CN105378058A - 具有高含量的Abu、γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly的酵母 - Google Patents
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Abstract
提供了具有高含量的Abu、γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly的酵母和酵母提取物。通过修饰酵母以使得胞内乙酰乳酸合酶活性降低，获得了具有高含量的Abu、γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly的酵母。通过使用以此种方式获得的酵母作为原材料制备了酵母提取物。
Description
技术领域
本发明涉及具有高含量的Abu、γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly的酵母和酵母提取物。所述酵母和酵母提取物在例如调味料和保健食品的食品领域有用。
背景技术
乙酰乳酸合酶已知为催化由两分子的丙酮酸生成乙酰乳酸和CO2的反应和由丙酮酸和α-丁酮酸(α-KB)生成α-乙酰羟基丁酸和CO2的反应的酶。已知ILV2和ILV6为编码酵母的乙酰乳酸合酶的基因，且ILV2和ILV6分别编码催化亚基和调节亚基。
已知若乙酰乳酸合酶从细菌中缺失，则α-KB在细胞中的蓄积量增加(非专利文件1)。
还已知若抑制编码乙酰乳酸合酶的ILV2基因，特别是对于啤酒酵母特征性的nonScILV2基因在酿造酵母中的表达量，则连位二酮，特别是二乙酰二酮的生产量增加，其中二酮起到产品的异味的作用(专利文件1)。
α-氨基丁酸(Abu)由α-KB通过氨基转移酶的作用生成。因此，通过增强参与Abu的生物合成的酶的活性，例如α-丁酮酸合成酶和氨基转移酶的活性，可增加Abu或γ-Glu-Abu在细胞中的蓄积量(专利文件2)。
但是，乙酰乳酸合酶活性和Abu、γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly在细胞中的蓄积量之间的任何关系均是未知的。
现有技术参考
专利文件
专利文件1:日本专利公开(Kohyo)No.2009-527218
专利文件2:WO2012/046731。
非专利文件
非专利文件1:Bioessays,(3):125-130(1987)。
发明概述
通过本发明实现的目的
本发明的目的是提供具有高含量的Abu、γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly的酵母和酵母提取物。
实现所述目的的手段
本发明的发明人进行了各种研究以实现前述的目的。结果，他们发现通过降低酵母中乙酰乳酸合酶的活性，其中酵母的α-丁酮酸合成酶和氨基转移酶的活性增强，Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在酵母细胞中的蓄积量增加，从而完成了本发明。
因而，可如下具体化本发明。
[1]
酵母，其具有高含量的α-氨基丁酸(Abu)-相关的化合物，其中酵母经修饰以使得胞内乙酰乳酸合酶活性降低，
其中所述Abu-相关的化合物由选自Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly的一种或更多种化合物组成。
[2]
根据[1]所述的酵母，其经进一步修饰以使得选自α-丁酮酸合成酶和氨基转移酶的一种或更多种酶的活性增加。
[3]
根据[2]所述的酵母，其中所述α-丁酮酸合成酶是由CHA1基因编码的酶。
[4]
根据[2]所述的酵母，其中所述氨基转移酶是由BAT1基因编码的酶。
[5]
根据[1]至[4]中任一项所述的酵母，其经进一步修饰以使得γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性增加。
[6]
根据[1]至[5]中任一项所述的酵母，其为酵母菌属酵母(Saccharomycesyeast)或假丝酵母菌属酵母(Candidayeast)。
[7]
根据[6]所述的酵母，其为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或产朊假丝酵母(Candidautilis)。
[8]
用于生产酵母提取物的方法，所述方法包括通过使用根据[1]至[7]中任一项所述的酵母作为原材料来制备酵母提取物。
[9]
用于生产Abu-相关的化合物的方法，所述方法包括：
在培养基中培养根据[1]至[7]中任一项所述的酵母；和
从培养物中收集所述Abu-相关的化合物。
[10]
根据[9]所述的方法，其中所述Abu-相关的化合物是γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly。
附图简述
[图1]图1是显示当将M007Y株(亲株)和M013Y株(ILV2启动子置换株)各自在SD培养基中培养时观察到的ILV2mRNA表达量的图表。数据显示为ILV2mRNA的量与作为内部标准的ACT1mRNA的量的比例。
[图2]图2是显示当将M007Y株(亲株)和M013Y株(ILV2启动子置换株)各自在SD培养基中培养时观察到的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在细胞中的含量的图表。数据显示为基于干燥细胞重量的化合物的含量(μmol/g-DCW)。在图表中，黑色部分显示γ-Glu-Abu含量，斜线部分显示Abu含量，及灰色部分显示γ-Glu-Abu-Gly含量。
[图3]图3是显示当将M007Y株、M013Y株和M014Y株(ILV2破坏株)各自在含有异亮氨酸和缬氨酸的SD培养基中培养时观察到的ILV2mRNA表达量的图表。数据显示为ILV2mRNA的量与作为内部标准的ACT1mRNA的量的比例。
[图4]图4是显示当将M007Y株、M013Y株和M014Y株(ILV2破坏株)各自在含有异亮氨酸和缬氨酸的SD培养基中培养时观察到的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在细胞中的含量的图表。数据显示为基于干燥细胞重量的化合物的含量(μmol/g-DCW)。在图表中，黑色部分显示γ-Glu-Abu含量，斜线部分显示Abu含量，及灰色部分显示γ-Glu-Abu-Gly含量。
[图5]图5是显示当将M007Y株、M013Y株和M014Y株(ILV2破坏株)各自在含有异亮氨酸和缬氨酸的SDTE培养基中培养时观察到的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在细胞中的含量的图表。数据显示为基于干燥细胞重量的化合物的含量(μmol/g-DCW)。在图表中，黑色部分显示γ-Glu-Abu含量，斜线部分显示Abu含量，及灰色部分显示γ-Glu-Abu-Gly含量。
[图6]图6是显示当将Y006Y株(亲株)和M015Y株(ILV2破坏株)各自在含有异亮氨酸和缬氨酸的SD培养基中培养时观察到的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在细胞中的含量的图表。数据显示为基于干燥细胞重量的化合物的含量(μmol/g-DCW)。在图表中，黑色部分显示γ-Glu-Abu含量，斜线部分显示Abu含量，及灰色部分显示γ-Glu-Abu-Gly含量。
[图7]图7是显示当将Y006Y株(亲株)和M015Y株(ILV2破坏株)各自在含有异亮氨酸和缬氨酸的SDTE培养基中培养时观察到的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在细胞中的含量的图表。数据显示为基于干燥细胞重量的化合物的含量(μmol/g-DCW)。在图表中，黑色部分显示γ-Glu-Abu含量，斜线部分显示Abu含量，及灰色部分显示γ-Glu-Abu-Gly含量。
实施本发明的方式
以下将详细地解释本发明。
<1>本发明的酵母
<1-1>本发明的酵母
本发明的酵母是具有高含量的α-氨基丁酸(Abu)-相关的化合物的酵母，其中酵母经修饰以使得胞内乙酰乳酸合酶活性降低。
在本发明中，“Abu-相关的化合物”指选自Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly的化合物。在本发明中，Abu和Glu是L-异构体。
表述"具有/含有高含量的Abu-相关的化合物"意指当在培养基中培养本发明的酵母时，所述酵母在其细胞中以使得所述化合物可被检测到的程度产生并蓄积Abu-相关的化合物。本发明的酵母可为能够以比对于非修饰株观察到的更大的量在细胞中蓄积Abu-相关的化合物的酵母。非修饰株的实例包括酵母的野生株和亲株。本发明的酵母可为能够以0.4μmol/g-DCW或更多、1μmol/g-DCW或更多、2μmol/g-DCW或更多、3μmol/g-DCW或更多、5μmol/g-DCW或更多、或10μmol/g-DCW或更多的量在细胞中蓄积Abu-相关的化合物的酵母。在本发明中，可产生并蓄积一种Abu-相关的化合物，或可产生并蓄积两种或更多种Abu-相关的化合物。
可通过修饰酵母的适当的菌株，例如，之后提到的任何菌株来获得本发明的酵母。
本发明的酵母可为芽殖酵母或裂殖酵母。芽殖酵母的实例包括属于酵母菌属的酵母，例如酿酒酵母，属于假丝酵母菌属的那些，例如产朊假丝酵母，属于毕赤酵母属(Pichia)的那些，例如毕赤酵母(Pichiapastoris)和属于汉逊酵母属(Hansenula)的那些，例如多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)。裂殖酵母的实例包括属于裂殖酵母属Schizosaccharomyces)的酵母，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。在这些当中，优选酿酒酵母和产朊假丝酵母，上述二者常常用于酵母提取物的生产。本发明的酵母可为单倍体酵母，或可为二倍体酵母或更多的多倍体酵母。
酿酒酵母的实例包括，例如，酿酒酵母Y006株(FERMBP-11299)。在2010年8月18日将Y006株作为国际保藏物保藏在独立行政法人产业技术综合研究所，特许生物保藏中心(NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology,InternationalPatentOrganismDepositary)(目前是独立行政法人，国家技术和评估研究所，国际专利生物保藏中心(independentadministrativeagency,NationalInstituteofTechnologyandEvaluation,InternationalPatentOrganismDepositary),#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)，并指定保藏号为FERMBP-11299。
酿酒酵母的实例还包括，例如，酿酒酵母BY4743株(ATCC201390)和酿酒酵母S288C株(ATCC26108)。作为产朊假丝酵母，也可使用例如产朊假丝酵母ATCC22023株。这些菌株可获自，例如美国模式培养物保藏所(AmericanTypeCultureCollection)(地址：12301ParklawnDrive,Rockville,Maryland20852,P.O.Box1549,Manassas,VA20108,UnitedStatesofAmerica)。即，赋予各菌株登记号，并可使用这些登记号来订购菌株(参考http://www.atcc.org/)。菌株的登记号列在美国模式培养物保藏所的目录中。
<1-2>乙酰乳酸合酶活性的降低
本发明的酵母已经修饰以使得胞内乙酰乳酸合酶活性降低。
在本发明中，"乙酰乳酸合酶"指具有用于催化由丙酮酸和α-丁酮酸(α-KB)生成α-乙酰羟基丁酸和CO2的反应的活性的蛋白(EC2.2.1.6)。该活性也称作"乙酰乳酸合酶活性"。在本发明中，乙酰乳酸合酶可具有，或可不具有用于催化由两分子的丙酮酸生成乙酰乳酸和CO2的反应的活性。可通过，例如，破坏编码乙酰乳酸合酶的基因来降低乙酰乳酸合酶活性。用于降低蛋白活性的方法的细节将在之后进行描述。
编码乙酰乳酸合酶的基因的实例包括编码乙酰乳酸合酶的催化亚基的ILV2基因。由ILV2基因编码的蛋白也称作Ilv2蛋白或Ilv2p。
酿酒酵母的ILV2基因的核苷酸序列在酵母菌属基因组数据库(SaccharomycesGenomeDatabase)中(http://www.yeastgenome.org/)公开。酿酒酵母S288C株(ATCC26108)的ILV2基因对应于在NCBI数据库中登记为GenBankAccessionNC_001145的染色体XIII的序列中的484084至486147的序列。酿酒酵母S288C株(ATCC26108)的Ilv2蛋白登记为GenBankAccessionNP_013826。酿酒酵母S288C株(ATCC26108)的ILV2基因的核苷酸序列和由该基因编码的Ilv2蛋白的氨基酸序列分别显示为SEQIDNO:15和16。
此外，例如，酿酒酵母Y006株(FERMBP-11299)具有两个拷贝的ILV2基因。
可通过，例如，由非修饰的酵母和经修饰的酵母制备粗酶溶液，并对比它们的乙酰乳酸合酶活性来确认乙酰乳酸合酶活性的降低。可通过，例如，已知的方法(F.C.Stormer和H.E.Umbarger,Biochem.Biophys.Res.Commun.,17,5,587-592(1964))来测量乙酰乳酸合酶活性。
乙酰乳酸合酶可为前述的乙酰乳酸合酶，例如含有SEQIDNO:16的氨基酸序列的蛋白的变体，只要维持原始的功能。此类变体可称作“保守变体”。保守变体的实例包括，例如，前述的乙酰乳酸合酶，例如含有SEQIDNO:16的氨基酸序列的蛋白的同源物和经人工修饰的形式。
表述“维持原始的功能”表示蛋白的变体具有对应于原始蛋白的活性的活性。即，用于乙酰乳酸合酶的表述“维持原始的功能”表示蛋白的变体具有乙酰乳酸合酶活性。
编码前述的乙酰乳酸合酶的同源物的基因可通过，例如，使用前述的编码乙酰乳酸合酶的基因的核苷酸序列作为查询序列的BLAST检索或FASTA检索由公共数据库容易地获得。此外，编码前述的乙酰乳酸合酶的同源物的基因也可通过，例如，使用酵母的染色体作为模板和基于已知的基因序列中的任何一个制备的寡核苷酸作为引物的PCR获得。
编码乙酰乳酸合酶的保守变体的基因可为，例如，如下所述的这样一种基因。即，编码乙酰乳酸合酶的基因也可为编码具有前述的氨基酸序列的蛋白的基因，所述氨基酸序列包括在一个或多个位置置换、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸残基，只要它编码具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白。在此类情况下，相对于在包括置换、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸残基之前的蛋白，变体蛋白中通常维持70%或更多，优选80%或更多，更优选90%或更多的对应活性。尽管“一个或多个”的数量可能取决于在蛋白的三维结构中的位置或氨基酸残基的类型而不同，但是具体地，其为1至50、1至40、或1至30，优选1至20、更优选1至10、再更优选1至5。
前述的一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入或添加是维持蛋白的正常功能的保守突变。保守突变的典型的实例是保守置换。保守置换是以下突变：其中若置换位点是芳香性氨基酸时，在Phe,Trp和Tyr中互相发生置换；若置换位点是疏水性氨基酸时，在Leu,Ile和Val中互相发生置换；若置换位点是极性氨基酸时，在Gln和Asn之间互相发生置换；若置换位点是碱性氨基酸时，在Lys,Arg和His中互相发生置换；若置换位点是酸性氨基酸时，在Asp和Glu之间互相发生置换；和若置换位点是具有羟基的氨基酸时，在Ser和Thr之间互相发生置换。被认为是保守置换的置换的实例具体地包括，Ser或Thr置换Ala，Gln、His或Lys置换Arg，Glu、Gln、Lys、His或Asp置换Asn，Asn、Glu或Gln置换Asp，Ser或Ala置换Cys，Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg置换Gln，Gly、Asn、Gln、Lys或Asp置换Glu，Pro置换Gly，Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr置换His，Leu、Met、Val或Phe置换Ile，Ile、Met、Val或Phe置换Leu，Asn、Glu、Gln、His或Arg置换Lys，Ile、Leu、Val或Phe置换Met，Trp、Tyr、Met、Ile或Leu置换Phe，Thr或Ala置换Ser，Ser或Ala置换Thr，Phe或Tyr置换Trp，His、Phe或Trp置换Tyr，和Met、Ile或Leu置换Val。此外，如上所述的氨基酸残基的此类置换、缺失、插入、添加、倒位等等包括由于个体差异，或由于由其获得基因的有机物种类的差异而天然发生的突变(突变体或变体)。
此外，具有如上所述的此类保守突变的基因可为编码显示与上述的总氨基酸序列具有80%或更多，优选90%或更多，更优选95%或更多，再更优选97%或更多，特别优选99%或更多的同源性，并具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白的基因。在本说明书中，“同源性”可表示“同一性”。
此外，编码乙酰乳酸合酶的基因可为能够在严格的条件下与探针杂交的DNA，所述探针可由已知的基因序列，例如与部分或全部的前述核苷酸序列互补的序列来制备，且其中DNA编码具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白。“严格的条件”指这样的条件：在此条件下，形成所谓的特异性杂交体，而不形成非特异性杂交体。严格的条件的实例包括那些条件：在此条件下，高度同源的DNA互相杂交，例如，不低于80%同源的，优选不低于90%同源的，更优选不低于95%同源的，再更优选不低于97%同源的，特别优选不低于99%同源的DNA互相杂交，比以上同源性低的DNA不互相杂交，或典型的Southern杂交的清洗条件，即在对应于1xSSC,0.1%SDS，60℃下，优选0.1xSSC,0.1%SDS，60℃下，更优选0.1xSSC,0.1%SDS，68℃下的盐浓度和温度下清洗一次，优选2或3次的条件。
如上所述，用于前述的杂交的探针可为与基因互补的序列的一部分。此类探针可通过使用基于已知的基因序列制备的寡核苷酸作为引物和含有这些核苷酸序列中的任何一种的DNA片段作为模板的PCR来制备。例如，当将具有大约300bp的长度的DNA片段用作探针时，杂交的清洗条件可为，例如，50℃,2xSSC和0.1%SDS。
此外，编码乙酰乳酸合酶的基因可为其中任意密码子被等同密码子替换的基因。
以上关于基因和蛋白的保守变体的描述经必要修改后也可适用于任意的蛋白(例如Cha1蛋白)和编码它们的基因。
<1-3>其它修饰
本发明的酵母可进一步具有另一修饰。可根据欲生成并蓄积的Abu-相关的化合物的类型等来适当地选择另一修饰。在本发明中，可采用任意的次序来进行用于构建本发明的酵母的修饰。
例如，本发明的酵母可经修饰以使得其Abu生物合成能力增强。预期Abu-相关的化合物在细胞中的含量通过此类修饰而增加。Abu生物合成能力可通过增加参与Abu的生物合成的酶的活性来增强。参与Abu的生物合成的酶的实例包括α-丁酮酸合成酶和氨基转移酶。在本发明中，可增强参与Abu的生物合成的一种酶的活性，或可增强参与Abu的生物合成的两种或更多种酶的活性。可通过，例如，增加编码所述酶的基因的表达来增加酶的活性。之后将描述用于增加蛋白活性的方法的细节。
本文提到的"α-丁酮酸合成酶"指具有用于催化由L-苏氨酸生成α-丁酮酸的反应的活性的蛋白。α-丁酮酸合成酶的实例包括，例如，丝氨酸/苏氨酸脱氨酶和苏氨酸脱氨酶。编码丝氨酸/苏氨酸脱氨酶的基因的实例包括CHA1基因。编码苏氨酸脱氨酶的基因的实例包括ILV1基因。优选，例如，在这些之中，由CHA1基因编码的丝氨酸/苏氨酸脱氨酶的活性增强。在本发明中，可增加一种α-丁酮酸合成酶的活性，或可增加两种或更多种α-丁酮酸合成酶的活性。
酿酒酵母的CHA1基因(系统名称:YCL064C)和ILV1基因(系统名称：YER086W)的核苷酸序列在酵母菌属基因组数据库中(http://www.yeastgenome.org/)公开。酿酒酵母S288C株(ATCC26108)的CHA1基因的核苷酸序列和由该基因编码的Cha1蛋白的氨基酸序列分别显示为SEQIDNO:17和18。酿酒酵母S288C株(ATCC26108)的ILV1基因的核苷酸序列和由该基因编码的Ilv1蛋白的氨基酸序列分别显示为SEQIDNO:19和20。
本文提到的"氨基转移酶"指具有通过转氨基作用来催化由α-丁酮酸生成Abu的反应的活性的蛋白。氨基转移酶的实例包括，例如，丙氨酸：乙醛酸氨基转移酶、支链氨基酸转氨酶、天冬氨酸氨基转移酶和γ-氨基丁酸转氨酶。编码丙氨酸：乙醛酸氨基转移酶的基因的实例包括AGX1基因。编码支链氨基酸转氨酶的基因的实例包括BAT1和BAT2基因。编码天冬氨酸氨基转移酶的基因的实例包括AAT1和AAT2基因。编码γ-氨基丁酸转氨酶的基因的实例包括UGA1基因。在这些之中，优选增加，例如由BAT1编码的支链氨基酸转氨酶的活性。在本发明中，可增加一种氨基转移酶的活性，或可增加两种或更多种氨基转移酶的活性。
酿酒酵母的AGX1(系统名称：YFL030W)、BAT1(系统名称：YHR208W)、BAT2(系统名称：YJR148W)、AAT1(系统名称：YKL106W)、AAT2(系统名称：YLR027C)和UGA1(系统名称：YGR019W)基因的核苷酸序列在酵母菌属基因组数据库中(http://www.yeastgenome.org/)公开。酿酒酵母S288C株(ATCC26108)的BAT1基因的核苷酸序列和由该基因编码的Bat1蛋白的氨基酸序列分别显示为SEQIDNO:21和22。
此外，本发明的酵母也可经修饰以使得γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的胞内活性增加或降低。本文提到的"γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶"可指具有用于将L-Glu和Abu识别为底物并催化生成γ-Glu-Abu的反应的活性的蛋白。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶可具有或可不具有用于将L-Glu和L-Cys识别为底物，并催化生成γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-Glu-Cys)的反应的活性。例如当γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly在细胞中生成并蓄积时，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性可增加。此外，例如，当γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly不在细胞中生成或蓄积时，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性可降低。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性的增强在例如，美国专利No.7,553,638；YasuyukiOtake等人，BioscienceandIndustry，第50卷，第10期，第989-994页等等中公开。
本发明的酵母也可经修饰以使得谷胱甘肽合酶的胞内活性增加或降低。本文提到的"谷胱甘肽合酶"可指具有用于将γ-Glu-Abu和Gly识别为底物，并催化生成γ-Glu-Abu-Gly的反应的活性的蛋白。谷胱甘肽合酶可具有，或可不具有用于将γ-Glu-Cys和Gly识别为底物，并催化生成谷胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)的反应的活性。例如，当γ-Glu-Abu-Gly在细胞中生成并蓄积时，谷胱甘肽合酶的活性可增加。此外，例如，当γ-Glu-Abu-Gly不在细胞中生成并蓄积时，谷胱甘肽合酶的活性可降低。
编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因的实例包括GSH1基因。编码谷胱甘肽合酶的基因的实例包括GSH2基因。酿酒酵母的GSH1基因和GSH2基因的核苷酸序列在酵母菌属基因组数据库中(http://www.yeastgenome.org/)公开。此外，产朊假丝酵母的GSH1基因和GSH2基因的核苷酸序列在美国专利No.7,553,638中公开。酿酒酵母S288C株(ATCC26108)的GSH1基因的核苷酸序列和由该基因编码的Gsh1蛋白的氨基酸序列分别显示为SEQIDNO:23和24。
此外，本发明的酵母也可经修饰以使得肽酶的胞内活性降低。本文提及的"肽酶"可指具有用于催化水解γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly的反应的活性的蛋白。肽酶的实例包括，例如，由DUG1基因、DUG2基因、DUG3基因和ECM38基因编码的蛋白(日本专利公开(Kokai)No.2012-213376)。分别由DUG1基因、DUG2基因和DUG3基因编码的Dug1p、Dug2p和Dug3p形成DUG复合物并起作用。已知谷胱甘肽通过DUG复合物的分解需要Dug1p、Dug2p和Dug3p三者(GanguliD.等人,Genetics,2007Mar;175(3):1137-51)，且DUG复合物的活性可通过降低一种或更多种选自Dug1p、Dug2p和Dug3p的蛋白的活性来降低。在它们之中，优选至少降低Dug2p的活性。在本发明中，可降低一种肽酶的活性，或可降低两种或更多种肽酶的活性。酿酒酵母的DUG1基因、DUG2基因、DUG3基因和ECM38基因的核苷酸序列在酵母菌属基因组数据库中(http://www.yeastgenome.org/)公开。
用于这些“其它修饰”的基因也不限于以上示例的基因或具有已知核苷酸序列的基因，而可以是它们的变体，只要编码维持原始功能的蛋白。对于基因或蛋白的此类变体，前述的关于乙酰乳酸合酶和编码其的基因的保守变体的描述可经必要修改后适用。当蛋白作为由多个亚基组成的复合物起作用时，用于各亚基的表述“维持原始功能”可意指各亚基可以与其它亚基一起形成复合物，且所述复合物具有相应的活性。即，例如，用于DUG复合物的各亚基的表述“维持原始功能”可意指各亚基可以与其它亚基一起形成复合物，且所述复合物具有肽分解活性。
可通过诱变处理或基因工程技术进行如上所述的此类各种修饰。用于酿酒酵母的基因工程技术在许多书中具体描述。此外，近年来也已报道用于产朊假丝酵母的各种方法，并也可使用它们。例如，具体的方法描述在诸如以下的现有参考文献中：NorihikoMisawa,ChemicalEngineering,1999年6月，第23-28页；LuisRodriguez等人,FEMSMicrobiologyLetters,165,335-340(1998)；WO98/07873；日本专利公开(Kokai)No.8-173170；WO95/32289；KeijiKondo等人,JournalofBacteriology,第177卷，第24期，第7171-7177页(1995)；WO98/14600；日本专利公开(Kokai)No.2006-75122、2006-75123、2007-089441和2006-101867，且可按需参考这些。
<1-4>用于增加蛋白活性的方法
以下将解释用于增加蛋白活性的方法。
表述“蛋白的活性增加”意指与非修饰株，例如野生型菌株和亲株相比较，每细胞蛋白的活性增加。“蛋白的活性增加”的陈述也可表述为“蛋白的活性增强”。具体地，表述“蛋白的活性增加”意指与非修饰株的那些相比较，每细胞蛋白的分子数增加，和/或蛋白的各分子的功能增强。即，在表述“蛋白的活性增加”中的术语“活性”不限于蛋白的催化活性，而且还可意指编码蛋白的基因的转录量(即mRNA的量)，或蛋白的翻译量(即蛋白的量)。此外，“蛋白的活性增加”的陈述不仅包括在固有地具有目标蛋白的活性的菌株中目标蛋白的活性增加的陈述，而且包括将目标蛋白的活性赋予不固有地具有目标蛋白的活性的菌株的陈述。此外，只要蛋白的活性最终增加了，那么可能削弱和/或消除固有地包含在酵母中的目标蛋白的活性，且随后可将适当类型的目标蛋白赋予宿主。
尽管只要与非修饰株相比较，蛋白的活性增加，那么蛋白活性增加的程度不受特别限制，但是与非修饰株的蛋白活性相比较，蛋白的活性可增加1.5倍或更多、2倍或更多、或3倍或更多。此外，当非修饰株不具有目标蛋白的活性时，蛋白由编码所述蛋白的基因的引入而产生是足够的，且例如，可产生蛋白至可测量酶活性的程度。
通过，例如增加编码所述蛋白的基因的表达获得用于增加蛋白活性的修饰。“基因的表达增加”的陈述也可称作“基因的表达增强”。与非修饰株的基因的表达相比较，基因的表达可增加1.5倍或更多、2倍或更多、或3倍或更多。此外，“基因的表达增加”的陈述不仅包括在固有地表达目标基因的菌株中的目标基因的表达量增加的陈述，而且包括将所述基因引入不固有地表达目标基因的菌株中，并在其中表达的陈述。即，短语“基因的表达增加”也可表示，例如，将目标基因引入没有该基因的菌株中，并在其中表达。
可通过，例如增加基因的拷贝数来增加基因的表达。
可通过将基因引入宿主的染色体中来增加基因的拷贝数。可通过，例如使用同源重组将基因引入染色体中(MillerI,J.H.,ExperimentsinMolecularGenetics,1972,ColdSpringHarborLaboratory)。可仅引入基因的一个拷贝，或两个或更多个拷贝。例如，通过使用存在于染色体上的多个拷贝中的序列作为靶进行同源重组，可将基因的多个拷贝引入染色体中。存在于染色体上的多个拷贝中的此类序列的实例包括自主复制序列(ARS)，其由特征性的短重复序列组成，和rDNA序列，其以大约150的拷贝数存在。使用含有ARS的质粒进行酵母转化的实例在WO95/32289中公开。此外，可将基因并入转座子，并可将所述转座子转移至染色体中从而引入该基因的很多拷贝。
可通过使用具有与全部基因或其部分互补的序列的探针的Southern杂交、使用基于所述基因的序列制备的引物的PCR等来确认靶基因引入染色体中。
此外，也可通过将含有靶基因的载体引入宿主微生物中来增加该靶基因的拷贝数。例如，可通过将含有靶基因的DNA片段与在宿主微生物中起作用的载体连接以构建该基因的表达载体，并用该表达载体转化该宿主微生物来增加该靶基因的拷贝数。可通过，例如，使用具有该靶基因的微生物的基因组DNA作为模板的PCR来获得含有该靶基因的DNA片段。作为载体，可使用在宿主微生物的细胞中可自主复制的载体。载体优选是多拷贝载体。在酵母细胞中起作用的载体的实例包括，例如，具有CEN4的复制起点的质粒，和具有2μmDNA的复制起点的多拷贝质粒。在酵母细胞中起作用的载体的具体实例包括，例如pAUR123(TakaraBio)和pYES2(Invitrogen)。
当引入基因时，本发明的酵母足以可表达地保持所述基因。具体地，引入所述基因以使得其在由启动子序列控制之下表达是足够的，所述启动子序列在本发明的酵母中起作用。所述启动子可为由宿主获得的启动子，或为异源启动子。所述启动子可为欲引入的基因的天然启动子，或可为另一基因的启动子。所述启动子可为由欲使用的载体原始携带的启动子。作为启动子，还可使用，例如，如后所述的此类更强的启动子。
此外，当引入两个或更多个基因时，本发明的酵母足以可表达地保持所述各基因。例如，所有基因均可由单一表达载体或染色体携带。此外，所述基因可由两种或更多种表达载体分开携带，或由单一的或两种或更多种表达载体和染色体分开携带。也可引入由两个或更多个基因构成的操纵子。“引入两个或更多个基因”的情况包括，例如，引入编码两种或更多种酶的分别的基因的情况，引入编码两个或更多个组成单一酶的亚基的分别的基因的情况，和前述情况的组合。
不特别限制欲引入的基因，只要其编码在宿主中起作用的蛋白。欲引入的基因可为从宿主获得的基因，或可为异源基因。可通过，例如，使用基于所述基因的核苷酸序列设计的引物，和使用具有所述基因的生物的基因组DNA、携带所述基因的质粒等等作为模板的PCR来获得欲引入的基因。欲引入的基因也可能是例如，基于所述基因的核苷酸序列完全合成的。
另外，当蛋白作为由多个亚基组成的复合物起作用时，可修饰多个亚基的部分或全部，只要蛋白的活性最终增加。即，例如，当通过增加基因的表达来增加蛋白的活性时，可增强编码亚基的部分或全部的多个基因的表达。通常优选增强编码亚基的全部多个基因的表达。此外，构成复合物的亚基可由单一种类的生物或两种或更多种的生物获得，只要该复合物具有目标蛋白的功能。即，例如，可将编码多个亚基的相同生物的基因引入宿主中，或可将编码多个亚基的不同生物的基因引入宿主中。
也可通过改善基因的转录效率来增加基因的表达。可通过例如，用更强的启动子取代在染色体上的基因的启动子来改善基因的转录效率。“更强的启动子”指与固有存在的基因的野生型启动子相比较，提供改善的基因转录的启动子。更强的启动子的实例包括，例如，已知的高表达启动子，即PGK1、PDC1、TDH3、TEF1、HXT7、ADH1基因的启动子，等等。此外，作为更强的启动子，也可通过使用各种报道基因来获得现存的启动子的高度活性类型。
也可通过改善基因的转录效率来增加基因的表达。可通过，例如，修饰密码子来改善基因的翻译效率。即，在基因等的异源表达的情况下，可通过用更加频繁使用的同义密码子取代存在于该基因中的罕用密码子来改善基因的翻译效率。可通过，例如，用于将目标突变引入DNA的目标位点的位点特异性的突变方法来取代密码子。位点特异性的突变方法的实例包括利用PCR的方法(Higuchi,R.,61,在PCRTechnology中,Erlich,H.A.编辑,StocktonPress(1989);Carter,P.,Meth.inEnzymol.,154,382(1987))。或者，其中目标密码子被取代的基因片段可以完全是合成的。在各种生物中的密码子频率在“密码子使用数据库”("CodonUsageDatabase")中公开(http://www.kazusa.or.jp/codon;Nakamura,Y.等人,Nucl.AcidsRes.,28,292(2000))。
此外，也可通过扩增增加基因表达的调节物，或去除或削弱减少基因表达的调节物来增加基因的表达。
可独立使用或以任意组合使用用于如上所述的增加基因表达的此类方法。
此外，也可通过，例如增强酶的比活性来获得增加蛋白活性的修饰。比活性的增强还包括削弱或消除反馈抑制。可通过例如，搜索各种生物来获得显示增强的比活性的蛋白。此外，也可通过将突变引入现存的蛋白中来获得现存蛋白的高度活性类型。待引入的突变可为，例如，在蛋白的一个或多个位置上置换、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸残基。可通过，例如，如上所述的此类位点特异性突变方法来引入突变。还可通过，例如，诱变处理来引入突变。诱变处理的实例包括X射线照射、紫外照射和使用突变剂的处理，所述突变剂例如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)。此外，可通过使用羟胺直接体外处理DNA来诱导随机突变。可独立使用比活性的增强，或可与如上所述的用于增强基因表达的此类方法以任意组合来使用比活性的增强。
当本发明的酵母具有二倍性或更高倍性的多倍性，且蛋白的活性通过染色体的修饰增加时，本发明的酵母可为异倍体，其具有经修饰以使得蛋白的活性增加的染色体和野生型染色体，或可为同倍体，其具有经修饰的染色体以使得蛋白的活性增加，只要蛋白的活性最终增加。
作为转化酵母的方法，可存在通常用于酵母转化的使用方法，例如原生质体法、KU法(H.Ito等人,J.Bateriol.,153-163(1983))、KUR法(FermentationandIndustry,第43卷,第630-637页(1985))、电穿孔法(Luis等人,FEMSMicrobiologyLetters,165(1998)335-340)和使用载体DNA的方法(GietzR.D.和SchiestlR.H.,MethodsMol.Cell.Biol.,5:255-269(1995))。此外，用于操作酵母的方法，例如用于孢子形成的方法和用于分离单倍体酵母的方法描述在“化学和生物试验系，31，用于酵母的实验技术”("ChemicalandBiologicalExperimentalLine,31,ExperimentalTechniqueforyeast")，第一版，Hirokawa出版；“生物手册系列10，使用酵母的基因实验方法”("BiomanualSeries10,MethodofGeneticExperimentusingyeast")，第一版，Yodosha；等等中。
可通过测量蛋白的活性来确认蛋白活性的增加。
也可通过确认编码蛋白的基因表达的增加来确认该蛋白活性的增加。可通过确认基因的转录量的增加，或通过确认由该基因表达的蛋白的量的增加来确认该基因表达的增加。
可通过将由基因转录的mRNA的量与非修饰株，例如野生型菌株或亲株的mRNA的量相比较来确认该基因转录量的增加。用于估计mRNA的量的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR等等(Sambrook,J.等人，MolecularCloningALaboratoryManual/第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor(USA),2001)。与非修饰株的mRNA的量相比较，该mRNA的量可增加，例如1.5倍或更多、2倍或更多、或3倍或更多。
可通过使用抗体的蛋白质印迹来确认蛋白的量增加(MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA),2001)。与非修饰株的蛋白量相比较，该蛋白的量可增加，例如1.5倍或更多、2倍或更多、或3倍或更多。
前述的用于增加蛋白活性的方法可用作任意蛋白(例如氨基转移酶)活性的增强，及用作任意基因(例如编码那些任意蛋白的基因)表达的增强。
<1-5>用于降低蛋白活性的方法
以下将解释用于降低蛋白活性的方法。
表述“蛋白的活性降低”表示与非修饰株，例如野生型菌株和亲株的蛋白活性相比较，每细胞蛋白的活性降低。“蛋白的活性降低”的陈述也包括蛋白的活性完全消失的陈述。具体地，表述“蛋白的活性降低”表示与非修饰株的那些相比较，每细胞蛋白的分子数减少，和/或蛋白的各分子的功能下降。即，在表述“蛋白的活性降低”中的术语“活性”不限于蛋白的催化活性，而且还表示编码所述蛋白的基因的转录量(即mRNA的量)或所述蛋白的翻译量(即蛋白的量)。“每细胞蛋白的分子数减少”的陈述还包括蛋白完全不存在的陈述。“蛋白的各分子的功能下降”的陈述还包括各蛋白分子的功能已完全消失的陈述。尽管只要与非修饰株的蛋白活性相比较，该(蛋白的)活性降低，那么蛋白活性降低的程度不受特别限制，但是蛋白的活性可降低至，例如，非修饰株蛋白活性的50%或更低、20%或更低、10%或更低、5%或更低、或0%。
通过，例如，减少编码蛋白的基因的表达来获得用于降低该蛋白活性的修饰。“基因的表达减少”的陈述也包括基因完全不表达的陈述。“基因的表达减少”的陈述也称作“基因的表达削弱”。基因的表达可减少至，例如，非修饰株基因表达的50%或更少、20%或更少、10%或更少、5%或更少、或0%。
基因表达的减少可归因于，例如，转录效率降低、翻译效率降低、或它们的组合。可通过修饰基因的表达控制序列，例如启动子来减少基因的表达。当修饰表达控制序列时，优选修饰表达控制序列的一个或更多个核苷酸，更优选修饰两个或更多个核苷酸，特别优选修饰三个或更多个核苷酸。此外，可使用较弱的启动子来取代在染色体上基因的启动子。“较弱的启动子”意指与固有存在的基因的野生型启动子相比较，提供削弱的基因转录的启动子。作为此类较弱的启动子，例如，可使用各种可诱导的启动子。即，在诱导物的缺失下，可诱导的启动子可起较弱的启动子的作用。可诱导的启动子的实例包括，例如，可诱导半乳糖的半乳糖激酶基因(GAL1)的启动子。此外，可缺失部分或全部的表达控制序列。也可通过，例如，操纵负责表达控制的因子来减少基因的表达。负责表达控制的因子的实例包括负责转录或翻译控制的低分子(诱导物、抑制剂等)、负责转录或翻译控制的蛋白(转录因子等)、负责转录或翻译控制的核酸(siRNA等)，等等。
也可通过，例如，破坏编码蛋白的基因来获得用于降低蛋白活性的修饰。可通过，例如，缺失在染色体上的基因的部分或全部编码区域来实现基因的破坏。此外，可缺失基因的全部，包括来自染色体上的基因的上游或下游的序列。待缺失的区域可为任何区域，例如N-末端区域、内部区域、或C-末端区域，只要可以降低蛋白的活性。缺失更长的区域可通常更确定地使基因失活。此外，优选来自待缺失的区域的上游和下游的序列的阅读框是不相同的。
也可通过，例如，将用于氨基酸置换的突变(错义突变)、终止密码子(无义突变)、添加或缺失一个或更多个核苷酸残基的移码突变等等引入染色体上的基因的编码区域来实现基因的破坏(JournalofBiologicalChemistry,272:8611-8617(1997);ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,USA,955511-5515(1998);JournalofBiologicalChemistry,26116,20833-20839(1991))。
也可通过，例如，将另一序列插入染色体上的基因的编码区域中来实现基因的破坏。插入的位点可在基因的任何区域中，且插入更长的区域可通常更确定地使基因失活。优选来自插入位点的上游和下游的序列的阅读框是不相同的。该另一序列不受特别限制，只要选择降低或消除被编码的蛋白的活性的序列，且其实例包括，例如，标志物基因，诸如抗生素抗性基因，和用于生产目标物质的基因。
可通过，例如，以下步骤来实现如上所述的染色体上的基因的此类修饰：制备缺陷型基因，通过其部分序列的缺失对其进行修饰，以使得其不能产生正常起作用的蛋白，并使用包含所述缺陷型基因的重组DNA转化微生物，以引起所述缺陷型基因和染色体上的野生型基因之间的同源重组，并因此用所述缺陷型基因置换染色体上的野生型基因。在该步骤中，若将根据宿主的特征，例如营养缺陷型所选择的标志物基因包括在重组DNA中，操作变得更加容易。即使其产生，由缺陷型基因编码的蛋白也具有不同于野生型蛋白的构型，从而其功能被减少或消除。
作为同源重组的结果，取决于欲使用的重组DNA的结构，可发生插入以使得野生型基因和缺失型基因与在它们旁侧的重组DNA的另一部分(例如，载体部分和标志物基因)一起包含在染色体中。因为野生型基因在那种状态下起作用，所以有必要在两个基因之间再次诱导同源重组，以从染色体DNA中消除与载体部分和标志物基因一起的一拷贝基因，并选择缺失型基因仍存在的菌株。
此外，例如，通过使用包含任意序列以及位于所述任意序列分别的末端的染色体上的置换靶位点的上游和下游序列的线型DNA来转化酵母，以引起在置换靶位点的上游和下游的各自的同源重组，可在一个步骤中使用任意序列取代该置换靶位点。作为任意序列，例如，可使用包含标志物基因的序列。此后，可按需除去该标志物基因。当除去标志物基因时，可将用于同源重组的序列添加到标志物基因的两端，以使得可有效除去标志物基因。
也可通过，例如，诱变处理来获得用于降低蛋白活性的修饰。诱变处理的实例包括X射线照射或紫外照射和使用突变剂的处理，所述突变剂例如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)。
当蛋白作为由多个亚基组成的复合物起作用时，可修饰该多个亚基的部分或全部，只要蛋白的活性最终降低。即，例如，可破坏编码各亚基的多个基因的部分或全部，等等。此外，当存在蛋白的多个同工酶时，可降低所述多个同工酶的部分或全部活性，只要蛋白的活性最终降低。即，例如，可破坏编码各同工酶的多个基因的部分或全部，等等。此外，例如，可破坏编码该同工酶的多个基因的一部分，并可减少剩余基因(一个或更多个)的表达。
当本发明的酵母具有二倍性或更高倍性的多倍性时，本发明的酵母可为异倍体，其具有经修饰以使得蛋白的活性降低的染色体和野生型染色体，或可为同倍体，其具有经修饰的染色体以使得蛋白的活性降低，只要蛋白的活性最终降低。通常优选本发明的酵母是同倍体，其具有经修饰的染色体以使得蛋白的活性降低。
可通过测量蛋白的活性来确认蛋白活性降低。
也可通过确认编码蛋白的基因表达的减少来确认该蛋白活性的降低。可通过确认基因的转录量的减少，或由该基因表达的蛋白的量的减少来确认该基因表达的减少。
可通过将由基因转录的mRNA的量与非修饰株mRNA的量相比较来确认该基因转录量的减少。用于估计mRNA的量的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR等等(MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA),2001)。mRNA的量优选减少至，例如，非修饰株的50%或更少、20%或更少、10%或更少、5%或更少、或0%。
可通过使用抗体的蛋白质印迹来确认蛋白的量的减少(MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(USA),2001)。蛋白的量优选减少至，例如，非修饰株的50%或更少、20%或更少、10%或更少、5%或更少、或0%。
取决于用于破坏的手段，可通过测定基因的部分或全部的核苷酸序列、基因的限制性酶谱、全长等等来确认基因的破坏。
如上所述，用于降低蛋白活性的前述方法可用以降低任意蛋白，例如乙酰乳酸合酶的活性，及用以减少任意基因，例如编码那些任意蛋白的基因的表达。
<2>用于生产酵母提取物的方法
可将本发明的酵母用作生产酵母提取物的原材料。即，本发明提供了用于生产酵母提取物的方法，所述方法包括通过使用本发明的酵母作为原材料来制备酵母提取物。通过使用本发明的酵母作为原材料生产的酵母提取物也称作“本发明的酵母提取物”。可采用与用于常规酵母提取物的生产相同的方式来生产本发明的酵母提取物，除了使用本发明的酵母作为原材料以外。以下将解释用于生产本发明的酵母提取物的方法。
首先，在培养基中培养本发明的酵母。欲使用的培养基不受特别限制，只要本发明的酵母可在其中增殖，且Abu-相关的化合物可在其中生成并蓄积。作为培养基，例如，可使用用于酵母培养的常规培养基。培养基的具体实例包括，例如，但不限于SD培养基、SG培养基和SDTE培养基。作为培养基，例如，可使用按需包含选自如下组分(一种或更多种)的培养基：碳源、氮源、磷酸盐来源、硫源和其它各种有机组分和无机组分。可根据各种条件，例如欲使用的酵母的类型和欲生成并蓄积的Abu-相关的化合物的类型来适当地确定培养基组分的类型和浓度。
碳源不受特别限制，只要本发明的酵母可利用它生成Abu-相关的化合物。碳源的具体实例包括，例如，糖类例如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、废糖蜜、淀粉水解产物和生物质水解产物，有机酸例如乙酸、富马酸、柠檬酸、琥珀酸和苹果酸，醇类例如甘油、粗甘油和乙醇，和脂肪酸。作为碳源，可使用一种碳源，或可组合使用两种或更多种碳源。
氮源的具体实例包括，例如，铵盐例如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，有机氮源例如胨、酵母提取物、肉膏和大豆蛋白分解产物、氨和尿素。作为氮源，可使用一种氮源，或可组合使用两种或更多种氮源。
磷酸盐来源的具体实例包括，例如，磷酸盐例如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，和磷酸聚合物例如焦磷酸。作为磷酸盐来源，可使用一种磷酸盐来源，或可组合使用两种或更多种磷酸盐来源。
硫源的具体实例包括，例如，无机硫化合物例如硫酸盐、硫代硫酸盐和亚硫酸盐，和含硫氨基酸例如半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽。作为硫源，可使用一种硫源，或可使用组合两种或更多种硫源。
其它各种有机和无机组分的具体实例包括，例如，无机盐例如氯化钠和氯化钾；痕量金属例如铁、锰、镁和钙；维生素例如维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺和维生素B12；氨基酸；核酸；和含有这些的有机组分例如胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白分解产物。作为其它的各种有机和无机组分，可使用一种组分，或可组合使用两种或更多种组分。
此外，当使用需要氨基酸等用于其生长的营养缺陷型突变株时，优选将所需的养分补充到培养基中。例如，对于培养乙酰乳酸合酶活性降低的菌株，优选使用补充有异亮氨酸和缬氨酸的培养基。
尽管即使本发明的酵母在没有用任何Abu-相关的化合物补充的培养基中培养时，其也可在其细胞中生成并蓄积Abu-相关的化合物，但是可将Abu-相关的化合物补充到培养基中。可将一种Abu-相关的化合物或两种或更多种Abu-相关的化合物补充到培养基中。
培养条件不受特别限制，只要本发明的酵母可增殖，且生成并蓄积Abu-相关的化合物。可使用，例如，用于酵母培养的常规条件进行培养。可根据各种条件，例如欲使用的酵母的类型和欲生成并蓄积的Abu-相关的化合物的类型来适当地确定培养条件。
可例如，通过使用液体培养基作为通气培养或振荡培养需氧地进行培养。培养温度可为，例如，25℃至35℃，优选27℃至33℃，更优选28℃至32℃。培养时间可为，例如，5小时或更长、10小时或更长、或15小时或更长，并可为120小时或更短、72小时或更短、或48小时或更短。可作为分批培养、补料分批培养、连续培养、或这些的组合来进行培养。
通过如上所述来培养本发明的酵母，Abu-相关的化合物在酵母的细胞中蓄积，并获得具有高含量的Abu-相关的化合物的酵母。
可采用与用于常规酵母提取物的制备相同的方式，由获得的酵母制备酵母提取物。酵母提取物可为通过酵母细胞的热水提取和后续处理获得的那种，或为通过酵母细胞的消化和后续处理获得的那种。可按需将获得的酵母提取物进行浓缩，或干燥成粉末。
如上所述，获得具有高含量的Abu-相关的化合物的酵母提取物(本发明的酵母提取物)。就以酵母提取物中的总固体内容物为基计的干燥重量而言，本发明的酵母提取物包含一定量的Abu-相关的化合物。本发明的酵母提取物可以优选0.1重量%或更多、更优选0.5重量%或更多、再更优选1.0重量%或更多、特别优选5.0重量%或更多的量包含例如Abu。本发明的酵母提取物可以优选0.1重量%或更多、更优选1.0重量%或更多、再更优选2.0重量%或更多、特别优选20重量%或更多的量包含例如γ-Glu-Abu。本发明的酵母提取物可以优选0.1重量%或更多、更优选0.5重量%或更多、再更优选1.0重量%或更多、特别优选2重量%或更多的量包含例如γ-Glu-Abu-Gly。
<3>用于生产Abu-相关的化合物的方法
还可从本发明的酵母的培养物中收集Abu-相关的化合物。即，本发明提供了用于生产Abu-相关的化合物的方法，所述方法包括在培养基中培养本发明的酵母，并从培养物中收集Abu-相关的化合物。培养方法如上所述。在本发明中，例如，可收集蓄积在细胞中的Abu-相关的化合物。当Abu-相关的化合物也在培养基中蓄积时，也可收集蓄积在培养基中的Abu-相关的化合物。
可通过用于化合物分离和纯化的已知方法来收集Abu-相关的化合物。此类方法的实例包括，例如，离子交换树脂法、膜处理、沉淀和结晶。可将这些方法按需组合使用。当收集蓄积在细胞中的Abu-相关的化合物时，例如，可使用超声波等来破坏细胞，通过离心可将细胞从破坏细胞的悬浮液中除去，且随后可通过离子交换树脂法等从如此获得的上清液中收集Abu-相关的化合物。收集的Abu-相关的化合物可为游离的化合物、其盐、或它们的混合物。
所述盐不受特别限制，只要其为可口头摄取的。在酸性基团例如羧基上的盐的具体实例包括铵盐，与碱金属例如钠和钾的盐，与碱土金属例如钙和镁的盐，铝盐，锌盐，与有机胺例如三乙胺、乙醇胺、吗啉、吡咯烷、哌啶、哌嗪和二环己基胺的盐，和与碱性氨基酸例如精氨酸和赖氨酸的盐。在碱性基团例如氨基上的盐的具体实例包括与无机酸例如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸和氢溴酸的盐、与有机羧酸例如乙酸、柠檬酸、苯甲酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、单宁酸、丁酸、羟苄基苯甲酸、扑酸、庚酸、癸酸、teoclicacid、水杨酸、乳酸、草酸、扁桃酸、苹果酸和甲基丙二酸的盐，和与有机磺酸例如甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸的盐。作为盐，可使用一种盐，或可组合使用两种或更多种盐。
除了Abu-相关的化合物以外，收集的Abu-相关的化合物也可包含诸如以下组分(一种或更多种)：例如，酵母细胞、培养基组分、水分和酵母的代谢副产物。收集的Abu-相关的化合物的纯度可为，例如，30%(w/w)或更高、50%(w/w)或更高、70%(w/w)或更高、80%(w/w)或更高、90%(w/w)或更高、或95%(w/w)或更高。
<4>本发明的食品或饮料
如上所述获得的Abu-相关的化合物和/或酵母提取物可用于食品和饮料的制造。即，本发明提供了用于生产食品或饮料的方法，所述方法包括将通过前述的方法获得的Abu-相关的化合物和/或酵母提取物添加到食品或饮料或它们的原材料中。如上所述生产的食品或饮料也称作“本发明的食品或饮料”。此外，在实施方式中，通过添加所述Abu-相关的化合物和/或酵母提取物可赋予食品或饮料“厚味”("kokumi")。食品或饮料的实例包括，例如，酒精饮料、面包和发酵食品调味料。
可通过使用与用于常规的食品或饮料的那些相同的原材料以相同的方式来生产本发明的食品或饮料，除了添加Abu-相关的化合物和/或酵母提取物以外。此类原材料的实例包括，例如，用于酒精饮料的大米、小麦、玉米淀粉等，用于面包的小麦粉、糖、盐、黄油、发酵酵母等，和用于发酵食品调味料的大豆、小麦等。可在食品或饮料的制造过程的任何阶段添加该Abu-相关的化合物和/或酵母提取物。即，可将该Abu-相关的化合物和/或酵母提取物添加到食品或饮料的原材料中、添加到正在制造中的食品或饮料中、或添加到完成的食品或饮料中。此外，也可将酵母提取物、其浓缩产物、或其干燥产物本身用作发酵食品调味料。
Abu-相关的化合物和/或酵母提取物的添加量不受特别限制，并可根据各种条件，例如食品或饮料的类型和食品或饮料的摄取方式来适当地确定。就Abu-相关的化合物的量而言，可例如，以1ppm(w/w)或更多、100ppm(w/w)或更多、或1%(w/w)或更多的量将Abu-相关的化合物和/或酵母提取物添加至食品或饮料或其原材料中。此外，就Abu-相关的化合物的量而言，可例如，以100%(w/w)或更少、10%(w/w)或更少、或1%(w/w)或更少的量将Abu-相关的化合物和/或酵母提取物添加至食品或饮料或其原材料中。
实施例
以下将再更具体地关于实施例来解释本发明。
<实施例1>M013Y株的构建，其具有增强的2-氨基丁酸生物合成系统酶活性和削弱的乙酰乳酸合酶基因(ILV2)表达
通过以下方法构建酵母株(M013Y株)，在所述酵母株中2-氨基丁酸生物合成系统酶活性增强，且编码乙酰乳酸合酶的基因(ILV2)的表达削弱，用于增强生产2-氨基丁酸的能力的目的。
将酿酒酵母AG1ura3-株(日本专利公开(Kokai)No.2012-213376)用作亲株。AG1ura3-株是酿酒酵母Y006株(FERMBP-11299)的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(GSH1)表达增强的菌株。AG1ura3-株缺损URA3基因，并显示尿嘧啶营养缺陷型。
根据Sofyanovich等人的方法(OlgaA.Sofyanovich等人,ANewMethodforRepeated"Self-Cloning"PromoterReplacementinSaccharomycescerevisiae,Mol.Biotechnol.,48,218-227(2011))，制备了对应于AG1ura3-株的菌株，其中支链氨基酸氨基转移酶基因(BAT1)的启动子被一种组成型表达启动子，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子区域(自此之后称作pTDH3)取代。所述方法如下。通过使用引物SEQIDNO:1(5'-GCCAGGCGGTTGATACTTTGTGCAGATTTCATACCGGCTGTCGCTATTATTACTGATG
AATTGGCTCTCTTTTTGTTTAATCTTAACCCAACTGCACAGA-3')，其具有在5'末端的BAT1的上游序列，引物SEQIDNO:2(5'-TTGGATGCATCTAATGGGGCACCAGTAGCGAGTGTTCTGATGGAGAATTTCCCCAACTTCAAGGAATGTCTCTGCAACATTTGTTTATGTGTGTTTATTC-3')，其具有从起始密码子开始的BAT1基因的ORF的内部部分序列，和pUC19-URA3-pTDH3-URA3质粒(在前述的Sofyanovich的报道中描述)作为模板来进行PCR，以获得具有旁侧有TDH3启动子的URA3的DNA片段。用于PCR的条件是94℃持续10秒(热变性)、60℃持续10秒(退火)和72℃持续4分钟(延伸)，持续25个循环。使用该DNA片段转化AG1ura3-株，并施用至不含尿嘧啶的SD平板培养基中。从生长转化体中获得其中BAT1启动子被pTDH3-URA3-pTDH3取代的菌株。SD培养基的制备方法显示如下。通过将2%的Bacto琼脂添加至SD培养基中制备SD平板培养基。
[SD培养基的组成]
D(+)-葡萄糖20g
10xYNB100mL
MilliQ水高达1L
1L
SD培养基通过以下步骤制备：将通过高压灭菌进行除菌的葡萄糖和通过过滤除菌进行除菌的YNB混合在前述的组合物中，并使用通过高压灭菌进行除菌的MilliQ水将该混合物稀释至总体积。
10xYNB制备如下。将不含氨基酸和硫酸铵的Difco酵母氮源基础(DifcoYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate)(17g)和硫酸铵(50g)溶解在MilliQ水(1L)中，将溶液调节为pH5.2，并通过过滤除菌进行除菌。将生成物保持在冷暗的地方，以防止维生素分解。
因为URA3基因缺损株显示5-氟乳清酸(5-FOA)抗性，可通过使用含5-FOA的培养基选择从其中消除了URA3选择标志物的菌株。因此，在含尿嘧啶的SD培养基中过夜培养其中BAT1启动子被pTDH3-URA3-pTDH3取代的菌株，并以适当的量施用至5-FOA平板培养基中。从生长的菌落中，获得其中URA3被引入的两个TDH3启动子的同源重组消除，且BAT1的启动子被TDH3启动子取代的菌株(AG1pTDH3-BAT1ura3-株)。5-FOA平板培养基制备如下。
[5-FOA平板培养基的组成]
袋装酵母生长培养基SD/-UraBroth2袋
尿嘧啶50mg
5-FOA1g
10XYNB100mL
Bacto琼脂20g
MilliQ水高达1L
1L
将使用MilliQ水稀释至500mL并通过过滤除菌进行除菌的袋装酵母生长培养基SD/-UraBroth(Clontech)、尿嘧啶、5-FOA和10xYNB的混合物，和使用MilliQ水稀释至500mL并通过高压灭菌进行除菌的Bacto琼脂混合，以制备5-FOA平板培养基。
随后，再次根据Sofyanovich等人的方法，制备以下菌株：对应于通过前述方法获得的AG1pTDH1-BAT1ura3-株，其中丝氨酸脱氨酶基因(CHA1)的启动子被一种组成型表达启动子pTDH3取代。所述方法如下。AG1pTDH3-BAT1ura3-株是URA3基因缺损株，并显示尿嘧啶营养缺陷型。通过使用引物SEQIDNO:3(5'-GAGTACTAATCACCGCGAACGGAAACTAATGAGTCCTCTGCGCGGAGACATGATTCCGCATGGGCGGCTCCTGTTAAGCCTCTTAACCCAACTGCACAGA-3')，其具有在5'末端的CHA1的上游序列，引物SEQIDNO:4(5'-TATTTCAAGAAAAATTGTGCAGAAGCCTTTCCGGGGAAGAATTGACGTAATAATGGTGTTTTATTGTAGACTATCGACATTTGTTTATGTGTGTTTATTC-3')，其具有从起始密码子开始的CHA1基因的ORF的内部部分序列，和pUC19-URA3-pTDH3-URA3质粒作为模板来进行PCR，以获得具有旁侧有TDH3启动子的URA3的DNA片段。用于PCR的条件是94℃持续10秒(热变性)、60℃持续10秒(退火)和72℃持续4分钟(延伸)，持续25个循环。使用该DNA片段转化该AG1pTDH1-BAT1ura3-株，并施用至不含尿嘧啶的SD平板培养基中。从生长转化体中，获得其中CHA1启动子被pTDH3-URA3-pTDH3取代的菌株。在含尿嘧啶的SD培养基中过夜培养其中CHA1启动子被pTDH3-URA3-pTDH3取代的菌株，并以适当的量施用至5-FOA平板培养基中。从生长的菌落中，获得其中URA3被引入的两个TDH3启动子的同源重组消除，且CHA1的启动子被TDH3启动子取代的菌株(AG1pTDH3-BAT1pTDH3-CHA1ura3-株)。
随后，再次根据Sofyanovich等人的方法，制备以下菌株：其对应于通过前述方法获得的AG1pTDH3-BAT1pTDH3-CHA1ura3-株，其中苏氨酸脱氨酶基因(ILV1)的启动子被组成型表达启动子pTDH3取代。所述方法如下。AG1pTDH3-BAT1pTDH3-CHA1ura3-株是URA3基因缺损株，并显示尿嘧啶营养缺陷型。通过使用引物SEQIDNO:5(5'-CTCTTTATTGCATATTATCTCTGCTATTTTGTGACGTTCAATTTTAATTGACGCGAAAAAGAAAAAATAAGAAGGGCAAATCTTAACCCAACTGCACAGA-3')，其具有在5'末端的ILV1的上游序列，引物SEQIDNO:6(5'-AGGTTCAATCCAGACACTTTGGACTGTTTACCTTGCCGAACAACCGTACATAATGGTTGCTTTAGTAGAGTAGCTGACATTTGTTTATGTGTGTTTATTC-3')，其具有从起始密码子开始的ILV1基因的ORF的内部部分序列，和pUC19-URA3-pTDH3-URA3质粒作为模板来进行PCR，以获得具有旁侧有TDH3启动子的URA3的DNA片段。用于PCR的条件是94℃持续10秒(热变性)、60℃持续10秒(退火)和72℃持续4分钟(延伸)，持续25个循环。使用该DNA片段转化AG1pTDH3-BAT1pTDH3-CHA1ura3-株，并施用至不含尿嘧啶的SD平板培养基中。从生长转化体中，获得其中ILV1启动子被pTDH3-URA3-pTDH3取代的菌株。在含尿嘧啶的SD培养基中进一步过夜培养其中ILV1启动子被pTDH3-URA3-pTDH3取代的菌株，并以适当的量施用至5-FOA平板培养基中。从生长的菌落中，获得其中URA3被引入的两个TDH3启动子的同源重组消除，且ILV1的启动子被TDH3启动子取代的菌株(AG1pTDH3-BAT1pTDH3-CHA1pTDH3-ILV1ura3-株)。自此以后将该菌株称作M007Y-ura3Δ0株，将通过以常规方式用URA3基因补充M007Y-ura3Δ0株获得的菌株(日本专利公开(Kokai)No.2012-213376)称作M007Y株。
通过使用M007Y-ura3Δ0株作为亲株，并再次根据Sofyanovich等人的方法，制备其中乙酰乳酸合酶基因(ILV2)的启动子被诱导半乳糖的半乳糖激酶基因(GAL1)的启动子(自此之后也称作pGAL1)取代的菌株。所述方法如下。通过使用引物SEQIDNO:7(5'-TATCTGGTTGATATATATGCTATCATTTATTTTCTTATCAAGTTTCCAAATTTCTAATCCTTTCTCCACCATCCCTAATTCTTAACCCAACTGCACAGA-3')，其具有在5'末端的ILV2的上游序列，引物SEQIDNO:8(5'-GGTGTGTTGCGGTATGCTATATGTTGAAAGCAACGCTTAATAGCGAAGTTTTTTAGCGTAGATTGTCTGATCATGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTA-3')，其具有从起始密码子开始的ILV2基因的ORF的内部部分序列，和pUC19-URA3-pGAL1-URA3质粒(在前述的Sofyanovich的报道中描述)作为模板来进行PCR，以获得具有旁侧有GAL1启动子的URA3的DNA片段。用于PCR的条件是94℃持续10秒(热变性)、60℃持续10秒(退火)和72℃持续4分钟(延伸)，持续25个循环。使用该DNA片段转化M007Y-ura3Δ0株，并施用至不含尿嘧啶的SG平板培养基中。从生长转化体中，获得其中ILV2启动子被pGAL1-URA3-pGAL1取代的菌株。SG培养基的制备方法显示如下。通过将2%的Bacto琼脂添加至SG培养基中来制备SG平板培养基。
[SG培养基的组成]
D(+)-半乳糖20g
10xYNB100mL
MilliQ水高达1L
1L
SG培养基通过以下步骤制备：将通过高压灭菌进行除菌的葡萄糖和通过过滤除菌进行除菌的YNB混合在前述的组合物中，并使用通过高压灭菌进行除菌的MilliQ水将混合物稀释至总体积。
随后，在含尿嘧啶的SG培养基中过夜培养其中ILV2启动子被pGAL1-URA3-pGAL1取代的菌株，并以适当的量施用至5-FOA平板培养基中。从生长的菌落中，获得其中URA3被引入的两个GAL1启动子的同源重组消除，且ILV2的启动子被GAL1启动子取代的菌株(AG1pTDH3-BAT1pTDH3-CHA1pTDH3-ILV1pGAL1-ILV2ura3-株)。自此以后将该菌株称作M013Y-ura3Δ0株，将通过以常规方式用URA3基因补充M013Y-ura3Δ0株获得的菌株称作M013Y株。
<实施例2>M007Y株和M013Y株中的ILV2基因mRNA表达量和Abu-相关的化合物的量分析
(1)培养和取样
将在实施例1中构建的M007Y株和M013Y株以一接种环的量接种到包含在500mL体积的阪口瓶中的SD培养基(50mL)中，并于30℃培养24小时，伴随120rpm振荡。
测量获得的各培养液的吸光度，并在0.01的OD600下将培养液接种到包含在500mL体积的阪口瓶中的SD培养基(70mL)中，于30℃进行培养大约18小时，伴随120rpm振荡(主培养物)。通过使用DU640分光光度计(BECKMANCOULTER)来测量吸光度。当OD600变成1.5时，将培养液进行取样。
(2)M007Y株和M013Y株的ILV2mRNA表达量分析
通过离心法收集包含在由前述方法获得的培养液(4mL)中的细胞。尽可能多地除去上清液，并将细胞悬浮在水(1mL)中。再次通过离心法收集细胞，并将其悬浮在水(1mL)中。重复该步骤两次，并通过使用RNeasyMini试剂盒(QIAGEN)从获得的酵母细胞中收集总RNA。使用500ng提取的RNA在37℃下、通过使用PrimeScriptRT试剂盒(TakaraBio)允许反应持续15分钟，以制备cDNA。单独地，为了在RT-PCR中用作阴性对照，通过不添加逆转录酶进行所述反应来制备样品。
随后，通过使用PowerSYBRGreen(AppliedBiosystem)制备反应混合物。为了检测ILV2的cDNA，使用引物SEQIDNO:9和10。此外，通过使用引物SEQIDNO:11和12来扩增ACT1的cDNA，并将之用作内部标准。使用10、50、100和500倍的四种不同的稀释比例的cDNA溶液。对于RT-PCR，使用7500实时PCR系统(AppliedBiosystems)。
作为通过上述方法进行的定量RT-PCR的结果，如图1所示，显示了与作为亲株的M007Y株相比较，在ILV2启动子被取代的M013Y株中，ILV2mRNA表达量减少。基于该结果，确认在ILV2启动子被取代的M013Y株中，来自GAL1启动子的表达未被诱导，因而ILV2mRNA在包含作为碳源的葡萄糖的SD培养基中的表达受到抑制。
(3)Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在M007Y株和M013Y株的细胞中的含量分析
通过离心法从获得的培养液中以40OD单位(将包含在显示OD600为1的1mL培养液中的细胞的量定义为1OD单位)的量收集细胞。尽可能多地除去上清液，并将剩余的细胞悬浮在MilliQ水(45mL)中。再次通过离心法收集细胞，并将之再悬浮在MilliQ水(45mL)中。通过总共重复该步骤3次，从细胞完全除去培养基组分。将获得的经清洗的细胞悬浮在MilliQ水(大约1.5mL)中，并于70℃加热10分钟。通过该方法来提取包含在细胞中的可提取的组分。随后，通过离心法使包含提取组分的部分和细胞残渣分离。
使用10kDa截断值的离心过滤膜(AmiconUltra-0.5mL10K,MILLIPORE,目录号UFC501096)从包含提取组分的部分除去细胞碎片，并将获得的滤液用作分析样品。
至于Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在样品中的含量的测量，使用AQC试剂将样品中的这些化合物衍生化，并根据已知方法(WO2011/129462、实施例1)通过LC-MS/MS进行测量。与来自WO2011/129462、实施例1的那些的测量条件的差异如下。
差异1：作为用于样品衍生化的5μM内部标准物质，使用由5μM3-甲基-His-d2(用稳定的同位素进行标记，Sigma)和5μMGly-d2(用稳定的同位素进行标记，Sigma)组成的标准溶液。
差异2：显示在下述表1中的质量用于质谱仪中的选择离子。
差异3：作为用于进行定量的内部标准物质，使用3-甲基-His-d3的衍生物用于Abu衍生物的测量，并使用Gly-d2的衍生物用于γ-Glu-Abu或γ-Glu-Abu-Gly衍生物的测量。取决于样品，当在γ-Glu-Abu的定量中极少观察到污染物峰时，通过将用于第二质量分析器中的选择离子变为145.2或104.1来进行定量。
[表1]
表1
| 衍生物 | 第一质量分析器(Q1) | 第二质量分析器(Q3) |
| Abu | 274.2 | 171.1 |
| γ-Glu-Abu | 403.4 | 171.1 |
| γ-Glu-Abu-Gly | 460.4 | 171.1 |
| Gly-d2 | 248 | 171.1 |
测量经清洗并随后于104℃干燥4小时的细胞的干燥细胞重量。
用包含在预定体积的培养液中的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly的浓度除以干燥细胞重量来计算每单位重量的干燥细胞重量的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly的含量。
因此，如图2中所示，与亲株，M007Y株相比较，对于M013Y株，观察到细胞中的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly含量增加。如上所述,显示通过削弱酵母的乙酰乳酸合酶的酶活性，可增加酵母细胞中的Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly的含量。此外，在此实施例中，对于两种菌株，在15小时的培养之后在主培养中均获得1.5的OD600，且未观察到归因于乙酰乳酸合酶基因表达削弱的生长退化。基于详细的分析，据估计两拷贝或更多拷贝的ILV2基因存在于M007Y株中。
<实施例3>具有进一步削弱的乙酰乳酸合酶基因(ILV2)表达的M014Y株的构建
如上所述，据估计M007Y株含有两拷贝或更多拷贝的ILV2基因。因此，通过以下方法破坏在作为亲株的M013Y株中的另外拷贝的ILV2基因，以制备其中乙酰乳酸合酶活性进一步降低的菌株(M014Y)。
(1)ILV2基因破坏株的构建
通过PCR扩增包含URA3基因的DNA片段，所述PCR使用引物SEQIDNO:13(5'-GTTACAATAGAAAGTATTTTACAAAATCTAAACCCTTTGAGCTAAGAGGAGATAAATACAACAGAATCAATTTTCAAAAGGGCAACGGTTCATCATC-3')，其包含来自ILV2的起始密码子的80-核苷酸上游序列，引物SEQIDNO:14(5'-TATAAGAAGCACGATTAAATAATAATAAAGTCTGCATTTTTTACTGAAAATGCTTTTGAAATAAATGTTTTTGAAATATTAGATATATATACGCCAG-3')，其包含来自ILV2的终止密码子的80-核苷酸下游序列，和酿酒酵母S288C株的基因组DNA作为模板。S288C株保藏在独立行政法人，国家技术和评估研究所，生物资源中心(theindependentadministrativeagency,NationalInstituteofTechnologyandEvaluation,BiologicalResourceCenter)(NITE生物资源中心(NBRC)),2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan，其具有登录号NBRC1136，并可由其提供。该菌株还保藏在美国模式培养物保藏所(12301ParklawnDrive,Rockville,Maryland20852,UnitedStatesofAmerica)，其具有登录号ATCC26108，并可由其提供。PCR条件为94℃持续10秒(热变性)、50℃持续10秒(退火)和72℃持续3分钟(延伸)，持续30个循环。使用获得的DNA片段转化M013Y-ura3Δ0株，并施用至不含尿嘧啶的SD平板培养基中。从生长转化体中，获得ILV2基因缺损株(AG1pTDH3-BAT1pTDH3-CHA1pTDH3-ILV1pGAL1-ILV2ilv2::URA3株)。自此以后，将该菌株称作M014Y株。
(2)M014Y株的异亮氨酸和缬氨酸营养缺陷型的确认
将在实施例1中构建的M007Y株和M013Y株，和在此实施例中构建的M014Y株各自接种到不含缬氨酸或亮氨酸的SD平板培养基上，并评估生长。结果显示M007Y株和M013Y株能够生长，而M014Y株不能生长(表2)。即，确认了归因于ILV2的破坏，M014Y株变成对于异亮氨酸和缬氨酸的营养缺陷型。
[表2]
表2
| 菌株 | 在SD平板培养基上的生长 |
| M007Y(亲株) | 可生长 |
| M013Y(ILV2启动子置换株) | 可生长 |
| M014Y(ILV2基因破坏株) | 不可生长 |
<实施例4>M014Y株中的ILV2基因mRNA表达量和Abu-相关的化合物的量分析
(1)培养和取样
将在实施例3中构建的M014Y株(ILV2破坏株)和在实施例1中构建的M007Y株(亲株)和M013Y(ILV2启动子置换株)各自以一接种环的量接种到包含在500mL体积阪口瓶中的含有异亮氨酸和缬氨酸的SD培养基(50mL)中，并于30℃培养24小时，伴随120rpm振荡。测量获得的各培养液的吸光度，并在0.01的起始OD600下将培养液接种到包含在500mL体积阪口瓶中的SD培养基(70mL)中，并在30℃和120rpm下进行培养。通过使用DU640分光光度计(BECKMANCOULTER)测量吸光度。当OD600变成1.5时，将培养液进行取样。在M007Y株和M013Y株的情况下，在18小时的培养之后，OD600变成1.5；在M014Y株的情况下，在47小时的培养之后，OD600变成1.5。
(2)在M014Y株中的ILV2mRNA表达量分析
采用与实施例2，(2)的那种相同的方式分析M007Y株、M013Y株和M014Y株中的ILV2mRNA表达量。结果如图3中所示，M014Y株的ILV2mRNA表达量显著小于M007Y株和M013Y株的ILV2mRNA表达量。
(3)Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在M014Y株的细胞中的含量分析
采用与实施例2，(3)的那种相同的方式测量Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly内容物在M007Y株、M013Y株和M014Y株的细胞中的含量。结果如图4中所示，这些化合物在M014Y株的细胞中的含量显著高于在M007Y株和M013Y株的细胞中的含量。即，显示了通过降低乙酰乳酸合酶的活性，Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在酵母细胞中的蓄积量显著增加。
<实施例5>通过在SDTE培养基中培养获得的菌株的评估
随后，设计SDTE培养基用于评估M007Y株、M013Y株和M014Y株。SDTE培养基制备如下。
[SDTE培养基的组成]
D(+)-葡萄糖20g
Thr1g
Glu1g
10xYNB(-硫酸铵)100mL
水高达1L
1L
10xYNB(-硫酸铵)制备如下。将不含氨基酸和硫酸铵的Difco酵母氮源基础(17g)溶解在MilliQ水(1L)中，将溶液调节为pH5.2，并通过过滤除菌进行除菌。当对其进行储存时，将其保持在冷暗的地方。
在实施例1中构建的M007Y株和M013Y株，和在实施例3中构建的M014Y株各自在通过将异亮氨酸和缬氨酸添加至以上SDTE培养基中获得的培养基中培养，并采用与实施例2，(3)的那种相同的方式测量Abu-相关的化合物在细胞中的含量。结果，Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在M014Y株的细胞中的含量显著高于在M007Y株和M013Y株的细胞中的含量(图5)。该结果显示乙酰乳酸合酶活性的降低对于Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在酵母细胞中的蓄积是有效的，而与培养基条件无关。
<实施例6>不具有增强的2-氨基丁酸生物合成酶活性但具有削弱的乙酰乳酸合酶基因(ILV2)表达的菌株的构建
在实施例4中，显示用于降低M014Y株中的乙酰乳酸合酶活性的修饰，其为经修饰的酵母以使得2-氨基丁酸生物合成酶(α-丁酮酸合成酶和氨基转移酶)的活性和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性增加，显著增加了Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在酵母细胞中的蓄积量。因此，在此实施例中，检验了仅通过降低乙酰乳酸合酶活性，而不增强2-氨基丁酸生物合成途径酶和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性时，Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly在酵母细胞中的含量是否增加。
(1)ILV2基因破坏株的构建
通过以下方法制备菌株，所述菌株对应于酿酒酵母Y006株(FERMBP-11299)，其中乙酰乳酸合酶基因(ILV2)被破坏，用于降低乙酰乳酸合酶活性的目的。
首先，包含ILV2被卡那霉素抗性基因盒KanMX取代的区域通过PCR进行扩增，所述PCR使用引物SEQIDNO:25(GACAGTAAAACGCAGGTTAT)和SEQIDNO:26(TCTAGAAGAGTTGTTATTTC)，和酵母敲除菌株集合(YEASTKNOCKOUTSTRAINCOLLECTION)(Funakoshi，YCS1056)的ILV2破坏株的基因组。PCR条件是94℃持续10秒(热变性)、50℃持续10秒(退火)、和72℃持续3分钟(延伸)，持续25个循环。随后，通过乙醇沉淀对如此扩增的DNA片段进行纯化，并将其用于转化Y006株，并将所述细胞施用至包含G418的YPD平板培养基中。从生长转化体中，获得ILV2基因被KanMX取代的菌株(ILV2::KanMX株)。自此以后，将该菌株称作M015Y株。YPD培养基的制备方法如下所示。通过将2%的Bacto琼脂添加至YPD培养基中来制备YPD平板培养基。
[YPD培养基的组成]
D(+)-葡萄糖20g
酵母提取物10g
聚胨20g
MilliQ水高达1L
1L
在以200mg/L的浓度添加G418硫酸氢盐(Sigma)之后使用培养基。
(2)M015Y株对于异亮氨酸和缬氨酸的营养缺陷型的确认
将在此实施例中构建的M015Y株及其亲株Y006株各自接种在不含缬氨酸或亮氨酸的SD平板培养基上，并评估生长。结果显示Y006株能够生长，而M015Y株不能生长(表3)。即，确认了由于ILV2的破坏，M015Y株变成对于异亮氨酸和缬氨酸是营养缺陷型的。
[表3]
表3
| 菌株 | 在SD平板培养基上的生长 |
| Y006(亲株) | 可生长 |
| M015Y(ILV2基因破坏株) | 不可生长 |
<实施例7>通过在SD培养基和SDTE培养基中培养的M015Y株的评估
随后，将M015Y株和Y006株各自在通过将异亮氨酸和缬氨酸添加至SD培养基和SDTE培养基中获得的培养基中培养，并以与实施例2，(3)的那种相同的方式测量Abu-相关的化合物在细胞中的含量。结果，在SD培养基中培养的情况下，Abu和γ-Glu-Abu在M015Y株的细胞中的含量显著高于在亲株Y006株中的含量(图6)。在SDTE培养基中培养的情况下，观察到Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly含量的增加(图7)。基于这些结果，显示了同样在未经修饰以使得2-氨基丁酸生物合成途径酶(α-丁酮酸合成酶和氨基转移酶)的活性和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性增加的酵母中，乙酰乳酸合酶活性的降低对于Abu、γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly在酵母细胞中的蓄积是有效的。
工业可应用性
根据本发明，提供了具有高含量的Abu、γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly酵母和酵母提取物。
<序列表的解释>
SEQIDNO:1至14，引物
SEQIDNO:15，酿酒酵母S288C的ILV2基因的核苷酸序列
SEQIDNO:16，酿酒酵母S288C的Ilv2蛋白的氨基酸序列
SEQIDNO:17，酿酒酵母S288C的CHA1基因的核苷酸序列
SEQIDNO:18，酿酒酵母S288C的Cha1蛋白的氨基酸序列
SEQIDNO:19，酿酒酵母S288C的ILV1基因的核苷酸序列
SEQIDNO:20，酿酒酵母S288C的Ilv1蛋白的氨基酸序列
SEQIDNO:21，酿酒酵母S288C的BAT1基因的核苷酸序列
SEQIDNO:22，酿酒酵母S288C的Bat1蛋白的氨基酸序列
SEQIDNO:23，酿酒酵母S288C的GSH1基因的核苷酸序列
SEQIDNO:24，酿酒酵母S288C的Gsh1蛋白的氨基酸序列
SEQIDNO:25和26，引物。
Claims (10)
1.酵母，其具有高含量的α-氨基丁酸(Abu)-相关的化合物，所述酵母经修饰以使得胞内乙酰乳酸合酶活性降低，
其中所述Abu-相关的化合物由选自Abu、γ-Glu-Abu和γ-Glu-Abu-Gly的一种或更多种化合物组成。
2.根据权利要求1所述的酵母，其经进一步修饰以使得选自α-丁酮酸合成酶和转氨酶的一种或更多种酶的活性增加。
3.根据权利要求2所述的酵母，其中所述α-丁酮酸合成酶是由CHA1基因编码的酶。
4.根据权利要求2所述的酵母，其中所述转氨酶是由BAT1基因编码的酶。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的酵母，其经进一步修饰以使得γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性增加。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的酵母，其为酵母菌属(Saccharomyces)酵母或假丝酵母菌属(Candida)酵母。
7.根据权利要求6所述的酵母，其为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或产朊假丝酵母(Candidautilis)。
8.用于生产酵母提取物的方法，所述方法包括通过使用根据权利要求1至7中任一项所述的酵母作为原材料来制备酵母提取物。
9.用于生产Abu-相关的化合物的方法，所述方法包括：
在培养基中培养根据权利要求1至7中任一项所述的酵母；和
从培养物中收集所述Abu-相关的化合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述Abu-相关的化合物是γ-Glu-Abu和/或γ-Glu-Abu-Gly。
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