JP4563228B2 - キャンディダ・ユティリス由来のａｒｓ遺伝子 - Google Patents

Description

本発明は、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）に外来遺伝子を導入して形質転換する際に利用される、キャンディダ・ユティリス由来のＡＲＳ（autonomously replicating sequence）遺伝子に関する。

キャンディダ・ユティリスは、炭素資化域が広く、好気的条件下での培養でエタノールを生成せず、その増殖阻害も受けないことから、高濃度での連続培養による菌体製造が可能であり、食飼料用のタンパク質源等として広く使用されているのみならず、グルタチオン等の生産株として広く工業的に利用されてきた。

組み換えＤＮＡ技術の発展によって、遺伝子を自在に改変しあるいは加工し、これを細胞に導入して遺伝子を組み換え、例えばその発酵特性の改良、工業的有用性の増大、などが行われており、種々の酵母で可能となってきた。
キャンディダ・ユティリスにおいても、そのゲノム中に相同組み換えにより、外来遺伝子を導入する方法、例えば、薬剤耐性マーカー、キャンディダ・ユティリス染色体ＤＮＡと相同な配列及び異種遺伝子を含んだベクターによりゲノム中に導入するキャンディダ・ユティリスの形質転換系は、既に知られている（特許文献１）。

酵母への形質転換系としては、この他、ＡＲＳを持ったプラスミドを導入して、染色体とは独立して細胞内に保持させる形式もよく知られている。ＡＲＳ(autonomously replicating sequence)とは、自律複製能を持った染色体成分で、真核生物としては初めてSaccharomyces cerevisiaeにおいて取得された。染色体に組み込むタイプのベクターと比べＡＲＳを持ったベクターは顕著に形質転換効率が向上するため、それを指標に目的の宿主ゲノムＤＮＡからＡＲＳを取得することが可能である。酵母のＡＲＳが高等真核生物と比べ小さいことも、比較的容易に取得できる要因である。そのため、他の様々な酵母、例えばCandida albicans（非特許文献１）、Candida maltosa（非特許文献２）、Candida tropicalis（特許文献２）、Kluyveromyces lactis（非特許文献３）、Schizosaccharomyces pombe（非特許文献４）等からＡＲＳが分離されている。ＡＲＳの構造は酵母の種類により異なることが知られており、表１に示すように、機能に必要なサイズもさまざまである。分裂酵母Schizosaccharomyces pombeでは０．５〜１．５ｋｂｐと言われており、同一種内でもサイズに差が認められる。

キャンディダ・ユティリスのＡＲＳは、１９８３年にＨｓｕらによって、S.cerevisiaeで機能する成分として初めて取得された（非特許文献５）。また、Ｈｏらは同様な手法で取得したＡＲＳがキャンディダ・ユティリスで機能することを確認している（非特許文献６）。しかしながら、これら文献にはいずれもキャンディダ・ユティリスでの形質転換効率が記載されておらず、取得されたＡＲＳが、キャンディダ・ユティリスでどの程度の活性を持つかは不明である。また、K.lactisのＫＡＲＳ１０１は、S.cerevisiaeでも自律複製能を有するが、S.cerevisiaeとK.lactisではＡＲＳ機能に必要な配列が異なることが知られており（非特許文献７）、宿主に適した高活性型のＡＲＳを取得するうえでは、同種の酵母を宿主としてクローニングすることが望ましい。

一方、特許文献１には、キャンディダ・ユティリスを宿主としてキャンディダ・ユティリス由来のＡＲＳがクローニングされたことが開示され、取得された２種類のＡＲＳの機能領域は、最も短いもので１．９ｋｂｐに特定できることが示されている。これら短縮化したＡＲＳの形質転換効率は６〜７×１０^２個／μｇＤＮＡと高いが、１．８ｋｂｐ以下にすると、急激な効率の低下が認められている。更に、これらＡＲＳは細胞内でのコピー数が一つと少なく、プラスミドの安定性も２０〜３０％／２．５〜３．５世代と悪いことも示されており、ＡＲＳ活性が低いものと推察される。
従って、キャンディダ・ユティリスのベクターを構築する上で、よりコンパクトでかつ高い活性を持つＡＲＳを取得することが強く望まれていた。
ＷＯ９５／３２２８９号公報 特開２０００−７８９８０号公報 Mol Gen Genet 1990 221 210 Agric Biol Chem 1987 51 1587 Yeast 1990 6 69 Mol Cell Biol 1998 18 7294 J Bacteriol 1983 154 1033 Biotechnology and Bioengineering Symp 1984 (14) 295 Molecular microbiology 1996 19 757

本発明は、かかる従来の問題点を解決することにあり、形質転換効率の向上に適する、短縮化された、キャンディダ・ユティリス由来のＡＲＳ遺伝子を提供することにある。

本発明者らは、キャンディダ・ユティリス由来のＡＲＳをクローニングするため鋭意研
究の結果、ＤＮＡ取り込み能に優れたキャンディダ・ユティリス株を見出し、これを宿主
として用いることで、キャンディダ・ユティリスのゲノムからＡＲＳ活性を示す遺伝子Ｄ
ＮＡ断片を多数クローニングし、活性の高いＡＲＳの取得に成功した。更に、細分化し、
そのＡＲＳ活性を示す部分配列を分離し、短縮化したＤＮＡ断片においてもＡＲＳ活性が
十分に保持されていることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
（１）配列表配列番号１の塩基配列で表されるキャンディダ・ユティリス（Candida util
is）由来のＡＲＳ遺伝子、
（２）配列表配列番号２の塩基配列で表されるキャンディダ・ユティリス（Candida util
is）由来のＡＲＳ遺伝子、
（３）上記（１）乃至（２）記載のＡＲＳ遺伝子を含む含むプラスミド、
を提供するものである。

本発明が提供する約０．９ｋｂ及び１．５ｋｂの２つのキャンディダ・ユティリス由来のＡＲＳは、キャンディダ・ユティリス細胞内においてＤＮＡ複製ができ、このＤＮＡ断片を挿入したプラスミドを用いることにより、一層効率よくキャンディダ・ユティリスを形質転換することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の、キャンディダ・ユティリス由来のＡＲＳ活性を有するＤＮＡ断片、特にキャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株の染色体遺伝子からクローニングされたＡＲＳ活性を有するＤＮＡ断片のうち、ＡＲＳ活性を示す部分領域である。具体的には、配列番号１及び２に示す塩基配列で示されるものである。

染色体遺伝子から目的のＤＮＡ断片をクローニングする手順について、以下、説明する。
１．ゲノムＤＮＡライブラリーの構築
キャンディダ・ユティリスのゲノムＤＮＡを予め選択してある制限酵素で処理し、適当なサイズのＤＮＡを分取して、キャンディダ・ユティリスで機能するＧ４１８耐性モジュールを持ち大腸菌でのみ複製可能なプラスミドの同じ制限酵素サイトに連結した。このライゲーション液を用いて大腸菌を形質転換し、得られらた薬剤耐性マーカーを利用して得られたコロニーからＤＮＡを回収して、ゲノムＤＮＡライブラリーとした。

２．ＡＲＳスクリーニング
ゲノムＤＮＡライブラリーをＡＲＳスクリーニングに適したキャンディダ・ユティリスに導入して、Ｇ４１８薬剤耐性を獲得したコロニーを取得した。この段階ではＡＲＳ配列を持ちプラスミドとして細胞内に存在する場合に加えて、低頻度ながらＧ４１８耐性モジュールが染色体に組み込まれて存在するものも混在している。ＡＲＳを持ったプラスミドは染色体組み込み型に比べ著しく高い形質転換効率を示すことから、それを指標にＡＲＳの有無の判別が可能であり、形質転換株からプラスミドを回収し、再度、キャンディダ・ユティリスに導入し、形質転換効率を調べ、ＡＲＳ活性の有無を確認した。

３．ＡＲＳ活性を有するＤＮＡ断片の短縮化
ＡＲＳ活性を有するＤＮＡ断片を、適当な制限酵素処理、もしくは下記４で得られる塩基配列を基にしたＰＣＲにより得られるさまざまなＤＮＡ断片を、大腸菌でのみ複製可能なプラスミドに挿入し、さらにこれにキャンディダ・ユティリスで機能するＧ４１８耐性モジュールを連結して、ＡＲＳ活性を確認した。

４．短縮化したＡＲＳ断片のＤＮＡ塩基配列解析
短縮化したＡＲＳの塩基配列はプライマーウォーキング法により決定した。これは塩基配列を決定するごとにその配列の末端に新たな特異的プライマーを作製して、段階的に配列を読み続ける方法である。配列の解読にはキャピラリーＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ）を用いた。
S．cerevisiaeでは、ＡＲＳ活性をもつ配列中に［Ｔ／Ａ］ＴＴＴＡ［Ｃ／Ｔ］［Ａ／Ｇ］ＴＴＴ［Ｔ／Ａ］の１１ｂｐからなるＡＣＳ（ARS consensus sequence）と呼ばれる保存配列があることが知られている（Current Biology 1993 3 752）。本発明のＡＲＳについては、図５、図７に示すように、ＡＣＳ及びＡＣＳ類似の塩基配列（１塩基又は２塩基異なる配列）の存在が認められた。

本発明において提供されるキャンディダ・ユティリス由来のＡＲＳ活性を示すＤＮＡ断片は、キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株から得られたものであるが、当該キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株から誘導される種々の変異株のみならず、キャンディダ・ユティリスに属する他の菌株においても高いＡＲＳ活性を示す。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例１
１．キャンディダ・ユティリスのゲノムＤＮＡライブラリーの構築
（１）ライブラリー用ベクターの構築
選択マーカーには既に配列が明らかになっている構造遺伝子、および遺伝子調節領域を基に薬剤耐性カセットを構築し用いた。すなわち、種々の酵母の選択マーカーとして広く用いられており、S．cerevisiaeの遺伝子破壊株コレクションの作成にも使用されているＧ４１８耐性を付与するバクテリアのトランスポゾンＴｎ９０３由来のｋａｎＭＸ（Yeast 1994 10 1793）、および解糖系の酵素で強い発現が知られているキャンディダ・ユティリス由来のグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）のプロモーター、ターミネーターである。
各遺伝子、遺伝子調節領域は以下のプライマーを用いてＰＣＲにより取得した。

プライマー
(1)ＫＡＮＭＸ−Ｆ
5'-GCTCTAGAATGGGTAAGGAAAAGACTCAC-3'
(2)ＫＡＮＭＸ−Ｒ
5'-GGGGTACCTTAGAAAAACTCATCGAGCAT-3'
(3)Ｐｇａｐ−Ｆ
5'-GGGGATCCAAGCTTACAGCGAGCACTCAA-3'
(4)Ｐｇａｐ−Ｒ
5'-CCTCTAGATATGTTGTTTGTAAGTGTGTT-3'
(5)Ｔｇａｐ−Ｆ
5'-GGGGTACCATTGTATGACTTTTATTTATG-3'
(6)Ｔｇａｐ−Ｒ
5'-GGGGATCCACGTGTAATACCTCAGGAGTC-3'
ＫＡＮＭＸ構造遺伝子の増幅には上記プライマーの(1)、(2)を、同様にＧＡＰプロモーターにはプライマー(3)、(4)を、ＧＡＰターミネーターにはプライマー(5)、(6)を用いた。

鋳型としては、ＫＡＮＭＸには を、ＧＡＰのプロモーター、ターミネーターにはキャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株の染色体をそれぞれ用いた。
ＰＣＲで合成したプロモーター０．９８ｋｂｐ、Ｇ４１８耐性構造遺伝子０．８ｋｂｐ、およびターミネーター０．８ｋｂｐを、各断片の両端に付した制限酵素サイト（ＢａｍＨＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＫｐｎＩ、およびＫｐｎＩとＢａｍＨＩ）を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）に連結し、Ｇ４１８カセットを構築した。さらに、ＢａｍＨＩで切り出されるＧ４１８カセットを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のマルチクローニングサイト内のＸｈｏＩとＳａｌＩの間にＢｇｌＩＩサイトを導入したベクターｐＹＮ１４１のＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩサイトに連結した（図１）。
なお、キャンディダ・ユティリスの３−イソプロピルマレイトデヒドロゲナーゼ（３−ＩＭＤＨ）遺伝子（J General Microbiology 1987 133 1089）の部分配列内のＢａｍＨＩサイトに、上記Ｇ４１８耐性カセットを挿入した染色体組み込み型のベクター（図２）をキャンディダ・ユティリスに導入し、Ｇ４１８耐性が付与されることを確認している。
また、相同遺伝子として用いた３−ＩＭＤＨのＫｐｎＩの下流からＨｉｎｄＩＩＩまでの部分配列は、以下のプライマーを用いてＩＡＭ４２６４株からＰＣＲにより取得した。
Ｌｅｕ−Ｆ
5'-GCGCGGCCGCGGTGCCGTCAGACCAGAGCAA-3'
Ｌｅｕ−Ｒ
5'-GGGCGGCCGCAGCTTGTGAGTGATGCATCCA-3'

（２）ライブラリーの構築
キャンディダ・ユティリスで機能するＧ４１８耐性カセットを用いて、キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株のゲノムＤＮＡライブラリーを構築した。
キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株のゲノムＤＮＡ９０μgに、Ｓａｕ３ＡＩを５、２．５、１．５、０．７５、０．３５、０．１７５ｕｎｉｔｓとなるように加え、３７℃、１５分の反応後、氷上に移し４μlの５００ｍＭ−ＥＤＴＡを添加した。この溶液の一部を電気泳動で確認し、適度な切断が得られたものをショ糖密度勾配遠心に供してＤＮＡ断片を分画した。７〜１０ｋｂがメインのフラクションをライブラリーに用いた。
ライブラリーのベクターとしては、図１のＧ４１８耐性カセットを持つプラスミドを用いた。
ＢａｍＨＩで消化した後、ＣＩＡＰ処理を行い、上記キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株のＳａｕ３ＡＩで部分分解したＤＮＡを連結した（図３）。この反応液をエレクトロポレーションにて大腸菌 ＴＯＰ１０Ｆ’に形質転換して、アンピシリン耐性コロニーを取得した。これらのコロニーを掻き集めて得た培養液を基に再度プレート上で菌体を増幅させＤＮＡを回収して、ＤＮＡライブラリーとした。
ライブラリーのインサート平均サイズは５．６９ｋｂｐ、インサート組み込み率は９２％であった。

２．ＡＲＳスクリーニング
得られたゲノムＤＮＡライブラリーをキャンディダ・ユティリスへ形質転換して、ＡＲＳ活性を持つ断片のクローニングを行った。
（１）形質転換に適したキャンディダ・ユティリス株へのゲノムライブラリーの導入
ＤＮＡライブラリー２．５μｇを、常法である酢酸リチウム法（J Bacteriol 1983 153 163）により、キャンディダ・ユティリスＩＡＭ４２６４株とＡＨＵ３０５３株に形質転換した。酢酸リチウム法で処理した菌体は、３０℃で１時間培養した後、プレートに塗沫した。終濃度５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＹＰＤ培地で３０℃、２日間培養した結果、ＩＡＭ４２６４株は１２個、ＡＨＵ３０５３株では４３２個のＧ４１８耐性コロニーが出現した。ＡＨＵ３０５３株では、酢酸リチウム法で非常に高効率で形質転換できることが明らかとなった。
（２）ＡＲＳ活性の確認
ＡＨＵ３０５３株由来の形質転換体９８個からプラスミドを抽出して、大腸菌ＤＨ５αに導入し、形質転換体からプラスミドを回収した。回収したプラスミドを再度酵母へ形質転換したところ、７３サンプルでＧ４１８耐性株を得た。プラスミドのＰｖｕＩＩ消化パターンからスクリーニングしたプラスミドには、１９種類のＡＲＳが含まれると推察された。そのうち良好な形質転換効率を示したＡＲＳ３とＡＲＳ４の２種類について短縮化を行った。

３．ＡＲＳ活性を有するＤＮＡ断片の短縮化
適当な制限酵素を用いてＡＲＳを分断して、得られた断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩにサブクローニングした。このプラスミドのＮｏｔＩサイトに、図２のＮｏｔＩで切り出されるＧ４１８耐性カセットを連結してＡＲＳ活性測定用のプラスミドとした。ＡＲＳ細分化様式を図４に、その形質転換効率を表２に示した。

ＡＲＳ４では、ＳｐｅＩとＳａｌＩで切り出される０．９ｋｂｐのＡＲＳ４−２−２に、ＡＲＳ４と比較して６割弱のＡＲＳ活性が認められ、短縮後も、１．７６×１０^４個／μｇＤＮＡと、なお高い形質転換効率を示した。
一方、ＡＲＳ３では、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩを用いた短縮化で、活性が１／１０以下に低下した。

４．短縮したＡＲＳ断片のＤＮＡ塩基配列解析
短縮化したＡＲＳ３−２、ＡＲＳ４−２−２について、プライマーウォーキング法によりＤＮＡ塩基配列を解析した。さらに決定した配列に関しては、塩基配列解析ソフトを用いてＡＣＳとの相同性解析を行った。
ＡＲＳ−４−２−２（配列番号２）は、全長８７４ｂｐから成り、１１ｂｐからなるＡＣＳ（［Ｔ／Ａ］ＴＴＴＡ［Ｃ／Ｔ］［Ａ／Ｇ］ＴＴＴ［Ｔ／Ａ］）が＋鎖と−鎖に１２ｂｐ隔てて１つずつ確認された（図５）。加えて、ＡＣＳと1塩基異なる配列を６個、２塩基異なるものを１９個含んでいた。

５．ＡＲＳ３−２のＰＣＲを用いた短縮化
塩基配列を基に、ＰＣＲにより両端から欠失変異株を作製し、その活性を調べ、機能領域を特定した。
ＡＲＳ３−２の５’上流より段階的に欠失させた変異ＡＲＳは、primer ＡＲＳ３−２Ｕシリーズ（Ｕ３７８〜Ｕ１２６９）とＡＲＳ３−２−Ｄ２８７４とにより、ＳａｌＩ−ＳｐｅＩ断片として増幅し、ＹＩｐＫＡＮのＳａｌＩ−ＳｐｅＩサイトに連結した。一方、ＡＲＳ３−２の３’下流より段階的に欠失させた変異ＡＲＳは、primer ＡＲＳ３−２−Ｕ７とＡＲＳ３−２−Ｄシリーズ（Ｄ７１５〜Ｄ２２３１）とによりＳａｌＩ−ＳｐｅＩ断片として増幅し、ｐＲＩ７７のＳａｌＩ−ＳｐｅＩサイトに連結した。
DelectionによりＤ１４９０の上流、及び７より下流の欠失により活性は緩やかに低下し、ＡＲＳ３−２の完全なＡＲＳ活性に必要な領域が広範囲に渡ることが明らかとなった。なお、Ｕ３７８−Ｄ１４９０のフラグメントはＡＲＳ３−２の約１／３と低調であることから、Ｕ７−Ｄ１４９０で得られるＡＲＳ３−２−Ｄ１４９０を高機能成分とした。この塩基配列を図７に示す。ＡＣＳと１塩基異なるものが５個、２塩基異なるものが２４個存在した。また、ＡＲＳ３−２−Ｄ１４９０のＡＴ含量は６９．６％であった。
なお、使用したprimerのリストを下記に示す。

(1)ＳＲＳ３−２−Ｕ７
5'-GGGTCGACCAAACTAATTTGAAAAGC-3'
(2)ＡＲＳ３−２−Ｕ３７８
5'-GGGTCGACGTCTGCTCTCTCAATATA-3'
(3)ＡＲＳ３−２−Ｕ６５６
5'-GGGTCGCCTCGAAAGTATTATATAT-3'
(4)ＡＲＳ３−２−Ｕ９２７
5'-GGGTCGACAGAACATTTCTTTTAGGA-3'
(5)ＡＲＳ３−２−Ｕ１２６９
5'-GGGTCGACTGGACTATCTTTAATAAA-3'
(6)ＡＲＳ３−２−Ｄ２８７４
5'-GGACTAGTTTATCAACACAAAATGAC-3'
(7)ＡＲＳ３−２−Ｄ２２３１
5'-GGACTAGTCAGATCAAACTTATACAT-3'
(8)ＡＲＳ３−２−Ｄ１７５６
5'-GGACTAGTATTGTCTTCCATTTACGT-3'
(9)ＡＲＳ３−２−Ｄ１４９０
5'-GGACTAGTTGCATTATGCGCTCTACT-3'
(10)ＡＲＳ３−２−Ｄ１２２０
5'-GGACTAGTTTAATAAATATTGCGTAT-3'
(11)ＡＲＳ３−２−Ｄ９２６
5'-GGACTAGTTAATATTGGTTTTCATAT-3'
(12)ＡＲＳ３−２−Ｄ７１５
5'-GGACTAGTTCCTAATAAAATTTATTT-3'

６．短縮化したＡＲＳの他のキャンディダ・ユティリス内での活性
他のキャンディダ・ユティリスでも、短縮化したＡＲＳが機能するかどうか検討した。
他のキャンディダ・ユティリスとして、ＡＴＣＣ２２０３３、ＡＴＣＣ９２２６、ＩＡＭ４２６４の３株を用いた。これら菌株の最少阻止濃度−それぞれ、４０、６０、４０μｇ／ｍｌ−に調製したＧ４１８添加ＹＰＤ培地で、酢酸リチウム法により短縮化した２種類のＡＲＳの形質転換を行った。
結果を表３に示す。

表３に示される通り、効率に差はあるものの各種キャンディダ・ユティリスで形質転換が可能であった。

以上、述べてきた通り、本発明によれば、キャンディダ・ユティリス由来の、安定性がよく短縮化されたＡＲＳ遺伝子が提供され、キャンディダ・ユティリスの効率的な形質転換が可能である。

ライブラリーに用いたベクターの図である。 染色体組み込み型のベクターの図である。 キャンディダ・ユティリスゲノムＤＮＡライブラリーの図である。 取得したＡＲＳの細分化を示す図である。 ＡＲＳ４−２−２中に含まれるＡＣＳおよびその類似配列の存在様式を示す図である。 図中、□で囲んだ部分がＡＣＳを、実線が１塩基異なる配列を、破線が２塩基異なる配列を示す。また、左向きの矢印はマイナス鎖を示す。 作製したＡＲＳ３−２の欠失変異株（Ａ）及びその形質転換効率（Ｂ）を示す図である。 Ａ：一番上の太い実線がＡＲＳ３−２を示し、その下の２本の細い実線がＤＮＡ二本鎖を示す。二本鎖上の三角シンボルは完全一致のＡＣＳ、短い縦線が１塩基異なるＡＣＳ類似塩基配列を示す。 その下の実線が作製した欠失変異株を示し、数値はその位置を示す。Ｕは上流からの、Ｄは下流からの欠失シリーズであることを示す。 Ｂ：図中、●はＵ、□はＤの各シリーズの形質転換効率を示す（３回の平均値）。 ＡＲＳ３−２−Ｄ１４９０中に含まれるＡＣＳ類似配列の存在様式を示す図である。 図中、実線が１塩基異なる配列を、破線が２塩基異なる配列を示す。また、左向きの矢印はマイナス鎖を示す。

Claims (3)

1. 配列表配列番号１の塩基配列で表されるキャンディダ・ユティリス（Candida utilis）由来のＡＲＳ遺伝子。
2. 配列表配列番号２の塩基配列で表されるキャンディダ・ユティリス（Candida utilis）由来のＡＲＳ遺伝子。
3. 請求項１又は２記載のＡＲＳ遺伝子を含むプラスミド。

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