WO2015111462A1 - γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕの製造法およびγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕを含有する酵母エキスの製造法 - Google Patents

γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕの製造法およびγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕを含有する酵母エキスの製造法 Download PDF

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WO2015111462A1
WO2015111462A1 PCT/JP2015/050658 JP2015050658W WO2015111462A1 WO 2015111462 A1 WO2015111462 A1 WO 2015111462A1 JP 2015050658 W JP2015050658 W JP 2015050658W WO 2015111462 A1 WO2015111462 A1 WO 2015111462A1
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WO
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yeast
glu
abu
protein
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PCT/JP2015/050658
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一雄 山岸
西内　博章
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味の素株式会社
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for controlling the intracellular and extracellular localization of ⁇ -Glu-Abu in yeast and its use.
  • the present invention particularly relates to a method for producing ⁇ -Glu-Abu and a method for producing a yeast extract containing ⁇ -Glu-Abu.
  • ⁇ -Glu-Abu and yeast extract containing it are useful in the food field.
  • ⁇ -Glu-Abu is a peptide having a “kokumi” imparting action.
  • “Kokumi” means sweetness (sweet taste), salty taste (salty taste), sour taste (sour taste), bitter taste (bitter taste), and umami (umami). It also refers to the taste that enhances the marginal tastes and flavors of the basic tastes such as growth (mouthfulness), continuity, and harmony.
  • ⁇ -Glu-Abu is produced from L-glutamic acid (L-Glu) and ⁇ -aminobutyric acid (Abu) by the action of ⁇ -glutamylcysteine synthetase.
  • Abu is produced from ⁇ -ketobutyric acid ( ⁇ -KB) by the action of aminotransferase.
  • the Gap1 gene is a gene encoding Gap1 protein, which is a general amino acid transmembrane enzyme (general amino acid permease). Gap1 protein has the ability to transport all natural amino acids and many amino acid analogs. It is known that the localization of Gap1 protein is controlled according to the amount of amino acids inside and outside the cell (Non-patent Document 1). That is, the Gap1 protein is localized in the cell membrane when almost no amino acid is present, and is ubiquitinated and degraded in vacuoles when a large amount of amino acid is present.
  • the mutant Gap1 protein in which the 9th and 16th lysines are substituted with arginine does not have a ubiquitination site and therefore does not undergo degradation due to ubiquitination. Therefore, this mutant Gap1 protein does not depend on the amount of amino acids inside and outside the cell, and is normally localized in the cell membrane (Non-patent Document 2).
  • YGL114W gene is a gene encoding a protein predicted to be a peptide transporter.
  • the present invention has developed a novel technique for controlling the intracellular and extracellular localization of ⁇ -Glu-Abu in yeast, an efficient method for producing ⁇ -Glu-Abu, and a yeast extract containing ⁇ -Glu-Abu. It is an object to provide a manufacturing method.
  • the present inventor has expressed extracellular membrane-localized GAP1 gene in yeast with enhanced biosynthesis of ⁇ -Glu-Abu, thereby producing extracellular ⁇ -The Glu-Abu accumulation amount was found to improve.
  • the present inventor has shown that the high expression or destruction of the YGL114w gene in yeast with enhanced biosynthesis of ⁇ -Glu-Abu decreases or increases the intracellular ⁇ -Glu-Abu concentration, respectively. I found it. Based on these findings, the present inventor has completed the present invention.
  • the present invention can be exemplified as follows.
  • a method for producing ⁇ -Glu-Abu, culturing yeast having ⁇ -Glu-Abu-producing ability in a medium to produce and accumulate ⁇ -Glu-Abu in the medium, and collecting ⁇ -Glu-Abu from the medium The method wherein the yeast has any or both of the following properties (1) to (2): (1) modified to retain the mutant GAP1 gene; (2) It has been modified to increase the activity of the protein encoded by the YGL114w gene.
  • mutant GAP1 gene is a gene having the following mutations (A) and (B): (A) a mutation in which the lysine residue at position 9 of the wild-type Gap1 protein is replaced with another amino acid residue; (B) A mutation in which the lysine residue at position 16 of the wild-type Gap1 protein is substituted with another amino acid residue. [3] The method according to [2], wherein the lysine residues at positions 9 and 16 are substituted with arginine residues.
  • the wild-type Gap1 protein is a protein selected from the group consisting of the following (a) to (c): (A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20; (B) a protein having an amino acid transporter activity, comprising an amino acid sequence comprising substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20; (C) A protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 and having amino acid transporter activity.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the activity of the protein encoded by the YGL114w gene is increased by increasing the expression of the YGL114w gene.
  • [6] The method according to [5], wherein the expression of the YGL114w gene is increased by increasing the copy number of the gene and / or modifying the expression regulatory sequence of the gene.
  • a method for producing a yeast extract containing ⁇ -Glu-Abu including preparing a yeast extract using yeast having ⁇ -Glu-Abu accumulation ability as a raw material, The yeast has the following property (3): (3) It has been modified so that the activity of the protein encoded by the YGL114w gene is reduced.
  • [8] [7] The method according to [7], wherein the activity of the protein encoded by the YGL114w gene is decreased by decreasing the expression of the YGL114w gene or by disrupting the gene.
  • the YGL114w gene is DNA selected from the group consisting of the following (A) to (E): (A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31; (B) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31, comprising an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acid residues, and having increased activity in yeast Properties that improve ⁇ -Glu-Abu production compared to non-modified strains, and / or properties that improve ⁇ -Glu-Abu accumulation in yeast compared to non-modified strains when activity is reduced in yeast DNA encoding a protein having (C) A non-modified strain containing an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence
  • the yeast is further modified to increase the activity of one or more enzymes selected from the group consisting of ⁇ -glutamylcysteine synthetase, ⁇ -ketobutyrate synthase, and aminotransferase. [1] to [9]. [11] The method according to [10], wherein the ⁇ -ketobutyric acid synthase is an enzyme encoded by a CHA1 gene. [12] The method according to [10] or [11], wherein the aminotransferase is an enzyme encoded by a BAT1 gene. [13] The method according to any one of [1] to [12], wherein the yeast is Saccharomyces yeast or Candida yeast.
  • yeast Saccharomyces cerevisiae or Candida utilis.
  • Yeast having any of the following properties (1) to (4) and having ⁇ -Glu-Abu production ability and / or ⁇ -Glu-Abu accumulation ability: (1) modified to retain the mutant GAP1 gene; (2) modified to increase the activity of the protein encoded by the YGL114w gene; (3) modified to reduce the activity of the protein encoded by the YGL114w gene; (4) A combination of the properties (1) and (2) above.
  • the vertical axis represents the ⁇ -Glu-Abu concentration in the culture supernatant.
  • the vertical axis represents the ⁇ -Glu-Abu concentration in the bacterial cell extract.
  • the yeast of the present invention is a yeast in which the localization of ⁇ -Glu-Abu inside and outside the cell is controlled.
  • the localization of ⁇ -Glu-Abu can be controlled using the GAP1 gene and / or the YGL114w gene.
  • Abu and Glu are L-forms. That is, “ ⁇ -Glu-Abu” means L- ⁇ -glutamyl-L-2-aminobutyric acid.
  • the yeast of the present invention has any of the following properties (1) to (4). This property is also referred to as “the property of the present invention”. (1) modified to retain the mutant GAP1 gene; (2) modified to increase the activity of the protein encoded by the YGL114w gene; (3) modified to reduce the activity of the protein encoded by the YGL114w gene; (4) A combination of the properties (1) and (2) above.
  • the properties of the present invention can be appropriately selected according to the mode of localization control of ⁇ -Glu-Abu.
  • one embodiment of the yeast of the present invention is a ⁇ -Glu- modified to retain the mutant GAP1 gene and / or modified to increase the activity of the protein encoded by the YGL114w gene.
  • It may be a yeast having Abu-producing ability (hereinafter also referred to as “ ⁇ -Glu-Abu-producing yeast”).
  • ⁇ -Glu-Abu-producing yeast a yeast having Abu-producing ability
  • the ⁇ -Glu-Abu-producing yeast can be used for the production of ⁇ -Glu-Abu, for example.
  • yeast of the present invention is a yeast having the ability to accumulate ⁇ -Glu-Abu modified so that the activity of the protein encoded by the YGL114w gene is reduced (hereinafter referred to as “ ⁇ -Glu-Abu accumulation”). May also be referred to as “type yeast”.
  • ⁇ -Glu-Abu accumulation May also be referred to as “type yeast”.
  • “the activity of the protein encoded by the YGL114w gene decreases” may be a decrease in the expression of the YGL114w gene or a destruction of the YGL114w gene.
  • the ⁇ -Glu-Abu accumulating yeast can be used, for example, for producing a yeast extract containing ⁇ -Glu-Abu.
  • the yeast of the present invention may have ⁇ -Glu-Abu production ability and / or ⁇ -Glu-Abu accumulation ability.
  • the yeast of the present invention may inherently have ⁇ -Glu-Abu production ability and / or ⁇ -Glu-Abu accumulation ability, and ⁇ -Glu-Abu production ability and / or ⁇ -Glu-Abu accumulation ability. It may be modified to have a function.
  • Yeast having ⁇ -Glu-Abu producing ability and / or ⁇ -Glu-Abu accumulating ability is obtained by, for example, imparting ⁇ -Glu-Abu producing ability and / or ⁇ -Glu-Abu accumulating ability to yeast described later.
  • the yeast of the present invention can be obtained by modifying a yeast having ⁇ -Glu-Abu production ability and / or ⁇ -Glu-Abu accumulation ability so as to have the properties of the present invention.
  • the yeast of the present invention can also be obtained by imparting ⁇ -Glu-Abu production ability and / or ⁇ -Glu-Abu accumulation ability after modifying the yeast to have the properties of the present invention.
  • the yeast of the present invention may have acquired ⁇ -Glu-Abu production ability and / or ⁇ -Glu-Abu accumulation ability by being modified so as to have the properties of the present invention.
  • the modification for constructing the yeast of the present invention can be performed in any order.
  • the ability to produce ⁇ -Glu-Abu refers to the ability to produce and accumulate ⁇ -Glu-Abu in the medium to the extent that it can be detected when the yeast of the present invention is cultured in the medium.
  • the yeast of the present invention may be a yeast that can accumulate a larger amount of ⁇ -Glu-Abu in the medium than the unmodified strain.
  • Non-modified strains include wild strains and parent strains.
  • the yeast of the present invention is capable of accumulating ⁇ -Glu-Abu in the medium in an amount of 1 mg / L or more, 5 Lmg / L or more, 10 mg / L or more, or 15 mg / L or more. It may be.
  • the ability to accumulate ⁇ -Glu-Abu refers to the ability to produce and accumulate ⁇ -Glu-Abu in cells to the extent that it can be detected when the yeast of the present invention is cultured in a medium.
  • the yeast of the present invention may be a yeast that can accumulate a larger amount of ⁇ -Glu-Abu in the cell than the unmodified strain.
  • Non-modified strains include wild strains and parent strains.
  • the yeast of the present invention is 0.4 ⁇ mol / g-DCW or more, 1 ⁇ mol / g-DCW or more, 2 ⁇ mol / g-DCW or more, 3 ⁇ mol / g-DCW or more, 5 ⁇ mol / g-DCW or more, or 10 ⁇ mol / g-DCW.
  • the yeast may be capable of accumulating ⁇ -Glu-Abu in the cell in the above amount.
  • the yeast of the present invention may be a budding yeast or a fission yeast.
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • Candida utilis Candida utilis
  • genus Pichia pastel Piichia ⁇ ⁇ pastoris
  • Pichia genus Hansenula polymorpha (Hansenula morph)
  • yeast belonging to the genus Hansenula examples include yeast belonging to the genus Hansenula.
  • the fission yeast include yeast belonging to the genus Schizosaccharomyces pombe, such as Schizosaccharomyces pombe.
  • Saccharomyces cerevisiae and Candida utilis which are often used for the production of yeast extract, are preferable.
  • the yeast of the present invention may be haploid or may have diploidity or higher ploidy.
  • Saccharomyces cerevisiae examples include Saccharomyces cerevisiae Y006 strain (FERM BP-11299). On August 18, 2010, the Y006 strain was patented by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (currently the National Institute for Product Evaluation Technology Patent Biological Depositary, ZIP Code: 292-0818, Address: Chiba, Japan. Kisarazu City Kazusa Kamashika 2-5-8 (room 120) has been deposited internationally and has been assigned the deposit number FERM BP-11299.
  • Saccharomyces cerevisiae examples include Saccharomyces cerevisiae BY4743 (ATCC 201390) and Saccharomyces cerevisiae S288C (ATCC 26108).
  • Examples of Candida utilis include Candida utilis ATCC 22023. These strains can be obtained from, for example, the American Type Culture Collection (address: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America). That is, it can be sold using the registration number corresponding to each strain (see http://www.atcc.org/). The registration number corresponding to each strain is described in the catalog of American Type Culture Collection.
  • the GAP1 gene and Gap1 protein will be described below.
  • the GAP1 gene is a gene encoding general amino acid permease of amino acids in general. That is, the Gap1 protein encoded by the same gene has an activity of transporting amino acids and / or peptides from the inside of the cell to the outside of the cell through the cell membrane. This activity is also referred to as “amino acid transporter activity”.
  • the Gap1 protein may have, for example, an activity to excrete ⁇ -Glu-Abu out of the cell.
  • a GAP1 gene having a “specific mutation” described later is also referred to as a mutant GAP1 gene, and a protein encoded thereby is also referred to as a mutant Gap1 protein.
  • the mutant Gap1 protein is normally localized in the cell membrane. Therefore, the mutant GAP1 gene is also referred to as a cell membrane normally localized GAP1 gene, and the mutant Gap1 protein is also referred to as a cell membrane normally localized Gap1 protein.
  • a GAP1 gene having no “specific mutation” described later is also referred to as a wild-type GAP1 gene, and a protein encoded thereby is also referred to as a wild-type Gap1 protein.
  • an amino acid sequence change caused by a “specific mutation” in the GAP1 gene is also referred to as a “specific mutation”.
  • Examples of the wild-type GAP1 gene include the yeast GAP1 gene.
  • Specific examples of the GAP1 gene of yeast include the GAP1 gene of Saccharomyces cerevisiae.
  • the base sequence of the GAP1 gene of Saccharomyces cerevisiae is disclosed in Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). Further, the GAP1 gene of Saccharomyces cerevisiae S288C strain (ATCC 26108) corresponds to the sequence of 515063 to 516871 among the sequences of chromosome XI registered as GenBank accession NC_001143 in the NCBI database. The Gap1 protein of Saccharomyces cerevisiae S288C strain (ATCC 26108) is registered as GenBank accession NP_012965.
  • the nucleotide sequence of the GAP1 gene of Saccharomyces cerevisiae S288C strain (ATCC 26108) and the amino acid sequence of the Gap1 protein encoded by the same gene are shown in SEQ ID NOs: 19 and 20, respectively.
  • the wild-type Gap1 protein may be a variant of the Gap1 protein as long as it does not have a “specific mutation” described below and the original function is maintained. Such variants may be referred to as “conservative variants”. Examples of conservative variants include homologues of the Gap1 protein and artificial modifications. “The original function is maintained” means that the variant of the protein has an activity corresponding to the activity of the original protein. That is, “the original function is maintained” for the wild type Gap1 protein means that the variant of the protein has amino acid transporter activity.
  • the wild-type GAP1 gene may be a variant of the GAP1 gene as long as it encodes the Gap1 protein or a conservative variant thereof.
  • the gene encoding the homologue of the Gap1 protein can be easily obtained from a public database by, for example, a BLAST search or FASTA search using the above-described yeast GAP1 gene (SEQ ID NO: 19) as a query sequence.
  • the gene encoding the homologue of the Gap1 protein can be obtained, for example, by PCR using yeast chromosomes as templates and oligonucleotides prepared based on these known gene sequences as primers.
  • one or several amino acids at one or several positions in the amino acid sequence are It may be a protein having an amino acid sequence substituted, deleted, inserted or added.
  • the above “one or several” differs depending on the position of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein and the type of amino acid residue, but specifically, for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 Means 30, preferably 1-20, more preferably 1-10, still more preferably 1-5, and particularly preferably 1-3.
  • substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids described above is a conservative mutation that maintains the protein function normally.
  • a typical conservative mutation is a conservative substitution.
  • Conservative substitution is a polar amino acid between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid. In this case, between Gln and Asn, when it is a basic amino acid, between Lys, Arg, and His, when it is an acidic amino acid, between Asp and Glu, when it is an amino acid having a hydroxyl group Is a mutation that substitutes between Ser and Thr.
  • substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Substitution from Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, substitution from Met to Ile, Leu, Val or Phe, substitution from Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala Substitution, substitution from Trp to Phe or Tyr, substitution
  • the wild-type Gap1 protein does not have a “specific mutation” described later, and as long as the original function is maintained, 80% or more, preferably 90% or more, based on the entire amino acid sequence, More preferably, it may be a protein having a homology of 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more.
  • “homology” may refer to “identity”.
  • the wild-type GAP1 gene does not have a “specific mutation” to be described later, and a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, the nucleotide sequence described above, as long as it encodes a protein that maintains the original function. It may be DNA that hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence in whole or in part. “Stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, highly homologous DNAs, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more between DNAs having homology.
  • the probe used for the hybridization may be a part of a gene complementary sequence.
  • a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared on the basis of a known gene sequence as a primer and a DNA fragment containing these base sequences as a template.
  • hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 ⁇ SSC, and 0.1% SDS.
  • wild-type GAP1 gene may be a gene in which any codon is replaced with an equivalent codon as long as it encodes the wild-type Gap1 protein as described above.
  • the wild type GAP1 gene may be modified to have an optimal codon depending on the codon usage of the host to be used.
  • the mutant Gap1 protein has a “specific mutation” described later in the amino acid sequence of the wild-type Gap1 protein as described above.
  • the mutant Gap1 protein may be the above-described yeast Gap1 protein or a conservative variant thereof except that it has a “specific mutation” described later.
  • the mutant Gap1 protein may be a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, except that it has a “specific mutation” described later.
  • the mutant Gap1 protein has one or several amino acid substitutions, deletions, insertions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, except that it has a “specific mutation” described later.
  • it may be a protein having an amino acid sequence including an addition.
  • the mutant Gap1 protein has 80% or more, preferably 90% or more, more preferably, relative to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, except that it has a “specific mutation” described later.
  • the mutant Gap1 protein is a variant having a “specific mutation” described later in the yeast Gap1 protein described above, and further including a conservative mutation at a place other than the “specific mutation”. It may be.
  • the mutant Gap1 protein has a “specific mutation” to be described later in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, and one or several additional portions other than the “specific mutation”. It may be a protein having an amino acid sequence including amino acid substitutions, deletions, insertions, or additions.
  • the mutant GAP1 gene is not particularly limited as long as it encodes the mutant Gap1 protein as described above.
  • a “specific mutation” is a mutation in which the encoded Gap1 protein becomes a cell membrane normal localization type. "Specific mutation” includes the following combinations (A) and (B): (A) a mutation in which the lysine residue at position 9 of the wild-type Gap1 protein is replaced with another amino acid residue; (B) A mutation in which the lysine residue at position 16 of the wild-type Gap1 protein is substituted with another amino acid residue.
  • Amino acids other than lysine include glycine (Gly), alanine (Ala), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ile), serine (Ser), threonine (Thr), cysteine (Cys), methionine (Met). ), Asparagine (Asn), glutamine (Gln), proline (Pro), aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), arginine (Arg), histidine (His), phenylalanine (Phe), tyrosine (Tyr), tryptophan ( Trp).
  • the 9th lysine residue is preferably substituted with, for example, an arginine residue.
  • the 16th lysine residue is preferably substituted with, for example, an arginine residue.
  • the “amino acid residue at the X position of the wild-type Gap1 protein” means an amino acid residue corresponding to the amino acid residue at the X position in SEQ ID NO: 20, unless otherwise specified.
  • the “X position” in the amino acid sequence means the X position from the N terminal of the amino acid sequence, and the amino acid residue at the N terminal is the first amino acid residue. That is, the position of the amino acid residue indicates a relative position, and the position may be moved back and forth by amino acid deletion, insertion, or addition.
  • “9th lysine residue of wild-type Gap1 protein” means an amino acid residue corresponding to the 9th lysine residue in SEQ ID NO: 20, and 1 amino acid residue N-terminal from 9th position.
  • the 8th amino acid residue from the N-terminal is assumed to be “9th lysine residue of wild-type Gap1 protein”.
  • the 10th amino acid residue from the N-terminal is assumed to be the “9th lysine residue of the wild-type Gap1 protein”.
  • amino acid residue in an arbitrary amino acid sequence is the “amino acid residue corresponding to the X-position amino acid residue in SEQ ID NO: 20” is aligned with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20
  • the alignment can be performed using, for example, known gene analysis software. Specific software includes DNA Solutions from Hitachi Solutions and GENETYX from Genetics (Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24 (1), 72-96, 1991; Barton GJ et) al., Journal of molecular biology, 198 (2), 327-37. 1987).
  • the mutant GAP1 gene can be obtained by modifying the wild-type GAP1 gene to have the above-mentioned “specific mutation”. Modification of DNA can be performed by a known method. Specifically, for example, as a site-specific mutation method for introducing a target mutation into a target site of DNA, a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds. , Stockton press (1989); Carter, P., Meth. In Enzymol., 154, 382 (1987)) and methods using phage (Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. In Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • the mutant GAP1 gene can also be obtained by chemical synthesis.
  • Altering the yeast so as to have a mutant GAP1 gene can be achieved by introducing the mutant GAP1 gene into the yeast. Further, modification of a yeast so as to have a mutant GAP1 gene can also be achieved by introducing a mutation into the wild-type GAP1 gene of the yeast by natural mutation or mutagen treatment.
  • the method for introducing the mutant GAP1 gene into yeast is not particularly limited.
  • the introduction of the mutant GAP1 gene can be carried out in the same manner as the method for increasing the gene copy number described later.
  • the mutant GAP1 gene only needs to be retained so that it can be expressed under the control of a promoter that functions in the yeast.
  • the mutant GAP1 gene may be present on a vector that autonomously proliferates outside the chromosome, such as a plasmid, or may be integrated on the chromosome.
  • Usable promoters and vectors are exemplified in the method for increasing the number of gene copies described below.
  • the yeast of the present invention may have only one copy of the mutant GAP1 gene, or may have two or more copies.
  • the yeast of the present invention may have only one type of mutant GAP1 gene or may have two or more types of mutant GAP1 genes.
  • the yeast of the present invention When the yeast of the present invention has a polyploidy of diploid or more, and the mutant GAP1 gene is integrated on the chromosome, the yeast of the present invention has a chromosome into which the mutant GAP1 gene is integrated and the mutant GAP1. It may have heterogeneous chromosomes that do not contain genes, and may have homologous chromosomes into which mutant GAP1 genes have been incorporated.
  • the yeast of the present invention may or may not have a wild type GAP1 gene.
  • Yeast having no wild-type GAP1 gene can be obtained by disrupting the wild-type GAP1 gene on the chromosome.
  • the wild type GAP1 gene can be disrupted by, for example, a technique for disrupting a gene described later.
  • the wild-type GAP1 gene can be disrupted by deleting part or all of the coding region of the wild-type GAP1 gene.
  • a yeast that does not have the wild-type GAP1 gene and is modified to have the mutant GAP1 gene can be obtained.
  • the YGL114W gene and YGL114W protein will be described below.
  • the YGL114W gene is a gene encoding a protein predicted to be a peptide transporter. That is, the YGL114W protein encoded by the same gene can have peptide transporter activity. Specifically, the YGL114W protein may have, for example, an activity to excrete ⁇ -Glu-Abu out of the cell.
  • YGL114W protein has the property of improving the production of ⁇ -Glu-Abu in yeast when the activity is increased in yeast and / or the activity of yeast when the activity is decreased in yeast. It has the property of improving the amount of ⁇ -Glu-Abu accumulation compared to the unmodified strain. This property is also referred to as “properties of YGL114W protein”.
  • Examples of the YGL114W gene include the yeast YGL114W gene. Specific examples of the yeast YGL114W gene include the Saccharomyces cerevisiae YGL114W gene.
  • the base sequence of the Saccharomyces cerevisiae YGL114W gene is disclosed in Saccharomyces® Genome® Database (http://www.yeastgenome.org/).
  • the YGL114W gene of Saccharomyces cerevisiae S288C strain corresponds to the sequence of 293460 to 295637 in the sequence of chromosome VII registered as GenBank accession NC_001139 in the NCBI database.
  • the YGL114W protein of Saccharomyces cerevisiae S288C strain is registered as GenBank accession NP_011401.
  • the nucleotide sequence of the YGL114W gene of Saccharomyces cerevisiae S288C strain (ATCC 26108) and the amino acid sequence of the YGL114W protein encoded by the same gene are shown in SEQ ID NOs: 30 and 31, respectively.
  • the YGL114W gene is not limited to the above-exemplified genes or genes having a known base sequence, and may be a variant thereof as long as it encodes a protein maintaining the original function.
  • the above-mentioned description concerning the conservative variants of wild-type GAP1 gene and wild-type Gap1 protein can be applied mutatis mutandis.
  • “The original function is maintained” for the YGL114W protein means that the variant of the protein has the properties of the YGL114W protein described above.
  • “the original function is maintained” for the YGL114W protein may mean that the variant of the protein has an activity to excrete ⁇ -Glu-Abu out of the cell.
  • a protein variant has the property of improving the production of ⁇ -Glu-Abu in yeast as compared to an unmodified strain when the activity in yeast is increased is, for example, a gene encoding the variant in yeast This can be confirmed by increasing the activity of the same variant in yeast by means such as introducing, and confirming whether the amount of ⁇ -Glu-Abu production is improved.
  • a protein variant has the property of improving the amount of ⁇ -Glu-Abu accumulated in yeast compared to an unmodified strain when its activity is reduced in yeast, for example, a gene encoding the same variant in yeast This can be confirmed by reducing the activity of the same variant in yeast by means such as disrupting and confirming whether the amount of ⁇ -Glu-Abu accumulation is improved.
  • the yeast of the present invention may further have other modifications.
  • the yeast of the present invention may be modified so as to impart or enhance ⁇ -Glu-Abu production ability and / or ⁇ -Glu-Abu accumulation ability.
  • the ability to produce ⁇ -Glu-Abu and / or accumulate ⁇ -Glu-Abu increases the activity of enzymes involved in the biosynthesis of ⁇ -Glu-Abu and decreases the activity of ⁇ -glutamylcysteine synthase Or reducing the activity of peptidase, or a combination thereof.
  • the modification for constructing the yeast of the present invention can be performed in any order.
  • the yeast of the present invention may be modified so that the activity of the enzyme involved in intracellular biosynthesis of ⁇ -Glu-Abu is increased.
  • enzymes involved in the biosynthesis of ⁇ -Glu-Abu include ⁇ -ketobutyric acid synthase, aminotransferase, and ⁇ -glutamylcysteine synthetase (gamma glutamylcysteine synthetase).
  • the activity of one enzyme involved in the biosynthesis of ⁇ -Glu-Abu may be increased, and the activity of two or more enzymes involved in the biosynthesis of ⁇ -Glu-Abu may be increased. It may be increased.
  • ⁇ -ketobutyric acid synthase refers to a protein having an activity of catalyzing a reaction for producing ⁇ -ketobutyric acid from L-threonine.
  • ⁇ -ketobutyric acid synthase include serine / threonine deaminase and threonine deaminase.
  • Examples of the gene encoding serine / threonine deaminase include the CHA1 gene.
  • Examples of the gene encoding threonine deaminase include ILV1 gene. Among these, for example, it is preferable to increase the activity of serine / threonine deaminase encoded by the CHA1 gene.
  • the activity of one ⁇ -ketobutyrate synthase may be increased, and the activity of two or more ⁇ -ketobutyrate synthases may be increased.
  • Saccharomyces cerevisiae CHA1 gene systematic name: YCL064C
  • ILV1 gene systematic name: YER086W
  • Saccharomyces® Genome® Database http://www.yeastgenome.org/.
  • the nucleotide sequence of the CHA1 gene of Saccharomyces cerevisiae S288C strain ATCC 26108
  • the amino acid sequence of the Cha1 protein encoded by the same gene are shown in SEQ ID NOs: 22 and 23, respectively.
  • the nucleotide sequence of the ILV1 gene of Saccharomyces cerevisiae S288C strain (ATCC 26108) and the amino acid sequence of the Ilv1 protein encoded by the same gene are shown in SEQ ID NOs: 24 and 25, respectively.
  • aminotransferase refers to a protein having an activity of catalyzing a reaction for producing Abu from ⁇ -ketobutyric acid by a transamination reaction.
  • aminotransferase include alanine: glyoxylate aminotransferase, branched-chain amino acid transaminase, aspartate aminotransferase, and ⁇ -aminobutyric acid transaminase. (Gamma-aminobutyrate transaminase).
  • Examples of the gene encoding alanine: glyoxylate aminotransferase include the AGX1 gene.
  • genes encoding branched chain amino acid transaminase include BAT1 and BAT2 genes.
  • Examples of the gene encoding aspartate aminotransferase include AAT1 and AAT2 genes.
  • An example of a gene encoding ⁇ -aminobutyric acid transaminase is the UGA1 gene.
  • the activity of one aminotransferase may be increased, and the activity of two or more aminotransferases may be increased.
  • Saccharomyces cerevisiae AGX1 gene (systematic name: YFL030W), BAT1 gene (systematic name: YHR208W), BAT2 gene (systematic name: YJR148W), AAT1 gene (systematic name: YKL106W), AAT2 gene (systematic name: YLR027C), and The base sequence of the UGA1 gene (systematic name: YGR019W) is disclosed in Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/).
  • the nucleotide sequence of the BAT1 gene of Saccharomyces cerevisiae S288C strain (ATCC 26108) and the amino acid sequence of the Bat1 protein encoded by the same gene are shown in SEQ ID NOs: 26 and 27, respectively.
  • ⁇ -glutamylcysteine synthase refers to a protein that recognizes L-Glu and Abu as substrates and has an activity of catalyzing a reaction for producing ⁇ -Glu-Abu.
  • ⁇ -glutamylcysteine synthetase may recognize L-Glu and L-Cys as substrates, and may have an activity of catalyzing a reaction to generate ⁇ -glutamylcysteine ( ⁇ -Glu-Cys). It does not have to be.
  • the enhancement of the activity of ⁇ -glutamylcysteine synthetase is disclosed in, for example, US Pat. No. 7553638, Yasuyuki Otake et al. (Bioscience and Industry, Vol. 50, No. 10, pages 989-994, 1992). ing.
  • yeast of the present invention may be modified so that the activity of intracellular glutathione synthase is reduced.
  • glutathione synthase refers to a protein that recognizes ⁇ -Glu-Abu and Gly as substrates and has an activity of catalyzing a reaction for producing ⁇ -Glu-Abu-Gly.
  • Glutathione synthase may or may not have the activity of recognizing ⁇ -Glu-Cys and Gly as substrates and catalyzing the reaction to produce glutathione ( ⁇ -Glu-Cys-Gly). Good.
  • Examples of the gene encoding ⁇ -glutamylcysteine synthetase include GSH1 gene.
  • An example of a gene encoding glutathione synthetase is the GSH2 gene.
  • the base sequences of Saccharomyces cerevisiae GSH1 and GSH2 genes are disclosed in Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/).
  • the base sequences of Candida utilis GSH1 and GSH2 genes are disclosed in US Pat. No. 7,553,638.
  • the nucleotide sequence of the GSH1 gene of Saccharomyces cerevisiae S288C strain (ATCC 26108) and the amino acid sequence of the Gsh1 protein encoded by the same gene are shown in SEQ ID NOs: 28 and 29, respectively.
  • yeast of the present invention may be modified so that the activity of intracellular peptide-degrading enzymes is reduced.
  • peptide degrading enzyme refers to a protein having an activity of catalyzing a reaction of hydrolyzing a peptide bond of a peptide.
  • the peptide degrading enzyme include proteins encoded by the DUG1 gene, DUG2 gene, DUG3 gene, and ECM38 gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2012-213376).
  • Dug1p, Dug2p, and Dug3p encoded by the DUG1 gene, DUG2 gene, and DUG3 gene function by forming a DUG complex, respectively.
  • Dug1p, Dug2p, and Dug3p are all required for degradation of glutathione by the DUG complex (Ganguli D. et al., Genetics. 2007 Mar; 175 (3): 1137-51)
  • the activity of the DUG complex can be reduced.
  • the activity of one type of peptide degrading enzyme may be reduced, and the activity of two or more types of peptide degrading enzymes may be reduced.
  • Saccharomyces cerevisiae DUG1, DUG2, DUG3, and ECM38 genes are disclosed in Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/).
  • genes used for these “other modifications” are not limited to the above-exemplified genes or genes having a known base sequence, as long as they encode a protein that maintains the original function. Good.
  • the description regarding the conservative variants of the wild-type GAP1 gene and the wild-type Gap1 protein described above can be applied mutatis mutandis.
  • Protein activity increases “means that the activity per cell of the protein is increased relative to unmodified strains such as wild strains and parental strains. Note that “increasing protein activity” is also referred to as “enhancing protein activity”. “Protein activity increases” specifically means that the number of molecules per cell of the protein is increased and / or the function per molecule of the protein compared to an unmodified strain. Is increasing. That is, “activity” in the case of “increasing protein activity” means not only the catalytic activity of the protein, but also the transcription amount (mRNA amount) or translation amount (protein amount) of the gene encoding the protein. May be.
  • Protein activity increases means not only to increase the activity of the protein in a strain that originally has the activity of the target protein, but also to the activity of the protein in a strain that does not originally have the activity of the target protein. Including granting. As a result, as long as the activity of the protein increases, the activity of the target protein inherent in yeast may be reduced or eliminated, and then the activity of a suitable target protein may be imparted.
  • the activity of the protein is not particularly limited as long as it is increased compared to the non-modified strain.
  • the protein activity is increased 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more compared to the non-modified strain. Good.
  • the protein is generated by introducing a gene encoding the protein.
  • the protein has an enzymatic activity. It may be produced to the extent that it can be measured.
  • Modification that increases the activity of the protein is achieved, for example, by increasing the expression of the gene encoding the protein.
  • Gene expression is increased means that the expression level of the gene per cell is increased as compared to a non-modified strain such as a wild strain or a parent strain.
  • Gene expression increases specifically means that the amount of gene transcription (mRNA amount) increases and / or the amount of gene translation (protein amount) increases. Good.
  • increasing gene expression is also referred to as “enhanced gene expression”.
  • the expression of the gene may be increased 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more, for example, as compared to the unmodified strain.
  • increasing gene expression means not only increasing the expression level of a target gene in a strain that originally expresses the target gene, but also in a strain that originally does not express the target gene. Including expressing a gene. That is, “increasing gene expression” includes, for example, introducing the gene into a strain that does not hold the target gene and expressing the gene.
  • An increase in gene expression can be achieved, for example, by increasing the copy number of the gene.
  • Increase in gene copy number can be achieved by introducing the gene into the chromosome of the host microorganism.
  • Introduction of a gene into a chromosome can be performed, for example, using homologous recombination (Miller I, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). Only one copy of the gene may be introduced, or two copies or more may be introduced. For example, multiple copies of a gene can be introduced into a chromosome by performing homologous recombination with a sequence having multiple copies on the chromosome as a target.
  • sequence having a large number of copies in the chromosome examples include an autonomously replicating sequence (ARS) consisting of a unique short repetitive sequence and an rDNA sequence having about 150 copies.
  • ARS autonomously replicating sequence
  • An example of transformation of yeast using a plasmid containing ARS is described in WO95 / 32289.
  • a gene may be incorporated into a transposon and transferred to introduce multiple copies of the gene into the chromosome.
  • the increase in gene copy number can be achieved by introducing a vector containing the target gene into the host microorganism.
  • a DNA fragment containing a target gene is linked to a vector that functions in the host microorganism to construct an expression vector for the gene, and the host microorganism is transformed with the expression vector to increase the copy number of the gene.
  • a DNA fragment containing a target gene can be obtained, for example, by PCR using a genomic DNA of a microorganism having the target gene as a template.
  • a vector capable of autonomous replication in a host microorganism cell can be used.
  • the vector is preferably a multicopy vector.
  • vectors that function in yeast cells include a plasmid having a CEN4 replication origin and a multicopy plasmid having a 2 ⁇ m DNA replication origin.
  • specific examples of vectors that function in yeast cells include pAUR123 (Takara Bio) and pYES2 (Invitrogen).
  • the gene When a gene is introduced, the gene only needs to be retained in the yeast of the present invention so that it can be expressed.
  • the gene may be introduced so as to be expressed under the control of a promoter sequence that functions in the yeast of the present invention.
  • the promoter may be a host-derived promoter or a heterologous promoter.
  • the promoter may be a native promoter of a gene to be introduced or a promoter of another gene.
  • the promoter may be a promoter originally mounted on the vector to be used. As the promoter, for example, a stronger promoter as described later may be used.
  • each gene when two or more genes are introduced, each gene may be retained in the yeast of the present invention so that it can be expressed. For example, all the genes may be held on a single expression vector, or all may be held on a chromosome. Moreover, each gene may be separately hold
  • the gene to be introduced is not particularly limited as long as it encodes a protein that functions in the host.
  • the introduced gene may be a host-derived gene or a heterologous gene.
  • the gene to be introduced can be obtained by PCR using, for example, a primer designed based on the base sequence of the gene, and using a genomic DNA of an organism having the gene or a plasmid carrying the gene as a template. Moreover, you may synthesize
  • each subunit constituting the complex may be derived from one organism or two or more different organisms as long as the complex has the function of the target protein. That is, for example, genes derived from the same organism encoding a plurality of subunits may be introduced into the host, or genes derived from different organisms may be introduced into the host.
  • the increase in gene expression can be achieved by improving the transcription efficiency of the gene.
  • the increase in gene expression can be achieved by improving the translation efficiency of the gene.
  • Improvement of gene transcription efficiency and translation efficiency can be achieved, for example, by altering an expression regulatory sequence.
  • “Expression regulatory sequence” is a general term for sites that affect gene expression, such as promoters.
  • improvement of gene transcription efficiency can be achieved, for example, by replacing a promoter of a gene on a chromosome with a stronger promoter.
  • stronger promoter is meant a promoter that improves transcription of the gene over the native wild-type promoter.
  • Examples of a stronger promoter include promoters of genes such as PGK1, PDC1, TDH3, TEF1, HXT7, and ADH1, which are known high expression promoters.
  • a highly active promoter of a conventional promoter may be obtained by using various reporter genes.
  • Improvement of gene translation efficiency can also be achieved, for example, by codon modification. That is, in the case of heterologous expression of a gene, the translation efficiency of the gene can be improved by replacing rare codons present in the gene with synonymous codons that are used more frequently. Codon substitution can be performed, for example, by a site-specific mutagenesis method in which a target mutation is introduced into a target site of DNA. As site-directed mutagenesis, a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, rlErlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., ethMeth. In Enzymol., 154, 382 (1987)).
  • gene fragments in which codons have been replaced may be fully synthesized.
  • the frequency of codon usage in various organisms can be found in the “Codon Usage Database” (http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)) Is disclosed.
  • the increase in gene expression can be achieved by amplifying a regulator that increases gene expression or by deleting or weakening a regulator that decreases gene expression.
  • the modification that increases the activity of the protein can be achieved, for example, by enhancing the specific activity of the protein.
  • Specific activity enhancement also includes the reduction and elimination of feedback inhibition.
  • Proteins with enhanced specific activity can be obtained by searching for various organisms, for example.
  • a highly active protein may be obtained by introducing a mutation into a conventional protein.
  • the introduced mutation may be, for example, a substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acids at one or several positions of the protein. Mutation can be introduced by, for example, the site-specific mutation method as described above. Moreover, you may introduce
  • Mutation treatments include X-ray irradiation, UV irradiation, and N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethylmethanesulfonate (EMS), and methylmethanesulfonate (MMS). ) And the like.
  • DNA may be directly treated with hydroxylamine in vitro to induce random mutations.
  • the enhancement of specific activity may be used alone or in any combination with the above-described method for enhancing gene expression.
  • yeast of the present invention has a ploidy of diploid or higher and the activity of the protein is increased by chromosomal modification
  • the yeast of the present invention can be used as long as the protein activity increases as a result.
  • a chromosome modified so as to increase the activity of the wild-type and a wild-type chromosome may be heterogeneous, and a chromosome modified so as to increase the activity of the protein may be homozygous.
  • Yeast transformation methods include protoplast method, KU method (H. Ito et al., J. Bateriol., 153-163 (1983)), KUR method (fermentation and industrial vol.43, p.630-637 ( 1985)), electroporation (Luis et al., FEMS micro microbiology Letters 165 (1998) 335-340), method using carrier DNA (Gietz RD and Schiestl RH, Methods Mol. Cell. Biol. 5: 255- 269 (1995)) or the like, a method usually used for yeast transformation can be employed.
  • the increase in protein activity can be confirmed by measuring the activity of the protein.
  • the increase in protein activity can also be confirmed by confirming that the expression of the gene encoding the protein has increased.
  • An increase in gene expression can be confirmed by confirming that the transcription amount of the gene has increased, or by confirming that the amount of protein expressed from the gene has increased.
  • the transcription amount of the gene has increased by comparing the amount of mRNA transcribed from the gene with an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain.
  • Methods for assessing the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR, etc. ), 2001).
  • the amount of mRNA may be increased by, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more, compared to the unmodified strain.
  • the amount of protein may be increased by, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more, compared to the unmodified strain.
  • the above-described techniques for increasing the activity of a protein include enhancing the activity of an arbitrary protein, for example, an enzyme involved in biosynthesis of ⁇ -Glu-Abu, and expressing an arbitrary gene, for example, a gene encoding the arbitrary protein. Can be used for enhancement.
  • Protein activity decreases means that the activity per cell of the protein is decreased compared to wild-type strains and parental unmodified strains, and the activity is completely lost. including. Specifically, “the activity of the protein is decreased” means that the number of molecules per cell of the protein is decreased and / or the function per molecule of the protein compared to the unmodified strain. Means that it is decreasing. In other words, “activity” in the case of “decrease in protein activity” means not only the catalytic activity of the protein but also the transcription amount (mRNA amount) or translation amount (protein amount) of the gene encoding the protein. May be. Note that “the number of molecules per cell of the protein is decreased” includes a case where the protein does not exist at all.
  • the function per molecule of the protein is reduced includes the case where the function per molecule of the protein is completely lost.
  • the activity of the protein is not particularly limited as long as it is lower than that of the non-modified strain. For example, it is 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0, compared to the non-modified strain. %.
  • the modification that reduces the activity of the protein is achieved, for example, by reducing the expression of a gene encoding the protein.
  • Gene expression decreases means that the expression level of the gene per cell decreases as compared to an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain. “Gene expression decreases” specifically means that the amount of gene transcription (mRNA amount) decreases and / or the amount of gene translation (protein amount) decreases. Good. “Gene expression decreases” includes the case where the gene is not expressed at all. In addition, “the expression of the gene is reduced” is also referred to as “the expression of the gene is weakened”. Gene expression may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% compared to an unmodified strain.
  • the decrease in gene expression may be due to, for example, a decrease in transcription efficiency, a decrease in translation efficiency, or a combination thereof.
  • Reduction of gene expression can be achieved, for example, by modifying an expression regulatory sequence such as a gene promoter.
  • the expression control sequence is preferably modified by 1 base or more, more preferably 2 bases or more, particularly preferably 3 bases or more.
  • the promoter of the gene on the chromosome may be replaced with a weaker promoter.
  • weaker promoter is meant a promoter whose gene transcription is weaker than the native wild-type promoter.
  • various inducible promoters can be used.
  • an inducible promoter can function as a weaker promoter in the absence of an inducer.
  • the inducible promoter include a galactose-inducible galactokinase gene (GAL1) promoter.
  • GAL1 galactose-inducible galactokinase gene
  • part or all of the expression regulatory sequence may be deleted.
  • reduction of gene expression can be achieved, for example, by manipulating factors involved in expression control. Factors involved in expression control include small molecules (such as inducers and inhibitors) involved in transcription and translation control, proteins (such as transcription factors), nucleic acids (such as siRNA), and the like.
  • reduction of gene expression can be achieved, for example, by introducing a mutation that reduces gene expression into the coding region of the gene.
  • gene expression can be reduced by replacing codons in the coding region of the gene with synonymous codons that are used less frequently in the host.
  • gene expression itself may be reduced by gene disruption as described below.
  • the modification that decreases the activity of the protein can be achieved, for example, by destroying a gene encoding the protein. “Gene is disrupted” means that the gene is modified so that it does not produce a normally functioning protein. “Does not produce a protein that functions normally” includes the case where no protein is produced from the same gene, or the case where a protein whose function (activity or property) per molecule is reduced or lost is produced from the same gene. It is.
  • Gene disruption can be achieved, for example, by deleting part or all of the coding region of the gene on the chromosome. Furthermore, the entire gene including the sequences before and after the gene on the chromosome may be deleted.
  • the region to be deleted may be any region such as an N-terminal region, an internal region, or a C-terminal region as long as a decrease in protein activity can be achieved. Usually, the longer region to be deleted can surely inactivate the gene. Moreover, it is preferable that the reading frames of the sequences before and after the region to be deleted do not match.
  • gene disruption is, for example, introducing an amino acid substitution (missense mutation) into a coding region of a gene on a chromosome, introducing a stop codon (nonsense mutation), or adding or deleting 1 to 2 bases. It can also be achieved by introducing a frameshift mutation (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515 (1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839 (1991)).
  • gene disruption can be achieved, for example, by inserting another sequence into the coding region of the gene on the chromosome.
  • the insertion site may be any region of the gene, but the longer the inserted sequence, the more reliably the gene can be inactivated.
  • the other sequence is not particularly limited as long as it reduces or eliminates the activity of the encoded protein, and examples thereof include marker genes such as antibiotic resistance genes and genes useful for the production of target substances.
  • Modifying a gene on a chromosome as described above includes, for example, deleting a partial sequence of the gene and preparing a deleted gene modified so as not to produce a normally functioning protein.
  • substituting the deleted gene for the wild-type gene on the chromosome by transforming the microorganism with the recombinant DNA containing, and causing homologous recombination between the deleted gene and the wild-type gene on the chromosome. Can be achieved.
  • the recombinant DNA can be easily manipulated by including a marker gene in accordance with a trait such as auxotrophy of the host. Even if the protein encoded by the deletion-type gene is produced, it has a three-dimensional structure different from that of the wild-type protein, and its function is reduced or lost.
  • the wild-type gene and the deletion-type gene are inserted into the chromosome with other parts of the recombinant DNA (for example, the vector part and the marker gene) sandwiched between them. May be. Since the wild-type gene functions in this state, homologous recombination occurs again between the two genes, and one copy of the gene is dropped from the chromosomal DNA together with the vector portion and the marker gene, leaving the deleted gene. It is necessary to select the ones.
  • a linear DNA containing an arbitrary sequence wherein yeast is transformed with a linear DNA having sequences upstream and downstream of the site to be replaced on both ends of the arbitrary sequence, and the target to be replaced
  • the site to be replaced can be replaced with the arbitrary sequence in one step.
  • a sequence containing a marker gene can be used. The marker gene may then be removed if necessary. When removing the marker gene, sequences for homologous recombination may be added to both ends of the marker gene so that the marker gene can be efficiently removed.
  • the modification that reduces the activity of the protein may be performed by, for example, a mutation treatment.
  • Mutation treatments include X-ray irradiation, UV irradiation, and N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethylmethanesulfonate (EMS), and methylmethanesulfonate (MMS). ) And the like.
  • all of the plurality of subunits may be modified or only a part may be modified as long as the activity of the protein decreases as a result. . That is, for example, all of a plurality of genes encoding these subunits may be destroyed, or only a part of them may be destroyed.
  • all the activities of the plurality of isozymes may be reduced, or only a part of the activities may be reduced. That is, for example, all of a plurality of genes encoding these isozymes may be destroyed, or only a part of them may be destroyed. Further, for example, a part of a plurality of genes encoding these isozymes may be destroyed to reduce the remaining expression.
  • the yeast of the present invention When the yeast of the present invention has a diploid or higher ploidy, the yeast of the present invention results in the chromosome and wild-type chromosome being modified so that the protein activity decreases as long as the protein activity decreases. And may have a chromosome modified so that the activity of the protein decreases. Usually, the yeast of the present invention preferably has a homologous gene modified so that the activity of the protein is reduced.
  • the decrease in the activity of the protein can be confirmed by measuring the activity of the protein.
  • the decrease in protein activity can also be confirmed by confirming that the expression of the gene encoding the protein has decreased.
  • the decrease in gene expression can be confirmed by confirming that the transcription amount of the gene has decreased, or confirming that the amount of protein expressed from the gene has decreased.
  • the amount of transcription of the gene has been reduced by comparing the amount of mRNA transcribed from the same gene with that of the unmodified strain.
  • methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR, and the like (Molecular cloning (Cold spring spring Laboratory Laboratory, Cold spring Harbor (USA), 2001)).
  • the amount of mRNA may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% compared to the unmodified strain.
  • the amount of protein may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% compared to the unmodified strain.
  • the gene has been destroyed by determining part or all of the nucleotide sequence, restriction enzyme map, full length, etc. of the gene according to the means used for the destruction.
  • the above-described technique for reducing the activity of a protein can be used to reduce the activity of an arbitrary protein, such as a peptide-degrading enzyme, or to reduce the expression of an arbitrary gene, such as a gene encoding the arbitrary protein.
  • ⁇ -Glu-Abu-producing yeast can be used for producing ⁇ -Glu-Abu, for example. That is, one embodiment of the method of the present invention includes culturing the yeast of the present invention (here, ⁇ -Glu-Abu-producing yeast) in a medium to produce and accumulate ⁇ -Glu-Abu in the medium, and A method for producing ⁇ -Glu-Abu, which comprises collecting ⁇ -Glu-Abu from a medium.
  • the medium to be used is not particularly limited as long as the yeast of the present invention can grow and ⁇ -Glu-Abu is produced and accumulated.
  • a normal medium used for yeast culture can be used.
  • Specific examples of the medium include, but are not limited to, an SD medium, an SG medium, and an SDTE medium.
  • a medium containing a carbon source, a nitrogen source, a phosphate source, a sulfur source, and other components selected from various organic components and inorganic components as necessary can be used. You may set suitably the kind and density
  • the carbon source is not particularly limited as long as the yeast of the present invention can be assimilated to produce ⁇ -Glu-Abu.
  • Specific examples of the carbon source include glucose, fructose, sucrose, lactose, galactose, xylose, arabinose, molasses, starch hydrolyzate, hydrolyzate of biomass, acetic acid, fumaric acid, citric acid, etc.
  • organic acids such as succinic acid and malic acid, alcohols such as glycerol, crude glycerol and ethanol, and fatty acids.
  • one type of carbon source may be used, or two or more types of carbon sources may be used in combination.
  • the nitrogen source examples include ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate, organic nitrogen sources such as peptone, yeast extract, meat extract, and soybean protein degradation product, ammonia, and urea.
  • ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate
  • organic nitrogen sources such as peptone, yeast extract, meat extract, and soybean protein degradation product, ammonia, and urea.
  • one kind of nitrogen source may be used, or two or more kinds of nitrogen sources may be used in combination.
  • the phosphoric acid source examples include phosphates such as potassium dihydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate, and phosphate polymers such as pyrophosphoric acid.
  • phosphates such as potassium dihydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate
  • phosphate polymers such as pyrophosphoric acid.
  • the phosphoric acid source one type of phosphoric acid source may be used, or two or more types of phosphoric acid sources may be used in combination.
  • the sulfur source include inorganic sulfur compounds such as sulfate, thiosulfate, and sulfite, and sulfur-containing amino acids such as cysteine, cystine, and glutathione.
  • the sulfur source one kind of sulfur source may be used, or two or more kinds of sulfur sources may be used in combination.
  • organic and inorganic components include, for example, inorganic salts such as sodium chloride and potassium chloride; trace metals such as iron, manganese, magnesium and calcium; vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6 and nicotine Examples include vitamins such as acid, nicotinamide, and vitamin B12; amino acids; nucleic acids; and organic components such as peptone, casamino acid, yeast extract, and soybean protein degradation products containing these.
  • inorganic salts such as sodium chloride and potassium chloride
  • trace metals such as iron, manganese, magnesium and calcium
  • vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6 and nicotine include vitamins such as acid, nicotinamide, and vitamin B12; amino acids; nucleic acids; and organic components such as peptone, casamino acid, yeast extract, and soybean protein degradation products containing these.
  • vitamins such as acid, nicotinamide, and vitamin B12
  • amino acids amino acids
  • nucleic acids amino acids
  • organic components such as peptone, casamino acid, yeast extract, and soybean
  • auxotrophic mutant strain that requires an amino acid or the like for growth
  • Abu may be supplemented to the medium.
  • Culture conditions are not particularly limited as long as the yeast of the present invention can grow and ⁇ -Glu-Abu is produced and accumulated.
  • the culture can be performed, for example, under normal conditions used for yeast culture.
  • the culture conditions may be appropriately set according to various conditions such as the type of yeast used.
  • Culturing can be performed aerobically, for example, by aeration culture or shaking culture using a liquid medium.
  • the culture temperature may be, for example, 25 to 35 ° C, more preferably 27 to 33 ° C, and further preferably 28 to 32 ° C.
  • the culture period may be, for example, 5 hours or more, 10 hours or more, or 15 hours or more, and may be 120 hours or less, 72 hours or less, or 48 hours or less.
  • the culture can be carried out by batch culture, fed-batch culture, continuous culture, or a combination thereof.
  • ⁇ -Glu-Abu accumulates in the medium by culturing the yeast of the present invention as described above.
  • ⁇ -Glu-Abu can be confirmed by a known method used for detection or identification of a compound. Examples of such a method include HPLC, LC / MS, LC-MS / MS, GC / MS, and NMR. These methods can be used in appropriate combination.
  • the recovered ⁇ -Glu-Abu can be recovered by a known method used for separation and purification of compounds. Examples of such a method include an ion exchange resin method, a membrane treatment method, a precipitation method, and a crystallization method. These methods can be used in appropriate combination.
  • the recovered ⁇ -Glu-Abu may be a free form, a salt thereof, or a mixture thereof.
  • the term “ ⁇ -Glu-Abu” may mean free ⁇ -Glu-Abu, a salt thereof, or a mixture thereof, unless otherwise specified.
  • Salt is not particularly limited as long as it can be taken orally.
  • specific examples of salts for acidic groups such as carboxyl groups include ammonium salts, salts with alkali metals such as sodium and potassium, salts with alkaline earth metals such as calcium and magnesium, aluminum salts, and zinc salts.
  • Salts with organic amines such as triethylamine, ethanolamine, morpholine, pyrrolidine, piperidine, piperazine and dicyclohexylamine, and salts with basic amino acids such as arginine and lysine.
  • a salt for a basic group such as an amino group specifically, a salt with an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, hydrobromic acid, acetic acid, citric acid, benzoic acid, Organics such as maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, succinic acid, tannic acid, butyric acid, hybenzic acid, pamoic acid, enanthic acid, decanoic acid, teocric acid, salicylic acid, lactic acid, oxalic acid, mandelic acid, malic acid, methylmalonic acid Examples thereof include salts with carboxylic acids and salts with organic sulfonic acids such as methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid and p-toluenesulfonic acid.
  • 1 type of salt may be used and 2 or more types of salts may be used in combination.
  • the recovered ⁇ -Glu-Abu may contain components other than ⁇ -Glu-Abu, such as yeast cells, medium components, moisture, and yeast metabolic byproducts.
  • the purity of the collected ⁇ -Glu-Abu is, for example, 30% (w / w) or higher, 50% (w / w) or higher, 70% (w / w) or higher, 80% (w / w) or higher, It may be 90% (w / w) or more, or 95% (w / w) or more.
  • ⁇ 2-2> Method for Producing Yeast Extract Containing ⁇ -Glu-Abu As described above, ⁇ -Glu-Abu accumulating yeast can be used, for example, for producing a yeast extract containing ⁇ -Glu-Abu. That is, another embodiment of the method of the present invention contains ⁇ -Glu-Abu, which comprises preparing a yeast extract using the yeast of the present invention (here, ⁇ -Glu-Abu accumulating yeast) as a raw material. This is a method for producing a yeast extract.
  • yeast extract of the present invention The yeast extract produced using the yeast of the present invention (here, ⁇ -Glu-Abu accumulation type yeast) as a raw material is also referred to as “yeast extract of the present invention”.
  • the yeast extract of the present invention can be produced in the same manner as a normal yeast extract except that the yeast of the present invention is used as a raw material.
  • the method for producing the yeast extract of the present invention will be described.
  • the yeast of the present invention is cultured in a medium.
  • the description of the medium and culture conditions in the method for producing ⁇ -Glu-Abu can be applied mutatis mutandis.
  • ⁇ -Glu-Abu accumulates in the yeast cells, and a yeast containing ⁇ -Glu-Abu is obtained.
  • yeast extract from the obtained yeast may be performed in the same manner as normal yeast extract preparation.
  • the yeast extract may be one obtained by treating a yeast cell extracted with hot water, or one obtained by digesting a yeast cell.
  • the obtained yeast extract may be concentrated as needed, and may be dried and made into a powder form.
  • a yeast extract containing ⁇ -Glu-Abu (a yeast extract of the present invention) is obtained.
  • ⁇ -Glu-Abu is preferably 0.1% by weight or more, more preferably 1.0% by weight or more, still more preferably 2.0% by weight or more, particularly preferably based on the total solid content in the yeast extract. It may be contained in an amount of 20% by weight or more.
  • Food / beverage products of this invention (gamma) -Glu-Abu and / or yeast extract obtained as mentioned above can be used for manufacture of food / beverage products. That is, this invention provides the manufacturing method of food / beverage products including adding (gamma) -Glu-Abu and / or yeast extract obtained by the method of this invention to food / beverage products or its raw material.
  • the food and drink manufactured in this way is also referred to as “the food and drink of the present invention”.
  • "kokumi” can be provided to food-drinks by addition of (gamma) -Glu-Abu and / or a yeast extract. Examples of the food and drink include alcoholic beverages, bread foods, and fermented food seasonings.
  • the food and drink of the present invention can be produced by the same method using the same raw materials as those of ordinary food and drink, except that ⁇ -Glu-Abu and / or yeast extract is added.
  • raw materials include rice, barley and corn starch for alcoholic beverages, flour, sugar, salt, butter, yeast for fermentation and the like for bread foods, and soybeans and wheat for fermented food seasonings.
  • Addition of ⁇ -Glu-Abu and / or yeast extract may be performed at any stage of the production process of food and drink. That is, ⁇ -Glu-Abu and / or yeast extract may be added to a raw material for food or drink, may be added to a food or drink in the middle of production, or may be added to a finished food or drink.
  • yeast extract or a concentrate thereof, or a dried product thereof can be used as a fermented food seasoning by itself.
  • the amount of ⁇ -Glu-Abu and / or yeast extract added is not particularly limited, and can be appropriately set according to various conditions such as the type of food and drink and the state of intake of the food and drink.
  • ⁇ -Glu-Abu and / or yeast extract is converted to the amount of ⁇ -Glu-Abu with respect to the food or drink or its raw material, for example, 1 ppm (w / w) or more, 100 ppm (w / w) More than 1% (w / w) may be added.
  • ⁇ -Glu-Abu and / or yeast extract is, for example, 100% (w / w) or less, 10% (w / w) in terms of the amount of ⁇ -Glu-Abu with respect to food or drink or its raw material w) or less, or 1% (w / w) or less may be added.
  • ⁇ Example 1 Construction of a GAP1 Gene Highly Expressed Strain
  • a general amino acid permease of amino acids on the extracellular excretion of ⁇ -Glu-Abu
  • yeast strains that highly express the wild type GAP1 gene and the cell membrane normal localization type GAP1 gene were constructed.
  • Saccharomyces cerevisiae AG1 ura3-strain JP 2012-213376 was used.
  • the AG1 ura3-strain is an enhanced expression strain of the ⁇ -glutamylcysteine synthase gene (GSH1) of the Saccharomycessiacerevisiae ⁇ Y006 strain (FERM BP-11299).
  • GSH1 ura3-strain lacks the URA3 gene and exhibits uracil requirement.
  • SEQ ID NO: 1 primer having an upstream sequence of BAT1 at the 5 ′ end (5′- GCCAGGCGGTTGATACTTTGTGCAGATTTCATACCGGCTGTCGCTATTATTACTGATGAATTGGCTCTTTTTGTTTAATCTTAACCCAACTGCACAGA -3 ′)
  • PCR was performed using the pUC19-URA3-pTDH3-URA3 plasmid (described in the above report of Sofyanovich et al.) To obtain a fragment containing the URA3 DNA.
  • PCR conditions were heat denaturation (94 ° C., 10 sec), annealing (60 ° C., 10 sec), extension (72 ° C., 4 ⁇ min), and 25 cycle.
  • AG1 ura3-strain was transformed with this DNA fragment and spread on an SD plate medium containing no uracil.
  • a strain in which the BAT1 promoter was replaced with pTDH3-URA3-pTDH3 was obtained from the grown transformant.
  • the SD medium preparation method is shown below.
  • the SD plate medium was prepared by adding 2% Bacto-agar to the SD medium.
  • SD medium composition D (+)-Glucose 20 g 10 x YNB 100 mL MilliQ water up to 1 L 1 L
  • the SD medium was prepared by mixing autoclaved glucose and filter sterilized YNB so as to have the above composition, and making up with MilliQ water autoclaved.
  • 10 x YNB was prepared as follows. 17 g of Difco Yeast Nitrogen Base w / o Amino Acids and Ammonium Sulfate and 50 g of ammonium sulfate were dissolved in 1 L of MilliQ water, adjusted to pH 5.2, and sterilized by filtration. Stored in a cool and dark place to prevent vitamin breakdown.
  • a strain from which the URA3 selection marker has been removed can be selected using a medium containing 5-FOA. Therefore, a strain in which the BAT1 promoter was replaced with pTDH3-URA3-pTDH3 was cultured overnight in SD medium supplemented with uracil, and an appropriate amount was applied to a 5-FOA plate medium. From the grown colonies, a strain in which URA3 was removed by homologous recombination between the two introduced TDH3 promoters and the BAT1 promoter was replaced with the TDH3 promoter (AG1 pTDH3-BAT1 ura3- strain) was obtained.
  • the 5-FOA plate medium was prepared as follows.
  • the primer of SEQ ID NO: 3 having an upstream sequence of CHA1 at the 5 'end (5'- GAGTACTAATCACCGCGAACGGAAACTAATGAGTCCTCTGCGCGGAGACATGATTCCGCATGGGCGGCTCCTGTTAAGCCTCTTAACCCAACTGCACAGA-3')
  • PCR was performed using the pUC19-URA3-pTDH3-URA3 plasmid as a template to obtain a DNA fragment having URA3 sandwiched between TDH3 promoters.
  • PCR conditions were heat denaturation (94 ° C., 10 sec), annealing (60 ° C., 10 sec), extension (72 ° C., 4 ⁇ min), and 25 cycle.
  • AG1 ⁇ ⁇ pTDH1-BAT1 ura3-strain was transformed with this DNA fragment and spread on an SD plate medium containing no uracil. From the grown transformant, a strain in which the CHA1 promoter was replaced with pTDH3-URA3-pTDH3 was obtained. Furthermore, the strain in which the CHA1 promoter was replaced with pTDH3-URA3-pTDH3 was cultured overnight in SD medium supplemented with uracil, and an appropriate amount was applied to a 5-FOA plate medium.
  • a strain (AG1URApTDH3-BAT1 pTDH3-CHA1 ura3-) in which URA3 was removed and the CHA1 promoter was replaced with the TDH3 promoter was obtained from the grown colonies by homologous recombination between the two introduced TDH3 promoters. .
  • this strain is referred to as M006Y ura3-strain.
  • M006Y ura3-strain exhibits uracil requirement.
  • the 1-copy plasmid for yeast uses the pUC19 (invitrogen) as the backbone to enable autonomous replication in yeast cells and the origin of budding yeast and centromeres. And the URA3 gene was cloned as a selection marker so that transformants could be selected.
  • ARS replication origin
  • SEQ ID NO: 7 having the KpnI restriction enzyme recognition sequence
  • SEQ ID NO: 8 having the EcoRI restriction enzyme recognition sequence
  • PCR was performed using the genomic DNA of (FERM BP-11299) as a template to obtain a DNA fragment having ARS.
  • PCR conditions were denaturation (94 ° C., 10 sec), annealing (60 ° C., 10 sec), extension (72 ° C., 4 min), and 25 cycles.
  • this DNA fragment was cloned into the KpnI-EcoRI site of pUC19-URA3 to obtain plasmid pUC19-URA3-ARS.
  • SEQ ID NO: 17 shows the ARS base sequence of Saccharomyces cerevisiae S288C.
  • centromere (2-3) Introduction of centromere (CEN)
  • the genomic DNA of wild type Saccharomyces cerevisiae Y006 strain (FERM BP-11299) as a template PCR was performed to obtain a DNA fragment having CEN.
  • PCR conditions were denaturation (94 ° C., 10 sec), annealing (60 ° C., 10 sec), extension (72 ° C., 4 min), and 25 cycles.
  • SEQ ID NO: 18 shows the CEN base sequence of Saccharomyces cerevisiae S288C.
  • a wild-type GAP1 gene high-expression plasmid was prepared by cloning the TDH3 promoter, a component high-expression promoter, into the YCp plasmid, and further cloning the wild-type GAP1 gene downstream of the promoter. did.
  • Non-patent Document 1 Preparation of cell membrane normal localization type GAP1 gene high expression plasmid Gap1 protein is ubiquitinated according to the amount of amino acids inside and outside the cell and is degraded in vacuoles.
  • the mutant Gap1 protein in which the 9th and 16th lysines are substituted with arginine does not have a ubiquitination site and therefore does not undergo degradation due to ubiquitination. Therefore, this mutant Gap1 protein is normally localized in the cell membrane without depending on the substrate concentration inside or outside the cell (Non-patent Document 2).
  • a mutant GAP1 gene encoding a mutant Gap1 protein in which lysine at positions 9 and 16 is substituted with arginine (hereinafter also referred to as “gap1K9,16R”) is a cell membrane normal localization type GAP1 gene high expression plasmid. ) High expression plasmid was prepared by the following procedure.
  • a primer represented by SEQ ID NO: 15 having a BamHI restriction enzyme recognition sequence and a GAP1 sequence modified so as to replace lysine at positions 9 and 16 with arginine and SEQ ID NO: 14 having a SphI restriction enzyme recognition sequence PCR was performed using the genomic DNA of wild-type Saccharomyces cerevisiae Y006 (FERM BP-11299) as a template to obtain a DNA fragment having a mutant GAP1 gene (gap1K9,16R). PCR conditions were denaturation (94 ° C., 10 sec), annealing (60 ° C., 10 sec), extension (72 ° C., 4 min), and 25 cycle.
  • SEQ ID NO: 21 shows the base sequence of the mutant GAP1 gene (gap1K9, 16R) that can be obtained using the primers of SEQ ID NOs: 14 and 15 when using the genomic DNA of Saccharomyces cerevisiae S288C as a template.
  • M006Y ura3-strain was transformed with the prepared YCp, YCp-GAP1, and YCp-gap1K9,16R and applied to an SD plate medium containing no uracil. From the grown transformants, M006Y YCp-GAP1 and M006Y YCp-gap1K9,16R strains that highly express the wild type GAP1 gene and the mutant GAP1 gene (gap1K9,16R), respectively, were obtained. Moreover, the M006Y YCp strain was obtained as a control strain.
  • Example 2 Analysis of extracellular ⁇ -Glu-Abu concentration of GAP1 gene highly expressing strain
  • biosynthesis of ⁇ -Glu-Abu was enhanced, and wild type GAP1 gene and mutant GAP1 gene
  • the extracellular ⁇ -Glu-Abu concentration of strains that highly express each of (gap1K9,16R) was measured, and the effect of Gap1 on the extracellular excretion of ⁇ -Glu-Abu was evaluated.
  • Example 1 (1) Cultivation and Sampling Each strain prepared in Example 1 was inoculated into SD medium in which 50 mL was placed in a 500 mL Sakaguchi flask, and cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm for 24 hours. .
  • the concentration of ⁇ -Glu-Abu in the supernatant was determined by derivatizing ⁇ -Glu-Abu in the supernatant with an AQC reagent according to a known method (Example 1 of WO2011 / 129462). It was measured by. Changes from the measurement conditions described in Example 1 of WO2011 / 129462 are as follows. Modification 1: 5 ⁇ M 3-methyl-His-d2 (labeled with a stable isotope) and 5 ⁇ M Gly-d2 (Sigma) as a 5 ⁇ M internal standard solution used for derivatization of the sample The standard solution is labeled with a stable isotope).
  • Gly-d2 was used as an internal standard during mass spectrometry of ⁇ -Glu-Abu.
  • Change point 2 During mass analysis of ⁇ -Glu-Abu, the selected ion in the first mass analyzer was 403.4, and the selected ion in the second mass analyzer was 171.1. When ⁇ -Glu-Abu was quantified, if a rare peak was observed in the sample, the selected ion in the second mass analyzer was changed to 145.2 or 104.1 for quantification.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • the Gap1 protein is ubiquitinated according to the amount of amino acids inside and outside the cell and degraded in vacuoles. Therefore, even if the wild-type GAP1 gene is highly expressed in a strain with enhanced ⁇ -Glu-Abu production pathway, it is presumed that the Gap1 protein is degraded without being localized in the cell membrane. Therefore, in order to achieve both enhancement of the production pathway of ⁇ -Glu-Abu and promotion of excretion, high expression of the cell membrane normally localized GAP1 gene is effective.
  • ⁇ Example 3 Construction of a high-yield strain of YGL114w gene and a disrupted strain of YGL114w gene
  • ⁇ -Glu-Abu was used in order to evaluate the effect of YGL114w protein on extracellular secretion of ⁇ -Glu-Abu.
  • yeast strain M006Y ura3-
  • a high expression strain of YGL114w gene and a disruption strain of YGL114w gene were constructed.
  • PCR was performed using the genomic DNA of FERM BP-11299) as a template to obtain a DNA fragment having the YGL114w gene. PCR conditions were denaturation (94 ° C., 10 sec), annealing (60 ° C., 10 sec), extension (72 ° C., 4 min), and 25 cycles.
  • M006Y ura3-strain was transformed with the prepared YCp-YGL114w and applied to an SD plate medium containing no uracil. From the grown transformant, M006Y YCp-YGL114w strain highly expressing the YGL114w gene was obtained.
  • M006Y ura3-strain was transformed with the obtained DNA fragment and applied to SD medium containing no uracil. From the grown transformant, M006Y YGL114w ⁇ strain lacking YGL114w gene was obtained.
  • Example 4 Analysis of intracellular ⁇ -Glu-Abu content of high expression strain of YGL114w gene and disrupted strain of YGL114w gene (1) Culture and sampling The strain prepared in Example 3 and the control strain (M006Y YCp strain) Each ase was inoculated into SD medium with 50 mL in a 500 mL Sakaguchi flask, and cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm for 24 hours.
  • ODunit cells contained in 1 mL of culture solution with an OD600 of 1 is defined as 1 ODunit.
  • the culture broth was collected, the supernatant was removed as much as possible by centrifugation, and the cells were collected. .
  • the cells were suspended in 45 mL of milliQ water.
  • the cells were collected again by centrifugation and resuspended in 45 mL of milliQ water. By repeating this operation three times in total, the medium components were completely removed from the cells.
  • the obtained washed cells were suspended in approximately 1.5 mL of milliQ water and heated at 70 ° C. for 10 minutes. In this step, the extract contained in the cells was extracted. Next, the fraction containing the extract and the bacterial cell residue were separated by centrifugation.
  • the ⁇ -Glu-Abu concentration in the sample was measured by the same method as in Example 2.
  • YGL114w protein was predicted to be a peptide transporter, but its actual function was unknown. From the above results, it was revealed that YGL114w protein is an extracellular excretion protein of ⁇ -Glu-Abu. Therefore, high expression of the YGL114w gene is effective for extracellular excretion of ⁇ -Glu-Abu.
  • the intracellular and extracellular localization of ⁇ -Glu-Abu in yeast can be controlled. Therefore, the present invention is useful for the production of ⁇ -Glu-Abu and the production of a yeast extract containing ⁇ -Glu-Abu.
  • SEQ ID NOs: 1 to 15 Primer SEQ ID NO: 16: Base sequence of URA3 gene of Saccharomyces cerevisiae S288C SEQ ID NO: 17: Base sequence of replication origin (ARS) of Saccharomyces cerevisiae S288C SEQ ID NO: 18: Base of centromere (CEN) of Saccharomyces cerevisiae S288C SEQ ID NO: 19: nucleotide sequence of wild-type GAP1 gene of Saccharomyces cerevisiae S288C SEQ ID NO: 20: amino acid sequence of wild-type Gap1 protein of Saccharomyces cerevisiae S288C SEQ ID NO: 21: base of mutant GAP1 gene (gap1K9, 16R) of Saccharomyces cerevisiae S288C SEQ ID NO: 22: Saccharomyces cerevisiae S288C CHA1 gene base sequence SEQ ID NO: 23:

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Abstract

γ-Glu-Abuの製造法およびγ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法を提供する。変異型GAP1遺伝子を保持するように改変された、且つ／又は、YGL114w遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大するように改変された、γ-Glu-Abu生産能を有する酵母を培地で培養してγ-Glu-Abuを該培地中に生成蓄積させること、および該培地よりγ-Glu-Abuを採取することにより、γ-Glu-Abuを製造する。また、YGL114w遺伝子にコードされるタンパク質の活性が低下するように改変された、γ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母を原料として用いて酵母エキスを調製することにより、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスを製造する。

Description

γ－Ｇｌｕ－Ａｂｕの製造法およびγ－Ｇｌｕ－Ａｂｕを含有する酵母エキスの製造法
　本発明は、酵母においてγ-Glu-Abuの細胞内外の局在を制御する方法およびその利用に関する。本発明は、特に、γ-Glu-Abuの製造法およびγ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法に関する。γ-Glu-Abuやそれを含有する酵母エキスは食品分野にて有用である。
　γ-Glu-Abuは、「コク味」付与作用を有するペプチドである。「コク味」とは、甘味(sweet taste)、塩味(salty taste)、酸味(sour taste)、苦味(bitter taste)、うま味(umami)の５基本味だけでは表すことのできない、厚み(thickness)、ひろがり(growth (mouthfulness))、持続性(continuity)、まとまり(harmony)等の基本味の周辺の味(marginal tastes)や風味（marginal flavor）をも増強した味覚をいう。
　γ-Glu-Abuは、γ－グルタミルシステイン合成酵素の作用により、Ｌ－グルタミン酸（L-Glu）およびα－アミノ酪酸（Abu）から生成する。また、Abuは、アミノ基転移酵素の作用により、α－ケト酪酸（α-KB）から生成する。よって、例えば、α－ケト酪酸合成酵素、アミノ基転移酵素、γ－グルタミルシステイン合成酵素等のγ-Glu-Abuの生合成に関与する酵素の活性を増強することにより、細胞内のγ-Glu-Abuの蓄積量を増大させることができる（特許文献１）。
　Gap1遺伝子は、アミノ酸全般の膜透過酵素（general amino acid permease）であるGap1タンパク質をコードする遺伝子である。Gap1タンパク質は、全ての天然アミノ酸および多くのアミノ酸アナログの輸送能を有する。Gap1タンパク質は、細胞内外のアミノ酸量に応じてその局在が制御されることが知られている（非特許文献１）。すなわち、Gap1タンパク質は、アミノ酸がほとんど存在しない場合には、細胞膜に局在し、アミノ酸が多量に存在する場合には、ユビキチン化され、液胞で分解される。一方、第９位および第１６位のリジンをアルギニンに置換した変異型Gap1タンパク質は、ユビキチン化部位を持たないため、ユビキチン化による分解を受けない。そのためこの変異型Gap1タンパク質は、細胞内外のアミノ酸量に依存せず、細胞膜に常局在する（非特許文献２）。
　YGL114W遺伝子は、ペプチドトランスポーターと予測されるタンパク質をコードする遺伝子である。
　しかしながら、γ-Glu-Abuの取り込みおよび／または排出に関わるトランスポーターは知られていない。
WO2012/046731
Cain NE, Kaiser CA., Mol. Biol. Cell., 2011, Jun 1; 22(11): 1919-29. Soetens O, De Craene JO, Andre B., J. Biol. Chem., 2001, Nov 23; 276(47): 43949-57.
　本発明は、酵母においてγ-Glu-Abuの細胞内外の局在を制御する新規な技術を開発し、効率的なγ-Glu-Abuの製造法およびγ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、γ-Glu-Abuの生合成が強化された酵母において細胞膜常局在型GAP1遺伝子を発現させることにより、細胞外のγ-Glu-Abu蓄積量が向上することを見出した。また、本発明者は、γ-Glu-Abuの生合成が強化された酵母においてYGL114w遺伝子を高発現または破壊することにより、細胞内のγ-Glu-Abu濃度が、それぞれ低下または増大することを見出した。これらの知見に基づき、本発明者は、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
　γ-Glu-Abuの製造法であって、
　γ-Glu-Abu生産能を有する酵母を培地で培養してγ-Glu-Abuを該培地中に生成蓄積させること、および
　該培地よりγ-Glu-Abuを採取すること、を含み、
　前記酵母が、下記（１）～（２）のいずれか又は両方の性質を有することを特徴とする、方法：
（１）変異型GAP1遺伝子を保持するように改変されている；
（２）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増大するように改変されている。
［２］
　前記変異型GAP1遺伝子が、下記（Ａ）および（Ｂ）の変異を有する遺伝子である、［１］に記載の方法：
（Ａ）野生型Gap1タンパク質の９位のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換される変異；
（Ｂ）野生型Gap1タンパク質の１６位のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換される変異。
［３］
　前記９位および１６位のリジン残基がアルギニン残基に置換されている、［２］に記載の方法。
［４］
　前記野生型Gap1タンパク質が、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるタンパク質である、［２］または［３］に記載の方法：
（ａ）配列番号２０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質。
［５］
　YGL114w遺伝子の発現を上昇させることにより、YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増大した、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
　前記YGL114w遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、及び／又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによって上昇した、［５］に記載の方法。
［７］
　γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法であって、
　γ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母を原料として用いて酵母エキスを調製することを含み、
　前記酵母が、下記（３）の性質を有することを特徴とする、方法：
（３）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下するように改変されている。
［８］
　YGL114w遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下した、［７］に記載の方法。
［９］
　前記YGL114w遺伝子が、下記（Ａ）～（Ｅ）からなる群より選択されるＤＮＡである、［１］～［８］のいずれかに記載の方法：
（Ａ）配列番号３１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号３１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、酵母において活性を増大させた際に酵母のγ-Glu-Abu生産量を非改変株と比べて向上させる性質、および／または、酵母において活性を低下させた際に酵母のγ-Glu-Abu蓄積量を非改変株と比べて向上させる性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号３１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、酵母において活性を増大させた際に酵母のγ-Glu-Abu生産量を非改変株と比べて向上させる性質、および／または、酵母において活性を低下させた際に酵母のγ-Glu-Abu蓄積量を非改変株と比べて向上させる性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号３０に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号３０に示す塩基配列の相補配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母において活性を増大させた際に酵母のγ-Glu-Abu生産量を非改変株と比べて向上させる性質、および／または、酵母において活性を低下させた際に酵母のγ-Glu-Abu蓄積量を非改変株と比べて向上させる性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［１０］
　前記酵母が、さらに、γ－グルタミルシステイン合成酵素、α－ケト酪酸合成酵素、およびアミノ基転移酵素からなる群より選択される１種またはそれ以上の酵素の活性が増大するように改変されている、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
　前記α－ケト酪酸合成酵素が、CHA1遺伝子によってコードされる酵素である、［１０］に記載の方法。
［１２］
　前記アミノ基転移酵素が、BAT1遺伝子によってコードされる酵素である、［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］
　前記酵母が、サッカロミセス属酵母またはキャンディダ属酵母である、［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
　前記酵母が、サッカロミセス・セレビシエまたはキャンディダ・ユティリスである、［１３］に記載の方法。
［１５］
　下記（１）～（４）のいずれかの性質を有し、且つ、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母：
（１）変異型GAP1遺伝子を保持するように改変されている；
（２）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増大するように改変されている；
（３）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下するように改変されている；
（４）上記（１）と（２）の性質の組み合わせ。
［１６］
　さらに、γ－グルタミルシステイン合成酵素、α－ケト酪酸合成酵素、およびアミノ基転移酵素からなる群より選択される１種またはそれ以上の酵素の活性が増大するように改変されている、［１５］に記載の酵母。
野生型GAP1遺伝子および細胞膜常局在型GAP1遺伝子の高発現がγ-Glu-Abu生産に与える影響を示す図。縦軸は培養上清中のγ-Glu-Abu濃度を示す。ＡはOD600 = 1.8時点、ＢはOD600 = 2.5時点でのγ-Glu-Abu濃度を示す。 YGL114w遺伝子の高発現および破壊がγ-Glu-Abu蓄積に与える影響を示す図。縦軸は菌体抽出液中のγ-Glu-Abu濃度を示す。ＡはYGL114w遺伝子の高発現の影響、ＢはYGL114w遺伝子の破壊の影響を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の酵母
＜１－１＞本発明の酵母
　本発明の酵母は、γ-Glu-Abuの細胞内外における局在が制御された酵母である。本発明において、γ-Glu-Abuの局在制御は、GAP1遺伝子および／またはYGL114w遺伝子を利用して行うことができる。なお、本発明において、AbuおよびGluはＬ体である。すなわち、「γ-Glu-Abu」とは、Ｌ－γ－グルタミル－Ｌ－２－アミノ酪酸を意味する。
　本発明の酵母は、具体的には、下記（１）～（４）のいずれかの性質を有する。当該性質を、「本発明の性質」ともいう。
（１）変異型GAP1遺伝子を保持するように改変されている；
（２）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増大するように改変されている；
（３）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下するように改変されている；
（４）上記（１）と（２）の性質の組み合わせ。
　本発明の性質は、γ-Glu-Abuの局在制御の態様に応じて適宜選択できる。
　例えば、酵母を、変異型GAP1遺伝子を保持するように改変することにより、および／または、YGL114w遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大するように改変することにより、γ-Glu-Abuの細胞外への生産を向上させることができる。すなわち、本発明の酵母の一態様は、変異型GAP1遺伝子を保持するように改変された、且つ／又は、YGL114w遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大するように改変された、γ-Glu-Abu生産能を有する酵母（以下、「γ-Glu-Abu生産型酵母」ともいう）であってよい。「YGL114w遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、YGL114w遺伝子の発現が上昇することであってもよい。γ-Glu-Abu生産型酵母は、例えば、γ-Glu-Abuの製造に利用できる。
　また、例えば、酵母を、YGL114w遺伝子にコードされるタンパク質の活性が低下するように改変することにより、γ-Glu-Abuの細胞内への蓄積を向上させることができる。すなわち、本発明の酵母の別の態様は、YGL114w遺伝子にコードされるタンパク質の活性が低下するように改変された、γ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母（以下、「γ-Glu-Abu蓄積型酵母」ともいう）であってよい。「YGL114w遺伝子にコードされるタンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、YGL114w遺伝子の発現が低下することであってもよく、YGL114w遺伝子が破壊されることであってもよい。γ-Glu-Abu蓄積型酵母は、例えば、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造に利用できる。
　すなわち、本発明の酵母は、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を有していてよい。本発明の酵母は、本来的にγ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を有していてもよく、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を有するように改変されていてもよい。γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母は、例えば、後述する酵母にγ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を付与することにより、または、後述する酵母のγ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を増強することにより、取得できる。γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を付与または増強する方法については後述する。
　本発明の酵母は、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母を、本発明の性質を有するように改変することによって得ることができる。また、本発明の酵母は、本発明の性質を有するように酵母を改変した後に、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を付与することによっても得ることができる。なお、本発明の酵母は、本発明の性質を有するように改変されたことにより、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を獲得したものであってもよい。本発明において、本発明の酵母を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
　「γ-Glu-Abu生産能」とは、本発明の酵母を培地中で培養したときに、γ-Glu-Abuを、検出できる程度に培地中に生成および蓄積する能力をいう。本発明の酵母は、非改変株よりも多い量のγ-Glu-Abuを培地中に蓄積することができる酵母であってよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、本発明の酵母は、1 mg/L以上、5 mg/L以上、10 mg/L以上、または15 mg/L以上の量でγ-Glu-Abuを培地中に蓄積することができる酵母であってよい。
　「γ-Glu-Abu蓄積能」とは、本発明の酵母を培地中で培養したときに、γ-Glu-Abuを、検出できる程度に細胞内に生成および蓄積する能力をいう。本発明の酵母は、非改変株よりも多い量のγ-Glu-Abuを細胞内に蓄積することができる酵母であってよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、本発明の酵母は、0.4μmol/g-DCW以上、1μmol/g-DCW以上、2μmol/g-DCW以上、3μmol/g-DCW以上、5μmol/g-DCW以上、または10μmol/g-DCW以上の量でγ-Glu-Abuを細胞内に蓄積することができる酵母であってよい。
　本発明の酵母は、出芽酵母であってもよく、分裂酵母であってもよい。出芽酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロミセス属、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）等のキャンディダ属、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等のピヒア属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等のハンゼヌラ属等に属する酵母を例示することができる。分裂酵母としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロミセス属等に属する酵母を例示することができる。中でも、酵母エキスの生産によく用いられているサッカロミセス・セレビシエやキャンディダ・ユティリスが好ましい。本発明の酵母は、１倍体でもよいし、２倍性またはそれ以上の倍数性を有するものであってもよい。
　サッカロミセス・セレビシエとしては、例えば、サッカロミセス・セレビシエY006株（FERM BP-11299）が挙げられる。Y006株は、2010年8月18日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  120号室）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11299が付与されている。
　また、サッカロミセス・セレビシエとしては、例えば、サッカロミセス・セレビシエBY4743株（ATCC 201390）やサッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）も挙げられる。また、キャンディダ・ユティリスとしては、例えば、キャンディダ・ユティリスATCC 22023株が挙げられる。これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より入手できる。すなわち、各菌株に対応する登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
＜１－２＞本発明において利用される遺伝子
＜１－２－１＞GAP1遺伝子およびGap1タンパク質
　以下、GAP1遺伝子およびGap1タンパク質について説明する。GAP1遺伝子は、アミノ酸全般の膜透過酵素（general amino acid permease）をコードする遺伝子である。すなわち、同遺伝子にコードされるGap1タンパク質は、細胞膜を通してアミノ酸および／またはペプチドを細胞内から細胞外へ輸送する活性を有する。同活性を「アミノ酸トランスポーター活性」ともいう。Gap1タンパク質は、具体的には、例えば、γ-Glu-Abuを細胞外に排出する活性を有していてもよい。
　本発明において、後述する「特定の変異」を有するGAP1遺伝子を変異型GAP1遺伝子、それによりコードされるタンパク質を変異型Gap1タンパク質ともいう。なお、変異型Gap1タンパク質は、細胞膜に常局在する。よって、変異型GAP1遺伝子を細胞膜常局在型GAP1遺伝子、変異型Gap1タンパク質を細胞膜常局在型Gap1タンパク質ともいう。また、本発明において、後述する「特定の変異」を有さないGAP1遺伝子を野生型GAP1遺伝子、それによりコードされるタンパク質を野生型Gap1タンパク質ともいう。なお、Gap1タンパク質にあっては、GAP1遺伝子における「特定の変異」により引き起こされるアミノ酸配列の変化を「特定の変異」ともいう。
　野生型GAP1遺伝子としては、例えば、酵母のGAP1遺伝子が挙げられる。酵母のGAP1遺伝子として、具体的には、例えば、サッカロミセス・セレビシエのGAP1遺伝子が挙げられる。
　サッカロミセス・セレビシエのGAP1遺伝子の塩基配列は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。また、サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のGAP1遺伝子は、NCBIデータベースにGenBank accession NC_001143として登録されている染色体XIの配列中、515063～516871の配列に相当する。また、サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のGap1タンパク質は、GenBank accession NP_012965として登録されている。サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のGAP1遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするGap1タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１９および２０に示す。
　また、野生型Gap1タンパク質は、後述する「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記Gap1タンパク質のバリアントであってもよい。なお、そのようなバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントとしては、例えば、上記Gap1タンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、元のタンパク質の活性に対応する活性を有することをいう。すなわち、野生型Gap1タンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、アミノ酸トランスポーター活性を有することをいう。
　また、野生型GAP1遺伝子は、上記Gap1タンパク質やその保存的バリアントをコードする限り、上記GAP1遺伝子のバリアントであってもよい。
　上記Gap1タンパク質のホモログをコードする遺伝子は、例えば、上記の酵母のGAP1遺伝子（配列番号１９）を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、上記Gap1タンパク質のホモログをコードする遺伝子は、例えば、酵母の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
　野生型Gap1タンパク質は、後述する「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても良い。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
　さらに、野生型Gap1タンパク質は、後述する「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
　また、野生型GAP1遺伝子は、後述する「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。
　上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
　また、野生型GAP1遺伝子は、上記のような野生型Gap1タンパク質をコードする限り、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、野生型GAP1遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
　なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、γ-Glu-Abuの生合成に関与する酵素等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
　変異型Gap1タンパク質は、上述したような野生型Gap1タンパク質のアミノ酸配列において、後述する「特定の変異」を有する。
　すなわち、言い換えると、変異型Gap1タンパク質は、後述する「特定の変異」を有する以外は、上述した酵母のGap1タンパク質やその保存的バリアントであってよい。
　具体的には、例えば、変異型Gap1タンパク質は、後述する「特定の変異」を有する以外は、配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
　また、具体的には、例えば、変異型Gap1タンパク質は、後述する「特定の変異」を有する以外は、配列番号２０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
　また、具体的には、例えば、変異型Gap1タンパク質は、後述する「特定の変異」を有する以外は、配列番号２０に示すアミノ酸配列に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
　また、言い換えると、変異型Gap1タンパク質は、上述した酵母のGap1タンパク質において、後述する「特定の変異」を有し、且つ、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに保存的変異を含むバリアントであってよい。
　具体的には、例えば、変異型Gap1タンパク質は、配列番号２０に示すアミノ酸配列において、後述する「特定の変異」を有し、且つ、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
　変異型GAP1遺伝子は、上記のような変異型Gap1タンパク質をコードする限り、特に制限されない。
　以下、変異型GAP1遺伝子が有する「特定の変異」について説明する。
　「特定の変異」は、コードされるGap1タンパク質が細胞膜常局在型となる変異である。「特定の変異」としては、下記（Ａ）および（Ｂ）の組み合わせが挙げられる：
（Ａ）野生型Gap1タンパク質の９位のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換される変異；
（Ｂ）野生型Gap1タンパク質の１６位のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換される変異。
　「他のアミノ酸」の種類は、リジン以外であれば特に制限されない。リジン以外のアミノ酸としては、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）が挙げられる。９位のリジン残基は、例えば、アルギニン残基に置換されるのが好ましい。１６位のリジン残基は、例えば、アルギニン残基に置換されるのが好ましい。
　本発明において、「野生型Gap1タンパク質のＸ位のアミノ酸残基」とは、特記しない限り、配列番号２０におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味する。なお、アミノ酸配列における「Ｘ位」とは、同アミノ酸配列のN末端からＸ番目を意味し、N末端のアミノ酸残基が１位のアミノ酸残基である。すなわち、上記アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、または付加などによってその位置は前後することがある。例えば、「野生型Gap1タンパク質の９位のリジン残基」とは、配列番号２０における９位のリジン残基に相当するアミノ酸残基を意味し、９位よりもN末端側の１アミノ酸残基が欠失している場合は、N末端から８番目のアミノ酸残基が「野生型Gap1タンパク質の９位のリジン残基」であるものとする。また、９位よりもN末端側に１アミノ酸残基挿入されている場合は、N末端から１０番目のアミノ酸残基が「野生型Gap1タンパク質の９位のリジン残基」であるものとする。
　任意のアミノ酸配列において、どのアミノ酸残基が「配列番号２０におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」であるかは、当該任意のアミノ酸配列と配列番号２０のアミノ酸配列とアライメントを行うことにより決定できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
　変異型GAP1遺伝子は、野生型GAP1遺伝子を上述の「特定の変異」を有するよう改変することにより取得できる。ＤＮＡの改変は公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、ＤＮＡの目的部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、変異型GAP1遺伝子は、化学合成によっても取得できる。
　以下、変異型GAP1遺伝子を有するように酵母を改変する手法について説明する。
　変異型GAP1遺伝子を有するように酵母を改変することは、変異型GAP1遺伝子を酵母に導入することにより達成できる。また、変異型GAP1遺伝子を有するように酵母を改変することは、自然変異や変異原処理により酵母が有する野生型GAP1遺伝子に変異を導入することによっても達成できる。
　変異型GAP1遺伝子を酵母に導入する手法は特に制限されない。変異型GAP1遺伝子の導入は、後述する遺伝子のコピー数を増加させる手法と同様に行うことができる。本発明の酵母において、変異型GAP1遺伝子は、同酵母で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。本発明の酵母において、変異型GAP1遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律増殖するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。使用可能なプロモーターやベクターについては、後述する遺伝子のコピー数を増加させる手法において例示する。本発明の酵母は、変異型GAP1遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピー有していてもよい。本発明の酵母は、１種類の変異型GAP1遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類の変異型GAP1遺伝子を有していてもよい。
　本発明の酵母が２倍体以上の倍数性を有する場合であって、変異型GAP1遺伝子が染色体上に組み込まれる場合、本発明の酵母は、変異型GAP1遺伝子が組み込まれた染色体と変異型GAP1遺伝子を含まない染色体とをヘテロで有していてもよく、変異型GAP1遺伝子が組み込まれた染色体をホモで有していてもよい。
　本発明の酵母は、野生型GAP1遺伝子を有していてもよく、有していなくともよい。野生型GAP1遺伝子を有さない酵母は、染色体上の野生型GAP1遺伝子を破壊することにより取得できる。野生型GAP1遺伝子の破壊は、例えば、後述する遺伝子を破壊する手法により行うことができる。具体的には、例えば、野生型GAP1遺伝子のコード領域の一部または全部を欠損させることにより野生型GAP1遺伝子を破壊できる。また、染色体上の野生型GAP1遺伝子を変異型GAP1遺伝子で置換することにより、野生型GAP1遺伝子を有さず、且つ、変異型GAP1遺伝子を有するように改変された酵母を取得できる。
＜１－２－２＞YGL114W遺伝子およびYGL114Wタンパク質
　以下、YGL114W遺伝子およびYGL114Wタンパク質について説明する。YGL114W遺伝子は、ペプチドトランスポーターと予測されるタンパク質をコードする遺伝子である。すなわち、同遺伝子にコードされるYGL114Wタンパク質は、ペプチドトランスポーター活性を有し得る。YGL114Wタンパク質は、具体的には、例えば、γ-Glu-Abuを細胞外に排出する活性を有していてもよい。
　また、YGL114Wタンパク質は、酵母において活性を増大させた際に酵母のγ-Glu-Abu生産量を非改変株と比べて向上させる性質、および／または、酵母において活性を低下させた際に酵母のγ-Glu-Abu蓄積量を非改変株と比べて向上させる性質を有する。同性質を「YGL114Wタンパク質の性質」ともいう。
　YGL114W遺伝子としては、例えば、酵母のYGL114W遺伝子が挙げられる。酵母のYGL114W遺伝子として、具体的には、例えば、サッカロミセス・セレビシエのYGL114W遺伝子が挙げられる。
　サッカロミセス・セレビシエのYGL114W遺伝子の塩基配列は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。また、サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のYGL114W遺伝子は、NCBIデータベースにGenBank accession NC_001139として登録されている染色体VIIの配列中、293460～295637の配列に相当する。また、サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のYGL114Wタンパク質は、GenBank accession NP_011401として登録されている。サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のYGL114W遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするYGL114Wタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３０および３１に示す。
　YGL114W遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。YGL114W遺伝子やYGL114Wタンパク質のバリアントについては、先述した野生型GAP1遺伝子および野生型Gap1タンパク質の保存的バリアントに関する記載を準用できる。YGL114Wタンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、上述したYGL114Wタンパク質の性質を有することをいう。また、YGL114Wタンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、γ-Glu-Abuを細胞外に排出する活性を有することであってもよい。
　タンパク質のバリアントが、酵母において活性を増大させた際に酵母のγ-Glu-Abu生産量を非改変株と比べて向上させる性質を有するか否かは、例えば、酵母に同バリアントをコードする遺伝子を導入する等の手段により酵母における同バリアントの活性を増大させ、γ-Glu-Abu生産量が向上するか否かを確認することにより、確認できる。
　タンパク質のバリアントが、酵母において活性を低下させた際に酵母のγ-Glu-Abu蓄積量を非改変株と比べて向上させる性質を有するか否かは、例えば、酵母において同バリアントをコードする遺伝子を破壊する等の手段により酵母における同バリアントの活性を低下させ、γ-Glu-Abu蓄積量が向上するか否かを確認することにより、確認できる。
＜１－３＞その他の改変
　本発明の酵母は、さらに、他の改変を有していてもよい。例えば、本発明の酵母は、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能が付与または増強されるよう、改変されていてよい。γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能は、例えば、γ-Glu-Abuの生合成に関与する酵素の活性を増大させること、γ－グルタミルシステイン合成酵素の活性を低下させること、ペプチド分解酵素の活性を低下させること、またはそれらの組み合わせにより、付与または増強できる。本発明において、本発明の酵母を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
　すなわち、本発明の酵母は、細胞内のγ-Glu-Abuの生合成に関与する酵素の活性が増大するよう、改変されていてよい。γ-Glu-Abuの生合成に関与する酵素としては、α－ケト酪酸合成酵素、アミノ基転移酵素、γ－グルタミルシステイン合成酵素（gamma glutamylcysteine synthetase）が挙げられる。本発明においては、γ-Glu-Abuの生合成に関与する１種の酵素の活性を増大させてもよく、γ-Glu-Abuの生合成に関与する２種またはそれ以上の酵素の活性を増大させてもよい。
　ここでいう「α－ケト酪酸合成酵素」とは、Ｌ－スレオニンからα－ケト酪酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。α－ケト酪酸合成酵素としては、例えば、セリン／スレオニンデアミナーゼ（serine/threonine deaminase）やスレオニンデアミナーゼ（threonine deaminase）が挙げられる。セリン／スレオニンデアミナーゼをコードする遺伝子としては、CHA1遺伝子が挙げられる。スレオニンデアミナーゼをコードする遺伝子としては、ILV1遺伝子が挙げられる。これらの中では、例えば、CHA1遺伝子にコードされるセリン／スレオニンデアミナーゼの活性を増大させるのが好ましい。本発明においては、１種のα－ケト酪酸合成酵素の活性を増大させてもよく、２種またはそれ以上のα－ケト酪酸合成酵素の活性を増大させてもよい。
　サッカロマイセス・セレビシエのCHA1遺伝子（システマティックネーム：YCL064C）およびILV1遺伝子（システマティックネーム：YER086W）の塩基配列は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のCHA1遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするCha1タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２２および２３に示す。サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のILV1遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするIlv1タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２４および２５に示す。
　ここでいう「アミノ基転移酵素」とは、アミノ基転移反応により、α－ケト酪酸からAbuを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。アミノ基転移酵素としては、例えば、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（alanine:glyoxylate aminotransferase）、分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（branched-chain amino acid transaminase）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（aspartate amino transferase）、γ－アミノ酪酸トランスアミナーゼ（gamma-aminobutyrate transaminase）が挙げられる。アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、AGX1遺伝子が挙げられる。分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子としては、BAT1およびBAT2遺伝子が挙げられる。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、AAT1およびAAT2遺伝子が挙げられる。γ－アミノ酪酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子としては、UGA1遺伝子が挙げられる。これらの中では、例えば、BAT1にコードされる分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼの活性を増大させるのが好ましい。本発明においては、１種のアミノ基転移酵素の活性を増大させてもよく、２種またはそれ以上のアミノ基転移酵素の活性を増大させてもよい。
　サッカロマイセス・セレビシエのAGX1遺伝子（システマティックネーム：YFL030W）、BAT1遺伝子（システマティックネーム：YHR208W）、BAT2遺伝子（システマティックネーム：YJR148W）、AAT1遺伝子（システマティックネーム：YKL106W）、AAT2遺伝子（システマティックネーム：YLR027C）、およびUGA1遺伝子（システマティックネーム：YGR019W）の塩基配列は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のBAT1遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするBat1タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２６および２７に示す。
　ここでいう「γ－グルタミルシステイン合成酵素」とは、L-GluおよびAbuを基質として認識し、γ-Glu-Abuを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。γ－グルタミルシステイン合成酵素は、L-GluおよびL-Cysを基質として認識し、γ－グルタミルシステイン（γ-Glu-Cys）を生成する反応を触媒する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。γ－グルタミルシステイン合成酵素の活性の増強については、例えば、米国特許第7553638号、大竹康之ら（バイオサイエンスとインダストリー、第50巻第10号、第989～994頁、1992年）等に開示されている。
　また、本発明の酵母は、細胞内のグルタチオン合成酵素（glutathione synthase）の活性が低下するよう、改変されていてよい。ここでいう「グルタチオン合成酵素」とは、γ-Glu-AbuおよびGlyを基質として認識し、γ-Glu-Abu-Glyを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。グルタチオン合成酵素は、γ-Glu-CysおよびGlyを基質として認識し、グルタチオン（γ-Glu-Cys-Gly）を生成する反応を触媒する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
　γ－グルタミルシステイン合成酵素をコードする遺伝子としては、GSH1遺伝子が挙げられる。グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子としては、GSH2遺伝子が挙げられる。サッカロミセス・セレビシエのGSH1遺伝子およびGSH2遺伝子の塩基配列は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。また、キャンディダ・ユティリスのGSH1遺伝子およびGSH2遺伝子の塩基配列は、米国特許第7553638号に開示されている。サッカロミセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のGSH1遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするGsh1タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２８および２９に示す。
　また、本発明の酵母は、細胞内のペプチド分解酵素の活性が低下するよう、改変されていてよい。ここでいう「ペプチド分解酵素」とは、ペプチドのペプチド結合を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。ペプチド分解酵素としては、例えば、DUG1遺伝子、DUG2遺伝子、DUG3遺伝子、およびECM38遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられる（特開2012-213376）。なお、DUG1遺伝子、DUG2遺伝子、およびDUG3遺伝子にそれぞれコードされるDug1p、Dug2p、およびDug3pは、DUG複合体を形成して機能する。DUG複合体によるグルタチオンの分解には、Dug1p、Dug2p、およびDug3pの全てが必要であることが知られており（Ganguli D. et al., Genetics. 2007 Mar; 175(3): 1137-51）、Dug1p、Dug2p、およびDug3pから選択される１またはそれ以上のタンパク質の活性を低下させることでDUG複合体の活性を低下させることができる。これらの内、少なくともDug2pの活性を低下させるのが好ましい。本発明においては、１種のペプチド分解酵素の活性を低下させてもよく、２種またはそれ以上のペプチド分解酵素の活性を低下させてもよい。サッカロミセス・セレビシエのDUG1遺伝子、DUG2遺伝子、DUG3遺伝子、およびECM38遺伝子の塩基配列は、Saccharomyces Genome Database（http://www.yeastgenome.org/）に開示されている。
　なお、これら「他の改変」に使用される遺伝子も、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、先述した野生型GAP1遺伝子および野生型Gap1タンパク質の保存的バリアントに関する記載を準用できる。なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合は、各サブユニットについての「元の機能が維持されている」とは、各サブユニットが残りのサブユニットと複合体を形成し、当該複合体が対応する活性を有することであってよい。すなわち、例えば、DUG複合体の各サブユニットについての「元の機能が維持されている」とは、各サブユニットが残りのサブユニットと複合体を形成し、当該複合体がペプチド分解活性を有することであってよい。
　上述したような各種改変は、突然変異処理や遺伝子工学により実施できる。サッカロマイセス・セレビシエの遺伝子工学の具体的手法は、多くの書籍に記されている。また、キャンディダ・ユティリスについても、近年各種の方法が報告されており、それらを用いてよい。例えば、ケミカルエンジニアリング1999年6月号（23p-28p、三沢典彦）、FEMS Microbiology Letters（Luis Rodriguez et al., 165 (1998) 335-340）、WO98/07873、特開平8-173170、WO95/32289、Journal of Bacteriology（KEIJI KONDO et al., Vol.177 No.24 (1995) 7171-7177）、WO98/14600、特開2006-75122、特開2006-75123、特開2007-089441、特開2006-101867などの先行文献にその具体的な手法が記されているので適宜参考にすることができる。
＜１－４＞タンパク質の活性を増大させる手法
　以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
　「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野生株や親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。また、「タンパク質の活性が増大する」とは、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することを含む。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、酵母が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。
　タンパク質の活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその酵素活性が測定できる程度に生産されていてよい。
　タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成される。「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株と比較して増大することを意味する。「遺伝子の発現が上昇する」とは、具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が増大すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が増大することを意味してよい。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。
　遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
　遺伝子のコピー数の増加は、宿主微生物の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体中に多数のコピーが存在する配列としては、特有の短い繰り返し配列からなる自律複製配列（ARS）や、約150コピー存在するrDNA配列が挙げられる。ARSを含むプラスミドを用いて酵母の形質転換を行った例が、国際公開95/32289号パンフレットに記載されている。また、トランスポゾンに遺伝子を組み込み、それを染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入するよう転移させてもよい。
　染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
　また、遺伝子のコピー数の増加は、標的遺伝子を含むベクターを宿主微生物に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主微生物を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。酵母細胞内で機能するベクターとしては、例えば、CEN4の複製開始点を持つプラスミドや2μm DNAの複製開始点を持つマルチコピー型プラスミドが挙げられる。酵母細胞内で機能するベクターとして、具体的には、例えば、pAUR123（タカラバイオ社製）やpYES2（インビトロジェン社）が挙げられる。
　遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に本発明の酵母に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の酵母で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターは、利用するベクターにもともと搭載されているプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
　また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の酵母に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、２またはそれ以上の酵素をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一の酵素を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
　導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい。
　なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が目的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。
　また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、例えば、発現調節配列の改変により達成できる。「発現調節配列」とは、プロモーター等の、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。具体的には、遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターである、PGK1、PDC1、TDH3、TEF1、HXT7、ADH1等の遺伝子のプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。
　遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。すなわち、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
　また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
　上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
　また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の低減および解除も含まれる。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ－メチル－Ｎ'－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
　本発明の酵母が２倍体以上の倍数性を有する場合であって、染色体の改変によりタンパク質の活性を増大させる場合には、本発明の酵母は、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、タンパク質の活性が増大するように改変された染色体と野生型染色体とをヘテロで有していてもよく、タンパク質の活性が増大するように改変された染色体をホモで有していてもよい。
　酵母の形質転換法としては、プロトプラスト法、ＫＵ法（H.Ito et al., J. Bateriol., 153-163 (1983)）、ＫＵＲ法（発酵と工業 vol.43, p.630-637 (1985)）、エレクトロポレーション法（Luis et al., FEMS Micro biology Letters 165 (1998) 335-340）、キャリアＤＮＡを用いる方法（Gietz R.D. and Schiestl R.H., Methods Mol.Cell. Biol. 5:255-269 (1995)）等、通常酵母の形質転換に用いられる方法を採用することができる。また、酵母の胞子形成、１倍体酵母の分離、等の操作については、「化学と生物 実験ライン３１ 酵母の実験技術」、初版、廣川書店；「バイオマニュアルシリーズ１０ 酵母による遺伝子実験法」初版、羊土社等に記載されている。
　タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
　タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
　遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
　タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
　上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、任意のタンパク質、例えばγ-Glu-Abuの生合成に関与する酵素、の活性増強や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現増強に利用できる。
＜１－５＞タンパク質の活性を低下させる手法
　以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
　「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株と比較して減少することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換してもよい。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプロモーターを意味する。より弱いプロモーターとしては、例えば、各種誘導型のプロモーターを利用することができる。すなわち、誘導型のプロモーターは、誘導物質の非存在下で、より弱いプロモーターとして機能し得る。誘導型のプロモーターとしては、例えば、ガラクトース誘導性のガラクトキナーゼ遺伝子（GAL1）のプロモーターが挙げられる。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
　また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が含まれる。
　遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
　また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１～２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
　また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
　染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで微生物を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。
　用いる組換えＤＮＡの構造によっては、相同組換えの結果として、野生型遺伝子と欠失型遺伝子とが組換えＤＮＡの他の部分（例えば、ベクター部分及びマーカー遺伝子）を挟んだ状態で染色体に挿入される場合がある。この状態では野生型遺伝子が機能するため、当該２個の遺伝子間で再度相同組換えを起こさせ、１コピーの遺伝子を、ベクター部分及びマーカー遺伝子とともに染色体ＤＮＡから脱落させ、欠失型遺伝子が残ったものを選抜する必要がある。
　また、例えば、任意の配列を含む線状ＤＮＡであって、当該任意の配列の両端に染色体上の置換対象部位の上流および下流の配列を備える線状ＤＮＡで酵母を形質転換して、置換対象部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、１ステップで置換対象部位を当該任意の配列に置換することができる。当該任意の配列としては、例えば、マーカー遺伝子を含む配列を用いることができる。マーカー遺伝子は、その後、必要により除去してもよい。マーカー遺伝子を除去する場合には、マーカー遺伝子を効率的に除去できるよう、相同組み換え用の配列をマーカー遺伝子の両端に付加しておいてもよい。
　また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ－メチル－Ｎ'－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
　なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の内、一部を破壊し、残りの発現を低下させてもよい。
　本発明の酵母が２倍体以上の倍数性を有する場合には、本発明の酵母は、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、タンパク質の活性が低下するように改変された染色体と野生型染色体とをヘテロで有していてもよく、タンパク質の活性が低下するように改変された染色体をホモで有していてもよい。通常は、本発明の酵母は、タンパク質の活性が低下するように改変された遺伝子をホモで有しているのが好ましい。
　タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
　タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
　遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT－PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
　上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、任意のタンパク質、例えばペプチド分解酵素、の活性低下や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現低下に利用できる。
＜２＞本発明の方法
＜２－１＞γ-Glu-Abuの製造法
　上述の通り、γ-Glu-Abu生産型酵母は、例えば、γ-Glu-Abuの製造に利用できる。すなわち、本発明の方法の一態様は、本発明の酵母（ここではγ-Glu-Abu生産型酵母）を培地で培養してγ-Glu-Abuを該培地中に生成蓄積させること、および該培地よりγ-Glu-Abuを採取することを含む、γ-Glu-Abuの製造法である。
　使用する培地は、本発明の酵母が増殖でき、γ-Glu-Abuが生成蓄積される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、酵母の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地として、具体的には、例えば、SD培地、SG培地、SDTE培地が挙げられるが、これらに限定されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、使用する酵母の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
　炭素源は、本発明の酵母が資化してγ-Glu-Abuを生成し得るものであれば、特に限定されない。炭炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
　窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
　リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
　硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
　その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
　また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。また、例えば、培地にAbuを補添してもよい。
　培養条件は、本発明の酵母が増殖でき、γ-Glu-Abuが生成蓄積される限り、特に制限されない。培養は、例えば、酵母の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する酵母の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
　培養は、例えば、液体培地を用いて、通気培養または振盪培養により、好気的に行うことができる。培養温度は、例えば、25～35℃、より好ましくは27～33℃、さらに好ましくは28～32℃であってよい。培養期間は、例えば、5時間以上、10時間以上、または15時間以上であってよく、120時間以下、72時間以下、または48時間以下であってよい。培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。
　上記のようにして本発明の酵母を培養することにより、培地中にγ-Glu-Abuが蓄積する。
　γ-Glu-Abuが生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
　生成したγ-Glu-Abuの回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。回収されるγ-Glu-Abuは、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。本発明において、「γ-Glu-Abu」という用語は、特記しない限り、フリー体のγ-Glu-Abu、その塩、またはそれらの混合物を意味してよい。
　塩は、経口摂取可能なものであれば特に制限されない。例えば、カルボキシル基等の酸性基に対する塩としては、具体的には、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロへキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。また、例えば、アミノ基等の塩基性基に対する塩としては、具体的には、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸、メチルマロン酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩が挙げられる。なお、塩としては、１種の塩を用いてもよく、２種またはそれ以上の塩を組み合わせて用いてもよい。
　尚、回収されるγ-Glu-Abuは、γ-Glu-Abu以外に、例えば、酵母菌体、培地成分、水分、及び酵母の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。回収されたγ-Glu-Abuの純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。
＜２－２＞γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法
　上述の通り、γ-Glu-Abu蓄積型酵母は、例えば、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造に利用できる。すなわち、本発明の方法の別の態様は、本発明の酵母（ここではγ-Glu-Abu蓄積型酵母）を原料として用いて酵母エキスを調製することを含む、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法である。
　本発明の酵母（ここではγ-Glu-Abu蓄積型酵母）を原料として製造される酵母エキスを、「本発明の酵母エキス」ともいう。本発明の酵母エキスは、本発明の酵母を原料として用いる以外は、通常の酵母エキスと同様に製造することができる。以下、本発明の酵母エキスを製造する方法を説明する。
　まず、本発明の酵母を培地で培養する。培地および培養条件については、γ-Glu-Abuの製造法における培地および培養条件の記載を準用できる。本発明の酵母を培養することにより、酵母の細胞内にγ-Glu-Abuが蓄積し、γ-Glu-Abuを含有する酵母が得られる。
　得られた酵母からの酵母エキスの調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを処理したものでもよい。また、必要に応じて、得られた酵母エキスを濃縮してもよいし、乾燥し粉末の形態にしてもよい。
　上記のようにして、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキス（本発明の酵母エキス）が得られる。本発明の酵母エキスは、酵母エキス中の固形分全量に対し、γ-Glu-Abuを、好ましくは0.1重量%以上、より好ましくは1.0重量%以上、さらに好ましくは2.0重量%以上、特に好ましくは20重量%以上含有してよい。
＜３＞本発明の飲食品
　上記のようにして得られるγ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスは、飲食品の製造に用いることができる。すなわち、本発明は、本発明の方法により得られるγ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスを飲食品またはその原料に添加することを含む、飲食品の製造方法を提供する。このようにして製造される飲食品を、「本発明の飲食品」ともいう。また、一態様においては、γ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスの添加により、飲食品に「コク味」を付与することができる。飲食品としては、例えば、アルコール飲料、パン食品、発酵食品調味料が挙げられる。
　本発明の飲食品は、γ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスを添加すること以外は、通常の飲食品と同様の原料を用い、同様の方法によって製造することができる。このような原料としては、例えば、アルコール飲料では米、大麦、コーンスターチ等が、パン食品では小麦粉、砂糖、食塩、バター、発酵用酵母菌等が、発酵食品調味料では大豆、小麦等が挙げられる。γ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスの添加は、飲食品の製造工程のいずれの段階で行われてもよい。すなわち、γ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスは、飲食品の原料に添加されてもよく、製造途中の飲食品に添加されてもよく、完成した飲食品に添加されてもよい。また、酵母エキスもしくはその濃縮物、またはそれらを乾燥したものは、それ自体で発酵食品調味料として用いることもできる。
　γ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスの添加量は特に制限されず、飲食品の種類や飲食品の摂取態様等の諸条件に応じて適宜設定することができる。γ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスは、飲食品またはその原料に対して、γ-Glu-Abu量に換算して、例えば、1 ppm（w/w）以上、100 ppm（w/w）以上、または1％（w/w）以上添加してよい。また、γ-Glu-Abuおよび／または酵母エキスは、飲食品またはその原料に対して、γ-Glu-Abu量に換算して、例えば、100％（w/w）以下、10％（w/w）以下、または1％（w/w）以下添加してよい。
　以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。
＜実施例１＞GAP1遺伝子の高発現株の構築
　本実施例では、アミノ酸全般の膜透過酵素（general amino acid permease）であるGap1がγ-Glu-Abuの細胞外排出に与える影響を評価するため、γ-Glu-Abuを高含有する酵母株（M006Y ura3-）を基に、野生型GAP1遺伝子および細胞膜常局在型GAP1遺伝子をそれぞれ高発現する酵母株を構築した。
（１）γ-Glu-Abuを高含有する株の構築
　γ-Glu-Abu生成に関与する分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子（BAT1）、セリン脱アミノ化酵素遺伝子（CHA1）、およびγ－グルタミルシステイン合成酵素遺伝子（GSH1）の発現を増強することにより、γ-Glu-Abuを高含有する酵母株（M006Y ura3-株）を構築した。手順を以下に示す。
　親株として、Saccharomyces cerevisiae AG1 ura3-株（特開2012-213376）を用いた。AG1 ura3-株は、Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のγ－グルタミルシステイン合成酵素遺伝子（GSH1）の発現増強株である。AG1 ura3-株は、URA3遺伝子を欠損しており、ウラシル要求性を示す。
　Sofyanovichらの方法（Olga A. Sofyanovich et al: A New Method for Repeated “Self-Cloning” Promoter Replacement in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biotechnol., 48, 218-227 (2011)）に基づき、AG1 ura3-株の分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子（BAT1）のプロモーターを構成発現プロモーターであるグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素遺伝子（TDH3）のプロモーター領域（以下、pTDH3ともいう）に置換した株を作製した。手順を以下に示す。5'端にBAT1の上流配列を有する配列番号１のプライマー（5’- GCCAGGCGGTTGATACTTTGTGCAGATTTCATACCGGCTGTCGCTATTATTACTGATGAATTGGCTCTCTTTTTGTTTAATCTTAACCCAACTGCACAGA -3’）、及びBAT1遺伝子の開始コドンから始まる一部のORF内配列を有する配列番号２のプライマー（5’- TTGGATGCATCTAATGGGGCACCAGTAGCGAGTGTTCTGATGGAGAATTTCCCCAACTTCAAGGAATGTCTCTGCAACATTTGTTTATGTGTGTTTATTC -3’）を用い、pUC19-URA3-pTDH3-URA3プラスミド（前述のSofyanovichらの報告に記載）を鋳型にPCRを行い、TDH3プロモーターに挟まれたURA3を有するDNA断片を得た。PCRの条件は、熱変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。このDNA断片でAG1 ura3-株を形質転換し、ウラシルを含有しないSD平板培地に塗布した。生育した形質転換体から、BAT1プロモーターがpTDH3-URA3-pTDH3に置換された株を取得した。以下にSD培地の調製方法を示す。SD平板培地はSD培地にBacto-agarを2%となるよう加えて作製した。
[SD培地組成]
D(+)-グルコース　　　　　　　　　　　　20 g
10 x YNB　　　　　　　　　　　　　　　100 mL
MilliQ水                          up to 1 L       
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1 L
　SD培地は、オートクレーブ滅菌したグルコースとフィルター滅菌したYNBを上記組成になるように混合し、オートクレーブ滅菌したMilliQ水でメスアップして調製した。
　10 x YNBは次のようにして調製した。MilliQ水1 Lに対し17 gのDifco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate及び50 gの硫酸アンモニウムを溶解させ、pH5.2になるように調整し、フィルター滅菌した。ビタミンの分解を防ぐため冷暗所に保管した。
　URA3遺伝子が欠損した株は５－フルオロオロト酸（5-FOA）耐性を示すため、5-FOAを含有する培地を利用してURA3選択マーカーが除去された株を選抜できる。そこで、BAT1プロモーターがpTDH3-URA3-pTDH3に置換された株を、ウラシル添加SD培地で一晩培養し、適量を5-FOA平板培地に塗布した。生育したコロニーから、導入された２つのTDH3プロモーター間の相同組換えにより、URA3が除去され、BAT1のプロモーターがTDH3プロモーターに置換された株（AG1 pTDH3-BAT1 ura3- 株）を取得した。なお、5-FOA平板培地は以下のように調製した。
[5-FOA平板培地組成]
酵母生育培地パウチ SD/-Ura Broth        2 pouches
Uracil                                 50 mg
5-FOA                                   1 g
10 x YNB                              100 mL
Bacto-agar                             20 g
MilliQ水                          up to 1 L       
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1 L
　酵母生育培地パウチ　SD/-Ura Broth（クロンテック社）、Uracil、5-FOA、及び10 x YNBを混合し、MilliQ水で500 mLにメスアップしてフィルター滅菌したものと、Bacto-agarをMilliQ水で500 mLにメスアップしオートクレーブ滅菌したものとを混合して、5-FOA平板培地を作製した。
　次に、同じくSofyanovichらの方法に基づき、上記の方法で得られたAG1 pTDH1-BAT1 ura3-株のセリン脱アミノ化酵素遺伝子（CHA1）のプロモーターを構成発現プロモーターであるpTDH3に置換した株を作製した。手順を以下に示す。なお、AG1 pTDH3-BAT1 ura3-株はURA3遺伝子の欠損株でありウラシル要求性を示す。5'端にCHA1の上流配列を有する配列番号３のプライマー（5’- GAGTACTAATCACCGCGAACGGAAACTAATGAGTCCTCTGCGCGGAGACATGATTCCGCATGGGCGGCTCCTGTTAAGCCTCTTAACCCAACTGCACAGA-3’）、及びCHA1遺伝子の開始コドンから始まる一部のORF内配列を有する配列番号４のプライマー（5’- TATTTCAAGAAAAATTGTGCAGAAGCCTTTCCGGGGAAGAATTGACGTAATAATGGTGTTTTATTGTAGACTATCGACATTTGTTTATGTGTGTTTATTC -3’）を用い、pUC19-URA3-pTDH3-URA3プラスミドを鋳型にPCRを行い、TDH3プロモーターに挟まれたURA3を有するDNA断片を得た。PCRの条件は、熱変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。このDNA断片でAG1 pTDH1-BAT1 ura3-株を形質転換し、ウラシルを含有しないSD平板培地に塗布した。生育した形質転換体から、CHA1プロモーターがpTDH3-URA3-pTDH3に置換された株を取得した。更に、CHA1プロモーターがpTDH3-URA3-pTDH3に置換された株を、ウラシル添加SD培地で一晩培養し、適量を5-FOA平板培地に塗布した。生育したコロニーから、導入された２つのTDH3プロモーター間の相同組換えにより、URA3が除去され、CHA1のプロモーターがTDH3プロモーターに置換された株（AG1 pTDH3-BAT1 pTDH3-CHA1 ura3- 株）を取得した。以下、本菌株をM006Y ura3-株と称する。M006Y ura3-株はウラシル要求性を示す。
（２）GAP1遺伝子の高発現に用いる１コピープラスミドの作製
　酵母用１コピープラスミドは、pUC19（invitrogen）をバックボーンに、酵母細胞内での自律複製が可能となるよう、出芽酵母の複製起点およびセントロメアをクローン化し、且つ、形質転換株を選択可能となるよう、選択マーカーとしてURA3遺伝子をクローン化して作製した。
（２－１）選択マーカーURA3の導入
　まず、AatII制限酵素認識配列を有する配列番号５で示されるプライマーおよびEcoRI制限酵素認識配列を有する配列番号６で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、URA3遺伝子を有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（50℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次に、このDNA断片をpUC19のAatII-EcoRI部位にクローン化し、プラスミドpUC19-URA3を得た。参考のため、Saccharomyces cerevisiae S288CのURA3遺伝子の塩基配列を配列番号１６に示す。
（２－２）複製起点（ARS）の導入
　KpnI制限酵素認識配列を有する配列番号７で示されるプライマーおよびEcoRI制限酵素認識配列を有する配列番号８で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、ARSを有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次に、このDNA断片をpUC19-URA3のKpnI-EcoRI部位にクローン化し、プラスミドpUC19-URA3-ARSを得た。参考のため、Saccharomyces cerevisiae S288CのARSの塩基配列を配列番号１７に示す。
（２－３）セントロメア（CEN）の導入
　KpnI制限酵素認識配列を有する配列番号９および配列番号１０で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、CENを有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次にこのDNA断片をpUC19-URA3-ARSのKpnI-KpnI部位にクローン化し、酵母用１コピープラスミドpUC19-URA3-ARS-CEN（以下、「YCp」ともいう）を得た。参考のため、Saccharomyces cerevisiae S288CのCENの塩基配列を配列番号１８に示す。
（３）野生型GAP1遺伝子高発現プラスミドの作製
　野生型GAP1遺伝子高発現プラスミドは、YCpプラスミドに構成高発現プロモーターであるTDH3プロモーターをクローン化し、さらにそのプロモーター下流に野生型GAP1遺伝子をクローン化して作製した。
（３－１）TDH3プロモーターの導入
　まず、SmaI制限酵素認識配列を有する配列番号１１で示されるプライマーおよびBamHI制限酵素認識配列を有する配列番号１２で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、TDH3プロモーターを有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次に、このDNA断片をYCpのSmaI-BamHI部位にクローン化し、プラスミドYCp-TDH3pを得た。
（３－２）野生型GAP1遺伝子高発現プラスミドの作製
　BamHI制限酵素認識配列を有する配列番号１３で示されるプライマーおよびSphI制限酵素認識配列を有する配列番号１４で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、野生型GAP1遺伝子を有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次に、このDNA断片をYCp-TDH3pのBamHI-SphI部位にクローン化し、プラスミドYCp-GAP1を得た。
（４）細胞膜常局在型GAP1遺伝子高発現プラスミドの作製
　Gap1タンパク質は、細胞内外のアミノ酸量に応じてユビキチン化され、液胞で分解される（非特許文献１）。一方、第９位および第１６位のリジンをアルギニンに置換した変異型Gap1タンパク質は、ユビキチン化部位を持たないため、ユビキチン化による分解を受けない。そのためこの変異型Gap1タンパク質は、細胞内外の基質濃度に依存せず、細胞膜に常局在する（非特許文献２）。そこで、細胞膜常局在型GAP1遺伝子高発現プラスミドとして、第９位および第１６位のリジンがアルギニンに置換された変異型Gap1タンパク質をコードする変異型GAP1遺伝子（以下、「gap1K9,16R」ともいう）の高発現プラスミドを、以下の手順で作製した。
　まず、BamHI制限酵素認識配列と第９位および第１６位のリジンをアルギニンに置換するように改変されたGAP1配列を有する配列番号１５で示されるプライマーおよびSphI制限酵素認識配列を有する配列番号１４で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、変異型GAP1遺伝子（gap1K9,16R）を有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次に、このDNA断片をYCp-TDH3pのBamHI-SphI部位にクローン化し、プラスミドYCp-gap1K9,16Rを得た。参考のため、Saccharomyces cerevisiae S288CのゲノムDNAを鋳型とした場合に、配列番号１４および１５のプライマーを用いて取得できる変異型GAP1遺伝子（gap1K9,16R）の塩基配列を配列番号２１に示す。
（５）GAP1遺伝子の高発現株の構築
　作製したYCp、YCp-GAP1、およびYCp-gap1K9,16Rで、M006Y ura3-株を形質転換し、ウラシルを含有しないSD平板培地に塗布した。生育した形質転換体から、野生型GAP1遺伝子および変異型GAP1遺伝子（gap1K9,16R）をそれぞれ高発現するM006Y YCp-GAP1株およびM006Y YCp-gap1K9,16R株を得た。また、対照株として、M006Y YCp株を得た。
＜実施例２＞GAP1遺伝子の高発現株の菌体外γ-Glu-Abu濃度の解析
　本実施例では、γ-Glu-Abuの生合成が強化され、且つ野生型GAP1遺伝子および変異型GAP1遺伝子（gap1K9,16R）のそれぞれを高発現する株の菌体外γ-Glu-Abu濃度を測定し、Gap1がγ-Glu-Abuの細胞外排出に与える影響を評価した。
（１）培養およびサンプリング
　実施例１で作製した株を、各々、500 mL容坂口フラスコに50 mL張り込んだSD培地に１エーゼ分植菌し、30℃、120 rpmで24時間振とう培養した。
　得られた培養液の吸光度を測定し、OD600が0.02になるように、500 mL容坂口フラスコに70 mL張り込んだSD培地に植菌し、30℃、120 rpmで約16～20時間振とう培養した（本培養）。なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した。OD600が1.8および2.5になるタイミングで培養液をサンプリングした。培養液から遠心分離により上清を回収し、γ-Glu-Abu濃度の測定に供した。
　上清中のγ-Glu-Abu濃度は、公知の方法（WO2011/129462の実施例１）に準じて、上清中のγ-Glu-AbuをAQC試薬にて誘導体化し、LC-MS/MSにより測定した。WO2011/129462の実施例１に記載の測定条件からの変更点は、下記の通りである。
変更点１：サンプルの誘導体化時に使用する5μMの内部標準物質液として、5μMの3-methyl-His-d2（シグマ社、安定同位体で標識されている。）と5μMのGly-d2（シグマ社、安定同位体で標識されている。）からなる標準液を用いた。γ-Glu-Abuの質量分析時には、これらの内、Gly-d2を内部標準物質として利用した。
変更点２：γ-Glu-Abuの質量分析時には、第一のマスアナライザーでの選択イオンを403.4、第二のマスアナライザーでの選択イオンを171.1とした。なお、γ-Glu-Abuの定量の際に、極まれにサンプルによって夾雑ピークが見られた場合は、第二のマスアナライザーでの選択イオンを、145.2、或いは、104.1に変更して定量した。
　γ-Glu-Abu濃度の測定の結果、図１に示すように、野生型GAP1遺伝子を高発現しても菌体外のγ-Glu-Abu濃度に影響は見られなかったが、細胞膜常局在型GAP1遺伝子であるgap1K9,16Rを高発現することにより菌体外γ-Glu-Abu濃度は上昇した。
　上述の通り、Gap1タンパク質は、細胞内外のアミノ酸量に応じてユビキチン化され、液胞で分解されることが知られている（非特許文献１）。そのため、γ-Glu-Abuの生成経路を増強した株において野生型GAP1遺伝子を高発現しても、Gap1タンパク質が細胞膜に局在せずに分解してしまうと推測される。従って、γ-Glu-Abuの生成経路の増強と排出の促進を両立させるためには、細胞膜常局在型GAP1遺伝子の高発現が有効である。
＜実施例３＞YGL114w遺伝子の高発現株およびYGL114w遺伝子の破壊株の構築
　本実施例では、YGL114wタンパク質がγ-Glu-Abuの細胞外排出に与える影響を評価するため、γ-Glu-Abuを高含有する酵母株（M006Y ura3-）を基に、YGL114w遺伝子の高発現株およびYGL114w遺伝子の破壊株を構築した。
（１）YGL114w遺伝子の高発現株の構築
　BamHI制限酵素認識配列を有する配列番号３２で示されるプライマーおよびSphI制限酵素認識配列を有する配列番号３３で示されるプライマーを用い、野生型Saccharomyces cerevisiae Y006株（FERM BP-11299）のゲノムDNAを鋳型にPCRし、YGL114w遺伝子を有するDNA断片を得た。PCR条件は、変性（94℃、10 sec）、アニーリング（60℃、10 sec）、伸張（72℃、4 min）、25 cycleとした。次に、このDNA断片をYCp-TDH3pのBamHI-SphI部位にクローン化し、プラスミドYCp-YGL114wを得た。作製したYCp-YGL114wで、M006Y ura3-株を形質転換し、ウラシルを含有しないSD平板培地に塗布した。生育した形質転換体から、YGL114w遺伝子を高発現するM006Y YCp-YGL114w株を得た。
（２）YGL114w遺伝子の破壊株の構築
　まず、M006Y ura3-株に、常法（特開2012-213376）に基づきURA3遺伝子を相補し、M006Y株を得た。次に、YGL114w遺伝子の開始コドンより上流80塩基を付加した配列番号３４のプライマー及びYGL114w遺伝子の終止コドンより下流80塩基を付加した配列番号３５のプライマーを用い、M006Y株のゲノムDNAを鋳型として、URA3遺伝子を含むDNA断片を増幅した。PCRの条件は、熱変性（94℃、10 sec）、アニーリング（50℃、10 sec）、伸張（72℃、2 min）、25 cycleとした。得られたDNA断片でM006Y ura3-株を形質転換し、ウラシルを含有しないSD培地に塗布した。生育した形質転換体からYGL114w遺伝子を欠損したM006Y YGL114wΔ株を得た。
＜実施例４＞YGL114w遺伝子の高発現株およびYGL114w遺伝子の破壊株の菌体内γ-Glu-Abu含量の解析
（１）培養およびサンプリング
　実施例３で作製した株および対照株（M006Y YCp株）を、各々、500 mL容坂口フラスコに50 mL張り込んだSD培地に１エーゼ分植菌し、30℃、120 rpmで24時間振とう培養した。
　得られた培養液の吸光度を測定し、OD600が0.02になるように、500 mL容坂口フラスコに70 mL張り込んだSD培地に植菌し、30℃、120 rpmで約16～20時間振とう培養した（本培養）。なお、吸光度は、BECKMAN COULTER社のDU640 SPECTROPHTOMETERを用いて測定した。OD600が1.8になるタイミングで培養液をサンプリングした。
　40 ODunit（OD600が1である培養液1 mLに含まれる菌体を1 ODunitと定義する。）分の培養液を分取し、遠心分離により上清を可能な限り取り除き、菌体を採取した。菌体は45 mLのmilliQ水に懸濁した。再度遠心分離により菌体を集菌し、45 mLのmilliQ水に再懸濁した。この操作を累計3回繰り返すことにより、菌体から培地成分を完全に除去した。得られた洗浄菌体は、約1.5 mLのmilliQ水に懸濁し、70℃で10分間加熱した。この工程にて菌体内に含まれるエキス分を抽出した。次に、遠心操作によりエキス分を含む画分と菌体残渣を分離した。
　エキス分を含む画分から10kDaの遠心濾過膜（MILLIPORE社：Amicon Ultra - 0.5 mL 10K（カタログ番号UFC501096））を用いて細胞デブリを除去し、得られた濾液を解析サンプルとした。
　サンプル中のγ-Glu-Abu濃度は、実施例２と同様の手法により測定した。
　γ-Glu-Abu濃度の測定の結果、図２に示すように、YGL114w遺伝子の高発現株であるM006Y YCp-YGL114w株では菌体内のγ-Glu-Abu濃度の低下が見られた（図２Ａ）。一方、YGL114w遺伝子の破壊株であるM006Y YGL114wΔ株では、菌体内のγ-Glu-Abu濃度の上昇が見られた（図２Ｂ）。
　YGL114wタンパク質は、ペプチドトランスポーターと予測されていたものの、実際の機能は未知であった。上記結果から、YGL114wタンパク質が、γ-Glu-Abuの細胞外排出タンパク質であることが明らかとなった。従って、γ-Glu-Abuの細胞外排出には、YGL114w遺伝子の高発現が有効である。
　本発明により、酵母におけるγ-Glu-Abuの細胞内外の局在を制御することができる。よって、本発明は、γ-Glu-Abuの製造や、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造に有用である。
＜配列表の説明＞
配列番号１～１５：プライマー
配列番号１６：Saccharomyces cerevisiae S288CのURA3遺伝子の塩基配列
配列番号１７：Saccharomyces cerevisiae S288Cの複製起点（ARS）の塩基配列
配列番号１８：Saccharomyces cerevisiae S288Cのセントロメア（CEN）の塩基配列
配列番号１９：Saccharomyces cerevisiae S288Cの野生型GAP1遺伝子の塩基配列
配列番号２０：Saccharomyces cerevisiae S288Cの野生型Gap1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２１：Saccharomyces cerevisiae S288Cの変異型GAP1遺伝子（gap1K9,16R）の塩基配列
配列番号２２：Saccharomyces cerevisiae S288CのCHA1遺伝子の塩基配列
配列番号２３：Saccharomyces cerevisiae S288CのCha1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２４：Saccharomyces cerevisiae S288CのILV1遺伝子の塩基配列
配列番号２５：Saccharomyces cerevisiae S288CのIlv1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２６：Saccharomyces cerevisiae S288CのBAT1遺伝子の塩基配列
配列番号２７：Saccharomyces cerevisiae S288CのBat1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２８：Saccharomyces cerevisiae S288CのGSH1遺伝子の塩基配列
配列番号２９：Saccharomyces cerevisiae S288CのGsh1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号３０：Saccharomyces cerevisiae S288CのYGL114W遺伝子の塩基配列
配列番号３１：Saccharomyces cerevisiae S288CのYGL114Wタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３２～３５：プライマー

Claims (16)

  1. 　γ-Glu-Abuの製造法であって、
    　γ-Glu-Abu生産能を有する酵母を培地で培養してγ-Glu-Abuを該培地中に生成蓄積させること、および
    　該培地よりγ-Glu-Abuを採取すること、を含み、
    　前記酵母が、下記（１）～（２）のいずれか又は両方の性質を有することを特徴とする、方法：
    （１）変異型GAP1遺伝子を保持するように改変されている；
    （２）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増大するように改変されている。
  2. 　前記変異型GAP1遺伝子が、下記（Ａ）および（Ｂ）の変異を有する遺伝子である、請求項１に記載の方法：
    （Ａ）野生型Gap1タンパク質の９位のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換される変異；
    （Ｂ）野生型Gap1タンパク質の１６位のリジン残基が他のアミノ酸残基に置換される変異。
  3. 　前記９位および１６位のリジン残基がアルギニン残基に置換されている、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記野生型Gap1タンパク質が、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるタンパク質である、請求項２または３に記載の方法：
    （ａ）配列番号２０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （ｂ）配列番号２０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号２０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質。
  5. 　YGL114w遺伝子の発現を上昇させることにより、YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増大した、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記YGL114w遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、及び／又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによって上昇した、請求項５に記載の方法。
  7. 　γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法であって、
    　γ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母を原料として用いて酵母エキスを調製することを含み、
    　前記酵母が、下記（３）の性質を有することを特徴とする、方法：
    （３）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下するように改変されている。
  8. 　YGL114w遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下した、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記YGL114w遺伝子が、下記（Ａ）～（Ｅ）からなる群より選択されるＤＮＡである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法：
    （Ａ）配列番号３１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
    （Ｂ）配列番号３１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、酵母において活性を増大させた際に酵母のγ-Glu-Abu生産量を非改変株と比べて向上させる性質、および／または、酵母において活性を低下させた際に酵母のγ-Glu-Abu蓄積量を非改変株と比べて向上させる性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
    （Ｃ）配列番号３１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、酵母において活性を増大させた際に酵母のγ-Glu-Abu生産量を非改変株と比べて向上させる性質、および／または、酵母において活性を低下させた際に酵母のγ-Glu-Abu蓄積量を非改変株と比べて向上させる性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
    （Ｄ）配列番号３０に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
    （Ｅ）配列番号３０に示す塩基配列の相補配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母において活性を増大させた際に酵母のγ-Glu-Abu生産量を非改変株と比べて向上させる性質、および／または、酵母において活性を低下させた際に酵母のγ-Glu-Abu蓄積量を非改変株と比べて向上させる性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  10. 　前記酵母が、さらに、γ－グルタミルシステイン合成酵素、α－ケト酪酸合成酵素、およびアミノ基転移酵素からなる群より選択される１種またはそれ以上の酵素の活性が増大するように改変されている、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記α－ケト酪酸合成酵素が、CHA1遺伝子によってコードされる酵素である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記アミノ基転移酵素が、BAT1遺伝子によってコードされる酵素である、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 　前記酵母が、サッカロミセス属酵母またはキャンディダ属酵母である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記酵母が、サッカロミセス・セレビシエまたはキャンディダ・ユティリスである、請求項１３に記載の方法。
  15. 　下記（１）～（４）のいずれかの性質を有し、且つ、γ-Glu-Abu生産能および／またはγ-Glu-Abu蓄積能を有する酵母：
    （１）変異型GAP1遺伝子を保持するように改変されている；
    （２）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が増大するように改変されている；
    （３）YGL114w遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が低下するように改変されている；
    （４）上記（１）と（２）の性質の組み合わせ。
  16. 　さらに、γ－グルタミルシステイン合成酵素、α－ケト酪酸合成酵素、およびアミノ基転移酵素からなる群より選択される１種またはそれ以上の酵素の活性が増大するように改変されている、請求項１５に記載の酵母。
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