JP2022501028A

JP2022501028A - プロモータ工学によるアルコールデヒドロゲナーゼ２（ａｄｈ２）プロモータ変異体の設計

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Publication number: JP2022501028A
Application number: JP2021515127A
Authority: JP
Inventors: チャルック，プナール; エルギュン，ブルジュギュンドゥズ
Original assignee: オルタドグテクニクユニヴェルシテシ
Priority date: 2018-09-24
Filing date: 2019-09-23
Publication date: 2022-01-06
Also published as: EP3824083A4; WO2020068019A3; US20210309990A1; WO2020068019A9; WO2020068019A2; CN112739819A; EP3824083A2

Abstract

ピキア・パストリスアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）プロモータ変異体は、配列番号１で示される野生型ピキア・パストリスＡＤＨ２プロモータ上の指定された改変の少なくとも１つを含むことを特徴とし、前記プロモータ変異体は、それぞれヌクレオチドａ）６４７〜６６０（−４０１〜−３８８）、ｂ）７３９〜７５２（−３０９〜−２９６）、ｃ）１〜９４８（−１０４７〜−１００）内の任意の位置におけるＣａｔ８転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）の組込み、特に「ＴＴＣＣＧＴＴＣＧＴＣＣＧＡ」遺伝子配列またはこの配列と少なくとも８０％の類似性を示す他の遺伝子配列の組込みからなる群から選択される変異、およびｄ）ヌクレオチド１５〜８４８（−１０３３〜−２００）内の配列番号２で指定された変異およびそれらの組み合わせを含み、ＡＤＨ２プロモータ変異体は、野生型ＡＤＨ２プロモータと比較した場合、増強された強度および誘導能をさらに特徴としている。

Description

本発明は、プロモータ工学によって設計された、増強された元のアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）遺伝子プロモータ変異体に関する。

プロモータ遺伝子は、プロモータ構造内で組換えタンパク質合成を開始および継続し、タンパク質発現に必要な上流のＤＮＡ要素であるＤＮＡヌクレオチド配列である。プロモータ遺伝子で利用可能な転写因子結合部位の数、質、機能的位置、およびこれらの位置に結合する転写因子ならびにそれらの間の相互作用は、プロモータ構造の基本的な構成要素である。

プロモータ遺伝子の強度は、宿主細胞の組換えタンパク質産生能力を決定する。酵母ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いた工業的組換えタンパク質の産生は１９８１年に開始され、過去１０年間で、この酵母は、ほとんどの研究が行われている酵母である。飼料業界で使用されるフィターゼ（Ｐｈｙｔｅｘ、シェリダン、インディアナ州、米国）、プロテオミクス研究用のトリプシン（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）、水分析および処理用の硝酸レダクターゼ（ＴｈｅＮｉｔｒａｔｅＥｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ社、レイクリンデン、ミシガン州、米国）、植物油の脱ガムに使用されるホスホリパーゼＣ（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国／ＤＳＭ、オランダ）、健康研究および皮膚充填物として使用されるコラーゲン（フィブロジェン、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国）、およびプロテイナーゼＫ（サーモサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによる先行技術（非特許文献１）ですでに産生されている組換えタンパク質である。ＦＤＡ（米国）によって承認された最初のバイオ医薬品であるＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）（エカランチド）は、２００９年に発売された。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを用いて製造されているＪｅｔｒｅａ（登録商標）は、ＦＤＡおよびＥＭＡ（ＥＵ）によっても承認されており、バイオ医薬品の新規の製造方法およびその承認申請を開発するための研究が続けられている。

プロモータ遺伝子は、酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのゲノム内の遺伝子配列の機能を決定することによって同定されており、野生型または改変プロモータ遺伝子配列は、その工業上の可能性のために特許を取得している。

先行技術の特許文献１に番号が付けられた特許において、メタノールおよび／またはメチルアミンで誘導されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）プロモータが開示されている。上記の特許では、ＦＬＤ１プロモータはＰ_ＡＯＸ１と同等のレベルで産生を行うことができるため、Ｐ_ＡＯＸ１の代替となる可能性があることが示唆されている。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ翻訳伸長因子（ＴＥＦ）プロモータ遺伝子およびこの構成的プロモータを用いた組換えタンパク質産生法は、特許文献２で番号付けられた特許により保護されている。

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型ＡＤＨ１遺伝子およびこの遺伝子を用いた組換えタンパク質産生プロセスは、特許文献３で番号付けられた特許により特許を取得している。本特許の対象となるＡＤＨ１プロモータは、調節されたプロモータであり、エタノールおよびグリセロールで誘導される。この特許で言及されているＡＤＨ１遺伝子は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型ＡＤＨ２遺伝子と同じ遺伝子であるが、ＡＤＨ２遺伝子は、文献では異なる注釈が付けられている。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのゲノムアノテーションは、主に酵母研究のモデル生物であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子との機能的類似性により行われる。本特許の対象となる遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＤＨ２遺伝子と機能的および構造的に類似しているため、本出願ではＡＤＨ２遺伝子と呼ばれる。

酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの調節されたＧＵＴ１（グリセロールキナーゼ）プロモータ遺伝子は、特許文献４で番号付けられた特許により特許を取得している。

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＤＡＳプロモータ変異体は、特許文献５で番号付けられた特許により特許を取得している。これらの変異体は、いくつかのプロモータ遺伝子領域の欠失、またはプロモータ内に位置するいくつかの上流活性化配列（ＵＡＳ）遺伝子要素の挿入により得られる。

先行技術の特許文献６で番号付けられた特許出願では、欠失、挿入または置換変異により形成されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ高親和性グルコース輸送体（ＧＴＨ１）遺伝子プロモータ（ｐＧ１）変異体（ｐＧ１−ｘ）が記載されている。

変異型ＡＯＸ１プロモータは、特許文献７で番号付けられた特許により特許を取得している。この研究では、プロモータ遺伝子上に位置するＨａｐ１、Ｈｓｆ、Ｈａｐ２３４、ａｂａＡ、Ｓｔｒｅ、Ｒａｐｔ、Ａｄｒ１、Ｍａｔ１ＭＣ、Ｇｃｒ１およびＱＡ−１Ｆの転写因子結合部位が同定され、これらの配列が削除または複製されて、野生型ＡＯＸ１プロモータの６％〜１６０％の割合で活性を示すＡＯＸ１変異体が作成された（非特許文献２）。

米国特許第６，７３０，４９９Ｂ１号米国特許第７８１６５０９号Ｂ２米国特許第８２２２３８６号Ｂ２米国特許第８７８５６１３号Ｂ２米国特許第２０１１０１２９８７４号Ａ１国際公開第２０１７／０２１５４１号Ａ１米国特許第９２７９１２９号Ｂ２

Ahmad, M.,Hirz, M., Pichler, H., &Schwab, H. (2014). Protein expression in Pichiapastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production. Applied microbiology and biotechnology, 98(12), 5301-5317. Hartner, F.S.,Ruth, C., Langenegger, D., Johnson, S.N., Hyka, P., vd. (2008). Promoter library designed for fine-tuned gene expression in Pichiapastoris. Nucleic acids research, 36(12), e76-e76.

本発明は、プロモータ工学設計による増強されたアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）遺伝子プロモータ変異体に関する。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＡＤＨ２酵素は、エタノールのアセトアルデヒドへの酸化である細胞内エタノール利用の第１のステップを触媒する。本発明に必要な２つの態様は以下のとおりである。
ａ）配列の設計、および
ｂ）設計されたモジュールの組込みのためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムの標的部位の選択。

Ｃａｔ８は、従来のバイオテクノロジーで重要なエタノール（エチルアルコール）産生酵母である出芽酵母のエタノール利用に関与する遺伝子の活性化における重要な転写因子である。本発明は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型ＡＤＨ２プロモータでは天然ではないＣａｔ８転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）「ＴＴＣＣＧＴＴＣＧＴＣＣＧＡ」配列（Ｒｏｔｈら、２００４年）を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムの標的位置に組み込み、機能分析により決定することによる、Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ１}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ１}）およびＰ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ２}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ２}）変異体の設計および構築、ならびに野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＡＤＨ２プロモータのヌクレオソーム最適化による第３のＡＤＨ２プロモータ変異体（Ｐ_{ＡＤＨ２−ＮｕｃＯｐｔ}）の設計および構築、ならびにその組換えタンパク質産生法に関する。

異なる炭素源において、Ｐ_{ＡＤＨ２−ｗｔ}（％）_Ｅ１を用いて構築された細胞、ＡＤＨ２プロモータ変異体を用いて構築された細胞におけるｅＧＦＰ発現に関する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の正規化されたｅＧＦＰ発現を示す。異なるエタノールおよびメタノール濃度において、Ｐ_{ＡＤＨ２−ｗｔ}（％）_Ｅ１を用いて構築された細胞、ＡＤＨ２プロモータ変異体を用いて構築された細胞におけるｅＧＦＰ発現に関する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の正規化されたｅＧＦＰ発現を示す。異なるエタノールおよびメタノール濃度において、Ｐ_{ＡＤＨ２−ｗｔ}（％）_Ｅ２を用いて構築された細胞、ＡＤＨ２プロモータ変異体を用いて構築された細胞におけるｅＧＦＰ発現に関する、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の正規化されたｅＧＦＰ発現を示す。

発明の詳細な説明

産生プロセスの産生性は、工業バイオテクノロジーの応用において重要な基準である。所望の組換えタンパク質を産生することができる宿主微生物の能力は、プロモータ構造に依存している。理想的な組換えタンパク質産生システムは、強力で調節されたプロモータ遺伝子の下で調節された方法で高収量の産生を行うシステムである。調節されたプロモータは、細胞増殖段階と組換えタンパク質産生段階を互いに分離することを可能にし、それによってプロセスの制御能力を高める。さらに、バイオリアクターでの組換えタンパク質の蓄積が細胞の増殖およびその生存率に及ぼす悪影響も、２つの段階を分離することによって防止される。

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓでは、ＡＯＸ１プロモータであるＰ_ＡＯＸ１システムが一般的に使用されている。Ｐ_ＡＯＸ１を使用する場合、有毒なアルコールであるメタノールをバイオリアクターに供給する必要があるため、リスクが生じる。食品および製薬業界向けに産生された組換えタンパク質にメタノール残留物が残る可能性があるため、この方法の使用は制限される。食品業界で高純度レベルではない粗酵素の一般的な使用は、食品業界で使用される組換えタンパク質生成物の精製コストの増加により、メタノールの使用が制限される。エタノールは、人類の歴史の中で生産された最初の伝統的なバイオテクノロジー製品の１つである。米国国立労働安全衛生研究所（ＮＩＯＳＨ）の作業環境でメタノールに許可されている閾値制限値（ＴＬＶ）は２００ｐｐｍであり、エタノールに対するこの値は、１０００ｐｐｍである。さらに、メタノールの致死量は０．３〜１ｇ／ｋｇであり、エタノールの致死量は７，０６０ｇ／ｋｇである。エタノールは、人類の歴史の中で生産された最初の伝統的なバイオテクノロジー製品の１つであり、また、化学、製薬および食品業界で長年使用されており、安全なプロセスの応用の観点から特別な注意を払う必要がないため、安全であることが知られている。

本発明の対象となるＡＤＨ２プロモータ変異体の誘導剤はエタノールであるため、エタノールは安価であり、無毒で無害な性質を有するため、これは本発明の対象となる変異体の工業上の重要性が増大する。プロモータの誘導および抑制特性を使用することにより、ＡＤＨ２プロモータ変異体の下で調節できるバイオリアクター供給戦略を開発することができる。バイオリアクター操作の第１の段階では、プロモータを抑制するグルコースまたはグリセロールを供給し、それによって組換えタンパク質の産生を停止することにより、高細胞密度の培養をもたらし、第２の段階では、濃度を増加させたエタノールを供給することにより、高細胞密度の組換えタンパク質産生プロセスに有意なプロモータ誘導および効果的なプロセス制御を提供することができる。効果的なプロセス制御メカニズムを提供し、産生段階を細胞増殖段階から分離することは、産生される異種タンパク質の特徴に依存する特定の場合に重要な利点を有する。これらの利点は、プロセスの最後に高いタンパク質収量が得られること、生成物の安定性が向上すること、および発現されるタンパク質が有毒である場合の組換えタンパク質産生である。

本発明の対象となるプロモータ変異体の新規で重要な特徴は、それらがＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型ＡＤＨ２プロモータ（Ｐ_{ＡＤＨ２−ｗｔ}）および一般的に使用されるメタノール誘導性ＡＯＸ１プロモータよりも強力であり、したがってそれらは、一般的に使用されるプロモータシステムと比較して、組換えタンパク質をより大量に産生できることである。組換えタンパク質産生の主な目的は、高収量の産生プロセスを開発することであり、強力なプロモータは、この目的を達成するための最も重要な遺伝的ツールである。

本発明は、野生型ＡＤＨ２プロモータよりも強い発現能力を有するエタノールおよびメタノール誘導条件下で、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＡＤＨ２プロモータ（配列番号１）のヌクレオチド１〜９４８（−１０４７〜−１００）内の少なくとも１つの変異を含むピキア・パストリスのアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）プロモータ変異体に関する。

本発明は、下記のヌクレオチド置換によって特定の部位に組み込まれたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣａｔ８ＴＦＢＳを含む、設計されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＡＤＨ２プロモータ変異体遺伝子配列、および野生型ＡＤＨ２プロモータの１００ヌクレオチドを修飾することによって設計された、ヌクレオソーム最適化ＡＤＨ２プロモータ変異体の遺伝子配列を含む。本発明は、組換えタンパク質生産プロセスのためのオリジナルの新規の戦略的バイオリアクター操作条件を設計することを可能にする。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによる高細胞密度組換えタンパク質産生プロセスは、本発明の対象となるプロモータ変異体を使用して開発することができ、グルコースおよびグリセロールを使用すると、高細胞密度濃度が得られ、次いでタンパク質産生は、増加したエタノール濃度下での誘導を用いて行うことができる。

プロモータ変異体のｐａｓｔｏｒｉｓＡＤＨ２プロモータを設計する方法には、ヌクレオチド６４７〜６６０（−４０１〜−３８８）、７３９〜７５２（−３０９〜−２９６）、１００〜１０００（−９４８〜−４８）内の任意の位置におけるＣａｔ８転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）の組込み、特に「ＴＴＣＣＧＴＴＣＧＴＣＣＧＡ」遺伝子配列またはこの配列と少なくとも８０％の類似性を示す他の遺伝子配列の組込みからなる変異、およびヌクレオチド１５〜８４８（−１０３３〜−２００）内の配列番号２で指定される変異、およびそれらの組み合わせが含まれる。

プロモータ変異体の構築は、欠失、置換、挿入、および／または反転であるヌクレオチド変異によって行われる。

本発明の対象となるＡＤＨ２プロモータ変異体の設計では、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型ＡＤＨ２プロモータ上の天然ではない遺伝子配列は、ＡＤＨ２プロモータの機能的に決定された領域への置換によって組み込まれている。この研究では、プロモータ変異体を設計するために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用に最適化されたＣａｔ８ＴＦＢＳ（Ｒｏｔｈら、２００４年）を、異なる宿主であるＰ．Ｐａｓｔｏｒｉｓのプロモータ工学研究に使用した。プロモータ変異体Ｐ_{ＡＤＨ２−ＮｕｃＯｐｔ}の設計では、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓプロモータが、ヌクレオソーム最適化戦略によって初めて改変された。

設計されたプロモータ変異体の基本的な利点は、それらが強力で調節されたシステムであるということであり、それらは、食品および製薬業界向けに無害なエタノールで誘導することができることである。エタノールは安価な炭素源であり、製造プロセスで作業する者に対して毒性リスクを引き起こさないため、食品および製薬業界に重要な利点を提供する。異なる炭素源を有するプロモータの活性（オン）状態および非活性（オフ）状態を調節することによって効率的なプロセス制御を提供することにより、高い生成物収量、生成物の安定性、および細胞への毒性タンパク質の産生などのプロセス要件を提供することができる。効率的なプロセス制御で行うことができる産生適用は、より高い収量を提供し、コストおよび時間の両方の点で利点を提供する可能性がある。本発明の対象となるプロモータ変異体は、エタノール誘導条件下で、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型ＡＤＨ２プロモータ遺伝子と比較して、有意に高い組換えタンパク質産生を提供することができる。ＡＤＨ２プロモータ変異体の中で、Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ２}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ２}）は、一般的に使用されているが毒性アルコールであるメタノールによって誘発されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモータと比較して、高い産生能力を発揮することができる。

本発明の対象となるプロモータ変異体は、１０４７ヌクレオチド配列からなる。ヌクレオチドの位置を５’末端の最初のヌクレオチドから数える場合、ヌクレオチドの位置は正の数の値で表される。しかし、プロモータ上のヌクレオチドはまた、プロモータの末端に位置するコード配列の開始に基づいて決定することができ、そのような場合、プロモータの３´末端の最初のヌクレオチド（この場合、ヌクレオチドＡ）は、「−１」に位置し、ヌクレオチド位置は、プロモータ遺伝子の５´末端に向かって減少し続け、遺伝子の５´末端の最初のヌクレオチド（この場合、ヌクレオチドＴ）は、−１０４７ベースペア（ｂｐ）位置に位置する。

本発明の対象となるＡＤＨ２プロモータ変異体のヌクレオチド配列を以下に提供する。

プロモータ変異体−１：Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ１}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ１}）

Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ１}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ１}）配列でマークされた１３ヌクレオチドは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型ＡＤＨ２プロモータでは天然ではない。１３ヌクレオチドの置換により、プロモータ変異体Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ１}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ１}）は、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＰ_ＡＤＨ２プロモータと比較して、有意に高い組換えタンパク質産生能力に達した。

プロモータ変異体−２：Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ２}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ２}）

Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ２}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ２}）変異体でマークされた７ヌクレオチドは、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＡＤＨ２プロモータでは天然ではない。ＡＤＨ２プロモータ変異体Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ２}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ２}）は、配列内の指定された７ヌクレオチド置換により、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓプロモータと比較して、有意に高い組換えタンパク質産生能力に達した。

プロモータ変異体−３：Ｐ_{ＡＤＨ２−ＮｕｃＯｐｔ}

本発明の対象となる第３のＡＤＨ２プロモータ変異体は、ヌクレオソーム最適化Ｐ_{ＡＤＨ２−ＮｕｃＯｐｔ}遺伝子である。Ｐ_{ＡＤＨ２−ＮｕｃＯｐｔ}変異体配列でマークされたヌクレオチドは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型ＡＤＨ２プロモータでは天然ではない。

米国特許第８２２２３８６Ｂ２号で番号付けられた特許の範囲内で提示された技術は、グリセロール、エタノール、またはこれら２つの炭素源の混合物によるＡＤＨ２野生型プロモータ（Ｐ_{ＡＤＨ２−ｗｔ}）の誘導を開示し、プロモータ遺伝子はグルコースとメタノールで抑制されると述べている。しかし、本発明の対象となるＡＤＨ２プロモータ変異体は、エタノールで誘導され、グリセロールで抑制される。開発されたＡＤＨ２プロモータ変異体の調節は、先行技術による以下の特徴で区別される。

ｏ設計および構築されたすべてのＡＤＨ２プロモータ変異体は、グリセロールで抑制されている。
ｏ開発されたＡＤＨ２プロモータ変異体は、野生型ＡＤＨ２プロモータと比較して、エタノール誘導下で有意に高い産生収量を行うことができる。
ｏ開発されたＡＤＨ２プロモータ変異体は、メタノールで中強度に誘導することができる。

設計されたＡＤＨ２プロモータ変異体は、エタノールの存在下で強く誘導することができる。また、開発されたＡＤＨ２プロモータ変異体は、メタノールの存在下で中強度に誘導される。限られたグルコース、過剰なグルコース、および過剰なグリセロール炭素源が使用される産生培地では、組換えタンパク質の産生が抑制される。設計されたプロモータ変異体は、誘導と抑制の両方が可能なように調節されているため、この機能は、宿主細胞への毒性タンパク質の産生にとって特に重要である。さらに、無毒のエタノールで誘導できるため、安全でクリーンでグリーンな組換えタンパク質産生条件を提供する。

ＡＤＨ２−Ｃａｔ２プロモータ変異体は、非常に強力であり、炭素源で厳密に調節できるため、非常に重要である。ＡＤＨ２−Ｃａｔ２プロモータ変異体は、最も一般的に使用されている強力で厳密に調節されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＡＯＸ１プロモータよりも多くのタンパク質産生を行うことができる。この状況は、潜在的な組換えタンパク質産生（例えば、ヒト成長ホルモン、血清アルブミン、インスリンおよび食品業界酵素の産生）が、ＡＯＸ１プロモータの代わりにＡＤＨ２−Ｃａｔ２（ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ２）プロモータ変異体で行われる場合、産生収量を直接増加できることを示している。これに加えて、ＡＯＸ１の誘導に有毒なメタノールを使用する代わりにエタノールを使用して前述の高効率の産生レベルを達成できるため、大きな利点が得られる。

野生型ＡＤＨ２プロモータ遺伝子上の天然ではないＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣａｔ８結合部位が、ＡＤＨ２プロモータ変異体の発現強度を増加させるのに重要な効果を有することが、本発明の対象となる変異体によって証明された。酵母プロモータの活性化遺伝子モジュールは、プロモータの上流の活性化配列部位に位置している。本発明者らの発見および酵母プロモータの構造を考慮すると、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣａｔ８結合部位は、プロモータ遺伝子の１〜９４８ヌクレオチドの間の任意の位置に組み込まれて強度を増加することができる。

クロマチンの構造は、転写因子の結合ならびに転写の開始および伸長を決定することによって遺伝子発現を調節する最も重要なパラメータの１つである（Ｌｉら、２００７年）。ヌクレオソームのポジショニングは、ゲノムＤＮＡ配列内のヌクレオソーム構造の部位および位置を決定する（ＳｔｒｕｈｌおよびＳｅｇａｌ、２０１３年）。ゲノムレベルでのヌクレオソームのポジショニングは、ＡＴＰ依存性のヌクレオソームリモデリング酵素および転写因子によって決定される。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ野生型Ｐ_ＡＤＨ２遺伝子のヌクレオソーム最適化は、ＮｕＰｏｐおよびＭＡＴＬＡＢ（登録商標）ソフトウェアを使用して行った（Ｘｉら、２０１０年、Ｃｕｒｒａｎら、２０１４年）。信頼性の高いヌクレオソーム親和性予測のために、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムのＰ_ＡＤＨ２の上流および下流の遺伝子配列は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムデータベース（オンラインアクセス：ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃｈｉａｇｅｎｏｍｅ−ｅｘｔ．ｂｏｋｕ．ａｃ．ａｔ：８０８０／ａｐｅｘ／ｆ？ｐ＝１００：１）から得られた。Ｐ_ＡＤＨ２の入力データは、ＮｕＰｏｐを使用するヌクレオソーム親和性をより確実に予測するために、プロモータの２００ｂｐ上流から１００ｂｐ下流（レポータータンパク質として使用されたため、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子の最初の１００ヌクレオチド）までの配列を設計した。最適化プロセス全体を通じて、酵母のストレス応答要素、炭素源応答要素、非最適な炭素源の利用に関連するＴＦＢＳ、コアプロモータ領域、および元々ヌクレオソームが枯渇した領域は、最適化アルゴリズムの禁止部位として定義することにより、変異から保護された。また、既知のＴＦＢＳの作成または破壊は、最適化プロセス全体を通じて提供された。

実施例１
材料および方法

実施例１．１
Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ１}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ１}）およびＰ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ２}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ２}）プロモータ変異体の設計とレポータータンパク質を用いたクローニング

２段階オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ−ＰＣＲ）法を使用して、Ｃａｔ８ＴＦＢＳをＡＤＨ２プロモータ遺伝子に組込み、下表に示す設計された変異原性プライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ＿ＰＡＤＨ２＿Ｃａｔ１、ＲｅｖｅｒｓｅＰＡＤＨ２＿Ｃａｔ１、Ｆｏｒｗａｒｄ＿ＰＡＤＨ２＿Ｃａｔ２、Ｒｅｖｅｒｓｅ＿ＰＡＤＨ２＿Ｃａｔ２、Ｆｏｒｗａｒｄ＿ＰＡＤＨ２およびＲｅｖｅｒｓｅ＿ＰＡＤＨ２）を使用して、Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ１}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ１}）およびＰ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ２}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ２}）プロモータ変異体を構築した。

増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子は、ＡＤＨ２プロモータ変異体の下での遺伝子発現レベルを決定するためのレポーターとして使用されている。ｅＧＦＰ遺伝子およびＡＤＨ２プロモータ変異体遺伝子は、上表に示されているプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ＿ＰＡＤＨ２、Ｒｅｖｅｒｓｅ＿ＰＡＤＨ２、Ｆｏｒｗａｒｄ＿ｅＧＦＰ、およびＲｅｖｅｒｓｅ＿ｅＧＦＰ）を使用したＯＥ−ＰＣＲ法によって増幅された。プロモータ遺伝子配列とｅＧＦＰ遺伝子配列との間のヌクレオチド付加は妨げられた。増幅されたプロモータ変異体およびｅＧＦＰ遺伝子断片を適切な制限酵素を使用して消化し、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）耐性遺伝子とＡＯＸ１転写ターミネータモジュールを有するベクターへのライゲーション反応でクローン化した。構築されたプラスミドを、塩化カルシウム法（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年）で調製した化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。選択的ＬＢ寒天培地を含むＺｅｏｃｉｎ（商標）を使用して推定陽性クローンを選択し、プラスミドを単離した後、構築された組換えベクターを遺伝子配列分析によって検証した。

実施例１．２
プロモータ変異体を有する組換えベクターを用いた酵母ピキア・パストリスの形質転換およびプロモータ変異体の発現能力の評価

ＡＤＨ２プロモータ変異体とｅＧＦＰレポーター遺伝子を含む組換えベクターを、メーカーの支持に従ってＢｇｌＩＩ制限酵素で直鎖化し、塩化リチウム法で調製したコンピテントＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＸ３３細胞を、直鎖化遺伝子断片を用いて形質転換した（インビトロジェン社、２０００年）。再生後、形質転換体を、ＹＰＤ寒天培地を含む選択的ゼオシン（商標）に播種した。形質転換後、プロモータ変異体遺伝子およびｅＧＦＰレポーター遺伝子を含む発現カセットを有する推定クローンをコロニーＰＣＲで検証し、各株から少なくとも１０個体を選択し、プロモータ変異体の産生能力を評価するために使用した。

発現カセットは、少なくとも１つのＡＤＨ２プロモータ変異体およびタンパク質（ペプチド）または機能的ヌクレオチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含み、当該プロモータ変異体および核酸分子は、シングルコピーまたはマルチコピーの発現カセットを形成する。これらの核酸分子およびプロモータは、作動可能に一緒に連結されている。

Ｚｅｏｃｉｎ（商標）耐性遺伝子およびＡＯＸ１転写ターミネータモジュールを有するベクターは、ピキア・パストリスアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）プロモータ変異体および少なくとも１つの発現カセット内の核酸分子を含む。

ピキア・パストリス細胞をＹＰ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）中で、２５℃、２８０ｒｐｍで２０時間前培養した後、産生培地に移した。前培養の終了時に、細胞を遠心分離によって収集し、産生培地に移した。プロモータ変異体の発現能力を評価するために、最小培地（６．３ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、０．８ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．４９ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ、２．６４ｇ／ＬのＫＣｌ、０．０５３５ｇ／ＬのＣａＣｌ_２＊２Ｈ_２Ｏ、２２ｇ／Ｌのクエン酸一水和物、１．４７ｍｌ／ＬのＰＴＭ１、２ｍｌ／Ｌのビオチン（０．２ｇ／Ｌ）、２０ｍｌのＮＨ_４ＯＨ（２５％））５つの異なる炭素源を別々に使用した。使用したさまざまな基質および産生試験で適用した産生パラメータを以下の表に示す。ｍ２ｐキット多糖類２５％（ｖ／ｖ）および０．７％（ｖ／ｖ）酵素（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ社、ドイツ）混合物を含む産生培地を、制限されたグルコース条件に使用した。

以下に述べる異なるエタノール濃度およびメタノール濃度を有する産生試験を行い、プロモータ変異体の産生可能性を、アルコール濃度が増加する一般的に使用されるプロモータと比較した。産生培地で使用した基質は、産生の開始であるｔ＝０時間に供給され、２０時間の終了時に細胞のｅＧＦＰ産生量を分析した。

細胞を、２４ディープウェルプレート（２４ディープウェルプレート、Ｗｈａｔｍａｎ社、英国）で、異なる炭素源を含む２ｍｌの産生培地で、混合速度２８０ｒｐｍ、温度２５°Ｃで２０時間培養した。２０時間の終了時に、ピキア・パストリス細胞をリン酸緩衝生理食塩水でＯＤ_６００値０．４に希釈した。

細胞内ｅＧＦＰ産生値は、ＧｕａｖａｅａｓｙＣｙｔｅ（商標）（ミリポア社）フローサイトメトリーを使用して、単位細胞あたりの平均ｅＧＦＰ蛍光を測定することによって決定した。フローサイトメトリーでは、ｅＧＦＰは４８８ｎｍで刺激され、発光値は５２５ｎｍで収集された。１０，０００個の細胞からの蛍光シグナルを各測定で考慮し、ＦＳＣおよびＳＳＣ値を使用して、グラフィック上で酵母クラスターを定義する細胞を選択し、ＦＳＣ−ＨおよびＦＳＣ−Ａ値に関して線形回帰を示す細胞をゲートして一重項を選択した。細胞の体積およびゲートされた集団の幾何平均に基づく蛍光強度は、細胞の特定のｅＧＦＰ合成レベルを決定するためのｅＧＦＰ蛍光計算で使用した。相対的なｅＧＦＰ発現レベルは、野生型ＡＤＨ２プロモータ下でのｅＧＦＰ発現と比較して計算した。

これらの細胞は、少なくとも１つのピキア・パストリスアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）プロモータ変異体、少なくとも１つの発現カセットおよび少なくとも１つのベクターを含む。当該細胞は、真核細胞、特に酵母細胞、好ましくはメチロトローフ酵母細胞、好ましくはピキア、カンジダ、ハンセヌラおよびトルプロシスからなる群から選択される酵母細胞、特にピキア・パストリス細胞である。

組換えタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸は、以下のステップ、
・ＡＤＨ２プロモータ変異体を作成すること、
・ｅＧＦＰレポーター遺伝子を付加した発現カセットを作成すること、
・組換えベクタープロモータ変異体を作成すること、
・真核細胞、特に酵母細胞、好ましくはメチロトローフ酵母細胞、好ましくはピキア、カンジダ、ハンセヌラおよびトルプロシスからなる群から選択される酵母細胞、特にピキア・パストリスを組換えベクターで形質転換し、当該形質転換された細胞を適当な培地中で培養すること、
・好ましくは、当該タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸分子を誘導性発現すること、
・生成されたタンパク質、ペプチド、機能性核酸分子を単離することにより発現される。

実施例２
結果

本発明の対象となるプロモータ変異体の下での組換えタンパク質（ｅＧＦＰ）産生を、震盪フラスコバイオリアクター実験で試験した。設計されたプロモータ変異体の産生能力を、一般的に使用されているＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ誘導性ＡＯＸ１および構成的ＧＡＰプロモータと比較し、結果を表４に示す。異なる炭素源がプロモータ変異体の活性に及ぼす影響を評価し、その結果、組換えタンパク質の産生効率を評価した。プロモータ変異体の産生性を表４に示し、１％（ｖ／ｖ）エタノール誘導下でのｗｔ−ＡＤＨ２プロモータによるｅＧＦＰ産生は、１００ユニットと決定され、変異体の産生性はこの値に関連していた。

表４の結果によると、エタノール濃度を０．５％から１％（ｖ／ｖ）に増加させると、Ｐ_{ＡＤＨ２−ｗｔ}およびプロモータ変異体のｅＧＦＰ発現レベルが約２８〜５３％増加した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を１％（ｖ／ｖ）エタノールで誘導した場合、Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ１}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ１}）、Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ２}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ２}）、およびＰ_{ＡＤＨ２−ＮｕｃＯｐｔ}のｅＧＦＰ産生能力はそれぞれ、ｗｔ−ＡＤＨ２プロモータより２．２１倍、４．７５倍、１．９２倍高かった。ＡＤＨ２プロモータ変異体の産生性は、エタノール誘導と比較して１％（ｖ／ｖ）メタノール誘導では低くなるが、中強度の産生性を行うことができる。プロモータ変異体の活性は、制限されたグルコース、過剰なグリセロール、および過剰なグルコース条件下で大幅に低下し、言い換えれば、プロモータ変異体はそのような条件下で抑制される。

Ｐ_ＡＤＨ２変異体による組換えタンパク質産生に対する異なるエタノールおよびメタノール濃度の影響を、震盪フラスコバイオリアクター実験で評価し、ｅＧＦＰ産生結果を表５に示す。

表５に示した結果によると、エタノール濃度を５％まで増加させると、Ｐ_{ＡＤＨ２−ｗｔ}およびプロモータ変異体の産生能力は増加し続ける。しかし、最も一般的に使用されているＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓプロモータであるＡＯＸ１プロモータの産生能力は、試験条件下でのメタノール濃度の増加に伴って増加せず、これに加えて、５％（ｖ／ｖ）メタノールで誘導されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞の増殖が妨げられ、細胞が死滅し始める。高濃度のエタノールに対するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの耐性は、メタノールと比較して高くなっている。この結果は、設計されたプロモータ変異体が、高濃度のエタノールを使用する完全に制御されたバイオリアクターでの高収量の組換えタンパク質産生プロセスに使用できることを示している。

異なる炭素源を使用した産生実験は、各プロモータ変異体を含む各Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の３つの生物学的レプリカを使用して行い、結果を表６に示す。

２％（ｖ／ｖ）エタノール誘導条件下で、Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ１}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ１}）、Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ２}（Ｐ_{ＡＤＨ２−Ｃａｔ８−Ｌ２}）、およびＰ_{ＡＤＨ２−ＮｕｃＯｐｔ}はそれぞれ、ｗｔ−ＡＤＨ２プロモータと比較して２．３６、４．７６、および１．５０倍高いｅＧＦＰ産生を行った。設計されたプロモータ変異体は、制限されたグルコース、過剰なグリセロール、および過剰なグルコースの存在下で抑制されることにより、その調節された性質を維持しながら、Ｐ_{ＡＤＨ２−ｗｔ}と比較して、エタノールおよびメタノール誘導条件下で有意に高い産生能力に達した。

参照文献
Ahmad, M.,Hirz, M., Pichler, H., &Schwab, H. (2014). Protein expression in Pichiapastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production. Applied microbiology and biotechnology, 98(12), 5301-5317.
Curran, K. A.,Crook, N. C., Karim, A. S., Gupta, A., Wagman, A. M., & Alper, H. S. (2014). Design of synthetic yeast promoters via tuning of nucleosome architecture. Nature communications, 5.
Hartner, F.S.,Ruth, C., Langenegger, D., Johnson, S.N., Hyka, P., vd. (2008). Promoter library designed for fine-tuned gene expression in Pichiapastoris. Nucleic acids research, 36(12), e76-e76.
Invitrogen (2010), EasySelect^TM Pichia Expression Kit For Expression of Recombinant Proteins Using pPICZ and PPICZα in Pichiapastoris
Li, B.,Carey, M. and Workman, J.L. (2007). The role of chromatin during transcription. Cell 128: 707-719.
Roth, S.,Kumme, J., and Schuller, H. J. (2004). Transcriptional activators Cat8 and Sip4 discriminate between sequence variants of the carbon source-responsive promoter element in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current genetics, 45(3), 121-128.
Sambrook, J.,Russell, D.W. (2001) “Molecular cloning: a library manual”, 3rdedn., Cold Spring Harbor Library Press, Cold Spring Harbor, New York
Struhl, K., and Segal, E. (2013). Determinants of nucleosome positioning. Nature structural and molecular biology, 20(3), 267-273.
Xi, L.,Fondufe-Mittendorf, Y., Xia, L., Flatow, J., Widom, J., & Wang, J. P. (2010). Predicting nucleosome positioning using a duration Hidden Markov Model. BMC bioinformatics, 11(1), 1.

Claims

エタノールおよびメタノール誘導条件下で、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＡＤＨ２プロモータ（配列番号１）のヌクレオチド１〜９４８（−１０４７〜−１００）内の少なくとも１つの変異を含む、ピキア・パストリスアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）プロモータ変異体
プロモータ変異体を設計する方法であって、ピキア・パストリスＡＤＨ２プロモータが、ヌクレオチド６４７〜６６０（−４０１〜−３８８）、７３９〜７５２（−３０９〜−２９６）、１００〜１０００（−９４８〜−４８）内の任意の位置におけるＣａｔ８転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）の組込み、特に「ＴＴＣＣＧＴＴＣＧＴＣＣＧＡ」遺伝子配列またはこの配列と少なくとも８０％の類似性を示す他の遺伝子配列の組込みからなる変異と、ヌクレオチド１５〜８４８（−１０３３〜−２００）内の配列番号２で指定される変異と、それらの組み合わせと、を含む、方法。
ヌクレオチドが、欠失、置換、挿入、および／または反転によって変異される、請求項２のいずれかに記載のプロモータ変異体構築方法。
請求項１、２または３のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＡＤＨ２プロモータ変異体、タンパク質（ペプチド）または機能的ヌクレオチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む発現カセットであって、前記プロモータ変異体および核酸分子が、シングルコピーまたはマルチコピーの発現カセットを形成する、発現カセット。
前記プロモータおよび前記核酸が互いに作動可能に連結されていることを特徴とする、請求項４に記載の発現カセット。
請求項１、２または３のいずれかに記載のピキア・パストリスアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）プロモータ変異体と、請求項４に記載の少なくとも１つの核酸分子とを含む、ベクター。
請求項１、２または３のいずれかに記載の少なくとも１つのピキア・パストリスアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）プロモータ変異体と、請求項４に記載の少なくとも１つの発現カセット、または請求項６に記載の少なくとも１つのベクターとを含む、細胞。
前記細胞が真核細胞、特に酵母細胞、好ましくはメチロトローフ酵母細胞、好ましくはピキア、カンジダ、ハンセヌラおよびトルプロシスからなる群から選択される酵母細胞、特にピキア・パストリス細胞である、請求項７に記載の細胞。
以下のステップを含む組換えタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸の発現方法であって、
−請求項４に記載の発現カセット、あるいは請求項１、２または３のいずれかに記載のＡＤＨ２プロモータ変異体を含む請求項６に記載のベクター、および請求項４または５のいずれかに記載のタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸分子をコードする核酸分子を提供することと、
−前記ベクターまたは核酸分子を用いて、請求項７または８のいずれかに記載の前記細胞を形質転換することと、
−形質転換した細胞を適切な培地で培養することと、
−好ましくは、前記タンパク質、ペプチドまたは機能的核酸分子を誘導性発現することと、
−産生されたタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸分子を単離することと、を含む、方法。
前記細胞が、請求項７または８のいずれかに記載の酵母細胞、好ましくはメチロトローフ酵母細胞、好ましくはピキア、カンジダ、ハンセヌラおよびトルプロシスからなる群から選択される酵母細胞、特にピキア・パストリス細胞である、請求項９に記載の方法。
請求項４に記載の発現カセット、請求項６に記載のベクター、あるいは請求項７または８のいずれかに記載の細胞を使用することを特徴とする、組換えタンパク質、ペプチドまたは機能的核酸分子の産生方法。