CN108064268A - 增加脂质产生和优化脂质组成 - Google Patents

Abstract

本发明公开可用以操纵细胞的脂质含量和/或组成的Arxula adeninivorans基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。本发明公开了用于利用该信息的方法和组合物以通过增加或降低某些基因靶的活性增加细胞的脂质含量或修改脂质组成。

Description

增加脂质产生和优化脂质组成

优先权要求

本申请要求于2014年5月29日提交的美国临时专利申请号62/004,506和于2014年12月10日提交的美国临时专利申请号62/090,169的优先权的权益。

序列表

本申请包含序列表，其已经以ASCII格式电子提交并通过引用以其整体结合到本文中。所述ASCII拷贝创建于2015年5月18日，名为NGX-03325_SL.txt，大小为657,774字节。

背景

脂质为食品和化妆品工业中不可缺少的成分，并且它们是生物柴油和生物化学工业中的重要前体。许多产油微生物产生脂质，包括很好表征的酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。

Arxula adeninivorans (Blastobotrys adeninivorans)是一种不如解脂耶氏酵母表征得好的产油酵母。事实上，当前，尚无工业的基于A. adeninivorans的过程，可能是因为Arxula adeninivorans是一种具有许多不寻常特征的酵母。其为二态的并且可利用宽范围的底物作为碳、氮、磷和能量源，包括淀粉、木糖、乙酸、乙醇、阿拉伯糖、纤维二糖、植酸、腺嘌呤、黄嘌呤、尿酸、腐胺和正烷基胺。A. adeninivorans也为硝酸盐-同化以及热-和渗透-耐受的。一个显著特征为其在37℃有效生长的能力，和温度依赖的二态性以及42℃以上温度时形成的菌丝结构。

概述

公开了可用以操纵细胞的脂质含量和组成的Arxula adeninivorans基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。公开了用于利用该信息的方法和组合物以通过增加或降低某些基因靶的活性增加细胞的脂质含量或修改脂质组成。

附图简述

图1描绘用于在A. adeninivorans菌株NS252 (ATCC 76597)中过表达NG167基因(AaDga1)的pNC363构建体的图谱。转化前通过PmeI/AscI限制酶切消化线性化载体pNC363。“2u ori”表示来自2 μm环状质粒的酿酒酵母复制起点；“pMB1 ori”表示来自pBR322质粒的大肠杆菌pMB1复制起点；“AmpR表示用作氨苄青霉素选择标志的bla基因；“Sc URA3”表示用于在酵母中选择的酿酒酵母URA3营养缺陷型标志；PR26 PGK1p表示A. adeninivoransPGK1启动子-524至-1；“NG3 NatR”表示用作诺尔斯菌素(nourscohricin)选择标志的诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei) Nat1基因；“ScFBA1t”表示终止后205 bp的酿酒酵母FBA1终止子；“PR25 AaADH1p”表示A. adeninivorans ADH1启动子-877至-1；“NG167AaDGA1”表示A. adeninivorans DGA1基因ORF (NG167)；“TER16 CYC1t”表示终止密码子后301 bp的A. adeninivorans CYC1终止子。

图2描绘用于在A. adeninivorans菌株NS252 (ATCC 76597)中缺失NG166基因的缺失盒的图谱。“NG166 5’ Flank”表示用作用于NG166缺失的重组侧翼的NG166开放阅读框的上游500碱基对；“PR26 PGK1p”表示A. adeninivorans PGK1启动子-524至-1；“NG3NatR”表示用作诺尔斯菌素选择标志的诺尔斯链霉菌Nat1基因；“ScFBA1t”表示终止后205bp的酿酒酵母FBA1终止子；“NG166 3’ Flank”表示用作用于NG166缺失的重组侧翼的NG166开放阅读框的下游500碱基对。

图3描绘用于过表达二酰基甘油酰基转移酶DGA1基因NG66的pNC243构建体的图谱。转化前通过PacI/NotI限制酶切消化线性化载体pNC243。“2u ori”表示来自2 μm环状质粒的酿酒酵母复制起点；“pMB1 ori”表示来自pBR322质粒的大肠杆菌pMB1复制起点；“AmpR表示用作氨苄青霉素选择标志的bla基因；“PR2”表示解脂耶氏酵母GPD1启动子-931至-1；“NG66”表示由GenScript合成的天然圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides) DGA1cDNA；“TER1”表示终止后300碱基对的解脂耶氏酵母CYC1终止子；“PR22”表示酿酒酵母TEF1启动子-412至-1；“NG3”表示用作诺尔斯菌素筛选标志的诺尔斯链霉菌Nat1基因；“TER2”表示终止后275碱基对的酿酒酵母CYC1终止子；和“Sc URA3”表示用于在酵母中选择的酿酒酵母URA3营养缺陷型标志。

图4描绘对于A. adeninivorans菌株NS252，用包含来自多个物种的DGAT2基因的核酸转化菌株后，为棕榈酸酯、棕榈油酸酯、硬脂酸酯、油酸酯和亚油酸酯的C16和C18脂肪酸的百分比。DGAT2基因编码DGA1蛋白。

图5描绘用于过表达NG15基因(YlDga1)的pNC104构建体的图谱。转化前通过PacI/NotI限制酶切消化线性化载体pNC243。“2u ori”表示来自2 μm环状质粒的酿酒酵母复制起点；“pMB1 ori”表示来自pBR322质粒的大肠杆菌pMB1复制起点；“AmpR”表示用作氨苄青霉素选择标志的bla基因；“ScGPM1p”表示解脂耶氏酵母GPD1启动子-764至-1；“hygR”表示用作潮霉素B选择标志的大肠杆菌hph基因表达盒；“ScGPM1t”表示终止密码子后406 bp的酿酒酵母GPD1终止子；“ARS68”和“CEN1-1”表示解脂耶氏酵母染色体复制起点；“YlTEF1p”表示解脂耶氏酵母TEF启动子-406至+125；“YlDGA1”表示解脂耶氏酵母DGA1基因ORF (NG15)；“YlCYC1t”表示终止后300碱基对的解脂耶氏酵母CYC1终止子；“ScTEF1p”表示酿酒酵母TEF1启动子-412至-1；“NAT”表示用作诺尔斯菌素选择标志的诺尔斯链霉菌Nat1基因；“ScCYC1t”表示终止后275碱基对的酿酒酵母CYC1终止子；和“URA3p-ScURA3-URA3t”表示用于在酵母中选择的酿酒酵母URA3营养缺陷型标志。

图6描绘用于过表达NG16基因的pNC281构建体的图谱。转化前通过PacI/AscI限制酶切消化线性化载体pNC281。“2u ori”表示来自2 μm环状质粒的酿酒酵母复制起点；“pMB1ori”表示来自pBR322质粒的大肠杆菌pMB1复制起点；“AmpR表示用作氨苄青霉素选择标志的bla基因；“PR3”表示解脂耶氏酵母TEF1启动子-406至+125；“NG16”表示从解脂耶氏酵母菌株NRRL YB-437的gDNA扩增的天然解脂耶氏酵母DGA2基因；“TER1”表示终止后300 bp的解脂耶氏酵母CYC1终止子；“PR1”表示解脂耶氏酵母TEF1启动子-406至-1；“NG76”表示用作博来霉素（Zeocin）选择标志的印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)BLE基因；“TER7”表示终止后400 bp的解脂耶氏酵母TEF1终止子；和“Sc URA3”表示用于在酵母中选择的酿酒酵母URA3营养缺陷型标志。

图7描绘野生型Arxula adeninivorans (菌株NS252)、Arxula adeninivorans菌株NS458 (其包含TGL3敲除)、Arxula adeninivorans菌株NS481 (其包含TGL4敲除)和Arxula adeninivorans菌株NS478 (其包含Δ12去饱和酶敲除)的相对脂质含量，如通过基于荧光的脂质测定而评估的。TGL3和TGL4敲除各包含比野生型菌株更高的脂质含量。

图8描绘对于表达A. adeninivorans或解脂耶氏酵母Δ9去饱和酶基因的解脂耶氏酵母菌株，为棕榈酸酯、棕榈油酸酯、硬脂酸酯、油酸酯和亚油酸酯的C16和C18脂肪酸的百分比。

图9描绘如使用基于荧光的测定所测量的，解脂耶氏酵母菌株NS18 (野生型)、NS563 (缺失解脂耶氏酵母SCT1)和NS804 (在NS563背景中过表达A. adeninivorans SCT1)的脂质积累。菌株在96孔板中一式两份生长。

图10描绘对于携带天然MFE1、TGL3、Δ12、PEX10、POX、和TGL4基因缺失的A. adeninivorans菌株，为棕榈酸酯、棕榈油酸酯、硬脂酸酯、油酸酯和亚油酸酯的C16和C18脂肪酸的百分比。

图11由4个面板组成，标记为面板(A)、(B)、(C)和(D)。面板描绘来自对于随机整合Arxula adeninivorans基因DGA1 (NG167)、DGA2 (NG168)、GPD1 (NG170)、SLC1 (NG177)、SCT1 (NG183)、ZWF1 (NG211)、GND1 (NG212)和PAH1 (NG218)的解脂耶氏酵母(面板(A)和(B))和A. adeninivorans (面板(C)和(D))转化体，96孔板脂质测定的结果。

图12描绘对于Arxula adeninivorans菌株NS554 (野生型Arxula adeninivorans 菌株NS252中Δ12敲除)和NS631 (在NS554背景中过表达Arxula adeninivoransELO1)，C16和C18脂肪酸的相对比例。Δ12敲除中Arxula adeninivoransELO1的表达增加C18脂肪酸的分数。

详述

综述

存在许多策略以通过基因工程增加或修改产油生物的脂质产生或含量。然而，多数产油生物在中温（mesophylic temperature）时生长相对缓慢，并且许多需要额外的工程改造以利用戊糖。产油酵母Arxula adeninivorans具有从多种底物产生脂质并在高温时快速生长的潜能，这可导致减少的生物精炼操作和资本费用以及减少的微生物污染风险。

产油生物的脂质产率和脂质组成可通过上调和/或下调或缺失各种脂质途径中牵涉的或调节各种脂质途径的基因而修改。除了操纵天然基因外，还可将外源基因引入宿主基因组中以调节脂质产生和组成。

本发明描述通过工程改造A. adeninivorans生产脂质的组合物和方法，并且这些组合物和方法普遍适用于其它生物以增加脂质产生水平和改变生物的脂质组成谱。增加脂质产生水平的方法涉及上调对脂质含量具有正面作用的基因靶和下调对脂质含量具有负面作用的靶。相似地，改变脂质组成谱的方法涉及上调对特定目的脂肪酸具有正面作用的基因靶和下调对特定脂肪酸具有负面作用的靶。例如，可修饰基因靶以增加细胞的棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸或亚油酸含量。可修饰基因靶以增加细胞中脂质、三酰基甘油酯、脂肪醇、脂肪酸、烷烃类、烯烃类、类异戊二烯、异戊二烯、角鲨烯、法呢烯、醇类、异丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、2-丁醇、丁二烯、二醇、1,3丙二醇、1,4丙二醇、丁二酸、己二酸、尼龙前体、柠檬酸、苹果酸、多元醇或赤藓糖醇的浓度。

定义

冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个或一个以上(即，至少一个)冠词的语法对象。例如，“一个元件”意指一个元件或一个以上元件。

术语“活性”指细胞实现一种功能的总能力。例如，降低细胞中三酰基甘油脂肪酶活性的遗传修饰可减少细胞中三酰基甘油脂肪酶的量或减少三酰基甘油脂肪酶的效率。三酰基甘油脂肪酶敲除减少细胞中三酰基甘油脂肪酶的量。或者，三酰基甘油脂肪酶基因的突变可减少其三酰基甘油脂肪酶蛋白产物的效率，而对细胞三酰基甘油脂肪酶的量几乎无作用。减少三酰基甘油脂肪酶效率的突变可，例如，通过改变一个或多个活性位点残基影响活性位点；其可，例如，通过空间阻塞底物或产物损伤酶动力学；其可，例如，通过减少适当折叠的酶的比例影响蛋白质折叠或动力学；其可，例如，通过阻止脂肪酶定位到脂质颗粒影响蛋白定位；或其可，例如，通过添加一个或多个蛋白切割位点或通过添加靶向蛋白用于蛋白酶解的一个或多个残基或氨基酸序列影响蛋白质降解。这些突变影响编码区。降低三酰基甘油脂肪酶活性的突变可替代地影响基因的转录或翻译。例如，三酰基甘油脂肪酶增强子或启动子的突变可通过减少其表达减少三酰基甘油脂肪酶活性。突变或缺失三酰基甘油脂肪酶基因的非编码部分，例如其内含子，也可减少转录或翻译。另外，三酰基甘油脂肪酶上游调控因子的突变可影响三酰基甘油脂肪酶活性；例如，过表达一种或多种阻遏物可降低三酰基甘油脂肪酶活性，敲除或突变一种或多种激活物可相似地降低三酰基甘油脂肪酶活性。增加细胞中二酰基甘油酰基转移酶活性的遗传修饰可增加细胞中三酰基甘油酰基转移酶的量或增加二酰基甘油酰基转移酶的效率。例如，遗传修饰可简单地在细胞中插入额外的二酰基甘油酰基转移酶拷贝，以致额外拷贝转录和翻译为额外的功能性二酰基甘油酰基转移酶。添加的二酰基甘油酰基转移酶基因可为宿主生物天然的或来自不同的生物。或者，突变或缺失天然二酰基甘油酰基转移酶基因的非编码部分，例如其内含子，也可增加翻译。天然二酰基甘油酰基转移酶基因可通过添加导致更多转录的新启动子改变。相似地，可向二酰基甘油酰基转移酶基因添加增加转录的增强子，或可从二酰基甘油酰基转移酶基因突变或缺失沉默子以增加转录。天然基因编码区的突变也可，例如，通过防止与抑制蛋白或分子相互作用，增加二酰基甘油酰基转移酶活性。过表达一种或多种激活物可通过增加其表达增加二酰基甘油酰基转移酶的活性，敲除或突变一种或多种阻遏物可相似地增加二酰基甘油酰基转移酶活性。

术语“生物学活性部分”指小于全长氨基酸序列但呈现全长序列的至少一种活性的氨基酸序列。例如，二酰基甘油酰基转移酶的生物学活性部分可指具有将酰基-CoA和二酰基甘油转化为三酰基甘油的生物学活性的DGA1或DGA2的一个或多个结构域。DGA1蛋白的生物学活性部分包括包含与DGA1蛋白的氨基酸序列足够同一或从其衍生的氨基酸序列的肽或多肽，例如SEQ ID NOs: 15、117、119、121、123、125、127、129、131或133中列出的氨基酸序列，其包含比全长DGA1少的氨基酸，并呈现DGA1蛋白的至少一种活性。通常，生物学活性部分包含具有将酰基-CoA和二酰基甘油转化为三酰基甘油的催化活性的结构域或基序。DGA1蛋白的生物学活性部分可为，例如，262个氨基酸长的多肽。

术语“DGAT1”指编码1型二酰基甘油酰基转移酶蛋白的基因，例如编码DGA2蛋白的基因。

术语“DGAT2”指编码2型二酰基甘油酰基转移酶蛋白的基因，例如编码DGA1蛋白的基因。

“二酰基甘油酯”、“二酰基甘油”和“甘油二酯”为由甘油和两个脂肪酸组成的酯。

术语“二酰基甘油酰基转移酶”和“DGA”指催化从二酰基甘油形成三酰基甘油酯的任何蛋白。二酰基甘油酰基转移酶包括1型二酰基甘油酰基转移酶(DGA2)、2型二酰基甘油酰基转移酶(DGA1)和催化上述反应的所有同源物。

术语“二酰基甘油酰基转移酶，1型”和“1型二酰基甘油酰基转移酶”指DGA2和DGA2直向同源物。

术语“二酰基甘油酰基转移酶，2型”和“2型二酰基甘油酰基转移酶”指DGA1和DGA1直向同源物。

术语“结构域”指能够不依赖其余蛋白折叠成稳定三维结构的蛋白的氨基酸序列的一部分。

术语“药物”指抑制细胞生长或增殖，从而对包含赋予药物抗性的基因的细胞提供选择优势的任何分子。药物包括抗生素、抗微生物剂、毒素和杀虫剂。

“干重”和“干细胞重”意指在相对缺乏水时测定的重量。例如，对产油细胞作为包含按干重计特定百分比的特定组分的提及意指该百分比基于去除基本上所有的水之后的细胞重量计算。

术语“编码”指包含编码区、部分编码区或其互补(compliments)的核酸。DNA和RNA二者均可编码基因。DNA和RNA二者均可编码蛋白。

术语“外源的”指引入细胞中的任何东西。“外源核酸”为穿过细胞膜进入细胞的核酸。外源核酸可包含细胞的天然基因组中存在的核苷酸序列和/或先前在其基因组中不存在的核苷酸序列。外源核酸包括外源基因。“外源基因”为已经引入细胞(例如，通过转化/转染)的编码用于RNA和/或蛋白的表达的核酸，也称为“转基因”。包含外源基因的细胞可称为重组细胞，可向其中引入额外的外源基因。外源基因可来自相对于转化细胞相同或不同的物种。因此，外源基因可包含相对于基因的内源拷贝在细胞基因组中占据不同位置或在不同控制下的天然基因。外源基因在细胞中可以以一个以上拷贝存在。外源基因可作为基因组(核或质体)中的插入物或作为附加体分子在细胞中维持。

术语“表达”指细胞中核酸或氨基酸序列(例如，肽、多肽或蛋白)的量。增加的基因表达指该基因转录增加。氨基酸序列、肽、多肽或蛋白的增加表达指编码氨基酸序列、肽、多肽或蛋白的核酸的翻译增加。

如本文所使用的，术语“基因”可包括含有内含子的基因组序列，特别是编码特定活性中涉及的多肽序列的多核苷酸序列。该术语进一步包括不从基因组序列衍生的合成核酸。在某些实施方案中，基因缺乏内含子，因为它们基于cDNA和蛋白质序列的已知DNA序列合成。在其它实施方案中，基因为合成的非天然cDNA，其中密码子基于密码子使用对于在解脂耶氏酵母中表达优化。该术语可进一步包括包含上游、下游和/或内含子核苷酸序列的核酸分子。

术语“遗传修饰”指转化的结果。按照定义每一转化导致一个遗传修饰。

如本文所使用的，术语“同源物”指(a) 相对于未修饰的目的蛋白具有氨基酸置换、缺失和/或插入并具有与衍生其的未修饰蛋白相似的生物学和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白和酶，和(b) 编码具有(a)中所描述的相同特征的肽、寡肽、多肽、蛋白和酶的核酸。

“可诱导的启动子”为响应特定刺激介导操作性连接的基因的转录的启动子。

术语“整合的”指作为细胞基因组中的插入物(例如，染色体中的插入物，包括质体基因组中的插入物)维持在细胞中的核酸。

“可操作连接”为两个核酸序列之间的功能性连接，如控制序列(通常启动子)和连接的序列(通常编码蛋白的序列，也称为编码序列)。如果其可介导基因的转录，那么启动子与基因可操作连接。

术语“敲除突变”或“敲除”指防止天然基因被转录或翻译为功能蛋白的遗传修饰。

术语“天然的”指转化事件之前细胞或亲本细胞的组成。“天然基因”指编码未通过转化事件引入细胞中的蛋白的核苷酸序列。“天然蛋白”指天然基因编码的氨基酸序列。

术语“核酸”指任何长度的多聚体形式的核苷酸，无论脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可实施任何功能。以下为多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区，从连锁分析定义的基因座、外显子、内含子、信使RNA (mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，核苷酸结构的修饰可在聚合物组装之前或之后给予。多核苷酸可，例如通过与标记元件连接进一步修饰。在本文所提供的所有核酸序列中，U核苷酸与T核苷酸可互换。

缩写“ORF”代表开放阅读框。

术语“亲本细胞”指细胞由其传下的每一细胞。细胞的基因组由亲本细胞的基因组和任何后续对其基因组的遗传修饰组成。

如本文所使用的，术语“质粒”指与生物的基因组DNA物理上分离的环形DNA分子。质粒可在引入宿主细胞之前线性化(本文称为线性化质粒)。线性化的质粒不可自主复制，但可整合入并随生物体的基因组DNA复制。

术语“部分”指肽、寡肽、多肽、蛋白质结构域和蛋白质。编码“蛋白的一部分”的核苷酸序列包括可转录和/或翻译的核苷酸序列和必须经历一个或多个重组事件以被转录和/或翻译的核苷酸序列二者。例如，核酸可包含编码可选择标志蛋白的一个或多个氨基酸的核苷酸序列。该核酸可经工程改造以与编码该蛋白其余部分的一个或多个不同核苷酸序列重组。这样的核酸可用于产生敲除突变，因为仅与靶序列重组可能重构全长的可选择标志基因，而随机整合事件不可能导致可产生功能标志蛋白的核苷酸序列。多肽的“生物学活性部分”为多肽的氨基酸序列中存在的小于全部氨基酸序列但可实现与全长多肽相同功能的任何氨基酸序列。二酰基甘油酰基转移酶的生物学活性部分包括全长二酰基甘油酰基转移酶中存在的可催化从二酰基甘油和酰基-CoA形成三酰基甘油的任何氨基酸序列。多肽的生物学活性部分包括具有与全长肽相同的活性的多肽部分和具有比背景更多活性的每一部分。例如，二酰基甘油酰基转移酶的生物学活性部分可具有相对于全长多肽百分之0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9、100、100.1、100.2、100.3、100.4、100.5、100.6、100.7、100.8、100.9、101、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400的活性或更高。多肽的生物学活性部分可包括缺乏将多肽靶向至细胞区室的结构域的肽部分。

“启动子”为指导核酸转录的核酸控制序列。如本文所使用的，启动子包含转录起始位点附近的必需核酸序列。启动子还任选包含远侧增强子或阻遏物元件，其可位于距转录起始位点多达几千碱基对处。

“重组体”指已经因为引入外源核酸或改变天然核酸而修饰的细胞、核酸、蛋白或载体。因此，例如，重组细胞可表达天然(非重组)形式的细胞中不存在的基因或与非重组细胞表达的那些基因相比有差别地表达天然基因。重组细胞可，但不限于，包含编码基因产物或减少细胞中活性基因产物水平的阻遏元件例如突变、敲除、反义、干扰RNA (RNAi)或dsRNA的重组核酸。“重组核酸”为一般通过，例如，使用聚合酶、连接酶、外切核酸酶和内切核酸酶操纵核酸最初在体外形成的核酸或另外为通常天然不存在的形式。可产生重组核酸，例如，以可操作连接放置两个或多个核酸。因此，通过连接通常天然不连接的DNA分子体外形成的分离核酸或表达载体二者均认为是用于本发明目的的重组体。一旦制成重组核酸并引入宿主细胞或生物中，其可使用宿主细胞的体内细胞机构复制；然而，一旦重组产生，尽管随后在细胞内复制，这样的核酸仍被认为是用于本发明目的的重组体。相似地，“重组蛋白”为使用重组技术，即，通过表达重组核酸制造的蛋白。

术语“调控区”指影响基因的转录或翻译但不编码氨基酸序列的核苷酸序列。调控区包括启动子、操纵子、增强子和沉默子。

“转化”指核酸转移入宿主生物或宿主生物的基因组中，导致遗传上稳定的遗传。包含转化的核酸片段的宿主生物称为“重组”、“转基因”或“转化”生物。因此，本发明的分离多核苷酸可并入能够引入宿主细胞并在其中复制的重组构建体(通常DNA构建体)中。这样的构建体可为包含在给定宿主细胞中能够转录和翻译多肽-编码序列的复制系统和序列的载体。通常，表达载体包含，例如，一个或多个在5'和3'调控序列转录控制下的克隆基因和可选择的标志。这样的载体也可包含启动子调控区(例如，控制可诱导或组成型、环境或发育调节的或位置特异性表达的调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。

术语“转化细胞”指经历过转化的细胞。因此，转化细胞包含亲本的基因组和可遗传的遗传修饰。

术语“三酰基甘油酯”、“三酰基甘油”、“甘油三酯”和“TAG”为甘油和三个脂肪酸组成的酯。

术语“三酰基甘油脂肪酶”指可催化脂肪酸链从三酰基甘油移除的蛋白质。三酰基甘油脂肪酶包括TGL3。

术语“载体”指通过其核酸可在生物、细胞或细胞元件之间传播和/或转移的手段。载体包括可能或可能不能够自主复制或整合入宿主细胞染色体中的质粒、线性DNA片段、病毒、噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子和人工染色体等。

微生物工程

A. 综述

在本发明的某些实施方案中，微生物经遗传修饰以增加其三酰基甘油含量或修改其脂质谱。

基因和基因产物可引入微生物宿主细胞中。用于表达基因和核酸分子的合适的宿主细胞为真菌和细菌家族中可广泛存在的微生物宿主。合适的宿主菌株的实例包括但不限于真菌或酵母物种，例如Arxula、曲霉属(Aspergillus)、Aurantiochytrium、假丝酵母属(Candida)、麦角菌属(Claviceps)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、地霉属(Geotrichum)、汉森酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、柯达菌属(Kodamaea)、Leucosporidiella、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、Ogataea、毕赤酵母属(Pichia)、原壁菌属(Prototheca)、根霉属(Rhizopus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、Tremella、毛孢子菌属(Trichosporon)、威克汉森酵母属(Wickerhamomyces)和耶氏酵母属(Yarrowia)或细菌物种，例如变形菌门和放线菌成员，以及属不动细菌属(Acinetobacter)、节细菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、食酸菌属(Acidovorax)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridia)、链球菌属(Streptomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)和棒状杆菌属(Cornyebacterium)。解脂耶氏酵母和Arxula adeninivorans非常适合用作宿主微生物，因为其可积累其重量的很大百分比为三酰基甘油。

本领域技术人员已知微生物表达系统和包含指导外源蛋白高水平表达的调控序列的表达载体。任何这些均可用于构建嵌合基因以产生本发明序列的基因产物的任一。这些嵌合基因可然后经由转化技术引入适当微生物中以提供酶的高水平表达。

例如，编码酶的基因可克隆入合适的质粒中，并且可用所得的质粒转化前述作为宿主的起始亲本菌株。该方法可增加编码酶的每一基因的拷贝数目，并且因此可增加酶的活性。质粒不受特别限制，只要其提供微生物子代可遗传的期需基因。

可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒为本领域所熟知的。通常载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、可选择标志和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5'区域和控制转录终止的DNA片段3'区域。两个控制区均可从与转化宿主细胞同源的基因衍生，尽管应理解这样的控制区不一定从选择作为生产宿主的特定物种的天然基因衍生。

启动子、cDNA和3'UTR，以及载体的其它元件，可使用从天然源分离的片段通过克隆技术产生(Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克 隆：实验室手册), (第4版, 2012); 美国专利号4,683,202; 通过引用结合)。或者，元件可使用已知方法合成产生(Gene 164:49-53 (1995)).

B. 同源重组

同源重组为互补DNA序列对齐和交换同源区域的能力。包含与靶向的基因组序列(“模板”)同源的序列的转基因DNA (“供体”)引入生物中，然后经历在相应的基因组同源序列位点重组入基因组中。

在宿主生物中进行同源重组的能力对于可在分子遗传水平进行的那些具有许多实践含义，并且可用于产生可生产期需产物的微生物。就其本质而言，同源重组为精确的基因靶向事件，因此，用同一靶向序列产生的多数转基因系在表型方面将基本同一，使需要筛选极少的转化事件。同源重组还靶向宿主染色体中的基因插入事件，潜在地导致出色的遗传稳定性，即使在缺乏遗传选择时。由于不同的染色体基因座将有可能影响基因表达，即使来自异源启动子/UTR，同源重组可为在不熟悉的基因组环境中查询基因座和评估这些环境对基因表达的影响的方法。

一个特别有用的使用同源重组的基因工程方法为指派(co-opt)特定宿主调控元件例如启动子/UTR以用高度特异的方式驱动异源基因表达。

因为同源重组为精确的基因靶向事件，其可用于精确修饰目的区域或基因内的任何核苷酸，只要已经鉴定足够的侧翼区域。因此，同源重组可用作修饰影响RNA和/或蛋白的基因表达的调控序列的手段。其还可用于修饰蛋白编码区以试图修饰酶活性例如底物特异性、亲和力和Km，由此影响宿主细胞代谢的期需变化。同源重组提供操纵宿主基因组的有力手段，这导致基因靶向、基因转变、基因缺失、基因重复、基因倒位和交换基因表达调控元件例如启动子、增强子和3'UTR。

同源重组可通过使用包含内源序列片段的靶向构建体以“靶向”内源宿主细胞基因组中的目的基因或区域达到。这样的靶向序列可位于目的基因或区域的5'、目的基因/区域的3'或甚至目的基因/区域的两侧。这样的靶向构建体可作为具有额外的载体骨架的超螺旋质粒DNA、作为无载体骨架的PCR产物或作为线性化分子转化入宿主细胞中。在一些情况下，首先通过用限制酶切割转基因DNA暴露转基因DNA (供体DNA)内的同源序列可为有利的。该步骤可增加重组效率和减少不期需事件的发生。增加重组效率的其它方法包括使用PCR产生含有与靶向的基因组序列同源的线性末端的转化的转基因DNA。

C. 载体和载体元件

鉴于本文的公开内容，用于本发明的微生物转化的载体可通过本领域技术人员熟悉的已知技术制备。载体通常包含一个或多个基因，其中每一基因编码用于一种期需产物(基因产物)的表达并且与调控基因表达或将基因产物靶向至重组细胞中的特定位置的一个或多个控制序列操作性连接。

1. 控制序列

控制序列为调控编码序列的表达或指引基因产物至细胞内或外的特定位置的核酸。调控表达的控制序列包括，例如，调控编码序列转录的启动子和终止编码序列转录的终止子。另一个控制序列为位于编码序列末端的编码多腺苷酸化信号的3'非翻译序列。指引基因产物至特定位置的控制序列包括编码信号肽的那些，其指引其连接的蛋白至细胞内或外的特定位置。

因此，用于在微生物中表达基因的一个示例性的载体设计包含与在酵母中与有活性的启动子可操作连接的期需基因产物(例如，可选择的标志或酶)的编码序列。或者，如果载体不包含与目的编码序列操作性连接的启动子，编码序列可转化入细胞中以致其变得在载体整合点与内源启动子操作性连接。

用于表达基因的启动子可为与该基因天然连接的启动子或不同的启动子。

启动子一般可表征为组成型或可诱导的。组成型启动子一般在所有时间(或在细胞生命周期的某些时间)以相同的水平活动或发挥功能以驱动表达。相反，可诱导的启动子仅响应刺激而活动(或致使不活动)或显著上调或下调。两种类型的启动子均可用于本发明方法。可用于本发明的可诱导启动子包括响应刺激，例如外源提供的小分子、温度(热或冷)、培养基中缺乏氮等，介导操作性连接的基因的转录的那些。合适的启动子可激活基本上沉默的基因的转录或上调，优选大量上调以低水平转录的操作性连接的基因的转录。

包含终止区控制序列为任选的，并且如果采用，那么选择主要为一种方便，因为终止区相对可互换的。终止区可为转录起始区(启动子)天然的，可为目的DNA序列天然的，或可从另一个源获得(参见，例如，Chen & Orozco, Nucleic Acids Research 16:8411(1988))。

2. 基因和密码子优化

通常，基因包含启动子、编码序列和终止控制序列。当通过重组DNA技术组装时，基因可被称为表达盒并且两侧可为限制位点用于方便插入用于将重组基因引入宿主细胞的载体中。表达盒两侧可为来自基因组或其它核酸靶的DNA序列以促进表达盒通过同源重组稳定整合入基因组中。或者，载体及其表达盒可保持未整合(例如，附加体)，在该情况下，载体通常包含复制起点，其能够提供载体DNA的复制。

载体上存在的共有基因为编码其表达允许区分包含该蛋白的重组细胞与不表达该蛋白的细胞的蛋白的基因，这样的基因，和其相应的基因产物，称为可选择标志或选择标志。可用于转化本发明生物的转基因构建体中可采用各种各样的可选择标志中的任何。

对于重组蛋白的最佳表达，使用产生具有待转化的宿主细胞所最佳使用的密码子的mRNA的编码序列是有益的。因此，转基因的适当表达可需要转基因的密码子使用与表达该转基因的生物的特定密码子偏好性匹配。该效果背后的精确机制有许多，但包括可用的氨酰化tRNA库与细胞中正在合成的蛋白的适当平衡，当该需求满足时，匹配以转基因信使RNA (mRNA)的更有效翻译。当转基因中的密码子使用不是最佳时，可用的tRNA库不足以允许转基因mRNA有效翻译，导致核糖体失速和终止以及可能的转基因mRNA不稳定。

D. 转化

细胞可通过任何合适的技术转化，包括，例如，生物射弹、电穿孔、玻璃珠转化和碳化硅晶须转化。本发明中可使用任何用于将转基因引入到微生物中的方便技术。转化可通过，例如，D. M. Morrison的方法(Methods in Enzymology 68:326 (1979))、通过用氯化钙增加受体细胞对DNA的渗透性的方法(Mandel & Higa, J. Molecular Biology, 53:159(1970))等达到。

在产油酵母(例如，解脂耶氏酵母)中表达转基因的实例可在文献中找到(Bordes等人, J. Microbiological Methods, 70:493 (2007); Chen等人, AppliedMicrobiology & Biotechnology 48:232 (1997))。在细菌，例如大肠杆菌，中表达外源基因的实例众所周知(Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分 子克隆：实验室手册), (第4版, 2012))。

用于本发明微生物转化的载体可通过本领域技术人员熟悉的已知技术制备。在一个实施方案中，用于在微生物中表达基因的示例性的载体设计包含与在微生物中有活性的启动子可操作连接的编码酶的基因。或者，如果载体不包含与目的基因操作性连接的启动子，基因可转化入细胞中以致其变得在载体整合点与天然启动子操作性连接。载体可还包含编码蛋白的第二个基因。任选，一个或两个基因随后为含有多聚腺苷酸化信号的3'非翻译序列。编码两个基因的表达盒可物理连接在载体中或在单独的载体上。也可使用微生物共转化，其中同时使用不同的载体分子转化细胞(Protist 155:381-93 (2004))。转化细胞可任选基于在缺乏该抗性盒的细胞将会不生长的条件下在抗生素或其它可选择标志存在下生长的能力而选择。

示例性核酸、细胞和方法

A. 二酰基甘油酰基转移酶核酸分子和载体

二酰基甘油酰基转移酶用作增加蛋白质活性的模型，并且下述组合物和方法一般性地适用于多种生物中的其它蛋白。

二酰基甘油酰基转移酶可为1型二酰基甘油酰基转移酶、2型二酰基甘油酰基转移酶或催化二酰基甘油转化为三酰基甘油的任何其它蛋白。在一些实施方案中，二酰基甘油酰基转移酶为DGA1。例如二酰基甘油酰基转移酶可为选自解脂耶氏酵母、Arxula adeninivorans、圆红冬孢酵母菌、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、土曲霉(Aspergillus terreus)、麦角菌(Claviceps purpurea)和裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)的DGAT2基因编码的DGA1蛋白。

DGAT2基因可具有SEQ ID NOs: 16、118、120、122、124、126、128、130、132或134列出的核苷酸序列。在其它实施方案中，DGAT2基因与SEQ ID NOs: 16、118、120、122、124、126、128、130、132或134基本相同，并且核苷酸序列编码保留SEQ ID NOs: 16、118、120、122、124、126、128、130、132或134所编码的蛋白的功能活性的蛋白，但由于天然等位基因变异或诱变引起核苷酸序列不同。在另一个实施方案中，DGAT2基因包含与SEQ ID NOs: 16、118、120、122、124、126、128、130、132或134至少约70%、72%、64%、76%、78%、80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更多同一的核苷酸序列。

DGA1蛋白可具有SEQ ID NOs: 15、117、119、121、123、125、127、129、131或133中列出的氨基酸序列。在其它实施方案中，DGA1蛋白与SEQ ID NOs: 15、117、119、121、123、125、127、129、131或133基本相同，并保留SEQ ID NOs: 15、117、119、121、123、125、127、129、131或133的蛋白的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变引起氨基酸序列不同。在另一个实施方案中，DGA1蛋白包含与SEQ ID NO: SEQ ID NOs: 15、117、119、121、123、125、127、129、131或133至少约80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更多同一的氨基酸序列。

在一些实施方案中，二酰基甘油酰基转移酶为DGA2。例如，所述二酰基甘油酰基转移酶可为选自解脂耶氏酵母、圆红冬孢酵母菌、斯达氏油脂酵母、土曲霉、Arxula adeninivorans、麦角菌和球毛壳菌(Chaetomium globosum)的生物中存在的DGAT1基因编码的DGA2蛋白。

DGAT1基因可具有SEQ ID NO: 18、136、138、140、142、144或146中列出的核苷酸序列。在其它实施方案中，DGAT1基因与SEQ ID NO: 18、136、138、140、142、144或146基本相同，并且核苷酸序列编码保留SEQ ID NO: 18、136、138、140、142、144或146所编码蛋白的功能活性的蛋白，但由于天然等位基因变异或诱变引起核苷酸序列不同。在另一个实施方案中，DGAT1基因包含与SEQ ID NO: 18、136、138、140、142、144或146至少约70%、72%、64%、76%、78%、80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更多同一的核苷酸序列。

DGA2蛋白可具有SEQ ID NO: 17、135、137、139、141、143或145中列出的氨基酸序列。在其它实施方案中，DAG2蛋白与SEQ ID NO: 17、135、137、139、141、143或145基本相同，并保留SEQ ID NO: 17、135、137、139、141、143或145的蛋白的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变引起氨基酸序列不同。在另一个实施方案中，DGA2蛋白包含与SEQ ID NO:17、135、137、139、141、143或145至少约80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更多同一的氨基酸序列。

DGAT2和DGAT1基因可包含保守置换、缺失和/或插入而仍编码具有功能性二酰基甘油酰基转移酶活性的蛋白。例如，可对于特定宿主细胞优化DGAT2和DGAT1密码子，为了方便可置换不同的密码子，例如以引入限制位点或创建最佳的PCR引物，或可为了另一种目的置换密码子。相似地，可改变核苷酸序列以创建保守的氨基酸置换、缺失和/或插入。

DGA1和DGA2多肽可包含保守置换、缺失和/或插入，而仍保持功能性二酰基甘油酰基转移酶活性。保守置换表为本领域所熟知(Creighton, Proteins (第二版, 1992))。

氨基酸置换、缺失和/或插入可使用本领域熟知的肽合成技术容易地制造，例如固相肽合成和/或任何其它合成技术，或通过重组DNA操作。用于操纵DNA序列以产生蛋白的置换、插入或缺失变体的方法为本领域所熟知。例如，用于在DNA中的预定位点制造置换突变的技术为本领域技术人员所熟知，并且包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB, Cleveland,OH)、Quick Change Site Directed mutagenesis (快速改变定点诱变) (Stratagene,San Diego, CA)、PCR-介导的定点诱变或其它定点诱变方案。

为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，可为了最佳比较目的对齐序列(例如，在第一个或第二个氨基酸或核酸序列的一个或两个中可引入缺口用于最佳对齐并且为了比较目的可忽视非同一序列)。为了比较目的对齐的参考序列的长度可为参考序列长度的至少95%。然后可比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的位置被与第二个序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么分子在该位置同一(如本文所使用的氨基酸和核酸“同一性”等于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的百分比同一性为序列共享的相同位置的数目的函数，考虑为了两个序列的最佳比对需要引入的缺口数目和每一缺口的长度。

序列的比较和两个序列之间百分比同一性的测定可使用数学算法实现。在一个实施方案中，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可使用并入GCG软件包(在http://www.gcg.com可得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch (J. Molecular Biology 48:444-453 (1970))算法，使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵和缺口权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6测定。在又一个实施方案中，两个多核苷酸序列之间的百分比同一性可使用GCG软件包(在http://www.gcg.com可得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和缺口权重40、50、60、70或80以及长度权重1、2、3、4、5或6测定。在另一个实施方案中，两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性可使用已经并入ALIGN程序(版本2.0或2.0U)中的E. Meyers和W. Miller算法(Computer Applications in the Biosciences 4:11-17 (1988))，使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4测定。

可用于测定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序包括，但不限于，BLAST程序组，例如，BLASTN、MEGABLAST、BLASTX、TBLASTN、TBLASTX和BLASTP，和Clustal程序，例如，ClustalW、ClustalX和Clustal Omega。

当相对于GenBank DNA序列和其它公共数据库中的核酸序列评估给定核酸序列时，序列查找通常使用BLASTN程序进行。BLASTX程序对于针对GenBank蛋白质序列和其它公共数据库中的氨基酸序列查找以所有阅读框翻译的核酸序列有效。

为了确定两个或多个序列之间“%同一性”比对所选择的序列使用例如，CLUSTAL-W程序进行。

“编码序列”或“编码区”指当表达序列时，具有产生蛋白产物，例如氨基酸或多肽所需的序列信息的核酸分子。编码序列可在翻译区内包含非翻译序列(包括内含子或5'或3'非翻译区)和/或由其组成，或可缺乏这样的间插非翻译序列(例如，如在cDNA中)。

整个说明书中用以指包含核苷酸序列和/或由核苷酸序列组成的核酸的缩写为常规的单字母缩写。因此当包含在核酸中时，天然存在的编码核苷酸如下缩写：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。同样，除非另有说明，本文呈现的核酸序列为5’→3’方向。

如本文所使用的，术语“互补的”及其衍生物关于核酸配对使用，即按照熟知的法则：A与T或U配对，C与G配对。互补可为“部分的”或“完全的”。在部分互补中，仅一些核酸碱基按照碱基配对法则匹配；而在完全或全体互补中，所有碱基按照配对法则匹配。核酸链之间的互补程度可对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著作用，如本领域所熟知的。所述杂交的效率和强度取决于检测方法。

如本文所使用的，“DGA1”意指二酰基甘油酰基转移酶2型(DGAT2)。DGA1为植物、真菌和哺乳动物中催化油生物合成和三酰基甘油产生中最终的酶促步骤的必备膜蛋白。DGA1可在改变产油生物的油中所产生的长链多不饱和脂肪酸的量中发挥关键作用。DGA1与酰基-辅酶A:胆固醇酰基转移酶(“ACAT”)有关。该酶导致酰基从酰基-辅酶A转移至1,2-二酰基甘油(“DAG”)的sn-3位以形成三酰基甘油(“TAG”) (从而参与TAG生物合成的终端步骤)。DAG1与植物和真菌中，特别是在含油种子中，的膜和脂质体分数有关，在其中它促成作为能量储备的碳贮存。认为TAG是一种重要的在细胞中储存能量的化学品。已知DAG1调节TAG结构和指导TAG合成。

DAG1多核苷酸和多肽序列可从具有非常高天然水平的脂质积累的高度产油生物衍生。(Bioresource Technology 144:360-69 (2013); Progress Lipid Research 52:395-408 (2013); Applied Microbiology & Biotechnology 90:1219-27 (2011);European Journal Lipid Science & Technology 113:1031-51 (2011); FoodTechnology & Biotechnology 47:215-20 (2009); Advances Applied Microbiology51:1-51 (2002); Lipids 11:837-44 (1976))。具有约50%及以上的报道脂质含量的生物的列表在表1中示出。圆红冬孢酵母菌和斯达氏油脂酵母具有最高的脂质含量。在表1的生物中，仅五种具有可公开访问的DGA1序列，圆红冬孢酵母菌、斯达氏油脂酵母、裂殖壶菌、土曲霉和麦角菌(表1中粗体)。

表1. 具有约50%及以上报道脂质含量的产油真菌的列表。具有可公开访问的DGA1基因序列的生物为粗体。

USSN 61/943,664和PCT专利申请号US15/017227 (二者均通过引用结合到本文中)中描述了用于增加DGA1活性的核酸构建体。图3显示用于在解脂耶氏酵母中过表达圆红冬孢酵母菌DGA1基因NG66 (SEQ ID NO: 6)的表达构建体pNC243。DGA1表达构建体在转化前通过PacI/NotI限制酶切消化线性化。线性表达构建体每一包含DGA1基因和用作诺尔斯菌素(NAT)选择标志的Nat1基因的表达盒。

用于增加DAG2和/或其它二酰基甘油酰基转移酶活性的核酸构建体可使用上文描述的方法和/或本领域已知的其它方法创建。相似地，增加其它蛋白活性的核酸构建体可如上文对于DGA1所描述的和/或通过本领域已知的其它方法工程改造。

B. 三酰基甘油脂肪酶核酸分子和载体

三酰基甘油脂肪酶用作降低蛋白活性的模型，并且下述组合物和方法一般性地适用于多种生物中的其它蛋白质。

三酰基甘油脂肪酶通过移除一个或多个脂肪链消耗细胞的三酰基甘油。因此，降低细胞的净三酰基甘油脂肪酶活性可增加细胞的三酰基甘油。该降低可通过减少酶效率，例如，通过突变其活性位点的氨基酸，或通过减少酶表达实现。例如，TGL3敲除突变将降低三酰基甘油脂肪酶的活性，因为其防止细胞转录TGL3。

在一些实施方案中，三酰基甘油脂肪酶为TGL3。

解脂耶氏酵母中的TGL3基因编码三酰基甘油脂肪酶蛋白TGL3 (SEQ ID NO:147)。SEQ ID NO: 148包含TGL3核苷酸序列、100上游核苷酸和100下游核苷酸。因此，SEQID NO: 148核苷酸序列可用于设计能够与天然解脂耶氏酵母三酰基甘油脂肪酶基因中的核酸序列重组的核酸。

敲除盒SEQ ID NOS: 160和161能够与解脂耶氏酵母中的天然TGL3基因重组。因此，在一些实施方案中，SEQ ID NOS: 160和161编码的核酸可用于在解脂耶氏酵母中产生三酰基甘油脂肪酶敲除突变。SEQ ID NOS: 160和161每一包含潮霉素抗性基因hph的一部分。两个分离的序列均不编码功能蛋白，但当成功重组时两个序列能够编码赋予潮霉素抗性的功能激酶。此外，SEQ ID NO: 160和SEQ ID NO: 161均不包含启动子或终止子，因此其依赖于与解脂耶氏酵母TGL3基因同源重组以便转录和翻译hph基因。以这种方式，成功转化的产油细胞可通过在包含潮霉素的培养基上生长细胞而选择。

敲除盒SEQ ID NO: 160可通过用引物NP1798 (SEQ ID NO: 157)和引物NP656(SEQ ID NO: 154)扩增潮霉素抗性基因hph (SEQ ID NO: 152)制备。敲除盒SEQ ID NO:161可通过用引物NP655 (SEQ ID NO: 153)和引物NP1799 (SEQ ID NO: 158)扩增潮霉素抗性基因hph (SEQ ID NO: 152)制备。

可使用不同的方法设计在解脂耶氏酵母中减少TGL3基因活性的核酸(BiochimicaBiophysica Acta 1831:1486-95 (2013))。可使用本文所公开的方法和本领域已知的其它方法减少多个物种，包括Arxula adeninivorans中三酰基甘油脂肪酶和其它基因的活性。

C. 转化的细胞

在一些实施方案中，转化的细胞为原核细胞，例如细菌细胞。在一些实施方案中，细胞为真核细胞，例如酵母细胞或丝状真菌细胞。

细胞可选自Arxula、曲霉属、Aurantiochytrium、假丝酵母属、麦角菌属、隐球菌属、小克银汉霉属、地霉属、汉森酵母属、克鲁维酵母属、柯达菌属、Leucosporidiella、油脂酵母属、被孢霉属、Ogataea、毕赤酵母属、原壁菌属、根霉属、红冬孢酵母属、红酵母属、酵母属、裂殖酵母属、Tremella、毛孢子菌属、威克汉森酵母属和耶氏酵母属。

在一些实施方案中，细胞选自Arxula adeninivorans、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus orzyae)、土曲霉、裂殖壶菌、产朊假丝酵母(Candida utilis)、麦角菌、浅白隐球菌、弯曲隐球菌、Cryptococcus ramirezgomezianus、地生隐球菌、Cryptococcus wieringae、刺孢小克银汉霉、山茶小克银汉霉、发酵地霉(Geotrichum fermentans)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、奥默柯达菌(Kodamaea ohmeri)、Leucosporidiella creatinivora、产油油脂酵母、斯达氏油脂酵母、子囊菌油脂酵母、深黄被孢霉、高山被孢霉(Mortierella alpina)、Ogataea polymorpha、西弗毕赤酵母(Pichia ciferrii)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、树干毕赤酵母(Pichia stipites)、左氏原壁菌、少根根霉、Rhodosporidium babjevae、圆红冬孢酵母菌、海洋红酵母、粘红酵母、胶红酵母、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、稷酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、Tremella enchepala、皮肤毛孢子菌、发酵毛孢子菌、西弗威克汉森酵母(Wickerhamomyces ciferrii)和解脂耶氏酵母。

在某些实施方案中，转化的细胞为高温耐受的酵母细胞。在一些实施方案中转化的细胞为马克斯克鲁维酵母。

在某些实施方案中，所述细胞为解脂耶氏酵母或Arxula adeninivorans。

D. 增加细胞中蛋白的活性

蛋白活性可通过过表达蛋白增加。蛋白可使用各种遗传修饰在细胞中过表达。在一些实施方案中，遗传修饰增加天然蛋白的表达。天然蛋白可通过修饰天然基因的上游转录调控因子过表达，例如通过增加转录激活因子的表达或降低转录阻遏物的表达。或者，可通过与外源核酸重组用组成型活性或可诱导的启动子替换天然基因的启动子。

在一些实施方案中，遗传修饰编码至少一个基因拷贝。所述基因可为细胞天然的或来自不同物种的基因。在某些实施方案中，基因可遗传给转化细胞的子代。在一些实施方案中，基因可遗传，因为其位于质粒上。在某些实施方案中，基因可遗传，因为其整合入转化细胞的基因组中。

在某些实施方案中，基因为来自土曲霉、Arxula adeninivorans、裂殖壶菌、麦角菌、斯达氏油脂酵母、圆红冬孢酵母菌或解脂耶氏酵母的2型二酰基甘油酰基转移酶基因(“DGAT2”)。在某些实施方案中，二酰基甘油酰基转移酶通过用编码二酰基甘油酰基转移酶基因的基因转化细胞而过表达。遗传修饰可编码一个或一个以上二酰基甘油酰基转移酶基因拷贝。在某些实施方案中，遗传修饰编码来自圆红冬孢酵母菌的DGA1蛋白的至少一个拷贝。在一些实施方案中，遗传修饰编码来自圆红冬孢酵母菌的DGA1蛋白的至少一个拷贝并且转化细胞为解脂耶氏酵母。在一些实施方案中，遗传修饰编码来自圆红冬孢酵母菌的DGA1蛋白的至少一个拷贝并且转化细胞为Arxula adeninivorans。

在某些实施方案中，基因为来自土曲霉、Arxula adeninivorans、球毛壳菌、麦角菌、斯达氏油脂酵母、圆红冬孢酵母菌或解脂耶氏酵母的1型二酰基甘油酰基转移酶基因(“DGAT1”)。在某些实施方案中，二酰基甘油酰基转移酶通过用编码二酰基甘油酰基转移酶基因的基因转化细胞过表达。遗传修饰可编码一个或一个以上二酰基甘油酰基转移酶基因拷贝。在某些实施方案中，遗传修饰编码来自麦角菌的DGA2蛋白的至少一个拷贝。在一些实施方案中，遗传修饰编码来自麦角菌的DGA2蛋白的至少一个拷贝并且转化细胞为解脂耶氏酵母。在一些实施方案中，遗传修饰编码来自麦角菌的DGA2蛋白的至少一个拷贝并且转化细胞为Arxula adeninivorans。

在一些实施方案中，DGA1蛋白来自圆红冬孢酵母菌并且DGA2蛋白来自麦角菌。在一些实施方案中，DGA1蛋白来自圆红冬孢酵母菌，DGA2蛋白来自麦角菌，并且转化细胞为解脂耶氏酵母。在一些实施方案中，DGA1蛋白来自圆红冬孢酵母菌，DGA2蛋白来自麦角菌，并且转化细胞为Arxula adeninivorans。

E. 降低细胞中蛋白的活性

蛋白质的活性可使用各种不同的遗传修饰降低。在一些实施方案中，转化细胞包含降低天然蛋白活性的遗传修饰。这样的遗传修饰可影响调节基因转录的蛋白，包括降低转录激活子表达和/或增加转录阻遏物表达的修饰。影响调控蛋白的修饰可既降低靶蛋白的表达也改变使细胞平衡向增加的脂质积累或修改的脂质组成移动的其它基因表达谱。或者，遗传修饰可为引入小干扰RNA，或编码小干扰RNA的核酸。在其它实施方案中，遗传修饰由核酸和基因调控区，包括操纵子、启动子、启动子上游序列、增强子和基因下游序列的同源重组组成。

在一些实施方案中，转化的产油细胞包含由同源重组事件组成的遗传修饰。在某些实施方案中，转化细胞包含由基因与核酸之间的同源重组事件组成的遗传修饰。因此，遗传修饰缺失基因、阻止其转录，或阻止可转录为完全活性蛋白的基因转录。同源重组事件可突变或缺失基因的部分。例如，同源重组事件可突变酶活性位点中的一个或多个残基，从而减小酶的效率或致使其失活。或者，同源重组事件可影响翻译后修饰、折叠、稳定性或在细胞中的定位。在一些实施方案中，同源重组事件用驱动较少转录的启动子替换启动子。在其它实施方案中，同源重组事件突变启动子以损伤其驱动转录的能力。在某些实施方案中，遗传修饰为敲除突变。

敲除突变可缺失基因。此外，敲除突变可用编码不同蛋白的外源基因置换天然基因。外源基因可与外源启动子操作性连接。在某些实施方案中，外源基因不与外源启动子连接，替代地，外源基因配置为与天然基因重组以致天然基因的启动子驱动外源基因转录。因此，如果随机整合入细胞的基因组中外源基因不太可能表达。用于创建敲除的方法为本领域所熟知(参见，例如，Fickers等人, J. Microbiological Methods 55:727 (2003))。

在某些实施方案中，遗传修饰包括两个同源重组事件。在第一个事件中，编码外源基因的一部分的核酸与天然基因重组，在第二个事件中，编码外源基因剩余部分的核酸与天然基因重组。外源基因的两部分设计为使得两个部分均无功能除非其彼此重组。这两个事件进一步减少外源基因可在随机整合事件之后表达的可能性。

在某些实施方案中，外源基因编码显性可选择标志。因此，敲除细胞可通过标志筛选选择。在一些实施方案中，显性可选择标志为药物抗性标志。药物抗性标志为当细胞表达时允许细胞在正常会抑制细胞生长和/或存活的药物存在下生长和/或存活的显性可选择标志。表达药物抗性标志的细胞可通过在药物存在下让细胞生长来选择。在一些实施方案中，药物抗性标志为抗生素抗性标志。在一些实施方案中，药物抗性标志赋予对选自以下的药物的抗性：两性霉素B、杀假丝菌素、菲律宾菌素、哈霉素、游霉素、制霉菌素、龟裂霉素、联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、艾沙康唑（Isavuconazole）、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬净、阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、苯甲酸、环吡酮、氟胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、灰黄霉素、卤丙炔氧苯、水蓼二醛、托萘酯、结晶紫、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、大观霉素、格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明、链霉素、氯碳头孢、厄他培南（Ertapenem）、多利培南、亚胺培南、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢洛林酯(Ceftaroline fosamil)、头孢吡罗、替考拉宁、万古霉素、特拉万星(Telavancin)、氯林肯霉素、林可霉素、达托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、呋喃妥因、利奈唑胺、泼斯唑来(Posizolid)、雷得唑来(Radezolid)、特地唑来(Torezolid)、阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、阿莫西林G、盘尼西林V、哌拉西林、盘尼西林G、替莫西林、替卡西林、克拉维酸、舒巴克坦、三唑巴坦、克拉维酸、杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酮酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替马沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺地托辛（Sulfadimethoxine）、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole)、磺胺(Sulfanilimide)、柳氮磺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、复方新诺明（Co-trimoxazole）、2,4-二氨基偶氮苯-4-磺酰胺(Sulfonamidochrysoidine)、地美环素、多西环素、米诺环素、土霉素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷汀、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普丁、达福普丁、甲砜霉素、替加环素(Tigecycline)、替硝唑、甲氧苄啶、遗传霉素、诺尔斯菌素、潮霉素、博来霉素和嘌呤霉素。

在一些实施方案中，显性可选择标志为营养标志。营养标志为当细胞表达时使细胞能够使用一种或多种特定的营养源生长或存活的显性可选择标志。表达营养标志的细胞可通过在其中表达营养标志的细胞可存活和/或生长但缺乏营养标志的细胞不能的限制营养条件下让细胞生长来选择。在一些实施方案中，营养标志选自乳清苷5-磷酸脱羧酶、亚磷酸盐特异性氧化还原酶、α酮戊二酸依赖性次磷酸盐双加氧酶、碱性磷酸酶、氰酰胺水合酶、三聚氰胺脱氨酶、氰尿酸天门冬酰胺酶、双缩脲水解酶、脲酰胺分解酶、氰脲酰胺氨基水解酶、鸟嘌呤脱氨酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶、亚磷酸盐氢化酶、甘油磷酸二酯酶、对硫磷水解酶、亚磷酸盐脱氢酶、二苯并噻吩脱硫酶、芳香脱亚磺酸酶、NADH-依赖性FMN还原酶、氨基嘌呤转运体、羟胺氧化还原酶、转化酶、β-葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、纤维素酶和支链淀粉酶（Pullulonase）。

在一些实施方案中，遗传修饰使天然基因的表达降低百分之0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100。

在一些实施方案中，遗传修饰使天然基因的效率降低百分之0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100。

在一些实施方案中，遗传修饰使天然基因的活性降低百分之0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100。

F. 降低细胞中的酰基-CoA氧化酶活性伴随二酰基甘油酰基转移酶过表达

在一些实施方案中，转化的产油细胞包含酰基-CoA氧化酶敲除突变和增加天然二酰基甘油酰基转移酶表达的遗传修饰。在某些实施方案中，转化的产油细胞包含酰基-CoA氧化酶敲除突变和编码细胞天然的或来自不同细胞种类的至少一个二酰基甘油酰基转移酶基因拷贝的遗传修饰。在一些实施方案中，POX基因被破坏并且DGA1蛋白过表达。在其它实施方案中，POX基因被破坏并且DGA2蛋白过表达。

在一些实施方案中，一个核酸增加天然二酰基甘油酰基转移酶的表达或编码至少一个二酰基甘油酰基转移酶基因拷贝，第二个核酸降低细胞中酰基-CoA氧化酶的活性。在一些实施方案中同一核酸编码至少一个二酰基甘油酰基转移酶基因拷贝并降低细胞中酰基-CoA氧化酶的活性。例如，设计以敲除酰基-CoA氧化酶基因的核酸也可包含一个二酰基甘油酰基转移酶基因拷贝。

G. 降低细胞中的三酰基甘油脂肪酶和酰基-CoA氧化酶活性二者

在一些实施方案中，转化的产油细胞包含酰基-CoA氧化酶敲除突变和三酰基甘油脂肪酶敲除突变。在某些实施方案中，TGL3、TGL3/4和/或TGL4基因被破坏。在某些实施方案中，POX基因被破坏。在一些实施方案中，第一个核酸降低细胞中三酰基甘油酰基转移酶的活性，第二个核酸降低细胞中酰基-CoA氧化酶的活性。

H. 三酰基甘油产生

在某些实施方案中，转化细胞在外源脂肪酸、葡糖糖、乙醇、木糖、蔗糖、淀粉、淀粉糊精、甘油、纤维素和/或乙酸存在下生长。这些底物可在培养期间加入以增加脂质产生。外源脂肪酸可包括硬脂酸酯、油酸、亚油酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳二烯酸和/或二十碳三烯酸。

在某些实施方案中，本发明涉及本文所述修饰的宿主细胞产生的产物。在某些实施方案中，所述产物为油、脂质或三酰基甘油。在一些实施方案中，所述产物为棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸或亚油酸。在某些实施方案中，产物为饱和脂肪酸。因此，所述产物可为辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十四烷酸或二十六烷酸(cerotic acid)。在一些实施方案中，产物为不饱和脂肪酸。因此，所述产物可为肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、sapienic acid、油酸、反油酸、异油酸(vaccenic acid)、亚油酸、反亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸或二十二碳六烯酸。

所述产物可选自脂质、三酰基甘油酯、脂肪醇、脂肪酸、烷烃类、烯烃类、类异戊二烯、异戊二烯、角鲨烯、法呢烯、醇类、异丙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、2-丁醇、丁二烯、二醇、1,3丙二醇、1,4丙二醇、丁二酸、己二酸、尼龙前体、柠檬酸、苹果酸、多元醇和赤藓糖醇。

I. 增加蛋白活性以增加或修改细胞的脂质含量

在一些实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO: 12、22、86、94、100、104、110、173或177中列出的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，本发明涉及包含与SEQ ID NO: 12、22、86、94、100、104、110、173或177中列出的核苷酸序列具有至少70%、72%、64%、76%、78%、80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，本发明涉及编码与SEQ ID NO: 11、21、85、93、99、103、109、172或176中列出的氨基酸序列具有至少80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的氨基酸序列的核酸。在一些实施方案中，核酸进一步包含启动子。在某些实施方案中，核苷酸序列与启动子操作性连接。在一些实施方案中，启动子不是Arxula adeninivorans启动子。

在一些实施方案中，本发明涉及包含编码选自以下的蛋白的基因的质粒载体：乙酰-CoA羧化酶(“ACC,” 基因NG160, SEQ ID:2)、ATP-柠檬酸裂合酶亚基1 (“ACL1,” 基因NG161, SEQ ID: 4)、ATP-柠檬酸裂合酶亚基2 (“ACL2,” 基因NG162, SEQ ID NO:6)、乙酰-CoA合成酶同种型1 (“ACS1,” 基因NG163, SEQ ID NO:8)、乙酰-CoA合成酶同种型2(“ACS2,” 基因NG164、NG165, SEQ ID NOs:10,12)、二酰基甘油酰基转移酶2型(“DGA1,”基因NG167, SEQ ID NO:16)、二酰基甘油酰基转移酶1型(“DGA2,” 基因NG168, SEQ IDNO:18)、甘油-3-磷酸脱氢酶(“GPD1,” 基因NG169、NG170, SEQ ID NOs:20、22)、苹果酸酶(“MAE1,” 基因NG171, SEQ ID NO:24)、1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(“SLC1,” 基因NG177, SEQ ID NO:36)、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶(“LRO1,” 基因NG178, SEQ IDNO:38)、甘油激酶(“GUT1,” 基因NG182, SEQ ID NO:46)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(“SCT1,” 基因NG183, SEQ ID NO:48)、磷脂酸磷酸酶(“PAH1,” 基因NG218, SEQ ID NO:50)、脂肪酸合酶、亚基α (“FAS2,” 基因NG186, SEQ ID NO:54)、脂肪酸合酶、亚基β(“FAS1,” 基因NG187, SEQ ID NO:56)、2A型相关蛋白磷酸酶(“SIT4,” 基因NG188, SEQID NO:58)、1型蛋白磷酸酶Glc7p的调节亚基(“REG1,” 基因NG189, SEQ ID NO:60)、Sit4磷酸酶的调节亚基(“SAP190,” 基因NG190, SEQ ID NO:62)、脱磷酸-CoA激酶(“DPCK,” 基因NG191, SEQ ID NO:64)、HAC1碱性亮氨酸拉链转录因子(“HAC1,” 基因NG192, SEQ IDNO:66)、CAT8锌指转录因子(“CAT8,” 基因NG193, SEQ ID NO:68)、泛素(“UBI4,” 基因NG194, SEQ ID NO:70)、STB5转录因子(“STB5,” 基因NG199, SEQ ID NO:80)、丙酮酸羧化酶(“PYC1,” 基因NG201、NG202, SEQ ID NOs:84、86)、丙酮酸脱羧酶(“PDC1,” 基因NG203,SEQ ID NO:88)、苹果酸脱氢酶1 (“MDH1,” 基因NG204, SEQ ID NO:90)、苹果酸脱氢酶2(“MDH2,” 基因NG205、NG206, SEQ ID NOs:92、94)、丙酮酸脱氢酶α (“PDA1,” 基因NG207,SEQ ID NO:96)、丙酮酸脱氢酶β (“PDB1,” 基因NG208、NG209, SEQ ID NOs:98、100)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“ZWF1,” 基因NG210、NG211, SEQ ID NOs:102、104)、6-磷酸葡萄糖酸酯脱氢酶(“GND1,” 基因NG212, SEQ ID NO:106)、柠檬酸合酶1 (“CIT1,” 基因NG213、NG214, SEQ ID NOs:108、110)、柠檬酸合酶2 (“CIT2,” 基因NG215,NG216, SEQ ID NOs:112、114)、醛脱氢酶(“ALD6,” 基因NG217, SEQ ID NO:116)、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶(“GPT2,” 基因NG219, SEQ ID NO:167)、溶血磷脂酰基转移酶(“SLC4,”基因NG220, SEQ ID NO:169)和溶血磷脂酸酰基转移酶(“LOA1,” 基因NG221、NG222, SEQID NOs:171、173)。

在一些实施方案中，本发明涉及包含与SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、16、18、20、22、24、36、38、46、48、50、54、56、58、60、62、64、66、68、70、80、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、167、169、171或173中列出的核苷酸序列具有至少70%、72%、64%、76%、78%、80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的核苷酸序列的载体。在一些实施方案中，本发明涉及编码与SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、15、17、19、21、23、35、37、45、47、49、53、55、57、59、61、63、65、67、69、79、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、166、168、170或172中列出的氨基酸序列具有至少80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的氨基酸序列的载体。在一些实施方案中，载体为质粒。在一些实施方案中，载体进一步包含启动子。在某些实施方案中，核苷酸序列与启动子操作性连接。在一些实施方案中，启动子不是Arxula adeninivorans启动子。

在一些实施方案中，本发明涉及包含增加选自以下的蛋白的活性的遗传修饰的转化细胞：乙酰-CoA羧化酶、ATP-柠檬酸裂合酶亚基1、ATP-柠檬酸裂合酶亚基2、乙酰-CoA合成酶同种型1、乙酰-CoA羧化酶、ATP-柠檬酸裂合酶亚基1、ATP-柠檬酸裂合酶亚基2、乙酰-CoA合成酶同种型1、乙酰-CoA合成酶同种型2、二酰基甘油酰基转移酶2型、二酰基甘油酰基转移酶1型、甘油-3-磷酸脱氢酶、苹果酸酶、1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、脂肪酸合酶亚基α、脂肪酸合酶亚基β、2A型相关蛋白磷酸酶、1型蛋白磷酸酶Glc7p的调节亚基、Sit4磷酸酶的调节亚基、脱磷酸-CoA激酶、HAC1碱性亮氨酸拉链转录因子、CAT8锌指转录因子、泛素、STB5转录因子、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱羧酶、苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸酯脱氢酶、柠檬酸合酶、醛脱氢酶、磷脂酸磷酸酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶、溶血磷脂和溶血磷脂酸酰基转移酶。

在一些实施方案中本发明涉及包含遗传修饰的转化细胞，其中所述遗传修饰为用包含编码以下的核苷酸序列的核酸转化：乙酰-CoA羧化酶(“ACC,” 基因NG160, SEQ ID:2)、ATP-柠檬酸裂合酶亚基1 (“ACL1,” 基因NG161, SEQ ID: 4)、ATP-柠檬酸裂合酶亚基2(“ACL2,” 基因NG162, SEQ ID NO:6)、乙酰-CoA合成酶同种型1 (“ACS1,” 基因NG163,SEQ ID NO:8)、乙酰-CoA合成酶同种型2 (“ACS2,” 基因NG164、NG165, SEQ ID NOs:10,12)、二酰基甘油酰基转移酶2型(“DGA1,” 基因NG167, SEQ ID NO:16)、二酰基甘油酰基转移酶1型(“DGA2,” 基因NG168, SEQ ID NO:18)、甘油-3-磷酸脱氢酶(“GPD1,” 基因NG169、NG170, SEQ ID NOs:20、22)、苹果酸酶(“MAE1,” 基因NG171, SEQ ID NO:24)、1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(“SLC1,” 基因NG177, SEQ ID NO:36)、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶(“LRO1,” 基因NG178, SEQ ID NO:38)、甘油激酶(“GUT1,” 基因NG182, SEQ ID NO:46)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(“SCT1,” 基因NG183, SEQ ID NO:48)、磷脂酸磷酸酶(“PAH1,” 基因NG218, SEQ ID NO:50)、脂肪酸合酶亚基α (“FAS2,” 基因NG186, SEQ IDNO:54)、脂肪酸合酶亚基β (“FAS1,” 基因NG187, SEQ ID NO:56)、2A型相关蛋白磷酸酶(“SIT4,” 基因NG188, SEQ ID NO:58)、1型蛋白磷酸酶Glc7p的调节亚基(“REG1,” 基因NG189, SEQ ID NO:60)、Sit4磷酸酶的调节亚基(“SAP190,” 基因NG190, SEQ ID NO:62)、脱磷酸-CoA激酶(“DPCK,” 基因NG191, SEQ ID NO:64)、HAC1碱性亮氨酸拉链转录因子(“HAC1,” 基因NG192, SEQ ID NO:66)、CAT8锌指转录因子(“CAT8,” 基因NG193, SEQ IDNO:68)、泛素(“UBI4,” 基因NG194, SEQ ID NO:70)、STB5转录因子(“STB5,” 基因NG199,SEQ ID NO:80)、丙酮酸羧化酶(“PYC1,” 基因NG201、NG202, SEQ ID NOs:84、86)、丙酮酸脱羧酶(“PDC1,” 基因NG203, SEQ ID NO:88)、苹果酸脱氢酶1 (“MDH1,” 基因NG204, SEQID NO:90)、苹果酸脱氢酶2 (“MDH2,” 基因NG205、NG206, SEQ ID NOs:92、94)、丙酮酸脱氢酶α (“PDA1,” 基因NG207, SEQ ID NO:96)、丙酮酸脱氢酶β (“PDB1,” 基因NG208、NG209, SEQ ID NOs:98、100)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“ZWF1,” 基因NG210、NG211, SEQ IDNOs:102、104)、6-磷酸葡萄糖酸酯脱氢酶(“GND1,” 基因NG212, SEQ ID NO:106)、柠檬酸合酶1 (“CIT1,” 基因NG213、NG214, SEQ ID NOs:108、110)、柠檬酸合酶2 (“CIT2,” 基因NG215、NG216, SEQ ID NOs:112、114)、醛脱氢酶(“ALD6,” 基因NG217, SEQ ID NO:116)、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸sn-1酰基转移酶(“GPT2,” 基因NG219, SEQ ID NO:167)、溶血磷脂酰基转移酶(“SLC4,” 基因NG220, SEQ ID NO:169)或溶血磷脂酸酰基转移酶(“LOA1,” 基因NG221、NG222 SEQ ID NOs:171、173)。

在一些实施方案中，本发明涉及包含遗传修饰的转化细胞，其中所述遗传修饰为用包含与SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、16、18、20、22、24、36、38、46、48、50、54、56、58、60、62、64、66、68、70、80、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、167、169、171或173中列出的核苷酸序列具有至少70%、72%、64%、76%、78%、80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的核苷酸序列的核酸转化。在一些实施方案中，本发明涉及包含遗传修饰的转化细胞，其中所述遗传修饰为用编码与SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、15、17、19、21、23、35、37、45、47、49、53、55、57、59、61、63、65、67、69、79、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、166、168、170或172中列出的氨基酸序列具有至少80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的氨基酸序列的核酸转化。

在一些实施方案中，本发明涉及修改细胞的脂质含量和/或组成的方法，包括用包含与SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、16、18、20、22、24、36、38、46、48、50、54、56、58、60、62、64、66、68、70、80、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、167、169、171或173中列出的核苷酸序列具有至少70%、72%、64%、76%、78%、80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的核苷酸序列的核酸转化亲本细胞。在一些实施方案中，本发明涉及修改细胞的脂质含量和/或组成的方法，包括用编码与SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、15、17、19、21、23、35、37、45、47、49、53、55、57、59、61、63、65、67、69、79、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、166、168、170或172中列出的氨基酸序列具有至少80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的氨基酸序列的核酸转化亲本细胞。

J. 降低蛋白的活性以增加或修改细胞的脂质含量

在一些实施方案中，本发明涉及包含降低选自以下的蛋白的活性的遗传修饰的转化Arxula adeninivorans细胞：B氧化中涉及的多功能酶(“MFE1,” 基因NG172, SEQ ID NO:26)、三酰基甘油脂肪酶(“TGL3,” 基因NG174, SEQ ID NO:30)、三酰基甘油脂肪酶(“TGL3/4,” 基因NG175, SEQ ID NO:32)、三酰基甘油脂肪酶(“TGL4,” 基因NG176, SEQ ID NO:34)、甘油-3-磷酸脱氢酶(“GUT2,” 基因NG179, SEQ ID NO:40)、AMP活化激酶(“SNF1,” 基因NG180, SEQ ID NO:42)、酰基-CoA氧化酶(“POX,” 基因NG181, SEQ ID NO:44)、过氧化物酶体膜E3泛素连接酶(“PEX10,” 基因NG196, SEQ ID NO:74)、丙酮酸脱氢酶复合体的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶组分(E2) (“LAT1,” 基因NG197, SEQ ID NO:76)、葡萄糖阻遏中涉及的转录因子(“MIG1,” 基因NG198, SEQ ID NO:78)、2-甲基柠檬酸脱水酶(“PHD1,” 基因NG200, SEQ ID NO:82)、磷脂酰乙醇胺甲基转移酶(“CHO2,” 基因NG226, SEQ ID NO:165)、亚甲基-脂肪-酰基-磷脂合酶(“OPI3,” 基因NG223, SEQ ID NO:175)和INO4 转录因子(“INO4,” 基因NG225, SEQ ID NO: 179)。在一些实施方案中，遗传修饰为敲除突变。

K. 增加或降低蛋白的活性以修改脂质含量和/或组成

在一些实施方案中，本发明涉及包含编码选自以下的蛋白的基因的质粒载体：Δ-12脂肪酸去饱和酶(“D12,” 基因NG166, SEQ ID NO:14)、Δ-9脂肪酸去饱和酶(“OLE1,” 基因NG173, SEQ ID NO:28), 脂肪酸延伸酶2 (“ELO2,” 基因NG185, SEQ ID NO:52)和脂肪酸延伸酶1 (“ELO1,” 基因NG195, SEQ ID NO:72)。

在一些实施方案中，本发明涉及包含与SEQ ID NO: 14、28、52或72中列出的核苷酸序列具有至少70%、72%、64%、76%、78%、80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的核苷酸序列的载体。在一些实施方案中，本发明涉及编码与SEQ ID NO: 13、27、51或71中列出的氨基酸序列具有至少80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的氨基酸序列的载体。在一些实施方案中，载体为质粒。

在一些实施方案中，本发明涉及包含增加选自Δ-12脂肪酸去饱和酶、Δ-9脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延伸酶的蛋白的活性的遗传修饰的转化细胞。

在一些实施方案中，本发明涉及包含遗传修饰的转化细胞，其中所述遗传修饰为用包含编码Δ-12脂肪酸去饱和酶(“D12,” 基因NG166, SEQ ID NO:14)、Δ-9脂肪酸去饱和酶(“OLE1,” 基因NG173, SEQ ID NO:28)、脂肪酸延伸酶2 (“ELO2,” 基因NG185, SEQID NO:52)或脂肪酸延伸酶1 (“ELO1,” 基因NG195, SEQ ID NO:72)的核苷酸序列的核酸转化。

在一些实施方案中，本发明涉及包含遗传修饰的转化细胞，其中所述遗传修饰为用包含与SEQ ID NO: 14、28、52或72中列出的核苷酸序列具有至少70%、72%、64%、76%、78%、80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的核苷酸序列的核酸转化。在一些实施方案中，本发明涉及包含遗传修饰的转化细胞，其中所述遗传修饰为用编码与SEQ ID NO: 13、27、51或71中列出的氨基酸序列具有至少80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的氨基酸序列的核酸转化。

在一些实施方案中，本发明涉及修改细胞的脂质含量和/或组成的方法，包括用包含与SEQ ID NO: 14、28、52或72中列出的核苷酸序列具有至少70%、72%、64%、76%、78%、80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的核苷酸序列的核酸转化亲本细胞。在一些实施方案中，本发明涉及修改细胞的脂质含量和/或组成的方法，包括用编码与SEQ ID NO:13、27、51或71中列出的氨基酸序列具有至少80%、82%、84%、85%、87%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的氨基酸序列的核酸转化亲本细胞。

在一些实施方案中，本发明涉及包含降低选自以下的蛋白的活性的遗传修饰的转化Arxula adeninivorans细胞：Δ-12脂肪酸去饱和酶(“D12,”基因NG166, SEQ ID NO:14)、Δ-9脂肪酸去饱和酶(“OLE1,”基因NG173, SEQ ID NO:28)、脂肪酸延伸酶2 (“ELO2,”基因NG185, SEQ ID NO:52)和脂肪酸延伸酶1 (“ELO1,”基因NG195, SEQ ID NO:72)。在一些实施方案中，遗传修饰为敲除突变。

本说明书通过下列实施例进一步说明，其不应解释为以任何方式限制。所有引用的参考(如该申请全文中所引用的包括文献参考、授权专利、出版专利申请和GenBank登录号)的内容通过引用清楚地结合到本文中。当通过本文引用结合的文档中的术语与本文中使用的那些矛盾时，以本文使用的定义为准。

例示

实施例1：测序Arxula adeninivorans基因组和选择基因靶

为了将A. adeninivorans菌株工程改造为最佳脂质含量和组成，筛查天然A. adeninivorans基因(基因靶)对A. adeninivorans中脂质产生的正面或负面作用。

首先，为了访问所选靶的DNA和蛋白序列，由Synthetic Genomics Inc. (CA,USA)测序并注释A. adeninivorans菌株NS252 (ATCC 76597)的基因组。菌株NS252也选择作为宿主用于筛选基因靶。

基于评估产油酵母和其它生物中的脂质途径的出版数据列举影响脂质产生效率和组成的基因靶(Ratledge & Wynn, Advances Applied Microbiology 51:1-51 (2002);Tai & Stephanopoulos, Metabolic Engineering 15:1-9 (2013), Beopoulos等人,Applied & Environmental Microbiology, 74:7779-89 (2008); Beopoulos等人,Progress 脂质Research, 48:375-87 (2009); Courchesne等人, J. Biotechnology141:31-41 (2009); Morin等人, PLoS One, 6(11):e27966 (2011); Bozaquel-Morais等人, PLoS One, 5(10):e13692 (2010))。选择用于在A. adeninivorans中筛查的基因靶的序列在SEQ ID NO:1-116和164-179中示出，并在下表2中列出。

表2

Arxula adeninivorans和其它生物中可上调或下调以增加生物的脂质含量、修改其脂质组成或二者的Arxula adeninivorans基因

*表示核苷酸序列无内含子，与包含内含子的Arxula adeninivorans基因相对应。

根据靶在脂质途径中的作用，上调或下调基因靶以增加脂质产生和/或修改脂质组成。例如，三酰基甘油合成的最终步骤中涉及的靶，例如，NG167(DGA1)和NG168(DGA2)过表达，而过氧化物酶体脂质降解中涉及的靶，例如NG173(TGL3)和NG181(POX)，通过缺失下调。靶单独或组合应用。

对于改变脂质组成，根据期需的组成，同一靶可上调或下调。例如，NG173 (δ-9脂肪酸去饱和酶“OLE1”)过表达和NG166 (δ-12脂肪酸去饱和酶“D12”)下调或缺失的组合可导致A. adeninivorans中增加的油酸含量。或者，过表达NG173和NG166二者可导致增加的亚油酸含量。

实施例2：增加靶蛋白的活性

用于过表达上调靶的表达构建体的图谱在图1中以NG167靶(2型二酰基甘油酰基转移酶“DGA1”)作为例子示出。对于所有其它上调的靶，构建体相同，除了靶ORF。过表达构建体通过酵母介导的连接方法组装。通过Chen (Applied Microbiology & Biotechnology 48:232-35 (1997))描述的转化程序转化入NS252之前，构建体通过PmeI/AscI限制酶切消化线性化。线性表达构建体包含基因靶和用作诺尔斯菌素(NAT)选择标志的诺尔斯链霉菌Nat1基因的表达盒。

包含内含子的上调靶以两种形式表达：从NS252菌株的基因组DNA扩增的天然基因和由Genscript (NJ, USA)合成的无内含子合成cDNA。

实施例3：降低靶蛋白的活性

用于缺失下调靶的缺失构建体的图谱在图2中以NG166靶(δ-12脂肪酸去饱和酶“D12”)作为例子示出。对于所有其它下调靶，缺失构建体相同，除了对靶特异性的靶重组侧翼。缺失构建体通过酵母介导的连接方法组装，并且其包含用作NAT选择标志的两侧为基因靶的上游和下游DNA区域的诺尔斯链霉菌Nat1基因的表达盒。重组侧翼从NS252的基因组DNA扩增或作为用于酵母介导的连接质粒组装的寡核苷酸的一部分由Integrated DNATechnologies, Inc. (Iowa, USA)合成。

实施例4：筛选策略

过表达和缺失转化体二者均在含有50 μg/ml NAT的YPD平板上选择。此外，转化体通过下文描述的荧光脂质测定分析以筛选增加的脂质含量。为了筛选最佳的脂质组成，通过气相色谱使用脂质组成分析的标准方法分析转化体。

实施例5：修饰多重靶

第一轮筛选靶之后，再次用包含相同靶(用于过表达)或不同靶的过表达或缺失构建体转化最佳转化体用于进一步增加脂质产生或优化脂质组成。在第二轮筛选中，使用与第一轮中相似的方法，除了选择标志。大肠杆菌hph基因表达盒可用作用于第二轮筛选的潮霉素B选择标志。对于两个以上靶的组合，可使用的额外的显性标志，或者，可使用与其它酵母物种使用的方法相似的标志重复利用程序(Akada等人, Yeast, 23:399-05 (2006); Sauer,Biotechniques 16:1086-88 (1994); Hartzog等人, Yeast, 22:789-98 (2005))。

实施例6：优化靶活性

确定天然A. adeninivorans基因靶的最佳组合之后，可进一步优化选择组中的每一靶。例如，在基因缺失的情况下，当完全的基因移除对生物的生长速率或另一个培养参数具有负面作用时，靶可在弱或可诱导启动子下整合回NS252基因组中，以表达最小量的靶蛋白。在这样的情况下，降低靶的表达或将其表达定时在特定的生物过程阶段对总体产量可比完全移除靶更有益。

在过表达靶的情况下，每一选择的靶可通过从不同生物筛选具有相同功能的异源靶用于更好表达或比活进一步优化。靶也可通过蛋白质工程，通过引入提高蛋白表达或活性的突变优化。用于过表达靶的另一个优化方法涉及筛选对于特定靶更优的调控元件例如启动子。

实施例7：脂质测定

高压灭菌的多孔板的每一板装上包含0.5 g/L尿素、1.5 g/L酵母提取物、0.85 g/L酪蛋白氨基酸、1.7 g/L YNB (无氨基酸和硫酸铵)、100 g/L葡萄糖和5.11 g/L 邻苯二甲酸氢钾(25 mM)的过滤灭菌的培养基。对于24孔板每孔使用1.5 mL培养基，对于96孔板每孔使用300 μl培养基。或者，酵母培养物用于接种高压灭菌的250 mL烧瓶中的50 mL已灭菌培养基。已经在YPD-琼脂平板上30℃孵育1-2天的酵母菌株用于接种多孔板的每一孔。

多孔板用多孔盖子覆盖并在Infors Multitron ATR摇床中30℃、70-90%湿度和900 rpm孵育。或者，烧瓶用铝箔覆盖并在New Brunswick Scientific摇床中37℃、70-90%湿度和900 rpm孵育。96小时后，在分析微孔板中向20 μL细胞中加入20 μL 100%乙醇并在4℃孵育30分钟。然后将20 μL细胞/乙醇混合物加入Costar 96-孔、黑色、透明底的板中包含50 μL 1 M 碘化钾、1 mM 1 μL Bodipy 493/503, 0.5 μL 100% DMSO, 1.5 μL 60% PEG4000和27 μL水的80 μl预混合溶液中并用透明封条覆盖。用SpectraMax M2分光光度计(Molecular Devices)动力学测定在30℃监测Bodipy荧光，并通过荧光除以600 nm处的吸光度归一化。

实施例8：在酵母中过表达DGA1蛋白(DGAT2基因)的方法

USSN 61/943,664和PCT专利申请号US15/017227 (二者均通过引用结合到本文中)中描述了用于过表达DGA1基因的核酸构建体。图3显示用于过表达圆红冬孢酵母菌DGA1基因NG66 (SEQ ID NO: 122)的表达构建体pNC243。DGA1表达构建体在转化之前通过PacI/NotI限制酶切消化线性化。线性表达构建体每一包含DGAT2基因和用作诺尔斯菌素(NAT)选择标志的Nat1基因的表达盒。

DGA1表达构建体使用Chen (Applied Microbiology & Biotechnology 48:232-35 (1997))描述的转化方案随机整合入解脂耶氏酵母菌株NS18 (获自ARS CultureCollection, NRRL# YB 392)的基因组中。在具有500 µg/mL NAT的YPD平板上选择转化体并通过如上述实施例7中所描述的荧光染色脂质测定筛选积累脂质的能力。对于每一表达构建体，分析8个转化体。

对于多数构建体，转化体之间存在显著的菌落变异，可能是因为仅获得功能Nat1盒的细胞中缺乏功能DGA1表达盒，或因为DGA1整合位点对DGA1表达的负面作用。无论如何，所有的转化体均具有脂质含量的显著增加。

如通过实施例7中所描述的荧光测定所测量的，与亲本菌株NS18相比，天然解脂耶氏酵母DGA1 (NG15)在强启动子下过表达使转化体脂质含量增加约2倍。显示最高荧光(与NS18相比约3倍更高)的转化体通过过表达圆红冬孢酵母菌DGA1 (NG66, NG67)和斯达氏油脂酵母DGA1 (NG68)产生。

在某些实验中，天然圆红冬孢酵母菌DGA1 (NG49)过表达对脂质产生的效果不如不包含内含子的合成版本的圆红冬孢酵母菌DGAT2基因的效果高。这一结果可表明圆红冬孢酵母菌DGAT2基因在解脂耶氏酵母中的基因剪接不是非常有效。在某些实验中，用于在解脂耶氏酵母中表达的圆红冬孢酵母菌DGA1基因的密码子优化对脂质产生不具有正面作用。

可使用相似策略在解脂耶氏酵母或另一个物种中表达A. adeninivoransDGAT2基因或其它A. adeninivorans基因。在A. adeninivorans菌株NS252中表达来自解脂耶氏酵母(SEQ ID NO:118)、圆红冬孢酵母菌(SEQ ID NO:120)和A. adeninivorans (SEQ ID NO:52)的2型二酰基甘油酰基转移酶，每一基因对不同C16/C18脂质分数的作用在图4中示出。

实施例9：过表达DGA1的酵母的分析和筛选

为了选择具有最高脂质产生水平的菌株，筛选表达NG15 (解脂耶氏酵母DGA1)或NG66(圆红冬孢酵母菌DGA1)的解脂耶氏酵母菌株NS18转化体。对于NG15，约50个菌落通过脂质测定筛选最高脂质积累，最佳转化体命名为NS249。对于NG66，筛选80个菌落，并选择8个最佳菌落用于进一步分析。

在摇瓶中生长菌株NS249和8个选择的NG66转化体并通过脂质测定分析脂质含量和通过HPLC分析葡萄糖消耗。过表达圆红冬孢酵母菌DGA1的解脂耶氏酵母菌株具有比在与圆红冬孢酵母菌DGAT2相同的启动子下表达天然解脂耶氏酵母DGAT2基因的解脂耶氏酵母菌株明显更高的脂质含量。同时，NG66转化体使用比NS249显著更多的葡萄糖，证明NG66更有效将葡萄糖转化为脂质。两个DGAT2基因之间的效率差异可归于圆红冬孢酵母菌DGA1在解脂耶氏酵母中更高的表达水平或更高水平的圆红冬孢酵母菌DGA1比活，或二者。

菌株NS125为解脂耶氏酵母菌株NS18 (获自ARS Culture Collection, NRRL# YB392)的衍生物，其用来自pNC104载体(图5)的解脂耶氏酵母DGA1表达盒转化。pNC104构建体在转化前通过PacI/NotI限制酶切消化线性化。该线性表达构建体包含解脂耶氏酵母DGAT2基因和用作诺尔斯菌素(NAT)选择标志的Nat1基因的表达盒。表达构建体使用Chen(Applied Microbiology & Biotechnology 48:232-35 (1997))描述的转化方案随机整合入解脂耶氏酵母菌株NS18的基因组中。在具有500 µg/mL NAT的YPD平板上选择转化体并通过如实施例7中所描述的荧光染色脂质测定筛选积累脂质的能力。筛选的约100个转化体中的最佳转化体命名为NS125。

NS281菌株使用与菌株NS125相似的过程获得，除了使用pNC243构建体转化NS18菌株(图3)。包含圆红冬孢酵母菌DGAT2基因(NG66)的pNC243构建体代替用于制造NS125的解脂耶氏酵母DGAT2基因。NS281菌株包含整合入解脂耶氏酵母基因组中的圆红冬孢酵母菌DGAT2基因。

实施例10：过表达DGA2蛋白(DGAT1基因)的方法

从公共数据库中选择若干编码DGA2蛋白的DGAT1基因序列并合成其天然无内含子的cDNA (GenScript, USA)。在解脂耶氏酵母菌株NS125和NS281 (每一过表达一种不同的DGA1蛋白)中表达来自六个所选供体(解脂耶氏酵母、圆红冬孢酵母菌、斯达氏油脂酵母、土曲霉、麦角菌、球毛壳菌)的DGAT1基因。因此，该方法提供在同一细胞中增加两种蛋白的活性的实例。

NS125和NS281菌株每一用一组DGA2表达构建体转化。图6显示用于在NS125和NS281菌株中过表达解脂耶氏酵母DGAT1基因(NG16)的表达构建体的图谱。对于所有其它DGAT1基因，使用的构建体相同，除了DGAT1 ORF。DGAT1构建体在转化前通过PacI/AscI限制酶切消化线性化。线性表达构建体包含DGAT1基因和用作博来霉素(NG76 ZEO)选择标志的BLE基因的表达盒。

对于每一表达构建体，通过下述荧光脂质测定分析15个转化体。在该实验中，解脂耶氏酵母中异源DGAT1的存在情况未通过菌落PCR证实。对于多数构建体，转化体之间存在显著的菌落变异，可能是因为一些仅获得功能ZEO盒的转化体中缺乏功能DGAT1表达盒，或因为DGAT1表达盒整合位点对DGA2表达的负面作用。无论如何，多数检验的DGAT1基因在单独DGAT2基因显示的效果以外增加解脂耶氏酵母的脂质含量。DGA2过表达的正面效果在NS125菌株背景中更显著，可能是因为过表达其天然DGA1的NS125菌株比过表达更高活性的DGA1的NS281菌株产油少。在NS125和NS281菌株二者中，NG112 DGAT1基因(麦角菌DGA2)最有效增加转化体的脂质含量，可能是因为与其它检验的DGAT1基因相比更高的表达水平和/或更高的比活。

可使用相似的策略在解脂耶氏酵母或另一个物种中表达A. adeninivoransDGAT1基因或其它A. adeninivorans基因。

实施例11：在酵母中减少三酰基甘油脂肪酶活性的方法

在解脂耶氏酵母野生型菌株NS18 (获自NRLL# YB-392)及其DGA1过表达衍生物NS281中缺失TGL3基因。如上所述NS281过表达来自圆红冬孢酵母菌的DGA1基因。解脂耶氏酵母TGL3基因(YALI0D17534g, SEQ ID NO: 148)如下缺失：使用引物对NP1798-NP656和NP655-NP1799 (SEQ ID NOs: 157、154、153、158)从包含潮霉素抗性基因(“hph,” SEQ ID NO:152)的质粒PCR扩增两片段缺失盒。所得PCR片段(SEQ ID NOs: 160 & 161)按照USSN 61/819,746和PCT专利申请出版号WO14/182657 (二者均通过引用结合到本文中)中开发的方案共转化入NS18和NS281中。hph盒中启动子和终止子的省略和hph编码序列分裂为两个PCR片段减少这些碎片的随机整合将会赋予潮霉素抗性的可能性。hph基因应仅在如果其通过同源重组整合在TGL3基因座以致TGL3启动子和终止子可指导其转录时表达。通过PCR筛选潮霉素抗性菌落以确认TGL3的不存在和tgl3::hyg特异性产物的存在情况。

可使用相似的策略减少A. adeninivorans中三酰基甘油脂肪酶活性或另一种蛋白的活性(参见实施例13)。

实施例12：在酵母中减少甘油-3-磷酸脱氢酶活性的方法

从解脂耶氏酵母野生型菌株NS18 (获自NRLL# YB-392)缺失编码甘油-3-磷酸脱氢酶的GUT2基因。解脂耶氏酵母GUT2基因(YALI0B13970g, SEQ ID NO: 150)如下缺失：使用引物对NP1563-NP656和NP655-NP1800 (分别SEQ ID NOs: 156、154、153和159) 从包含潮霉素抗性基因(“hph,” SEQ ID NO: 152)的质粒PCR扩增两片段缺失盒。所得PCR片段(SEQ IDNOs: 162 & 163)共转化入NS8中。hph盒中启动子和终止子的省略和hph编码序列分裂为两个PCR片段减少这些碎片的随机整合将会赋予潮霉素抗性的可能性。

解脂耶氏酵母菌株NS18在YPD平板上30℃生长过夜。向平板施加1 mL水以使用L型涂布器和移液管收集细胞。细胞在每一包含25 mL YPD的两个烧瓶中稀释至OD₆₀₀ = 0.5并在30℃摇动30 min以使细胞适应液体培养。加入95 mg羟基脲至终浓度50 mM。继续摇动两小时以允许细胞周期停滞，如通过显微术所测定的(所有细胞停滞在出芽期)。离心收集细胞，用水洗涤，并重悬在颗粒体积(a pellet volume of)的水中。每一转化等分50 µL，离心收集细胞，丢弃上清液。将细胞重悬在100 µL转化混合物(80 µL过滤灭菌的60% PEG 4000;5 µL过滤灭菌的2 M醋酸锂, pH调整为6.0; 5 µL过滤灭菌的2 M二硫苏糖醇(DTT); 10 µL2 mg/mL鲑精DNA, 使用前煮10 min)中。加入SEQ ID NOs: 162 & 163每一的9 µL未纯化的PCR产物。细胞在39℃经受热激1 h，离心收集，重悬在1 mL YPD中，30℃培养过夜以允许hph基因表达。第二天将100 µL细胞铺在干选择性平板(包含300 µg/mL潮霉素的YPD/琼脂)上，一天后筛选在甘油上生长的转化体。

潮霉素抗性菌落印迹(patched)到包含葡萄糖或甘油的最小培养基上以筛选由于丧失GUT2功能丧失在甘油上生长的能力的分离物。当用羟基脲首先将转化细胞停滞在S期时获得7个正确的整合(筛选48个菌落)。

可使用相似的策略减少A. adeninivorans和其它物种中甘油-3-磷酸脱氢酶的活性或另一种蛋白的活性。

实施例13：减少酵母中三酰基甘油酰基转移酶活性的方法

为了检验脂肪酶缺失导致A. adeninivorans中更高的脂质积累这一想法，在A. adeninivorans野生型菌株NS252 (获自ATCC, #76597)中缺失TGL3和TGL4。如PCT专利申请出版号WO14/182657 (通过引用结合到本文中)中描述的缺失A. adeninivorans TGL3(SEQ ID NO: 30)、TGL4 (SEQ ID NO: 34)和Δ12去饱和酶(SEQ ID NO:14)基因。NS252中TGL3的缺失导致菌株NS458。NS252中TGL4的缺失导致菌株NS481。NS252中Δ12的缺失导致菌株NS478。使用分批葡萄糖过程在50-mL烧瓶中生长这些菌株并在96小时后通过基于荧光的测定分析脂质含量。具体地，每一烧瓶装有50 mL过滤灭菌的包含0.5 g/L尿素、1.5 g/L酵母提取物、0.85 g/L酪蛋白氨基酸、1.7 g/L YNB (无氨基酸和硫酸铵)、100 g/L葡萄糖和5.11 g/L邻苯二甲酸氢钾(25 mM)的培养基。已经在YPD-琼脂平板上30℃孵育1-2天的酵母菌株用于接种每一烧瓶。30℃振荡孵育96小时后，在分析微孔板中向20 μL细胞中加入20μL 100%乙醇并在4℃孵育30分钟。然后将20 μL细胞/乙醇混合物加入Costar 96-孔、黑色、透明底的板中包含50 μL 1 M 碘化钾、1 μL 1 mM Bodipy 493/503, 0.5 μL 100% DMSO,1.5 μL 60% PEG 4000和27 μL水的80 μl预混合溶液中并用透明封条覆盖。用SpectraMaxM2分光光度计(Molecular Devices)动力学测定在30℃监测Bodipy荧光，并通过荧光除以600 nm处的吸光度归一化。平均双份生长实验的数据。与亲本菌株相比，两种缺失菌株均显示增加的脂质含量(图7)。

实施例14：在解脂耶氏酵母中表达A. adeninivorans Δ9去饱和酶

解脂耶氏酵母的天然Δ9去饱和酶使用C16和C18饱和脂肪酸二者作为底物。通过引入基因(SEQ ID NO:28)作为解脂耶氏酵母中单独的Δ9活性检验Arxula adeninivorans Δ9酶更高的C18特异性。这通过在NS18中首先缺失解脂耶氏酵母Δ9以产生菌株NS418达到。NS418需要补充不饱和脂肪酸用于生长，因为缺乏Δ9活性。然后通过靶向整合将外源Δ9基因插入天然基因座中并选择无补充生长的能力。A. adeninivorans Δ9在缺乏天然酶下的表达导致底物特异性向压倒性地C18:0底物的转换，因此将C16:1含量减少至最低水平(图8)。

实施例15：在解脂耶氏酵母中表达A. adeninivorans SCT1

在包含天然解脂耶氏酵母SCT1基因敲除的解脂耶氏酵母菌株中表达来自A. adeninivorans的甘油-3-磷酸酰基转移酶SCT1。具体地，在解脂耶氏酵母菌株NS18中缺失甘油酰基转移酶SCT1以产生菌株NS563，导致较低的脂质积累(图9)。然后在菌株NS563中表达来自A. adeninivorans的SCT1基因(SEQ ID NO:48)以产生菌株NS804，其产生可比菌株NS18或NS563积累更多脂质的解脂耶氏酵母菌株(图9)。

实施例16：降低A. adeninivorans中多种蛋白的活性

使用与PCT专利申请出版号WO14/182657 (通过引用结合到本文中)中描述的那些相似的方法各个敲除野生型A. adeninivorans菌株252的天然MFE1、TGL3、Δ12、PEX10、POX和 TGL4基因，对于每一敲除，各种C16和C18脂肪酸相对于总C16和C18脂肪酸的百分比在图10中示出。

实施例17：增加A. adeninivorans和解脂耶氏酵母中多种蛋白的活性

选择脂质合成中涉及的8个Arxula adeninivorans基因(表3)用于在Arxula adeninivorans菌株NS252和解脂耶氏酵母菌株NS18中过表达。用于过表达上调靶的表达构建体的图谱在图1中示出，以Arxula adeninivorans DGA1 (NG167)作为例子。对于所有其它靶，构建体相同，除了开放阅读框。过表达构建体通过酵母介导的连接组装。构建体在转化前通过PmeI/AscI限制酶切消化线性化。线性表达构建体包含基因靶和用作诺尔斯菌素(NAT)选择标志的诺尔斯链霉菌Nat1基因的各自的表达盒。

表3. 在Arxula adeninivorans和解脂耶氏酵母中表达的脂质合成中涉及的8个Arxula adeninivorans基因

基因ID	SEQ ID NO	基因名称	功能
				NG167	16	DGA1	二酰基甘油酰基转移酶2型
NG168	18	DGA2	二酰基甘油酰基转移酶1型
				NG170	22	GPD1	甘油-3-磷酸脱氢酶
NG177	36	SLC1	1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶
				NG183	48	SCT1	甘油-3-磷酸酰基转移酶
NG211	104	ZWF1	葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
				NG212	106	GND1	6-磷酸葡萄糖酸酯脱氢酶
NG218	50	PAH1	磷脂酸磷酸酶

表达构建体通过Chen等人(Applied Microbiology & Biotechnology 48:232-35(1997))描述的转化方案随机整合入解脂耶氏酵母菌株NS18 (获自ARS CultureCollection, NRRL# YB 392)的基因组中。表达构建体使用特别适用于A. adeninivorans的方案整合入A. adeninivorans (ATCC #76597)中。简言之，用亲本A. adeninivorans培养物接种2 mL YPD并在旋转振荡器中37℃生长过夜。然后使用0.5 mL过夜培养物接种250烧瓶中的25 mL新鲜YPD，其然后在37℃生长3.5-4小时。3000 rpm沉淀细胞2分钟，丢弃上清液。在无菌水中洗涤细胞，并再次3000 rpm沉淀2分钟。将沉淀悬浮在2 mL包含40 μM二硫苏糖醇的100 mM醋酸锂中并转移至微量离心管中。在旋转振荡器上37℃孵育悬浮液1 h。10,000 rpm沉淀细胞10 s并丢弃上清液。温和吹吸将细胞重悬在1 mL水中，再次10,000 rpm离心10 s，丢弃水。通过用1 M冷山梨醇吹吸洗涤细胞，然后再次10,000 rpm离心10 s，丢弃上清液。向沉淀加入2 mL冷1 M山梨醇，并将管放置在冰上。然后将40 μL细胞连同5 μL DNA一起加入预冷的0.2 cm电穿孔样品池中。细胞在25 μF, 200 ohms, 1.5 kV电穿孔，时间常数~4.9-5.0 ms。将细胞加入1 mL YPD中，37℃孵育过夜，并将100 μL-500 μL细胞铺在YPD琼脂上。

在具有500 μg/mL NAT的YPD平板上选择解脂耶氏酵母转化体。在具有50 μg/mLNAT的YPD平板上选择A. adeninivorans转化体。通过上述荧光脂质测定筛选两种酵母的转化体的积累脂质的能力。对于每一表达构建体，分析8个转化体。亲本菌株NS18和NS252用作阴性对照并以4个重复分析。脂质测定的结果在图11中示出。图11证明在取样的72 hrs时A. adeninivorans DGA1和DGA2对脂质具有显著效果。在96 hrs，所有8个选择的基因增加A. adeninivorans的脂质含量。有趣地，编码TAG合成的最后3步中涉及的酶的4个靶(DGA1,DGA2, SLC1, PAH1)对A. adeninivorans中的脂质含量具有最大效果。在解脂耶氏酵母中，在96 hrs时仅DGA1和DGA2对脂质具有显著的正面作用。

实施例18：增加A. adeninivorans中ELO1的活性

从A. adeninivorans敲除A. adeninivorans Δ12去饱和酶基因(SEQ ID NO:14)，导致菌株NS554，并在Δ12敲除背景中过表达A. adeninivoransELO1基因(SEQ ID NO:72)，导致菌株NS631。对于每一菌株，定量总C16和C18脂质，图12显示相对于亲本菌株NS554 A. adeninivoransELO1基因增加细胞中C18脂质的分数。

通过引用结合

本文引用的所有美国专利和美国出版专利申请通过引用结合到本文中。

等同物

本领域技术人员将会认识到，或能够仅仅使用常规实验探知，本文所描述的本发明具体实施方案的许多等同物。这样的等同物意在包含在下列权利要求中。

Claims (25)

1.一种核酸，包含编码来自Arxula adeninivorans的蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白包含与SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、164、166、168、170、172、174、176或178中列出的氨基酸序列或其任一的生物学活性部分具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。

2.权利要求1的核酸，其中所述蛋白质包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、164、166、168、170、172、174、176或178中列出的氨基酸序列，或其任一的生物学活性部分。

3.权利要求1或2的核酸，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、20、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、165、167、169、171、173、175、177或179中列出的核苷酸序列具有至少70%的序列同源性。

4.权利要求3的核酸，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、20、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、165、167、169、171、173、175、177或179中列出的核苷酸序列。

5.权利要求1-4中任一项的核酸，进一步包含启动子，其中所述核苷酸序列与启动子操作性连接。

6.权利要求5的核酸，其中所述启动子不是Arxula adeninivorans启动子。

7.一种载体，其包含权利要求1-6中任一项的核酸，其中所述载体为质粒。

8.用于修改细胞的脂质含量和/或组成的方法，包括用权利要求1-6中任一项的核酸或权利要求7的载体转化所述细胞。

9.权利要求8的方法，其中所述细胞选自藻类、细菌、霉菌、真菌、植物和酵母。

10.权利要求9的方法，其中所述细胞选自Arxula、曲霉属、Aurantiochytrium、假丝酵母属、麦角菌属、隐球菌属、小克银汉霉属、地霉属、汉森酵母属、克鲁维酵母属、柯达菌属(Kodamaea)、Leucosporidiella、油脂酵母属（Lipomyces）、被孢霉属、Ogataea、毕赤酵母属、原壁菌属、根霉属、红冬孢酵母属、红酵母属、酵母属、裂殖酵母属、Tremella、毛孢子菌属、威克汉森酵母属(Wickerhamomyes)和耶氏酵母属(Yarrowia)。

11.权利要求10的方法，其中所述细胞选自Arxula adeninivorans、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉、土曲霉、裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、麦角菌、浅白隐球菌(Cryptococcus albidus)、弯曲隐球菌、Cryptococcus ramirezgomezianus、地生隐球菌（Cryptococcus terreus）、Cryptococcus wieringae、刺孢小克银汉霉、山茶小克银汉霉（Cunninghamella japonica）、发酵地霉、多形汉森酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）、奥默柯达菌、Leucosporidiella creatinivora、产油油脂酵母（Lipomyces lipofer）、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、子囊菌油脂酵母(Lipomyes tetrasporus)、深黄被孢霉、高山被孢霉、Ogataea polymorpha、西弗毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、树干毕赤酵母、左氏原壁菌、少根根霉、Rhodosporidium babjevae、圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidiumtoruloides)、海洋红酵母(Rhodosporidium paludigenum)、粘红酵母、胶红酵母、酿酒酵母、稷酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、Tremella enchepala、皮肤毛孢子菌、发酵毛孢子菌、西弗威克汉森酵母（Wickerhamomyces ciferrii）、和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。

12.权利要求11的方法，其中所述细胞为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或Arxula adeninivorans。

13.包含遗传修饰的转化细胞，其中所述遗传修饰为用权利要求1-6中任一项的核酸或权利要求7的载体转化。

14.包含遗传修饰的转化细胞，其中所述遗传修饰增加选自乙酰-CoA羧化酶、ATP-柠檬酸裂合酶亚基1、ATP-柠檬酸裂合酶亚基2、乙酰-CoA合成酶同种型1、乙酰-CoA羧化酶、ATP-柠檬酸裂合酶亚基1、ATP-柠檬酸裂合酶亚基2、乙酰-CoA合成酶同种型1、乙酰-CoA合成酶同种型2、2型二酰基甘油酰基转移酶、1型二酰基甘油酰基转移酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、苹果酸酶、1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶、磷脂:二酰基甘油酰基转移酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶、脂肪酸合酶亚基α、脂肪酸合酶亚基β、2A型相关蛋白磷酸酶、1型蛋白磷酸酶Glc7p的调节亚基、Sit4磷酸酶的调节亚基、脱磷酸-CoA激酶、HAC1碱性亮氨酸拉链转录因子、CAT8锌指转录因子、泛素、STB5转录因子、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱羧酶、苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸酯脱氢酶、柠檬酸合酶、醛脱氢酶、磷脂酸磷酸酶、甘油-3-磷酸/二羟丙酮磷酸-sn-1酰基转移酶、溶血磷脂和溶血磷脂酸酰基转移酶的蛋白的活性。

15.权利要求13或14的转化细胞，其中所述细胞选自藻类、细菌、霉菌、真菌、植物和酵母。

16.权利要求15的转化细胞，其中所述细胞选自Arxula、曲霉属、Aurantiochytrium、假丝酵母属、麦角菌属、隐球菌属、小克银汉霉属、地霉属、汉森酵母属、克鲁维酵母属、柯达菌属、Leucosporidiella、油脂酵母属、被孢霉属、Ogataea、毕赤酵母属、原壁菌属、根霉属、红冬孢酵母属、红酵母属、酵母属、裂殖酵母属、Tremella、毛孢子菌属、威克汉森酵母属和耶氏酵母属。

17.权利要求16的转化细胞，其中所述细胞选自Arxula adeninivorans、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、裂殖壶菌、产朊假丝酵母、麦角菌、浅白隐球菌、弯曲隐球菌、Cryptococcus ramirezgomezianus、地生隐球菌、Cryptococcus wieringae、刺孢小克银汉霉、山茶小克银 汉霉、发酵地霉、多形汉森酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、奥默柯达菌、Leucosporidiella creatinivora、产油油脂酵母、斯达氏油脂酵母、子囊菌油脂酵母、深黄被孢霉、高山被孢霉、Ogataea polymorpha、西弗毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、树干毕赤酵母、左氏原壁菌、少根根霉、Rhodosporidium babjevae、圆红冬孢酵母菌、海洋红酵母、粘红酵母、胶红酵母、酿酒酵母、稷酒裂殖酵母、Tremella enchepala、皮肤毛孢子菌、发酵毛孢子菌、西弗威克汉森酵母和解脂耶氏酵母。

18.权利要求17的转化细胞，其中所述细胞为解脂耶氏酵母或Arxula adeninivorans。

19.权利要求18的转化细胞，其中所述细胞为Arxula adeninivorans，进一步包含第二个遗传修饰，其中：

所述第二个遗传修饰降低含有SEQ ID NO: 13、25、27、29、31、33、39、41、43、51、71、73、75、77、81、164、174、176或178中列出的氨基酸序列的蛋白的活性；或

所述第二个遗传修饰降低SEQ ID NO: 14、26、28、30、32、34、40、42、44、52、72、74、76、78、82、165、175、177或179中列出的核酸所编码的蛋白的活性。

20.权利要求19的转化细胞，其中所述第二个遗传修饰为敲除突变。

21.包含遗传修饰的Arxula adeninivorans细胞，其中所述修饰降低选自δ-12脂肪酸去饱和酶、多功能β-氧化酶、δ-9脂肪酸去饱和酶、三酰基甘油脂肪酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、AMP活化激酶、酰基-CoA氧化酶、脂肪酸延伸酶、过氧化物酶体膜E3泛素连接酶、丙酮酸脱氢酶复合体的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶组分(E2)、葡萄糖阻遏中涉及的MIG1转录因子、2-甲基柠檬酸脱水酶、磷脂酰乙醇胺甲基转移酶、亚甲基-脂肪-酰基-磷脂合酶和INO4转录因子的蛋白的活性。

22.权利要求21的细胞，其中所述遗传修饰为敲除突变。

23.权利要求21或22的细胞，其中所述蛋白包含SEQ ID NO: 13、25、27、29、31、33、39、41、43、51、71、73、75、77、81、164、174、176或178中列出的氨基酸序列。

24.权利要求21-23中任一项的细胞，其中所述蛋白由SEQ ID NO: 14、26、28、30、32、34、40、42、44、52、72、74、76、78、82、165、175、177或179中列出的核酸序列编码。

25.权利要求21-24中任一项的细胞，进一步包含第二个遗传修饰，其中所述第二个遗传修饰为用权利要求1-6中任一项的核酸或权利要求7的载体转化。