CN104480130A - 一种pTerm-SC质粒及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种pTerm-SC质粒及其构建方法和应用，所述的pTerm-SC质粒包括repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、ori2复制子、oriⅤ复制子、原核生物转录终止子以及抗生素抗性基因。本发明的pTerm-SC质粒具有拷贝数很低、容量大、稳定性高等特点，可用于结构复杂基因、包括重复序列、不稳定基因以及长片段基因的克隆、筛选、测序和基因组的构建等基因工程领域，对基因的高效率、高质量合成具有重要的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术及基因工程领域，具体涉及一种低拷贝、大容量、高稳定性的pTerm-SC质粒及其构建方法和应用。
背景技术
质粒是染色质外的遗传因子，能够进行自主复制，是一种能独立复制的复制子。质粒是一种双链共价闭合环形DNA分子，可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2kb-300kb之间。
质粒虽然不是宿主生存所必需的遗传元件，但是能够给予宿主细胞某些特殊的性质，例如抗药性等。质粒可以作为载体用于克隆外源基因，广泛应用于基因克隆、测序及基因合成等领域。人们一方面不断从自然界发现新质粒，另一方面也不断在已有质粒的基础上构建衍生质粒，作为基因工程的载体。
所谓复制子，即是一个遗传单位，包括DNA复制起点(ori)及其相关的调控原件。每个质粒DNA上都含有ori，在质粒中ori是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，只有ori能被宿主细胞复制及蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状况主要与ori的序列结构相关。
根据质粒复制的特点，质粒被分为严紧型和松弛型两类。严紧型质粒也称低拷贝数质粒，每个细胞中拷贝数有限，大约一个至十几个；松弛型质粒也称高拷贝数质粒，其拷贝数较多，可达几百个。恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、宿主细胞遗传背景及生长条件有关。尤其是高拷贝数质粒更是因其分子量小、拷贝数高、操作方便、易于大量制备等优点而成为实验中的首选。
质粒复制控制系统首先通过调节ori来控制拷贝数，调节因素包括阻遏蛋白、反义RNA和某些顺向重复序列等，一旦质粒上与调控有关的基因位点突变，可使拷贝数明显增加或减少。在质粒复制时，首先合成前RNAⅡ即前引物，并与DNA形成杂交体；而后RNase H切割前RNAⅡ，使之成为成熟的RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二级结构，同时Rop增强RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。削弱RNAⅠ和RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有pMB1或(ColE1)复制子的拷贝数。
松弛型质粒(高拷贝数质粒)通常带有蓝白斑筛选功能(例如pUC系列载体)，这个特点给基因克隆带来了极大的方便。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz＇的基因，lacz＇中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子序列；编码α肽链的序列；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的序列中，是外源DNA的插入位点。设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽(即α肽链)，从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用，能够使X-gal生成蓝色物质，这种现象即α-互补。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生有活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型呈现白色菌落。
虽然带有蓝白斑筛选功能的高拷贝数质粒给基因克隆提供了极大的方便，但是其β-半乳糖苷酶的启动子属于强启动子，能够大量启动外源基因的转绿、翻译，这也导致了某些结构复杂的基因、转录或翻译产物对宿主有毒性的基因无法克隆。目前通常使用以下两种方式克隆这类“难度”基因：①选用低拷贝或单拷贝质粒作为克隆载体；②选用可以降低质粒拷贝数的菌株，例如EPI400。尽管这些方法可以成功克隆部分“难度”基因，但是仍有很多基因无法克隆，究其原因是因为这些载体尽管拷贝数低，但是通常还是带有蓝白斑筛选功能，仍具有大量启动外源基因的转绿、翻译的强启动子，并且即使质粒中不带有蓝白斑筛选功能，不具有相应的强启动子，质粒中其它启动子(例如抗生素抗性基因启动子)也可以启动外源基因的低量转录、翻译，因此，如何克服现有质粒载体存在的上述缺陷，提高克隆“难度”基因的成功率是很多科研人员需要解决的首要问题。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种能够有效遏制外源基因的转录、翻译，更为稳定的低拷贝书细菌致育因子(Fertility factor)衍生载体pTerm-SC质粒，并进一步公开其构建方法及应用。
本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：
一种pTerm-SC质粒，所述质粒包括repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、ori2复制子、oriⅤ复制子、抗生素抗性基因以及原核生物转录终止子；所述原核生物转录终止子为至少两个不依赖ρ因子的原核生物转录终止子；所述原核生物转录终止子设置于多克隆位点的两端。
优选的，所述抗生素抗性基因为编码氯霉素乙酰转移酶的Cm基因。
优选的，所述质粒的拷贝数为7-10个。
优选的，所述质粒具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，所述质粒中，自5’端第4366bp-5540bp为sopA基因，5541bp-6512bp为sopB基因，6608bp-7062bp为sopC基因，542bp-1201bp为Cm基因，2438bp-3193bp为repE基因，1573bp-2079bp为oriⅤ复制子，2135bp-2344bp为ori2复制子，1bp-412bp及3608bp-4201bp为转录终止子区域，3915bp-3956bp为多克隆位点。
一种构建pTerm-SC质粒的方法，包括以下步骤：
步骤一：分别设计并人工合成具有SEQ ID NO.1所示序列结构的SopA-SopB基因片段、具有SEQ ID NO.2所示序列结构的SopC-原核生物转录终止子基因片段、具有SEQ ID NO.3所示序列结构的Cm-oriⅤ-ori2基因片段以及具有SEQ ID NO.4所示序列结构的repE-原核生物转录终止子基因片段；
步骤二：运用多段重组法将所述SopA-SopB基因片段、SopC-原核生物转录终止子基因片段、Cm-oriⅤ-ori2基因片段、repE-原核生物转录终止子基因片段连接环化，最终得到环形的质粒。
优选的，所述SopA-SopB基因片段、SopC-原核生物转录终止子基因片段、Cm-oriⅤ-ori2基因片段、repE-原核生物转录终止子基因片段之间具有30bp的重叠互补区。
优选的，所述多段重组法为Gibson重组方法，按1:1:1:1的摩尔比取所述SopA-SopB基因片段、SopC-原核生物转录终止子基因片段、Cm-oriⅤ-ori2基因片段、repE-原核生物转录终止子基因片段，加入灭菌去离子水及Gibson Assembly Master Mix试剂，50℃下反应至得到环形质粒。
上述所述方法构建得到的pTerm-SC质粒。
所述pTerm-SC质粒在基因克隆、筛选和测序领域中的应用。
优选的，所述pTerm-SC质粒在结构复杂、含有重复序列以及不稳定序列基因的克隆、筛选和测序中的应用。
优选的，所述pTerm-SC质粒在长片段基因的克隆、筛选、测序和基因组合成中的应用。
本发明利用人工合成的方法，合成一种低拷贝pTerm-SC质粒，主要技术手段是删除众多克隆质粒所具有的蓝白斑筛选基因及相应的强启动子，并且在多克隆位点两端添加了多个防止外源DNA序列从上游质粒启动子过多转录的原核生物转录终止子，即不依赖ρ因子的原核生物转录终止子，因此能够有效遏制外源基因的转录、翻译，从而使该质粒能够克隆高拷贝、低拷贝、单拷贝载体所不能克隆的基因及对宿主细胞有毒害的基因。该质粒转化可诱导表达TrfA菌株后，在诱导剂，如阿拉伯糖，存在的情况下，TrfA可激活oriⅤ复制起点，并使质粒拷贝数由每个细胞1-10拷贝提高到每个细胞30-50拷贝从而提高质粒抽提量。
本发明所述pTerm-SC质粒可以克隆0.1kb-150kb的基因片段，容量较大：并且具有可供转化子选择的标记抗生素抗性基因；同时具有两个大肠杆菌复制子，在不能表达trfA的菌株中以低拷贝形式复制以提高质粒的稳定性；在能够表达trfA的菌株中oriⅤ可以启动质粒的高拷贝复制，方便后续质粒制备等实验操作；所述质粒在没有选择压力的情况下，连续培养120代，质粒的保持率均为100％，具有较高的稳定性，且能够克隆高拷贝、低拷贝、单拷贝载体所不能克隆的外源基因。
本发明的pTerm-SC质粒具有拷贝数很低、容量大、稳定性高等特点，可用于结构复杂基因、包括重复序列、不稳定基因以及长片段基因的克隆、筛选、测序和基因组的构建等基因工程领域，对基因的高效率、高质量合成具有重要的作用。利用pTerm-SC质粒已经成功构建出约72kb的Ostreococcus tauri叶绿体基因组片段。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为pTerm-SC质粒的物理图谱；
图2为pTerm-SC质粒构建流程模式图；
图3为pTerm-SC载体构建肺炎链球菌DNA序列重组质粒的酶切验证图，其中1为重组质粒对照；2为重组质粒用限制性内切酶XhoⅠ和MluⅠ酶切结果；3为1KB DNA Marker；
图4为Ostreococcus tauri叶绿体基因组重组质粒的酶切验证图，其中1为重组质粒对照，2为重组质粒用限制性内切酶NotⅠ和AscⅠ的酶切结果，3为1KB DNA Marker。
具体实施方式
实施例1：质粒pTerm-SC的构建
质粒pTerm-SC的结构如图1所示，其构建流程模式图如图2所示，具体方法如下：
1.设计并合成SopA-SopB基因，基因序列如序列表中的序列1所示，序列全长2250bp，其中66-1240bp为SopA基因，编码SopA蛋白，1241-2212bp为SopB基因，编码SopB蛋白；
2.设计并合成SopC-Terminator基因，基因序列如序列表中的序列2所示，序列全长1266bp，其中序列88-542bp为SopC顺式作用区域，797-1208bp为原核生物转录终止子；
3.设计并合成Cm-oriⅤ-ori2基因，基因序列如序列表中的序列3所示，序列全长1960bp，其中102-761为氯霉素抗性基因，编码氯霉素乙酰转移酶，1133-1639bp为oriⅤ复制子基因，1695-1904bp为ori2复制子基因；
4.设计并合成repE-Terminator基因，基因序列如序列表中的序列4所示，序列全长1960bp，其中68-823bp为repE基因，编码repE蛋白，1238-1831bp为原核生物转录终止子；
5.分别合成以上四个基因片段，由于四个片段之间具有30bp重叠互补区，因此使用GibsonMaster Mix(NEB)试剂盒将它们组装起来最终得到环形的质粒，记为pTerm-SC，其测序序列如SEQ ID No.5所示。
GibsonMaster Mix反应体系及条件：四个基因片段各1μl，灭菌去离子水6μl，GibsonMaster Mix：10μl，50℃反应1小时。
测序结果表明构建出的质粒与预期相符，质粒的长度为7316bp。质粒中主要元件的位置分别是：sopA基因，4366bp-5541bp；sopB基因，5541bp-6512bp；sopC基因，6608bp-7062bp；Cm基因，542bp-1201bp；repE基因，2438bp-3193bp；oriⅤ复制子，1573bp-2079bp；ori2复制子，2135bp-2344bp；原核生物转录终止子区域，1bp-412bp及3608bp-4201bp；其中多克隆位点在3915bp-3956bp处。
实施例2：质粒pTerm-SC稳定性检测
将质粒pTerm-SC转化到大肠杆菌TOP10F′感受态细胞中，挑取单克隆菌落在含有氯霉素抗生素(25-50μg/μl)的LB培养基中过夜培养，之后对培养的菌液在含有氯霉素抗生素(25-50μg/μl)的平板上划线培养，对划线得到的单克隆重新在含有氯霉素抗生素(25-50μg/μl)的平板上再进行一次划线培养，由此得到纯的阳性转化克隆。
将得到的纯的阳性转化克隆接种到不含有抗生素的LB培养基中，37℃培养20代(约7h)后，从中取100μl接种至新的不含有抗生素的培养基LB中，37℃继续培养20代，如此重复6次。最后分别得到40代、60代、80代、100代和120代的细菌，取上述各代菌液100μl，稀释100倍后分别接种至不含有抗生素的LB平板上和含有氯霉素抗生素(25-50μg/μl)的LB平板上，37℃培养过夜。
无抗生素条件下质粒的保持率＝含有氯霉素抗生素(25-50μg/μl)的LB平板上的存活菌落数/不含有抗生素的LB平板上的存活菌落数。
在没有选择压力的情况下，连续培养120代，质粒pTerm-SC的保持率为100％。表明合成的pTerm-SC具有较强的稳定性，适用于作为基因工程的克隆载体。
实施例3：质粒pTerm-SC拷贝数检测
分别转化pUC57和pTerm-SC质粒到大肠杆菌TOP10F′感受态细胞中，分别挑取四个单克隆菌落到4ml LB培养基中，37℃200rpm过夜培养12小时，第二天提取质粒，最终质粒溶解到50μl灭菌TE中，测质粒的浓度得到pUC57的浓度分别是：396ng/μl、377ng/μl、385ng/μl、397ng/μl，pTerm-SC质粒的浓度分别是：14.0ng/μl、14.5ng/μl、13.9ng/μl、16.9ng/μl，根据所测质粒浓度计算pUC57和pTerm-SC的摩尔浓度。
腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)分子量分别为313.2、304.2、329.2、289.2(g/mol)，则：
pUC57的分子量＝313.2g/mol×672+304.2g/mol×691+329.2g/mol×683+289.2g/mol×664＝837545g/mol；
pTerm-SC的分子量＝313.2g/mol×1788+304.2g/mol×1820+329.2g/mol×1742+289.2g/mol×1966＝2255679g/mol；
检测得到质粒pUC57的平均浓度＝388.75ng/μl，pTerm-SC的平均浓度＝14.825ng/μl；
质粒pUC57的摩尔浓度＝388.75ng/μl÷837545g/mol＝4.6415416485E-7mol/L；
质粒pTerm-SC的摩尔浓度＝14.825ng/μl÷2255679g/mol＝6.5723004026E-9mol/L；
pUC57为高拷贝质粒，每个细胞中质粒的拷贝数为500个-700个，由此可以计算出质粒pTerm-SC的拷贝数＝pTerm-SC的摩尔浓度×(500-700)÷pUC57的摩尔浓度；
pTerm-SC的拷贝数＝6.5723004026E-9×(500-700)÷4.6415416485E-7＝7-10(个)；即质粒pTerm-SC的拷贝数为7个-10个，为低拷贝质粒。
实施例4：利用质粒pTerm-SC构建肺炎链球菌DNA序列
肺炎链球菌于1881年首次由巴斯德(Louis Pasteur)及G.M.Sternberg分别在法国及美国从患者痰液中分离出，为革兰氏阳性菌，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌。有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜，5％-10％正常人上呼吸道中携带此菌，有毒株是引起人类疾病的重要病原菌。肺炎链球菌主要的致病物质是肺炎链球菌溶血素及荚膜，荚膜具有抗原性，是肺炎链球菌分型的依据，此菌可引起大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎等疾病。
将15337bp的肺炎链球菌DNA序列(GenBank登录号：CR931658；Range：7959-23295)分成首尾重叠互补的4个约4kb的DNA片段，标记为4kb-1，4kb-2，4kb-3，4kb-4，再根据这4个DNA片段设计寡核苷酸链，使用PCR方法分别将寡核苷酸链拼接获得这4个DNA片段；
分别以pUC57、pCA为模板，F-pUC57/pCA、R-pUC57/pCA为引物，通过PCR使pUC57、pCA载体带有肺炎链球菌DNA序列两端的同源序列及KpnⅠ、MluⅠ酶切位点，PCR产物通过胶回收纯化。
F-pUC57/pCA：AAGAGTAAAATTGAACGTATTTGATGGACGCGTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCA；
R-pUC57/pCA：GGTACTTGATATTTCTTGGTATGAACACGGTACCGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCG。
以pTerm-SC为模板，F-pTerm-SC、R-pTerm-SC为引物，通过PCR使pTerm-SC载体带有肺炎链球菌DNA序列两端的同源序列及KpnⅠ、MluⅠ酶切位点，PCR产物通过胶回收纯化。
F-pTerm-SC：
AAGAGTAAAATTGAACGTATTTGATGGACGCGTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCGC；
R-pTerm-SC：
GGTACTTGATATTTCTTGGTATGAACACGGTACCGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGGC。
使用GibsonMaster Mix(NEB)试剂盒将4kb-1，4kb-2，4kb-3，4kb-4，与胶回收纯化的pUC57、pCA以及pTerm-SC载体分别进行组装。
GibsonMaster Mix反应体系及条件：四个DNA片段及pUC57(pCA或pTerm-SC)各1μl，灭菌去离子水5μl，GibsonMaster Mix：10μl，50℃反应1小时。
将5μl反应产物转化TOP10F＇大肠杆菌感受态细胞，第二天早上各挑选24个单克隆进行菌检PCR，结果显示使用pTerm-SC载体的克隆菌检阳性率为100％，而使用pUC57、pCA载体的克隆菌检阳性率为0。将使用pTerm-SC载体菌检到的阳性克隆摇菌并抽质粒然后进行酶切验证，酶切验证图如图3所示，其中1为肺炎链球菌DNA重组质粒对照；2为重组质粒用限制性内切酶XhoⅠ和MluⅠ的酶切结果，条带大小和理论值(1712bp、4946bp)相符；3为1KB DNA Marker，此图说明肺炎链球菌DNA序列已经成功克隆进pTerm-SC载体，将酶切正确质粒进行测序验证，测序结果显示序列完全正确。实验结果表明pTerm-SC可以用于克隆pUC57高拷贝类型载体及pC系列低拷贝类型载体无法克隆的不稳定序列。
实施例5：利用质粒pTerm-SC构建Ostreococcus tauri叶绿体基因组
Ostreococcus tauri是世界上最小的能够自由生活的真核细胞，也是地球上的一种很古老的生物，可以追溯到15亿年前。Ostreococcus tauri能进行光合作用，帮助碳循环，是海洋里的光合作用能手，其通过光合作用产生的生物量要比蓝藻多。因此对Ostreococcus tauri叶绿体基因组的研究能够为生物体进行光合作用所需的最小基因组尺寸提供重要线索，而通过人工合成该基因组无疑能够为该项研究提供有力手段。本实施例对Ostreococcustauri叶绿体基因组的构建参考文献《J.Progress in Modern Biomedicine.13,6204-6209(LIU Wei-qiang,et al.(2013).)中的方法。
Ostreococcus tauri叶绿体基因组全长71666bp(GenBank登录号：CR954199)，经过分析我们将该基因组分成首尾重叠互补的12个约6kb的DNA片段，标记为genome-6kb-1，genome-6kb-2，genome-6kb-3，genome-6kb-4，genome-6kb-5，genome-6kb-6，genome-6kb-7，genome-6kb-8，genome-6kb-9，genome-6kb-10，genome-6kb-11，genome-6kb-12。根据这12个DNA片段设计寡核苷酸链，使用电化学DNA芯片合成仪合成了564条150bp的Oligo Mix，并成功扩增分离了其中96％的Oligo序列，剩下的基因组序列是通过传统的固相亚磷酰胺三脂合成法进行合成。首先将得到的150bp Oligo通过PCR拼接的方法得到正确的1.5kb序列，再将4个1.5kb片段拼接得到6kb序列，分别为genome-6kb-1，genome-6kb-2，genome-6kb-3，genome-6kb-4，genome-6kb-5，genome-6kb-6，genome-6kb-7，genome-6kb-8，genome-6kb-9，genome-6kb-10，genome-6kb-11，genome-6kb-12，然后使用GibsonMaster Mix(NEB)试剂盒将genome-6kb-1，genome-6kb-2，genome-6kb-3，genome-6kb-4与pTerm-SC(BamHⅠ、HindⅢ酶切后胶回收)组装得到环形质粒genome-24kb-1-pTerm-SC，将genome-6kb-5，genome-6kb-6，genome-6kb-7，genome-6kb-8与pTerm-SC(BamHⅠ、HindⅢ酶切后胶回收)组装得到环形质粒genome-24kb-2-pTerm-SC，将genome-6kb-9，genome-6kb-10，genome-6kb-11，genome-6kb-12与pTerm-SC(BamHⅠ、HindⅢ酶切后胶回收)组装得到环形质粒genome-24kb-3-pTerm-SC，最后将genome-24kb-1，genome-24kb-2，genome-24kb-3，pTerm-SC(BamHⅠ、HindⅢ酶切后胶回收)用GibsonMaster Mix(NEB)组装得到完整的Ostreococcus tauri叶绿体基因组genome-72kb-pTerm-SC。将质粒genome-72kb-pTerm-SC用NotⅠ和AscⅠ酶切，酶切验证图如图4所示，其中1为重组质粒对照，2为重组质粒用限制性内切酶NotⅠ和AscⅠ的酶切结果，3为1KB DNA Marker，此图说明Ostreococcus tauri叶绿体基因组已经成功克隆进pTerm-SC载体，将酶切正确质粒进行测序验证，测序结果显示序列完全正确。
将重组质粒用NotⅠ和AscⅠ酶切并酚氯仿异丙醇纯化基因片段，再分别以pUC57、pCA、pTerm-HK、pTerm-LK、pCC1(EPICENTRE公司单拷贝载体)质粒为模板，通过PCR使各个载体带有肺炎链球菌DNA序列两端的同源序列及KpnⅠ、MluⅠ酶切位点，PCR产物通过胶回收纯化，然后将纯化的基因片段与带有同源臂的pUC57、pCA、pTerm-HK、pTerm-LK、pCC1载体用GibsonMaster Mix(NEB)进行组装。
GibsonMaster Mix反应体系及条件：基因片段9μl，pUC57(pCA或pTerm-HK或pTerm-LK或pCC1)1μl，GibsonMasterMix：10μl，50℃反应1小时。
取5μl反应产物转化TOP10F＇大肠杆菌感受态细胞，第二天早上各挑选24个单克隆进行菌检PCR，结果所有载体的克隆菌检阳性率为0，这些实验结果表明pTerm-SC载体能够用于克隆高拷贝、低拷贝、单拷贝载体所不能克隆的外源基因。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种pTerm-SC质粒，其特征在于，所述质粒包括repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、ori2复制子、oriⅤ复制子、抗生素抗性基因以及原核生物转录终止子；所述原核生物转录终止子为至少两个不依赖ρ因子的原核生物转录终止子；所述原核生物转录终止子设置于多克隆位点的两端。
2.根据权利要求1所述的pTerm-SC质粒，其特征在于，所述抗生素抗性基因为编码氯霉素乙酰转移酶的Cm基因。
3.根据权利要求1或2所述的一种pTerm-SC质粒，其特征在于，所述质粒的拷贝数为7-10个。
4.根据权利要求1-3任一所述的pTerm-SC质粒，其特征在于，所述质粒具有如SEQ ID NO.5所示的DNA序列，所述质粒中，自5’端第4366bp-5540bp为sopA基因，5541bp-6512bp为sopB基因，6608bp-7062bp为sopC基因，542bp-1201bp为Cm基因，2438bp-3193bp为repE基因，1573bp-2079bp为oriⅤ复制子，2135bp-2344bp为ori2复制子，1bp-412bp及3608bp-4201bp为转录终止子区域，3915bp-3956bp为多克隆位点。
5.一种构建权利要求1-4任一所述的pTerm-SC质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：分别设计并人工合成具有SEQ ID NO.1所示序列结构的SopA-SopB基因片段、具有SEQ ID NO.2所示序列结构的SopC-原核生物转录终止子基因片段、具有SEQ ID NO.3所示序列结构的Cm-oriⅤ-ori2基因片段以及具有SEQ ID NO.4所示序列结构的repE-原核生物转录终止子基因片段；
步骤二：运用多段重组法将所述SopA-SopB基因片段、SopC-原核生物转录终止子基因片段、Cm-oriⅤ-ori2基因片段、repE-原核生物转录终止子基因片段连接环化，最终得到环形的质粒。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述SopA-SopB基因片段、SopC-原核生物转录终止子基因片段、Cm-oriⅤ-ori2基因片段、repE-原核生物转录终止子基因片段之间具有30bp的重叠互补区。
7.根据权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于，所述多段重组法为Gibson重组方法，按1:1:1:1的摩尔比取所述SopA-SopB基因片段、SopC-原核生物转录终止子基因片段、Cm-oriⅤ-ori2基因片段、repE-原核生物转录终止子基因片段，加入灭菌去离子水及Gibson Assembly Master Mix试剂，50℃下反应至得到环形质粒。
8.根据权利要求5-7任一所述方法构建得到的pTerm-SC质粒。
9.权利要求1-4任一或8所述pTerm-SC质粒在基因克隆、筛选和测序领域中的应用。
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