CN106164252A - 用于琥珀酸产生的改进微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及修饰微生物，与其野生型相比，其具有降低的pykA基因编码的酶的活性。本发明还涉及用于产生有机化合物的方法及修饰微生物的用途。

Description

用于琥珀酸产生的改进微生物
本发明涉及修饰微生物、用于产生有机化合物的方法及修饰微生物的用途。
诸如具有6个碳或6个以下碳的小的二羧酸的有机化合物是商业上重要的具有许多用途的化学品。例如，小的二酸包括1,4-二酸，如琥珀酸、苹果酸和酒石酸，及5碳分子衣康酸。其他二酸包括二碳草酸、三碳丙二酸、五碳戊二酸和6碳己二酸，也存在这类二酸的许多衍生物。
作为一个组，小的二酸具有一些化学相似性，它们在聚合物生产中的使用可以为树脂提供特化性质。这种通用性使得它们能够容易地契合下游化学基础市场。例如，1,4-二酸分子满足大规模化学品马来酐的许多用途，因为它们转化为多种工业化学品(四氢呋喃、丁内酯、1,4-丁二醇、2-吡咯烷酮)及琥珀酸衍生物琥珀酰胺、琥珀腈、二氨基丁烷和琥珀酸酯。酒石酸在食品、皮革、金属和印刷工业中具有许多用途。衣康酸形成用于产生3-甲基吡咯烷酮、甲基-BDO和甲基-THF等的原材料。
尤其是，琥珀酸(succinic acid)或琥珀酸(succinate)(这些术语在本文中可互换使用)引起了相当大的兴趣，因为它已在食品、化学和药物工业中用作许多工业上重要的化学品的前体。事实上，来自美国能源部的报告报道，琥珀酸是从生物量制造的前12种化学构件之一。因此，在细菌中产生二酸的能力将具有显著的商业重要性。
WO-A-2009/024294公开了产琥珀酸细菌菌株，该菌株是巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)成员，最初分离自瘤胃，能够利用甘油作为碳源，从其衍生的变体和突变菌株保留该能力，尤其是保藏于DSMZ(德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH),Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,德国)的命名为DD1的细菌菌株，其具有保藏号DSM 18541(ID 06-614)，且具有产生琥珀酸的能力。如Kuhnert等,2010所分类，DD1菌株属于物种Basfia succiniciproducens和巴斯德氏菌科。这些菌株的突变(其中破坏了ldhA基因和/或pflD或pflA基因)公开于WO-A-2010/092155中，这些突变菌株的特征在于，与WO-A-2009/024294中公开的DD1野生型相比，在厌氧条件下，从诸如甘油或甘油和糖类(如麦芽糖)的碳源产生的琥珀酸显著增加。
但是，在用诸如WO-A-2009/024294或WO-A-2010/092155中公开的那些的细菌菌株来产生诸如琥珀酸的有机化合物时，将碳源转化为希望得到的有机化合物的选择性以及希望得到的有机化合物的产率仍可以改进。
此外，已观察到，在用现有技术的细菌菌株来在厌氧条件下产生诸如琥珀酸的有机化合物时，也可以改进微生物的生长速度，以使微生物更适合用于以工业规模产生诸如琥珀酸的有机化合物。
因此本发明的目的是克服现有技术的劣势。
具体而言，本发明的目的是提供微生物，该微生物可以用于发酵产生有机化合物(如琥珀酸)，且不仅从可同化的碳源(如甘油、葡萄糖、蔗糖、木糖、乳糖、果糖或麦芽糖)大量(优选仅有少量副产物)产生希望得到的有机产物(如琥珀酸)，还表征为厌氧条件下的快速生长。
通过修饰微生物来为达到上述目的提供贡献，与其野生型相比，该修饰微生物具有降低的pykA基因编码的酶的活性，其中衍生该修饰微生物的野生型属于巴斯德氏菌科。尤其通过已在野生型pykA基因中引入突变的修饰微生物来提供促成达到上述目的，其中衍生该修饰微生物的野生型属于巴斯德氏菌科。
令人惊奇地，已发现，优选通过在野生型pykA基因中引入至少一个突变来降低pykA基因编码的酶(此酶PykA是催化磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转化为丙酮酸的丙酮酸激酶(EC2.7.1.40))的活性产生这样的重组巴斯德氏菌科菌株，与其中此酶活性未降低的相应微生物相比，该菌株表征为提高的有机化合物(如琥珀酸)产率，以及厌氧条件下的更快生长。
在表述“与其野生型相比具有降低的x基因编码的酶的活性的修饰微生物”(其中x基因是pykA基因，及可选地，后文所述的ldhA基因、pflA基因和/或pflD基因)的背景中，术语“野生型”指其中x基因编码的酶的活性未降低的微生物，即指其基因组以引入x基因(尤其是pykA基因，及可选地，ldhA基因、pflA基因和/或pflD基因)的遗传修饰之前的状态存在的微生物。优选地，表述“野生型”指其基因组尤其是其x基因以由于进化而天然产生的状态存在的微生物。该术语可以用于整个微生物和单个基因二者，但优选用于单个基因，如pykA基因、ldhA基因、pflA基因和/或pflD基因。因此术语“修饰微生物”包括这样的微生物，该微生物已进行遗传改变、修饰或改造(例如遗传改造)，使得它与它所衍生自的天然存在的野生型微生物相比显示改变的、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，在遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)。根据本发明的修饰微生物的具体的优选实施方案，修饰微生物是重组微生物，其是指用重组DNA获得的微生物。本文所用的表述“重组DNA”指源自用实验室方法(分子克隆)使来自多种来源的遗传物质结合在一起产生否则将不见于生物中的序列的DNA序列。
衍生本发明的微生物的野生型属于巴斯德氏菌科。巴斯德氏菌科包含革兰氏阴性朊细菌门(Proteobacteria)的大家族，成员从细菌(如流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae))至动物和人类黏膜的共生体。大部分成员作为鸟类和哺乳类黏膜表面(尤其是在上呼吸道中)上的共生体生活。巴斯德氏菌科通常为杆状，是值得注意的一组兼性厌氧菌。它们可以通过氧化酶的存在而与相关的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)区分开，并通过鞭毛的缺乏而与大多数其他相似的细菌区分开。巴斯德氏菌科中的细菌已根据代谢特性及其16S RNA和23S RNA序列分类为许多属。巴斯德氏菌科的许多成员包含丙酮酸甲酸裂合酶基因，能够厌氧发酵碳源为有机酸。
根据本发明的修饰微生物的具体的优选实施方案，衍生修饰微生物的野生型属于Basfia属，尤其优选衍生修饰微生物的野生型属于Basfiasucciniciproducens物种。
最优选地，衍生本发明的修饰微生物的野生型是在布达佩斯条约下保藏于德国DSMZ(德意志微生物保藏中心)的保藏号DSM 18541的Basfia succiniciproducens菌株DD1。此菌株最初分离自德国来源的牛的瘤胃，巴斯德氏菌属(Pasteurella)细菌可从动物优选哺乳动物的胃肠道分离。细菌菌株DD1尤其可从牛瘤胃分离，且能够利用甘油(包括粗甘油)作为碳源。可以用于制备本发明的修饰微生物的其他Basfia属菌株是以保藏号DSM22022，保藏于DSZM的Basfia属菌株，或保藏于瑞典哥德堡大学培养物保藏所(CultureCollection of the University ofCCUG)的具有保藏号CCUG 57335、CCUG57762、CCUG 57763、CCUG 57764、CCUG 57765或CCUG 57766的Basfia属菌株。该菌株最初分离自德国或瑞士来源的牛的瘤胃。
在此背景中，尤其优选衍生本发明的修饰微生物的野生型具有SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1显示至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％序列同源性的序列的16S rDNA。还优选衍生本发明的修饰微生物的野生型具有SEQ ID NO:2或与SEQ IDNO:2显示至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％序列同源性的序列的23SrDNA。
与待用于本发明的修饰微生物的多种多肽或多核苷酸一并提到的以百分比值表示的同一性优选计算为所比对的序列全长内残基的同一性，例如，借助来自生物信息学软件包EMBOSS(5.0.0版,http://emboss.source-forge.net/what/)的程序，以默认参数计算的同一性(对于非常相似的序列)，该默认参数即为缺口开放(开放一个缺口的罚分)：10.0；缺口延伸(延伸一个缺口的罚分)：0.5；数据文件(包括在软件包中的评分矩阵文件)：EDNAFUL。
应指出，本发明的修饰微生物不仅可以衍生自上述野生型微生物，尤其是衍生自Basfia succiniciproducens菌株DD1，还可以衍生自这些菌株的变体。在此背景中，表述“菌株的变体”包含具有与野生型菌株相同或基本相同的特征的每种菌株。在此背景中，尤其优选变体的16S rDNA与衍生变体的野生型具有至少90％、优选至少95％、更优选至少99％、更优选至少99.5％、更优选至少99.6％、更优选至少99.7％、更优选至少99.8％和最优选至少99.9％同一性。还尤其优选变体的23S rDNA与衍生变体的野生型具有至少90％、优选至少95％、更优选至少99％、更优选至少99.5％、更优选至少99.6％、更优选至少99.7％、更优选至少99.8％和最优选至少99.9％同一性。此定义意义上的菌株的变体可以例如通过用诱变化学剂、X射线或紫外线处理野生型菌株来获得。
本发明的修饰微生物的特征在于，与其野生型相比，pykA基因编码的酶的活性降低。
酶活性的降低(Δ活性)优选定义如下：
其中，在测定Δ活性时，在完全相同的条件下测定野生型中的活性和修饰微生物中的活性。用于检测和测定pykA基因编码的酶的活性的方法可见于例如Bergmeyer,H.U.,Gawehn,K.和Grassl,M.(1974):“Methods of Enzymatic Analysis”,第2版,I卷,509-511页,Academic Press,Inc.,New York,NY.中。
降低的本文公开的酶的活性，尤其是降低的pykA基因编码的酶、乳酸脱氢酶和/或丙酮酸甲酸裂合酶的活性可以是，与野生型微生物中该酶的活性相比，酶活性降低0.1％至99％，或酶活性降低至少15％、或至少25％、或至少35％、或至少45％、或至少55％、或至少65％、或至少75％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％。优选地，pykA基因编码的酶活性的降低在15％至99％范围内，更优选在50％至95％范围内，甚至更优选在15％至99％范围内。术语“降低的pykA基因编码的酶的活性”或下文所述的“降低的乳酸脱氢酶活性”或“降低的丙酮酸甲酸裂合酶活性”也涵盖没有可检测到的这些酶活性的修饰微生物。
术语“降低的酶活性”包括，例如，该遗传修饰(例如遗传改造)微生物以比该微生物的野生型的表达水平低的水平表达该酶。用于降低酶的表达的遗传操作可以包括但不限于缺失编码该酶的基因或其部分、改变或修饰与编码该酶的基因的表达相关的调节序列或位点(例如通过去除强启动子或阻抑型启动子)、修饰涉及编码该酶的基因的转录和/或基因产物的翻译的蛋白质(例如调节蛋白质、抑制因子、增强子、转录激活因子等)、或本领域例行的任何其他降低特定基因表达的常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子或其他方法来敲除或阻断靶蛋白的表达)。此外，可以在mRNA中引入去稳定化元件或引入导致RNA核糖体结合位点(RBS)退化的遗传修饰。还可能以这样的方式改变基因的密码子选择，使得翻译效率和速度降低。
降低的酶活性也可以通过引入一个或多个导致酶活性降低的基因突变来获得。此外，酶活性降低还可以包括使激活待降低其活性的酶所必需的激活酶失活(或降低表达)。通过后一种方法，待降低其活性的酶优选保持处于失活状态。
具有降低的pykA基因编码的酶的活性的微生物可以天然存在，即由于自发突变。可以通过多种技术(如化学处理或辐射)来将微生物修饰为缺乏或具有显著降低的pykA基因编码的酶的活性。为此，将通过例如诱变化学剂、X射线或紫外线来处理微生物。在随后的步骤中，将选择具有降低的pykA基因编码的酶的活性的那些微生物。修饰微生物也可通过同源重组技术获得，该同源重组技术旨在突变、破坏或切除微生物基因组中的pykA基因，或用相应基因取代该基因，该相应基因编码与野生型基因编码的酶相比具有降低的活性的酶。
根据本发明的修饰微生物的优选实施方案，通过在pykA基因中、优选在野生型pykA基因中引入至少一个突变来降低pykA基因编码的酶的活性。在此背景中，尤其优选该至少一个突变导致pykA基因的核酸序列的修饰，使得修饰基因编码的酶的氨基酸序列在至少一个氨基酸上不同于野生型pykA基因编码的酶的氨基酸序列。
可以例如通过定位或随机诱变来在pykA基因中引入突变，然后通过重组来将修饰基因引入微生物的基因组中。可以通过借助PCR突变基因序列SEQ ID NO:3来产生pykA基因的变体。可以用“Quickchange定位诱变试剂盒”(Stratagene)来进行定位诱变。可以借助“GeneMorph II随机诱变试剂盒”(Stratagene)来进行SEQ ID NO:3的整个编码序列或仅其部分的随机诱变。通过所用模板DNA的量来将诱变率设为希望得到的突变量。通过靶向单突变组合或通过连续进行几个诱变循环来产生多重突变。
在下文中，描述适合用于重组、尤其是用于将修饰的pykA基因引入微生物中的技术。
此技术在本位中有时也称为“Campbell重组”(Leenhouts等,Appl EnvMicrobiol.(1989),55卷,394-400页)。本文所用的“Campbell入(Campbell in)”指原宿主细胞的转化体，其中整个环状双链DNA分子(例如质粒)通过单个同源重组事件(交叉入(cross in)事件)整合入染色体，并有效导致该环状DNA分子的线性化形式插入与该环状DNA分子的第一DNA序列同源的染色体的第一DNA序列。“已Campbell入(Campbelled in)”指已整合入“Campbell入”转化体的染色体中的线性化DNA序列。“Campbell入”包含双份第一同源DNA序列，其中每个拷贝包含和围绕同源重组交叉点的拷贝。
本文所用的“Campbell出(Campbell out)”指源自“Campbell入”转化体的细胞，其中在包含在“已Campbell入”DNA的线性化插入DNA上的第二DNA序列和与该线性化插入片段的第二DNA序列同源的染色体来源的第二DNA序列之间发生了第二同源重组事件(交叉出(cross out)事件)，该第二重组事件导致一部分整合DNA序列的缺失(抛弃)，但更重要的是，还导致一部分(这可以少至单个碱基)整合的已Campbell入DNA保留在染色体中，使得与原宿主细胞相比，“Campbell出”细胞在染色体中包含一个或多个有意改变(例如，单个碱基取代、多个碱基取代、插入异源基因或DNA序列、插入同源基因或修饰同源基因的一个或多个额外拷贝、或插入包含一个以上上文所列的这些前述实例的DNA序列)。优选通过针对包含在“已Campbell入”DNA序列的一部分(希望抛弃的部分)中的基因的逆选择来获得“Campbell出”细胞，该基因例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)sacB基因，其在约5％至10％蔗糖存在下培养的细胞中表达时致死。在有或无逆选择的情况下，可以通过用任何可筛选表型筛选希望得到的细胞来获得或鉴定希望得到的“Campbell出”细胞，该可筛选表型例如但不限于菌落形态、菌落颜色、存在或缺乏抗生素抗性、聚合酶链反应确定给定DNA序列的存在或缺乏、存在或缺乏辅源营养、存在或缺乏酶、菌落核酸杂交、抗体筛选等。术语“Campbell入”和“Campbell出”也可以以多种时态用作动词来指上述方法或过程。
应理解，导致“Campbell入”或“Campbell出”的同源重组事件可以在同源DNA序列内的DNA碱基的一个范围内发生，由于同源序列将在此范围的至少一部分内彼此相同，通常不可能确切地指出在什么地方发生交叉事件。换言之，不可能精确指出那个序列最初来自插入的DNA，哪个序列最初来自染色体DNA。此外，第一同源DNA序列和第二同源DNA序列通常由部分非同源的区域分隔开，正是此非同源区域保留在“Campbell出”细胞的染色体中。
优选地，第一和第二同源DNA序列长度为至少约200个碱基对，且长度可以为至多几千个碱基对。但是，可使该方法对更短或更长的序列有效。例如，第一和第二同源序列的长度可以在约500个碱基至2000个碱基的范围内，通过安排第一和第二同源序列为大致相同的长度，优选差异小于200个碱基对，最优选二者中较短的序列是较长的序列的碱基对长度的至少70％，来便于从“Campbell入”获得“Campbell出”。
其活性在本发明的修饰微生物中降低的pykA基因优选包含选自以下的核酸：
a)具有核苷酸序列SEQ ID NO:3的核酸；
b)编码氨基酸序列序列SEQ ID NO:4的核酸；
c)与a)或b)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最优选100％同一的核酸，该同一性是a)或b)的核酸全长内的同一性；
d)编码与a)或b)的核酸所编码的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最优选100％同一的氨基酸序列的核酸，该同一性是a)或b)的核酸所编码的氨基酸序列全长内的同一性；
e)能够在严格条件下与a)或b)的任意核酸的互补序列杂交的核酸；和
f)编码与a)或b)的任意核酸相同的蛋白质但由于遗传密码的简并性而不同于以上a)或b)的核酸的核酸。
本文所用的术语“杂交”包括“核酸分子的链通过碱基配对与互补链结合的任何过程”(J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology,Stockton Press,纽约)。杂交和杂交的强度(即核酸分子间结合的强度)受诸多因素影响，如核酸分子间的互补程度、所涉及条件的严格性、所形成杂合链的Tm、核酸分子内的G:C比。
本文所用的术语“Tm”用来指“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群体的一半解离为单链的温度。用于计算核酸分子Tm的方程为本领域公知。如标准参考文献所示，可以通过方程Tm＝81.5+0.41(％G+C)来计算核酸分子处于1M NaCl水溶液中时的Tm值的简单估计值(参见例如Anderson和Young,Quantitative Filter Hybridization,in Nucleic AcidHybridization(1985))。其他参考文献包括更复杂的计算，其将结构以及序列特征考虑在Tm的计算中。严格条件为本领域技术人员已知，且可见于Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。
具体而言，术语“严格条件”指这样的条件，其中作为互补核苷酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)的片段或与互补核苷酸分子同一的100个相邻核苷酸或更多核苷酸、150个相邻核苷酸或更多核苷酸、200个相邻核苷酸或更多核苷酸、或250个相邻核苷酸或更多核苷酸，在等同于在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，并在50℃或65℃下、优选65℃下在2×SSC、0.1％SDS中洗涤的条件下，与特定核酸分子(DNA、RNA、ssDNA或ssRNA)杂交。优选地，该杂交条件等同于在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，并在50℃或65℃、优选65℃下在1×SSC、0.1％SDS中洗涤，更优选地，该杂交条件等同于在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA中杂交，并在50℃或65℃、优选65℃下在0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤。优选地，该互补核苷酸与pykA核酸片段或整个pykA核酸杂交。备选地，优选的杂交条件包括在65℃下在1×SSC中或在42℃下在1×SSC和50％甲酰胺中杂交，然后在65℃下在0.3×SSC中洗涤，或在50℃下在4×SSC中或在40℃下在6×SSC和50％甲酰胺中杂交，然后在50℃下在2×SSC中洗涤。其他优选的杂交条件是0.1％SDS、0.1SSD和65℃。
通过上述定位诱变和“Campbell重组”的组合在其中引入至少一个突变的pykA基因优选包含上文所定义的核酸。
具有核苷酸序列SEQ ID NO:3的核酸对应于Basfia succiniciproducens菌株DD1的pykA基因。
根据本发明的修饰微生物的优选实施方案，与其野生型相比，该修饰微生物不具有pcK基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(EC 4.1.1.49)的提高的活性水平。在此背景中，尤其优选的是，在该修饰微生物中，磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶活性水平未由于用改变的提高磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶活性的调节序列取代pck基因的天然调节序列而提高。
根据本发明的修饰微生物的另一优选实施方案，与其野生型相比，此微生物不仅表征为降低的pykA基因编码的酶的活性，还表征为：
i)降低的丙酮酸甲酸裂合酶活性；
ii)降低的乳酸脱氢酶活性；或
iii)降低的丙酮酸甲酸裂合酶活性和降低的乳酸脱氢酶活性。
WO-A-2010/092155、US 2010/0159543和WO-A-2005/052135中公开了乳酸脱氢酶缺陷和/或丙酮酸甲酸裂合酶活性缺陷的修饰微生物，其关于降低微生物中、优选巴斯德氏菌属细菌细胞中、尤其优选Basfia succiniciproducens菌株DD1中乳酸脱氢酶和/或丙酮酸甲酸裂合酶活性的不同方法的公开内容，在此引入作为参考。用于测定丙酮酸甲酸裂合酶活性的方法例如由Asanuma N.和Hino T.公开于“Effects of pH and Energy Supplyon Activity and Amount of Pyruvate-Formate-Lyase in Streptococcus bovis”,Appl.Environ.Microbiol.(2000),66卷,3773-3777页中，用于测定乳酸脱氢酶活性的方法例如由Bergmeyer,H.U.,Bergmeyer J.和Grassl,M.(1983-1986)公开于“Methods ofEnzymatic Analysis”,第3版,III卷,126-133页,Verlag Chemie,Weinheim中。
在此背景中，优选通过失活ldhA基因(其编码乳酸脱氢酶LdhA；EC 1.1.1.27或EC1.1.1.28)来达到降低乳酸脱氢酶活性，通过失活pflA基因(其编丙酮酸甲酸裂合酶激活物PflA；EC 1.97.1.4)或pflD基因(其编丙酮酸甲酸裂合酶PflD；EC 2.3.1.54)来达到降低丙酮酸甲酸裂合酶活性，其中优选通过缺失这些基因或其部分、通过缺失这些基因的调节元件或至少其部分、或通过在这些基因中引入至少一个突变来达到失活这些基因(即ldhA、pflA和pflD)，其中优选借助上文所述的“Campbell重组”来进行这些修饰。
其活性在本发明的修饰微生物中降低的ldhA基因优选包含选自以下的核酸：
α1)具有核苷酸序列SEQ ID NO:27的核酸；
α2)编码氨基酸序列序列SEQ ID NO:28的核酸；
α3)与α1)或α2)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最优选100％同一的核酸，该同一性是α1)或α2)的核酸全长内的同一性；
α4)编码与α1)或α2)的核酸所编码的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最优选100％同一的氨基酸序列的核酸，该同一性是α1)或α2)的核酸所编码的氨基酸序列全长内的同一性；
α5)能够在严格条件下与α1)或α2)的任意核酸的互补序列杂交的核酸；和
α6)编码与α1)或α2)的任意核酸相同的蛋白质但由于遗传密码的简并性而不同于以上α1)或α2)的核酸的核酸。
其活性在本发明的修饰微生物中降低的pflA基因优选包含选自以下的核酸：
β1)具有核苷酸序列SEQ ID NO:29的核酸；
β2)编码氨基酸序列序列SEQ ID NO:30的核酸；
β3)与β1)或β2)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最优选100％同一的核酸，该同一性是β1)或β2)的核酸全长内的同一性；
β4)编码与β1)或β2)的核酸所编码的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最优选100％同一的氨基酸序列的核酸，该同一性是β1)或β2)的核酸所编码的氨基酸序列全长内的同一性；
β5)能够在严格条件下与β1)或β2)的任意核酸的互补序列杂交的核酸；和
β6)编码与β1)或β2)的任意核酸相同的蛋白质但由于遗传密码的简并性而不同于以上β1)或β2)的核酸的核酸。
其活性在本发明的修饰微生物中降低的pflD基因优选包含选自以下的核酸：
γ1)具有核苷酸序列SEQ ID NO:31的核酸；
γ2)编码氨基酸序列序列SEQ ID NO:32的核酸；
γ3)与γ1)或γ2)的核酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最优选100％同一的核酸，该同一性是γ1)或γ2)的核酸全长内的同一性；
γ4)编码与γ1)或γ2)的核酸所编码的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％、最优选100％同一的氨基酸序列的核酸，该同一性是γ1)或γ2)的核酸所编码的氨基酸序列全长内的同一性；
γ5)能够在严格条件下与γ1)或γ2)的任意核酸的互补序列杂交的核酸；和
γ6)编码与γ1)或γ2)的任意核酸相同的蛋白质但由于遗传密码的简并性而不同于以上γ1)或γ2)的核酸的核酸。
在此背景中，优选本发明的修饰微生物进一步包含：
A)ldhA基因或至少其部分的缺失，ldhA基因的调节元件或至少其部分的缺失，或ldhA基因中至少一个突变的引入；
B)pflD基因或至少其部分的缺失，pflD基因的调节元件或至少其部分的缺失，或pflD基因中至少一个突变的引入；
C)pflA基因或至少其部分的缺失，pflA基因的调节元件或至少其部分的缺失，或pflA基因中至少一个突变的引入；
D)ldhA基因或至少其部分的缺失，ldhA基因的调节元件或至少其部分的缺失，或ldhA基因中至少一个突变的引入；
和
pflD基因或至少其部分的缺失，pflD基因的调节元件或至少其部分的缺失，或pflD基因中至少一个突变的引入；
或
E)ldhA基因或至少其部分的缺失，ldhA基因的调节元件或至少其部分的缺失，或ldhA基因中至少一个突变的引入；
和
pflA基因或至少其部分的缺失，pflA基因的调节元件或至少其部分的缺失，或pflA基因中至少一个突变的引入。
本发明的修饰微生物的尤其优选的实施方案是：
-Basfia属且尤其优选Basfia succiniciproducens物种的修饰细菌细胞，其中在pykA基因中引入了至少一个突变，优选至少一个导致pykA基因所编码的酶中至少一个氨基酸的取代的突变，最优选至少导致pykA基因所编码的酶中半胱氨酸取代167位甘氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸、或甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且酪氨酸取代417位半胱氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸、酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸的突变，且其中进一步优选与野生型相比，该修饰细菌细胞不具有提高的pck基因编码的酶的活性；
-Basfia属且尤其优选Basfia succiniciproducens物种的修饰细菌细胞，其中在pykA基因中引入了至少一个突变，优选至少一个导致pykA基因所编码的酶中至少一个氨基酸的取代的突变，最优选至少导致pykA基因所编码的酶中半胱氨酸取代167位甘氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸、或甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且酪氨酸取代417位半胱氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸、酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸的突变，且其中与野生型相比，优选通过修饰ldhA基因，尤其是通过修饰具有SEQ ID NO:27的核酸序列且编码具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LdhA的ldhA基因，来降低乳酸脱氢酶的活性，且其中进一步优选与野生型相比，该修饰细菌细胞不具有提高的pck基因编码的酶的活性；
-Basfia属且尤其优选Basfia succiniciproducens物种的修饰细菌细胞，其中在pykA基因中引入了至少一个突变，优选至少一个导致pykA基因所编码的酶中至少一个氨基酸的取代的突变，最优选至少导致pykA基因所编码的酶中半胱氨酸取代167位甘氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸、或甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且酪氨酸取代417位半胱氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸、酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸的突变，且其中与野生型相比，优选通过修饰pflA基因或pflD基因，尤其是通过修饰具有SEQ ID NO:29的核酸序列且编码具有SEQ IDNO:30的氨基酸序列的PflA的pflA基因，或通过修饰具有SEQ ID NO:31的核酸序列且编码具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的PflD的pflD基因，来降低丙酮酸甲酸裂合酶的活性，且其中进一步优选与野生型相比，该修饰细菌细胞不具有提高的pck基因编码的酶的活性；
或
-Basfia属且尤其优选Basfia succiniciproducens物种的修饰细菌细胞，其中在pykA基因中引入了至少一个突变，优选至少一个导致pykA基因所编码的酶中至少一个氨基酸的取代的突变，最优选至少导致pykA基因所编码的酶中半胱氨酸取代167位甘氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸、或甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且酪氨酸取代417位半胱氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸、或半胱氨酸取代167位甘氨酸、酪氨酸取代417位半胱氨酸且甘氨酸取代171位丙氨酸的突变，且其中与野生型相比，优选通过修饰ldhA基因和pflA基因，尤其是通过修饰具有SEQ ID NO:27的核酸序列且编码具有SEQ IDNO:28的氨基酸序列的LdhA的ldhA基因，或通过修饰具有SEQ ID NO:29的核酸序列且编码具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的PflA的pflA基因，或通过修饰ldhA基因和pflD基因，尤其是通过修饰具有SEQ ID NO:27的核酸序列且编码具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LdhA的ldhA基因，或通过修饰具有SEQ ID NO:31的核酸序列且编码具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的PflD的pflD基因，来降低乳酸脱氢酶和丙酮酸甲酸裂合酶的活性，且其中进一步优选与野生型相比，该修饰细菌细胞不具有提高的pck基因编码的酶的活性。
此外，通过产生有机化合物的方法来为解决一开始提到的问题提供贡献，该方法包括：
I)在包含至少一种可同化的碳源的培养基中培养本发明的修饰微生物，以允许修饰微生物产生有机化合物，从而获得包含有机化合物的发酵液；
II)从方法步骤I)中获得的发酵液回收有机化合物。
在方法步骤I)中，在包含至少一种可同化的碳源的培养基中培养本发明的修饰微生物，以允许修饰微生物产生有机化合物，从而获得包含有机化合物的发酵液。可通过本发明的方法产生的优选的有机化合物包括：羧酸，如甲酸、乳酸、丙酸、2-羟基丙酸、3-羟基丙酸、3-羟基丁酸、丙烯酸、丙酮酸或这些羧酸的盐；二羧酸，如丙二酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、戊二酸、衣康酸、己二酸或其盐；三羧酸，如柠檬酸或其盐；醇，如甲醇或乙醇；氨基酸，如L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-精氨酸、L-异亮氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-丝氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸等。
根据本发明的方法的优选实施方案，该有机化合物是琥珀酸。在本发明背景中使用的术语“琥珀酸”必须以其最广泛的含义理解，且还涵盖其盐(即琥珀酸盐)，例如，碱金属盐，如Na+和K+盐，或碱土金属盐，如Mg2+和Ca2+盐，或铵盐，或琥珀酸酐。
优选在约10℃至60℃或20℃至50℃或30℃至45℃范围内的温度下，在5.0至9.0或5.5至8.0或6.0至7.0的pH下，在培养基中培养本发明的修饰微生物。
优选地，在厌氧条件下产生有机化合物，尤其是琥珀酸。厌氧条件可以借助常规技术来建立，例如，通过对反应介质的组分脱气，并通过按例如0.1至1或0.2至0.5vvm的流速引入二氧化碳或氮气或其混合物和可选地引入氢气来维持厌氧条件。需氧条件可以借助常规技术来建立，例如，通过按例如0.1至1或0.2至0.5vvm的流速引入空气或氧气。根据需要，可以在方法中应用0.1至1.5bar的轻微超压。
可同化的碳源优选选自蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-甘露糖、甘油、其混合物及包含该化合物中的至少一种的组合物，或选自淀粉、纤维素、半纤维素和/或木素纤维素的分解产物。优选地，可同化的碳源选自D-葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘油及这些化合物中的至少两种的混合物，其中尤其优选甘油和D-葡萄糖、甘油和蔗糖、甘油和D-木糖、甘油和麦芽糖及D-葡萄糖和果糖的混合物。
可同化的碳源的初始浓度优选调节至5至100g/l、优选5至75g/l和更优选5至50g/l范围内的值，且可以在培养期间维持在该范围内。反应介质的pH可以通过加入适宜的碱来控制，例如气态氨、NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、Mg(HCO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N和/或其混合物。如果发酵方法过程中形成的有机化合物是羧酸或二羧酸，则尤其需要这些碱性中和剂。在琥珀酸作为有机化合物的情况下，Mg(OH)2和MgCO3是尤其优选的碱。
本发明的发酵步骤I)可以例如在搅拌式发酵罐、泡罩塔和环式反应器中进行。可能的方法类型(包括搅拌器类型和几何设计)的综合概述可见于Chmiel:“Bioprozesstechnik:Einführung in die Bioverfahrenstechnik”,1卷中。在本发明的方法中，在本发明的方法中，可用的典型变通形式是本领域技术人员已知或例如Chmiel,Hammes and Bailey:“Biochemical Engineering”中解释的以下变通形式：如批次、补料分批、反复补料分批或其他具有生物质再循环的连续发酵。取决于生产菌株，可以用空气、氧气、二氧化碳、氢气、氮气或适当的气体混合物进行通气，以达到良好的产率(YP/S)。
用于在方法步骤I)中产生有机化合物尤其是琥珀酸的尤其优选的条件是：
可同化的碳源：甘油、蔗糖、D-葡萄糖、麦芽糖、甘油+D-葡萄糖、甘油+蔗糖、甘油+麦芽糖、甘油+D-木糖、D-葡萄糖+果糖
温度：30至45℃
pH：5.5至7.0
所提供的气体：CO2
此外，优选在方法步骤I)中，可同化的碳源转化为有机化合物(优选琥珀酸)，碳产率YP/S为至少0.5g/g至约1.28g/g，例如，碳产率YP/S为至少0.6g/g、至少0.7g/g、至少0.75g/g、至少0.8g/g、至少0.85g/g、至少0.9g/g、至少0.95g/g、至少1.0g/g、至少1.05g/g、至少1.1g/g、至少1.15g/g、至少1.20g/g、至少1.22g/g或至少1.24g/g(有机化合物/碳，优选琥珀酸/碳)。
此外，优选在方法步骤I)中，可同化的碳源转化为有机化合物(优选琥珀酸)，单位生产率(specific productivity yield)为至少0.6g g DCW-1h-1有机化合物(优选琥珀酸)、或至少0.65g g DCW-1h-1、或至少0.7g g DCW-1h-1、或至少0.75g g DCW-1h-1或至少0.77g g DCW-1h-1有机化合物(优选琥珀酸)。
此外，优选在方法步骤I)中，可同化的碳源转化为有机化合物(优选琥珀酸)，有机化合物(优选琥珀酸)的时空产率为至少2.2g/(L×h)、或至少2.5g/(L×h)、至少2.75g/(L×h)、至少3g/(L×h)、至少3.25g/(L×h)、至少3.5g/(L×h)、至少3.7g/(L×h)、至少4.0g/(L×h)、至少4.5g/(L×h)、或至少5.0g/(L×h)有机化合物(优选琥珀酸)。根据本发明的方法的另一优选实施方案，在方法步骤I)中，修饰微生物将至少20g/l、更优选至少25g/l和甚至更优选至少30g/l的可同化碳源转化为至少20g/l、更优选至少25g/l和甚至更优选至少30g/l的有机化合物(优选琥珀酸)。
本文所述的不同产率参数(“碳产率”或“YP/S”、“单位生产率”或“时空产率(STY)”)为本领域公知，并按例如Song和Lee,2006所述测定。“碳产率”和“YP/S”(各以所产生的有机化合物的质量/所消耗的可同化碳源的质量表示)在本文中作为同义词使用。单位生产率描述每克干生物质每小时和每升发酵液产生的产物(如琥珀酸)的量。表示为“DCW”的干细胞重的量描述生物化学反应中生物活性微生物的量。值作为克产物/克DCW/小时(即g g DCW-1h-1)给出。时空产率(STY)定义为发酵过程中形成的有机化合物的总量与培养物体积的比值，在整个培养时间内考虑。时空产率也称为“体积生产力(volumetricproductivity)”。
在方法步骤II)中，从方法步骤I)中获得的发酵液回收有机化合物，优选琥珀酸。
通常，回收方法包括将重组微生物作为所谓的“生物质”从发酵液分开的步骤。用于去除生物质的方法为本领域技术人员已知，且包括过滤、沉降、漂浮或其组合。因此，可以用例如离心机、分离器、倾析器、滤器或在漂浮设备中去除生物质。为了有价值的产物的最大回收，通常可以例如以渗滤的形式洗涤生物质。方法的选择取决于发酵液中的生物质含量和生物质的特性，以及生物质与有机化合物(即有价值的产物)的相互作用。在一个实施方案中，可对发酵液进行灭菌或巴氏灭菌。在另一实施方案中，浓缩发酵液。取决于需要，此浓缩可以分批或连续进行。压力和温度范围应这样选择，使得首先不发生产物损伤，其次仅有必要最小程度地使用设备和能量。为多级蒸发巧妙地选择压力和温度水平尤其使得能够节约能量。
回收方法可以进一步包括附加的纯化步骤，其中进一步纯化有机化合物，优选琥珀酸。但是，如果通过下文所述的化学反应将该有机化合物转化为次级有机产物，则取决于反应类型和反应条件，并非必然需要进一步纯化该有机化合物。为了纯化方法步骤II)中获得的有机化合物，优选为了纯化琥珀酸，可以使用本领域技术人员已知的方法，例如结晶、过滤、电透析和层析。在琥珀酸作为有机化合物的情况下，例如，可以通过用氢氧化钙、氧化钙、碳酸钙或碳酸氢钙中和并过滤沉淀，通过将琥珀酸沉淀为琥珀酸钙产物来分离它。通过用硫酸酸化，然后过滤去除沉淀的硫酸钙(石膏)来从沉淀的琥珀酸钙回收琥珀酸。得到的溶液可以借助离子交换层析来进一步纯化，以去除不希望得到的残留离子。备选地，如果用氢氧化镁、碳酸镁或其混合物来中和发酵液，则可以酸化方法步骤I)中获得的发酵液，以将包含在介质中的琥珀酸镁转化为酸形式(即琥珀酸)，随后可以通过冷却酸化的介质来结晶。其他适宜的纯化方法的实例公开于EP-A-1005562、WO-A-2008/010373、WO-A-2011/082378、WO-A-2011/043443、WO-A-2005/030973、WO-A-2011/123268、WO-A-2011/064151和EP-A-2360137中。
根据本发明的方法的优选实施方案，该方法进一步包括方法步骤：
III)通过至少一步化学反应，使包含在方法步骤I)中获得的发酵液中的有机化合物转化或使方法步骤II)中获得的回收的有机化合物转化为不同于该有机化合物次级有机产物。
在琥珀酸作为有机化合物的情况下，优选的次级有机产物选自琥珀酸酯及其聚合物、四氢呋喃(THF)、1,4-丁二醇(BDO)、γ-丁内酯(GBL)和吡咯烷酮。
根据用于产生THF、BDO和/或GBL的优选实施方案，此方法包括：
b1)直接催化氢化方法步骤I)或II)中获得的琥珀酸为THF和/或BDO和/或GBL；或
b2)化学酯化方法步骤I)或II)中获得的琥珀酸和/或琥珀酸盐为其相应的二-低级烷基酯，随后催化氢化该酯为THF和/或BDO和/或GBL。
根据用于产生吡咯烷酮的优选实施方案，此方法包括：
b)以本身已知的方式化学转化方法步骤I)或II)中获得的琥珀酸铵盐为吡咯烷酮。
对于制备这些化合物的详情，参考US-A-2010/0159543和WO-A-2010/092155。
通过本发明的修饰微生物在发酵产生有机化合物中的用途来为解决一开始提到的问题提供贡献。优选的有机化合物是已经与本发明的方法一并提到的那些化合物，最优选的有机化合物是琥珀酸。此外，用于发酵产生有机化合物(优选琥珀酸)的优选条件是已经与本发明方法的方法步骤I)一并描述的那些条件。
现在借助附图和非限制性实施例更详细地解释本发明。
图1显示质粒pSacB(SEQ ID NO:5)的示意图谱。
图2显示质粒pSacBΔldhA(SEQ ID NO:6)的示意图谱。
图3显示质粒pSacBΔpflA(SEQ ID NO:7)的示意图谱。
图4显示质粒pSacBΔpflD(SEQ ID NO:8)的示意图谱。
图5显示质粒pSacB pykA1(SEQ ID NO:9)的示意图谱。
图6显示质粒pSacB pykA2(SEQ ID NO:10)的示意图谱。
图7显示质粒pSacB pykA3(SEQ ID NO:11)的示意图谱。
图8显示质粒pSacB pykA4(SEQ ID NO:12)的示意图谱。
图9显示质粒pSacB pykA5(SEQ ID NO:13)的示意图谱。
图10显示质粒pSacB pykA6(SEQ ID NO:14)的示意图谱。
图11显示丙酮酸激酶的氨基酸序列比对(pykA野生型：来自野生型菌株Basfiasucciniciproducens DD1的丙酮酸激酶的氨基酸序列；pykA2：来自DD1 ΔldhA ΔpflApykA2菌株的丙酮酸激酶PykA2的氨基酸序列；pykA4：来自DD1 ΔldhA ΔpflD pykA4菌株的丙酮酸激酶PykA4的氨基酸序列；pykA5：来自DD1 ΔldhA ΔpflD pykA5菌株的丙酮酸激酶PykA5的氨基酸序列；pykA6：来自ΔldhA ΔpflD pykA6菌株的丙酮酸激酶PykA6的氨基酸序列)。
实施例
实施例1：用于转化Basfia succiniciproducens的一般方法
菌株
野生型DD1(保藏号DSM18541)
DD1 ΔldhA
DD1 ΔldhA ΔpflA
DD1 ΔldhA ΔpflA pykA2
DD1 ΔldhA ΔpflD
DD1 ΔldhA ΔpflD pykA4
DD1 ΔldhA ΔpflD pykA5
DD1 ΔldhA ΔpflD pykA5
表1：实施例中提到的DD1野生型和突变体的命名。
通过使用以下流程的电穿孔来用DNA转化Basfia succiniciproducens DD1(野生型)：
为了制备预培养物，从冻存物将DD1接种入100ml摇瓶中的40mlBHI(脑心浸液；Becton,Dickinson and Company)。37℃、200转/分钟过夜进行孵育。为了制备主培养物，在250ml摇瓶中放入100ml BHI，用预培养物接种至最终OD(600nm为0.2。37℃、200转/分钟过夜进行孵育。在OD约为0.5、0.6和0.7时收集细胞，用4℃的10％冷甘油洗涤沉淀一次，重悬在2ml 10％甘油(4℃)中。
在宽度为0.2cm的电穿孔杯中将100μl感受态细胞与2-8μg质粒DNA混合，并在冰上放置2分钟。在以下条件下电穿孔：400Ω、25μF、2.5kV(Gene Pulser,Bio-Rad)。电穿孔后立即加入1ml冷BHI，并在37℃进行约2小时孵育。
将细胞接种在含5mg/L氯霉素的BHI上，并在37℃孵育2-5天，直至转化体的菌落可见。分离克隆，并重新划线接种在含5mg/L氯霉素的BHI上，直至获得纯的克隆。
实施例2：缺失/突变构建体的产生
1.缺失构建体的产生
缺失质粒基于载体pSacB(SEQ ID NO:5)构建。图1显示质粒pSacB的示意图谱。通过PCR从Basfia succiniciproducens的染色体DNA扩增应缺失的染色体片段5’-和3’-侧翼区(各约1500bp)，并用标准技术引入该载体。通常，靶向至少80％的OFR进行缺失。以这种方式，构建了用于乳酸脱氢酶ldhA(pSacB_delta_ldhA(SEQ ID NO:6))、丙酮酸甲酸裂合酶激活酶pflA(pSacB_delta_pflA(SEQ ID NO:7))和丙酮酸甲酸裂合酶pflD(pSacB_delta_pflD(SEQ ID NO:8))的缺失质粒。图2、3和4分别显示质粒pSacB_delta_ldhA、pSacB_delta_pflA和pSacB_delta_pflD的示意图谱。
在pSacB的质粒序列(SEQ ID NO:5)中，从碱基2380至3801包含sacB基因。从碱基3802至4264包含sacB启动子。从碱基526至984包含氯霉素基因。从碱基1477至2337包含用于大肠杆菌(E.coli)的复制起点(ori EC)(参见图1)。
在pSacB_delta_ldhA的质粒序列(SEQ ID NO:6)中，从碱基1519至2850包含与Basfia succiniciproducens基因组同源的ldhA基因5’侧翼区，而从碱基62至1518包含与Basfia succiniciproducens基因组同源的ldhA基因3’侧翼区。从碱基5169至6590包含sacB基因。从碱基6591至7053包含sacB启动子。从碱基3315至3773包含氯霉素基因。从碱基4266至5126包含用于大肠杆菌的复制起点(ori EC)(参见图2)。
在pSacB_delta_pflA的质粒序列(SEQ ID NO:7)中，从碱基1506至3005包含与Basfia succiniciproducens基因组同源的pflA基因5’侧翼区，而从碱基6至1505包含与Basfia succiniciproducens基因组同源的pflA基因3’侧翼区。从碱基5278至6699包含sacB基因。从碱基6700至7162包含sacB启动子。从碱基3424至3882包含氯霉素基因。从碱基4375至5235包含用于大肠杆菌的复制起点(ori EC)(参见图3)。
在pSacB_delta_pflD的质粒序列(SEQ ID NO:8)中，从碱基1533至2955包含与Basfia succiniciproducens基因组同源的pflD基因5’侧翼区，而从碱基62至1532包含与Basfia succiniciproducens基因组同源的pflD基因3’侧翼区。从碱基5256至6677包含sacB基因。从碱基6678至7140包含sacB启动子。从碱基3402至3860包含氯霉素基因。从碱基4353至5213包含用于大肠杆菌的复制起点(ori EC)(参见图4)。
2.用于在pykA基因中引入点突变的构建体的产生
在pSacB_pykA1的质粒序列(SEQ ID NO:9)中，从碱基6至1185包含与Basfiasucciniciproducens基因组同源的pykA基因部分。从碱基3458至4879包含sacB基因。从碱基4880至5342包含sacB启动子。从碱基1604至2062包含氯霉素基因。从碱基2555至3415包含用于大肠杆菌的复制起点(ori EC)(参见图5)。
通过定位诱变从pSac_pykA1质粒产生质粒pSacB_pykA2。在pykA基因中引入的G至T突变最终将导致PykA蛋白质中167位的G(甘氨酸)至C(半胱氨酸)交换(参见图6)。SEQ IDNO:15中显示pSacB_pykA2中的pykA基因的核苷酸序列，SEQ ID NO:16中显示此基因编码的酶的氨基酸序列。
在pSacB_delta_pykA2的质粒序列(SEQ ID NO:10)中，从碱基6至1185包含与Basfia succiniciproducens基因组同源的pykA基因部分。从碱基3458至4879包含sacB基因。从碱基4880至5342包含sacB启动子。从碱基1604至2062包含氯霉素基因。从碱基2555至3415包含用于大肠杆菌的复制起点(ori EC)(参见图7)。
在pSacB_pykA3的质粒序列(SEQ ID NO:11)中，从碱基6至909包含与Basfiasucciniciproducens基因组同源的pykA基因部分。从碱基3729至5150包含sacB基因。从碱基5151至5613包含sacB启动子。从碱基1875至2333包含氯霉素基因。从碱基2826至3686包含用于大肠杆菌的复制起点(ori EC)(参见图8)。
通过定位诱变从pSac_pykA3质粒产生质粒pSacB_pykA4。在pykA基因中引入的G至A突变最终将导致PykA蛋白质中417位的C(半胱氨酸)至Y(酪氨酸)交换(参见图8)。SEQ IDNO:17中显示pSacB_pykA4中的pykA基因的核苷酸序列，SEQ ID NO:18中显示此基因编码的酶的氨基酸序列。此外，通过沉默突变产生DraI限制位点。此限制位点将帮助鉴定正确的转化体。在pSacB_delta_pykA4的质粒序列(SEQ ID NO:19)中，从碱基6至909包含与Basfiasucciniciproducens基因组同源的pykA基因部分。从碱基3729至5150包含sacB基因。从碱基5151至5613包含sacB启动子。从碱基1875至2333包含氯霉素基因。从碱基2826至3686包含用于大肠杆菌的复制起点(ori EC)(参见图9)。
通过定位诱变从pSac_pykA1质粒产生质粒pSacB_pykA5。在pykA基因中引入的C至G突变最终将导致PykA蛋白质中171位的A(丙氨酸)至G(甘氨酸)交换(参见图9)。SEQ IDNO:19中显示pSacB_pykA5中的pykA基因的核苷酸序列，SEQ ID NO:20中显示此基因编码的酶的氨基酸序列。此外，通过沉默突变产生HpaI限制位点。此限制位点将帮助鉴定正确的转化体。在pSacB_pykA5的质粒序列(SEQ ID NO:13)中，从碱基6至1185包含与Basfiasucciniciproducens基因组同源的pykA基因部分。从碱基3458至4879包含sacB基因。从碱基4880至5342包含sacB启动子。从碱基1604至2062包含氯霉素基因。从碱基2555至3415包含用于大肠杆菌的复制起点(ori EC)。
通过定位诱变从pSac_pykA1质粒产生质粒pSacB_pykA6。在pykA基因中引入的G至T突变最终将导致PykA蛋白质中167位的G(甘氨酸)至C(半胱氨酸)交换(参见图10)。SEQ IDNO:21中显示pSacB_pykA6中的pykA基因的核苷酸序列，SEQ ID NO:22中显示此基因编码的酶的氨基酸序列。此外，通过沉默突变产生HpaI限制位点。此限制位点将帮助鉴定正确的转化体。在pSacB_pykA6的质粒序列(SEQ ID NO:14)中，从碱基6至1185包含与Basfiasucciniciproducens基因组同源的pykA基因部分。从碱基3458至4879包含sacB基因。从碱基4880至5342包含sacB启动子。从碱基1604至2062包含氯霉素基因。从碱基2555至3415包含用于大肠杆菌的复制起点(ori EC)。
实施例3：改进的产琥珀酸菌株的产生
1.缺失突变体的产生
a)用pSacB_delta_ldhA按上文所述转化Basfia succiniciproducens DD1，并“Campbelled入”，以产生“Campbell入”菌株。通过PCR来确认转化和整合入Basfiasucciniciproducens基因组，该PCR产生质粒整合入Basfia succiniciproducens基因组的事件的条带。
然后用含有蔗糖的琼脂平板作为针对sacB基因(的功能)的丧失进行选择的反选择培养基“Campbelled出”“Campbell入”菌株。因此，在25-35ml非选择培养基(不含抗生素的BHI)中37℃、200转/分钟过夜孵育“Campbell入”菌株。然后将过夜培养物划线培养在现配制的含蔗糖的BHI平板(10％，不含抗生素)上，并在37℃过夜孵育(“第一次蔗糖转移”)。从第一转移获得的单菌落再次划线培养在现配制的含蔗糖的BHI平板(10％)上，并在37℃过夜孵育(“第二次蔗糖转移”)。重复此流程，直至在蔗糖中完成最少五次转移(“第三、第四、第五次转移”)。术语“第一至第五次蔗糖转移”指为了选择sacB基因和周围质粒序列丢失的菌株的目的而将染色体整合了含有sacB果聚糖蔗糖酶基因的菌株转移至含有蔗糖和生长培养基的琼脂平板上。将从第五块转移平板获得的单菌落接种在25-35ml非选择培养基(不含抗生素的BHI)上，并在37℃、220转/分钟过夜孵育。将过夜培养物系列稀释，并接种在BHI平板上，以获得分离的单菌落。
通过氯霉素敏感性来确认含有ldhA基因座的野生型环境或ldhA基因的突变/缺失的“Campbelled出”菌株。通过PCR分析来鉴定和确认这些菌株中的突变/缺失突变体。这产生了ldhA缺失突变体Basfia succiniciproducens DD1 ΔldhA。
b)按上文所述用pSacB_delta_pflA转化Basfia succiniciproducens DD1 ΔldhA，并“Campbelled入”，以产生“Campbell入”菌株。通过PCR来确认转化和整合。然后按之前所述“Campbelled出”“Campbell入”菌株。通过PCR分析来鉴定和确认这些菌株中的缺失突变体。这产生了ldhA pflD双缺失突变体Basfia succiniciproducens DD1 ΔldhA ΔpflA。
c)按上文所述用pSacB_delta_pflD转化Basfia succiniciproducens ΔldhA，并“Campbelled入”，以产生“Campbell入”菌株。通过PCR来确认转化和整合。然后按之前所述“Campbelled出”“Campbell入”菌株。通过PCR分析来鉴定和确认这些菌株中的缺失突变体。这产生了ldhA pflD双缺失突变体Basfia succiniciproducens DD1 ΔldhA ΔpflD。
2.pykA基因中携带点突变的突变体的产生
a)按上文所述用pSacB_pykA2转化Basfia succiniciproducens DD1 ΔldhA ΔpflA，并“Campbelled入”，以产生“Campbell入”菌株。然后按之前所述“Campbelled出”“Campbell入”菌株。借助PCR扩增pykA编码区并测序，以鉴定在pykA基因内携带突变的“Campbell出”克隆。这产生了突变体Basfia succiniciproducens DD1 ΔldhA ΔpflApykA2。
b)按上文所述用pSacB_pykA4转化Basfia succiniciproducens DD1 ΔldhA ΔpflD，并“Campbelled入”，以产生“Campbell入”菌株。然后按之前所述“Campbelled出”“Campbell入”菌株。为了鉴定在pykA基因内携带突变的“Campbell出”克隆，用引物pykA4_fw(SEQ ID NO:23)和pykA4_rv(SEQ ID NO:24)借助PCR扩增部分pykA基因座。在预筛选中，用DraI限制酶消化所得到的DNA片段。对显示附加的DraI限制位点的片段进行测序，以确认预期的靠近pykA基因内引入的DraI限制位点的点突变。这产生了突变体Basfiasucciniciproducens DD1 ΔldhA ΔpflD pykA4。
c)按上文所述用pSacB_pykA5转化Basfia succiniciproducens ΔldhA ΔpflD，并“Campbelled入”，以产生“Campbell入”菌株。然后按之前所述“Campbelled出”“Campbell入”菌株。为了鉴定在pykA基因内携带突变的“Campbell出”克隆，用引物pykA5/6_fw(SEQID NO:25)和pykA5/6_rv(SEQ ID NO:26)借助PCR扩增部分pykA基因座。在预筛选中，用HpaI限制酶消化所得到的DNA片段。对显示附加的HpaI限制位点的片段进行测序，以确认预期的靠近pykA基因内引入的HpaI限制位点的点突变。这产生了突变体Basfiasucciniciproducens DD1 ΔldhA ΔpflD pykA5。
d)按上文所述用pSacB_pykA6转化Basfia succiniciproducens ΔldhA ΔpflD，并“Campbelled入”，以产生“Campbell入”菌株。然后按之前所述“Campbelled出”“Campbell入”菌株。为了鉴定在pykA基因内携带突变的“Campbell出”克隆，用引物pykA5/6_fw(SEQID NO:25)和pykA5/6_rv(SEQ ID NO:26)借助PCR扩增部分pykA基因座。在预筛选中，用HpaI限制酶消化所得到的DNA片段。对显示附加的HpaI限制位点的片段进行测序，以确认预期的靠近pykA基因内引入的HpaI限制位点的点突变。这产生了突变体Basfiasucciniciproducens DD1 ΔldhA ΔpflD pykA6。
实施例4：丙酮酸激酶活性
在血清瓶中在如下培养基(BHI培养基(Becton Dickinsion，含有以下添加：MOPS9.4g/l、Mg(OH)2 0.625g/l、BIS-TRIS 5.8g/l、NaHCO3 1,8g/l)中37℃厌氧培养Basfia菌株18小时。通过离心收集细胞并冷冻。将细胞沉淀重悬在60mM HEPES-Na、60mM KCl、8.5mMMgCl2pH 7.5中。用Ribolyser(ThermoHybaid)机器和蓝色基质管裂解细胞。提取物在eppedorf离心机中4℃、14000转/分钟离心10分钟，并保持在冰上，直至进行测定。上清用于用以下测定法测定丙酮酸激酶活性：按照Methods of Enzymatic Analysis,第2英文版,1卷,Bergmeyer,H.U.编辑,Academic Press(New York,NY:1974),509-511页测定的PykA酶活性。用IgG作为蛋白质校正标准品，通过Biorad protein blue assay来测定细胞提取物中的蛋白质浓度。酶活性表示为比活(U/mg蛋白质和分钟)，并相对地表示为携带未突变的pykA等位基因的菌株DD1ΔldhAΔpflD的活性的百分比。结果显示在表2中。
菌株 比活[mU/mg蛋白质] Δ活性[％]
DD1ΔldhA ΔpflD 32.4 0
DD1ΔldhA ΔpflA pykA2 2.25 93.1
DD1ΔldhA ΔpflD pykA4 2.40 92.7
DD1ΔldhA ΔpflD pykA5 9.70 90.3
表2：PykA酶活性测试结果
实施例5：在葡萄糖、蔗糖和麦芽糖/甘油上培养多种DD1菌株
在存在葡萄糖、或蔗糖、或麦芽糖和甘油作为碳源的情况下，将DD1 ΔldhA ΔpflA菌株的生产力与DD1 ΔldhA ΔpflA pykA2菌株的生产力相比较(表6、7和8)。
利用下文所述的培养基和孵育条件分析生产力。
1.培养基配制
培养基的组成和配制如以下表3、4和5中所述。
化合物 浓度[g/L]
酵母提取物(Bio Springer) 10.0
CaCl2×2H2O 0.2
MgCl2×6H2O 0.2
(NH4)2SO4 2.0
NaCl 1.0
K2HPO4 3.0
MgCO3 50.0
NaHCO3 8.4
葡萄糖 52.0
表3：用于葡萄糖上培养的培养基组成(培养基P)
化合物 浓度[g/L]
酵母提取物(Bio Springer) 10.0
CaCl2×2H2O 0.2
MgCl2×6H2O 0.2
(NH4)2SO4 2.0
NaCl 1.0
K2HPO4 3.0
MgCO3 50.0
NaHCO3 8.4
蔗糖 50.0
表4：用于蔗糖上培养的培养基组成(培养基P)
化合物 浓度[g/L]
酵母提取物(Bio Springer) 10.0
CaCl2×2H2O 0.2
MgCl2×6H2O 0.2
(NH4)2SO4 2.0
NaCl 1.0
K2HPO4 3.0
MgCO3 70.0
NaHCO3 8.4
麦芽糖 22.5
甘油 50.0
表5：用于麦芽糖/蔗糖上培养的培养基组成(培养基P)
2.培养和分析
为了培养主培养物，用来自新鲜培养的BHI琼脂平板(厌氧条件下37℃过夜孵育)的细菌接种具有气密丁基橡胶塞的100ml血清瓶至OD600＝0.75，该血清瓶包含50ml表3、4和5中所述液体培养基，具有CO2气体，具有0.8bar超压。37℃和160转/分钟(摇动直径：2.5cm)孵育血清瓶。24小时后通过HPLC(HPLC方法在表9和10中描述)定量碳源的消耗和羧酸的产生。通过用分光光度计(Ultrospec3000,Amersham Biosciences,Uppsala Sweden)测量600nm吸光度(OD600)来测量细胞生长。
3.结果
表6至8中显示不同DD1菌株的培养实验的结果。
表6：葡萄糖上的DD1 ΔldhA ΔpflA菌株和DD1 ΔldhA ΔpflA ΔpykA2菌株培养
a培养时间
b底物(葡萄糖)的消耗
c琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸和乙醇的形成
gSA产率(每份所消耗的底物的SA定量)
h发现乙酸、乳酸、苹果酸和甲酸的检测限在给定HPLC方法中低于0.01g/l
表7：蔗糖上的DD1 ΔldhA ΔpflA菌株和DD1 ΔldhA ΔpflA ΔpykA2菌株培养
a培养时间
b底物(蔗糖)的消耗
c琥珀酸的形成
pykA基因编码的酶的活性的降低导致细胞在蔗糖上的更快生长。这在比较表7中的蔗糖消耗值时得到证明：在16小时内，DD1 ΔldhA ΔpflA菌株消耗18.55g/L的蔗糖；在相同时间(也是16小时)内，DD1 ΔldhA ΔpflA ΔpykA2菌株已消耗50.90g/L的蔗糖。
表8：麦芽糖/甘油上的DD1 ΔldhA ΔpflA菌株和DD1 ΔldhA ΔpflA ΔpykA2菌株培养
a培养时间
b底物(麦芽糖和甘油)的消耗
c琥珀酸的形成
表9：用于分析葡萄糖、麦芽糖、甘油、琥珀酸、甲酸、乳酸、乙酸、丙酮酸和乙醇的HPLC方法(ZX-THF50)
表10：用于分析葡萄糖和蔗糖的HPLC(Fast-CH)方法
实施例6：葡萄糖、或蔗糖、或甘油和葡萄糖存在下的DD1 ΔldhA ΔpflD pykA4培养
在存在葡萄糖、或蔗糖、或葡萄糖和甘油作为碳源的情况下，将DD1 ΔldhA ΔpflD菌株的生产力与突变体菌株DD1 ΔldhA ΔpflD pykA4的生产力相比较。
利用下文所述的培养基和孵育条件分析生产力。
1.培养基配制
培养基CGM的组成和配制如以下表11中所述。
表11：培养基CGM的组成。
培养基LSM_3_葡萄糖、培养基LSM_3_蔗糖和培养基LSM_3_甘油_葡萄糖的组成如以下表14、15和16中所描述。
表12：痕量元素溶液5的组成
表13：维生素溶液9的组成
表14：LSM_3_培养基的组成
表15：SM_3_蔗糖培养基的组成
表16：LSM_3_甘油_葡萄糖培养基的组成
2.培养和分析
为了培养预培养物，用来自新鲜培养的BHI琼脂平板(厌氧条件下37℃过夜孵育)的细菌接种具有气密丁基橡胶塞的100ml血清瓶，该血清瓶包含50ml表11中所述CGM液体培养基，具有CO2气体。37℃和170转/分钟(摇动直径：2.5cm)孵育血清瓶。为了培养主培养物，用CGM培养基中的2.5ml细菌培养物(孵育10小时后)接种具有气密丁基橡胶塞的100ml血清瓶至，该血清瓶包含50ml表14中所述LSM_葡萄糖液体培养基(或LSM_3_蔗糖培养基，或LSM_3_甘油_葡萄糖培养基)(LSM_3_蔗糖培养基：表15；LSM_3_甘油_葡萄糖培养基：表16)，具有CO2气体。6小时和30小时后通过HPLC(HPLC方法在表9和10中描述)定量碳源的消耗和羧酸的产生。通过用分光光度计(Ultrospec3000,Amersham Biosciences,Uppsala瑞典)测量600nm吸光度(OD600)来测量细胞生长。
3.结果
表17、18和19中显示葡萄糖、蔗糖和麦芽糖/甘油上的DD1 ΔldhA ΔpflD pykA4菌株培养实验的结果。
表17：葡萄糖上的DD1 ΔldhA ΔpflD菌株和DD1 ΔldhA ΔpflD pykA4菌株培养
a培养时间
b底物(葡萄糖)的消耗
c琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸的形成
表18：蔗糖上的DD1 ΔldhA ΔpflD菌株和DD1 ΔldhA ΔpflD pykA4菌株培养
a培养时间
b底物(蔗糖)的消耗
c琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸的形成
表19：甘油和葡萄糖上的DD1 ΔldhA ΔpflD菌株和DD1 ΔldhA ΔpflD pykA4菌株培养
a培养时间
b底物(甘油、葡萄糖)的消耗
c琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酮酸的形成
pykA基因编码的酶的活性的降低导致细胞在葡萄糖、蔗糖以及甘油/葡萄糖混合物上的更快生长。这在比较葡萄糖上(表17)、蔗糖上(表18)和甘油/葡萄糖上(表19)生长的DD1 ΔldhA ΔpflD菌株和DD1 ΔldhA ΔpflD pykA4菌株时得到证明。
序列
SEQ ID NO：1(菌株DD1的16S rDNA的核苷酸序列)
tttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgaacggtagcgggaggaaagcttgctttctttgccgacgagtggcggacgggtgagtaatgcttggggatctggcttatggagggggataacgacgggaaactgtcgctaataccgcgtaatatcttcggattaaagggtgggactttcgggccacccgccataagatgagcccaagtgggattaggtagttggtggggtaaaggcctaccaagccgacgatctctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatggggggaaccctgatgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggttgtaaagttctttcggtgacgaggaaggtgtttgttttaataggacaagcaattgacgttaatcacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcgagcgttaatcggaataactgggcgtaaagggcatgcaggcggacttttaagtgagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaattgcatttcagactgggagtctagagtactttagggaggggtagaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaataccgaaggcgaaggcagccccttgggaagatactgacgctcatatgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgcggtaaacgctgtcgatttggggattgggctttaggcctggtgctcgtagctaacgtgataaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatcctgtagagatacgggagtgccttcgggagctctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcatgtaaagatgggaactcaaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggtgcatacagagggcggcgataccgcgaggtagagcgaatctcagaaagtgcatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgtaccagaagtagatagcttaaccttcggggggggcgtttaccacggtatgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcgg
SEQ ID NO：2(菌株DD1的23S rDNA的核苷酸序列)
agtaataacgaacgacacaggtataagaatacttgaggttgtatggttaagtgactaagcgtacaaggtggatgccttggcaatcagaggcgaagaaggacgtgctaatctgcgaaaagcttgggtgagttgataagaagcgtctaacccaagatatccgaatggggcaacccagtagatgaagaatctactatcaataaccgaatccataggttattgaggcaaaccgggagaactgaaacatctaagtaccccgaggaaaagaaatcaaccgagattacgtcagtagcggcgagcgaaagcgtaagagccggcaagtgatagcatgaggattagaggaatcggctgggaagccgggcggcacagggtgatagccccgtacttgaaaatcattgtgtggtactgagcttgcgagaagtagggcgggacacgagaaatcctgtttgaagaaggggggaccatcctccaaggctaaatactcctgattgaccgatagtgaaccagtactgtgaaggaaaggcgaaaagaaccccggtgaggggagtgaaatagaacctgaaaccttgtacgtacaagcagtgggagcccgcgagggtgactgcgtaccttttgtataatgggtcagcgacttatattatgtagcgaggttaaccgaataggggagccgaagggaaaccgagtcttaactgggcgtcgagttgcatgatatagacccgaaacccggtgatctagccatgggcaggttgaaggttgggtaacactaactggaggaccgaaccgactaatgttgaaaaattagcggatgacctgtggctgggggtgaaaggccaatcaaaccgggagatagctggttctccccgaaatctatttaggtagagccttatgtgaataccttcgggggtagagcactgtttcggctagggggccatcccggcttaccaacccgatgcaaactgcgaataccgaagagtaatgcataggagacacacggcgggtgctaacgttcgtcgtggagagggaaacaacccagaccgccagctaaggtcccaaagtttatattaagtgggaaacgaagtgggaaggcttagacagctaggatgttggcttagaagcagccatcatttaaagaaagcgtaatagctcactagtcgagtcggcctgcgcggaagatgtaacggggctcaaatatagcaccgaagctgcggcatcaggcgtaagcctgttgggtaggggagcgtcgtgtaagcggaagaaggtggttcgagagggctgctggacgtatcacgagtgcgaatgctgacataagtaacgataaaacgggtgaaaaacccgttcgccggaagaccaagggttcctgtccaacgttaatcggggcagggtgagtcggcccctaaggcgaggctgaagagcgtagtcgatgggaaacgggttaatattcccgtacttgttataattgcgatgtggggacggagtaggttaggttatcgacctgttggaaaaggtcgtttaagttggtaggtggagcgtttaggcaaatccggacgcttatcaacaccgagagatgatgacgaggcgctaaggtgccgaagtaaccgataccacacttccaggaaaagccactaagcgtcagattataataaaccgtactataaaccgacacaggtggtcaggtagagaatactcaggcgcttgagagaactcgggtgaaggaactaggcaaaatagcaccgtaacttcgggagaaggtgcgccggcgtagattgtagaggtatacccttgaaggttgaaccggtcgaagtgacccgctggctgcaactgtttattaaaaacacagcactctgcaaacacgaaagtggacgtatagggtgtgatgcctgcccggtgctggaaggttaattgatggcgttatcgcaagagaagcgcctgatcgaagccccagtaaacggcggccgtaactataacggtcctaaggtagcgaaattccttgtcgggtaagttccgacctgcacgaatggcataatgatggccaggctgtctccacccgagactcagtgaaattgaaatcgccgtgaagatgcggtgtacccgcggctagacggaaagaccccgtgaacctttactatagcttgacactgaaccttgaattttgatgtgtaggataggtgggaggctttgaagcggtaacgccagttatcgtggagccatccttgaaataccaccctttaacgtttgatgttctaacgaagtgcccggaacgggtactcggacagtgtctggtgggtagtttgactggggcggtctcctcccaaagagtaacggaggagcacgaaggtttgctaatgaccggtcggacatcgtcaggttagtgcaatggtataagcaagcttaactgcgagacggacaagtcgagcaggtgcgaaagcaggtcatagtgatccggtggttctgaatggaagggccatcgctcaacggataaaaggtactccggggataacaggctgataccgcccaagagttcatatcgacggcggtgtttggcacctcgatgtcggctcatcacatcctggggctgaagtaggtcccaagggtatggctgttcgccatttaaagtggtacgcgagctgggtttaaaacgtcgtgagacagtttggtccctatctgccgtgggcgttggagaattgagaggggctgctcctagtacgagaggaccggagtggacgcatcactggtgttccggttgtgtcgccagacgcattgccgggtagctacatgcggaagagataagtgctgaaagcatctaagcacgaaacttgcctcgagatgagttctcccagtatttaatactgtaagggttgttggagacgacgacgtagataggccgggtgtgtaagcgttgcgagacgttgagctaaccggtactaattgcccgagaggcttagccatacaacgctcaagtgtttttggtagtgaaagttattacggaataagtaagtagtcagggaatcggct
SEQ ID NO：3(来自菌株DD1的pykA基因的核苷酸序列)
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SEQ ID NO：4(来自菌株DD1的pykA的氨基酸序列)
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SEQ ID NO：5(质粒pSacB的完整核苷酸序列)
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SEQ ID NO：6(质粒pSacB_delta_ldhA的完整核苷酸序列)
tcgagaggcctgacgtcgggcccggtaccacgcgtcatatgactagttcggacctagggatgggtcagcctgaacgaaccgcacttgtatgtaggtagttttgaccgcccgaatattcgttataccttggtggaaaaattcaaaccgatggagcaattatacaattttgtggcggcgcaaaaaggtaaaagcggtatcgtctattgcaacagccgtagcaaagtggagcgcattgcggaagccctgaagaaaagaggcatttccgcagccgcttatcatgcgggcatggagccgtcgcagcgggaagcggtgcaacaggcgtttcaacgggataatattcaagtggtggtggcgaccattgcttttggtatggggatcaacaaatctaatgtgcgttttgtggcgcattttgatttatctcgcagcattgaggcgtattatcaggaaaccgggcgcgcggggcgggacgacctgccggcggaagcggtactgttttacgagccggcggattatgcctggttgcataaaattttattggaagagccggaaagcccgcaacgggatattaaacggcataagctggaagccatcggcgaatttgccgaaagccagacctgccgtcgtttagtgctgttaaattatttcggcgaaaaccgccaaacgccatgtaataactgtgatatctgcctcgatccgccgaaaaaatatgacggattattagacgcgcagaaaatcctttcgaccatttatcgcaccgggcaacgtttcggcacgcaatacgtaatcggcgtaatgcgcggtttgcagaatcagaaaataaaagaaaatcaacatgatgagttgaaagtctacggaattggcaaagataaaagcaaagaatactggcaatcggtaattcgtcagctgattcatttgggctttgtgcaacaaatcatcagcgatttcggcatggggaccagattacagctcaccgaaagcgcgcgtcccgtgctgcgcggcgaagtgtctttggaactggccatgccgagattatcttccattaccatggtacaggctccgcaacgcaatgcggtaaccaactacgacaaagatttatttgcccgcctgcgtttcctgcgcaaacagattgccgacaaagaaaacattccgccttatattgtgttcagtgacgcgaccttgcaggaaatgtcgttgtatcagccgaccagcaaagtggaaatgctgcaaatcaacggtgtcggcgccatcaaatggcagcgcttcggacagccttttatggcgattattaaagaacatcaggctttgcgtaaagcgggtaagaatccgttggaattgcaatcttaaaatttttaactttttgaccgcacttttaaggttagcaaattccaataaaaagtgcggtgggttttcgggaatttttaacgcgctgatttcctcgtcttttcaatttyttcgyctccatttgttcggyggttgccggatcctttcttgactgagatccataagagagtagaatagcgccgcttatatttttaatagcgtacctaatcgggtacgctttttttatgcggaaaatccatatttttctaccgcactttttctttaaagatttatacttaagtctgtttgattcaatttatttggaggttttatgcaacacattcaactggctcccgatttaacattcagtcgcttaattcaaggattctggcggttaaaaagctggcggaaatcgccgcaggaattgcttacattcgttaagcaaggattagaattaggcgttgatacgctggatcatgccgcttgttacggggcttttacttccgaggcggaattcggacgggcgctggcgctggataaatccttgcgcgcacagcttactttggtgaccaaatgcgggattttgtatcctaatgaagaattacccgatataaaatcccatcactatgacaacagctaccgccatattatgtggtcggcgcaacgttccattgaaaaactgcaatgcgactatttagatgtattgctgattcaccgwctttctccctgtgcggatcccgaacaaatcgcgcgggcttttgatgaactttatcaaaccggraaagtacgttatttcggggtatctaactatacgccggctaagttcgccatgttgcaatcttatgtgaatcagccgttaatcactaatcaaattgagatttcgcctcttcatcgtcaggcttttgatgacggtaccctggattttttactggaaaaacgtattcaaccgatggcatggtcgccacttgccggcggtcgtttattcaatcaggatgagaacagtcgggcggtgcaaaaaacattactcgaaatcggtgaaacgaaaggagaaacccgtttagatacattggcttatgcctggttattggcgcatccggcaaaaattatgccggttatggggtccggtaaaattgaacgggtaaaaagcgcggcggatgcgttacgaatttccttcactgaggaagaatggattaaggtttatgttgccgcacagggacgggatattccgtaacatcatccgtctaatcctgcgtatctggggaaagatgcgtcatcgtaagaggtctataatattcgtcgttttgataagggtgccatatccggcacccgttaaaatcacattgcgttcgcaacaaaattattccttacgaatagcattcacctcttttaacagatgttgaatatccgtatcggcaaaaatatcctctatatttgcggttaaacggcgccgccagttagcatattgagtgctggttcccggaatattgacgggttcggtcataccgagccagtcttcaggttggaatccccatcgtcgacatcgatgctcttctgcgttaattaacaattgggatcctctagactccataggccgctttcctggctttgcttccagatgtatgctctcctccggagagtaccgtgactttattttcggcacaaatacaggggtcgatggataaatacggcgatagtttcctgacggatgatccgtatgtaccggcggaagacaagctgcaaacctgtcagatggagattgatttaatggcggatgtgctgagagcaccgccccgtgaatccgcagaactgatccgctatgtgtttgcggatgattggccggaataaataaagccgggcttaatacagattaagcccgtatagggtattattactgaataccaaacagcttacggaggacggaatgttacccattgagacaaccagactgccttctgattattaatatttttcactattaatcagaaggaataaccatgaattttacccggattgacctgaatacctggaatcgcagggaacactttgccctttatcgtcagcagattaaatgcggattcagcctgaccaccaaactcgatattaccgctttgcgtaccgcactggcggagacaggttataagttttatccgctgatgatttacctgatctcccgggctgttaatcagtttccggagttccggatggcactgaaagacaatgaacttatttactgggaccagtcagacccggtctttactgtctttcataaagaaaccgaaacattctctgcactgtcctgccgttattttccggatctcagtgagtttatggcaggttataatgcggtaacggcagaatatcagcatgataccagattgtttccgcagggaaatttaccggagaatcacctgaatatatcatcattaccgtgggtgagttttgacgggatttaacctgaacatcaccggaaatgatgattattttgccccggtttttacgatggcaaagtttcagcaggaaggtgaccgcgtattattacctgtttctgtacaggttcatcatgcagtctgtgatggctttcatgcagcacggtttattaatacacttcagctgatgtgtgataacatactgaaataaattaattaattctgtatttaagccaccgtatccggcaggaatggtggctttttttttatattttaaccgtaatctgtaatttcgtttcagactggttcaggatgagctcgcttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttattggtgagaatccaagcactagcggcgcgccggccggcccggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcag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SEQ ID NO：7(质粒pSacB_delta_pflA的完整核苷酸序列)
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SEQ ID NO：8(质粒pSacB_delta_pflD的完整核苷酸序列)
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SEQ ID NO：9(质粒pSacB_pykA1的完整核苷酸序列)
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SEQ ID NO：10(质粒pSacB_pykA2的完整核苷酸序列)
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SEQ ID NO：11(质粒pSacB_pykA3的完整核苷酸序列)
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SEQ ID NO：12(质粒pSacB_pykA4的完整核苷酸序列)
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SEQ ID NO：13(质粒pSacB_pykA5的完整核苷酸序列)
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SEQ ID NO：14(质粒pSacB_pykA6的完整核苷酸序列)
tcgagcagaagattaagaagaacgaaaatcgtatgtacaatggggcctgcaacagacaaaggcaataatttagaaaaaatcattgctgccggtgcaaacgttgtacgtatgaacttctcccacggtacgcccgaagatcatatcggtcgtgctgaaaaagtacgtgaaatcgctcataaattaggtaaacacgtagcaatcttaggtgacttacaaggccctaaaatccgtgtttctacttttaaagaaggcaaaattttcttaaatatcggtgataaattcattttagacgcagagatgcctaaaggtgaaggtaaccaggaagcggttggtttagactataaaacattaccgcaagatgtggttccgggcgatatcttattattagatgacggtcgagttcaattgaaagtattggcaaccgaaggtgcaaaagtattcaccgaagtaacggtcggtggcccactatcaaataataaaggcattaacaaattaggctgcggtttatctgccgatgcgttaaccgaaaaagataaagcggatatcattactgcggcgcgtatcggtgtggattaccttgccgtatctttcccgcgttcaagcgcggatttaaactacgcccgtcaattagcaaaagatgcgggcttggatgcgaaaatcgttgcgaaagtagaacgtgccgaaacagttgaaacggacgaagcaatggacgatatcatcaatgcggcggacgtaatcatggttgcgcgcggtgacttaggtgttgaaatcggtgatccggaattagtcggtgttcagaaaaaattaatccgtcgttcacgtcagttaaatcgtgttgttattaccgcaactcaaatgatggaatcaatgattagtaatcctatgccgactcgtgcggaagtaatggacgtagctaacgcagtattggacggtaccgatgcggtaatgctttctgctgaaaccgcggctggtcaatatccggcggaaactgttgcggcgatggcgaaagttgcgttaggtgcggagaaaatgccaagcattaatgtgtctaaacaccgtatgaacgttcaattcgagtctattgaagaatctgttgcgatgtctgcaatgtatgcggcaaaccacatgagaggcgtagcggcgattatcacattaacaagtagcggtcgtactgctcgtttaatgtctagactccataggccgctttcctggctttgcttccagatgtatgctctcctccggagagtaccgtgactttattttcggcacaaatacaggggtcgatggataaatacggcgatagtttcctgacggatgatccgtatgtaccggcggaagacaagctgcaaacctgtcagatggagattgatttaatggcggatgtgctgagagcaccgccccgtgaatccgcagaactgatccgctatgtgtttgcggatgattggccggaataaataaagccgggcttaatacagattaagcccgtatagggtattattactgaataccaaacagcttacggaggacggaatgttacccattgagacaaccagactgccttctgattattaatatttttcactattaatcagaaggaataaccatgaattttacccggattgacctgaatacctggaatcgcagggaacactttgccctttatcgtcagcagattaaatgcggattcagcctgaccaccaaactcgatattaccgctttgcgtaccgcactggcggagacaggttataagttttatccgctgatgatttacctgatctcccgggctgttaatcagtttccggagttccggatggcactgaaagacaatgaacttatttactgggaccagtcagacccggtctttactgtctttcataaagaaaccgaaacattctctgcactgtcctgccgttattttccggatctcagtgagtttatggcaggttataatgcggtaacggcagaatatcagcatgataccagattgtttccgcagggaaatttaccggagaatcacctgaatatatcatcattaccgtgggtgagttttgacgggatttaacctgaacatcaccggaaatgatgattattttgccccggtttttacgatggcaaagtttcagcaggaaggtgaccgcgtattattacctgtttctgtacaggttcatcatgcagtctgtgatggctttcatgcagcacggtttattaatacacttcagctgatgtgtgataacatactgaaataaattaattaattctgtatttaagccaccgtatccggcaggaatggtggctttttttttatattttaaccgtaatctgtaatttcgtttcagactggttcaggatgagctcgcttggactcctgttgatagatccagtaatgacctcagaactccatctggatttgttcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttattggtgagaatccaagcactagcggcgcgccggccggcccggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaaggccggccgcggccgccatcggcattttcttttgcgtttttatttgttaactgttaattgtccttgttcaaggatgctgtctttgacaacagatgttttcttgcctttgatgttcagcaggaagctcggcgcaaacgttgattgtttgtctgcgtagaatcctctgtttgtcatatagcttgtaatcacgacattgtttcctttcgcttgaggtacagcgaagtgtgagtaagtaaaggttacatcgttaggatcaagatccatttttaacacaaggccagttttgttcagcggcttgtatgggccagttaaagaattagaaacataaccaagcatgtaaatatcgttagacgtaatgccgtcaatcgtcatttttgatccgcgggagtcagtgaacaggtaccatttgccgttcattttaaagacgttcgcgcgttcaatttcatctgttactgtgttagatgcaatcagcggtttcatcacttttttcagtgtgtaatcatcgtttagctcaatcataccgagagcgccgtttgctaactcagccgtgcgttttttatcgctttgcagaagtttttgactttcttgacggaagaatgatgtgcttttgccatagtatgctttgttaaataaagattcttcgccttggtagccatcttcagttccagtgtttgcttcaaatactaagtatttgtggcctttatcttctacgtagtgaggatctctcagcgtatggttgtcgcctgagctgtagttgccttcatcgatgaactgctgtacattttgatacgtttttccgtcaccgtcaaagattgatttataatcctctacaccgttgatgttcaaagagctgtctgatgctgatacgttaacttgtgcagttgtcagtgtttgtttgccgtaatgtttaccggagaaatcagtgtagaataaacggatttttccgtcagatgtaaatgtggctgaacctgaccattcttgtgtttggtcttttaggatagaatcatttgcatcgaatttgtcgctgtctttaaagacgcggccagcgtttttccagctgtcaatagaagtttcgccgactttttgatagaacatgtaaatcgatgtgtcatccgcatttttaggatctccggctaatgcaaagacgatgtggtagccgtgatagtttgcgacagtgccgtcagcgttttgtaatggccagctgtcccaaacgtccaggccttttgcagaagagatatttttaattgtggacgaatcaaattcagaaacttgatatttttcatttttttgctgttcagggatttgcagcatatcatggcgtgtaatatgggaaatgccgtatgtttccttatatggcttttggttcgtttctttcgcaaacgcttgagttgcgcctcctgccagcagtgcggtagtaaaggttaatactgttgcttgttttgcaaactttttgatgttcatcgttcatgtctccttttttatgtactgtgttagcggtctgcttcttccagccctcctgtttgaagatggcaagttagttacgcacaataaaaaaagacctaaaatatgtaaggggtgacgc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SEQ ID NO：15(来自DD1ΔldhA ΔpflA pykA2菌株的pykA基因的核苷酸序列)
atgtccagaagattaagaagaacgaaaatcgtatgtacaatggggcctgcaacagacaaaggcaataatttagaaaaaatcattgctgccggtgcaaacgttgtacgtatgaacttctcccacggtacgcccgaagatcatatcggtcgtgctgaaaaagtacgtgaaatcgctcataaattaggtaaacacgtagcaatcttaggtgacttacaaggccctaaaatccgtgtttctacttttaaagaaggcaaaattttcttaaatatcggtgataaattcattttagacgcagagatgcctaaaggtgaaggtaaccaggaagcggttggtttagactataaaacattaccgcaagatgtggttccgggcgatatcttattattagatgacggtcgagttcaattgaaagtattggcaaccgaaggtgcaaaagtattcaccgaagtaacggtcggtggcccactatcaaataataaaggcattaacaaattaggcTgcggtttatctgccgatgcattaaccgaaaaagataaagcggatatcattactgcggcgcgtatcggtgtggattaccttgccgtatctttcccgcgttcaagcgcggatttaaactacgcccgtcaattagcaaaagatgcgggcttggatgcgaaaatcgttgcgaaagtagaacgtgccgaaacagttgaaacggacgaagcaatggacgatatcatcaatgcggcggacgtaatcatggttgcgcgcggtgacttaggtgttgaaatcggtgatccggaattagtcggtgttcagaaaaaattaatccgtcgttcacgtcagttaaatcgtgttgttattaccgcaactcaaatgatggaatcaatgattagtaatcctatgccgactcgtgcggaagtaatggacgtagctaacgcagtattggacggtaccgatgcggtaatgctttctgctgaaaccgcggctggtcaatatccggcggaaactgttgcggcgatggcgaaagttgcgttaggtgcggagaaaatgccaagcattaatgtgtctaaacaccgtatgaacgttcaattcgagtctattgaagaatctgttgcgatgtctgcaatgtatgcggcaaaccacatgagaggcgtagcggcgattatcacattaacaagtagcggtcgtactgctcgtttaatgtctcgcattagttccggtttaccaatctttgcattgtcacgtaacgaatctacattaaacttatgcgcattatatcgtggtgtgacaccggttcattttgataaagacagccgtacctcagaaggtgcgacagcggcggttcaattattaaaagacgaaggtttcttagtgtctggcgatttagtgttattaactcagggcgacgcaagcagttctagcggtactaacctttgccgtacattgattgttgaataa
SEQ ID NO：16(来自DD1 ΔldhA ΔpflA pykA2菌株的PykA2的氨基酸序列)
MSRRLRRTKIVCTMGPATDKGNNLEKIIAAGANVVRMNFSHGTPEDHIGRAEKVREIAHKLGKHVAILGDLQGPKIRVSTFKEGKIFLNIGDKFILDAEMPKGEGNQEAVGLDYKTLPQDVVPGDILLLDDGRVQLKVLATEGAKVFTEVTVGGPLSNNKGINKLGCGLSADALTEKDKADIITAARIGVDYLAVSFPRSSADLNYARQLAKDAGLDAKIVAKVERAETVETDEAMDDIINAADVIMVARGDLGVEIGDPELVGVQKKLIRRSRQLNRVVITATQMMESMISNPMPTRAEVMDVANAVLDGTDAVMLSAETAAGQYPAETVAAMAKVALGAEKMPSINVSKHRMNVQFESIEESVAMSAMYAANHMRGVAAIITLTSSGRTARLMSRISSGLPIFALSRNESTLNLCALYRGVTPVHFDKDSRTSEGATAAVQLLKDEGFLVSGDLVLLTQGDASSSSGTNLCRTLIVE
SEQ ID NO：17(来自DD1 ΔldhA ΔpflD pykA4菌株的pykA基因的核苷酸序列)
atgtccagaagattaagaagaacgaaaatcgtatgtacaatggggcctgcaacagacaaaggcaataatttagaaaaaatcattgctgccggtgcaaacgttgtacgtatgaacttctcccacggtacgcccgaagatcatatcggtcgtgctgaaaaagtacgtgaaatcgctcataaattaggtaaacacgtagcaatcttaggtgacttacaaggccctaaaatccgtgtttctacttttaaagaaggcaaaattttcttaaatatcggtgataaattcattttagacgcagagatgcctaaaggtgaaggtaaccaggaagcggttggtttagactataaaacattaccgcaagatgtggttccgggcgatatcttattattagatgacggtcgagttcaattgaaagtattggcaaccgaaggtgcaaaagtattcaccgaagtaacggtcggtggcccactatcaaataataaaggcattaacaaattaggcggcggtttatctgccgatgcattaaccgaaaaagataaagcggatatcattactgcggcgcgtatcggtgtggattaccttgccgtatctttcccgcgttcaagcgcggatttaaactacgcccgtcaattagcaaaagatgcgggcttggatgcgaaaatcgttgcgaaagtagaacgtgccgaaacagttgaaacggacgaagcaatggacgatatcatcaatgcggcggacgtaatcatggttgcgcgcggtgacttaggtgttgaaatcggtgatccggaattagtcggtgttcagaaaaaattaatccgtcgttcacgtcagttaaatcgtgttgttattaccgcaactcaaatgatggaatcaatgattagtaatcctatgccgactcgtgcggaagtaatggacgtagctaacgcagtattggacggtaccgatgcggtaatgctttctgctgaaaccgcggctggtcaatatccggcggaaactgttgcggcgatggcgaaagttgcgttaggtgcggagaaaatgccaagcattaatgtgtctaaacaccgtatgaacgttcaattcgagtctattgaagaatctgttgcgatgtctgcaatgtatgcggcaaaccacatgagaggcgtagcggcgattatcacattaacaagtagcggtcgtactgctcgtttaatgtctcgcattagttccggtttaccaatctttgcattgtcacgtaacgaatctacTttaaacttatacgcattatatcgtggtgtgacaccggttcattttgataaagacagccgtacctcagaaggtgcgacagcggcggttcaattattaaaagacgaaggtttcttagtgtctggcgatttagtgttattaactcagggcgacgcaagcagttctagcggtactaacctttgccgtacattgattgttgaataa
SEQ ID NO：18(来自DD1 ΔldhA ΔpflD pykA4菌株的PykA4的氨基酸序列)
MSRRLRRTKIVCTMGPATDKGNNLEKIIAAGANVVRMNFSHGTPEDHIGRAEKVREIAHKLGKHVAILGDLQGPKIRVSTFKEGKIFLNIGDKFILDAEMPKGEGNQEAVGLDYKTLPQDVVPGDILLLDDGRVQLKVLATEGAKVFTEVTVGGPLSNNKGINKLGGGLSADALTEKDKADIITAARIGVDYLAVSFPRSSADLNYARQLAKDAGLDAKIVAKVERAETVETDEAMDDIINAADVIMVARGDLGVEIGDPELVGVQKKLIRRSRQLNRVVITATQMMESMISNPMPTRAEVMDVANAVLDGTDAVMLSAETAAGQYPAETVAAMAKVALGAEKMPSINVSKHRMNVQFESIEESVAMSAMYAANHMRGVAAIITLTSSGRTARLMSRISSGLPIFALSRNESTLNLYALYRGVTPVHFDKDSRTSEGATAAVQLLKDEGFLVSGDLVLLTQGDASSSSGTNLCRTLIVE
SEQ ID NO：19(来自DD1 ΔldhA ΔpflD pykA5菌株的pykA基因的核苷酸序列)
atgtccagaagattaagaagaacgaaaatcgtatgtacaatggggcctgcaacagacaaaggcaataatttagaaaaaatcattgctgccggtgcaaacgttgtacgtatgaacttctcccacggtacgcccgaagatcatatcggtcgtgctgaaaaagtacgtgaaatcgctcataaattaggtaaacacgtagcaatcttaggtgacttacaaggccctaaaatccgtgtttctacttttaaagaaggcaaaattttcttaaatatcggtgataaattcattttagacgcagagatgcctaaaggtgaaggtaaccaggaagcggttggtttagactataaaacattaccgcaagatgtggttccgggcgatatcttattattagatgacggtcgagttcaattgaaagtattggcaaccgaaggtgcaaaagtattcaccgaagtaacggtcggtggcccactatcaaataataaaggcattaacaaattaggcggcggtttatctggcgatgcGttaaccgaaaaagataaagcggatatcattactgcggcgcgtatcggtgtggattaccttgccgtatctttcccgcgttcaagcgcggatttaaactacgcccgtcaattagcaaaagatgcgggcttggatgcgaaaatcgttgcgaaagtagaacgtgccgaaacagttgaaacggacgaagcaatggacgatatcatcaatgcggcggacgtaatcatggttgcgcgcggtgacttaggtgttgaaatcggtgatccggaattagtcggtgttcagaaaaaattaatccgtcgttcacgtcagttaaatcgtgttgttattaccgcaactcaaatgatggaatcaatgattagtaatcctatgccgactcgtgcggaagtaatggacgtagctaacgcagtattggacggtaccgatgcggtaatgctttctgctgaaaccgcggctggtcaatatccggcggaaactgttgcggcgatggcgaaagttgcgttaggtgcggagaaaatgccaagcattaatgtgtctaaacaccgtatgaacgttcaattcgagtctattgaagaatctgttgcgatgtctgcaatgtatgcggcaaaccacatgagaggcgtagcggcgattatcacattaacaagtagcggtcgtactgctcgtttaatgtctcgcattagttccggtttaccaatctttgcattgtcacgtaacgaatctacattaaacttatgcgcattatatcgtggtgtgacaccggttcattttgataaagacagccgtacctcagaaggtgcgacagcggcggttcaattattaaaagacgaaggtttcttagtgtctggcgatttagtgttattaactcagggcgacgcaagcagttctagcggtactaacctttgccgtacattgattgttgaataa
SEQ ID NO：20(来自DD1 ΔldhA ΔpflD pykA5菌株的PykA5的氨基酸序列)
MSRRLRRTKIVCTMGPATDKGNNLEKIIAAGANVVRMNFSHGTPEDHIGRAEKVREIAHKLGKHVAILGDLQGPKIRVSTFKEGKIFLNIGDKFILDAEMPKGEGNQEAVGLDYKTLPQDVVPGDILLLDDGRVQLKVLATEGAKVFTEVTVGGPLSNNKGINKLGGGLSGDALTEKDKADIITAARIGVDYLAVSFPRSSADLNYARQLAKDAGLDAKIVAKVERAETVETDEAMDDIINAADVIMVARGDLGVEIGDPELVGVQKKLIRRSRQLNRVVITATQMMESMISNPMPTRAEVMDVANAVLDGTDAVMLSAETAAGQYPAETVAAMAKVALGAEKMPSINVSKHRMNVQFESIEESVAMSAMYAANHMRGVAAIITLTSSGRTARLMSRISSGLPIFALSRNESTLNLCALYRGVTPVHFDKDSRTSEGATAAVQLLKDEGFLVSGDLVLLTQGDASSSSGTNLCRTLIVE
SEQ ID NO：21(来自DD1 AldhA ΔpflD pykA6菌株的pykA基因的核苷酸序列)
atgtccagaagattaagaagaacgaaaatcgtatgtacaatggggcctgcaacagacaaaggcaataatttagaaaaaatcattgctgccggtgcaaacgttgtacgtatgaacttctcccacggtacgcccgaagatcatatcggtcgtgctgaaaaagtacgtgaaatcgctcataaattaggtaaacacgtagcaatcttaggtgacttacaaggccctaaaatccgtgtttctacttttaaagaaggcaaaattttcttaaatatcggtgataaattcattttagacgcagagatgcctaaaggtgaaggtaaccaggaagcggttggtttagactataaaacattaccgcaagatgtggttccgggcgatatcttattattagatgacggtcgagttcaattgaaagtattggcaaccgaaggtgcaaaagtattcaccgaagtaacggtcggtggcccactatcaaataataaaggcattaacaaattaggctgcggtttatctgccgatgcGttaaccgaaaaagataaagcggatatcattactgcggcgcgtatcggtgtggattaccttgccgtatctttcccgcgttcaagcgcggatttaaactacgcccgtcaattagcaaaagatgcgggcttggatgcgaaaatcgttgcgaaagtagaacgtgccgaaacagttgaaacggacgaagcaatggacgatatcatcaatgcggcggacgtaatcatggttgcgcgcggtgacttaggtgttgaaatcggtgatccggaattagtcggtgttcagaaaaaattaatccgtcgttcacgtcagttaaatcgtgttgttattaccgcaactcaaatgatggaatcaatgattagtaatcctatgccgactcgtgcggaagtaatggacgtagctaacgcagtattggacggtaccgatgcggtaatgctttctgctgaaaccgcggctggtcaatatccggcggaaactgttgcggcgatggcgaaagttgcgttaggtgcggagaaaatgccaagcattaatgtgtctaaacaccgtatgaacgttcaattcgagtctattgaagaatctgttgcgatgtctgcaatgtatgcggcaaaccacatgagaggcgtagcggcgattatcacattaacaagtagcggtcgtactgctcgtttaatgtctcgcattagttccggtttaccaatctttgcattgtcacgtaacgaatctacattaaacttatgcgcattatatcgtggtgtgacaccggttcattttgataaagacagccgtacctcagaaggtgcgacagcggcggttcaattattaaaagacgaaggtttcttagtgtctggcgatttagtgttattaactcagggcgacgcaagcagttctagcggtactaacctttgccgtacattgattgttgaataa
SEQ ID NO：22(来自DD1 ΔldhA ΔpflD pykA6菌株的PykA6的氨基酸序列)
MSRRLRRTKIVCTMGPATDKGNNLEKIIAAGANVVRMNFSHGTPEDHIGRAEKVREIAHKLGKHVAILGDLQGPKIRVSTFKEGKIFLNIGDKFILDAEMPKGEGNQEAVGLDYKTLPQDVVPGDILLLDDGRVQLKVLATEGAKVFTEVTVGGPLSNNKGINKLGCGLSADALTEKDKADIITAARIGVDYLAVSFPRSSADLNYARQLAKDAGLDAKIVAKVERAETVETDEAMDDIINAADVIMVARGDLGVEIGDPELVGVQKKLIRRSRQLNRVVITATQMMESMISNPMPTRAEVMDVANAVLDGTDAVMLSAETAAGQYPAETVAAMAKVALGAEKMPSINVSKHRMNVQFESIEESVAMSAMYAANHMRGVAAIITLTSSGRTARLMSRISSGLPIFALSRNESTLNLCALYRGVTPVHFDKDSRTSEGATAAVQLLKDEGFLVSGDLVLLTQGDASSSSGTNLCRTLIVE
SEQ ID NO：23(pykA4_fw引物的序列)
aatgcggcggacgtaatcat
SEQ ID NO：24(pykA4_rv引物的序列)
tggagaacctatccatgaagtatca
SEQ ID NO：25(pykA5/6_fw引物的序列)
tggggcctgcaacagacaaa
SEQ ID NO：26(pykA5/6_rv引物的序列)
aaacgagcagtacgaccgct
SEQ ID NO：27(来自菌株DD1的ldhA基因的核苷酸序列)
ttgacaaaatcagtatgtttaaataaggagctaactatgaaagttgccgtttacagtactaaaaattatgatcgcaaacatctggatttggcgaataaaaaatttaattttgagcttcatttctttgattttttacttgatgaacaaaccgcgaaaatggcggagggcgccgatgccgtctgtattttcgtcaatgatgatgcgagccgcccggtgttaacaaagttggcgcaaatcggagtgaaaattatcgctttacgttgtgccggttttaataatgtggatttggaggcggcaaaagagctgggattaaaagtcgtacgggtgcctgcgtattcgccggaagccgttgccgagcatgcgatcggattaatgctgactttaaaccgccgtatccataaggcttatcagcgtacccgcgatgcgaatttttctctggaaggattggtcggttttaatatgttcggcaaaaccgccggagtgattggtacgggaaaaatcggcttggcggctattcgcattttaaaaggcttcggtatggacgttctggcgtttgatccttttaaaaatccggcggcggaagcgttgggcgcaaaatatgtcggtttagacgagctttatgcaaaatcccatgttatcactttgcattgcccggctacggcggataattatcatttattaaatgaagcggcttttaataaaatgcgcgacggtgtaatgattattaataccagccgcggcgttttaattgacagccgggcggcaatcgaagcgttaaaacggcagaaaatcggcgctctcggtatggatgtttatgaaaatgaacgggatttgtttttcgaggataaatctaacgatgttattacggatgatgtattccgtcgcctttcttcctgtcataatgtgctttttaccggtcatcaggcgtttttaacggaagaagcgctgaataatatcgccgatgtgactttatcgaatattcaggcggtttccaaaaatgcaacgtgcgaaaatagcgttgaaggctaa
SEQ ID NO：28(来自菌株DD1的LdhA的氨基酸序列)
MTKSVCLNKELTMKVAVYSTKNYDRKHLDLANKKFNFELHFFDFLLDEQTAKMAEGADAVCIFVNDDASRPVLTKLAQIGVKIIALRCAGFNNVDLEAAKELGLKVVRVPAYSPEAVAEHAIGLMLTLNRRIHKAYQRTRDANFSLEGLVGFNMFGKTAGVIGTGKIGLAAIRILKGFGMDVLAFDPFKNPAAEALGAKYVGLDELYAKSHVITLHCPATADNYHLLNEAAFNKMRDGVMIINTSRGVLIDSRAAIEALKRQKIGALGMDVYENERDLFFEDKSNDVITDDVFRRLSSCHNVLFTGHQAFLTEEALNNIADVTLSNIQAVSKNATCENSVEG
SEQ ID NO：29(来自菌株DD1的pflA基因的核苷酸序列)
atgtcggttttaggacgaattcattcatttgaaacctgcgggacagttgacgggccgggaatccgctttattttatttttacaaggctgcttaatgcgttgtaaatactgccataatagagacacctgggatttgcacggcggtaaagaaatttccgttgaagaattaatgaaagaagtggtgacctatcgccattttatgaacgcctcgggcggcggagttaccgcttccggcggtgaagctattttacaggcggaatttgtacgggactggttcagagcctgccataaagaaggaattaatacttgcttggataccaacggtttcgtccgtcatcatgatcatattattgatgaattgattgatgacacggatcttgtgttgcttgacctgaaagaaatgaatgaacgggttcacgaaagcctgattggcgtgccgaataaaagagtgctcgaattcgcaaaatatttagcggatcgaaatcagcgtacctggatccgccatgttgtagtgccgggttatacagatagtgacgaagatttgcacatgctggggaatttcattaaagatatgaagaatatcgaaaaagtggaattattaccttatcaccgtctaggcgcccataaatgggaagtactcggcgataaatacgagcttgaagatgtaaaaccgccgacaaaagaattaatggagcatgttaaggggttgcttgcaggctacgggcttaatgtgacatattag
SEQ ID NO：30(来自菌株DD1的PflA的氨基酸序列)
MSVLGRIHSFETCGTVDGPGIRFILFLQGCLMRCKYCHNRDTWDLHGGKEISVEELMKEVVTYRHFMNASGGGVTASGGEAILQAEFVRDWFRACHKEGINTCLDTNGFVRHHDHIIDELIDDTDLVLLDLKEMNERVHESLIGVPNKRVLEFAKYLADRNQRTWIRHVVVPGYTDSDEDLHMLGNFIKDMKNIEKVELLPYHRLGAHKWEVLGDKYELEDVKPPTKELMEHVKGLLAGYGLNVTY
SEQ ID NO：31(来自菌株DD1的pflD基因的核苷酸序列)
atggctgaattaacagaagctcaaaaaaaagcatgggaaggattcgttcccggtgaatggcaaaacggcgtaaatttacgtgactttatccaaaaaaactatactccgtatgaaggtgacgaatcattcttagctgatgcgactcctgcaaccagcgagttgtggaacagcgtgatggaaggcatcaaaatcgaaaacaaaactcacgcacctttagatttcgacgaacatactccgtcaactatcacttctcacaagcctggttatatcaataaagatttagaaaaaatcgttggtcttcaaacagacgctccgttaaaacgtgcaattatgccgtacggcggtatcaaaatgatcaaaggttcttgcgaagtttacggtcgtaaattagatccgcaagtagaatttattttcaccgaatatcgtaaaacccataaccaaggcgtattcgacgtttatacgccggatattttacgctgccgtaaatcaggcgtgttaaccggtttaccggatgcttacggtcgtggtcgtattatcggtgactaccgtcgtttagcggtatacggtattgattacctgatgaaagataaaaaagcccaattcgattcattacaaccgcgtttggaagcgggcgaagacattcaggcaactatccaattacgtgaagaaattgccgaacaacaccgcgctttaggcaaaatcaaagaaatggcggcatcttacggttacgacatttccggccctgcgacaaacgcacaggaagcaatccaatggacatattttgcttatctggcagcggttaaatcacaaaacggtgcggcaatgtcattcggtcgtacgtctacattcttagatatctatatcgaacgtgacttaaaacgcggtttaatcactgaacaacaggcgcaggaattaatggaccacttagtaatgaaattacgtatggttcgtttcttacgtacgccggaatacgatcaattattctcaggcgacccgatgtgggcaaccgaaactatcgccggtatgggcttagacggtcgtccgttggtaactaaaaacagcttccgcgtattacatactttatacactatgggtacttctccggaaccaaacttaactattctttggtccgaacaattacctgaagcgttcaaacgtttctgtgcgaaagtatctattgatacttcctccgtacaatacgaaaatgatgacttaatgcgtcctgacttcaacaacgatgactatgcaatcgcatgctgcgtatcaccgatggtcgtaggtaaacaaatgcaattcttcggtgcgcgcgcaaacttagctaaaactatgttatacgcaattaacggcggtatcgatgagaaaaatggtatgcaagtcggtcctaaaactgcgccgattacagacgaagtattgaatttcgataccgtaatcgaacgtatggacagtttcatggactggttggcgactcaatatgtaaccgcattgaacatcatccacttcatgcacgataaatatgcatatgaagcggcattgatggcgttccacgatcgcgacgtattccgtacaatggcttgcggtatcgcgggtctttccgtggctgcggactcattatccgcaatcaaatatgcgaaagttaaaccgattcgcggcgacatcaaagataaagacggtaatgtcgtggcctcgaatgttgctatcgacttcgaaattgaaggcgaatatccgcaattcggtaacaatgatccgcgtgttgatgatttagcggtagacttagttgaacgtttcatgaaaaaagttcaaaaacacaaaacttaccgcaacgcaactccgacacaatctatcctgactatcacttctaacgtggtatacggtaagaaaaccggtaatactccggacggtcgtcgagcaggcgcgccattcggaccgggtgcaaacccaatgcacggtcgtgaccaaaaaggtgcggttgcttcacttacttctgtggctaaacttccgttcgcttacgcgaaagacggtatttcatataccttctctatcgtaccgaacgcattaggtaaagatgacgaagcgcaaaaacgcaaccttgccggtttaatggacggttatttccatcatgaagcgacagtggaaggcggtcaacacttgaatgttaacgttcttaaccgtgaaatgttgttagacgcgatggaaaatccggaaaaatacccgcaattaaccattcgtgtttcaggttacgcggttcgtttcaactcattaactaaagagcaacaacaagacgtcatcactcgtacgtttacacaatcaatgtaa
SEQ ID NO：32(来自菌株DD1的PflD的氨基酸)
MAELTEAQKKAWEGFVPGEWQNGVNLRDFIQKNYTPYEGDESFLADATPATSELWNSVMEGIKIENKTHAPLDFDEHTPSTITSHKPGYINKDLEKIVGLQTDAPLKRAIMPYGGIKMIKGSCEVYGRKLDPQVEFIFTEYRKTHNQGVFDVYTPDILRCRKSGVLTGLPDAYGRGRIIGDYRRLAVYGIDYLMKDKKAQFDSLQPRLEAGEDIQATIQLREEIAEQHRALGKIKEMAASYGYDISGPATNAQEAIQWTYFAYLAAVKSQNGAAMSFGRTSTFLDIYIERDLKRGLITEQQAQELMDHLVMKLRMVRFLRTPEYDQLFSGDPMWATETIAGMGLDGRPLVTKNSFRVLHTLYTMGTSPEPNLTILWSEQLPEAFKRFCAKVSIDTSSVQYENDDLMRPDFNNDDYAIACCVSPMVVGKQMQFFGARANLAKTMLYAINGGIDEKNGMQVGPKTAPITDEVLNFDTVIERMDSFMDWLATQYVTALNIIHFMHDKYAYEAALMAFHDRDVFRTMACGIAGLSVAADSLSAIKYAKVKPIRGDIKDKDGNVVASNVAIDFEIEGEYPQFGNNDPRVDDLAVDLVERFMKKVQKHKTYRNATPTQSILTITSNVVYGKKTGNTPDGRRAGAPFGPGANPMHGRDQKGAVASLTSVAKLPFAYAKDGISYTFSIVPNALGKDDEAQKRNLAGLMDGYFHHEATVEGGQHLNVNVLNREMLLDAMENPEKYPQLTIRVSGYAVRFNSLTKEQQQDVITRTFTQSM

Claims (18)

1.修饰微生物，与其野生型相比，其具有降低的pykA基因编码的酶的活性，其中衍生修饰微生物的野生型属于巴斯德氏菌科。
2.权利要求1的修饰微生物，其中修饰微生物与其野生型相比不具有提高的磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶活性水平。
3.权利要求1或2的修饰微生物，其中衍生修饰微生物的野生型具有SEQ ID NO:1的16SrDNA，或与SEQ ID NO:1显示至少96％序列同源性的序列的16S rDNA。
4.权利要求3的修饰微生物，其中衍生修饰微生物的野生型属于Basfia属。
5.权利要求4的修饰微生物，其中衍生修饰微生物的野生型属于Basfiasucciniciproducens物种。
6.权利要求5的修饰微生物，其中衍生修饰微生物的野生型是以DSM 18541保藏于德国DSMZ的Basfia succiniciproducens菌株DD1。
7.权利要求1至6中任一项的修饰微生物，其中野生型pykA基因包含选自以下的核酸：
a)具有核苷酸序列SEQ ID NO:3的核酸；
b)编码氨基酸序列序列SEQ ID NO:4的核酸；
c)与a)或b)的核酸具有至少70％同一性的核酸，同一性是a)或b)的核酸全长内的同一性；
d)编码与a)或b)的核酸所编码的氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列的核酸，同一性是a)或b)的核酸所编码的氨基酸序列全长内的同一性；
e)能够在严格条件下与a)或b)的任意核酸的互补序列杂交的核酸；和
f)编码与a)或b)的任意核酸相同的蛋白质但由于遗传密码的简并性而不同于以上a)或b)的核酸的核酸。
8.权利要求1至7中任一项的修饰微生物，其中通过在pykA基因中引入至少一个突变来降低pykA基因编码的酶的活性。
9.权利要求8的修饰微生物，其中至少一个突变导致pykA基因的核酸序列的修饰，使得修饰基因编码的酶的氨基酸序列在至少一个氨基酸上不同于野生型pykA基因编码的酶的氨基酸序列。
10.权利要求1至9中任一项的修饰微生物，其中重组微生物与其野生型相比进一步具有：
i)降低的丙酮酸甲酸裂合酶活性；
ii)降低的乳酸脱氢酶活性；或
iii)降低的丙酮酸甲酸裂合酶活性和降低的乳酸脱氢酶活性。
11.权利要求10的修饰微生物，其中微生物包含：
A)ldhA基因或至少其部分的缺失，ldhA基因的调节元件或至少其部分的缺失，或ldhA基因中至少一个突变的引入；
B)pflD基因或至少其部分的缺失，pflD基因的调节元件或至少其部分的缺失，或pflD基因中至少一个突变的引入；
C)pflA基因或至少其部分的缺失，pflA基因的调节元件或至少其部分的缺失，或pflA基因中至少一个突变的引入；
D)ldhA基因或至少其部分的缺失，ldhA基因的调节元件或至少其部分的缺失，或ldhA基因中至少一个突变的引入；
和
pflD基因或至少其部分的缺失，pflD基因的调节元件或至少其部分的缺失，或pflD基因中至少一个突变的引入；
E)ldhA基因或至少其部分的缺失，ldhA基因的调节元件或至少其部分的缺失，或ldhA基因中至少一个突变的引入；
和
pflA基因或至少其部分的缺失，pflA基因的调节元件或至少其部分的缺失，或pflA基因中至少一个突变的引入。
12.产生有机化合物的方法，其包括：
I)在包含至少一种可同化的碳源的培养基中培养权利要求1至11中任一项的修饰微生物，以允许修饰微生物产生有机化合物，从而获得包含有机化合物的发酵液；
II)从方法步骤I)中获得的发酵液回收有机化合物。
13.权利要求12的方法，其中有机化合物是琥珀酸。
14.权利要求12或13的方法，其中可同化的碳源选自蔗糖、麦芽糖、D-葡萄糖、甘油、甘油和D-葡萄糖的混合物、甘油和蔗糖的混合物、甘油和D-木糖的混合物、甘油的混合物及麦芽糖，和D-葡萄糖和果糖的混合物。
15.权利要求12至14中任一项的方法，其中方法进一步包括方法步骤：
III)通过至少一步化学反应，使包含在方法步骤I)中获得的发酵液中的有机化合物或方法步骤II)中获得的回收的有机化合物转化为不同于有机化合物的次级有机产物。
16.权利要求15的方法，其中有机化合物是琥珀酸，其中次级有机产物选自琥珀酸酯或其聚合物、四氢呋喃(THF)、1,4-丁二醇(BDO)、γ-丁内酯(GBL)和吡咯烷酮。
17.权利要求1至11中任一项的修饰微生物的用途，用于发酵产生有机化合物。
18.权利要求17的用途，其中有机化合物是琥珀酸。
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