CN103757048A - 无抗药基因的酵母-细菌穿梭载体的构建和应用 - Google Patents

Abstract

穿梭载体是具有两种不同的复制起点和筛选标记、能够在大肠杆菌和另一种宿主细胞中独立存在并进行复制的质粒载体。目前广泛使用的穿梭载体都含有用作筛选标记的抗药基因，其生物安全性是限制微生物转基因技术推广应用的关键因素。本发明成功利用葡萄糖胺合成酶基因取代抗药基因，获得酵母-大肠杆菌，穿梭载体pGFA。新载体的特征：(1)不含潜在危害性基因，具有生物安全性；(2)筛选功能强，能够有效维持重组表征；(3)不受微环境中富营养条件的影响；(4)两种宿主共用筛选标记，从而精简了载体分子、扩大了载体容量、提高了基因转化率。通过pGFA赋予新功能的酵母细胞可以在食品发酵、饲料添加、环境修复等领域得到推广应用。

Description

无抗药基因的酵母-细菌穿梭载体的构建和应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域；具体涉及分子生物技术、基因工程、细胞工程、环境修复等技术领域；更具体涉及1种不含抗药基因的酵母-细菌穿梭载体及其应用技术。

背景技术

穿梭载体是具有两种不同的复制起点和筛选标记、能够在大肠杆菌和另一种宿主细胞中独立存在并进行复制的质粒载体(吴乃虎，2001，《基因工程原理》，p.502)。大肠杆菌是转化率最高、质粒最容易分离的宿主细胞。为了有效转化大肠杆菌以外的宿主细胞，人们首先需要在大肠杆菌中进行基因克隆和载体构建，并通过大肠杆菌细胞制备较大量的纯质粒；因此，所采用的质粒必须含有一套大肠杆菌的复制元件和筛选标记，同时含有第二套适用于另一种宿主细胞的复制元件和筛选标记。

筛选标记是质粒载体所必备的基本元件。抗药基因是微生物转基因的有效筛选标记，目前所使用的在不同微生物和大肠杆菌之间共用的穿梭载体都含有用作筛选标记的抗药基因。通过这些载体转基因可能导致抗药基因的扩散，其生物安全性问题长久以来一直是限制微生物转基因技术推广应用的关键因素。营养缺陷型筛选标记可以避免抗药基因的传播，具有生物安全性，但是自然环境或自然培养基中富含氨基酸、核苷酸等营养成分，使相关的营养缺陷型筛选标记不能够维持筛选压力。同时，由于细菌易于回复突变，营养缺陷型筛选标记在细菌如大肠杆菌中未能有效运用。

谷氨酰胺：6-磷酸果糖氨基转移酶(Gfa)又称6-磷酸葡萄糖胺合成酶(Glm)；它是一种胞内酶，催化底物谷氨酰胺和6-磷酸果糖形成6-磷酸葡萄糖胺和谷氨酸，即氨基己糖合成代谢途径中的第一步反应(Bearne SL，J Biol Chem，1996，271：p.3052-7)。Gfa几乎存在于每个物种和组织中，是生命活动所必需的(Yamazaki K，et al.，Gene，2000，261：p.329-36；Smith RJ，etal.，J Bacteriol，1996，178：p.2320-7)。Gfa编码基因的失活会使细胞依赖于外源葡萄糖胺的补充。

本实验室在以前的研究中，我们首次用实验证明葡萄糖胺合成酶基因可以是一种既适用于真菌又适用于细菌的生物安全性的筛选标记基因(Wu G，et al.，PLoS One，2011.6：p.e17082)。我们敲除了大肠杆菌(Escherichia coli)的Gfa编码基因glmS和粟裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的Gfa编码基因gfa1，构建了两种gfa缺失菌株，E.coli ΔglmS和S.pombe Δgfa1；这些菌株在不添加葡萄糖胺的培养基中不能正常生长。当我们用带有glmS基因的大肠杆菌质粒pHsh-glmS转化大肠杆菌后，含有质粒的大肠杆菌细胞得到成功筛选。同样，用带有gfa1的粟酒裂殖酵母质粒pREP-AGCX转化菌株S.pombe Δgfa1能够使它重新获得在不添加葡萄糖胺的培养基上生长的能力；其中，pREP-AGCX和其他所有的穿梭载体一样：至少带有1个用作大肠杆菌筛选标记的抗药，如amp^r(氨苄青霉素抗药基因)(Wu G，et al.，PLoS One，2011，6：p.e17082)。

发明内容

1.发明目的：

以Gfa缺失菌株为基础，创建1个既能够被酵母系统又能够被大肠杆菌系统识别和转录表达的非抗药性筛选标记，从而构成1个不带有任何抗药基因的穿梭载体。本发明的穿梭载体由生物安全性基因构成，从而能够在基因重组菌株的应用范围方面取得突破：用该质粒进行遗传改造的细胞可以直接应用于食品发酵、饲料添加、环境修复等复杂环境。

2.技术关键：

将粟酒裂殖酵母基因gfa1(Sp-gfa)用着酵母-大肠杆菌穿梭载体中的筛选标记，对Sp-gfa上游的转录表达元件进行重新设计和改造，使穿梭载体中的Sp-gfa在大肠杆菌和粟酒裂殖酵母都具有筛选标记功能，不再使用抗生素筛选，达到构建生物安全性穿梭载体的目的。

3.技术方案：

(1)利用生物信息学软件分析粟酒裂殖酵母gfa1基因的启动子和终止信号序列区，并将含有自身启动子和终止信号序列的gfa1基因插入到一个原核载体pHsh中。

(2)在pHsh-Sp-gfa中，删除gfa基因中的内含子序列，并人工改造gfa基因的终止密码子下游序列，形成可以在大肠杆菌中使用的终止子序列。

(3)在优化过的pHsh-Sp-gfa载体基础上，人工设计改造gfa基因的启动子序列，加入大肠杆菌的σ⁷⁰启动子核心序列和核糖体结合位点SD序列，并转化E.coliΔglmS。

(4)将经过改造的可在大肠杆菌中发挥筛选功能的gfa基因序列插入到pREP3X中，并删除载体中的leu和amp筛选标记基因序列，构建成新型穿梭载体pGFA(图1)。

(5)验证改造后的穿梭载体在gfa缺失型菌株S.pombeΔgfa1和E.coliΔglmS中的转化和选择功能。

(6)新型穿梭载体pGFA克隆外源基因在裂殖酵母中进行表达试验。

4.本发明可取得的有益效果：

(1)本发明产生的质粒pGFA是一个生物安全性的转基因载体。这是生物工程领域第1个成功剔除抗生素筛选标记基因的新型穿梭载体，质粒的基本元件仅包含质粒复制元件和gfa筛选标记，前者广泛存在于自然界而后者是各种生物都具有的必需基因。

(2)pGFA所使用的非抗药基因筛选标记能够有效地维持筛选压力，从而有效防止重组基因的丢失。

(3)pGFA的筛选作用不依赖于抗菌素或其他化学品的添加，也不受自然环境或发酵原料中的糖、氨基酸、核苷酸等营养成分的影响。

(4)在pGFA中，不同宿主共用同一个筛选标记，质粒的分子得到充分精简，外源目标基因的容量进一步扩大，基因转化率得到提高。

附图说明

图1.本发明的穿梭载体pGFA(B)与通用穿梭载体(A)的结构图比较。

图2.筛选标记gfa基因的起始密码子上游序列人工设计改造前后比较。

图3.载体pGFA转化E.coliΔglmS(A，B)和S.pombe Δgfa1的互补验证(C，D)：在不补充葡萄糖胺的培养基上，只有带有pGFA的菌株才能生长(B，D)。

图4.运用载体pGFA克隆木聚糖酶基因，使无抗药基因酵母重组菌分泌木聚糖酶。

具体实施方式：

本发明中所用术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面的方法结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。应理解实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

1.所用材料与常规技术

(1)菌株及质粒：

敲除粟酒裂殖酵母S.pombe YHL6381菌株(h⁺，his3-D1，leu1-32，ura4-D18，ade6-M210)中的gfa1基因构获得gfa缺失型菌株S.pombe Δgfa1，敲除E.coli K12菌株中的glmS基因获得gfa缺失型菌株E.coliΔglmS，具体方法参见Wu G，et al.(PLoS One，2011，6：p.e17082)。本研究中还用到E.coli DH10B菌株以及质粒pREP3X(Maundrell，K.1993，Gene123：127-130)，pHsh-Amp(Wu H，et al.，2010，Biotechnol Lett，32：795-801)。

(2)感受态细胞的制备及基因转化方法：

菌株E.coli ΔglmS在含有5mM盐酸葡萄糖胺(购自Sigma公司，货号G4875)的LB培养基中培养(37℃)，并按照标准大肠杆菌感受态制备方法制备电转化感受态细胞。采用电穿孔系统(Bio-rad Gene Pulser Xcell^TM)并按其操作要求进行大肠杆菌的电转化。粟酒裂殖酵母菌株S.pombeΔgfa1在含有10mM盐酸葡萄糖胺的YES培养基中培养，按照标准醋酸锂转化方法进行基因转化。本研究中所使用的酵母培养基YES和EMM中均添加了终浓度为225mg/l的组氨酸、亮氨酸、腺嘌呤和尿嘧啶。

(3)其他常规DNA操作方法：

实验中所使用的T4 DNA连接酶购自NEB公司，DNA聚合酶、

DNA聚合酶、DNA分子量Marker等常规试剂均购自大连Takara生物公司，DNA片段割胶回收中所用QG、PE试剂购自Qiagen公司。PCR反应和DNA片段连接反应均按照相应说明书要求操作。根据Yeast Plasmid Mini Kit试剂盒操作说明，提取酵母质粒。基因序列的测定由上海美吉生物公司完成。

2.在酵母gfa基因及其表达元件中植入大肠杆菌基因表达元件

(1)基因克隆：根据GeneBank数据中的GeneID：2539622基因数据，设计引物(SEQ IDNO.1和No.2)从粟酒裂殖酵母基因组中扩增gfa1基因及其自身带有的启动子和终止信号序列。得到的PCR产物长度为2,718bp，其碱基序列列表于SEQ ID NO.3，定名为Sp-gfa。设计引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5扩增大肠杆菌表达载体pHsh-Amp的线性片段，将它与Sp-gfa连接构建成大肠杆菌表达质粒pHsh-Sp-gfa。由于Sp-gfa插入pHsh-Amp质粒中的amp基因序列与复制元件序列之间，保证Sp-gfa的表达不受pHsh-Amp自身启动子的影响。

(2)终止子和内含子：带有自身启动子的酵母基因gfa1在大肠杆菌中不能够表达，需要经过添加大肠杆菌的终止子、启动子，并去除内含子。我们在gfa1基因编码框的下游区设计加入不依赖ρ因子的终止子序列，采用反向PCR方法，以构建得到的pHsh-SpGfa质粒为模板，用引物SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7扩增，得到的PCR片段，磷酸化处理后，进行连接反应得到质粒pHsh-Sp-gfa-term。在gfa1基因中发现两个紧邻的内含子，我们通过一步反向PCR的方法将其去除，所用引物序列见SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，所得到的质粒命名为pHsh-Sp-gfa-Δintron。

(3)启动子和核糖体结合位点：为了保证gfa1基因在大肠杆菌中的各个生长时期都能表达，所以我们将其设计在组成型启动子的控制下。因此，我们采用反向PCR的方法，在gfa1基因的上游序列区中设计引物插入σ⁷⁰类型启动子的核心序列-10区(5’-TATAAT-3’)和-35区(5’-TTGACA-3’)，所用引物序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，得到的质粒命名为pHsh-Sp-gfa-σ70。

在大肠杆菌中，目的基因的表达除了有启动子核心序列元件外，还要有核糖体结合位点SD序列，以便在翻译过程中使核糖体能正确结合到转录合成的mRNA上。采用反向PCR方法，将大肠杆菌基因dmsC的核糖体结合位点序列加入到pHsh-Sp-gfa-σ70中的gfa1基因的前面，所用引物为SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13。测序正确的质粒命名为pHsh-Sp-gfa-Ec，启动子序列改造前后比较见图2。经人工改造后的的gfa1基因及表达元件序列见SEQ ID NO.14。

(4)筛选标记功能验证：我们用pHsh-Sp-gfa-Ec转化E.coliΔglmS，结果显示gfa缺失型大肠杆菌的转化子获得了在不添加葡萄糖胺的培养基上生长的能力，证明一个酵母-大肠杆菌共用型的非抗药基因筛选标记Sp-gfa-Ec已经构建成功。

3.新型穿梭载体pGFA的构建

(1)质粒pREP3X中酵母筛选标记的替换

通用型穿梭载体pREP3X中的筛选标记基因是leu，适用于氨基酸Leucine营养缺陷型酵母菌株，但是在含有酵母粉或蛋白胨的培养基中无选择压力。我们为了以gfa筛选标记替换leu，我们用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从质粒pHsh-Sp-gfa-Ec中扩增出Sp-gfa-Ec；用引物SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16从穿梭载体pREP3X中扩增出删除了leu的线性载体片段，将其与Sp-gfa-Ec片段连接后，获得穿梭载体pRep-Sp-gfa-Ec。

(2)抗药基因amp的删除

Sp-gfa-Ec在大肠杆菌E.coliΔglmS中已经具备筛选标记基因的功能，所以，我们除去质粒pRep-Sp-gfa-Ec中的筛选标记amp，建立无抗药基因穿梭载体pGFA。用引物SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，以质粒pRep-Sp-gfa-Ec为模板进行反向PCR扩增。对PCR产物进行磷酸化处理后，用T4 DNA连接酶连接，反应液转化E.coliΔglmS感受态细胞，在无抗生素的LB固体培养基平皿上培养转化子，获得的质粒被命名为pGFA-nmt。

(3)nmt启动子的替换：

在穿梭载体pGFA-nmt中位于多克隆位点上游控制外源基因表达的启动子是裂殖酵母nmt基因的启动子；nmt启动子的启动转录功能受到酵母粉中的营养成分的抑制，因此，本发明中将它替换为磷酸丙酮酸水合酶eno基因的启动子。根据NCBI数据库中eno基因信息(SPBC1815.01)，设计引物SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20，以酵母基因组DNA为模板扩增eno基因启动子片段。同时，以构建的质粒pGFA-nmt为模板，设计引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22，扩增载体片段。将得到的eno基因启动子片段和载体片段进行平端连接后转化E.coli ΔglmS。获得的质粒为eno基因启动子替换nmt启动子后的质粒，被命名为pGFA，其分子大小为7007bp(图1)，序列见SEQ ID NO.23。

用pGFA转化大肠杆菌E.coliΔglmS和酵母S.pombe Δgfa1，验证其中的Sp-gfa-Ec在两种宿主中能否发挥筛选功能，图3显示转化pGFA质粒的gfa缺失型菌株E.coli ΔglmS和S.pombeΔgfa1均获得了正常生长的能力。因此，宿主菌株在不补充葡萄糖胺的自然培养基的生长能力依赖于穿梭载体的存在，换言之，pGFA是一个无抗药基因而稳定有效的生物安全性穿梭载体。

4.新型穿梭载体pGFA应用实例：

实例1.用pGFA构建产生木聚糖酶的裂殖酵母

为了检验构建的质粒pGFA的实用效果，以本实验室之前构建的质粒pREP-AGCX为模板(Wu H，et al.，2010，Biotechnol Lett，32：795-801)，设计引物SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25，得到分泌信号肽cpy和木聚糖酶XynA融合的片段序列，并将个PCR片段割胶回收和磷酸化处理。以pGFA为模板，设计引物SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27，扩增载体序列。通过平端克隆方式将两片段连接到一起，并转化E.coliΔglmS，得到的质粒命名为pGFA-CX。将质粒pGFA-CX转化S.pombe Δgfa1感受态细胞，在YES培养基上筛选。挑取裂殖酵母转化子到EMM液体培养基中培养，培养3天后使用蛋白浓缩柱浓缩胞外分泌蛋白，并取相当于胞外培养液1ml的样品量进行SDS-PAGE电泳分析。木聚糖酶XynA的大小为23kD左右，结果如图4所示，在转化pGFA-CX的酵母培养液中在23kD处有明显的目的蛋白条带。木聚糖酶活性的测定是以0.5％燕麦木聚糖为底物，利用对羟基苯甲酸酰肼与水解反应产生的还原糖的显色反应进行比色，410nm下测定其吸收值(Lever M，Anal Biochem，1972，47：273-279.)。在EMM培养液中测得分泌表达的木聚糖酶活最高可达30U/ml。

实例2.用pGFA构建具有降低胆固醇能力的裂殖酵母

根据GeneBank数据库中来源于Streptomyces clavuligerus的胆固醇氧化酶信息(NZ_CM000913.1)设计引物SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29扩增胆固醇氧化酶基因片段，得到的PCR产物割胶并磷酸化处理。以pGFA为模板，设计引物SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27，扩增载体序列片段。将载体序列与磷酸化的胆固醇氧化酶基因片段平端连接，并电转化E.coliΔglmS，在无抗性LB培养基上筛选。挑转化子测序，正向插入的质粒命名为pGFA-Clo。将质粒pGFA-Clo转化S.pombe Δgfa1感受态细胞，在YES培养基上筛选转化子。挑取转化子在EMM液体培养基中培养。收集培养的5ml酵母细胞，在5000rpm离心10min，用150μl的PBS缓冲液重悬细胞，并加入0.1mm的酸洗玻璃珠震荡破碎酵母细胞。将破碎的细胞混合液在12000rpm下高速离心以去除细胞残留，取上清液进行酶活分析(季文明，陈毅力，食品与生物技术，2000，19(3)：251-254)，检测到明显酶活。

Claims (6)

1.一种新型酵母-大肠杆菌穿梭载体，其基本特征在于不含有任何用作筛选标记的抗药基因。

2.一种穿梭载体，其特征在于只带有1个能够被不同的宿主细胞共同使用的非抗药性筛选标记基因。

3.一种穿梭载体，其特征在于控制外源基因表达的启动子是来源于酵母菌eno基因的强启动子。

4.如权利要求2所述的穿梭载体中的筛选标记，其特征在于是由人工设计和合成的、能够被酵母和细菌共用的谷氨酰胺：6-磷酸果糖氨基转移酶的基因表达盒，其组合元件依次为：酵母启动子、大肠杆菌启动子、核糖体结合位点、开放阅读框、大肠杆菌转录终止子、酵母转录终止信号序列。

5.一种大肠杆菌载体pHsh-Sp-gfa-Ec其特征在于带有如权利要求4所述的谷氨酰胺：6-磷酸果糖氨基转移酶的基因表达盒。

6.如权利要求4和权利要求5所述的谷氨酰胺：6-磷酸果糖氨基转移酶的基因表达盒，其碱基序列与pHsh-Sp-gfa-Ec中的Sp-gfa-Ec序列(SEQ ID NO.14)的同源性高于80％。

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