KR20150001830A - 맞춤 오일 - Google Patents

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죠지 루덴코
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신후아 자오
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솔라짐, 인코포레이티드
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Abstract

재조합 DNA 기술은 원하는 지방산 프로파일 및 위치특이적 또는 입체특이적 프로파일을 가지는 트리글리세리드 오일을 생성하는 유지성 재조합 세포를 생성하는데 사용된다. 조작된 유전자는 스테아로일-ACP 불포화효소, 델타 12 지방산 불포화효소, 아실-ACP 티오에스테라제, 케토아실-ACP 합성 효소, 및 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제를 암호화한 것들을 포함한다. 생성된 오일은 향상된 산화 또는 열적 안정성을 가질 수 있거나, 튀김 기름, 쇼트닝, 롤인 쇼트닝, 템퍼링 지방, 코코아 버터 대체물로서, 윤활유로서, 또는 다양한 화학 공정을 위한 공급 원료로서 유용할 수 있다. 지방산 프로파일은 중쇄 프로파일이 풍부할 수 있거나, 오일은 포화-불포화-포화 유형의 트리글리세리드가 풍부할 수 있다.

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맞춤 오일{TAILORED OILS}
관련출원과의 상호참조
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서열목록에 대한 참조
본 출원은 상세한 설명의 마지막에 나타낸 바와 같은 서열 목록을 포함한다.
본 발명의 기술분야
본 발명의 실시형태는 오일/지방, 연료, 식품 및 함유 화학 제품(oleochemical) 및 유전적으로 조작된 세포의 배양물로부터의 이들의 생산에 관한 것이다. 구체적 실시형태는 특히 위치특이적 패턴으로 글리세롤 백본 상에 지방 아실기를 보유하는 고함량의 트리글리세리드를 포함하는 오일, 고도로 안정적인 오일, 고수준의 올레산 또는 중쇄 지방산을 포함하는 오일, 및 이와 같은 오일로부터 생산된 제품에 관한 것이다.
PCT 공개 WO 제2008/151149호, WO 제2010/06032호, WO 제2011/150410호, WO 제2011/150411호, WO 제2012/061647호 및 WO 제2012/106560호는 오일 및 미세조류를 포함하는 미생물에서 해당 오일을 생성하기 위한 방법을 개시한다. 이들 간행물은 또한 함유 화학 제품 및 연료를 만들기 위한 이와 같은 오일의 용도를 기재한다.
템퍼링(tempering)은 지방 또는 지방 함유 물질의 온도 조작에 의해 지방을 원하는 다형체 형태로 전환시키는 공정이며, 초콜릿 제조에서 흔히 사용된다.
지방 아실-CoA 신장 경로의 특정 효소는 지방 아실-CoA 분자의 길이를 연장시키는 작용을 한다. 신장효소-복합체 효소는 2개의 탄소 첨가로 지방 아실-CoA 분자를, 예를 들어 미리스토일-CoA를 팔미토일-CoA로, 스테아로일-CoA를 아라키딜-CoA로, 또는 올레일-CoA를 에이코사노일-CoA로, 에이코사노일-CoA를 에루실-CoA로 연장시킨다. 추가로, 신장효소는 또한 2개의 탄소 증가분으로 아실 사슬 길이를 연장시킨다. KCS 효소는 아실-CoA 분자를 말로닐-CoA로부터의 2개의 탄소와 함께 축합시켜 베타-케토아실-CoA를 형성한다. KCS 및 신장효소는 특정 탄소 길이의 아실 기질을 축합시키기 위한 특이성, 변형(예를 들어, 하이드록실화) 또는 포화도를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 호호바(심몬드시아 키넨시스(Simmondsia chinensis)) 베타-케토아실-CoA 합성 효소는 유전자이식 식물 중의 에루스산의 생성을 상승시키기 위해 단불포화 및 포화 C18- 및 C20-CoA 기질을 선호하는 것으로 증명된 반면(Lassner et al., Plant Cell, 1996, Vol 8(2), pp 281-292), 트립파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)의 특이적 신장효소는 단쇄 및 중쇄 포화 CoA 기질을 신장시키는 것에 대한 선호를 나타낸다(Lee et al., Cell , 2006, Vol 126(4), pp 691-9).
유형 II 지방산 생합성 경로는 아실기 운반 단백질(acyl carrier protein: ACP)의 티오에스테르로서 효소 사이를 오가는 중간체를 가지는 가용성 단백질에 의해 촉진되는 일련의 반응을 이용한다. 대조적으로, 유형 I 지방산 생합성 경로는 단일의 거대한 다기능성 폴리펩티드를 사용한다.
유지성의 비광합성 조류인 프로테테카 모리포르미스(Protetheca moriformis)는 영양 탄소 공급이 과량일 때의 조건 하에서 엄청난 양의 트리아실글리세리드 오일을 저장하지만, 기타 다른 필수 영양소의 제한으로 인하여 세포 분열은 저해된다. C18까지의 탄소 사슬 길이를 가지는 지방산의 벌크 생합성은 색소체 중에서 일어나며; 그 다음에 지방산은, (일어난다면) C18을 넘어서는 신장 및 트리아실글리세리드(TAG)로의 혼입이 일어나는 것으로 여겨지는 경우, 소포체로 전해진다. 지질은 환경적 조건이 성장에 유리하게 변할 때까지 지질체로 불리는 거대한 세포질내 소기관에 저장되고, 그 결과 지질은 동화작용 대사를 위한 에너지 및 탄소 분자를 제공하기 위해 동원된다.
일 양태에서, 본 발명은 세포가 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스 상에서 성장할 수 있도록, 선택적으로 서열 번호 76에 대해 적어도 65% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 23S rRNA를 포함하고, 선택적으로 절대 종속영양적이며, 선택적으로 외인성 수크로스 전화효소 유전자를 포함하는 유지성 미세조류 세포를 제공하며, 여기서 세포는 활성 LPAAT 효소를 암호화하는 외인성 유전자를 포함하고, 세포는 트리글리세리드를 포함하는 오일을 생성하며, 여기서 오일은 LPAAT 활성 때문에 (a) 중쇄 지방산을 포함하는 트리글리세리드가 풍부하거나; 또는 (b) 포화-불포화-포화 유형의 트리글리세리드가 풍부하다.
일부 경우에, 오일의 트리글리세리드는 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이상의 C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, 또는 C16:0 지방산을 포함한다. 일부 경우에, 세포는 활성 FATB 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 오일의 트리글리세리드는 외인성 LPAAT 및 아실-ACP 티오에스테라제의 발현의 결과로서 70% 초과만큼 중쇄 지방산이 풍부하다. 일부 경우에, 세포는 외인성 KAS I 또는 KAS IV 효소를 암호화하도록 조작가능한 재조합 핵산을 추가로 포함하여 내인성 KAS I 효소의 활성을 감소시킨다. 일부 경우에, 세포는 선택적으로 조절가능한 프로모터를 통해 델타 12 지방산 불포화효소의 발현을 감소시키도록 조작가능한 핵산을 추가로 포함해서 FAME GC/FID에 의해 전체 5영역% 이하의 리놀레산 및 리놀렌산을 포함하는 오일을 생성한다. 일부 경우에, 오일은 포화-불포화-포화 유형의 트리글리세리드가 풍부하다. 일부 경우에, 오일은 SOS, POS 및/또는 POP가 풍부하다. 일부 경우에, 오일은 적어도 50% SOS, 및 선택적으로 10% 미만의 SSS를 포함하는 트리글리세리드를 포함한다.
일부 경우에, 세포는 스테아로일-ACP 불포화효소 유전자, FatA 유전자 또는 둘 다의 녹아웃 또는 녹다운을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 세포는 베타-케토아실 CoA 합성 효소 활성을 증가시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 베타-케토실 합성 효소 활성을 증가시키도록 조작가능한 핵산은 베타-케토아실 CoA 합성 효소를 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다.
일부 경우에, 오일 중 스테아레이트 대 올리에이트의 비는 3:1±20%이다. 일부 경우에, 오일 중 POP, SOS 및 POS는 총합 중 적어도 30%를 구성한다. 일부 경우에, 오일은 적어도 30% POS를 포함한다. 일부 경우에, 오일은 POP를 16%±20%으로, POS를 38%±20%로, 그리고 SOS를 23%±20%로 포함한다. 일부 경우에, 오일의 지방산 프로파일은 1% 내지 4% 아라키드산을 포함한다.
일부 경우에, 세포는 선택적으로 조절가능한 프로모터를 통해 델타 12 지방산 불포화효소의 발현을 감소시키도록 조작가능한 핵산을 추가로 포함하여 전체 5영역% 이하의 리놀레산 및 리놀렌산을 포함하는 오일을 생성한다. 일부 경우에, 오일은 65% 초과의 SOS, 45% 미만의 불포화 지방산, 5% 미만의 다가불포화 지방산, 1% 미만의 라우르산, 및 2% 미만의 트랜스 지방산을 가진다.
일부 경우에, LPAAT는 서열 번호 78 또는 서열 번호 79의 아미노산 서열 또는 서열 번호78 또는 서열 번호 79와 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 논의한 바와 같은 세포를 제공하거나 배양하는 단계, 및 오일을 추출하는 단계를 포함하는 오일 생성 방법을 제공하되, 여기서 세포는 선택적으로 종속영양적으로 배양된다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 논의한 방법에 의해 생성된 트리글리세리드를 포함하는 오일을 제공한다. 일부 경우에, 오일은 적어도 10%의 에르고스테롤; 에르고스테롤 및 b-시토스테롤(여기서, 에르고스테롤 대 b-시토스테롤의 비는 25:1 초과임); 에르고스테롤 및 브라시카스테롤; 에르고스테롤, 브라시카스테롤, 및 포리페라스테롤 중 하나 이상을 포함하고, 오일에는 선택적으로 β-시토스테롤, 캄페스테롤, 및 스티그마스테롤 중 하나 이상이 없다.
일부 경우에, 오일은 β 다형체 결정을 형성한다. 일부 경우에, 결정은 2L 라멜라 구조를 가진다. 일부 경우에, 결정은 3L 라멜라 구조를 가진다.
일부 경우에, 오일은 β' 다형체 결정을 형성한다. 일부 경우에, 결정은 2L 라멜라 구조를 가진다. 일부 경우에, 결정은 3L 라멜라 구조를 가진다.
일부 경우에, 오일의 트리글리세리드는 스테아레이트 및 팔미테이트의 백분율의 총합이 올리에이트 백분율의 2.0배 +/- 40%와 동일한 것을 특징으로 하는 지방산 프로파일을 가진다. 일부 경우에, 오일은 65% 초과의 SOS 트리글리세리드, 45% 미만의 불포화 지방산, 5% 미만의 불포화 지방산, 1% 미만의 라우르산, 및 2% 미만의 트랜스 지방산을 가진다. 일부 경우에, 오일의 지방산 프로파일에서 스테아레이트 및 팔미테이트 백분율의 총합은 올리에이트의 백분율의 2배±20%이다. 일부 경우에, 오일의 sn-2 프로파일은 적어도 40% 올리에이트를 가진다. 일부 경우에, 오일은 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% SOS이다.
일부 경우에, 오일은 융점이 30℃ 내지 40℃인 롤인 쇼트닝(roll-in shortening)이다. 일부 경우에, 오일은 β' 다형체 결정을 포함한다. 일부 경우에, 오일은 고체 지방 함량이 35℃에서 15% 미만이다. 일부 경우에, 오일은 15% 내지 20%의 C8 내지 C14 지방산, 45% 내지 50%의 C16 이상의 지방산, 및/또는 30% 내지 25%의 불포화 지방산을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 논의한 오일을 사용하여 생산된 식품, 연료 또는 화학 제품을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 천연 오일 또는 천연 오일로부터 생성된 RBD 오일을 제공하며, 여기서 오일은 3.5% 이하의 포화 지방산을 포함하고, 선택적으로 50% 초과의 올레산 및/또는 1% 초과의 팔미톨레산을 포함한다. 일부 경우에, 오일은 0.1% 내지 3.5% 포화 지방산을 가진다. 일부 경우에, 오일은 적어도 90% 올레산을 포함한다. 일부 경우에, 오일은 적어도 3% 다가불포화 지방산을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 선택적으로 서열 번호 76에 대해 적어도 65% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 23S rRNA를 포함하고, 선택적으로 절대 종속영양적인 유지성 세포를 제공하며, 여기서 세포는 3.5% 이하의 포화 지방산을 포함하는 오일을 생성한다.
일부 경우에, 세포는 선택적으로 프로토테카(Prototheca) 속의 미세조류 세포이다. 일부 경우에, 세포는 FATA 녹아웃 또는 녹다운을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 세포는 팔미토일-CoA를 팔미토일-CoA로 불포화시키는데 활성인 효소를 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 외인성 유전자는 PAD 유전자이다. 일부 경우에, 외인성 유전자는 팔미토일-ACP에 대해 불포화효소 활성을 갖는 SAD 유전자이다. 일부 경우에, 세포는 과발현된 KAS II 효소를 추가로 포함한다.
일부 경우에, 세포는 선택적으로 조절가능한 프로모터를 통해 델타 12 지방산 불포화효소의 발현을 감소시키도록 조작가능한 핵산을 추가로 포함하여 전체 5영역% 이하의 리놀레산 및 리놀렌산을 포함하는 오일을 생성한다.
다른 양태에서, 본 발명은 선택적으로 정련, 표백, 및 탈취된 상기 논의한 세포에 의해 생성된 오일을 제공하며, 여기서 오일은 적어도 10%의 에르고스테롤; 에르고스테롤 및 b-시토스테롤(여기서, 에르고스테롤 대 b-시토스테롤의 비는 25:1 초과임); 에르고스테롤 및 브라시카스테롤; 및 에르고스테롤, 브라시카스테롤 및 포리페라스테롤 중 하나 이상을 포함하고, 여기서 오일에는 β-시토스테롤, 캄페스테롤, 및 스티그마스테롤 중 하나 이상이 선택적으로 없다.
다른 양태에서, 본 발명은 3.5% 이하의 포화 지방산을 갖는 오일을 생성하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 상기 또는 본 명세서에서 논의되는 바와 같은 세포를 제공하거나 배양하는 단계, 및 상기 세포로부터 오일을 추출하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 식품을 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 상기 또는 본 명세서에서 논의되는 방법에 의해 생성된 오일을 식품에 혼입시키는 단계를 포함하며, 여기서 완성된 식료품은 3.5% 이하의 포화 지방을 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은 선택적으로 서열 번호 76에 대해 적어도 65% 뉴클레오티드 서열 동일성을 가지는 23S rRNA를 포함하고, 그리고 선택적으로 절대 종속영양적인 재조합 유지성 세포를 제공하며, 여기서 세포는 활성 케토아실-CoA 합성 효소를 암호화하는 외인성 유전자를 포함한다.
일부 경우에, 세포는 20% 초과의 에루스산을 포함하는 오일을 생성한다. 일부 경우에, 세포는 60% 초과의 에루스산을 포함하는 오일을 생성한다. 일부 경우에, 세포는 적어도 40%의 오일을 포함한다. 일부 경우에, 세포는 프로토테카 속, 그리고 선택적으로 프로토테카 모리포르미스 종의 것이다. 일부 경우에, 세포에 의해 생성된 오일은 적어도 10%의 에르고스테롤; 에르고스테롤 및 b-시토스테롤(여기서, 에르고스테롤 대 b-시토스테롤의 비는 25:1 초과임); 에르고스테롤 및 브라시카스테롤; 및 에르고스테롤, 브라시카스테롤, 및 포리페라스테롤 중 하나 이상을 포함하며, 여기서 오일에는 선택적으로 β-시토스테롤, 캄페스테롤 및 스티그마스테롤 중 하나 이상이 없다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 논의한 오일로부터 생성되는 화학 제품을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 오일을 생성하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 상기 논의한 바와 같은 세포를 제공하거나 배양하는 단계, 및 세포로부터 오일을 추출하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 세포가 5% 미만의 리놀레산을 갖는 트리아실글리세롤 프로파일을 포함하는 오일을 생성하도록, 델타 12 지방산 불포화효소 유전자 산물의 활성을 억제하도록 조작가능한 재조합 핵산을 포함하는 재조합 유지성 세포를 제공한다. 일부 경우에, 세포는 3% 미만의 리놀레산을 갖는 트리아실글리세롤 프로파일을 포함하는 오일을 생성한다. 일부 경우에, 세포는 2% 미만의 리놀레산을 갖는 트리아실글리세롤 프로파일을 포함하는 오일을 생성한다.
일부 경우에, 세포는 리놀레산 영양요구체이거나 또는 델타 12 지방산 불포화효소의 활성은 오일을 생성하기 위한 환경적 조건을 통해 억제될 수 있다. 일부 경우에, 델타 12 지방산 불포화효소는 델타 12 지방산 불포화효소 유전자에 대한 조작가능한 연관에서 조절가능한 프로모터에 기인하는 환경적 조건을 통해 조절가능하다. 일부 경우에, 조절가능한 프로모터는 배지 pH 또는 질소 수준의 변화에 의해 조절가능하다.
일부 경우에, 세포는 외인성 KAS II, LPAAT 또는 FATB 효소를 발현시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 세포는 스테아로일 ACP 불포화효소의 발현을 녹아웃 또는 녹다운시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 세포는 내인성 FatA-암호화 아실-ACP 티오에스테라제의 발현을 녹아웃 또는 녹다운시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 추가로 포함한다.
일부 경우에, AOCS Cd 12b-92 랜시매트 테스트(Rancimat test)의 조건 하에서 전도도에서의 변곡점(inflection point)에 20시간까지 아직 도달하지 않도록 오일은 110℃에서 안정적이다. 일부 경우에, 1050 ppm의 토코페롤 및 500 pm의 아스코빌 팔미테이트가 오일에 첨가될 때, AOCS Cd 12b-92 랜시매트 테스트의 조건 하에서 전도도에서의 변곡점에 5일까지 아직 도달하지 않도록 오일은 110℃에서 안정적이다.
다른 양태에서, 본 발명은 (a) 선택적으로 서열 번호 76에 대해 적어도 65% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 23S rRNA를 포함하고, 선택적으로 절대 종속영양적인 재조합 유지성 세포를 제공하는 단계(여기서, 세포는 환경적 조건의 변화에 대한 반응으로 세포에 의해 만들어진 지방산의 양을 변화시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 포함함); (b) 세포 분열을 허용하고 세포의 수를 증가시키기 위하여 지방산의 합성에 허용된 제1 환경적 조건 하에서 세포를 배양하는 단계; (c) 재조합 핵산에 기인하여 지방산의 합성을 감소시키고 이에 따라 세포에 의해 생성된 오일 중의 해당 지방산의 양을 감소시키는 제2 환경적 조건 하에서 세포를 배양하는 단계; 및 (d) 세포로부터 오일을 추출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 경우에, 세포는 오일 중의 리놀레산의 양을 감소시키기 위해 델타 12 지방산 불포화효소의 활성을 감소시키도록 조작가능한 외인성 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 리놀레산은 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%만큼 오일 중에서 고갈된다.
일부 경우에, 세포는 종속영양적으로 배양된다. 일부 경우에, 세포는 미세조류 세포이다. 일부 경우에, 세포는 건조 세포 중량으로 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 오일을 생성한다.
일부 경우에, 제1 환경 조건은 제1 pH이고, 제2 환경 조건은 배양 배지의 제2 pH이다.
일부 경우에, 오일이 세포로부터 추출될 때, AOCS Cd 12b-92 랜시매트 테스트의 조건 하에서 전도도에서의 변곡점에 20시간까지 아직 도달하지 않도록 오일은 110℃에서 안정적이다. 일부 경우에, 오일이 세포로부터 추출될 때, 1050 ppm의 토코페롤 및 500 pm의 아스코빌 팔미테이트가 오일에 첨가될 때, AOCS Cd 12b-92 랜시매트 테스트의 조건 하에서 전도도에서의 변곡점에 5일까지 아직 도달하지 않도록 오일은 110℃에서 안정적이다.
일부 경우에, 세포는 KAS II 효소를 암호화하는 외인성 유전자 및 선택적으로 FatA 유전자의 녹아웃 또는 녹다운을 포함한다. 일부 경우에, 세포에 의해 만들어진 지방산의 양을 변화시키도록 조작가능한 재조합 핵산은 FAD 유전자를 표적화하는 저해 RNA를 포함하되, 저해 RNA의 생성은 조절가능한 프로모터의 제어 하에 있다.
일부 경우에, 오일은 60% 초과의 올레산 및 3% 미만의 다가불포화물(polyunsaturate)을 가지는 지방산 프로파일을 특징으로 한다. 일부 경우에, 오일은 70% 초과의 올레산 및 2% 미만의 다가불포화물을 가지는 지방산 프로파일을 특징으로 한다. 일부 경우에, 오일은 80% 초과의 올레산 및 1% 미만의 다가불포화물을 가지는 지방산 프로파일을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 논의한 방법에 의해 생성된 오일을 제공한다. 일부 경우에, 오일은 0.01% 내지 2% 리놀레산 및 (i) 80% 내지 95% 올레산 또는 (ii) 40% 초과의 C8, C10, C12, C14 또는 C16 지방산을 포함한다. 일부 경우에, 오일은 적어도 10%의 에르고스테롤; 에르고스테롤 및 β-시토스테롤(여기서, 에르고스테롤 대 β-시토스테롤의 비는 25:1 초과임); 에르고스테롤 및 브라시카스테롤; 및 에르고스테롤, 브라시카스테롤, 및 포리페라스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 논의한 오일에 의해 생성된 생성물을 제공한다. 일부 경우에, 생성물은 식품, 연료 또는 화학 제품이다. 일부 경우에, 생성물은 튀김 기름, 윤활유, 세정 용제, 계면활성제, 거품 또는 윤활제이다. 일부 경우에, 생성물은 올레산 다이머이다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열 번호 77 내지 서열 번호 79에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 작제물, 벡터, 염색체 또는 숙주 세포를 제공한다. 일부 경우에, 핵산은 서열 번호 77 내지 서열 번호 79에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 단백질을 암호화한다. 일부 경우에, 핵산은 서열 번호 77 내지 서열 번호 79 에 대해 적어도 98% 동일성을 갖는 단백질을 암호화한다. 일부 경우에, 핵산은 서열 번호80 내지 서열 번호 85에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성 또는 유전 암호의 축퇴에 의한 동등한 서열을 가진다.
본 발명의 이들 및 다른 양태 및 실시형태는 수반하는 도면, 바로 다음의 간단한 설명, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예에서 설명되고/설명되거나 예시된다. 상기 및 본 출원 전체적으로 논의한 특징 중 임의의 것 또는 모두는 본 발명의 다양한 실시형태로 조합될 수 있다.
도 1 내지 도 14는 실시예 4에서 논의한 바와 같은 유전자 조작된 프로토테카 모리포르미스 균주로부터 정련, 표백 및 탈취된 오일의 지방산 프로파일 및 용융 곡선을 나타낸다;
도 15는 실시예 5에서 논의한 바와 같은 항산화제 농도의 함수로서 상이한 오일의 안정성을 나타낸다;
도 16은 본 발명의 실시형태에 따른 매우 저수준의 다가불포화 지방산을 포함하는 천연 오일의 다양한 특성을 나타낸다;
도 17은 다음과 같이 다양한 오일에 대한 고형 지방 함량 백분율의 도표를 나타낸다: (a) 지질 경로 조작이 없는 피. 모리포르미스 RBD 오일; (b) 브라질 코코아 버터 +25% 유지방; (c) SAD 대립유전자의 수준을 감소시키는 헤어핀 핵산을 발현시키고, 이에 따라서 TAG 프로파일 중 올레산을 감소시키며 스테아르산을 증가시키는 균주로부터 피. 모리포르미스 RBD 오일의 3가지 복제물; (d) 내인성 OTE(올레오일 아실-ACP 티오에스테라제, 실시예 45 참조)를 과발현하는 균주로부터 피. 모리포르미스 RBD 오일; (e) 말레이시아 코코아 버터 +25% 유지방; 및 (f) 말레이시아 코코아 버터. 코코아 버터 및 코코아 버터 유지방 값은 문헌 값이다(Bailey? Industrial Oils and Fat Products, 6th ed.).
도 18은 콩 메틸 에스테르 대조군 샘플과 비교하여 종속영양적으로 성장된 유지성 미세조류로부터 제조된 고 올레산(high-oleic: HO) 및 고 안정성 고 올레산(high-stability high-oleic: HSAO) 트리글리세리드 오일로부터 제조된 메틸화된 오일 상에서 실행된 열 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 19는 고 올레산 및 고 안정성 고 올레산 조류 오일의 다양한 특성을 나타낸다.
도 20은 플라스크 및 발효기 바이오매스로부터의 S4495, S5665 및 S5675 오일의 TAG 조성을 나타낸다. La = 라우레이트(C12:0), M = 미리스테이트(C14:0), P = 팔미테이트(C16:0), Po = 팔미톨리에이트(C16:1), S = 스테아레이트(C18:0), O = 올리에이트(C18:1), L= 리놀리에이트(C18:2), Ln = α-리놀레네이트(C18:3), A = 아라키데이트(C20:0), B = 베헤네이트(C22:0), Lg = 리그노세레이트(C24:0), Hx = 헥사코사노에이트(C26:0). S-S-S는 모두 3개의 지방산이 포화된 TAG의 합을 말한다. 막대의 각각의 블록에서, 균주는 도면의 하부에 나타낸 순서로 나타내어져 있다.
도 21은 진탕 플라스크 바이오매스로부터의 S5774, S5775 및 S5776 오일의 TAG 조성을 나타낸다. La = 라우레이트(C12:0), M = 미리스테이트(C14:0), P = 팔미테이트(C16:0), Po = 팔미톨리에이트(C16:1), S = 스테아레이트(C18:0), O = 올리에이트(C18:1), L = 리놀리에이트(C18:2), Ln = α-리놀레네이트(C18:3), A = 아라키데이트(C20:0), B = 베헤네이트(C22:0), Lg = 리그노세레이트(C24:0), Hx = 헥사코사노에이트(C26:0). S-S-S는 모두 3개의 지방산이 포화된 TAG의 합을 말한다. 막대의 각각의 블록에서, 균주는 도면의 하부에 나타낸 순서로 나타내어져 있다.
도 22는 실시예 52에서 논의한 바와 같은 유전자 조작된 프로토테카 모리포르미스 균주로부터 정련, 표백 및 탈취된 미리스테이트가 풍부한 오일의 지방산 프로파일 및 고형 지방 함량을 나타낸다.
도 23은 균주 Z에서 발현된 이종성 FAE 단백질의 쌍 정렬을 나타낸다.
I. 정의
“대립유전자”는 하나의 특성 또는 특징에 관한 유전자의 임의의 하나 이상의 대안의 형태이다.
“천연 오일” 또는 “천연 지방”은 대부분 유기체로부터 얻은 트리글리세리드 오일을 의미할 것이며, 여기서 오일은 트리글리세리드의 지방산 프로파일을 실질적으로 변경시키기 위해 다른 천연 또는 합성 오일 또는 분획물과의 배합을 겪지 않는다. 특정 위치특이성의 트리글리세리드를 포함하는 오일과 관련하여, 천연 오일 또는 천연 지방은 해당 위치특이적 트리글리세리드 프로파일을 얻기 위한 에스테르교환 또는 기타 다른 합성 공정이 실시되지 않았고, 오히려 위치선택성이 세포 또는 세포의 집단에 의해 자연적으로 생성된다. 천연 오일 또는 천연 지방과 관련하여, 그리고 일반적으로 본 개시내용 전체적으로 사용된 바와 같이, 용어 오일 및 지방은 달리 언급되는 경우를 제외하고, 상호호환적으로 사용된다. 따라서, “오일” 또는 “지방”은 물질의 구성 및 기타 다른 조건에 따라서 실온에서 액체, 고체 또는 부분적으로 고체일 수 있다. 여기서, 용어 “분획화”는 유기체에 의해 생성되지만, 달성되는 프로파일에 대해 오일의 지방산 프로파일을 변화시키는 방법으로 오일로부터 재료를 제거하는 것을 의미한다. 용어 “천연 오일” 및 “천연 지방”은 유기체로부터 얻은 이와 같은 오일을 포함하며, 여기서 오일은 실질적으로 오일의 트리글리세리드 프로파일을 변화시키지 않고 정련, 표백 및/또는 탈검을 포함하는 최소의 가공을 겪는다. 천연 오일은 또한 “에스테르교환되지 않은 천연 오일”일 수 있는데, 이는 지방산이 글리세롤에 대한 지방산의 아실 결합에서 재분포되고, 본질적으로 유기체로부터 회수될 때와 동일한 구성으로 남아있는 공정을 천연 오일이 겪지 않는 것을 의미한다.
“외인성 유전자”는 (예를 들어, 형질전환/형질감염에 의해) 세포 내로 도입된 RNA 및/또는 단백질의 발현을 위해 암호화하는 핵산을 의미할 것이며, 또한 “이식유전자”로서 지칭된다. 외인성 유전자를 포함하는 세포는 추가적인 외인성 유전자(들)가 도입될 수 있는 재조합 세포로서 지칭될 수 있다. 외인성 유전자는 형질전환되는 세포에 대해 상이한 종으로부터 유래하거나(이종성) 또는 동일한 종으로부터 유래될 수 있다(상동성). 따라서, 외인성 유전자는 유전자의 내인성 복제물에 대해 세포 게놈의 상이한 위치를 점유하거나 또는 상이한 제어 하에 있는 상동성 유전자를 포함할 수 있다. 외인성 유전자는 세포 내 하나 초과의 복제물에 존재할 수 있다. 외인성 유전자는 게놈(핵 또는 색소체) 내로 삽입으로서 또는 에피솜 분자로서 세포 내에서 유지될 수 있다.
“지방산”은 글리세로지질 내 유리 지방산, 지방산 염 또는 지방 아실 모이어티를 의미할 것이다. 글리세로지질의 지방 아실기는 카복실산에 대해서 또는 트리글리세리드가 가수분해되거나 비누화될 때 생성되는 카복실산의 음이온에 대해서 설명될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
“고정 탄소 공급원”은 탄소를 함유하는 분자(들), 통상적으로 배양 배지 안에서 배양된 미생물유기체에 의해 이용될 수 있는 배양 배지 내 고체 또는 액체 형태로 주위 온도 및 압력에서 존재하는 유기 분자이다. 따라서, 이산화탄소는 고정탄소 공급원이 아니다.
“조작가능한 연관에서”는 2개의 핵산 서열, 예를 들어 대조군 서열(통상적으로 프로모터)와 연결된 서열(통상적으로 단백질을 암호화하는 서열, 또한 암호화 서열로 불림) 간의 기능적 연관이다. 프로모터가 유전자의 전사를 매개할 수 있다면, 프로모터는 외인성 유전자와 조작가능한 연관에 있다.
“미세조류”는 엽록체 또는 기타 다른 색소체를 함유하고, 선택적으로 광합성을 실행할 수 있는 미생물 유기체 또는 광합성을 실행할 수 있는 원핵 미생물 유기체이다. 미세조류는 에너지로서 고정 탄소 공급원을 대사할 수 없는 절대 광독립영양생물뿐만 아니라 오로지 고정 탄소 공급원에 의지해서만 살 수 있는 종속영양생물을 포함한다. 미세조류는 클라미도모나스(Chlamydomonas)와 같이 세포 분열 직후 자매세포로부터 분리되는 단세포 유기체뿐만 아니라, 예를 들어2가지 별개의 세포 유형의 단순 다세포 광합성 미생물인 볼복스(Volvox)와 같은 미생물을 포함한다. 미세조류는 클로렐라(Chlorella), 두날리엘라(Dunaliella) 및 프로토테카와 같은 세포를 포함한다. 미세조류는 또한 아그메넬룸(Agmenellum), 아나바에나(Anabaena) 및 피로보트리스(Pyrobotrys)와 같은 세포-세포 부착을 나타내는 기타 다른 광합성 미생물 유기체를 포함한다. 미세조류는 또한 특정 쌍편모조류 종 및 프로토테카 속의 종과 같이 광합성을 실행할 능력을 상실한 절대 종속영양 미생물유기체를 포함한다.
재조합 세포와 관련하여, 용어 “녹다운”은 유전자에 의해 암호화된 단백질의 생성 또는 활성에 대해 부분적으로 억제된(예를 들어, 약 1% 내지 95%만큼) 유전자를 말한다.
또한, 재조합 세포와 관련하여, 용어 “녹아웃”은 유전자에 의해 암호화된 단백질의 생성 또는 활성에 대해 완전히 또는 거의 완전히(예를 들어, >95%) 억제된 유전자를 말한다. 녹아웃은 암호화 서열 내로 비암호화 서열의 상동성 재조합, 유전자 결실, 돌연변이 또는 기타 다른 방법에 의해 제조될 수 있다.
“유지성” 세포는 자연적으로, 또는 재조합 또는 고전적인 균주 개선을 통해 건조 세포 중량으로 적어도 20%의 지질을 생성할 수 있는 세포이다. “유지성 미생물” 또는 “유지성 미생물유기체”는 유지성인 미세조류를 포함하는 미생물이다. 유지성 세포는 또한 지질의 일부 또는 모두 또는 기타 다른 내용물이 제거된 세포를 포함하며, 살아있는 세포와 죽은 세포를 둘 다 포함한다.
“규칙적(ordered) 오일” 또는 “규칙적 지방”은 주로 주어진 다형체 구조를 가지는 결정을 형성하는 것이다. 예를 들어, 규칙적 오일 또는 규칙적 지방은 β 또는 β' 다형체 형태가 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 초과하는 결정을 가질 수 있다.
천연 오일과 관련하여, “프로파일”은 오일 내에서의 특정 종 또는 트리글리세리드 또는 지방 아실기의 분포이다. “지방산 프로파일”은 글리세롤 백본에 대한 부착에 관련없는 오일의 트리글리세리드 내 지방 아실기의 분포이다. 지방산 프로파일은 통상적으로 지방산 메틸 에스테르(FAME)로 전환한 다음, 불꽃 이온화 검출(flame ionization detection: FID)을 이용한 기체 크로마토그래피(gas chromatography: GC) 분석에 의해 결정된다. 지방산 프로파일은 해당 지방산에 대한 곡선 하 면적으로부터 결정된 전체 지방산 신호에서 1% 이상의 지방산으로서 표현될 수 있다. FAME-GC-FID 측정은 지방산의 중량 백분율을 근사치로 계산한다. “sn-2 프로파일”은 오일에서 트리아실글리세리드의 sn-2 위치에서 발견되는 지방산의 분포이다. “위치특이적 프로파일”은 입체특이성에 관련없는 글리세롤 백본에 대한 아실기 부착의 위치화에 대한 트리글리세리드의 분포이다. 다시 말해서, 위치특이적 프로파일은 sn-1/3 대 sn-2에서 아실기 부착을 설명한다. 따라서, 위치특이적 프로파일에서, POS(팔미테이트-올리에이트-스테아레이트) 및 SOP(스테아레이트-올리에이트-팔미테이트)는 동일하게 처리된다. “입체특이적 프로파일”은 sn-1, sn-2 및 sn-3에서 아실기의 부착을 설명한다. 달리 나타내지 않는다면, SOP 및 POS와 같은 트리글리세리드는 동등한 것으로 고려된다. “TAG 프로파일”은 글리세롤 백본에 대한 연결와 관련하지만, 연결의 위치특이적 특성과 관련 없는 트리글리세리드에서 발견된 지방산의 분포이다. 따라서, TAG 프로파일에서, 오일 중 SSO의 백분율은 SSO와 SOS의 합인 반면, 위치특이적 프로파일에서, SSO의 백분율은 오일 중 SOS 종의 포함없이 계산된다. FAME-GC-FID 분석의 중량 백분율과 대조적으로, 트리글리세리드 백분율은 통상적으로 몰 백분율로서 주어지며; 즉, TAG 혼합물 중에 주어진 TAG 분자의 백분율이다.
“재조합”은 외인성 핵산의 도입 또는 천연 핵산의 변경에 기인하여 변형된 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터이다. 따라서, 예를 들어 재조합 세포는 천연(비재조합) 형태의 세포 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현시킬 수 있거나 또는 비재조합 세포에 의해 발현되는 해당 유전자와 상이하게 천연 유전자를 발현시킬 수 있다. 재조합 세포는 유전자 산물을 또는 억제 구성요소, 예를 들어 돌연변이, 녹아웃, 안티센스, 간섭 RNA(RNAi) 또는 세포 내 활성 유전자 산물의 수준을 감소시키는 dsRNA를 암호화하는 재조합 핵산을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. “재조합 핵산”은 일반적으로 핵산의 조작에 의해, 예를 들어 폴리머라제, 리가제, 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제의 사용, 화학적 합성의 사용에 의해 본래 시험관내에서 형성된 핵산이며, 또 다르게는 천연에서 정상적으로 발견되지 않는 형태이다. 재조합 핵산은, 예를 들어 조작가능한 연관에서 2가지 이상의 핵산을 위치시키기 위해 생성될 수 있다. 따라서, 천연에서 정상적으로 결합되지 않은 DNA 분자를 결찰시킴으로써 시험관내에서 형성된 단리된 핵산 또는 발현 벡터는 둘 다 본 발명의 목적을 위한 재조합체로 고려된다. 일단 재조합 핵산이 만들어지고 숙주 세포 또는 유기체 내로 도입되면, 이는 숙주 세포의 생체내 세포 기작을 사용하여 복제될 수 있지만; 그러나, 이와 같은 핵산은, 일단 재조합적으로 생성되면, 후속적으로 세포내에서 복제된다고 해도, 여전히 본 발명의 목적을 위한 재조합체로 고려된다. 유사하게, “재조합 단백질”은 재조합 기법을 사용하여, 즉 재조합 핵산의 발현을 통해 만들어진 단백질이다.
용어 “트리글리세리드”, “트리아실글리세리드” 및 “TAG”는 당업계에 공지된 바와 같이 상호호환적으로 사용된다.
II . 일반
본 발명의 예시적 실시형태는 변경된 지방산 프로파일을 생성하는 유지성 세포 및/또는 글리세로지질 중의 지방산의 변경된 위치특이적 분포, 및 세포로부터 생성된 생성물을 특징으로 한다. 유지성 세포의 예는 색소체의 유지성 세포, 예를 들어 유지성 조류의 세포를 포함하는 II형 지방산 생합성 경로를 갖는 미생물 세포를 포함한다. 세포의 구체적 예는 녹조식물문(phylum Chlorophtya), 트레복시조강(class Trebouxiophytae), 클로렐라목(order Chlorellales) 또는 클로렐라과(family Chlorellacae)의 종속영양 또는 절대 종속영양 미세조류를 포함한다. 유지성 미세조류의 예는 또한 클로렐라 및 프로토테카 종, 절대 종속영양생물을 포함하는 속을 포함하여, 공개된 PCT 특허출원 WO 제2008/151149호, WO 제2010/06032호, WO 제2011/150410호 및 WO 제2011/150411호에서 제공된다. 유지성 세포는 세포 중량으로, 예를 들어 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 또는 약 90%±5%오일을 생성할 수 있다. 선택적으로, 생성된 오일은 DHA 또는 EPA 지방산과 같은 고도로 불포화된 지방산이 낮을 수 있다. 예를 들어, 오일은 5%, 2% 또는 1% 미만의 DHA 및/또는 EPA를 포함할 수 있다. 상기 언급한 간행물은 또한 특히 미세조류 세포로부터 이와 같은 세포를 배양하고 오일을 추출하는 방법을 개시하며; 이와 같은 방법은 본 명세서에 개시된 세포에 적용가능하고, 이들 교시를 위한 참조로서 포함된다. 미세조류 세포가 사용될 때, 미세조류 세포들은 (절대 종속영양생물이 아닌 한) 자가영양적으로 또는 당(예를 들어, 글루코스, 프럭토스 및/또는 수크로스)을 사용하여 암실에서 배양될 수 있다. 본 명세서에 기재된 실시형태 중 임의의 것에서, 세포는 수크로스 공급 원료로부터 세포가 오일을 생성할 수 있도록 외인성 전화효소 유전자를 포함하는 종속영양 세포일 수 있다. 교대로 또는 추가적으로, 세포는 셀룰로스 공급 원료로부터 자일로스를 대사할 수 있다. 예를 들어, 세포는 활성 자일로스 수송체, 자일로스-5-포스페이트 수송체, 자일로스 이소머라제, 자일룰로키나제, 자일리톨 탈수소효소 및 자일로스 환원 효소를 암호화하는 것과 같은 하나 이상의 자일로스 대사 유전자를 발현시키기 위해 유전적으로 조작될 수 있다. 2012년 11월 15일 공개된 WO 제2012/154626호(발명의 명칭: GENETICALLY ENGINEERED MICROORGANISMS THAT METABOLIZE XYLOSE)를 참조한다.
유지성 세포는 지방산 생합성 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자를 발현한다. 결과로서, 일부 실시형태는 비식물 또는 비종자 오일로부터 얻을 수 없는 또는 전혀 얻을 수 없는 천연 오일을 특징으로 한다.
유지성 세포는 주로 트리아실글리세리드인 저장 오일을 생성하며, 세포의 저장체에 저장될 수 있다. 원유는 세포를 파괴하고, 오일을 단리시킴으로써 세포로부터 얻을 수 있다. WO 제2008/151149호, WO 제2010/06032호, WO 제2011/150410호 및 WO 제2011/1504호는 종속영양 배양 및 오일 단리 기술을 개시한다. 예를 들어, 오일은 세포를 제공 또는 배양하는 단계, 건조시키는 단계 및 압축시키는 단계에 의해 얻어질 수 있다. 생성된 오일은 당업계에 공지된 바와 같거나 또는 WO 제2010/120939호에 기재된 바와 같이 정련, 표백, 및 탈취(RBD)될 수 있다. 원유 또는 RBD 오일은 다양한 식품, 화학 제품 및 산업적 제품 또는 공정에서 사용될 수 있다. 오일의 회수 후, 가치있는 잔여 바이오매스가 남아있다. 잔여 바이오매스에 대한 용도는 종이, 플라스틱, 흡수제, 흡착제, 시추유체(drilling fluid)의 제조, 동물 먹이로서, 인간 영양소용 또는 비료용을 포함한다.
트리글리세리드의 지방산 프로파일(또한 “트리아실글리세리드” 또는 “TAG”로서 지칭됨) 세포 오일이 본 명세서에서 주어지는 경우, 이는 인지질이 제거된 조건 하에서 또는 인지질의 지방산에 대해 실질적으로 민감하지 않은 분석방법(예를 들어, 크로마토그래피 및 질량 분석법을 사용)을 이용하여 분석된 세포로부터 추출된 저장 오일의 비분획화된 샘플을 말하는 것으로 이해될 것이다. 오일에 인지질을 제거하기 위한 RBD 공정이 실시될 수 있고, 유리 지방산 및 냄새는 아직 오일 중 트리글리세리드의 지방산 프로파일에 대해 단지 부수적이거나 또는 무시할 만한 변화만을 가진다. 세포가 유지성이기 때문에, 일부 경우에 저장 오일은 세포 중 모든 TAG의 벌크를 구성할 것이다. 이하의 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 8은 TAG 지방산 조성물 및 위치특이적 구조를 결정하는 분석 방법을 제공한다.
크게 범주화하면, 본 발명의 특정 실시형태는 (i) 특정 지방산의 영양요구체; (ii) 불포화 지방산에 대한 영양요구체인 세포를 포함하여, 저농도의 다가불포화 지방산을 갖는 오일을 생성하는 세포; (iii) 글리세롤 또는 글리세롤 에스테르에 지방산을 전달하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 유전자의 발현에 기인하여 고농도의 특정 지방산을 갖는 오일을 생성하는 세포; (iv) 위치특이적 오일을 생성하는 세포, 및 (v) 쿠페아(Cuphea) PSR23 유래의 LPAAT 효소를 암호화하는 새로 발견된 유전자를 암호화하는 유전적 작제물 또는 세포(실시예 43 참조)를 포함한다. 실시형태는 또한 이와 같은 세포에 의해 만들어진 오일, 오일 추출 후 이와 같은 세포 유래의 잔여 바이오매스, 오일로 만들어진 함유 화학 물질, 연료 및 식료품, 및 세포를 배양하는 방법을 포함한다.
이하의 실시형태 중 임의의 것에서, 사용한 세포는 선택적으로 녹조식물문(Chlorophyta), 트레복시조강, 클로렐라목, 클로렐라과 또는 녹조강으로서 분류된 세포를 포함하는 종속영양 또는 절대 종속영양 미세조류 세포, 또는 합성 생물학의 도구를 사용하는(즉, II형 지방산 생합성을 위한 유전적 기작을 이와 같은 경로가 없는 유기체에 수송하는) II형 지방산 생합성 경로를 갖도록 조작된 세포를 포함하는 미세조류 세포와 같은 II형 지방산 생합성 경로를 갖는 세포이다. 구체적 실시형태에서, 세포는 프로토테카 모리포르미스, 프로토테카 크루가니(Prototheca krugani), 프로토테카 스타그노라(Prototheca stagnora) 또는 프로토테카 좁피(Prototheca zopfii) 종의 세포이거나 또는 서열 번호 76에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 뉴클레오티드 동일성을 가지는 23S rRNA 서열을 가진다. 암실에서 배양하거나 절대 종속영양생물을 사용함으로써, 생성된 천연 오일은 엽록소 또는 다른 색소가 낮을 수 있다. 예를 들어, 천연 오일은 실질적인 정제 없이 엽록소가 100 ppm, 50 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 1 ppm, 0.0.5 ppm 미만일 수 있다.
안정적인 탄소 동위원소 값 δ13C는 표준(예를 들어, 사우스 캐롤라이나의 Peedee formation제의 벨렘나이트 아메리카나(Belemnite americana)의 화석 골격의 카보나이트인 PDB)에 대한 13C/12C 비의 표현이다. 오일의 안정적인 탄소 동위원소값 δ13C(‰)는 사용한 공급 원료의 δ13C 값에 관련될 수 있다. 일부 실시형태에서, 오일은 C4 식물, 예를 들어 옥수수 또는 사탕수수로부터 유래된 당에서 종속영양적으로 성장된 유지성 유기체로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 오일의 δ13C(‰)는 -10‰ 내지 -17‰ 또는 -13‰ 내지 -16‰이다.
이하에 논의하는 구체적 실시형태 및 실시예에서, 하나 이상의 지방산 합성 유전자(예를 들어, 아실-ACP 티오에스테라제, 케토-아실 ACP 합성 효소, LPAAT, 스테아로일 ACP 불포화효소 또는 본 명세서에 기재된 기타 다른 것을 암호화하는 것)는 미세조류에 혼입된다. 특정 미세조류에 대해, 유전자 산물이 기능하기 위해 ACP의 결합을 필요로 하는 아실-ACP 티오에스테라제와 같은 효소일 때조차, 식물 지방산 합성 유전자 산물은 대응되는 식물 아실기 운반 단백질(ACP)의 부재 시 기능성이라는 것이 발견되었다. 따라서, 선택적으로, 미세조류 세포는 식물 ACP 유전자의 공동 발현 없이 원하는 오일을 만들기 위해 이와 같은 유전자를 이용할 수 있다.
III . 오일 생성 단계 동안 성장 저해 조건에 대한 지방산 영양요구체 /환원 지방산 수준
실시형태에서, 세포는 지질 경로 유전자의 모든 대립유전자가 녹아웃되도록 유전적으로 조작된다. 교대로, 대립유전자의 유전자 산물의 양 또는 활성은 지방산을 이용한 보충을 필요로 하도록 녹다운된다. 유전자의 대립유전자 중 하나 이상에 대해 상동성인 공여체 서열을 보유하는 제1 형질전환 작제물이 생성될 수 있다. 이러한 제1 형질전환 작제물이 도입될 수 있고, 하나 이상의 대립유전자 파괴를 특징으로 하는 단리된 균주를 얻기 위한 선택 방법이 뒤따를 수 있다. 대안적으로, 삽입으로부터 제1 대립유전자 내로 선택마커를 발현하도록 조작된 제1 균주가 만들어질 수 있고, 이에 의해 제1 대립유전자를 불활성화시킨다. 이 균주는 또한 지질 경로 유전자의 남아있는 대립유전자(들)를 녹아웃 또는 녹다운시키도록 추가적인 유전자 조작을 위한 숙주로서 사용될 수 있다. 내인성 유전자의 상보성은 활성이 본래 제거된 내인성 유전자를 보유하는 추가적인 형질전환 작제물의 조작된 발현을 통해 또는 적합한 이종성 유전자의 발현을 통해 달성될 수 있다. 상보성 유전자의 발현은 구성적으로 또는 조절가능한 대조군을 통해 조절될 수 있고, 이에 의해 성장을 허용하거나 또는 영양요구체의 조건을 마음대로 만들기 위해 원하는 수준으로 발현을 조절할 수 있게 한다. 실시형태에서, 지방산 영양요구체 세포의 집단은 상보성 유전자에 대한 선별 또는 선택에 사용되며; 예를 들어, 외인성 지방산 합성 효소 또는 핵산 라이브러리에 대한 특정 유전자 후보를 이용한 형질전환에 의해 이와 같은 후보를 함유하는 것으로 여겨진다.
원하는 유전자의 모든 대립유전자의 녹아웃 및 녹아웃 유전자의 상보성은 순차적으로 수행될 필요가 없다. 적합한 상보성 유전자의 구성적 또는 유도성 발현에 의한 관심 대상의 내인성 유전자 및 그것의 상보성의 파괴는 몇몇 방법으로 수행될 수 있다. 하나의 방법에서, 이는 적합한 작제물의 공동형질전환에 의해 달성될 수 있는데, 하나는 관심대상의 유전자를 파괴하는 것이고, 두번째는 적합한 대안의 좌위에서 상보성을 제공하는 것이다. 다른 방법에서, 표적 유전자의 제거는 유도성 프로모터의 제어 하에서 적합한 유전자에 의한 표적 유전자의 직접적 대체를 통해 달성될 수 있다. 이 방법에서, 표적화된 유전자의 발현은 이제 조절가능한 프로모터의 제어 하에 놓인다. 추가적인 접근법은 유전자의 내인성 조절 구성요소를 외인성, 유도성 유전자 발현 시스템으로 대체하는 것이다. 이와 같은 계획 하에서, 관심 대상의 유전자는 이제 특정 필요에 따라서 턴온(turn on)되거나 턴오프(turn off)될 수 있다. 또한 관심 대상의 유전자를 보완할 수 있는 외인성 유전자를 발현시키기 위해 제1 균주를 만든 다음, 이러한 제1 균주에서 관심 대상의 유전자의 모든 대립유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키는 추가적인 방법이 있다. 다수 대립유전자의 녹다운 또는 녹아웃 및 외인성 유전자를 이용한 보완의 접근법은 조작된 세포의 지방산 프로파일, 위치특이적 프로파일, sn-2 프로파일 또는 TAG 프로파일을 변경시키는데 사용될 수 있다.
구체적 실시형태에서, 재조합 세포는 내인성 아실-ACP 티오에스테라제; 예를 들어, 길이 C18의 지방 아실-ACP 사슬(예를 들어, 스테아레이트(C18:0) 또는 올리에이트(C18:1), 또는 C8:0-C16:0 지방산)을 가수분해하는 것을 선호하는 FatA 또는 FatB 아실-ACP 티오에스테라제의 활성을 감소시키도록 조작가능한 핵산을 포함한다. 내인성 아실-ACP 티오에스테라제의 활성은 녹아웃 또는 녹다운 접근법에 의해 감소될 수 있다. 하나 이상의 RNA 헤어핀 작제물의 사용을 통해, 프로모터 강탈(hijacking)(더 낮은 활성 또는 유도성 프로모터를 내인성 유전자의 천연 프로모터로 치환)에 의해, 또는 유도성 프로모터의 제어 하에서 유사하거나 동일한 유전자의 도입과 조합한 유전자 녹아웃에 의해 녹다운이 달성될 수 있다. 실시예 34는 내인성 지방 아실-ACP 티오에스테라제(FATA1)의 2개의 대립유전자가 녹아웃된 프로토테카 균주의 조작을 기재한다. 프로토테카 모리포르미스 FATA1의 활성은 외인성 티오에스테라제의 발현에 의해 보완되었다. 실시예 36은 프로토테카에서 FATA1의 발현을 감소시키기 위한 RNA 헤어핀 작제물의 용도를 상세히 설명한다.
따라서, II형 지방산 생합성 경로를 이용한 유기체 세포를 포함하는 유지성 세포는 지방산 보충 또는 유전적 보완의 부재 하에서 세포의 생존력을 제거하거나 또는 심하게 제한하기 위한 정도로 아실-ACP-티오에스테라제 암호화 대립유전자의 녹아웃 또는 녹다운을 가질 수 있다. 이들 균주는 아실-ACP-티오에스테라제 이식유전자를 발현하는 형질전환체에 대한 선택에 사용될 수 있다. 교대로 또는 추가적으로, 균주는 외인성 아실-ACP-티오에스테라제를 완전히 이식하는데 사용되어 이와 같은 세포에 의해 생성된 천연 오일의 극적으로 상이한 지방산 프로파일을 제공할 수 있다. 예를 들어, FATA 발현은 완전히 또는 거의 완전히 제거될 수 있고, 중쇄 지방산을 생성하는 FATB 유전자로 대체될 수 있다. 구체적 실시형태에서, 이들 형질전환체는 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산 또는 팔미트산을 포함하는 천연 오일 또는 전체 지방산의 사슬 길이가 18개 탄소 미만인 천연 오일을 생성한다. 이와 같은 세포는 스테아르산 또는 올레산과 같은 더 긴 사슬의 지방산에 의한 보충 또는 FatA 유전자를 조절하는 유도성 프로모터의 경우에 성장 허용적 상태와 제한적 상태 간의 환경적 조건의 전환을 필요로 할 수 있다.
실시형태에서, 유지성 세포가 배양된다. 세포는 하나 이상 유형의 지방산에 대해 완전히 영양요구성이거나 또는 부분적으로 영양요구성(즉, 치명적 또는 합성적 질병)이다. 세포는 세포수를 증가시키기 위해 지방산(들)을 보충하면서 배양된 다음, 세포가 오일을 축적할 수 있게 한다(예를 들어, 건조세포 중량으로 적어도 40%). 대안적으로, 세포는 환경적 조건에 기반하여 활성이 전환될 수 있는 조절가능한 지방산 합성 유전자를 포함하고, 제1 세포 분열 단계 동안 환경적 조건은 지방산의 생성을 선호하며, 제2의 오일 축적 단계 동안 환경적 조건은 지방산의 생성을 선호하지 않는다. 유도성 유전자의 경우에, 유도성 유전자의 조절은 환경적 pH를 통해(예를 들어, 실시예에서 기재하는 바와 같은 AMT3 프로모터를 사용함으로써) 제한 없이 매개될 수 있다.
이들 보충 또는 조절 방법 중 하나를 적용하는 결과로서, 세포 오일은 최적 세포 증식에 필수적인 소량의 하나 이상의 지방산을 갖는 세포로부터 얻어질 수 있다. 얻어질 수 있는 오일의 구체적 예는 스테아르산, 리놀레산 및/또는 리놀렌산이 적은 것을 포함한다.
이들 세포 및 방법은 저 다가불포화 오일과 관련하여 바로 아래의 부문에서 그리고 다가불포화 지방산이 적은 오일과 관련하여 실시예 6(지방산 불포화효소 영양요구체)에서 그리고 실시예 34(아실-ACP 티오에스테라제 영양요구체)에서 설명된다.
마찬가지로, 지방산 영양요구체는 SAD, FAD, KASIII, KASI, KASII, KCS, 신장효소, GPAT, LPAAT, DGAT 또는 AGPAT 또는 PAP를 암호화하는 것을 포함하여 기타 다른 지방산 합성 유전자에서 만들어질 수 있다. 유지성 세포에 의해 생성된 천연 오일의 지방산 프로파일, 위치특이적 프로파일 또는 TAG 프로파일을 변경시키기 위해 이들 영양요구체는 또한 보체 유전자에 대한 선택에 또는 원하는 외인성 유전자에 도움이 되는 이들 유전자의 천연 발현을 제거하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시형태에서, 오일/지방을 생성하기 위한 방법이 있다. 상기 방법은 지방산의 존재에 기인하여 세포 수를 증가시키기 위해 세포 분열이 허용된 조건의 제1 세트 하 성장 단계에서 재조합 유지성 세포를 배양하는 단계, 세포 분열은 제한되지만, 지방산이 고갈된 오일의 생성이 허용되는 조건의 제2 세트 하 오일 생성 단계에서 세포를 배양하는 단계, 및 세포로부터 오일을 추출하는 단계를 포함하며, 여기서 세포는 지방산 합성 효소의 활성을 억제하도록 조작가능한 돌연변이 또는 외인성 핵산을 가지고, 효소는 선택적으로 스테아로일-ACP 불포화효소, 델타 12 지방산 불포화효소 또는 케토아실-ACP 합성 효소이다. 세포에 의해 생성된 오일은 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%만큼 지방산이 고갈될 수 있다. 세포는 종속영양적으로 배양될 수 있다. 세포는 종속영양적으로 또는 자가영양으로 배양된 미세조류 세포일 수 있고, 건조세포 중량으로 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 오일을 생성할 수 있다.
IV . 저 다가불포화 천연 오일
본 발명의 실시형태에서, 세포에 의해 생성된 천연 오일은 매우 낮은 수준의 다가불포화 지방산을 가진다. 결과로서, 천연 오일은 산화적 안정성을 포함하여 개선된 안정성을 가질 수 있다. 천연 오일은 실온에서 액체 또는 고체일 수 있거나, 또는 위치특이적 또는 입체특이적 오일, 고스테아레이트 오일 또는 이하에 기재되는 고 중쇄 오일을 포함하는 액체 및 고체 오일의 배합물일 수 있다. 산화적 안정성은 정해진 온도에서 AOCS Cd 12b-92 표준 시험을 사용하여 랜시매트 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, OSI(산화적 안정성 지수) 시험은 110℃ 내지 140℃의 온도에서 실행될 수 있다. 오일은 하나 이상의 지방산 불포화효소 활성을 감소시키도록 유전적으로 조작된 세포(예를 들어, 상기 또는 본 명세서의 다른 곳에서 언급된 색소체 미생물 세포 중 임의의 것)를 배양함으로써 생성된다. 예를 들어, 세포는 올레산(18:1)을 리놀레산(18:2)으로 전환시키는 하나 이상의 지방 아실 Δ12 불포화효소(들) 및/또는 리놀레산(18:2)을 리놀렌산(18:3)으로 전환시키는 하나 이상의 지방 아실 Δ15 불포화효소(들)의 활성을 감소시키도록 유전적으로 조작될 수 있다. RNAi, siRNA, miRNA, dsRNA, 안티센스 및 헤어핀 RNA 기법을 포함하는 다양한 방법이 암호 또는 조절 영역, RNA 전사의 저해 또는 효소 번역에서 불포화 효소를 암호화하는 유전자 중 하나 이상의 대립유전자의 녹아웃 또는 돌연변이를 포함하여 불포화효소를 저해하는데 사용될 수 있다. 저해 단백질 또는 불포화효소에 특이적인 기타 다른 물질을 생성하는 외인성 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 당업계에 공지된 기타 다른 기법이 또한 사용될 수 있다.
구체적 실시형태에서, 세포 내 지방산 불포화효소(예를 들어, Δ12 지방산 불포화효소) 활성은 세포가 배양될 수 없거나 또는 배양이 어려운 정도로 감소된다(예를 들어, 세포 분열 속도는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 초과로 감소됨). 이와 같은 조건을 달성하는 것은 불포화효소 또는 이의 유전자 산물의 다수 유전자 복제물(예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상)의 활성의 녹아웃 또는 효과적인 억제를 수반할 수 있다. 구체적 실시형태는 세포수를 증가시키기 위해 지방산 또는 지방산의 혼합물을 보충하면서 완전한 또는 부분적 지방산 영양요구체의 세포 배양에서의 배양 단계 다음에, 세포가 오일을 축적할 수 있게 하는 단계(예를 들어, 세포 중량으로 적어도 40%로)를 포함한다. 대안적으로, 세포는 활성이 전환될 수 있는 조절가능한 지방산 합성 유전자를 포함한다. 예를 들어, 조절은 환경적 조건에 기반할 수 있으며, 제1 세포 분열 단계 동안 환경적 조건은 지방산의 생성을 선호하고, 제2 오일 축적 단계 동안 환경적 조건은 오일 생성을 선호하지 않는다. 예를 들어, 배양 배지 pH는 높은 또는 낮은 합성 효소 활성 상태를 만들기 위한 지질 경로 유전자의 발현을 전환시키는 환경적 제어로서 사용될 수 있다. 이와 같은 세포의 예는 실시예 7에 기재되어 있다.
구체적 실시형태에서, 세포는 세포 내에서 리놀레산 수준의 조정을 사용하여 배양된다. 특히, 천연 오일은 리놀레산의 존재에 기인하여 세포 수의 증가를 허용하는 제1 조건 하에서 세포를 배양하는 단계 및 이어서 리놀레산 기아(starvation)를 특징으로 하고 따라서 세포 분열을 저해하지만, 아직 오일 축적은 허용하는 제2 조건 하에서 세포를 배양하는 단계에 의해 생성된다. 예를 들어, 세포의 종자 배양물은 배양 배지에 첨가된 리놀레산의 존재 하에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 지방 아실 Δ12 불포화효소의 2개의 대립유전자의 제거에 기인하는 리놀레산 생성이 없는 프로토테카 균주(즉, 리놀레산 영양요구체)의 종자 배양물에서 리놀레산의 0.25 g/L까지의 첨가는 세포 분열을 야생형 세포의 수준과 비슷한 수준으로 지지하는데 충분하다. 선택적으로, 그 다음에 리놀레산은 세포에 의해 소모될 수 있거나 또 다르게는 제거되거나 또는 희석될 수 있다. 그 다음에 세포는 오일 생성 단계(예를 들어, WO 제2010/063032호에 기재된 바와 같은 질소 제한 조건 하에서 당을 공급하는 단계)로 전환된다. 놀랍게도, 절대 종속영양 유지성 미세조류 프로토테카에서 입증되는 바와 같지만, 일반적으로 기타 다른 유지성 미세조류, 미생물유기체 또는 심지어 다세포 유기체(예를 들어, 배양된 식물 세포)에 적용가능한 오일 생성은 리놀레산 생성 또는 보충이 없을 때 조차 일어나는 것이 발견되었다. 이들 조건 하에서, 세포의 오일 함량은 건조 세포 중량으로 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상으로 증가될 수 있는 한편, 생성된 오일은 오일 중 전체 트리아실글리세롤 지방산의 백분율로서 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.05% 이하로 다가불포화 지방산(예를 들어; 리놀레산+리놀렌산) 프로파일을 가질 수 있다. 예를 들어, 세포의 오일 함량은 건조 세포 중량으로 50% 이상이고, 생성된 오일의 트리글리세리드는 다가불포화 지방산이 3% 미만일 수 있다.
이들 오일은 또한 리놀레산을 생성하기 위한 세포 기작을 사용함으로써 리놀레산으로 배양물을 보충할 필요는 없지만(또는 필요가 감소됨), 우세하게 또는 세포 분열 단계 동안만 생성될 수 있다. 리놀레산 생성 세포 기작은 오일 생성 단계 동안 실질적으로 더 적은 리놀레산을 생성하도록 조절가능할 수 있다. 조절은 불포화효소 유전자(들)의 전사 조정을 통할 수 있다. 예를 들어, 지방산 Δ12 불포화효소 활성의 대다수 및 바람직하게는 모두는 세포 분열 단계에서 불포화효소를 발현시키지만, 오일 축적 단계 동안 감소되거나 꺼지도록 조절된 조절가능한 프로모터 하에 놓일 수 있다. 조절은 본 명세서에 기재된 바와 같이 pH 및/또는 질소 수준과 같은 세포 배양 조건 또는 기타 다른 환경적 조건과 관련될 수 있다. 실제로, 불포화효소 활성의 조절에서 원하는 전환을 달성하기 위해 조건은 물질(예를 들어, 산 또는 염기의 첨가를 통한 양성자)을 첨가하거나 또는 제거함으로써 또는 세포가 물질(예를 들어, 질소 공급 영양소)을 소모시킬 수 있도록 함으로써 조작될 수 있다.
불포화효소 활성을 조절하기 위한 기타 다른 유전적 또는 비유전적 방법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 불포화효소의 저해제는 오일 생성 단계 동안 다가불포화 지방산이 생성되는 것을 저해하는데 효과적인 방식으로 배양 배지에 첨가될 수 있다.
따라서, 본 발명의 구체적 실시형태에서, 환경적 조건을 통해 재조합 조절 구성요소의 제어 하에서 조절가능한 델타 12 지방산 불포화효소 유전자를 갖는 재조합 세포를 제공하는 단계를 포함하는 방법이 있다. 세포는 세포 조작이 유리한 조건 하에서 배양된다. 주어진 세포 밀도에 도달 시, 세포 배지는 영양소 제한(예를 들어, 이용가능한 질소의 감소)에 의해 세포를 지질 생성 모드로 전환시키도록 변경된다. 지질 생성 단계 동안, 환경적 조건은 델타 12 지방산 불포화효소의 활성이 하향조절되도록 하는 것이다. 그 다음에 세포가 채취되며, 선택적으로, 오일이 추출된다. 지질 생성 단계 동안 저수준의 델타 12 지방산 불포화효소 때문에, 오일은 더 적은 다가불포화 지방산을 가지며, 개선된 산화적 안정성을 가진다. 선택적으로, 세포는 종속영양적으로 배양되고, 선택적으로 미세조류 세포이다.
이들 불포화효소 조절 방법 중 하나 이상을 사용하여, 특히 생물반응기에서 대규모(예를 들어, 1000 L 초과) 배양에서 이전에 얻을 수 없었던 것으로 여겨졌던 천연 오일을 얻을 수 있다. 오일은 오일 중에서 전체 트리아실글리세롤 지방산의 영역%로서 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.3%, 0.2% 이하로 다가불포화 지방산 수준을 가질 수 있다.
이와 같은 저수준의 다가불포화물을 갖는 하나의 결과는 오일이 산화에 대해 예외적으로 안정적이다는 것이다. 사실, 일부 경우에 오일은 임의의 이전에 공지된 천연 세포 오일보다 더 안정적일 수 있다. 구체적 실시형태에서, 오일은 AOCS Cd 12b-92의 조건 하에서 전도도에서의 변곡점에 10시간, 15시간, 20시간, 30시간, 40시간, 50시간, 60 시간 또는 70 시간까지 아직 도달하지 않도록 첨가된 항산화제 없이 110℃에서 안정적이다. 매우 안정적인 오일에 대해 주목하는 랜시매트 시험은, 이와 같은 긴 시험 기간으로 일어나는 증발로 인하여 이와 같은 시험에서 물의 보충이 필요할 수 있다(실시예 5 참조). 예를 들어, 오일은 항산화제를 첨가하지 않고 110℃에서 40시간 내지 50시간 또는 41시간 내지 46시간의 OSI 값을 가질 수 있다. 항산화제(식품 또는 다른 것에 적합함)가 첨가될 때, 측정된 OSI 값은 추가로 증가될 수 있다. 예를 들어, 토코페롤(100 ppm) 및 아스코빌 팔미테이트(500 ppm) 또는 PANA 및 아스코빌 팔미테이트가 첨가되면, 이와 같은 오일은 랜시매트 시험에 의해 측정되는 바와 같이 110℃에서 100시간 또는 200시간 초과로 산화적 안정성 지수(oxidative stability index: OSI 값)을 가질 수 있다. 다른 예에서, 혼합 토코페롤 1050 ppm 및 아스코빌 팔미테이트 500 pm이 1% 미만의 리놀레산 또는 1% 미만의 리놀레산 + 리놀렌산을 포함하는 오일에 첨가되고; 결과로서, 오일은 110℃에서 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 또는 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 또는 16일, 20일, 30일, 40일 또는 50일, 5일 내지 15일, 6일 내지 14일, 7일 내지 13일, 8일 내지 12일, 9일 내지 11일, 약 10일, 또는 약 20일 동안 안정적이다. 오일은 또한 130℃에서 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 또는 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 또는 16일, 20일, 30일, 40일 또는 50일, 5일 내지 15일, 6일 내지 14일, 7일 내지 13일, 8일 내지 12일, 9일 내지 11일, 약 10일 또는 약 20일 동안 안정적일 수 있다. 구체적 예에서, 이와 같은 오일은 100시간 초과 동안(관찰한 바와 같이 약 128시간) 안정적인 것으로 발견되었다. 추가 실시형태에서, 120℃에서 첨가한 항산화제가 없는 천연 오일의 OSI 값은 15시간 또는 20시간 초과이거나 또는 10시간 내지 15시간, 15시간 내지 20시간, 20시간 내지 25시간, 또는 25시간 내지 50시간, 또는 50시간 내지 100시간의 범위에 있다.
일 예에서, 이들 방법을 사용하여, 미세조류 세포의 오일 함량은 건조 세포 중량으로 40% 내지 약 85%이고, 오일의 지방산 프로파일에서 다가불포화 지방산은 오일의 지방산 프로파일에서 0.001% 내지 3%이며, 선택적으로 OSI 유도 시간이 항산화제의 첨가 없이 110℃에서 적어도 20시간인 천연 오일을 수득한다. 또 다른 예에서, 유지성 세포로부터 천연 오일의 RBD 처리에 의해 생성된 천연 오일이 있으며, 상기 오일은 0.001% 내지 2% 다가불포화 지방산을 포함하고, OSI 유도 시간이 항산화제의 첨가 없이 110C에서 30시간을 초과한다. 또 다른 예에서, 유지성 세포로부터 천연 오일의 RBD 처리에 의해 생성된 천연 오일이 있으며, 상기 오일은 0.001% 내지 1% 다가불포화 지방산을 포함하고, OSI 유도 시간이 항산화제의 첨가 없이 110C에서 30시간을 초과한다.
다른 구체적 실시형태에서, 상기 기재한 방법에 의해 생성된 감소된 다가불포화 수준을 가지는 오일이 있다. 오일은 PANA 및 아스코빌 팔미테이트와 같은 항산화제와 조합된다. 예를 들어, 이와 같은 오일이 0.5% PANA 및 500 ppm의 아스코빌 팔미테이트와 조합될 때, 오일은 OSI 값이 130℃에서 약 5일 또는 110℃에서 21일인 것으로 발견되었다. 이들 현저한 결과는 오일이 특별히 안정적일 뿐만 아니라 이들 두 항산화제가 트리글리세리드 오일의 특별히 강력한 안정제이고 이들 항산화제의 조합이 안정적인 생분해성 윤활제(예를 들어, 제트 엔진 윤활제)를 생성하는데 포함되는 일반적인 적용 가능성을 가질 수 있다는 것을 시사한다. 구체적 실시형태에서, 지방 아실 Δ12 불포화효소의 유전적 조작은 조작 없이 균주에 대해 (예를 들어, 110℃에서) OSI에서 2배 내지 30배, 또는 5배 내지 25배, 또는 10배 내지 20배 증가를 가져온다. 오일은 상기 기재한 것을 포함하여, 세포에서 불포화효소 활성을 억제함으로써 생성될 수 있다.
본 발명의 오일과 함께 사용하기에 적합한 항산화제는 알파, 델타 및 감마 토코페롤(비타민 E), 토코트리에놀, 아스코르브산(비타민 C), 글루타티온, 리포산, 요산, β-카로텐, 라이코펜, 루테인, 레티놀(비타민 A), 유비퀴놀(코엔자임 Q), 멜라토닌, 레스베라트롤, 플라보노이드, 로즈마리 추출물, 프로필 갈레이트(propyl gallate; PG), 3차 부틸하이드로퀴논(TBHQ), 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA) 및 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), N,N'-디-2-부틸-1,4-페닐렌디아민, 2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀, 2,4-디메틸-6-tert-부틸페놀, 2,4-디메틸-6-tert-부틸페놀, 2,4-디메틸-6-tert-부틸페놀, 2,6-디-tert-부틸-4-메틸페놀, 2,6-디-tert-부틸페놀 및 페닐-알파-나프틸아민(PANA)을 포함한다.
불포화효소 변형에 추가적으로, 관련된 실시형태에서, KAS, SAD, LPAAT 또는 DGAT 유전자를 암호화하는 내인성 또는 외인성 유전자의 과발현 및/또는 변경된 사슬 길이 특이성을 갖는 아실-ACP 티오에스테라제의 도입 또는 치환을 포함하는 기타 다른 유전적 변형이 전체적으로 기재한 바와 같이 오일의 특성을 추가로 조정하도록 만들어질 수 있다. 예를 들어, 상승된 올레산 수준을 생성하는 균주는 또한 저수준의 다가불포화물을 생성할 수 있다. 이와 같은 유전적 변형은 외인성 SAD 유전자를 도입함으로써 스테아로일-ACP 불포화효소(SAD)의 활성을 증가시키는 것, 외인성 KASII 유전자를 도입함으로써 신장효소 활성을 증가시키는 것 및/또는 FATA 유전자를 녹다운 또는 녹아웃시키는 것을 포함할 수 있다.
구체적 실시형태에서, 적은 다가불포화물을 포함하는 고올레산 천연 오일이 생성될 수 있다. 예를 들어, 오일은 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 초과의 올레산 및 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 다가불포화물을 포함하는 지방산 프로파일을 가질 수 있다. 관련된 실시형태에서, 천연 오일은 60% 초과의 올레산과 함께 3% 이하의 다가불포화 지방산, 2% 미만의 다가불포화 지방산과 70% 초과의 올레산, 1% 미만의 다가불포화 지방산과 80% 초과의 올레산, 또는 0.5% 미만의 다가불포화 지방산과 90% 초과의 올레산을 갖는 오일을 생성하기 위해 지방산 Δ12 불포화효소 활성을 감소시키도록 조작가능한 재조합 핵산 및 선택적으로 지방산 Δ15 불포화효소를 갖는 세포에 의해 생성된다. 올레산을 증가시키는 한 방법은 FATA 아실-ACP 티오에스테라제의 발현을 감소시키고 선택적으로 KAS II 유전자를 과발현하도록 조작가능한 재조합 핵산을 사용하는 것으로 발견되었고; 이와 같은 세포는 75% 이상의 올레산을 포함하는 오일을 생성할 수 있다. 교대로, KASII의 과발현은 FATA 녹아웃 또는 녹다운 없이 사용될 수 있다. 올레산 수준은 상기 방법을 사용하여 델타 12 지방산 불포화효소 활성의 감소에 의해 추가로 증가될 수 있고, 이에 의해 불포화 리놀레산 및 리놀렌산으로 전환되는 올레산 양이 감소될 수 있다. 따라서, 생성된 오일은 적어도 75% 올레산 및 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 이하의 리놀레산을 포함하는 지방산 프로파일을 가질 수 있다. 관련된 실시예에서, 오일은 80% 내지 95% 올레산 및 약 0.001% 내지 2% 리놀레산, 0.01% 내지 2% 리놀레산, 또는 0.1% 내지 2% 리놀레산을 가진다. 이와 같은 오일은 우수한 안정성과 함께 낮은 빙점을 가질 것이며, 식품에서, 튀김용, 연료용, 또는 화학 물질 적용분야에서 유용하다. 추가로, 이들 오일은 시간에 따른 색 변화에 대해 감소된 경향을 나타낼 수 있다. 예시적 화학적 적용에서, 고올레산 오일이 화학 물질을 생성하는데 사용된다. 오일 중 트리글리세리드의 올레산기의 올레산 이중 결합은 에폭시화되거나 하이드록실화되어 폴리올을 만들 수 있다. 에폭시화되거나 하이드록실화된 오일은 다양한 적용분야에서 사용될 수 있다. 하나의 이와 같은 적용분야는 이소시아네이트와 하이드록실화된 트리글리세리드의 축합을 통한 폴리우레탄(폴리우레탄 발포체를 포함함)의 생성이며, 이는 하이드록실화된 대두오일 또는 피마자 오일을 이용하여 실행된 바와 같다. 예를 들어 하이드록실화 및 폴리우레탄 축합 화학분야의, 예를 들어 US 제2005/0239915호, US 제2009/0176904호, US 제2005/0176839호, US 제2009/0270520호 및 US 특허 제4,264,743호 및 문헌[Zlatanic, et al, Biomacromolecules 2002, 3, 1048-1056 (2002)]을 참조한다. 적합한 하이드록실 형성 반응은 지방산의 하나 이상의 이중 결합의 에폭시화 다음에 물(디올을 형성), 알코올(하이드록실 에테르를 형성), 또는 산(하이드록실 에스테르를 형성)을 이용한 산 촉매 에폭시드 고리 개방을 포함한다. 바이오 기반 폴리우레탄을 생성하는 것에서 고올레산/저 다가불포화 오일을 사용하는 것의 다수의 이점이 있으며, 즉 (1) 폴리우레탄 발포체의 보관 수명, 색상 또는 냄새가 개선될 수 있고; (2) 다가불포화물로부터 생성된 원치않는 부반응이 없기 때문에 생성물의 재현 가능성이 개선될 수 있으며; (3) 다가불포화물이 없기 때문에 더 큰 정도의 하이드록실화 반응이 일어날 수 있고, 따라서 폴리우레탄 산물의 구조적 특징이 개선될 수 있다.
본 명세서에 기재된 저 다가불포화 또는 고올레산/저 다가불포화 오일은 황변이 바람직하지 않은 화학적 적용분야에서 유리하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 황변은 트리글리세리드로부터 유래된 트리글리세리드 지방산으로부터 만들어진 페인트 또는 코팅에서 바람직하지 않을 수 있다. 황변은 다가불포화 지방산 및 토코트리에놀 및/또는 토코페롤을 수반하는 반응에 의해 야기될 수 있다. 따라서 저수준의 토코트리에놀을 가지는 유지성 미생물 중에서 고안정성 오일을 생성하는 것은 오일을 사용하여 만들어진 화학적 조성물에서 높은 색상 안정성을 상승시키는데 유리할 수 있다. 보통 사용되는 식물 오일과 대조적으로, 유지성 미생물의 적절한 선택을 통해, 이들 실시형태의 천연 오일은 토코페롤 및 토코트리에놀 수준이 1 g/L 이하일 수 있다. 구체적 실시형태에서, 천연 오일은 다가불포화 지방산이 2% 미만이고, 토코페롤, 토코트리에놀 또는 토코페롤과 토코트리에놀의 합에 대해 1 g/L 미만인 지방산 프로파일을 가진다. 다른 구체적 실시형태에서, 천연 오일은 다가불포화 지방산이 1% 미만이고, 토코페롤, 토코트리에놀 또는 토코페롤과 토코트리에놀의 합에 대해 0.5 g/L 미만인 지방산 프로파일을 가진다.
고안정성(저 다가불포화물) 천연 오일 또는 이의 유도체 중 임의의 것은 식품, 약물, 비타민, 기능식품, 퍼스널 케어 또는 기타 다른 제품을 제형화하는데 사용될 수 있고, 산화적으로 민감한 제품에 대해 특히 유용하다. 예를 들어, 고안정성 천연 오일(예를 들어, 3%, 2% 또는 1% 이하의 다가불포화물)은 다가불포화 지방산과 관련된 유리 라디칼 반응이 없기 때문에 보관 수명이 증가된 선스크린(예를 들어, 아보벤존, 호모살레이트, 옥티살레이트, 옥토크릴렌 또는 옥시벤존 중 하나 이상을 갖는 조성물) 또는 레티노이드 페이스 크림을 제형화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 보관 수명은 색, 냄새, 관능 특성 또는 54℃에서 4주 동안 가속화된 분해 후 남아있는 활성 화합물%의 면에서 증가될 수 있다. 고안정성 오일은 또한 우수한 고온 안정성을 가지는 윤활제로서 사용될 수 있다. 안정성에 추가적으로, 오일은 생분해성일 수 있는데, 이는 드문 조합 특성이다.
다른 관련된 실시형태에서, 천연 오일의 지방산 프로파일은 추가적인 유전적 변형을 통해, 예를 들어 단쇄 내지 중쇄 선호 아실-ACP 티오에스테라제의 과발현을 통해 또는 본 명세서에 기재된 기타 다른 변형을 통해 C8 내지 C16 지방산에서 상승된다. 이들 실시형태에 따른 저 다가불포화 오일은 개선된 산화적 안정성을 필요로 하는 것을 포함하여, 다양한 산업 제품, 식료품 또는 소비재에 사용될 수 있다. 식품 적용분야에서, 오일은 고온에서 연장된 수명 또는 연장된 저장 수명을 가지는 튀김용으로 사용될 수 있다.
오일이 튀김용으로 사용되는 경우, 오일의 고안정성은 항산화제 및/또는 소포제(예를 들어, 실리콘)의 추가 없이 튀김용을 가능하게 한다. 발포제를 생략한 결과로서, 튀긴 식품은 더 적은 오일을 흡수할 수 있다. 트리글리세리드로서, 또는 바이오디젤 또는 재생 디젤로 가공되는 연료 적용분야에서 사용되는 경우(예를 들어, WO 제2008/151149호, WO 제2010/063032호 및 WO 제2011/150410호 참조), 고안정성은 장기간 동안 저장을 촉진할 수 있거나, 또는 상승된 온도에서 사용되게 할 수 있다. 예를 들어, 고안정성 오일로부터 만들어진 연료는 1년 초과 또는 5년 초과 동안 사용을 위해 백업 발전기에서 저장될 수 있다. 튀김 오일은 발연점이 200℃ 초과이고, 유리 지방산은 0.1% 미만일 수 있다.
저 다가불포화 오일은 베타 또는 베타 프라임 결정을 형성하는 것과 같은 지방을 구조화하는 것을 포함하고, 이하에 기재하는 바와 같이 생성되는 것을 포함하는 식품 오일과 배합될 수 있다. 이들 오일은 또한 액체 오일과 배합될 수 있다. 옥수수 오일과 같이 리놀레산을 갖는 오일과 혼합된다면, 배합물의 리놀레산 수준은 고 올레산 해바라기 오일과 같은 고 올레산 식물 오일의 리놀레산 수준에 근접할 수 있다(예를 들어, 약 80% 올레산과 8% 리놀렌산).
저 다가불포화 천연 오일의 배합물은 기타 다른 오일과 에스테르교환될 수 있다. 예를 들어, 오일은 화학적으로 또는 효소적으로 에스테르교환될 수 있다. 구체적 실시형태에서, 본 발명의 실시형태에 따른 저 다가불포화 오일은 이의 지방산 프로파일에서 적어도 10% 올레산 및 5% 미만의 다가불포화물을 가지며, sn-1 및 sn-2 트리아실글리세롤 위치에 특이적인 효소를 사용하여 고 포화 오일(예를 들어, 수소화된 대두 오일 또는 고 스테아레이트 수준을 가지는 기타 다른 오일)과 효소적으로 에스테르교환된다. 결과는 스테아레이트-올리에이트-스테아레이트(SOS)를 포함하는 오일이다. 에스테르교환을 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며; 예를 들어, 문헌[“Enzymes in Lipid Modification,” Uwe T. Bornschuer, ed., Wiley_VCH, 2000, ISBN 3-527-30176-3]을 참조한다.
고 안정성 오일은 스프레이 오일로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 건포도와 같은 건조 과일에는 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 다가불포화물을 갖는 고 안정성 오일을 이용하여 분무될 수 있다. 그 결과, 사용된 스프레이 노즐은 다가불포화물의 존재로부터 달리 생성될 수 있는 노즐에서 만들어진 중합 또는 산화 생성물 때문에 덜 빈번하게 막하게 될 것이다.
추가 실시형태에서, SOS가 높은 오일, 예를 들어 이하에 기재된 것은 델타 12 지방산 불포화효소의 녹다운 또는 조절에 의해 안정성이 개선될 수 있다.
V. 외인성 아실트랜스퍼라제를 가지는 세포
본 발명의 다양한 실시형태에서, 아실트랜스퍼라제(글리세롤 또는 글리세롤 유도체와 지방산을 축합하여 아실글리세리드를 형성하는 효소)를 암호화하는 하나 이상의 유전자는 유지성 세포(예를 들어, 색소체 미세조류 세포) 내로 도입되어 세포에 의해 생성된 천연 오일의 지방산 조성을 변경시킬 수 있다. 유전자는 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GPAT), 1-아실글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(AGPAT)로도 알려진 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제(LPAAT), 포스파티드산 포스파타제(PAP), 또는 DAG의 sn-3 위치에 아실기를 전달하고 이에 의해 TAG를 생성하는 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(DGAT) 중 하나 이상을 암호화할 수 있다.
재조합 핵산은 세포의 플라스미드 또는 염색체 내로 통합될 수 있다. 교대로, 유전자는 상기 경로와 별개인 지방 아실-CoA-독립적 경로를 통해 TAG 전구체 분자를 생성하는 지질 경로의 효소를 암호화한다. 아실-ACP는 색소체 GPAT 및 LPAAT 효소 및/또는 미토콘드리아 GPAT 및 LPAAT 효소에 대한 기질일 수 있다. TAG를 생성하기 위해 아실기(예를 들어, 막 인지질 유래)를 혼입시킬 수 있는 추가적인 효소 중에 인지질 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(PDAT)가 있다. 또한 추가로 리소포스포스파티딜콜린 아실트랜스퍼라제(LPCAT), 리소포스포스파티딜세린 아실트랜스퍼라제(LPSAT), 리소포스포스파티딜에탄올아민 아실트랜스퍼라제(LPEAT) 및 리소포스포스파티딜이노시톨 아실트랜스퍼라제(LPIAT)를 포함하는 아실트랜스퍼라제는 트리글리세리드 조성에 영향을 줄 수 있는 인지질 합성 및 리모델링에 수반된다.
외인성 유전자는 구체적 수의 탄소 원자를 포함하는 아실 기질을 전달하기 위한 우선적인 특이성을 갖는 아실트랜스퍼라제 효소를 암호화할 수 있고/있거나 구체적 포화도는 주어진 위치특이적 트리글리세리드가 풍부한 오일을 생성하기 위해 유지성 세포 내로 도입된다. 예를 들어, 코코넛(코코스 누시페라(Cocos nucifera)) 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제는 기타 다른 아실-CoA 기질 이상으로 C12:0-CoA 기질을 선호하는 것으로 입증된 반면(Knutzon et al., Plant Physiology, Vol. 120, 1999, pp 739-746), 성숙 홍화씨의 1-아실-sn-3-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제는 스테아로일-CoA를 포함하는 기타 다른 아실-CoA 기질 이상으로 리놀레오일-CoA 및 올레일-CoA 기질에 대한 선호도를 나타낸다(Ichihara et al., European Journal of Biochemistry, Vol. 167, 1989, pp 339-347). 더 나아가, 아실트랜스퍼라제 단백질은 하나 이상의 단쇄, 중간쇄 또는 장쇄 아실-CoA 또는 아실-ACP 기질에 대해 우선적인 특이성을 입증할 수 있지만, 특히 예를 들어 중간쇄 아실기가 리소포스파티드산 공여체 기질의 sn-1 또는 sn-3 위치에 존재하는 경우에만 선호될 수 있다. 외인성 유전자의 결과로서, TAG 오일은 특정 지방산이 TAG 분자의 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90% 또는 90% 초과로 sn-2 위치에서 발견되는 세포에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 세포는 포화-불포화-포화(sat-unsat-sat포화-불포화-포화) TAG가 풍부한 오일을 만든다. 포화-불포화-포화 TAG는 1,3-디헥사데카노일-2-(9Z-옥타데세노일)-글리세롤(1-팔미토일-2-올레일-글리세로-3-팔미토일로서 지칭됨), 1,3-디옥타데카노일-2-(9Z-옥타데세노일)-글리세롤(1-스테아로일-2-올레일-글리세로-3-스테아로일로서 지칭됨), 및 1-헥사데카노일-2-(9Z-옥타데세노일)-3-옥타데카노일-글리세롤(1-팔미토일-2-올레일-글리세로-3-스테아로일로서 지칭됨)을 포함한다. 이들 분자는 더 흔하게 각각 POP, SOS 및 POS로서 지칭되며, 'P'는 팔미트산을 나타내고, 'S'는 스테아르산을 나타내며, 'O'는 올레산을 나타낸다. 포화-불포화-포화 TAG의 추가적인 예는 MOM, LOL, MOL, COC 및 COL을 포함하며, 여기서 'M'은 미리스트산을 나타내고, 'L'은 라우르산을 나타내며, 'C'는 카프르산을 나타낸다(C8:0). 삼중포화물(trisaturate), 즉 3개의 포화된 지방 아실기를 가지는 트리글리세리드는 기타 다른 유형의 트리글리세리드보다 삼중포화물의 더 큰 결정화 속도때문에 식품 적용분야에서의 사용이 흔히 추구된다. 삼중포화물의 예는 PPM, PPP, LLL, SSS, CCC, PPS, PPL, PPM, LLP 및 LLS를 포함한다. 추가적으로, TAG에서 지방산의 위치특이적 분포는 분해 및 흡수 동안 음식물 지방의 대사경로의 중요한 결정요인이다.
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 유지성 세포는 상승된 양의 구체화된 위치특이적 트리글리세리드, 예를 들어 1-아실-2-올레일-글리세로-3-아실 또는 1-아실-2-라우릭-글리세로-3-아실을 포함하는 천연 오일을 생성하도록 재조합 핵산을 이용하여 형질전환되는데, 여기서 올레산 또는 라우르산은 각각 도입된 재조합 핵산의 결과로서 sn-2 위치에 있다. 교대로, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산 또는 팔미트산은 sn-2 위치에 있을 수 있다. 천연 오일에 존재하는 구체화된 위치특이적 트리글리세리드의 양은 재조합 핵산이 없는 미생물유기체에 의해 생성된 천연 오일에서보다 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 100% 내지 500% 초과 또는 500% 초과만큼 증가될 수 있다. 그 결과, 세포 트리글리세리드의 sn-2 프로파일은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 특정 지방산을 가질 수 있다.
글리세로지질에서 별개의 입체특이적 또는 위치특이적 위치에 위치된 아실 사슬의 동일성은 당업계에 공지된 하나 이상의 분석 방법을 통해(문헌[Luddy et al., J. Am . Oil Chem . Soc., 41, 693-696 (1964)], [Brockerhoff, J. Lipid Res., 6, 10-15 (1965)], [Angers and Aryl, J. Am . Oil Chem. Soc.,Vol. 76:4, (1999)], [Buchgraber et al., Eur . J. Lipid Sci . Technol ., 106, 621-648 (2004)] 참조) 또는 이하에 제공되는 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 8에 따라 평가될 수 있다.
트리글리세리드 분자에서 지방산의 위치적 분포는 아실트랜스퍼라제의 기질 특이성에 의해 그리고 이용가능한 아실 모이어티의 농도 및 유형에 의해 영향받을 수 있다. 재조합 미생물유기체에서 생성된 트리글리세리드의 위치특이성을 변경시키는데 적합한 효소의 비제한적 예는 표 1 내지 표 4에 열거되어 있다. 당업자는 추가적인 적합한 단백질을 확인할 수 있다.
글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 및 GenBank 수탁 번호.
글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) BAA00575
글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 클라미도모나스 레인하르드티(Chlamydomonas reinhardtii) EDP02129
글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 클라미도모나스 레인하르드티 Q886Q7
아실-(아실기 운반 단백질):
글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제		 쿠쿠르비타 모스차타(Cucurbita moschata) BAB39688
글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 엘라에이스 구이닌시스(Elaeis guineensis) AAF64066
글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 가르시나 망고스타나(Garcina mangostana) ABS86942
글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum) ADK23938
글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 자트로파 쿠르카스(Jatropha curcas) ADV77219
색소체 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 자트로파 쿠르카스 ACR61638
색소체 글리세롤-포스페이트 아실트랜스퍼라제 리시누스 콤무니스(Ricinus communis) EEF43526
글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 비카 파바(Vica faba) AAD05164
글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 제아 메이스(Zea mays) ACG45812
본 발명의 미생물 및 방법을 이용한 사용에 적합한 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제는 표 2에 열거된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 및 GenBank 수탁 번호.
1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 아라비돕시스 탈리아나 AEE85783
1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 브라시카 준세아(Brassica juncea) ABQ42862
1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 브라시카 준세아 ABM92334
1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 브라시카 나푸스(Brassica napus) CAB09138
리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 클라미도모나스 레인하르드티 EDP02300
리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 림난테스 알바(Limnanthes alba) AAC49185
1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(추정적) 림난테스 도우글라시(Limnanthes douglasii) CAA88620
아실-CoA:sn-1-아실글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 림난테스 도우글라시 ABD62751
1-아실글리세롤-3-포스페이트 O-아실트랜스퍼라제 림난테스 도우글라시 CAA58239
1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 리시누스 콤무니스 EEF39377
본 발명의 미생물 및 방법을 이용한 사용에 적합한 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제는 표 3에 열거된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 및 GenBank 수탁 번호.
디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 아라비돕시스 탈리아나 CAB45373
디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 브라시카 준세아 AAY40784
추정적 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 엘라에이스 구이닌시스 AEQ94187
추정적 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 엘라에이스 구이닌시스 AEQ94186
아실 CoA:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 글리신 맥스(Glycine max) AAT73629
디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 헬리안투스 안누스(Helianthus annus) ABX61081
아실-CoA:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 1 올레아 유로파에아 (Olea europaea) AAS01606
디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 리시누스 콤무니스 AAR11479
본 발명의 미생물 및 방법을 이용한 사용에 적합한 인지질 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제는 표 4에 열거된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
인지질 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 및 GenBank 수탁 번호.
인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 아라비돕시스 탈리아나 AED91921
추정적 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 엘라에이스 구이닌시스 AEQ94116
인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 1-유사 글리신 맥스 XP_003541296
인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 자트로파 쿠르카스 AEZ56255
인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 리시누스 콤무니스 ADK92410
인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 리시누스 콤무니스 AEW99982
본 발명의 실시형태에서, 공지되거나 또는 신규한 LPAAT 유전자는 해당 세포에 의해 생성된 트리글리세리드의 지방산 프로파일을 변경시키도록, 가장 현저하게는 트리글리세리드의 sn-2 프로파일을 변경시킴으로써 유지성 세포로 형질전환된다. 예를 들어, 유지성 세포 내 외인성 활성 LPAAT를 발현시킨 덕분에, sn-2 위치에서 불포화 지방산의 백분율은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상만큼 증가된다. 예를 들어, 세포는 sn-2 위치에서 30% 불포화물(주로 18:1 및 18:2 및 18:3 지방산일 수 있음)을 포함하는 트리글리세리드를 생성할 수 있다. 이 예에서, 트리글리세리드의 36%가 sn-2 위치에서 불포화물을 포함하도록, LPAAT 활성의 도입은 sn-2 위치에서 20%만큼 불포화물을 증가시킨다. 교대로, 외인성 LPAAT는 sn-2 위치에서 C8:0, C10:0, C12:0, C14:0 또는 C16:0 모이어티와 같은 포화된 중쇄를 포함하는 중쇄 지방산을 증가시키는데 사용될 수 있다. 그 결과, 전반적인 지방산 프로파일에서 중쇄 수준은 증가될 수 있다. 실시예 43 및 실시예 44는 유지성 미생물에서 sn-2 및 지방산 프로파일을 변경시키는 것을 기재한다. 해당 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, LPAAT 유전자의 선택은 상이한 LPAAT가 상이한 아실기 사슬 길이 또는 포화 수준에 대해 sn-2 및 지방산 프로파일에서 이동을 야기할 수 있다는 점에서 중요하다. 예를 들어, 실시예 43의 LPAAT는 C10 내지 C14 지방산을 증가시키고, 실시예 44의 LPAAT는 C16 및 C18 지방산의 증가를 야기한다. 이들 실시예에서와 같이, 외인성 LPAAT의 도입은 외인성 아실-ACP 티오에스테라제의 도입과 조합될 수 있다. 중쇄 선호 LPAAT와 중쇄 선호 FatB를 조합하는 것은 추가적인 효과를 제공하는 것으로 발견되었고; 지방산 프로파일은 외인성 FatB 유전자만 존재할 때보다 외인성 LPAAT와 FatB 유전자가 둘 다 존재할 때 더 중쇄 지방산 쪽으로 더 이동되었다. 구체적 실시형태에서, 외인성 중쇄 특이적 LPAAT 및 (선택적으로) 외인성 FatB 아실-ACP 티오에스테라제 유전자를 포함하는 세포에 의해 생성된 오일은 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 이상의 C8:0, C10:0, C12:0, C14:0 또는 C16:0 지방산(별개로 또는 합으로)에 의한 지방산 프로파일을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적 실시형태는 핵산 작제물, 핵산 작제물을 포함하는 세포, 트리글리세리드 생성하는 세포를 배양하는 방법, 및 핵산 작제물이 신규 LPAAT 암호화 서열에 조작가능하게 연결된 프로모터를 가지는 경우 생성된 트리글리세리드 오일이다. 암호화 서열은 상류의 개시 코돈 및 하류의 종결 코돈 다음에 3 UTR 서열을 가질 수 있다. 특정 구체적 실시형태에서, LPAAT 유전자는 서열 번호 80 내지 서열 번호 85의 cDNA 중 임의의 것에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 가지는 암호화 서열, 또는 유전 암호의 축퇴에 의해 동등한 서열을 포함하는 상기 서열의 기능성 단편을 가진다. 인트론은 마찬가지로 서열에 삽입될 수 있다. 교대로, LPAAT 유전자는 서열 번호 77 내지 서열 번호 79의 아미노산 서열 또는 이의 기능성 단편을 암호화한다. 신규 LPAAT를 발현하는 식물은 명백하게 실시형태에 포함되며, 공지된 유전적 조작 기법을 사용하여 생성될 수 있다.
VI . 외인성 신장효소 또는 신장효소 복합체 효소를 가지는 세포
본 발명의 다양한 실시형태에서, 지방 아실-CoA 신장 복합체의 신장효소 또는 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자는 유지성 세포(예를 들어, 색소체 미세조류 세포) 내로 도입되어 세포의 또는 세포에 의해 생성된 천연 오일의 지방산 조성을 변경시킬 수 있다. 유전자는 베타-케토아실-CoA 합성 효소(또한 3-케토아실 합성 효소, 베타-케토아실 합성 효소 또는 KCS로 지칭됨), 케토아실-CoA 환원 효소, 하이드록시아실-CoA 탈수 효소, 에노일-CoA 환원 효소 또는 신장효소를 암호화할 수 있다. 이들 유전자에 의해 암호화된 효소는 아실-ACP 티오에스테라제에 의해 유리된 아실-coA 분자의 신장에서 활성적이다. 재조합 핵산은 세포의 플라스미드 또는 염색체 내로 통합될 수 있다. 구체적 실시형태에서, 세포는 프로토테카속의 세포와 같은 종속영양 세포를 포함하는 녹조식물문의 세포이다.
본 발명의 미생물 및 방법을 이용한 사용에 적합한 베타-케토아실-CoA 합성 효소 및 신장효소는 표 5에 열거된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
GenBank 수탁 번호에 의해 열거한 베타-케토아실-CoA 합성 효소 및 신장효소.
트립파노소마 브루세이 신장효소 3(GenBank 수탁 번호 AAX70673), 마르카니타 폴리모르파(Marchanita polymorpha)( GenBank 수탁 번호 AAP74370), 트립파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi) 지방산 신장효소, 추정적(GenBank 수탁 번호 EFZ33366), 난노클로롭시스 오쿨라타(Nannochloropsis oculata) 지방산 신장효소(GenBank 수탁 번호 ACV21066.1), 레이쉬만니아 도노바니(Leishmania donovani) 지방산 신장효소, 추정적(GenBank 수탁 번호 CBZ32733.1), 글리신 맥스 3-케토아실-CoA 합성 효소 11-유사(GenBank 수탁 번호 XP_003524525.1), 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula) 베타-케토아실-CoA 합성 효소(GenBank 수탁 번호 XP_003609222), 제아 메이스 신장효소(GenBank 수탁 번호 ACG36525), 고시피움 히르수툼 베타-케토아실-CoA 합성 효소(GenBank 수탁 번호 ABV60087), 헬리안투스 안누스(Helianthus annuus) 베타-케토아실-CoA 합성 효소(GenBank 수탁 번호 ACC60973.1), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) ELO1(GenBank 수탁 번호 P39540), 심몬드시아 키넨시스 베타-케토아실-CoA 합성 효소(GenBank 수탁 번호 AAC49186), 트로파에올룸 마주스(Tropaeolum majus) 추정적 지방산 신장효소(GenBank 수탁 번호 AAL99199, 브라시카 나푸스 지방산 신장효소(GenBank 수탁 번호 AAA96054)
본 발명의 실시형태에서, 구체적인 탄소 원자의 수 및/또는 구체적인 아실 사슬 포화도를 포함하는 아실 기질을 신장시키기 위한 우선적인 특이성을 갖는 베타-케토아실-CoA 합성 효소 또는 신장효소를 암호화하는 외인성 유전자가 유지성 세포 내로 도입되어 구체화된 사슬 길이 및/또는 포화도의 지방산이 풍부한 세포 또는 오일을 생성한다. 실시예 40은 중쇄 지방 아실-CoA를 연장시키는 것을 선호하는 외인성 신장효소가 과발현되어 스테아레이트의 농도를 증가시킨 프로토테카 균주의 조작을 기재한다. 실시예 42 및 실시예 54는 단일불포화 및 포화 C18- 및 C20-CoA 기질을 연장시키는 것을 선호하는 외인성 신장효소 또는 베타-케토아실-CoA 합성 효소가 과발현되어 에루스산의 농도를 증가시키는 프로토테카의 조작을 기재한다.
구체적 실시형태에서, 유지성 세포는 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 초과의 에루스산 및/또는 에이코세노산을 포함하는 오일을 생성한다. 교댜로, 세포는 0.5% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 15%, 15% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90% 또는 90% 내지 99% 에루스산 또는 에이코세노산을 포함하는 오일을 생성한다. 세포는 올레오일-CoA를 신장시키는데 활성적인 외인성 베타-케토아실-CoA 합성 효소의 추가 도입이 있는 고올레산 오일과 관련하여 상기 기재한 재조합산을 포함할 수 있다. 외인성 베타-케토아실-CoA 합성 효소 발현의 결과로서, 세포에 의한 에루스산 또는 에이코세노산의 자연적 생성은 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 70배, 100배, 130배, 170배 또는 200배 초과만큼 증가될 수 있다. 고에루스산 및/또는 에이코세노산 오일은 또한 고안정성 오일일 수 있고; 예를 들어, 하나는 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 다가불포화물을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 세포는 선택적으로 종속영양적으로 배양된 미세조류 세포이다. 다른 실시형태에서와 같이, 지방은 녹조식물문, 트레복시조강, 클로렐라목 또는 클로렐라과의 종속영양 미세조류를 포함하는 색소체 세포의 유전적 조작에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게, 세포는 유지성이며, 건조 세포 중량으로 적어도 40% 오일을 축적할 수 있다. 세포는 프로토테카 모리포르미스 또는 프로토테카 좁피를 포함하는 프로토테카 종과 같은 절대 종속영양생물일 수 있다.
VII . 위치특이적 및 입체특이적 오일/지방
실시형태에서, 재조합 세포는 주어진 위치특이적 구성을 갖는 천연 지방 또는 오일을 생성한다. 그 결과, 세포는, 예를 들어 용융 온도 초과로 가열된 다음, 지방의 용융 온도 미만으로 냉각될 때, 주어진 다형체 형태의 결정을 형성하는 경향을 가지는 트리글리세리드 지방을 생성할 수 있다. 예를 들어, 지방은 템퍼링하면서 또는 템퍼링하지 않고 β 또는 β' 형태(예를 들어, X 레이 회절 분석에 의해 결정된 바와 같음)의 결정 다형체를 형성하는 경향이 있을 수 있다. 지방은 규칙적 지방일 수 있다. 구체적 실시형태에서, 지방은 냉각 시 β 또는 β' 결정 중 하나를 직접적으로 형성할 수 있고; 대안적으로, 지방은 β 형태를 통해 β' 형태로 진행할 수 있다. 이와 같은 지방은 식품 적용분야에 대해 라미네이팅 또는 코팅 지방을 구조화하는 것으로서 사용될 수 있다. 천연 지방은 사탕, 다크 또는 화이트 초콜릿, 초콜릿향 당과 제품, 아이스크림, 마가린 또는 기타 다른 스프레드, 크림 필링, 페스트리 또는 기타 다른 식료품 내에 혼입될 수 있다. 선택적으로, 지방은 인공적으로 생성된 트랜스 지방산이 아직 없는 반고체일 수 있다. 이와 같은 지방은 또한 스킨케어 및 기타 다른 소비재 또는 산업재에서 유용할 수 있다.
다른 실시형태에서와 같이, 지방은 녹조식물문, 트레복시조강, 클로렐라목 또는 클로렐라과의 종속영양 미세조류를 포함하는 색소체 세포의 유전적 조작에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 유지성이며 건조 세포 중량으로 적어도 40% 오일을 축적할 수 있다. 세포는 프로토테카 모리포르미스 또는 프로토테카 좁피를 포함하는 프로토테카 종과 같은 절대 종속영양생물일 수 있다. 지방은 또한 독립영양 조류 또는 식물에서 생성될 수 있다. 선택적으로, 세포는 오일을 생성하기 위해 수크로스를 사용할 수 있고, 재조합 전화효소 유전자는 PCT 공개 WO 제2008/151149호, WO 제2010/06032 호, WO 제2011/150410 호, WO 제2011/150411 호, 및 국제특허출원 PCT/US12/23696호에 기재된 바와 같은 수크로스의 대사를 허용하도록 도입될 수 있다. 전화효소는 본 명세서에 언급된 모든 유전자와 같이, 코돈 최적화되고 세포의 염색체에 통합될 수 있다.
실시형태에서, 천연 지방은 일반 구조[포화 지방산(sn-1)-불포화 지방산(sn-2)-포화 지방산(sn-3)]의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 지방을 가진다. 이는 이하에서 포화-불포화-포화 지방으로서 나타낸다. 구체적 실시형태에서, 이 구조에서 포화 지방산은 바람직하게 스테아레이트 또는 팔미테이트이고, 불포화 지방산은 바람직하게 올리에이트다. 그 결과, 지방은 주로 β 또는 β' 다형체 결정 또는 이들의 혼합물을 형성할 수 있고, 식품 또는 퍼스널 케어 제품에서의 사용에 바람직한 것을 포함하는 대응하는 물리적 특성을 가진다. 예를 들어, 지방은 식료품에 대해 구강 온도, 또는 크림, 로션 또는 기타 다른 퍼스널케어 제품에 대해 피부 온도에서 용융될 수 있다(예를 들어, 30℃ 내지 40℃ 또는 32℃ 내지 35℃의 용융 온도). 선택적으로, 지방은 2L 또는 3L 라멜라 구조를 가질 수 있다(예를 들어, X-레이회절 분석에 의해 결정되는 바와 같음). 선택적으로, 지방은 템퍼링 없이 이러한 다형체 형태를 형성할 수 있다.
구체적인 관련된 실시형태에서, 천연 지방 트리글리세리드는 고농도의 SOS(즉, 글리세롤 백본의 sn-2 위치에서 올리에이트와 함께 말단 sn-1 및 sn-3 위치에서 스테아레이트를 포함하는 트리글리세리드)를 가진다. 예를 들어, 지방은 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% SOS를 포함하는 트리글리세리드를 가질 수 있다. 실시형태에서, 지방은 적어도 80% SOS의 트리글리세리드를 가진다. 선택적으로, sn-2 연결된 지방산의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 불포화 지방산이다. 구체적 실시형태에서, sn-2 연결된 지방산의 적어도 95%는 불포화 지방산이다. 추가로, SSS(트리스테아레이트) 수준은 20%, 10% 또는 5% 미만일 수 있고/있거나 C20:0 지방산(아라키드산) 수준은6% 미만 및 선택적으로 1% 초과(예를 들어, 1% 내지 5%)일 수 있다. 예를 들어, 구체적 실시형태에서, 재조합 세포에 의해 생성되는 천연 지방은 적어도 80% sn-2 불포화 지방 아실 모이어티를 포함하는 적어도 70% SOS 트리글리세리드를 가진다. 다른 구체적 실시형태에서, 재조합 세포에 의해 생성된 천연 지방은, 적어도 80% SOS 트리글리세리드를 포함하고 적어도 95% sn-2 불포화 지방 아실 모이어티를 포함하는 TAG를 가진다. 또 다른 구체적 실시형태에서, 재조합 세포에 의해 생성된 천연 지방은, 적어도 80% SOS를 포함하고 적어도 95% sn-2 불포화 지방 아실 모이어티, 및 1% 내지 6% C20 지방산을 포함하는 TAG를 가진다.
또 다른 구체적 실시형태에서, 천연 지방의 지방산 프로파일에서 스테아레이트와 팔미테이트 백분율의 합은 올리에이트 백분율의 2배±10%, 20%, 30% 또는 40%[예를 들어, (%P+%S)/%O=2.0±20%]이다. 선택적으로, 이 지방의 sn-2 프로파일은 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 70% 또는 80% 올리에이트다. 또한 선택적으로, 이 지방은 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% SOS일 수 있다. 선택적으로, 지방은 1% 내지 6% C20 지방산을 포함한다.
이들 실시형태 중 임의의 것에서, 고 포화불포화포화 지방은 β' 다형체 결정을 형성하는 경향이 있을 수 있다. 이전에 이용가능한 식물 지방 유사 코코아 버터와 달리, 세포에 의해 생성된 포화불포화포화 지방은 템퍼링 없이 β' 다형체 결정을 형성할 수 있다. 실시형태에서, 다형체는 용융 온도 초과로 가열하고 용융 온도 미만으로 3시간, 2시간, 1시간 또는 0.5시간 동안 냉각했을 때 형성된다. 관련된 실시형태에서, 다형체는 60℃ 초과로 가열하고 10℃로 3시간, 2시간, 1시간 또는 0.5시간 동안 냉각했을 때 형성된다.
다양한 실시형태에서, 지방은 용융 온도 초과로 가열하고, 용융 온도 미만으로 냉각시킬 때, β 형태, β' 형태 또는 둘 다의 다형체를 형성하고, 선택적으로 용융 온도 초과로 가열한 다음, 10℃에서 냉각시켰을 때, 5시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 0.5시간 이하 내에 다형체 평형 상태의 적어도 50%가 진행된다. 지방은 코코아 버터의 지방보다 더 빠른 속도로 β' 결정을 형성할 수 있다.
선택적으로, 이들 지방 중 임의의 것은 합에서, 2몰% 미만의 디아실글리세롤 또는 2몰% 미만의 모노 및 디아실글리세롤을 가질 수 있다.
실시형태에서, 지방은 용융 온도가 30℃ 내지 60℃, 30℃내지 40℃, 32℃ 내지 37℃, 40℃ 내지 60℃ 또는 45℃ 내지 55℃일 수 있다. 다른 실시형태에서, 지방은 고형 지방 함량(SFC)이 20℃에서 40% 내지 50%, 15% 내지 25% 또는 15% 미만이고/미만이거나 SFC가 35℃에서 15% 미만일 수 있다.
지방을 만들기 위해 사용한 세포는 세포 트리글리세리드 내 지방산의 포화 대 불포화 비를 변형시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 포함하여 포화불포화포화 지방의 형성을 유리하게 할 수 있다. 예를 들어, 스테아로일-ACP 불포화효소(SAD) 유전자의 녹아웃 또는 녹다운은 올리에이트 이상으로 스테아레이트의 형성을 유리하게 하는데 사용될 수 있거나 또는 외인성 중쇄 선호 아실-ACP 티오에스테라제의 발현은 중쇄 포화 수준을 증가시킬 수 있다. 교대로, SAD 효소를 암호화하는 유전자는 과발현되어 불포화물을 증가시킬 수 있다.
구체적 실시형태에서, 세포는 세포 내 스테아레이트 수준을 상승시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 가진다. 그 결과, SOS의 농도는 증가될 수 있다. 실시예 9는 재조합 미생물의 위치특이적 프로파일이 브라시카 나푸스 C18:0 선호 티오에스테라제를 과발현시킨 결과로서 포화불포화포화 트리글리세리드 POP, POS 및 SOS를 풍부하게 한다는 것을 입증한다. 세포의 스테아레이트를 증가시키는 추가적인 방법은 올리에이트 수준을 감소시키는 것이다. 고올리에이트 수준(예를 들어, 스테아레이트 수준의 절반을 초과)을 갖는 세포에 대해, 올리에이트 수준을 감소시키도록 조작가능한 재조합 핵산 또는 고전적 유전자 돌연변이를 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포는 아실-ACP 티오에스테라제를 유리시키는 올리에이트를 암호화하는 하나 이상의 FATA 대립유전자 및/또는 스테아로일 ACP 불포화효소(SAD)를 암호화하는 하나 이상의 대립유전자에서 녹아웃, 녹다운 또는 돌연변이를 가질 수 있다. 실시예 35는 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)에서 37% 스테아레이트의 지방산 프로파일을 생성하기 위해 헤어핀 RNA를 사용하는 SAD2 유전자 산물 발현의 저해를 기재하는 반면, 야생형 균주는 4% 미만의 스테아레이트, 9배 초과의 개선을 생성하였다. 게다가, 실시예 35의 균주는 SAD 활성을 감소시키도록 조작되며, SOS, POP 및 POS를 만드는데 충분한 올리에이트를 생성하는 충분한 SAD 활성이 남아있다. 실시예 47의 TAG 프로파일을 참조한다. 구체적 예에서, 다수의 SAD 암호화 대립유전자 중 하나는 녹아웃될 수 있고/있거나 하나 이상의 대립유전자는 안티센스, RNAi 또는 siRNA, 헤어핀 RNA 또는 이들의 조합과 같은 저해 기법을 사용하여 하향조절된다. 다양한 실시형태에서, 세포는 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90%, 또는 90% 내지 약 100% 스테아레이트를 갖는 TAG를 생성할 수 있다. 다른 실시형태에서, 세포는 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90%, 또는 90% 내지 약 100% SOS인 TAG를 생성할 수 있다. 선택적으로 또는 유전적 변형에 추가적으로, 스테아로일 ACP 불포화효소는 화학적으로; 예를 들어 오일 생성 동안 세포 배양물에 스테큘린산(sterculic acid)의 첨가에 의해 저해될 수 있다.
놀랍게도, 단일 FATA 대립유전자의 녹아웃은 미세조류에서 생성된 C18 지방산의 존재를 증가시키는 것으로 발견되었다. 하나의 대립유전자를 녹아웃시키거나 또 다르게는 FATA 유전자의 활성을 억제함으로써 RNA를 생성하는 한편(예를 들어, 헤어핀을 사용), 또한 스테아로일-ACP 불포화효소의 활성을 억제함으로써(본 명세서에 개시된 기법을 사용) 세포 내 스테아레이트 수준은 증가될 수 있다.
스테아레이트 수준을 증가시키기 위한 다른 유전적 변형은 세포 내 케토아실 ACP 합성 효소(KAS) 활성을 증가시켜 스테아레이트 생성 속도를 증가시키는 것을 포함한다. 미세조류에서, KASII 활성을 증가시키는 것은 C18 합성을 증가시키는데 효과적이며, 특히 SAD 활성을 감소시키는데 효과적인 재조합 DNA와 조합하여 세포 트리글리세리드에서 스테아레이트 수준을 상승시키는데 효과적이다는 것이 밝혀졌다. KASII(예를 들어, 외인성 KasII 유전자)를 증가시키도록 조작가능한 재조합 핵산은 또한 FatA 유전자의 녹아웃 또는 녹다운과 조합될 수 있거나, 또는 FatA 유전자와 SAD 유전자 둘 다의 녹아웃 또는 녹다운과 조합될 수 있다.
선택적으로, 세포는 유일한 변형으로서 또는 하나 이상의 기타 다른 스테아레이트 증가 유전적 변형과 조합하여 아실-ACP 티오에스테라제를 유리시키는 외인성 스테아레이트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 C18:0-ACP를 절단시키는 것을 선호하는 아실-ACP 티오에스테라제를 과발현시키도록 조작될 수 있다. 실시예 9는 약 3.7% 내지 약 30.4%의 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)의 지방산 프로파일에서 스테아레이트를 증가시키는 외인성 C18:0 선호 아실-ACP 티오에스테라제의 발현을 기재한다. 실시예 41은 프로토테카에서 C18:0 수준을 상승시키는 C18:0 선호 아실-ACP 티오에스테라제 기능의 추가적인 예를 제공한다. 티오에스테라제의 도입은 하나 이상의 내인성 아실-ACP 티오에스테라제 대립유전자의 녹아웃 또는 녹다운과 조합될 수 있다. 티오에스테라제의 도입은 또한 신장효소 또는 베타-케토아실-CoA 합성 효소의 과발현과 조합될 수 있다. 추가로, 하나 이상의 외인성 유전자(예를 들어, SAD 또는 KASII를 암호화)는 환경적 조건을 통해(예를 들어, 조절가능한 프로모터와 조작가능한 연관에 위치함으로써) 조절될 수 있다. 구체적 예에서, pH 및/또는 질소 수준이 amt03 프로모터를 조절하는데 사용된다. 그 다음에 환경적 조건은 세포를 조정하도록 조절해서 세포 트리글리세리드에서 나타나는 원하는 양의 스테아레이트(예를 들어, 올리에이트 농도의 2배로)를 생성할 수 있다. 이들 조작의 결과로서, 세포는 스테아레이트에서 적어도 5배, 10배, 15배 또는 20배의 증가를 나타낼 수 있다.
추가의 변형으로서 단독으로 또는 기타 다른 스테아레이트 증가 변형과 조합하여, 세포는 신장효소 또는 베타-케토아실-CoA 합성 효소를 발현시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, C18:0 선호 아실-ACP 티오에스테라제의 과발현은 중쇄 연장 신장효소 또는 KCS의 과발현과 조합되어 재조합 세포에서 스테아레이트의 생성을 증가시킬 수 있다. 외인성 유전자(예를 들어, 티오에스테라제, 신장효소 또는 KCS를 암호화함) 중 하나 이상은 환경적 조건을 통해(예를 들어, 조절가능한 프로모터와 조작가능한 연관에 위치함으로써) 조절될 수 있다. 구체적 예에서, pH 및/또는 질소 수준이 amt03 프로모터를 조절하는데 사용된다. 그 다음에 환경적 조건은 세포를 조정하도록 조절해서 세포 트리글리세리드에서 나타나는 원하는 양의 스테아레이트(예를 들어 올리에이트 농도의 2배로)를 생성할 수 있다. 이들 조작의 결과로서, 세포는 스테아레이트에서 적어도 5배, 10배, 15배 또는 20배의 증가를 나타낼 수 있다. 스테아레이트에 추가적으로, 아라키드산, 베헨산, 리그노세린산 및 세로틴산이 또한 생성될 수 있다.
구체적 실시형태에서, 스테아레이트 수준을 증가시키는 세포의 유전적 조작에 기인하여, 세포에 의해 생성된 오일에서 스테아레이트 대 올리에이트의 비는 3:1±30%(즉, 2.7:1 내지 3.3:1의 범위), 3:1±20% 또는 3:1±10%이다.
교대로, 포화가 팔미테이트 또는 팔미테이트와 스테아레이트의 혼합물인 포화불포화포화의 형성에 유리하도록 세포가 조작될 수 있다. 이 경우에, 외인성 팔미테이트 유리 아실-ACP 티오에스테라제의 도입은 팔미테이트 형성을 촉진할 수 있다. 이 실시형태에서, 세포는 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% POP인 트리글리세리드, 또는 POP, SOS 및 POS의 합이 세포 트리글리세리드의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%인 트리글리세리드를 생성할 수 있다. 다른 관련된 실시형태에서, POS 수준은 세포에 의해 생성된 트리글리세리드의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이다.
구체적 실시형태에서, 오일의 용융 온도는 코코아 버터의 용융 온도(약 30℃ 내지 32℃)와 유사하다. POP, POS 및 SOS 수준은 각각 16%, 38% 및 23%으로 코코아 버터에 근접할 수 있다. 예를 들어, POP는 16%±20%일 수 있고, POS는 38%±20%일 수 있으며, SOS는 23%±20%일 수 있다. 또는, POP는 16%±15%일 수 있고, POS는 38%±15%일 수 있으며, SOS는 23%±15%일 수 있다. 또는, POP는 16%±10%일 수 있고, POS는 38%±10%일 수 있으며, SOS는 23%±10%일 수 있다.
스테아레이트를 증가시키는 재조합 핵산의 결과로서, 지방산 프로파일의 비율은 아라키드산일 수 있다. 예를 들어, 지방산 프로파일은 0.01% 내지 5%, 0.1% 내지 4%, 또는 1% 내지 3% 아라키드산일 수 있다. 더 나아가, 위치특이적 프로파일은 0.01% 내지 4%, 0.05% 내지 3%, 또는 0.07% 내지 2% AOS를 가질 수 있거나, 또는 0.01% 내지 4%, 0.05% 내지 3%, 또는 0.07% 내지 2% AOA를 가질 수 있다. AOS 및 AOA는 기타 다른 잠재적 이점 중에서 본 발명의 지방을 포함하는 당과 제품에서 대증식(blooming) 및 지방 이동을 감소시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
스테아레이트 및/또는 팔미테이트를 증가시키고, 포화불포화포화 수준을 변형시키도록 설계된 조작에 추가적으로, 델타 12 지방산 불포화효소 활성(예를 들어, Fad 유전자에 의해 암호화되는 바와 같음)을 감소시키고, 선택적으로 성장 배지를 보충하거나 또는 FAD 발현을 조절함으로써 상기 기재한 바와 같이 포함하는 다가불포화물의 수준은 억제될 수 있다. 미세조류(프로토테카 균주에서의 작업에 의해 증명된 바와 같음)에서, 다가불포화물은 sn-2 위치에 우선적으로 첨가된다는 것이 발견되었다. 따라서, sn-2 위치에서 올리에이트와 함께 트리글리세리드의 백분율을 상승시키기 위해, 세포에 의한 리놀레산의 생성은 억제될 수 있다. 지방산 불포화효소(FAD) 유전자 또는 유전자 산물을 저해하거나 또는 제거하기 위해 고도로 산화적으로 안정적인 오일과 관련하여 본 명세서에 기재된 기법은 sn-2 위치에서 다가불포화물을 감소시킴으로써 포화불포화포화 오일을 생성하는 것에 대해 양호한 효과로 적용될 수 있다. 추가된 이점으로서, 이와 같은 오일은 산화적 안정성이 개선될 수 있다. 또한 본 명세서에 기재된 바와 같이, 지방은, 제1 단계에서 세포에 의해 공급되거나 또는 생성된 다가불포화물을 이용하고 지방 생성 단계 동안 다가불포화물이 결여되는 2 단계로 생성될 수 있다. 생성된 지방은 다가불포화물이 15%, 10%, 7%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 이하인 지방산 프로파일을 가질 수 있다. 구체적 실시형태에서, 세포에 의해 생성된 오일/지방은 50% 초과의 포화불포화포화, 및 선택적으로 50% 초과의 SOS를 가지고, 또한 3% 미만의 다가불포화물을 가진다. 선택적으로, 다가불포화물은 지방산 프로파일에서 리놀레산 및 리놀렌산 영역%의 합에 의해 계산될 수 있다.
실시형태에서, 천연 지방은 65% 내지 95% SOS 및 선택적으로 0.001% 내지 5% SSS를 갖는 시어 스테아린 치환체이다. 관련된 실시형태에서, 지방은 65% 내지 95% SOS, 0.001% 내지 5% SSS, 및 선택적으로 0.1% 내지 8% 아라키드산 함유 트리글리세리드를 가진다. 다른 관련된 실시형태에서, 지방은 65% 내지 95% SOS를 가지며, SSS와 SSO의 합은 10% 미만 또는 5% 미만이다.
세포의 위치특이적 선호도는 이하에 기재하는 분석 방법을 사용하여 습득될 수 있다(실시예 1 내지 실시예 2, 실시예 8). 상기 기재한 바와 같은 포화물 및 불포화물의 균형이 맞음에도 불구하고, 세포 효소는 sn-2 위치에서 불포화 지방산을 위치시키지 않을 수 있다. 이 경우에, 유전적 조작은 (i) 내인성 sn-2 특이적 아실 트랜스퍼라제(예를 들어, LPAAT)의 활성을 감소시키고/감소시키거나 (ii) 원하는 특이성을 가지는 외인성 LPAAT를 도입함으로써(즉, sn-2에서 올리에이트의 도입) 원하는 위치특이성을 부여할 수 있다. 외인성 LPAAT가 도입되는 경우, 바람직하게 LPAAT를 암호화하는 유전자는 숙주 염색체 내로 통합되며, 소포체에 대해 표적화된다. 일부 경우에, 숙주 세포는 특이적인 LPAAT대립유전자와 비특이적인 LPAAT 대립유전자를 둘 다 가질 수 있고, 이들 대립유전자 중 하나의 활성을 억제하는 것은(예를 들어, 유전자 녹아웃을 이용) 원하는 특이성을 부여할 것이다. 예를 들어, 서열 번호 78 및 서열 번호 79의 LPAAT 또는 이들 서열 중 하나에 대해 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 포함하는 LPAAT를 암호화하는 유전자는 sn-2 위치에 올리에이트를 첨가하여 포화불포화포화 TAG 수준을 올리는데 사용될 수 있다. 유전자는 유전 암호의 축퇴 때문에 서열 번호 80 내지 서열 번호 85 중 임의의 것에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 뉴클레오티드 동일성을 가지거나 유전 암호의 축퇴에 의한 동등한 서열을 가질 수 있다. 이들 유전자는 이들 서열을 포함하는 재조합 핵산 작제물, 벡터, 염색체 또는 숙주 세포 또는 이들의 기능적 단편으로서 나타날 수 있으며, 이는 공지된 기법을 사용하여 서열로부터 핵산의 조직적 결실에 의해 찾을 수 있다. 유전자 발현의 결과로서, sn-2 위치에서 C8 내지 C16 지방산을 가지는 SOS, POS, POP 또는 트리글리세리드와 같은 포화-불포화-포화 TAG의 양은 숙주 세포에서 증가될 수 있다.
실시형태에서, 본 발명에 따른 세포에 의해 생성된 지방은 당과 제품, 사탕코팅 또는 기타 다른 식료품을 생산하는데 사용된다. 그 결과, 초콜릿 또는 캔디바와 같은 식료품은 코코아 버터를 사용하여 생산된 유사한 제품의 "스냅"(예를 들어, 부러뜨릴 때)을 가질 수 있다. 사용된 지방은 베타 다형 형태일 수 있거나 또는 베타 다형체 형태의 경향이 있다. 실시형태에서, 방법은 당과 제품에 이와 같은 지방을 첨가하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 지방은 65% 초과의 SOS, 45% 미만의 불포화 지방산, 5% 미만의 다가불포화 지방산, 1% 미만의 라우르산, 및 2% 미만의 트랜스 지방산을 갖는, EEC 규정에 따른 코코아 버터 동등물일 수 있다. 지방은 또한 예를 들어 식품 및 퍼스널 케어 제품에서, 코코아 버터 증량제, 개선제, 대체제 또는 대증식 방지제(anti-blooming agent) 또는 시어 버터 대체제로서 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 세포 및 방법을 사용하여 생성된 고 SOS 지방은 시어 버터 또는 시어 분획을 필요로 하는 임의의 적용분야 또는 제형에서 사용될 수 있다. 그러나, 시어 버터와 달리, 본 발명의 실시형태에 의해 생성된 지방은 저량의 비비누화물; 예를 들어 7%, 5%, 3% 또는 2% 미만의 비비누화물을 가질 수 있다. 추가적으로, 시어 버터는 디아실글리세리드의 존재에 기인하여 빠르게 분해되는 경향이 있는 반면, 본 발명의 실시형태에 의해 생성된 지방은 저량의 디아실글리세리드; 예를 들어, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 미만의 디아실글리세리드를 가질 수 있다.
본 발명의 실시형태에서, 쇼트닝으로서 및 특히 롤인 쇼트닝으로서 적합한 천연 지방이 있다. 따라서, 쇼트닝은 페스트리 또는 기타 다른 다층 식품을 만드는데 사용될 수 있다. 쇼트닝은 조작된 유기체 및 특히 종속영양 미세조류를 생성하기 위해 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 실시형태에서, 쇼트닝은 40℃ 내지 60℃ 및 바람직하게는 45℃ 내지 55℃의 용융 온도를 가지며, 15% 내지 20% 중간쇄 지방산(C8 내지 C14), 45% 내지 50% 장쇄 포화 지방산(C16 이상), 및 30% 내지 35% 불포화 지방산(바람직하게는 올레산이 리놀레산보다 더 많음)을 포함하는 트리글리세리드 프로파일을 가질 수 있다. 쇼트닝은 선택적으로 β 다형체 형태를 통과하는 일 없이 β' 다형체 결정을 형성할 수 있다. 쇼트닝은 요변성이 있을 수 있다. 쇼트닝은 35℃에서 15% 미만의 고형 지방 함량을 가질 수 있다. 구체적 실시형태에서, 재조합 미세조류에 의해 생성된 롤인 쇼트닝으로서 적합한 천연 오일이 있으며, 여기서 오일은 항복 응력이 400 Pa 내지 700 Pa, 또는 500 Pa 내지 600 Pa이고, 저장 탄성률이 1x105 Pa 또는 1x106 Pa보다 높다.(실시예 46 참조)
구조화된 고체-액체 지방 시스템은 구조화시킨 오일을 실온에서 액체인 오일(예를 들어, 트리스테아린 또는 트리올레인이 높은 오일)과 배합함으로써 구조화시킨 오일을 사용하여 생성될 수 있다. 배합된 시스템은 식품 스프레드, 마요네즈, 드레싱, 쇼트닝에서; 즉, 오일-물-오일 에멀전을 형성함으로써 사용에 적합할 수 있다. 본 명세서에 기재된 실시형태에 따른 구조화시킨 지방, 및 특히 SOS가 높은 것은 기타 다른 오일/지방과 배합되어 코코아 버터 동등물, 대체제 또는 증량제를 만들 수 있다. 예를 들어, 65% 초과의 SOS를 갖는 천연 지방은 팜 중간 분획과 배합되어 코코아 버터 동등물을 만들 수 있다.
일반적으로, 이와 같은 고 포화-불포화-포화 지방 또는 지방 시스템은 휘핑된 토핑, 마가린, 스프레드, 샐러드 드레싱, 구운 상품(예를 들어, 빵, 쿠키, 크래커, 머핀 및 페스트리), 치즈, 크림치즈, 마요네즈 등을 포함하는 다양한 기타 다른 제품에서 사용될 수 있다.
구체적 실시형태에서, 상기 기재한 포화-불포화-포화 지방은 마가린, 스프레드 등을 생산하는데 사용된다. 예를 들어, 마가린은 US 특허 제7118773호, 제6171636호, 제4447462호, 제5690985호, 제5888575호, 제5972412호, 제6171636호 또는 국제특허 공개 WO 제9108677호 A1에서 발견되는 레시피 또는 방법 중 임의의 것을 사용하여 지방으로부터 만들어질 수 있다.
실시형태에서, 지방은 다른 지방과 선택적으로 배합되는 천연(예를 들어, 미세조류 세포 유래) 지방을 포함하고, 스프레드 또는 마가린을 생산하는데 유용하며, 또는 기타 다른 식료품은 유전적으로 조작된 세포에 의해 생성되고,
(a) C18 내지 C24 포화 지방산 적어도 10중량%,
(b) 스테아르산 및/또는 아라키드산 및/또는 베헨산 및/또는 리그노세린산, 및
(c) 올레산 및/또는 리놀레산을 포함하는 한편,
(d) 포화된 C18 산/포화된 (C20+C22+C24)-산 ≥1, 바람직하게는 ≥5, 더 바람직하게는 ≥10의 비
를 포함하는, 지방산으로부터 유래된 글리세리드를 가지며,
이 글리세리드는:
(e) 전체 지방산 중량에 대해 계산한 리놀렌산 ≤5중량%
(f) 전체 지방산 중량에 대해 계산한 트랜스 지방산 ≤5중량%
(g) sn-2 위치에서 ≤75중량%, 바람직하게는 ≤60중량% 올레산
을 함유하며: 글리세리드는 (전체 글리세리드 중량에 대해 계산하여)
(h) HOH+HHO 트리글리세리드 ≥8 중량%
(i) 삼중포화된 트리글리세리드 ≤5 중량%를 포함하고, 선택적으로 다음의 특성 중 하나 이상을 포함하며:
(j) 10℃에서 고형 지방 함량 >10%
(k) 35℃에서 고형 지방 함량 ≤15%,
(l) 10℃에서 고형 지방 함량 >15% 및 35℃에서 고형 지방 함량 ≤25%,
(m) (HOH+HHO) 및 (HLH+HHL) 트리글리세리드의 비는 >1이고, 바람직하게는 >2이며,
여기서, H는 C18-C24 포화 지방산을 나타내고, O은 올레산을 나타내며, L은 리놀레산을 나타낸다.
선택적으로, 지방의 고체 함량(%SFC)은 10℃에서 11 내지 30이고, 20℃에서 4 내지 15이며, 30℃에서 0.5 내지 8이고, 35℃에서 0 내지 4이다. 교대로, 지방의 %SFC는 10℃에서 20 내지 45이고, 20℃에서 14 내지 25이며, 30℃에서 2 내지 12이고, 35℃에서 0 내지 5이다. 관련된 실시형태에서, 지방의 %SFC는 10℃에서 30 내지 60이고, 20℃에서 20 내지 55이며, 30℃에서 5 내지 35이고, 35℃에서 0 내지 15이다. C12 내지 C16 지방산 함량은 ≤15 중량%일 수 있다. 지방은 이중포화된 디글리세리드 ≤5 중량%를 가질 수 있다.
관련된 실시형태에서, 천연 오일 또는 천연 오일 배합물로 만들어진 스프레드, 마가린 또는 기타 다른 식료품이 있다. 예를 들어, 천연 지방은 30중량% 내지 80중량%의 지방상 중에 분산된 70중량% 내지 20중량%의 수성상을 포함하는 식용가능한 W/O 에멀전 스프레드를 만드는데 사용될 수 있으며, 이때 지방상은 식물성 트리글리세리드 오일 A 50중량% 내지 99중량%와 구조화시킨 트리글리세리드 지방 B 1중량% 내지 50중량%의 혼합물이며, 지방은 5중량% 내지 100중량%의 하드스톡(hardstock) 지방 C 및 95중량%까지의 지방 D로 이루어지며, 여기서 하드스톡 지방 C 트리글리세리드의 적어도 45중량%는 포화O포화 트리글리세리드로 이루어지고, 포화는 포화된 C18 내지 C24 탄소 사슬을 가지는 지방산 잔기를 의미하며, O는 올레산 잔기를 의미하고, 단 지방의 분획화, 수소화, 에스테르화 또는 에스테르교환 반응에 의해 얻어진 임의의 하드스톡 지방 C는 제외된다. 하드스톡 지방은 본 명세서에 개시된 방법에 따른 세포에 의해 생성된 천연 지방일 수 있다. 따라서, 하드스톡 지방은 위치특이적 프로파일이 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% SOS인 지방일 수 있다. W/O 에멀전은 US 특허 제7,118,773호에 포함되는 당업계에 공지된 방법으로 제조될 수 있다.
관련된 실시형태에서, 세포는 또한 리신올레산을 생성하는 내인성 가수분해효소를 발현시킨다. 그 결과, 생성된 오일(예를 들어, 액체 오일 또는 구조화된 지방)은 마가린, 스프레드 또는 기타 다른 식료품 또는 비식료품으로 더 용이하게 유화될 수 있다. 예를 들어, 생성된 오일은 추가되는 유화제 없이 또는 저량의 이러한 유화제를 사용하여 유화될 수 있다. 미국특허 출원 제13/365,253호는 미세조류 및 기타 다른 세포에서 이와 같은 수소화효소를 발현시키는 방법을 개시한다. 구체적 실시형태에서, 천연 오일은 적어도 1%, 2% 또는 5% SRS를 포함하며, 여기서 S는 스테아레이트이고, R은 리신올레산이다.
대안의 실시형태에서, 상기 기재한 바와 같은 코코아 버터 모방체인 천연 오일은 분획화되어 삼중포화물(예를 들어, 트리스테아린 및 트리팔미틴, SSP 및 PPS)을 제거할 수 있다. 예를 들어, SOS 농도를 증가시키는 SAD 활성을 감소시키도록 조작된 미세조류는 분획화되어 삼중포화물을 제거할 수 있는 것으로 발견되었다. 실시예 47을 참조한다. 구체적 실시형태에서, 분획화된 천연 오일의 용융 온도는 코코아 버터의 용융 온도(약 30℃ 내지 32℃)와 유사하다. POP, POS 및 SOS 수준은 각각 약 16%, 38% 및 23%에서 코코아 버터에 근접할 수 있다. 예를 들어, POP는 16%±20%일 수 있고, POS는 38%±20%일 수 있으며, SOS는 23%±20%일 수 있다. 또는, POP는 16%±15%일 수 있고, POS는 38%±15%일 수 있으며, SOS는 23%±15%일 수 있다. 또는 POP는 16%±10%일 수 있고, POS는 38%±10%일 수 있으며, SOS는 23%±10%일 수 있다. 추가로, 트리스테아린 수준은 트리아실글리세리드의 5% 미만일 수 있다.
VIII . 고 중쇄 오일
본 발명의 실시형태에서, 세포는 세포에서 또는 세포의 오일에서 중쇄 지방산(예를 들어, C8:0, C10:0, C12:0, C14:0 또는 C16:0 지방산)의 수준을 상승시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 가진다. 세포에서 또는 세포의 오일에서 중쇄 지방산 수준을 증가시키는 한 가지 방법은 단독 변형으로서 또는 하나 이상의 기타 다른 유전적 변형과 조합하여 중쇄 지방 아실-ACP 기질(예를 들어, FatB 유전자에 의해 암호화된 것)에 대해 활성을 갖는 외인성 아실-ACP 티오에스테라제를 발현시키도록 세포를 조작하는 것이다. 세포에서 또는 세포의 오일에서 중쇄 지방산 수준을 증가시키기 위한 추가적인 유전적 변형은 치환된 아실 글리세로에스테르의 sn-2 위치에 중쇄 지방-아실기의 전달을 촉진하는 활성 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제(LPAAT)를 암호화하는 외인성 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 유전자의 발현이다. 구체적인 관련된 실시형태에서, 외인성 아실-ACP 티오에스테라제와 LPAAT는 둘 다 세포에서 안정적으로 발현된다. 실시형태에서, 재조합 핵산은 치환된 아실 글리세로에스테르의 sn-2 위치에 중쇄 지방-아실기의 전달을 촉진하는 외인성 LPAAT 및 외인성 중쇄 특이적 티오에스테라제의 발현을 야기하는 유지성 세포 내로(특히, 색소체 미생물 세포 내로) 도입된다. 그 결과, 세포는 TAG 중의 중쇄 지방산 백분율이 증가되게 하여 중쇄 지방산을 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 이상 만큼 생성할 수 있다. 외인성 LPAAT의 도입은 외인성 중쇄 선호 아실-ACP 티오에스테라제를 단독으로 도입하는 것에 비해 1.2배, 1.5배, 1.7배, 2배, 3배, 4배 이상만큼 sn-2 위치에서 중쇄 지방산을 증가시킬 수 있다. 실시형태에서, 중쇄 지방산은 세포에 의해 생성되는 TAG 지방산의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 초과한다. 다양한 실시형태에서, 중쇄 지방산은 라우르산, 미리스트산 또는 팔미트산이다. 실시예 3, 실시예 43 및 실시예 44는 지방산 프로파일에서 변경이 일어난 미세조류 세포에서 식물 LPAAT의 발현을 기재한다. 실시예에서와 같이, 세포는 또한 주어진 지방 아실-ACP 사슬 길이를 선호하는 외인성 아실-ACP 티오에스테라제(이는 또한 식물로부터 유래될 수 있음)를 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 미세조류 세포는 C8, C10, C12, C14, C8-C12 또는 C8-C10 지방산을 우선적으로 절단하는 아실-ACP 티오에스테라제 및 LPAAT를 암호화하는 외인성 유전자를 포함할 수 있다. 구체적 실시형태에서, 이와 같은 세포는 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90% 또는 90% 내지 99%, >20%, >30%, >40%, >50%, >60%, >70%, >80% 또는 >90% C8, C10, C12, C14, C8-C12 또는 C8-C10 지방산을 포함하는 지방산 프로파일을 가지는 천연 오일을 생성할 수 있다. 기타 다른 LPAAT는 C16 또는 C18 지방산을 우선적으로 절단할 수 있다(실시예 44 참조). 지방산 불포화효소 경로의 추가적인 유전적 조작(예를 들어, 이하에 기재하는 바와 같음)은 오일의 안정성을 증가시킬 수 있다.
이들 천연 오일 중 임의의 것은 에스테르교환될 수 있다. 에스테르교환은, 예를 들어 오일의 용융 온도 또는 유동점을 낮추는데 사용될 수 있다. 구체적 실시형태에서, 천연 오일은 카프릴산과 카프르산 합의 적어도 50%를 포함하며, 에스테르교환되어 유동점 및/또는 동적 점성도를 감소시킬 수 있다. 이와 같은 오일(천연 오일 또는 에스테르교환된 오일)은, 선택적으로 예를 들어 2% 미만의 다가불포화 지방산을 포함하는 고안정성 오일일 수 있다.
외인성 LPAAT의 발현에 교대로 또는 추가적으로, 세포는, 외인성 KASI 또는 KASIV 효소를 발현시키고 선택적으로 중쇄 선호 아실-ACP 티오에스테라제가 발현될 때 특히 유리한 KASII의 활성을 감소시키거나 또는 제거하도록 조작가능한 재조합 핵산을 포함할 수 있다. 실시예 37은 균주를 생성하기 위해 중쇄 선호 아실-ACP 티오에스테라제와 함께 KASI 또는 KASIV 효소를 과발현시키는 프로토테카 세포의 조작을 기재하며, 이때 C10-C12 지방산의 생성은 전체 지방산의 약 59%이다. 중쇄 생성은 또한 KASI 및/또는 KASII의 활성을 억제함으로써(예를 들어, 녹아웃 또는 녹다운을 사용함) 증가될 수 있다. 실시예 38은 약 76% 또는 84% C10-C14 지방산인 지방산 프로파일을 달성하는 중쇄 선호 아실-ACP 티오에스테라제의 과발현과 함께 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) KASI의 상이한 대립유전자의 염색체 녹아웃을 상세히 설명한다. 실시예 39는 KASI RNA 헤어핀 폴리뉴클레오티드의 발현 결과로서 상승된 중쇄 지방산을 특징으로 하는 재조합 세포 및 오일을 제공한다. 이들 변형 중 임의의 것에 추가적으로, SAD 또는 FAD 효소의 불포화 또는 다가불포화 지방산 생성은 억제될 수 있다(예를 들어, 녹아웃 또는 녹다운에 의해).
특정 실시형태에서, 재조합 세포는 40% 이상의 라우르산을 갖는 TAG를 생성한다. 다른 관련된 실시형태에서, 재조합 세포는 40% 이상의 미리스트산, 카프릴산, 카프르산 또는 팔미트산의 지방산 프로파일을 갖는 TAG를 생성한다. 예를 들어, 유지성 재조합 녹조류 세포는 세포 건조 중량의 40%, 50% 또는 60% 이상을 구성하는 오일 중에서 40% 라우르산 또는 미리스트산을 생성할 수 있다.
구체적 실시형태에서, 재조합 세포는 ACP로부터 중쇄 지방산의 절단을 촉진하는 활성 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 아실-ACP 티오에스테라제 외인성 유전자의 산물을 발현시키도록 조작가능한 치환된 아실 글리세로에스테르 및 핵산의 sn-2 위치에 중쇄 지방 아실기의 전달을 촉진하는 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제를 암호화하는 외인성 유전자의 산물을 발현시키도록 조작가능한 핵산을 포함한다. 그 결과, 일 실시형태에서, 생성된 오일은 재조합 핵산의 결과로서 C10 및 C12 지방산이 상승되고 C16, C18 및 C18:1 지방산이 감소된 지방산 프로파일을 특징으로 할 수 있다. 실시예 3을 참조하며, 이때 쿠페아 라이티(Cuphea wrightii) 아실-ACP 티오에스테라제 및 코코스 누시페라(Cocos nucifera) LPAAT 유전자의 과발현은 C12 지방산의 백분율을 미형질전환 세포에서의 약 0.04%로부터 약 46%로 증가시켰고, C10 지방산의 백분율을 미형질전환 세포에서의 약 0.01%로부터 약 11%로 증가시켰다. 관련된 실시형태에서, 중쇄 지방산 생성에서의 증가는 70% 초과, 75% 내지 85%, 70% 내지 90%, 90% 내지 200%, 200% 내지 300%, 300% 내지 400%, 400% 내지 500% 또는 500% 초과이다.
평균 사슬 길이는 또한 C18 특이적 아실-ACP 티오에스테라제의 과발현에 의해 감소될 수 있다. C18 또는 기타 다른 아실-ACP 티오에스테라제를 과발현시키도록 조작가능한 재조합 핵산은 단독으로 또는 본 명세서에 기재된 기타 다른 작제물과 조합하여 사용되어 평균 사슬 길이를 추가로 감소시킬 수 있다. 용도 중에서, 생성된 오일은 코코아버터/유지방 대체물로서 사용될 수 있다. 실시예 45 및 도 17의 논의를 참조한다. 실시형태에서, 상기 기재된 고 중쇄 생성 세포 중 하나는 부문 IV에서 상기 기재한 바와 같이 하나 이상의 지방 아실 불포화효소를 녹아웃 또는 녹다운시킴으로써 저 다가불포화 오일을 생성하도록 추가로 조작된다. 따라서, 생성된 오일은 해당 부문 또는 대응하는 실시예에서 언급된 고안정성 특징을 가질 수 있다. 구체적 실시형태에서, 세포는 30% 초과의 중쇄 지방산 및 5% 이하의 다가불포화물을 포함하는 오일을 생성한다. 관련된 실시형태에서, 세포는 40% 초과의 중쇄 지방산 및 4% 이하의 다가불포화물을 포함하는 오일을 생성한다. 관련된 추가 실시형태에서, 세포는 50% 초과의 중쇄 지방산 및 3% 이하의 다가불포화물을 포함하는 오일을 생성한다.
이들 오일의 가수분해로부터 유래된 고 중쇄 오일 또는 지방산은 식품, 연료 및 윤활제 및 계면활성제의 생성을 포함하는 함유 화학 제품 적용분야에서 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 세포로부터 유래된 지방산은 에스테르화되거나, 크래킹되거나, 알데하이드 또는 알코올로 환원되거나, 아미노화되거나, 황화되거나, 설폰화되거나 또는 당업계에 공지된 기타 다른 화학적 공정이 실시될 수 있다.
실시형태에서, 천연 오일은 에스테르교환되고, 에스테르교환된 천연 오일의 동적 점성도는 40℃에서 30센티 스토크스, 20센티 스토크스, 15센티 스토크스, 10센티 스토크스, 9센티 스토크스, 8센티 스토크스, 7센티 스토크스, 6센티 스토크스, 5센티 스토크스, 4센티 스토크스, 3센티 스토크스, 2센티 스토크스 또는 1센티 스토크스 미만이다. 일부 실시형태에서, 동적 점성도는 40℃에서 3센티 스토크스 미만이다. 일부 실시형태에서, 에스테르교환된 천연 오일의 유동점은 5℃, 0℃, -10℃, -12℃, -15℃, -20℃, -25℃, -30℃, -35℃, -40℃, -45℃ 또는 -50℃ 미만이다. 일부 실시형태에서, 유동점은 -10℃ 미만이다. 일부 실시형태에서, 유동점은 -20℃미만이다.
실시예 53은 60% 초과의 미리스테이트를 포함하는 미세조류에서 오일을 생성하기 위한 조류에서 식물 FatB 유전자의 사용을 기재한다. 실시형태에서, 서열 번호 87 또는 서열 번호 89에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는 선택적으로 상기 기재한 바와 같이 중쇄 선호 LPAAT와 조합하여 사용된다.
IX . 고 올레산/팔미트산 오일
다른 실시형태에서, 약 60% 올레산, 25% 팔미트산 및 선택적으로 5% 이하 다가불포화물을 포함하는 고 올레산 오일이 있다. 관련 부분에서 참조로 포함되는 U.S. 특허 출원 제13/365,253호에 개시된 방법을 사용하여 고 올레산 오일이 생성될 수 있다. 예를 들어, 세포는 아실-ACP 티오에스테라제를 억제하도록(예를 들어, FATA를 암호화하는 유전자의 녹아웃 또는 녹다운) 조작가능한 핵산을 가질 수 있는 한편, 또한 KASII 활성을 증가시키는 유전자를 발현시킬 수 있다. 세포는 상기 기재한 바와 같은 유전자 발현의 조절을 포함하여, 델타 12 지방산 불포화효소의 발현을 저해하는 변형을 추가로 가질 수 있다. 그 결과, 다가불포화물은 5영역%, 4영역%, 3영역%, 2영역% 또는 1영역% 이하일 수 있다.
X. 저 포화 오일
실시형태에서, 천연 오일은 재조합 세포로부터 생성된다. 생성된 오일은 4%, 3%, 2%, 1%(영역%) 미만의 포화된 지방산을 갖는 지방산 프로파일을 가진다. 구체적 실시형태에서, 오일은 0.1% 내지 3.5% 포화 지방산을 가진다. 이와 같은 특정한 오일은 무시할 만한 양의 포화 지방산을 포함하는 식품을 생산하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 이들 오일은 적어도 3% 다가불포화 지방산과 함께 적어도 90% 올레산 또는 적어도 90% 올레산을 포함하는 지방산 프로파일을 가질 수 있다. 실시형태에서, 재조합 세포에 의해 생성된 천연 오일은 적어도 90% 올레산, 리놀레산과 리놀렌산 합의 적어도 3%를 포함하고, 3.5% 미만의 포화 지방산을 가진다. 관련된 실시형태에서, 재조합 세포에 의해 생성된 천연 오일은 적어도 90% 올레산, 리놀레산과 리놀렌산 합의 적어도 3%를 포함하고, 3.5% 미만의 포화 지방산을 가지되, 대다수의 포화 지방산은 10개 내지 16개 사슬 길이를 포함한다. 이들 오일은, 본 명세서 및 U.S. 특허 출원 제13/365,253호에 기재된 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 재조합 유지성 세포에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 고도로 활성인 SAD를 포함하는 세포에서 KASII 효소의 과발현은 3.5% 이하의 포화물을 포함하는 고 올레산 오일을 생성할 수 있다. 선택적으로, 올리에이트 특이적 아실-ACP 티오에스테라제는 또한 과발현되고/과발현되거나 C18 미만의 아실 사슬을 가수분해하는 경향을 갖는 내인성 티오에스테라제는 녹아웃되거나 또는 억제된다. 생성된 오일의 지방산 프로파일에서 팔미트산과 스테아르산의 합에 대한 올레산의 비는 3, 5, 7 또는 10 초과이도록, 올리에이트 특이적 아실-ACP 티오에스테라제는 ACP-팔미테이트 및 ACP-스테아레이트에 대해 낮은 활성을 가지는 이식유전자일 수 있다. 교대로 또는 추가적으로, FATA 유전자는 이하의 실시예 36에서와 같이 녹아웃되거나 또는 녹다운될 수 있다. FATA 유전자는 녹아웃되거나 또는 녹다운될 수 있고, 외인성 KASII는 과발현될 수 있다. 다른 선택적 변형은 KASI 및/또는 KASIII 활성을 증가시키는 것인데, 이는 더 짧은 사슬 포화물의 형성을 추가로 억제할 수 있다. 선택적으로, 치환된 글리세롤에 불포화 지방 아실 모이어티를 전달하기 위한 특이성을 갖는 하나 이상의 아실트랜스퍼라제(예를 들어, LPAAT)는 또한 과발현되고/과발현되거나 내인성 아실트랜스퍼라제는 녹아웃되거나 또는 약화된다. 추가적인 선택적 변형은 불포화 지방산을 연장시키기 위한 특이성을 갖는 KCS 효소의 활성을 증가시키는 것이고/것이거나 포화 지방산을 신장시키기 위한 특이성을 갖는 내인성 KCS 는 녹아웃되거나 또는 약화된다. 선택적으로, 올리에이트는 델타 12 지방산 불포화효소의 녹아웃 또는 녹다운에 의한 리놀레이트 생성의 대가로, 예를 들어 본 특허 출원의 부문 IV의 기법을 사용하여 증가된다.
실시예 51에서 기재하는 바와 같이, 포화 지방의 수준은 또한 팔미트산을 팔미톨레산으로 불포화시키는 외인성 유전자의 도입에 의해 감소될 수 있다. 유지성 세포에서의 사용에 적합한 유전자의 예는 맥파디에나 운구이스(Macfadyena unguis)(고양이 발톱(Cat? claw)), 마카다미아 인테그리폴리아(Macadamia integrifolia)(마카다미아 너트) 및 힙포파에 람노이데스(Hippophae rhamnoides)(산자나무)를 포함하는 식물에서 발견된다. 팔미토일-ACP를 불포화시키는 변이체 외인성 또는 내인성 SAD가 또한 사용될 수 있으며, 실시예 51에서 추가로 논의된다. 선택적으로, PAD 또는 SAD 유전자는 실시예 51에 기재하는 유전자 산물에 대해 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 가진다. 하나 이상의 내인성 FATA 대립유전자의 녹아웃 또는 녹다운 및/또는 KASII의 과발현을 포함하는, 이 변형은 단독으로 또는 부문 IX에서 및 실시예에서 바로 상기에 기재한 것과 같은 올리에이트-증가 변형과 조합하여 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 유지성 미세조류와 같은 유지성 세포는 (i) FATA 녹아웃 또는 녹다운과 (ii) 외인성 PAD 유전자의 발현(이는 또한 PAD 활성을 가지는 변이체 SAD일 수 있음, 실시예 55 참조) 및/또는 PAD 활성을 제공하는 내인성 SAD 유전자에서의 돌연변이의 조합을 가진다. 예를 들어 세포는 과발현된 내인성 또는 외인성 KASII 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 이들 실시형태 중 임의의 것에 따르면, 유지성 세포는 1영역% 내지 2영역%, 2영역% 내지 3영역%, 3영역% 내지 4영역%, 5영역% 내지 6영역%, 7영역% 내지 8영역%, 9영역% 내지 10영역%, 10영역% 내지 15영역%, 15영역% 내지 20영역%, 20영역% 내지 30영역%, 30영역% 내지 40영역%, 40영역% 내지 60영역%, 60영역% 내지 70영역%, 70영역% 내지 80영역%, 80영역% 내지 90영역% 또는 90영역% 내지 100영역% 팔미톨레산을 포함하는 지방산 프로파일을 갖는 오일을 생성한다. 구체적 실시형태에서, 세포는 50% 초과의 올레산, 1% 초과의 팔미톨레산, 및 3.5영역 % 이하의 포화 지방산을 생성한다.
상기 유전적 변형에 추가로, 저 포화 오일은 저량의 다가불포화 지방산 때문에 고안정성 오일일 수 있다. 고안정성, 저 다가불포화 오일의 방법 및 특성규명은 내인성 Δ12 지방산 불포화효소의 활성을 감소시키는 방법을 포함하는 상기의 표제가 저 다가불포화 오일인 부문에서 기재된다. 구체적 실시형태에서, 오일은 II형 지방산 합성 경로를 갖는 유지성 미생물 세포에 의해 생성되며, 3.5% 이하의 포화 지방산을 가지고, 또한 3% 이하의 다가불포화 지방산을 가진다. 다른 구체적 실시형태에서, 오일은 3% 이하의 포화 지방산을 가지며, 또한 2% 이하의 다가불포화 지방산을 가진다. 다른 구체적 실시형태에서, 오일은 3% 이하의 포화 지방산을 가지며, 또한 1% 이하의 다가불포화 지방산을 가진다.
저 포화 및 저 포화/고 안정성 오일은 저 비용 오일과 배합되어 저 비용으로 표적화된 포화 지방산 수준에 도달될 수 있다. 예를 들어, 1% 포화 지방을 포함하는 오일은 7% 포화 지방(예를 들어, 고올레산 해바라기 오일)을 갖는 오일과 배합되어 3% 포화 지방을 갖는 오일을 제공할 수 있다.
본 발명의 실시형태에 따라 생성된 오일은 적용 분야 중에서, 수송 연료, 함유 화학 제품 및/또는 식품 및 화장품 산업에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 지질의 에스테르교환은 바이오디젤로서 유용한 장쇄 지방산 에스테르를 수득할 수 있다. 기타 다른 효소적 및 화학적 공정은 지방산, 알데하이드, 알코올, 알칸 및 알켄을 수득하도록 조정될 수 있다. 일부 적용분야에서, 재생 가능한 디젤, 제트 연료 또는 기타 다른 탄화수소 화합물이 생성된다. 본 개시내용은 또한 증가된 생산성 및 증가된 지질 수율을 위해, 및/또는 본 명세서에 기재된 조성물의 더 비용 효과적인 생산을 위해 미세조류를 배양하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 기재된 방법은 대규모로, 예를 들어 1000리터, 10,000리터, 100,000리터 이상으로 색소체 세포 배양물로부터 오일을 생성할 수 있게 한다.
실시형태에서, 세포로부터 추출된 오일은 3.5%, 3%, 2.5% 또는 2% 이하의 포화 지방을 가지고, 식료품 내에 포함된다. 완성된 식료품은 3.5%, 3%, 2.5% 또는 2% 이하의 포화 지방을 가진다.
XI . 코코아 버터/유지방 배합물 모방체
특정 실시형태에서, 세포는 코코아 버터와 유지방의 배합물에 근접하는 온도 의존적 고형 지방 함량(“SFC-곡선”)을 갖는 천연 오일을 생성한다. 코코아 버터/유지방 배합물이 사용될 수 있는 이와 같은 오일은, 예를 들어 초콜릿 기타 다른 당과 제품, 아이스크림 또는 기타 다른 냉동 디저트, 퀵브레드 또는 기타 다른 구운 상품을 포함하여, 페스트리 또는 도넛에서 사용될 수 있다. 오일은 대증식을 저해하거나, 향미를 향상시키거나, 질감을 향상시키거나 또는 비용을 감소시킬 수 있다. 구체적 예에서, 천연 오일이 근접한다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 레시피에서 코코아 버터/유지방 배합물을 대체하기 위해 재조합 미세조류 세포로부터 천연 오일을 사용하는 것이다. 관련된 실시형태에서,
도 17은 다음과 같은 다양한 오일에 대해 고형 지방 함량%의 도표를 나타낸다: (a) 지질 경로 조작이 없는 프로토테카 모리포르미스 RBD 오일, (b) 브라질 코코아 버터 +25% 유지방, (c) TAG 프로파일에서 SAD 대립유전자 수준을 감소시키는 헤어핀 핵산을 발현시키고, 이에 의해 올레산을 감소시키며, 스테아르산을 증가시키는 균주로부터 피. 모리포르미스 RBD 오일의 3회 복제, (d) 내인성 OTE(올레오일 아실-ACP 티오에스테라제, 실시예 45 참조)를 과발현시키는 균주로부터의 피. 모리포르미스 RBD 오일, (e) 말레이시아 코코아 버터 +25% 유지방, 및 (f) 말레이시아 코코아 버터. 코코아 버터 및 코코아 버터 유지방 값은 문헌값이다(Bailey? Industrial Oils and Fat Products, 6th ed.)
본 발명의 실시형태에서, 75% 코코아 버터/25% 유지방 배합물에 대한 열적 특성이 유사한 천연 오일은 미세조류 또는 상기 기재한 기타 다른 세포에 의해 생성된다. 세포는 오일이 20℃에서 38%±30%, 25℃에서 32%±30%, 30℃에서 17%±30%, 및 35℃에서 5%±30% 미만의 고형 지방 함량(예를 들어, NMR에 의해 결정된 바와 같음)을 가지도록 세포에 의해 생성된 트리글리세리드의 지방산 프로파일을 변경시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 포함한다. 명확함을 위해, ±10%는 SFC 백분율의 백분율을 지칭한다(예를 들어, 5% SFC의 30%는 1.5%SFC이며, 따라서 범위는 35℃에서 3.5% 내지 6.5% SFC이다). 관련된 실시형태에서, 오일은 20℃에서 38%±20%, 25℃에서 32%±20%, 30℃에서 17%±20%, 및 35℃에서 5%±20% 미만의 고형 지방 함량(예를 들어, NMR에 의해 결정된 바와 같음)을 가지거나, 또는 오일은 20℃에서 38%±10%, 25℃에서 32%±10%, 30℃에서 17%±10%, 및 35℃에서 5%±10% 미만의 고형 지방 함량(예를 들어, NMR에 의해 결정된 바와 같음)을 가진다.
XII . 부수적 오일 성분
상기 방법에 따라 생성된 오일은 일부 경우에 미세조류 숙주 세포를 사용하여 만들어진다. 상기 기재한 바와 같이, 미세조류는 제한 없이 녹조식물문, 트레복시조강, 클로렐라목, 클로렐라과 또는 녹조강의 분류에 속할 수 있다. 트레복시조강의 미세조류는 그것의 스테롤 프로파일에 기반하여 식물성 오일과 구별될 수 있는 것이 발견되었다. 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides)에 의해 생성된 오일은 GC-MS에 의해 검출될 때, 브라시카스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 β-시토스테롤이 되는 것으로 나타난 스테롤을 생성하는 것으로 발견되었다. 그러나, 클로렐라에 의해 생성된 모든 스테롤은 C24β 입체화학을 가지는 것으로 여겨진다. 따라서, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 β-시토스테롤로서 검출된 분자는 실제로 각각 22,23-디하이드로브라시카스테롤, 프로페라스테롤 및 클리오나스테롤인 것으로 여겨진다. 따라서, 상기 기재한 미세조류에 의해 생성된 오일은 C24β 입체화학을 가지는 스테롤의 존재 및 존재하는 스테롤 중의 C24α 입체화학의 부재에 의해 식물 오일과 구별될 수 있다. 예를 들어, 생성된 오일은 22,23-디하이드로브라시카스테롤을 함유할 수 있는 한편, 캄페스테롤이 없을 수 있고; 클리오나스테롤을 함유하는 한편 β-시토스테롤이 없을 수 있고/있거나 포리페라스테롤을 함유하는 한편 스티그마스테롤이 없을 수 있다. 교대로 또는 추가적으로, 오일은 상당한 양의 Δ7-포리페라스테롤을 함유할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 오일은 식물성 오일이 아니다. 식물성 오일은 식물 및 식물 종자로부터 추출된 오일이다. 식물성 오일은 그것의 오일 함량을 기준으로 본 명세서에서 제공된 비식물 오일과 구별될 수 있다. 오일 함량을 분석하는 다양한 방법은 오일의 공급원 또는 상이한(예를 들어, 식물) 기원의 오일을 포함하는 본 명세서에 제공된 오일의 불순품이 생겼는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 결정은 분석 방법 중 하나 또는 조합에 기반하여 만들어질 수 있다. 이들 시험은 유리 지방산, 지방산 프로파일, 전체 트리아실글리세롤 함량, 디아실글리세롤 함량, 과산화물 값, 스펙트럼 특성(예를 들어, UV 흡수), 스테롤 프로파일, 스테롤 분해 산물, 항산화제(예를 들어, 토코페롤), 색소(예를 들어, 엽록소), d13C 값 및 감각 분석(예를 들어, 맛, 냄새 및 구강 촉감) 중 하나 이상의 분석을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다수의 이와 같은 시험은 식용 지방 및 오일에 대한 국제식품규격(Codex Alimentarius standards)과 같이 상업적 오일에 대해 표준화되었다.
스테롤 프로파일 분석은 유기 물질의 생물학적 공급원을 결정하기 위한 특히 잘 공지된 방법이다. 캄페스테롤, b-시토스테롤 및 스티감스테롤은 흔한 식물 스테롤이며, b-시토스테롤은 원칙적 식물 스테롤이다. 예를 들어, b-시토스테롤은 특정 종자 오일의 분석에서 가장 흔하고, 대략 옥수수에서 64%, 평지씨에서 29%, 해바라기에서 64%, 면실에서 74%, 대두에서 26% 및 올리브 오일에서 79%인 것으로 발견되었다(Gul et al. J. Cell and Molecular Biology 5:71-79, 2006).
프로토테카 모리포르미스 균주 UTEX1435로부터 단리된 오일을 별개로 정화시키거나(CL), 정련 및 표백시키거나(RB) 또는 정련, 표백 및 탈취시켰고(RBD), 문헌[JAOCS vol. 60, no.8, August 1983]에 기재된 절차에 따라 스테롤 함량에 대해 시험하였다. 분석 결과를 이하에 나타낸다(단위: mg/100 g):
Figure pct00001
이들 결과는 3가지 눈에 띄는 특징을 나타낸다. 첫째로, 에르고스테롤은 모든 스테롤 중에서 가장 흔하며, 전체 스테롤의 약 50% 이상을 차지하는 것으로 발견되었다. 에르고스테롤의 양은 캄페스테롤, β-시토스테롤, 및 스티감스테롤을 합한 양보다 많다. 에르고스테롤은 진균에서 흔히 발견되며, 식물에서는 흔히 발견되지 않는 스테로이드이고, 특히 상당한 양으로 에르고스테롤의 존재는 비식물 오일에 대한 유용한 마커로서 작용한다. 둘째로, 오일은 브라시카스테롤을 함유하는 것으로 발견되었다. 평지씨 오일을 제외하고, 브라시카스테롤은 식물계 오일에서 흔히 발견되지 않는다. 셋째로, 2% 미만의 β-시토스테롤이 존재하는 것으로 발견되었으며, β-시토스테롤은 미세조류에서 흔히 발견되지 않는 두드러진 식물 스테롤이고, 특히 상당한 양으로 β-시토스테롤의 존재는 식물 유래 오일에 대한 유용한 마커로서 작용한다. 요약하면, 프로토테카 모리포르미스 균주 UTEX1435는 전체 스테롤 함량의 백분율로서 상당한 양의 에르고스테롤과 단지 미량의 β-시토스테롤을 둘 다 함유하는 것으로 발견되었다. 따라서, 에르고스테롤:β-시토스테롤의 비 또는 브라시카스테롤의 존재와의 조합에서 이 오일을 식물 오일과 구별하는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 오일의 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 β-시토스테롤을 함유한다. 다른 실시형태에서, 오일에는 β-시토스테롤이 없다.
일부 실시형태에서, 오일에는 β-시토스테롤, 캄페스테롤 또는 스티그마스테롤 중 하나 이상이 없다. 일부 실시형태에서, 오일에는 β-시토스테롤, 캄페스테롤, 및 스티그마스테롤이 없다. 일부 실시형태에서 오일에는 캄페스테롤이 없다. 일부 실시형태에서, 오일에는 스티그마스테롤이 없다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 오일의 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 24-에틸콜레스트-5-엔-3-올을 포함한다. 일부 실시형태에서, 24-에틸콜레스트-5-엔-3-올은 클리오나스테롤이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 오일의 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서, 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%의 클리오나스테롤을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 오일의 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 24-메틸콜레스트-5-엔-3-올을 함유한다. 일부 실시형태에서, 24-메틸콜레스트-5-엔-3-올은 22,23-디하이드로브라시카스테롤이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 오일의 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%의 22,23-디하이드로브라시카스테롤을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 오일의 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 5,22-콜레스타디엔-24-에틸-3-올을 함유한다. 일부 실시형태에서, 5,22-콜레스타디엔-24-에틸-3-올은 포리페라스테롤이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 오일의 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%의 포리페라스테롤을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 오일의 오일 함량은 에르고스테롤 또는 브라시카스테롤 또는 둘의 조합물을 함유한다. 일부 실시형태에서, 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서 적어도 5%, 10%, 20%, 25%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65%의 에르고스테롤을 함유한다. 일부 실시형태에서, 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서, 적어도 25%의 에르고스테롤을 함유한다. 일부 실시형태에서, 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서, 적어도 40%의 에르고스테롤을 함유한다. 일부 실시형태에서, 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서, 적어도 5%, 10%, 20%, 25%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65%의 에르고스테롤 및 브라시카스테롤의 조합물을 함유한다.
일부 실시형태에서, 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서, 적어도 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5%의 브라시카스테롤을 함유한다. 일부 실시형태에서, 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5%의 브라시카스테롤을 함유한다.
일부 실시형태에서 에르고스테롤 대 브라시카스테롤의 비는 적어도 5:1, 10:1, 15:1 또는 20:1이다.
일부 실시형태에서, 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서, 적어도 5%, 10%, 20%, 25%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65%의 에르고스테롤 및 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 β-시토스테롤을 함유한다. 일부 실시형태에서, 오일 함량은 전체 스테롤의 백분율로서, 적어도 25%의 에르고스테롤 및 5% 미만의 β-시토스테롤을 함유한다. 일부 실시형태에서, 오일 함량은 브라시카스테롤을 추가로 포함한다.
XIII . 연료 및 화학물질
상기 논의한 오일은 단독으로 또는 조합하여 식품, 연료 및 화학 물질(플라스틱, 거품, 필름 등을 포함함)의 생성에서 유용하다. 오일, 트리글리세리드, 오일 유래의 지방산에 C-H 활성화, 하이드로아미노 메틸화, 메톡시-탄산화, 오존분해, 효소적 형질전환, 에폭시화, 메틸화, 다이머화, 티올화, 복분해, 수소첨가-알킬화, 락톤화 또는 기타 다른 화학적 공정이 실시될 수 있다.
오일은 알칸(예를 들어, 재생 디젤) 또는 에스테르(예를 들어, 에스테르교환에 의해 생성된 바이오디젤용 메틸 또는 에틸 에스테르)로 전환될 수 있다. 알칸 또는 에스테르는 연료로서, 용매로서 또는 윤활제로서 또는 화학물질 공급 원료로서 사용될 수 있다. 재생 디젤 및 바이오디젤의 생성을 위한 방법은 당업계에 잘 확립되어 있다. 예를 들어, WO 제2011/150411호를 참조한다.
본 발명의 구체적 실시형태에서, 상기 기재한 고올레산 또는 고올레산-고 안정성 오일은 에스테르화된다. 예를 들어, 오일은 메탄올을 이용하여 메틸 올리에이트가 풍부한 오일로 에스테르교환될 수 있다. 실시예 49에서 기재한 바와 같이, 이와 같은 제형은 대두 오일로부터의 메틸 올리에이트와 바람직하게 비교되는 것으로 발견되었다.
다른 구체적 예에서, 오일은 C36 2산 또는 C36 2산의 생성물로 전환된다. 오일로부터 생성된 지방산은 중합되어 C36 다이머 산이 풍부한 조성물을 제공할 수 있다. 구체적 예에서, 고올레산 오일은 분할되어 고올레산 지방산 물질을 제공하는데, 이는 중합되어 C36-다이머 산이 풍부한 조성물을 제공한다. 선택적으로, 오일은 고올레산 고안정성 오일이다(예를 들어, 3% 미만의 다가불포화물을 포함하는 60% 초과의 올레산, 2% 미만의 다가불포화물을 포함하는 70% 초과의 올레산 또는 1% 미만의 다가불포화물을 포함하는 80% 초과의 올레산). 고올레산, 고안정성 출발 물질을 사용하면, 일부 경우에 바람직할 수 있는 더 소량의 고리형 생성물을 제공하는 것으로 여겨진다. 오일을 가수분해한 후, 고농도의 올레산을 얻는다. 다이머산의 제조 공정에서, 고올레산 스트림은 "더 깨끗한" C36 다이머산으로 전환되고, 트라이머산(C54), 및 C18:2 및 C18:3 산의 존재에 의해 얻어지는 기타 다른 더 복잡한 고리형 부산물을 생성하지 않을 것이다. 예를 들어, 오일은 지방산으로 가수분해되고, 지방산은 정제되며, 몬트모릴로나이트 점토의 존재 하에서 250℃에서 다이머화될 수 있다. 문헌[SRI Natural Fatty Acid, March 2009]을 참조한다. 올레산의 C36 다이머가 풍부한 생성물이 회수된다.
Figure pct00002
추가로, C36 다이머산은 에스테르화되고 수소화되어 디올을 제공할 수 있다. 디올은 촉매적 탈수소화에 의해 중합될 수 있다. 중합체는 또한 디메틸 카보네이트를 이용한 다이머디올의 에스테르교환에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 연료의 생성을 위해, 본 발명의 세포에 의해 생성된 지질이 채취되거나 또 다르게는 임의의 편리한 수단에 의해 수집된다. 지질은 전체 세포 추출에 의해 단리될 수 있다. 세포는 우선 파괴된 다음, 세포내 및 세포막/세포벽-결합 지질뿐만 아니라 세포밖 탄화수소는 세포 덩어리로부터, 예를 들어 원심분리의 사용에 의해 분리될 수 있다. 유지성 세포에서 생성된 세포내 지질은, 일부 실시형태에서 세포를 용해한 후 추출된다. 일단 추출되면, 지질은 추가로 정련되어 오일, 연료 또는 함유 화학 제품을 생산한다.
세포 용해물로부터 지질을 분리하기 위해 다양한 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 지질 및 지질 유도체, 예를 들어 지방 알데하이드, 지방 알코올, 및 탄화수소, 예를 들어 알칸은 헥산과 같은 소수성 용매를 이용하여 추출될 수 있다(문헌[Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol., 11:717] 참조). 지질 및 지질 유도체는 또한 액화(liquefaction)(예를 들어, 문헌[Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17:33-39] 및 [Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6(4):269-274] 참조); 오일 액화(예를 들어, 문헌[Minowa et al. 1995, Fuel 74(12):1735-1738] 참조); 및 초임계 CO2 추출(예를 들어, 문헌[Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356:328-334] 참조)을 사용하여 추출될 수 있다. Miao 및 Wu는 클로렐라 프로토테오코이데스(Chlorella prototheocoides)의 배양물로부터 미세조류 지질의 회수 프로토콜을 기재하며, 이때 세포는 원심분리에 의해 채취되고, 증류수로 세척되며, 냉동 건조에 의해 건조되었다. 생성된 세포 분말은 막자사발에서 분쇄된 다음, n-헥산을 이용하여 추출되었다. 문헌[Miao 및 Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846].
지질 및 지질 유도체는 유기 용매를이용한 추출에 의해 회수될 수 있다. 일부 경우에, 바람직한 유기 용매는 헥산이다. 통상적으로, 유기 용매는 용해물 성분의 사전 분리 없이 용해물에 직접 첨가된다. 일 실시형태에서, 상기 기재한 방법 중 하나 이상에 의해 생성된 용해물은 지질 및/또는 탄화수소 성분이 유기 용매와 함께 용액을 형성할 수 있도록 하는데 충분한 일정 시간 동안 유기 용매와 접촉된다. 일부 경우에, 그 다음에 용액은 추가로 정련되어 구체적인 원하는 지질 또는 탄화수소 성분을 회수할 수 있다. 헥산 추출 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 생체내 세포에 의해 생성되거나 또는 시험관내에서 효소적으로 변형된 지질은 선택적으로 통상적인 수단에 의해 추가로 가공될 수 있다. 가공은 크기를 감소시키는 "크래킹"을 포함하며, 따라서 탄화수소 분자의 수소:탄소 비를 증가시킬 수 있다. 촉매적 및 열적 크래킹 방법은 탄화수소 및 트리글리세리드 오일 가공에서 일상적으로 사용된다. 촉매적 방법은 고체산 촉매와 같은 촉매의 사용을 수반한다. 촉매는 실리카-알루미나 또는 제올라이트일 수 있는데, 이는 탄소-탄소 결합의 불균일 또는 비대칭적 파괴를 일으켜서 카보양이온 및 수소 음이온을 만든다. 그 다음에 이들 반응 중간체는 다른 탄화수소를 이용한 재배열 또는 수소화물 전달을 겪는다. 따라서 반응은 자전(self-propagating) 연쇄 반응을 일으키는 중간체를 재생할 수 있다. 탄화수소는 또한 그 안의 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합의 수를, 선택적으로 0으로, 감소시키도록 처리될 수 있다. 탄화수소는 또한 그 안의 고리 또는 고리형 구조를 제거하거나 또는 없애도록 처리될 수 있다. 탄화수소는 또한 수소:탄소 비를 증가시키도록 처리될 수 있다. 이는 수소의 첨가("수소화") 및/또는 더 작은 탄화수소로 탄화수소의 "크래킹"을 포함할 수 있다.
열적 방법은 탄화수소 크기를 감소시키기 위한 상승 온도 및 압력의 사용을 수반한다. 상승 온도 약 800℃ 및 압력 약 700 kPa이 사용될 수 있다. 이들 조건은 때때로 수소가 풍부한 탄화수소 분자를 말하는데 사용되는 용어인 "경질(light)"(광자 유입과 구별됨)을 생성하는 한편, 또한 축합에 의해 상대적으로 수소가 고갈된 더 중질의 탄화수소 분자를 생성한다. 방법은 등방성 또는 대칭적 파괴를 제공하며, 알켄을 생성하는데, 이는 선택적으로 상기 기재한 바와 같이 효소적으로 포화될 수 있다.
촉매적 및 열적 방법은 탄화수소 가공 및 오일 정련을 위한 식물에서의 표준이다. 따라서 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포에 의해 생성된 탄화수소는 통상적인 수단을 통해 수집되고, 가공되거나 또는 정련될 수 있다. 미세조류 생성 탄화수소의 수소화분해에 대한 보고에 대해 문헌[Hillen et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV:193-205 (1982)]을 참조한다. 대안의 실시형태에서, 분획은 다른 촉매, 예를 들어 유기 화합물, 열 및/또는 무기 화합물로 처리된다. 바이오디젤로 지질을 가공하기 위해, 에스테르교환 공정이 이하의 부문에서 기재되는 바와 같이 사용된다.
본 발명의 방법을 통해 생성된 탄화수소는 다양한 산업적 적용분야에서 유용하다. 예를 들어, 거의 모든 유형의 세정제 및 세정용 제조물에서 사용되는 음이온성 계면활성제인 선형 알킬벤젠 설포네이트(linear alkylbenzene sulfonate: LAS)의 생성은 일반적으로 10개 내지 14개의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소를 이용한다. 예를 들어, US 특허 제6,946,430호; 제5,506,201호; 제6,692,730호; 제6,268,517호; 제6,020,509호; 제6,140,302호; 제5,080,848호; 및 제5,567,359호를 참조한다. LAS와 같은 계면활성제는 퍼스널 케어 조성물 및 세정제, 예를 들어 US 특허 제5,942,479호; 제6,086,903호; 제5,833,999호; 제6,468,955호; 및 제6,407,044호에 기재된 것의 제조에서 사용될 수 있다.
바이오디젤, 재생 디젤, 및 제트 연료와 같은 연료에서 생물학적 유래의 탄화수소 성분 사용과 관련된 관심이 증가되었는데, 이는 화석 연료로부터 유래된 출발 물질을 대체할 수 있는 재생 생물학적 출발 물질이 이용가능하며, 이의 사용이 바람직하기 때문이다. 생물학적 물질로부터 탄화수소 성분을 생성하기 위한 방법에 대한 긴급한 필요가 있다. 본 발명은 바이오디젤, 재생 디젤, 및 제트 연료를 생산하기 위해 생물학적 물질로서 본 발명에 기재된 방법에 의해 생성된 지질을 사용하여 바이오디젤, 재생 디젤, 및 제트 연료를 생성하는 방법을 제공함으로써 이러한 필요를 충족시킨다.
전통적인 디젤 연료는 파라핀 탄화수소가 풍부한 석유 증류물이다. 이들은 비등 범위가 370℉ 내지 780℉만큼 넓은데, 이는 디젤 엔진 차량과 같은 압축 점화 엔진에서 연소에 적합하다. 미국 재료 시험 협회(American Society of Testing and Materials: ASTM)는 기타 다른 연료 특성, 예를 들어 세탄가, 혼탁점, 인화점, 점성도, 아닐린점, 황 함량, 물 함량, 회분 함량, 동판부식, 및 탄소 잔기의 허용가능한 범위에 덧붙여 비등 범위에 따른 디젤 등급을 확립한다. 기술적으로, 바이오매스로부터 유래된 임의의 탄화수소 증류 물질 또는 적절한 ASTM 사양을 충족시키는 다른 것은, 그것이 지방산 메틸 에스테르(ASTM D6751)라면, 디젤 연료(ASTM D975), 제트 연료(ASTM D1655)로서 또는 바이오디젤로서 정해질 수 있다.
추출 후, 본 명세서에 기재된 미생물 바이오매스로부터 회수된 지질 및/또는 탄화수소 성분은 디젤 차량 및 제트 엔진에서의 이용을 위한 연료를 제조하기 위한 화학적 처리를 받을 수 있다.
바이오디젤은 생산 공급 원료에 따라서 색이 (금색 내지 진한 갈색으로) 변하는 액체이다. 이것은 사실상 물과 혼합되지 않으며, 고비등점 및 저증기압을 가진다. 바이오디젤은 디젤 엔진 차량에서의 사용을 위한 디젤 동등물 처리 연료를 말한다. 바이오디젤은 생물분해성이며, 비독성이다. 통상적인 디젤 연료 이상의 바이오디젤의 추가적인 이점은 더 낮은 엔진마모이다. 통상적으로, 바이오디젤은 C14 내지 C18 알킬 에스테르를 포함한다. 다양한 공정은 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성되고 단리된 바이오매스 또는 지질을 디젤 연료로 전환시킨다. 바이오디젤을 생성하기 위한 바람직한 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 지질의 에스테르교환에 의한 것이다. 바이오디젤로서의 사용을 위한 바람직한 알킬 에스테르는 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르이다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 바이오디젤은 대부분의 현대적인 디젤 엔진 차량에서 임의의 농도로 통상적인 디젤 연료와 배합되거나 또는 단독으로 사용될 수 있다. 통상적인 디젤 연료(석유 디젤)과 배합되었을 때, 바이오디젤은 약 0.1% 내지 약 99.9%로 존재할 수 있다. 전세계적으로 임의의 연료 혼합물에서 바이오디젤의 양을 언급하기 위해 "B" 인자로서 알려진 시스템을 사용한다. 예를 들어, 20% 바이오디젤을 함유하는 연료는 B20으로 표지된다. 순수한 바이오디젤은 B100으로서 지칭된다.
바이오디젤은 오일이 풍부한 바이오매스에 함유된 트리글리세리드의 에스테르교환에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양태에서 바이오디젤의 생성을 위한 방법이 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 바이오디젤을 생성하는 방법은 (a) 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 지질 함유 미생물유기체를 배양하는 단계, (b) 지질-함유 미생물유기체를 용해시켜 용해물을 생성하는 단계, (c) 용해된 미생물유기체로부터 지질을 단리시키는 단계, 및 (d) 지질 조성물을 에스테르교환시키고, 이에 의해 바이오디젤이 생성되는 단계를 포함한다. 미생물유기체의 성장을 위한 방법, 즉, 미생물유기체를 용해시켜 용해물을 생성하는 단계, 유기 용매를 포함하는 배지에서 용해물을 처리하여 불균질 혼합물을 형성하는 단계 및 처리한 용해물을 지질 조성물로 분리시키는 단계가 상기 기재되었고, 또한 바이오디젤의 생성방법에서 사용될 수 있다. 바이오디젤의 지질 프로파일은 보통 공급 원료 오일의 지질 프로파일과 고도로 유사하다.
지질 조성물은 에스테르교환되어 바이오디젤로서 유용한 장쇄 지방산 에스테르를 수득할 수 있다. 바람직한 에스테르교환 반응은 이하에 약술되며, 염기 촉진된 에스테르교환 및 재조합 리파제를 사용하는 에스테르교환을 포함한다. 염기 촉진된 에스테르교환 공정에서, 트리아실글리세리드는 알칼리성 촉매, 통상적으로 수산화칼륨의 존재 하에서 메탄올 또는 에탄올과 같은 알코올과 반응된다. 이 반응은 메틸 또는 에틸 에스테르 및 부산물로서 글리세린(글리세롤)을 형성한다.
또한 염기 대신 리파제와 같은 효소를 사용하여 상기 논의한 바와 같은 에스테르교환이 수행되었다. 리파제 촉진된 에스테르교환은, 예를 들어 실온 내지 80℃의 온도에서, 및 TAG 대 저급 알코올의 몰비 1:1 초과, 바람직하게는 약 3:1에서 수행될 수 있다. 에스테르교환에서 사용에 적합한 리파제는 표 9에 열거된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 에스테르교환에 유용한 리파제의 다른 예는, 예를 들어 U.S. 특허 제4,798,793호; 제4,940,845호; 제5,156,963호; 제5,342,768호; 제5,776,741호 및 WO 제89/01032호에서 발견된다. 이와 같은 리파제는 리조푸스(Rhizopus), 아스퍼질러스(Aspergillus), 칸디다(Candida), 무코르(Mucor), 슈도모나스(Pseudomonas), 리조무코르(Rhizomucor), 칸디다(Candida) 및 후미콜라(Humicola)의 미생물유기체에 의해 생성된 리파제 및 췌장 리파제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
바이오디젤이 특히 저온에서 사용된다면, 후속 공정이 또한 사용될 수 있다. 이와 같은 공정은 동결방지처리(winterization) 및 분획화를 포함한다. 이들 공정은 둘 다 혼탁점(바이오디젤이 결정화를 시작하는 온도)을 낮춤으로써 연료의 저온 흐름 및 동절기 성능을 개선시키도록 설계된다. 바이오디젤을 동결방지 하기 위한 몇몇 접근법이 있다. 하나의 접근법은 바이오디젤을 석유 디젤과 배합하는 것이다. 다른 접근법은 바이오디젤의 혼탁점을 낮출 수 있는 첨가제를 사용하는 것이다. 다른 접근법은 무차별적으로 첨가제에서 혼합하고 포화물의 결정화를 가능하게 한 다음, 결정을 여과시킴으로써 포화 메틸 에스테르를 제거하는 것이다. 분획화는 메틸 에스테르를 개개의 성분 또는 분획으로 선택적으로 분리시키며, 이는 특이적 메틸 에스테르를 제거하거나 또는 포함시키는 것을 가능하게 한다. 분획화 방법은 우레아 분획화, 용매 분획화 및 열 증류를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 제공되는 다른 가치있는 연료는 재생 디젤인데, 이는 알칸, 예를 들어 C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 및 C18:0을 포함하고, 따라서 바이오디젤과 구별할 수 있다. 고품질 재생 디젤은 ASTM D975 표준에 따른다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 재생 디젤을 생성하기 위한 공급 원료로서 작용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양태에서, 재생 디젤을 생성하는 방법이 제공된다. 재생 디젤은 적어도 3가지 공정, 즉 수열 공정(수소처리); 수소화 공정; 및 간접적 액화에 의해 생성될 수 있다. 이들 공정은 비에스테르 증류물을 산출한다. 이들 공정 동안, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성되고 단리된 트리아실글리세리드는 알칸으로 전환된다.
일 실시형태에서, 재생 디젤을 생성하는 방법은 (a) 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 지질 함유 미생물유기체를 배양하는 단계, (b) 미생물유기체를 용해해서 용해물을 생성하는 단계, (c) 용해된 미생물유기체로부터 지질을 단리시키는 단계, 및 (d) 지질을 탈산소화 및 수소처리하여 알칸을 생성함으로써, 재생 디젤이 생성되는 단계를 포함한다. 재생 디젤을 제조하는데 적합한 지질은 헥산과 같은 유기 용매를 사용하여 미생물 바이오매스로부터의 추출을 통해, 또는 US 특허 제5,928,696호에 기재된 것과 같은 기타 다른 방법을 통해 얻어질 수 있다. 일부 적합한 방법은 기계적 압축 및 원심분리를 포함할 수 있다.
일부 방법에서, 미생물 지질은 우선 수소처리와 함께 크래킹되어 탄소 사슬 길이 및 포화 이중 결합을 각각 감소시킨다. 그 다음에 재료는 또한 수소처리와 함께 이성질화된다. 그 다음 나프타 분획은 증류를 통해 제거된 후 추가적인 증류로 증발되고, ASTM D975 표준을 충족시키도록 디젤 연료 중에서 원하는 성분을 증류시키는 한편, D975 표준을 충족시키기 위해 요구되는 것보다 더 중질의 성분을 남겨둘 수 있다. 트리글리세리드 오일을 포함하는 오일을 화학적으로 개질하는 수소처리, 수소크래킹, 탈산소화 및 이성질화 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 유럽특허출원 EP제1741768호(A1); EP제1741767호(A1); EP제1682466호(A1); EP제1640437호(A1); EP제1681337호(A1); EP제1795576호(A1); 및 U.S. 특허 제7,238,277호; 제6,630,066호; 제6,596,155호; 제6,977,322호; 제7,041,866호; 제6,217,746호; 제5,885,440호; 제6,881,873호를 참조한다.
재생 디젤을 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 지질을 처리하여 알칸을 생성하는 것은 지질 조성물의 수소처리에 의해 실행된다. 수열 공정에서, 통상적으로 바이오매스는 상승된 온도 및 압력에서 수중에서 반응되어 오일 및 잔여 고체를 형성한다. 전환 온도는 통상적으로 300℉ 내지 660℉ 이고, 100 내지 170 표준 대기압(atm)인 압력은 물을 주로 액체로서 유지하는데 충분하다. 반응 시간은 약 15분 내지 30분이다. 반응이 완료된 후, 유기물은 물로부터 분리된다. 이에 의해 디젤에 적합한 증류물이 생성된다.
재생 디젤의 일부 제조방법에서, 트리글리세리드를 처리하는 제1 단계는 수소처리하여 이중 결합을 포화시킨 후, 수소 및 촉매의 존재 하에서 상승된 온도에서 탈산소화하는 것이다. 일부 방법에서, 수소화 및 탈산소화는 동일한 반응에서 일어난다. 기타 다른 방법에서, 탈산소화는 수소화 전에 일어난다. 그 다음 이성질화는 또한 수소 및 촉매의 존재 하에서 선택적으로 실행된다. 나프타 성분은 바람직하게 증류를 통해 제거된다. 예를 들어, U.S. 특허 제5,475,160호(트리글리세리드의 수소화); 제5,091,116호(탈산소화, 수소화 및 가스 제거); 제6,391,815호(수소화); 및 제5,888,947호(이성질화)를 참조한다.
트리글리세리드의 수소화를 위한 하나의 적합한 방법은 구리, 아연, 마그네슘 및 란탄염의 수용액 및 알칼리금속 또는 바람직하게는 탄산암모늄의 다른 용액을 제조하는 단계를 포함한다. 두 용액은 약 20℃ 내지 약 85℃의 온도로 가열될 수 있고, 침전 용기 내 pH가 5.5 내지 7.5에서 유지되어 촉매를 형성하는 비율에서 침전 용기 내로 함께 계량된다. 추가적인 물은 초기에 침전 용기에서 사용되거나 또는 염 용액 및 침전 용액과 동시에 첨가될 수 있다. 그 다음에 생성된 침전물은 철저히 세척되고, 건조되며, 약 300℃에서 하소되고, 약 100℃ 내지 약 400℃ 범위의 온도에서 수소 중에서 활성화될 수 있다. 그 다음에 하나 이상의 트리글리세리드는 반응기에서 상기 기재한 촉매의 존재 하에서 수소와 접촉되고 반응될 수 있다. 반응기는 삼상층(trickle bed) 반응기, 고정층 기체 고체 반응기, 충진 기포탑 반응기, 연속적으로 교반되는 탱크 반응기, 슬러리상 반응기 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 다른 적합한 반응기 유형일 수 있다. 공정은 배취식 또는 연속적 방식으로 수행될 수 있다. 반응 온도는 통상적으로 약 170℃ 내지 약 250℃의 범위에 있는 한편, 반응 압력은 통상적으로 약 300 psig 내지 약 2000 psig의 범위에 있다. 게다가, 본 발명의 공정에서 수소 대 트리글리세리드의 몰비는 통상적으로 약 20:1 내지 약 700:1의 범위에 있다. 공정은 통상적으로 약 0.1 hr-1 내지 약 5 hr-1의 범위에서 시중량공간속도(weight hourly space velocity: WHSV)에서 수행된다. 당업자는 반응을 위해 필요한 일정 시간이 사용되는 온도, 수소 대 트리글리세리드의 몰비 및 수소의 부분압에 따라서 다를 것이라는 것을 인식할 것이다. 이와 같은 수소화 공정에 의해 생성된 생성물은 지방 알코올, 글리세롤, 미량의 파라핀 및 미반응 트리글리세리드를 포함한다. 이들 생성물은 통상적으로, 예를 들어 증류, 추출, 여과, 결정화 등과 같은 통상적인 수단에 의해 분리된다.
석유 정련기는 수소로 공급물을 처리함으로써 불순물을 제거하는 수소첨가를 사용한다. 수소화 공정 전환 온도는 통상적으로 300℉ 내지 700℉이다. 압력은 통상적으로 40 atm 내지 100 atm이다. 반응 시간은 통상적으로 10분 내지 60분의 순서이다. 고체 촉매는 특정 반응 속도를 증가시키고, 특정 생성물에 대한 선택성을 개선시키며, 수소 소모를 최적화하는데 사용된다.
오일의 탈산소화에 적합한 방법은 약 350℉ 내지 약 550℉의 범위에서의 온도로 오일을 가열하는 단계 및 적어도 약 5분 동안 적어도 거의 대기압으로부터 대기압 초과의 범위에 있는 압력 하에서 질소와 가열된 오일을 연속적으로 접촉시키는 단계를 포함한다.
이성질화에 적합한 방법은 알칼리 이성질화 및 당업계에 공지된 기타 다른 오일 이성질화를 사용하는 단계를 포함한다.
수소처리 및 수소화공정은 궁극적으로 트리글리세리드 공급물의 분자량 감소를 야기한다. 트리글리세리드 분자는 수소화 공정 조건 하에서 4가지 탄화수소 분자, 즉 프로판 분자 및 통상적으로 C8 내지 C18 범위에 있는 3가지 중질 탄화수소 분자로 환원된다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 지질 조성물 상에서 실행된 하나 이상의 화학 반응(들)의 생성물은 ASTM D975 재생 디젤을 포함하는 알칸 혼합물이다. 미생물유기체에 의한 탄화수소의 생성은 문헌[Metzger et al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66: 486-496] 및 [A Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann and Paul Roessler (1998)]에서 검토된다.
디젤 연료의 증류 특성은 T10 내지 T90에 대해 기재된다(각각 10% 및 90%에서의 온도, 증류된 용적). 실시예 13에서 생성된 물질의 T10 내지 T90은 57.9℃였다. 수소처리, 이성질화, 및 본 명세서에 개시된 오일의 기타 다른 공유적 개질 방법 및 본 명세서에 개시된 증류 및 분획화(예를 들어, 빙점 여과) 방법은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 생성된 트리글리세리드 오일을 사용하여 기타 다른 T10 내지 T90 범위, 예를 들어 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 60℃ 및 65℃로 재생 디젤 조성물을 생성하는데 사용될 수 있다.
수소처리, 이성질화, 및 본 명세서에 개시된 오일의 기타 다른 공유적 개질 방법 및 본 명세서에 개시된 증류 및 분획화(예를 들어, 빙점 여과) 방법은 기타 다른 T10값, 예를 들어 180 내지 295, 190 내지 270, 210 내지 250, 225 내지 245, 및 적어도 290의 T10을 가지는 재생 디젤 조성물을 생성하는데 사용될 수 있다.
수소처리, 이성질화, 및 본 명세서에 개시된 오일의 기타 다른 공유적 개질 방법 및 본 명세서에 개시된 증류 및 분획화(예를 들어, 빙점 여과) 방법은 특정 T90 값, 예를 들어 280 내지 380, 290 내지 360, 300 내지 350, 310 내지 340, 및 적어도 290 의 T90을 가지는 재생 디젤 조성물을 생성하는데 사용될 수 있다.
실시예 13에서 생성된 재료의 FBP는 300℃였다. 수소처리, 이성질화, 및 본 명세서에 개시된 오일의 기타 다른 공유적 개질 방법 및 본 명세서에 개시된 증류 및 분획화(예를 들어, 빙점 여과) 방법은 기타 다른 FBP 값, 예를 들어 290 내지 400, 300 내지 385, 310 내지 370, 315 내지 360, 및 적어도 300의 FBP를 가지는 재생 디젤 조성물을 생성하는데 사용될 수 있다.
(a) 적어도 1% 내지 5%, 바람직하게는 적어도 4%, C8 내지 C14; (b) 적어도 0.25% 내지 1%, 바람직하게는 적어도 0.3%, C8; (c) 적어도 1% 내지 5%, 바람직하게는 적어도 2%, C10; (d) 적어도 1% 내지 5%, 바람직하게는 적어도 2%, C12; 및 (3) 적어도 20% 내지 40%, 바람직하게는 적어도 30% C8 내지 C14를 포함하는 지질 프로파일을 가지는 오일을 포함하여, 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 제공된 기타 다른 오일에 수소처리, 이성질화 및 기타 다른 공유적 개질의 조합이 실시될 수 있다.
전통적인 초 저황 디젤은 2단계 공정에 의해 임의의 형태의 바이오매스로부터 생성될 수 있다. 우선, 바이오매스는 합성가스, 수소 및 일산화탄소가 풍부한 가스 혼합물로 전환된다. 그 다음에 합성가스는 액체로 촉매적으로 전환된다. 통상적으로, 액체의 생성은 피셔-트로프슈(Fischer-Tropsch: FT) 합성을 사용하여 수행된다. 이 기법은 석탄, 천연가스 및 중질 오일에 적용된다. 따라서, 재생 디젤을 생산하는 방법의 또 다른 바람직한 실시형태에서, 알칸을 생성하기 위해 지질 조성물을 처리하는 것은 지질 조성물의 간접적 액화에 의해 실행된다.
본 발명은 또한 제트 연료를 생산하는 방법을 제공한다. 제트 연료는 투명한 색 내지 볏짚색이다. 가장 흔한 연료는 국제적으로 표준화된 사양 세트로 생산된 Aeroplane A-1로서 분류되는 무연/파라핀 오일계 연료이다. 제트 연료는 가능하게는 1000가지 이상만큼 많은 매우 다수의 상이한 탄화수소 혼합물이다. 탄화수소의 크기 범위(분자량 또는 탄소수)는 생성물에 대한 필요조건, 예를 들어 빙점 또는 발연점에 의해 제한된다. 케로손형(Kerosone-type) 항공기 연료(제트 A 및 제트 A-1을 포함함)는 약 8개 내지 16개의 탄소수의 탄소수 분포를 가진다. 와이드-컷 또는 나프타형 항공기 연료(제트 B를 포함함)는 통상적으로 약 5개 내지 15개의 탄소의 탄소수 분포를 가진다.
본 발명의 일 실시형태에서, 제트 연료는 기존의 제트 연료와 조류 연료를 배합함으로써 생성된다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 제트 연료를 생산하기 위한 공급 원료로서 작용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양태에서, 제트 연료를 생산하는 방법이 제공된다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 지질로부터 제트 연료를 생산하는 2가지의 방법, 즉 유동 촉매성 크래킹(fluid catalytic cracking: FCC); 및 수소화탈산소(hydrodeoxygenation: HDO)가 본 명세서에 제공된다.
유동 촉매성 크래킹(FCC)은 올레핀을, 특히 중질의 미정제 분획으로부터 프로필렌을 생성하는데 사용되는 하나의 방법이다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 지질은 올레핀으로 전환될 수 있다. 공정은 FCC 구역을 통해 생성된 지질을 유동시키는 단계 및 제트 연료로서 유용한 올레핀으로 구성된 생성물 스트림을 수집하는 단계를 수반한다. 생성된 지질은 크래킹 조건에서 크래킹 촉매와 접촉되어 제트 연료로서 유용한 올레핀 및 탄화수소를 포함하는 생성물 스트림을 제공한다.
일 실시형태에서, 제트 연료를 생산하는 방법은 (a) 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 지질 함유 미생물유기체를 배양하는 단계, (b) 지질 함유 미생물유기체를 용해시켜 용해물을 생성하는 단계, (c) 용해물로부터 지질을 단리시키는 단계, 및 (d) 지질 조성물을 처리함으로써 제트 연료가 생성되는 단계를 포함한다. 제트 연료를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 지질 조성물은 유동 촉매성 크래킹 구역을 통해 유동될 수 있는데, 유동 촉매성 크래킹 구역은, 일 실시형태에서, 크래킹 조건에서 크래킹 촉매와 지질 조성물을 접촉시켜 C2-C5 올레핀을 포함하는 생성물 스트림을 제공하는 단계를 포함할 수 있다.
본 방법의 특정 실시형태에서, 지질 조성물에 존재할 수 있는 임의의 오염물질을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 유동 촉매성 크래킹 구역을 통해 지질 조성물을 유동시키기 전에, 지질 조성물은 전처리된다. 전처리는 지질 조성물을 이온 교환 수지와 접촉시키는 단계를 수반할 수 있다. 이온 교환 수지는 산성 이온 교환 수지, 예를 들어 AmberlystTM-15이고 반응기에서 층으로서 사용될 수 있으며, 이를 통해 지질 조성물이 상류로 또는 하류로 유동된다. 기타 다른 전처리는 산, 예를 들어 황산, 아세트산, 질산 또는 염산과 지질 조성물을 접촉시키는 것에 의한 약산 세척을 포함할 수 있다. 보통 주위 온도 및 대기압에서 묽은 산 용액과의 접촉이 행해진다.
선택적으로 전처리된 지질 조성물은 탄화수소 성분이 올레핀으로 크래킹되는 FCC 구역으로 유동된다. 촉매성 크래킹은 미세하게 분열된 미립자 물질로 구성된 촉매와 반응 구역 내 지질 조성물을 접촉시킴으로써 수행된다. 반응은 수소화크래킹과 대조적으로 촉매성 크래킹이고, 첨가되는 수소 또는 수소의 소모가 없을 때 수행된다. 크래킹 반응이 진행됨에 따라, 상당한 양의 코크스가 촉매 상에 침착된다. 촉매는 재생 구역 내 촉매로부터 코크스를 연소시킴으로써 고온에서 재생된다. 본 명세서에서 "코크스 촉매"로서 지칭되는 코크스 함유 촉매는 반응 구역으로부터 재생 구역으로 연속적으로 이동되어서 재생되고, 재생 구역으로부터 본질적으로 코크스가 없는 재생 촉매에 의해 대체된다. 다양한 가스 스트림에 의한 촉매 입자의 유동화는 반응 구역과 재생 구역 간에 촉매의 이동을 가능하게 한다. 촉매의 유동 스트림 내에서 탄화수소, 예를 들어 본 명세서에 기재된 지질 조성물의 탄화수소의 크래킹, 반응 구역과 재생 구역 간에 촉매의 이동, 및 재생기에서 코크스의 연소를 위한 방법은 FCC 공정 업계에서 당업자에 의해 잘 공지되어 있다. 지질 조성물을 크래킹하여 C2-C5 올레핀을 생성하는데 유용한 예시적인 FCC 적용 및 촉매는 본 명세서에 전체가 참조로서 포함되어 있는 U.S. 특허 제6,538,169호, 제7,288,685호에 기재되어 있다.
적합한 FCC 촉매는 일반적으로 동일한 매트릭스 상에 있을 수 있거나 있지 않을 수도 있는 적어도 2가지의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 두 성분은 모두 전체 반응 용기를 통해 순환될 수 있다. 제1 성분은 일반적으로 활성 무정형 점토형 촉매 및/또는 고활성, 결정질 분자체와 같은 유동화된 촉매성 크래킹의 분야에서 사용되는 잘 공지된 촉매 중 임의의 것을 포함한다. 분자체 촉매는 원하는 생성물에 대한 훨씬 개선된 선택성 때문에 무정형 촉매 이상으로 바람직할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 제올라이트는 FCC 공정에서 분자체로서 사용될 수 있다. 바람직하게, 제1 촉매 성분은 거대 기공 제올라이트, 예를 들어 Y형 제올라이트, 활성 알루미나 재료, 실리카 또는 알루미나 및 카올린과 같은 비활성 충전제를 포함하는 결합제 재료를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 지질 조성물의 크래킹은 FCC 구역의 라이저 부문 또는 대안적으로, 리프트 부문에서 일어난다. 지질 조성물은 노즐에 의해 라이저 내로 도입되면, 그 결과 지질 조성물의 빠른 증발이 일어난다. 촉매와 접촉 전, 지질 조성물은 보통 약 149℃ 내지 약 316℃(300℉ 내지 600℉)의 온도를 가질 것이다. 촉매는 배합 용기로부터, 촉매가 약 2초 이하의 시간 동안 지질 조성물과 접촉되는 라이저까지 유동된다.
그 다음에 배합된 촉매 및 반응된 지질 조성물 증기는, 이어서, 배출구를 통해 라이저의 상부로부터 배출되고, 상당한 양의 코크스로 뒤덮이고 일반적으로 "코크스 촉매"로서 지칭되는 촉매 입자의 수집물 및 올레핀을 포함하는 크래킹된 생성물 증기 스트림으로 분리된다. 원하는 생성물의 원치않는 기타 다른 생성물로 추가적인 전환을 촉진할 수 있는 촉매와 지질 조성물의 접촉 시간을 최소화하기 위한 노력에서, 스월 암(swirl arm) 배치와 같은 세퍼레이터의 임의의 배치는 생성물 스트림으로부터 코크스 촉매를 빠르게 제거하는데 사용될 수 있다. 세퍼레이터, 예를 들어 스월 암 세퍼레이터는 챔버의 상부에 위치되며, 스트리핑 구역은 챔버의 하부에 위치된다. 스월 암 배치에 의해 분리된 촉매는 스트리핑 구역으로 내려간다. 경질 올레핀 및 일부 촉매를 포함하는 크래킹된 탄화수소를 포함하는 크래킹된 생성물 증기 스트림은 사이클론과 연통되는 관을 통해 챔버를 나간다. 사이클론은 남아있는 촉매 입자를 생성물 증기 스트림으로부터 제거하여 입자 농도를 매우 낮은 수준으로 감소시킨다. 그 다음에 생성물 증기 스트림은 분별 용기의 상부를 나간다. 사이클론에 의해 분리된 촉매는 분리 용기로 되돌아온 다음, 스트리핑 용기로 되돌아온다. 스트리핑 구역은 흡착된 탄화수소를 스팀과의 역류 접촉에 의해 촉매의 표면으로부터 제거한다.
저탄화수소 부분압은 경질 올레핀의 생성에 유리하게 작동한다. 따라서, 라이저 압력은 약 172 kPa 내지 241 kPa(25 psia 내지 35 psia)이며, 탄화수소 부분압은 약 35 kPa 내지 172 kPa(5 psia 내지 25 psia)이고, 바람직한 탄화수소 부분압은 약 69 kPa 내지 138 kPa(10 psia 내지 20 psia)로 설정된다. 희석제가 지질 조성물 10중량% 내지 55중량% 및 바람직하게는 지질 조성물 약 15중량%인 정도로 희석제로서 스팀을 사용하여 탄화수소에 대해 이러한 상대적으로 낮은 부분압이 달성된다. 건성 가스와 같은 기타 다른 희석제가 동등한 탄화수소 부분압에 도달하는데 사용될 수 있다.
라이저 배출구에서 크래킹된 스트림의 온도는 약 510℃ 내지 621℃(950℉ 내지 1150℉)이다. 그러나, 566℃(1050℉) 초과의 라이저 배출구 온도는 더 많은 건성 가스 및 더 많은 올레핀을 만든다. 반면, 566℃(1050℉) 미만의 라이저 배출구 온도는 더 적은 에틸렌 및 프로필렌을 만든다. 따라서, 바람직한 온도 약 566℃ 내지 약 630℃, 바람직한 압력 약 138 kPa 내지 약 240 kPa(20 psia 내지 35 psia)에서 FCC 공정을 실행하는 것이 바람직하다. 공정을 위한 다른 조건은 약 5 내지 약 20, 및 바람직하게는 약 10 내지 약 15에서 변할 수 있는 촉매 대 지질 조성물 비이다.
제트 연료를 생성하는 방법의 일 실시형태에서, 지질 조성물은 FCC 반응기의 리프트 부문에 도입된다. 리프트 부문 내 온도는 매우 뜨거우며, 약 700℃(1292℉) 내지 약 760℃(1400℉)의 범위에 있고, 촉매 대 지질 조성물 비는 약 100 내지 약 150일 것이다. 리프트 부문 내로 지질 조성물을 도입하는 것은 상당한 양의 프로필렌 및 에틸렌을 생성할 것으로 기대된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 지질 조성물 또는 지질을 사용하여 제트 연료를 생성하는 방법의 다른 실시형태에서, 지질 조성물 또는 지질의 구조는 수소화탈산소(hydrodeoxygenation: HDO)로서 지칭되는 공정에 의해 파괴된다. HDO는 수소에 의한 산소의 제거를 의미하며, 즉 산소는 제거되는 한편, 재료의 구조를 파괴한다. 올레산 이중 결합은 수소화되고, 임의의 황 및 질소 화합물은 제거된다. 황 제거는 수소화탈황(hydrodesulphurization: HDS)으로 불린다. 원재료(지질 조성물 또는 지질)의 전처리 및 순도는 촉매의 내용년수(service life)에 기여한다.
일반적으로 HDO/HDS 단계에서, 수소는 공급 원료(지질 조성물 또는 지질)와 혼합된 다음, 혼합물은 병류(co-current flow)로서, 단일상 또는 2상 공급 원료로서 촉매층을 통과한다. HDO/MDS 단계 후에, 생성물 분획은 분리되고, 별개의 이성질화 반응기로 통과한다. 생물학적 출발 물질에 대한 이성질화 반응기는 문헌(FI 100 248)에서 병류 반응기로서 기재되어 있다.
탄화수소 공급물, 예를 들어 본 명세서의 지질 조성물 또는 지질을 수소화시킴으로써 연료를 생성하기 위한 공정은 또한 수소 가스와의 병류로서 지질 조성물 또는 지질을 제1 수소화 구역을 통해 통과시킴으로써 실행될 수 있고, 그 이후에 탄화수소 배출물은 수소 가스를 탄화수소 배출물에 대한 역류로서 제2 수소화 구역으로 통과시킴으로써 제2 수소화 구역에서 추가로 수소화된다. C2-C5 올레핀을 생성하기 위해 지질 조성물을 크래킹하는데 유용한 예시적인 HDO 적용 및 촉매는 본 명세서에 전문이 참조로서 포함되어 있는 U.S. 특허 제7,232,935호에 기재되어 있다.
통상적으로, 수소화탈산소 단계에서, 본 명세서의 지질 조성물 또는 지질과 같은 생물학적 성분의 구조는 분해되고, 산소, 질소, 인 및 황 화합물 및 기체로서의 경질 탄화수소는 제거되며, 올레핀 결합은 수소화된다. 공정의 제2 단계에서, 즉 소위 이성질화 단계에서, 이성질화는 탄화수소 사슬을 분기시키고, 저온에서 파라핀 성능을 개선시키기 위해 수행된다.
제1 단계, 즉 크래킹 공정의 HDO 단계에서, 수소 가스 및 수소화되어야 하는 본 명세서의 지질 조성물 또는 지질은 병류 또는 역류로서 HDO 촉매층 시스템으로 통과하는데, 상기 촉매층 시스템은 하나 이상의 촉매층(들), 바람직하게는 1개 내지 3개의 촉매층을 포함한다. HDO 단계는 통상적으로 병류 방식으로 작동된다. 2개 이상의 촉매층을 포함하는 HDO 촉매층 시스템의 경우에, 층 중 하나 이상은 역류 원리를 사용하여 작동될 수 있다. HDO 단계에서, 압력은 20 bar 내지 150 bar, 바람직하게는 50 bar 내지 100 bar에서 변하고, 온도는 200℃ 내지 500℃, 바람직하게는 300℃ 내지 400℃의 범위에서 변한다. HDO 단계에서, 주기율표의 VII족 및/또는 VIB족으로부터의 금속을 함유하는 공지된 수소화 촉매가 사용될 수 있다. 바람직하게, 수소화 촉매는 지지된 Pd, Pt, Ni, NiMo 또는 CoMo 촉매이고, 지지체는 알루미나 및/또는 실리카이다. 통상적으로, NiMo/Al2O3 및 CoMo/Al2O3 촉매가 사용된다.
HDO 단계 전에, 본 명세서의 지질 조성물 또는 지질은 선택적으로 더 온화한 조건 하에서 예비 수소화에 의해 처리되고, 따라서 이중 결합의 부반응을 회피할 수 있다. 이와 같은 예비 수소화는 온도 50℃ 내지 400℃에서 및 수소압력 1 bar 내지 200 bar에서, 바람직하게는 온도 150℃ 내지 250℃에서 및 수소압력 10 bar 내지 100 bar에서 예비수소화 촉매의 존재 하에서 수행된다. 촉매는 주기율표의 VIII족 및/또는 VIB족으로부터의 금속을 함유할 수 있다. 바람직하게, 예비수소화 촉매는 지지된 Pd, Pt, Ni, NiMo 또는 CoMo 촉매이며, 지지체는 알루미나 및/또는 실리카이다.
수소를 함유하는 HDO 단계로부터의 가스 스트림은 냉각된 다음, 일산화탄소, 이산화탄소, 질소, 인 및 황 화합물, 가스 경질 탄화수소 및 기타 다른 불순물이 그것으로부터 제거된다. 압축된 후, 정제된 수소 또는 재순환된 수소는 제1 촉매층으로 및/또는 촉매층 사이로 다시 되돌아가서 회수되는 가스 스트림을 구성한다. 축합된 액체로부터 물은 제거된다. 액체는 제1 촉매층으로 또는 촉매층 사이로 통과된다.
HDO 단계 후에, 생성물에 이성질화 단계가 실시된다. 공정에 있어서 실질적으로, 탄화수소가 이성질화 촉매와 접촉되기 전에 가능하면 완전하게 불순물이 제거된다. 이성질화 단계는 선택적 스트리핑 단계를 포함하되, HDO 단계로부터의 반응 생성물은 수증기 또는 적합한 가스, 예를 들어 경질의 탄화수소, 질소 또는 수소를 이용한 스트리핑에 의해 정제될 수 있다. 선택적 스트리핑 단계는 이성질화 촉매 상류의 유닛에서(기체 및 액체는 서로 접촉됨) 또는 역류 원리를 이용하는 별개의 스트리핑 유닛 내 실제 이성질화 반응기 전에 역류 방식으로 수행된다.
스트리핑 단계 후에, 수소 가스 및 본 명세서의 수소화된 지질 조성물 또는 지질, 및 선택적으로 n-파라핀 혼합물은 하나 또는 몇몇 촉매층(들)을 포함하는 반응 이성질화 유닛으로 통과한다. 이성질화 단계의 촉매층은 병류 또는 역류 방식으로 작동할 수 있다.
병류 원리가 이성질화 단계에 적용되는 것이 공정에 대해 중요하다. 이성질화 단계에서, 이는 선택적 스트리핑 단계 또는 이성질화 반응 단계 또는 둘 다를 역류 방식으로 수행함으로써 행해진다. 이성질화 단계에서, 압력은 20 bar 내지 150 bar, 바람직하게는 20 bar 내지 100 bar의 범위에서 변하고, 온도는 200℃ 내지 500℃, 바람직하게는 300℃ 내지 400℃이다. 이성질화 단계에서, 당업계에 공지된 이성질화 촉매가 사용될 수 있다. 적합한 이성질화 촉매는 분자체 및/또는 VII족 금속 및/또는 운반체를 함유한다. 바람직하게, 이성질화 촉매는 SAPO-11 또는 SAPO41 또는 ZSM-22 또는 ZSM-23 또는 페리에라이트 및 Pt, Pd 또는 Ni 및 Al2O3 또는 SiO2를 함유한다. 통상적인 이성질화 촉매는, 예를 들어 Pt/SAPO-11/Al2O3, Pt/ZSM-22/Al2O3, Pt/ZSM-23/Al2O3 및 Pt/SAPO-11/SiO2이다. 이성질화 단계 및 HDO 단계는 동일한 압력 용기에서 또는 별개의 압력 용기에서 수행될 수 있다. 선택적 예비수소화는 별개의 압력 용기에서 또는 동일한 압력 용기에서 HDO 및 이성질화 단계로서 수행될 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 하나 이상의 화학적 반응의 생성물은 HRJ-5를 포함하는 알칸 혼합물이다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 화학적 반응의 생성물은 ASTM D1655 제트 연료를 포함하는 알칸 혼합물이다. 일부 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양에 따르는 조성물은 황 함량이 10 ppm 미만이다. 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료 사양에 따르는 조성물은 증류곡선의 T10 값이 205℃ 미만이다. 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료 사양에 따르는 조성물은 최종 비등점(final boiling point: FBP)이 300℃ 미만이다. 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료 사양에 따르는 조성물은 인화점이 적어도 38℃이다. 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료 사양에 따르는 조성물은 밀도가 775 K/M3 내지 840 K/M3이다. 또 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양에 따르는 조성물은 빙점이 -47℃ 미만이다. 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양에 따르는 조성물은 순연소열(net Heat of Combustion)이 적어도 42.8 MJ/K이다. 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양에 따르는 조성물은 수소 함량이 적어도 13.4질량%이다. 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양에 따르는 조성물은 260℃에서 정량적 무게분석 JFTOT에 의해 시험한 바와 같이 열 안정성이 3 mm Hg 미만이다. 다른 실시형태에서, ASTM 1655 제트 연료의 사양에 따르는 조성물은 실재고무(existent gum)가 7 mg/dl 미만이다.
따라서, 본 발명은 미세조류 지질의 화학적 변형으로 다양한 산업적 및 기타 다른 적용분야에서 유용한 생성물을 산출하는 다양한 방법을 개시한다. 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생성된 오일을 개질하기 위한 공정의 예는 오일의 가수분해, 오일의 수소화 공정, 및 오일의 에스테르화를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 미세조류 지질의 기타 다른 화학적 변형은 에폭시화, 산화, 가수분해, 황산화, 설폰화, 에톡실화, 프로폭실화, 아미드화 및 비누화를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 미세조류 오일의 변형은 원하는 기능을 위한 선택된 유도체 함유 화학 제품으로 추가로 개질될 수 있는 기본적 함유 화학 제품을 생성한다. 연료 생성 공정에 대해 상기 기재한 것과 유사한 방식으로, 이들 화학적 변형이 또한 본 명세서에 기재된 미생물 배양물로부터 생성된 오일에 대해 실행될 수 있다. 기본적 함유 화학 제품의 예는 비누, 지방산, 지방 에스테르, 지방 알코올, 지방 아미드를 포함하는 지방 질소 화합물, 지방산 메틸 에스테르, 및 글리세롤을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 유도체 함유 화학 제품의 예는 지방 니트릴, 에스테르, 다이머산, 쿼즈(quats), 계면활성제, 지방 알칸올아미드, 지방 알코올 설페이트, 수지, 유화제, 지방 알코올, 올레핀, 시추니(drilling mud), 폴리올, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트, 고무, 양초, 화장료, 금속성 비누, 비누, 알파 설폰화된 메틸 에스테르, 지방 알코올 설페이트, 지방 알코올 에톡실레이트, 지방 알코올 에테르 설페이트, 이미다졸린, 계면활성제, 세정제, 에스테르, 쿼즈, 오존 분해 제품, 지방 아민, 지방 알칸올아미드, 에톡시설페이트, 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드(중간쇄 트리글리세리드를 포함함), 윤활제, 유압유, 그리스, 전기 비전도유체, 이형제, 금속작업유, 열전달 유체, 기타 다른 기능성 유체, 산업적 화학 물질(예를 들어, 세정제, 질감 가공 보조제, 가소제, 안정화제, 첨가제), 표면 코팅제, 페인트 및 라커, 전기 배선 절연체 및 고차 알칸을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 글리세로지질로부터의 지방산 구성요소의 가수분해는 기타 다른 유용한 화학 물질을 생성하도록 유도체화될 수 있는 유리 지방산을 산출한다. 가수분해는 물 및 산 또는 염기일 수 있는 촉매의 존재 하에서 일어난다. 유리된 유리 지방산은 유도체화되어 US 특허 제5,304,664호(고도로 황산화된 지방산); 제7,262,158호(세정 조성물); 제7,115,173호(섬유 유연제 조성물); 제6,342,208호(피부 치료용 에멀전); 제7,264,886호(발수 조성물); 제6,924,333호(페인트 첨가제); 제6,596,768호(지질-풍부 반추동물 공급 원료); 및 제6,380,410호(세척제 및 세정제용 계면활성제)에서 보고되는 바와 같은 다양한 생성물을 수득할 수 있다.
일부 방법에서, 화학적 변형의 제1 단계는 이중 결합을 포화하기 위한 수소화 공정 다음에, 수소 및 촉매의 존재 하에 상승된 온도에서의 탈산소화일 수 있다. 기타 다른 방법에서, 수소화 및 탈산소화는 동일 반응에서 일어날 수 있다. 또 기타 다른 방법에서, 탈산소화는 수소화 전에 일어난다. 그 다음에 이성질화가 또한 수소 및 촉매의 존재 하에서 선택적으로 실행될 수 있다. 최종적으로, 가스 및 나프타 성분은 원한다면 제거될 수 있다. 예를 들어, U.S. 특허 제5,475,160호(트리글리세리드의 수소화); 제5,091,116호(탈산소화, 수소화 및 가스 제거); 제6,391,815호(수소화); 및 제5,888,947호(이성질화)를 참조한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 트리글리세리드 오일은 부분적으로 또는 완전히 탈산소화된다. 탈산소 반응은 지방산, 지방 알코올, 폴리올, 케톤 및 알데히드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 원하는 생성물을 형성한다. 일반적으로, 어떤 특정 이론에 구속되는 일 없이, 탈산소화 반응은 수소화 분해, 수소화, 연속적 수소화-수소화 분해, 연속적 수소화 분해-수소화, 및 조합된 수소화-수소화 분해 반응을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 다양한 상이한 반응 경로의 조합을 수반하여, 지방산 또는 지방산 에스테르로부터 산소의 적어도 부분적인 제거를 가져와서 지방 알코올과 같은 반응 생성물을 생성하고, 이는 추가적인 가공에 의해 원하는 화학물질로 용이하게 전환될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 지방 알코올은 FCC 반응을 통해 올레핀으로 또는 축합 반응을 통해 더 고차의 알칸으로 전환될 수 있다.
하나의 이와 같은 화학적 변형은 글리세로지질 또는 유리 지방산의 지방산 구성성분에서 이중 결합에 수소를 첨가하는 수소화이다. 수소화 공정은 액체 오일을 반고체 또는 고형 지방으로의 전환을 허용하는데, 이는 구체적 적용분야에 더 적합하게 될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 오일의 수소화는 US 특허 제7,288,278호(식품 첨가제 또는 의약); 제5,346,724호(윤활 제품); 제5,475,160호(지방 알코올); 제5,091,116호(식용 오일); 제6,808,737호(마가린 및 스프레드에 대한 구조적 지방); 제5,298,637호(감소된 칼로리의 지방 대체물); 제6,391,815호(수소화 촉매 및 황 흡착제); 제5,233,099호 및 제5,233,100호(지방 알코올); 제4,584,139호(수소화 촉매); 제6,057,375호(거품 억제제); 및 제7,118,773호(식용 에멀전 스프레드)에서 보고된 바와 같은 본 명세서에 제공된 방법 및/또는 재료 중 하나 이상과 함께 실행될 수 있다.
당업자는 탄수화물을 수소화하는데 다양한 공정이 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 하나의 적합한 방법은 수소화 반응기에서 충분한 조건 하에 탄수화물을 수소 또는 적합한 가스 및 촉매와 혼합된 수소와 접촉시켜서 수소화된 생성물을 형성하는 단계를 포함한다. 수소화 촉매는 일반적으로 Cu, Re, Ni, Fe, Co, Ru, Pd, Rh, Pt, Os, Ir, 및 이의 합금 또는 임의의 조합물을 단독으로 또는 W, Mo, Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, B, P, Bi, 및 이들의 합금 또는 임의의 조합물과 같은 프로모터와 함께 포함할 수 있다. 기타 다른 효과적인 수소화 촉매 재료는 지지된 니켈, 또는 레늄을 이용하여 개질된 루테늄을 포함한다. 실시형태에서, 수소화 촉매는 또한 촉매의 원하는 기능성에 따라서 지지체 중 어느 하나를 포함한다. 수소화 촉매는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 수소화 촉매는 지지된 VIII족 금속 촉매 및 금속 스펀지 재료(예를 들어, 스펀지 니켈 촉매)를 포함한다. 레이니 니켈은 본 발명에서의 사용에 적합한 활성화된 스펀지 니켈 촉매의 예를 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명에서의 수소화 반응은 니켈-레늄 촉매 또는 텅스텐 개질 니켈 촉매를 포함하는 촉매를 사용하여 수행된다. 본 발명의 수소화 반응을 위한 적합한 촉매의 하나의 예는 탄소-지지 니켈-레늄 촉매이다.
실시형태에서, 적합한 레이티 니켈 촉매는 니켈 및 알루미늄의 중량으로 거의 동일한 양의 합금을, 예를 들어 수산화나트륨 약 25중량%를 함유하는 알칼리 수용액으로 처리함으로써 제조될 수 있다. 알루미늄은 알칼리 수용액에 의해 선택적으로 용해되어서 적은 양의 알루미늄과 함께 대부분 니켈을 포함하는 스폰지형 재료를 생성한다. 초기 합금은 약 1중량% 내지 2중량%가 형성된 스펀지 니켈 촉매 중에 남아있도록 하는 양으로 프로모터 금속(즉, 몰리브덴 또는 크롬)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 수소화 촉매는 수 중에서 루테늄(III) 니트로실니트레이트, 루테늄(III) 클로라이드 용액을 사용하여 제조되어 적합한 지지 재료에 스며들게 한다. 그 다음에 용액은 건조되어 물 함량이 약 1중량% 미만인 고체를 형성한다. 그 다음에 고체는 회전볼 노(rotary ball furnace)에서 4시간 동안 300℃(비하소) 또는 400℃(하소) 수소 스트림에서, 대기압에서 환원될 수 있다. 질소를 이용하여 촉매를 냉각시키고 불활성화 시킨 후, 질소 중의 산소 5용적%를 2시간 동안 촉매 상으로 통과시킨다.
특정 실시형태에서, 기재된 촉매는 촉매 지지체를 포함한다. 촉매 지지체는 촉매를 안정화하고 지지한다. 사용된 촉매 지지체의 유형은 선택된 촉매 및 반응 조건에 좌우된다. 본 발명에 적합한 지지체는 탄소, 실리카, 실리카-알루미나, 지르코니아, 티타니아, 세리아, 바나디아, 질화물, 질화붕소, 헤테로다중산, 하이드록시아파타이트, 산화아연, 크로미아, 제올라이트, 탄소 나노튜브, 탄소 플러렌 및 이들의 임의의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 촉매는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 방법은 초기 습윤, 증발 함침, 화학적 기상 증착, 세척 코팅, 마그네트론 스퍼터링 기법 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않을 수 있다.
수소화 반응을 수행하기 위한 조건은 출발 물질의 유형 및 원하는 생성물에 기반하여 다를 것이다. 당업자는 본 개시내용의 이점에 의해 적절한 반응 조건을 인식할 것이다. 일반적으로, 수소화 반응은 80℃ 내지 250℃, 바람직하게는 90℃ 내지 200℃에서, 가장 바람직하게는 100℃ 내지 150℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 수소화 반응은 500 KPa 내지 14000 KPa의 압력에서 수행된다.
본 발명의 수소화 분해 반응에서 사용되는 수소는 외부 수소, 재순환된 수소, 동일계 내에서 생성된 수소 및 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 “외부 수소”는, 그 자체가 바이오매스 반응으로부터 유래하고 다른 공급원으로부터의 시스템에 첨가되는 수소를 지칭한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 출발 탄수화물을 원하는 더 고차의 탄화수소로 더 용이하게 전환될 보다 작은 분자로 전환시키는 것이 바람직하다. 이러한 전환에 적합한 하나의 방법은 수소화 분해 반응을 통한 것이다. 탄수화물의 수소화 분해를 실행하기 위한 다양한 공정이 공지되어 있다. 하나의 적합한 방법은 수소화 분해 반응기에서 더 작은 분자 또는 폴리올을 포함하는 반응 생성물을 형성하는데 충분한 조건 하에서 수소 또는 적합한 기체와 혼합된 수소 및 수소화 분해 촉매와 탄수화물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 “더 작은 분자 또는 폴리올”은 출발 탄수화물보다 더 적은 수의 탄소 원자 또는 산소 원자를 포함할 수 있는 더 적은 분자량을 갖는 임의의 분자를 포함한다. 실시형태에서, 반응 생성물은 폴리올 및 알코올을 포함하는 더 작은 분자를 포함한다. 일부 당업자는 수소화 분해 반응을 수행하는 적절한 방법을 선택할 수 있다.
일부 실시형태에서, 5개 및/또는 6개 탄소 당 또는 당 알코올은 수소화 분해 촉매를 사용하여 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 및 글리세롤로 전환될 수 있다. 수소화 분해 촉매는 Cr, Mo, W, Re, Mn, Cu, Cd, Fe, Co, Ni, Pt, Pd, Rh, Ru, Ir, Os, 및 이들의 합금 또는 임의의 조합물을 단독으로 또는 Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, Bi, B, O, 및 이들의 합금 또는 임의의 조합물과 같은 프로모터와 함께 포함할 수 있다. 수소화 분해 촉매는 또한 전이금속(예를 들어 크롬, 몰리브덴, 텅스텐, 레늄, 망간, 구리, 카드뮴) 또는 VIII족 금속(예를 들어, 철, 코발트, 니켈, 백금, 팔라듐, 로듐, 루테늄, 이리듐 및 오스뮴)을 함유하는 탄소질 파이로중합체 촉매를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 수소화 분해 촉매는 알칼리토금속 산화물과 조합되거나 또는 촉매적으로 활성인 지지체에 부착된 상기 금속 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 수소화 분해 반응에서 기재된 촉매는 수소화 반응에 대해 상기 기재한 바와 같은 촉매 지지체를 포함할 수 있다.
수소화 분해 반응을 수행하기 위한 조건은 출발 물질의 유형 및 원하는 생성물에 기반하여 다를 것이다. 당업자는 본 개시내용에 유리하게 반응을 수행하는데 사용하기 위한 적절한 조건을 인식할 것이다. 일반적으로, 이들 수소화 분해 반응은 110℃ 내지 300℃, 바람직하게는 170℃ 내지 220℃, 가장 바람직하게는 200℃ 내지 225℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 수소화 분해 반응은 염기성 조건 하에서, 바람직하게는 pH 8 내지 13, 훨씬 더 바람직하게는 pH 10 내지 12에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 수소화 분해 반응은 60 KPa 내지 16500 KPa의 범위, 및 바람직하게는 1700 KPa 내지 14000 KPa, 훨씬 더 바람직하게는 4800 KPa 내지 11000 KPa 범위의 압력에서 수행된다.
본 발명의 수소화 분해 반응에서 사용되는 수소는 외부 수소, 재순환된 수소, 동일계 내에서 생성된 수소 및 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 논의한 반응 생성물은 축합 반응기에서 축합 반응을 통해 더 고차의 탄화수소로 전환될 수 있다. 이와 같은 실시형태에서, 반응 생성물의 축합은 더 고차의 탄화수소를 형성할 수 있는 촉매의 존재 하에서 일어난다. 이론에 의해 제한하는 것으로 의도하지 않고, 더 고차 탄화수소의 생성은 탄소-탄소 또는 탄소-산소 결합의 형성을 포함하는 단계적 첨가 반응을 통해 진행되는 것으로 여겨진다. 생성된 반응 생성물은 이하에 더 상세하게 기재되는 바와 같은 이들 모이어티를 함유하는 임의의 수의 화합물을 포함한다.
특정 실시형태에서, 적합한 축합 촉매는 산 촉매, 염기 촉매 또는 산/염기 촉매를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 “산/염기 촉매”는 산과 염기 기능을 둘 다 갖는 촉매를 지칭한다. 일부 실시형태에서 축합 촉매는 제올라이트, 탄화물, 질화물, 지르코니아, 알루미나, 실리카, 알루미노실리케이트, 포스페이트, 산화티타늄, 산화아연, 산화바나듐, 산화란타넘, 산화이트륨, 산화스칸듐, 산화마그네슘, 산화세륨, 산화바륨, 산화칼슘, 수산화물, 헤테로다중산, 무기산, 산 개질된 수지, 염기 개질된 수지 및 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 축합 촉매는 또한 개질제를 포함할 수 있다. 적합한 개질제는 La, Y, Sc, P, B, Bi, Li, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 축합 촉매는 또한 금속을 포함할 수 있다. 적합한 금속은 Cu, Ag, Au, Pt, Ni, Fe, Co, Ru, Zn, Cd, Ga, In, Rh, Pd, Ir, Re, Mn, Cr, Mo, W, Sn, Os, 합금, 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
특정 실시형태에서, 축합 반응에서 기재된 촉매는 수소화 반응을 위해 상기 기재한 바와 같은 촉매 지지체를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 축합 촉매는 자체 지지성(self-supporting )이다. 본 명세서에 사용되는 용어 “자체 지지성”은 촉매가 지지체로서 작용하는데 다른 재료를 필요로 하지 않는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 축합 촉매는 촉매를 현탁시키는데 적합한 별개의 지지체와 함께 사용된다. 실시형태에서, 축합 촉매 지지체는 실리카이다.
축합 반응이 일어나는 조건은 출발 물질 유형 및 원하는 생성물에 기반하여 다를 것이다. 당업자는 본 개시내용의 이점에 의해 반응을 수행하기 위한 사용에 적절한 조건을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 축합 반응은 제안된 반응에 대한 열역학에 유리한 온도에서 수행된다. 축합 반응을 위한 온도는 구체적 출발 폴리올 또는 알코올에 따라서 다를 것이다. 일부 실시형태에서, 축합 반응을 위한 온도는 80℃ 내지 500℃, 바람직하게는 125℃ 내지 450℃, 가장 바람직하게는 125℃ 내지 250℃의 범위에 있다. 일부 실시형태에서, 축합 반응은 0 Kpa 내지 9000 KPa의 범위, 바람직하게는 0 KPa 내지 7000 KPa, 훨씬 더 바람직하게는 0 KPa 내지 5000 KPa의 범위의 압력에서 수행된다.
본 발명에 의해 형성되는 고차 알칸은 4개 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 직쇄 알칸, 4개 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 직쇄 알켄, 5개 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알칸, 5개 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알켄, 아릴, 융합된 아릴, 알코올 및 케톤을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 알칸은 부탄, 펜탄, 펜텐, 2-메틸부탄, 헥산, 헥센, 2-메틸펜탄, 3-메틸펜탄, 2,2,-디메틸부탄, 2,3-디메틸부탄, 헵탄, 헵텐, 옥탄, 옥텐, 2,2,4-트리메틸펜탄, 2,3-디메틸 헥산, 2,3,4-트리메틸펜탄, 2,3-디메틸펜탄, 노난, 노넨, 데칸, 데센, 운데칸, 운데센, 도데칸, 도데센, 트리데칸, 트리데센, 테트라데칸, 테트라데센, 펜타데칸, 펜타데센, 노닐데칸, 노닐데센, 에이코산, 에이코센, 운에이코산, 운에이코센, 도에이코산, 도에이코센, 트리에이코산, 트리에이코센, 테트라에이코산, 테트라에이코센, 및 이들의 이성질체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이들 생성물 중 일부는 연료로서의 사용에 적합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 비치환된다. 다른 실시형태에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 일치환된다. 또 다른 실시형태에서, 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 다중치환된다. 치환된 사이클로알칸 및 사이클로알켄을 포함하는 실시형태에서, 치환된 기는 1개 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 직쇄 알킬, 1개 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 직쇄 알킬렌, 페닐, 및 이의 임의의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 사이클로알칸 및 사이클로알켄은 사이클로펜탄, 사이클로펜텐, 사이클로헥산, 사이클로헥센, 메틸-사이클로펜탄, 메틸-사이클로펜텐, 에틸-사이클로펜탄, 에틸-사이클로펜텐, 에틸-사이클로헥산, 에틸-사이클로헥센, 및 이들의 이성질체 및 임의의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 형성된 아릴은 비치환된다. 다른 실시형태에서, 형성된 아릴은 일치환된다. 치환된 아릴을 포함하는 실시형태에서, 치환된 기는 1개 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 직쇄 알킬, 1개 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 분지쇄 또는 직쇄 알킬렌, 페닐 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명에 적합한 아릴은 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸 벤젠, 파라 자일렌, 메타 자일렌 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에서 생성된 알코올은 4개 내지 30개의 탄소 원자를 가진다. 일부 실시형태에서, 알코올은 고리형이다. 다른 실시형태에서, 알코올은 분지형이다. 다른 실시형태에서, 알코올은 직쇄형이다. 본 발명에 적합한 알코올은 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 운데칸올, 도데칸올, 트리데칸올, 테트라데칸올, 펜타데칸올, 헥사데칸올, 헵틸데칸올, 옥틸데칸올, 노닐데칸올, 에이코산올, 운에이코산올, 도에이코산올, 트리에이코산올, 테트라에이코산올 및 이들의 이성질체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에서 생성된 케톤은 4개 내지 30개의 탄소 원자를 가진다. 실시형태에서, 케톤은 고리형이다. 다른 실시형태에서, 케톤은 분지형이다. 다른 실시형태에서, 케톤은 직쇄형이다. 본 발명에 적합한 케톤은 부타논, 펜타논, 헥사논, 헵타논, 옥타논, 노나논, 데카논, 운데카논, 도데카논, 트리데카논, 테트라데카논, 펜타데카논, 헥사데카논, 헵틸데카논, 옥틸데카논, 노닐데카논, 에이코사논, 운에이코사논, 도에이코사논, 트리에이코사논, 테트라에이코사논 및 이들의 이성질체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 이와 같은 화학적 변형은 에스테르교환이다. 자연적으로 생성된 글리세로지질은 균일한 분포의 지방산 구성성분을 가지지 않는다. 오일과 관련하여, 에스테르교환은 상이한 글리세로지질의 2개 에스테르 간의 아실 라디칼의 교환을 말한다. 에스테르교환 공정은 글리세로지질의 혼합물의 지방산 구성성분이 재배열되어 분포 패턴을 변형시키는 메커니즘을 제공한다. 에스테르교환은 잘 공지된 화학적 공정이며, 일반적으로 알칼리 금속 또는 알칼리 금속 알킬레이트(예를 들어, 메톡시화나트륨)와 같은 촉매의 존재 하에서 기간 동안(예를 들어, 30분) 오일의 혼합물을 가열시키는 단계(약 200℃로)를 포함한다. 이 공정은 오일 혼합물의 지방산 구성성분의 분포 패턴을 무작위화하는데 사용될 수 있거나 또는 원하는 분포 패턴을 생성하게 할 수 있다. 이러한 지질의 화학적 변형 방법은 본 명세서에 제공된 재료, 예를 들어 적어도 20%의 지질의 건조 세포 중량 백분율을 가지는 미생물 바이오매스 상에서 실행된다.
지시된 에스테르교환(지방산의 특이적 분포 패턴이 추구됨)은 생길 수 있는 일부 TAG의 융점 미만의 온도에서 오일 혼합물을 유지함으로써 실행될 수 있다. 이는 이들 TAG의 선택적 결정화를 일으키며, TAG가 결정화됨에 따라 반응 혼합물로부터 TAG를 효과적으로 제거한다. 공정은, 예를 들어 오일 중의 대부분의 지방산이 침전될 때까지 계속될 수 있다. 지시된 에스테르교환 공정은, 예를 들어 장쇄 지방산의 단쇄 대응물로 치환을 통해 더 낮은 칼로리 함량을 가지는 생성물을 생성하는데 사용될 수 있다. 지시된 에스테르교환은 또한 원치않는 트랜스 이성질체를 생성할 수 있는 수소화에 의지하는 일 없이 식품 첨가제 또는 생성물(예를 들어, 마가린)에서 추구되는 구조적 특징 및 원하는 용융 특징을 제공할 수 있는 지방의 혼합물을 포함하는 생성물을 생성하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 오일의 에스테르교환은 US 특허 제6,080,853호(난소화성(Nondigestible) 지방 대체물); 제4,288,378호(피넛 버터 안정화제); 제5,391,383호(식용 분무 오일); 제6,022,577호(식료품용 식용 지방); 제5,434,278호(식료품용 식용 지방); 제5,268,192호(저칼로리 견과 제품); 제5,258,197호(감소된 칼로리의 식용 조성물); 제4,335,156호(식용 지방 제품); 제7,288,278호(식품 첨가제 또는 의약); 제7,115,760호(분획화 공정); 제6,808,737호(구조적 지방); 제5,888,947호(엔진 윤활제); 제5,686,131호(식용 오일 혼합물); 및 제4,603,188호(경화성 우레탄 조성물)에서 보고된 바와 같은 생성물을 생성하기 위한 방법 및/또는 재료 중 하나 이상과 함께 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 일 실시형태에서, 상기 기재한 바와 같은 오일의 에스테르교환 다음에 US 특허 제6,465,642호에 보고된 바와 같은 폴리올과 에스테르교환된 생성물의 반응으로 폴리올 지방산 폴리에스테르를 생성한다. 이와 같은 에스테르화 및 분리 공정은, 비누의 존재 하에서 저급 알킬 에스테르를 폴리올과 반응시키는 단계; 생성물 혼합물로부터 잔여 비누를 제거하는 단계; 생성물 혼합물을 물 세척하고 건조시켜 불순물을 제거하는 단계; 정련을 위해 생성물 혼합물을 표백하는 단계; 생성물 혼합물에서 폴리올 지방산 폴리에스테르로부터 적어도 일부의 미반응 저급 알킬 에스테르를 분리시키는 단계; 및 분리된 미반응 저급 알킬 에스테르를 재순환시키는 단계를 포함할 수 있다.
에스테르교환은 또한 U.S. 특허 제6,278,006호에서 보고된 바와 같은 단쇄 지방산 에스테르를 포함하는 미생물 바이오매스 상에서 실행될 수 있다. 일반적으로, 에스테르교환은 적합한 촉매의 존재 하에서 오일에 단쇄 지방산 에스테르를 첨가하는 단계 및 혼합물을 가열하는 단계에 의해 실행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 오일은 약 5중량% 내지 약 90중량%의 반응 혼합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단쇄 지방산 에스테르는 약 10중량% 내지 약 50중량%의 반응 혼합물일 수 있다. 촉매의 비제한적 예는 염기 촉매, 메톡시화나트륨, 무기산, 예를 들어 황산 및 산성화된 점토, 유기산, 예를 들어 메탄설폰산, 벤젠설폰산 및 톨루엔설폰산 및 산성 수지, 예를 들어 Amberlyst 15를 포함하는 산 촉매를 포함한다. 금속, 예를 들어 나트륨 및 마그네슘 및 수소화금속이 또한 유용한 촉매이다.
다른 이와 같은 화학적 변형은, 하이드록실 모이어티의 포함 및 포화를 가져오는 이중 결합에 물의 첨가를 수반하는, 하이드록실화이다. 하이드록실화 공정은 하이드록시 지방산으로 글리세로지질의 하나 이상의 지방산 구성성분의 전환을 위한 메커니즘을 제공한다. 하이드록실화는, 예를 들어 US 특허 제5,576,027호에서 보고된 바와 같은 방법을 통해 수행될 수 있다. 피마자 오일 및 이의 유도체를 포함하는 하이드록실화된 지방산은 식품 첨가제, 계면활성제, 색소 습윤제, 발포제, 방수 첨가제, 가소제, 화장료 유화제 및/또는 데오드란트제뿐만 아니라 전자제품, 약제, 페인트, 잉크, 접착제 및 윤활제를 포함하는 몇몇 산업적 적용에서 성분으로서 유용하다. 글리세리드의 하이드록실화가 수행될 수 있는 방법의 한 가지 예는 다음과 같다: 헵탄과 조합된 지방은 바람직하게 약 30℃ 내지 50℃로 가열되고, 30분 이상 동안 그 온도에서 유지될 수 있으며; 그 다음, 아세트산이 혼합물에 첨가된 후에 황산의 수용액이 첨가되고, 그 후 과산화수소 수용액이 적은 증분으로 1시간에 걸쳐 혼합물에 첨가되며; 수성 과산화수소 다음에, 온도는 적어도 약 60℃로 증가되고, 적어도 6시간 동안 교반될 수 있으며; 교반 후에, 혼합물을 정착시키고, 반응에 의해 형성된 하부 수층을 제거할 수 있는 한편, 반응에 의해 형성된 상부 헵탄층을 약 60℃ 온도의 뜨거운 물로 세척할 수 있으며; 그 다음에 세척한 헵탄층을 수산화칼륨 수용액을 이용하여 pH 약 5 내지 7로 중화시킨 다음, 진공 하에서 증류에 의해 제거할 수 있고; 그 다음, 반응 생성물을 100℃, 진공 하에서 건조시키고, 건조된 생성물을 진공 조건 하에서 증기-탈취시키며 규조토를 사용하여 약 50℃ 내지 60℃에서 여과한다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 미생물 오일의 하이드록실화는 US 특허 제6,590,113호(오일 기반 코팅 및 잉크); 제4,049,724호(하이드록실화 공정); 제6,113,971호(올리브 오일 버터); 제4,992,189호(윤활제 및 윤활유 첨가제); 제5,576,027호(하이드록실화된 우유); 및 제6,869,597호(화장품)에 보고된 바와 같은 생성물을 생성하기 위한 방법 및/또는 재료 중 하나 이상과 함께 수행될 수 있다.
하이드록실화된 글리세로지질은 에스톨리드로 전환될 수 있다. 에스톨리드는 글리세로지질로 이루어지는데, 이때 하이드록실화된 지방산 구성성분은 다른 지방산 분자로 에스테르화되었다. 에스톨리드로 하이드록실화된 글리세로지질의 전환은 문헌[Isbell et al., JAOCS 71(2):169-174 (1994)]에 기재된 바와 같이, 글리세로지질 및 지방산의 혼합물을 가온시키는 단계 및 무기산과 혼합물을 접촉시키는 단계에 의해 수행될 수 있다. 에스톨리드는 US 특허 제7,196,124호(탄성재료 및 바닥마감재); 제5,458,795호(고온 적용용 농화유); 제5,451,332호(산업적 적용을 위한 유체); 제5,427,704호(연료 첨가제); 및 제5,380,894호(윤활제, 그리스, 가소제 및 인쇄 잉크)에서 보고된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 적용분야에서 유용하다.
다른 이와 같은 화학적 변형은 올레핀 복분해이다. 올레핀 복분해에서, 촉매는 알켄(올레핀)에서 알킬리덴 탄소를 잘라내고, 그것들을 상이한 알킬리덴 탄소와 서로 짝지음으로써 새로운 알켄을 형성한다. 올레핀 복분해 반응은 에테놀리시스(ethenolysis)에 의해 알켄에서 불포화 지방산 알킬 사슬을 절단하는 것, 자기 복분해에 의해 알켄 연관을 통해 지방산을 가교시키는 것, 및 유도체화된 알켄과 상호 복분해에 의해 지방산 상에 새로운 작용기를 혼입시키는 것과 같은 공정을 위한 메커니즘을 제공한다.
에스테르교환 및 수소화와 같은 기타 다른 반응과 함께, 올레핀 복분해는 불포화 글리세로지질을 다양한 최종 생성물로 전환시킬 수 있다. 이들 생성물은 왁스용 글리세로지질 올리고머; 윤활제용 단쇄 글리세로지질; 화학 물질 및 중합체용 호모- 및 헤테로-2작용성 알킬 사슬; 바이오연료용 단쇄 에스테르; 및 제트 연료용 단쇄 탄화수소를 포함한다. 올레핀 복분해는, 예를 들어 U.S. 특허 제7,119,216호, US 특허 공개 제2010/0160506호 및 U.S. 특허 공개 제 2010/0145086호에 보고된 촉매 및 방법을 사용하여, 트리아실글리세롤 및 지방산 유도체에 실행될 수 있다.
바이오오일의 올레핀 복분해는 일반적으로 기타 다른 알켄의 존재(상호 복분해) 또는 부재(자기 복분해) 하에서 불포화 지방산 에스테르에 대한 비활성 조건 하에서 약 10 ppm 내지 250 ppm의 장입으로 Ru 촉매의 용액을 첨가하는 단계를 포함한다. 반응은 통상적으로 수시간 내지 며칠간 진행할 수 있도록 하며, 궁극적으로 알켄 생성물의 분포를 산출한다. 올레핀 복분해가 지방산 유도체에 대해 실행될 수 있는 하나의 예는 다음과 같다: 톨루엔 중에서 제1 생성 그럽스(Grubbs) 촉매(디클로로[2(1-메틸에톡시-α-O)페닐]메틸렌-α-C](트리사이클로헥실-포스핀)의 용액이 222 ppm 의 촉매 장입에서 탈기되고 건조된 메틸 올리에이트를 함유하는 용기에 첨가될 수 있다. 그 다음에 용기는 에틸렌 가스 약 60 psig를 이용하여 가압될 수 있고, 약 30℃ 이하에서 3시간 동안 유지됨으로써 메틸 9-데세노에이트의 대략 50% 수율이 생성될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 오일의 올레핀 복분해는 특허출원 PCT/US07/081427호(α-올레핀 지방산) 및 U.S. 특허 출원 제12/281,938호(석유 크림), 제12/281,931호(페인트볼 건 캡슐), 제12/653,742호(가소제 및 윤활제), 제12/422,096호(2작용성 유기 화합물), 및 제11/795,052호(양초 왁스)에 보고된 바와 같이 생성물을 생성하기 위한 방법 및/또는 재료 중 하나 이상과 함께 수행될 수 있다.
미생물 오일에 대해 수행될 수 있는 기타 다른 화학적 반응은 U.S. 특허 제6,051,539호에 보고된 바와 같이 유동성 및/또는 산화적 안정성을 향상시키기 위해 트리아실글리세롤을 사이클로프로판화제와 반응시키는 단계; U.S. 특허 제6,770,104호에 보고된 바와 같이 트리아실글리세롤로부터 왁스를 제조하는 단계; 및 문헌[The effect of fatty acid composition on the acrylation kinetics of epoxidized triacylglycerols", Journal of the American Oil Chemists' Society, 79:1, 59-63, (2001)] 및 [Free Radical Biology and Medicine, 37:1, 104-114 (2004)]에 보고된 바와 같이 트리아실글리세롤의 에폭시화 단계를 포함한다.
상기 기재한 바와 같은 연료 및 화학 제품용 오일 보유 미생물 바이오매스의 생성은 탈지질화된 바이오매스 음식물의 생성을 가져온다. 탈지질화된 음식물은 조류 오일을 제조하는 것의 부산물이며, 농장 동물, 예를 들어 반추동물, 가금류, 돼지 및 수산양식물용의 동물 사료로서 유용하다. 감소된 오일 함량에도 불구하고 생성된 음식물은 여전히 고품질 단백질, 탄수화물, 섬유질, 애쉬(ash), 잔여 오일 및 동물 사료용으로 적절한 기타 다른 영양소를 함유한다. 세포는 대부분 오일 분리 공정에 의해 용해되기 때문에, 탈지질된 음식물은 이와 같은 동물ㅇ이 용이하게 소화시킬 수 있다. 탈지질화된 음식물은 동물 사료에서 선택적으로 곡물과 같은 기타 다른 성분과 조합될 수 있다. 탈지질화된 음식물은 분말 점조도를 가지기 때문에, 이는 압출기 또는 확장기 또는 상업적으로 입수가능한 다른 유형의 기계를 사용하여 펠렛으로 압축될 수 있다.
상기에 상세하게 기재한 본 발명은 설명을 위해 제공되는 다음의 실시예에서 예시되지만, 특허청구된 발명을 제한하는 것은 아니다.
XIV . 실시예
실시예 1: 지방산 메틸 에스테르 검출에 의한 지방산 분석
지질 샘플을 건조 바이오매스로부터 제조하였다. 20 mg 내지 40 mg의 건조 바이오매스를 MeOH 중의 5% H2SO4 2 mL에 재현탁시켰고, 적합한 내부 표준(C19:0)의 적절한 양을 함유하는 200 ul의 톨루엔을 첨가하였다. 혼합물에 간단하게 초음파 처리하여 바이오매스를 분산시킨 다음, 70℃ 내지 75℃에서 3.5시간 동안 가열하였다. 2 mL의 헵탄을 첨가하여 지방산 메틸 에스테르를 추출한 다음, 2 mL의 6% K2CO3(aq)를 첨가하여 산을 중화시켰다. 혼합물을 격렬하게 교반시켰고, 표준 FAME GC/FID(fatty acid methyl ester gas chromatography flame ionization detection; 지방산 메틸 에스테르 기체 크로마토그래피 불꽃 이온화 검출) 방법을 사용하는 기체 크로마토그래피 분석을 위해 상부층의 일부를 Na2SO4(무수)를 포함하는 바이알로 옮겼다.
실시예 2: 오일로부터의 트리아실글리세리드 정제 및 트리아실글리세리드 리파제 분해를 위한 방법
디클로로메탄에 약 10 mg의 오일을 용해시키고 이를 헵탄으로 미리 조정된 Bond-Elut 아미노프로필 고체상 추출 카트리지(500 mg)로 로딩함으로써 각각의 오일 샘플의 트리아실글리세리드(TAG) 분획을 분리하였다. 디클로로메탄-MeOH(1:1)을 이용하여 TAG를 수집관으로 용리시키는 한편, 극성 지질은 컬럼 상에 유지시켰다. 질소 가스 스트림을 이용하여 용매를 제거하였다. 트리스 버퍼 및 2 mg의 돼지 췌장 리파제(유형 II, Sigma, 100단위/mg 내지 400단위/mg)를 TAG 분획에 첨가한 다음, 담즙염 및 염화칼슘 용액을 첨가하였다. 돼지 췌장 리파제는 sn-1 및 sn-3 지방산을 절단하며, 이에 의하여 2-모노아실글리세리드 및 유리 지방산을 생성한다. 이러한 혼합물을 40℃에서 3분 동안 교반하면서 가열하고, 잠시 냉각시킨 후, 6 N HCl로 ?칭하였다. 그 후, 혼합물을 디에틸 에테르로 추출하고, 에테르 층을 물로 세척한 후, 황산나트륨으로 건조시켰다. 질소 스트림을 이용하여 용매를 제거하였다. 모노아실글리세리드(MAG) 분획을 분리시키기 위하여, 잔사를 헵탄 중에 용해시키고 헵탄으로 미리 처리한 제2 아미노프로필 고체상 추출 카트리지 상에 로딩하였다. 잔여 TAG를 디에틸 에테르-디클로로메탄-헵탄(1:9:40)을 이용하여 용리시키고, 디아실글리세리드(DAG)를 에틸 아세테이트-헵탄(1:4)를 이용하여 용리시켰으며, MAG를 디클로로메탄-메탄올(2:1)을 이용하여 카트리지로부터 용리시켰다. 그 후, 생성된 MAG, DAG, 및 TAG 분획을 질소 스트림을 이용하여 농축 건조시키고, 실시예 1에 기재된 바와 같은 GC/FID 분석의 통상적인 직접적 에스테르교환반응 방법을 거치게 하였다.
실시예 3: 외인성 LPAAT 발현을 통하여 라우르산에서 지방산 및 sn -2 프로파일의 증가를 위한 미생물유기체의 조작
이 실시예는 형질전환된 미생물유기체의 지방산 프로파일 및 sn-2 프로파일이 라우르산 중에 풍부화된 미생물유기체를 조작하기 위한, 씨. 누시페라 1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(C. nucifera 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyl transferase; Cn LPAAT) 효소를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 용도를 기재한다.
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)의 고전적으로 돌연변이유발된 균주, 즉 균주 A를 처음에 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재되어 있는 바이오리스틱 형질전환 방법에 따라 플라스미드 작제물 pSZ1283으로 형질전환시켰다. 본 명세서에 참조로서 포함되어 있는 PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 pSZ1283은 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR(서열 번호 5) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에서 쿠페아 라이티 FATB2 (CwTE2) 티오에스테라제(서열 번호 10)의 암호화 서열, 6S 게놈 영역에 대해 상동성인 5'(서열 번호 1) 및 3'(서열 번호 2) 재조합 표적화 서열(작제물에 측접)(핵내 게놈으로의 통합용), 및 에스. 세레비지아에 suc2 수크로스 전화효소 암호화 영역(서열 번호 4)(서열 번호 3에 주어진 단백질 서열을 발현함)을 포함하였다. 이러한 에스. 세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 7로서 열거되어 있으며, 선택 마커로서 작용한다. 서열 번호 11에 주어진 단백질 서열을 발현시키기 위하여 CwTE2 단백질 암호화 서열은 피. 모리포르미스 Amt03 프로모터/5?TR(서열 번호 8) 및 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3?TR의 제어 하에 있었다. CwTE2 및 suc2의 단백질 암호화 영역을 코돈 최적화하여 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 피. 모리포르미스 UTEX 1435 핵 유전자에 내재한 코돈 바이어스를 반영하였다.
균주 A로 pSZ1283의 형질전환 시, 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스를 포함하는 한천 플레이트 상에서 양성 클론을 선별하였다. 그 후, 1차 형질전환체를 클론정제하고, 단일 형질전환체, 즉 균주 B를 추가 유전자 변형을 위하여 선별하였다. 이러한 유전적으로 조작된 균주를 플라스미드 작제물 pSZ2046을 이용하여 형질전환하여 균주 B의 pLoop 유전자좌를 방해하였다. 작제물 pSZ2046은 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR(서열 번호 5) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에서 씨. 누시페라 1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(Cn LPAAT) 효소(서열 번호 12)의 암호화 서열, pLoop 게놈 영역에 대해 상동성인 5'(서열 번호 13) 및 3'(서열 번호 14) 재조합 표적화 서열(작제물에 측접)(핵내 게놈으로의 통합용), 및 네오마이신 저항성 단백질 암호화 서열을 포함하였다. 이러한 NeoR 발현 카세트는 서열 번호 15로서 열거되어 있으며, 선택 마커로서 작용한다. Cn LPAAT 단백질 암호화 서열은 피. 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 8) 및 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있었다. Cn LPAAT 및 NeoR 의 단백질 암호화 영역을 코돈 최적화하여 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 피. 모리포르미스 UTEX 1435 핵 유전자에 내재한 코돈 바이어스를 반영하였다. Cn LPAAT의 아미노산 서열을 서열 번호 16으로서 제공한다.
균주 B로 pSZ2046을 형질전환하고, 이에 의하여 균주 C를 생성할 시, G418(제네티신(Geneticin))을 포함하는 한천 플레이트 상에서 양성 클론을 선별하였다. 개개의 형질전환체를 클론정제하고, PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 상세하게 기재된 바와 같은 지질 생성에 적합한 조건 하 pH 7.0에서 성장시켰다. 지질 샘플을 각각의 형질전환체로부터의 건조 바이오매스로부터 준비하였고, 실시예 1에 기재된 바와 같은 표준 지방산 메틸 에스테르 기체 크로마토그래피 불꽃 이온화(FAME GC/FID) 검출 방법을 사용하여 이들 샘플로부터의 지방산 프로파일을 분석하였다. 유일한 탄소 공급원으로서 글루코스 상에서 성장시킨 피. 모리포르미스 UTEX 1435(U1), 즉 비형질전환 균주 B 및 5가지의 pSZ2046 양성 형질전환체(균주 C, 1 내지 5)의 지방산 프로파일(전체 지방산의 영역%로서 표현)이 표 6에 제시되어 있다.
중쇄 선호 티오에스테라제를 포함하는 형질전환된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)의 지방산 프로파일에 대한 LPAAT 발현의 효과.
영역% 지방산 U1 균주 B 균주 C-1 균주 C-2 균주 C-3 균주 C-4 균주 C-5
C10:0 0.01 5.53 11.37 11.47 10.84 11.13 11.12
C12:0 0.04 31.04 46.63 46.47 45.84 45.80 45.67
C14:0 1.27 15.99 15.14 15.12 15.20 15.19 15.07
C16:0 27.20 12.49 7.05 7.03 7.30 7.20 7.19
C18:0 3.85 1.30 0.71 0.72 0.74 0.74 0.74
C18:1 58.70 24.39 10.26 10.41 10.95 11.31 11.45
C18:2 7.18 7.79 7.05 6.93 7.30 6.88 7.01
C10-C12 0.50 36.57 58.00 57.94 56.68 56.93 56.79
표 6에 나타낸 바와 같이, CwTE2를 발현하는 균주 B의 지방산 프로파일은 비형질전환 UTEX 1435 균주의 지방산 프로파일에 대해 C10:0, C12:0, 및 C14:0 지방산의 증가된 조성, 및 C16:0, C18:0, 및 C18:1 지방산의 감소를 나타내었다. 형질전환된 균주의 지방산 프로파일, 즉 균주 B에서 CnLPAAT의 발현에 대한 추가적인 유전자 변형의 영향은 C10:0 및 C12:0 지방산의 조성에서 또한 추가적으로 증가하는 것이며, C16:0, C18:0, 및 C18:1 지방산에서 또한 추가적으로 감소하는 것이지만, C14:0 지방산 조성에 대하여는 상당한 영향을 미치지 않는다. 이들 데이터는 CnLPAAT가 미생물 숙주 유기체의 내용에서 기질 선호도를 나타낸다는 것을 의미한다.
비형질전환 피. 모리포르미스 균주 A는 0.5% 미만의 C12 지방산 및 1% 미만의 C10-C12 지방산을 포함하는 지방산 프로파일을 특징으로 한다. 반대로, 씨. 라이티 티오에스테라제를 발현하는 균주 B의 지방산 프로파일은, 전체 지방산의 36% 초과를 구성하는 C10-C12 지방산과 함께, 31%의 C12:0 지방산을 포함하였다. 또한, 고등 식물 티오에스테라제 및 CnLPAAT 효소를 발현하는 균주 C의 지방산 프로파일은, 전체 지방산의 71% 내지 73%를 구성하는 C10-C12 지방산과 함께, 45.67% 내지 46.63%의 C12:0 지방산을 포함하였다. 외인성 티오에스테라제의 발현 결과, 조작된 미생물에 존재하는 C12 지방산의 백분율에 있어서 62배 증가하였다. 외인성 티오에스테라제 및 외인성 LPAAT의 발현 결과, 조작된 미생물에 존재하는 C12 지방산의 백분율에 있어서 92배 증가하였다.
균주 A, B, 및 C로부터 추출된 오일 샘플의 TAG 분획을 이들 트리아실글리세리드의 sn-2 프로파일에 대하여 분석하였다. TAG를 실시예 2에 기재된 바와 같이 추출 및 가공하고, 실시예 1 및 실시예 2에서와 같이 분석하였다. 균주 A, B, 및 C로부터 추출된 오일의 TAG 분획의 지방산 조성 및 sn-2 프로파일(전체 지방산의 영역%로서 표현)은 표 7에 제시되어 있다. 기록되지 않은 값은 “n.r.”로서 나타내어져 있다.
중쇄 선호 티오에스테라제를 포함하는 형질전환된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)로부터 생성된 TAG의 지방산 조성 및 sn-2 프로파일에 대한 LPAAT 발현의 효과.
균주 균주 A( 비형질전환 ) 균주 B( pSZ1500 ) 균주 C(pSZ1500 + pSZ2046 )
영역% 지방산 FA sn-2 프로파일 FA sn-2 프로파일 FA sn-2 프로파일
C10:0 n.r. n.r. 11.9 14.2 12.4 7.1
C12:0 n.r. n.r. 42.4 25 47.9 52.8
C14:0 1.0 0.6 12 10.4 13.9 9.1
C16:0 23.9 1.6 7.2 1.3 6.1 0.9
C18:0 3.7 0.3 n.r n.r. 0.8 0.3
C18:1 64.3 90.5 18.3 36.6 9.9 17.5
C18:2 4.5 5.8 5.8 10.8 6.5 10
C18:3 n.r. n.r. n.r. n.r. 1.1 1.6
표 7에 나타낸 바와 같이, CwTE2를 발현하는 균주 B로부터 분리된 트리글리세리드(TAG)의 지방산 조성은 비형질전환 균주 A로부터 분리된 TAG의 지방산 프로파일에 대해 C10:0, C12:0, 및 C14:0 지방산에 있어서 증가하였고, C16:0 및 C18:1 지방산에서 감소하였다. 형질전환된 균주의 지방산 프로파일, 즉 CnLPAAT의 발현에 대한 추가적인 유전자 변형의 영향은 C10:0 및 C12:0 지방산의 조성에서 또한 추가적으로 증가하는 것이며, C16:0, C18:0, 및 C18:1 지방산에서 또한 추가적으로 감소하는 것이지만, C14:0 지방산 조성에 대하여는 상당한 영향을 미치지 않는다. 이들 데이터는 외인성 CnLPAAT의 발현이 형질전환 미생물의 중쇄 지방산 프로파일을 개선시킨다는 것을 의미한다.
비형질전환 피. 모리포르미스 균주 A는 약 0.6%의 C14, 약 1.6%의 C16:0, 약 0.3%의 C18:0, 약 90%의 C18:1, 및 약 5.8%의 C18:2의 sn-2 프로파일을 특징으로 한다. 균주 A와 반대로, 씨. 라이티 티오에스테라제를 발현하는 균주 B는 중쇄 지방산에서 더 높고 장쇄 지방산에서 더 낮은 sn-2 프로파일을 특징으로 한다. C12 지방산은 균주 B의 sn-2 프로파일의 25%를 구성하였다. 형질전환된 균주의 sn-2 프로파일, 즉 CnLPAAT의 발현에 대한 추가적인 유전자 변형의 영향은 C12 지방산에서 또한 추가적으로 증가하는 것(25%에서 52.8%)이며, C18:1 지방산에서 감소하는 것(36.6%에서 17.5%)이고, C10:0 지방산에서 감소하는 것이다. (C14:0 및 C16:0 지방산의 sn-2 프로파일 조성은 균주 B 및 균주 C에 대하여 상대적으로 유사하였다.)
이들 데이터는 조작된 미생물유기체의 지방산 프로파일을 변경시키기 위해, 특히 미생물 세포에서 C10:0 및 C12:0 지방산의 농도를 증가시키는데 있어서, 외인성 LPAAT 발현을 허용하는 폴리뉴클레오티드의 유용성 및 유효성을 입증한다. 이들 데이터는 미생물 세포에 의해 생성되는 TAG의 sn-2 프로파일을 변경시키기 위해, 특히 sn-2 프로파일의 C12 조성을 증가시키고 sn-2 프로파일의 C18:1 조성을 감소시키는데 있어서 외인성 티오에스테라제 및 외인성 LPAAT 발현을 허용하는 폴리뉴클레오티드의 유용성 및 유효성을 추가로 입증한다.
실시예 4: 재조합 미세조류로부터 생성된 오일의 열적 거동.
도 1 내지 도 14는 유전적으로 조작된 프로토테카 모리포르미스 균주로부터 정련, 표백 및 탈취된 오일의 지방산 프로파일 및 용융 곡선을 포함한다. 일부 경우에서, 용융 곡선의 변형은 유전자 조작을 통해 얻어진다. 예를 들어, 생성된 오일의 일부는 대조 미세조류 오일(즉, 주어진 유전자 변형이 없는 균주로부터 생성된 것)에 비해 또는 널리 이용가능한 식물 오일에 비해 더 얕거나 더 날카로운 용융 전이를 가진다. 추가적으로, 도 12는 며칠 동안 실온에서 유지함으로써 템퍼링될 때 고등 팔미트 오일에 대한(하부 선), 그리고 제1 주사를 실행한 후 동일한 오일에 대한(상부 선) 주사 열량 측정법을 나타낸다. 10℃/분의 가열 속도로 -60℃ 내지 +50℃의 범위에서 주사하였다. 2개의 선 사이의 차이는 오일의 템퍼링이 오일 내 결정 구조에서의 변화를 야기하였다는 것을 시사한다.
또한 중요하게, 도 10 및 도 11은 RBD-5 및 RBD 6의 안정성 시험을 나타낸다. 현저하게, 18:2 및 18:3 지방산이 0.1% 미만인 오일인 RBD 6은 심지어 110℃에서 36시간 가열한 후에도 산화 안정성 지수(AOCS 방법 Cd 12b-92)에 의해 측정된 바와 같이, 실질적으로 안정적이었다.
하기 표 8은 도 1 내지 도 13에서 확인된 균주의 유전자 조작의 상세 내용을 제공한다.
유전자 조작 균주.
RB Z 울머스 아메리카나(Ulmus Americana) 티오에스테라제
RBD-1 amt03에 의해 구동되는 쿠페아 라이티 FATB2 티오에스테라제
RBD-2 울머스 아메리카나 티오에스테라제
RBD-3 amt03 프로모터를 포함하는 천연 씨. 후커리아나(C. hookeriana) C16:0 특이적 티오에스테라제
RBD Y Btub 프로모터를 포함하는 울머스 아메리카나 티오에스테라제
RBD X 천연 씨. 라이티 FAT2B 티오에스테라제, amt03 프로모터를 포함하는 SAD2B 녹아웃
RBD W 삽입 부위에서 amt03에 의해 구동되는 천연 씨. 라이티 FATB2를 포함하는 SAD2B KO
RBD-4 대조 균주
RBD-5 삽입 부위에서 amt03 프로모터에 의해 구동되는 카르타무스 올리에이트 종 TE(Carthamus oleate sp. TE)를 포함하는 FATA-1 녹아웃
RBD-6 카르타무스 틴크토리우스(Carthamus tinctorius) 올레오일 티오에스테라제를 포함하는 FADc 녹아웃
실시예 5: 조작된 미생물유기체로부터 생성된 가공 오일의 특징
형질전환 벡터 pSZ1500(서열 번호 17)에 의해 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)를 형질전환시키는 방법 및 효과는 이전에 국제특허출원 PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에서 기재되었다.
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435), 즉, 균주 A의 고전적으로 돌연변이유발된(고차 오일 생성을 위해) 유도체를 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호 및 PCT/US2012/023696호에 기재되어 있는 바이오리스틱 형질전환 방법에 따라 pSZ1500으로 형질전환시켰다. pSZ1500은 카르타무스 틴크토리우스 올레일-티오에스테라제(CtOTE) 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하였고, 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 내 발현에 대해 코돈 최적화되었다. pSZ1500 발현 작제물은 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR(서열 번호 5) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 66)의 제어 하에 핵내 게놈 및 사카로마이세스 세레비지아에 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역 내로 통합을 위한 FADc 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 18) 및 3'(서열 번호 19) 상동성 재조합 표적화 서열(작제물에 측접)을 포함하였다. 이 사카로마이세스 세레비지아에 suc2 발현 카세트를 서열 번호 7로서 열거하며, 선택마커로서 제공하였다. CtOTE 암호화 영역은 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5?TR(서열 번호 8) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3?TR의 제어 하에 있으며, 천연 수송 펩티드를 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일-ACP 불포화효소 수송 펩티드(서열 번호 9)로 대체하였다. CtOTE 및 suc2의 단백질 암호화 영역을 코돈 최적화하여 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호 및 PCT/US2012/023696호에서 기재된 바와 같은 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 핵 유전자에서 내재한 코돈 바이어스를 반영하였다.
균주 A의 1차 pSZ1500 형질전환체를 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스를 함유하는 한천 플레이트 상에서 선택하였고, 클론정제하였으며, 단일의 조작된 계통인 균주 D를 분석을 위해 선택하였다. 균주 D를 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호 및 PCT/US2012/023696호에 기재한 바와 같이 생장시켰다. 그 다음에 표준 방법을 사용하여 만들어진 바이오매스로부터 오일의 헥산 추출을 수행하였고, 얻어진 트리글리세리드 오일을 잔여 헥산이 없도록 결정하였다. 익스펠러 프레스를 사용하는 미세조류로부터 오일 추출의 다른 방법은 국제특허출원 PCT/US2010/031108호에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로서 포함된다.
균주 D의 바이오매스로부터 추출한 상이한 로트의 오일을 정련하였고, 표백하였으며, 표준 식물성 오일 가공 방법을 사용하여 냄새를 제거하였다. 이들 절차는 오일 샘플 RBD437, RBD469, RBD501, RBD 502, RBD503 및 RBD529를 만들었는데, 이들에 미국유지화학회(American Oil Chemists' Society), 미국재료시험협회(American Society for Testing and Materials) 및 국제표준화기구(International Organization for Standardization)를 통해 정의된 방법에 따른 분석 시험 프로토콜을 실시하였다. 이들 분석의 결과를 이하의 표 9 내지 표 14에서 요약한다.
오일 샘플 RBD469 에 대한 분석 결과.
방법 번호 시험 설명 결과 단위
AOCS Ca 3a-46 불용성 불순물 <0.01 %
AOCS Ca 5a-40 유리 지방산 (Oleic) 0.02 %
AOCS Ca 5a-40 산가 0.04 mg KOH/g
AOCS CA 9f-57 중성오일 98.9 %
D97 혼탁점 -15 ℃
D97 유동점 -18 ℃
카를 피셔 수분 0.01 %
AOCS Cc 13d-55 (변형됨) 엽록소 <0.01 ppm
요오드 값 78.3 g I2/100g
AOCS Cd 8b-90 과산화물값 0.31 meq/kg
ISO 6885 p-아니시딘값 0.65
AOCS Cc 18-80 드로핑 융점(메틀러) 6.2 ℃
AOCS Cd 11d-96 트리사이글리세리드 98.6 %
AOCS Cd 11d-96 모노글리세리드 <0.01 %
AOCS Cd 11d-96 디글리세리드 0.68 %
AOCS Cd 20-91 전체 극성 화합물 2.62 %
IUPAC, 2.507 및 2.508 산화 및 중합된 트리사이글리세리드 17.62 %
AOCS Cc 9b-55 인화점 244 ℃
AOCS Cc 9a-48 발연점 232 ℃
AOCS Cd 12b-92 산화 안정성 지수 랜시매트(110℃) 31.6 시간
AOCS Ca 6a-40 불검화물 2.28 %
RBD469 오일을 미량의 구성요소 함량, 고체지방 함량 및 AOCS 방법에 따른 로비본드(Lovibond) 색에 대해 분석하였다. 이들 분석의 결과를 이하의 표 10, 표 10 및 표 11에서 제시한다.
RBD469 오일의 ICP 구성요소 분석.
방법 번호 시험 설명 결과(ppm)
AOCS Ca 20-99 및 AOCS Ca 17-01(변형됨) 인 1.09
칼슘 0.1
마그네슘 0.04
철 <0.02
황 28.8
구리 <0.05
칼륨 <0.50
나트륨 <0.50
규소 0.51
붕소 0.06
알루미늄 <0.20
납 <0.20
리튬 <0.02
니켈 <0.20
바나듐 <0.05
아연 <0.02
비소 <0.20
수은 <0.20
카드뮴 <0.03
크롬 <0.02
망간 <0.05
은 <0.05
티타늄 <0.05
셀레늄 <0.50
UOP779 유기 염화물 <1
UOP779 무기 염화물 7.24
AOCS Ba 4e-93 질소 6.7
RBD469 오일의 고체 지방 함량
방법 번호 고체 지방 함량 결과
AOCS Cd 12b-93 고체지방 함량 10℃ 0.13%
AOCS Cd 12b-93 고체지방 함량 15℃ 0.13%
AOCS Cd 12b-93 고체지방 함량 20℃ 0.28%
AOCS Cd 12b-93 고체지방 함량 25℃ 0.14%
AOCS Cd 12b-93 고체지방 함량 30℃ 0.08%
AOCS Cd 12b-93 고체지방 함량 35℃ 0.25%
RBD469 오일의 로비본드 색
방법 번호 색 결과 단위
AOCS Cc 13j-97 적색 2 단위
AOCS Cc 13j-97 황색 27 단위
지방산 메틸 에스테르(FAME)를 생성하기 위해 RBD469 오일에 에스테르 교환 반응을 실시하였다. RBD469의 얻어진 FAME 프로파일을 표 12에 나타낸다.
RBD469 오일의 FAME 프로파일
지방산 영역%
C10 0.01
C12:0 0.04
C14:0 0.64
C15:0 0.08
C16:0 8.17
C16:1 이소 0.39
C16:1 0.77
C17:0 0.08
C18:0 1.93
C18:1 85.88
C18:1 이소 0.05
C18:2 0.05
C20:0 0.3
C20:1 0.06
C20:1 0.44
C22:0 0.11
C23:0 0.03
C24:0 0.1
확인한 전체 FAME 99.13
보충한 항산화제가 없는 6개의 RBD 오일 샘플 및 항산화제로 보충한 3개의 RBD 오일 샘플의 오일 안정성 지수(oil stability indexes; OSI)를 오일 안정성 지수 AOCS 방법 Cd 12b-92에 따라 분석하였다. 표 14에, 110℃에서 수행하였고, Metrohm 873 Biodiesel Rancimat를 사용하여 수행한 OSI AOCS Cd 12b-92 시험 결과를 나타내었다. 별표(*)로 표시한 경우를 제외하고 결과는 다회 OSI 실행의 평균이었다. 분석하지 않은 해당 샘플을 표시한다(NA).
항산화제를 지니는 RBD 오일 샘플 및 항산화제가 없는 RBD 오일 샘플의 110℃에서 오일 안정성 지수
각 RBD 샘플에 대한 OSI(시간)
RBD437 RBD469 RBD502 RBD501 RBD503 RBD529
첨가한 항산화제 항산화제 농도
없음 0 65.41 38.33 72.10 50.32 63.04 26.68
토코페롤 및 아스코빌 팔미테이트 35 ppm/16.7 ppm 77.72 48.60 82.67 NA NA NA
토코페롤 및 아스코빌 팔미테이트 140 ppm/66.7 ppm 130.27 81.54* 211.49* NA NA NA
토코페롤 및 아스코빌 팔미테이트 1050 ppm/500 ppm >157* >144 242.5* NA NA NA
토코페롤 50 ppm NA 46.97 NA NA NA NA
TBHQ 20 ppm 63.37 37.4 NA NA NA NA
형질전환시키지 않은 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 산 프로파일은 60% 미만 C18:1 지방산 및 7% 초과 C18:2 지방산을 포함한다. 대조적으로, 균주 D(pSZ1500을 포함)는 C18:1 지방산의 증가된 조성(85% 초과) C18:2 지방산의 감소(0.06% 미만)에 의한 지방산 프로파일을 나타내었다. 정련, 표백 및 탈검시, 균주 E로부터 만들어진 오일로부터 제조된 RBD 오일 샘플은 > 26시간의 OSI 값을 나타내었다. 항산화제의 첨가에 의해, 균주 D의 오일로부터 제조된 RBD 오일의 OSI는 48.60시간으로부터 242시간 초과로 증가되었다. 다른 실험에서, 400시간 초과의 OSI 값을 획득하였다. 본 발명의 실시형태에 따른 낮은 다가불포화 오일의 추가적인 특성은 도 16에 제공되어 있다.
실시예 6: 지방산 불포화효소 및 아실- ACP 티오에스테라제의 대립유전자 파괴를 통해 조작된 미생물의 올레산 수준 개선
본 실시예는 높은 올레산 및 낮은 리놀레산 생성을 위해 이전에 조작된 프로토테카 모리포르미스 균주의 FATA 좌위를 파괴하기 위한 형질전환 벡터의 사용을 기재한다. 본 실시예에서 사용한 형질전환 카세트는 미생물유기체를 조작하는 프로토테카 모리포르미스 KASII 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 선택마커를 포함하였는데, 이때 형질전환된 미생물유기체의 지방산 프로파일은 추가로 증가된 올레산 및 저하된 팔미트산 수준에 대해 변경되었다.
실시예 5에 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 균주 D는 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호 및 PCT/US2012/023696호에서 기재된 바와 같은 바이오리스틱 형질전환 방법에 따라 형질전환 작제물 pSZ1500(서열 번호 17)에 의해 후속적으로 형질전환된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)의 고전적으로 돌연변이유발된(고차의 오일 생성을 위해) 유도체이다. KASII 효소의 발현을 증가시키기 위해 이 균주를 작제물 pSZ2276에 의한 형질전환을 위한 숙주로서 사용한 한편, 내인성 아실-ACP 티오에스테라제 유전적 좌위를 동시에 제거하여 균주 E를 만들었다. pSZ2276 형질전환 작제물은 클로렐라 프로토테코이데스 액틴 프로모터/5'UTR(서열 번호 22) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에 아라비돕시스 탈리아나(A. thaliana) THIC 단백질 암호화 영역인 프로토테카 모리포르미스 핵내 게놈 내로 통합을 위해 FATA1 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 20) 및 3'(서열 번호 21) 상동성 재조합 표적화 서열(작제물에 측접)을 포함하였다. 이 AtTHIC 발현 카세트를 서열 번호 23으로서 열거하며, 선택마커로서 제공한다. 프로토테카 모리포르미스 KASII 단백질 암호화 영역은 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 8) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있었고, KASII 효소의 천연 수송 펩티드를 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일-ACP 불포화효소 수송 펩티드(서열 번호 9)로 대체하였다. 클로렐라 프로토테코이데스 S106 스테아로일-ACP 불포화효소 수송 펩티드를 포함하는 PmKASII의 코돈 최적화 서열은 서열 번호 24로서 서열목록을 제공한다. 서열 번호 25는 서열 번호 24의 단백질 번역을 제공한다. PmKASII 및 suc2의 단백질 암호화 영역을 코돈 최적화하여 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호 및PCT/US2012/023696호에 기재되어 있는 바와 같은 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 핵 유전자에서 내재한 코돈 바이어스를 반영하였다.
균주 D의 1차 pSZ2276 형질전환체를 티아민이 없는 한천 플레이트 상에서 선택하였고, 클론정제하였으며, 단일의 조작된 계통인 균주 E를 분석을 위해 선택하였다. 균주 E를 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호 및 PCT/US2012/023696호에서 기재된 바와 같이 pH5.0 및 pH7.0에서 종속 영양 지질 생성 조건 하에 배양시켰다. 지질 샘플을 각각의 형질전환체로부터의 건조 바이오매스로부터 준비하였고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 표준 지방산 메틸 에스테르 기체 크로마토그래피 불꽃 이온화(FAME GC/FID) 검출 방법을 사용하여 이들 샘플로부터의 지방산 프로파일을 분석하였다. 균주 D로 pSZ2276에 의한 형질전환으로부터 생긴 유전자이식 계통으로부터의 지방산 프로파일(전체 지방산의 영역%로서 표현)을 표 15에 나타낸다.
증가된 올레산 및 저하된 리놀레산 수준에 대해 조작된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)의 균주 A, D 및 E의 지방산 프로파일.
영역% 지방산
균주 형질전환 작제물(들) pH C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C20:1
균주 A 없음 pH 5 26.6 3.3 60.5 6.7 0.07
균주 A 없음 pH 7 28.3 4.1 58 6.5 0.06
균주 D pSZ1500 pH 5 17 3.6 77.1 0.01 0.14
균주 D pSZ1500 pH 7 19.5 5.3 72.6 0.01 0.09
균주 E pSZ1500 + pSZ2276 pH 5 4.1 2.36 88.5 0.04 3.1
균주 E pSZ1500+ pSZ2276 pH 7 2.1 7.8 87.9 0.01 0.5
표 15에 나타낸 바와 같이, CtOTE 발현 카세트를 지니는 FADc 대립유전자의 표적화된 중단은 형질전환된 미생물유기체의 지방산 프로파일에 영향을 미쳤다. 균주 D의 지방산 프로파일(pSZ1500 형질전환 벡터를 포함)은 균주 A에 대해 C16:0 및 C18:2 지방산의 동시 감소와 함께 C18:1 지방산의 증가된 조성을 나타내었다. 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) KASII 단백질을 과발현시키는 한편 동시에 FATA 유전자 좌위(이에 의해 균주 E를 만듦)를 제거하는 pSZ2276에 의한 균주 D의 후속 형질전환은 형질전환된 미생물유기체의 지방산 프로파일의 또한 추가적인 영향을 초래하였다. 균주 E의 지방산 프로파일은 균주 A 및 D에 대해 C16:0 지방산의 추가적인 감소와 함께 C18:1 지방산의 증가된 조성을 나타내었다. Amt03 프로모터로부터 발현을 유발하기 위한 pH 7에서 배양 조건 내 균주 E의 증식은 pH 5에서 배양시킨 동일한 균주에 대해 C18:0 및 C18:1 지방산에서 더 높으면서 C16:0 지방산에서 더 낮은 지방산 프로파일을 초래하였다.
이들 데이터는 리놀레산 및 팔미트산의 동시 감소된 수준과 함께 올레산의 증가된 수준에 대해 숙주 유기체의 지방산 프로파일에 영향을 미치는 다수의 유전적 변형의 유용성을 보여준다. 추가로, 이 실시예는 숙주 미생물의 지방산 프로파일을 변경시키기 위해 외인성 KASII 단백질-암호화 영역의 발현을 제어하도록 pH-조절가능 프로모터를 포함하는 카세트에 의한 내인성 FATA 대립유전자의 유전자 방해를 표적화하기 위한 재조합 폴리뉴클레오티드의 사용을 예시한다.
실시예 7: 지방산 불포화효소의 조건적 발현
이 실시예는 증식의 씨딩와 지질 생성 단계 둘 다에서 고올레산 및 매우 낮은 리놀레산 생성에 대해 이전에 조작된 프로토테카 모리포르미스 균주에서 델타 12 지방산 불포화효소(FAD)를 조건적으로 발현시키기 위한 형질전환 벡터의 사용을 기재한다. 천연 오일 중의 매우 낮은 리놀레산 수준은 특정 적용에서 사용을 위해 추구된다. 그러나, 숙주 미생물의 세포 분열 단계("씨딩 단계") 동안 리놀레산의 부재는 불리하다. 리놀레산은 세포분열을 촉진하기 위해 씨딩 배지에 보충될 수 있고, 지질 생성 동안 첨가되지 않을 수 있지만, 이 첨가는 원치않는 비용을 부과한다. 이 문제를 극복하기 위해, 형질전환 카세트를 FAD2 효소의 조절된 발현을 위해 구성하였으므로 세포분열을 위해 충분한 리놀레산의 수준이 달성될 수 있었고, 매우 낮은 수준의 리놀레산을 지니는 오일은 미생물유기체 배양의 오일 생성 단계 동안 생성될 수 있었다. 이 실시예에서 사용한 형질전환 카세트는 선택마커, pH-조절가능 프로모터, 및 미생물유기체를 조작하도록 프로토테카 모리포르미스 FAD2 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하였고, 이때 형질전환된 미생물유기체의 지방산 프로파일은 증가된 올레산 생성 및 조절가능한 리놀레산 생성을 위해 변경되었다.
실시예 5, 실시예 6에서 및 PCT/US2012/023696호에서 기재된 균주 D는 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호 및 PCT/US2012/023696호에 기재되어 있는 바이오리스틱 형질전환 방법에 따라 형질전환 작제물 pSZ1500(서열 번호 17)에 의해 후속적으로 형질전환된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)의 고전적으로 돌연변이유발된(고차의 오일 생성을 위해) 유도체이다. 이 균주를 작제물 pSZ2413에 의한 형질전환을 위한 숙주로서 사용하여 프로토테카 모리포르미스 FAD2 효소의 조절을 위한 pH-구동 프로모터를 도입하였다. pSZ2413 형질전환 작제물은 클로렐라 프로토테코이데스 액틴 프로모터/5'UTR(서열 번호 22) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에 아라비돕시스 탈리아나(A. thaliana) THIC 단백질 암호화 영역인 프로토테카 모리포르미스 핵내 게놈 내로 통합을 위해 6S 게놈 영역에 대해 5'(서열 번호 1) 및 3'(서열 번호 2) 상동성 재조합 표적화 서열(작제물에 측접)을 포함하였다. 이 AtTHIC 발현 카세트를 서열 번호 23으로서 열거하고, 선택마커로서 제공한다. 프로토테카 모리포르미스 FAD2 단백질 암호화 영역은 프로토테카 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR (서열 번호 8) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있었다. PmFAD2의 코돈 최적화된 서열은 서열 번호 26로서 서열목록을 제공한다. 서열 번호 27은 서열 번호 26의 단백질 번역을 제공한다. PmFAD2 및 suc2의 단백질 암호화 영역을 코돈 최적화하여 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재되어 있는 바와 같은 프로토테카 모리포르미스 UTEX 1435 핵 유전자에 내재된 코돈 바이어스를 반영하였다.
균주 D의 1차 pSZ2413 형질전환체를 티아민이 없는 한천 플레이트 상에서 선택하였고, 클론정제하였으며, 조작된 계통의 분리물인 균주 F를 분석을 위해 선택하였다. 이들 분리물을 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호 및 PCT/US2012/023696호에 기재되어 있는 바와 같이 pH7.0에서(PmAmt03 프로모터로부터 FAD2의 발현을 활성화함) 및 pH5.0에서 종속 영양 지질 생성 조건 하에서 배양시켰다. 지질 샘플을 각 형질전환체로부터의 건조 바이오매스로부터 준비하였고, 이들 샘플로부터의 지방산 프로파일을 실시예 1에 기재한 바와 같은 표준 지방산 메틸 에스테르 기체 크로마토그래피 불꽃 이온화(FAME GC/FID) 검출 방법을 사용하여 분석하였다. 균주 D로 pSZ2413에 의한 형질전환으로부터 생긴 유전자이식 균주 F(F-1 내지 F-9)의 9개 대표적인 분리물로부터 C18:2 지방산의 얻어진 프로파일(영역%로 표현)을 표 16에 나타낸다.
프로토테카 모리포르미스 (UTEX 1435) 균주 A, D 및 F의 C18:2 지방산 프로파일.
균주 형질전환 작제물(들) 영역% C18:2
pH 5.0 pH 7.0
A 없음 6.07 7.26
D pSZ1500 0.01 0.01
F-1 pSZ1500 + pSZ2413 0.37 5.29
F-2 pSZ1500 + pSZ2413 0.45 6.87
F-3 pSZ1500 + pSZ2413 0.50 6.79
F-4 pSZ1500 + pSZ2413 0.57 5.06
F-5 pSZ1500 + pSZ2413 0.57 7.58
F-6 pSZ1500 + pSZ2413 0.60 6.88
F-7 pSZ1500 + pSZ2413 0.62 6.52
F-8 pSZ1500 + pSZ2413 0.63 5.79
F-9 pSZ1500 + pSZ2413 0.77 4.53
표 16에서 나타내는 바와 같이, 상이한 pH 수준에서 균주 배양을 통해 달성된 PmFAD2 효소의 조절된 발현의 영향은 형질전환된 미생물유기체에서 C18:2 지방산의 조성에서 분명한 증가이다. 리놀레산은 약 6% 내지 약 7.3%의 균주 A의 지방산을 포함한다. 대조적으로, 균주 D(FAD2 대립유전자를 둘 다 제거하는 pSZ1500 형질전환 벡터를 포함)는 0.01% 리놀레산의 지방산 프로파일을 특징으로 한다. 균주 F를 만드는 pSZ2413에 의한 균주 D의 형질전환은 재조합 미생물을 야기하는데, 이때 리놀레산의 생성은 Amt03 프로모터에 의해 조절된다. Amt03 프로모터로부터 FAD2 발현을 유발하기 위한 pH 7에서 배양 조건에서 균주 F 분리물의 증식은 약 4.5% 내지 약 7.5% 리놀레산을 특징으로 하는 지방산 프로파일을 초래하였다. 대조적으로, pH 5에서 배양 조건 내 균주 F 분리물의 증식은 약 0.33 내지 약 0.77% 리놀레산을 특징으로 하는 지방산 프로파일을 초래하였다.
이들 데이터는 조작된 미생물유기체의 지방산 프로파일을 변경하기 위한 FAD2 효소의 조건적 발현을 허용하고, 특히 미생물 세포 내 C18:2 지방산의 생성을 조절하는 것에서 재조합 폴리뉴클레오티드의 유용성 및 유효성을 보여준다.
실시예 8: 위치특이적 프로파일의 분석
LC/MS TAG 분포 분석을 SIL-30AC 자동 샘플러, 2개의 LC-30AD 펌프, DGU-20A5 인라인 탈기기, 및 CTO-20A 컬럼 오븐(APCI 공급원이 장착된 Shimadzu LCMS 8030 3중 사극자 질량 분석기에 연결됨)을 포함한, Shimadzu Nexera 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 수행하였다. CID 가스(아르곤) 압력이 230 kPa로 설정된 양이온 모드에서 1428 u/초의 주사 속도에서 m/z 350~1050의 Q3 주사를 사용하여 데이터를 획득하였다. APCI, 탈용매화 라인, 및 열 차단 온도는 각각 300℃, 250℃, 및 200℃로 설정하였고, 분무 및 건조 가스의 유속은 각각 3.0 L/분 및 5.0 L/분이었으며, 계면 전압은 4500 V이었다. 오일 샘플을 디클로로메탄-메탄올(1:1)에 5 mg/mL의 농도로 용해하였고, 0.8 μL의 샘플을 30℃에서 유지시킨 Shimadzu Shim-pack XR-ODS III(2.2 μm, 2.0 x 200 mm)으로 주입하였다. 0.48 mL/분으로 27분에 걸쳐서 30% 디클로로메탄-2-프로판올(1:1)/아세토니트릴에서 51% 디클로로메탄-2-프로판올(1:1)/아세토니트릴로의 선형 구배를 크로마토그래피 분리에 사용하였다.
실시예 9: SOS , POP , 및 POS 트리아실글리세리드의 생성 증가를 위한 미생물의 조작
이 실시예는 형질전환된 미생물유기체의 트리아실글리세리드 분포가 SOS, POS, 및 POP 트리아실글리세리드에 풍부화된 미생물유기체를 조작하기 위한, C18:0 선호 브라시카 나푸스 티오에스테라제(BnOTE) 효소를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 사용을 기재한다.
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435), 즉 균주 A의 고전적으로 돌연변이유발된 균주를 처음에 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 바이오리스틱 형질전환 방법에 따라 플라스미드 작제물 pSZ1358로 형질전환시켰다. 본 명세서에 참조로서 포함되어 있는 PCT/US2012/023696호에 기재된 pSZ1358은 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR(서열 번호 5) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에서 브라시카 나푸스 티오에스테라제(BnOTE) 티오에스테라제(서열 번호 28), 6S 게놈 영역에 대해 상동성인 5'(서열 번호 1) 및 3'(서열 번호 2) 재조합 표적화 서열(작제물에 측접)(핵내 게놈으로의 통합용), 및 에스. 세레비지아에 suc2 수크로스 전화효소 암호화 영역(서열 번호 4)(서열 번호 3에 주어진 단백질 서열을 발현함)을 포함하였다. 이러한 에스. 세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 7로서 열거되어 있으며, 선택 마커로서 작용한다. 서열 번호 29에 주어진 단백질 서열을 발현시키기 위하여 BnOTE 단백질 암호화 서열은 피. 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 8) 및 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR의 제어 하에 있었다. BnOTE 및 suc2의 단백질 암호화 영역을 코돈 최적화하여 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 피. 모리포르미스 UTEX 1435 핵 유전자에 내재한 코돈 바이어스를 반영하였다.
균주 A의 일차 pSZ1358 형질전환체를 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스를 포함하는 한천 플레이트 상에서 선별하고, 클론정제하였으며, 단일 조작된 계통인 균주 G를 분석을 위하여 선별하였다. PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같이 균주 G를 (PmAmt03 프로모터로부터 BnOTE의 발현을 활성화시키기 위하여) 종속영양의 지질 생성 조건 하 pH7.0에서 배양하였다. 균주 A 및 균주 G로부터 얻은 오일 샘플을 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 방법을 사용하여 지방산 조성에 대하여 분석하고, 실시예 8에 기재된 방법을 사용하여 오일 중 트리아실글리세리드의 위치특이성에 대하여 분석하였다. 균주 A 및 균주 G로부터 분리된 TAG의 지방산 프로파일은 표 17에 나타내어져 있다. 표 18은 균주 A 및 균주 G로부터의 오일 샘플에 존재하는 POP, POS, 및 SOS TAG의 위치특이성 프로파일을 제시한다.
형질전환된 프로토테카 모리포르미스로부터 생성된 TAG의 지방산 조성 및 sn-2 프로파일에 대한 BnOTE 발현의 효과.
균주 A 균주 G ( pSZ1358 )
영역% 지방산 FA 프 로파 일 FA
프로파일
C10 :0 n.r. 0.5
C12 :0 n.r. 0.5
C14 :0 1.0 1.3
C16 :0 23.9 25.8
C18 :0 3.7 30.4
C18 :1 64.3 30.2
C18 :2 4.5 8.8
C18 :3α n.r. 0.4
형질전환된 프로토테카 모리포르미스로부터 생성된 POP, POS, 및 SOS TAG의 위치특이적 프로파일에 대한 BnOTE 발현의 효과.
균주 A ( 비형질전환 ) 균주 G ( pSZ1358 ) 코코아버터
TAG 영역% 정규화된 영역% 영역% 정규화된 영역% 영역% 정규화된 영역%
POP 13.09 76.8 10.6 23.5 17.9 22.1
POS 3.51 20.5 21.0 46.6 39.2 48.4
SOS 0.45 2.6 13.5 29.9 23.9 29.5
전체 17.05 100 45.0 100 81.1 100
표 17에 나타낸 바와 같이, BnOTE를 발현하는 균주 G로부터 TAG의 지방산 조성은 비형질전환 균주 A로부터 분리된 TAG의 지방산 프로파일에 비해 C18:0 지방산에 있어서 현저하게 증가하였고(3.7%에서 30.4%), C18:1 지방산에서 감소하였다(64.3%에서 30.2%). 균주 A로부터 분리된 TAG의 지방산 조성은 약 23.9% 팔미트산, 3.7% 스테아르산, 및 64.3% 올레산, 즉 약 6.5:1:17.4의 P:S:O에 대한 비를 특징으로 하였다. 반대로, 균주 G로부터 분리된 TAG의 지방산 조성은 약 25.8% 팔미트산, 30.4% 스테아르산, 및 30.2 % 올레산, 즉 약 1:1.18:1.17의 P:O:S에 대한 비를 특징으로 하였다.
형질전환된 미생물유기체로부터 생성된 오일의 POP, POS, 및 SOS TAG의 위치특이적 프로파일에 대한 C18:0 선호 티오에스테라제의 발현의 영향은 오일에 존재하는 전체 TAG의 비율로서 3가지 모든 TAG에서 증가하는 것이었다. 표 18에 나타낸 바와 같이, POP + POS + SOS TAG의 합은 균주 G에 의해 생성된 TAG의 45%를 차지하는 반면, POP, POS, 및 SOS TAG는 합계하여 균주 A에서 생성된 TAG의 단지 약 17%가 되었다. 균주 G의 POP, POS 및 SOS의 백분율은 표 18에서 코코아 버터와 비교되어 있다. 알 수 있는 바와 같이, 균주 G의 POP, POS 및 SOS의 비는 코코아 버터에서 관찰되는 비와 매우 유사하다.
이들 데이터는 조작된 미생물유기체 TAG의 지방산 및 위치특이적 프로파일을 변경시키기 위해, 특히 POP, POS, 및 SOS TAG의 분포를 증가시키기 위하여, 외인성 티오에스테라제 발현을 허용하는 폴리뉴클레오티드의 유용성 및 유효성을 입증한다.
실시예 10 내지 33: 미생물유기체의 조작
이하의 실시예 10 내지 실시예 33은 본 발명에 따른 다양한 미생물유기체의 조작을 기재한다. 미생물유기체의 지방산 프로파일을 변경시키기 위해, 미생물유기체는 유전적으로 변형될 수 있되, 내인성 또는 외인성 지질 생합성 경로 효소는 발현되거나, 과발현되거나 또는 약화된다.지방산 불포화 정도에 대해서와 같이 미생물의 지방산 프로파일을 변경하기 위해 그리고 지방산 사슬 길이를 감소시키거나 또는 증가시키기 위해 미생물을 유전적으로 조작하는 단계는 형질전환 벡터(예를 들어, 플라스미드)의 설계 및 구성, 하나 이상의 벡터에 의한 미생물의 형질전환, 형질전환된 미생물(형질전환체)의 선택, 형질전환된 미생물의 생장 및 조작된 미생물에 의해 생성된 지질의 지방산 프로파일의 분석을 포함한다.
숙주 유기체의 지방산 프로파일을 변경시키는 이식유전자를 수많은 진핵 미생물에서 발현시킬 수 있다. 클라미도모나스 레인하르드티, 클로렐라 엘립소이데아, 클로렐라 사카로필라(Chlorella saccarophila), 클로렐라 불가리스, 클로렐라 케슬레리(Chlorella kessleri), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 하에마토코커스 풀비알리스(Haematococcus pluvialis), 고니움 펙토랄레(Gonium pectorale), 볼복스 카르테리(Volvox carteri), 두날리엘라 테르티오렉타(Dunaliella tertiolecta), 두날리엘라 비리디스(Dunaliella viridis), 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina), 클로스테리움 페라세로숨(Closterium peracerosum)-스트리고숨(strigosum)-리토랄레(littorale) 복합체, 나노클로롭시스 종(Nannochloropsis sp .), 탈라시오시라 슈도나나(Thalassiosira pseudonana), 파에오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum), 나비쿨라 사프로필라(Navicula saprophila), 실린드로테카 푸시포르미스(Cylindrotheca fusiformis), 시클로텔라 크립티카(Cyclotella cryptica), 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰(Symbiodinium microadriacticum), 암피디니움 종(Amphidinium sp .), 카에토세로스 종(Chaetoceros sp .), 모리티에렐라 알피나(Mortierella alpina), 및 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하는 진핵 미생물 내 이식유전자 발현의 예는 과학 문헌에서 찾는다. 이들 발현 기법은 변경된 지방산 프로파일을 지니는 조작된 미생물유기체를 생성하기 위해 본 발명의 교시 내용과 조합할 수 있다.
숙주 유기체의 지방산 프로파일을 변경시키거나 또는 숙주 유기체에 의해 생성된 글리세롤지질의 위치특이적 분포를 변경시키는 이식유전자를 또한 수많은 원핵 미생물에서 발현시킬 수 있다. 로돕코커스 오파쿠스(Rhodococcus opacus)를 포함하는 유성 미생물 내 이식유전자 발현의 실시예를 문헌에서 발견할 수 있다. 이들 발현 기법은 변경된 지방산 프로파일을 지니는 조작된 미생물유기체를 생성하기 위해 본 발명의 교시 내용과 조합될 수 있다.
표 19A 내지 표 19D. 코돈 선호도 목록.
[표 19A]
Figure pct00003
Figure pct00004
[표 19B]
Figure pct00005
Figure pct00006
[표 19C]
Figure pct00007
Figure pct00008
[표 19D]
Figure pct00009
Figure pct00010
지질 생합성 경로 단백질.
3- 케토아실 ACP 합성 효소

쿠페아 후커리아나(Cuphea hookeriana) 3-케토아실-ACP 합성 효소(GenBank 등록번호 AAC68861.1), 쿠페아 라이티 베타- 케토아실-ACP 합성 효소 II(GenBank 등록번호 AAB37271.1), 쿠페아 란세올라타(Cuphea lanceolata) 베타- 케토아실-ACP 합성 효소 IV(GenBank 등록번호 CAC59946.1), 쿠페아 라이티 베타- 케토아실 - ACP 합성 효소 II( GenBank 등록번호 AAB37270.1), 리시누스 콤무니스 케토아실 - ACP 합성 효소( GenBank 등록번호 XP_002516228 ), 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum) 케토아실 - ACP 합성 효소( GenBank 등록번호 ADK23940.1), 글리신 맥스 색소체 3- 케토 -아실- ACP 합성 효소 II -A(GenBank Acc No.AAW88763.1), 엘라이스 기넨시스(Elaeis guineensis) 베타-케토아실-ACP 합성 효소 II(GenBank 등록번호 AAF26738.2), 헬리안투스 아누스 색소체 3-케토-아실-ACP 합성 효소 I(GenkBank 등록번호 ABM53471.1), 글리신 맥스3-케토-아실-ACP 합성 효소 I(GenkBank 등록번호 NP_001238610.1), 헬리안투스 아누스 색소체 3-케토-아실-ACP 합성 효소 II(GenBank Acc ABI18155.1), 브라시카 나푸스(Brassica napus) 베타- 케토아실 - ACP 신테타제 2(GenBank 등록번호 AAF61739 .1), 페릴라 프루테센스(Perilla frutescens) 베타-케토아실-ACP 합성 효소 II(GenBank 등록번호 AAC04692.1), 헬리안투스 안누스(Helianthus annus) 베타-케토아실-ACP 합성 효소 II(GenBank 등록번호. ABI18155), 리시누스 콤무니스 베타-케토아실-ACP 합성 효소 II(GenBank 등록번호. AAA33872), 하에마토코커스 풀비알리스 베타-케토아실 아실 운반 단백질 합성 효소(GenBank 등록번호. HM560033.1), 야트로파 쿠르카스(Jatropha curcas)베타 케토아실-ACP 합성 효소 I(GenBank 등록번호. ABJ90468.1), 포퓰러스 트리코카르파(Populus trichocarpa) 베타-케토아실-ACP 합성 효소 I(GenBank 등록번호. XP_002303661.1), 코리안드럼 사티붐(Coriandrum sativum) 베타-케토아실-ACP 신테타제 I(GenBank 등록번호. AAK58535.1), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 3-옥소아실-[아실-운반-단백질] 합성 효소 I(GenBank 등록번호. NP_001190479.1), 비티스 비니페라(Vitis vinifera)3-옥소아실-[아실-운반-단백질] 합성 효소 I(GenBank 등록번호. XP_002272874.2)

지방 아실- ACP 티오에스테라제

엄벨루라리아 캘리포르니카(Umbellularia californica)지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAC49001), 신나모뭄 캄포라(Cinnamomum camphora) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 Q39473), 엄벨루라리아 캘리포르니카 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 Q41635), 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAB71729), 미리스티카 프라그란스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAB71730), 엘라이스 기넨시스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 ABD83939), 엘라이스 기넨시스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAD42220), 포풀러스 토멘토사(Populus tomentosa) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 ABC47311), 아라비돕시스 탈리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 NP_172327), 아라비돕시스 탈리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 CAA85387), 아라비돕시스 탈리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 CAA85388), 고시피움 히르수툼 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 Q9SQI3), 쿠페아 란세올라타 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 CAA54060), 쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAC72882), 쿠페아 칼로필라 아종 메조스테몬(Cuphea calophylla subsp . mesostemon) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 ABB71581), 쿠페아 란세올라타 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 CAC19933), 엘라이스 기넨시스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAL15645), 쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 Q39513), 고시피움 히르수툼 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAD01982), 비티스 비니페라 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 CAN81819), 가르시니아 망고스타나(Garcinia mangostana) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAB51525),부라시카 준세아(Brassica juncea) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 ABI18986), 마듀카 롱기폴리아(Madhuca longifolia) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAX51637), 브라시카 나푸스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 ABH11710), 브라시카 나푸스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 CAA52070.1), 오리자 사티바(Oryza sativa)(인디카 재배품종집단) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 EAY86877), 오리자 사티바 (japonica cultivar-group) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 NP_001068400), 오리자 사티바 (인디카 재배품종집단) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 EAY99617), 쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAC49269), Ulmus Americana 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAB71731), 쿠페아 란세올라타 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 CAB60830), 쿠페아 팔루스트리스(Cuphea palustris) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAC49180), 이리스 게르마니카(Iris germanica) 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAG43858, 이리스 게르마니카 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAG43858.1), 쿠페아 팔루스트리스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAC49179), 미리스티카 프라그란스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAB71729), 미리스티카 프라그란스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 AAB717291.1), 쿠페아 후커리아나 지방 아실-ACP 티오에스테라제 GenBank 등록번호 U39834), Umbelluaria californica 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 M94159), 신나모뭄 캄포라 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 U31813), 리시누스 콤무니스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호 ABS30422.1), 헬리안투스 아누스 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호. AAL79361.1), 야트로파 쿠르카스 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호. ABX82799.3), 제아 마이스oleoyl-아실 운반 단백질 티오에스테라제,(GenBank 등록번호. ACG40089.1), 하에마토코커스 풀비알리스 지방 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 등록번호. HM560034.1)

불포화효소 효소

리눔 우시타티시뭄(Linum usitatissimum) 지방산 불포화효소 3C,(GenBank 등록번호 ADV92272.1), 리시누스 콤무니스 오메가-3 지방산 불포화효소, 소포체, 추정,(GenBank 등록번호 EEF36775.1), 베르니시아 포르디(Vernicia fordii) 오메가-3 지방산 불포화효소,(GenBank 등록번호 AAF12821), 글리신 맥스 엽록체 오메가 3 지방산 불포화효소 이소폼 2,(GenBank 등록번호 ACF19424.1), 프로토테카 모리포르미스FAD-D 오메가 3 불포화효소(서열 번호 155), 프로토테카 모리포르미스리놀레에이트 불포화효소(서열 번호 156), 카르타무스 틴크토리우스(Carthamus tinctorius) 델타 12 불포화효소,(GenBank 등록번호. ADM48790.1), 고시피움 히르수툼 오메가-6 불포화효소,(GenBank 등록번호. CAA71199.1), 글리신 맥스 마이크로솜 불포화효소(GenBank 등록번호. BAD89862.1), 제아 마이스(Zea mays) 지방산 불포화효소(GenBank 등록번호. ABF50053.1), 브라시카 나파(Brassica napa) 리놀렌산 불포화효소(GenBank 등록번호. AAA32994.1), 카멜리나 사티바오메가-3 불포화효소(서열 번호 157), 프로토테카 모리포르미스델타 12 불포화효소 대립유전자 2(서열 번호 158, 카멜리나 사티바(Camelina sativa)오메가-3 FAD7-1(서열 번호 159), 헬리안투스 아누스 스테아로일-ACP 불포화효소,(GenBank 등록번호. AAB65145.1), 리시누스 콤무니스 스테아로일-ACP 불포화효소,(GenBank 등록번호. AACG59946.1), 부라시카 준세아 색소체 델타-9-스테아로일-ACP 불포화효소(GenBank 등록번호. AAD40245.1), 글리신 맥스 스테아로일-ACP 불포화효소(GenBank 등록번호. ACJ39209.1), 올레아 유로파에아(Olea europaea) 스테아로일-ACP 불포화효소(GenBank 등록번호. AAB67840.1), 베르니시아 포르디 스테아로일-아실-운반 단백질 불포화효소,(GenBank 등록번호. ADC32803.1), 데스쿠라이니아 소피아(Descurainia sophia) 델타-12 지방산 불포화효소(GenBank 등록번호. ABS86964.2), 유포르비아 라가스카에(Euphorbia lagascae) 델타12-올레산 불포화효소(GenBank 등록번호 AAS57577.1), 클로렐라 불가리스 델타 12 지방산 불포화효소(GenBank 등록번호. ACF98528),클로렐라 불가리스 오메가-3 지방산 불포화효소(GenBank 등록번호. BAB78717), 하에마토코커스 풀비알리스 오메가-3 지방산 불포화효소(GenBank 등록번호. HM560035.1), 하에마토코커스 풀비알리스 스테아로일-ACP-불포화효소 GenBank 등록번호. EF586860.1, 하에마토코커스 풀비알리스 스테아로일-ACP-불포화효소 GenBank 등록번호. EF523479.1

올레에이트 12-하이드록실라제 효소

리시누스 콤무니스 올레에이트 12-하이드록실라제(GenBank 등록번호 AAC49010.1),
피사리아 린드헤이메리(Physaria lindheimeri) 올레에이트 12-하이드록실라제(GenBank 등록번호 ABQ01458.1),
피사리아 린드헤이메리 돌연변이체 이작용성 올레에이트 12-하이드록실라제:불포화효소(GenBank 등록번호 ACF17571.1), 피사리아 린드헤이메리 이작용성 올레에이트 12-하이드록실라제:불포화효소(GenBank 등록번호. ACQ42234.1), 피사리아 린드헤이메리 이작용성 올레에이트 12-하이드록실라제:불포화효소(GenBank 등록번호 AAC32755.1), 아라비돕시스 리라타 아종 리라타(Arabidopsis lyrata subsp . Lyrata)(GenBank 등록번호 XP_002884883.1)

글리세롤-3-포스페이트 효소

아라비돕시스 탈리아나 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 BAA00575, 클라미도모나스 레인하르드티 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 EDP02129), 클라미도모나스 레인하르드티 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 Q886Q7), 쿠쿠르비타 모스차타(Cucurbita moschata) 아실-(아실-carrier-단백질):글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 BAB39688), 엘라이스 기넨시스 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제, ((GenBank 등록번호 AAF64066), 가르시나 망고스타나(Garcina mangostana) 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 ABS86942), 고시피움 히르수툼 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 ADK23938), 야트로파 쿠르카스 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 ADV77219), 야트로파 쿠르카스 색소체 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 ACR61638), 리시누스 콤무니스 색소체 글리세롤-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 EEF43526), 비카 파바(Vica faba) 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호. AAD05164), 제아 마이스 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 ACG45812)

리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제 효소

아라비돕시스 탈리아나 1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호. AEE85783), 부라시카 준세아 1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호. ABQ42862 ), 부라시카 준세아 1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호. ABM92334), 브라시카 나푸스 1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호. CAB09138), 클라미도모나스 레인하르드티 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호. EDP02300), 코코스 누시페라(Cocos nucifera) 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 AAC49119), 림난테스 알바(Limnanthes alba) 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호. EDP02300), 림난테스 도우글라시(Limnanthes douglasii) 1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(추정)(GenBank 등록번호. CAA88620), 림난테스 도우글라시아실-CoA:sn-1-아실글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호. ABD62751), 림난테스 도우글라시1-아실글리세롤-3-포스페이트 O-아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호. CAA58239), 리시누스 콤무니스 1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호. EEF39377)

디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 효소

아라비돕시스 탈리아나 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 CAB45373), 부라시카 준세아 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 AAY40784), 엘라이스 기넨시스
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인지질 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 효소

아라비돕시스 탈리아나 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 AED91921), 엘라이스 기넨시스추정 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 AEQ94116), 글리신 맥스 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 1-like(GenBank 등록번호 XP_003541296), 야트로파 쿠르카스 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 AEZ56255), 리시누스 콤무니스 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 ADK92410), 리시누스 콤무니스 인지질:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(GenBank 등록번호 AEW99982)
실시예 10: 클로렐라 소로키니아나 의 조작
클로렐라 소로키니아나에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의되는 바와 같은 문헌[Dawson et al .]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형시킴으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Dawson et al ., Current Microbiology Vol. 35 (1997) pp. 356-362]은 플라스미드 DNA에 의한 클로렐라 소로키니아나의 안정한 핵 형질전환을 보고하였다. 미세입자투사법(microprojectile bombardment)의 형질전환 방법을 사용하여, Dawson은 전체 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 유전자(NR, GenBank 등록번호. U39931)를 암호화하는 플라스미드 pSV72-NRg를 돌연변이체 클로렐라 소로키니아나(NR-돌연변이체) 내로 도입하였다. NR-돌연변이체는 질소 공급원으로서 질산염을 사용하지 않고는 생장이 불가능하다. 질산염 환원 효소는 질산염의 아질산염으로 전환을 촉진시킨다. 형질전환 전, 클로렐라 소로키니아나 NR-돌연변이체는 유일한 질소 공급원으로서 질산염(NO3 -)을 포함하는 배양 배지 상에서 미소군락 단계 이상으로 생장할 수 없었다. NR-돌연변이체 클로렐라 소로키니아나에서 클로렐라 불가리스 NR 유전자 산물의 발현을 선택마커로서 사용하여 질산염 대사 결핍에서 구하였다. pSV72-NRg 플라스미드에 의한 형질전환시, 유일한 탄소 공급원으로서 질산염을 포함하는 한천 플레이트 상에서 미소군락 단계 이상으로 생장할 수 있는 클로렐라 불가리스 NR 유전자 산물을 안정하게 발현시키는 NR-돌연변이체 클로렐라 소로키니아나를 얻었다. 안정한 형질전환체의 DNA 평가를 서던 분석에 의해 수행하였고, 안정한 형질전환체의 RNA 평가를 RNase 보호에 의해 수행하였다. 클로렐라 소로키니아나(NR 돌연변이체)의 선택 및 유지를 0.2g/L MgSO4, 0.67g/L KH2PO4, 3.5g/L K2HPO4, 1.0g/L Na3C6H5O7·H2O 및 16.0g/L 한천, 적절한 질소 공급원(예를 들어, NO3 -), 미량요소 및 탄소 공급원을 포함하는 한천 플레이트(pH 7.4) 상에서 수행하였다. Dawson은 또한 액체 배양 배지에서 클로렐라 소로키니아나 및 클로렐라 소로키니아나 NR 돌연변이체의 증식을 보고하였다. Dawson은 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 유전자의 플라스미드 pSV72-NRg 및 프로모터 및 3' UTR/종결자가 클로렐라 소로키니아나 NR-돌연변이체에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하였다는 것을 보고하였다. Dawson은 또한 클로 렐라 불가리스 질산염 환원 효소 유전자 산물의 발현이 클로렐라 소로키니아나 NR-돌연변이체에서 선택마커로서 적합하였다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소(CvNR) 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pSV72-NRg를 구성하고 변형시켜 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하고, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하고, 클로렐라 소로키니아나 내 발현을 위해 각 단백질 암호 서열을 코돈 최적화하여 표 19A 내지 표 19D에 따른 클로렐라 소로키니아나의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 CvNR 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있고, 단백질-암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 CvNR 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 클로렐라 소로키니아나 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 미세입자투사법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 형질전환 벡터에 의한 클로렐라 소로키니아나의 안정한 형질전환을 달성한다. 클로렐라 소로키니아나 NR 돌연변이체 균주의 질소 동화 결핍에서 구하기 위해 그리고 형질전환 벡터를 안정하게 발현시키는 클로렐라 소로키니아나 NR-돌연변이체에 대해 선택하기 위해 CvNR 유전자 산물의 활성을 선택마커로서 사용할 수 있다. 클로렐라 소로키니아나 지질 생성에 적합한 생장 배지는 보충적 미량요소 및 적절한 질소 및 탄소 공급원과 함께 0.5g/L KH2PO4, 0.5g/L K2HPO4, 0.25g/L MgSO4-7H2O를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(Patterson, Lipids Vol.5:7 (1970), pp.597-600). 클로렐라 소로키니아나 지질의 평가를 표준 지질 추출법 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가할 수 있다.
실시예 11: 클로렐라 불가리스 의 유전자 조작
클로렐라 불가리스에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Chow and Tunget al .]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Chow and Tung et al ., Plant Cell Reports, Volume 18 (1999), pp. 778-780]은 플라스미드 DNA에 의한 클로렐라 불가리스의 안정한 핵 형질전환을 보고하였다. 전기천공법의 형질전환 방법을 사용하여, Chow 및 Tung은 플라스미드 pIG121-Hm(GenBank 등록번호. AB489142)을 클로렐라 불가리스 내로 도입하였다. pIG121-Hm의 뉴클레오티드 서열은 GUS 단백질 암호 서열의 상류의 CaMV 35S 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 추가로 GUS 단백질-암호 서열의 하류의 노팔린 합성 효소(nos) 유전자의 3' UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 베타 글루쿠로니다제(GUS) 수용체 유전자 산물을 암호화하는 서열을 포함하였다. 플라스미드 pIG121-Hm의 서열은 하이그로마이신 B 항생제 저항성 카세트를 추가로 포함하였다. 이 하이그로마이신 B 항생제 저항성 카세트는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hpt, GenBank 등록번호. BAH24259) 유전자 산물을 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결된 CaMV 35S 프로모터를 포함하였다. 형질전환 전, 클로렐라 불가리스는 50ug/ml 하이그로마이신 B를 포함하는 배양 배지에서 증식될 수 없었다. pIG121-Hm 플라스미드에 의한 형질전환 시, 50ug/ml 하이그로마이신 B를 포함하는 배양 배지에서 증식된 클로렐라 불가리스의 형질전환체를 얻었다. 클로렐라 불가리스 내 hpt 유전자 산물의 발현은 50ug/mL 하이그로마이신 B의 존재에서 형질전환된 클로렐라 불가리스의 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 클로렐라 불가리스에서 사용을 위한 선택마커로서 하이크로마이신 B 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. GUS 리포터 유전자의 검출가능한 활성은 CaMV 35S 프로모터 및 nos 3?TR이 클로렐라 불가리스에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 나타내었다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 형질전환된 클로렐라 불가리스의 선택 및 유지를 YA 배지를 포함하는 한천 플레이트(한천 및 4g/L 효모 추출물) 상에서 수행하였다. 액체 배양 배지 내 클로렐라 불가리스의 증식을 Chow와 Tung에 의해 논의된 바와 같이 수행하였다. YA 배지가 아닌 배지 내 클로렐라 불가리스의 증식을 기재하였다(예를 들어, 문헌[Chader et al., Revue des Energies Renouvelabes, Volume 14 (2011), pp. 21-26 및 Illman et al., Enzyme and Microbial Technology, Vol. 27 (2000), pp. 631-635] 참조). Chow와 Tung은 플라스미드 pIG121-Hm, CaMV 35S 프로모터, 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 노팔린 합성 효소 유전자 3'UTR/종결자가 클로렐라 불가리스에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, Chow와 Tung은 하이그로마이신 B 저항성 카세트가 클로렐라 불가리스에서 선택마커로서 사용에 적합하다는 것을 보고하였다. 클로렐라 불가리스에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합한 추가적인 플라스미드, 프로모터, 3'UTR/종결자 및 선택마커는 문헌[Chader et al., Revue des Energies Renouvelabes, Volume 14 (2011), pp. 21-26]에서 논의되었다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 하이그로마이신 B 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pIG121-Hm은 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 클로렐라 불가리스에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 클로렐라 불가리스의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 CaMV 35S에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성 효소 유전자 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 클로렐라 불가리스 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택할 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 클로렐라 불가리스의 안정한 형질전환을 전기천공법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. 하이그로마이신 B 저항성 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 하이그로마이신을 포함하는 한천 배지 상에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 클로렐라 불가리스에 대해 선택하기 위한 마커로서 사용할 수 있다. 클로렐라 불가리스 지질 생성에 적합한 생장 배지는 미량 금속, 및 선택적으로 1.5g/L NaNO3로 보충한 BG11 배지(0.04g/L KH2PO4, 0.075g/L CaCl2, 0.036g/L 시트르산, 0.006g/L 암모늄 페릭 시트레이트, 1mg/L EDTA, 및 0.02g/L Na2CO3)를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다. 지질 생성을 위해 클로렐라 불가리스를 배양하는데 적합한 추가적인 배지는 문헌[Illman et al., Enzyme and Microbial Technology, Vol. 27 (2000), pp. 631-635]에 의해 보고되는 바와 같은, 예를 들어 와타나베(Watanabe) 배지(미량요소와 함께 1.5g/L KNO3, 1.25g/L KH2PO4, 1.25gl-1 MgSO4·7H2O, 20mgl-1 FeSO4·7H2O를 포함) 및 저질소 배지(203mg/l (NH4)2HPO4, 2.236g/l KCl, 2.465g/l MgSO4, 1.361g/l KH2PO4 및 10mg/l FeSO4를 포함)를 포함한다. 클로렐라 불가리스 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 12: 클로렐라 엘립소이데아 의 조작
클로렐라 엘립소이데아에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Chen et al.]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Chen et al., Current Genetics, Vol. 39:5 (2001), pp. 365-370]은 플라스미드 DNA에 의한 클로렐라 엘립소이데아의 안정한 형질전환을 보고하였다. 전기천공법의 형질전환 방법을 사용하여, Chen은 플라스미드 pBinUWNP-1을 엘립소이데아 내로 도입하였다. pBinUWNP-1의 뉴클레오티드 서열은 NP-1 단백질 암호 역역 상류의 제아 마이스 유비퀴틴(ubi1) 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, NP-1 단백질 암호화 영역 하류의 노팔린 합성 효소(nos) 유전자의 3' UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 호중구 펩티드-1(NP-1) 토끼 유전자 산물을 암호화하는 서열을 포함하였다. 플라스미드 pBinUWNP-1의 서열은 G418 항생제 저항성 카세트를 추가로 포함하였다. 이 G418 B 항생제 저항성 카세트는 아미노글라이코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제(aph 3') 유전자 산물을 암호화하는 서열을 포함하였다. aph 3' 유전자 산물은 항생제 G418에 대한 저항성을 부여한다. 형질전환 전, 클로렐라 엘립소이데아는 30ug/mL G418을 포함하는 배양 배지에서 증식될 수 없었다. pBinUWNP-1 플라스미드에 의한 형질전환 시, 30ug/mL G418을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식된 클로렐라 엘립소이데아의 형질전환체를 얻었다. 클로렐라 엘립소이데아 내 aph 3' 유전자산물의 발현은 30ug/mL G418의 존재에서 형질전환된 클로렐라 엘립소이데아의 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 클로렐라 엘립소이데아에서 사용을 위한 선택마커로서 G418 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. NP-1 유전자 산물의 검출가능한 활성은 ubi1 프로모터 및 nos 3?TR이 클로렐라 엘립소이데아 에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 나타내었다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 형질전환된 클로렐라 엘립소이데아의 선택 및 유지를 15ug/mL G418(액체 배양물에 대해)를 지니는 또는 30ug/mL G418(1.8% 한천을 포함하는 고체 배양물에 대해)를 지니는 Knop 배지(0.1% 효모 추출물 및 0.2% 글루코스로 보충한 0.2g/L K2HPO4, 0.2g/L MgSO4 ·7H2O, 0.12g/L KCl, 및 10mg/L FeCl3, pH 6.0-8.0을 포함) 상에서 수행하였다. Knop 배지가 아닌 배지 내 클로렐라 엘립소이데아의 증식을 보고하였다(예를 들어, 문헌[Cho et al ., Fisheries Science, Vol. 73:5 (2007), pp. 1050-1056, Jarvis and Brown, Current Genetics, Vol. 19 (1991), pp.317-321 및 Kim et al ., Marine Biotechnology, Vol. 4 (2002), pp.63-73] 참조). 클로렐라 엘립소이데아에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합한 추가적인 플라스미드, 프로모터, 3?TR/종결자 및 선택마커를 보고하였다(문헌[Jarvis and Brown and Kim et al ., Marine Biotechnology, Vol. 4 (2002), pp.63-73]). 문헌[Chen]은 플라스미드 pBinUWNP-1, ubi1 프로모터, 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 노팔린 합성 효소 유전자 3?TR/종결자가 클로렐라 엘립소이데아에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Chen]은 pBinUWNP-1 상에서 암호화된 G418 저항성 카세트가 클로렐라 엘립소이데아에서 선택마커로서 사용에 적합하다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 G418에 저항성을 부여하는 aph 3' 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pBinUWNP-1은 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 클로렐라 엘립소이데아에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 클로렐라 엘립소이데아의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 제아 마이스 ubi1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성 효소 유전자 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 클로렐라 엘립소이데아에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택할 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 클로렐라 엘립소이데아의 안정한 형질전환을 전기천공법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. aph 3' 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, G418을 포함하는 Knop 한천 배지 상에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 클로렐라 불가리스에 대해 선택하기 위한 마커로서 사용할 수 있다. 클로렐라 엘립소이데아 지질 생성에 적합한 생장 배지는 Knop 배지 및 Jarvis 및 Brown 및 Kim et al에 의해 보고된 바와 같은 해당 배양 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 클로렐라 엘립소이데아 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 13: 클로렐라 케슬레리 의 유전자 조작
클로렐라 케슬레리에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[El-Sheekh et al .]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[El-Sheekh et al ., Biologia 식물 arium, Vol. 42:2 (1999), pp. 209-216]은 플라스미드 DNA에 의한 클로렐라 케슬레리의 안정한 형질전환을 보고하였다. 미세입자투사법의 형질전환 방법을 사용하여, El-Sheekh은 플라스미드 pBI121(GenBank 등록번호. AF485783)을 클로렐라 케슬레리 내로 도입하였다. 플라스미드 pBI121은 카나마이신/네오마이신 항생제 저항성 카세트를 포함하였다. 이 카나마이신/네오마이신 항생제 저항성 카세트는 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성 효소(nos) 유전자 프로모터, 카나마이신 및 G418에 저항성인 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (nptII) 유전자 산물(GenBank 등록번호. AAL92039)을 암호화하는 서열, 및 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성 효소(nos) 유전자의 3' UTR/종결자를 포함하였다. pBI121은 CaMV 35S 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, nos 유전자의 3' UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 베타-글루쿠로니다제(GUS) 리포터 유전자 산물을 암호화하는 서열을 추가로 포함하였다. 형질전환 전, 클로렐라 케슬레리는 15ug/L 카나마이신을 포함하는 배양 배지 내에서 증식될 수 없었다. pBI121플라스미드에 의한 형질전환시, 15mg/L 카나마이신을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식되는 클로렐라 케슬레리의 형질전환체를 얻었다. 클로렐라 케슬레리 내 nptII 유전자 산물의 발현은 15mg/L 카나마이신의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 클로렐라 케슬레리에서 사용을 위한 선택마커로서 카나마이신/네오마이신 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. GUS 유전자 산물의 검출가능한 활성은 CaMV 35S 프로모터 및 nos 3' UTR이 클로렐라 케슬레리에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 나타내었다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 문헌[El-Sheekh]에 의해 보고되는 바와 같이, 형질전환된 클로렐라 케슬레리의 선택 및 유지를 YEG 배지(1% 효모 추출물, 1% 글루코스) 및 15mg/L 카나마이신을 포함하는 반고체 한천 플레이트 상에서 수행하였다. 문헌[El-Sheekh]은 또한 YEG 액체 배양 배지 내 클로렐라 케슬레리의 증식을 보고하였다. 지질 생성을 위해 클로렐라 케슬레리를 배양시키기 위한 추가적인 적합한 배지는 문헌[Sato et al., BBA Molecular and Cell Biology of Lipids, Vol. 1633 (2003), pp. 27-34)]에 개시되어 있다. 문헌[El-Sheekh]은 플라스미드 pBI121, CaMV 프로모터, 및 노팔린 합성 효소 유전자 3?TR/종결자가 클로렐라 케슬레리에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[El-Sheekh]은 pBI121 상에서 암호화된 카나마이신/네오마이신 저항성 카세트가 클로렐라 케슬레리에서 선택마커로서 사용에 적합하였다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 카나마이신/네오마이신 저항성 유전자 산물을 포함하는 벡터 pBI121은 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 클로렐라 케슬레리에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 클로렐라 케슬레리의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 CaMV 35S 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성 효소 유전자 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 클로렐라 케슬레리에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택할 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 클로렐라 케슬레리의 안정한 형질전환을 미세입자투사법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. nptII 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 카나마이신 또는 네오마이신을 포함하는 YEG 한천 배지 상에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 클로렐라 케슬레리에 대해 선택하기 위한 마커로서 사용할 수 있다. 클로렐라 케슬레리 지질 생성에 적합한 생장 배지는 YEG 배지 및 문헌[Sato et al]에 의해 보고된 바와 같은 해당 배양 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 클로렐라 케슬레리 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 14: 두날리엘라 테르티오렉타의 유전자 조작
두날리엘라 테르티오렉타에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Walker et al .]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Walker et al ., Journal of Applied Phycology, Vol. 17 (2005), pp. 363-368]은 플라스미드 DNA에 의한 두날리엘라 테르티오렉타의 안정한 형질전환을 보고하였다. 전기천공법의 형질전환 방법을 사용하여, Walker는 플라스미드 pDbleFLAG1.2를 두날리엘라 테르티오렉타 내로 도입하였다. pDbleFLAG1.2는 두날리엘라 테르티오렉타 리불로스-1, 5-비스포스페이트 카복실라제/옥시게나제 소 서브유닛 유전자(rbcS1, GenBank Accession No. AY530155)의 프로모터 및 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 항생제 플레오마이신에 대한 저항성을 위해 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타너스(Streptoalloteichus hindustanus) 블레오마이신 결합 단백질(ble)을 암호화하는 서열을 포함하는, 블레오마이신 항생제 저항성 카세트를 암호화하는 서열을 포함하였다. 형질전환 전, 두날리엘라 테르티오렉타는 1mg/L 플레오마이신을 포함하는 배양 배지 내에서 증식될 수 없었다. pDbleFLAG1.2플라스미드에 의한 형질전환시, 1mg/L 플레오마이신을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식되는 두날리엘라 테르티오렉타의 형질전환체를 얻었다. 두날리엘라 테르티오렉타 내 ble 유전자 산물의 발현은 1mg/L 플레오마이신의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 두날리엘라 테르티오렉타에서 사용을 위한 선택마커로서 블레오마이신 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 문헌[Walker]에 의해 보고되는 바와 같이, 형질전환된 두날리엘라 테르티오렉타의 선택 및 유지를 4.5g/L NaCl 및 1mg/L 플레오마이신을 추가로 포함하는 두날리엘라 배지에서 수행하였다(DM, 문헌[Provasoli et al., Archiv fur Mikrobiologie, Vol. 25 (1957), pp. 392-428]에 의해 기재되는 바와 같음). 지질 생성을 위해 두날리엘라 테르티오렉타를 배양시키기 위한 추가적인 적합한 배지는 문헌[Takagi et al ., Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 101:3 (2006), pp. 223-226 및 Massart and Hanston, Proceedings Venice 2010, Third International Symposium on Energy from Biomass and Waste]에 개시되어 있다. Walker는 플라스미드 pDbleFLAG1.2 및 두날리엘라 테르티오렉타 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제/옥시게나제 소 서브유닛 유전자의 3?TR이 두날리엘라 테르티오렉타에서 이종성 발현에 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Walker]은 pDbleFLAG1.2 상에서 암호화된 블레오마이신 저항성 카세트가 두날리엘라 테르티오렉타에서 선택가능한 마커로서 사용에 적합하였다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 ble 유전자 산물 을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pDbleFLAG1.2는 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 두날리엘라 테르티오렉타에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 클로렐라 케슬레리의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 rbcS1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 rbcS1 3?TR/종결자에 작동 가능하게 연결된다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 두날리엘라 테르티오렉타 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택할 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 두날리엘라 테르티오렉타의 안정한 형질전환을 전기천공법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. ble 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 플레오마이신을 포함하는 DM 배지 상에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 두날리엘라 테르티오렉타에 대해 선택하기 위한 마커로서 사용할 수 있다. 두날리엘라 테르티오렉타 지질 생성에 적합한 생장 배지는 DM 배지 및 문헌[Takagi et al. 및 Massart and Hanston]에 의해 기재된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 두날리엘라 테르티오렉타 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 15: 볼복스 카르테리의 유전자 조작
볼복스 카르테리에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Hallman and Rappel et al .]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Hallman and Rappel et al ., The Plant Journal, Volume 17 (1999), pp. 99-109]은 플라스미드 DNA에 의한 볼복스 카르테리의 안정한 형질전환을 보고하였다. 미세입자투사법의 형질전환 방법을 사용하여, 문헌[Hallman 및 Rappel]은 pzeoE 플라스미드를 볼복스 카르테리 내로 도입하였다. pzeoE 플라스미드는 볼복스 카르테리베타-튜불린 유전자(GenBank 등록번호. L24547)의 프로모터 및 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 항생제 제오신에 대한 저항성에 대해 저항성을 위해 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타너스 블레오마이신 결합 단백질(ble)을 암호화하는 서열을 포함하는, 블레오마이신 항생제 저항성 카세트를 암호화하는 서열을 포함하였다. 형질전환 전, 볼복스 카르테리는 1.5ug/ml 제오신을 포함하는 배양 배지에서 증식될 수 없었다. pzeoE 플라스미드에 의한 형질전환시, 20ug/ml 제오신을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식되는 볼복스 카르테리의 형질전환체를 얻었다. 볼복스 카르테리 내 ble 유전자 산물의 발현은 20ug/ml 제오신의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 볼복스 카르테리에서 사용을 위한 선택마커로서 블레오마이신 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 문헌[Hallman and Rappel]에 의해 보고되는 바와 같이, 형질전환된 볼복스 카르테리의 선택 및 유지를 1mg/L 플레오마이신을 지니는 볼복스 배지에서 수행하였다(VM, 문헌[Provasoli and Pintner, The Ecology of Algae, Special Publication No. 2 (1959), Tyron, C.A. 및 Hartman, R.T., eds., Pittsburgh: Univeristy of Pittsburgh, pp. 88-96]에 의해 기재되는 바와 같음). 지질 생성을 위해 볼복스 카르테리를 배양시키기 위한 적합한 배지는 문헌[Starr in Starr R,C,. Dev Biol Suppl., Vol. 4 (1970), pp.59-100)]에 의해 논의된다. Hallman 및 Rappel은 플라스미드 pzeoE 및 볼복스 카르테리베타-튜불린 유전자의 프로모터 및 3' UTR이 볼복스 카르테리에서 이종성 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Hallman and Rappel]은 onpzeoE를 암호화한 블레오마이신 저항성 카세트가 볼복스 카르테리에서 선택가능한 마커로서 사용에 적합하였다는 것을 보고하였다. 볼복스 카르테리에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하고, 볼복스 카르테리에서 선택 마커로서 사용에 적합한 추가적인 플라스미드, 프로모터, 3?TR/종결자 및 선택마커가 보고되었다(예를 들어, 문헌[Hallamann and Sumper, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 91(1994), pp 11562-11566 및 Hallman and Wodniok, Plant Cell Reports, Volume 25 (2006), pp. 582-581] 참조).
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 ble 유전자 산물 을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pzeoE는 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 19로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 볼복스 카르테리에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 볼복스 카르테리의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 볼복스 카르테리 베타-튜불린 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 볼복스 카르테리 베타-튜불린 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 볼복스 카르테리 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택할 수 있다. 당업자는 볼복스 카르테리 게놈의 서열 내에서 이러한 상동성 영역을 확인할 수 있다(문헌[Prochnik et al., Science, Vol. 329:5988 (2010), pp223-226]에 의한 간행물을 참조로 함). 형질전환 벡터에 의한 볼복스 카르테리의 안정한 형질전환을 미세입자투사법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. ble 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 제오신을 포함하는 VM 배지 상에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 볼복스 카르테리에 대해 선택하기 위한 마커로서 사용할 수 있다. 볼복스 카르테리 지질 생성에 적합한 생장 배지는 VM 배지 및 Starr에 의해 논의된 해당 배양 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 볼복스 카르테리 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 16: 하에마토코커스 풀비알리스 의 조작
하에마토코커스 풀비알리스에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Steinbrenner and Sandmannet al.]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Steinbrenner and Sandmann et al ., Applied and Environmental Microbiology, Vol. 72:12 (2006), pp.7477-7484]은 플라스미드 DNA에 의한 하에마토코커스 풀비알리스의 안정한 핵 형질전환을 보고하였다. 미세입자투사법의 형질전환 방법을 사용하여, Steinbrenner는 플라스미드 pPlat-pds-L504R을 하에마토코커스 풀비알리스 내로 도입하였다. 플라스미드 pPlat-pds-L504R은 노르플루라존 저항성 카세트를 포함하였으며, 이는 프로모터, 단백질 암호 서열, 및 하에마토코커스 풀비알리스 피토엔 불포화효소 유전자(Pds, GenBank 등록번호. AY781170)의 3?TR을 포함한하였고, 여기서 Pd의 단백질 암호 서열은 제초제 노르플루라존에 저항성을 부여하는 유전자 산물(Pds-L504R)을 암호화하는 위치 504에서 변형되었다(이에 의해 류신을 아르기닌으로 변화시킴). pPlat-pds-L504R에 의한 형질전환 전, 하에마토코커스 풀비알리스는 5uM 노르플루라존을 포함하는 배양 배지 내에서 증식될 수 없었다. pPlat-pds-L504R 플라스미드에 의한 형질전환시, 5uM 노르플루라존을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식되는 하에마토코커스 풀비알리스의 형질전환체를 얻었다. 하에마토코커스 풀비알리스에서 Pds-L504R 유전자 산물의 발현은 5uM 노르플루라존의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 하에마토코커스 풀비알리스에서 사용을 위한 선택마커로서 노르플루라존 제초제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 문헌[Steinbrenner]에 의해 보고되는 바와 같이, 형질전환된 하에마토코커스 풀비알리스의 선택 및 유지를 2.42g/L 트리스-아세테이트, 및 5mM 노르플루라존으로 보충한 OHA 배지(OHM (0.41g/L KNO3, 0.03g/L Na2HPO4, 0.246g/L MgSO4·7H2O, 0.11g/L CaCl2·2H2O, 2.62mg/L Fe( III )시트레이트 x H2O, 0.011mg/L CoCl2·6H2O, 0.012mg/L CuSO4·5H2O, 0.075mg/L Cr2O3, 0.98mg/L MnCl2·4H2O, 0.12mg/L Na2MoO4 x 2H20, 0.005mg/L SeO2 및 25mg/L 바이오틴, 17.5mg/L 티아민 및 15mg/L 비타민 B12)를 포함하는 한천 플레이트 상에서 수행하였다. 액체 배양물에서 하에마토코커스 풀비알리스의 증식을 기본 배지를 사용하여 Steinbrenner 및 Sandmann에 의해 수행하였다(문헌[Kobayashi et al ., Applied and Environmental Microbiology, Vol. 59 (1993), pp.867-873]에 기재된 바와 같은 기본 배지). Steinbrenner 및 Sandmann은 pPlat-pds-L504R 플라스미드 및 하에마토코커스 풀비알리스 피토엔 불포화효소 유전자의 프로모터 및 3?TR이 하에마토코커스 풀비알리스에서 이종성 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Steinbrenner and Sandmann]은 pPlat-pds-L504R에서 암호화된 노르플루라존 저항성 카세트가 하에마토코커스 풀비알리스에서 선택마커로서 사용에 적합하였다는 것을 보고하였다. 하에마토코커스 풀비알리스에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합한 추가적인 플라스미드, 프로모터, 3?TR/종결자 및 선택마커가 보고되었다(예를 들어, 문헌[Kathiresan et al., Journal of Phycology, Vol. 45 (2009), pp 642-649] 참조).
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 Pds-L504R 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pPlat-pds-L504R는 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 하에마토코커스 풀비알리스에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 하에마토코커스 풀비알리스의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 하에마토코커스 풀비알리스pds 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 하에마토코 커스 풀비알리스pds 유전자 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 하에마토코커스 풀비알리스 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택할 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 하에마토코커스 풀비알리스의 안정한 형질전환을 미세입자투사법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. Pds-L504R유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 노르플루라존을 포함하는 OHA 배지 상에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 하에마토코커스 풀비알리스에 대해 선택하기 위한 마커로서 사용할 수 있다. 하에마토코커스 풀비알리스 지질 생성에 적합한 생장 배지는 기본 배지 및 문헌[Kobayashi et al ., Kathiresan et al, 및 Gong and Chen, Journal of Applied Phycology, Vol. 9:5 (1997), pp. 437-444]에 기재된 해당 배양 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 하에마토코커스 풀비알리스 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 17: 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체 의 조작
클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Abe et al .]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Abe et al., Plant Cell Physiology, Vol. 52:9 (2011), pp. 1676-1685]은 플라스미드 DNA에 의한 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체의 안정한 핵 형질전환을 보고하였다. 미세입자투사법의 형질전환 방법을 사용하여, Abe는 플라스미드 pSA106을 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체 내로 도입하였다. 플라스미드 pSA106은 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체엽록소 a/b-결합 단백질 유전자(CAB, GenBank 등록번호. AB363403)의 프로모터 및 3' UTR에 작동 가능하게 연결된 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타너스 블레오마이신 결합 단백질 유전자(ble, GenBank 등록번호. CAA37050)를 암호화하는 서열을 포함하는 블레오마이신 저항성 카세트를 포함하였다. pSA106에 의한 형질전환 전, 클로스테 리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체는 3ug/ml 플레오마이신을 포함하는 배지 상에서 증식될 수 없었다. pSA106에 의한 형질전환시, 3ug/ml 플레오마이신을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식되는 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리 토랄레 복합체의 형질전환체를 얻었다. 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체에서 ble 유전자 산물의 발현은 3ug/ml 플레오마이신의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체에서 사용을 위한 선택마커로서 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 문헌[Abe]에 의해 보고되는 바와 같이, 형질전환된 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체의 선택 및 유지를 C 배지(0.1g/L KNO3, 0.015g/L Ca(NO3)2·4H2O, 0.05g/L 글리세로포스페이트-Na2, 0.04g/L MgSO4·7H2O, 0.5g/L 트리스(하이드록실메틸) 아미노메탄, 미량 무기염, 바이오틴, 비타민 B1 및 B12)를 지니는 상부 한천에서 수행한 다음, 후속적으로 플레오마이신으로 보충한 C 배지를 포함하는 한천 플레이트로 단리시켰다. 문헌[Abe]에 의해 보고되는 바와 같이, 액체 배양물에서 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체의 증식을 C 배지에서 수행하였다. 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체의 증식에 적합한 추가적인 액체 배양 배지는 문헌[Sekimoto et al ., DNA Research, 10:4 (2003), pp. 147-153]에 의해 논의된다. Abe는 pSA106 플라스미드 및 클로스테리움 페라세로숨 -스트리고숨- 리토랄레 복합체 CAB 유전자의 프로모터 및 3' UTR이 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체에서 이종성 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, Abe는 pSA106에서 암호화된 블레오마이신 저항성 카세트가 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체에서 선택마커로서 사용에 적합하였다는 것을 보고하였다. 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합한 추가적인 플라스미드, 프로모터, 3'UTR/종결자 및 선택마커가 보고되었다(예를 들어, 문헌[Abe et al.,식물 Cell Physiology, Vol. 49 (2008), pp. 625-632] 참조).
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 ble 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pSA106은 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체 CAB 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체 CAB 유전자 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 하에마토코커스 풀비알리스 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택할 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체의 안정한 형질전환을 미세입자투사법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. ble 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 플레오마이신을 포함하는 C 배지 상에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체에 대해 선택하기 위한 마커로서 사용할 수 있다. 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체 지질 생성에 적합한 생장 배지는 C 배지 및 문헌[Abe et al. 및 Sekimoto et al]에 기재된 해당 배양 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 클로스테리움 페라세로숨 - 스트리고숨 - 리토랄레 복합체 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 18: 두날리엘라 비리디스 의 유전자 조작
두날리엘라 비리디스에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Sun et al.]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Sun et al., Gene, Vol. 377 (2006), pp.140-149]은 플라스미드 DNA에 의한 클로스테리움 두날리엘라 비리디스의 안정한 핵 형질전환을 보고하였다. 전기천공법의 형질전환 방법을 사용하여, 문헌[Sun]은 전체 두날리엘라 비리디스 질산염 환원 효소 유전자를 암호화하는 플라스미드 pDVNR을 돌연변이체 두날리엘라 비리디스(두날리엘라 비리디스 NR- 돌연변이체) 내로 도입하였다. NR-돌연변이체는 질소 공급원으로서 질산염을 사용하지 않고는 생장이 불가능하다. 질산염 환원 효소는 질산염의 아질산염으로 전환을 촉진시킨다. 형질전환 전, 두날리엘라 비리디스 NR-돌연변이체는 유일한 질소 공급원으로서 질산염(NO3 -)을 포함하는 배양 배지에서 증식될 수 없었다. NR-돌연변이체 두날리엘라 비리디스에서 두날리엘라 비리디스NR 유전자 산물의 발현을 선택마커로서 사용하여 질산염 대사 결핍에서 구하였다. pDVNR 플라스미드에 의한 형질전환시, 유일한 탄소 공급원으로서 질산염을 포함하는 한천 플레이트 상에서 생장할 수 있는 두날리엘라 비리디스NR 유전자 산물을 안정하게 발현시키는 NR-돌연변이체 두날리엘라 비리디스를 얻었다. 안정한 형질전환체의 DNA 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 형질전환된 두날리엘라 비리디스(NR 돌연변이체)의 선택 및 유지를 5 mM KNO3을 포함하는 한천 플레이트 상에서 수행하였다. 문헌[Sun]은 또한 액체 배양 배지에서 두날리엘라 비리디스 및 두날리엘라 비리디스NR 돌연변이체의 증식을 보고하였다. 두날리엘라 비리디스의 증식에 적합한 추가적인 배지는 문헌[Gordillo et al., Journal of Applied Phycology, Vol. 10:2 (1998), pp. 135-144] 및 문헌[Moulton and Burford, Hydrobiologia, Vols. 204-205:1(1990), pp. 401-408]에 의해 보고된다. 문헌[Sun]은 플라스미드 pDVNR 및 두날리엘라 비리디스질산염 환원 효소의 프로모터 및 3' UTR/종결자가 두날리엘라 비리디스NR-돌연변이체에서 이종성 발현을 가능하게 하는데 적합하였다는 것을 보고하였다. 문헌[Sun]은 또한 두날리엘라 비 리디스질산염 환원 효소 유전자 산물의 발현이 두날리엘라 비리디스NR-돌연변이체에서 선택마커로서 적합하였다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 두날리엘라 비리디스 질산염 환원 효소(DvNR) 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pDVNR은 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 두날리엘라 비리디스에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 두날리엘라 비리디스의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 DvNR 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 DvNR 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 두날리엘라 비리디스 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택할 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 두날리엘라 비리디스 NR의 안정한 형질전환을 전기천공법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. 두날리엘라 비리디스NR 돌연변이체 균주의 질소 동화 결핍에서 구하기 위해 그리고 형질전환 벡터를 안정하게 발현시키는 두날리엘라 비리디스 NR-돌연변이체에 대해 선택하기 위해 DvNR 유전자 산물의 활성을 선택마커로서 사용할 수 있다. 두날리엘라 비리디스 지질 생성에 적합한 생장 배지는 문헌[Sun et al., Moulton and Burford, 및 Gordillo et al.]에 의해 논의되는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 두날리엘라 비리디스 지질의 평가를 표준 지질 추출법 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가할 수 있다.
실시예 19: 두날리엘라 살리나 의 조작
두날리엘라 살리나에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Geng et al.]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Geng et al ., Journal of Applied Phycology, Vol. 15 (2003), pp. 451-456]은 플라스미드 DNA에 의한 두날리엘라 살리나의 안정한 형질전환을 보고하였다. 전기천공법의 형질전환 방법을 사용하여, Geng은 전체 pUWHBsAg-CAT 플라스미드를 암호화하는 플라스미드 pDVNR을 두날리엘라 살리나 내로 도입하였다. pUWHBsAg-CAT는 HBsAG 단백질 암호화 영역 상류의 제아 마이스 ubi1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, HBsAG 단백질 암호화 영역 하류의 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성 효소 유전자(nos)의 3?TR /종결자에 작동 가능하게 연결된 B형 간염 표면 항원을 암호화하는 서열을 포함하는 B형 간염 표면 항원(HBsAG) 발현 카세트를 포함한다. pUWHBsAg-CAT은 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자 산물을 암호화하는 서열을 포함하며, 유인원 바이러스 40 프로모터 및 인핸서에 작동 가능하게 연결된 항생제 클로람페니콜에 대한 저항성을 부여하는 클로람페니콜 저항성 카세트를 추가로 포함하였다. pUWHBsAg-CAT에 의한 형질전환 전, 두날리엘라 살리나는 60mg/L 클로람페니콜을 포함하는 배지 상에서 증식할 수 없었다. pUWHBsAg-CAT 플라스미드에 의한 형질전환 시, 60mg/L 클로람페니콜을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식한 두날리엘라 살리나의 형질전환체를 얻었다. 두날리엘라 살리나에서 CAT 유전자 산물의 발현은 60mg/L 클로람페니콜의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 두날리엘라 살리나에서 사용을 위한 선택마커로서 클로람페니콜 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. HBsAg 유전자 산물의 검출가능한 활성은 ubi1 프로모터 및 nos 3?TR/종결자가 두날리엘라 살리나에서 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 나타내었다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. Geng은 형질전환된 두날리엘라 살리나의 선택 및 유지를 60mg/L 클로람페니콜을 지니는 존슨(Johnson) 배지(J1, Borowitzka and Borowitzka (eds)에 기재됨, Micro-조류 Biotechnology. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 460-461)를 포함하는 한천 플레이트 상에서 수행하였다는 것을 보고하였다. 두날리엘라 살리나 의 액체 증식을 60mg/L 클로람페니콜을 지니는 J1 배지에서 Geng에 의해 논의된 바와 같이 수행하였다. J1 배지가 아닌 배지 내 두날리엘라 살리나의 증식을 논의하였다(예를 들어, 문헌[Feng et al ., Mol . Bio . Reports, Vol. 36 (2009), pp.1433-1439 및 Borowitzka et al ., Hydrobiologia, Vols. 116-117:1(1984), pp. 115-121] 참조). 두날리엘라 살리나에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합한 추가적인 플라스미드, 프로모터, 3?TR/종결자 및 선택마커는 문헌[Feng et al.]에서 논의되었다. 문헌[Geng]은 플라스미드 pUWHBsAg-CAT, ubi1 프로모터, 및 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성 효소 유전자 3?TR/종결자가 두날리엘라 살리나에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Geng]은 pUWHBsAg-CAT 상에서 암호화된 CAT 저항성 카세트가 두날리엘라 살리나에서 선택마커로서 사용에 적합하다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 CAT 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pUWHBsAg-CAT는 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 두날리엘라 살리나에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 두날리엘라 살리나의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 ubi1 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성 효소 유전자 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 두날리엘라 살리나 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 두날리엘라 살리나의 안정한 형질전환을 전기천공법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. CAT유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 클로람페니콜을 포함하는 J1 배지 상에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 두날리엘라 살리나에 대해 선택하기 위한 마커로서 사용할 수 있다. 두날리엘라 살리나 지질 생성에 적합한 생장 배지는 J1 배지 및 문헌[Feng et al . 및 Borowitzka et al]에 의해 보고된 바와 같은 해당 배양 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 두날리엘라 살리나 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 20: 고니움 펙토랄레 의 유전자 조작
고니움 펙토랄레에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Lerche and Hallman et al]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Lerche and Hallman et al ., BMC Biotechnology, Volume 9:64, 2009]은 플라스미드 DNA에 의한 고니움 펙토랄레의 안정한 형질전환을 보고하였다. 미세입자투사법의 형질전환 방법을 사용하여, Lerche은 플라스미드 pPmr3을 고니움 펙토랄레 내로 도입하였다. 플라스미드 pPmr3은 aphVIII 단백질-암호화 영역 상류의 볼복스 카르테리 hsp70A-rbcS3 혼성 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, aphVIII 단백질-암호화 영역 하류의 볼복스 카르테 리 rbcS3 유전자의 3' UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 항생제 파로모마이신에 저항성을 위해 스트렙토마이세스 리모서스(Streptomyces rimosus)의 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제(aphVIII) 유전자 산물(GenBank 등록번호. AAB03856)를 암호화하는 서열을 포함하는 파로마이신 저항성 카세트를 포함하였다. pPmr3에 의한 형질전환 전, 고니움 펙토랄레는 0.06ug/ml 파로모마이신을 포함하는 배지 상에서 증식할 수 없었다. pPmr3에 의한 형질전환 시, 0.75ug/ml 이상의 파로모마이신을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식한 고니움 펙토랄레의 형질전환체를 얻었다. 고니움 펙토랄레에서 aphVIII유전자 산물의 발현은 0.75mg/L 이상의 파로모마이신의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 고니움 펙토랄레에서 사용을 위한 선택마커로서 파로모마이신 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 문헌[Lerche and Hallman]은 형질전환된 고니움 펙토랄의 선택 및 유지를 1.0ug/ml 파로모마이신을 지니는 자워스키(Jaworski) 배지(20mg/L Ca(NO3)2·4H2O, 12.4mg/L KH2PO4, 50mg/L MgSO4·7H2O, 15.9mg/L NaHCO3, 2.25mg/L EDTA-FeNa, 2.25mg/L EDTA Na2, 2.48g/L H3BO3, 1.39g/L MnCl2.4H2O, 1mg/L (NH4)6MO7O24.4H2O, 0.04mg/L vitamin B12, 0.04mg/L 티아민-HCl, 0.04mg/L 바이오틴, 80mg/L NaNO3, 36mg/L Na4HPO4.12H2O)를 포함하는 배지에서 수행하였다는 것을 보고하였다. 니움 펙토랄레에서 이종성유전자 발현을 가능하게 하는데 적합한 추가적인 플라스미드, 프로모터, 3?TR/종결자 및 선택마커는 문헌[Lerche and Hallman]에서 논의되었다. 문헌[Lerche and Hallman]은 플라스미드 pPmr3, 볼복스 카르테리 hsp70A-rbcS3 혼성 프로모터, 및 볼복스 카르테리 rbcS3 유전자의 3' UTR/종결자가 고니움 펙토랄레에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Lerche and Hallman]은 pPmr3을 암호화한 파로모마이신 저항성 카세트가 고니움 펙토랄레에서 선택마커로서 사용에 적합하다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 aphVIII유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pPmr3은 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 고니움 펙토랄레에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 고니움 펙토랄레의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 hsp70A-rbcS3 혼성체 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3 영역에서 또는 하류의 볼복스 카르테리 rbcS3 유전자 3?TR/종결자에 작동 가능하게 연결된다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 고니움 펙토랄레 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 고니움 펙토랄레의 안정한 형질전환을 미세입자투사법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. aphVIII 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 파로모마이신을 포함하는 자워스키 배지에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 고니움 펙토랄레에 대해 선택하기 위한 마커로서 사용할 수 있다. 고니움 펙토랄레 지질 생성에 적합한 생장 배지는 자워스키 배지 및 문헌[Stein, American Journal of Botany, Vol. 45:9 (1958), pp. 664-672]에 의해 보고된 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 고니움 펙토랄레 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 21: 파에오닥틸룸 트리코르누툼 의 조작
파에오닥틸룸 트리코르누툼에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Apt et al .]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Apt et al ., Molecular and General Genetics, Vol. 252 (1996), pp. 572-579]은 벡터 DNA에 의한 파에오닥틸룸 트리코르누툼의 안정한 형질전환을 보고하였다. 미세입자투사법의 형질전환 방법을 사용하여, Apt는 플라스미드 pfcpA를 파에오닥틸룸 트리코르누툼 내로 도입하였다. 플라스미드 pfcpA는 ble 단백질-암호화 영역 상류의 파에오닥틸룸 트리코르누툼 갈조소 엽록소 결합 단백질 유전자(fcpA)의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, ble 단백질-암호화 영역의 3' 영역에서 또는 하류의 파에오닥틸룸 트리코르누툼 fcpA 유전자의 3' UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 항생제 플레오마이신 및 제오신에 대한 저항성을 위해 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타너스 블레오마이신 결합 단백질(ble)을 암호화하는 서열을 포함하는 블레오마이신 저항성 카세트를 포함하였다. pfcpA에 의한 형질전환 전, 파에오닥틸룸 트리코르누툼은 50ug/ml 제오신을 포함하는 배지 상에서 증식할 수 없었다. pfcpA에 의한 형질전환 시, 50ug/ml 제오신을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식한 파에오닥틸룸 트리코르누툼의 형질전환체를 얻었다. 파에오닥틸룸 트리코르누툼에서 ble유전자 산물의 발현은 50mg/L 제오신의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 파에오닥틸룸 트리코르누툼에서 사용을 위한 선택마커로서 블레오마이신 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 문헌[Apt]은 형질전환된 파에오닥틸룸 트리코르누툼의 선택 및 유지를 50mg/L 제오신을 지니는 LDM 배지(문헌[Starr and Zeikus, Journal of Phycology, Vol. 29, Supplement, (1993)]에 의해 보고된 바와 같음)를 포함하는 한천 플레이트 상에서 수행하였다는 것을 보고하였다. 문헌[Apt]은 50mg/L 제오신을 지니는 LDM 배지에서 파에오닥틸룸 트리코르누툼 형질전환체의 액체 증식을 보고하였다. LDM 배지가 아닌 배지에서 파에오닥틸룸 트리코르누툼의 증식이 논의되었다(문헌[Zaslavskaia et al.,Science, Vol. 292 (2001), pp. 2073-2075]에 의해, 및 문헌[Radokovits et al., Metabolic Engineering, Vol. 13 (2011), pp. 89-95]에 의해). 파에오닥틸룸 트리코르누툼에서 이종성유전자 발현을 가능하게 하는데 적합한 추가적인 플라스미드, 프로모터, 3?TR/종결자 및 선택마커는 문헌[Apt et al ., Zaslavskaia et al ., 및 Radokovits et al .]에 의한 동일한 보고에서 보고되었다. 문헌[Apt]은 플라스미드 pfcpA, 및 파에오닥틸룸 트리코르누툼 fcpA 프로모터 및 3' UTR/종결자가 파에오닥틸룸 트리코르누툼에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Apt]는 pfcpA 상에서 암호화된 블레오마이신 저항성 카세트가 파에오닥틸룸 트리코르누툼에서 선택마커로서 사용에 적합하였다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 ble 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pfcpA은 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 파에오닥틸룸 트리코르누툼에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 파에오닥틸룸 트리코르누툼의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 파에오닥틸룸 트리코르누툼 fcpA 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 파에오닥틸룸 트리코르누툼 fcpA 유전자 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 파에오닥틸룸 트리코르누툼 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 당업자는 파에오닥틸룸 트리코르누툼 게놈의 서열 내에서 이러한 상동성 영역을 확인할 수 있다(문헌[Bowler et al., Nature, Vol. 456 (2008), pp. 239-244]에 의해 간행물을 참조로 함). 형질전환 벡터에 의한 파에오닥틸룸 트리코르누툼의 안정한 형질전환을 미세입자투사법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. ble 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 파로모마이신을 포함하는 LDM 배지에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 파에오닥틸룸 트리코르누툼에 대해 선택하기 위한 마커로서 사용할 수 있다. 파에오닥틸룸 트리코르누툼 지질 생성에 적합한 생장 배지는 문헌[Radokovits et al]에 의해 보고된 바와 같은 f/2 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 파에오닥틸룸 트리코르누툼 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 22: 카에토세로스 종 의 조작
카에토세로스 종에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Yamaguchi et al .]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Yamaguchi et al ., Phycological Research, Vol. 59:2 (2011), pp.113-119]은 플라스미드 DNA에 의한 카에토세로스 종(Chaetocerossp .)의 안정한 핵 형질전환을 보고하였다. 미세입자투사법의 형질전환 방법을 사용하여, Yamaguchi는 플라스미드 pTpfcp/nat를 카에토세로스 종 내로 도입하였다. pTpfcp/nat는 nat 단백질-암호화 영역 상류의 탈라시오시라 슈도나나 갈조소 엽록소 a/c 결합 단백질 유전자(fcp) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 3' 영역에서(nat 단백질 암호 서열) 탈라시오시라 슈도나나 fcp 유전자 3' UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 노르세트로신(nourseothricin) 아세틸트랜스퍼라제(nat) 유전자 산물(GenBank 등록번호. AAC60439)을 암호화하는 서열을 포함하는, 노르세트로신 저항성 카세트를 포함하였다. nat 유전자 산물은 항생제 노르세트로신에 대한 저항성을 부여한다. pTpfcp/nat에 의한 형질전환 전, 카에토세로스 종은 500ug/ml 노르세트로신을 포함하는 배지 상에서 증식할 수 없었다. pTpfcp/nat에 의한 형질전환 시, 500ug/ml 노르세트로신을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식한 카에토세로스 종의 형질전환체를 얻었다. 카에토세로스 종에서 nat 유전자 산물의 발현은 500mg/L 노르세트로신의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 카에토세로스 종에서 사용을 위한 선택마커로서 노르세트로신 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 문헌[Yamaguchi]은 형질전환된 카에토세로스 종의 선택 및 유지를 500mg/L 노르세트로신을 지니는 f/2 배지(문헌[Guilard, R.R., Culture of Phytoplankton for feeding marine invertebrates, In Culture of Marine Invertebrate Animals, Smith and Chanley (eds) 1975, Plenum Press, New York, pp. 26-60]에 의해 보고된 바와 같음)를 포함하는 한천 플레이트 상에서 수행하였다는 것을 보고하였다. 문헌[Yamaguchi]에 의해 수행되는 바와 같은 카에토세로스 종 형질전환체의 액체 증식을 500mg/L 노르세트로신을 지니는 f/2 배지에서 수행하였다. 추가적인 배양 배지에서 카에토세로스 종 의 증식을 보고하였다(예를 들어 문헌[Napolitano et al., Journal of the World Aquaculture Society, Vol. 21:2 (1990), pp. 122-130, 및 문헌[Volkman et al., Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, Vol. 128:3 (1989), pp. 219-240]에 의해). 카에토세로스 종에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합한 추가적인 플라스미드, 프로모터, 3?TR/종결자 및 선택마커는 문헌[Yamaguchi et al .]의 동일한 보고에서 보고되었다. Yamaguchi는 플라스미드pTpfcp/nat 및 탈라시오시라 슈도나나 fcp 프로모터 및 3' UTR/종결자가 카에토세로스 종에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다고 보고하였다. 추가로, 문헌[Yamaguchi]는 pTpfcp/nat 상에서 암호화된 노르세트로신 저항성 카세트가 카에토세로스 종 에서 선택마커로서 사용에 적합하였다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 nat 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pTpfcp/nat는 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 밀접하게 관련된 카에토세로스 콤프레숨에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 카에토세로스 콤프레숨의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 탈라시오시라 슈도나나 fcp 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 탈라시오시라 슈도나나 fcp 유전자 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 카에토세로스 종 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 카에토세로스 종의 안정한 형질전환을 미세입자투사법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. nat 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 노르세트로신을 포함하는 f/2 한천 배지에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 카에토세로스 종에 대해 선택하기 위한 선택마커로서 사용할 수 있다. 카에토세로스 종 지질 생성에 적합한 생장 배지는 f/2 배지, 및 문헌[Napolitano et al. 및 Volkman et al]에 의해 논의된 해당 배양 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 카에토세로스 종 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 23: 실린드로테카 푸시포르미스 의 조작
실린드로테카 푸시포르미에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Poulsen and Krogeret al .]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Poulsen and Kroger et al ., FEBS Journal, Vol. 272 (2005), pp.3413-3423]은 플라스미드 DNA에 의한 실린드로테카 푸시포르미스의 형질전환을 보고하였다. 미세입자투사법의 형질전환 방법을 사용하여, 문헌[Poulsen and Kroger]는 pCF-ble 플라스미드를 실린드로테카 푸시포르미스 내로 도입하였다. 플라스미드 pCF-ble는 ble 단백질-암호화 영역 상류의 실린드로테카 푸시포르미스 갈조소 엽록소 a/c 결합 단백질 유전자(fcpA, GenBank 등록번호 AY125580) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 3' 영역에서(ble 단백질 암호 서열의 하류) 실린드로테카 푸시포르미스 fcpA gene 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 항생제 제오신 및 플레오마이신에 대한 저항성을 위해 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타너스 블레오마이신 결합 단백질(ble)을 암호화하는 서열을 포함하는 블레오마이신 저항성 카세트를 포함하였다. pCF-ble에 의한 형질전환 전, 실린드로테카 푸시포르미스는 1mg/ml 제오신을 포함하는 배지 상에서 증식할 수 없었다. pCF-ble에 의한 형질전환 시, 1mg/ml 제오신을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식한 실린드로테카 푸시포르미스의 형질전환체를 얻었다. 실린드로테카 푸시포르미스에서 ble 유전자 산물의 발현은 1mg/ml 제오신의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 실린드로테카 푸시포르미스에서 사용을 위한 선택마커로서 블레오마이신 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. 문헌[Poulsen and Kroger]은 형질전환된 실린드로테카 푸시포르미스의 선택 및 유지를 1mg/ml 제오신을 지니는 인공 해수 배지를 포함하는 한천 플레이트 상에서 수행하였다는 것을 보고하였다. 문헌[Poulsen and Kroger]은 1mg/ml 제오신을 지니는 인공 해수 배지 내 실린드로테카 푸시포르미스 형질전환체의 액체 증식을 보고하였다. 추가적인 배양 배지 내 실린드로테카 푸시포르미스의 증식을 논의하였다(예를 들어, 문헌[Liang et al., Journal of Applied Phycology, Vol. 17:1(2005), pp. 61-65], 및 문헌[Orcutt and Patterson, Lipids, Vol. 9:12 (1974), pp. 1000-1003]에 의해). 카에토세로스 종에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합한 추가적인 플라스미드, 프로모터, 3?TR/종결자를 문헌[Poulsen and Kroger]에 의한 동일한 보고에서 보고하였다. 문헌[Poulsen and Kroger]는 플라스미드pCF-ble 및 실린드로테카 푸시포르미스 fcp 프로모터 및 3' UTR/종결자가 실린드로테카 푸시포르미스 내 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Poulsen and Kroger]은 pCF-ble 상에서 암호화된 블레오마이신 저항성 카세트가 실린드로테카 푸시포르미스에서 선택마커로서 사용에 적합하였다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 ble 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pCF-ble는 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 밀접하게 관련된 실린드로테카 푸시포르미스에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 실린드로테카 푸시포르미스의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 실린드로테카 푸시포르미스 fcp 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 실린 드로테카 푸시포르미스 fcp 유전자 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 실린드로테카 푸시포르미스 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 실린드로테카 푸시포르미스의 안정한 형질전환을 미세입자투사법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. ble 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 제오신을 포함하는 인공 해수 한천 배지에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 실린드로테카 푸시포르미스에 대해 선택하기 위한 선택마커로서 사용할 수 있다. 실린드로테카 푸시포르미스 지질 생성에 적합한 생장 배지는 인공 해수 배지, 및 문헌[Liang et al. and Orcutt and Patterson]에 의해 논의된 해당 배양 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 실린드로테카 푸시포르미스 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 24: 암피디니움 종의 조작
암피디니움 종에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[ten Lohuis and Miller et al .]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Lohuis and Miller et al ., The Plant Journal, Vol. 13:3 (1998), pp. 427-435]은 플라스미드 DNA에 의한 암피디니움 종의 안정한 형질전환을 보고하였다. 탄화규소 휘스커의 존재에서 교반의 형질전환 방법을 사용하여, ten Lohuis는 플라스미드pMT NPT/GUS를 암피디니움 종 내로 도입하였다. pMT NPT/GUS는 nptII 단백질-암호화 영역의 상류 또는 5'의 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성 효소(nos) 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 3' 영역(nptII 단백질-암호화 영역의 하류)에서 nos 유전자의 3' UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptII) 유전자 산물(GenBank 등록번호. AAL92039)을 암호화하는 서열을 포함하는, 네오마이신 저항성 카세트를 포함하였다. nptII 유전자 산물은 항생제 G418에 대한 저항성을 부여한다. pMT NPT/GUS 플라스미드는 CaMV 35S 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 추가로 CaMV 35S 3' UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 베타-글루쿠로니다제(GUS) 리포터 유전자 산물을 암호화하는 서열을 추가로 포함하였다. pMT NPT/GUS에 의한 형질전환 전, 암피디니움 종은 3mg/ml G418 제오신을 포함하는 배지 상에서 증식할 수 없었다. pMT NPT/GUS에 의한 형질전환 시, 3mg/ml G418을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식한 암피디니움 종의 형질전환체를 얻었다. 암피디니움 종에서 nptII유전자 산물의 발현은 3mg/ml G418의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 암피디니움 종에서 사용을 위한 선택마커로서 네오마이신 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. GUS 리포터 유전자의 검출가능한 활성은 CaMV 35S 프로모터 및 3?TR이 암피디니움 종 내 유전자 발현을 가능하게 하는제 적합하다는 것을 나타내었다. 문헌[ten Lohuis and Miller]은 F/2 풍부 용액(공급업자 Sigma에 의해 제공됨) 및 3mg/ml G418으로 보충한 해수를 포함하는 배지에서 암피디니움 종의 액체 증식뿐만 아니라 F/2 풍부 용액 및 3mg/ml G418으로 보충한 해수를 포함하는 한천 배지 상에서 암피디니움 종 형질전환체의 선택 및 유지를 보고하였다. 추가적인 배양 배지에서 암피디니움 종의 증식을 보고하였다(예를 들어 문헌[Mansour et al., Journal of Applied Phycology, Vol. 17:4 (2005) pp. 287-v300]). 암피디니움 종에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는 추가적인 프로모터, 3?TR/종결자 및 선택마커를 포함하는 추가적인 플라스미드는 문헌[ten Lohuis and Miller]에 의한 동일 보고에서 보고되었다. 문헌[ten Lohuis and Miller]은 플라스미드pMT NPT/GUS 및 nos 및 CaMV 35S 유전자의 프로모터 및 3' UTR/종결자가 암피디니움 종에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[ten Lohuis and Miller]은 pMT NPT/GUS 상에서 암호화된 네오마이신 저항성 카세트가 암피디니움 종에서 선택마커로서 사용에 적합하다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 nptII 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pMT NPT/GUS는 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 밀접하게 관련된 암피디니움 종에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 밀접하게 관련된 종인 암피디니움 카르테래(Amphidinium carterae)의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성 효소(nos) 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 nos 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 암피디니움 종 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 암피디니움 종의 안정한 형질전환을 미세입자투사법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. nptII 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, G418을 포함하는 해수 한천 배지에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 암피디니움 종에 대해 선택하기 위한 선택마커로서 사용할 수 있다. 암피디니움 종 지질 생성에 적합한 생장 배지는 인공 해수 배지, 및 문헌[Mansour et al. 및 ten Lohuis and Miller]에 의해 논의된 해당 배양 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 암피디니움 종 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 25: 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰 의 유전자 조작
심비오디니움 마이크로아드리악티쿰에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Lohuis and Miller et al.]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Lohuis and Miller et al ., The Plant Journal, Vol. 13:3 (1998), pp. 427-435]은 플라스미드 DNA에 의한 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰 의 안정한 형질전환을 보고하였다. 규소 섬유-매개 미세주입법의 형질전환 기법을 사용하여, ten Lohuis는 플라스미드pMT NPT/GUS를 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰 내로 도입하였다. pMT NPT/GUS는 nptII 단백질-암호화 영역의 상류 또는 5'의 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성 효소(nos) 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 3' 영역(nptII 단백질-암호화 영역의 하류)에서 nos 유전자의 3' UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptII) 유전자 산물(GenBank 등록번호. AAL92039)을 암호화하는 서열을 포함하는, 네오마이신 저항성 카세트를 포함하였다. nptII 유전자 산물은 항생제 G418에 대한 저항성을 부여한다. pMT NPT/GUS 플라스미드는 CaMV 35S 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 추가로 CaMV 35S 3 UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 베타-글루쿠로니다제(GUS) 리포터 유전자 산물을 암호화하는 서열을 추가로 포함하였다. pMT NPT/GUS에 의한 형질전환 전, 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰은 3mg/ml G418을 포함하는 배지 상에서 증식될 수 없었다. pMT NPT/GUS에 의한 형질전환 시, 3mg/ml G418을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식한 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰의 형질전환체를 얻었다. 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰에서 nptII유전자 산물의 발현은 3mg/ml G418의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰에서 사용을 위한 선택마커로서 네오마이신 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. GUS 리포터 유전자의 검출가능한 활성은 CaMV 35S 프로모터 및 3?TR이 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰 내 유전자 발현을 가능하게 하는제 적합하다는 것을 나타내었다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 문헌[ten Lohuis and Miller]은 F/2 풍부 용액(공급업자 Sigma에 의해 제공됨) 및 3mg/ml G418으로 보충한 해수를 포함하는 배지에서 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰의 액체 증식뿐만 아니라 F/2 풍부 용액 및 3mg/ml G418으로 보충한 해수를 포함하는 한천 배지 상에서 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰 형질전환체의 선택 및 유지를 보고하였다. 추가적인 배양 배지에서 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰의 증식을 보고하였다(예를 들어 문헌[Iglesias-Prieto et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 89:21(1992) pp. 10302-10305]). 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰 내 이종성 유전자 발현을 가능하게 하기 위한 추가적인 프로모터, 3?TR/종결자 및 선택마커를 포함하는 추가적인 플라스미드는 문헌[ten Lohuis and Miller]에 의한 동일 보고에서 보고되었다. 문헌[ten Lohuis and Miller]은 플라스미드pMT NPT/GUS 및 프로모터 및 nos 및 CaMV 35S 유전자의 3' UTR/종결자가 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[ten Lohuis and Miller]은 pMT NPT/GUS 상에서 암호화된 네오마이신 저항성 카세트가 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰에서 선택마커로서 사용에 적합하다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 nptII 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pMT NPT/GUS는 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 밀접하게 관련된 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 밀접하게 관련된 종인 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 합성 효소(nos) 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 nos 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰의 안정한 형질전환을 규소 섬유 매개 미세주입법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. nptII 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, G418을 포함하는 해수 한천 배지에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰에 대해 선택하기 위한 선택마커로서 사용할 수 있다. 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰 지질 생성에 적합한 생장 배지는 인공 해수 배지 및 문헌[Iglesias-Prieto et al.]에 의해 보고된 해당 배양 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 심비오디니움 마이크로아드리악티쿰 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 26: 나노클로롭시스 종 의 유전자 조작
나노클로롭시스 종 W2J3B에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Kilian et al .]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Kilian et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 108:52 (2011) pp.21265-21269]은 형질전환 작제물에 의한 나노클로롭시스의 안정한 핵 형질전환을 보고하였다. 전기천공법의 형질전환 기법을 사용하여, Kilian은 작제물 C2를 나노클로롭시스 종 W2J3B 내로 도입하였다. C2 형질전환 작제물은 ble 단백질-암호화 영역의 상류의 나노클로롭시스 종 W2J3B 비올라크사닌/엽록소 a-결합 단백질 유전자 VCP2의 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, ble 단백질-암호화 영역 하류의 나노클로롭시스 종 W2J3B비올라크사닌/엽록소 a-결합 유전자 VCP1의 3' UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 항생제 플레오마이신 및 제오신에 저항성을 위해, 스트렙토알로테이쿠스 힌두스타너스 블레오마이신 결합 단백질(ble)을 포함하는 블레오마이신 저항성 카세트를 포함하였다. C2에 의한 형질전환 전, 나노클로롭시스 종 W2J3B는 2ug/ml 제오신을 포함하는 배지 상에서 증식할 수 없었다. C2에 의한 형질전환 시, 2ug/ml 제오신을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식한 나노클로롭시스 종 W2J3B의 형질전환체를 얻었다. 나노클로롭시스 종 W2J3B 에서 ble 유전자 산물의 발현은 2ug/ml 제오신의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 나노클로롭시스에서 사용을 위한 선택마커로서 블레오마이신 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 PCR에 의해 수행하였다. 문헌[Kilian]은 5배 수준의 미량금속, 비타민 및 포스페이트 용액을 포함하고, 추가로 2ug/ml 제오신을 포함하는 F/2 배지(문헌[Guilard and Ryther, Canadian Journal of Microbiology, Vol. 8 (1962), pp. 229-239]에 의해 보고됨)에서 나노클로롭시스 종 W2J3B형질전환체의 액체 증식을 보고하였다. 문헌[Kilian]은 또한 인공 해수 2mg/ml 제오신을 포함하는 한천 F/2 배지 상에서 나노클로롭시스 종 W2J3B형질전환체의 선택 및 유지를 보고하였다. 추가적인 배양 배지 내 나노클로롭시스의 증식을 논의하였다(예를 들어 문헌[Chiu et al., Bioresour Technol ., Vol . 100:2 (2009), pp . 833-838 및 Pal et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 90:4 (2011), pp. 1429-1441.]). 나노클로롭시스 종 W2J3B 내 이종성 유전자 발현을 가능하게 하기 위한 추가적인 프로모터, 3?TR/종결자 및 형질전환체의 선택을 위한 선택마커를 포함하는 추가적인 형질전환 작제물은 문헌[Kilian]에 의한 동일 보고에서 기재되었다. 문헌[Kilian]은 형질전환 작제물 C2 및 나노클로롭시스 종 W2J3B비올라크사닌/엽록소 a-결합 단백질 유전자 VCP2의 프로모터 및 나노클로롭시스 종 W2J3B비올라크사닌/엽록소 a-결합 단백질 유전자 VCP1의 3' UTR/종결자가 나노클로롭시스 종 W2J3B에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Kilian]은 C2 상에서 암호화된 블레오마이신 저항성 카세트가 나노클로롭시스 종 W2J3B에서 선택마커로서 사용에 적합하다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 ble 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 작제물 C2는 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 밀접하게 관련된 나노클로롭시스 종 W2J3B에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 밀접하게 관련된 종인 나노클로롭시스 종의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 나노클로롭시스 종 W2J3BVCP2 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 나노클로롭시스 종 W2J3BVCP1 유전자 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 나노클로롭시스 종 W2J3B 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 나노클로롭시스 종 W2J3B의 안정한 형질전환을 전기천공법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. ble 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 제오신을 포함하는 F/2 배지에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 나노클로롭시스 종 W2J3B에 대해 선택하기 위한 선택마커로서 사용할 수 있다. 나노클로롭시스 종 W2J3B 지질 생성에 적합한 생장 배지는 F/2 배지 및 문헌[Chiu et al. 및 Pal et al.]에 의해 보고된 해당 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 나노클로롭시스 종 W2J3B 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 27: 시클로텔라 크립티카 의 조작
시클로텔라 크립티카에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Dunahayet al.]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Dunahay et al ., Journal of Phycology, Vol. 31(1995), pp. 1004-1012]은 플라스미드 DNA에 의한 시클로텔라 크립티카의 안정한 핵 형질전환을 보고하였다. 미세입자투사법의 형질전환 기법을 사용하여, Dunahay은 플라스미드 pACCNPT5.1를 시클로텔라 크립티카 내로 도입하였다. 플라스미드 pACCNPT5.1은 nptII 암호화 영역의 상류의 시클로텔라 크립티카 아세틸-CoA 카복실라제(ACCase) 유전자(GenBank 등록번호. L20784) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 3' 영역(nptII 암호화 영역의 하류)에서 시클로텔라 크립티카 ACCase 유전자의 3' UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptII) 유전자 산물의 암호 서열을 포함하는 네오마이신 저항성 카세트를 포함하였다. nptII 유전자 산물은 항생제 G418에 대한 저항성을 부여한다. pACCNPT5.1에 의한 형질전환 전, 시클로텔라 크립티카를 100ug/ml G418을 포함하는 50% 인공 해수 배지 상에서 증식할 수 없었다. pACCNPT5.1에 의한 형질전환 시, 100ug/ml G418을 포함하는 선택적 50% 인공 해수 배지에서 증식한 시클로텔라 크립티카의 형질전환체를 얻었다. 시클로텔라 크립티카에서 nptII유전자 산물의 발현은 100ug/ml G418의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 시클로텔라 크립티카에서 사용을 위한 선택마커로서 네오마이신 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 문헌[Dunahay]은 1.07 mM 규산나트륨으로 및 100ug/ml G418로 보충한 인공 해수 배지(ASW, 문헌[Brown, L., Phycologia, Vol. 21(1982), pp. 408-410]에 의해 논의된 바와 같음) 내 시클로텔라 크립티카의 액체 증식을 보고하였다. 문헌[Dunahay]은 또한 100ug/ml G418을 지니는 ASW 배지를 포함하는 한천 플레이트 상에서 시클로텔라 크립티카 형질전환체의 선택 및 유지를 보고하였다. 추가적인 배양 배지 내 시클로텔라 크립티카의 증식을 논의하였다(예를 들어 문헌[Sriharan et al ., Applied Biochemistry and Biotechnology , Vol. 28-29:1(1991), pp . 317-326 및 Pahl et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 109:3 (2010), pp. 235 239]). 문헌[Dunahay]는 시클로텔라 크립티카 아세틸-CoA 카복실라제(ACCase) 유전자의 플라스미드 pACCNPT5.1 및 프로모터가 시클로텔라 크립티카 내 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Dunahay]은 pACCNPT5.1 상에서 암호화된 네오마이신 저항성 카세트가 시클로텔라 크립티카에서 선택마커로서 사용에 적합하다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 nptII 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pACCNPT5.1은 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 시클로텔라 크립티카에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 시클로텔라 크립티카의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 시클로텔라 크립티카 ACCase 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 시클로텔라 크립티카ACCase 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 시클로텔라 크립티카 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 시클로텔라 크립티카의 안정한 형질전환을 미세입자투사법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. nptII 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, G418을 포함하는 한천 ASW 배지에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 시클로텔라 크립티카에 대해 선택하기 위한 선택마커로서 사용할 수 있다. 시클로텔라 크립티카 지질 생성에 적합한 생장 배지는 ASW 배지 및 문헌[Sriharan et al ., 1991 및 Pahl et al .]에 의해 보고된 해당 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 시클로텔라 크립티카 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 28: 나비쿨라 사프로필라 의 조작
나비쿨라 사프로필라에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Dunahayet al.]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Dunahay et al ., Journal of Phycology, Vol. 31(1995), pp. 1004-1012]은 플라스미드 DNA에 의한 나비쿨라 사프로필라의 안정한 형질전환을 보고하였다. 미세입자투사법의 형질전환 기법을 사용하여, Dunahay은 플라스미드 pACCNPT5.1을 나비쿨라 사프로필라 내로 도입하였다. 플라스미드 pACCNPT5.1은 nptII 암호화 영역의 상류의 시클로텔라 크립티카 아세틸-CoA 카복실라제(ACCase) 유전자(GenBank 등록번호. L20784) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 3' 영역(nptII 암호화 영역의 하류)에서 시클로텔라 크립티카 ACCase 유전자의 3' UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptII) 유전자 산물의 암호 서열을 포함하는 네오마이신 저항성 카세트를 포함하였다. nptII 유전자 산물은 항생제 G418에 대한 저항성을 부여한다. pACCNPT5.1에 의한 형질전환 전, 나비쿨라 사프로필라를 100ug/ml G418을 포함하는 인공 해수 배지 상에서 증식할 수 없었다. pACCNPT5.1에 의한 형질전환 시, 100ug/ml G418을 포함하는 선택적 인공 해수 배지에서 증식한 나비쿨라 사프로필라의 형질전환체를 얻었다. 나비쿨라 사프로필라에서 nptII유전자 산물의 발현은 G418의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 나비쿨라 사프로필라에서 사용을 위한 선택마커로서 네오마이신 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 문헌[Dunahay]은 1.07 mM 규산나트륨으로 및 100ug/ml G418로 보충한 인공 해수 배지(ASW, 문헌[Brown, L., Phycologia, Vol. 21(1982), pp. 408-410]에 의해 논의된 바와 같음) 내 나비쿨라 사프로필라의 액체 증식을 보고하였다. 문헌[Dunahay]은 또한 100ug/ml G418을 지니는 ASW 배지를 포함하는 한천 플레이트 상에서 나비쿨라 사프로필라 형질전환체의 선택 및 유지를 보고하였다. 추가적인 배양 배지 내 나비쿨라 사프로필라의 증식을 논의하였다(예를 들어 문헌[Tadros and Johansen, Journal of Phycology, Vol. 24:4 (1988), pp. 445-452 및 Sriharan et al., Applied Biochemistry and Biotechnology , Vol. 20-21:1(1989), pp . 281-291]). 문헌[Dunahay]는 시클로텔라 크립티카 아세틸-CoA 카복실라제(ACCase) 유전자의 플라스미드 pACCNPT5.1 및 프로모터가 시클로텔라 크립티카 내 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Dunahay]은 pACCNPT5.1 상에서 암호화된 네오마이신 저항성 카세트가 나비쿨라 사프로필라에서 선택마커로서 사용에 적합하다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 nptII 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pACCNPT5.1은 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 나비쿨라 사프로필라에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 나비쿨라 펠리쿨로사(Navicula pelliculosa)의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 시클로텔라 크립티카 ACCase 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 시클로텔라 크립티카 ACCase 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 나비쿨라 사프로필라 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 형질전환 벡터에 의한 나비쿨라 사프로필라의 안정한 형질전환을 미세입자투사법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. nptII 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, G418을 포함하는 한천 ASW 배지에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 나비쿨라 사프로필라에 대해 선택하기 위한 선택마커로서 사용할 수 있다. 나비쿨라 사프로필라 지질 생성에 적합한 생장 배지는 ASW 배지 및 문헌[Sriharan et al . 1989 및 Tadros and Johansen] 에 의해 보고된 해당 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 나비쿨라 사프로필라 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 29: 탈라시오시라 슈도나나 의 유전자 조작
탈라시오시라 슈도나나에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Poulsen et al .]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Poulsen et al., Journal of Phycology, Vol. 42 (2006), pp. 1059-1065]은 플라스미드 DNA에 의한 탈라시오시라 슈도나나의 안정한 형질전환을 보고하였다. 미세입자투사법의 형질전환 기법을 사용하여, Poulsen은 플라스미드 플라스미드 pTpfcp/nat을 탈라시오시라 슈도나나 내로 도입하였다. pTpfcp/nat는 nat 단백질-암호화 영역의 상류의 탈라시오시라 슈도나나 갈조소 엽록소 a/c 결합 단백질 유전자(fcp) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 3' 영역(nat 암호 서열의 하류)에서 탈라시오시라 슈도나나 fcp 유전자 3 UTR/ 종결자에 작동 가능하게 연결된 노르세트로신 아세틸트랜스퍼라제(nat) 유전자 산물(GenBank 등록번호. AAC60439)의 암호 서열을 포함하는 노르세트로신 저항성 카세트를 포함하였다. npt 유전자 산물은 항생제 노르세트로신에 대한 저항성을 부여한다. pTpfcp/nat에 의한 형질전환 전, 탈라시오시라 슈도나나를 10ug/ml 노르세트로신을 포함하는 배지 상에서 증식할 수 없었다. pTpfcp/nat에 의한 형질전환 시, 100ug/ml 노르세트로신을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식한 탈라시오시라 슈도나나의 형질전환체를 얻었다. 탈라시오시라 슈도나나에서 nat유전자 산물의 발현은 100ug/ml 노르세트로신의 존재에서 증식을 가능하게 하였고, 이에 의해 탈라시오시라 슈도나나에서 사용을 위한 선택마커로서 노르세트로신 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 문헌[Poulsen]은 100ug/ml 노르세트로신을 지니는 변형된 ESAW 배지(문헌[Harrison et al., Journal of Phycology, Vol. 16 (1980), pp. 28-35]에 의해 논의된 바와 같음)를 포함하는 액체 배양물에서 형질전환된 탈라시오시라 슈도나나의 선택 및 유지를 수행하였다는 것을 보고하였다. 추가적인 배양 배지 내 탈라시오시라 슈도나나의 증식을 논의하였다(예를 들어 문헌[Volkman et al., Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, Vol. 128:3 (1989), pp. 219-240]). 탈라시오시라 슈도나나에서 사용에 적합한 추가적인 선택마커를 포함하는 추가적인 플라스미드는 문헌[Poulsen]에 의한 동일한 보고에서 논의하였다. 문헌[Poulsen]은 플라스미드pTpfcp/nat, 및 탈라시오시라 슈도나나 fcp 프로모터 및 3' UTR/종결자는 탈라시오시라 슈도나나에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Poulsen]은 pTpfcp/nat 상에서 암호화된 노르세트로신 저항성 카세트가 탈라시오시라 슈도나나에서 선택마커로서 사용에 적합하다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 nat 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pTpfcp/nat는 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 탈라시오시라 슈도나나에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 탈라시오시라 슈도나나의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 탈라시오시라 슈도나나 fcp 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 탈라시오시라 슈도나나 fcp 유전자 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 탈라시오시라 슈도나나 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 당업자는 탈라시오시라 슈도나나 게놈의 서열 내에서 이러한 상동성 영역을 확인할 수 있다(문헌[Armbrust et al., Science,Vol. 306: 5693 (2004): pp. 79-86]에 의한 간행물을 참조로 함). 형질전환 벡터에 의한 탈라시오시라 슈도나나의 안정한 형질전환을 미세입자투사법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. nat 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 노르세트로신을 포함하는 한천 ESAW 배지에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 탈라시오시라 슈도나나에 대해 선택하기 위한 선택마커로서 사용할 수 있다. 탈라시오시라 슈도나나 지질 생성에 적합한 생장 배지는 ASW 배지 및 문헌[Volkman et al. 및 Harrison et al.] 에 의해 보고된 해당 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 탈라시오시라 슈도나나 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 30: 클라미도모나스 레인하르드티의 유전자 조작
클라미도모나스 레인하르드티에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Cerutti et al.]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Cerutti et al ., Genetics , Vol. 145:1(1997), pp. 97-110]은 형질전환 벡터에 의한 클라미도모나스 레인하르드티의 안정한 형질전환을 보고하였다. 미세입자투사법의 형질전환 기법을 사용하여, Cerutti 는 형질전환 작제물 P[1030]을 클라미도모나스 레인하르드티 내로 도입하였다. 작제물 P[1030]은 aadA 단백질-암호화 영역의 상류의 클라미도모나스 레인하르드티 리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제/옥시게나제 소 서브유닛 유전자(RbcS2, GenBank 등록번호. X04472) 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 3' 영역(aadA 단백질 암호 서열의 하류)에서 클라미도모나스 레인하르드티RbcS2 gene 3 UTR/ 종결자에 작동 가능하게 연결된 아미노글루코사이드 3"-아데닐트랜스퍼라제(aadA) 유전자 산물을 암호화하는 서열을 포함하는 스펙티노마이신 저항성 카세트를 포함하였다. aadA 유전자 산물은 항생제 스펙티노마이신에 대한 저항성을 부여한다. P[1030]에 의한 형질전환 전, 클라미도모나스 레인하르드티를 90ug/ml 스펙티노마이신을 포함하는 배지 상에서 증식할 수 없었다. P[1030]에 의한 형질전환 시, 90ug/ml 스펙티노마이신을 포함하는 선택적 배양 배지에서 증식한 클라미도모나스 레인하르드티의 형질전환체를 얻었고, 이에 의해 클라미도모나스 레인하르드티에서 사용을 위한 선택마커로서 스펙티노마이신 항생제 저항성 카세트의 유용성을 확립하였다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 문헌[Cerutti]은 90ug/ml 스펙티노마이신을 지니는 트리스-아세테이트-포스페이트 배지(TAP, 문헌[Harris, TheChlamydomonas Sourcebook, Academic Press, San Diego, 1989]에 의해 기재된 바와 같음)를 포함하는 한천 플레이트 상에서 형질전환된 클라미도모나스 레인하르드티의 선택 및 유지를 수행하였다는 것을 보고하였다. 문헌[Cerutti]은 또한 90ug/ml 스펙티노마이신을 지니는 TAP 액체 배양물에서 클라미도모나스 레인하르드티의 증식을 추가적으로 보고하였다. 대안의 배양 배지에서 클라미도모나스 레인하르드티의 증식을 논의하였다(예를 들어 문헌[Dent et al ., African Journal of Microbiology Research, Vol. 5:3 (2011), pp. 260-270 및 Yantao et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 107:2 (2010), pp. 258-268]). 클라미도모나스 레인하르드에서 사용에 적합한 추가적인 선택마커뿐만 아니라 클라미도모나스 레인하르드티에서 이종성 유전자 발현을 촉진하는데 적합한 프로모터 및 3' UTR을 포함하는 수많은 조절서열을 포함하는 추가적인 작제물은 당업계에 공지되어 있고, 논의되었다(검토를 위해, 문헌[Radakovits et al ., Eurkaryotic 세포, Vol. 9:4 (2010), pp. 486-501] 참조). 문헌[Cerutti]은 형질전환 벡터 P[1030] 및 클라미도모나스 레인하르드티 프로모터 및 3' UTR/종결자가 클라미도모나스 레인하르드티에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Cerutti]은 P[1030] 상에서 암호화된 스펙티노마이신 저항성 카세트가 클라미도모나스 레인하르드티에서 선택마커로서 사용에 적합하다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 aadA 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 P[1030]는 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 클라미도모나스 레인하르드티에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 탈라시오시라 슈도나나의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 클라미도모나스 레인하르드티 RbcS2 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 클라미도모나스 레인하르드티 RbcS2 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 클라미도모나스 레인하르드티 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 당업자는 클라미도모나스 레인하르드티 게놈의 서열 내에서 이러한 상동성 영역을 확인할 수 있다(문헌[Merchant et al., Science, Vol. 318:5848 (2007), pp. 245-250]에 의한 간행물을 참조로 함). 형질전환 벡터에 의한 클라미도모나스 레인하르드티의 안정한 형질전환을 미세입자투사법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. aadA 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 스펙티노마이신을 포함하는 TAP 한천 배지에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 클라미도모나스 레인하르드티에 대해 선택하기 위한 선택마커로서 사용할 수 있다. 클라미도모나스 레인하르드티 지질 생성에 적합한 생장 배지는 ESAW 배지 및 문헌[Yantao et al. 및 Dent et al] 에 의해 보고된 해당 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 클라미도모나스 레인하르드티 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 31: 야로위아 리포리티카 의 조작
야로위아 리포리티카에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Fickers et al.]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Fickers et al ., Journal of Microbiological Methods, Vol. 55 (2003), pp. 727-737]은 플라스미드 DNA에 의한 야로위아 리포리티카의 안정한 형질전환을 보고하였다. 아세테이트 형질전환 방법을 사용하여, Fickers는 플라스미드 JMP123을 야로위아 리포리티카 내로 도입하였다. 플라스미드 JMP123은 hph 단백질-암호화 영역의 상류의 야로위아 리포리티카 LIP2 유전자 프로모터(GenBank Accession No. AJ012632)에 작동 가능하게 연결되고, hph 단백질-암호화 영역 하류의 야로위아 리포리티카 LIP2 유전자 3?TR/종결자에 작동 가능하게 연결된 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자 산물(hph)을 암호화하는 서열을 포함하는 하이그로마이신 B 저항성 카세트를 포함하였다. JMP123에 의한 형질전환 전, 야로위아 리포리티카를 100ug/ml 스펙티노마이신을 포함하는 배지 상에서 증식할 수 없었다. JMP123에 의한 형질전환 시, 100ug/ml 하이그로마이신을 포함하는 배지에서 증식한 야로위아 리포리티카의 형질전환체를 얻었고, 이에 의해 야로위아 리포리티카에서 사용을 위한 선택마커로서 하이그로마이신 B 항생제 저항성 카세트를 확립하였다. 뉴클레오티드 서열을 프로모터의 JMP123 상에서 제공하였고, 야로위아 리포리티카 LIP2 유전자의 3?TR/종결자는 LIP2 좌위 내로 hph 암호 서열의 상동성 재조합을 위한 공여체 서열로서 작용하였다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던 분석에 의해 수행하였다. 문헌[Ficker]은 100ug/ml 하이그로마이신을 지니는 표준 YPD 배지(효모 추출물 펩톤 덱스트로스)를 포함하는 한천 플레이트 상에서 형질전환된 야로위아 리포리티카의 선택 및 유지를 수행하였다는 것을 보고하였다. 형질전환된 야로위아 리포리티카의 액체 배양을 하이그로마이신을 지니는 YPD 배지에서 수행하였다. 야로위아 리포리티카를 배양하기 위해 사용한 다른 배지 및 기법을 보고하였고, 야로위아 리포리티 카에서 사용을 위한 수많은 다른 플라스미드, 프로모터, 3' UTR 및 선택마커를 보고하였다(예를 들어 문헌[Pignede et al., Applied and Environmental Biology, Vol. 66:8 (2000), pp. 3283-3289, Chuang et al ., New Biotechnology, Vol. 27:4 (2010), pp. 277-282, 및 Barth and Gaillardin, (1996), In: K,W. (Ed.), Nonconventional Yeasts in Biotecnology. Sprinter-Verlag, Berlin-Heidelber, pp. 313-388]). 문헌[Fickers]은 형질전환 벡터 JMP123 및 야로위아 리포리티카 LIP2 유전자 프로모터 및 3' UTR/종결자가 야로위아 리포리티카에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Fickers]은 JMP123상에서 암호화된 하이그로마이신 저항성 카세트가 야로위아 리포리티카에서 선택마커로서 사용에 적합하다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 hph 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 JMP123는 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 야로위아 리포리티카에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 야로위아 리포리티카의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 야로위아 리포리티카 LIP2 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 야로위아 리포리티카 LIP2 유전자 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 야로위아 리포리티카 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 당업자는 야로위아 리포리티카 게놈의 서열 내에서 이러한 상동성 영역을 확인할 수 있다(문헌[Dujun et al ., Nature, Vol. 430 (2004), pp. 35-44]에 의한 간행물을 참조로 함). 형질전환 벡터에 의한 야로위아 리포리티카의 안정한 형질전환을 리튬 아세테이트 형질전환 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. hph 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 하이그로마이신을 포함하는 YPD 배지에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 야로위아 리포리티카에 대해 선택하기 위한 선택마커로서 사용할 수 있다. 야로위아 리포리티카 지질 생성에 적합한 생장 배지는 YPD 배지 및 문헌[Chuang et al] 에 의해 보고된 해당 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 야로위아 리포리티카 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 32: 모리티에렐라 알피나 의 조작
모리티에렐라 알피나에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Mackenzie et al .]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Mackenzie et al., Applied and Environmental Microbiology, Vol. 66 (2000), pp. 4655-4661]은 플라스미드 DNA에 의한 모리티에렐라 알피나의 안정한 형질전환을 보고하였다. 원형질체 형질전환 방법을 사용하여, MacKenzie는 플라스미드 pD4를 모리티에렐라 알피나 내로 도입하였다. 플라스미드 pD4는 hpt 단백질-암호화 영역의 상류의 모리티에렐라 알피나 히스톤 H4.1 유전자 프로모터(GenBank 등록번호. AJ249812)에 작동 가능하게 연결되고, hpt 단백질-암호화 영역 하류의 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans)N-(5'-포스포리보실)안트라닐레이트 이소머라제(trpC) 유전자 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결된 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자 산물(hph)을 암호화하는 서열을 포함하는 하이그로마이신 B 저항성 카세트를 포함하였다. pD4에 의한 형질전환 전, 모리티에렐라 알피나를 300ug/ml 스펙티노마이신을 포함하는 배지 상에서 증식할 수 없었다. pD4에 의한 형질전환 시, 300ug/ml 하이그로마이신을 포함하는 배지에서 증식한 야로위아 리포리티카의 형질전환체를 얻었고, 이에 의해 모리티에렐라 알피나에서 사용을 위한 선택마커로서 하이그로마이신 B 항생제 저항성 카세트를 확립하였다. 안정한 형질전환체의 게놈 DNA의 평가를 서던에 의해 수행하였다. 문헌[Mackenzie]은 하이그로마이신을 포함하는 PDA(감자 덱스트로스 한천) 상에서 형질전환된 모리티에렐라 알피나의 선택 및 유지를 수행한 것을 보고하였다. 문헌[Mackenzie]에 의해 형질전환된 모리티에렐라 알피나의 액체 배양을 하이그로마이신을 지니는 PDA 배지에서 또는 S2GYE 배지에서(5% 글루코스, 0.5% 효모 추출물, 0.18% NH4SO4, 0.02% MgSO4-7H2O, 0.0001% FeCl3-6H2O, 0.1%, 미량원소, 10 mM K2HPO4?aH2PO4을 포함) 수행하였다. 모리티에렐라 알피나를 배양시키기 위해 사용한 다른 배지 및 기법을 보고하였고, 모리티에렐라 알피나에서 사용을 위한 플라스미드, 프로모터, 3' UTR 및 선택마커를 보고하였다(예를 들어 문헌[Ando et al., Applied and Environmental Biology, Vol. 75:17 (2009) pp. 5529-35 및 Lu et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 164:7 (2001), pp. 979-90] 참조). 문헌[Mackenzie]은 형질전환 벡터 pD4 및 모리티에렐라 알피나 히스톤 H4.1 및 아스퍼질러스 니둘란스 trpC 유전자 3' UTR/종결자가 모리티에렐라 알피나에서 외인성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Mackenzie]은 pD4상에서 암호화된 하이그로마이신 저항성 카세트가 모리티에렐라 알피나에서 선택마커로서 사용에 적합하다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 hph 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pD4는 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 모리티에렐라 알피나에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 모리티에렐라 알피나의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 모리티에렐라 알피나 히스톤 H4.1 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 단백질 암호 서열의 3' 영역에서 또는 하류의 아스퍼질러스 니둘란스 trpC 3'UTR/종결자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 모리티에렐라 알피나 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 당업자는 모리티에렐라 알피나 게놈의 서열 내에서 이러한 상동성 영역을 확인할 수 있다(문헌[Wang et al., PLOS One, Vol. 6:12 (2011)]에 의한 간행물을 참조로 함). 형질전환 벡터에 의한 모리티에렐라 알피나의 안정한 형질전환을 원형질체 형질전환 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. hph 유전자 산물의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 하이그로마이신을 포함하는 PDA 배지에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 모리티에렐라 알피나에 대해 선택하기 위한 선택마커로서 사용할 수 있다. 모리티에렐라 알피나 지질 생성에 적합한 생장 배지는 S2GYE 배지 및 문헌[Lu et al. 및 Ando et al] 에 의해 보고된 해당 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 모리티에렐라 알피나 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 33: 로돕코커스 오파쿠스 PD630 의 조작
로돕코커스 오파쿠스 PD630에서 본 발명에 따른 재조합 유전자의 발현은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 문헌[Kalscheuer et al.]에 의해 교시되는 방법 및 벡터를 변형함으로써 수행할 수 있다. 요약하면, 문헌[Kalscheuer et al. as discussed herein. Briefly, Kalscheuer et al ., Applied and Environmental Microbiology, Vol. 52 (1999), pp. 508-515]은 플라스미드 DNA에 의한 로돕코커스 오파쿠스의 안정한 형질전환을 보고하였다.전기천공법의 방법을 사용하여, Kalscheuer는 플라스미드 pNC9501를 로돕코커스 오파쿠스 PD630 내로 도입하였다. 플라스미드 pNC9501는 유전자의 프로모터 및 3' 종결자 서열을 포함하는, 스트렙토마이세스 아주레우스(Streptomyces azureus) 23S rRNA A1067 메틸트랜스퍼라제 유전자의 전체 뉴클레오티드 서열을 포함하는 티오스트렙톤 저항성(티오r) 카세트를 포함하였다. pNC9501에 의한 형질전환 전, 로돕코커스 오파쿠스를 1 mg / ml 티오스트렙톤을 포함하는 배지 상에서 증식할 수 없었다. pNC9501에 의한 로돕코커스 오파쿠스 PD630 형질전환 시, 1mg/ml 티오스트렙톤을 포함하는 배지에서 증식한 형질전환체를 얻었고, 이에 의해 로돕코커스 오파쿠스 PD630에서 선택마커로서 티오스트렙톤 저항성 카세트를 확립하였다. 문헌[Kalscheuer]에 의해 기재되는 제2 플라스미드인 pAK68는 lacZ 프로모터에 의해 구동되는 폴리하이드록시 알카노에이트 생합성을 위해 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)베타-케토티올라제(phaB), 아세토아세틸-CoA 환원 효소(phaA) 및 폴리3-하이드록시알카논산 합성 효소(phaC) 유전자의 유전자 서열뿐만 아니라 저항성 티오r 카세트를 포함하였다. 폴리하이드록시알카노에이트 생합성에서 결여된 로돕코커스 오파쿠스 PD630 균주의 pAK68 형질전환시, 비형질전환된 균주보다 더 다량의 폴리 하이드록시 알카노에이트가 생성된 형질전환된 로돕코커스 오파쿠스 PD630를 얻었다. 도입된 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) phaB, phaA 및 phaC 효소의 검출가능한 활성은 pAK68 플라스미드 상에서 암호화된 조절 구성요소가 로돕코커스 오파쿠스 PD630에서 이종성 유전자 발현에 적합하다는 것을 나타내었다. 문헌[Kalscheuer]은 표준 루리아 브로스(Luria Broth; LB), 영양 브로스(nutrient broth; NB) 또는 티오스트렙톤을 포함하는 무기염 배지(mineral salts medium; MSM) 상에서 형질전환된 로돕코커스 오파쿠스 PD630의 선택 및 유지를 수행한 것을 보고하였다. 로돕코커스 오파쿠스 PD630을 배양시키기 위해 사용한 다른 배지 및 기법이 기재되었다(예를 들어 seeKurosawa et al., Journal of Biotechnology, Vol. 147:3-4 (2010), pp. 212-218 및 Alverez et al., Applied Microbial and Biotechnology, Vol. 54:2 (2000), pp.218-223). 문헌[Kalscheuer]은 형질전환 벡터 pNC9501 및 pAK68, 스트렙토마이세스 아주레우스(Streptomyces azureus) 23S rRNA A1067 메틸트랜스퍼라제 유전자의 프로모터 및 lacZ가 로돕코커스 오파쿠스 PD630에서 이종성 유전자 발현을 가능하게 하는데 적합하다는 것을 보고하였다. 추가로, 문헌[Kalscheuer]은 pNC9501 및 pAK68 상에서 암호화된 티오r카세트가 로돕코커스 오파쿠스 PD630.에서 선택마커로서 적합하다는 것을 보고하였다.
본 발명의 실시형태에서, 선택마커로서 사용을 위한 티오r 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 pNC9501은 지질 생합성 경로 발현 카세트 서열을 추가로 포함하도록 구성되고 변형되며, 이에 의해 형질전환 벡터를 만든다. 지질 생합성 경로 발현 카세트는 표 20으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 생합성 경로 단백질을 암호화하며, 각각의 단백질 암호 서열은 로돕코커스 오파쿠스 PD630에서 발현을 위해 코돈 최적화되어 표 19A 내지 표 19D에 따른 로돕코커스 오파쿠스의 핵 유전자에 내재하는 코돈 바이어스를 반영한다. 표 20의 각각의 지질 생합성 경로 단백질에 대해, 코돈 최적화된 유전자 서열은 개별적으로 단백질-암호 서열 상류의 lacZ 유전자 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 형질전환 작제물은 형질전환 벡터의 표적화된 게놈 통합을 위해 로돕코커스 오파쿠스 PD630 게놈에 대한 상동성 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 상동성 영역은 내인성 지질 생합성 경로 유전자의 하나 이상의 게놈 부위를 파괴하도록 선택될 수 있다. 당업자는 로돕코커스 오파쿠스 PD630 게놈의 서열 내에서 이러한 상동성 영역을 확인할 수 있다(문헌[Holder et al ., PLOS Genetics, Vol. 7:9 (2011)]에 의한 간행물을 참조로 함). 형질전환 벡터에 의한 로돕코커스 오파쿠스 PD630의 형질전환을 전기천공법 또는 다른 공지된 방법을 포함하는 잘 공지된 형질전환 기법을 통해 달성한다. 스트렙토마이세스 아주레우스 23S rRNA A1067 메틸트랜스퍼라제 유전자 산물 의 활성을, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 티오스트렙톤을 포함하는 LB 배지에서 형질전환 벡터에 의해 형질전환시킨 로돕코커스 오파쿠스 PD630에 대해 선택하기 위한 선택마커로서 사용할 수 있다. 로돕코커스 오파쿠스 PD630 지질 생성에 적합한 생장 배지는 문헌[Kurosawa et al . 및 Alvarez et al.] 에 의해 논의된 해당 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 로돕코커스 오파쿠스 PD630 지질의 지방산 프로파일의 평가는 표준 지질 추출 및 본 명세서에 기재된 분석 방법을 통해 평가될 수 있다.
실시예 34: 지방산 영양요구성에 대한 미세조류의 조작
쿠페아 라이티 티오에스테라제(CwTE2)를 발현시키기 위해 조작한 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435), 즉 실시예 3의 균주 B를 내인성 티오에스테라제 대립유전자, 즉, FATA1-1과 FATA1-2를 둘 다 녹아웃시키는 추가적인 유전적 변형을 위한 숙주 유기체로서 사용하였다. 여기서, 제1 형질전환 작제물을 만들어서 FATA1-1 좌위에서 네오마이신 발현 카세트를 균주 B로 통합시켰다. 이 작제물, 즉 pSZ2226은 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR(서열 번호 5) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에 핵 게놈의 FATA1-1 좌위에 대한 5'(서열 번호 30) 및 3'(서열 번호 31) 상동성 재조합 표적 서열(작제물에 측접함) 및 네오마이신 저항성 단백질 암호 서열을 포함하였다. 이 NeoR 발현 카세트를 서열 번호 15로서 열거하고, 선택마커로서 제공한다.
균주 B로 pSZ2226의 형질전환시, 개개의 형질전환체를 수크로스 및 G418을 포함하는 한천 플레이트 상에서 선택하였다. 단일 단리물인 균주 H를 추가적인 유전적 변형을 위해 선택하였다. 제2 형질전환 작제물인 pSZ2236을 만들어서 FATA1-2 좌위에서 균주 H 내로 티아민 선택마커의 발현을 가능하게 하는 폴리뉴클레오티드를 통합하였다. pSZ2236은 클로렐라 프로토테코이데스 액틴 프로모터/5?TR(서열 번호 22) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에 피. 모리포르미스(UTEX 1435) 핵 게놈 내로 통합을 위해 FATA1-2 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 32) 및 3'(서열 번호 33) 상동성 재조합 표적 서열(작제물에 측접) 및 아라비돕시스 탈리아나(A. thalian) THIC 단백질 암호화 영역을 포함하였다. 이 AtTHIC 발현 카세트를 서열 번호 23으로서 열거하고 선택마커로서 제공한다. 균주 I을 만들기 위해 pSZ2236으로 균주 H의 형질전환시, 개개의 형질전환체를 유리 지방산을 포함하는 한천 플레이트 상에서 선택하였다. 균주 I을 한천 플레이트 상에서 그리고 티아민이 없으며 유리 지방산으로 보충한 배지에서 증식시킬 수 있었다.
실시예 35: 스테아르산의 증가된 생성을 위한 조작 미생물유기체
프로토테카 모리포르미스의 고전적으로 돌연변이유발된 균주(UTEX 1435)인 균주 J를 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호 및 PCT/US2012/023696호에서 기재된 바와 같은 바이오리스틱 형질전환 방법에 따라 플라스미드 작제물 pSZ2281로 형질전환시켰다. pSZ2281은 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5?TR (서열 번호 5) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에, 서열 번호 3에서 주어진 단백질 서열을 발현시키기 위하여, 스테아로일-ACP 불포화효소의 발현을 하향조절하는 RNA 헤어핀(SAD2hpC, 서열 번호 34)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 핵 게놈 내로 통합을 위한 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 1) 및 3'(서열 번호 2) 상동성 재조합 표적 서열(작제물에 측접) 및 사카로마이세스 세레비시애 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역(서열 번호 4)을 포함하였다. 이 사카로마이세스 세레비시애 suc2 발현 카세트를 서열 번호 7로서 열거하고, 선택마커로서 제공한다. SAD2hpC RNA 헤어핀을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 클로렐라 프로토테코이 데스 액틴 프로모터/5'UTR(서열 번호 22) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어하에 있었다.
작제물 pSZ2281에 의한 균주 J의 형질전환시, 이에 의해 균주 K를 만들었고, 유일한 탄소 공급원으로서 스크로스를 함유하는 한천 플레이트 상에서 양성 클론을 선택하였다. 개개의 형질전환체를 클론정제하였고, PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에서 상세히 설명되는 것과 같은 지질 생성에 적합한 종속 영양 조건 하에서 증식시켰다. 지질 샘플을 건조 바이오매스로부터 제조하였고, 실시예 1에 기재한 바와 같은 표준 지방산 메틸 에스테르 기체 크로마토그래피 불꽃 이온화 검출 방법을 사용하여 분석하였다(또한 PCT/US2012/023696호 참조). 유일한 탄소 공급원으로서 글루코스 상에서 증식시킨 프로토테카 모리포르미스 UTEX 균주 J 및 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스 상에서 증식시킨 균주 K의 3가지 대표적인 단리물의 지방산 프로파일(전체 지방산의 영역%로서 표현)을 표 21에 제시한다.
스테아로일 ACP 불포화효소 유전자/유전자 산물를 표적화하는 헤어핀 RNA 작제물을 발현시키도록 조작된 프로토테카 모리모르미스(UTEX 1435) 세포의 지방산 프로파일.
영역% 지방산 균주 J 균주 K-1 균주 K-2 균주 K-3 균주 K-4
C8:0 0.02
C10:0 0.01 0.00 0.02 0.02 0.04
C12:0 0.03 0.05 0.05 0.05 0.08
C14:0 1.22 0.89 0.87 0.77 1.2
C16:0 26.75 29.23 28.96 27.55 28.06
C18:0 3.06 37.39 36.76 36.41 40.82
C18:1 59.62 23.90 24.76 26.92 22.02
C18:2 7.33 5.44 5.54 5.54 4.53
C18:3 0.14
C20:0 1.43
표 21에 제시한 데이터는 형질전환된 유기체의 C18:0 및 C18:1 지방산 프로파일에 대한 SAD2 헤어핀 RNA 작제물의 발현에 대한 분명한 영향을 나타낸다. SAD2 헤어핀 RNA 작제물을 포함하는 균주 K 형질전환체의 지방산 프로파일은 불포화 C18:1 지방산의 동시 감소와 함께 포화 C18:0 지방산 백분율의 증가를 보여주었다. 비형질전환 균주의 지방산 프로파일은 약 3% C18:0을 포함한다. 형질전환된 균주의 지방산 프로파일은 약 37% C18:0을 포함한다. 이들 데이터는 조작된 숙주 미생물에서 포화 지방산의 백분율을 변경시키기 위한, 특히 미생물 세포 내 C18:0 지방산의 농도를 증가시키고 C18:1 지방산을 감소시키기 위한 프로토테카 모리포르미스에서 SAD RNA 헤어핀 작제물의 발현을 가능하게 하는 폴리뉴클레오티드의 성공적인 발현 및 사용을 예시한다.
또한 표 21에 나타낸, 균주 K-4는 훨씬 더 상승된 수준의 스테아레이트를 가졌다. 균주 K4는 SAD2B 유전자좌로 균주 K1 내지 균주 K3의 작제물을 삽압함으로써 형성되었다. 따라서, SAD 유전자의 하나의 복사체를 녹아웃시키고 RNA 수준에서 남아있는 복사체를 억제함으로써, 올레산에서 추가 감소 및 스테아레이트에서의 이에 상응하는 증가가 얻어졌다. 균주 K4로부터 얻은 RBD의 트리글리세리드 분석은 약 12%의 POP, 27%의 POS 및 18%의 SOS를 나타내었다.
실시예 36: 내인성 아실- ACP 티오에스테라제의 녹아웃을 통한 올레산의 증가된 생성을 위한 미생물유기체의 조작
프로토테카 모리포르미스의 고전적으로 돌연변이 유발된 균주(UTEX 1435)인 균주 J를 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에서 기재된 바이오리스틱 형질전환 방법에 따라 작제물 pSZ2402 내지 pSZ2407의 각각으로 독립적으로 형질전환시켰다. 작제물 pSZ2402 내지 pSZ2407의 각각은 지방 아실-ACP 티오에스테라제의 발현을 하향조절하는 프로토테카 모리포르미스 FATA1 mRNA 전사체에 대해 표적화된 헤어핀 RNA를 암호화하는 상이한 폴리뉴클레오티드, 핵 게놈 내로 통합을 위한 6S 게놈 영역에 대한 5'(서열 번호 1) 및 3'(서열 번호 2) 상동성 재조합 표적 서열(작제물에 측접함), 및 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR(서열 번호 5) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에 서열 번호 3에서 주어진 단백질 서열을 발현시키기 위한 사카로마이세스 세레비시애 suc2 수크로스 인버타제 암호화 영역(서열 번호 4)을 포함하였다. 이 사카로마이세스 세레비시애 suc2 발현 카세트를 서열목록 7에 열거하고 선택마커로서 제공한다. 각각의 헤어핀에 대응되는 폴리뉴클레오티드에 대한 서열 목록 동일성을 표 22에 열거한다. 각각의 RNA 헤어핀을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 클라미도모나스 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR (서열 번호 125) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 126)의 제어 하에 있었다.
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 J를 형질전환시키는데 사용된 플라스미드 작제물.
플라스미드 작제물 헤어핀 명칭 서열 번호
pSZ2402 PmFATA-hpB 서열 번호 40
pSZ2403 PmFATA-hpC 서열 번호 41
pSZ2404 PmFATA-hpD 서열 번호 42
pSZ2405 PmFATA-hpE 서열 번호 43
pSZ2406 PmFATA-hpF 서열 번호 44
pSZ2407 PmFATA-hpG 서열 번호 45
표 22에 열거한 작제물 각각에 의한 균주 J의 독립적 형질전환시, 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스를 함유하는 한천 플레이트 상에서 양성 클론을 선택하였다. 개개의 형질전환체를 클론정제하였고, PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에서 상세하게 설명되는 것과 같은 지질 생성에 적합한 종속 영양 조건 하에서 증식시켰다. 지질 샘플을 건조 바이오매스로부터 제조하였고, 실시예 1에 기재한 바와 같은 표준 지방산 메틸 에스테르 기체 크로마토그래피 불꽃 이온화 검출 방법을 사용하여 분석하였다(또한, PCT/US2012/023696호 참조). 유일한 탄소 공급원으로서 글루코스 상에서 증식시킨 피. 모리포르미스 (UTEX 1435) 균주 J 및 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스 상에서 증식시킨 균주 J의 지방산 프로파일(전체 지방산의 영역%로서 표현)을 표 23에 제시한다.
지방 아실- ACP 티오에스테라제 유전자/유전자 산물을 표적화하는 헤어핀 RNA 작제물을 발현시키기 위해 조작된 피. 모리포르미스( UTEX 1435) 세포의 지방산 프로파일.
영역% 지방산
작제물 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2
비형질전환 균주 J 0 0.05 1.32 26.66 3.1 59.07 7.39
PmFATA-hpB 0.04 0.07 1.36 24.88 2.24 61.92 6.84
0 0.08 1.33 25.34 2.39 61.72 6.5
0 0.07 1.29 25.44 2.26 61.7 6.69
0 0.06 1.33 25.1 2.37 61.56 6.87
PmFATA-hpC 0 0.08 1.18 22.03 1.71 63.8 8.63
0 0.07 1.21 24.5 2.23 62.32 7.19
0 0.08 1.29 24.93 2.24 62.02 7.01
0.05 0.06 1.29 25.45 2.26 61.81 6.76
PmFATA-hpD 0 0.02 0.68 15.8 1.88 72.64 6.96
0 0.03 0.78 17.56 1.7 71.8 6.03
0 0.03 0.92 19.04 2.03 68.82 7.05
0 0.04 1.27 23.14 2.25 65.27 6.07
PmFATA-hpE 0 0.03 0.79 18.55 2.13 69.66 6.77
0 0.04 1.11 21.01 1.74 65.18 8.55
0 0.03 1.08 21.11 1.54 64.76 8.87
0 0.03 1.17 21.93 1.71 63.89 8.77
PmFATA-hpF 0.03 0.04 0.34 8.6 1.69 78.08 8.87
0 0.03 0.49 10.2 1.52 76.97 8.78
0 0.03 1 20.47 2.22 66.34 7.45
0 0.03 1.03 21.61 1.88 65.39 7.76
PmFATA-hpG 0 0.03 1.03 20.57 2.36 64.73 8.75
0 0.03 1.2 24.39 2.47 61.9 7.49
0 0.04 1.29 24.14 2.29 61.41 8.22
표 23에 제시한 데이터는 형질전환된 유기체의 C18:0 및 C18:1 지방산 프로파일에 대한 FATA 헤어핀 RNA 작제물의 발현에 대한 분명한 영향을 나타낸다. FATA 헤어핀 RNA 작제물을 포함하는 균주 J 형질전환체의 지방산 프로파일은 C16:0 및 C18:0 지방산의 동시 감소와 함께 C18:1 지방산 백분율의 증가를 보여주었다. 비형질전환 균주 J의 지방산 프로파일은 약 26.66% C16:0, 3% C18:0, 및 약 59% C18:1 지방산이다. 대조적으로, 형질전환된 균주의 지방산 프로파일은 8.6%만큼 낮은 C16:0 및 1.54%만큼 낮은 C18:0 및 78%초과의 C18:1를 포함한다.
이들 데이터는 조작된 미생물의 지방산 프로파일을 변경시키는, 특히 미생물 세포 내 C18:1 지방산의 농도를 증가시키고, C18:0 및 C16:0 지방산을 감소시키는 프로토테카 모리포르미스에서 폴리뉴클레오티드 FATA RNA 헤어핀 작제물의 이용성 및 성공적인 사용을 예시한다.
실시예 37: KASI 또는 KASIV 과발현을 통해 중쇄 지방산의 생성 증가를 위한 미생물유기체 조작
이 실시예는 형질전환된 미생물유기체의 지방산 프로파일이 라우르산, C10:0 및 전체 포화 지방산에서 풍부화된 미생물유기체를 조작하기 위한, KASI 또는 KASIV 효소를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 용도를 기재한다.
작제물 pSZD1132, pSZD1133, pSZD1134, 또는 pSZD1201 각각은 독립적으로 사용되어 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 바이오리스틱 형질전환 방법에 따라 쿠페아 라이티 티오에스테라제(CwTE2)를 발현하도록 조작된 실시예 3의 균주 B, 즉 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)를 형절전환시켰다. 상기 작제물 각각은 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR(서열 번호 5) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에서 KASI 또는 KASIV 효소, pLoop 게놈 영역에 대해 상동성인 5'(서열 번호 13) 및 3'(서열 번호 14) 재조합 표적화 서열(작제물에 측접)(핵내 게놈으로의 통합용), 및 네오마이신 저항성 단백질 암호화 서열을 포함하였다. 이러한 NeoR 발현 카세트는 서열 번호 15로서 열거되어 있으며, 선택 마커로서 작용한다. 각각의 작제물에 대응되는 폴리뉴클레오티드에 대한 서열 목록 동일성은 표 20에 열거되어 있다. 각각의 KAS 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 피. 모리포르미스 UTEX 1435 Amt03 프로모터/5?TR(서열 번호 8) 및 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3?TR(서열 번호 6)의 제어 하에 있었다. KAS 효소 및 네오마이신 저항성 유전자의 단백질 암호화 영역을 코돈 최적화하여 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 피. 모리포르미스 UTEX 1435 핵 유전자에 내재한 코돈 바이어스를 반영하였다.
균주 B로 개개의 플라스미드의 형질전환 시, G418을 포함하는 한천 플레이트 상에서 양성 클론을 선별하였다. 개개의 형질전환체를 클론정제하고, PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 상세하게 기재된 바와 같은 지질 생성에 적합한 조건 하 pH 7.0에서 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스 상에서 성장시켰다. 지질 샘플을 각각의 형질전환체로부터의 건조 바이오매스로부터 준비하였고, 실시예 1에 기재된 바와 같은 표준 지방산 메틸 에스테르 기체 크로마토그래피 불꽃 이온화(FAME GC/FID) 검출 방법을 사용하여 이들 샘플로부터의 지방산 프로파일을 분석하였다. 균주 B 및 4가지의 pSZ2046 각각의 양성 형질전환체(균주 M-P, 1 내지 4)의 지방산 프로파일(전체 지방산의 영역%로서 표현)은 표 6에 제시되어 있다.
피. 모리포르미스 UTEX 1435(U1)의 지방산 프로파일(전체 지방산의 영역%로서 표현), 즉 비형질전환 균주 B 및 5가지의 pSZ2046 양성 형질전환체(균주 C, 1 내지 5)는 표 24에 제시되어 있다.
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 B를 형전전환시키는데 사용된 플라스미드 작제물.
플라스미드 작제물 KASI / KASIV 공급원 수송 펩티드 서열 번호
pSZD1134 쿠페아 라이티 GenBank 수탁 번호 U67317 천연 서열 번호 46
pSZD1201 쿠페아 라이티 PmSAD 서열 번호 47
pSZD1132 쿠페아 풀체리마(Cuphea pulcherrima) GenBank 수탁 번호 AAC68860 천연 서열 번호 48
pSZD1133 쿠페아 후커리아나 천연 서열 번호 49
C10, 라우르산, 및 전체 포화 지방산의 증가를 위하여 조작된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 B의 지방산 프로파일.
지방산(면적%)
플라스미드 작제물(들) 번호 C10 C12 C14 C16 C18:0 C18:1 C18:2 C10-C12 %포화/전체
pSZ1283 7.89 35.49 16.58 11.5 1.09 19.64 6.49 43.38 72.55
pSZ1283, pSZD1134 1 14.94 43.97 12.19 7.56 0.72 14.11 5.31 58.91 79.38
pSZ1283, pSZD1134 2 10.27 39.61 15.35 9.61 0.94 17.1 5.88 49.88 75.78
pSZ1283, pSZD1134 3 11.69 41.83 15.21 8.77 0.83 15.04 5.40 53.52 78.33
D1134-20 4 10.76 40.77 15.32 9.19 0.88 16.06 5.76 51.53 76.92
pSZ1283,
pSZD1132		 1 10.77 40.31 15.21 9.43 0.88 16.18 5.97 51.08 76.6
pSZ1283,
pSZD1132		 2 9.19 37.03 15.02 10.52 1.00 19.63 6.29 46.22 72.76
pSZ1283,
pSZD1132		 3 8.97 36.09 15.01 10.77 1.05 20.38 6.39 45.06 71.89
pSZ1283,
pSZD1132		 4 9.51 38.12 14.96 9.96 0.94 18.93 6.32 47.63 73.49
pSZ1283,
pSZD1201		 1 13.06 46.21 9.84 7.12 0.75 16.7 5.22 59.27 76.98
pSZ1283,
pSZD1201		 2 11.02 43.91 13.01 7.78 0.86 16.53 5.77 54.93 76.58
pSZ1283,
pSZD1201		 3 11.59 45.14 12.41 7.61 0.82 15.72 5.65 56.73 77.57
pSZ1283,
pSZD1201		 4 10.66 41.32 13.74 8.75 0.68 18.64 5.21 51.98 75.15
pSZ1283,
pSZD1133		 1 6.90 36.08 15.15 11.02 1.00 21.74 6.77 42.98 70.15
pSZ1283,
pSZD1133		 2 7.01 35.88 15.01 10.75 1.07 22.02 6.93 42.89 69.72
pSZ1283,
pSZD1133		 3 10.65 41.94 12.38 8.48 0.85 18.28 6.15 52.59 74.3
pSZ1283,
pSZD1133		 4 10.23 41.88 12.58 8.52 0.82 18.48 6.22 52.11 74.03
표 25에 제시된 데이터는 형질전환된 유기체의 C10:0 및 C12 지방산 프로파일에 대한 KASI 및 KASIV 효소의 외인성 발현의 분명한 영향을 나타낸다. 쿠페아 라이티 티오에스테라제만 발현하는 균주 B의 지방산 프로파일은 전체 지방산의 72.55%를 차지하는 포화 지방산과 함께 약 8% C10:0 및 약 35.5% C12:0을 포함하였다. 대조적으로 피. 모리포르미스 스테아로일 ACP 불포화효소 수송 펩티드와 함께 추가적으로 쿠페아 라이티 KASI를 발현하도록 조작된 균주 B의 형질전환체는 약 13% C10:0 및 약 46% C12:0의 지방산 프로파일을 특징으로 하였다. 포화 지방산 지방산은 씨. 라이티 KASI 융합 단백질을 공동발현하는 균주 B의 형질전환체에서 77%만큼 높이 차지하였다. 유사하게, 효소의 천연 수송 펩티드와 함께 씨. 라이티 KASI를 발현하도록 조작된 균주 B의 형질전환체는 약 15% C10, 약 44% C12, 및 약 79% 포화 지방산의 지방산 프로파일을 특징으로 하였다. 쿠페아 풀체리마 KASIV 또는 쿠페아 후커리아나 KASIV를 발현하는 균주 B의 많은 형질전환체 또는 지방산 프로파일은 또한 균주 B 자체의 지방산 프로파일에 비하여 C10% 및 C12% 수준의 상승을 나타내었다.
이들 데이터는 조작된 숙주 미생물에서 포화 지방산의 백분율을 변경시키기 위해, 특히 미생물 세포에서 C10:0 및 C12:0 지방산의 농도를 증가시키는데 있어서, 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)에서 KASI 및 KASIV 작제물의 발현을 가능하게 하는 폴리뉴클레오티드의 유용성 및 유효성을 입증한다.
실시예 38: KASI 녹아웃을 통해 중쇄 지방산의 생성 증가를 위한 미생물유기체 조작
이 실시예는 형질전환된 미생물유기체의 지방산 프로파일이 C10:0 및 중쇄 지방산에서 풍부화된 미생물유기체를 조작하기 위한, 상이한 KASI 대립유전자를 방해하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 용도를 기재한다.
작제물 pSZ2302 및 pSZ2304는 독립적으로 사용되어 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 바이오리스틱 형질전환 방법에 따라 쿠페아 라이티 티오에스테라제(CwTE2)를 발현하도록 조작된 실시예 3의 균주 B, 즉 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)를 형절전환시켰다. pSZ2302는 씨. 프로토테코이데스 액틴 프로모터/5'UTR(서열 번호 22) 및 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에서 KAS1 대립유전자 1 게놈 영역에 대해 상동성인 5'(서열 번호 50) 및 3'(서열 번호 51) 재조합 표적화 서열(작제물에 측접)(피. 모리포르미스 핵내 게놈으로의 통합용), 및 에이. 탈리아나 THIC 단백질 암호화 서열을 포함하였다. pSZ2304는 씨. 프로토테코이데스 액틴 프로모터/5'UTR(서열 번호 22) 및 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에서 KAS1 대립유전자 2 게놈 영역에 대해 상동성인 5'(서열 번호 52) 및 3'(서열 번호 53) 재조합 표적화 서열(작제물에 측접)(피. 모리포르미스 핵내 게놈으로의 통합용), 및 에이. 탈리아나 THIC 단백질 암호화 서열을 포함하였다. 이러한 AtTHIC 발현 카세트는 서열 번호 23으로서 열거되어 있으며, 선택 마커로서 작용한다. AtTHIC의 단백질 암호화 영역을 코돈 최적화하여 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 피. 모리포르미스 UTEX 1435 핵 유전자에 내재한 코돈 바이어스를 반영하였다.
균주 B로 pSZ2302 및 pSZ2304를 독립적으로 형질전환하고, 이에 의하여 균주 Q 및 R을 생성할 시, 티아민을 포함하는 한천 플레이트 상에서 양성 클론을 선별하였다. 개개의 형질전환체를 클론정제하고, PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 상세하게 기재된 바와 같은 지질 생성에 적합한 종속영양 조건 하 pH 5.0 또는 pH 7.0에서 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스 상에서 배양하였다. 지질 샘플을 각각의 형질전환체로부터의 건조 바이오매스로부터 준비하였고, 실시예 1에 기재된 바와 같은 지방산 메틸 에스테르 기체 크로마토그래피 불꽃 이온화(FAME GC/FID) 검출 방법을 사용하여 이들 샘플로부터의 지방산 프로파일을 분석하였다. 균주 B 및 양성 pSZ2302(균주 Q, 1 내지 5) 및 pSZ2304(균주 R, 1 내지 5) 형질전환체의 지방산 프로파일은 표 26 및 표 27에 제시되어 있다.
중쇄 지방산의 증가를 위하여 조작된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 B, Q, 및 R(pH 5.0에서 배양됨)의 지방산 프로파일.
　 지방산(면적%)
균주 형질전환 플라스미드(들) C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C10-C14
UTEX 1435 없음 0.00 0.04 1.28 26.67 3.05 59.96 7.19 1.32
균주 B pSZ1283 0.01 0.09 1.09 21.60 2.21 65.15 7.94 1.19
균주 Q-1 pSZ1283, pSZ2302 0.08 1.21 7.52 38.71 1.38 38.32 8.75 8.81
균주 Q-2 pSZ1283, pSZ2302 0.15 1.36 7.51 38.23 1.33 38.27 8.94 9.02
균주 Q-3 pSZ1283, pSZ2302 0.16 1.43 7.49 38.88 1.30 37.58 8.73 9.08
균주 Q-4 pSZ1283, pSZ2302 0.00 1.71 7.42 37.67 1.43 37.26 10.38 9.13
균주 Q-5 pSZ1283, pSZ2302 0.13 1.21 7.36 38.81 1.31 38.07 8.71 8.7
균주 R-1 pSZ1283, pSZ2304 0.19 1.78 8.47 40.11 1.34 33.46 9.98 10.44
균주 R-2 pSZ1283, pSZ2304 0.90 8.00 7.78 28.96 1.15 30.26 17.14 16.68
균주 R-3 pSZ1283, pSZ2304 0.26 3.58 7.77 34.98 1.56 32.86 14.60 11.61
균주 R-4 pSZ1283, pSZ2304 1.64 13.50 7.61 21.38 0.90 36.13 14.73 22.75
균주 R-5 pSZ1283, pSZ2304 1.03 9.63 7.56 25.61 1.00 31.70 18.23 18.22
중쇄 지방산의 증가를 위하여 조작된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 B, Q, 및 R(pH 7.0에서 배양됨)의 지방산 프로파일.
지방산(면적%)
균주 형질전환 플라스미드(들) C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C10-C14
UTEX 1435 없음 0.01 0.04 1.34 27.94 3.24 57.46 7.88 1.39
균주 B pSZ1283 4.72 29.57 15.56 12.63 1.20 27.65 7.39 49.85
균주 Q-1 pSZ1283, pSZ2302 16.00 50.61 9.52 5.33 0.54 11.79 5.28 76.13
균주 Q-2 pSZ1283, pSZ2302 16.32 49.79 9.82 5.52 0.54 12.28 4.87 75.93
균주 Q-3 pSZ1283, pSZ2302 15.08 47.58 10.23 5.93 0.56 15.12 4.50 72.89
균주 Q-4 pSZ1283, pSZ2302 14.27 47.30 10.44 6.17 0.56 15.50 4.59 72.01
균주 Q-5 pSZ1283, pSZ2302 14.75 47.28 10.32 6.04 0.59 15.50 4.65 72.35
균주 R-1 pSZ1283, pSZ2304 21.25 55.42 7.97 3.65 0.00 5.46 5.66 84.64
균주 R-2 pSZ1283, pSZ2304 13.00 55.05 10.88 5.78 0.28 7.90 6.29 78.93
균주 R-3 pSZ1283, pSZ2304 12.89 53.15 11.11 6.13 0.00 9.87 6.13 77.15
균주 R-4 pSZ1283, pSZ2304 12.80 51.64 13.86 6.69 0.00 7.51 6.70 78.3
균주 R-5 pSZ1283, pSZ2304 16.61 51.42 9.84 5.27 0.33 11.15 4.79 77.87
표 26 및 표 27에 제시된 데이터는 형질전환된 유기체의 지방산 프로파일에 대한 상이한 KASI 대립유전자의 방해의 분명한 영향을 나타낸다. pH 5.0에서 배양될 때, 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 및 pH 조절가능 프로모터의 제어 하에서 쿠페아 라이티 FATB2 티오에스테라제를 발현하는 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 B의 지방산 프로파일은 매우 유사하였다. 이들 프로파일은 전체 지방산의 약 1.19% 내지 1.3%를 포함하는 C10-C14 지방산과 함께 약 1% C14:0, 약 21% 내지 26% C16:0, 약 2% 내지 3% C18:0, 약 60% 내지 65% C18:1, 약 7% C18:2를 특징으로 하였다. 대조적으로, pH 5.0에서 배양될 때, KASI 대립유전자 1(균주 Q) 또는 KASI 대립유전자 2(균주 R)을 방해하도록 추가로 조작된 균주 B는 균주 B 또는 UTEX 1435에 비하여 C12 지방산의 수준 증가, C14 지방산의 수준 증가, C18 지방산의 수준 감소, 및 C18:1 지방산의 수준 감소를 특징으로 하는 변경된 지방산 프로파일을 나타내었다. 균주 R(대립유전자 2 녹아웃) 단리물이 일반적으로 균주 Q(대립유전자 1 녹아웃)보다 C12가 더 크고 C16 및 C18:1이 더 낮다는 점에서, 균주 Q 및 R의 단리물의 지방산 프로파일은 상이하다.
pH 7.0에서 배양될 때, 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)의 지방산 프로파일은 pH 조절가능 프로모터의 제어 하에서 쿠페아 라이티 FATB2 티오에스테라제를 발현하는 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 B와 다르다. pH 7.0에서 배양될 때, 균주 B는 C10, C12, 및 C14 지방산이 상승된 지방산 프로파일을 특징으로 하였다(이들 지방산은 전체 지방산의 50%를 구성함). pH 7.0에서 배양될 때, 균주 Q 및 균주 R은 균주 B의 지방산 프로파일에 대하여 C10, C12, 및 C14 지방산이 훨씬 더 증가되고, C18:0 및 C18:1 지방산이 훨씬 더 감소된 지방산 프로파일을 나타내었다.
이들 프로파일은 전체 지방산의 약 1.19% 내지 1.3%를 포함하는 C10-C14 지방산과 함께 약 1% C14:0, 약 21% 내지 26% C16:0, 약 2% 내지 3% C18:0, 약 60% 내지 65% C18:1, 약 7% C18:2를 특징으로 하였다. 또한, 균주 Q 및 R 사이 지방산 프로파일의 차이는 균주 R의 프로파일이 균주 Q의 프로파일보다 더 큰 백분율 수준의 C12 및 더 낮은 수준의 C18:1을 포함하는 것으로 관찰되었다.
이들 데이터는 조작된 숙주 미생물에서 포화 지방산의 백분율을 변경시키기 위해, 특히 미생물 세포에서 C10:0 및 C12:0 지방산의 농도를 증가시키고 C18:0 및 C18:1 지방산의 농도를 감소시키는데 있어서, 프로토테카 모리포르미스에서 KASI 및 KASIV 작제물의 발현을 가능하게 하는 폴리뉴클레오티드의 성공적인 발현 및 용도를 설명한다. 추가적으로, 본원의 데이터는 상이한 KASI 대립유전자는 방해되어 형질전환된 유기체의 지방산 프로파일의 변경을 가져올 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 39: KASI 녹다운 통해 중쇄 지방산의 생성 증가를 위한 미생물유기체 조작
이 실시예는 형질전환된 미생물유기체의 지방산 프로파일이 중쇄 지방산에서 풍부화된 미생물유기체를 조작하기 위한, KASI 효소를 약화시키는 RNA 헤어핀을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 용도를 기재한다.
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)의 고전적으로 돌연변이유발된 균주, 즉 균주 S를 처음에 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 바이오리스틱 형질전환 방법에 따라 작제물 pSZ2482 내지 pSZ248 각각으로 독립적으로 형질전환시켰다. 작제물 pSZ2482 내지 pSZ2485는 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR(서열 번호 5) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에서 아실-ACP 티오에스테라제, 6S 게놈 영역에 대해 상동성인 5'(서열 번호 1) 및 3'(서열 번호 2) 재조합 표적화 서열(작제물에 측접)(핵내 게놈으로의 통합용), 및 에스. 세레비지아에 suc2 수크로스 전화효소 암호화 영역(서열 번호 4)(서열 번호 3에 주어진 단백질 서열을 발현함)의 발현을 하향 조절하는 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) KASI mRNA 전사체에 대하여 표적화된 헤어핀 RNA를 암호화하는 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함하였다. 이러한 에스. 세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 7로서 열거되어 있으며, 선택 마커로서 작용한다. 각각의 KASI 헤어핀에 대응되는 폴리뉴클레오티드에 대한 서열 목록 동일성은 표 28에 열거되어 있다. 각각의 RNA 헤어핀을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 피. 모리포르미스 Amt03 프로모터/5?TR(서열 번호 8) 및 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3?TR(서열 번호 6)의 제어 하에 있었다. suc2 발현 카세트의 단백질 암호화 영역을 코돈 최적화하여 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 피. 모리포르미스 UTEX 1435 핵 유전자에 내재한 코돈 바이어스를 반영하였다.
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 S를 형질전환시키는데 사용된 플라스미드 작제물.
형질전환 작제물 헤어핀 서열 번호
pSZ2482 KASI 헤어핀 B 서열 번호 54
pSZ2483 KASI 헤어핀 C 서열 번호 55
pSZ2484 KASI 헤어핀 D 서열 번호 56
pSZ2485 KASI 헤어핀 E 서열 번호 57
표 28에 열거된 작제물 각각을 이용하여 균주 S의 독립적인 형질전환 시, 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스를 포함하는 한천 플레이트 상에서 양성 클론을 선별하였다. 개개의 형질전환체를 클론정제하고, PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 상세하게 기재된 바와 같은 지질 생성에 적합한 종속영양 조건 하에서 증식시켰다. 지질 샘플을 건조 바이오매스로부터 준비하였고, 실시예 1(또한, PCT/US2012/023696호 참조)에 기재된 바와 같은 지방산 메틸 에스테르 기체 크로마토그래피 불꽃 이온화 검출 방법을 사용하여 분석하였다. 유일한 탄소 공급원으로서 글루코스 상에서 증식시킨 피. 모리포르미스 UTEX 1435 및 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스 상에서 증식시킨 균주 S의 각각의 형질전환체의 4가지 대표적인 단리물의 지방산 프로파일(전체 지방산의 영역%로서 표현)이 표 29에 제시되어 있다.
KASI 유전자/유전자 산물을 표적화하는 헤어핀 RNA 작제물을 발현하도록 조작된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 세포의 지방산 프로파일.
　 　 　 지방산(영역%)
균주 플라스미드 번호 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3
UTEX 1435 없음 1 0.00 0.04 1.45 27.97 3.18 58.35 6.78 0.60
균주 S pSZ2482 1 0.19 0.74 8.47 38.30 2.15 36.24 9.45 1.42
2 0.07 0.25 4.16 32.46 2.62 49.57 7.73 0.82
3 0.03 0.10 2.68 27.48 2.65 56.40 8.14 0.55
4 0.03 0.10 2.60 27.44 2.01 55.54 9.15 0.78
pSZ2483 1 0.00 0.06 1.94 30.58 1.55 53.26 9.31 0.76
2 0.20 0.05 1.76 28.01 2.31 56.61 8.70 0.60
3 0.00 0.06 1.60 24.38 2.65 58.25 9.93 1.15
4 0.00 0.04 1.56 26.65 2.96 60.06 6.92 0.52
pSZ2484 1 0.72 3.71 19.15 38.03 1.68 14.22 15.00 4.21
2 0.66 2.76 16.34 38.19 1.78 18.52 14.91 3.38
3 0.69 2.96 16.20 37.28 1.77 19.05 15.26 3.48
4 0.18 0.70 8.61 36.80 2.35 36.22 10.89 1.10
pSZ2485 1 0.00 0.04 1.41 25.34 3.16 60.12 7.78 0.48
2 0.03 0.04 1.41 23.85 2.19 61.23 8.75 0.67
3 0.00 0.04 1.41 24.41 2.23 60.64 8.69 0.67
4 0.00 0.04 1.41 24.51 2.16 60.85 8.91 0.66
표 29에 제시된 데이터는 형질전환된 유기체의 지방산 프로파일에 대한 KAS 헤어핀 RNA 작제물의 발현의 분명한 영향을 나타낸다. pSZ2482 또는 pSZ2484 KASI 헤어핀 RNA 작제물을 포함하는 균주 S 형질전환체의 지방산 프로파일은 UTEX 1435의 지방산 프로파일에 대하여 C18:0 및 C18:1 지방산의 감소를 수반하면서 C10, C12, C14, 및 C16 지방산의 백분율에서 증가를나타내었다.
이들 데이터는 조작된 미생물의 지방산 프로파일을 변경시키기 위해, 특히 미생물 세포에서 중쇄 지방산의 농도를 증가시키고 C18:0 및 C18:1 지방산을 감소시키는데 있어서, 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)에서 폴리뉴클레오티드 KASI RNA 헤어핀 작제물의 유용성 및 성공적인 용도를 설명한다.
실시예 40: 신장효소 과발현을 통해 스테아르산의 생성 증가를 위한 미생물유기체 조작
이 실시예는 형질전환된 미생물유기체의 지방산 프로파일이 스테아르산, 아라키드산, 및 도코사디엔산에서 풍부화된 미생물유기체를 조작하기 위한, 신장효소 효소를 약화시키는 RNA 헤어핀을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 용도를 기재한다.
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)의 고전적으로 돌연변이유발된 균주, 즉 균주 J를 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 바이오리스틱 형질전환 방법에 따라 작제물 pSZ2323, pSZ2324, 또는 pSZ2328의 각각으로 독립적으로 형질전환시켰다. 각각의 작제물은 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR(서열 번호 5) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에서 신장효소, 6S 게놈 영역에 대해 상동성인 5'(서열 번호 1) 및 3'(서열 번호 2) 재조합 표적화 서열(작제물에 측접)(핵내 게놈으로의 통합용), 및 에스. 세레비지아에 suc2 수크로스 전화효소 암호화 영역(서열 번호 4)(서열 번호 3에 주어진 단백질 서열을 발현함)을 포함하였다. 이러한 에스. 세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 7로서 열거되어 있으며, 선택 마커로서 작용한다. 각각의 신장효소에 대응되는 폴리뉴클레오티드에 대한 서열 목록 동일성은 표 30에 열거되어 있다. 각각의 신장효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 피. 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 8) 및 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR(서열 번호 6)의 제어 하에 있었다. 외인성 신장효소 및 suc2 발현 카세트의 단백질 암호화 영역을 코돈 최적화하여 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 피. 모리포르미스 UTEX 1435 핵 유전자에 내재한 코돈 바이어스를 반영하였다.
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 J를 형질전환시키는데 사용된 플라스미드 작제물.
플라스미드 작제물 신장효소 공급원 GenBank 수탁 번호 서열 번호
pSZ2328 마르칸티아 폴리모르파(Marchantia polymorpha) AAP74370 58, 59
pSZ2324 트립파노소마 브루세이 AAX70673 60, 61
pSZ2323 사카로마이세스 세레비지아에 P39540 62, 63
표 30에 열거된 작제물을 이용하여 균주 J의 독립적인 형질전환 시, 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스를 포함하는 한천 플레이트 상에서 양성 클론을 선별하였다. 개개의 형질전환체를 클론정제하고, PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 상세하게 기재된 바와 같은 지질 생성에 적합한 종속영양 조건 하에서 증식시켰다. 지질 샘플을 건조 바이오매스로부터 준비하였고, 실시예 1(또한, PCT/US2012/023696호 참조)에 기재된 바와 같은 지방산 메틸 에스테르 기체 크로마토그래피 불꽃 이온화 검출 방법을 사용하여 분석하였다. 유일한 탄소 공급원으로서 글루코스 상에서 증식시킨 피. 모리포르미스 UTEX 1435 균주 J 및 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스 상에서 증식시킨 균주 J의 각각의 형질전환의 3가지 대표적인 단리물의 지방산 프로파일(전체 지방산의 영역%로서 표현)이 표 31에 제시되어 있다.
신장효소를 과발현하도록 조작된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 J 세포의 지방산 프로파일.
플라스미드 작제물 번호 지방산 영역%
C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3α C20:0 C22:2n6
None 1 1.39 27.42 0.77 3.33 57.46 8.05 0.61 0.30 0.03
pSZ2328 1 1.25 19.23 0.85 8.26 57.54 9.34 0.79 0.73 0.94
pSZ2328 2 1.22 17.76 0.69 7.86 60.56 9.38 0.59 0.6 0.47
pSZ2328 3 1.26 18.37 0.92 7.83 58.77 10.01 0.72 0.64 0.52
pSZ2324 1 1.51 22.97 1.09 8.71 53.01 9.63 0.65 0.68 0.55
pSZ2324 2 1.29 20.6 0.92 7.53 56.97 9.92 0.73 0.64 0.43
pSZ2324 3 1.28 20.59 0.93 7.33 57.52 9.68 0.65 0.58 0.42
pSZ2323 1 1.65 27.27 0.67 3.56 56.68 8.72 0.33 0.36 0.00
pSZ2323 2 1.56 28.44 0.74 3.36 55.22 9.07 0.46 0.39 0.03
pSZ2323 3 1.64 28.7 0.75 3.34 55.29 8.59 0.49 0.36 0.02
표 31에 제시된 데이터는 형질전환된 유기체의 C14, C16, C18:0, C20:0, 및 C22:2n6 지방산 프로파일에 대한 마르칸티아 폴리모르파 및 트립파노소마 브루세이 효소의 발현의 분명한 영향을 나타낸다. 비형질전환 균주 J의 지방산 프로파일은 약 27.42% C16:0, 약 3% C18:0, 약 57.5% C18:1, 약 0.3% C20:0 및 약 0.03% C22:2n6이었다. 균주 J의 지방산 프로파일과 대조적으로, 신장효소를 발현하도록 상이한 플라스미드 작제물을 이용하여 형질전환된 균주 J의 지방산 프로파일은 더 낮은 백분율 수준의 C16 및 더 높은 백분율 수준의 C18:0, C20:0, 및 C22:2n6 지방산을 포함하였다. 마르칸티아 폴리모르파 신장효소의 과발현의 결과는 균주 J의 지방산 프로파일에 대하여 C18:0 지방산의 백분율 수준에서 약 2.5배 증가, C20:0 지방산의 백분율 수준에서 2배 증가, C22:2n6 지방산의 백분율 수준에서 약 15 내지 30배 증가이었다.
이들 데이터는 조작된 미생물에서 지방산 프로파일을 변경시키기 위해, 특히 재조합 미생물 세포에서 C18:0, C20:0, 및 C22:2n6 지방산의 농도를 증가시키고 C16:0 지방산의 농도를 감소시키는데 있어서, 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)에서의 발현을 위한 신장효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 성공적인 용도를 설명한다.
실시예 41: 아실- ACP 티오에스테라제 과발현을 통해 스테아르산의 생성 증가를 위한 미생물유기체 조작
이 실시예는 형질전환된 미생물유기체의 지방산 프로파일이 스테아르산에서 풍부화된 미생물유기체를 조작하기 위한, 상이한 C18:0 선호 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 용도를 기재한다.
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)의 고전적으로 돌연변이유발된 균주, 즉 균주 J 또는 균주 A를 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 바이오리스틱 형질전환 방법에 따라 표 32에 열거된 작제물을 이용하여 독립적으로 형질전환시켰다. 각각의 작제물은 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR(서열 번호 5) 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR(서열 번호 6)의 제어 하에서 C-말단 3X FLAG® 에피토프 태그를 가지는 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 과발현하는 단백질 암호화 영역, 6S 게놈 영역에 대해 상동성인 5'(서열 번호 1) 및 3'(서열 번호 2) 재조합 표적화 서열(작제물에 측접)(핵내 게놈으로의 통합용), 및 에스. 세레비지아에 suc2 수크로스 전화효소 암호화 영역(서열 번호 4)(서열 번호 3에 주어진 단백질 서열을 발현함)을 포함하였다. 이러한 에스. 세레비지아에 suc2 발현 카세트는 서열 번호 7로서 열거되어 있으며, 선택 마커로서 작용한다. 각각의 티오에스테라제에 대응되는 폴리뉴클레오티드에 대한 서열 목록 동일성은 표 32에 열거되어 있다. 각각의 티오에스테라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 피. 모리포르미스 Amt03 프로모터/5'UTR(서열 번호 8) 및 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3'UTR(서열 번호 6)의 제어 하에 있었다. 외인성 티오에스테라제 및 suc2 발현 카세트의 단백질 암호화 영역을 코돈 최적화하여 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 피. 모리포르미스 UTEX 1435 핵 유전자에 내재한 코돈 바이어스를 반영하였다.
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 A 또는 균주 J를 형질전환시키는데 사용된 플라스미드 작제물.
플라스미드 작제물 아실-ACP 티오에스테라제, GenBank 수탁 번호 아실-ACP 티오에스테라제 공급원 수송 펩티드 공급원 서열 번호
pSZD581 FATA, CAA52070 브라시카 나푸스 천연 64, 65
pSZD643 FATA, CAA52070 브라시카 나푸스 UTEX 250 SAD 66, 67
pSZD645 FATA, AAA33019 씨. 틴크토리우스 UTEX 250 SAD 68, 69
pSZD644 FATA, ABS30422 리시니스 콤무니스(Ricinis communis) 천연 70, 71
pSZD1323 FATA, AAB51523 지. 망고스타나 천연 72, 73
pSZD1320 FATA 테오브로마 카카오(Theobroma cacao) 천연 74, 75
표 32에 열거된 작제물을 이용하여 균주 A 또는 J의 독립적인 형질전환 시, 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스를 포함하는 한천 플레이트 상에서 양성 클론을 선별하였다. 개개의 형질전환체를 클론정제하고, PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 상세하게 기재된 바와 같은 지질 생성에 적합한 종속영양 조건 하에서 증식시켰다. 지질 샘플을 건조 바이오매스로부터 준비하였고, 실시예 1(또한, PCT/US2012/023696호 참조)에 기재된 바와 같은 지방산 메틸 에스테르 기체 크로마토그래피 불꽃 이온화 검출 방법을 사용하여 분석하였다. 유일한 탄소 공급원으로서 글루코스 상에서 증식시킨 피. 모리포르미스 UTEX 1435 균주 J 및 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스 상에서 증식시킨 균주 J의 각각의 형질전환의 대표적인 단리물의 지방산 프로파일(전체 지방산의 영역%로서 표현)이 표 33에 제시되어 있다.
외인성 아실-ACP 티오에스테라제 효소를 과발현하도록 조작된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) 균주 J 세포의 지방산 프로파일.
지방산 영역%
균주 플라스미드 작제물 번호 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3α
A 없음 1 1.08 25.48 3.23 59.70 8.25 0.70
J 없음 1 1.41 27.33 3.38 57.07 8.15 0.64

A
 pSZD581
 1 1.02 26.60 14.47 44.80 10.05 0.65
2 1.08 28.24 13.57 43.89 10.07 0.68
3 0.97 24.70 9.13 50.85 11.27 0.82
A
 pSZD643
 1 1.39 26.97 16.21 44.10 8.43 0.83
2 1.37 27.91 11.15 48.31 8.40 0.78
A pSZD645 1 0.90 23.39 8.35 50.69 13.34 0.96
A pSZD644 1 1.67 19.70 4.40 59.15 12.32 1.01

J
 pSZD1323
 1 1.33 23.26 9.28 53.42 10.35 0.69
2 1.47 26.84 7.36 52.78 9.29 0.64
3 1.43 26.31 6.05 54.45 9.37 0.66

J
 pSZD1320
 1 1.30 24.76 3.84 60.90 6.96 0.55
2 1.36 26.30 3.27 58.19 8.66 0.48
3 1.39 25.51 3.18 58.78 8.85 0.45
표 33에 제시된 데이터는 형질전환된 미생물유기체의 지방산 프로파일에 대한 외인성 아실-ACP 효소의 발현의 분명한 영향을 나타낸다. 비형질전환 균주 A 및 J의 지방산 프로파일은 약 25% C16:0, 약 3.3% C18:0, 약 57% 내지 60% C18:1이었다. 대조적으로, 아실-ACP 효소를 발현하도록 상이한 플라스미드 작제물을 이용하여 형질전환된 균주 A의 지방산 프로파일은 더 큰 백분율 수준의 C18:0 및 더 낮은 백분율 수준의 C18:1 지방산을 포함하였다. 균주 A 또는 J에서 비. 나푸스, 씨. 틴크토리우스, 알. 콤무니스 및 지. 망고스타나 유래 FATA 효소의 발현은 형질전환된 유기체에서 스테아레이트 수준의 축적을 가능하게 하였다. 브라시카 나푸스 아실-ACP 티오에스테라제의 과발현의 결과는 균주 A의 지방산 프로파일에 대하여 형질전환된 유기체의 지방산 프로파일의 C18:0 지방산의 백분율 수준에서 약 2배 내지 5배 증가이었다. 씨. 프로토테코이데스 SAD1 수송 펩티드를 이용하여 지. 망고스타나 아실-ACP FATA 티오에스테라제를 과발현하도록 조작된 세포의 지방산 프로파일은 균주 J의 지방산 프로파일에 대하여 형질전환된 유기체의 지방산 프로파일의 C18:0 지방산의 백분율 수준에서 약 2배 내지 3배 증가를 특징으로 하였다.
이들 데이터는 조작된 미생물에서 지방산 프로파일을 변경시키기 위해, 특히 재조합 미생물 세포에서 C18:0의농도를 증가시키고 C18:1 지방산을 감소시키는데 있어서, 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)에서의 발현을 위한 지방 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 유용성 및 유효한 용도를
설명한다.
실시예 42: 베타- 케토아실 - CoA 합성 효소 과발현을 통해 에루크산의 생성 증가를 위한 미생물유기체 조작
본 발명의 실시형태에서, 선택적으로 색소체 유지성 미생물에서 외인성 신장효소 또는 베타-케토아실-CoA 합성 효소를 발현하도록 조작가능한 재조합 폴리뉴클레오티드 형질전환 벡터는 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같은 바이오리스틱 형질전환 방법에 따라 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435)를 형질전환시켜 에루스산의 생성이 증가된 세포를 얻는데 이용하였다. 형질전환 벡터는 신장효소 또는 표 5에 열거된 바와 같은 베타-케토아실-CoA 합성 효소를 과발현하는 단백질 암호화 영역, 외인성 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 및 3'UTR 제어 서열, 재조합 폴리뉴클레오티드를 표적화하는 5' 및 3' 상동성 재조합 표적화 서열(피. 모리포르미스(UTEX 1435) 핵내 게놈으로의 통합용), 및 선택 가능한 마커를 발현하도록 조작가능한 뉴클레오티드를 포함한다. 형질전환 벡터의 단백질 암호화 서열을 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 기재된 바와 같이 피. 모리포르미스(UTEX 1435)에서의 발현을 위하 코돈 최적화한다. 피. 모리포르미스(UTEX 1435)에서의 발현을 위해 조작가능한 선택 마커, 프로모터, 및 3' UTR을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본원 및 PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 개시되어 있다.
피. 모리포르미스(UTEX 1435) 또는 피. 모리포르미스(UTEX 1435)의 고전적으로 돌연변이유발된 균주로 형질전환 벡터의 형질전환 시, 한천 플레이트 상에서 양성 클론을 선별하였다. 개개의 형질전환체를 클론정제하고, PCT/US2009/066141호, PCT/US2009/066142호, PCT/US2011/038463호, PCT/US2011/038464호, 및 PCT/US2012/023696호에 상세하게 기재된 바와 같은 지질 생성에 적합한 종속영양 조건 하에서 배양하였다. 지질 샘플을 각각의 형질전환체로부터의 건조 바이오매스로부터 준비하고, 실시예 1에 기재된 바와 같은 지방산 메틸 에스테르 기체 크로마토그래피 불꽃 이온화(FAME GC/FID) 검출 방법을 사용하여 분석하였다. 이러한 조적의 결과로서, 세포는 에루크산에서 적어도 5배, 10배, 15배, 또는 20배의 증가를 나타낼 수 있다.
실시예 43: 쿠페아 PSR23 LPAAT 의 발현에 의해 균주 UTEX1435 에서 카프르산 , 라우르산 , 및 미리스트산이 풍부한 오일의 생성
본 발명자들은 쿠페아 라이티 유래의 아실 ACP 티오에스테라제(FATB2)를 발현하는, 앞서 기재한 피. 모리포르미스(UTEX 1435) 유전자이식 균주에서 2가지의 1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(LPAAT)의 발현을 효과를 시험하였다. 쿠페아 PSR23(CuPSR23) 유래의 LPAAT2 및 LPAAT3 유전자를 종자 RNA(seed RNA)로부터 유래한 CuPSR23 게놈 서열 및 전사체 서열의 조합의 분석에 의해 확인하였다. 2가지 LPAAT는 앞서 기재된 바 없다. 유전자는 코돈 최적화하여 UTEX 1435 코돈 선호도를 반영하였다. 형질전환, 세포 배양, 지질 생성 및 지방산 분석은 모두 앞서 기재한 바와 같이 수행하였다.
쿠페아 PSR23 1-아실- sn -글리세롤-3- 포스페이트 아실트랜스퍼라제( LPAAT2 및 LPAAT3 )[각각 pSZ2299 및 pSZ2300 ]의 발현에 의한 균주 B에서의 카프르산 , 라우르산 , 및 미리스트산 축적 증가: 이 실시예에서, 각각 CuPSR23 LPAAT2 및 LPAAT3을 암호화하는 작제물 pSZ2299 또는 pSZ2300을 이용하여 균주 B의 형질전환을 통해 유전자이식 균주를 생성하였다. 항생제 G418에 대하여 저항성인 유전자이식 균주를 선택하였다. 작제물 pSZ2299은 pLOOP5'::CrTUB2:NeoR:CvNR::PmAMT3:CuPSR23LPAAT2-1:CvNR::pLOOP3'로 기재될 수 있다. 작제물 pSZ2300은 pLOOP5':::CrTUB2:NeoR:CvNR::PmAMT3:CuPSR23LPAAT3-1:CvNR::pLOOP3'으로 기재될 수 있다. 형질전환시킨 DNA(pSZ2299 및 pSZ2300)의 서열은 이하에 제공되어 있다. 5'-3', BspQI, KpnI, XbaI, Mfe I, BamHI, EcoRI, SpeI, XhoI, SacI, BspQI 각각으로부터의 작제물에서 관련 제한 부위는 소문자, 볼드체 및 밑줄로 나타내어져 있다. BspQI 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 작제물의 5' 및 3' 말단에서 볼드체의 소문자 서열은 상동성 재조합을 통해 pLoop 좌위로의 통합을 표적화하는 UTEX 1435 유래의 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, 선택 카세트는 NeoR 유전자(G418에 대하여 저항성을 부여함)의 발현을 구동하는 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소(NR) 유전자 3'UTR을 가진다. 프로모터는 소문자의 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. NeoR을 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있다. 2가지 카세트 사이의 스페이서 영역은 대문자의 문자로 나타내어져 있다. 쿠페아 PSR23 유래의 코돈 최적화된 LPAAT2 유전자(pSZ2299) 또는 LPAAT3 유전자(pSZ2300)를 포함하는 제2의 카세트는 프로토테카 모리포르미스 내인성 AMT3 프로모터에 의해 구동되고, 동일한 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소(NR) 유전자 3' UTR을 가진다. 이 카세트에서, AMT3 프로모터는 소문자의 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. CuPSR23 LPAAT2 및 LPAAT3 유전자를 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있다. 최종 작제물은 정확한 리딩프레임 및 표적화 서열을 보장하기 위해 서열결정하였다.
pSZ2299 형질전환 작제물
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
pSZ2300 형질전환 작제물
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
(서열 번호91)
중쇄 지방산 축적에 대한 CuPSR23 LPAAT2 및 LPAAT3 유전자의 영향을 결정하기 위하여, UTEX 1453 AMT3 프로모터에 의해 구동되는 코돈 최적화된 CuPSR23 LPAAT2 또는 LPAAT3 유전자를 포함하는 상기 작제물을 균주 B로 형질전환시켰다.
일차 형질전환체를 클론정제하고, 표준 지질 생성 조건 하 pH7.0에서 성장시켰다(모든 균주는 pH 조절 AMT3 프로모터에 의해 구동되는 CuPSR23 LPAAT2 또는 LPAAT3 유전자의 최대 발현을 가능하게 하기 위해 pH 7.0에서의 성장을 필요로 한다). 이들 형질전환으로 생기는 대표적인 클론의 세트로부터 생성된 프로파일은 하기 표 34에 나타내어져 있다. D1520은 CuPSR23 LPAAT2를 가지는 균주 B의 클론을 나타내고, D1521는 CuPSR23 LPAAT3을 가지는 균주 B의 클론을 나타낸다.
균주 B 및 pSZ2299 및 pSZ2300 DNA를 이용하여 형질전환된 대표적인 유전자이식 계통의 지방산 프로파일.
Figure pct00017
유전자이식 CuPSR23 LPAAT2 균주(D1520A 내지 E)는 C18:1 및 C18:2에서 감소를 수반하면서, C10:0, C12:0, 및 C14:0 지방산의 축적에서 상당한 증가를 나타낸다. 유전자이식 CuPSR23 LPAAT3 균주(D1521A 내지 E)는 C18:1에서 감소를 수반하면서, C10:0, C12:0, 및 C14:0 지방산의 축적에서 상당한 증가를 나타낸다. 이들 유전자이식 계통에서 CuPSR23 LPAAT의 발현은 일반적으로, 그리고 특히 라우레이트에서 중쇄 지방산의 축적 증가에 직접적으로 원인이 있는 것으로 보인다. 유전자이식 계통이 더 긴 사슬의 지방산(C16:0 이상)에서 중쇄 지방산으로의 이동을 나타내는 한편, 상기 이동은 대부분 C14:0 지방산에 대하여 약간의 영향이 있는 C10:0 및 C12:0 지방산으로 표적화된다. 제시된 데이터는 또한 쿠페아 PSR23 유래의 LPAAT2 및 LPAAT3 유전자 및 씨. 라이티 유래 FATB2(균주 B에서 발현됨)는 C12:0 지방산의 축적에 대하여 추가적인 영향을 미친다.
본 발명자들의 결과는 쿠페아 PSR23 유래 LPAAT 효소는 UTEX 1435에서 유래한 조류 균주에서 활성적이라는 것을 시사한다. 이들 결과는 또한 상기 효소는 균주 B에서 발현되는 이종성 FatB2 아실-ACP 티오에스테라제 효소(쿠페아 라이티로부터 유래함)와 함께 작용한다는 것을 입증한다.
실시예 44: 쿠페아 라이티 FATB2 와 조합한 쿠페아 PSR23 LPAATx 의 발현에 의한 균주 UTEX1435 에서 지방산 수준의 변경
본원에서 본 발명자들은 앞서 기재한 피. 모리포르미스(UTEX 1435) 유전자이식 균주, 즉 균주 B에서 1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(LPAAT)의 발현의 효과를 입증하였다. 상기 기재한 바와 같이, 균주 B는 쿠페아 라이티 유래의 아실 ACP 티오에스테라제(FATB2)를 발현하는 유전자이식 균주이며, 이는 40% 내지 49%로 C12:0 지방산을 축적한다. 실시예 43에 추가로, 제3의 CuPSR23 LPAAT, 즉 LPAATx를 종자 RNA로부터 유래한 CuPSR23 게놈 서열 및 전사체 서열의 조합의 분석에 의해 확인하였다. 따라서 중쇄 특이적 LPAAT의 발현은 sn-2 위치에서 카프르산(C10:0 지방산), 라우르산(C12:0 지방산), 또는 미리스트산(C14:0 지방산)을 가지는 TAG의 백분율을 증가시켜야 하고, 그 결과 이들 지방산의 전반적인 수준을 상승시켜야 한다. 실시예 43에서, LPAAT2 및 LPAAT3은 균주 B에서 카프레이트, 라우레이트, 및 미리스테이트 축적을 증가시키는 것으로 나타났다. LPAATx는 균주 B로 도입되어 이 균주에서의 지방산 수준에 대한 영향을 결정하였다. LPAATx 유전자는 코돈 최적화하여 UTEX 1435 코돈 선호도를 반영하였다. 형질전환, 세포 배양, 지질 생성 및 지방산 분석은 모두 앞서 기재한 바와 같이 수행하였다.
쿠페아 PSR23 1-아실- sn -글리세롤-3- 포스페이트 아실트랜스퍼라제( LPAATx )[ pSZ2575 ]의 발현에 의한 균주 B에서의 감소된 카프레이트 , 라우레이트 , 및 미리스테이트 축적 감소 및 팔미테이트 및 스테아레이트 축적 증가: 이 실시예에서, CuPSR23 LPAATx를 암호화하는 작제물 pSZ2575를 이용하여 균주 B의 형질전환을 통해 유전자이식 균주를 생성하였다. 항생제 G418에 대하여 저항성인 유전자이식 균주를 선택하였다. 작제물 pSZ2575는 pLOOP5'::CrTUB2:NeoR:CvNR::PmAMT3:CuPSR23LPAATx:CvNR ::pLOOP3'로 기재될 수 있다. 형질전환시킨 DNA의 서열은 이하에 제공되어 있다(pSZ2575). 5'-3', BspQ1, KpnI, XbaI, MfeI, BamHI, EcoRI, SpeI, XhoI, SacI, BspQ1 각각으로부터의 작제물에서 관련 제한 부위는 소문자, 볼드체 및 밑줄로 나타내어져 있다. BspQ1 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 작제물의 5' 및 3' 말단에서 볼드체의 소문자 서열은 상동성 재조합을 통해 pLoop 좌위로의 통합을 표적화하는 UTEX 1435 유래의 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, 선택 카세트는 NeoR 유전자(G418에 대하여 저항성을 부여함)의 발현을 구동하는 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소(NR) 유전자 3' UTR을 가진다. 프로모터는 소문자의 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. NeoR을 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있다. 2가지 카세트 사이의 스페이서 영역은 대문자의 문자로 나타내어져 있다. 쿠페아 PSR23 유래의 코돈 최적화된 LPAATx 유전자((pSZ2575)를 포함하는 제2의 카세트는 프로토테카 모리포르미스 내인성 AMT3 프로모터에 의해 구동되고, 동일한 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소(NR) 유전자 3' UTR을 가진다. 이 카세트에서, AMT3 프로모터는 소문자의 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. CuPSR23 LPAATx 유전자를 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있다. 최종 작제물은 정확한 리딩프레임 및 표적화 서열을 보장하기 위해 서열결정하였다.
pSZ2575 형질전환 작제물
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
지방산 축적에 대한 CuPSR23 LPAATx 유전자의 영향을 결정하기 위하여, UTEX 1453 AMT3 프로모터에 의해 구동되는 코돈 최적화된 CuPSR23 LPAATx 유전자를 포함하는 상기 작제물을 균주 B로 형질전환시켰다.
일차 형질전환체를 클론정제하고, 저 질소 조건 하 pH7.0에서 성장시켰으며; 균주는 pH 조절 AMT3 프로모터에 의해 구동되는 CuPSR23 LPAATx 및 CwFATB2 유전자의 최대 발현을 가능하게 하기 위해 pH 7.0에서의 성장을 필요로 한다. 이들 형질전환으로 생기는 대표적인 클론의 세트로부터 생성된 프로파일은 하기 표 35에 나타내어져 있다. D1542는 CuPSR23 LPAATx를 가지는 균주 B의 클론을 나타낸다.
균주 B 및 pSZ2575를 이용하여 형질전환된 대표적인 유전자이식 계통의 지방산 프로파일.
샘플 ID C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2
균주 B 4.77 28.63 15.48 12.65 1.28 28.20 7.57
　 　 　 　 　 　 　 　
샘플 ID C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2
D1542-A 1.19 13.25 10.48 21.34 4.49 32.07 14.78
D1542-B 1.15 14.01 10.62 20.61 3.99 32.12 15.24
D1542-C 1.21 13.69 10.83 20.40 3.59 33.54 15.05
D1542-D 1.56 16.83 11.51 18.44 2.94 33.97 12.74
D1542-E 2.15 18.58 11.94 18.22 3.17 32.63 11.62
유전자이식 CuPSR23 LP AATx 균주(D1542A 내지 E)는 C16:0, C18:0, C18:1 및 C18:2에서 증가를 수반하면서, 모 균주인 균주 B에 대하여 C10:0, C12:0, 및 C14:0 지방산의 축적에서 상당한 감소를 나타낸다. 이들 유전자이식 CuPSR23 LPAATx의 발현은 중쇄 지방산(C10-C14)의 축적 감소, 및 C16:0 및 C18 지방산의 축적 증가(대부분의 확연한 증가는 팔미테이트(C16:0)에서 관찰됨)에 직접적으로 원인이 있는 것으로 보인다. 제시된 데이터는 또한, 씨. 라이티 유래 중쇄 특이적 FATB2(균주 B에 존재함)의 발현에도 불구하고, CuPSR23 LPAATx의 발현은 TAG로 더 긴 사슬의 지방산의 통합을 선호하는 것으로 보임을 나타낸다.
본 발명자들의 결과는 쿠페아 PSR23 유래 LPAATx 효소는 UTEX 1435에서 유래한 조류 균주에서 활성적이라는 것을 시사한다. 중쇄 지방산 수준이증가하는 쿠페아 PSR23 LPAAT2 및 LPAAT3에 반해, CuPSR23 LPAATx는 C16:0 및 C18:0 수준의 증가를 가져온다. 이들 결과는 CuPSR23로부터 유래한 상이한 LPAAT(LPAAT2, LPAAT3, 및 LPAATx)는 전반적인 지방산 수준에 대한 이들의 영향에 의해 판단되는 바와 같이, 균주 B에서 상이한 지방산 특이성을 나타낸다는 것을 입증한다.
실시예 45: 내인성 미세조류 FATA 아실- ACP 티오에스테라제를 과발현한 결과로서 지방산 프로파일의 사슬 길이의 감소
본원에서, 본 발명자들은 UTEX1435에서 프로토테카 모리포르미스 내인성 티오에스테라제 FATA1의 과발현이 C16:0, C14:0에서 증가한 세포 트리글리세리드 C18:0 및 C18:1 아실 사슬의 분명한 감소를 가녀온다는 것을 입증한다.
피. 모리포르미스 FATA1 유전자의 과발현에 사용된 작제물( pSZ2422 , pSZ2421 ): 피. 모리포르미스 균주 J에서 PmFATA1을 과발현시키기 위하여, 코돈 최적화된 PmFATA1 유전자를 균주 J로 형질전환시켰다. 사카로마이세스 세레비지아에 전화효소 유전자를 선택 마커로서 이용하여 수크로스 배지 상에서 성장시켰다. 균주 J에서 발현된 작제물 pSZ2422는 : 6SA:: CrTUB2-ScSUC2-CvNR3':PmAMT3-Pm FATA1 (opt)-CvNR3'::6SB로 기재될 수 있고, 작제물 pSZ2421은 6SA:: CrTUB2-ScSUC2-CvNR3':PmAMT3-S106SAD TP-Pm FATA1 (opt)-CvNR3'::6SB로 기재될 수 있다.
형질전환시킨 DNA의 서열은 이하에 제공되어 있다. 작제물 pSZ2422에서 관련 제한 부위는 소문자, 볼드체 및 밑줄로 나타내어져 있으며, 각각 5'-3' BspQ 1, Kpn I, Xba I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Asc I, Cla I, Sac I, BspQ I이다. BspQI 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 볼드체의 소문자 서열은 상동성 재조합을 통해 6s 좌위에서 표적화된 통합을 허용하는 균주 J 유래의 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, 효모 수크로스 전화효소 유전자(수크로스를 대사하는 균주 J의 능력을 부여함)의 발현을 구동하는 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. 전화효소를 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 피. 모리포르미스의 내인성 amt03 프로모터는 박스 표시된 이탤릭체의 문자로 나타내어져 있다. PmFATA1의 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 유전자의 나머지는 볼드의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 다시, 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 균주 J의 6S 게놈 영역은 볼드체의 소문자 문자로 나타내어져 있다.
작제물 pSZ2421에서 관련 제한 부위는 pSZ2422와 동일하다. pSZ2421에서, PmFATA1은 클로렐라 프로토테코이데스 S106 스테아로일-ACP 불포화효소 수송 펩티드와 융합되고 수송 펩티드는 PmFATA1의 개시자 ATG 및 Asc I 부위 사이에 위치한다.
pSZ2422에 포함되는 형질전환시킨 DNA의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
내인성 FATA1 유전자가 균주 J에서 과발현될 때 지방산 프로파일에 대한 영향을 결정하기 위하여, 클로렐라 프로토테코이데스 SAD 수송 펩티드에 융합된 PmFATA1과 천연 수송 펩티드를 가지는 피. 모리포르미스 FATA1 둘 다 amt03 프로모터에 의해 구동되었고, 생성된 플라스미드는 균주 J로 독립적으로 형질전환되었다.
일차 형질전환체를 클론정제하고, 저 질소 지질 생성 조건 하 pH7.0에서 성장시켰다(모든 플라스미드는 pH 조절 amt03 프로모터에 의해 구동될 때 PmFATA1 유전자의 최대 발현을 가능하게 하기 위해 pH 7.0에서의 성장을 필요로 한다). pSZ2422 및 pSZ2421을 이용하여 균주 J로의 형질전환으로 생기는 대표적인 클론으로부터 생성된 프로파일은 하기 표에 나타내어져 있다.
하기 표 36에서, 천연 PmFATA1을 과발현하는 영향은 C16:0, C14:0에서, 가능하게는 C18:0에서의 증가와 함께 C18:1 사슬 길이의 분명한 감소이다. 가공의 단백질 국재화를 고려하여, 본 발명자들은 또한 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일-ACP 불포화효소 수송 펩티드에 융합된 PmFATA1을 시험하였다. 상기 결과와 유사하게, 본 발명자들은 amt03-native PmFATA1 작제물에서 관찰하였으며, C16:0 및 C14:0 수준은 모 균주 J보다 상당히 더 높다.
균주 J 및 pSZ2422 DNA를 이용하여 형질전환된 유도체 유전자이식 계통에서의 지방산 프로파일.
샘플 ID C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2
pH 7; 균주 J; T374 ; D1377 -7 96웰 7.69 55.00 4.92 24.94 5.19
pH 7; 균주 J; T374 ; D1377 -13 96웰 6.39 54.11 5.85 25.91 5.76
pH 7; 균주 J; T374 ; D1377 -14 96웰 6.57 53.55 4.68 27.18 5.74
pH 7; 균주 J; T374 ; D1377 -16 96웰 5.29 49.93 4.24 30.76 7.27
pH 7; 균주 J; T374 ; D1377 -9 96웰 4.76 49.10 4.75 32.36 6.77
pH 7; 균주 J; T374 ; D1377 -19 96웰 4.28 46.06 5.14 35.87 6.69
Ctrl - pH7 ; 균주 J 1.42 27.63 3.31 57.20 8.00
균주 J 및 pSZ2421 DNA를 이용하여 형질전환된 유도체 유전자이식 계통에서의 지방산 프로파일.
샘플 ID C14 :0 C16 :0 C18 :0 C18 :1 C18 :2
pH 7; 균주 J; T374 ; D1376 -21 96웰 6.76 57.06 4.12 23.66 6.07
pH 7; 균주 J; T374 ; D1376 -22 96웰 6.56 54.62 5.44 25.69 5.64
pH 7; 균주 J; T374 ; D1376 -23 96웰 4.54 48.38 4.27 33.23 7.24
pH 7; 균주 J; T374 ; D1376 -19 96웰 4.48 47.66 4.60 34.28 6.91
pH 7; 균주 J; T374 ; D1376 -20 96웰 4.53 47.30 4.67 34.51 6.80
pH 7; 균주 J; T374 ; D1376 -17 96웰 3.56 42.70 4.03 39.85 7.52
대조- pH7 ; 균주 J 1.42 27.63 3.31 57.20 8.00
따라서, 본 발명자들은 미세조류 세포의 지방산 프로파일에서 미리스트산 및 라우르산 수준의 백분율은 C18 선호 아실-ACP 티오에스테라제의 과발현에 의해 증가될 수 있다는 결론을 내린다.
실시예 46: 롤인 쇼트닝으로서의 사용에 적당한 천연 오일
식용 지방의 영양상 및 기능상 특성은 전통적으로 특이적인 화학적 조성 및 결정화 조건과 연관되었다. 하나의 오일 공급원으로부터 다른 것으로의 전환은 보통 어려운 작업이다. 지방의 용융 거동 및 구조 모두 급격하게 변화하여, 기능성에서 부정적인 변화로 이어졌다. 최근 이력에서, 본 발명자들은 부분적으로 수소화된 지방이 팜오일 및 팜오일 분획물로 대체될 때 괴로운 기간을 상기할 수 있다. 본 발명자들은 매우 상이한 화학적 조성을 가지는 2가지 지방의 항복 응력, 탄성률, 다형성, 미세구조 및 용융 곡선을 일치시킬 수 있는 방법을 검사하였다. 오일 A는 외인성 전화효소 및 클로렐라 프로토테코이데스 색소체 표적화 서열을 가지는 울머스 아메리카나 아실-ACP 티오에스테라제를 발현하는 프로토테카 모리포르미스 세포로부터 생성되었다. 오일 B는 외인성 전화효소 및 쿠페아 후커리아나 아실-ACP 티오에스테라제를 발현하는 프로토테카 모리포르미스 세포로부터 생성되었다. 오일 A는 62%(w/w) 초과의 중쇄 지방산, 또는 MCT(C8:0-C14:0), 23% (C16:0+C18:0) 및 9% C18:1을 포함하는 한편, 오일 B는 2% 미만의 C8:0-C14:0, 54% (C16:0+C18:0) 및 29% C18:1을 포함하였다. 따라서, 오일 A는 중쇄 트리글리세리드 풍부 지방인 반면, 오일 B는 팜오일과 비슷하였다. 2가지 오일 모두 20℃에서 고형 지방 함량이 약 45%이었고, 온도에 비해 매우 유사한 SFC를 가졌다. DSC(dynamic scanning calorimetry; 동적 주사 열량측정법) 용융 곡선은 2개의 주요 피크가 약 12℃ 내지 13℃, 및 약 28℃ 내지 35℃ 근처에 집중되어 있다는 것을 나타내었다. 2가지 지방 모두 베타-프라임 다형태(X선 회절에 의해 결정됨)이었고, 특징적인 특색을 가지는 비대칭의 신장된 결정자 형태를 나타내었다. 오일 A 및 오일 B의 항복 응력 및 저장 탄성률(G')은 각각 520 Pa 내지 550 Pa, 및 7x106 Pa 내지 1.8x107 Pa이었다. 이 영역에서 항복 응력은, 만족스러운 가소성을 시사하는데, 높은 저장 탄성률과 조합된 가소성은 이상적인 롤인 쇼트닝에 도움이 된다. 따라서, 층상 기능성을 유지하면서 식품 오일의 화학적 조성을 변경하는 것이 가능하다.
본 발명의 상기 실시형태 중 임의의 것의 방법 및 세포를 이용하는 사용에 적합한 기타 다른 효소는 상기 기재에 열거된 단백질 중 하나와 적어도 70% 아미노산 동일성을 가지고 대응하는 원하는 효소 활성을 나타내는 것들을 포함한다. 추가적인 실시형태에서, 효소 활성은 상기 기재된 핵산 서열 중 하나와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 가지는 서열에 존재하며, 이들 모두 완전히 제시된 것과 같이 본원에 참조로서 포함된다.
실시예 47: 코코아 버터 모방체인 맞춤 미생물 오일 유래 삼중포화물을 제거하는 분별작용
정련된 표백 및 탈취 오일을 균주 K4로부터 얻었다(실시예 35 참조). 오일을 70℃로 가열하고 분당 0.5℃로 36℃까지 냉각시켰으며, 1시간 동안 36℃에서 유지하였다. 그 다음 대략 2.5 ml의 샘플을 36℃에서 1시간 동안 4300에서 원심분리하였다. 액체 상청액을 회수하고 리파제 및 질량분석법을 사용하여 분석하였다. 샘플은 트리스테아린(SSS), SSP, 및 PPS이 고갈되는 것으로 발견되었다. 샘플의 트리아실글리세롤은 코코아 버터의 트리아실글리세롤과 매우 유사한 것으로 발견되었으며, 액체 상청액은 심지어 삼중포화물의 양이 적은 점에서 코코아 버터에 훨씬 더 근접하였다.
코코아 버터와 비교하여 분별 전 및 후 K4 균주 유래 오일의 TAG 프로파일.
TAG K4 오일 분별
상층(액체) 		코코아 버터
OOL (+?) 0.12 0.12 0.00
POL 0.23 0.31 0.33
PLP 2.41 3.38 1.58
MOP 0.93 1.25 0.00
PPM (+ MMS ) 0.42 0.29 0.00
OOO 0.23 0.34 0.00
SOL 0.36 0.47 0.32
OOP 0.95 1.42 2.44
PLS 5.66 7.90 2.90
POP (+ MSO ) 11.80 15.20 17.93
PPP + MPS 2.22 1.07 0.36
OOS 1.19 1.68 3.02
SLS (+ PLA ) 3.96 5.11 1.77
POS 27.22 32.80 40.25
PPS (+ SSM ) 6.47 1.52 0.49
MaOO 0.00 0.00 0.36
SLA 0.31 0.34 0.00
SOS (+ POA ) 17.84 22.50 24.93
SSP (+ PPA ) 9.24 0.96 0.63
SOA (+ POB ) 1.39 1.68 1.51
SSS (+ PSA ) 5.25 0.23 0.33
SOB + LgOP 0.38 0.44 0.27
SSA 0.41 0.00 0.00
SOLg 0.41 0.00 0.00
PSLg + ASB 0.26 0.00 0.00
SOHx 0.12 0.51 0.00
SSLg 0.21 0.14 0.15
합계 영역% 100.00 99.67 99.57
실시예 48: KASII 의 과발현, 하나의 SAD 대립유전자의 녹아웃 및 제2의 SAD 대립유전자의 억압에 의해 유지성 세포에서 고- 스테아레이트 트리글리세리드 오일의 생성
유지성의 비광합성 조류인 프로테테카 모리포르미스는 영양상 탄소 공급이 초과인 조건 하에서 방대한 양의 트리아실글리세리드 오일을 저장하지만, 기타 다른 필수 영양소의 제한으로 인하여 세포 분열은 억제된다. C18까지의 탄소 사슬 길이를 가지는 지방산의 대규모 생합성은 색소체에서 일어나고; 그 다음 지방산은 C18을 넘는 신장 및 트리아실글리세리드(TAG)로의 혼합이 일어나는 것으로 여겨지는 소포체로 보내진다. 환경 조건이 성장을 선호하도록 변경경될 때까지 지질체로 불리는 큰 세포질 소기관에 저장되며, 그 결과 지질은 빠르게 동원되어 동화작용 대사를 위한 에너지 및 탄소 분자를 제공한다. 야생형 피. 모리포르미스 저장 지질은 주로 약 60% 올레산(C18:1), 약25% 내지 30% 팔미트산(C16:0), 및 약 5% 내지 8% 리놀레산(C18:2)으로 구성되며, 소량의 스테아르산(C18:0), 미리스트산(C14:0), α-리놀렌산(C18:3 α), 및 팔미톨레산(C16:1)을 포함한다. 이러한 지방산 프로파일은 내인성 지방산 생합성 경로의 효소의 지질 친화성 및 상대 활성으로부터 생긴다. 피. 모리포르미스는 분자 유전자 도구를 사용하여 지방산 및 지방 생합성의 조작을 쉽게 할 수 있으며, 야생형 조성과 매우 상이한 지방산 프로파일을 가지는 오일의 생성을 가능하게 한다. 본원에서 본 발명자는, 본 발명자들이 57%까지의 스테아레이트 및 7%의 팔미테이트 만큼 적은 양을 포함하는 균주를 생성하기 위하여 스테아로일-ACP 불포화효소(SAD) 및 β-케토아실-ACP 합성 효소 II(KASII) 유전자의 발현을 변형시킨 균주를 기재한다. 본 발명자들은, 본 발명자들이 FATA 티오에스테라제 및 FAD2 지방산 불포화효소 유전자의 발현을 하향 조절함과 함께 유사한 변형을 실행할 때 55%까지의 스테아레이트 및 2.4% 리놀레이트만큼의 적은 양을 포함하는 추가적인 균주를 확인한다.
가용성 SAD는 올리에이트(C18:1 시스-Δ9)로 아실기 운반 단백질(ACP)-결합 스테아레이트의 불포화를 촉진시키는 색소체에 위치한, 이철(di-iron) 효소이다. 앞서, 본 발명자들은 SAD1 또는 SAD2 전사체를 표적화하는 헤어핀 작제물이 세포 RNA 간섭(RNAi) 기구, SAD 활성을 하향 조절하는 것 및 저장 지질에서 C18:0 수준의 상승을 가져오는 것을 활성화하는 것을 확립하였다. SAD 활성은 또한, 본 발명자들이 저장 지질 생합성 동안 발현되는 주요 SAD를 암호화하는 SAD2의 2가지 대립유전자 중 하나를 방해하는 균주에서 감소된다. 지방산 불포화효소 2(FAD2) 유전자는 리놀레에이트(C18:2 시스-Δ9, 시스-Δ12)로 올레레이트를 전환시키는 소포체막 연관 불포화효소를 암호화한다. FAD2를 표적화하는 헤어핀 RNAi 작제물은 레놀레에이트 수준을 1% 내지 2%로 감소시킨다. KASII는 팔미토일(C16:0)-ACP을 가지는 말로닐-ACP의 축합을 구체적으로 촉진하여 β-케토-스테아로일-ACP를 형성하는 지방산 합성 효소이다. 본 발명자들은 피. 모리포르미스에서 KASII의 과발현은 C18:1 존재도에서 부수적으로 증가하면서, C16:0 수준을 감소로 야기한다는 것을 나타내었다. 하기 실시예에서, 본 발명자들은, SAD 유전자의 대립유전자를 방해하는 RNAi를 사용하여 SAD 유전자 발현을 하향 조절하고 KASII 지방산 합성 효소를 과발현시킴으로써, 본 발명자들은 전체 지방산의 50%를 초과하여 스테아레이트를 축적할 수 있고, 주요 TAG 종으로서 SOS를 포함하는 균주를 생성한다는 것을 입증한다. SOS 수준은 KASII 과발현과 SAD2 및 FAD2 하향 조절을 조합한 균주에서 47%까지 증가한다.
S1920 에서 SAD2 녹아웃/ RNAi 에 사용된 작제물 : DNA 작제물, 즉 pSZ2282는 동시에 SAD2 -1 대립유전자를 방해하고 S1920에서 SAD2 헤어핀 작제물을 발현하도록 제조되었다. 피. 모리포르미스에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 수크로스 전화효소를 암호화하는 사카로마이세스 세레비지아에 SUC2 유전자의 형태는 형질전환용 선택 마커로서 이용하였다. 형질전환시킨 DNA의 서열은 바로 아래에 제공되어 있다. 관련 제한 부위는 소문자의 볼드체로 나타내어져 있고, 5'-3' BspQI, KpnI, AscI, MfeI, BamHI, AvrII, EcoRV, EcoRI, SpeI, BamHI, HinDIII, 및 SacI 각각으로부터 유래한다. BspQI 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 작제물의 5' 및 3' 측접에서 밑줄친 서열은 상동성 재조합을 통해 SAD2 -1 좌위에서 형질전환시키는 DNA의 표적화된 통합을 가능하게 하는 피. 모리포르미스 유래의 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, 사카로마이세스 세레비지아에 SUC2 유전자(수크로스 가수분해 활성을 암호화하며, 이에 의하여 균주가 수크로스 상에서 성장하는 것을 허용함)의 발현을 구동하는 클라미도모나스 레인하르드티 TUB2 프로모터는 소문자의 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. SUC2를 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소(NR) 유전자의 3' UTR은 소형 대문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 소문자의 문자로 나타낸 스페이서 영역으로 나타내어져 있다. 소문자의 박스 표시된 문자로 나타낸 제2의 씨. 레인하르드티 TUB2 프로모터 서열은 SAD2 헤어핀 C 서열의 발현을 구동한다. 센스 및 안티센스 가닥은 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있으며, 피. 모리포르미스 Δ12-지방산 불포화효소(FAD2) 인트론 및 FAD2 제2의 엑손(대문자의 이탤릭체)의 처음 10개 염기로 분리되어 있다. 제2의 씨. 불가리스 NR 3' UTR은 소형 대문자로 나타내어져 있다.
pSZ2282 유래의 형질전환시킨 DNA의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
SAD2 녹아웃/녹다운 균주의 확인 및 분석: pSZ2282로부터 유래한 작제물 D128을 앞서 기재한 바와 같이 S1920로 형질전환시켰다. 일차 형질전환체를 클론정제하고, 표준 지질 생성 조건 하 pH5에서 성장시켰다. pSZ2282를 이용하여 S1920로의 형질전환으로 생기는 대표적인 클론으로부터 생성된 지방산 프로파일은 하기 표 39에 요약되어 있다. D1283 형질전환체는 C18:1이 소실되면서 약 42%까지 C18:0을 축적하였으며, 이는 SAD 활성이 이들 균주에서 상당히 감소되었다는 것을 나타낸다.
Figure pct00028
표 39에서, 야생형 수준보다 더 큰 스테아레이트(C18:0) 수준은 볼드체 문자로 강조되어 있다.
형질전환체 D1283-4 및 D1283-7의 지방산 프로파일은 선택 부재 하에서 30세대 초과의 성장(수크로스 상에서 성장) 후에 안정적인 것으로 결정되었다. 그 다음 진탕 플라스크 분석에서 선택된 균주의 성능을 평가하였으며, 지방산 프로파일 및 지질 역가는 하기 표 40에 제시되어 있다. S4495는 모 S1920에 대하여 가장 높은 수준의 C18:0 (약 44%) 및 가장 양호한 지질 역가(약 26%)를 가졌으며, 따라서 추가의 발효 발달을 위해 선택되었다.
Figure pct00029
표 40에서, 야생형 수준보다 더 큰 스테아레이트(C18:0) 수준은 볼드체 문자로 강조되어 있다.
본 발명자들은 7 L 발효물에서 S4495의 실행을 최적화하였으며, 본 발명자들은 야생형 모균주의 약 45%인 지질 생산성을 가지는, 진탕 플라스크에서 얻은 약 44% C18:0 수준을 일치시킬 수 있음을 발견하였다. 대표적인 S4495 발효물의 지방산 프로파일 및 지질 역가는 하기 표 41에 요약되어 있다. 최적의 조건 하에서 S4495의 발효물은 거의 44% C18:0을 생성하며, 이는 진탕 플라스크 분석에서 축적된 스테아레이트 수준과 유사하였다. S4495는 플라스크 및 7 L 규모 모두에서 높은 C18:0 수준을 생성하였으며, 7 L 발효물에서 허용가능한 지질 생산성을 가졌고; 그 결과 이러한 균주는 C18:0 축적을 증가시키는 것을 목적으로 하는 추가적인 변형을 위한 기저 균주로서 선택하였다.
Figure pct00030
표 41에서, 대조군보다 더 큰 스테아레이트(C18:0) 수준은 볼드체 문자로 강조되어 있다. S2074는 6S 좌위에 통합된, 수크로스 전화효소를 암호화하는 에스. 세레비지아에 SUC2를 포함하며, 모 S1920 야생형과 구별하기 어려운 지방산 프로파일을 가진다.
S4495 에서 KASII 과발현에 사용되는 작제물 : DNA 작제물 pSZ2734는 S4495에서 코돈 최적화된 피. 모리포르미스 KASII 유전자를 과발현하도록 제조되었다. 아미노글리코시드 항생제에 대한 저항성을 부여하는, 트랜스포존 Tn5 유래 neoR 유전자를 형질전환을 위한 선택 마커로서 사용하였다. 형질전환시킨 DNA의 서열은 바로 아래에 제공되어 있다. 관련 제한 부위는 소문자의 볼드체로 나타내어져 있고, 5'-3' BspQI, KpnI, XbaI, MfeI, BamHI, AvrII, EcoRV, SpeI, AscI, ClaI, BglII, AflII, HinDIII 및 SacI 각각으로부터 유래한다. BspQI 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 작제물의 5' 및 3' 측접에서 밑줄친 서열은 상동성 재조합을 통해 6S 좌위에서 형질전환시키는 DNA의 표적화된 통합을 가능하게 하는 피. 모리포르미스 유래의 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, neoR(아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 활성을 암호화하며, 이에 의하여 균주가 G418 상에서 성장하는 것을 허용함)의 발현을 구동하는 씨. 레인하르드티 TUB2 프로모터는 소문자의 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. neoR을 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 씨. 불가리스 NR 유전자의 3' UTR은 소형 대문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 소문자의 문자로 나타낸 스페이서 영역으로 나타내어져 있다. 박스 표시된 문자로 나타낸 피. 모리포르미스 SAD2 -2 프로모터 서열은 코돈 최적화된 피. 모리포르미스 KASII 유전자의 발현을 구동한다. KASII 색소체 표적화 서열을 암호화하는 영역은 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 성숙한 피. 모리포르미스 KASII 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 볼드체의 밑줄친 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 3xFLAG 에피토프 암호화 서열은 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있다. 제2의 씨. 불가리스 NR 3' UTR은 소형 대문자로 나타내어져 있다.
pSZ2734 유래의 형질전환시킨 DNA의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
균주 X에서 KASII 의 과발현: pSZ2734로부터 유래한 작제물 D1643을 앞서 기재한 바와 같이 S4495로 형질전환시켰다. 일차 형질전환체를 클론정제하고, 표준 지질 생성 조건 하 pH5에서 성장시켰다. D1643을 이용하여 S4495의 형질전환으로 생기는 대표적인 클론으로부터 생성된 지방산 프로파일은 하기 표 42에 요약되어 있다. SAD2 녹아웃/녹다운 S4495 배경에서 KASII의 과발현은 50% 초과의 C18:0을 축적하고 실질적으로 C16:0의 수준을 감소시킨 다수의 균주를 생성하였다. 본 발명자들은 또한 KASII 과발현 계통이 S4495에 비하여 불포화 지방산에 대한 포화 지방산의 전반적인 비율이 더 낮다는 것을 관찰하였다.
Figure pct00035
표 42에서, 야생형 수준보다 더 큰 스테아레이트(C18:0) 수준은 볼드체 문자로 강조되어 있다. S4495 또는 S1920보다 더 낮은 팔미테이트(C16:0) 수준은 볼드체로 강조되어 있다. 3가지 균주에 있어서, 불포화 지방산에 대한 포화 지방산의 비는 ≤ 2:1이며; 이는 볼드 이탤릭체로 강조되어 있다.
안정적인 계통은 표 42에 나타낸 일차 형질전환체로부터 단리하였다. 진탕 플라스크 배양의 지방산 프로파일 및 지질 역가는 하기 표 43에 제시되어 있다. 균주는 모 균주 S4495에 대하여 비슷한 지질 역가를 가지면서, C18:0을 55%까지 축적하고, C16:0은 7%만큼 적게 축적하였다. 포화물:불포화물 비는 S4495에 비하여 실질적으로 감소하였다. 균주 S5665 및 S5675를 3 L 고밀도 발효물에서의 평가를 위하여 선택하였다.
Figure pct00036
표 43에서, S4495는 모 균주이고; S1920은 야생형의 기저 균주이다. 야생형 균주에서보다 적어도 2배 더 높은 스테아레이트(C18:0) 수준은 볼드체 문자로 강조되어 있다. S1920 및 S4495에서보다 더 적은 팔미테이트 수준은 볼드체로 강조되어 있다. 볼드 이탤릭체는 포화물:불포화물의 비가 ≤ 2:1인 것을 나타낸다.
균주 S5665 및 S5675의 지방산 프로파일 및 성능 메트릭은 하기 표 44에 상게하게 기재되어 있다. 동일한 발효 조건 하에서 성장시킨 모 균주 S4495의 지방산 프로파일이 비교를 위하여 제시되어 있다. KASII를 과발현하는 균주는 모 균주 S4495보다 약 11% 더 많은 C18:0을 축적한다. C16:0은 7% 내지 9%로 감소하고, 불포화 지방산의 수준은 4% 내지 5% 만큼 증가한다. S5665 및 S5675의 지질 역가는 S4495와 비슷하였으며, 이는 KASII 과발현이 지질 생성에 대하여 해로운 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.
Figure pct00037
발효물은 유가식 공정(fed-batch process)을 사용하여 6일 동안 배양하였다. 발효물 120580F1 유래의 S4495 지방산 프로파일은 표 41에 제시하였으며, 다시 비교를 위하여 S5665 및 S5675와 함께 표 44에 나타내어져 있다. 모든 발효는 32℃, pH 5에서, 질소/인(N/P) 비 1.4, 용존 산소(DO) 30%, 질소 농도[N] 300 mM, 철 농도 557.5 μM에서 수행하였다. 당 공급원은 70% 수크로스(S70)이었다. 야생형 균주에서보다 더 높은 스테아레이트(C18:0) 수준은 볼드체로 강조되어 있다. 야생형에서보다 더 적은 팔미테이트(C16:0) 수준은 볼드체로 강조되어 있다.
실험실 규모의 오일을 진탕 플라스크로부터 유래한 바이오매스 및 상기 기재한 발효물로부터 제조하였다. 이들 오일의 TAG 조성은 LC/MS에 의해 결정하였다. SOS는 S5665 및 S5675 둘 다에서 주요한 TAG 종이며, 이는 진탕 플라스크 유래 바이오매스에서 33% 내지 35%의 범위에 있고, 고밀도 발효 바이오매스에서 37%에 이른다. 주요한 팔미테이트 포함 TAG는 실질적으로 감소되며, 삼중포화물의 수준은 S4495 오일에서 관찰되는 것의 절반 미만이다. 이들 결과는 높은 스테아레이트 배경에서 KASII 과발현은 SOS 축적을 상당히 개선시키고, 삼중포화 TAG의 축적을 감소시킨다는 것을 입증한다.
S1920 에서 FATA -1 파괴, KASII 과발현 및 FAD2 RNAi 에 사용되는 작제물 : DNA 작제물인 pSZ2419는 S1920에서 동시에 FATA -1 대립유전자를 파괴하고, 피. 모리포르미스 KASII를 과발현하며, FAD2 헤어핀 작제물을 발현하도록 제조되었다. 피. 모리포르미스에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 수크로스 전화효소를 암호화하는 에스. 세레비지아에 SUC2 유전자의 형태는 형질전환용 선택 마커로서 이용하였다. 형질전환시킨 DNA의 서열은 바로 아래에 제공되어 있다. 관련 제한 부위는 소문자의 볼드체로 나타내어져 있고, 5'-3' BspQI, KpnI, AscI, MfeI, BamHI, AvrII, EcoRV, EcoRI, SpeI, AscI, ClaI, BglII, AflII, HinDIII, SacI, SpeI, 및 XhoI 각각으로부터 유래한다. BspQI 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 작제물의 5' 및 3' 측접에서 밑줄친 서열은 상동성 재조합을 통해 FATA -1 좌위에서 형질전환시키는 DNA의 표적화된 통합을 가능하게 하는 피. 모리포르미스 유래의 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, 에스. 세레비지아에 SUC2 유전자(수크로스 가수분해 활성을 암호화하며, 이에 의하여 균주가 수크로스 상에서 성장하는 것을 허용함)의 발현을 구동하는 씨. 레인하르드티 TUB2 프로모터는 소문자의 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. SUC2를 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 씨. 불가리스 질산염 환원 효소(NR) 유전자의 3' UTR은 소형 대문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 소문자의 문자로 나타낸 스페이서 영역으로 나타내어져 있다. 소문자의 박스 표시된 문자로 나타낸 피. 모리포르미스 AMT3 프로모터는 피. 모리포르미스 KASII 유전자의 발현을 구동한다. 클로렐라 프로토테코이데스 SAD1 유래 색포체 표적화 펩티드를 암호화하는 영역은 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 성숙한 피. 모리포르미스 KASII 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 볼드체의 밑줄친 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 3xFLAG 에피토프 암호화 서열은 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있다. 제2의 씨. 불가리스 NR 3' UTR은 소형 대문자로 나타내어져 있다. 소문자의 박스 표시된 문자로 나타낸 제2의 씨. 레인하르드티 TUB2 프로모터 서열은 피. 모리포르미스 FAD2 헤어핀 A 서열의 발현을 구동한다. 센스 및 안티센스 가닥은 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있으며, FAD2 인트론 및 FAD2 제2의 엑손(대문자의 이탤릭체)의 처음 10개 염기로 분리되어 있다. 제3의 씨. 불가리스 NR 3' UTR은 소형 대문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 소문자의 문자로 나타내어진 제2의 스페이서 영역으로 나타내어져 있다.
pSZ2419 유래 형질전환시키는 DNA의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
FATA - 1 녹아웃, KASII 과발현 및 FAD2 RNAi 균주의 확인 및 분석: pSZ2419로부터 유래한 작제물 D1358을 앞서 기재한 바와 같이 S1920으로 형질전환시켰다. 일차 형질전환체를 클론정제하고, 표준 지질 생성 조건 하 pH5에서 성장시켰다. D1358를 이용하여 S1920의 형질전환으로 생기는 대표적인 클론으로부터 생성된 지방산 프로파일은 하기 표 45에 요약되어 있다. 피. 모리포르미스 AMT3 프로모터는 pH 5에서 억압되어 관찰된 표현형은 피. 모리포르미스 KASII의 과발현을 반영하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 다수의 균주가 C16:0의 수준을 실질적으로 감소시키고 C18:1에서 10% 내지 15% 증가하였음을 관찰하였으며, 이는 작제물이 FATA -1 표적 유전자를 파괴하고, 내인성 KASII에 의한 확대를 위해 이용가능한 팔미토일-ACP의 양을 증가시킨다는 것을 시사한다..
D1283 형질전환체는 C18:1이 소실되면서 약 42%까지 C18:0을 축적하였으며, 이는 SAD 활성이 이들 균주에서 상당히 감소되었다는 것을 나타낸다. 하나의 계통인 D1358-13을 추가 분석을 위하여 선택하였다. D1358-13은 약 17% C16:0, 약 75% C18:1 및 2% 미만의 C18:2를 축적하였고, 이는 본 발명자들이 FATA -1에서 성공적으로 통합하고 이 균주에서 FAD2 Δ12-불포화효소의 활성을 하향 조절하였다는 것을 나타낸다.
Figure pct00042
표 45에서, 야생형 수준보다 더 큰 올리에이트(C18:1) 수준은 볼드체 문자로 강조되어 있다. 야생형보다 더 작은 팔미테이트(C16:0) 수준은 볼드체 문자로 강조되어 있다. 모 균주 S1920에 비하여 1% 이상만큼 감소한 리놀레에이트(C18:2)의 수준은 볼드체의 문자로 강조되어 있다.
형질전환체 D1358-13으로부터 유래한 균주의 지방산 프로파일은 선택 부재 하에서 60세대 초과의 성장(수크로스 상에서 성장) 후에 안정적인 것으로 결정되었다. 그 다음 진탕 플라스크 분석에서 선택된 균주의 성능을 평가하였으며, 지방산 프로파일 및 지질 역가는 하기 표 46에 제시되어 있다. 플라스크 실험은 pH 7에서 실행하였으며, 이는 KASII 이식유전자의 발현을 구동하는 PmAMT3 프로모터의 활성화를 가능하게 한다. KASII 과발현 및 FATA -1 녹아웃의 조합은 pH 5에서 관찰된 표현형에 비하여 팔미테이트 수준에서 추가의 감소, 및 올리에이트 축적의 향상으로 이어진다(표 45). 야생형 지질 역가의 82% 초과의 C18:1, 11% 미만의 C16:0, 2% 미만의 C18:2 및 약 83%를 가지는, S5003은 스테아레이트 수준을 상승시키는 후속 개질을 위한 숙주 균주로서 작용하는 이러한 세트로부터 가장 적절한 균주인 것으로 결정되었다. DA 블롯 분석은 S5003이 FATA-1 좌위에서 작제물 D1358[pSZ2419]의 단순한 삽입물을 가지다는 것을 나타내었다.
Figure pct00043
표 46에서, 야생형 수준보다 더 큰 스테아레이트(C18:0) 수준은 볼드체 문자로 강조되어 있다. 야생형보다 더 낮은 팔미테이트(C16:0) 수준은 볼드체 문자로 강조되어 있다. 야생형보다 더 낮은 리놀레에이트(C18:2) 수준은 볼드체 문자로 나타내어져 있다.
S5003 에서 SAD2 녹아웃/ RNAi 에 사용된 작제물 : 2가지 DNA 작제물, 즉 pSZ2283 및 pSZ2697은 동시에 SAD2 -1 대립유전자를 파괴하고 S5003에서 SAD2 헤어핀 작제물을 발현하도록 제조되었다. 각각의 작제물에서, 아미노글리코시드 항생제에 대한 저항성을 부여하는, 트랜스포존 Tn5 유래 neoR 유전자를 형질전환을 위한 선택 마커로서 사용하였다. pSZ2283으로부터 유래한 형질전환시킨 DNA의 서열은 바로 아래에 제공되어 있다. 관련 제한 부위는 소문자의 볼드체로 나타내어져 있고, 5'-3' BspQI, KpnI, XbaI, MfeI, BamHI, AvrII, EcoRV, EcoRI, SpeI, BamHI, HinDIII, 및 SacI 각각으로부터 유래한다. BspQI 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 작제물의 5' 및 3' 측접에서 밑줄친 서열은 상동성 재조합을 통해 SAD2 -1 좌위에서 형질전환시키는 DNA의 표적화된 통합을 가능하게 하는 피. 모리포르미스 유래의 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, neoR(아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 활성을 암호화하며, 이에 의하여 균주가 G418 상에서 성장하는 것을 허용함)의 발현을 구동하는 클라미도모나스 레인하르드티 TUB2 프로모터는 소문자의 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. neoR을 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 씨. 불가리스 NR 유전자의 3 UTR은 소형 대문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 소문자의 문자로 나타낸 스페이서 영역으로 나타내어져 있다. 소문자의 박스 표시된 문자로 나타낸 제2의 씨. 레인하르드티 TUB2 프로모터 서열은 SAD2 헤어핀 C 서열의 발현을 구동한다. 센스 및 안티센스 가닥은 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있으며, 피. 모리포르미스 FAD2 인트론 및 FAD2 제2의 엑손(대문자의 이탤릭체)의 처음 10개 염기에 의해 분리되어 있다. 제2의 씨. 불가리스 NR 3' UTR은 소형 대문자로 나타내어져 있다.
pSZ2283 유래의 형질전환시킨 DNA의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00044
Figure pct00045
pSZ2697로부터 유래한 형질전환시킨 DNA의 서열은 바로 아래에 제공되어 있다. 관련 제한 부위는 소문자의 볼드체로 나타내어져 있고, 5'-3' NsiI, SpeI, BamHI, HinDIII, SacII, EcoRV, KpnI, XbaI, MfeI, BamHI, AvrII, EcoRV, EcoRI 및 XbaI 각각으로부터 유래한다. BspQI 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 작제물의 5' 및 3' 측접에서 밑줄친 서열은 상동성 재조합을 통해 SAD2 -1 좌위에서 형질전환시키는 DNA의 표적화된 통합을 가능하게 하는 피. 모리포르미스 유래의 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, SAD2 헤어핀 C, 및 센스 및 안티센스 가닥은 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있으며, 피. 모리포르미스 FAD2 인트론 및 FAD2 제2의 엑손(대문자의 이탤릭체)의 처음 10개 염기에 의해 분리되어 있다. 씨. 불가리스 NR 유전자의 3' UTR은 소형 대문자로 나타내어져 있다. neoR(아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 활성을 암호화하며, 이에 의하여 균주가 G418 상에서 성장하는 것을 허용함)의 발현을 구동하는 클로렐라 소로키니아나 글루타메이트 글루타메이트 탈수소효소(GDH) 프로모터는 소문자의 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. neoR을 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 제2의 씨. 불가리스 NR 3' UTR은 소형 대문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 소문자의 문자로 나타낸 스페이서 영역으로 나타내어져 있다.
pSZ2697 유래의 형질전환시킨 DNA의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
S5003 배경에서 SAD2 녹아웃/녹다운 균주의 확인 및 분석: pSZ26972로부터 유래한 작제물 D1639, 및 pSZ2283으로부터 유래한 작제물 D1682를 앞서 기재한 바와 같이 S5003로 형질전환시켰다. 일차 형질전환체를 클론정제하고, 표준 지질 생성 조건 하 pH 7에서 성장시켰다. 형질전환으로 생기는 대표적인 클론으로부터 생성된 지방산 프로파일은 하기 표 47에 요약되어 있다. D1639 형질전환체는 56%까지 C18:0을 축적하였고, D1682 형질전환체는 최대 약 35%의 C18:0를 축적하였다. 스테아레이트에서 증가의 대부분은 C18:1을 소실하였으며, 이는 SAD 활성이 이들 균주에서 SAD2 녹아웃/RNAi 작제물에 의해 상당히 감소되었다는 것을 나타낸다. C16:0 수준은 6%에서 14%까지 다양하며, C18:2는 2% 내지 5%의 범위에 있었다. 대부분의 균주는 모 균주인 S5003의 낮은 C16:0 및 C18:2 표현형을 유지하였다. 이들 지방산 프로파일은 파괴된 FATA -1, KASII 과발현 및 FAD2 RNAi를 가지는 배경에서, 녹아웃/RNAi 작제물을 사용하여 SAD2 발현을 하향 조절하는 것은 높은 C18:0, 낮은 C16:0 및 낮은 C18:2 표현형을 가지는 균주를 생성한다. 이들 균주는 높은 안정성, 높은 스테아레이트, 높은 올레산 오일, 및 SOS 함량이 높은 오일의 생성에 유용할 것이다.
Figure pct00049
표 47에서, 야생형 수준보다 더 큰 스테아레이트(C18:0) 수준은 볼드체 문자로 강조되어 있다. 야생형보다 더 높은 올리에이트(C18:1) 수준은 볼드체 문자로 강조되어 있다. 야생형보다 더 적은 팔미테이트(C16:0) 수준은 볼드체로 강조되어 있다. 야생형에 비하여 리놀레에이트(C18:2)의 감소된 수준은 볼드체 문자로 강조되어 있다.
안정적인 계통은 다수의 D1639 및 D1682 형질전환체로부터 단리하였다. 진탕 플라스크 분석을 수행하여 D1639-5로부터 유래한 4가지 계통의 성능을 평가하였다. 바이오매스 유래의 지방산 프로파일 및 상대적인 지질 역가는 하기 표 48에 나타내어져 있다.
Figure pct00050
표 43에서, S5003은 모 균주이고; S1920은 야생형의 기저 균주이다. 야생형 균주에서보다 더 높은 스테아레이트(C18:0) 수준은 볼드체로 강조되어 있다. 볼드체 문자는 야생형에 비하여 S5003에서 올리에이트(C18:1)의 증가된 수준을 나타낸다. 야생형에서보다 더 적은 팔미테이트(C16:0) 수준은 볼드체로 강조되어 있다. 야생형에서보다 더 적은 리놀레에이트(C18:2) 수준은 볼드체로 강조되어 있다.
실험실 규모의 오일을 S5774, S5775 및 S5776 진탕 플라스크로부터 수집한 바이오매스로부터 제조하였다. 이들 오일의 TAG 조성은 LC/MS에 의해 결정하였고, 도 21에 나타내어져 있다. 이들 균주에서 SOS 축적은 42% 내지 47%의 범위에 있었다. POS는 16% 내지 17%로 그 다음 가장 풍부한 TAG이었다. 리놀레에이트 포함 TAG는 상기 기재한 S5665 및 S5675 오일에 비하여 50% 초과만큼 감소하였다. S5774 내지 S5776 오일은 S5665 및 S5775 오일에서 축적된 양과 유사하게 12% 내지 13%의 삼중포화 TAG(S-S-S)를 포함하였다. 포화 지방산의 과다생성을 방지하기 위하여 오일 생성 동안 SAD 활성의 조절은 삼중포화물의 축적을 감소시키는데 도움을 줄 수 있다.
실시예 49: 높은 올레산 미세조류 오일 유래 메틸 올리에이트의 특성.
메틸 올리에이트에서 높은 에스테르화 오일은 세정 및 기계류의 윤활과 같은 다양한 적용분야에서 유용하다. 이들 적용분야의 일부에 있어서, 높은 열적 안정성이 요구된다. 열적 안정성 시험은 상기 기재된 바와 같은 종속영양으로 성장한 유지성 미세조류로부터 제조된 높은 올레익 및 높은 안정성-높은 올레익 트리글리세리드 오일로부터 제조된 메틸화 오일에 대하여 실행하였다. 메틸화 이전에 오일을 표백 및 탈취하였다. 상업적으로 입수가능한 콩 메틸 에스테르를 대조군으로서 사용하였다.
고올레산(HO) 오일을 FatA1_Btub:inv:nr::amt03-CwTE2:nr_FatA1로서 기재될 수 있는 플라스미드를 이용하여 형질전환된 프로토테카 모리포르미스의 고 오일 생성 균주로부터 제조되었다. 이러한 플라스미드는 pH 조절 amt3 프로모터의 제어 하에서 FATA1 염색체 부위에서 상동적으로 재결합하고, 따라서 FATA 아실-ACP 티오에스테라제 염색체 대립유전자를 제거하는 한편, 쿠페아 라이티(CwTE2, 서열 번호 11) 유래의 외인성 아실-ACP 티오에스테라제를 발현하도록 고안되었다. CwTE2 유전자는 오일 생성 동안 pH 5에서 배양에 의해 하향 조절되어 올리에이트 생성을 추가로 상승시킬 수 있다. 수크로스 전화효소는 또한 선택 마커로서 발현되었으며, 유일한 탄소 공급원으로서 수크로서 상에서 균주의 배양의 가능하게 하였다. 3' UTR 서열은 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 유전자 유래의 것이다. 생성된 HO 균주는 균주 Q로 표시되어 있다. 균주 Q에 의해 생성된 오일의 지방산 프로파일은 하기 표 49에 열거되어 있다.
균주 Q 유래 고올레산 오일의 지방산 프로파일.
지방산 영역%
C10 0.01
C12:0 0.03
C14:0 0.43
C15:0 0.03
C16:0 7.27
C16:1 이소 0.81
C16:1 0.689
C17:0 0.06
C18:0 1.198
C18:1 80.15
C18:1 이소 0.08
C18:2 8.38
C18:3 알파 0.25
C20 :0 0.02
C20:1 0.38
C22:0 0.04
C24:0 0.03
고안정성-고올레산 오일(high-stability-high-oleic oil; HSAO)은 또한 FADc5'_Btub:inv:nr::btub-CpSAD_CtOTE:nr_FADc3'로 기재될 수 있는 플라스미드를 이용하여 형질전환된 프로토테카 모리포르미스의 고 오일 생성 균주로부터 제조되었다. 생성된 균주(균주 R)은 선택 마커로서 수크로스 전화효소를 발현하고, 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스 상에서 배양을 가능하게 한다. 추가적으로, FAD 대립유전자(리놀레에이트로 올리에이트의 전환에 책임이 있는 지방산 불포화효소를 암호화함)는 파괴도고, 클로렐라 프로토테코이데스의 SAD 유전자 유래의 수송 펩티드와 융합되는 올리에이트 특이적 아시- ACP 티오에스테라제(카르타무스 틴크토리우스 OTE, 실시예 5 참조)는 베타 튜불린 프로모터의 제어 하에서 발현된다. 3 UTR 서열은 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 유전자 유래의 것이다. 종속영양 배양 후 균주 R에 의해 생성된 오일의 지방산 프로파일은 하기 표 50에 열거되어 있다. 지방산 프로파일은 85% 초과의 올리에이트를 가지지만, 주요한 다가불포화물, 즉 리놀레산 및 리놀렌산은 거의 존재하지 않는다.
균주 R 유래 고올레산 오일의 지방산 프로파일.
지방산 영역%
C10 0.02
C12:0 0.07
C14:0 0.09
C15:0 0.05
C16:0 7.28
C16:1 0.70
C17:0 0.08
C18:0 2.15
C18:1 86.32
C20:0 0.30
C20:1 0.46
C22:0 0.08
C23:0 0.01
C24:0 0.06
HO 및 HSAO 오일은 공지된 바이오디젤 생성 기술에 의해 메틸화되어 메틸-HO 및 메틸-HSAO 에스테르를 만든다. 이들 메틸 에스테르는 그 다음 하기 절차에 따라 열 시험을 거친다:
1. 도 1에 나타낸 바와 같은 장비를 준비한다.
2. 시험 용기에 물 1리터를 첨가하고 핫플레이트 상에서 활발하게 끓인다.
3. 각각의 시험 생성물에 코발트 50 ppm(샘플 100.0그램 중 6% 코발트 나프테네이트 0.083g)을 첨가하고 완전히 혼합한다.
4. 시계 접시에서 100% 면 거즈(#50 치즈클로스) 7.0 g을 칭량한다.
5. 단계 3에서 준비한 바와 같이 시험 생성물 14.0 g을 거즈 상에 균일하게 분배한다.
6. #15 스토퍼의 중심을 통해 열전대(온도계)를 넣는다. 열전대 주위를 면으로 감싼다.
7. 감싼 면이 상부 4 ½인치를 차지하도록 24메쉬 와이어 프레임 실린더로 감싼 면을 넣는다.
8. 1L 긴 형태의 비커로 거즈로 감싼 실린더를 위치시킨다. 끓는 물 중 비커를 고정시키고 시간에 따른 온도 증가를 기록하기 시작한다.
9. 2시간 동안 또는 10도의 온도 하락이 관찰될 때까지 온도를 계속 모니터링한다.
10. 그래프 상에 온도 대 시간을 플롯팅한다.
11. 1시간에 100℃ 또는 2시간에 200℃를 초과하는 온도를 나타내는 임의의 샘플은 위험한 산화 위험 요소로 간주하거나 자발적으로 연소하는 것으로 간주하여야 한다.
결과: HO 및 HSAO 메틸 에스테르는 온도 상승에 의해 입증된 바와 같이 자동산화를 나타내지 않았다. 대조 콩 메틸 에스테르 샘플은 자동산화에 대한 가능성을 나타내었다. 시간-온도 프로파일은 도 18에 나타내어져 있다.
추가적으로, 균주 Q에 의해 생성된 오일로부터 메틸화된 지방산은 하기 특징을 가지는 것으로 밝혀졌다:
· 인화점(ASTM D93): 182℃
· 비휘발성
· 카우리 부탄 수치(ASTM D1133): 53.5
· 40℃에서의 점도(ASTM D445): 4.57 mm2/s
· 산가(ASTM D664): 0.17 mg KOH/g
· 끓는점 범위 분포(ASTM D2887): 325℃ 내지 362℃.
실시예 50: 고올레산 ( HO ) 및 고안정성-고올레산( HSAO ) 미세조류 오일의 추가 특성.
고올레산 오일 및 고안정성 고올레산 조류 오일은 도 19에 나타낸 특성 또는 측정된 파라미터에 대하여 이들 값±20%을 가질 수 있다.
하나의 실험에서, HSAO 미세조류 오일은 0.5% 페닐-알파-나프틸아민(PANA)의 항산화제 및 아스코빌 팔미테이트(AP) 500 ppm을 이용하여 110℃에서 OSI에 의해 측정된(130℃ 데이터를 사용하여 추산됨) 512시간 안정성을 나타내었다.
실시예 51: 팔미톨레에이트로 팔미트산의 전환에 의한 저포화물 오일의 생성.
상기 실시예에 기재된 바와 같이, 미세조류의 유전자 조작은 특히 올레산의 생성을 증가시킴으로써 포화 지방 수준을 감소시킬 수 있다. 그러나, 일부 경우에서, 유지성 세포에서 발현되는 아실-ACP 티오에스테라제는 바람직한 양의 필미테이트보다 더 많이 방출한다. 여기에서, 본 발명자들은 팔미토일-ACP 불포화효소 (PAD) 유전자를 과발현시킴으로써 팔미톨레에이트(16:1)로 팔미테이트(16:0)를 전환시키는 방법을 기재한다. PAD 유전자는 맥파디에나 운구이스(고양이 발톱), 마카다미아 인테그리폴리아(마카다미아 너트), 힙포파에 람노이데스(산자나무)와 같은 천연 공급원으로부터 얻을 수 있거나, 스테아로일-ACP 불포화효소의 돌연변이를 통해 16:1 활성을 가지는 PAD를 형성함으로써 얻을 수 있다. 맥파디에나 운구이스 불포화효소는 (MuPAD)로 표시된다.
프로토테카 모리포르미스의 고 오일 생성 균주(균주 Z)는 PAD 유전자를 가지는 플라스미드 DNA 작제물을 이용하여 바이오리스틱 형질전환된다. 예를 들어, 실시예 6, 실시예 36, 또는 실시예 49에 기재된 고 올레산 균주 중 하나는 외인성 PAD 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 작제물은 선택 마커로서 수크로스 전화효소, 및 MuPAD 또는 팔미테이트로 기질 특이성을 이동시키는 L118W 돌연변이를 가지는 SAD 유전자(예를 들어, 올레아 유로파에아 스테아로일-ACP 불포화효소, GenBank 수탁 번호 AAB67840.1)를포함한다. 문헌[Cahoon, et al., Plant Physoil (1998) 117:593-598]을 참조한다. amt3 및 베타 튜불린(Btub) 프로모터가 둘 다 사용된다. 추가적으로, 식물 PAD 유전자의 천연 수송 펩티드는 미세조류에서 효과적이도록 공지된 것(예를 들어, 클로렐라 불라리스 SAD 유전자 유래 수송 펩티드)으로 바뀔 수 있다.
PAD 유전자는 FATA 녹아웃 또는 녹다운 및/또는 KASII 녹인(knockin)을 가지는 것들을 포함하여 다양한 균주에서 발현되어 고올레산 오일을 생성할 수 있다. 선택적으로, 이들 균주는 또한 FAD(델타 12 지방산 불포화효소) 녹아웃, 녹다운 덕분에, 또는 조절가능 프로모터의 제어 하에서 FAD 발현을 하고 FAD를 하향 조절하는 조건 하에서 오일을 생성함으로써 고안정성(저다가불포화물) 오일을 생성할 수 있다. 추가적으로, PAD 유전자 활성의 도입에 유용한 기저 균주는 또한 KASII 녹아웃, 및 FATA 녹인을 가지는 균주를 포함할 수 있었으며, 이에 의하여 C16:0 팔미테이트의 수준은 상승한다.
팔미트산이 시스-팔미톨레산 및 시스-바크센산으로 전환되므로, 결과적으로 팔미트산의 더 낮은 수준이 미세조류 오일의 지방산 프로파일에서 발견된다. 일부 경우에서, 포화 지방산의 전체 영역 백분율은 3.5%, 3% 또는 2.5% 이하이다.
맥파디에나 운구이스 C16:0 불포화효소(MuPAD)의 과발현을 위한 작제물은 다음과 같다:
1) pSZ3142 : 6S:: CrTUB2 : ScSUC2 : CvNR :: PmAMT3 : CpSADtp : MuPAD : CvNR ::6S
작제물 pSZ3142 6S::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmAMT3:CpSADtp :MuPAD:CvNR::6S 에서 관련 제한 부위는 소문자, 볼드체 및 밑줄로 나타내어져 있고, 각각 5'-3' BspQ 1, Kpn I, Xba I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Asc I, Cla I, Sac I, BspQ I이다. BspQI 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 볼드체의 소문자 서열은 상동성 재조합을 통해 6s 좌위에서 표적화된 통합을 허용하는 것 유래의 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, 효모 수크로스 전화효소 유전자(수크로스를 대사하는 균주 Z의 능력을 부여함)의 발현을 구동하는 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. 전화효소를 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 박스 표시된 이탤릭체 문자로 나타내어진 프로토테카 모리포르미스의 내인성 amt03 프로모터가 나타내어져 있다. MuPAD의 개시자 ATG 및 종결자 TGA 코돈은 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역의 나머지는 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있다. 클로렐라 프로토테코이데스 S106 스테아로일-ACP 불포화효소 수송 펩티드는 개시자 ATG와 Asc I 부위 사이에 위치한다. 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 다시 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 6S 게놈 영역은 볼드체 소문자의 문자로 나타내어져 있다.
pSZ3142에 포함된 형질전환시킨 DNA의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
2) pSZ3145 : 6S:: CrTUB2 : ScSUC2 : CvNR :: PmAMT3 : MuPAD : CvNR ::6S
작제물 pSZ3145 6S::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmAMT3: MuPAD:CvNR::6S에서 관련 제한 부위는 소문자, 볼드체 및 밑줄로 나타내어져 있고, 각각 5'-3' BspQ 1, Kpn I, Xba I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Cla I, Sac I, BspQ I이다. BspQI 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 볼드체의 소문자 서열은 상동성 재조합을 통해 6s 좌위에서 표적화된 통합을 허용하는 것 유래의 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, 효모 수크로스 전화효소 유전자(수크로스를 대사하는 균주 Z의 능력을 부여함)의 발현을 구동하는 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. 전화효소를 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 프로토테카 모리포르미스의 내인성 amt03 프로모터는 박스 표시된 이탤릭체 문자로 나타내어져 있다. MuPAD의 개시자 ATG 및 종결자 TGA 코돈은 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역의 나머지는 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있다. 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 다시 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 6S 게놈 영역은 볼드체 소문자의 문자로 나타내어져 있다.
pSZ3145에 포함된 형질전환시킨 DNA의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
3) pSZ3137 : 6S:: CrTUB2 : ScSUC2 : CvNR :: CrTUB2 : CpSADtp : MuPAD : CvNR ::6S
pSZ3137 6S::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::CrTUB2:CpSADtp :MuPAD:CvNR::6S에서 관련 제한 부위는 소문자, 볼드체 및 밑줄로 나타내어져 있고, 각각 5'-3' BspQ 1, Kpn I, Xba I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Asc I, Cla I, Sac I, BspQ I이다. BspQI 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 볼드체의 소문자 서열은 상동성 재조합을 통해 6s 좌위에서 표적화된 통합을 허용하는 것 유래의 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, 효모 수크로스 전화효소 유전자(수크로스를 대사하는 균주 Z의 능력을 부여함)의 발현을 구동하는 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. 전화효소를 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 박스 표시된 이탤릭체 문자로 나타내어져 있다. MuPAD의 개시자 ATG 및 종결자 TGA 코돈은 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역의 나머지는 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있다. 클로렐라 프로토테코이데스 S106 스테아로일-ACP 불포화효소 수송 펩티드는 개시자 ATG와 Asc I 부위 사이에 위치한다. 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 다시 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 6S 게놈 영역은 볼드체 소문자의 문자로 나타내어져 있다.
pSZ3137에 포함된 형질전환시킨 DNA의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
실시예 52: 쿠페아 팔루스트리스 티오에스테라제를 과발현함으로써 생성된 미리스테이트 풍부 오일
여기에서, 본 발명자들은 쿠페아 팔루스트리스 티오에스테라제(Cpal FATB1, 수탁 AAC49180) UTEX1435의 과발현이 C14:0에서 큰 증가를 가져온다는 것을 입증한다.
Cpal FATB1 유전자의 과발현에 사용된 작제물은 본원에 기재된 바와 같이 피. 모리포르미스에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 작제물은 6SA::CrTUB2-ScSUC2-CvNR:PmAMT3-CpSAD1tpExt_CpalFATB2FLAG_ExtA-CvNR::6SB로 기재될 수 있다.
이러한 고미리스테이트 균주에서, 미리스테이트 함량은 하기 표 51에 나타낸 바와 같이 65.70%이었다. 이는 미리스테이트 함량이 대략 1%인 기저 균주에 의해 생성된 야생형 오일의 미리스테이트 함량으로부터 매우 크게 증가한 것이다.
고미리스테이트 균주의 지방산 프로파일.
C10:0 0.04
C12:0 1.19
C14:0 65.7
C16:0 13.55
C18:0 0.57
C18:1 12.2
C18:2 5.13
C20:0 0.05
C22:0 0.01
C24:0 0.01
도 22는 25℃에서 고형 지방 함량이 80%를 초과한다는 것을 나타낸다. 25℃에서, 기저 균주 오일에는 고형 지방이 전혀 없거나 무시해도 될 정도이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 비교로서, 정련, 표백 및 탈취된 오일(RBD-3)의 고형 지방 함량을 재현한다. RBD-3은 고량의 C16:0을 생성하도록 조작된 피. 모리포르미스 균주 유래의 오일이다. 고 C16:0 생성 균주를 위한 작제물은 6SA-bTub-Inv-nr::Amt03-천연 Ch16TE-nr-6SB로 기재된다. 이러한 작제물은 C16:0 선호 쿠페아 후커리아나 티오에스테라제를 암호화한다.
실시예 53: 쿠페아 팔루스트리스 티오에스테라제를 과발현함으로써 생성된 미리스테이트 풍부 오일
여기에서, 본 발명자들은 UTEX1435에서 쿠페아 팔루스트리스 티오에스테라제(Cpal FATB2, 수탁 AAC49180)의 과발현이 C14:0 생성에서 큰 증가(지방산 프로파일의 60% 초과)를 가져온다는 것을 입증한다.
Cpal FATB2 유전자의 과발현에 사용된 작제물은 본원에 기재된 바와 같이 피. 모리포르미스에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 쿠페아 팔루스트리스 FATB2는 C14 선호 티오에스테라제이다. 2가지 작제물(둘 다 Cpal FATB2 유전자를 암호화함)을 제조하였다. 제1의 작제물인 pSZ2479는 6SA::CrTUB2-ScSUC2-CvNR:PmAMT3-CpSAD1tpExt- CpalFATB2ExtA-CvNR::6SB로 기재될 수 있다. FatB2 암호화 서열은 서열 번호 86으로서 주어져 있으며, 아미노산 서열은 서열 번호 87로서 주어져 있다. 제2의 작제물인 pSZ2480은 6 SA :: CrTUB2 - ScSUC2 - CvNR : PmAMT3 - CpSAD1tpExt _ CpalFATB2FLAG _ ExtA -CvNR::6SB로 기재될 수 있다.
작제물은 6SA::CrTUB2-ScSUC2-CvNR:PmAMT3-CpSAD1tpExt_CpalFATB2FLAG_ExtA-CvNR::6SB로 기재될 수 있다. 핵산 서열 및 아미노산 서열은 서열 번호 88 및 서열 번호 89로서 주어져 있다.
pSZ2480을 이용하여 형질전환된 피. 모리포르미스는 고수준의 미리스트산을 생성하였다. 미리스테이트 함량은 65.70%이었다. 이는 미리스테이트 함량이 대략 1%인 기저 균주에 의해 생성된 야생형 오일의 미리스테이트 함량과 비교할 때 매우 크게 증가한 것이다.
고미리스테이트 균주의 지방산 프로파일은 하기 표 52에 나타내어져 있다.
고미리스테이트 균주의 지방산 프로파일.
지방산 %
C10:0 0.04
C12:0 1.19
C14:0 65.7
C16:0 13.55
C18:0 0.57
C18:1 12.2
C18:2 5.13
C20:0 0.05
C22:0 0.01
C24:0 0.01
실시예 54: 에이코세노 지방산 및 에루스 지방산의 생성
이 실시예에서, 본 발명자들은 이종성 지방산 신장효소(FAE)(또한, 3-케토아실-CoA 합성 효소(KCS)로 알려짐), 크램블 아비시니카(Cramble abyssinica; CaFAE, 수탁 번호: AY793549), 루나리아 안누아(Lunaria annua; LaFAE, ACJ61777), 및 카르다민 그라에카(CgFAE, ACJ61778) 의 발현이 고전적으로 돌연변이유발된 UTEX 1435의 유도체, 즉 균주 Z에서 에이코세노산(20　:　1Δ11) 및 에루스산(22　:　1Δ13)과 같은 매우 긴 사슬의 단불포화 지방산의 생성으로 이어진다는 것을 입증한다. 한편, 에이코세노산(20　:　1Δ11)에서 보통의 증가를 가져오면서, 에올룸 마주스(TmFAE, ABD77097) 유래의 추정 FAE 유전자 및 브라시카 나푸스(BnFAE1, AAA96054 and BnFAE2, AAT65206) 유래 2가지 FAE 유전자는 균주 Z에서 검출가능한 에루크산을 생성하지 않았다. 흥미롭게도, 균주 Z에서 BnFAE1의 이종성 발현으로 얻은 불포화 지방산 프로파일은 도코사디엔산(22:2n6)에서 현저한 증가를 가져왔다. 모든 유전자는 코돈 최적화하여 UTEX 1435 코돈 선호도를 반영하였다. 이들 결과는 CaFAE, LaFAE 또는 CgFAE 유전자는, 에이코세노산 및 에루크산 함량을 개선시키는 특이적인 능력을 가지면서, 매우 긴 사슬을 이용하는 단불포화 및 포화된 아실 기질의 생합성에서 수반되는 축합 효소를 암호화한다는 것을 시사한다.
피. 모리포르미스 ( UTEX 1435 균주인 균주 Z) - [pSZ3070]에서 크램블 아비시니카 지방산 신장효소( CaFAE )의 발현에 사용되는 작제물 : 이 실시예에서, 작제물 pSZ3070을 이용하여 형질전환된 균주인 균주 Z를 생성하였으며, 균주 Z는 수크로스 전화효소(수크로스를 포함하는 배지에서 이들 균주의 성장 및 선택을 가능하게 함) 및 씨. 아비시니카 FAE 유전자를 발현한다. 균주 Z에서의 발현을 위해 도입된 작제물 pSZ3070은 6S::CrTUB2-ScSUC2-Cvnr:PmAmt03-CaFAE-Cvnr::6S로 기재될 수 있다.
형질전환시킨 DNA의 서열은 이하에 제공되어 있다. 작제물에서 관련 제한 부위는 소문자의 볼드체로 나타내어져 있고, 각각 5'-3' BspQI, KpnI, XbaI, MfeI, BamHI, EcoRI, SpeI, AflII, SacI, BspQI로부터 유래한다. BspQI 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 볼드체의 소문자 서열은 상동성 재조합을 통해 6S 좌위에서 표적화된 통합을 허용하는 균주 Z 유래의 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, 사카로마이세스 세레비지아에 SUC2 유전자(수크로스 가수분해 활성을 암호화하며, 이에 의하여 균주가 수크로스 상에서 성장하는 것을 허용함)의 발현을 구동하는 Tl. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 소문자의 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. SUC2를 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소(NR) 유전자 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 피. 모리포르미스의 내인성 AMT3 프로모터는 박스 표시된 이탤릭체 문자로 나타내어져 있다. CaFAE의 개시자 ATG 및 종결자 TGA 코돈은 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역의 나머지는 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있다. 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 다시 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 균주 Z의 6S 게놈 영역은 볼드체 소문자의 문자로 나타내어져 있다. 최종 작제물은 정확한 리딩프레임 및 표적화 서열을 보장하기 위해 서열결정하였다.
플라스미드 pSZ3070에 포함된 형질전환시킨 DNA의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
(서열 번호102)
균주 Z에서 고등 식물 유래 FAE 유전자의 발현에 사용되는 작제물 : CaFAE 유전자(pSZ3070), 루나리아 안누아 유래 LaFA (pSZ3071), 카르다민 그라에카 유래 CgFAE(pSZ3072), 트로파에올룸 마주스 유래 TmFAE (pSZ3067) 및 브라시카 나푸스 유래 BnFAE (pSZ3068) 및 BnFAE (pSZ3069) 유전자를 균주 Z에서의 발현을 위하여 작제물로 만들었다. 이들 작제물은 다음과 같이 기재될 수 있다:
pSZ3071 - 6S::CrTUB2-ScSUC2-Cvnr:PmAmt03-LaFAE-Cvnr::6S
pSZ3072 - 6S::CrTUB2-ScSUC2-Cvnr:PmAmt03-CgFAE-Cvnr::6S
pSZ3067 - 6S::CrTUB2-ScSUC2-Cvnr:PmAmt03-TmFAE-Cvnr::6S
pSZ3068 - 6S::CrTUB2-ScSUC2-Cvnr:PmAmt03-BnFAE1-Cvnr::6S
pSZ3069 - 6S::CrTUB2-ScSUC2-Cvnr:PmAmt03-BnFAE2-Cvnr::6S
이들 모든 작제물은 pSZ3070과 동일한 벡터 백본, 선택 마커, 프로모터, 및 3' utr을 가지며, 각각의 FAE 유전자만이 상이하다. 이들 작제물에서 관련 제한 부위는 또한 pSZ3070에서와 동일하다. LaFAE, CgFAE, TmFAE, BnFAE1 및 BnFAE2의 서열은 하기 나타내어져 있다. SpeI 및 AflII를 포함한 관련 제한 부위는 볼드체의 문자로서 각각 5'-3'으로 나타내어져 있다.
pSZ3071에 포함된 LaFAE의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00064
pSZ3072에 포함된 CgFAE의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00065
Figure pct00066
pSZ3067에 포함된 TmFAE의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00067
(서열 번호105)
pSZ3068에 포함된 BnFAE1의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00068
pSZ3069에 포함된 BnFAE2의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00069
Figure pct00070
(서열 번호107)
지방산 프로파일에 대한 상기 작제물의 영향을 결정하기 위하여, PmAMT3 프로모터에 의해 구동되는 다양한 이종성 FAE 유전자를 포함하는 상기 작제물을 균주 Z로 독립적으로 형질전환시켰다.
일차 형질전환체를 클론정제하고, 표준 지질 생성 조건 하 pH7.0에서 성장시켰다(모든 플라스미드는 pH 조절 PmAMT03 프로모터에 의해 구동될 때 FAE 유전자의 최대 발현을 가능하게 하기 위해 pH 7.0에서의 성장을 필요로 한다). 균주 Z로 pSZ3070, pSZ3071, pSZ3072, pSZ3067, pSZ3068 및 pSZ3069를 이용한 형질전환으로 생기는 대표적인 클론의 세트로부터 생성된 프로파일은 각각 하기 표 53 내지 표 58에 나타내어져 있다.
이종성 FAE 유전자를 발현하는 모든 유전자이식 균주 Z는 C20:1 및 C22:1 지방산의 축적 증가를 나타낸다(표 53 내지 표 58 참조). 야생형에 비하여 에이코세노산(20　:　1Δ11) 및 에루스산(22　:　1Δ13) 수준의 증가는 야생형 수준보다 지속적으로 더 높다. 추가적으로, 균주 Z에서 BnFAE1의 이종성 발현으로 얻어진 불포화 지방산 프로파일은 도코사디엔산(C22:2n6)에서 현저한 증가를 가져왔다. 균주 Z에서 발현된 상기 언급한 FAE의 단백질 정렬은 도 23에 나타내어져 있다.
균주 Z 및 pSZ3070(CaFAE) DNA를 이용하여 형질전환된 대표적인 유도체 유전자이식 계통의 불포화 지방산 프로파일.
샘플 ID C18:1 C18:2 C18:3a C20:1 C22:1 C22:2 n6 C22:5
균주 Z; T588 ; D1828 -20 51.49 9.13 0.65 4.35 1.24 0.11 0.00
균주 Z; T588 ; D1828 -23 55.59 7.65 0.50 3.78 0.85 0.00 0.13
균주 Z; T588 ; D1828 -43 54.70 7.64 0.50 3.44 0.85 0.09 0.00
균주 Z; T588 ; D1828 -12 52.43 7.89 0.59 2.72 0.73 0.00 0.00
균주 Z; T588 ; D1828 -19 56.02 7.12 0.52 3.04 0.63 0.10 0.11
대조 균주 Z pH 7 57.99 6.62 0.56 0.19 0.00 0.06 0.05
대조 균주 Z pH 5 57.70 7.08 0.54 0.11 0.00 0.05 0.05
균주 Z 및 pSZ3071(LaFAE) DNA를 이용하여 형질전환된 대표적인 유도체 유전자이식 계통의 불포화 지방산 프로파일.
샘플 ID C18 :1 C18 :2 C18 :3 a C20 :1 C22 :1 C22 :2 n6 C22 :5
균주 Z; T588 ; D1829 -36 54.66 7.04 0.52 1.82 0.84 0.12 0.09
균주 Z; T588 ; D1829 -24 56.27 6.72 0.51 1.70 0.72 0.09 0.00
균주 Z; T588 ; D1829 -11 56.65 8.36 0.54 2.04 0.67 0.00 0.00
균주 Z; T588 ; D1829 -35 55.57 7.71 0.53 0.10 0.66 0.00 0.00
균주 Z; T588 ; D1829 -42 56.03 7.06 0.54 1.54 0.51 0.06 0.08
대조 균주 Z pH 7 57.70 7.08 0.54 0.11 0.00 0.06 0.05
대조 균주 Z pH 5 57.99 6.62 0.56 0.19 0.00 0.05 0.05
균주 Z 및 pSZ3072 (CgFAE) DNA를 이용하여 형질전환된 대표적인 유도체 유전자이식 계통의 불포화 지방산 프로파일.
샘플 ID C18 :1 C18 :2 C18 :3 a C20 :1 C22 :1 C22 :2 n6 C22 :5
균주 Z; T588 ; D1830 -47 57.74 7.79 0.52 1.61 0.25 0.11 0.05
균주 Z; T588 ; D1830 -16 58.06 7.39 0.55 1.64 0.22 0.07 0.06
균주 Z; T588 ; D1830 -12 57.77 6.86 0.51 1.34 0.19 0.09 0.00
균주 Z; T588 ; D1830 -37 58.45 7.54 0.49 1.65 0.19 0.06 0.00
균주 Z; T588 ; D1830 -44 57.10 7.28 0.56 1.43 0.19 0.07 0.00
대조 균주 Z pH 7 57.70 7.08 0.54 0.11 0.00 0.06 0.05
대조 균주 Z pH 5 57.99 6.62 0.56 0.19 0.00 0.05 0.05
S3067 및 pSZ3070 (TmFAE) DNA를 이용하여 형질전환된 대표적인 유도체 유전자이식 계통의 불포화 지방산 프로파일. 이들 유전자이식 계통에 대하여 어떠한 검출가능한 에루스산(22:1) 피크도 기록되지 않았다.
샘플 ID C18 :1 C18 :2 C18 :3 a C20 :1 C22 :2 n6 C22 :5
균주 Z; T588 ; D1825 -47 59.97 7.44 0.56 0.57 0.00 0.00
균주 Z; T588 ; D1825 -35 58.77 7.16 0.51 0.50 0.09 0.11
균주 Z; T588 ; D1825 -27 60.40 7.82 0.47 0.44 0.07 0.07
균주 Z; T588 ; D1825 -14 58.07 7.32 0.54 0.41 0.05 0.05
균주 Z; T588 ; D1825 -40 58.66 7.74 0.46 0.39 0.08 0.00
대조 균주 Z pH 7 57.99 6.62 0.56 0.19 0.05 0.05
대조 균주 Z pH 5 57.70 7.08 0.54 0.11 0.06 0.05
균주 Z 및 pSZ3068 (BnFAE1) DNA를 이용하여 형질전환된 대표적인 유도체 유전자이식 계통의 불포화 지방산 프로파일. 이들 유전자이식 계통에 대하여 어떠한 검출가능한 에루스산(22:1) 피크도 기록되지 않았다.
샘플 ID C18 :1 C18 :2 C18 :3 a C20 :1 C22 :2 n6 C22 :5
균주 Z; T588 ; D1826 -30 59.82 7.88 0.55 0.32 0.17 0.10
균주 Z; T588 ; D1826 -23 59.32 8.02 0.58 0.27 0.18 0.07
균주 Z; T588 ; D1826 -45 59.63 7.49 0.55 0.27 0.19 0.08
균주 Z; T588 ; D1826 -24 59.35 7.78 0.57 0.26 0.23 0.00
균주 Z; T588 ; D1826 -34 59.14 7.61 0.57 0.25 0.22 0.05
대조 균주 Z pH 7 57.81 7.15 0.59 0.19 0.04 0.06
대조 균주 Z pH 5 58.23 6.70 0.58 0.18 0.05 0.06
균주 Z 및 pSZ3069 (BnFAE2) DNA를 이용하여 형질전환된 대표적인 유도체 유전자이식 계통의 불포화 지방산 프로파일. 이들 유전자이식 계통에 대하여 어떠한 검출가능한 에루스산(22:1) 피크도 기록되지 않았다.
샘플 ID C18 :1 C18 :2 C18 :3 a C20 :1 C22 :2 n6 C22 :5
균주 Z; T588 ; D1827 -6 60.59 8.20 0.57 0.34 0.00 0.07
균주 Z; T588 ; D1827 -42 59.62 6.44 0.52 0.30 0.07 0.00
균주 Z; T588 ; D1827 -48 59.71 7.99 0.59 0.30 0.06 0.00
균주 Z; T588 ; D1827 -43 60.66 8.21 0.59 0.29 0.04 0.00
균주 Z; T588 ; D1827 -3 60.26 7.99 0.57 0.28 0.04 0.00
대조 균주 Z pH 7 57.81 7.15 0.59 0.19 0.04 0.06
대조 균주 Z pH 5 58.23 6.70 0.58 0.18 0.05 0.06
실시예 55: 이종 불포화효소 유전자의 발현에 의한 전체 불포화 지방산 수준의 상승
“제로 SAT FAT”(예를 들어, 전체 불포화 지방산 표적 97% 또는 포화 지방 3% 이상/이하) 균주를 생성하는 접근법의 하나는 균주 N과 같은 고올레산 균주에서 불포화효소를 발현시키는 것이며, 본 발명자들은 다수의 발효 실행에서 대략 93%로 전체 불포화물을 포함하는 약 85%의 C18:1을 생성한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 전체 포화물이 균주 N에서 불포화효소 유전자를 발현함으로써 추가로 감소될 것임을 예상한다.
하기 실시예에서, 본 발명자들은 올레아 유로파에아, 리시누스 콤무니스, 및 클로렐라 프로토테코이데스 유래 불포화효소를 포함하여 이종성 스테아로일-ACP 불포화효소의 과발현에 의해 야생형 균주 UTEX1435에서 스테아르산 및 팔미트산 수준을 감소시키는 능력을 입증하였다.
올레아 유로파에아 스테아로일 - ACP 불포화효소의 발현에 사용되는 작제물 : 오. 유로파에아 스테아로일-ACP 불포화효소(수탁 번호: AAB67840.1)를 UTEX1435, 즉 균주 A로 도입하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지아에 전화효소 유전자를 선택 마커로서 이용하여 수크로스 배지 상에서 성장하는 능력을 부여하였다. UTEX1435, 즉 균주 A에서 발현된 작제물은 6SA::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::CrTUB2:CpSADtp :OeSAD:CvNR::6SB로 기재될 수 있으며, pSZ1377이라고 한다.
작제물 pSZ1377에서 관련 제한 부위는 소문자, 볼드체 및 밑줄로 나타내어져 있으며, 각각 5'-3' BspQ 1, Kpn I, Xba I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Asc I, Cla I, Sac I, BspQ I이다. BspQI 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 볼드체의 소문자 서열은 상동성 재조합을 통해 6s 좌위에서 표적화된 통합을 허용하는 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, 효모 수크로스 전화효소 유전자의 발현을 구동하는 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. 전화효소를 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 OeSAD의 발현을 구동하는 제2의 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 박스 표시된 이탤릭체의 문자로 나타내어져 있다. OeSAD의 개시자 ATG 및 종결자 TGA 코돈은 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 스테아로일-ACP 불포화효소 암호화 영역의 나머지는 볼드의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일-ACP 불포화효소 수송 펩티드는 개시자 ATG 및 Asc I 부위 사이에 위치한다. 다시, 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 6S 게놈 영역은 볼드체의 소문자 문자로 나타내어져 있다.
pSZ 1377에 포함되는 형질전환시킨 DNA의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
리시누스 콤무니스 스테아로일 - ACP 불포화효소의 발현에 사용되는 작제물 : 리시누스 콤무니스 스테아로일-ACP 불포화효소(수탁 번호: AAA74692.1)를 UTEX1435, 즉 균주 A로 도입하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지아에 전화효소 유전자를 선택 마커로서 이용하여 수크로스 배지 상에서 성장하는 능력을 부여하였다. UTEX1435, 즉 균주 A에서 발현된 작제물은 6SA::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmAMT03:CpSADtp:RcSAD:CvNR::6SB로 기재될 수 있으며, pSZ1454라고 한다.
작제물 pSZ1454에서 관련 제한 부위는 소문자, 볼드체 및 밑줄로 나타내어져 있으며, 각각 5'-3' BspQ 1, Kpn I, Xba I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Asc I, Cla I, Sac I, BspQ I이다. BspQI 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 볼드체의 소문자 서열은 상동성 재조합을 통해 6s 좌위에서 표적화된 통합을 허용하는 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, 효모 수크로스 전화효소 유전자의 발현을 구동하는 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. 전화효소를 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 RcSAD의 발현을 구동하는 내인성 AMT03 프로모터는 박스 표시된 이탤릭체의 문자로 나타내어져 있다. RcSAD의 개시자 ATG 및 종결자 TGA 코돈은 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 스테아로일-ACP 불포화효소 암호화 영역의 나머지는 볼드의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일-ACP 불포화효소 수송 펩티드는 개시자 ATG 및 Asc I 부위 사이에 위치한다. 다시, 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 6S 게놈 영역은 볼드체의 소문자 문자로 나타내어져 있다.
pSZ1454에 포함되는 형질전환시킨 DNA의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일 -ACP 불포화효소의 발현에 사용되는 작제물 : 클로렐라 프로토테코이데스 스테아로일-ACP 불포화효소를 UTEX1435, 즉 균주 Z로 도입하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지아에 전화효소 유전자를 선택 마커로서 이용하여 수크로스 배지 상에서 성장하는 능력을 부여하였다. UTEX1435, 즉 균주 Z에서 발현된 작제물은 6SA::CrTUB2:ScSUC2:CvNR::PmAMT03:CpSAD1:CvNR::6SB로 기재될 수 있으며, pSZ3144라고 한다.
작제물 pSZ3144에서 관련 제한 부위는 소문자, 볼드체 및 밑줄로 나타내어져 있으며, 각각 5'-3' BspQ 1, Kpn I, Xba I, Mfe I, BamH I, EcoR I, Spe I, Cla I, Sac I, BspQ I이다. BspQI 부위는 형질전환시킨 DNA의 5' 및 3' 말단을 한정한다. 볼드체의 소문자 서열은 상동성 재조합을 통해 6s 좌위에서 표적화된 통합을 허용하는 게놈 DNA를 나타낸다. 5'에서 3' 방향으로 진행함으로써, 효모 수크로스 전화효소 유전자의 발현을 구동하는 씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터는 박스 표시된 문자로 나타내어져 있다. 전화효소를 위한 개시자 ATG 및 종결자 TGA는 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 암호화 영역은 소문자의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 CpSAD1의 발현을 구동하는 내인성 AMT03 프로모터는 박스 표시된 이탤릭체의 문자로 나타내어져 있다. CpSAD1의 개시자 ATG 및 종결자 TGA 코돈은 대문자의 볼드 이탤릭체로 나타내어져 있는 한편, 스테아로일-ACP 불포화효소 암호화 영역의 나머지는 볼드의 이탤릭체로 나타내어져 있다. 다시, 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR은 소문자의 밑줄친 문자로 나타내어져 있으며, 그 다음 6S 게놈 영역은 볼드체의 소문자 문자로 나타내어져 있다.
pSZ3144에 포함되는 형질전환시킨 DNA의 뉴클레오티드 서열:
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
결과: 일차 형질전환체를 클론정제하고, 불포화효소 유전자의 발현을 구동하는 프로모터에 따라서 저 질소 지질 생성 조건 하 pH5.0 또는 pH7.0에서 성장시켰다. pSZ1377(D583)을 이용한 형질전환으로 생기는 유전자이식 계통은, 피. 모리포르미스가 pH5.0에서 더 많은 지질을 생성한다는 사실 및 프로모터의 성질 때문에 pH5.0의 지질 생성 배지에서 분석하였다. pSZ1454(D648) 및 pSZ3144(D1923)의 형질전환으로 생기는 유전자이식 계통은 pH 조절 PmAMT3 프로모터에 의해 구동될 때 불포화효소 유전자의 최대 발현을 가능하게 하는 pH 7.0에서 분석한다. D583, D648, 및 D1923를 이용한 형질전환으로 생기는 대표적인 클론으로부터 생성된 프로파일은 각각 하기 표 59, 표 60 및 표 61에 나타내어져 있다. OeSAD 및 CpSAD1 유전자의 발현은 C18:1에서의 증가와 함께 C18:0 사슬 길이를 분명하게 감소시킨다. 또한 본 발명자들은 C16:1의 수준에서 미묘한 증가가 있다는 것을 주목하였는데, 이는 이들 스테아로일-ACP 불포화효소가 광범위한 특이성을 가질 수 있다는 것을 나타낸다. 형질전환체는 또한 C18:0의 수준에서의 감소, 및 C16:1에서의 상승하는 RcSAD 유전자의 발현으로 생성되었다. 그러나, C18:1 지방산의 수준에서의 하락 및 C18:2에서의 증가 또한 있으며, 이는 이들 유전자이식 계통의 성장 결함에 의해 야기될 수 있다. 고올레산 균주 S5587에서 이들 불포화효소 유전자의 영향이 결정될 것이다.
D583(pSZ1377) DNA를 이용한 형질전환으로 생기는 대표적인 클론의 지질 프로파일
샘플 ID C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2
D583 -25 19.20 1.53 1.15 64.08 11.76
D583 -10 21.86 0.99 1.77 61.43 11.42
D583 -3 21.94 0.95 1.85 62.22 10.53
D583 -33 20.76 0.95 1.85 61.76 12.17
D583 -26 20.18 0.92 1.89 62.56 11.97
D583 -1 21.28 0.95 1.90 62.63 10.94
S1331 25.48 0.71 3.23 59.70 8.25
D648(pSZ1454) DNA를 이용한 형질전환으로 생기는 대표적인 클론의 지질 프로파일
샘플 ID C16 :0 C16 :1 C18 :0 C18 :1 C18 :2
D648 -9 26.92 2.30 1.12 54.27 11.30
D648 -28 26.54 2.50 1.32 52.58 12.90
D648 -15 29.47 1.68 1.48 51.74 11.48
D648 -12 27.39 1.41 1.66 54.45 11.58
D648 -43 29.74 1.52 1.68 52.59 10.85
D648 -7 26.98 1.62 1.69 54.51 11.39
S1331 - pH7 25.86 0.96 2.84 58.33 9.16
D1923(pSZ3144) DNA를 이용한 형질전환으로 생기는 대표적인 클론의 지질 프로파일
샘플 ID C14 :0 C14 .1 C16 :0 C16 :1 C18 :0 C18 :1 C18 :2
블록 2; E2 ; pH7 ; 균주 Z; T613; D1923 -2 1.46 0.11 20.74 2.54 0.86 63.99 9.03
블록 2; G12 ; pH7 ; 균주 Z; T613; D1923 -36 1.52 0.10 25.20 1.97 1.67 61.10 7.38
블록 2; E8 ; pH7 ; 균주 Z; T613; D1923 -8 1.48 0.09 26.41 1.78 1.54 60.54 7.01
블록 2; F3; pH7 균주 Z; T613; D1923 -15 1.50 0.07 25.87 1.75 1.62 61.25 6.94
블록 2; F9; pH7 ; 균주 Z; T613; D1923 -21 1.47 0.07 27.02 1.73 1.84 60.15 6.55
블록 2; F4; pH7 ; 균주 Z; T613; D1923 -16 1.44 0.07 24.30 1.71 1.41 62.79 7.29
pH7 균주 Z 1.47 0.00 28.25 0.82 3.16 58.27 6.72
본 발명의 기재된 실시형태는 단지 예시적인 것으로 의도되며, 수많은 변화 및 변형이 당업자에게 명백할 것이다. 이와 같은 모든 변화 및 변형은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 예를 들어, 오일 또는 오일로 만든 화학 물질의 극성, 용해력, 및 발포 높이와 같은 파라미터를 조정하기 위하여, 중쇄 및 장쇄 지방산의 혼합물을 위해 다양한 트리글리세리드 오일이 맞추어질 수 있다. 추가적으로, 유전자의 녹아웃이 필요한 경우, RNAi 또는 안티센스와 같은 억제 물질의 돌연변이 및 발현을 포함하여 녹다운 기술을 사용하여 동등한 결과에 이를 수 있다.
서열목록
서열 번호 1
6S 5' 게놈 공여체 서열
Figure pct00081

서열 번호 2
6S 3' 게놈 공여체 서열
Figure pct00082

서열 번호 3
에스. 세레비지아에 전화효소 단백질 서열
Figure pct00083

서열 번호 4
피. 모리포르미스(UTEX 1435)에서의 발현을 위해 최적화된 에스. 세레비지아에 전화효소 단백질 암호화 서열
Figure pct00084

서열 번호 5
클라미도모나스 레인하르드티 TUB2(B-tub) 프로모터/5' UTR
Figure pct00085

서열 번호 6
클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR
Figure pct00086

서열 번호 7
씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5?TR 및 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR을 가지는 에스. 세레비지아에 suc2 유전자의 코돈 최적화된 발현 카세트의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00087
Figure pct00088

서열 번호 8
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) Amt03 프로모터
Figure pct00089

서열 번호 9
피. 모리포르미스에서의 발현을 위해 최적화된 클로렐라 프로토테코이데스(UTEX 250) 스테아로일 ACP 불포화효소 수송 펩티드 cDNA 서열 코돈.
Figure pct00090

서열 번호 10
쿠페아 라이티 FatB2 티오에스테라제 핵산 서열; Gen Bank 수탁 번호 U56104
Figure pct00091
Figure pct00092

서열 번호 11
쿠페아 라이티 FatB2 티오에스테라제 아미노산 서열; Gen Bank 수탁 번호 U56104
Figure pct00093

서열 번호 12
pSZ2046 유래 코쿠스 누시페라 C12:0 선호 LPAAT의 코돈 최적화된 암호화 영역
Figure pct00094

서열 번호 13
pLoop 5' 게놈 공여체 서열
Figure pct00095

서열 번호 14
pLoop 3' 게놈 공여체 서열
Figure pct00096
Figure pct00097

서열 번호 15
씨. 레인하르드티 β-튜불린 프로모터/5'UTR 및 씨. 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR포함하는 을 NeoR 발현 카세트
Figure pct00098

서열 번호 16
코코스 누시페라 1-아실-sn-글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(LPAAT)
Figure pct00099

서열 번호 17
pSZ1500
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102

서열 번호 18
5' FADc 게놈 영역 공여체 DNA
Figure pct00103

서열 번호 19
3' FADc 게놈 영역 공여체 DNA
Figure pct00104
Figure pct00105

서열 번호 20
작제물을 표적화하는 프로토테카 모리포르미스 FATA1 녹아웃 상동성 재조합의 5' 공여체 DNA 서열
Figure pct00106

서열 번호 21
작제물을 표적화하는 프로토테카 모리포르미스 FATA1 녹아웃 상동성 재조합의 3' 공여체 DNA 서열
Figure pct00107

서열 번호 22
클로렐라 프로토테코이데스 액틴 프로모터/5'UTR
Figure pct00108
Figure pct00109

서열 번호 23
클로렐라 프로토테코이데스 액틴 프로모터/5'UTR, 프로토테카 모리포르미스에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 아라비돕시스 탈리아나 THIC 단백질 암호화 서열, 및 클로렐라 불가리스 질산염 환원 효소 3' UTR을 포함하는 AtTHIC 발현 카세트
Figure pct00110
Figure pct00111

서열 번호 24
Figure pct00112

서열 번호 25
Figure pct00113

서열 번호 26
코돈 최적화된 프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) FAD2 단백질 암호화 서열
Figure pct00114
Figure pct00115

서열 번호 27
프로토테카 모리포르미스 FAD2의 아미노산 서열
Figure pct00116

서열 번호 28
pSZ1358 유래 브라시카 나푸스 C18:0 선호 티오에스테라제의 코돈 최적화 암호화 영역
Figure pct00117

서열 번호 29
브라시카 나푸스 C18:0 선호 티오에스테라제(수탁 번호 CAA52070.1)의 아미노산 서열
Figure pct00118

서열 번호 30
프로토테카 모리포르미스 FATA1 대립유전자 1 5' 상동성 공여체 영역
Figure pct00119

서열 번호 31
프로토테카 모리포르미스 FATA1 대립유전자 1 3' 상동성 공여체 영역
Figure pct00120

서열 번호 32
프로토테카 모리포르미스 FATA1 대립유전자 2 5' 상동성 공여체 영역
Figure pct00121

서열 번호 33
프로토테카 모리포르미스 FATA1 대립유전자 2 3' 상동성 공여체 영역
Figure pct00122

서열 번호 34
SAD2 헤어핀 C
Figure pct00123

서열 번호 35
Figure pct00124

서열 번호 36
Figure pct00125

서열 번호 37
카멜리나 사티바 오메가-3 FAD7-2
Figure pct00126

서열 번호 38
프로토테카 모리포르미스 델타 12 불포화효소 대립유전자 2
Figure pct00127

서열 번호 39
카멜리나 사티바 오메가-3 FAD7-1
Figure pct00128
Figure pct00129

서열 번호 40
PmFATA-hpB
Figure pct00130

서열 번호 41
PmFATA-hpC
Figure pct00131

서열 번호 42
PmFATA-hpD
Figure pct00132

서열 번호 43
PmFATA-hpE
Figure pct00133

서열 번호 44
PmFATA-hpF
Figure pct00134
Figure pct00135

서열 번호 45
PmFATA-hpG
Figure pct00136

서열 번호 46
코돈 최적화된 쿠페아 라이티 KASAI
Figure pct00137

서열 번호 47
피. 모리포르미스 SAD 수송 펩티드를 이용한 코돈 최적화된 쿠페아 라이티 KASAI
Figure pct00138
Figure pct00139

서열 번호 48
코돈 최적화된 쿠페아 풀체리마 KASIV
Figure pct00140

서열 번호 49
코돈 최적화된 쿠페아 후커리아나 KASIV
Figure pct00141
Figure pct00142

서열 번호 50
프로테카 모리포르미스(UTEX 1435) KAS1 대립유전자 1 5' 공여체 서열
Figure pct00143

서열 번호 51
프로테카 모리포르미스(UTEX 1435) KAS1 대립유전자 1 3' 공여체 서열
Figure pct00144

서열 번호 52
프로테카 모리포르미스(UTEX 1435) KAS1 대립유전자 2 5' 공여체 서열
Figure pct00145

서열 번호 53
프로테카 모리포르미스(UTEX 1435) KAS1 대립유전자 2 3' 공여체 서열
Figure pct00146

서열 번호 54
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) KASI-헤어핀 B
Figure pct00147

서열 번호 55
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) KASI-헤어핀 C
Figure pct00148

서열 번호 56
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) KASI-헤어핀 D
Figure pct00149

서열 번호 57
프로토테카 모리포르미스(UTEX 1435) KASI-헤어핀 E
Figure pct00150

서열 번호 58
코돈 최적화된 엠. 폴리모르파 FAE3(GenBank 수탁 번호 AAP74370)
Figure pct00151

서열 번호 59
엠. 폴리모르파 FAE3(GenBank 수탁 번호 AAP74370)
Figure pct00152

서열 번호 60
트립파노소마 브루세이 ELO3(GenBank 수탁번호 AAX70673)
Figure pct00153
Figure pct00154

서열 번호 61
트립파노소마 브루세이 ELO3(GenBank 수탁 번호 AAX70673)
Figure pct00155

서열 번호 62
코돈 최적화된 사카로마이세스 세레비지아에 ELO1(GenBank 수탁 번호 P39540)
Figure pct00156

서열 번호 63
사카로마이세스 세레비지아에 ELO1(GenBank 수탁 번호 P39540)
Figure pct00157

서열 번호 64
3X FLAG 태그를 포함하는 코돈 최적화된 브라시카 나푸스 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 수탁 번호 CAA52070)
Figure pct00158
Figure pct00159

서열 번호 65
3X FLAG 태그를 포함하는 브라시카 나푸스 아실-ACP 티오에스테라제(Genbank 수탁 번호 CAA52070)
Figure pct00160

서열 번호 66
UTEX 250 스테아로일-ACP 불포화효소(SAD) 엽록체 수송 펩티드 및 3X FLAG 태그를 포함하는 코돈 최적화된 브라시카 나푸스 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 수탁 번호 CAA52070)
Figure pct00161

서열 번호 67
UTEX 250 스테아로일-ACP 불포화효소(SAD) 엽록체 수송 펩티드 및 3X FLAG® 태그를 포함하는 브라시카 나푸스 아실-ACP 티오에스테라제(GenBank 수탁 번호 CAA52070)
Figure pct00162

서열 번호 68
UTEX 250 스테아로일-ACP 불포화효소(SAD) 엽록체 수송 펩티드 및 3X FLAG® 태그를 포함하는 코돈 최적화된 씨. 틴크토리우스 FATA(GenBank 수탁 번호 AAA33019)
Figure pct00163

서열 번호 69
UTEX 250 스테아로일-ACP 불포화효소(SAD) 엽록체 수송 펩티드를 포함하는 씨. 틴크토리우스 FATA(GenBank 수탁 번호 AAA33019)
Figure pct00164

서열 번호 70
3xFLAG 에피토프 태그를 포함하는 코돈 최적화된 알. 콤무니스(Genbank 수탁 번호 ABS30422)
Figure pct00165
Figure pct00166

서열 번호 71
3xFLAG® 에피토프 태그를 포함하는 알. 콤무니스 FATA(Genbank 수탁 번호 ABS30422)
Figure pct00167

서열 번호 72
3X FLAG® 에피토프 태그를 포함하는 코돈 최적화된 지. 망고스타나 FATA1(GenBank 수탁 번호 AAB51523)
Figure pct00168

서열 번호 73
3X FLAG® 에피토프 태그를 포함하는 지. 망고스타나 FATA1(GenBank 수탁 번호 AAB51523)
Figure pct00169

서열 번호 74
3X FLAG® 에피토프 태그를 포함하는 코돈 최적화된 테오브로마 카카오 FATA1
Figure pct00170
Figure pct00171

서열 번호 75
3X FLAG® 에피토프 태그를 포함하는 테오브로마 카카오 FATA1
Figure pct00172

서열 번호 76
UTEX 1439, UTEX 1441, UTEX 1435, UTEX 1437 프로토테카 모리포르미스
Figure pct00173

서열 번호 77
Cu PSR23 LPAAT2-1
Figure pct00174

서열 번호 78
CuPSR23 LPAAT3-1
Figure pct00175

서열 번호 79
CuPSR23 LPPATx를 위한 아미노산 서열:
Figure pct00176

서열 번호 80
CuPSR23 LPAATx 암호화 영역을 위한 cDNA 서열
Figure pct00177

서열 번호 81
CuPSR23 LPAAT 2-1 암호화 영역을 위한 cDNA 서열
Figure pct00178
Figure pct00179

서열 번호 82
CuPSR23 LPAAx 3-1 암호화 영역을 위한 cDNA 서열
Figure pct00180

서열 번호 83
프로토테카 모리포르미스를 위하여 코돈 최적화된 CuPSR23 LPAATx 암호화 영역을 위한 cDNA 서열
Figure pct00181

서열 번호 84
프로토테카 모리포르미스를 위하여 코돈 최적화된 CuPSR23 LPAAT 2-1 암호화 영역을 위한 cDNA 서열
Figure pct00182

서열 번호 85
프로토테카 모리포르미스를 위하여 코돈 최적화된 CuPSR23 LPAAx 3-1 암호화 영역을 위한 cDNA 서열
Figure pct00183

서열 번호 86
14:0-ACP 티오에스테라제, 씨. 프로토테코이데스 유래 확장된 이종성 수송 펩티드를 포함하는 쿠페아 팔루스트리스(Cpal FATB2, 수탁 번호 AAC49180) 및 작제물 D1481[pSZ2479]에서 천연 Cpal FATB2 서열로부터 유래한 41개의 아미노산 N-말단 확장물을 암호화하는 핵산 서열
Figure pct00184

서열 번호 87
14:0-ACP 티오에스테라제, 씨. 프로토테코이데스 유래 확장된 이종성 수송 펩티드를 포함하는 쿠페아 팔루스트리스(Cpal FATB2, 수탁 번호 AAC49180) 및 작제물 D1481[pSZ2479]에 의해 암호화된 천연 Cpal FATB2 서열로부터 유래한 41개의 아미노산 N-말단 확장물의 아미노산 서열
Figure pct00185

서열 번호 88
14:0-ACP 티오에스테라제, 씨. 프로토테코이데스 유래 확장된 이종성 수송 펩티드를 포함하는 쿠페아 팔루스트리스(Cpal FATB2, 수탁 번호 AAC49180) 및 작제물 D1482[pSZ2480]에서 천연 Cpal FATB2 서열로부터 유래한 41개의 아미노산 N-말단 확장물, 및 C-말단 FLAG 에피토프 태그를 암호화하는 핵산 서열
Figure pct00186

서열 번호 89
14:0-ACP 티오에스테라제, 씨. 프로토테코이데스 유래 확장된 이종성 수송 펩티드를 포함하는 쿠페아 팔루스트리스(Cpal FATB2, 수탁 번호 AAC49180), 천연 Cpal FATB2 서열로부터 유래한 41개의 아미노산 N-말단 확장물 및 작제물 D1482[pSZ2480]에 의해 암호화되는 C-말단 FLAG 에피토프 태그의 아미노산 서열
Figure pct00187
SEQUENCE LISTING <110> SOLAZYME, INC. <120> TAILORED OILS <130> 057518-432135 <140> PCT/US2013/037261 <141> 2013-04-18 <150> 61/809,213 <151> 2013-04-05 <150> 61/778,963 <151> 2013-03-13 <150> 61/769,678 <151> 2013-02-26 <150> 61/715,998 <151> 2012-10-19 <150> 61/679,026 <151> 2012-08-02 <150> 61/672,196 <151> 2012-07-16 <150> 61/655,469 <151> 2012-06-04 <150> 61/639,838 <151> 2012-04-27 <150> 61/635,285 <151> 2012-04-18 <160> 117 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 726 <212> DNA <213> Cuphea wrightii <400> 1 gctcttcgcc gccgccactc ctgctcgagc gcgcccgcgc gtgcgccgcc agcgccttgg 60 ccttttcgcc gcgctcgtgc gcgtcgctga tgtccatcac caggtccatg aggtctgcct 120 tgcgccggct gagccactgc ttcgtccggg cggccaagag gagcatgagg gaggactcct 180 ggtccagggt cctgacgtgg tcgcggctct gggagcgggc cagcatcatc tggctctgcc 240 gcaccgaggc cgcctccaac tggtcctcca gcagccgcag tcgccgccga ccctggcaga 300 ggaagacagg tgaggggggt atgaattgta cagaacaacc acgagccttg tctaggcaga 360 atccctacca gtcatggctt tacctggatg acggcctgcg aacagctgtc cagcgaccct 420 cgctgccgcc gcttctcccg cacgcttctt tccagcaccg tgatggcgcg agccagcgcc 480 gcacgctggc gctgcgcttc gccgatctga ggacagtcgg ggaactctga tcagtctaaa 540 cccccttgcg cgttagtgtt gccatccttt gcagaccggt gagagccgac ttgttgtgcg 600 ccacccccca caccacctcc tcccagacca attctgtcac ctttttggcg aaggcatcgg 660 cctcggcctg cagagaggac agcagtgccc agccgctggg ggttggcgga tgcacgctca 720 ggtacc 726 <210> 2 <211> 749 <212> DNA <213> Cuphea wrightii <400> 2 gagctccttg ttttccagaa ggagttgctc cttgagcctt tcattctcag cctcgataac 60 ctccaaagcc gctctaattg tggagggggt tcgaatttaa aagcttggaa tgttggttcg 120 tgcgtctgga acaagcccag acttgttgct cactgggaaa aggaccatca gctccaaaaa 180 acttgccgct caaaccgcgt acctctgctt tcgcgcaatc tgccctgttg aaatcgccac 240 cacattcata ttgtgacgct tgagcagtct gtaattgcct cagaatgtgg aatcatctgc 300 cccctgtgcg agcccatgcc aggcatgtcg cgggcgagga cacccgccac tcgtacagca 360 gaccattatg ctacctcaca atagttcata acagtgacca tatttctcga agctccccaa 420 cgagcacctc catgctctga gtggccaccc cccggccctg gtgcttgcgg agggcaggtc 480 aaccggcatg gggctaccga aatccccgac cggatcccac cacccccgcg atgggaagaa 540 tctctccccg ggatgtgggc ccaccaccag cacaacctgc tggcccaggc gagcgtcaaa 600 ccataccaca caaatatcct tggcatcggc cctgaattcc ttctgccgct ctgctacccg 660 gtgcttctgt ccgaagcagg ggttgctagg gatcgctccg agtccgcaaa cccttgtcgc 720 gtggcggggc ttgttcgagc ttgaagagc 749 <210> 3 <211> 532 <212> PRT <213> Saccharomyces cereviseae <400> 3 Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ile Ser Ala Ser Met Thr Asn Glu Thr Ser Asp Arg Pro Leu Val His 20 25 30 Phe Thr Pro Asn Lys Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Trp Tyr 35 40 45 Asp Glu Lys Asp Ala Lys Trp His Leu Tyr Phe Gln Tyr Asn Pro Asn 50 55 60 Asp Thr Val Trp Gly Thr Pro Leu Phe Trp Gly His Ala Thr Ser Asp 65 70 75 80 Asp Leu Thr Asn Trp Glu Asp Gln Pro Ile Ala Ile Ala Pro Lys Arg 85 90 95 Asn Asp Ser Gly Ala Phe Ser Gly Ser Met Val Val Asp Tyr Asn Asn 100 105 110 Thr Ser Gly Phe Phe Asn Asp Thr Ile Asp Pro Arg Gln Arg Cys Val 115 120 125 Ala Ile Trp Thr Tyr Asn Thr Pro Glu Ser Glu Glu Gln Tyr Ile Ser 130 135 140 Tyr Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Gln Lys Asn Pro 145 150 155 160 Val Leu Ala Ala Asn Ser Thr Gln Phe Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp 165 170 175 Tyr Glu Pro Ser Gln Lys Trp Ile Met Thr Ala Ala Lys Ser Gln Asp 180 185 190 Tyr Lys Ile Glu Ile Tyr Ser Ser Asp Asp Leu Lys Ser Trp Lys Leu 195 200 205 Glu Ser Ala Phe Ala Asn Glu Gly Phe Leu Gly Tyr Gln Tyr Glu Cys 210 215 220 Pro Gly Leu Ile Glu Val Pro Thr Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Tyr 225 230 235 240 Trp Val Met Phe Ile Ser Ile Asn Pro Gly Ala Pro Ala Gly Gly Ser 245 250 255 Phe Asn Gln Tyr Phe Val Gly Ser Phe Asn Gly Thr His Phe Glu Ala 260 265 270 Phe Asp Asn Gln Ser Arg Val Val Asp Phe Gly Lys Asp Tyr Tyr Ala 275 280 285 Leu Gln Thr Phe Phe Asn Thr Asp Pro Thr Tyr Gly Ser Ala Leu Gly 290 295 300 Ile Ala Trp Ala Ser Asn Trp Glu Tyr Ser Ala Phe Val Pro Thr Asn 305 310 315 320 Pro Trp Arg Ser Ser Met Ser Leu Val Arg Lys Phe Ser Leu Asn Thr 325 330 335 Glu Tyr Gln Ala Asn Pro Glu Thr Glu Leu Ile Asn Leu Lys Ala Glu 340 345 350 Pro Ile Leu Asn Ile Ser Asn Ala Gly Pro Trp Ser Arg Phe Ala Thr 355 360 365 Asn Thr Thr Leu Thr Lys Ala Asn Ser Tyr Asn Val Asp Leu Ser Asn 370 375 380 Ser Thr Gly Thr Leu Glu Phe Glu Leu Val Tyr Ala Val Asn Thr Thr 385 390 395 400 Gln Thr Ile Ser Lys Ser Val Phe Ala Asp Leu Ser Leu Trp Phe Lys 405 410 415 Gly Leu Glu Asp Pro Glu Glu Tyr Leu Arg Met Gly Phe Glu Val Ser 420 425 430 Ala Ser Ser Phe Phe Leu Asp Arg Gly Asn Ser Lys Val Lys Phe Val 435 440 445 Lys Glu Asn Pro Tyr Phe Thr Asn Arg Met Ser Val Asn Asn Gln Pro 450 455 460 Phe Lys Ser Glu Asn Asp Leu Ser Tyr Tyr Lys Val Tyr Gly Leu Leu 465 470 475 480 Asp Gln Asn Ile Leu Glu Leu Tyr Phe Asn Asp Gly Asp Val Val Ser 485 490 495 Thr Asn Thr Tyr Phe Met Thr Thr Gly Asn Ala Leu Gly Ser Val Asn 500 505 510 Met Thr Thr Gly Val Asp Asn Leu Phe Tyr Ile Asp Lys Phe Gln Val 515 520 525 Arg Glu Val Lys 530 <210> 4 <211> 1599 <212> DNA <213> Saccharomyces cereviseae <400> 4 atgctgctgc aggccttcct gttcctgctg gccggcttcg ccgccaagat cagcgcctcc 60 atgacgaacg agacgtccga ccgccccctg gtgcacttca cccccaacaa gggctggatg 120 aacgacccca acggcctgtg gtacgacgag aaggacgcca agtggcacct gtacttccag 180 tacaacccga acgacaccgt ctgggggacg cccttgttct ggggccacgc cacgtccgac 240 gacctgacca actgggagga ccagcccatc gccatcgccc cgaagcgcaa cgactccggc 300 gccttctccg gctccatggt ggtggactac aacaacacct ccggcttctt caacgacacc 360 atcgacccgc gccagcgctg cgtggccatc tggacctaca acaccccgga gtccgaggag 420 cagtacatct cctacagcct ggacggcggc tacaccttca ccgagtacca gaagaacccc 480 gtgctggccg ccaactccac ccagttccgc gacccgaagg tcttctggta cgagccctcc 540 cagaagtgga tcatgaccgc ggccaagtcc caggactaca agatcgagat ctactcctcc 600 gacgacctga agtcctggaa gctggagtcc gcgttcgcca acgagggctt cctcggctac 660 cagtacgagt gccccggcct gatcgaggtc cccaccgagc aggaccccag caagtcctac 720 tgggtgatgt tcatctccat caaccccggc gccccggccg gcggctcctt caaccagtac 780 ttcgtcggca gcttcaacgg cacccacttc gaggccttcg acaaccagtc ccgcgtggtg 840 gacttcggca aggactacta cgccctgcag accttcttca acaccgaccc gacctacggg 900 agcgccctgg gcatcgcgtg ggcctccaac tgggagtact ccgccttcgt gcccaccaac 960 ccctggcgct cctccatgtc cctcgtgcgc aagttctccc tcaacaccga gtaccaggcc 1020 aacccggaga cggagctgat caacctgaag gccgagccga tcctgaacat cagcaacgcc 1080 ggcccctgga gccggttcgc caccaacacc acgttgacga aggccaacag ctacaacgtc 1140 gacctgtcca acagcaccgg caccctggag ttcgagctgg tgtacgccgt caacaccacc 1200 cagacgatct ccaagtccgt gttcgcggac ctctccctct ggttcaaggg cctggaggac 1260 cccgaggagt acctccgcat gggcttcgag gtgtccgcgt cctccttctt cctggaccgc 1320 gggaacagca aggtgaagtt cgtgaaggag aacccctact tcaccaaccg catgagcgtg 1380 aacaaccagc ccttcaagag cgagaacgac ctgtcctact acaaggtgta cggcttgctg 1440 gaccagaaca tcctggagct gtacttcaac gacggcgacg tcgtgtccac caacacctac 1500 ttcatgacca ccgggaacgc cctgggctcc gtgaacatga cgacgggggt ggacaacctg 1560 ttctacatcg acaagttcca ggtgcgcgag gtcaagtga 1599 <210> 5 <211> 312 <212> DNA <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 5 ctttcttgcg ctatgacact tccagcaaaa ggtagggcgg gctgcgagac ggcttcccgg 60 cgctgcatgc aacaccgatg atgcttcgac cccccgaagc tccttcgggg ctgcatgggc 120 gctccgatgc cgctccaggg cgagcgctgt ttaaatagcc aggcccccga ttgcaaagac 180 attatagcga gctaccaaag ccatattcaa acacctagat cactaccact tctacacagg 240 ccactcgagc ttgtgatcgc actccgctaa gggggcgcct cttcctcttc gtttcagtca 300 caacccgcaa ac 312 <210> 6 <211> 408 <212> DNA <213> Chlorella vulgaris <400> 6 gcagcagcag ctcggatagt atcgacacac tctggacgct ggtcgtgtga tggactgttg 60 ccgccacact tgctgccttg acctgtgaat atccctgccg cttttatcaa acagcctcag 120 tgtgtttgat cttgtgtgta cgcgcttttg cgagttgcta gctgcttgtg ctatttgcga 180 ataccacccc cagcatcccc ttccctcgtt tcatatcgct tgcatcccaa ccgcaactta 240 tctacgctgt cctgctatcc ctcagcgctg ctcctgctcc tgctcactgc ccctcgcaca 300 gccttggttt gggctccgcc tgtattctcc tggtactgca acctgtaaac cagcactgca 360 atgctgatgc acgggaagta gtgggatggg aacacaaatg gaaagctt 408 <210> 7 <211> 2333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 7 ctttcttgcg ctatgacact tccagcaaaa ggtagggcgg gctgcgagac ggcttcccgg 60 cgctgcatgc aacaccgatg atgcttcgac cccccgaagc tccttcgggg ctgcatgggc 120 gctccgatgc cgctccaggg cgagcgctgt ttaaatagcc aggcccccga ttgcaaagac 180 attatagcga gctaccaaag ccatattcaa acacctagat cactaccact tctacacagg 240 ccactcgagc ttgtgatcgc actccgctaa gggggcgcct cttcctcttc gtttcagtca 300 caacccgcaa acggcgcgcc atgctgctgc aggccttcct gttcctgctg gccggcttcg 360 ccgccaagat cagcgcctcc atgacgaacg agacgtccga ccgccccctg gtgcacttca 420 cccccaacaa gggctggatg aacgacccca acggcctgtg gtacgacgag aaggacgcca 480 agtggcacct gtacttccag tacaacccga acgacaccgt ctgggggacg cccttgttct 540 ggggccacgc cacgtccgac gacctgacca actgggagga ccagcccatc gccatcgccc 600 cgaagcgcaa cgactccggc gccttctccg gctccatggt ggtggactac aacaacacct 660 ccggcttctt caacgacacc atcgacccgc gccagcgctg cgtggccatc tggacctaca 720 acaccccgga gtccgaggag cagtacatct cctacagcct ggacggcggc tacaccttca 780 ccgagtacca gaagaacccc gtgctggccg ccaactccac ccagttccgc gacccgaagg 840 tcttctggta cgagccctcc cagaagtgga tcatgaccgc ggccaagtcc caggactaca 900 agatcgagat ctactcctcc gacgacctga agtcctggaa gctggagtcc gcgttcgcca 960 acgagggctt cctcggctac cagtacgagt gccccggcct gatcgaggtc cccaccgagc 1020 aggaccccag caagtcctac tgggtgatgt tcatctccat caaccccggc gccccggccg 1080 gcggctcctt caaccagtac ttcgtcggca gcttcaacgg cacccacttc gaggccttcg 1140 acaaccagtc ccgcgtggtg gacttcggca aggactacta cgccctgcag accttcttca 1200 acaccgaccc gacctacggg agcgccctgg gcatcgcgtg ggcctccaac tgggagtact 1260 ccgccttcgt gcccaccaac ccctggcgct cctccatgtc cctcgtgcgc aagttctccc 1320 tcaacaccga gtaccaggcc aacccggaga cggagctgat caacctgaag gccgagccga 1380 tcctgaacat cagcaacgcc ggcccctgga gccggttcgc caccaacacc acgttgacga 1440 aggccaacag ctacaacgtc gacctgtcca acagcaccgg caccctggag ttcgagctgg 1500 tgtacgccgt caacaccacc cagacgatct ccaagtccgt gttcgcggac ctctccctct 1560 ggttcaaggg cctggaggac cccgaggagt acctccgcat gggcttcgag gtgtccgcgt 1620 cctccttctt cctggaccgc gggaacagca aggtgaagtt cgtgaaggag aacccctact 1680 tcaccaaccg catgagcgtg aacaaccagc ccttcaagag 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180 gaggcaagag cgcccgggtc agttgaaggg ctttacgcgc aaggtacagc cgctcctgca 240 aggctgcgtg gtggaattgg acgtgcaggt cctgctgaag ttcctccacc gcctcaccag 300 cggacaaagc accggtgtat caggtccgtg tcatccactc taaagagctc gactacgacc 360 tactgatggc cctagattct tcatcaaaaa cgcctgagac acttgcccag gattgaaact 420 ccctgaaggg accaccaggg gccctgagtt gttccttccc cccgtggcga gctgccagcc 480 aggctgtacc tgtgatcgag gctggcggga aaataggctt cgtgtgctca ggtcatggga 540 ggtgcaggac agctcatgaa acgccaacaa tcgcacaatt catgtcaagc taatcagcta 600 tttcctcttc acgagctgta attgtcccaa aattctggtc taccgggggt gatccttcgt 660 gtacgggccc ttccctcaac cctaggtatg cgcgcatgcg gtcgccgcgc aactcgcgcg 720 agggccgagg gtttgggacg ggccgtcccg aaatgcagtt gcacccggat gcgtggcacc 780 ttttttgcga taatttatgc aatggactgc tctgcaaaat tctggctctg tcgccaaccc 840 taggatcagc ggcgtaggat ttcgtaatca ttcgtcctga tggggagcta ccgactaccc 900 taatatcagc ccgactgcct gacgccagcg tccacttttg tgcacacatt ccattcgtgc 960 ccaagacatt tcattgtggt gcgaagcgtc cccagttacg ctcacctgtt tcccgacctc 1020 cttactgttc tgtcgacaga gcgggcccac aggccggtcg cagcc 1065 <210> 9 <211> 120 <212> DNA <213> Chlorella protothecoides <400> 9 actagtatgg ccaccgcatc cactttctcg gcgttcaatg cccgctgcgg cgacctgcgt 60 cgctcggcgg gctccgggcc ccggcgccca gcgaggcccc tccccgtgcg cgggcgcgcc 120 <210> 10 <211> 1236 <212> DNA <213> Cuphea wrightii <400> 10 atggtggtgg ccgccgccgc cagcagcgcc ttcttccccg tgcccgcccc ccgccccacc 60 cccaagcccg gcaagttcgg caactggccc agcagcctga gccagccctt caagcccaag 120 agcaacccca acggccgctt ccaggtgaag gccaacgtga gcccccacgg gcgcgccccc 180 aaggccaacg gcagcgccgt gagcctgaag tccggcagcc tgaacaccct ggaggacccc 240 cccagcagcc cccccccccg caccttcctg aaccagctgc ccgactggag ccgcctgcgc 300 accgccatca ccaccgtgtt cgtggccgcc gagaagcagt tcacccgcct ggaccgcaag 360 agcaagcgcc ccgacatgct ggtggactgg ttcggcagcg agaccatcgt gcaggacggc 420 ctggtgttcc gcgagcgctt cagcatccgc agctacgaga tcggcgccga ccgcaccgcc 480 agcatcgaga ccctgatgaa ccacctgcag gacaccagcc tgaaccactg caagagcgtg 540 ggcctgctga acgacggctt cggccgcacc cccgagatgt gcacccgcga 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Lys Ser Asn Pro Asn Gly Arg Phe Gln 35 40 45 Val Lys Ala Asn Val Ser Pro His Pro Lys Ala Asn Gly Ser Ala Val 50 55 60 Ser Leu Lys Ser Gly Ser Leu Asn Thr Leu Glu Asp Pro Pro Ser Ser 65 70 75 80 Pro Pro Pro Arg Thr Phe Leu Asn Gln Leu Pro Asp Trp Ser Arg Leu 85 90 95 Arg Thr Ala Ile Thr Thr Val Phe Val Ala Ala Glu Lys Gln Phe Thr 100 105 110 Arg Leu Asp Arg Lys Ser Lys Arg Pro Asp Met Leu Val Asp Trp Phe 115 120 125 Gly Ser Glu Thr Ile Val Gln Asp Gly Leu Val Phe Arg Glu Arg Phe 130 135 140 Ser Ile Arg Ser Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Thr Ala Ser Ile Glu 145 150 155 160 Thr Leu Met Asn His Leu Gln Asp Thr Ser Leu Asn His Cys Lys Ser 165 170 175 Val Gly Leu Leu Asn Asp Gly Phe Gly Arg Thr Pro Glu Met Cys Thr 180 185 190 Arg Asp Leu Ile Trp Val Leu Thr Lys Met Gln Ile Val Val Asn Arg 195 200 205 Tyr Pro Thr Trp Gly Asp Thr Val Glu Ile Asn Ser Trp Phe Ser Gln 210 215 220 Ser Gly Lys Ile Gly Met Gly Arg Glu Trp Leu Ile Ser Asp Cys Asn 225 230 235 240 Thr Gly Glu Ile Leu Val Arg Ala Thr Ser 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gaccgctgga tcaccgtgat cctgtccgtg 180 gtgcgcatcg ccgcctgctt cctgtccatg atggtgacca ccatcgtgtg gaacatgatc 240 atgctgatcc tgctgccctg gccctacgcc cgcatccgcc agggcaacct gtacggccac 300 gtgaccggcc gcatgctgat gtggattctg ggcaacccca tcaccatcga gggctccgag 360 ttctccaaca cccgcgccat ctacatctgc aaccacgcct ccctggtgga catcttcctg 420 atcatgtggc tgatccccaa gggcaccgtg accatcgcca agaaggagat catctggtat 480 cccctgttcg gccagctgta cgtgctggcc aaccaccagc gcatcgaccg ctccaacccc 540 tccgccgcca tcgagtccat caaggaggtg gcccgcgccg tggtgaagaa gaacctgtcc 600 ctgatcatct tccccgaggg cacccgctcc aagaccggcc gcctgctgcc cttcaagaag 660 ggcttcatcc acatcgccct ccagacccgc ctgcccatcg tgccgatggt gctgaccggc 720 acccacctgg cctggcgcaa gaactccctg cgcgtgcgcc ccgcccccat caccgtgaag 780 tacttctccc ccatcaagac cgacgactgg gaggaggaga agatcaacca ctacgtggag 840 atgatccacg ccctgtacgt ggaccacctg cccgagtccc agaagcccct ggtgtccaag 900 ggccgcgacg cctccggccg ctccaactcc tga 933 <210> 13 <211> 563 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 gctcttcgct aacggaggtc tgtcaccaaa tggaccccgt ctattgcggg aaaccacggc 60 gatggcacgt ttcaaaactt gatgaaatac aatattcagt atgtcgcggg cggcgacggc 120 ggggagctga tgtcgcgctg ggtattgctt aatcgccagc ttcgcccccg tcttggcgcg 180 aggcgtgaac aagccgaccg atgtgcacga gcaaatcctg acactagaag ggctgactcg 240 cccggcacgg ctgaattaca caggcttgca aaaataccag aatttgcacg caccgtattc 300 gcggtatttt gttggacagt gaatagcgat gcggcaatgg cttgtggcgt tagaaggtgc 360 gacgaaggtg gtgccaccac tgtgccagcc agtcctggcg gctcccaggg ccccgatcaa 420 gagccaggac atccaaacta cccacagcat caacgccccg gcctatactc gaaccccact 480 tgcactctgc aatggtatgg gaaccacggg gcagtcttgt gtgggtcgcg cctatcgcgg 540 tcggcgaaga ccgggaaggt acc 563 <210> 14 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 14 gagctcagcg gcgacggtcc tgctaccgta cgacgttggg cacgcccatg aaagtttgta 60 taccgagctt gttgagcgaa ctgcaagcgc ggctcaagga tacttgaact cctggattga 120 tatcggtcca ataatggatg gaaaatccga acctcgtgca agaactgagc aaacctcgtt 180 acatggatgc acagtcgcca gtccaatgaa cattgaagtg agcgaactgt tcgcttcggt 240 ggcagtacta ctcaaagaat gagctgctgt taaaaatgca ctctcgttct ctcaagtgag 300 tggcagatga gtgctcacgc cttgcacttc gctgcccgtg tcatgccctg cgccccaaaa 360 tttgaaaaaa gggatgagat tattgggcaa tggacgacgt cgtcgctccg ggagtcagga 420 ccggcggaaa ataagaggca acacactccg cttcttagct cttcc 465 <210> 15 <211> 1533 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 15 ctttcttgcg ctatgacact tccagcaaaa ggtagggcgg gctgcgagac ggcttcccgg 60 cgctgcatgc aacaccgatg atgcttcgac cccccgaagc tccttcgggg ctgcatgggc 120 gctccgatgc cgctccaggg cgagcgctgt ttaaatagcc aggcccccga ttgcaaagac 180 attatagcga gctaccaaag ccatattcaa acacctagat cactaccact tctacacagg 240 ccactcgagc ttgtgatcgc actccgctaa gggggcgcct cttcctcttc gtttcagtca 300 caacccgcaa actctagaat atcaatgatc gagcaggacg gcctccacgc cggctccccc 360 gccgcctggg tggagcgcct gttcggctac gactgggccc 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<400> 17 gggctggtct gaatccttca ggcgggtgtt acccgagaaa gaaagggtgc cgatttcaaa 60 gcagacccat gtgccgggcc ctgtggcctg tgttggcgcc tatgtagtca ccccccctca 120 cccaattgtc gccagtttgc gcactccata aactcaaaac agcagcttct gagctgcgct 180 gttcaagaac acctctgggg tttgctcacc cgcgaggtcg acgcccagca tggctatcaa 240 gacgaacagg cagcctgtgg agaagcctcc gttcacgatc gggacgctgc gcaaggccat 300 ccccgcgcac tgtttcgagc gctcggcgct tcgtagcagc atgtacctgg cctttgacat 360 cgcggtcatg tccctgctct acgtcgcgtc gacgtacatc gaccctgcac cggtgcctac 420 gtgggtcaag tacggcatca tgtggccgct ctactggttc ttccaggtgt gtttgagggt 480 tttggttgcc cgtattgagg tcctggtggc gcgcatggag gagaaggcgc ctgtcccgct 540 gacccccccg gctaccctcc cggcaccttc cagggcgcct tcggcacggg tgtctgggtg 600 tgcgcgcacg agtgcggcca ccaggccttt tcctccagcc aggccatcaa cgacggcgtg 660 ggcctggtgt tccacagcct gctgctggtg ccctactact cctggaagca ctcgcaccgg 720 gtaccctttc ttgcgctatg acacttccag caaaaggtag ggcgggctgc gagacggctt 780 cccggcgctg catgcaacac cgatgatgct tcgacccccc gaagctcctt cggggctgca 840 tgggcgctcc 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 gggctggtct gaatccttca ggcgggtgtt acccgagaaa gaaagggtgc cgatttcaaa 60 gcagacccat gtgccgggcc ctgtggcctg tgttggcgcc tatgtagtca ccccccctca 120 cccaattgtc gccagtttgc gcactccata aactcaaaac agcagcttct gagctgcgct 180 gttcaagaac acctctgggg tttgctcacc cgcgaggtcg acgcccagca tggctatcaa 240 gacgaacagg cagcctgtgg agaagcctcc gttcacgatc gggacgctgc gcaaggccat 300 ccccgcgcac tgtttcgagc gctcggcgct tcgtagcagc atgtacctgg cctttgacat 360 cgcggtcatg tccctgctct acgtcgcgtc gacgtacatc gaccctgcac cggtgcctac 420 gtgggtcaag tacggcatca tgtggccgct ctactggttc ttccaggtgt gtttgagggt 480 tttggttgcc cgtattgagg tcctggtggc gcgcatggag gagaaggcgc ctgtcccgct 540 gacccccccg gctaccctcc cggcaccttc cagggcgcct tcggcacggg tgtctgggtg 600 tgcgcgcacg agtgcggcca ccaggccttt tcctccagcc aggccatcaa cgacggcgtg 660 ggcctggtgt tccacagcct gctgctggtg ccctactact cctggaagca ctcgcaccg 719 <210> 19 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 19 ccgccaccac tccaacacgg ggtgcctgga caaggacgag gtgtttgtgc cgccgcaccg 60 cgcagtggcg cacgagggcc tggagtggga ggagtggctg cccatccgca tgggcaaggt 120 gctggtcacc ctgaccctgg gctggccgct gtacctcatg ttcaacgtcg cctcgcggcc 180 gtacccgcgc ttcgccaacc actttgaccc gtggtcgccc atcttcagca agcgcgagcg 240 catcgaggtg gtcatctccg acctggcgct ggtggcggtg ctcagcgggc tcagcgtgct 300 gggccgcacc atgggctggg cctggctggt caagacctac gtggtgccct acctgatcgt 360 gaacatgtgg ctcgtgctca tcacgctgct ccagcacacg cacccggcgc tgccgcacta 420 cttcgagaag gactgggact ggctgcgcgg cgccatggcc accgtggacc gctccatggg 480 cccgcccttc atggacaaca tcctgcacca catctccgac acccacgtgc tgcaccacct 540 cttcagcacc atcccgcact accacgccga ggaggcctcc gccgccatca ggcccatcct 600 gggcaagtac taccagtccg acagccgctg ggtcggccgc gccctgtggg aggactggcg 660 cgactgccgc tacgtcgtcc cggacgcgcc cgaggacgac tccgcgctct ggttccacaa 720 gtgagtgagt ga 732 <210> 20 <211> 612 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 20 gctcttcgga gtcactgtgc cactgagttc gactggtagc tgaatggagt cgctgctcca 60 ctaaacgaat tgtcagcacc gccagccggc cgaggacccg agtcatagcg agggtagtag 120 cgcgccatgg caccgaccag cctgcttgcc agtactggcg tctcttccgc ttctctgtgg 180 tcctctgcgc gctccagcgc gtgcgctttt ccggtggatc atgcggtccg tggcgcaccg 240 cagcggccgc tgcccatgca gcgccgctgc ttccgaacag tggcggtcag ggccgcaccc 300 gcggtagccg tccgtccgga acccgcccaa gagttttggg agcagcttga gccctgcaag 360 atggcggagg acaagcgcat cttcctggag gagcaccggt gcgtggaggt ccggggctga 420 ccggccgtcg cattcaacgt aatcaatcgc atgatgatca gaggacacga agtcttggtg 480 gcggtggcca gaaacactgt ccattgcaag ggcataggga tgcgttcctt cacctctcat 540 ttctcatttc tgaatccctc cctgctcact ctttctcctc ctccttcccg ttcacgcagc 600 attcggggta cc 612 <210> 21 <211> 528 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 21 gacagggtgg ttggctggat ggggaaacgc tggtcgcggg attcgatcct gctgcttata 60 tcctccctgg aagcacaccc 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 agtttaggtc cagcgtccgt ggggggggac gggctgggag cttgggccgg gaagggcaag 60 acgatgcagt ccctctgggg agtcacagcc gactgtgtgt gttgcactgt gcggcccgca 120 gcactcacac gcaaaatgcc tggccgacag gcaggccctg tccagtgcaa catccacggt 180 ccctctcatc aggctcacct tgctcattga cataacggaa tgcgtaccgc tctttcagat 240 ctgtccatcc agagagggga gcaggctccc caccgacgct gtcaaacttg cttcctgccc 300 aaccgaaaac attattgttt gagggggggg gggggggggc agattgcatg gcgggatatc 360 tcgtgaggaa catcactggg acactgtgga acacagtgag tgcagtatgc agagcatgta 420 tgctaggggt cagcgcagga agggggcctt tcccagtctc ccatgccact gcaccgtatc 480 cacgactcac caggaccagc ttcttgatcg gcttccgctc ccgtggacac cagtgtgtag 540 cctctggact ccaggtatgc gtgcaccgca aaggccagcc gatcgtgccg attcctgggg 600 tggaggatat gagtcagcca acttggggct cagagtgcac actggggcac gatacgaaac 660 aacatctaca ccgtgtcctc catgctgaca caccacagct tcgctccacc tgaatgtggg 720 cgcatgggcc cgaatcacag ccaatgtcgc tgctgccata 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cgagatggac tacaaggacc acgacggcga ctacaaggac 1440 cacgacatcg actacaagga cgacgacgac aagtga 1476 <210> 25 <211> 491 <212> PRT <213> Protetheca moriformis <400> 25 Met Ala Thr Ala Ser Thr Phe Ser Ala Phe Asn Ala Arg Cys Gly Asp 1 5 10 15 Leu Arg Arg Ser Ala Gly Ser Gly Pro Arg Arg Pro Ala Arg Pro Leu 20 25 30 Pro Val Arg Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala Asn Pro Ala Arg 35 40 45 Pro Glu Arg Arg Val Val Ile Thr Gly Gln Gly Val Val Thr Ser Leu 50 55 60 Gly Gln Thr Ile Glu Gln Phe Tyr Ser Ser Leu Leu Glu Gly Val Ser 65 70 75 80 Gly Ile Ser Gln Ile Gln Lys Phe Asp Thr Thr Gly Tyr Thr Thr Thr 85 90 95 Ile Ala Gly Glu Ile Lys Ser Leu Gln Leu Asp Pro Tyr Val Pro Lys 100 105 110 Arg Trp Ala Lys Arg Val Asp Asp Val Ile Lys Tyr Val Tyr Ile Ala 115 120 125 Gly Lys Gln Ala Leu Glu Ser Ala Gly Leu Pro Ile Glu Ala Ala Gly 130 135 140 Leu Ala Gly Ala Gly Leu Asp Pro Ala Leu Cys Gly Val Leu Ile Gly 145 150 155 160 Thr Ala Met Ala Gly Met Thr Ser Phe Ala Ala Gly Val Glu Ala Leu 165 170 175 Thr Arg Gly 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moriformis <400> 30 ggagtcactg tgccactgag ttcgactggt agctgaatgg agtcgctgct ccactaaacg 60 aattgtcagc accgccagcc ggccgaggac ccgagtcata gcgagggtag tagcgcgcca 120 tggcaccgac cagcctgctt gccagtactg gcgtctcttc cgcttctctg tggtcctctg 180 cgcgctccag cgcgtgcgct tttccggtgg atcatgcggt ccgtggcgca ccgcagcggc 240 cgctgcccat gcagcgccgc tgcttccgaa cagtggcggt cagggccgca cccgcggtag 300 ccgtccgtcc ggaacccgcc caagagtttt gggagcagct tgagccctgc aagatggcgg 360 aggacaagcg catcttcctg gaggagcacc ggtgcgtgga ggtccggggc tgaccggccg 420 tcgcattcaa cgtaatcaat cgcatgatga tcagaggaca cgaagtcttg gtggcggtgg 480 ccagaaacac tgtccattgc aagggcatag ggatgcgttc cttcacctct catttctcat 540 ttctgaatcc ctccctgctc actctttctc ctcctccttc ccgttcacgc agcattcgg 599 <210> 31 <211> 521 <212> DNA <213> Prototheca moriformis <400> 31 gacagggtgg ttggctggat ggggaaacgc tggtcgcggg attcgatcct gctgcttata 60 tcctccctgg aagcacaccc acgactctga agaagaaaac gtgcacacac acaacccaac 120 cggccgaata tttgcttcct tatcccgggt ccaagagaga ctgcgatgcc cccctcaatc 180 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agtgggtggc cgaggagaac cggcacggcg acctgctgaa 60 caagtactgt tggctgacgg ggcgcgtcaa catgcgggcc gtggaggtga ccatcaacaa 120 cctgatcaag agcggcatga acccgcagac ggacaacaac ccttacttgg gcttcgtcta 180 cacctccttc caggagcgcg cgaccaagta cagccacggc aacaccgcgc gccttgcggc 240 cgagcagtgt gtttgagggt tttggttgcc cgtatcgagg tcctggtggc gcgcatgggg 300 gagaaggcgc ctgtcccgct gacccccccg gctaccctcc cggcaccttc cagggcgcgt 360 acgggatcct gctcggccgc aaggcgcgcg gtgttgccgt ggctgtactt ggtcgcgcgc 420 tcctggaagg aggtgtagac gaagcccaag taagggttgt tgtccgtctg cgggttcatg 480 ccgctcttga tcaggttgtt gatggtcacc tccacggccc gcatgttgac gcgccccgtc 540 agccaacagt acttgttcag caggtcgccg tgccggttct cctcggccac ccactgccgc 600 gtccagcgca agctt 615 <210> 35 <211> 452 <212> PRT <213> Prototheca moriformis <400> 35 Met Ser Ile Gln Phe Ala Leu Arg Ala Ala Tyr Ile Lys Gly Thr Cys 1 5 10 15 Gln Arg Leu Ser Gly Arg Gly Ala Ala Leu Gly Leu Ser Arg Asp Trp 20 25 30 Thr Pro Gly Trp Thr Leu Pro Arg Cys Trp Pro Ala Ser Ala Ala Ala 35 40 45 Thr Ala Pro Pro 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gcgagtgggt gctgcgcgac aagctgaccg 60 gcgaggcgct gggcgcggcc acctcgagct gggtcatgat caacatccgc acgcgccggc 120 cgtgccgcat gccgggtgtg tttgagggtt ttggttgccc gtatcgaggt cctggtggcg 180 cgcatggggg agaaggcgcc tgtcccgctg acccccccgg ctaccctccc ggcaccttcc 240 agggcgcgta cgggatcccc ggcatgcggc acggccggcg cgtgcggatg ttgatcatga 300 cccagctcga ggtggccgcg cccagcgcct cgccggtcag cttgtcgcgc agcacccact 360 cgcgctgcgc gcccagcttg cccgccgaag ctt 393 <210> 43 <211> 517 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 43 actagtgtcc gcgtcaagtc ggccttcttc gcgcgcgagc cgccgcgcct ggcgctgccg 60 cccgcggtca cgcgtgccaa gctgcccaac atcgcgacgc cggcgccgct gcgcgggcac 120 cgccaggtcg cgcgccgcac cgacatggac atgaacgggc acgtgaacaa cgtggcctac 180 ctggcctggt gcctggagtg tgtttgaggg ttttggttgc ccgtattgag gtcctggtgg 240 cgcgcatggg ggagaaggcg cctgtcccgc tgaccccccc ggctaccctc ccggcacctt 300 ccagggcgcg tacgggatcc tccaggcacc aggccaggta ggccacgttg ttcacgtgcc 360 cgttcatgtc catgtcggtg cggcgcgcga cctggcggtg cccgcgcagc ggcgccggcg 420 tcgcgatgtt gggcagcttg gcacgcgtga ccgcgggcgg cagcgccagg cgcggcggct 480 cgcgcgcgaa gaaggccgac ttgacgcgga caagctt 517 <210> 44 <211> 519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 44 actagtccgt gcccgagcac gtcttcagcg actaccacct ctaccagatg gagatcgact 60 tcaaggccga gtgccacgcg ggcgacgtca tctcctccca ggccgagcag atcccgcccc 120 aggaggcgct cacgcacaac ggcgccggcc gcaacccctc ctgcttcgtc catagcattc 180 tgcgcgccga gaccgagcgt gtgtttgagg gttttggttg cccgtatcga ggtcctggtg 240 gcgcgcatgg gggagaaggc gcctgtcccg ctgacccccc cggctaccct cccggcacct 300 tccagggcgc gtacgggatc cgctcggtct cggcgcgcag aatgctatgg acgaagcagg 360 aggggttgcg gccggcgccg ttgtgcgtga gcgcctcctg gggcgggatc tgctcggcct 420 gggaggagat gacgtcgccc gcgtggcact cggccttgaa gtcgatctcc atctggtaga 480 ggtggtagtc gctgaagacg tgctcgggca cggaagctt 519 <210> 45 <211> 415 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 45 actagttcgt ccgcgcgcga accacatggt cggcccccat cgacgcgccc gccgccaagc 60 cgcccaaggc gagccactga ggacagggtg gttggctgga tggggaaacg ctggtcgcgg 120 gattcgatcc tgctgcttat atcctcgtgt gtttgagggt tttggttgcc cgtattgagg 180 tcctggtggc gcgcatgggg gagaaggcgc ctgtcccgct gacccccccg gctaccctcc 240 cggcaccttc cagggcgcgt acgggatccg aggatataag cagcaggatc gaatcccgcg 300 accagcgttt ccccatccag ccaaccaccc tgtcctcagt ggctcgcctt gggcggcttg 360 gcggcgggcg cgtcgatggg ggccgaccat gtggttcgcg cgcggacgaa agctt 415 <210> 46 <211> 1629 <212> DNA <213> Cuphea wrightii <400> 46 atggccgccg ccgccagcat ggtggccagc cccttctgca cctggctggt ggccagctgc 60 atgagcacca gcttcgacaa cgacccccgc agccccagcg tgaagcgctt cccccgccgc 120 aagcgcgtgc tgagccagcg cggcagcacc tacgtattcc agtgcctggt ggccagctgc 180 atcgacccct gcgaccagta ccgcagcagc gccagcctga gcttcctggg cgacaacggc 240 ttcgccagcc tgttcggcag caagcccttc atgagcaacc gcggccaccg ccgcctgcgc 300 cgcgccagcc acagcggcga ggccatggcc gtggccctgc agcccgccca ggaggccggc 360 accaagaaga agcccgtgat caagcagcgc cgcgtggtgg tgaccggcat gggcgtggtg 420 acccccctgg gccacgagcc cgacgtgttc tacaacaacc tgctggacgg cgtgagcggc 480 atcagcgaga tcgagacctt cgactgcacc cagttcccca cccgcatcgc cggcgagatc 540 aagagcttca gcaccgacgg ctgggtggcc cccaagctga gcaagcgcat ggacaagttc 600 atgctgtacc tgctgaccgc cggcaagaag gccctggccg acggcggcat caccgacgag 660 gtgatgaagg agctggacaa gcgcaagtgc ggcgtgctga tcggcagcgg catgggcggc 720 atgaaggtgt tcaacgacgc catcgaggcc ctgcgcgtga gctacaagaa gatgaacccc 780 ttctgcgtgc ccttcgccac caccaacatg ggcagcgcca tgctggccat ggacctgggc 840 tggatgggcc ccaactacag catcagcacc gcctgcgcca ccagcaactt ctgcatcctg 900 aacgccgcca accacatcat ccgcggcgag gccgacatga tgctgtgcgg cggcagcgac 960 gccgtgatca tccccatcgg cctgggcggc ttcgtggcct gccgcgccct gagccagcgc 1020 aacagcgacc ccaccaaggc cagccgcccc tgggacagca accgcgacgg cttcgtgatg 1080 ggcgagggcg ccggcgtgct gctgctggag gagctggagc acgccaagaa gcgcggcgcc 1140 accatctacg ccgagttcct gggcggcagc ttcacctgcg acgcctacca catgaccgag 1200 ccccaccccg agggcgccgg cgtgatcctg tgcatcgaga aggccctggc ccaggccggc 1260 gtgagcaagg aggacgtgaa ctacatcaac gcccacgcca ccagcaccag cgccggcgac 1320 atcaaggagt accaggccct ggcccgctgc ttcggccaga acagcgagct gcgcgtgaac 1380 agcaccaaga gcatgatcgg ccacctgctg ggcgccgccg gcggcgtgga ggccgtgacc 1440 gtggtgcagg ccatccgcac cggctggatt caccccaacc tgaacctgga ggaccccgac 1500 aaggccgtgg acgccaagct gctggtgggc cccaagaagg agcgcctgaa cgtgaaggtg 1560 ggcctgagca acagcttcgg cttcggcggc cacaacagca gcatcctgtt cgccccctgc 1620 aacgtgtga 1629 <210> 47 <211> 1552 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 47 atgggccgcg gtgtctccct tccccggccc agggtcgcgg tgcgcgccca gtcggcgagt 60 caggttttgg agagctgtat tccagtgcct ggtggccagc tgcatcgacc cctgcgacca 120 gtaccgcagc agcgccagcc tgagcttcct gggcgacaac ggcttcgcca gcctgttcgg 180 cagcaagccc ttcatgagca accgcggcca ccgccgcctg cgccgcgcca gccacagcgg 240 cgaggccatg gccgtggccc tgcagcccgc ccaggaggcc ggcaccaaga agaagcccgt 300 gatcaagcag cgccgcgtgg tggtgaccgg catgggcgtg gtgacccccc tgggccacga 360 gcccgacgtg ttctacaaca acctgctgga cggcgtgagc ggcatcagcg agatcgagac 420 cttcgactgc acccagttcc ccacccgcat cgccggcgag atcaagagct tcagcaccga 480 cggctgggtg gcccccaagc tgagcaagcg catggacaag ttcatgctgt acctgctgac 540 cgccggcaag aaggccctgg ccgacggcgg catcaccgac gaggtgatga aggagctgga 600 caagcgcaag tgcggcgtgc tgatcggcag cggcatgggc ggcatgaagg tgttcaacga 660 cgccatcgag gccctgcgcg tgagctacaa gaagatgaac cccttctgcg tgcccttcgc 720 caccaccaac atgggcagcg ccatgctggc catggacctg ggctggatgg gccccaacta 780 cagcatcagc accgcctgcg ccaccagcaa cttctgcatc ctgaacgccg ccaaccacat 840 catccgcggc gaggccgaca tgatgctgtg cggcggcagc gacgccgtga tcatccccat 900 cggcctgggc ggcttcgtgg cctgccgcgc cctgagccag cgcaacagcg accccaccaa 960 ggccagccgc ccctgggaca gcaaccgcga cggcttcgtg atgggcgagg gcgccggcgt 1020 gctgctgctg gaggagctgg agcacgccaa gaagcgcggc gccaccatct acgccgagtt 1080 cctgggcggc agcttcacct gcgacgccta ccacatgacc gagccccacc ccgagggcgc 1140 cggcgtgatc ctgtgcatcg agaaggccct ggcccaggcc ggcgtgagca aggaggacgt 1200 gaactacatc aacgcccacg ccaccagcac cagcgccggc gacatcaagg agtaccaggc 1260 cctggcccgc tgcttcggcc agaacagcga gctgcgcgtg aacagcacca agagcatgat 1320 cggccacctg ctgggcgccg ccggcggcgt ggaggccgtg accgtggtgc aggccatccg 1380 caccggctgg attcacccca acctgaacct ggaggacccc gacaaggccg tggacgccaa 1440 gctgctggtg ggccccaaga aggagcgcct gaacgtgaag gtgggcctga gcaacagctt 1500 cggcttcggc ggccacaaca gcagcatcct gttcgccccc tgcaacgtgt ga 1552 <210> 48 <211> 1641 <212> DNA <213> Cuphea pulcherrima <400> 48 atgcccgcgg ccagctcgct gctggcgtcc cccctgtgca cctggctgct ggccgcgtgc 60 atgagcacct cgttccaccc ctccgacccc ctgcccccca gcatctcgtc cccccgccgc 120 cgcctgagcc gccgccgcat cctgtcgcag tgcgcccccc tgccctccgc gagctcggcc 180 ctgcgcggct ccagcttcca caccctggtg acctcgtatc tggcgtgctt cgagccctgc 240 cacgactatt ataccagcgc ctccctgttc ggctcgcgcc ccatccgcac cacccgccgc 300 caccgccgcc tgaaccgcgc gagcccctcg cgcgaggcga tggcggtcgc cctgcagccc 360 gagcaggagg tgaccaccaa 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gcacatcgag atctacaagt accccgcctg gtccgacgtg 480 gtggagatcg agacctggtg ccagtccgag ggccgcatcg gcacccgccg cgactggatc 540 ctgcgcgact ccgccaccaa cgaggtgatc ggccgcgcca cctccaagtg ggtgatgatg 600 aaccaggaca cccgccgcct gcagcgcgtg accgacgagg tgcgcgacga gtacctggtg 660 ttctgccccc gcgagccccg cctggccttc cccgaggaga acaactcctc cctgaagaag 720 atccccaagc tggaggaccc cgcccagtac tccatgctgg agctgaagcc ccgccgcgcc 780 gacctggaca tgaaccagca cgtgaacaac gtgacctaca tcggctgggt gctggagtcc 840 atcccccagg agatcatcga cacccacgag ctgcaggtga tcaccctgga ctaccgccgc 900 gagtgccagc aggacgacat cgtggactcc ctgaccacct ccgagatccc cgacgacccc 960 atctccaagt tcaccggcac caacggctcc gccatgtcct ccatccaggg ccacaacgag 1020 tcccagttcc tgcacatgct gcgcctgtcc gagaacggcc aggagatcaa ccgcggccgc 1080 acccagtggc gcaagaagtc ctcccgcatg gactacaagg accacgacgg cgactacaag 1140 gaccacgaca tcgactacaa ggacgacgac gacaagtga 1179 <210> 65 <211> 392 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Met Leu Lys Leu Ser Cys Asn Val Thr Asn Asn Leu His Thr Phe Ser 1 5 10 15 Phe Phe Ser Asp Ser Ser Leu Phe Ile Pro Val Asn Arg Arg Thr Ile 20 25 30 Ala Val Ser Ser Gly Arg Ala Ser Gln Leu Arg Lys Pro Ala Leu Asp 35 40 45 Pro Leu Arg Ala Val Ile Ser Ala Asp Gln Gly Ser Ile Ser Pro Val 50 55 60 Asn Ser Cys Thr Pro Ala Asp Arg Leu Arg Ala Gly Arg Leu Met Glu 65 70 75 80 Asp Gly Tyr Ser Tyr Lys Glu Lys Phe Ile Val Arg Ser Tyr Glu Val 85 90 95 Gly Ile Asn Lys Thr Ala Thr Val Glu Thr Ile Ala Asn Leu Leu Gln 100 105 110 Glu Val Ala Cys Asn His Val Gln Lys Cys Gly Phe Ser Thr Asp Gly 115 120 125 Phe Ala Thr Thr Leu Thr Met Arg Lys Leu His Leu Ile Trp Val Thr 130 135 140 Ala Arg Met His Ile Glu Ile Tyr Lys Tyr Pro Ala Trp Ser Asp Val 145 150 155 160 Val Glu Ile Glu Thr Trp Cys Gln Ser Glu Gly Arg Ile Gly Thr Arg 165 170 175 Arg Asp Trp Ile Leu Arg Asp Ser Ala Thr Asn Glu Val Ile Gly Arg 180 185 190 Ala Thr Ser Lys Trp Val Met Met Asn Gln Asp Thr Arg Arg Leu Gln 195 200 205 Arg Val Thr Asp Glu 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66 atggccaccg catccacttt ctcggcgttc aatgcccgct gcggcgacct gcgtcgctcg 60 gcgggctccg ggccccggcg cccagcgagg cccctccccg tgcgcgggcg cgcctcccag 120 ctgcgcaagc ccgccctgga ccccctgcgc gccgtgatct ccgccgacca gggctccatc 180 tcccccgtga actcctgcac ccccgccgac cgcctgcgcg ccggccgcct gatggaggac 240 ggctactcct acaaggagaa gttcatcgtg cgctcctacg aggtgggcat caacaagacc 300 gccaccgtgg agaccatcgc caacctgctg caggaggtgg cctgcaacca cgtgcagaag 360 tgcggcttct ccaccgacgg cttcgccacc accctgacca tgcgcaagct gcacctgatc 420 tgggtgaccg cccgcatgca catcgagatc tacaagtacc ccgcctggtc cgacgtggtg 480 gagatcgaga cctggtgcca gtccgagggc cgcatcggca cccgccgcga ctggatcctg 540 cgcgactccg ccaccaacga ggtgatcggc cgcgccacct ccaagtgggt gatgatgaac 600 caggacaccc gccgcctgca gcgcgtgacc gacgaggtgc gcgacgagta cctggtgttc 660 tgcccccgcg agccccgcct ggccttcccc gaggagaaca actcctccct gaagaagatc 720 cccaagctgg aggaccccgc ccagtactcc atgctggagc tgaagccccg ccgcgccgac 780 ctggacatga accagcacgt gaacaacgtg acctacatcg gctgggtgct ggagtccatc 840 ccccaggaga 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gcacatcgag 420 atctaccgct accccgcctg gtccgacgtg atcgagatcg agacctgggt gcagggcgag 480 ggcaaggtgg gcacccgccg cgactggatc ctgaaggact acgccaacgg cgaggtgatc 540 ggccgcgcca cctccaagtg ggtgatgatg aacgaggaca cccgccgcct gcagaaggtg 600 tccgacgacg tgcgcgagga gtacctggtg ttctgccccc gcaccctgcg cctggccttc 660 cccgaggaga acaacaactc catgaagaag atccccaagc tggaggaccc cgccgagtac 720 tcccgcctgg gcctggtgcc ccgccgctcc gacctggaca tgaacaagca cgtgaacaac 780 gtgacctaca tcggctgggc cctggagtcc atcccccccg agatcatcga cacccacgag 840 ctgcaggcca tcaccctgga ctaccgccgc gagtgccagc gcgacgacat cgtggactcc 900 ctgacctccc gcgagcccct gggcaacgcc gccggcgtga agttcaagga gatcaacggc 960 tccgtgtccc ccaagaagga cgagcaggac ctgtcccgct tcatgcacct gctgcgctcc 1020 gccggctccg gcctggagat caaccgctgc cgcaccgagt ggcgcaagaa gcccgccaag 1080 cgcatggact acaaggacca cgacggcgac tacaaggacc acgacatcga ctacaaggac 1140 gacgacgaca agtga 1155 <210> 69 <211> 384 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 69 Met Ala Thr Ala Ser Thr Phe Ser Ala Phe Asn Ala Arg Cys Gly Asp 1 5 10 15 Leu Arg Arg Ser Ala Gly Ser Gly Pro Arg Arg Pro Ala Arg Pro Leu 20 25 30 Pro Val Arg Gly Arg Ala Ala Thr Gly Glu Gln Pro Ser Gly Val Ala 35 40 45 Ser Leu Arg Glu Ala Asp Lys Glu Lys Ser Leu Gly Asn Arg Leu Arg 50 55 60 Leu Gly Ser Leu Thr Glu Asp Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Lys Phe Val 65 70 75 80 Ile Arg Cys Tyr Glu Val Gly Ile Asn Lys Thr Ala Thr Ile Glu Thr 85 90 95 Ile Ala Asn Leu Leu Gln Glu Val Gly Gly Asn His Ala Gln Gly Val 100 105 110 Gly Phe Ser Thr Asp Gly Phe Ala Thr Thr Thr Thr Met Arg Lys Leu 115 120 125 His Leu Ile Trp Val Thr Ala Arg Met His Ile Glu Ile Tyr Arg Tyr 130 135 140 Pro Ala Trp Ser Asp Val Ile Glu Ile Glu Thr Trp Val Gln Gly Glu 145 150 155 160 Gly Lys Val Gly Thr Arg Arg Asp Trp Ile Leu Lys Asp Tyr Ala Asn 165 170 175 Gly Glu Val Ile Gly Arg Ala Thr Ser Lys Trp Val Met Met Asn Glu 180 185 190 Asp Thr Arg Arg Leu Gln Lys Val Ser Asp Asp Val Arg Glu Glu Tyr 195 200 205 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gcgagtgcca gcaggacgac gtggtggact ccctgacctc ccccgagcag 960 gtggagggca ccgagaaggt gtccgccatc cacggcacca acggctccgc cgccgcccgc 1020 gaggacaagc aggactgccg ccagttcctg cacctgctgc gcctgtcctc cgacggccag 1080 gagatcaacc gcggccgcac cgagtggcgc aagaagcccg cccgcatgga ctacaaggac 1140 cacgacggcg actacaagga ccacgacatc gactacaagg acgacgacga caagtga 1197 <210> 75 <211> 398 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 75 Met Leu Lys Leu Ser Ser Cys Asn Val Thr Asp Gln Arg Gln Ala Leu 1 5 10 15 Ala Gln Cys Arg Phe Leu Ala Pro Pro Ala Pro Phe Ser Phe Arg Trp 20 25 30 Arg Thr Pro Val Val Val Ser Cys Ser Pro Ser Ser Arg Pro Asn Leu 35 40 45 Ser Pro Leu Gln Val Val Leu Ser Gly Gln Gln Gln Ala Gly Met Glu 50 55 60 Leu Val Glu Ser Gly Ser Gly Ser Leu Ala Asp Arg Leu Arg Leu Gly 65 70 75 80 Ser Leu Thr Glu Asp Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Lys Phe Ile Val Arg 85 90 95 Cys Tyr Glu Val Gly Ile Asn Lys Thr Ala Thr Val Glu Thr Ile Ala 100 105 110 Asn Leu 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ccatagtcga gagggaaaca gcccagacca ccagttaagg ccccaaaatg 480 ataatgaagt ggtaaaggag gtgaaaatgc aaatacaacc aggaggttgg cttagaagca 540 gccatccttt aaagagtgcg taatagctca ctg 573 <210> 77 <211> 384 <212> PRT <213> Cuphea wrightii <400> 77 Met Ala Ile Ala Ala Ala Ala Val Ile Phe Leu Phe Gly Leu Ile Phe 1 5 10 15 Phe Ala Ser Gly Leu Ile Ile Asn Leu Phe Gln Ala Leu Cys Phe Val 20 25 30 Leu Ile Arg Pro Leu Ser Lys Asn Ala Tyr Arg Arg Ile Asn Arg Val 35 40 45 Phe Ala Glu Leu Leu Leu Ser Glu Leu Leu Cys Leu Phe Asp Trp Trp 50 55 60 Ala Gly Ala Lys Leu Lys Leu Phe Thr Asp Pro Glu Thr Phe Arg Leu 65 70 75 80 Met Gly Lys Glu His Ala Leu Val Ile Ile Asn His Met Thr Glu Leu 85 90 95 Asp Trp Met Val Gly Trp Val Met Gly Gln His Phe Gly Cys Leu Gly 100 105 110 Ser Ile Ile Ser Val Ala Lys Lys Ser Thr Lys Phe Leu Pro Val Leu 115 120 125 Gly Trp Ser Met Trp Phe Ser Glu Tyr Leu Tyr Leu Glu Arg Ser Trp 130 135 140 Ala Lys Asp Lys Ser Thr Leu Lys Ser His Ile Glu Arg Leu Ile Asp 145 150 155 160 Tyr Pro Leu Pro Phe 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wrightii <400> 79 Met Glu Ile Pro Pro His Cys Leu Cys Ser Pro Ser Pro Ala Pro Ser 1 5 10 15 Gln Leu Tyr Tyr Lys Lys Lys Lys His Ala Ile Leu Gln Thr Gln Thr 20 25 30 Pro Tyr Arg Tyr Arg Val Ser Pro Thr Cys Phe Ala Pro Pro Arg Leu 35 40 45 Arg Lys Gln His Pro Tyr Pro Leu Pro Val Leu Cys Tyr Pro Lys Leu 50 55 60 Leu His Phe Ser Gln Pro Arg Tyr Pro Leu Val Arg Ser His Leu Ala 65 70 75 80 Glu Ala Gly Val Ala Tyr Arg Pro Gly Tyr Glu Leu Leu Gly Lys Ile 85 90 95 Arg Gly Val Cys Phe Tyr Ala Val Thr Ala Ala Val Ala Leu Leu Leu 100 105 110 Phe Gln Cys Met Leu Leu Leu His Pro Phe Val Leu Leu Phe Asp Pro 115 120 125 Phe Pro Arg Lys Ala His His Thr Ile Ala Lys Leu Trp Ser Ile Cys 130 135 140 Ser Val Ser Leu Phe Tyr Lys Ile His Ile Lys Gly Leu Glu Asn Leu 145 150 155 160 Pro Pro Pro His Ser Pro Ala Val Tyr Val Ser Asn His Gln Ser Phe 165 170 175 Leu Asp Ile Tyr Thr Leu Leu Thr Leu Gly Arg Thr Phe Lys Phe Ile 180 185 190 Ser Lys Thr Glu Ile Phe Leu Tyr Pro Ile Ile Gly Trp Ala Met Tyr 195 200 205 Met 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agtttttgca gaattgttgt tgtcggagct tttatgccta 180 ttcgattggt gggctggtgc taagctcaaa ttatttaccg accctgaaac ctttcgcctt 240 atgggcaagg aacatgctct tgtcataatt aatcacatga ctgaacttga ctggatggtt 300 ggatgggtta tgggtcagca ttttggttgc cttgggagca taatatctgt tgcgaagaaa 360 tcaacaaaat ttcttccggt attggggtgg tcaatgtggt tttcagagta cctatatctt 420 gagagaagct gggccaagga taaaagtaca ttaaagtcac atatcgagag gctgatagac 480 taccccctgc ccttctggtt ggtaattttt gtggaaggaa ctcggtttac tcggacaaaa 540 ctcttggcag cccagcagta tgctgtctca tctgggctac cagtgccgag aaatgttttg 600 atcccacgta ctaagggttt tgtttcatgt gtaagtcaca tgcgatcatt tgttccagca 660 gtatatgatg tcacagtggc attccctaag acttcacctc caccaacgtt gctaaatctt 720 ttcgagggtc agtccataat gcttcacgtt cacatcaagc gacatgcaat gaaagattta 780 ccagaatccg atgatgcagt agcagagtgg tgtagagaca aatttgtgga aaaggatgct 840 ttgttggaca agcataatgc tgaggacact ttcagtggtc aagaagtttg tcatagcggc 900 agccgccagt taaagtctct tctggtggta atatcttggg tggttgtaac aacatttggg 960 gctctaaagt tccttcagtg gtcatcatgg aaggggaaag cattttcagc tatcgggctg 1020 ggcatcgtca ctctacttat gcacgtattg attctatcct cacaagcaga gcggtctaac 1080 cctgcggagg tggcacaggc aaagctaaag accgggttgt cgatctcaaa gaaggtaacg 1140 gacaaggaaa actag 1155 <210> 82 <211> 1164 <212> DNA <213> Cuphea wrightii <400> 82 atggcgattg ctgcggcagc tgtcatcgtc ccgctcagcc tcctcttctt cgtctccggc 60 ctcatcgtca atctcgtaca ggcagtttgc tttgtactga ttaggcctct gtcgaaaaac 120 acttacagaa gaataaacag agtggttgca gaattgttgt ggttggagtt ggtatggctg 180 attgattggt gggctggtgt caagataaaa gtattcacgg atcatgaaac ctttcacctt 240 atgggcaaag aacatgctct tgtcatttgt aatcacaaga gtgacataga ctggctggtt 300 gggtgggttc tgggacagcg gtcaggttgc cttggaagca cattagctgt tatgaagaaa 360 tcatcaaagt ttctcccggt attagggtgg tcaatgtggt tctcagagta tctattcctt 420 gaaagaagct gggccaagga tgaaattaca ttaaagtcag gtttgaatag gctgaaagac 480 tatcccttac ccttctggtt ggcacttttt gtggaaggaa ctcggttcac tcgagcaaaa 540 ctcttggcag cccagcagta tgctgcctct tcggggctac ctgtgccgag aaatgttctg 600 atcccgcgta ctaagggttt tgtttcttct gtgagtcaca tgcgatcatt tgttccagcc 660 atatatgatg ttacagtggc aatcccaaag acgtcacctc caccaacatt gataagaatg 720 ttcaagggac agtcctcagt gcttcacgtc cacctcaagc gacacctaat gaaagattta 780 cctgaatcag atgatgctgt tgctcagtgg tgcagagata tattcgtcga gaaggatgct 840 ttgttggata agcataatgc tgaggacact ttcagtggcc aagaacttca agaaactggc 900 cgcccaataa agtctcttct ggttgtaatc tcttgggcgg tgttggaggt atttggagct 960 gtgaagtttc ttcaatggtc atcgctgtta tcatcatgga agggacttgc attttcggga 1020 ataggactgg gtgtcatcac gctactcatg cacatactga ttttattctc acaatccgag 1080 cggtctaccc ctgcaaaagt ggcaccagca aagccaaaga atgagggaga gtcctccaag 1140 acggaaatgg aaaaggaaaa gtag 1164 <210> 83 <211> 984 <212> DNA <213> Cuphea wrightii <400> 83 atggagatcc ccccccactg cctgtgctcc ccctcccccg ccccctccca gctgtactac 60 aagaagaaga agcacgccat cctgcagacc cagaccccct accgctaccg cgtgtccccc 120 acctgcttcg cccccccccg cctgcgcaag cagcacccct accccctgcc cgtgctgtgc 180 taccccaagc tgctgcactt ctcccagccc cgctaccccc tggtgcgctc ccacctggcc 240 gaggccggcg tggcctaccg ccccggctac gagctgctgg gcaagatccg cggcgtgtgc 300 ttctacgccg tgaccgccgc cgtggccctg ctgctgttcc agtgcatgct gctgctgcac 360 cccttcgtgc tgctgttcga ccccttcccc cgcaaggccc accacaccat cgccaagctg 420 tggtccatct gctccgtgtc cctgttctac aagatccaca tcaagggcct ggagaacctg 480 cccccccccc actcccccgc cgtgtacgtg tccaaccacc agtccttcct ggacatctac 540 accctgctga ccctgggccg caccttcaag ttcatctcca agaccgagat cttcctgtac 600 cccatcatcg gctgggccat gtacatgctg ggcaccatcc ccctgaagcg cctggactcc 660 cgctcccagc tggacaccct gaagcgctgc atggacctga tcaagaaggg cgcctccgtg 720 ttcttcttcc ccgagggcac ccgctccaag gacggcaagc tgggcgcctt caagaagggc 780 gccttctcca tcgccgccaa gtccaaggtg cccgtggtgc ccatcaccct gatcggcacc 840 ggcaagatca tgccccccgg ctccgagctg accgtgaacc ccggcaccgt gcaggtgatc 900 atccacaagc ccatcgaggg ctccgacgcc gaggccatgt gcaacgaggc ccgcgccacc 960 atctcccact ccctggacga ctga 984 <210> 84 <211> 1155 <212> DNA <213> Cuphea wrightii <400> 84 atggcgatcg cggccgcggc ggtgatcttc ctgttcggcc tgatcttctt cgcctccggc 60 ctgatcatca acctgttcca ggcgctgtgc ttcgtcctga tccgccccct gtccaagaac 120 gcctaccgcc gcatcaaccg cgtgttcgcg gagctgctgc tgtccgagct gctgtgcctg 180 ttcgactggt gggcgggcgc gaagctgaag ctgttcaccg accccgagac gttccgcctg 240 atgggcaagg agcacgccct ggtcatcatc aaccacatga ccgagctgga ctggatggtg 300 ggctgggtga tgggccagca cttcggctgc ctgggctcca tcatctccgt cgccaagaag 360 tccacgaagt tcctgcccgt gctgggctgg tccatgtggt tctccgagta cctgtacctg 420 gagcgctcct gggccaagga caagtccacc ctgaagtccc acatcgagcg cctgatcgac 480 taccccctgc ccttctggct ggtcatcttc gtcgagggca cccgcttcac gcgcacgaag 540 ctgctggcgg cccagcagta cgcggtctcc tccggcctgc ccgtcccccg caacgtcctg 600 atcccccgca cgaagggctt cgtctcctgc gtgtcccaca tgcgctcctt cgtccccgcg 660 gtgtacgacg tcacggtggc gttccccaag acgtcccccc cccccacgct gctgaacctg 720 ttcgagggcc agtccatcat gctgcacgtg cacatcaagc gccacgccat gaaggacctg 780 cccgagtccg acgacgccgt cgcggagtgg tgccgcgaca agttcgtcga gaaggacgcc 840 ctgctggaca agcacaacgc ggaggacacg ttctccggcc aggaggtgtg ccactccggc 900 tcccgccagc tgaagtccct gctggtcgtg atctcctggg tcgtggtgac gacgttcggc 960 gccctgaagt tcctgcagtg gtcctcctgg aagggcaagg cgttctccgc catcggcctg 1020 ggcatcgtca ccctgctgat gcacgtgctg atcctgtcct cccaggccga gcgctccaac 1080 cccgccgagg tggcccaggc caagctgaag accggcctgt ccatctccaa gaaggtgacg 1140 gacaaggaga actga 1155 <210> 85 <211> 1164 <212> DNA <213> Cuphea wrightii <400> 85 atggccatcg cggcggccgc ggtgatcgtg cccctgtccc tgctgttctt cgtgtccggc 60 ctgatcgtca acctggtgca ggccgtctgc ttcgtcctga tccgccccct gtccaagaac 120 acgtaccgcc gcatcaaccg cgtggtcgcg gagctgctgt ggctggagct ggtgtggctg 180 atcgactggt gggcgggcgt gaagatcaag gtcttcacgg accacgagac gttccacctg 240 atgggcaagg agcacgccct ggtcatctgc aaccacaagt ccgacatcga ctggctggtc 300 ggctgggtcc tgggccagcg ctccggctgc ctgggctcca ccctggcggt catgaagaag 360 tcctccaagt tcctgcccgt cctgggctgg tccatgtggt tctccgagta cctgttcctg 420 gagcgctcct gggccaagga cgagatcacg ctgaagtccg gcctgaaccg cctgaaggac 480 taccccctgc ccttctggct ggcgctgttc gtggagggca cgcgcttcac ccgcgcgaag 540 ctgctggcgg cgcagcagta cgccgcgtcc tccggcctgc ccgtgccccg caacgtgctg 600 atcccccgca cgaagggctt cgtgtcctcc gtgtcccaca tgcgctcctt cgtgcccgcg 660 atctacgacg tcaccgtggc catccccaag acgtcccccc cccccacgct gatccgcatg 720 ttcaagggcc agtcctccgt gctgcacgtg cacctgaagc gccacctgat gaaggacctg 780 cccgagtccg acgacgccgt cgcgcagtgg tgccgcgaca tcttcgtgga gaaggacgcg 840 ctgctggaca agcacaacgc cgaggacacc ttctccggcc aggagctgca ggagaccggc 900 cgccccatca agtccctgct ggtcgtcatc tcctgggccg tcctggaggt gttcggcgcc 960 gtcaagttcc tgcagtggtc ctccctgctg tcctcctgga agggcctggc gttctccggc 1020 atcggcctgg gcgtgatcac cctgctgatg cacatcctga tcctgttctc ccagtccgag 1080 cgctccaccc ccgccaaggt ggcccccgcg aagcccaaga acgagggcga gtcctccaag 1140 accgagatgg agaaggagaa gtga 1164 <210> 86 <211> 1098 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 86 gcgcacccca aggcgaacgg cagcgcggtg tcgctgaagt cgggctccct ggagacccag 60 gaggacaaga cgagcagctc gtcccccccc ccccgcacgt tcatcaacca gctgcccgtg 120 tggagcatgc tgctgtcggc ggtgaccacg gtcttcggcg tggccgagaa gcagtggccc 180 atgctggacc gcaagtccaa gcgccccgac atgctggtcg agcccctggg cgtggaccgc 240 atcgtctacg acggcgtgag cttccgccag tcgttctcca tccgcagcta cgagatcggc 300 gccgaccgca ccgcctcgat cgagacgctg atgaacatgt tccaggagac ctccctgaac 360 cactgcaaga tcatcggcct gctgaacgac ggcttcggcc gcacgcccga gatgtgcaag 420 cgcgacctga tctgggtcgt gaccaagatg cagatcgagg tgaaccgcta ccccacgtgg 480 ggcgacacca tcgaggtcaa cacgtgggtg agcgcctcgg gcaagcacgg catgggccgc 540 gactggctga tctccgactg ccacaccggc gagatcctga tccgcgcgac gagcgtctgg 600 gcgatgatga accagaagac ccgccgcctg tcgaagatcc cctacgaggt gcgccaggag 660 atcgagcccc agttcgtcga ctccgccccc gtgatcgtgg acgaccgcaa gttccacaag 720 ctggacctga agacgggcga cagcatctgc aacggcctga ccccccgctg gacggacctg 780 gacgtgaacc agcacgtcaa caacgtgaag tacatcggct ggatcctgca gtcggtcccc 840 accgaggtgt tcgagacgca ggagctgtgc ggcctgaccc tggagtaccg ccgcgagtgc 900 ggccgcgact ccgtgctgga gagcgtcacg gccatggacc cctcgaagga gggcgaccgc 960 tccctgtacc agcacctgct gcgcctggag gacggcgcgg acatcgtgaa gggccgcacc 1020 gagtggcgcc ccaagaacgc cggcgccaag ggcgccatcc tgacgggcaa gaccagcaac 1080 ggcaactcga tctcctga 1098 <210> 87 <211> 365 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 87 Ala His Pro Lys Ala Asn Gly Ser Ala Val Ser Leu Lys Ser Gly Ser 1 5 10 15 Leu Glu Thr Gln Glu Asp Lys Thr Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Arg 20 25 30 Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Val Trp Ser Met Leu Leu Ser Ala Val 35 40 45 Thr Thr Val Phe Gly Val Ala Glu Lys Gln Trp Pro Met Leu Asp Arg 50 55 60 Lys Ser Lys Arg Pro Asp Met Leu Val Glu Pro Leu Gly Val Asp Arg 65 70 75 80 Ile Val Tyr Asp Gly Val Ser Phe Arg Gln Ser Phe Ser Ile Arg Ser 85 90 95 Tyr Glu Ile Gly Ala Asp Arg Thr Ala Ser Ile Glu Thr Leu Met Asn 100 105 110 Met Phe Gln Glu Thr Ser Leu Asn His Cys Lys Ile Ile Gly Leu Leu 115 120 125 Asn Asp Gly Phe Gly Arg Thr Pro Glu Met Cys Lys Arg Asp Leu Ile 130 135 140 Trp Val Val Thr Lys Met Gln Ile Glu Val Asn Arg Tyr Pro Thr 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agacgggcga cagcatctgc aacggcctga ccccccgctg gacggacctg 780 gacgtgaacc agcacgtcaa caacgtgaag tacatcggct ggatcctgca gtcggtcccc 840 accgaggtgt tcgagacgca ggagctgtgc ggcctgaccc tggagtaccg ccgcgagtgc 900 ggccgcgact ccgtgctgga gagcgtcacg gccatggacc cctcgaagga gggcgaccgc 960 tccctgtacc agcacctgct gcgcctggag gacggcgcgg acatcgtgaa gggccgcacc 1020 gagtggcgcc ccaagaacgc cggcgccaag ggcgccatcc tgacgggcaa gaccagcaac 1080 ggcaactcga tctccatgga ctacaaggac cacgacggcg actacaagga ccacgacatc 1140 gactacaagg acgacgacga caagtga 1167 <210> 89 <211> 388 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 89 Ala His Pro Lys Ala Asn Gly Ser Ala Val Ser Leu Lys Ser Gly Ser 1 5 10 15 Leu Glu Thr Gln Glu Asp Lys Thr Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Arg 20 25 30 Thr Phe Ile Asn Gln Leu Pro Val Trp Ser Met Leu Leu Ser Ala Val 35 40 45 Thr Thr Val Phe Gly Val Ala Glu Lys Gln Trp Pro Met Leu Asp Arg 50 55 60 Lys Ser Lys Arg Pro Asp Met Leu Val Glu Pro Leu Gly Val 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ccgggagtca ggaccggcgg aaaataagag 5400 gcaacacact ccgcttctta gctcttcg 5428 <210> 91 <211> 5437 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 91 gctcttccgc taacggaggt ctgtcaccaa atggaccccg tctattgcgg gaaaccacgg 60 cgatggcacg tttcaaaact tgatgaaata caatattcag tatgtcgcgg gcggcgacgg 120 cggggagctg atgtcgcgct gggtattgct taatcgccag cttcgccccc gtcttggcgc 180 gaggcgtgaa caagccgacc gatgtgcacg agcaaatcct gacactagaa gggctgactc 240 gcccggcacg gctgaattac acaggcttgc aaaaatacca gaatttgcac gcaccgtatt 300 cgcggtattt tgttggacag tgaatagcga tgcggcaatg gcttgtggcg ttagaaggtg 360 cgacgaaggt ggtgccacca ctgtgccagc cagtcctggc ggctcccagg gccccgatca 420 agagccagga catccaaact acccacagca tcaacgcccc ggcctatact cgaaccccac 480 ttgcactctg caatggtatg ggaaccacgg ggcagtcttg tgtgggtcgc gcctatcgcg 540 gtcggcgaag accgggaagg taccctttct tgcgctatga cacttccagc aaaaggtagg 600 gcgggctgcg agacggcttc ccggcgctgc atgcaacacc gatgatgctt cgaccccccg 660 aagctccttc 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ggttggcgga tgcacgctca 720 ggtacccttt cttgcgctat gacacttcca gcaaaaggta gggcgggctg cgagacggct 780 tcccggcgct gcatgcaaca ccgatgatgc ttcgaccccc cgaagctcct tcggggctgc 840 atgggcgctc cgatgccgct ccagggcgag cgctgtttaa atagccaggc ccccgattgc 900 aaagacatta tagcgagcta ccaaagccat attcaaacac ctagatcact accacttcta 960 cacaggccac tcgagcttgt gatcgcactc cgctaagggg gcgcctcttc ctcttcgttt 1020 cagtcacaac ccgcaaactc tagaatatca atgctgctgc aggccttcct gttcctgctg 1080 gccggcttcg ccgccaagat cagcgcctcc atgacgaacg agacgtccga ccgccccctg 1140 gtgcacttca cccccaacaa gggctggatg aacgacccca acggcctgtg gtacgacgag 1200 aaggacgcca agtggcacct gtacttccag tacaacccga acgacaccgt ctgggggacg 1260 cccttgttct ggggccacgc cacgtccgac gacctgacca actgggagga ccagcccatc 1320 gccatcgccc cgaagcgcaa cgactccggc gccttctccg gctccatggt ggtggactac 1380 aacaacacct ccggcttctt caacgacacc atcgacccgc gccagcgctg cgtggccatc 1440 tggacctaca acaccccgga gtccgaggag cagtacatct cctacagcct ggacggcggc 1500 tacaccttca ccgagtacca gaagaacccc gtgctggccg ccaactccac 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ccatcgccgg cgagatcaag tccctgcagc tggaccccta 4560 cgtgcccaag cgctgggcca agcgcgtgga cgacgtgatc aagtacgtgt acatcgccgg 4620 caagcaggcc ctggagtccg ccggcctgcc catcgaggcc gccggcctgg ccggcgccgg 4680 cctggacccc gccctgtgcg gcgtgctgat cggcaccgcc atggccggca tgacctcctt 4740 cgccgccggc gtggaggccc tgacccgcgg cggcgtgcgc aagatgaacc ccttctgcat 4800 ccccttctcc atctccaaca tgggcggcgc catgctggcc atggacatcg gcttcatggg 4860 ccccaactac tccatctcca ccgcctgcgc caccggcaac tactgcatcc tgggcgccgc 4920 cgaccacatc cgccgcggcg acgccaacgt gatgctggcc ggcggcgccg acgccgccat 4980 catcccctcc ggcatcggcg gcttcatcgc ctgcaaggcc ctgtccaagc gcaacgacga 5040 gcccgagcgc gcctcccgcc cctgggacgc cgaccgcgac ggcttcgtga tgggcgaggg 5100 cgccggcgtg ctggtgctgg aggagctgga gcacgccaag cgccgcggcg ccaccatcct 5160 ggccgagctg gtgggcggcg ccgccacctc cgacgcccac cacatgaccg agcccgaccc 5220 ccagggccgc ggcgtgcgcc tgtgcctgga gcgcgccctg gagcgcgccc gcctggcccc 5280 cgagcgcgtg ggctacgtga acgcccacgg cacctccacc cccgccggcg acgtggccga 5340 gtaccgcgcc atccgcgccg 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cgcctgcaac gcaagggcag 1860 ccacagccgc tcccacccgc cgctgaaccg acacgtgctt gggcgcctgc cgcctgcctg 1920 ccgcatgctt gtgctggtga ggctgggcag tgctgccatg ctgattgagg cttggttcat 1980 cgggtggaag cttatgtgtg tgctgggctt gcatgccggg caatgcgcat ggtggcaaga 2040 gggcggcagc acttgctgga gctgccgcgg tgcctccagg tggttcaatc gcggcagcca 2100 gagggatttc agatgatcgc gcgtacaggt tgagcagcag tgtcagcaaa ggtagcagtt 2160 tgccagaatg atcggttcag ctgttaatca atgccagcaa gagaaggggt caagtgcaaa 2220 cacgggcatg ccacagcacg ggcaccgggg agtggaatgg caccaccaag tgtgtgcgag 2280 ccagcatcgc cgcctggctg tttcagctac aacggcagga gtcatccaac gtaaccatga 2340 gctgatcaac actgcaatca tcgggcgggc gtgatgcaag catgcctggc gaagacacat 2400 ggtgtgcgga tgctgccggc tgctgcctgc tgcgcacgcc gttgagttgg cagcaggctc 2460 agccatgcac tggatggcag ctgggctgcc actgcaatgt ggtggatagg atgcaagtgg 2520 agcgaatacc aaaccctctg gctgcttgct gggttgcatg gcatcgcacc atcagcagga 2580 gcgcatgcga agggactggc cccatgcacg ccatgccaaa ccggagcgca ccgagtgtcc 2640 acactgtcac caggcccgca agctttgcag aaccatgctc 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gtgcgccgcc agcgccttgg 60 ccttttcgcc gcgctcgtgc gcgtcgctga tgtccatcac caggtccatg aggtctgcct 120 tgcgccggct gagccactgc ttcgtccggg cggccaagag gagcatgagg gaggactcct 180 ggtccagggt cctgacgtgg tcgcggctct gggagcgggc cagcatcatc tggctctgcc 240 gcaccgaggc cgcctccaac tggtcctcca gcagccgcag tcgccgccga ccctggcaga 300 ggaagacagg tgaggggggt atgaattgta cagaacaacc acgagccttg tctaggcaga 360 atccctacca gtcatggctt tacctggatg acggcctgcg aacagctgtc cagcgaccct 420 cgctgccgcc gcttctcccg cacgcttctt tccagcaccg tgatggcgcg agccagcgcc 480 gcacgctggc gctgcgcttc gccgatctga ggacagtcgg ggaactctga tcagtctaaa 540 cccccttgcg cgttagtgtt gccatccttt gcagaccggt gagagccgac ttgttgtgcg 600 ccacccccca caccacctcc tcccagacca attctgtcac ctttttggcg aaggcatcgg 660 cctcggcctg cagagaggac agcagtgccc agccgctggg ggttggcgga tgcacgctca 720 ggtacccttt cttgcgctat gacacttcca gcaaaaggta gggcgggctg cgagacggct 780 tcccggcgct gcatgcaaca ccgatgatgc ttcgaccccc cgaagctcct tcggggctgc 840 atgggcgctc cgatgccgct ccagggcgag cgctgtttaa atagccaggc ccccgattgc 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ctccggcttc 1380 aagtgcaact ccgccgtgtg ggtggccctg tgcaacgtga agccctccgt gaactccccc 1440 tgggagcact gcatcgaccg ctaccccgtg gagatcaact acggctcctc caagtccgag 1500 acccgcgccc agaacggccg ctcctgactt aag 1533 <210> 105 <211> 1524 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 105 actagtatgt ccggcaccaa ggccacctcc gtgtccgtgc ccctgcccga cttcaagcag 60 tccgtgaacc tgaagtacgt gaagctgggc taccactact ccatcaccca cgccatgtac 120 ctgttcctga cccccctgct gctgatcatg tccgcccaga tctccacctt ctccatccag 180 gacttccacc acctgtacaa ccacctgatc ctgcacaacc tgtcctccct gatcctgtgc 240 atcgccctgc tgctgttcgt gctgaccctg tacttcctga cccgccccac ccccgtgtac 300 ctgctgaact tctcctgcta caagcccgac gccatccaca agtgcgaccg ccgccgcttc 360 atggacacca tccgcggcat gggcacctac accgaggaga acatcgagtt ccagcgcaag 420 gtgctggagc gctccggcat cggcgagtcc tcctacctgc cccccaccgt gttcaagatc 480 cccccccgcg tgtacgacgc cgaggagcgc gccgaggccg agatgctgat gttcggcgcc 540 gtggacggcc tgttcgagaa 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cggccgcaac ctgttcgccg acttctccgc cgtgaccgag aagctggacg 5340 tgtacgacgc cgaggactac tgcaagatcc tggagcacct gaactcccgc tggaagatcg 5400 ccgaccgcac cgtgtccggc gacgccggcg ccgaccagga gtacgtgctg cgcctgccct 5460 cccgcttccg caagctggcc gagaagtccg ccgccaagcg cgccaagacc aagcccaagc 5520 ccgtggcctt ctcctggctg tccggccgcg aggtgatggt gtgaatcgat agatctctta 5580 aggcagcagc agctcggata gtatcgacac actctggacg ctggtcgtgt gatggactgt 5640 tgccgccaca cttgctgcct tgacctgtga atatccctgc cgcttttatc aaacagcctc 5700 agtgtgtttg atcttgtgtg tacgcgcttt tgcgagttgc tagctgcttg tgctatttgc 5760 gaataccacc cccagcatcc ccttccctcg tttcatatcg cttgcatccc aaccgcaact 5820 tatctacgct gtcctgctat ccctcagcgc tgctcctgct cctgctcact gcccctcgca 5880 cagccttggt ttgggctccg cctgtattct cctggtactg caacctgtaa accagcactg 5940 caatgctgat gcacgggaag tagtgggatg ggaacacaaa tggaaagctt aattaagagc 6000 tcttgttttc cagaaggagt tgctccttga gcctttcatt ctcagcctcg ataacctcca 6060 aagccgctct aattgtggag ggggttcgaa tttaaaagct tggaatgttg gttcgtgcgt 6120 ctggaacaag cccagacttg ttgctcactg ggaaaaggac catcagctcc aaaaaacttg 6180 ccgctcaaac cgcgtacctc tgctttcgcg caatctgccc tgttgaaatc gccaccacat 6240 tcatattgtg acgcttgagc agtctgtaat tgcctcagaa tgtggaatca tctgccccct 6300 gtgcgagccc atgccaggca tgtcgcgggc gaggacaccc gccactcgta cagcagacca 6360 ttatgctacc tcacaatagt tcataacagt gaccatattt ctcgaagctc cccaacgagc 6420 acctccatgc tctgagtggc caccccccgg ccctggtgct tgcggagggc aggtcaaccg 6480 gcatggggct accgaaatcc ccgaccggat cccaccaccc ccgcgatggg aagaatctct 6540 ccccgggatg tgggcccacc accagcacaa cctgctggcc caggcgagcg tcaaaccata 6600 ccacacaaat atccttggca tcggccctga attccttctg ccgctctgct acccggtgct 6660 tctgtccgaa gcaggggttg ctagggatcg ctccgagtcc gcaaaccctt gtcgcgtggc 6720 ggggcttgtt cgagcttgaa gagc 6744 <210> 111 <211> 542 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Asp, Met or absent <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Ser, Gly or absent <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Ser, Thr or absent <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Ala, Lys or absent <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Val, Ala or absent <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Ile, Thr or absent <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Arg, Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Ile, Val or absent <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Arg, Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Arg, Val or absent <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Arg, Pro or absent <220> <221> MOD_RES <222> (92)..(92) <223> Leu or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (93)..(93) <223> Ala, Leu, Thr or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (128)..(128) <223> Cys, Arg, Leu or His <220> <221> MOD_RES <222> (129)..(129) <223> Arg, Lys or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (130)..(130) <223> Ser, Met, Cys or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (142)..(142) <223> Val, Ile, Met or absent <220> <221> MOD_RES <222> (145)..(145) <223> Ala, Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (148)..(148) <223> Ser, Phe, Leu or absent <220> <221> MOD_RES <222> (153)..(153) <223> Cys, Phe, Leu or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (158)..(158) <223> Trp, Ser or absent <220> <221> MOD_RES <222> (182)..(182) <223> Leu, Thr, Val or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (184)..(184) <223> Val, Thr, Met or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (192)..(192) <223> Arg, Glu, Ala or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (202)..(202) <223> Ile, Phe, Val or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (206)..(206) <223> Glu, Asp or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (249)..(249) <223> Val or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (295)..(295) <223> Ala, Phe, Thr or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (310)..(310) <223> Val or Met <220> <221> MOD_RES <222> (322)..(322) <223> Arg, Gln, Gly or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (350)..(350) <223> Gln, Tyr, Arg or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (352)..(352) <223> Gly, Lys or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (353)..(353) <223> Asp or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (356)..(356) <223> Asn, Arg, Ser or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (359)..(359) <223> Thr or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (373)..(373) <223> Arg, Asp, Lys or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (380)..(380) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (399)..(399) <223> Phe or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (400)..(400) <223> Met or Val <220> <221> MOD_RES <222> (490)..(490) <223> Leu, Phe, Ile or Val <220> <221> MOD_RES <222> (529)..(529) <223> Asp, Gly, Asn or absent <400> 111 Met Glu Arg Thr Asn Ser Ile Glu Met Asp Gln Glu Arg Leu Thr Ala 1 5 10 15 Glu Met Ala Phe Lys Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Pro Asp Phe Met Thr Ser Ile Asn Val Lys Leu Leu Tyr His 35 40 45 Tyr Val Ile Thr Asn Leu Phe Asn Leu Cys Phe Phe Pro Leu Thr Ala 50 55 60 Ile Val Ala Gly Lys Ala Ser Arg Leu Thr Ile Asx Asp Leu His His 65 70 75 80 Leu Tyr Ser Tyr Leu Gln His Asn Leu Ile Thr Xaa Xaa Leu Leu Phe 85 90 95 Ala Phe Thr Val Phe Gly Ser Ile Leu Tyr Ile Val Thr Arg Pro Lys 100 105 110 Pro Val Tyr Leu Val Asp Tyr Ser 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Asn Gly Arg Ser 500 505 <210> 116 <211> 505 <212> PRT <213> Lunaria annua <400> 116 Met Thr Ser Ile Asn Val Lys Leu Leu Tyr His Tyr Val Ile Thr Asn 1 5 10 15 Phe Phe Asn Leu Cys Phe Phe Pro Leu Thr Ala Ile Leu Ala Gly Lys 20 25 30 Ala Ser Arg Leu Thr Thr Asn Asp Leu His His Phe Tyr Ser Tyr Leu 35 40 45 Gln His Asn Leu Ile Thr Leu Thr Leu Leu Phe Ala Phe Thr Val Phe 50 55 60 Gly Ser Val Leu Tyr Phe Val Thr Arg Pro Lys Pro Val Tyr Leu Val 65 70 75 80 Asp Tyr Ser Cys Tyr Leu Pro Pro Gln His Leu Ser Ala Gly Ile Ser 85 90 95 Lys Thr Met Glu Ile Phe Tyr Gln Ile Arg Lys Ser Asp Pro Leu Arg 100 105 110 Asn Val Ala Leu Asp Asp Ser Ser Ser Leu Asp Phe Leu Arg Lys Ile 115 120 125 Gln Glu Arg Ser Gly Leu Gly Asp Glu Thr Tyr Gly Pro Glu Gly Leu 130 135 140 Phe Glu Ile Pro Pro Arg Lys Asn Leu Ala Ser Ala Arg Glu Glu Thr 145 150 155 160 Glu Gln Val Ile Asn Gly Ala Leu Lys Asn Leu Phe Glu Asn Thr Lys 165 170 175 Val Asn Pro Lys Glu Ile Gly Ile Leu Val Val Asn Ser Ser Met Phe 180 185 190 Asn Pro Thr Pro Ser Leu Ser Ala Met Val Val Asn Thr Phe Lys Leu 195 200 205 Arg Ser Asn Ile Lys Ser Phe Asn Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ala 210 215 220 Gly Val Ile Ala Ile Asp Leu Ala Lys Asp Leu Leu His Val His Lys 225 230 235 240 Asn Thr Tyr Ala Leu Val Val Ser Thr Glu Asn Ile Thr Gln Asn Ile 245 250 255 Tyr Thr Gly Asp Asn Arg Ser Met Met Val Ser Asn Cys Leu Phe Arg 260 265 270 Val Gly Gly Ala Ala Ile Leu Leu Ser Asn Lys Pro Gly Asp Arg Arg 275 280 285 Arg Ser Lys Tyr Arg Leu Ala His Thr Val Arg Thr His Thr Gly Ala 290 295 300 Asp Asp Lys Ser Phe Gly Cys Val Arg Gln Glu Glu Asp Asp Ser Gly 305 310 315 320 Lys Thr Gly Val Ser Leu Ser Lys Asp Ile Thr Gly Val Ala Gly Ile 325 330 335 Thr Val Gln Lys Asn Ile Thr Thr Leu Gly Pro Leu Val Leu Pro Leu 340 345 350 Ser Glu Lys Ile Leu Phe Val Val Thr Phe Val Ala Lys Lys Leu Leu 355 360 365 Lys Asp Lys Ile Lys His Tyr Tyr Val Pro Asp Phe Lys Leu Ala Val 370 375 380 Asp His Phe Cys Ile His Ala Gly Gly Arg Ala Val Ile Asp Val Leu 385 390 395 400 Glu Lys Asn Leu Gly Leu Ser Pro Ile Asp Val Glu Ala Ser Arg Ser 405 410 415 Thr Leu His Arg Phe Gly Asn Thr Ser Ser Ser Ser Ile Trp Tyr Glu 420 425 430 Leu Ala Tyr Ile Glu Ala Lys Gly Arg Met Lys Lys Gly Asn Lys Ala 435 440 445 Trp Gln Ile Ala Val Gly Ser Gly Phe Lys Cys Asn Ser Ala Val Trp 450 455 460 Val Ala Leu Arg Asn Val Lys Ala Ser Ala Asn Ser Pro Trp Glu His 465 470 475 480 Cys Ile His Lys Tyr Pro Val Gln Met Tyr Ser Gly Ser Ser Lys Ser 485 490 495 Glu Thr Arg Ala Gln Asn Gly Arg Ser 500 505 <210> 117 <211> 503 <212> PRT <213> Tropaeolum majus <400> 117 Met Ser Gly Thr Lys Ala Thr Ser Val Ser Val Pro Leu Pro Asp Phe 1 5 10 15 Lys Gln Ser Val Asn Leu Lys Tyr Val Lys Leu Gly Tyr His Tyr Ser 20 25 30 Ile Thr His Ala Met Tyr Leu Phe Leu Thr Pro Leu Leu Leu Ile Met 35 40 45 Ser Ala Gln Ile Ser Thr Phe Ser Ile Gln Asp Phe His His Leu Tyr 50 55 60 Asn His Leu Ile Leu His Asn Leu Ser Ser Leu Ile Leu Cys Ile Ala 65 70 75 80 Leu Leu Leu Phe Val Leu Thr Leu Tyr Phe Leu Thr Arg Pro Thr Pro 85 90 95 Val Tyr Leu Leu Asn Phe Ser Cys Tyr Lys Pro Asp Ala Ile His Lys 100 105 110 Cys Asp Arg Arg Arg Phe Met Asp Thr Ile Arg Gly Met Gly Thr Tyr 115 120 125 Thr Glu Glu Asn Ile Glu Phe Gln Arg Lys Val Leu Glu Arg Ser Gly 130 135 140 Ile Gly Glu Ser Ser Tyr Leu Pro Pro Thr Val Phe Lys Ile Pro Pro 145 150 155 160 Arg Val Tyr Asp Ala Glu Glu Arg Ala Glu Ala Glu Met Leu Met Phe 165 170 175 Gly Ala Val Asp Gly Leu Phe Glu Lys Ile Ser Val Lys Pro Asn Gln 180 185 190 Ile Gly Val Leu Val Val Asn Cys Gly Leu Phe Asn Pro Ile Pro Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Met Ile Val Asn Arg Tyr Lys Met Arg Gly Asn Val Phe 210 215 220 Ser Tyr Asn Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ala Gly Val Ile Ser Ile 225 230 235 240 Asp Leu Ala Lys Asp Leu Leu Gln Val Arg Pro Asn Ser Tyr Ala Leu 245 250 255 Val Val Ser Leu Glu Cys Ile Ser Lys Asn Leu Tyr Leu Gly Glu Gln 260 265 270 Arg Ser Met Leu Val Ser Asn Cys Leu Phe Arg Met Gly Gly Ala Ala 275 280 285 Ile Leu Leu Ser Asn Lys Met Ser Asp Arg Trp Arg Ser Lys Tyr Arg 290 295 300 Leu Val His Thr Val Arg Thr His Lys Gly Thr Glu Asp Asn Cys Phe 305 310 315 320 Ser Cys Val Thr Arg Lys Glu Asp Ser Asp Gly Lys Ile Gly Ile Ser 325 330 335 Leu Ser Lys Asn Leu Met Ala Val Ala Gly Asp Ala Leu Lys Thr Asn 340 345 350 Ile Thr Thr Leu Gly Pro Leu Val Leu Pro Met Ser Glu Gln Leu Leu 355 360 365 Phe Phe Ala Thr Leu Val Gly Lys Lys Val Phe Lys Met Lys Leu Gln 370 375 380 Pro Tyr Ile Pro Asp Phe Lys Leu Ala Phe Glu His Phe Cys Ile His 385 390 395 400 Ala Gly Gly Arg Ala Val Leu Asp Glu Leu Glu Lys Asn Leu Lys Leu 405 410 415 Ser Ser Trp His Met Glu Pro Ser Arg Met Ser Leu Tyr Arg Phe Gly 420 425 430 Asn Thr Ser Ser Ser Ser Leu Trp Tyr Glu Leu Ala Tyr Ser Glu Ala 435 440 445 Lys Gly Arg Ile Lys Lys Gly Asp Arg Val Trp Gln Ile Ala Phe Gly 450 455 460 Ser Gly Phe Lys Cys Asn Ser Ala Val Trp Lys Ala Leu Arg Asn Val 465 470 475 480 Asn Pro Ala Glu Glu Lys Asn Pro Trp Met Asp Glu Ile His Leu Phe 485 490 495 Pro Val Glu Val Pro Leu Asn 500

Claims (98)

  1. 선택적으로 서열 번호 76에 대해 적어도 65% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 23S rRNA를 포함하고, 선택적으로 절대 종속영양성이며, 선택적으로 세포가 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스 상에서 성장할 수 있도록 외인성 수크로스 전화효소 유전자를 포함하는 유지성 미세조류 세포로서, 상기 세포는 활성 LPAAT 효소를 암호화하는 외인성 유전자를 포함하고, 상기 세포는 트리글리세리드를 포함하는 오일을 생성하되, 오일은
    (a) 중쇄 지방산을 포함하는 트리글리세리드가 풍부
    (b) 포화-불포화-포화 유형의 트리글리세리드가 풍부한
    LPAAT 활성 때문인, 세포.
  2. 제1항에 있어서, 오일의 트리글리세리드는 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80% 이상의 C8:0, C10:0, C12:0, C14:0, 또는 C16:0 지방산을 포함하는 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포는 활성 FATB 아실-ACP 티오에스테라제를 암호화하는 외인성 유전자를 추가로 포함하는 세포.
  4. 제3항에 있어서, 오일의 트리글리세리드는 외인성 LPAAT 및 아실-ACP 티오에스테라제의 발현의 결과로서 70% 초과만큼 중쇄 지방산이 풍부화된 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 외인성 KAS I 또는 KAS IV 효소를 암호화하거나 내인성 KAS I 효소의 활성을 감소시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 선택적으로 조절가능한 프로모터를 통해 델타 12 지방산 불포화효소의 발현을 감소시켜 리놀레산 및 리놀렌산이 FAME GC/FID에 의해 전체 영역의 5% 이하인 오일을 생성하도록 조작가능한 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  7. 제1항에 있어서, 오일은 포화-불포화-포화 유형의 트리글리세리드가 풍부화되는 세포.
  8. 제7항에 있어서, 오일은 SOS, POS, 및/또는 POP가 풍부화되는 세포.
  9. 제8항에 있어서, 오일은 적어도 50%의 SOS, 그리고 선택적으로 10% 미만의 SSS를 포함하는 트리글리세리드를 포함하는 세포.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 스테아로일-ACP 불포화효소 유전자, FatA 유전자, 또는 이 둘 모두의 녹아웃 또는 녹다운을 추가로 포함하는 세포.
  11. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-케토아실 CoA 합성 효소 활성을 증가시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  12. 제11항에 있어서, 베타-케토실 합성 효소 활성을 증가시키도록 조작가능한 핵산은 베타-케토아실 CoA 합성 효소를 암호화하는 외인성 유전자를 포함하는 세포.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 오일 중 스테아레이트 대 올리에이트의 비는 3:1 ± 20%인 세포.
  14. 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 오일 중 POP, SOS, 및 POS는 총합 중 적어도 30%를 구성하는 세포.
  15. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 오일은 적어도 30%의 POS를 포함하는 세포.
  16. 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 오일은 POP를 16% ±20%로, POS를 38%±20%로, SOS를 23% ± 20%로 포함하는 세포.
  17. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 오일의 지방산 프로파일은 1% 내지 4%의 아라키드산을 포함하는 세포.
  18. 제7항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 선택적으로 조절가능한 프로모터를 통해 델타 12 지방산 불포화효소의 발현을 감소시켜 리놀레산 및 리놀렌산이 전체 영역 5% 이하인 오일을 생성하도록 조작가능한 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  19. 제7항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 오일은 65% 초과의 SOS, 45% 미만의 불포화 지방산, 5% 미만의 다가불포화 지방산, 1% 미만의 라우르산, 및 2% 미만의 트랜스 지방산을 가지는 세포.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, LPAAT는 서열 번호 78 또는 서열 번호 79의 아미노산 서열 또는 서열 번호 78 또는 서열 번호 79와 적어도 95%의 동일성을 가지는 서열을 가지는 세포.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 세포를 제공하거나 배양하는 단계, 및 오일을 추출하는 단계를 포함하는 오일을 생성하는 방법으로서, 상기 세포는 선택적으로 종속영양적으로 배양되는 방법.
  22. 제21항에 따라서 생성되는 트리글리세리드를 포함하는 오일.
  23. 제22항에 있어서,
    적어도 10%의 에르고스테롤;
    에르고스테롤 및 β-시토스테롤(여기서, 에르고스테롤 대 β-시토스테롤의 비는 25:1 초과임);
    에르고스테롤 및 브라시카스테롤; 및
    에르고스테롤, 브라시카스테롤, 및 포리페라스테롤
    중 하나 이상을 포함하며,
    여기서, 오일에는 선택적으로 β-시토스테롤, 캄페스테롤, 및 스티그마스테롤 중 하나 이상이 없는 오일.
  24. 제22항에 있어서, 오일은 β 다형체 결정을 형성하는 오일.
  25. 제24항에 있어서, 결정은 2L 라멜라 구조를 가지는 오일.
  26. 제24항에 있어서, 결정은 3L 라멜라 구조를 가지는 오일.
  27. 제22항에 있어서, 오일은 β' 다형체 결정을 형성하는 오일.
  28. 제24항에 있어서, 결정은 2L 라멜라 구조를 가지는 오일.
  29. 제24항에 있어서, 결정은 3L 라멜라 구조를 가지는 오일.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 트리글리세리드는 스테아레이트 및 팔미테이트의 백분율의 총합이 올리에이트 백분율의 2.0배 +/- 40%와 동일한 것을 특징으로 하는 지방산 프로파일을 가지는 오일.
  31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 오일은 65% 초과의 SOS 트리글리세리드, 45% 미만의 불포화 지방산, 5% 미만의 불포화 지방산, 1% 미만의 라우르산, 및 2% 미만의 트랜스 지방산을 가지는 오일.
  32. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 지방산 프로파일 중 스테아레이트 및 팔미테이트 백분율의 총합은 올리에이트의 백분율의 2배± 20%인 오일.
  33. 제32항에 있어서, sn-2 프로파일은 적어도 40%의 올리에이트를 가지는 오일.
  34. 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 오일은 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 SOS인 오일.
  35. 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 오일은 용융 온도가 30℃ 내지 40℃인 롤인 쇼트닝인 오일.
  36. 제35항에 있어서, β' 다형체 결정을 포함하는 오일.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 35℃에서 고형 지방 함량이 15% 미만인 오일.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 15% 내지 20%의 C8 내지 C14 지방산, 45% 내지 50%의 C16 이상의 지방산, 및/또는 30% 내지 25%의 불포화 지방산을 포함하는 오일.
  39. 제22항 내지 제38항 중 어느 한 항의 오일을 사용하여 생산되는 식품, 연료 또는 화학 제품.
  40. 천연 오일 또는 천연 오일로부터 생성된 RBD 오일로서, 상기 오일은 3.5% 이하의 포화 지방산을 포함하고, 선택적으로 50% 초과의 올레산 및/또는 1% 초과의 팔미톨레산을 포함하는 오일.
  41. 제40항에 있어서, 0.1% 내지 3.5%의 포화 지방산을 가지는 오일.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 적어도 90%의 올레산을 포함하는 오일.
  43. 제42항에 있어서, 적어도 3%의 다가불포화 지방산을 포함하는 오일.
  44. 선택적으로 서열 번호 76에 대해 적어도 65% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 23S rRNA를 포함하고, 선택적으로 절대 종속영양성이며, 3.5% 이하의 포화 지방산을 포함하는 오일을 생성하는 유기질 세포.
  45. 제44항에 있어서, 세포는 프로토테카 속의 것인 세포.
  46. 제44항에 있어서, FATA 녹아웃 또는 녹다운을 추가로 포함하는 세포.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 플라미토일-CoA로 팔미토일-CoA를 불포화시키는데 활성인 효소를 암호화하는 외인성 유전자를 포함하는 세포.
  48. 제47항에 있어서, 외인성 유전자는 PAD 유전자인 세포.
  49. 제47항에 있어서, 외인성 유전자는 팔미토일-ACP에 대한 불포화효소 활성을 가지는 SAD 유전자인 세포.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 과발현된 KASII 효소를 추가로 포함하는 세포.
  51. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로 조절가능한 프로모터를 통해 델타 12 지방산 불포화효소의 발현을 감소시켜 리놀레산 및 리놀렌산이 전체 영역 5% 이하인 오일을 생성하도록 조작가능한 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  52. 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항의 세포에 의해 생성된 오일로서, 선택적으로 정련, 표백 및 탈취되고, 상기 오일은
    적어도 10%의 에르고스테롤;
    에르고스테롤 및 b-시토스테롤(여기서, 에르고스테롤 대 b-시토스테롤의 비는 25:1 초과임);
    에르고스테롤 및 브라시카스테롤; 및
    에르고스테롤, 브라시카스테롤, 및 포리페라스테롤
    중 하나 이상을 포함하며,
    여기서, 오일에는 선택적으로 -시토스테롤, 캄페스테롤, 및 스티그마스테롤 중 하나 이상이 없는 오일.
  53. 포화 지방신이 3.5% 이하인 오일을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항의 세포를 제공하거나 배양하는 단계, 및 세포로부터 오일을 추출하는 단계를 포함하는 방법.
  54. 제53항의 방법에 의해 생성된 오일을 식품에 혼입시키는 단계를 포함하는 식품을 생성하는 방법으로서, 최종 식품 제품은 포화 지방이 3.5% 이하인 방법.
  55. 선택적으로 서열 번호 76에 대해 적어도 65% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 23S rRNA를 포함하고, 선택적으로 절대 종속영양성인 재조합 유기질 세포로서, 상기 세포는 활성 케토아실-CoA 합성효소를 암호화하는 외인성 유전자를 포함하는 세포.
  56. 제55항에 있어서, 세포는 20% 초과의 에루크산을 포함하는 오일을 생성하는 세포.
  57. 제56항에 있어서, 세포는 60% 초과의 에루크산을 포함하는 오일을 생성하는 방법.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 적어도 40%의 오일을 포함하는 세포.
  59. 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 프로토테카 속의 것이고, 선택적으로 프로토테카 모리포르미스 종의 것인 세포.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항의 세포에 의해 생성되는 오일로서,
    적어도 10%의 에르고스테롤;
    에르고스테롤 및 β-시토스테롤(여기서, 에르고스테롤 대 β-시토스테롤의 비는 25:1 초과임);
    에르고스테롤 및 브라시카스테롤; 및
    에르고스테롤, 브라시카스테롤, 및 포리페라스테롤
    중 하나 이상을 포함하며,
    여기서, 오일에는 선택적으로 β-시토스테롤, 캄페스테롤, 및 스티그마스테롤 중 하나 이상이 없는 오일.
  61. 제60항의 오일로부터 생성된 화학 물질.
  62. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 따른 세포를 제공하거나 배양하는 단계, 및 세포로부터 오일을 추출하는 단계를 포함하는 오일을 생성하는 방법.
  63. 델타 12 지방산 불포화효소 유전자 산물의 활성을 억제하여 세포가 5% 미만의 리놀레산을 가지는 트리아실글리세롤 프로파일을 가지는 오일을 생성하도록 조작가능한 재조합 핵산을 포함하는 재조합 유지성 세포.
  64. 제63항에 있어서, 세포는 3% 미만의 리놀레산을 가지는 트리아실글리세롤 프로파일을 가지는 오일을 생성하는 세포.
  65. 제64항에 있어서, 세포는 2% 미만의 리놀레산을 가지는 트리아실글리세롤 프로파일을 가지는 오일을 생성하는 세포.
  66. 제63항에 있어서, 세포는 리놀레산 영양요구체이거나 또는 델타 12 지방산 불포화효소의 활성은 오일을 생성하기 위한 환경적 조건을 통해 억제될 수 있는 세포.
  67. 제66항에 있어서, 델타 12 지방산 불포화효소는 델타 12 지방산 불포화효소 유전자에 대한 조작가능한 연관에서 조절가능한 프로모터에 기인하는 환경적 조건을 통해 조절가능한 세포.
  68. 제67항에 있어서, 조절가능한 프로모터는 배지 pH 또는 질소 수준에서의 변화에 의해 조절가능한 세포.
  69. 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 KASII, LPAAT, 또는 FATB 효소를 발현하도록 조작가능한 재조합 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  70. 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 스테아로일 ACP 불포화효소의 발현을 녹아웃 또는 녹다운시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  71. 제64항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 FatA-암호화 아실-ACP 티오에스테라제의 발현을 녹아웃 또는 녹다운시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 추가로 포함하는 세포.
  72. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 오일은 AOCS Cd 12b-92 랜시매트 테스트의 조건 하에서 전도도에서의 변곡점이 20시간까지 아직 도달되지 않도록 110℃에서 안정적인 세포.
  73. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 1050 ppm의 토코페롤 및 500 pm의 아스코빌 팔미테이트가 오일에 첨가될 때, 오일은 AOCS Cd 12b-92 랜시매트 테스트의 조건 하에서 전도도에서의 변곡점이 5일까지 아직 도달되지 않도록 110℃에서 안정적인 세포.
  74. a) 선택적으로 서열 번호 76에 대해 적어도 65% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 23S rRNA를 포함하고, 선택적으로 절대 종속영양성인 재조합 유지성 세포를 제공하는 단계로서, 상기 세포는 환경적 조건에서의 변화에 대한 반응에서 세포에 의해 만들어진 지방산의 양을 변형시키도록 조작가능한 재조합 핵산을 포함하는 단계;
    (b) 세포 분열을 가능하게 하고 세포의 수를 증가시키기 위한 지방산의 합성에 허용된 제1 환경적 조건 하에서 세포를 배양시키는 단계;
    (c) 재조합 핵산에 기인하여 지방산의 합성을 감소시키고 그에 따라 세포에 의해 생성된 오일 중의 해당 지방산의 양을 감소시키는 제2 환경적 조건 하에서 세포를 배양시키는 단계; 및
    (d) 세포로부터 오일을 추출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 세포는 오일 중 리놀레산의 양을 감소시키기 위하여 델타 12 지방산 불포화효소의 활성을 감소시키도록 조작가능한 외인성 핵산을 포함하는 방법.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 리놀레산은 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 오일에서 고갈되는 방법.
  77. 제74항 내지 제76항에 있어서, 세포는 종속영양적으로 배양되는 방법.
  78. 제74항 내지 제77항에 있어서, 세포는 미세조류 세포인 방법.
  79. 제74항 내지 제78항에 있어서, 세포는 건조 세포 중량으로 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%의 오일을 생성하는 방법.
  80. 제74항 내지 제79항에 있어서, 제1 환경적 조건은 배양 배지의 제1 pH이고, 제2 환경적 조건은 배양 배지의 제2 pH인 방법.
  81. 제74항 내지 제80항에 있어서, 세포로부터 추출될 때, 오일은 AOCS Cd 12b-92 랜시매트 테스트의 조건 하에서 전도도에서의 변곡점이 20시간까지 아직 도달되지 않도록 110℃에서 안정적인 세포.
  82. 제74항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 1050 ppm의 토코페롤 및 500 pm의 아스코빌 팔미테이트가 오일에 첨가될 때, 오일은 AOCS Cd 12b-92 랜시매트 테스트의 조건 하에서 전도도에서의 변곡점이 5일까지 아직 도달되지 않도록 110℃에서 안정적인 세포.
  83. 제74항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 KAS II 효소를 암호화하는 외인성 유전자 및 선택적으로 FatA 유전자의 녹아웃 또는 녹다운을 포함하는 방법.
  84. 제74항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 의해 제조된 지방산의 양을 변형시키도록 조작가능한 재조합 핵산은 FAD 유전자를 표적화하는 저해 RNA를 포함하고, 저해 RNA의 생성은 조절가능한 프로모터의 제어 하에 있는 방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 오일은 올레산이 60% 초과이고, 다가불포화물이 3% 미만인 지방산 프로파일을 특징으로 하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 오일은 올레산이 70% 초과이고, 다가불포화물이 2% 미만인 지방산 프로파일을 특징으로 하는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 오일은 올레산이 80% 초과이고, 다가불포화물이 1% 미만인 지방산 프로파일을 특징으로 하는 방법.
  88. 제74항 내지 제87항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 오일.
  89. 제88항에 있어서, 0.01% 내지 2%의 리놀레산 및 (i) 80% 내지 95%의 올레산 또는 (ii) 40% 초과의 C8, C10, C12, C14 또는 C16 지방산을 포함하는 오일.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서,
    적어도 10%의 에르고스테롤;
    에르고스테롤 및 b-시토스테롤(여기서, 에르고스테롤 대 b-시토스테롤의 비는 25:1 초과임);
    에르고스테롤 및 브라시카스테롤; 및
    에르고스테롤, 브라시카스테롤, 및 포리페라스테롤;
    중 하나 이상을 추가로 포함하는 오일.
  91. 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항의 오일로부터 생성된 제품.
  92. 제91항에 있어서, 제품은 식품, 연료 또는 화학 물질인 제품.
  93. 제91항에 있어서, 제품은 튀김 기름, 윤활유, 세정 용제, 계면활성제, 거품 또는 윤활제인 제품.
  94. 제91항에 있어서, 제품은 올레산 다이머인 제품.
  95. 서열 번호 77 내지 서열 번호 79에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 작제물, 벡터, 염색체 또는 숙주 세포.
  96. 제95항에 있어서, 서열 번호 77 내지 서열 번호 79에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는 작제물, 벡터, 염색체 또는 숙주 세포.
  97. 제95항에 있어서, 서열 번호 77 내지 서열 번호 79에 대해 적어도 98% 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는 작제물, 벡터, 염색체 또는 숙주 세포.
  98. 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 80 내지 서열 번호 85에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 또는 유전 암호의 축퇴에 의한 동등한 서열을 포함하는 작제물, 벡터, 염색체 또는 숙주 세포.
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