JP2003199556A - 清酒の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ペプチド取込能低下酵母の育種法を開発し、そ
れを用いることによってペプチド含量の高い清酒の製造
方法を提供する。 【構成】清酒酵母より低分子ペプチド存在下で銅耐性の
ある株を分離し、この中からペプチド取込能低下酵母を
分離する。これを用いてペプチド含量の高い清酒を製造
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【００１】

【産業上の利用分野】本発明はサッカロマイセス属に属
する変異酵母を用いるアルコール飲料の製造方法に関す
るものである。

【００２】

【従来の技術】ペプチドは清酒中の重要な呈味成分の一
つであり、酒に「丸味」や「ふくらみ」を与えると言わ
れている（醸協、６４、７３９−７４３）。また、近
年、ペプチドの生理活性について多くの研究がなされて
おり、清酒中のペプチドの生理活性に関してもプロリル
エンドペプチダーゼ阻害ペプチド（特開平１０−７７３
００）やアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド（日農
化誌、６６、１０８１−１０８７）などの存在が明らか
にされている。

【００３】そこで清酒中のペプチド含量を増やすことが
出来れば、味覚的にも機能的にも清酒の多様性、販路拡
大につながるので、そのような清酒を簡便に製造できる
酵母の開発が望まれる。

【００４】

【本発明が解決しようとする課題】本発明は新たなペプ
チド取込能低下酵母の取得法、およびそれを用いたペプ
チド含量が高い清酒の製造方法の開発を目的とするもの
である。

【００５】

【問題を解決するための手段】本発明者は酵母が硫酸銅
と少量のペプチドを含み炭素源が乳酸ナトリウムである
培地（以下銅培地と略す）において、著しく生育が阻害
されることをみいだした。酵母のペプチド取込遺伝子Ｐ
ＴＲ２の転写抑制因子Ｃｕｐ９ｐは銅耐性にも関与して
おり、銅培地耐性株はＰＴＲ２転写制御系に何らかの変
化を生じ、その結果、親株とはペプチド取込能に差が生
じることが期待できる。そこで、銅培地を、耐性株を分
離する手段として利用することにより、効率よくペプチ
ド取込能低下変異株を取得できることを認め、本発明を
完成させるに至った。

【００６】本発明において、変異株はポジティブに得ら
れるものであり、銅耐性株は自然変異あるいは人工的な
変異誘発によって取得できる。変異誘発剤は特に限定す
るものではなく、エチルメタンスルホネートによる処理
など公知の方法を利用できる。親株としては1倍体ある
いは2倍体いずれにおいても取得可能であり、また各種
協会酵母に代表される実用株あるいは野生酵母、実験室
酵母からも耐性株を取得可能であり、これらを種酵母と
して使用すればペプチド含量の多い清酒を製造できる。

【００７】本発明で得られた耐性株は銅培地で生育可能
であるが、遺伝子工学的にＰＴＲ２を破壊した酵母は同
培地で生育できない。これまでに知られているペプチド
アナログ等の耐性株として得られたペプチド取込能欠損
酵母（Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１４，１０
４−１１５）はＰＴＲ２の機能が破壊されたものである
ので、本発明で得られた耐性株は既知のペプチドアナロ
グ耐性株とは異なる機作によって獲得されたものである
と推定された。

【００８】本発明によって取得した銅耐性株によって親
株の約２倍のペプチドを含有する清酒を得ることが出来
る。

【００９】

【実施例1】日本醸造協会９０１号酵母（以下、Ｋ９０
１と略す）をYPD平板培地（酵母エキス１％、ペプトン
２％、グルコース２％、寒天２％）で３０℃、２日培養
後、集菌、洗浄した。洗浄菌体を１０ｍｌの５０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、エチルメ
タンスルホネート０．３ｍｌを添加し、３０℃で１時間
緩やかに浸透した。１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液を
１０ｍｌ加え中和後、集菌、洗浄し、滅菌水に懸濁した
菌体を銅培地（ディフコ社イーストニトロゲンベース：
アミノ酸と硫安を除いたもの０．１７％、乳酸ナトリウ
ム２％、フナコシ社ＣＳＭ−ＵＲＡ０．０７７％、０．
５ｍＭ硫酸銅、０．１ｍＭヒスチジルロイシン、寒天２
％）に塗沫した。これを３０℃で４日間培養後、出現す
るコロニーを銅耐性株として単離した。

【０１０】耐性株をペプチド平板培地（ディフコ社イー
ストニトロゲンベース：アミノ酸と硫安を除いたもの
０．１７％、グルコース２％、グリシルロイシン０．０
７７％、寒天２％）とアミノ酸平板培地（ディフコ社イ
ーストニトロゲンベース：アミノ酸と硫安を除いたもの
０．１７％、グルコース２％、グリシン０．０３％、ロ
イシン０．０５％、寒天２％）に植え、ペプチド培地で
の生育が著しく悪い株としてＣｕ−１１株を選択した。

【０１１】Ｃｕ−１１株のペプチド取込能を以下の方法
で測定した。Ｃｕ−１１株および親株であるＫ９０１株
をＹＮＢ培地（ディフコ社イーストニトロゲンベース：
アミノ酸と硫安を除いたもの０．１７％、グルコース２
％、ＣＳＭ−ＵＲＡ０．０７７％）で１５℃、３日間培
養後、集菌、洗浄し、ＯＤ６６０＝１．０に調製し、そ
の０．５ｍｌを１．５ｍｌの微量遠心管に移し、そこに
０．２ｍｌの０．１Ｍ乳酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ５．
６および０．１ｍｌの２０％グルコース水溶液を加え、
３０℃で３０分振とう後、０．２ｍｌの２ｍＭロイシル
グリシルグリシンを加え３０℃で１５分振とうした。次
いで、遠心分離により酵母を除き、上清に残ったグリシ
ルロイシルロイシンの濃度をＴＮＢＳ法（Ｊ．Ａｇｒｉ
ｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１９９４，４２，２７７８−
２７８２）により測定した。酵母懸濁液の代わりに滅菌
水を用い同様の操作を行ったものをコントロールとし
て、そのコントロールペプチド濃度と酵母懸濁液の入っ
た試験区のペプチド濃度の差を酵母が取り込んだペプチ
ドの濃度とした。その結果、表1に示す通りＣｕ−１１
株のペプチド取込能は親株の５０分の１以下にまで消失
していた。なおこの菌株は独立行政法人産業技術総合研
究所にＦＥＲＭＰ−１８６３９として寄託されている。

【０１２】

【実施例2】Ｃｕ−１１株を用いて表２に示す配合で清
酒小仕込試験を行った。麹汁で３０℃、２日間静置培養
した酵母を初添の水麹時に７×１０９個添加した。品温
経過は次のようにした。三段仕込時は１５℃一定とし、
留で９℃に落とし、以後１℃／日で上昇させ留７日目以
降は１５℃一定とした。日本酒度が０になった時点で上
槽した。製成酒の分析結果を表３に示す。

【０１３】親株であるＫ９０１は１３日目に、Ｃｕ−１
１株は１５日目に上槽した。Ｃｕ−１１株は清酒醪にお
いてもペプチドを取込なかったと考えられ、製成酒中の
ペプチド濃度は親株の２倍近かった。また、耐性株で製
成した清酒はリンゴ酸、ピルビン酸も親株に比べ多かっ
た。このように新たに取得した菌株の清酒醸造への利用
は、呈味性あるいは機能性において新たな清酒製造を可
能にするものであり、清酒の多様化に対応するための有
用な手段として期待できる。

【０１４】

【表１】

【０１５】

【表２】

【０１６】

【表３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 原 昌道 兵庫県神戸市東灘区魚崎西町１丁目８番６ 号菊正宗酒造株式会社総合研究所内 Ｆターム(参考） 4B065 AA80X AC20 BA23 BB19 CA42

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】サッカロマイセス・セレビジェから低分子
   ペプチド存在下で銅耐性を有する株を分離し、そのなか
   からペプチド取込能が低下あるいは欠損した株を分離す
   る酵母の育種方法。
2. 【請求項２】請求項1に記載する方法により取得した酵
   母を用いたペプチド含量の高い清酒の製造方法。
3. 【請求項３】低分子ペプチド存在下で銅耐性を有するサ
   ッカロマイセス・セレビジェ。