CN106544313B - 一种缺失sahn基因的大肠杆菌MG1655菌株及构建方法和应用 - Google Patents

一种缺失sahn基因的大肠杆菌MG1655菌株及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种缺失sahn基因的大肠杆菌MG1655菌株及构建方法和应用，包括以下步骤：本发明利用中间为筛选标记基因、两端为同源序列的线性DNA片段，借助Red重组酶的作用，同源序列与目的基因发生同源重组，从而用标记基因替换靶基因。为了消除筛选标记基因的痕迹，在两侧加上能被Cre位点特异性重组酶识别的特殊位点，通过位点特异性重组酶的作用将筛选标记基因删除，得到缺失sahn基因的大肠杆菌MG1655菌株：MG1655△sahn。本发明提供该菌株的应用，利用该突变株△sahn的群感效应特征作为对照筛选到一种新型抑制剂1‑((4‑amino‑5H‑pyrrolo[3,2‑d]pyrimidin‑7‑yl)methyl)‑5‑(1H‑1,2,3‑triazo l‑4‑yl)piperidin‑3‑ol，降低了病原菌的生长和分裂能力。

Description

一种缺失sahn基因的大肠杆菌MG1655菌株及构建方法和应用
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种缺失sahn基因的大肠杆菌MG1655菌株及构建方法和应用。
背景技术：
通过甲基化修饰改变抗菌药物靶点的结构是以大肠杆菌为代表的致病菌的一种重要的耐药机制。大肠杆菌基因组基因sahn表达的S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)作为重要的酶参与甲基循环，在S-腺苷甲硫氨酸(SAM)调控的甲基化反应中使得甲硫氨酸和腺嘌呤再生。细胞内SAHN酶活性的抑制会严重影响细菌的生长和分裂，原因是，首先，SAHN酶活性下降会造成菌体内S-腺苷高半胱氨酸(SAH)的累积，作为SAM所依赖的甲基转移酶的有效反馈抑制剂，菌体内SAH的积累就会使甲基转移反应受到全面抑制，进而以影响基因表达调控和蛋白修饰的方式来降低病原菌的适应性，使细菌的生长和分裂得到抑制；其次，SAHN酶的抑制会造成下游群感效应(QS)信号分子AI-2前体的缺失，病原菌无法合成AI-2信号分子，从而可有效控制病原菌毒力因子表达、菌膜形成等细菌群体感应效应；再有，SAHN酶的抑制将会造成甲基循环的中断，甲基循环中的重要化合物甲硫氨酸和SAM无法再生，SAM是不能透过菌体细胞膜的，如果环境中没有甲硫氨酸供应，病原菌是根本无法生长的。菌体sahn基因的缺失将造成S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)无法表达，从而对细菌的生长和分裂产生影响。
Red/ET同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两翼同源的PCR片段导入宿主菌细胞，利用λ噬菌体Red重组酶的作用，使导入细胞的线性DNA片段与基因组的特定靶序列进行同源重组。
发明内容：
本发明目的在于提供一种缺失sahn基因的大肠杆菌MG1655菌株的构建方法。本发明提供该菌株的应用，利用该缺失菌株△sahn研究S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)在细菌生长分裂和群感效应中所起的作用，从而为评估SAHN作为抗细菌感染药物靶点的可行性提供依据。同时，利用该突变株△sahn的群感效应特征作为对照筛选到一种新型抑制剂1-((4-amino-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-7-yl)methyl)-5-(1H-1,2,3-triazo l-4-yl)piperidin-3-ol，可以用来降低病原菌生长和分裂能力。
本发明利用中间为筛选标记基因、两端为同源序列的线性DNA片段，借助Red重组酶的作用，同源序列与目的基因发生同源重组，从而用标记基因替换靶基因。为了消除筛选标记基因的痕迹，在两侧加上能被Cre位点特异性重组酶识别的特殊位点，通过位点特异性重组酶的作用将筛选标记基因删除。
本研究课题受国家自然科学基金面上项目：31370090，国家自然科学基金青年基金项目：21507040，山东省重点研发计划，2015GSF121006山东省自然科学基金：BS2015SWSW023资助。
一种缺失sahn基因的大肠杆菌MG1655菌株，缺失的基因序列：如SEQ ID NO.1所示。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种缺失sahn基因的大肠杆菌MG1655菌株的构建方法，包括以下步骤：
步骤一：同源线性打靶片段的构建
(1)设计同源臂引物，以质粒PSC101-tetR-tetO-eGFP(Kan)为模板，PCR扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因、两端各带有70bp与sahn基因同源的线性打靶片段；
步骤二：大肠杆菌MG1655菌株sahn基因敲除突变株的构建
(a)制备大肠杆菌MG1655感受态；
(b)将重组质粒PSC101-BAD-gbaA(amp)电转入到大肠杆菌MG1655感受态中；
(c)Red重组酶的诱导表达与同源线性打靶片段的电击转化将含有质粒PSC101-BAD-gbaA(amp)的大肠杆菌MG1655在含有终浓度为100μg/mL的氨苄霉素的LB培养基中30℃培养过夜；过夜菌液继续培养至0.4-0.6，立即加入终浓度为100mM的L-阿拉伯糖，37℃培养40min，诱导Red重组酶的表达，然后制备感受态细胞；取取500ng步骤(1)制备的同源的线性打靶片段与100μL制备的感受态细胞混合，转移至电转杯，设置电转化仪电压为1350V，进行电击转化；加入LB培养基重悬细胞，涂于含有卡那霉素的平板上，37℃倒置培养24h，以去除温敏型质粒PSC101-BAD-gbaA(amp)，筛选卡那霉素抗性和氨苄霉素敏感性的菌株，用T1、T2引物进行PCR测序鉴定；
(d)卡那霉素抗性基因的消除
将步骤(c)获得卡那霉素抗性的MG1655菌株制成感受态细胞，电转入表达Cre重组酶的质粒PSC101-BAD-Cre(tet)；37℃过夜培养以去除温敏性质粒PSC101-BAD-Cre(tet)，用T1、T2引物进行PCR鉴定，得到缺失sahn基因的大肠杆菌菌株MG1655△sahn。
优选地，所述步骤(1)中的同源臂引物为H1P1和H2P2：
H1P1：
5’-CAATCTGTGCCATGTCCTCTCCCGCGTGAGAAATACGCTTCC CCGTAAGCGCATGGTAAACTATGCCTTCGCTTTAATGCGGTAGTTTAT-3’；基因的序列如SEQ ID NO.2所示；
H2P2：
5’-GCGGCAAAGGCAAGTTCAGTGTTGGCGGGAGAAAGCGTGATGACGCGCGGCGCGGCGTTGAGCCACAGTGGTGGGTCTTAATACCGTTCG-3’；基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
作为进一步优选，所述的步骤(1)中PCR反应体系为：
2×Prime STAR Max,25μL；
模板，1μL；
H1P1，1μL；
H2P2，1μL；
ddH2O,22μL；
Total,50μL；
反应参数为：预变性95℃，5min；变性98℃，30s；退火52℃，30s；延伸72℃，90s；共30个循环，最后72℃延伸10min。
优选地，所述的PCR测序鉴定的引物为T1和T2：
T1:5’-TTCCATCGAGTGGGTAAGA-3’；基因的序列如SEQ ID NO.4所示；
T2:5’-ACCAGATCGGGTTTCAGC-3’，基因的序列如SEQ ID NO.5所示。
构建过程所用的模板质粒PSC101-tetR-tetO-eGFP(Kan)、重组质粒PSC101-BAD-gbaA(amp)和PSC101-BAD-Cre(tet)均为山东大学张友明实验室馈赠，质粒图谱依次为附图5、6、7所示。重组质粒PSC101-BAD-gbaA(amp)和PSC101-BAD-Cre(tet)为温敏型质粒，当培养温度为30℃时，该质粒在细胞中稳定复制；当培养温度为37℃-42℃时，该质粒从细胞中丢失。三种质粒和同源线性打靶片段的加入量均为500ng；培养过程中所用的培养基均为LB培养基，pH为6.0-7.0。
所述的重组方法为线环重组。
本发明提供该菌株的应用，利用该缺失菌株△sahn研究S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)在细菌生长分裂和群感效应中所起的作用。
同时，本发明利用该突变株△sahn的群感效应特征作为对照筛选到一种新型抑制剂1-((4-amino-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-7-yl)methyl)-5-(1H-1,2,3-triazo l-4-yl)piperidin-3-ol，中文名称为，1-((4-氨基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-7-基)甲基)-5-(1H-1,2,3-三唑-4-基)哌啶-3-醇，可以用来降低病原菌生长和分裂能力。
本发明具有以下有益成果：
1.本发明通过Red/ET同源重组技术构建sahn基因缺失菌株，该方法可以完全镂掉sahn基因，在基因组中不会残留抗性标记，与传统意义的插入失活具有本质的不同。
2.本发明运用的Red/ET同源重组技术，具有同源序列短(同源臂长度仅为70bp)，重组效率高的特点。这种技术可在靶分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作，无需使用限制性内切酶和连接酶。
3.本发明提供该sahn基因缺失突变株的应用，通过Red/ET同源重组技术成功敲除了sahn基因，使菌体不能表达S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)，甲基循环中断，降低了细菌生物膜的形成和致病性，细菌的生长和分裂受到影响，为发展以SAHN为药物靶点的新型抗感染药物依据和参考。
4.本发明提供该sahn基因缺失突变株的应用，利用该突变株的群感效应特征作为对照筛选到一种新型抑制剂1-((4-amino-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-7-yl)methyl)-5-(1H-1,2,3-triazo l-4-yl)piperidin-3-ol，来降低病原菌的生长和分裂能力。
5.质粒PSC101-tetR-tetO-eGFP(Kan)包含两个LoxP位点。LoxP位点长34bp，两端是13bp的反向重复序列，是重组酶的结合部位，中间相隔8bp，这8个碱基序列决定了作用位点的方向。质粒PSC101-tetR-tetO-eGFP(Kan)的两个LoxP的位点方向相同。
6.在Red/ET重组工程中，将方向一致的LoxP位点置于抗性基因两端，这样在重组完成之后，利用Cre重组酶可以很容易将抗性基因除去。
7.本发明在敲除过程中使用的同源臂引物H1P1和H2P2为90bp，与其他引物相比一般引物为18-20(bp)，比较长，同时采用较低的退火温度52℃，H1P1和H2P2与模板的特异性结合好，PCR产物质量高。
8.本发明在敲除过程中使用的同源线性打靶片段较为特殊，中间为卡那霉素抗性基因与两个LoxP位点，两端为与sahn基因同源的片段。
9.用于基因敲除后的PCR鉴定的引物T1和T2均位于sahn基因上、下游同源臂的外侧，利于验证。
总之，本发明通过对构建方法的各个步骤和参数进行调整优化，得到了缺失sahn基因的大肠杆菌菌株MG1655△sahn，并通过群感效应对照筛选得到新型的抑制剂。
本研究课题受国家自然科学基金面上项目：31370090，国家自然科学基金青年基金项目：21507040，山东省重点研发计划，2015GSF121006山东省自然科学基金：BS2015SWSW023资助。
附图说明
图1：采用Red重组系统敲除大肠杆菌MG1655的sahn基因过程示意图：图中，A：线性基因打靶片段的构建过程，H1为sahn基因的前同源臂，H2为sahn基因的后同源臂，P1、P2是根据质粒PSC101-tetR-tetO-eGFP(Kan)所设计的引物，线性打靶片段包含两个LoxP位点和一个卡那霉素抗性基因；B：sahn基因在大肠杆菌MG1655基因组中的相对位置；C：卡那霉素抗性基因取代sahn基因；D：卡那霉素抗性基因的消除。
图2：同源打靶片段的PCR示意图。
图3：同源重组前后的PCR示意图。
图4：卡那霉素基因消除后的PCR示意图。
图5：PSC101-tetR-tetO-eGFP(Kan)的质粒图谱。
图6：PSC101-BAD-gbaA(amp)的质粒图谱。
图7：PSC101-BAD-Cre(tet)的质粒图谱。
图8：抑制剂的结构图。
1-((4-amino-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-7-yl)methyl)-5-(1H-1,2,3-triazol-4-yl)piperidin-3-ol。
图9：S-腺苷高半胱氨酸核苷酶与抑制剂的结合模式图。
图10：信号分子Al-2的检测图。
图11：生物膜的检测。
具体实施方式
下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
采用Red重组系统敲除大肠杆菌MG1655的sahn基因过程示意图见附图1：图中，A：线性基因打靶片段的构建过程，H1为sahn基因的前同源臂，H2为sahn基因的后同源臂，P1、P2是根据质粒PSC101-tetR-tetO-eGFP(Kan)所设计的引物，PSC101-tetR-tetO-eGFP(Kan)质粒图谱见附图5，线性打靶片段包含两个LoxP位点和一个卡那霉素抗性基因；B：sahn基因在大肠杆菌MG1655基因组中的相对位置；C：卡那霉素抗性基因取代sahn基因；D：卡那霉素抗性基因的消除。具体分为以下几个步骤。
1.同源打靶片段的构建
(1)引物设计为：
H1P1：
5’-CAATCTGTGCCATGTCCTCTCCCGCGTGAGAAATACGCTTCCCCGTAAGCGCATGGTAAACTATGCCTTCGCTTTAATGCGGTAGTTTAT-3’；基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
H2P2：
5’-GCGGCAAAGGCAAGTTCAGTGTTGGCGGGAGAAAGCGTGATGACGCGCGGCGCGGCGTTGAGCCACAGTGGTGGGTCTTAATACCGTTCG-3’；基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
(2)PCR扩增：以质粒PSC101-tetR-tetO-eGFP(Kan)为模板，用引物H1P1、H2P2进行PCR扩增，得到中间带有卡那霉素抗性基因、两端各带有70bp与sahn基因同源的线性打靶片段。
PCR反应体系为：
反应参数为：预变性95℃，5min；变性98℃，30s；退火52℃，30s；延伸72℃，90s；共30个循环，最后72℃延伸10min。
(3)如图2所示，PCR产物长度为1396bp。
2.大肠杆菌MG1655菌株sahn基因敲除突变株的构建
(1)大肠杆菌MG1655电转感受态细胞的制备
①从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌MG1655单菌落，接种于50mL LB培养基中，37℃振荡培养至对数生长期。
②将菌液迅速置于冰上冷却20min，4℃条件下12000r/min离心1min，弃去上清液,加入1mL ddH2O，使细胞重悬，4℃条件下12000r/min再次离心1min，重复3次。
③加入100μL预冷的ddH2O，用移液枪将细胞吹打混匀。
(2)将重组质粒PSC101-BAD-gbaA(amp)电转入到大肠杆菌MG1655感受态中，PSC101-BAD-gbaA(amp)的质粒谱图见附图6。
①取5μL PSC101-BAD-gbaA(amp)质粒(100ng/μL)加入到100μL感受态细胞中。
②混匀后将菌液转移至预冷的电转杯中，设置电转化仪电压为1350V，进行电击转化。
③电击后迅速加入1mL LB培养基，重悬细胞后，转移到1.5mL灭菌的离心管中，37℃孵育1h。
④4℃条件下12000r/min离心1min，去上清。
⑤加入100μL LB培养基重悬细胞，涂于含有100μg/mL氨苄霉素的平板上，30℃倒置培养24h。
(3)Red重组酶的诱导表达与同源打靶片段的电击转化
①将含有质粒PSC101-BAD-gbaA(amp)的大肠杆菌MG1655在含有氨苄霉素(终浓度为100μg/mL)的LB培养基中30℃培养过夜。
②过夜菌液按1:100接种于50mL培养基中(含终浓度为100μg/mL的氨苄霉素)，30℃培养OD值至0.4—0.6，立即加入终浓度为100mM的L-阿拉伯糖，37℃培养40min，诱导Red重组酶的表达。
③将②按2.(1)制备感受态细胞。
④取500ng步骤(1)制备的同源的线性打靶片段与100μL③制备的感受态细胞混合，转移至电转杯，设置电转化仪电压为1350V，进行电击转化。
⑤电击后迅速加入1mL LB培养基，重悬细胞后，转移到1.5mL灭菌的离心管中，37℃孵育1h。
⑥4℃条件下12000r/min离心1min，去上清。
⑦加入100μL LB培养基重悬细胞，涂于含有50μg/mL卡那霉素的平板上，37℃倒置培养24h，以去除温敏型质粒PSC101-BAD-gbaA(amp)。
⑧分离单菌落，筛选卡那霉素抗性和氨苄霉素敏感性的菌株。
⑨在同源臂上下游设计引物，通过PCR鉴定转化子。
验证引物为：
T1:5’-TTCCATCGAGTGGGTAAGA-3’；基因的序列如SEQ ID NO.4所示。
T2:5’-ACCAGATCGGGTTTCAGC-3’；基因的序列如SEQ ID NO.5所示。
PCR反应体系为：
10×PCR buffer(Mg2<sup>+</sup>plus) 1.25μL
模板 0.5μL
dNTP Mixture 1μL
T<sub>1</sub> 0.25μL
T<sub>2</sub> 0.25μL
ddH<sub>2</sub>O 9.18μL
Taq多聚酶 0.07μL
Total 12.5μL
反应参数为：预变性95℃，5min；变性98℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，90s；共30个循环，最后72℃延伸10min。
如图3所示：同源重组前PCR产物为1725bp；同源重组后PCR产物为1235bp。
(4)卡那霉素抗性基因的消除
①将步骤(3)获得卡那霉素抗性的MG1655菌株制成感受态细胞，电转入表达Cre重组酶的质粒PSC101-BAD-Cre(tet)，在含有四环素(终浓度为10μg/mL)的平板上30℃培养24h，筛选阳性转化子。PSC101-BAD-Cre(tet)的质粒谱图见图7。
②转接至含终浓度为10μg/mL的四环素培养基中，30℃培养2h，加入L-阿拉伯糖(终浓度为100mM)培养40min，诱导Cre酶的表达。
③在无抗性的板上，37℃过夜培养以去除温敏性质粒PSC101-BAD-Cre(tet)。
④对单菌落进行卡那霉素和四环素敏感性检测，获得对两种抗生素敏感的单克隆即为去除了卡那霉素抗性和PSC101-BAD-Cre(tet)的sahn基因缺失菌株。
⑤用T1、T2引物进行PCR鉴定。
PCR反应体系为：
10×PCR buffer(Mg2<sup>+</sup>plus) 1.25μL
模板 0.5μL
dNTP Mixture 1μL
T<sub>1</sub> 0.25μL
T<sub>2</sub> 0.25μL
ddH<sub>2</sub>O 9.18μL
Taq多聚酶 0.07μL
Total 12.5μL
反应参数为：预变性95℃，5min；变性98℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，45s；共30个循环，最后72℃延伸10min。
如图4所示：消除卡那霉素抗性后，PCR产物长度为550bp。
该结果表明本发明所涉及的大肠杆菌MG1655中sahn已成功敲除，MG1655△sahn构建成功。
实施例2
该基因缺失菌株△sahn的应用。
S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)作为重要的酶参与甲基循环，在S-腺苷甲硫氨酸(SAM)调控的甲基化反应中使得甲硫氨酸和腺嘌呤再生，并产生通用群感效应信号分子自诱导剂AI-2。而由群感效应所影响的生物膜作为细菌生长分裂的一种重要的保护模式，保证细菌在恶劣环境下可以生存，也会使细菌对抗抗生素的能力提高，生物膜的形成成为细菌耐药的重要机制之一，是许多慢性感染性疾病反复发作和难以控制的主要原因。
本发明利用该基因缺失菌株△sahn研究了S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(SAHN)在细菌生物膜形成和致病性中所起的作用，为发展以SAHN为药物靶点的新型抗感染药物提供理论和实验上的依据和参考。同时本发明利用该突变株△sahn群感效应特征作为对照筛选到一种新型抑制剂1-((4-amino-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-7-yl)methyl)-5-(1H-1,2,3-triazo l-4-yl)piperidin-3-ol，来降低病原菌的致病性。
(1)信号分子AI-2的检测
①取大肠杆菌MG1655，MG1655△sahn分别接种到LB液体培养基中培养至处于对数生长期，12000rpm，4℃离心10min，收集上清，过滤，-80℃冻存，用于AI-2的检测。其中，大肠杆菌MG1655培养基中加入抑制剂1-((4-amino-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-7-yl)methyl)-5-(1H-1,2,3-triazo l-4-yl)piperidin-3-ol。
②接种哈氏弧菌BB170到AB液体培养基中，28℃震荡培养过夜。
③用新配制的AB培养基以1:1000稀释BB170培养物，向灭菌的试管中加入9mL稀释后的BB170培养物。
④向③中加入1mL①制备的细菌培养上清，150rpm，28℃培养。
⑤生物发光仪(Agilent Technologies，USA)检测培养物发光。
如图10所示，与正常菌株MG1655相比，构建的突变菌株MG1655△sahn信号分子AI-2生成量显著降低。同时，加入抑制剂后MG1655信号分子AI-2生成量降低了78.50％。
(2)生物膜的检测
生物膜实验是通过96孔板微量法进行测定。
①大肠杆菌MG1655，MG1655△sahn分别接种到LB液体培养基中培养至处于对数生长期。其中，大肠杆菌MG1655培养基中加入抑制剂1-((4-amino-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-7-yl)methyl)-5-(1H-1,2,3-triazo l-4-yl)piperidin-3-ol。
②用灭菌的M9液体培养基将①培养的大肠杆菌稀释至OD600值为0.01。
③将200μL稀释至OD600值为0.01菌液加入96孔板中，每个菌液加6孔，于37℃恒温箱中培养48h。
④将培养好的96孔板从恒温箱中取出，弃菌液。用1％PBS缓冲液洗96孔板，重复3次，弃洗液，拍干。
⑤将甲醇加入96孔板中，固定15min，倒出并晾干。将150μL 0.5％结晶紫溶液加入96孔板中，染色5min，灭菌水冲洗，将200μL33％的冰醋酸加于96孔板中，待细菌生物膜完全溶解后，用全波长酶标仪中测定OD570。
如图11所示，与正常菌株MG1655相比，构建的突变菌株MG1655△sahn菌膜的生成量显著降低。同时，加入抑制剂后MG1655菌膜的生成量降低了82.05％。
本发明所涉及的大肠杆菌MG1655中sahn基因已成功敲除，MG1655△sahn构建成功。本发明将sahn基因缺失菌株与野生型菌株的信号分子AI-2和菌膜的生成量进行对比分析，发现大肠杆菌MG1655△sahn的AI-2和生物膜生成量下降，说明SAHN酶蛋白的表达水平不同，大肠杆菌的群感效应受到了影响。突变菌株△sahn为今后分析SAHN酶蛋白在机体中的功能机制，筛选SAHN酶蛋白的特异性抑制剂提供了可行性依据，为发展以S-腺苷高半胱氨酸核苷酶为药物靶点的新型抗感染药物研究提供了参考。同时，将突变株△sahn群感效应特征作为对照筛选到一种新型抑制剂1-((4-amino-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-7-yl)methyl)-5-(1H-1,2,3-triazo l-4-yl)piperidin-3-ol，降低了病原菌的生长和分裂能力。
本研究课题受国家自然科学基金面上项目：31370090，国家自然科学基金青年基金项目：21507040，山东省重点研发计划，2015GSF121006山东省自然科学基金：BS2015SWSW023资助。
SEQUENCE LISTING
<110> 济南大学
<120> 一种缺失sahn基因的大肠杆菌MG1655菌株及构建方法和应用
<130> 201602
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 699
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 1
atgaaaatcg gcatcattgg tgcaatggaa gaagaagtta cgctgctgcg tgacaaaatc 60
gaaaaccgtc aaactatcag tctcggcggt tgcgaaatct ataccggcca actgaatgga 120
accgaggttg cgcttctgaa atcgggcatc ggtaaagtcg ctgcggcgct gggtgccact 180
ctgctgttgg aacactgcaa gccagatgtg attattaaca ccggttctgc cggtggcctg 240
gcaccaacgt tgaaagtggg cgatatcgtt gtctcggacg aagcacgtta tcacgacgcg 300
gatgtcacgg catttggtta tgaatacggt cagttaccag gctgtccggc aggctttaaa 360
gctgacgata aactgatcgc tgccgctgag gcctgcattg ccgaactgaa tcttaacgct 420
gtacgtggcc tgattgttag cggcgacgct ttcatcaacg gttctgttgg tctggcgaaa 480
atccgccaca acttcccaca ggccattgct gtagagatgg aagcgacggc aatcgcccat 540
gtctgccaca atttcaacgt cccgtttgtc gtagtacgcg ccatctccga cgtggccgat 600
caacagtctc atcttagctt cgatgagttc ctggctgttg ccgctaaaca gtccagcctg 660
atggttgagt cactggtgca gaaactggca catggctaa 699
<210> 2
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caatctgtgc catgtcctct cccgcgtgag aaatacgctt ccccgtaagc gcatggtaaa 60
ctatgccttc gctttaatgc ggtagtttat 90
<210> 3
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcggcaaagg caagttcagt gttggcggga gaaagcgtga tgacgcgcgg cgcggcgttg 60
agccacagtg gtgggtctta ataccgttcg 90
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttccatcgag tgggtaaga 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
accagatcgg gtttcagc 18

Claims (1)

1.一种抑制剂，其特征在于，所述的抑制剂为：1-((4-amino-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-7-yl)methyl)-5-(1H-1,2,3-triazo l-4-yl)piperidin-3-ol。
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感染药物靶标S-腺苷高半胱氨酸核苷酶的作用机制及其特异性抑制物的研究;谷劲松;《纪念中国微生物学会成立六十周年大会暨2012年中国微生物学会学术年会论文集》;20131022;参见第208页第3段和第209页第1段
重组大肠杆菌SAHN和LuxS蛋白表达及群感效应分析;李超 等;《济南大学学报(自然科学版)》;20161130;第30卷(第6期);参见摘要

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