CN101440375A

CN101440375A - 一种乳清酸核苷-5＇-磷酸脱羧酶基因及其蛋白和应用

Info

Publication number: CN101440375A
Application number: CN 200710158415
Authority: CN
Inventors: 张素芳; 赵宗保; 杨帆
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2007-11-21
Filing date: 2007-11-21
Publication date: 2009-05-27
Anticipated expiration: 2027-11-21
Also published as: CN101440375B

Abstract

本发明涉及自圆红冬孢酵母分离得到的一种乳清酸核苷－5′－磷酸脱羧酶基因及其编码蛋白和重组载体。以圆红冬孢酵母菌AS 2.0389总RNA为模板，利用简并PCR和RACE方法，分离得到Rt－ura3，cDNA序列如SEQ ID No：1所示，基因组DNA序列如SEQ ID No：3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。所获得的载体pYES2/CT－Rt－ura3可以用于补偿营养缺陷型酿酒酵母菌BY4741的嘧啶生物合成途径，使构建的工程菌在不含尿嘧啶的培养基中正常生长。将Rt－ura3基因用做营养缺陷型标记基因或反选择标记基因，可构建新的酵母遗传操作系统及新的重组工程菌株。

Description

一种乳清酸核苷-5＇-磷酸脱羧酶基因及其蛋白和应用

技术领域

本发明涉及乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因ura3，具体地说是圆红冬孢酵母的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因的克隆、重组载体构建，以及在基因工程研究中的应用。

背景技术

生命体是由核酸、蛋白质等生物大分子组成的有机体。其中，核苷酸是核酸的组成单位，在体内分布广泛并具有多种生物学功能。核苷酸的正常生物合成是生命特征维持的前提，在没有补救途径的情况下，核苷酸生物合成异常或中止将会导致生命体生命特征的丧失。

如上图所示，酵母嘧啶核苷酸的从头生物合成以谷氨酰胺为原料，经多步生物催化生成乳清苷酸(OMP)，再由OMP脱羧酶催化脱羧生成尿苷酸(UMP)，后者进一步转化生成尿苷三磷酸(UTP)和胞苷三磷酸(CTP)(Flynn PJ，Reece RJ.Activation of transcription by metabolic intermediates ofthe pyrimidine biosynthetic pathway.Mol.Cell Biol.1999，19(1)：882-888；JundR，LacrouteF.Regulation of orotidylic acid pyrophosphorylase inSaccharomyces cerevisiae.J Bacteriol.1972，109(1)：196-202)。酵母的OMP脱羧酶(URA3)通常由ura3基因编码，是嘧啶生物合成所必需的酶；若OMP脱羧酶功能缺失，嘧啶生物合成途径将中断，在没有外源尿嘧啶补给条件下酵母无法存活。

乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因ura3做为一种选择性标记基因，常用于酿酒酵母、假丝酵母、克鲁维酵母和裂殖酵母等酵母菌的遗传操作或遗传操作系统的构建(Alani E，Cao L，Kleckner N.A method for genedisruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction ofmultiply disrupted yeast strains.Genetics 1987，116：541-545；Francois F，Chapeland-Leclerc F，Villard J，etal.Development of an integrativetransformation system for the opportunistic pathogenic yeast Candida lusitaniaeusing URA3as a selection marker.Yeast 2004，21(2)：95-106；Ngan WY，NgaBH，Pridmore D，et al.Transformation of Endomyces fibuliger based on its genefor orotidine-5′-phosphate decarboxylase.Gene 2000，254(1-2)：7-103；Hirashima K，Iwakil T，Takegawa K，et al.A simple and effective chromosomemodification method for large-scale deletion of genome sequences andidentification of essential genes in fission yeast.Nucleic Acids Research，2006，34(2)：e11)。如Invitrogen公司(美国，加利福尼亚州)推出的载体pYES2/CT和pYC2/CT均携带酿酒酵母野生型ura3基因序列；而该公司用于蛋白质表达的工程菌株INVSc1则不能正常产生乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶，具有尿嘧啶营养缺陷的表型(www.invitrogen.com)。

一般来讲，通过部分或全部缺失ura3基因可构建乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶功能缺失的工程菌株，即尿嘧啶营养缺陷型菌株；而ura3基因连接到载体的适当位置后，就可以作为负向选择标记基因进行遗传操作(Ngan WY，Nga BH，Pridmore D，et al.Transformation of Endomyces fibuliger based on itsgene for orotidine-5′-phosphate decarboxylase.Gene 2000，254(1-2)：7-103)，或用于向尿嘧啶营养缺陷型菌株中引入新基因，构建各种工程菌株。而且，工程菌株构建时不要求载体携带的ura3基因来源于相同微生物种属。

圆红冬孢酵母AS 2.1389是一种生产油脂能力很强的酵母菌，其胞内油脂可达到菌体干重的70％以上(LiY，Zhao Z，Bai F.High-density cultivationof oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4 in fed-batch culture.EnzymeMicrob.Technol.2007，41(3)：312-317)。当前圆红冬孢酵母遗传背景不清楚，缺乏相应的遗传操作系统。关于圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因的信息尚没有公开报道。

发明内容

本发明涉及自圆红冬孢酵母分离得到的一种乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因ura3及其编码蛋白和重组载体；具体来说，是一种来源于圆红冬孢酵母AS2.0389的乳清酸核苷-5′磷酸脱羧酶新基因Rt-ura3的克隆和生物功能分析，以及该基因在构建重组载体和构建基因工程菌株领域的应用。

为实验上述目的，本发明采用的技术方案为：

结合利用简并聚合酶链式反应(PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)的方法，以圆红冬孢酵母AS 2.0389总RNA为模板，经RT-PCR得到乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因Rt-ura3，其cDNA具有如序列表SEQ ID NO：1所示序列，其基因组DNA具有如序列表SEQ ID NO：3所示序列。

本发明提出的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因Rt-ura3编码的蛋白，其氨基酸具有如序列表SEQ ID NO：2所示序列。

本发明利用分子克隆方法构建获得新型重组酵母/大肠杆菌穿梭载体pYES2/CT-Rt-ura3，简要过程如下：经无限制性酶切克隆法(RF cloning)操作，将Rt-ura3基因的开放阅读框(ORF)完全置换酿酒酵母/大肠杆菌穿梭载体pYES2/CT所携带ura3基因的ORF。可以用于补偿营养缺陷型酿酒酵母菌BY4741的嘧啶生物合成途径，使构建的工程菌在不含尿嘧啶的人工培养基中正常生长。将Rt-ura3基因用做一种营养缺陷型标记基因或反选择标记基因，可构建新的酵母遗传操作系统及新的重组工程菌株。

本发明根据已获得的ura3的DNA序列(如序列表SEQ ID NO：3所示)，利用PCR介导的基因一步灭活法构建圆红冬孢酵母营养缺陷型菌株。

其操作过程为：

1.本发明所选择的圆红冬孢酵母AS 2.1389，购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)。根据NCBI已公布的来源于其它物种的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶保守氨基酸序列(图7)，设计一对简并引物用于扩增圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因片段。以圆红冬孢酵母总RNA(图1)为模板，经RT-PCR分别得到简并PCR产物(图2A)，5′-RACE产物(图2B)，3′-RACE产物(图2C)，和全长cDNA扩增产物(图2D)。所有PCR产物克隆于pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)，转化E.coli DH5α感受态细胞(参照分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取、PCR鉴定和测序分析。测序结果表明获得一种新的ura3基因，命名为Rt-ura3，其cDNA如序列表中SEQ ID NO：1所示。

2.以圆红冬孢酵母AS 2.1389的基因组DNA为模板，根据获得的圆红冬孢酵母cDNA序列设计两条引物ura3-full-sense和ura3-full-anti，按照常规方法进行PCR扩增(参照分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，得到Rt-ura3基因对应的基因组DNA产物，大小约为1.0kb(图3)，其序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

3.利用Rt-ura3基因信息设计两条引物ura3-RF-sense和ura3-RF-anti，参照文献方法(Van den Ent，F.，Lowe，J.，2006.RF cloning：A restriction-freemethod for inserting target genes into plasmids.J.Biochem.Biophys.Methods67，67-74)，构建重组载体pYES2/CT-Rt-ura3(图4和图5)。重组载体pYES2/CT-Rt-ura3电击转化酿酒酵母BY4741(购自ATCC，为全基因组测序完成酿酒酵母菌株S288c的营养缺陷菌株，基因型：Mat a；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0)感受态细胞获得重组菌株。

4.携带有载体pYES2/CT-Rt-ura3的重组酿酒酵母BY4741菌株进行功能性表达分析，表明Rt-ura3可以补偿URA3营养缺陷，重建酿酒酵母BY4741嘧啶生物合成途径，菌株在在不含尿嘧啶的SD培养基上正常生长(图6)。

5.参照文献(Baudin A，Ozier-Kalogeropoulos O，Denouel A，et al.Asimple and efficient method for direct gene deletion in Saccharomycescerevisiae.Nucleic Acids Res，1993，21(14)：3329-3330)所述PCR介导的基因一步灭活法构建圆红冬孢酵母营养缺陷型菌株。参考Rt-ura3的DNA序列(如序列表SEQ ID NO：3所示)，设计两对引物，通过两轮PCR扩增获得两端各携带90bp左右同源重组臂的ura3基因敲除盒，通过连续敲除方法转化圆红冬孢酵母感受态细胞，经筛选获得URA3营养缺陷型圆红冬孢酵母菌株。

6.本发明中，构建工程菌株所利用的转化方法包括以下步骤：

a.接单菌落到YEPD(YPD)培养基中，28℃或30℃振荡培养(12-16h)；

b.按1:50-1:100比例将过夜培养液转接至新鲜YEPD(YPD)培养基中，28℃或30℃振荡培养至OD₆₀₀为1.2-1.5左右，以下所有操作置冰上进行；

c.3000-5000rpm离心5min，收集菌体；

d.用等体积(起始菌液体积)的0℃的超纯水洗涤，3000-5000rpm离心5min，收集菌体；

e.用1/2体积(起始菌液体积)的0℃的超纯水洗涤，3000-5000rpm离心5min，收集菌体；

f.用10ml 1M山梨醇洗涤1次，3000-5000rpm离心5min，收集菌体，用10ml 1M山梨醇再洗涤1次，3000-5000rpm离心5min，收集菌体，菌体沉淀悬浮于1/6体积1M山梨醇中，取100μl细胞和小于5μl体积(5-10μg)的DNA混合，加入到预冷至0℃的电转杯中；

g.电击参数：0℃，1.5kv，200Ω，25μF，电击时间：4.5-10毫秒；

h.立刻加入1ml 1M山梨醇，30℃温浴1h；

i.取200μl电转液涂不含尿嘧啶的SD选择平板或G418/SD选择平板。

本发明的优点和有益效果：

本发明涉及的Rt-ura3基因来源于高产油脂酵母菌圆红冬孢酵母AS2.1389，其胞内油脂可达到菌体干重的70％以上。如前所述，当前圆红冬孢酵母遗传背景不清楚，缺乏相应遗传操作系统。因此，Rt-ura3基因可作为自身来源的营养标记基因或反选择标记基因，用于构建圆红冬孢酵母遗传操作系统，或用于其菌株改良。通过建立圆红冬孢酵母营养缺陷型宿主菌，为后续遗传操作奠定基础，并可进一步借助代谢工程方法提高油脂发酵的生产强度，增加其利用廉价碳源的能力，降低生产成本，提高微生物油脂技术的竞争力。同时，携带Rt-ura3基因的载体pYES2/CT-Rt-ura3也可应用在其它真核微生物的基因工程操作中。

附图说明

图1为圆红冬孢酵母AS 2.1389总RNA电泳结果。

图2为圆红冬孢酵母AS 2.1389来源的Rt-ura3基因简并PCR结果(A)、5’-RACE结果(B)、3’-RACE结果(C)和Rt-ura3全长cDNA扩增结果(D)。1：目的基因；M：DNA分子量标准(购自北京舟鼎国)。

图3为圆红冬孢酵母AS 2.1389 ura3的基因扩增产物。1：目的基因；M：DNA分子量标准(购自北京舟鼎国)。

图4为含有Rt-ura3基因的重组穿梭载体pYES2/CT-Rt-ura3的RF克隆扩增结果。1：目的基因；M：DNA分子量标准(购自北京舟鼎国)。

图5为含有Rt-ura3基因的重组穿梭载体pYES2/CT-Rt-ura3的构建流程图。

图6为穿梭载体pYES2/CT-Rt-ura3的酿酒酵母BY4741重组菌株在不含尿嘧啶的SD培养基上培养2天后出现的转化子菌落。证明圆红冬孢酵母AS2.1389来源的Rt-ura3基因产物可以补偿酿酒酵母BY4741的URA3营养缺陷，具有乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶的功能。

图7为NCBI已公布的来源于6种不同物种的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶的氨基酸序列比对结果，黑色方框内序列表示用于设计简并引物的保守氨基酸序列。

图8为圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶URA3的结构模型，其表明三维结构正确。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1：圆红冬孢酵母AS2.1389总RNA的提取

将新鲜圆红冬孢酵母R.toruloides AS 2.1389由斜面接种到50ml YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养12h，再以1:25的体积比例将菌液分别转接到100ml YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养12h达对数生长期。在4℃下，4000rpm离心5min，收集菌体，用液氮迅速冷冻菌体，研磨破壁。使用TaKaRa公司RNAiso试剂盒，并按照其标准步骤提取总RNA。

RNA进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定，可见清晰的两条带(图1)。用紫外/可见光光谱仪分析总RNA样品，测得OD₂₆₀/OD₂₈₀＝2.03，表明总RNA质量很好。总RNA样品冻存于-80℃，备用。

实施例2：反转录合成圆红冬孢酵母AS 2.1389cDNA第一链和简并PCR

以圆红冬孢酵母R.toruloides AS 2.1389总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。首先，将1.0μl RNA(约2μg)，1.0μl引物SMART IV：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3′和1.0μl引物CDSIII/3′：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)_30N-1N-3′，2.0μl DEPC处理水(焦碳酸二乙酯处理水，购自大连TaKaRa公司)，加入到PCR管中混匀，于72℃保温2min，立即置于冰上冷却2min，将2.0μl5×first strand buffer，1.0μl DTT(20mM)，1.0μl dNTP(10mM)，1.0μlpowerscript reverse transcriptase(Clontech公司)加入到体系中，混匀。于42℃延伸反应60min，最后4℃结束反应，存于-20℃，备用。

设计合成两条简并引物ura3-sense：5′-TT(CT)GA(AG)GA(CT)(AC)G(AGCT)AA(AG)TT(CT)GC-3′和ura3-anti：5′-CCA(AGCT)CC(AGCT)GC(CT)(CT)T(CT)TG(AG)TA-3′，以反转录合成的cDNA第一链为模板，进行部分ura3基因的PCR扩增，10×PCR缓冲液(大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(10mM，TaKaRa)1.0μl，ura3-sense引物(50mmol/l)1.0μl，ura3-anti引物(50mmol/l)1ul，Taq酶(大连TakaRa)0.5μl，合成的cDNA第一链模板1.0μl，ddH₂O 40.5μl，于94℃保温3min，然后于94℃ 30s，57℃ 45s，72℃ 1min，35个循环，72℃ 10min，4℃结束反应。扩增产物进行1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，观察到540bp左右的条带(图2A)，利用DNA回收试剂盒(购自北京舟鼎国)，按照供应商建议步骤纯化PCR产物。PCR产物参照TaKaRa公司提供的方法克隆到pMD18-T载体，转化入E.coli DH5α感受态细胞，其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，序列结果经Blastn分析，证实为乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因ura3的部分序列。

实施例3：圆红冬孢酵母AS2.1389 ura3全长cDNA获得

1.根据实施例2中克隆得到的ura3 cDNA中间序列设计引物5′-NUP：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′和ura3-GSP-anti：5′-ATGCCCCGACCGACGATGATAACG-3′，以实施例2中合成的cDNA第一链为模板，参照Clontech公司提供的BD SMART RACE cDNAAmplification kit操作手册(www.bdbiosciences.com)进行5’-RACE，得到约0.9kb的PCR产物(图2B)；设计引物ura3-GSP-sense：5′-GGCACACATCACCAACGCCCACCT-3′和CDSIII/3′PCR primer(实施例2)，以实施例2中合成的cDNA第一链为模板，参照Clontech公司提供的BD SMART RACE cDNA Amplification kit操作手册(www.bdbiosciences.com)进行3’-RACE，得到约0.6kb的PCR产物(图2C)。PCR扩增产物按照实施例2的操作步骤回收、克隆到pMD18-T载体，并进行测序分析，表明获得了正确的ura3cDNA的5’端和3’端序列。

2.根据步骤1中克隆得到的ura3 cDNA两端序列设计引物ura3-full-sense：5′-ATGCCGTCCATCACGACCCGCACCT-3′和ura3-full-anti：5′-TCACTGCCTCAGCCTGCTCTCGTAC-3′，以实施例2中得到的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，得到约0.8kb的PCR产物(图2D)。PCR扩增产物按照实施例2的操作步骤回收、克隆到pMD18-T载体，并进行测序得到如序列表SEQ ID NO：1所示的序列。

序列号：1(SEQ ID NO：1)

序列长度：840bp

序列类型：cDNA

来源：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

来源菌株特征：分类地位：担子菌门，高产油脂菌株，胞内油脂最高达细胞干重的70％。

序列特征：

表示特征的记号：有正确的读码框

决定位置：起始、终止密码子

决定特征的方法：实验

存在位置：ATG，1位；TGA，838位；正义链引物3’端序列，1-26位；反义链引物3’端序列互补链位置，816-840位。

1 ATGCCGTCCA TCACGACCCG CACCTACGCC GAACGGGCTG CCAAGCACCC CGTCCCGGTC

61 GCAAAGCAGT TGCTCGACAT CTGCGACCGC AAAAAGACCA ACCTCTGCGT TTCAGTCGAC

121 GTGACGAGCA AGGCGGGCCT GCTCAGGATC GCAGAGGCTG CCGGCCCGTA CTGCTGCTGC

181 ATCAAGACCC ACATCGACAT CGTCGAGGAC TTTGACCGGG ATCTCGTTCA GCAACTGCAG

241 GCTCTCGCAG ACAAGCACGA TTTTCTGATT TGGGAGGACC GCAAGTTTGC CGACATCGGC

301 AGCACCGTTC GGCTGCAGTA CTCGTCCGGT ATCTACAAGA TCGCATCCTG GGCGCACATC

361 ACCAACGCCC ACTTGGTCCC CGGCGAGGGC ATCCTGACGG GCCTCGCATC CGTCGGTCTG

421 CCCCTTGGCC GCGGTCTCCT GCTTCTCGCC GAGATGAGCG CCAAGGGCAA CCTCGCGACT

481 GGCGAGTACA CGGCCAAGAA TGTCGAGGCG GCGAGGCGGC ATCCTGAATT CGTGATGGGC

541 TTCGTTGCGA TGCGGAGGGT GGACGAGCGG GAAGAGACGG CTGGCGGTGT TGCGCCGGGG

601 GAAGGGGCCG ACTACGTCAT CATGACGCCC GGCGTCGGAC TCGACTCGAA GGGCGACGGC

661 ATGGGCCAGC AGTACCGTAC ACCCGACGAG GTCATCCGCG AGTCCGGCTG CGACGTTATC

721 ATCGTCGGTC GGGGTATCTA CGGCGGCGGC GACGGCAACC CTAACGAAGA GATCGTCAAG

781 CAGTGCAAGC GGTATCAGGA GGCGGGCTGG AAGGCGTACG AGGACAGGCT GAGGCAGTGA

3.上述步骤2所得序列全长840bp，编码蛋白质具有如序列表中SEQID NO：2所示的氨基酸序列。该蛋白质含有279个氨基酸残基，无信号肽序列，无N糖基化修饰序列N-X-T/S，分子量31kDa，含34个碱性氨基酸残基(K，R)，38个强酸性氨基酸残基(D，E)，96个疏水性氨基酸残基(A，I，L，F，W，V)，58个极性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)。利用DNAstarMegAlign将该氨基酸序列与几种酵母来源的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶的氨基酸序列进行比较，发现具有58％-63％的序列同源性。结果表明获得了圆红冬孢酵母AS2.1389乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因ura3的全长cDNA编码区序列。

序列号：2(SEQ ID NO：2)

序列长度：279AA

序列类型：氨基酸

来源：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

序列特征：无信号肽序列，无N糖基化修饰序列N-X-T/S。

1 MPSITTRTYA ERAAKHPVPV AKQLLDICDR KKTNLCVSVD VTSKAGLLRI

51 AEAAGPYCCC IKTHIDIVED FDRDLVQQLQ ALADKHDFLI WEDRKFADIG

101 STVRLQYSSG IYKIASWAHI TNAHLVPGEG ILTGLASVGL PLGRGLLLLA

151 EMSAKGNLAT GEYTAKNVEA ARRHPEFVMG FVAMRRVDER EETAGGVAPG

201 EGADYVIMTP GVGLDSKGDG MGQQYRTPDE VIRESGCDVI IVGRGIYGGG

251 DGNPNEEIVK QCKRYQEAGW KAYEDRLRQ

实施例4：圆红冬孢酵母AS 2.1389 ura3的基因组DNA的获取

1.按照“精编分子生物学实验指南(第四版)(奥斯伯等著，颜子颖等译，科学出版社出版)”描述方法提取圆红冬孢酵母AS 2.1389的基因组DNA，紫外/可见光光谱分析测得样品OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.88，表明基因组DNA质量很好。冻存于-20℃，备用。

2.以圆红冬孢酵母AS 2.1389的基因组DNA为模板，利用实施例3步骤2的两条引物ura3-full-sense和ura3-full-anti，按照常规方法进行PCR扩增，得到约1.0kb的PCR(图3)。PCR扩增产物按照实施例2的操作步骤回收、克隆到pMD18-T载体，并进行测序，得到如序列表SEQ ID NO：3所示的DNA序列。该序列长度为1017bp，与ura3的cDNA序列对比，发现存在3个内含子，分别为5’端第187位到第251位碱基，5’端第364位到第419位碱基，5’端第728位到第783位碱基。结果表明获得了圆红冬孢酵母AS2.1389乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因ura3的基因组DNA。

序列号：3(SEQ ID NO：3)

序列长度：

序列类型：DNA

来源：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

序列特征：

外显子(exon)和内含子(intron)、起始密码子和终止密码子

存在位置：ATG，1位；TGA，1017位；正义链引物3’端序列，1-26位；反义链引物3’端序列互补链位置，993—1017位。3个内含子位置分别为5’端第187位到第251位碱基，5’端第364位到第419位碱基，5’端第728位到第783位碱基。

1 ATGCCGTCCA TCACGACCCG CACCTACGCC GAACGGGCTG CCAAGCACCC CGTCCCGGTC

61 GCAAAGCAGT TGCTCGACAT CTGCGACCGC AAAAAGACCA ACCTCTGCGT TTCAGTCGAC

121 GTGACGAGCA AGGCGGGCCT GCTCAGGATC GCAGAGGCTG CCGGCCCGTA CTGCTGCTGC

181 ATCAAGGTAG GTTGTACCGG CGCTGAAGTA ATCCGAGGAC CGCAGCTGAC AGACCGAGAC

241 ACCGACGATA GACCCACATC GACATCGTCG AGGACTTTGA CCGGGATCTC GTTCAGCAAC

301 TGCAGGCTCT CGCAGACAAG CACGATTTTC TGATTTGGGA GGACCGCAAG TTTGCCGACA

361 TCGGTGCGTC AATCGAGACT CCCGACTACC TTCCCCGCTG ATGGCCCGCG AGACGACAGG

421 CAACACCGTT CGGCTGCAGT ACTCGTCCGG TATCTACAAG ATCGCATCCT GGGCGCACAT

481 CACCAACGCC CACTTGGTCC CCGGCGAGGG CATCCTGACG GGCCTCGCAT CCGTCGGTCT

541 GCCCCTTGGC CGCGGTCTCC TGCTTCTCGC CGAGATGAGC GCCAAGGGCA ACCTCGCGAC

601 TGGCGAGTAC ACGGCCAAGA ATGTCGAGGC GGCGAGGCGG CATCCTGAAT TCGTGATGGG

661 CTTCGTTGCG ATGCGGAGGG TGGACGAGCG GGAAGAGACG GCTGGCGGTG TTGCGCCGGG

721 AGAAGGGGTG CGTCCCATCT CACTCTTTTC CGCTCAACTT CAGCTGACTC CGTGCTCCAC

781 CAGGCCGACT ACGTCATCAT GACGCCCGGC GTCGGACTCG ACTCGAAGGG CGACGGCATG

841 GGCCAGCAGT ACCGTACACC CGACGAGGTC ATCCGCGAGT CCGGCTGCGA CGTTATCATC

901 GTCGGTCGGG GTATCTACGG CGGCGGCGAC GGCAACCCTA ACGAAGAGAT CGTCAAGCAG

961 TGCAAGCGGT ATCAGGAGGC GGGCTGGAAG GCGTACGAGG ACAGGCTGAG GCAGTGA

实施例5：构建重组载体pYES2/CT-Rt-ura3

参照文献方法(Van den Ent，F.，Lowe，J.，2006.RF cloning：Arestriction-free method for inserting target genes into plasmids.J.Biochem.Biophys.Methods 67，67-74)，设计RF克隆引物：ura3-RF-sense：5′-CCTGCAGGAAACGAAGATAAATCATatgccgtacatcacgacccgcacct-3′和ura3-RF-anti：

5′-TGCATTTACTTATAATACAGTTTTTtcactgcctcagcctgtcctcgtac-3′(其中大写字母部分序列与pYES2/CT载体中原有的ura3ORF两侧的序列互补，小写字母部分序列与圆红冬孢酵母AS2.1389乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因Rt-ura3互补)，构建重组载体pYES2/CT-Rt-ura3，构建流程如图5所示。

1.PCR反应体系I及流程：10×PCR缓冲液(大连TaKaRa)5.0μl，dNTPs(大连TaKaRa)1.0μl，ura3-RF-sense引物(10mmol/l)1.0μl，ura3-RF-anti引物(10mmol/l)1ul，Taq酶(大连TaKaRa)0.5μl，携带Rt-ura 3的T-ura3载体(50ng/μl)2.0μl，ddH₂O 39.5μl，于94℃保温3min，然后于94℃ 30s，57℃ 45s，72℃ 1min，35个循环，72℃ 10min，4℃结束反应。

2.反应体系II及流程：模板(pYES2/CT，购自Invitrogen公司，200ng/ul)1μl，上述步骤1产物8μl，10×PCR缓冲液(大连TaKaRa)5.0μl，ddH₂O 33μl，将以上成分混匀加样至PCR管中，于95℃保温2min，待混合物降到室温时置于冰上，加入1.5μl dNTPs(大连TaKaRa)，1.5μl pfu DNA聚合酶(北京鼎国)，于68℃ 5min，95℃ 1min，55℃ 1.5min，68℃ 18min，35个循环，4℃结束反应，得到约7kb左右的PCR产物(图4)。

3.上述步骤2的PCR产物用Dpn I(购自New England Biolabs)1μl于37℃消化1小时，取5μl电击转化E.coli DH5α感受态细胞(按标准方法制备)，电击转化参数：2200-2500V，400Ω，25μF。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取和测序分析。结果显示，圆红冬孢酵母AS2.1389 Rt-ura3 ORF序列正确替换pYES2/CT原有的ura3 ORF序列。新质粒命名为pYES2/CT-Rt-ura3。

实施例6：酿酒酵母基因工程菌株构建

将pYES2/CT-Rt-ura3电击转化营养缺陷型酿酒酵母BY4741(Mat a；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0，购自ATCC，编号：ATCC 201388)感受态细胞，取200μl转化液涂布不含尿嘧啶的SD培养基(0.67％ YNB，2％葡萄糖，0.005％组氨酸，0.005％蛋氨酸，0.01％亮氨酸，2％琼脂粉。参考Invitrogen公司pYES2/CT产品手册配制)，30℃倒置培养2天，得到约50个生长正常的转化子菌落(图6)。在相同条件下未经转化的酿酒酵母BY4741菌液涂布在不含尿嘧啶的SD培养基上，没有菌落形成。实验表明，携带质粒pYES2/CT-Rt-ura3的酿酒酵母BY4741获得了新表型，属于基因工程菌株。

实验结果还表明，Rt-ura3基因产物可以补偿酿酒酵母BY4741的URA3营养缺陷，重建嘧啶生物合成途径，生长培养基中无需外加尿嘧啶，从而验证了Rt-ura3基因的生物学功能。

实施例7：圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶URA3的结构表征

参考Invitrogen公司pYES2/CT产品手册和分子克隆实验指南第三版(萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)纯化得到圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶URA3。纯化后的重组OMPdecase的结晶是在4℃用悬滴结晶法获得的。采用Hampton Research公司的Kit I和Kit II试剂盒及稀疏矩阵采样法，摸索获得可基本满足高分辨率的结构解析要求的晶体。最终的结晶条件：重组URA3蛋白溶液浓度10mg/ml，0.1M Hepes(pH7.0)、10％(w/v)异丙醇和20％(w/v)聚乙二醇4000做为促进剂，温度：4℃。用多波长反常散射法(MAD)确定位相，MAD数据在ADSC Quantum-4RCCD探测器上收集，所有数据用DPS软件包进行统一，用CCP4软件包进行坐标修正与处理。模型用Xtal View 4.0软件在Silicon Graphics OCTANE上构建和校正，用REFMAC程序进行精化。圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶晶体属于空间群P2₁2₁2₁，晶格常数为

，

，

，根据衍射数据得到三维结构模型见图8。

实施例8：圆红冬孢酵母营养缺陷型菌株构建及应用

参考文献(Baudin A，Ozier-Kalogeropoulos O，Denouel A，et al.A simpleand efficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae.Nucleic Acids Res，1993，21(14)：3329-3330)所述PCR介导的基因一步灭活法构建圆红冬孢酵母营养缺陷型菌株。

1.设计合成两条引物，Ura3-disruption-up1：5′-ctgggcgcacatcaccaacgcccacttggtccccggcgaCGTACGCTGCAGGTCGAC-3′(大写字母部分为pFA6-kanMax4同源序列，小写字母部分与Rt-ura3基因组DNA序列一致，其中下划线部分与引物Ura3-disruption-up90下划线序列一致)和Ura3-disruption-down1：5′-

aacgtcgcagccggactcgcg-ATCGATGAATTCGAGCTCG-3′(大写字母部分为pFA6-kanMax4同源序列，小写字母部分与Rt-ura3基因组DNA序列一致，双下划线部分序列与引物Ura3-disruption-down90双下划线序列一致)。以pFA6-kanMax4 DNA质粒为模板，以Ura3-disruption-up1和Ura3-disruption-down1为引物，PCR扩增两端带有45bp左右同源重臂序列的ura3-基因敲除盒I。PCR体系(100μl)：10×PCR缓冲液10.0μl，dNTPs2.0μl，上游引物(20mmol/l)2.0μl，下游引物(20mmol/l)2.0μl，Taq酶1.0μl，模板1.0μl，ddH₂O 82μl。反应条件：94℃ 5min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环，72℃10min，4℃结束反应。PCR产物按实施例2的步骤回收，得到ura3-基因敲除盒I，保存于-20℃，备用。

2.以上步骤1的PCR反应产物为模板，以Ura3-disruption-up90：aggcaacaccgttcggctgcagtactcgtccggtatctacaagatcgcatcctgggcgcacatcaccaac(下划线部分序列与Ura3-disruption-upstream1下划线序列一致)和Ura3-disruption-down90gcactgcttgacgatctcttcgttagggttgccgtcgccgccgccgtaga

(双下划线部分序列与Ura3-disruption-down1双下划线序列一致)为引物，扩增两端带有90bp左右同源重臂序列的ura3-基因敲除盒II。PCR体系(100μl)：10×PCR缓冲液10.0μl，dNTPs 2.0μl，上游引物(20mmol/l)2.0μl，下游引物(20mmol/l)2.0μl，Taq酶1.0μl，模板1.0μl，ddH₂O 82μl。反应条件：94℃ 5min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环，72℃10min，4℃结束反应。PCR产物按实施例2的步骤回收，得到ura3-基因敲除盒II，保存于-20℃，备用。

3.取10μg(≦10μl体积)纯化好的ura3-基因敲除盒II，电击转化圆红冬孢酵母AS 2.1389感受态细胞，转化液涂布含200μg/ml G418的无尿嘧啶的CM固体培养基(0.67％ YNB，2％葡萄糖，200μg/ml G418，2％琼脂粉)平板，30℃倒置培养4天，得到约70个转化子菌落。

4.挑选步骤3所得转化子单菌落，在YEPD液体培养基上进行增菌培养，制备感受态细胞，备用。取10μg(≦10μl体积)纯化好的ura3-基因敲除盒II，电击转化新制备的感受态细胞，转化液涂布含5’-FOA(5’-氟乳清酸，购自上海金和生物技术有限公司)和G418的CM固体培养基(0.67％ YNB，2％葡萄糖，0.1％ 5’-FOA，0.0012％尿嘧啶，200μg/ml G418，2％琼脂粉)平板，30℃倒置培养5天，出现约30个转化子菌落。

5.挑选步骤4所得转化子单菌落，在YEPD液体培养基上进行增菌培养，菌株正常生长。将同一转化子菌落接种在不含尿嘧啶的SD培养基上，没有菌落形成。可见转化子获得了新表型，即：尿嘧啶营养缺陷型。因此，成功构建了圆红冬孢酵母AS 2.1389的尿嘧啶营养缺陷型工程菌株。

6.尿嘧啶营养缺陷型圆红冬孢酵母工程菌株在含有5’-FOA的培养基(0.1％ 5’-FOA，葡萄糖70g/L，(NH₄)₂SO₄0.1g/L，酵母粉0.75g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，pH6.0)中正常生长，28-30℃发酵96h后收集菌体，胞内油脂含量达到65wt％。而圆红冬孢酵母AS 2.1389对照菌则在含有5’-FOA的限氮培养基中无法生长。因此，该工程菌可以用于发酵生产油脂。

实施例9：圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶URA3的应用

乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶URA3催化转化乳清苷酸(OMP)合成尿苷酸UMP。

参考文献(Floyd E E and Jones M E，Isolation and characterization of theorotidine 5’-monophosphate decarboxylase domain of the multifunctionalprotein uridine 5’-monophosphate synthase.J.Biol.Chem.1985，260：9443-9451)方法，反应条件：2.0mM乳清苷酸(OMP)，20mM Tris-HCI，2.0mM DTT，0.1mM EDTA，pH7.4，总体积1.0ml。向上述溶液中加入URA3至终浓度0.8μM，在37℃孵育3h，尿苷酸(UMP)浓度达到1.6mM。结果显示，OMP的转化率达到80％。所以，圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶URA3用于制备尿嘧啶。

同时，提示圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶URA3还可用于转化5’-氟乳清酸(5’-FOA)制备5’-氟尿嘧啶(5’-FU，一种抗肿瘤药物)。

乳清酸核苷.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院大连化学物理研究所

<120>一种乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因及其蛋白和应用

<130>

<160>3

<170>PatentIn version　3.1

<210>1

<211>840

<212>DNA

<213>圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(837)

<223>

<400>1

<210>2

<211>279

<212>PRT

<213>圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

<400>2

<210>3

<211>1017

<212>DNA

<213>圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

<220>

<221>exon

<222>(1)..(186)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(784)..(1017)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(728)..(783)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(420)..(727)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(364)..(419)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(252)..(363)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(187)..(251)

<223>

<400>3

Claims

1.一种乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因，其特征在于：具有序列表SEQID NO：1所示的脱氧核苷酸序列。

2.按照权利要求1所述乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因，其特征在于：其来源于圆红冬孢酵母，基因组DNA具有序列表SEQ ID NO：3所示的脱氧核苷酸序列。

3.一种权利要求1所述乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因的编码蛋白，其特征在于：具有序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

4.一种权利要求1所述乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因的应用，其特征在于：所述乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因的开放阅读框ORF置换了载体pYES2/CT所携带来源于酿酒酵母ura3的ORF，获得重组载体pYES2/CT-Rt-ura3；即重组载体pYES2/CT-Rt-ura3的2919-3756位具有乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因的开放阅读框ORF序列；可以用于补偿营养缺陷型酿酒酵母菌BY4741的嘧啶生物合成途径，使构建的工程菌在不含尿嘧啶的培养基中正常生长。

5.一种权利要求1所述乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因的应用，其特征在于：序列表SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列可作为营养缺陷型标记基因或反选择标记基因用于基因工程菌株中，可构建新的酵母遗传操作系统及新的重组工程菌株，所得到的基因工程菌株携带全部乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因Rt-ura3的序列或部分Rt-ura3序列。

6.按照权利要求5所述乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因的应用，其特征在于：所述基因工程菌株为圆红冬孢酵母基因工程菌株。

7.一种DNA序列，其特征在于：与权利要求1所述序列表SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列具有95％以上同源性，且编码蛋白质具有乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶的功能。