチノマイシン及び/又はカナマイシンを20μg/mLの濃度となるよう添加した。
乾燥サンプルに、0.5N水酸化カリウム/メタノール溶液0.7mLを添加し、80℃で30分恒温した。続いて14%三フッ化ホウ素溶液(SIGMA社製)1mLを添加し、80℃にて10分恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各1mL添加し激しく撹拌し、室温にて30分放置した。そして、上層のヘキサン層を回収し、脂肪酸メチルエステルを得た。
(解析条件)
キャピラリーカラム:DB-1 MS 30m×200μm×0.25μm(J&W Scientific社製)
移動相:高純度ヘリウム
カラム内流量:1.0mL/分
昇温プログラム:100℃(1分間)→10℃/分→300℃(5分間)
平衡化時間:1分間
注入口:スプリット注入(スプリット比:100:1),圧力14.49psi,104mL/分
注入量1μL
洗浄バイアル:メタノール・クロロホルム
検出器温度:300℃
培養1Lあたりに含まれる各脂肪酸の量及びこれらの合計量を算出した。さらに、Δ0918::UcTE株の各脂肪酸量及び総脂肪酸量をそれぞれ1とし、ΔNS1::NoKASIVΔ0918::UcTE株の各脂肪酸量及び総脂肪酸量をそれぞれ相対値で算出した。
その結果を表3に示す。なお表3の結果は、独立した3回の培養とクロマトグラフィー解析の結果の平均値である。
Claims (13)
- 下記タンパク質(a)又は(b)をコードする遺伝子をシアノバクテリアに導入して得た形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)前記タンパク質(a)のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有するタンパク質 - 前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステルである、請求項1記載の製造方法。
- 前記タンパク質(a)又は(b)が、中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するβ−ケトアシル−ACPシンターゼである、請求項1又は2記載の製造方法。
- 中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するアシル−ACPチオエステラーゼをコードする遺伝子が前記シアノバクテリアにさらに導入されている、請求項1〜3のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記シアノバクテリアが、シネコシスティス(Synechocystis)属又はシネココッカス(Synechococcus)属のシアノバクテリアである、請求項1〜4のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記シアノバクテリアのアシル−ACPシンテターゼの機能が喪失している、請求項1〜5のいずれか1項記載の製造方法。
- シアノバクテリアに下記タンパク質(a)又は(b)をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)前記タンパク質(a)のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつβ−ケトアシル−ACPシンターゼ活性を有するタンパク質 - 前記タンパク質(a)又は(b)が、中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するβ−ケトアシル−ACPシンターゼである、請求項7記載の形質転換体。
- 中鎖アシル−ACPに対する基質特異性を有するアシル−ACPチオエステラーゼをコードする遺伝子が前記シアノバクテリアにさらに導入されている、請求項7又は8記載の形質転換体。
- 前記シアノバクテリアが、シネコシスティス(Synechocystis)属又はシネココッカス(Synechococcus)属のシアノバクテリアである、請求項7〜9のいずれか1項記載の形質転換体。
- 前記シアノバクテリアのアシル−ACPシンテターゼの機能が喪失している、請求項7〜10のいずれか1項記載の形質転換体。
- ラウリン酸及びミリスチン酸の生産性を向上させる、請求項1〜6のいずれか1項記載の製造方法。
- ラウリン酸及びミリスチン酸の生産性を向上させる、請求項7〜11のいずれか1項記載の形質転換体。
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