CN102352371A - 一种pC系列质粒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了一种pC系列质粒及其构建方法和应用，所述pC系列质粒包括依次首尾相连的rep基因、rop基因、lacZ基因和抗生素抗性基因。本发明的pC系列质粒具有分子量小、容量大、拷贝数低、稳定性高等特点，可用于结构复杂，包括重复序列、不稳定基因以及长片段基因的克隆、筛选、测序和基因组的构建等基因工程领域。

Description

一种pC系列质粒及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域和基因工程领域，具体涉及一种具有低拷贝、大容量、高稳定性的pC系列质粒及其构建方法和应用。

背景技术

质粒是细菌或细胞染色质以外的、能自主复制且与细菌或细胞共生的遗传成分。它并不是寄主细胞生命活动必需的遗传与案件，但是能够给予宿主细胞某些特殊的性质，如抗药性，降解或利用某些化合物等。

质粒具有如下特点：①是染色质外的双链共价闭合环形DNA分子，可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2kb～300kb之间。②能自主复制，是能独立复制的复制子。③质粒对宿主生存并不是必需的。

每个质粒DNA上都有复制的起点（ori），只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关。根据复制特性，质粒分严紧型和松弛型两类，严紧型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约一个～十几个；松弛型质粒拷贝数较多，可达几百个。恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、宿主细胞遗传背景及生长条件有关。质粒复制控制系统首先通过调节复制的起始点来控制拷贝数，调节因素包括阻遏蛋白、反义RNA和某些顺向重复序列等，一旦质粒上与调控有关的基因位点突变，可使拷贝数明显增加或减少。在复制时，首先合成前RNAⅡ，即前引物，并与 DNA 形成杂交体；而后RNase H切割前 RNAⅡ，使之成为成熟的RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二级结构，同时Rop增强RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。削弱RNAⅠ和RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有pMB1或（ColE1）复制子的拷贝数。

在分子生物学研究中，质粒可以作为载体用于克隆外源基因。由于大的质粒（大于15kb）不能很好转化，而且DNA产量通常很低，在设计实验时要考虑到加入插入片段的最终载体大小，尽量用更小的载体。因此现在常用的载体都具有分子量小、拷贝数高等特点。但是高拷贝质粒的稳定性低，使克隆的基因片段长度受到限制，而且高拷贝质粒给宿主细胞的压力大，含有质粒的重组菌通常都不稳定，最终导致大片段基因的克隆成功率相对较低。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明利用人工合成的方法，从头合成了一种pC系列质粒，该系列质粒具有分子量小、拷贝数低、稳定性高和容量大的特点。

本发明的目的之一是提供一种低拷贝、大容量、高稳定性的pC系列质粒。

本发明的目的之二是提供上述pC系列质粒的构建方法。

本发明的目的之三是提供上述pC系列质粒的应用。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一种pC系列质粒，包括依次首尾相连的rep基因、rop基因、lacZ基因和抗生素抗性基因。rep基因为大肠杆菌θ型复制子，主管质粒的复制，该复制子比滚环型(rolling circle repliation，RCR)复制子具有更高的内部结构的稳定性，在复制中期无单链结构，复制起始位点位于rep基因内。rop基因编码rop蛋白，该蛋白可以增强RNAⅠ与RNAⅡ之间相互作用，控制质粒的拷贝数。lacZ基因（大肠杆菌lac操纵子区域基因）是质粒的报告基因，用于目的基因与质粒重组体的筛选。lacZ基因编码β-半乳糖苷酶N-部分，该片段在IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）诱导下可与宿主编码的β-半乳糖苷酶缺陷型等位基因形成α-互补。因此当IPTG存在时，大肠杆菌合成这两种片段，可以水解底物X-gal（5-溴-4-录-3-吲哚-β-半乳糖苷）产生兰色化合物。当外源基因插入lacZ的多克隆位点时，会使β-半乳糖苷酶的N-端片段失活从而消除α-互补效应，不能水解底物X-gal，菌落呈现白色。因此该基因可以作为报告基因进行蓝白斑筛选。lacZ基因中包括CAP蛋白结合位点、启动子Plac、lac抑制子结合位点和β-半乳糖苷酶基因的5＇-部分。其中β-半乳糖苷酶基因的5＇-部分中含有多克隆位点（MCS）。多克隆位点区域包括常用限制性内切酶EcoRI、SacⅠ、KpnⅠ、NruI、NsiI、XbaⅠ、EcoRⅤ、BamHⅠ、XmaI、SmaⅠ、ApaI、SalI、StuI、SphI、HindⅢ等在内的10余种具有单一位点的限制性内切酶的酶切位点。

优选的，上述的一种pC系列质粒，其中：所述抗生素抗性基因为bla基因、kan基因或者Cmr基因中的任一种，对应的质粒为pCA、pCK或者pCC。抗生素抗性基因bla基因编码β-内酰胺酶，对氨苄青霉素有抗性；kan基因编码氨基糖苷3＇-磷酸转移酶，对卡那霉素有抗性；Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，对氯霉素有抗性。

优选的，上述的一种pC系列质粒，其中：所述的质粒pCA具有序列表中序列1的核苷酸序列，包括rep基因、rop基因、lacZ基因和bla基因。

优选的，上述的一种pC系列质粒，其中：所述的质粒pCK具有序列表中序列2的核苷酸序列，包括rep基因、rop基因、lacZ基因和kan基因。

优选的，上述的一种pC系列质粒，其中：所述的质粒pCC具有序列表中序列3的核苷酸序列，包括rep基因、rop基因、lacZ基因和Cmr基因。

一种上述的pC系列质粒的构建方法，包括以下步骤： 

步骤一：所述rep基因、rop基因、LacZ基因和抗生素抗性基因通过人工设计并合成；

步骤二：运用PCR的方法将rep基因反向拼接到rop基因的3＇-端，得到rop-rep基因拼接产物；

步骤三：运用PCR的方法将lacZ基因反向拼接到rop-rep基因拼接产物的5＇-端，得到lacZ-rop-rep基因片段；

步骤四：运用PCR的方法将抗生素抗性基因反向拼接到lacZ-rop-rep基因片段的3＇-端，得到线形基因片段；

步骤五：所述线形基因片段通过同源重组的方法环化，最终得到环形的质粒。

优选的，上述的一种pC系列质粒的构建方法，其中：所述抗生素抗性基因为bla基因、kan基因或者Cmr基因中的任一种，对应的所述线形基因片段为lacZ-rop-rep-bla、lacZ-rop-rep-kan或者lacZ-rop-rep-Cmr，对应的质粒为pCA、pCK或者pCC。

上述pC系列质粒在普通的基因克隆、筛选和测序中的应用。

上述pC系列质粒在结构复杂、含有重复序列以及不稳定序列基因的克隆、筛选和测序中的应用。

上述pC系列质粒在长片段基因的克隆、筛选、测序和基因组的合成中的应用。

本发明的pC系列质粒具有分子量小、容量大、拷贝数低、稳定性高等特点。可用于结构复杂基因、包括重复序列、不稳定基因以及长片段基因的克隆、筛选、测序和基因组的构建等基因工程领域，对基因的高效率、高质量合成具有重要的作用，其中利用质粒pCA已经成功构建出50kb的基因片段。

本发明具有以下优点：

1．相对分子量小：pCA相对分子量3539bp，pCK相对分子量3494bp，pCC相对分子量3338bp；

2．具有一个大肠杆菌复制子，该复制子的存在使质粒具有只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能；

3．具有可供转化子选择的标记抗生素抗性基因；

4．具有较大的容量：可以克隆0.1kb～100kb的基因片段；

5．具有较低的拷贝数：每个细胞中质粒的拷贝数在5个～60个范围内，这一范围的拷贝数既保证了质粒的顺利提取又保证了长片段基因在质粒复制扩增中的稳定性；

6．具有较高的稳定性：在没有选择压力的情况下，连续培养120代，三种质粒pCA、pCK和pCC的保持率均在99%以上。

以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。

附图说明

图1为质粒pCA的物理图谱；

图2为质粒pCK的物理图谱；

图3为质粒pCC的物理图谱；

图4为质粒pCA构建流程模式图；

图5A为PCR拼接rop基因与rep基因的电泳结果，其中1为rop与rep基因的PCR拼接产物rop-rep基因片段，长度1862bp；2为Marker DS5000；

图5B为PCR拼接rop-rep基因片段与lacZ基因的电泳结果，其中1为Marker DS5000；2为rop-rep基因片段与lacZ基因的PCR拼接产物lacZ-rop-rep基因片段，长度2432bp；

图5C为PCR拼接lacZ-rop-rep基因片段与bla基因的电泳结果，其中1为lacZ-rop-rep基因片段与bla基因的拼接产物lacZ-rop-rep-bla基因片段，长度3577bp；2为Marker DS5000；

图6A为合成的Kan电泳图，其中1为合成的kan基因，2为Marker DS5000；

图6B为PCR扩增质粒pCA得到的lacZ-rop-rep基因片段的电泳图，其中1为基因片段lacZ-rop-rep的PCR结果，长度2706bp；2为Marker DS5000；

图6C为PCR拼接lacZ-rop-rep基因片段和kan基因的电泳图，其中1为Marker DS5000，2为PCR拼接出的lacZ-rop-rep-kan基因片段，长度3520bp；

图7为重组质粒ZFN-MOS-pCK的酶切验证图，其中1为重组质粒ZFN-MOS-pCK对照；2为限制性内切酶SmaI酶切结果；3为1 KB DNA Marker；

图8为重组质粒pCA-LRRK2的酶切验证图，其中1为重组质粒pCA-LRRK2对照，2为限制性内切酶KpnI和BamHI的酶切结果，3为1 KB DNA Marker。

具体实施方式

实施例1：质粒pCA的构建

质粒pCA的构建流程模式图如图4所示，具体方法如下：

1.设计并合成lacZ基因，序列全长588bp，其中104～141为CAP结合区，181～217为操纵基因，226～573为β-半乳糖苷酶基因的5＇-部分基因序列，243～323处为多克隆位点区域。基因序列如序列表中的序列4；

2.设计并合成rop基因，序列全长822bp，其中序列611～782为rop基因，编码rop蛋白，基因序列如序列表中的序列5；

3.设计并合成rep复制子基因，序列全长1080bp，其中22～689为复制子rep基因，DNA复制起始位点447（+/-）位置，基因序列如序列表中的序列6； 

4.设计并合成bla基因，序列全长1187bp，其中159～1019为bla基因，编码β-内酰胺酶，对氨苄青霉素有抗性，基因序列如序列表中的序列7；

5.分别合成以上四段基因片段后，使用PCR的方法，设计引物分别将它们组装起来：

（1）rop基因与rep基因的拼接：

设计引物P1，P2使用PCR的方法将rop基因与rep基因拼接起来，其中rep基因序列的方向为反向与rop基因的3＇-端相连。引物序列如下：

P1： 5＇- GGGGAGAGGCGGTTTGCGTAGAGCCAATCAATTCTTGC -3＇

P2： 5＇- TTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCT -3＇

PCR反应体系为：总体积50μl，H₂O：33.5μl、5×Buffer：10μl；dNTP (10mM)：2μl；引物P1：1μl；引物P2：1μl；模板各1μl，pfu聚合酶（GENEWIZ, 2.5U/μl）：0.5μl混匀。

PCR反应条件：首先95℃ 2min；然后95℃ 15s、60℃ 15s、72℃ 45s、25个循环；再72℃ 1min。PCR扩增rop基因与rep基因拼接产物rop-rep的电泳结果如图5A，其中1为rop与rep基因的PCR拼接结果，目的基因片段全长1862bp；2为Marker DS5000。此图说明拼接出的基因片段与设计相同。

（2）rop-rep基因拼接产物与lacZ基因拼接：

为使得所构建的质粒在基因工程应用中便于筛选克隆重组体，在质粒中引入报告基因：lacZ基因。同样使用PCR的方法，将lacZ基因序列反向拼接到rop-rep的5＇-端，引物序列如下：

P3： 5＇- AGTGCCACCTGTCTAGCTACTCGGGGCTGGCTTAACTA -3＇

P2： 5＇- TTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCT -3＇

反应体系为：总体积50μl，H₂O：33.5μl、5×Buffer：10μl；dNTP (10mM)：2μl；引物P3：1μl；引物P2：1μl；模板各1μl，pfu聚合酶（GENEWIZ, 2.5U/μl）：0.5μl混匀。

PCR反应条件：首先95℃ 2min；然后95℃ 15s、60℃ 15s、72℃ 45s、25个循环；再72℃ 1min。PCR扩增的电泳结果如图5B，其中1为Marker DS5000；2为rop-rep基因片段与lacZ基因的PCR拼接结果，目的基因片段全长2432bp。此图说明拼接出的基因片段长度与设计相同，实验结果正确。

（3）将PCR扩增出的lacZ-rop-rep基因片段与bla基因相拼接：

在质粒中加入bla基因，以增强质粒在氨苄青霉素存在时能够大量扩增。使用PCR的方法，设计引物将bla基因序列反向拼接到lacZ-rop-rep基因片段的3＇-端。引物序列如下：

P4： 5＇- AGTGCCACCTGTCTAGCTACTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGA -3＇

P5： 5＇- TAGTTAAGCCAGCCCCGAGTAGCTAGACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAAT-3＇

PCR反应体系为：总体积50μl，H₂O：33.5μl、5×Buffer：10μl；dNTP (10mM)：2μl；引物P4：1μl；引物P5：1μl；模板各1μl，pfu聚合酶（GENEWIZ, 2.5U/μl）：0.5μl混匀。

PCR反应条件：首先95℃ 2min；然后95℃ 15s、60℃ 15s、72℃ 1min、25个循环；再72℃ 1min。PCR扩增的电泳结果如图5C，lacZ-rop-rep基因片段与bla基因的PCR拼接产物，其中1为lacZ-rop-rep-bla的PCR拼接结果，目的基因片段全长3577bp；2为Marker DS5000。此图说明拼接出的基因片段与设计相同，由此得到质粒pCA基因序列的全长。

（4）线形基因片段环化成环状质粒：

由于拼接的线形基因片段lacZ-rop-rep-bla首尾两端具有重叠互补序列，因此可以利用同源重组的方法通过首尾重叠互补序列的同源重组，最终得到环形的质粒pCA。

同源重组反应体系及条件：基因片段5μl，重组酶：15μl，22℃，1小时。

测序结果表明构建出的质粒与预期相符，质粒的总长度3539碱基对，其中以lacZ基因片段互补序列5＇-端的第一个碱基T为载体序列的起始碱基。质粒中主要成分的位置分别是lacZ基因：16bp～570bp，其中多克隆位点在246bp～346bp处；rop基因1161bp～1352bp；rep基因：1724bp～2391bp；bla基因：2539bp～3399bp。

实施例2：质粒pCK的构建

在质粒pCA的基础上更改抗生素抗性基因，构建出具有卡那霉素抗性的质粒pCK，具体方法如下：

1.人工设计并合成kan基因片段，全长850碱基，其中碱基22～837为kan基因编码区。kan基因片段序列如序列表中的序列8，合成的Kan电泳图如图6A，其中1为合成的kan基因的PCR结果，2为Marker DS5000。此图说明拼接出的基因片段与设计相同；

2.设计引物P6和P7对质粒pCA中bla基因以外的部分（lacZ-rop-rep）进行扩增，根据设计的引物，扩增出来的基因片段两端含有与kan基因两端重叠互补的序列；

引物P6、P7的序列如下：

P6：   5＇- TTGAATATGGCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTA -3＇

P7：   5＇- TGAGTTTTTCTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCA -3＇

PCR扩增pCA得到的lacZ-rop-rep基因片段的电泳图如图6B，其中1为基因片段lacZ-rop-rep的PCR扩增结果，目的基因片段全长2706bp；2为Marker DS5000；

3.kan基因与pCA基因片段lacZ-rop-rep拼接：

使用PCR的方法将kan基因与pCA基因片段lacZ-rop-rep进行拼接，设计引物将kan基因反向连接到pCA基因片段lacZ-rop-rep的3＇-端，引物序列如下：

P6：   5＇- TTGAATATGGCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTA -3＇

P8：   5＇- ATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGGAAACG -3＇

PCR反应体系：总体积50μl，H₂O：33.5μl、5×Buffer：10μl；dNTP (10mM)：2μl；引物P6：1μl；引物P8：1μl；模板各1μl，pfu聚合酶（GENEWIZ, 2.5U/μl）：0.5μl混匀；

PCR反应条件：首先95℃ 2min；然后95℃ 15s、62℃ 15s、72℃ 1min、25个循环；再72℃ 1min。PCR扩增的电泳结果如图6C，其中1为Marker DS5000，2为PCR拼接出的lacZ-rop-rep-kan基因片段，长度3520bp，此图说明拼接出的基因片段与设计相同，由此得到质粒pCK基因序列的全长；

4.线形基因片段环化成环状质粒：

由于引物P6，P8具有重叠互补序列，因此PCR扩增出的线形基因片段两端具有重叠互补序列，利用互补序列的同源性使用同源重组的方法将线形基因片段环化成环状质粒pCK。

同源重组反应体系及条件：基因片段5μl，重组酶：15μl，22℃，1小时。

测序结果表明构建出的环状质粒pCK与预期相符，质粒的总长度为3494碱基对，仍以lacZ基因片段互补序列5＇-端的第一个碱基T为载体序列的起始碱基。kan基因位于2539bp～3354bp位置处。

实施例3：质粒pCC的构建

质粒pCC的构建方法与实施例2中质粒pCK的构建方法相同，首先合成Cmr基因，之后设计引物将lacZ-rop-rep基因片段从pCA中扩增出来，再将Cmr基因反向拼接到pCA基因片段lacZ-rop-rep的3＇-端形成线形lacZ-rop-rep-Cmr基因片段，最后通过同源重组的方法将线形基因片段环化成环状质粒pCC。

质粒pCC中碱基的编号与pCA、pCK相同，以lacZ基因片段互补序列5＇-端的第一个碱基T为质粒序列的起始碱基，质粒的总长度为3338碱基对，测序结果表明构建出的环状质粒pCC与预期相符，Cmr基因位于2539bp～3168bp位置处。

人工合成的Cmr基因，基因片段全长705碱基，其中碱基26～685为Cmr基因编码区，Cmr基因序列如序列表中的序列9。

扩增pCA载体的引物：

P9： 5＇- ACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCA -3＇

P10： 5＇- 

AGTGGCAGGGCGGGGCGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTC -3＇

lacZ-rop-rep基因片段与Cmr基因拼接的引物：

P9： 5＇- ACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCA -3＇

P11： 5＇- TCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGGAGAAAAAAATCACTGGATATA -3＇

实施例4：质粒pCA、pCK和pCC稳定性检测

分别将质粒pCA、pCK和pCC转化到大肠杆菌TOP10F′感受态细胞中，挑取单克隆菌落在含有相应抗生素（Amp：100μg/μl或kan：50μg/μl或Chl：34μg/μl）的培养基LB中过夜培养，之后对培养的菌液在含有相应抗生素（Amp：100μg/μl或kan：50μg/μl或Chl：34μg/μl）的平板上划线培养，对划线得到的单克隆重新在含有相应抗生素（Amp：100μg/μl或kan：50μg/μl或Chl：34μg/μl）的平板上再进行一次划线培养，由此得到纯的阳性转化克隆。

将得到的纯的阳性转化克隆接种到不含有抗生素的培养基LB中，37℃培养20代（约7h）后，从中取100μl接种至新的不含有抗生素的培养基LB中，37℃继续培养20代，如此重复6次。最后分别得到40代、60代、80代、100代和120代的细菌，取上述各代菌液100μl，稀释100倍后分别接种至不含有抗生素的LB平板上和含有相应抗生素（Amp：100μg/μl或kan：50μg/μl或Chl：34μg/μl）的LB平板上，37℃培养过夜。

无抗生素条件下质粒的保持率 = 含有相应抗生素（Amp：100μg/μl或kan：50μg/μl或Chl：34μg/μl）的LB平板上的存活菌落数/不含有抗生素的LB平板上的存活菌落数。

在没有选择压力的情况下，连续培养120代，质粒pCA的保持率为99.9%；质粒pCK的保持率为100%；质粒PCC的保持率99.8%以上。表明合成的pC系列质粒：pCA、pCK和pCC具有较强的稳定性，适用于作为基因工程的克隆载体。

实施例5：质粒pCA拷贝数检测

分别转化pUC57和pCA质粒到大肠杆菌TOP10F′感受态细胞中，挑取单克隆菌落，到4ml LB培养基中，37℃ 200rpm过夜培养12小时，第二天提取质粒，溶解到60μl H₂O中，测质粒的浓度。得到pUC57的浓度分别是：196μg/μl、205μg/μl、201μg/μl，pCA质粒的浓度分别是：22μg/μl、20μg/μl、19μg/μl，根据所测质粒浓度计算pUC57和pCA的摩尔浓度。

平均的脱氧核苷酸(碱基)分子量是 326.95（μg/μmol），因此，平均的碱基对的分子量是753.9（μg/μmol）。则

pUC57的分子量 = 753.9 μg/μmol×2710bp = 2043069 μg/μmol

pCA的分子量 = 753.9 μg/μmol×3539bp = 2668052.1 μg/μmol

检测得到质粒pUC57的平均浓度 = 200.67 μg/μl，pCA的平均浓度 = 20.3 μg/μl

质粒pUC57的摩尔浓度= 200.67 μg/μl÷2043069 μg/μmol = 9.8218252378E-5 μmol/μl

质粒pCA的摩尔浓度= 20.3 μg/μl÷2668052.1 μg/μmol = 7.6210405836E-6 μmol/μl

pUC57为高拷贝质粒，每个细胞中质粒的拷贝数为500个～700个，由此可以计算出质粒pCA的拷贝数= pCA的摩尔浓度×（500～700）÷pUC57的摩尔浓度

pCA的拷贝数= 7.6210405836E-06 ×（500～700）÷9.8218252378E-05 = 38.8～54.3（个）

即质粒pCA的拷贝数为38个～55个，为低拷贝质粒。

实施例6：利用质粒pCK构建ZFN-MOS基因的克隆重组体

ZFN（Zinc-finger Nuclease）是一种锌指核酸酶，可诱导生物体内的DNA在特定位置产生双链断裂的重组蛋白。这种双链断裂刺激细胞的天然DNA修复路径，并导致DNA序列中特定位置的变化；MOS（v-mos moloney murine sarcoma viral oncogene homolog）是一种原癌基因，表达产物是肉瘤病毒致癌因子（v-mos）。ZFN-MOS基因538碱基，经分析发现该基因结构复杂，具有回文序列，反向重复序列等复杂结构，ZFN-MOS基因序列如下：

aatctagacc cggggagcgc cccttccagt gtcgcatttg catgcggaac ttttcgcagg  60

catctaactt ggcacgtcat acccgtactc ataccggtga aaaaccgttt cagtgtcgga  120

tctgtatgcg aaatttctcc gactcttctg ttttgcgtcg tcatctacgt acgcacaccg  180

gcgagaagcc attccaatgc cgaatatgca tgcgcaactt cagtcagggt ggtaccttgc  240

gtcgtcacct aaaaacccac ctgaggggat cccctcaggt gggtttttag gtgacgaccc  300

aagttgttac gctgactgaa gttgcgcatg catattcggc attggaatgg cttctcgccg  360

gtgtgcgtac gtagatgacg ggtcaagtca gaacgctggg agaaatttcg catacagatc  420

cgacactgaa acggtttttc accggtatga gtacgggtat gacgtttcaa ggtaccgtta  480

tgcgaaaagt tccgcatgca aatgcgacac tggaaggggc gctccccggg tctagatt    538

回文序列：

序列长度：58bp，位置：241bp～298bp，序列如下：

5＇-gtcgtcacctaaaaacccacctgaggggatcccctcaggtgggtttttaggtgacgac-3＇

反向重复序列：

序列1长度：69bp，位置：159bp～227bp，序列如下：

5＇-cgtcatctacgtacgcacaccggcgagaagccattccaatgccgaatatgcatgcgcaacttcagtcag-3＇ 

其反向重复序列位置：312bp～380bp，序列如下：

5＇-ctgactgaagttgcgcatgcatattcggcattggaatggcttctcgccggtgtgcgtacgtagatgacg-3＇

序列2长度：67，位置74bp～140bp，序列如下：

5＇-acgtcatacccgtactcataccggtgaaaaaccgtttcagtgtcggatctgtatgcgaaatttctcc-3＇ 

其反向重复序列位置：399bp～465bp，序列如下：

5＇-ggagaaatttcgcatacagatccgacactgaaacggtttttcaccggtatgagtacgggtatgacgt-3＇

序列3长度：58，位置1bp～58bp，序列如下：

5＇-aatctagacccggggagcgccccttccagtgtcgcatttgcatgcggaacttttcgca-3＇

其反向重复序列位置：481bp～538bp，序列如下：

5＇-tgcgaaaagttccgcatgcaaatgcgacactggaaggggcgctccccgggtctagatt-3＇

经过分析将ZFN-MOS基因分成两段分别合成，命名为ZFN-MOS-A和ZFN-MOS-B，并分别在基因序列的两端添加限制性内切酶酶切位点（EcoRI：gaattc和HindⅢ：aagctt）和保护序列（ggaacggaac）序列如下：

ZFN-MOS-A基因序列：

ggaacggaac gaattcaatc tagacccggg gagcgcccct tccagtgtcg catttgcatg  60

cggaactttt cgcaggcatc taacttggca cgtcataccc gtactcatac cggtgaaaaa  120

ccgtttcagt gtcggatctg tatgcgaaat ttctccgact cttctgtttt gcgtcgtcat  180

ctacgtacgc acaccggcga gaagccattc caatgccgaa tatgcatgcg caacttcagt  240

cagggtggta ccttgcgtcg tcacctaaaa acccacctga ggggatccgt tccgttcc    298

ZFN-MOS-B基因序列：

ggaacggaac ggatcccctc aggtgggttt ttaggtgacg acccaagttg ttacgctgac  60

tgaagttgcg catgcatatt cggcattgga atggcttctc gccggtgtgc gtacgtagat  120

gacgggtcaa gtcagaacgc tgggagaaat ttcgcataca gatccgacac tgaaacggtt  180

tttcaccggt atgagtacgg gtatgacgtt tcaaggtacc gttatgcgaa aagttccgca  240

tgcaaatgcg acactggaag gggcgctccc cgggtctaga ttaagcttgg aacggaac    298

先将合成的ZFN-MOS-A和ZFN-MOS-B使用PCR方法拼接起来，再将拼接得到的ZFN-MOS克隆重组到载体pUC57上。结果发现经过多次尝试，尝试过各种感受态细胞，也尝试过各种连接方法，但是都得不到正确的基因全长克隆。因此换用pCK质粒，使用限制性内切酶EcoRI和HindⅢ对基因片段ZFN-MOS和载体pCK分别进行双酶切，之后将ZFN-MOS基因片段和载体pCK相连接。

酶切体系及反应条件：

pCK：1.5μl（600-700ng），10×Buffer：5μl，HindⅢ：1μl，EcoRI：1μl，H₂O：41.5μl，37℃，30min；

ZFN-MOS：10μl，10×Buffer：5μl，HindⅢ：1μl，EcoRI：1μl，H₂O：33μl，37℃，30min。

连接体系及条件： pCK：2μl（10-20ng），ZFN-MOS：7μl，2×Buffer：10μl，T4 DNA连接酶：1μl，22℃，30min。

将链接产物转化到大肠杆菌TOP10F′感受态细胞中，挑选单克隆菌落，提质粒筛选ZFN-MOS-pCK重组体。对筛选出的重组体ZFN-MOS-pCK进行酶切和测序验证，结果证明序列完全正确。酶切验证图如图7所示，其中1为重组质粒ZFN-MOS-pCK对照；2为限制性内切酶SmaI酶切结果；3为1 KB DNA Marker。此图说明克隆得到的正是目标基因ZFN-MOS与载体pCK的重组体。

实施例7：利用质粒pCA构建LRRK2基因（具有亮氨酸富集区的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2：leucine-rich repeat serine/threonine-protein kinase 2）重组体

LRRK2蛋白属于Roco蛋白家族，包含6个功能域：ANK，LRR，ROC，COR，MAPKKK和WD40，在进化上高度保守。近些年发现的LRRK2基因与家族性及散发性帕金森病关系密切，LRRK2基因一旦发生变异，会使其丧失控制多巴胺传导的正常作用，结果导致实验鼠罹患帕金森氏症。多巴胺是一种神经传递物质，主要负责大脑的情欲、感觉和兴奋等情绪的信息传递。帕金森病的病因与控制多巴胺传导的LRRK2基因发生变异有关，已经成为研究热点。 

本实施例的具体实验过程如下：

1.对目标基因序列进行分析和优化

优化后的目标基因序列如序列表中序列10，目标基因LRRK2全长8685碱基对，结构复杂，有多个正向重复序列、短发夹结构、回文序列和反向重复等复杂二级结构。为验证质粒pCA及其衍生质粒在构建复杂基因序列上的优点，使用质粒pCA与质粒pUC57同时构建LRRK2基因重组体。LRRK2基因中的复杂结构如下：

正向重复序列：

序列长度	核苷酸序列（5＇-3＇）	位点
			18	ATTGCTCCCGATCTCATT	202，6529
17	CTGAAAAACGTGATGCT	3088，8362
			15	ACGAGGGCGAGGAGG	1985，6659
14	TCCTGGTGGGAACC	5309，7754
			13	ACTGCTCCAGCAG	5013，6837
13	ACTGGCTCTGGAT	919，3345
			12	ACCCACCTCGAT	4078，5320
12	ATCTGGAGAAAC	4001，8483
			12	CTCGATGTGTCC	4783，5326
12	CTGGAGGCTTGC	2014，4411
			12	GCCCTCCATGTG	1513，6889
12	GGAGGTGCTGGG	63，1293
			12	GTCATCTACAAT	7108，8305
12	TCACCATCACCA	8619，8625

短发夹序列：

序列长度	核苷酸序列（5＇-3＇）	位点
			16	ACGGCAAAAAACGGCA	7658
14	ACTCAAAAAACTCA	1011
			14	TGCTACAACATCGT	1711
13	ACCGCCGCCGCCA	4
			12	GCTTCCCCTTCG	38
12	GGAGTGGTGAGG	544

发夹重复序列：

序列长度	位点	核苷酸序列（5＇-3＇）	重复序列位点	核苷酸序列
					13	3261	CTCTAGGGAACAG	8608	GACAAGGGATCTC
13	1681	GTCGAGGTGCTCA	3234	ACTCGTGGAGCTG
					12	678	ACTCGTCGAGGA	5378	AGGAGCTGCTCA
12	1196	TCCAGCAGGTCG	6444	GCTGGACGACCT

回文序列：

序列长度	核苷酸序列（5＇-3＇）	位点
			12	ACGAGATCTCGT	5121
12	GACCAGCTGGTC	5509
			12	GATTCTAGAATC	7552

反向重复序列：

                                                

2. 寡核苷酸链的设计与合成

根据目标DNA序列设计并合成用于延伸的寡核苷酸链，由于目标DNA序列片段较长8685碱基对并且结构复杂，因此将目标DNA序列分成首尾重叠互补的四段分别合成，标记为LRRK2-1、LRRK2-2、LRRK2-3和LRRK2-4。根据这四段基因设计寡核苷酸链，使用PCR方法分别将寡核苷酸链拼接成LRRK2-1、LRRK2-2、LRRK2-3和LRRK2-4，最后设计引物将四段片段重组拼接成完整的LRRK2基因。引物序列如下：

    LRRK2-P1： 5＇-TAAAACGACGGCCAGTGAATTCCCAGCGATGGTACCGCCGCCGCCACC-3＇

    LRRK2-P2：  5＇-CTCTCAGAGCCTCCAGCTGGACGGGCAGACTAGTCTCGTGCCGTTTCA-3＇

    LRRK2-P3：  5＇-AATCCTCACTGTGATGAAACGGCACGAGACTAGTCTGCCCGTCCAGCT-3＇

    LRRK2-P4：  5＇-AGATCTGGTTGTGAGAAAACAGGAGTTCCCGGAGATTCAGAGATTTCC-3＇

    LRRK2-P5：  5＇-CCTGGCCCTGCCCACTGGAAATCTCTGAATCTCCGGGAACTCCTGTTT-3＇

    LRRK2-P6：  5＇-CTTTGCTAGCCAGTTCCATGACCAGCATCCTAGGCCGGATTCCAGCAG-3＇

    LRRK2-P7：  5＇-CATTTCTCTGCTGGCTGCTGGAATCCGGCCTAGGATGCTGGTCATGGA-3＇

    LRRK2-P8：  5＇-ATGACCATGATTACGCCAAGCTTGACTGATCTCGAGTCATTATTTTTC-3＇

3. 基因克隆至载体构建重组体

将步骤2拼接得到的LRRK2基因片段和质粒pCA以及质粒pUC57使用KpnI和BamHI双酶切，再将切割后的片段和载体使用T4 DNA连接酶进行连接。酶切和连接反应体系如下：

酶切反应体系及反应条件：pCA（pUC57）：1.5μl(300ng)，10×Buffer：5μl，KpnI：1μl；BamHI：1μl，H₂O：41.5μl。37℃，30min。

连接反应体系即反应条件：2×Buffer：10μl，DNA片段：8μl，pCA（pUC57）：1μl（4ng），T4 DNA连接酶（Fermentas, 1000U 1000CEU/μl）：1μl；22℃，30min。

4.检测 

将链接产物转入大肠杆菌进行蓝白斑筛选，挑选单克隆白斑菌落进行测序，结果发现转化pUC57-LRRK2重组质粒的细胞测序结果混乱。对这些细胞接菌扩增培养后发现5个样品中有3个提不出质粒，另外的两个质粒杂乱，片段大小与预期差异较大，推测可能是由于质粒pUC57拷贝数高，导致基因不稳定，在扩增过程中重组质粒pUC57-LRRK2序列自身发生重组导致。而转化pCA-LRRK2重组质粒的细胞则信号正常，测序结果与预期目标DNA序列相同。对重组质粒pCA-LRRK2的酶切验证电泳图如图8，其中1为重组质粒pCA-LRRK2对照，2为限制性内切酶KpnI和BamHI的酶切结果，3为1 KB DNA Marker。此图说明合成的DNA序列与目标序列大小相同，正是LRRK2基因。

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

<110>苏州金唯智生物科技有限公司

<120>一种pC系列质粒及其构建方法和应用

 

<160> 10

 

<210>1

<211>3539

<212>DNA

<213>pCA质粒

<400>1

 tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg  60

 gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt  120

 caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct  180

 ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc  240

 acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa tgcatctaga  300

 tatcggatcc cgggcccgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg taatcatggt  360

 catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg  420

 gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt  480

 tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg  540

 gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta gagccaatca attcttgcgg agaactgtga  600

 atgcgcaaac caacccttgg cagaacatat ccatcgcgtc cgccatctcc agcagccgca  660

 cgcggcgcat ctcgggcagc gttgggtcct ggccacgggt gcgcatgatc gtgctcctgt  720

 cgttgaggac ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg ttagcagaat gaatcaccga  780

 tacgcgagcg aacgtgaagc gactgctgct gcaaaacgtc tgcgacctga gcaacaacat  840

 gaatggtctt cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac gcggaagtca gcgccctgca  900

 ccattatgtt ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct accctgtgga acacctacat  960

 ctgtattaac gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt tctctggtcc cgccgcatcc  1020

 ataccgccag ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg ggcatgttca tcatcagtaa  1080

 cccgtatcgt gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat tacccccatg aacagaaatc  1141

 ccccttacac ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac cgcccttaac atggcccgct  1200

 ttatcagaag ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa cgagctggac gcggatgaac  1260

 aggcagacat ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga gctttaccgc agctgcctcg  1320

 cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag  1380

 cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg  1440

 gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct  1500

 taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc  1560

 gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga  1620

 ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat  1680

 acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca  1740

 aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc  1800

 tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata  1860

 aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc  1920

 gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc  1980

 acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga  2040

 accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc  2100

 ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag  2160

 gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag  2220

 gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag  2280

 ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca  2340

 gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga  2400

 cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat  2460

 cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga  2520

 gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg  2580

 tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga  2640

 gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc  2700

 agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac  2760

 tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc  2820

 agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt cacgctcgtc  2880

 gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc  2940

 catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt  3000

 ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc  3060

 atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg  3120

 tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaacacgg gataataccg cgccacatag  3180

 cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat  3240

 cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc  3300

 atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa  3360

 aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta  3420

 ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa  3480

 aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg tctagctac   3539

 

 

<210>2

<211>3494

<212>DNA

<213>pCK质粒

<400>2

tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg  60

gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt  120

caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct  180

ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc  240

acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa tgcatctaga  300

tatcggatcc cgggcccgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg taatcatggt  360

catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg  420

gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt  480

tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg  540

gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta gagccaatca attcttgcgg agaactgtga  600

atgcgcaaac caacccttgg cagaacatat ccatcgcgtc cgccatctcc agcagccgca  660

cgcggcgcat ctcgggcagc gttgggtcct ggccacgggt gcgcatgatc gtgctcctgt  720

cgttgaggac ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg ttagcagaat gaatcaccga  780

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ccattatgtt ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct accctgtgga acacctacat  960

ctgtattaac gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt tctctggtcc cgccgcatcc  1020

ataccgccag ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg ggcatgttca tcatcagtaa  1080

cccgtatcgt gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat tacccccatg aacagaaatc  1140

ccccttacac ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac cgcccttaac atggcccgct  1200

ttatcagaag ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa cgagctggac gcggatgaac  1260

aggcagacat ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga gctttaccgc agctgcctcg  1320

cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag  1380

cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg  1440

gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct  1500

taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc  1560

gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga  1620

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat  1680

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca  1740

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc  1800

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata  1860

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc  1920

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc  1980

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga  2040

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc  2100

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag  2160

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ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca  2340

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga  2400

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat  2460

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catatcagga ttatcaatac catatttttg aaaaagccgt ttctgtaatg aaggagaaaa  2640

ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat cggtctgcga ttccgactcg  2700

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gacttgttca acaggccagc cattacgctc gtcatcaaaa tcactcgcat caaccaaacc  2880

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ggtgagtaac catgcatcat caggagtacg gataaaatgc ttgatggtcg gaagaggcat  3120

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<210>3

<211>3338

<212>DNA

<213>pCC质粒

<400>3

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tatcggatcc cgggcccgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg taatcatggt  360

catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg  420

gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt  480

tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg  540

gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta gagccaatca attcttgcgg agaactgtga  600

atgcgcaaac caacccttgg cagaacatat ccatcgcgtc cgccatctcc agcagccgca  660

cgcggcgcat ctcgggcagc gttgggtcct ggccacgggt gcgcatgatc gtgctcctgt  720

cgttgaggac ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg ttagcagaat gaatcaccga  780

tacgcgagcg aacgtgaagc gactgctgct gcaaaacgtc tgcgacctga gcaacaacat  840

gaatggtctt cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac gcggaagtca gcgccctgca  900

ccattatgtt ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct accctgtgga acacctacat  960

ctgtattaac gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt tctctggtcc cgccgcatcc  1020

ataccgccag ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg ggcatgttca tcatcagtaa  1080

cccgtatcgt gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat tacccccatg aacagaaatc  1140

ccccttacac ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac cgcccttaac atggcccgct  1200

ttatcagaag ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa cgagctggac gcggatgaac  1260

aggcagacat ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga gctttaccgc agctgcctcg  1320

cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag  1380

cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg  1440

gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct  1500

taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc  1560

gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga  1620

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat  1680

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca  1740

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc  1800

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata  1860

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc  1920

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc  1980

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga  2040

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc  2100

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag  2160

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag  2220

gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag  2280

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca  2340

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga  2400

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat  2460

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga  2520

gtaaacttgg tctgacagtt acgccccgcc ctgccactca tcgcagtact gttgtaattc  2580

attaagcatt ctgccgacat ggaagccatc acagacggca tgatgaacct gaatcgccag  2640

cggcatcagc accttgtcgc cttgcgtata atatttgccc atggtgaaaa cgggggcgaa  2700

gaagttgtcc atattggcca cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc agggattggc  2760

tgagacgaaa aacatattct caataaaccc tttagggaaa taggccaggt tttcaccgta  2820

acacgccaca tcttgcgaat atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt ggtattcact  2880

ccagagcgat gaaaacgttt cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag ggtgaacact  2940

atcccatatc accagctcac cgtctttcat tgccatacga aattccggat gagcattcat  3000

caggcgggca agaatgtgaa taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt tctttacggt  3060

ctttaaaaag gccgtaatat ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt gagcaactga  3120

ctgaaatgcc tcaaaatgtt ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg tggtatatcc  3180

agtgattttt ttctccatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta  3240

ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc  3300

gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctgt ctagctac                          3338

 

 

<210>4

<211>588

<212>DNA

<213>大肠杆菌lac操纵子基因

<400>4

gcaagaattg attggctcta cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat  60

gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg  120

tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt  180

tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg  240

ccaagcttgc atgcaggcct ctgcagtcga cgggcccggg atccgatatc tagatgcatt  300

cgcgaggtac cgagctcgaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac  360

cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat  420

agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg  480

cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc  540

actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccga               588

 

 

<210>5

<211>822

<212>DNA

<213>rop基因

<400>5

ggggagaggc ggtttgcgta gagccaatca attcttgcgg agaactgtga atgcgcaaac  60

caacccttgg cagaacatat ccatcgcgtc cgccatctcc agcagccgca cgcggcgcat  120

ctcgggcagc gttgggtcct ggccacgggt gcgcatgatc gtgctcctgt cgttgaggac  180

ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg ttagcagaat gaatcaccga tacgcgagcg  240

aacgtgaagc gactgctgct gcaaaacgtc tgcgacctga gcaacaacat gaatggtctt  300

cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac gcggaagtca gcgccctgca ccattatgtt  360

ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct accctgtgga acacctacat ctgtattaac  420

gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt tctctggtcc cgccgcatcc ataccgccag  480

ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg ggcatgttca tcatcagtaa cccgtatcgt  540

gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat tacccccatg aacagaaatc ccccttacac  600

ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac cgcccttaac atggcccgct ttatcagaag  660

ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa cgagctggac gcggatgaac aggcagacat  720

ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga gctttaccgc agctgcctcg cgcgtttcgg  780

tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag ac                     822

 

 

<210>6

<211>1080

<212>DNA

<213>rep基因

<400>6

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt  60

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg  120

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata  180

ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca  240

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag  300

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc  360

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga  420

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg  480

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac  540

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg  600

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg  660

ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct  720

gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc  780

gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt  840

acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat  900

gccgcatagt taagccagta tacactccgc tatcgctacg tgactgggtc atggctgcgc  960

cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg  1020

cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat  1080

 

 

<210>7

<211>1187

<212>DNA

<213>氨苄青霉素抗性基因（bla基因）

<400>7

tagttaagcc agccccgagt agctagacag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa  60

cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac  120

cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg  180

tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc  240

tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg  300

atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga  360

gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc  420

aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag  480

aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga  540

gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg  600

cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga  660

atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagcaatg gcaacaacgt  720

tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact  780

ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt  840

ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg  900

ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta  960

tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac  1021

tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta  1081

aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt  1140

tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatct                1187

 

 

<210>8

<211>850

<212>DNA

<213>卡那霉素抗性基因（kan基因）

<400>8

taatattgaa aaaggaagag tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg ctctaggccg  60

cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc  120

gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt  180

ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt cagactaaac  240

tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat  300

gcatggttac tcaccactgc gatccctggg aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat  360

cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg  420

attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa  480

tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg taatggctgg  540

cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat aaacttttgc cattctcacc ggattcagtc  600

gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa attaataggt  660

tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg  720

aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt  780

gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt tttctaactg  840

tcagaccaag                                                         850

 

 

<210>9

<211>705

<212>DNA

<213>氯霉素性基因（Cmr基因）

<400>9

 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgga gaaaaaaatc actggatata ccaccgttga  60

 tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt cagtcagttg ctcaatgtac  120

 ctataaccag accgttcagc tggatattac ggccttttta aagaccgtaa agaaaaataa  180

 gcacaagttt tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc ctgatgaatg ctcatccgga  240

 atttcgtatg gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg gatagtgttc acccttgtta  300

 caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc tggagtgaat accacgacga  360

 tttccggcag tttctacaca tatattcgca agatgtggcg tgttacggtg aaaacctggc  420

 ctatttccct aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc tcagccaatc cctgggtgag  480

 tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac ttcttcgccc ccgttttcac  540

 catgggcaaa tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca  600

 tcatgccgtc tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac aacagtactg  660

 cgatgagtgg cagggcgggg cgtaactgtc agaccaagtt tactc                  705

 

 

<210>10

<211>8685

<212>DNA

<213>具有亮氨酸富集区的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2基因（LRRK2：leucine-rich repeat serine/threonine-protein kinase 2）

<400>10

ggtaccgccg ccgccaccat ggccgaaatt ggaaccggct tccccttcga tcctcattac  60

gtggaggtgc tgggcgagag aatgcactac gtcgatgtcg ggcctagaga tggcacaccc  120

gtcctgtttc tccacggcaa tccaacctct tcatacgtgt ggcggaacat cattccacat  180

gtggccccta ctcatcggtg tattgctccc gatctcattg gcatgggcaa atccgacaaa  240

cccgatctgg gctacttctt cgacgatcat gtgagattca tggacgcctt tatcgaggca  300

ctgggactgg aggaagtcgt gctcgtcatt cacgattggg gatctgctct gggattccat  360

tgggctaaac ggaaccctga gagagtgaaa ggaattgctt ttatggaatt catccggccc  420

attcccactt gggacgaatg gcctgagttt gctagggaga catttcaggc tttccggact  480

accgatgtgg gacggaaact catcatcgac cagaacgtgt tcattgaggg caccctgcct  540

atgggagtgg tgaggccact cactgaagtc gagatggacc attaccgaga gccttttctg  600

aaccctgtcg accgagaacc tctgtggcga ttcccaaacg aactgcctat tgctggcgaa  660

cctgccaaca ttgtggcact cgtcgaggag tacatggatt ggctccacca gagtcctgtg  720

cctaaactgc tgttttgggg gacacctggc gtgctcatcc ctcctgctga ggctgctaga  780

ctggccaaat cactgcccaa ctgtaaagct gtggacattg gacctggact caatctgctc  840

caggaggaca atcccgacct catcggatct gagattgctc gatggctgtc cactctggag  900

atctccgggg aaccaacaac tggctctgga tctgaaaacc tgtacttcca gggcggctcc  960

ggctctatgg catccggatc ttgtcagggc tgtgaggagg acgaggaaac actcaaaaaa  1020

ctcattgtcc ggctgaacaa cgtccaggag ggcaaacaga tcgaaacact ggtccagatt  1080

ctggaggatc tgctggtgtt cacctactct gaacatgcct ctaaactgtt ccagggcaaa  1140

aacattcacg tgcccctgct cattgtgctg gattcctaca tgagagtcgc tagtgtccag  1200

caggtcggct ggtcactcct gtgtaaactc atcgaagtgt gtcctggcac tatgcagtca  1260

ctcatgggac ctcaggatgt gggcaacgat tgggaggtgc tgggagtcca tcagctcatt  1320

ctgaaaatgc tcaccgtcca caacgcctcc gtcaatctgt ctgtgatcgg actgaaaaca  1380

ctcgatctgc tgctcacatc tggcaaaatc accctgctca ttctggatga agagagcgac  1440

atcttcatgc tcatcttcga cgccatgcat tcattccctg ccaacgacga agtccagaaa  1500

ctcggctgta aagccctcca tgtgctgttt gaacgagtgt ctgaggaaca gctcactgag  1560

ttcgtggaaa acaaggatta catgattctg ctgtccgccc tcacaaactt caaagacgag  1620

gaagaaatcg tcctccacgt gctccattgt ctccattcac tggctatccc ttgtaataat  1680

gtcgaggtgc tcatgagcgg aaatgtgaga tgctacaaca tcgtggtcga ggctatgaag  1740

gcttttccca tgtctgaacg gattcaggaa gtgtcttgct gtctgctcca tcggctcaca  1800

ctgggcaatt ttttcaatat cctggtgctc aacgaagtcc acgagttcgt ggtgaaagct  1860

gtccagcagt accctgaaaa tgctgctctc cagatctctg ccctgtcttg tctggccctg  1920

ctcactgaaa ccatctttct caatcaggac ctggaggaga aaaacgagaa ccaggagaac  1980

gacgacgagg gcgaggagga caaactgttt tggctggagg cttgctacaa agctctcact  2040

tggcaccgga aaaacaaaca tgtccaggag gctgcttgtt gggctctgaa taatctgctc  2100

atgtaccaga actccctcca cgaaaaaatc ggcgacgagg atggccattt tcctgcccac  2160

cgggaagtga tgctgagtat gctcatgcac tcatcctcta aggaggtgtt ccaggcttct  2220

gccaacgctc tgtctactct gctcgaacag aacgtcaact ttcgaaaaat cctgctcagt  2280

aagggcattc acctgaacgt gctcgaactc atgcagaaac acatccactc tcccgaagtg  2340

gctgagtctg gctgtaaaat gctgaaccac ctctttgagg gatcaaacac atccctggat  2400

atcatggctg ctgtggtgcc taaaatcctc actgtgatga aacggcacga gactagtctg  2460

cccgtccagc tggaggctct gagagccatt ctccatttca tcgtgcctgg catgcctgag  2520

gagtctagag aggataccga gttccaccat aagctgaata tggtgaaaaa acagtgcttc  2580

aaaaatgaca ttcacaaact ggtgctggct gctctgaacc ggtttattgg caatcccggc  2640

attcagaaat gtggcctgaa agtcatctcc tctatcgtcc actttcccga tgctctggaa  2700

atgctgagtc tggagggggc tatggattct gtgctccata cactccagat gtaccccgat  2760

gatcaggaga tccagtgtct gggactgtct ctcattggat acctcatcac caaaaaaaac  2820

gtctttatcg gcaccggcca tctgctcgct aaaattctcg tgtcctcact ctaccgcttc  2880

aaggatgtgg ctgagattca gaccaaaggc ttccagacaa ttctggccat tctgaaactg  2940

agcgcctcct tctctaaact gctcgtccac cactctttcg atctggtgat cttccatcag  3000

atgtcctcca acattatgga acagaaggac cagcagttcc tgaatctgtg ctgtaaatgc  3060

ttcgccaaag tggctatgga tgactacctg aaaaacgtga tgctcgaacg ggcttgtgat  3120

cagaacaact caatcatggt cgagtgtctg ctcctcctcg gcgccgatgc caatcaggct  3180

aaagagggct cttctctcat ttgccaggtg tgcgaaaagg agtctagccc caaactcgtg  3240

gagctgctcc tgaattctgg ctctagggaa caggatgtga ggaaagctct caccatctct  3300

atcggcaaag gcgattccca gatcatctct ctgctcctcc gacgactggc tctggatgtg  3360

gccaataata gcatctgcct gggcggattt tgtatcggga aagtggagcc ttcatggctg  3420

ggcccactgt tccccgacaa aacatccaac ctccggaaac agacaaacat tgcctctaca  3480

ctggcccgaa tggtcattcg ataccagatg aaatctgctg tggaggaggg cactgctagc  3540

gggagtgatg gcaatttcag cgaggatgtg ctgtccaaat tcgacgagtg gacattcatc  3600

cccgattcct ctatggactc cgtgtttgcc cagagtgacg acctcgattc tgagggatct  3660

gaggggagtt tcctggtcaa aaaaaagtcc aactccatct ctgtgggcga attctaccga  3720

gatgccgtgc tccagcggtg ttcaccaaat ctccagcgac attccaattc actggggcca  3780

atcttcgatc acgaggacct gctcaaacga aaacggaaaa ttctctcttc cgatgactca  3840

ctgagatcct ctaaactcca gtcccacatg agacattccg actcaatctc tagtctggcc  3900

tctgaacggg aatacatcac ctcactggac ctgtctgcca atgaactgag ggatatcgat  3960

gccctgtccc agaaatgctg tattagcgtc cacctcgaac atctggagaa actggaactc  4020

caccagaacg ccctcacctc ttttccccag cagctgtgtg agacactgaa atcactcacc  4080

cacctcgatc tccactccaa caaattcacc tcattcccat cctacctgct caaaatgagc  4140

tgtatcgcca acctggacgt gtctagaaac gacattggac cctctgtcgt gctggaccca  4200

accgtcaaat gccctaccct gaaacagttc aacctgtcct acaatcagct gtcatttgtg  4260

cccgagaacc tcaccgatgt ggtcgaaaaa ctcgaacagc tcatcctgga gggcaacaaa  4320

atttccggga tttgctcccc actccgactg aaagaactga aaattctgaa cctgtccaaa  4380

aaccatatta gtagcctctc cgaaaacttc ctggaggctt gcccaaaagt ggaatcattc  4440

tccgctcgga tgaactttct ggccgctatg ccttttctgc ccccttctat gacaatcctc  4500

aaactgtccc agaacaaatt ctcctgtatc cccgaggcta tcctgaatct ccctcatctc  4560

cgatctctgg acatgtcatc aaacgatatt cagtacctcc ctggccctgc ccactggaaa  4620

tctctgaatc tccgggaact cctgttttct cacaaccaga tctccatcct ggatctgagc  4680

gaaaaagcct acctctggtc tagagtcgag aaactccacc tgagccacaa caaactgaag  4740

gagatcccac ctgaaatcgg atgtctggaa aacctcactt ctctcgatgt gtcctacaac  4800

ctggaactcc ggtcttttcc caatgaaatg gggaaactga gcaaaatctg ggacctccct  4860

ctggacgaac tccatctcaa cttcgacttc aaacacattg gctgtaaggc caaggatatt  4920

atccgcttcc tccagcagag gctgaaaaaa gctgtgccat acaataggat gaaactcatg  4980

attgtgggga ataccggatc tggaaaaacc acactgctcc agcagctcat gaaaaccaaa  5040

aaatccgatc tgggcatgca gtctgctact gtcgggatcg acgtgaagga ctggcctatc  5100

cagattaggg acaaacggaa acgagatctc gtgctgaatg tgtgggattt cgccggacga  5160

gaggagtttt actccaccca ccctcacttt atgactcagc gggctctgta cctcgccgtg  5220

tacgatctgt ctaaaggcca ggctgaagtg gatgccatga aaccttggct gttcaacatc  5280

aaggctaggg cttcatcttc acccgtgatc ctggtgggaa cccacctcga tgtgtccgat  5340

gagaaacagc ggaaagcctg tatgagcaaa atcaccaagg agctgctcaa caaacgggga  5400

tttcctgcta ttcgggacta ccacttcgtg aatgccaccg aggagtccga cgctctggca  5460

aaactgagaa aaaccatcat caacgagtcc ctgaacttca aaattcggga ccagctggtc  5520

gtgggccagc tcatccccga ctgttacgtg gagctggaaa aaatcatcct gagtgagcgg  5580

aaaaatgtgc ccatcgaatt ccctgtcatc gaccggaaac ggctgctcca gctcgtgaga  5640

gaaaatcagc tccagctgga cgagaatgaa ctcccacatg ccgtccattt tctgaatgaa  5700

tccggcgtgc tgctccattt tcaggaccct gctctccagc tgagtgatct gtacttcgtg  5760

gaacccaaat ggctgtgtaa aatcatggcc cagattctca ccgtgaaagt cgagggctgc  5820

cctaaacacc ctaaggggat cattagtcgg cgggacgtgg aaaaattcct gtctaaaaaa  5880

cgaaaatttc ccaaaaacta catgtcacag tacttcaaac tgctcgaaaa atttcagatc  5940

gccctgccta ttggcgagga gtacctgctg gtgccttctt ctctgtccga tcaccgacct  6000

gtcattgaac tgccccactg tgaaaattcc gagatcatca tccggctcta cgaaatgcca  6060

tacttcccta tgggcttttg gtcacggctc atcaaccgac tgctggagat tagtccctac  6120

atgctgtctg gacgggagcg agcactgagg ccaaatcgaa tgtactggcg gcagggcatc  6180

tacctcaact ggtcccccga ggcttactgt ctcgtgggct ctgaagtcct ggataaccat  6240

cctgagtcct ttctgaaaat cactgtcccc tcttgtcgaa aaggctgtat tctcctgggc  6300

caggtggtcg accatatcga tagtctcatg gaggaatggt tccctggact gctcgaaatc  6360

gacatctgtg gagagggcga aactctgctg aaaaaatggg ctctctactc tttcaacgat  6420

ggcgaagagc atcagaaaat cctgctggac gacctcatga aaaaggccga ggagggcgat  6480

ctgctggtca atcccgatca gccacggctc acaatcccaa tctcacagat tgctcccgat  6540

ctcattctgg ccgatctgcc tagaaacatc atgctgaaca acgacgagct ggagtttgaa  6600

caggctcctg aatttctgct cggcgacggc tcttttggct ctgtgtaccg agctgcttac  6660

gagggcgagg aggtggccgt caaaatcttc aacaaacaca catcactccg cctgctccga  6720

caggaactgg tcgtcctctg tcatctccat cacccttccc tcatttctct gctggctgct  6780

ggaatccggc ctaggatgct ggtcatggaa ctggctagca aaggctctct ggatcgactg  6840

ctccagcagg acaaagcatc tctcactcgg acactccagc atagaattgc cctccatgtg  6900

gccgatggac tccgatacct ccactctgcc atgatcatct accgggacct gaaacctcat  6960

aacgtgctgc tgtttaccct gtacccaaac gctgccatta tcgctaaaat tgccgactac  7020

ggcattgctc agtactgctg tcgaatgggc atcaaaacat ccgagggcac acctggattt  7080

cgggcccctg aagtggcacg gggaaacgtc atctacaatc agcaggccga tgtgtactca  7140

tttggactgc tgctgtacga tatcctcaca accggcggac gaattgtcga ggggctcaaa  7200

ttccccaacg aattcgatga actggagatc cagggcaaac tgcccgatcc cgtgaaagaa  7260

tacggatgtg ccccttggcc tatggtggaa aaactcatca aacagtgcct gaaggaaaac  7320

ccacaggaac ggcctactag cgctcaggtg ttcgatattc tgaactccgc tgaactggtc  7380

tgtctcacta gacgaattct gctgcccaaa aacgtcattg tggagtgtat ggtcgctaca  7440

caccataata gccggaatgc ctccatttgg ctgggatgtg gacacaccga tagaggccag  7500

ctgtcctttc tcgatctgaa taccgaggga tacacctctg aggaagtggc cgattctaga  7560

atcctctgtc tggctctggt ccacctgcct gtggaaaagg aatcttggat cgtgtctggg  7620

acacagtctg gaacactgct cgtgatcaac accgaggacg gcaaaaaacg gcatactctg  7680

gaaaaaatga ccgactccgt cacatgtctg tactgtaaca gcttctccaa acagtcaaaa  7740

cagaaaaatt tcctcctggt gggaaccgcc gacggaaaac tggccatctt cgaggacaaa  7800

accgtgaaac tgaaaggcgc tgctcctctc aaaattctca atattggcaa tgtgtctacc  7860

ccactcatgt gtctctccga atcaaccaat tccactgaac ggaacgtcat gtgggggggc  7920

tgtggaacaa aaatcttctc cttctcaaac gactttacca tccagaaact cattgagaca  7980

cggacctcac agctgttctc ttacgccgct tttagtgact ccaacatcat caccgtggtg  8040

gtggatactg ctctctacat tgctaaacag aactcccccg tggtcgaagt gtgggacaaa  8100

aaaaccgaaa aactctgtgg gctcatcgat tgtgtccatt ttctccggga ggtcatggtg  8160

aaggaaaaca aagaatctaa acacaaaatg tcctactctg ggcgagtcaa aaccctgtgc  8220

ctccagaaaa acactgctct gtggatcgga actggaggag gccatattct gctcctcgat  8280

ctgtccacta ggagactcat tcgagtcatc tacaatttct gtaactctgt gagagtgatg  8340

atgactgccc agctgggatc tctgaaaaac gtgatgctgg tgctgggata caatagaaaa  8400

aacactgagg gcacccagaa acagaaagag attcagagct gcctcactgt ctgggacatc  8460

aacctgcctc atgaagtcca gaatctggag aaacacatcg aagtccggaa agaactggcc  8520

gaaaaaatga ggagaacctc cgtcgaggga tctggctcac tggaagtgct gtttcaggga  8580

cctgggagtg actacaagga cgacgatgac aagggatctc accatcacca tcaccaccat  8640

catggatctt ggagccatcc tcagttcgaa aaataatgag gatcc                  8685

 

 

 

 

Claims (10)

1. 一种pC系列质粒，其特征在于：包括依次首尾相连的rep基因、rop基因、lacZ基因和抗生素抗性基因。

2.根据权利要求1所述的一种pC系列质粒，其特征在于：所述抗生素抗性基因为bla基因、kan基因或者Cmr基因中的任一种，对应的质粒为pCA、pCK或者pCC。

3.根据权利要求2所述的一种pC系列质粒，其特征在于：所述的质粒pCA具有序列表中序列1的核苷酸序列，包括rep基因、rop基因、lacZ基因和bla基因。

4.根据权利要求2所述的一种pC系列质粒，其特征在于：所述的质粒pCK具有序列表中序列2的核苷酸序列，包括rep基因、rop基因、lacZ基因和kan基因。

5.根据权利要求2所述的一种pC系列质粒，其特征在于：所述的质粒pCC具有序列表中序列3的核苷酸序列，包括rep基因、rop基因、lacZ基因和Cmr基因。

6.一种根据权利要求1所述的pC系列质粒的构建方法，其特征在于包括以下步骤： 

步骤一：所述rep基因、rop基因、LacZ基因和抗生素抗性基因通过人工设计并合成；

步骤二：运用PCR的方法将rep基因反向拼接到rop基因的3＇-端，得到rop-rep基因拼接产物；

步骤三：运用PCR的方法将lacZ基因反向拼接到rop-rep基因拼接产物的5＇-端，得到lacZ-rop-rep基因片段；

步骤四：运用PCR的方法将抗生素抗性基因反向拼接到lacZ-rop-rep基因片段的3＇-端，得到线形基因片段；

步骤五：所述线形基因片段通过同源重组的方法环化，最终得到环形的质粒。

7.根据权利要求3所述的一种pC系列质粒的构建方法，其特征在于：所述抗生素抗性基因为bla基因、kan基因或者Cmr基因中的任一种，对应的所述线形基因片段为lacZ-rop-rep-bla、lacZ-rop-rep-kan或者lacZ-rop-rep-Cmr，对应的质粒为pCA、pCK或者pCC。

8.权利要求1所述的一种pC系列质粒的应用，其特征在于：所述pC系列质粒在普通的基因克隆、筛选和测序中的应用。

9.权利要求1所述的一种pC系列质粒的应用，其特征在于：所述pC系列质粒在结构复杂、含有重复序列以及不稳定序列基因的克隆、筛选和测序中的应用。

10.权利要求1所述的一种pC系列质粒的应用，其特征在于：所述pC系列质粒在长片段基因的克隆、筛选、测序和基因组的合成中的应用。

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