CN112410365B - 伯克氏菌同源重组系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了伯克氏菌同源重组系统，该重组系统由一系列伯克氏菌同源重组系统表达质粒构成，分别命名为pBBR1‑Rha‑EThe_bdu8‑kan、其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；pBBR1‑Rha‑ETh_tji49‑kan、其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；pBBR1‑Rha‑ETh1h2e_yi23‑kan、其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明还公开了所述重组系统在伯克氏菌中介导短同源臂的同源重组进行基因组DNA遗传修饰中的应用和该重组系统在伯克氏菌中进行基因插入以激活沉默基因簇的应用。本发明所述的伯克氏菌同源重组系统能够极大地促进伯克氏菌的基因组修饰，使得伯克氏菌的遗传修饰变得简单快捷，也为进一步挖掘伯克氏菌中的次级代谢产物提供了重要的工具，具有广阔的应用前景。

Description

伯克氏菌同源重组系统及其应用
技术领域
本发明涉及一种革兰氏阴性菌中的同源重组系统及其构建与应用，尤其涉及一种伯克氏菌中的同源重组系统及其构建与应用，属于微生物基因工程领域。
背景技术
Red/ET同源重组技术可以用来精确的修饰大肠杆菌的基因组，其中，RecET同源重组蛋白源自大肠杆菌Rac前噬菌体，Redαβγ同源重组蛋白源于大肠杆菌的λ噬菌体的Red操纵子。RecET和Redαβγ同源重组技术极大地提高了大肠杆菌中的重组效率，并为其遗传修饰提供了有效的方法。其中，RecE和Redα具有5’–3’的核酸外切酶活性，RecT和Redβ是DNA单链退火蛋白。
Redγ可以抑制RecBCD的外切酶活性，RecBCD是一个多功能酶复合物，它能加工处理由双链断裂产生的DNA末端。Redγ可以形成一个二聚体的DNA类似物，与RecBCD系统中核酸外切酶和解旋酶相互并且抑制这些酶的活性，从而可以提高DNA的重组效率。
除了大肠杆菌来源的RecET和Redαβγ同源重组系统，许多文献也报道了通过使用噬菌体重组功能操纵子构建的重组系统，例如发光杆菌(Photorhabdus)、致病杆菌(Xenorhabdus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、梭状杆菌(Clostridium)、乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、假单胞杆菌(Pseudomonas)等等，但是这些重组系统都具有显著的宿主专一性，这样导致了这些重组系统的应用范围比较窄。
伯克氏菌是一种革兰氏阴性菌，在需氧条件下生长，属于伯克氏菌属。生物信息学分析发现，伯克氏菌中存在着大量未知的天然产物生物合成基因簇，预测这些生物合成基因簇能够编码表达不同类型的化合物，包括非核糖体肽类、聚酮类、萜类等。而且这些生物合成基因簇大部分都是沉默的或者表达水平很低。因此，通过原位激活的策略可以获得大量新的天然产物。但是伯克氏菌缺乏高效简捷的遗传操作方法，因此，在伯克氏菌中建立一套高效简捷的遗传操作系统非常必要。经检索，有关伯克氏菌的重组系统及其构建与应用的研究还未见报道。
发明内容
针对目前伯克氏菌缺乏高效遗传操作系统的不足，本发明要解决的问题是提供一种伯克氏菌中的同源重组系统及其构建与应用。
本发明技术方案是：挖掘伯克氏菌噬菌体同源重组蛋白，构建伯克氏菌同源重组系统表达质粒，对并同源重组系统表达质粒在伯克氏菌中的重组条件进行优化，实现应用伯克氏菌同源重组系统对伯克氏菌的基因组进行修饰以激活沉默基因簇。
本发明所述的伯克氏菌同源重组系统由一系列伯克氏菌同源重组系统表达质粒构成，其特征在于：所述重组系统中的系列表达质粒包括pBBR1复制起点、卡那霉素抗性基因、鼠李糖诱导型启动子以及伯克氏菌来源同源重组操纵子(如图1所示)；所述系列表达质粒分别命名为pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan、其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan、其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示(如图2所示)；其中涉及的同源重组酶EThe_BDU8、ETh_TJI49和ETh1h2e_YI23分别来源于伯克氏菌Burkholderia sp.BDU8、Burkholderia sp.TJI49和Burkholderia sp.YI23。
上述重组系统中的系列表达质粒pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan和pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan的构建方法如下：
(1)以pBBR1-Rha-redgba-kan为初始质粒，用NdeI和HindIII对其进行双酶切，将酶切目的线性片段pBBR1-Rha-kan进行胶回收；
(2)步骤(1)得到的胶回收线性片段pBBR1-Rha-kan分别与合成的带有同源臂的重组酶片段EThe_bdu8HA、ETh_tji49HA和ETh1h2e_yi23HA共转化到E.coli GB05-dir中进行线线重组；
(3)对步骤(2)得到的重组子进行酶切验证，从而得到伯克氏菌同源重组系统系列表达质粒，所述系列表达质粒分别命名为pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、其核苷酸序列如SEQID No.1所示；pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan、其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan、、其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明所述伯克氏菌同源重组系统在伯克氏菌中介导短同源臂的同源重组进行基因组DNA遗传修饰中的应用，其中所述短同源臂是指50bp-150bp的同源臂。
上述的应用中：所述伯克氏菌同源重组系统的系列表达质粒优选pBBR1-PRha-ETh_tji49-kan或pBBR1-PRha-ETh1h2e_yi23-kan，所述伯克氏菌优选是Burkholderia glumaePG1，所述表达质粒在Burkholderia glumae PG1中提高重组效率的优化条件是：
重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan在Burkholderia glumae PG1中最佳重组条件：起始OD600＝0.1，转接2h，35℃诱导时间为60min，在4℃条件下，用4℃的10％甘油溶液制备感受态细胞，外源DNA的量的范围在500–1000ng，同源臂长度为125bp。
重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan在Burkholderia glumae PG1中最佳重组条件：起始OD600＝0.1，转接2h，35℃诱导时间为60min，在4℃条件下，用4℃的双蒸去离子水制备感受态细胞，外源DNA的量的范围在500–1000ng，同源臂长度为150bp。
本发明还公开了所述伯克氏菌同源重组系统在伯克氏菌中进行基因插入以激活伯克氏菌中的沉默基因簇的应用。
其中：所述伯克氏菌优选是Burkholderia plantarri DSM9509；所述沉默基因簇包括非核糖体肽类、聚酮类、萜类的生物合成基因簇；所述进行基因插入优选在上述优化的工作条件下实施。
与现有的技术相比，本发明具有的显著效果体现在：
本发明公开了由一系列伯克氏菌同源重组系统表达质粒构成的伯克氏菌同源重组系统，该重组系统在文献中未见报道，并首次对重组系统表达质粒pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan和pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan的重组效率在伯克氏菌中进行了优化和应用。实验结果显示，重组系统表达质粒中除了包含编码核酸外切酶基因和单链DNA退火蛋白基因，还包含未知蛋白编码基因。这些未知蛋白，除pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan中h2表达的蛋白外，均与重组有关。本发明利用构建的重组系统实现了对伯克氏菌Burkholderia plantarri DSM9509的基因组挖掘，发现了一类新化合物haereoplantin F、haereoplantin G和haereoplantin H，这三个化合物为首次报道。本发明所述的伯克氏菌重组系统能够极大地促进伯克氏菌的基因组修饰，为开发生物活性天然产物提供了有力的工具，具有非常广阔的应用前景。
附图说明
图1：大肠杆菌来源的Redαβγ和RecET操纵子与伯克氏菌来源的同源重组操纵子结构图。其中，颜色相同的基因编码的蛋白功能类似。
图2：伯克氏菌重组系统表达质粒构建示意图。
图3：Burkholderia glumae PG1电转条件的优化。
(A)Burkholderia glumae PG1的生长曲线。
(B)不同培养时间及不同温度下制备的感受态细胞对Burkholderia glumae PG1电转效率的影响。
(C)不同电转缓冲液及不同温度下制备的感受态细胞对Burkholderia glumaePG1电转效率的影响。
(D)不同DNA的量对Burkholderia glumae PG1电转效率的影响。误差线，每个实验组有三个平行样品，n＝3。
图4：几种重组系统在E.coli GB2005和Burkholderia glumae PG1中重组功能的检测。
(A)在E.coli GB2005中用阿博拉霉素抗性基因替代重组系统表达质粒上的重组酶片段，进行线环重组的示意图。
(B)重组系统表达质粒在E.coli GB2005中重组效率的比较。
(C)在Burkholderia glumae PG1中用阿博拉霉素抗性基因插入到基因BGL_RS05915前面，进行线环重组的示意图。
(D)重组系统表达质粒在Burkholderia glumae PG1中重组效率的比较。
图5：重组系统表达质粒pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan和pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan在Burkholderia glumae PG1进行遗传修饰后进行菌落PCR验证重组修饰的正确性。
其中M为TaKaRa DL2000 DNA Marker，N为Burkholderia glumae PG1野生菌株。
(A)pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan，(B)pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan，(C)pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan，所有随机挑取的单克隆均正确。误差线，每个实验组有七个平行样品，n＝7。
图6：重组系统不同组合在E.coli GB2005和Burkholderia glumae PG1中的重组效率的比较。
(A)E.coli GB2005中EThe_bdu8不同组合的重组效率比较。
(B)Burkholderia glumae PG1中EThe_bdu8不同组合的重组效率比较。
(C)E.coli GB2005中ETh_tji49不同组合的重组效率比较。
(D)Burkholderia glumae PG1中ETh_tji49不同组合的重组效率比较。
(E)E.coli GB2005中ETh1h2_yi23不同组合的重组效率比较。
(F)Burkholderia glumae PG1中ETh1h2_yi23不同组合的重组效率比较。误差线，每个实验组有三个平行样品，n＝3。
图7：重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan在Burkholderia glumae PG1中重组效率的优化。
(A)不同转接时间对重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan重组效率的影响。
(B)不同诱导时间对重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan重组效率的影响。
(C)不同诱导温度对重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan重组效率的影响。
(D)不同电转缓冲液对重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan重组效率的影响。
(E)不同外源DNA的量对重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan重组效率的影响。
(F)不同同源臂长度对重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan重组效率的影响。
(G)不同长度的同源臂进行重组后菌落PCR验证结果。M为TaKaRa DL2000 DNAMarker，C为Burkholderia glumae PG1野生菌株。误差线，每个实验组有三个平行样品，n＝3。
图8：重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan在Burkholderia glumaePG1中重组效率的优化。
(A)不同转接时间对重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan重组效率的影响。
(B)不同诱导时间对重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan重组效率的影响。
(C)不同诱导温度对重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan重组效率的影响。
(D)不同电转缓冲液对重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan重组效率的影响。
(E)不同外源DNA的量对重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan重组效率的影响。
(F)不同同源臂长度对重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan重组效率的影响。
图9：利用伯克氏菌重组系统激活Burkholderia plantarri DSM9509中的沉默生物合成基因簇。
(A)Burkholderia plantarri DSM9509 Chrom1Cluster4阿博拉霉素表达基因及其启动子的插入及敲除位置。
(B)Burkholderia plantarri DSM9509 Chrom1Cluster4基因插入及基因敲除突变株菌落PCR验证图，M为TaKaRa DL5000 DNA Marker；N为Burkholderia plantarriDSM9509野生菌株。
(C)Burkholderia plantarri DSM9509 Chrom1Cluster4的启动子插入及基因敲除突变株发酵产物HPLC-MS检测结果，(a)为野生菌的发酵产物，(b)为基因敲除突变株的发酵产物，(c)为启动子插入突变株的发酵产物。
(D)通过插入阿博拉霉素启动子激活Burkholderia plantarri DSM9509Chrom1Cluster4得到的化合物的MS谱图。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
一般性说明：
如下实施例所涉及的重组系统表达菌株E.coli GB2005和E.coli GB05-dir均购于德国GeneBridges公司；Burkhoderia glumae PG1来源于山东大学-赫姆霍兹生物技术研究所；Burkhoderia plantarri DSM9509来源于山东大学-赫姆霍兹生物技术研究所。
质粒pBBR1-Rha-GFP-kan、pBBR1-Rha-redgba-kan、pBBR1-Rha-BA_7029-kan、pBBR1-Rha-TEpsy-kan、pBBR1-Rha-BAS-kan、pBBR1-Rha-GBAS-kan和pBBR1-apra-kan来源于山东大学-赫姆霍兹生物技术研究所。
Burkhoderia glumae PG1和Burkhoderia plantarri DSM9509基因组序列为已知序列，详见NCBI中发表的基因组序列。
质粒构建中基因测序由华大基因公司完成。基因合成由金唯智公司完成。其他未提及质粒均为市售常规质粒，电转化转入受体菌中的方法为常规方法。
其他涉及的试剂和耗材均为国产。实施例中的实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。
实施例1：一系列伯克氏菌同源重组表达质粒的构建
以λBeta或者rac RecT的氨基酸序列作为参考，BLAST分析来自伯克氏菌及其噬菌体基因组中，寻找潜在的具有重组功能的蛋白。分别在Burkholderia sp.BDU8、Burkholderia sp.TJI49和Burkholderia sp.YI23中找到了与RecET同源的核酸外切酶-重组酶的操纵子，其分别是EThe_bdu8、ETh_tji49和ETh1h2e_yi23。其中，EThe_bdu8编码四个蛋白：E_bdu8含有321个氨基酸，序列与RecE具有34％的同源性，T_bdu8含有320个氨基酸，序列与RecT具有36％的同源性，h_bdu8和e_bdu8为假设性蛋白；ETh_tji49编码三个蛋白：E_tji49含有217个氨基酸，序列与RecE具有24％的同源性，T_tji49含有339个氨基酸，序列与RecT具有34％的同源性，h_tji49为假设性蛋白；ETh1h2e_yi23编码五个蛋白：E_yi23含有271个氨基酸，序列与RecE具有34％的同源性，T_yi23含有349个氨基酸，序列与RecT具有46％的同源性，h1_yi23含有159个氨基酸，序列与Redγ具有29％的同源性，h2_yi23和e_yi23为假设性蛋白。
伯克氏菌同源重组系统一系列重组系统表达质粒以广宿主的复制子pBBR1为基础进行构建，重组功能蛋白利用鼠李糖启动子进行诱导表达。
同源重组系统系列表达质粒pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan和pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan的构建方法步骤如下：
(1)以pBBR1-Rha-redgba-kan为初始质粒，用NdeI和HindIII对其进行双酶切，将酶切目的线性片段pBBR1-Rha-kan进行胶回收；
(2)步骤(1)得到的胶回收线性片段pBBR1-Rha-kan分别与合成的带有同源臂的重组酶片段EThe_bdu8HA、ETh_tji49HA和ETh1h2e_yi23HA共转化到E.coli GB05-dir中进行线线重组；
(3)对步骤(2)得到的重组子进行酶切验证，从而得到伯克氏菌同源重组系统系列表达质粒，所述系列表达质粒分别命名为pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、其核苷酸序列如SEQID No.1所示；pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan、其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan、、其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
实施例2：Burkholderia glumae PG1电转条件的优化
Burkholderia glumae PG1电转条件的优化探索涉及如下四部分：
(1)Burkholderia glumae PG1生长曲线的测定
首先，需要测定Burkholderia glumae PG1的生长曲线，以此来确定制备感受态细胞培养的最适时长。挑取三个Burkholderia glumae PG1单克隆，分别接种至扎孔的含有1.8ml LB液体培养基的2ml EP管中，30℃，950rpm振荡培养18-24h，吸取100μl种子液加入到900μl液体LB中，吹打混匀，测OD600。吸取适量的种子液接种至含有卡那霉素(5μg/ml)的50ml LB液体培养基中，使起始OD600＝0.1，30℃，200rpm振荡培养，每隔2个小时，吸取1ml菌液测OD600，根据各时间点的OD600绘制Burkholderia glumae PG1的生长曲线，实验结果见图3A。显示当起始OD600＝0.1时，菌体在适应期过后，2小时后进入到对数生长期。
(2)不同培养时间及温度对Burkholderia glumae PG1电转效率的影响
根据Burkholderia glumae PG1的生长曲线，在对数生长期前后分别取2-3个时间点对其电转及重组培养时间进行优化。
分别吸取培养1h、1.5h、2h、2.5h和3h后的Burkholderia glumae PG1菌液1ml，测OD600，以1h的菌液中最小的OD600为标准均一OD600，用无菌水洗两次后，分别在室温及4℃制备感受态细胞，加入1μg供试质粒pBBR1-Rha-GFP-kan，进行电转。实验结果见图3B。结果表明，培养2h，室温制备感受态，OD600值为0.381，电转效率最高。
(3)不同电转缓冲液及温度对Burkholderia glumae PG1电转效率的影响
Burkholderia glumae PG1培养2h后，每个实验组分别用10％蔗糖溶液，10％甘油溶液,10％蔗糖+HEPES(SH)，10％甘油+HEPES(GH)，无菌水，洗涤2次，分别在室温及4℃制备感受态细胞，加入1μg供试质粒pBBR1-Rha-GFP-kan，进行电转。实验结果见图3C，结果表明，用10％蔗糖溶液制备感受态细胞时，电转效率最高。
(4)不同DNA量对Burkholderia glumae PG1电转效率的影响
Burkholderia glumae PG1培养2h后，10000rpm离心1min，10％蔗糖溶液洗两次，剩余40-50μl悬浮菌体，分别加入100ng、500ng、800ng、1000ng、1500ng和2000ng的供试质粒pBBR1-Rha-GFP-kan，1300V电击，30℃，950rpm复苏2h，涂布到含有卡那霉素5μg/ml的LB平板上，30℃倒置培养。实验结果见图3D。结果表明，随着DNA量的增加，获得的重组子的数目也相应增多，当外源DNA的量为1500ng时，电转效率最高。
综合以上转化效率的优化结果，本发明确定了Burkholderia glumae PG1的最优转化条件：起始OD600＝0.1的菌液，30℃，200rpm振荡培养2h至OD600值为0.381，10％蔗糖溶液室温制备感受态，外源DNA的量为1500ng。
实施例3：重组系统表达质粒在Burkholderia glumae PG1和E.coli GB2005中重组功能的检测
以如下方式将重组系统表达质粒pBBR1-Rha-redgba-kan、pBBR1-Rha-BA_7029-kan、pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan、pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan、pBBR1-Rha-TEpsy-kan、pBBR1-Rha-BAS-kan和pBBR1-Rha-GBAS-kan分别电转化至Burkholderia glumae PG1和E.coli GB2005中。
在Burkholderia glumae PG1中，以pBBR1-apra-kan为模板，其核苷酸序列见SEQID No.4，以primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-5-80和primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-3-80为引物扩增apraR，得到PCR产物apraR-LCG两端带有Burkholderia glumaePG1基因组中C1BGC4前面序列的同源臂，将纯化的apraR-LCG插入到Burkholderia glumaePG1基因组中基因BGL_RS05915的前面，进行线环重组，见图4A和4B。
primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-5-80：gagggctagatggccgcgatggatctttttcgctcgcgtcgcgagtctgtcatcaaggcgccgcaaccggcgcgcactccACGCTCAGTGGAACGAGGTT
primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-3-80：gcggcctcgagatcgcgaaccgcgagcgcgatgtggtcgaggcgccggaacgcggcggcgtcgtcgacgcggttatccatAATCTGTACCTCCTTAAGT(引物中小写字母为同源臂，大写字母为引物)。
用引物primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-5-80和primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-3-80PCR扩增片段apraR的具体做法如下：
Figure BDA0002735249420000071
Figure BDA0002735249420000081
PCR反应程序
Figure BDA0002735249420000082
在E.coli GB2005中，以pBBR1-apra-kan为模板，以primer-Apra-5和primer-Apra-3为引物扩增apraR，得到PCR产物apraR-LCP两端带有与重组系统表达质粒中重组酶编码基因两端序列的同源臂，将纯化的apraR-LCP替换重组系统表达质粒中的重组酶编码基因片段，进行线环重组，见图4C和4D。
primer-Apra-5：TTGAGATGACGCCACTGGCTG
primer-Apra-3：GCTCTGGGAGGCAGAATAAATG
用引物primer-Apra-5和primer-Apra-3 PCR扩增片段apraR的具体做法如下：
Figure BDA0002735249420000083
PCR反应程序
Figure BDA0002735249420000084
挑取3个携带重组系统表达质粒pBBR1-Rha-redgba-kan、pBBR1-Rha-BA_7029-kan、pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan、pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan、pBBR1-Rha-TEpsy-kan、pBBR1-Rha-BAS-kan或pBBR1-Rha-GBAS-kan的Burkholderiaglumae PG1或者E.coli GB2005单克隆至含有1.8ml液体LB培养基的2ml EP管中，卡那霉素的使用浓度为5μg/ml，30℃，950rpm振荡培养18-24h，吸取100μl种子液加入到900μl液体LB中，吹打混匀，测OD600。吸取适量的种子液接种至含有卡那霉素(5μg/ml)的LB液体培养基中，使起始OD600＝0.1，30℃，200rpm振荡培养2h，加入100mg/ml的鼠李糖200μl，30℃，200rpm振荡培养40min，诱导重组酶的表达。吸取1ml诱导后的菌液测OD600，按照实验组中最小值均一OD600，吸取1.3ml菌液至扎孔的1.5ml EP管中，室温下，10000rpm离心1min，弃上清，用1ml无菌水洗菌体，10000rpm离心1min，弃上清，再次用1ml无菌水洗菌体，10000rpm离心1min，轻轻吸取上清，留下30-50μl悬浮菌体。每个实验组中加入等量的纯化好的PCR产物(1μg)，混匀，转移至1mm的伯乐电极杯中，1300V电击，向电极杯中加入1ml LB液体培养基，吹打两次，吸取到先前的EP管中。30℃，950rpm复苏培养2h。吸取800μl菌体涂布至加有阿博拉霉素(5μg/ml)的LB平板上，另外吸取100μl菌液稀释105倍后，涂布至LB平板上，30℃恒温培养箱倒置培养18-24h。计菌落数，统计后比较各个重组系统的重组效率，见图4。
同源重组系统系列表达质粒pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan和pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan在Burkholderia glumae PG1中进行重组修饰后利用菌落PCR对重组修饰的正确性进行验证，见图5。
以引物check-Papra-5和check-Apra-up-3扩增5’junction PCR(625bp)。以引物check-Apra-down-5和check-Papra-3扩增3’junction PCR(651bp)。
check-Papra-5：GTCTGCCATCAATCCGTCAC
check-Apra-up-3：GACGCTACGGAAGGAGCTGTG
check-Apra-down-5：GAAGGTCCAGTCGGTCATGC
check-Papra-3：ATACTTGCCCGACTGCTCGAG
菌落PCR扩增体系
5’junction PCR
Figure BDA0002735249420000091
3’junction PCR
Figure BDA0002735249420000092
Figure BDA0002735249420000101
PCR反应程序
Figure BDA0002735249420000102
实验结果显示：
在Burkholderia glumae PG1中，pBBR1-Rha-redgba-kan、pBBR1-Rha-BA_7029-kan、pBBR1-Rha-TEpsy-kan、pBBR1-Rha-BAS-kan、pBBR1-Rha-GBAS-kan几乎没有重组功能，pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan和pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan能够发挥重组功能，而且pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan和pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan的重组效率较pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan高。
在E.coli GB2005中，所有重组系统表达质粒pBBR1-Rha-redgba-kan、pBBR1-Rha-BA_7029-kan、pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan、pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan、pBBR1-Rha-TEpsy-kan、pBBR1-Rha-BAS-kan或pBBR1-Rha-GBAS-kan都能发挥重组作用，但是，大肠杆菌来源的重组系统表达质粒pBBR1-Rha-redgba-kan的重组效率最高，伯克氏菌来源的重组系统表达质粒pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan和pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan的重组效率很低。
菌落PCR验证结果显示，所有随机挑取的单克隆均正确。表明，在Burkholderiaglumae PG1中，伯克氏菌同源重组系统系列表达质粒pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan和pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan的重组正确率都很高。
实施例4：重组系统不同组合形式表达质粒在Burkholderia glumae PG1和E.coliGB2005中重组效率比较
在重组系统挖掘的过程中，申请人发现RecET同源的核酸外切酶-重组酶的操纵子内存在一些未知蛋白编码基因(h或者e)，这些假设性蛋白可能具有与Redγ或者Pluγ相同的功能，与RecBCD系统中核酸外切酶和解旋酶相互并且抑制这些酶的活性，从而可以提高DNA的重组效率。为了研究这些假设性蛋白对重组效率的影响，我们在基因合成时，在假设性蛋白编码基因(h或者e)两端分别插入了限制性内切酶的酶切位点，然后利用相对应的限制性内切酶将pBBR1-PRha-EThe_bdu8-kan、pBBR1-PRha-ETh_tji49-kan和pBBR1-PRha-ETh1h2e_yi23-kan中的假设性蛋白编码基因分别切除，然后用T4 DNA连接酶连接，构建了一系列不同组合形式的重组系统表达质粒，具体名称如下：pBBR1-Rha-ETh_bdu8-kan、pBBR1-Rha-ETe_bdu8-kan、pBBR1-Rha-ET_bdu8-kan、pBBR1-PRha-ET_tji49-kan、pBBR1-PRha-ETh2e_yi23-kan、pBBR1-PRha-ETh1e_yi23-kan、pBBR1-PRha-ETh1h2_yi23-kan、pBBR1-PRha-ETh2_yi23-kan、pBBR1-PRha-ETh1_yi23-kan、pBBR1-PRha-ETe_yi23-kan和pBBR1-PRha-ET_yi23-kan。
除此之外，用来源于E.coli的Redγ或者来源于Pseudomonas的Pluγ替代这些假设性蛋白，采用Red/ET与ccdB反向筛选的方法，构建成不同组合形式的重组系统表达质粒，具体名称如下：pBBR1-Rha-ET-redγ_bdu8-kan、pBBR1-Rha-ET-pluγ_bdu8-kan、pBBR1-PRha-ET-redγ_tji49-kan、pBBR1-PRha-ET-pluγ_tji49-kan、pBBR1-PRha-ET-redγ_yi23-kan和pBBR1-PRha-ET-pluγ_yi23-kan。
将这些重组系统不同组合形式的表达质粒分别电转到Burkholderia glumae PG1和E.coli GB2005中，参照实施例3中实验操作的方法进行重组效率的的比较。
实验结果显示：
同源重组系统表达质粒pBBR1-PRha-EThe_bdu8-kan在Burkholderia glumae PG1中，见图6A，假设性蛋白h或者e去掉后，重组效率均降低，假设性蛋白h和e同时去掉后，与只去掉其中的一种相比，重组效率有少许提高，但是与完整的EThe_bdu8重组系统相比，重组效率是降低的，当用Redγ或者Pluγ替代假设性蛋白时，与完整的EThe_bdu8重组系统相比，重组效率均降低，说明在Burkholderia glumae PG1中假设性蛋白h和e有一定的重组功能。
同源重组系统表达质粒pBBR1-PRha-EThe_bdu8-kan在E.coli GB2005中，见图6B，假设性蛋白h去掉或者假设性蛋白h和e同时去掉后，重组效率未有变化，假设性蛋白e去掉后，重组效率有少许提高，当用Redγ替代假设性蛋白后，重组效率得到了提高，当用Pluγ替代假设性蛋白后，重组效率几乎没有变化，说明在E.coli GB2005中，假设性蛋白h不影响EThe_bdu8的重组效率，假设性蛋白e对EThe_bdu8同源重组系统有阻遏作用，Redγ可以用来提高重组效率。
同源重组系统表达质粒pBBR1-PRha-ETh_tji49-kan在Burkholderia glumae PG1中，见图6C，当去掉假设性蛋白h，或者用Redγ或者Pluγ替代假设性蛋白h后，重组效率下降了约7倍，说明在Burkholderia glumae PG1中，假设性蛋白h与DNA同源重组相关。
同源重组系统表达质粒pBBR1-PRha-ETh_tji49-kan在E.coli GB2005中，见图6D，当去掉假设性蛋白h后，以及用Pluγ替代ETh_tji49重组系统中的假设性蛋白h，重组效率并没有发生变化，当用Redγ替代假设性蛋白h后，重组效率得以提高，说明在E.coliGB2005中，假设性蛋白h无作用。
同源重组系统表达质粒pBBR1-PRha-ETh1h2e_yi23-kanETh1h2e_yi23在Burkholderia glumae PG1中，见图6E，当只去掉假设性蛋白h2时，与ETh1h2e_yi23同源重组系统相比，重组效率无明显变化，其他情况下，重组效率均降低，说明在Burkholderiaglumae PG1中，假设性蛋白h2对重组效率无影响，为了减少细胞的代谢负荷，可以将其去除，而假设性蛋白h1，e都具有一定的功能，能够帮助提高重组效率。
同源重组系统表达质粒pBBR1-PRha-ETh1h2e_yi23-kanETh1h2e_yi23在E.coliGB2005中，见图6F，当分别去掉假设性蛋白h1，h2，e时，重组效率未有明显变化，当用Redγ或者Pluγ替代假设性蛋白h1h2e后，重组效率约提高了4倍，甚至当用Pluγ替代假设性蛋白后，重组效率高于Redαβγ重组系统，说明在E.coli GB2005中假设性蛋白h1，h2，e没有功能，ETh1h2e_yi23重组系统可以和Pluγ联合应用，提高E.coli的重组效率。
实施例5：重组系统表达质粒在Burkholderia glumae PG1中重组工作条件的优化从而提高重组效率
菌体在不同的生长状态下，对外源DNA的吸收率有很大的区别，为了使重组效率满足对微生物DNA分子进行遗传修饰的要求，有必要优化重组系统的工作条件。在实施例2Burkholderia glumae PG1最佳转化条件的研究基础上，本实施例对有较高重组效率的重组系统表达质粒pBBR1-PRha-ETh_tji49-kan和pBBR1-PRha-ETh1h2e_yi23-kan进行重组工作条件的优化，以下将从培养时间、诱导时间、诱导温度、制备感受态细胞所用的电转缓冲液、制备感受态细胞的温度、DNA的用量、及同源臂的长度这七个方面进行重组工作条件的优化。
(1)培养时间对Burkholderia glumae PG1重组效率的影响
细胞对外源DNA的摄取能力对DNA分子发生同源重组的效率有很大的影响，细胞对外源DNA的摄取能力最好的时期是进入对数生长期前后，因此根据Burkholderia glumaePG1的生长曲线，来确定其最佳培养时间。将种子液转接至含有卡那霉素(5μg/ml)的20mlLB液体培养基中，使起始OD600＝0.1。30℃，200rpm振荡培养，分别测定1.5h、2h、2.5h、3h和3.5h时细菌的OD600，均一OD600与1.5h的OD600一致，诱导重组酶的表达，制备感受态细胞，加入PG1-Chrom1C4-Papra-insert-HA100 PCR产物500ng，混匀，转移至1mm电转杯中，电击，用合适的抗生素筛选重组子。
上述PG1-Chrom1C4-Papra-insert-HA100 PCR产物是以pBBR1-apra-kan为模板，以primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-HA100-5和primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-HA100-3为引物进行PCR扩增apraR得到的。
primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-HA100-5：agcgctacgagaatcagagagagggctagatggccgcgatggatctttttcgctcgcgtcgcgagtctgtcatcaaggcgccgcaaccggcgcgcactccACGCTCAGTGGAACGAGGTT
primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-HA100-3：gcacgtcgcgaaacaggtgcacggcggcctcgagatcgcgaaccgcgagcgcgatgtggtcgaggcgccggaacgcggcggcgtcgtcgacgcggttatccatAATCTGTACCTCCTTAAGT(引物中小写字母为同源臂，大写字母为引物)。
具体PCR反应体系及反应程序同实施例3。
实验结果见图7A和8A，结果表明，当转接时间为2h，pBBR1-PRha-ETh_tji49-kan和pBBR1-PRha-ETh1h2e_yi23-kan的重组效率达到最高，随着培养时间的增加，其重组效率不增反降，证明细菌对外源DNA的摄取能力与其培养时间有关。
(2)诱导时间对Burkholderia glumae PG1重组效率的影响
通过可诱导型启动子控制同源重组酶的表达，在需要重组酶发挥作用时，可以通过加入诱导剂诱导重组酶的表达，在不需要重组酶时，只要不加入诱导剂即可，这样做一方面可以减少细菌的代谢负荷，另一方面可以减少不必要的分子重组。通过控制诱导重组酶表达的时间，可以使重组酶积累到能够发挥作用的浓度，当诱导表达时间和诱导剂浓度最适时，重组效率会达到最大值。具体的，将种子液转接至含有卡那霉素(5μg/ml)的20ml LB液体培养基中，将起始OD600＝0.1的菌液培养2h后，加入鼠李糖诱导重组酶的表达，分别在诱导20min、40min、60min和80min后，取适量菌液至1.5ml EP管中，均一OD600与20min时的OD600一致，制备感受态细胞，加入PG1-Chrom1C4-Papra-insert-HA100 PCR产物500ng，混匀，转移至1mm电转杯中，电击，用合适的抗生素筛选重组子。
实验结果见图7B和8B，结果表明，当诱导时间为60min时，pBBR1-PRha-ETh_tji49-kan和pBBR1-PRha-ETh1h2e_yi23-kan的重组效率达到最高。
(3)诱导温度对Burkholderia glumae PG1重组效率的影响
菌体生长及蛋白质的表达都有其最适温度，重组酶的表达也有最适温度，所以可以通过研究重组酶不同的诱导时间，来确定重组酶最适表达温度，以此获得较高的重组效率。将起始OD600＝0.1的菌液培养2h后，分别在28℃、30℃、35℃、37℃和39℃，加入鼠李糖诱导重组酶的表达。
实验结果见图7C和8C，结果表明，当在35℃诱导时，pBBR1-PRha-ETh_tji49-kan和pBBR1-PRha-ETh1h2e_yi23-kan的重组效率最高。
(4)电转缓冲液对Burkholderia glumae PG1重组效率的影响
用不同的缓冲液处理细胞，会导致细胞膜的渗透性有所不同,因此可通过用不同的缓冲液处理菌体,增加细胞膜的通透性来提高细胞对外源DNA的摄取量，从而提高重组效率。将起始OD600＝0.1的菌液培养2h后，在35℃加入鼠李糖诱导重组酶表达60min后，选择5种电转缓冲液10％蔗糖溶液，10％甘油，无菌水，10％蔗糖溶液加HEPES(GH)，10％甘油加HEPES(SH)，分别在室温以及冰上制备感受态细胞。
实验结果见图7D和8D，结果表明，pBBR1-PRha-ETh_tji49-kan，在4℃条件下，用4℃10％甘油溶液制备感受态细胞，重组效率最高。pBBR1-PRha-ETh1h2e_yi23-kan，在4℃条件下，用4℃的双蒸去离子水制备感受态细胞，重组效率最高。
(5)外源DNA的量对Burkholderia glumae PG1重组效率的影响
细胞对外源DNA的摄取量有一定的阈值，当其容量达到饱和时，多余的DNA就不能被吸收，所以通过研究加入外源DNA的量对重组效率的影响，可以大大减少实验材料的浪费。将起始OD600＝0.1的菌液培养2h后，在35℃加入鼠李糖诱导重组酶表达60min后，低温制备感受态细胞，用冷的10％甘油溶液洗含有pBBR1-PRha-ETh_tji49-kan的细胞，用冷的无菌水洗含有pBBR1-PRha-ETh1h2e-kan的细胞，分别加入PG1-Chrom1C4-Papra-insert-HA100PCR产物100ng、500ng、1000ng、1500ng和2000ng。
实验结果见图7E和8E，随着外源DNA量的增加，其重组效率也有所增加，但是到达一定量后，重组效率变化不大，当外源DNA的量为800–2000ng时，pBBR1-PRha-ETh_tji49-kan和pBBR1-PRha-ETh1h2e_yi23-kan的重组效率变化不大。pBBR1-PRha-ETh_tji49-kan，当加入100ng的PCR产物时，就可获得可进行下步操作数量的重组子。pBBR1-PRha-ETh1h2e_yi23-kan，当加入500ng的PCR产物，可获得满足实验操作的重组子。所以，外源DNA的量的范围在500–1000ng。
(6)同源臂长度对Burkholderia glumae PG1重组效率的影响
Red重组系统由三种蛋白组成：RecE和Redα蛋白是核酸外切酶，结合在双链DNA的末端，从5’端向3’端降解DNA，产生3’末端或单链DNA；RecT和Redβ是单链DNA结合蛋白，并介导互补单链DNA退火；Redγ蛋白与RecBCD蛋白结合，抑制其降解外源DNA的活性。具有核酸外切酶活性的RecE和Redα蛋白其识别序列的长度有一定的范围，并不是同源臂越长越好。因此可以通过研究同源臂的长度对重组效率的影响，可以缩短同源臂的使用。本发明中使用的同源臂长度分别为50bp、100bp、125bp、150bp。
实验结果见图7F和8F，pBBR1-PRha-ETh_tji49-kan和pBBR1-PRha-ETh1h2e-yi23-kan重组酶，当同源臂长度为50bp时，就可满足重组需要。当同源臂长度为125bp时，pBBR1-PRha-ETh_tji49-kan重组效率达到最大。当同源臂长度为150bp时，pBBR1-PRha-ETh1h2e-kan重组效率达到最大。
用于重组的不同长度同源臂PCR产物以pBBR1-apra-kan为模板对apraR进行PCR扩增得到。具体如下：
PG1-Chrom1C4-Papra-insert-HA50 PCR产物是以pBBR1-apra-kan为模板，以primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-5-50和primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-3-50为引物进行PCR扩增apraR得到的。
PG1-Chrom1C4-Papra-insert-HA125 PCR产物是以pBBR1-apra-kan为模板，以primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-5-125和primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-3-125为引物进行PCR扩增apraR得到的。
PG1-Chrom1C4-Papra-insert-HA150 PCR产物是以pBBR1-apra-kan为模板，以primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-5-150和primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-3-150为引物进行PCR扩增apraR得到的。
primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-5-50：cgctcgcgtcgcgagtctgtcatcaaggcgccgcaaccggcgcgcactccACGCTCAGTGGAACGAGGTT
primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-3-50：gcgatgtggtcgaggcgccggaacgcggcggcgtcgtcgacgcggttatccatAATCTGTACCTCCTTAAGT
primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-5-125：ggggcaatttgaccatgtcgaatgcAGCGCTACGAGAATCAGAGAG
primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-3-125：aggcggcgcttgagcgcgaagccgaGCACGTCGCGAAACAGGTG
primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-5-150：gcgtggcgtccggcgcgtgttgacaggggcaatttgaccatgtcgaatgcAGCGCTACGAGAATCAGAGAG
primer-PG1-chrom1C4-Papra-insert-3-150：gcccgtgcgcgcgcccttgatctgcaggcggcgcttgagcgcgaagccgaGCACGTCGCGAAACAGGTG(引物中小写字母为同源臂，大写字母为引物)。
具体PCR反应体系及反应程序同实施例3。
重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan在Burkholderia glumae PG1中进行重组修饰后利用菌落PCR对重组修饰的正确性进行验证。
以引物check-Papra-5(GTCTGCCATCAATCCGTCAC)和check-Apra-up-3(GACGCTACGGAAGGAGCTGTG)扩增5’junction PCR(625bp)。
以引物check-Apra-down-5(GAAGGTCCAGTCGGTCATGC)和check-Papra-3(ATACTTGCCCGACTGCTCGAG)扩增3’junction PCR(651bp)。
以引物check-Papra-5(GTCTGCCATCAATCCGTCAC)和check-Papra-3(ATACTTGCCCGACTGCTCGAG)扩增全长PCR(1815bp)。
具体菌落PCR反应体系及反应程序同实施例3。
实验结果显示：
重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan在Burkholderia glumae PG1中最佳重组条件：起始OD600＝0.1，转接2h，35℃诱导时间为60min，在4℃条件下，用4℃的10％甘油溶液制备感受态细胞，外源DNA的量的范围在500–1000ng，同源臂长度为125bp。
重组系统表达质粒pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan在Burkholderia glumae PG1中最佳重组条件：起始OD600＝0.1，转接2h，35℃诱导时间为60min，在4℃条件下，用4℃的双蒸去离子水制备感受态细胞，外源DNA的量的范围在500–1000ng，同源臂长度为150bp。
菌落PCR结果显示，所有随机挑取的单克隆均正确。
实施例6：利用伯克氏菌新型重组系统激活伯克氏菌Burkholderia plantarriDSM9509中的沉默基因簇的应用
(1)Burkholderiaplantarri DSM9509的电转步骤
挑取单克隆接种至含有1.8ml的CYMG液体培养基的2ml的EP管中，30℃，950rpm振荡培养16–18h。吸取40μl种子液接种至含有1.3ml的CYMG液体培养基的1.5ml EP管中，30℃，950rpm振荡培养3h。10000rpm离心1min，弃上清，加入1ml的10％蔗糖溶液悬浮细胞，10000rpm离心1min，弃上清。重复步骤3。留下40–50μl溶液悬浮细胞。加入重组酶质粒pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan 500ng，混匀，转移至1mm的电极杯中。1300V电击，向电极杯中加入1ml液体CYMG培养基，吹打两次，转移至1.5ml的EP管中。30℃，950rpm振荡培养2h。8000rpm离心1min，弃去部分上清，留下100μl悬浮菌体，三区划线至含有卡那霉素(10μg/mL)的CYMG固体培养基上，30℃很稳培养箱导致培养24–36h。挑取单克隆验证。
用同样方法选择另外一个质粒的重复试验时候，具有同样效果。
(2)在Burkholderiaplantarri DSM9509中进行重组
挑取含有重组酶的单菌落接种至含有1.3ml的CYMG液体培养基的中间扎孔的1.5ml EP管中，30℃，950rpm振荡培养16–18h。吸取适量的种子液接种至1.3ml的CYMG液体培养基中间扎孔的1.5ml EP管中，30℃，950rpm振荡培养3h。加入100mg/ml的鼠李糖20μl，35℃，950rpm振荡培养60min，诱导Burkholderiaplantarri DSM9509中Red/ET同源重组酶的表达。按照上述Burkholderiaplantarri DSM9509电转步骤，加入相应的用于基因插入的PCR产物DSM9509-chrom1C4-Papra-insert和基因敲除的PCR产物DSM9509-chrom1C4-KO500ng，电转，进行同源重组操作。选择合适抗性的固体平板筛选重组子。
重组过程中，用于基因插入的PCR产物DSM9509-chrom1C4-Papra-insert以pBBR1-apra-kan为模板，以如下引物对进行扩增得到：
primer-DSM9509-chrom1C4-Papra-insert-5：cttgcacgccgacgcgccggcacgcccgcgcgcggcgttcgcgcgccccaatgcgcactctcgtttggcaggacagatccACGCTCAGTGGAACGAGGTT
primer-DSM9509-chrom1C4-Papra-insert-3：gcgatgtcaacggccgcgccgtcccgcggggtctcggcgcgatcggccgtgcgggccgcgtcccgggagagtctgtccatAATCTGTACCTCCTTAAGTCAG
重组过程中，用于基因敲除的PCR产物DSM9509-chrom1C4-KO以pBBR1-apra-kan为模板，以如下引物对进行扩增得到：
primer-DSM9509-chrom1C4-KO-5：tcgatgaggtgagcgtagccgcgcaagcggcgctgccgcccttgagcgccgccgacgtggcacgcctgcctgccgacgtgACGCTCAGTGGAACGAGGTT
primer-DSM9509-chrom1C4-KO-3：tcgacgtcggccggcagcttcgcgcggtcggcttcgccgagcgagagcgccgagccgtcctgcgtggggctgacttcatcAATCTGTACCTCCTTAAGTCAG(引物中小写字母为同源臂，大写字母为引物)。具体PCR反应体系及反应程序同实施例3。
对遗传操作突变菌株挑取单菌落进行菌落PCR验证，见图9B。
以引物check-DSM9509-chrom1C4-Papra-insert-5(GCGGCATGCGTTCGGATCTC)和check-Apra-up-3扩增5’junction PCR(730bp)。
以引物check-Apra-down-5和check-DSM9509-chrom1C4-Papra-insert-3(GAGCGACTCGATCAGCGACG)扩增3’junction PCR(748bp)。
以引物check-DSM9509-chrom1C4-KO-5(CACTTCGTGACGCTCGACCG)和check-Apra-up-3扩增5’junction PCR(699bp)。
以引物check-Apra-down-5和check-DSM9509-chrom1C4-KO-3(GATACGCGCCGAACAGCTCG)扩增3’junction PCR(730bp)。
具体菌落PCR反应体系及反应程序同实施例3。
(3)发酵产物的检测及鉴定
对测序结果正确的单菌落进行发酵，挑取单菌落接种至含有相应抗生素的1.3ml的CYMG液体培养基的盖中间扎孔的1.5ml EP管中，30℃，950rpm振荡培养16–18h获得种子液，按照种子液：培养基＝1：50的比例，将种子液接种到含有相应抗生素的50ml的CYMG液体培养基的锥形瓶中，30℃，200rpm振荡培养48h，加入1ml的XD–600树脂进行吸附，30℃，200rpm振荡培养12h。8000rpm离心10min，弃上清。加入30ml甲醇洗脱化合物，30℃，200rpm振荡培养3–4h。将甲醇蒸干，用1ml甲醇溶解化合物。0.22μm滤膜过滤之后取3μl用于HPLC-MS分析。
高效液相色谱仪型号为Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 system。色谱条件为：Thermo ScientificTMAcclaimTMC18 column(2.1×100mm,2.2μm)；溶剂A为超纯水(0.1％三氟乙酸)和B乙腈(0.1％三氟乙酸)；溶剂梯度为，0–5min，5％B，5–20min，5％–95％B，20–25min，95％B；柱流速是0.30ml/min。高分辨质谱仪的型号为Bruker amaZon SL，ESI-Ion trap MS(电喷雾离子肼质谱仪)。质谱条件：Auto MS2，Mass range(70–2000)，precursor ion 2。
采用Data Analysis软件对采集到的液质数据进行分析。
以野生菌株Burkholderiaplantarri DSM9509的提取物为阴性对照，通过BPC图谱(图9C)比较发现，在工程菌株DSM5029-Papra-C1BGC4 activiation中有7个新峰，对应着7个次生代谢产物：1m/z[M+H]+759、2m/z[M+H]+743、3m/z[M+H]+757、4m/z[M+H]+809、5m/z[M+H]+793、6m/z[M+H]+773和7m/z[M+H]+757(图9D)。通过对这7个化合物进行分离纯化以及利用各种波谱技术对其结构进行解析，最后鉴定这类化合物为非核糖体多肽类化合物，其中化合物1(haereoplantin F)、2(haereoplantin G)和3(haereoplantin H)为新化合物。
序列表
<110> 山东大学
<120>伯克氏菌同源重组系统及其应用
<141> 2020-10-20
<160>4
<210> 1
<211> 9279
<212> DNA
<213> 人工序列
<221>pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan的核苷酸序列
<222>（1）…（9279）
<400>1
ctaccggcgc ggcagcgtga cccgtgtcgg cggctccaac ggctcgccat cgtccagaaa 60
acacggctca tcgggcatcg gcaggcgctg ctgcccgcgc cgttcccatt cctccgtttc 120
ggtcaaggct ggcaggtctg gttccatgcc cggaatgccg ggctggctgg gcggctcctc 180
gccggggccg gtcggtagtt gctgctcgcc cggatacagg gtcgggatgc ggcgcaggtc 240
gccatgcccc aacagcgatt cgtcctggtc gtcgtgatca accaccacgg cggcactgaa 300
caccgacagg cgcaactggt cgcggggctg gccccacgcc acgcggtcat tgaccacgta 360
ggccgacacg gtgccggggc cgttgagctt cacgacggag atccagcgct cggccaccaa 420
gtccttgact gcgtattgga ccgtccgcaa agaacgtccg atgagcttgg aaagtgtctt 480
ctggctgacc accacggcgt tctggtggcc catctgcgcc acgaggtgat gcagcagcat 540
tgccgccgtg ggtttcctcg caataagccc ggcccacgcc tcatgcgctt tgcgttccgt 600
ttgcacccag tgaccgggct tgttcttggc ttgaatgccg atttctctgg actgcgtggc 660
catgcttatc tccatgcggt agggtgccgc acggttgcgg caccatgcgc aatcagctgc 720
aacttttcgg cagcgcgaca acaattatgc gttgcgtaaa agtggcagtc aattacagat 780
tttctttaac ctacgcaatg agctattgcg gggggtgccg caatgagctg ttgcgtaccc 840
ccctttttta agttgttgat ttttaagtct ttcgcatttc gccctatatc tagttctttg 900
gtgcccaaag aagggcaccc ctgcggggtt cccccacgcc ttcggcgcgg ctccccctcc 960
ggcaaaaagt ggcccctccg gggcttgttg atcgactgcg cggccttcgg ccttgcccaa 1020
ggtggcgctg cccccttgga acccccgcac tcgccgccgt gaggctcggg gggcaggcgg 1080
gcgggcttcg ccttcgactg cccccactcg cataggcttg ggtcgttcca ggcgcgtcaa 1140
ggccaagccg ctgcgcggtc gctgcgcgag ccttgacccg ccttccactt ggtgtccaac 1200
cggcaagcga agcgcgcagg ccgcaggccg gaggcttttc cccagagaaa attaaaaaaa 1260
ttgatggggc aaggccgcag gccgcgcagt tggagccggt gggtatgtgg tcgaaggctg 1320
ggtagccggt gggcaatccc tgtggtcaag ctcgtgggca ggcgcagcct gtccatcagc 1380
ttgtccagca gggttgtcca cgggccgagc gaagcgagcc agccggtggc cgctcgcggc 1440
catcgtccac atatccacgg gctggcaagg gagcgcagcg accgcgcagg gcgaagcccg 1500
gagagcaagc ccgtagggcg ccgcagccgc cgtaggcggt cacgactttg cgaagcaaag 1560
tctagtgagt atactcaagc attgagtggc ccgccggagg caccgccttg cgctgccccc 1620
gtcgagccgg ttggacacca aaagggaggg gcaggcatgg cggcatacgc gatcatgcga 1680
tgcaagaagc tggcgaaaat gggcaacgtg gcggccagtc tcaagcacgc ctaccgcgag 1740
cgcgagacgc ccaacgctga cgccagcagg acgccagaga acgagcactg ggcggccagc 1800
agcaccgatg aagcgatggg ccgactgcgc gagttgctgc cagagaagcg gcgcaaggac 1860
gctgtgttgg cggtcgagta cgtcatgacg gccagcccgg aatggtggaa gtcggccagc 1920
caagaacagc aggcggcgtt cttcgagaag gcgcacaagt ggctggcgga caagtacggg 1980
gcggatcgca tcgtgacggc cagcatccac cgtgacgaaa ccagcccgca catgaccgcg 2040
ttcgtggtgc cgctgacgca ggacggcagg ctgtcggcca aggagttcat cggcaacaaa 2100
gcgcagatga cccgcgacca gaccacgttt gcggccgctg tggccgatct agggctgcaa 2160
cggggcatcg agggcagcaa ggcacgtcac acgcgcattc aggcgttcta cgaggccctg 2220
gagcggccac cagtgggcca cgtcaccatc agcccgcaag cggtcgagcc acgcgcctat 2280
gcaccgcagg gattggccga aaagctggga atctcaaagc gcgttgagac gccggaagcc 2340
gtggccgacc ggctgacaaa agcggttcgg caggggtatg agcctgccct acaggccgcc 2400
gcaggagcgc gtgagatgcg caagaaggcc gatcaagccc aagagacggc ccgagacctt 2460
cgggagcgcc tgaagcccgt tctggacgcc ctggggccgt tgaatcggga tatgcaggcc 2520
aaggccgccg cgatcatcaa ggccgtgggc gaaaagctgc tgacggaaca gcgggaagtc 2580
cagcgccaga aacaggccca gcgccagcag gaacgcgggc gcgcacattt ccccgaaaag 2640
tgccacctgg gatgaatgtc agctactggg ctatctggac aagggaaaac gcaagcgcaa 2700
agagaaagca ggtagcttgc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat 2760
ggacagcaag cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct 2820
gcaaagtaaa ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagat 2880
ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag 2940
gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg 3000
gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca 3060
agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc 3120
tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg 3180
actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg 3240
ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta 3300
cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag 3360
ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac 3420
tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg 3480
atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg 3540
gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg 3600
aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg 3660
attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg 3720
gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg attccaccgc 3780
cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct 3840
ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc catgggcaaa tattatacgc 3900
aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt tgtgatggct 3960
tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac aacagttttt atgcattaat ctttctgcga 4020
attgagatga cgccactggc tgggcgtcat cccggtttcc cgggtaaaca ccaccgaaaa 4080
atagttacta tcttcaaagc cacattcggt cgaaatatca ctgattaaca ggcggctatg 4140
ctggagaaga tattgcgcat gacacactct gacctgtcgc agatattgat tgatggtcat 4200
tccagtctgc tggcgaaatt gctgacgcaa aacgcgctca ctgcacgatg cctcatcaca 4260
aaatttatcc agcgcaaagg gacttttcag gctagccgcc agccgggtaa tcagcttatc 4320
cagcaacgtt tcgctggatg ttggcggcaa cgaatcactg gtgtaacgat ggcgattcag 4380
caacatcacc aactgcccga acagcaactc agccatttcg ttagcaaacg gcacatgctg 4440
actactttca tgctcaagct gaccgataac ctgccgcgcc tgcgccatcc ccatgctacc 4500
taagcgccag tgtggttgcc ctgcgctggc gttaaatccc ggaatcgccc cctgccagtc 4560
aagattcagc ttcagacgct ccgggcaata aataatattc tgcaaaacca gatcgttaac 4620
ggaagcgtag gagtgtttat cgtcagcatg aatgtaaaag agatcgccac gggtaatgcg 4680
ataagggcga tcgttgagta catgcaggcc attaccgcgc cagacaatca ccagctcaca 4740
aaaatcatgt gtatgttcag caaagacatc ttgcggataa cggtcagcca cagcgactgc 4800
ctgctggtcg ctggcaaaaa aatcatcttt gagaagtttt aactgatgcg ccaccgtggc 4860
tacctcggcc agagaacgaa gttgattatt cgcaatatgg cgtacaaata cgttgagaag 4920
attcgcgtta ttgcagaaag ccatcccgtc cctggcgaat atcacgcggt gaccagttaa 4980
actctcggcg aaaaagcgtc gaaaagtggt tactgtcgct gaatccacag cgataggcga 5040
tgtcagtaac gctggcctcg ctgtggcgta gcagatgtcg ggctttcatc agtcgcaggc 5100
ggttcaggta tcgctgaggc gtcagtcccg tttgctgctt aagctgccga tgtagcgtac 5160
gcagtgaaag agaaaattga tccgccacgg catcccaatt cacctcatcg gcaaaatggt 5220
cctccagcca ggccagaagc aagttgagac gtgatgcgct gttttccagg ttctcctgca 5280
aactgctttt acgcagcaag agcagtaatt gcataaacaa gatctcgcga ctggcggtcg 5340
agggtaaatc attttcccct tcctgctgtt ccatctgtgc aaccagctgt cgcacctgct 5400
gcaatacgct gtggttaacg cgccagtgag acggatactg cccatccagc tcttgtggca 5460
gcaactgatt cagcccggcg agaaactgaa atcgatccgg cgagcgatac agcacattgg 5520
tcagacacag attatcggta tgttcataca gatgccgatc atgatcgcgt acgaaacaga 5580
ccgtgccacc ggtgatggta tagggctgcc cattaaacac atgaataccc gtgccatgtt 5640
cgacaatcac aatttcatga aaatcatgat gatgttcagg aaaatccgcc tgcgggagcc 5700
ggggttctat cgccacggac gcgttaccag acggaaaaaa atccacacta tgtaatacgg 5760
tcatactggc ctcctgatgt cgtcaacacg gcgaaatagt aatcacgagg tcaggttctt 5820
accttaaatt ttcgacggaa aaccacgtaa aaaacgtcga tttttcaaga tacagcgtga 5880
attttcagga aatgcggtga gcatcacatc accacaattc agcaaattgt gaacatcatc 5940
acgttcatct ttccctggtt gccaatggcc cattttcctg tcagtaacga gaaggtcgcg 6000
aattcaggcg ctttttagac tggtcgtaat gaacaattct taagaaggag atatacatat 6060
gtccgaaatg aatcgccttg gcttcatcgg cggcagcgac gttgccgcca tccttggtgt 6120
aagcccgtgg aaaacgccgc acgaactgtg gcttcagaag acgggccgcg cgccgcgcga 6180
agaagtcacg cctgagcaac aaaagcgctt cgaccgtggt caccgcctgg agccggtcgt 6240
gctgcaaatg ctcatcgatc gcctcgagga tgaagggatc gaagtcgagc tcatgcgcac 6300
gaacaagcgc tacaccgatg ccgaacatcc ctttttggcg tgtgagatcg acttcgagct 6360
gcgcgtgaca ggcgaaatcg aaatcgccgg cgaactggtc cagttctcgg gcgagcatat 6420
caatggcgac tgcaagacgg tgcacccgtt cgctgcgaag aagtggggcg aagaaggaac 6480
cgacgaagtg ccgatcgatt acgccgcgca gttcatgcac ggcctcggca tcactggccg 6540
tgacttctgc atcgtggcaa ccctcatcgg catggacgac ctgctcattt attgggtgaa 6600
gcgcgaccaa gaaaccatcg acggtattcg cagccacgtc gtggaattct ggaacgaatg 6660
cgtgctcgcc gacgtggcgc ccgacccgat cgacttcgac gactgcaagg cgatctacgc 6720
gaagagcaac ggcggctcaa tcgaagcaaa caccgagatc cgcgacgcag tgttcaacct 6780
gatcgacgtg aaagccaaga tcaagatcct agaagcgtcc gaagaggaat tgagctatcg 6840
catcacggcg tatatgcagc ccaacgcggt tctcacggcc ggtggcaaca cgatcgccac 6900
gtggaagaac cagaacgata cgcgcatcga ccagaagctg ctgaaggatg acgcacccga 6960
ggtctacgcg aagtactcgc gtacgaagga aatccgcgtg ctgcgtcttt cgaagatcaa 7020
gtaaaggagg cagctatatg agcaccgccc aactgaagca agtcgcaacc ggcaagaaag 7080
acaatccggt tgcttcgttc agcagcttcc tcgacaagtt caagccgcag atggcgctcg 7140
cgctgccgaa gcacctgacg gcggatcgca tggcgcgcct cgccgtgacc gcgttcagct 7200
cgacgccgaa gctgcaggag tgcgagccga agacgatcgt cgccggaatc atgacggccg 7260
cgacgctcgg cctcgagatc ggcgtcgacg gtcaaggctt cctcgtgccg tacggccgca 7320
cgtgccagtt cgtgccgggc tggaaaggtc tcgtcgacct ggtgtcgcgt agcggccgcg 7380
caaccgtctg gacgggcgct gtattcgagg gcgacgagtt cgactatgcc ctcggcgatt 7440
cgccgttcat tcgccatcgc ccgggcgaag agaacgatcc ggacaagatc acgcacgtgt 7500
atgcagtcgg ccgcgtgaac ggttcggact acccggtgat cgaagtctgg accattagga 7560
aggtctggaa gcaccgtgac aagtacaaca aggtcggcgc gaagcactac agcttccgcg 7620
acccggaaat gtacgcgcgc aaagtgccgc tgctgcaggt gctcaagtac atgccgaaat 7680
cgatcgaact acagaatgca atggcgatcg cgaacgcagc cgataacggc catcacgccg 7740
tcatcgacgg aaacttcgtc acggtcaccg atccggatac cggcgcgacg gtcgatccat 7800
cgactggcga actcactgac cagcgtgcgc agcagtccga catgacgctg cccgcctacg 7860
acgacctgct cggccagatc cagaaagcag acgacgtcga ggtactggcg ctcgtgatgg 7920
acagcgcacg cgatctccct gccgatcagc tcacgaagct gaaacaggca tacgaagatc 7980
gcaaagaagt cctgatgtga ttatctagaa ggaggggtac ctatgaaacc catcctcttc 8040
tacgacaccg aaacgaacgg cctgccgctg tggaacgagc catccaacca tcctagccaa 8100
ccgcacatca cgcaacttgc ggccgagctt ttcgatgccg atagtggacg cacactcgcg 8160
ttcatggatc tgatgatccg accggaagat tggacgattc cggaggagct tgagcagctc 8220
accggaatca cgaacgatct cgcacatcgc ttcggccatt cgctgaatca tgcgctcggc 8280
acgttcatct gcatgtggtc ggaagccgag ctgcgcgtcg cgcacaacga atcgttcgac 8340
caacgtctcg tgcgcattgc cgcgatgcgc gcgctcggcg cggaccacgg tttccacgag 8400
gactggaaga agggagccgt cttctgcacg cagacgaaca gcacgaagat tctgaatctg 8460
ccgccgaccg agaagatggt gcgtgcaggc cgcaaccatg cgaagtcgcc gaacctcgcc 8520
gaagcctacg aatttttcac cggcaaaaaa ctcgagggcg cacataacgc cgcggtagat 8580
ctggcggcat gcaaggccgt ctacttcggc atccaaactc atcatgaagc gatggcctcg 8640
tgaggatcca ggaggggtac ctatgaccaa caccaaatac gaaaagctcg atgcgctgat 8700
cctctcgaag atcggcgtcg ccccgatcaa attcgcatcg atacacagtg gcgatatcga 8760
agacgagagc aaccgaatcg tctcggaaca aggccctcac tcgttatatg gtttcaccga 8820
tccatggcgc atcgtcgatc gccgccttca gtcgcttcgc aaggccggaa agatccgctc 8880
gacaccgaag ggatgggttc ggacggcacc acaaaagccg tagggatcct ctagacccag 8940
cccgcctaat gagcgggctt ttttttgaac aaagcttacc ggtttattga ctaccggaag 9000
cagtgtgacc gtgtgcttct caaatgcctg aggccagttt gctcaggctc tccccgtgga 9060
ggtaataatt gacgatatga tcatttattc tgcctcccag agcctgataa aaacggtgaa 9120
tccgttagcg aggtgccgcc ggcttccatt caggtcgagg tggcccggct ccatgcaccg 9180
cgacgcaacg cggggaggca gacaaggtat agggcggcga ggcggctaca gccgatagtc 9240
tggaacagcg cacttacggg ttgctgcgca acccaagtg 9279
<210> 2
<211> 8294
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan 的核苷酸序列
<222>（1）…（8294）
<400> 2
ctaccggcgc ggcagcgtga cccgtgtcgg cggctccaac ggctcgccat cgtccagaaa 60
acacggctca tcgggcatcg gcaggcgctg ctgcccgcgc cgttcccatt cctccgtttc 120
ggtcaaggct ggcaggtctg gttccatgcc cggaatgccg ggctggctgg gcggctcctc 180
gccggggccg gtcggtagtt gctgctcgcc cggatacagg gtcgggatgc ggcgcaggtc 240
gccatgcccc aacagcgatt cgtcctggtc gtcgtgatca accaccacgg cggcactgaa 300
caccgacagg cgcaactggt cgcggggctg gccccacgcc acgcggtcat tgaccacgta 360
ggccgacacg gtgccggggc cgttgagctt cacgacggag atccagcgct cggccaccaa 420
gtccttgact gcgtattgga ccgtccgcaa agaacgtccg atgagcttgg aaagtgtctt 480
ctggctgacc accacggcgt tctggtggcc catctgcgcc acgaggtgat gcagcagcat 540
tgccgccgtg ggtttcctcg caataagccc ggcccacgcc tcatgcgctt tgcgttccgt 600
ttgcacccag tgaccgggct tgttcttggc ttgaatgccg atttctctgg actgcgtggc 660
catgcttatc tccatgcggt agggtgccgc acggttgcgg caccatgcgc aatcagctgc 720
aacttttcgg cagcgcgaca acaattatgc gttgcgtaaa agtggcagtc aattacagat 780
tttctttaac ctacgcaatg agctattgcg gggggtgccg caatgagctg ttgcgtaccc 840
ccctttttta agttgttgat ttttaagtct ttcgcatttc gccctatatc tagttctttg 900
gtgcccaaag aagggcaccc ctgcggggtt cccccacgcc ttcggcgcgg ctccccctcc 960
ggcaaaaagt ggcccctccg gggcttgttg atcgactgcg cggccttcgg ccttgcccaa 1020
ggtggcgctg cccccttgga acccccgcac tcgccgccgt gaggctcggg gggcaggcgg 1080
gcgggcttcg ccttcgactg cccccactcg cataggcttg ggtcgttcca ggcgcgtcaa 1140
ggccaagccg ctgcgcggtc gctgcgcgag ccttgacccg ccttccactt ggtgtccaac 1200
cggcaagcga agcgcgcagg ccgcaggccg gaggcttttc cccagagaaa attaaaaaaa 1260
ttgatggggc aaggccgcag gccgcgcagt tggagccggt gggtatgtgg tcgaaggctg 1320
ggtagccggt gggcaatccc tgtggtcaag ctcgtgggca ggcgcagcct gtccatcagc 1380
ttgtccagca gggttgtcca cgggccgagc gaagcgagcc agccggtggc cgctcgcggc 1440
catcgtccac atatccacgg gctggcaagg gagcgcagcg accgcgcagg gcgaagcccg 1500
gagagcaagc ccgtagggcg ccgcagccgc cgtaggcggt cacgactttg cgaagcaaag 1560
tctagtgagt atactcaagc attgagtggc ccgccggagg caccgccttg cgctgccccc 1620
gtcgagccgg ttggacacca aaagggaggg gcaggcatgg cggcatacgc gatcatgcga 1680
tgcaagaagc tggcgaaaat gggcaacgtg gcggccagtc tcaagcacgc ctaccgcgag 1740
cgcgagacgc ccaacgctga cgccagcagg acgccagaga acgagcactg ggcggccagc 1800
agcaccgatg aagcgatggg ccgactgcgc gagttgctgc cagagaagcg gcgcaaggac 1860
gctgtgttgg cggtcgagta cgtcatgacg gccagcccgg aatggtggaa gtcggccagc 1920
caagaacagc aggcggcgtt cttcgagaag gcgcacaagt ggctggcgga caagtacggg 1980
gcggatcgca tcgtgacggc cagcatccac cgtgacgaaa ccagcccgca catgaccgcg 2040
ttcgtggtgc cgctgacgca ggacggcagg ctgtcggcca aggagttcat cggcaacaaa 2100
gcgcagatga cccgcgacca gaccacgttt gcggccgctg tggccgatct agggctgcaa 2160
cggggcatcg agggcagcaa ggcacgtcac acgcgcattc aggcgttcta cgaggccctg 2220
gagcggccac cagtgggcca cgtcaccatc agcccgcaag cggtcgagcc acgcgcctat 2280
gcaccgcagg gattggccga aaagctggga atctcaaagc gcgttgagac gccggaagcc 2340
gtggccgacc ggctgacaaa agcggttcgg caggggtatg agcctgccct acaggccgcc 2400
gcaggagcgc gtgagatgcg caagaaggcc gatcaagccc aagagacggc ccgagacctt 2460
cgggagcgcc tgaagcccgt tctggacgcc ctggggccgt tgaatcggga tatgcaggcc 2520
aaggccgccg cgatcatcaa ggccgtgggc gaaaagctgc tgacggaaca gcgggaagtc 2580
cagcgccaga aacaggccca gcgccagcag gaacgcgggc gcgcacattt ccccgaaaag 2640
tgccacctgg gatgaatgtc agctactggg ctatctggac aagggaaaac gcaagcgcaa 2700
agagaaagca ggtagcttgc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat 2760
ggacagcaag cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct 2820
gcaaagtaaa ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagat 2880
ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag 2940
gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg 3000
gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca 3060
agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc 3120
tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg 3180
actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg 3240
ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta 3300
cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag 3360
ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac 3420
tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg 3480
atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg 3540
gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg 3600
aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg 3660
attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg 3720
gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg attccaccgc 3780
cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct 3840
ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc catgggcaaa tattatacgc 3900
aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt tgtgatggct 3960
tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac aacagttttt atgcattaat ctttctgcga 4020
attgagatga cgccactggc tgggcgtcat cccggtttcc cgggtaaaca ccaccgaaaa 4080
atagttacta tcttcaaagc cacattcggt cgaaatatca ctgattaaca ggcggctatg 4140
ctggagaaga tattgcgcat gacacactct gacctgtcgc agatattgat tgatggtcat 4200
tccagtctgc tggcgaaatt gctgacgcaa aacgcgctca ctgcacgatg cctcatcaca 4260
aaatttatcc agcgcaaagg gacttttcag gctagccgcc agccgggtaa tcagcttatc 4320
cagcaacgtt tcgctggatg ttggcggcaa cgaatcactg gtgtaacgat ggcgattcag 4380
caacatcacc aactgcccga acagcaactc agccatttcg ttagcaaacg gcacatgctg 4440
actactttca tgctcaagct gaccgataac ctgccgcgcc tgcgccatcc ccatgctacc 4500
taagcgccag tgtggttgcc ctgcgctggc gttaaatccc ggaatcgccc cctgccagtc 4560
aagattcagc ttcagacgct ccgggcaata aataatattc tgcaaaacca gatcgttaac 4620
ggaagcgtag gagtgtttat cgtcagcatg aatgtaaaag agatcgccac gggtaatgcg 4680
ataagggcga tcgttgagta catgcaggcc attaccgcgc cagacaatca ccagctcaca 4740
aaaatcatgt gtatgttcag caaagacatc ttgcggataa cggtcagcca cagcgactgc 4800
ctgctggtcg ctggcaaaaa aatcatcttt gagaagtttt aactgatgcg ccaccgtggc 4860
tacctcggcc agagaacgaa gttgattatt cgcaatatgg cgtacaaata cgttgagaag 4920
attcgcgtta ttgcagaaag ccatcccgtc cctggcgaat atcacgcggt gaccagttaa 4980
actctcggcg aaaaagcgtc gaaaagtggt tactgtcgct gaatccacag cgataggcga 5040
tgtcagtaac gctggcctcg ctgtggcgta gcagatgtcg ggctttcatc agtcgcaggc 5100
ggttcaggta tcgctgaggc gtcagtcccg tttgctgctt aagctgccga tgtagcgtac 5160
gcagtgaaag agaaaattga tccgccacgg catcccaatt cacctcatcg gcaaaatggt 5220
cctccagcca ggccagaagc aagttgagac gtgatgcgct gttttccagg ttctcctgca 5280
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gcaatacgct gtggttaacg cgccagtgag acggatactg cccatccagc tcttgtggca 5460
gcaactgatt cagcccggcg agaaactgaa atcgatccgg cgagcgatac agcacattgg 5520
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ccgtgccacc ggtgatggta tagggctgcc cattaaacac atgaataccc gtgccatgtt 5640
cgacaatcac aatttcatga aaatcatgat gatgttcagg aaaatccgcc tgcgggagcc 5700
ggggttctat cgccacggac gcgttaccag acggaaaaaa atccacacta tgtaatacgg 5760
tcatactggc ctcctgatgt cgtcaacacg gcgaaatagt aatcacgagg tcaggttctt 5820
accttaaatt ttcgacggaa aaccacgtaa aaaacgtcga tttttcaaga tacagcgtga 5880
attttcagga aatgcggtga gcatcacatc accacaattc agcaaattgt gaacatcatc 5940
acgttcatct ttccctggtt gccaatggcc cattttcctg tcagtaacga gaaggtcgcg 6000
aattcaggcg ctttttagac tggtcgtaat gaacaattct taagaaggag atatacatat 6060
gcgaatcgtt gaatgcgcac agggtagcga cgaatggcat cgcgcgcgtg ccggcgtcat 6120
cacggccagc atgttcgccg cggcgcgcaa gcgtctcaag gtcggcccta acaagggcga 6180
ttacacgtcc gaggcgaaag actatgcatt ccgcctcgcg gtcgagcgca ttggcggtca 6240
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ggcgcgcatg gagcacgaag cactcacagg cctgttcgtg aagcgcgccg gattcgtcgt 6360
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cggcgacgtc atggaacagg cgcagggctg catgtggctt tgcggcgcga agtggtggca 6540
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cgtcactgcg tacgaaacac ggctgcgcca gcacccagcc attgaggctt gaaggaggca 6720
gctatatgag caatgccctc atcgccgtca ccaacgaaat ctacggcgtc cgtgaaaact 6780
tcgagcgtgt cgccgtcgat cgctcgatca acttcgaccg cgaggccgga tttgcagtgc 6840
agatcctgca aggcaatccg tacttgctcg gcgtcgccga gaaggatcgc gcttcgatga 6900
tcgcggcggt gacgaacgtt tcggcgattg gcatcagcct caaccccgcg aagaagcagg 6960
cgtacctcgt gccgcgtggc ggcaaggtct gtctcgacat cagctacatg gggctgctgg 7020
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agcgagccta caagacgtgg ccgaagacgg atcgccttga tgcggccgtg caccacctga 7380
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tattcaagca gacggtcgcg gttcgtggcg aagaaattaa gcgccgcgcc gagcagcgga 7620
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gttgactcga ggaggggatc ctatgaaccc gatcacctac ctgtgcggcg cgctcgaccg 7800
gctgttcgaa cgtagtccgg tcgcggggat tgttgttgcg atcgtgattg cggccggatg 7860
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acaaatgagc ttaccggttt attgactacc ggaagcagtg tgaccgtgtg cttctcaaat 8040
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ggtatagggc ggcgaggcgg ctacagccga tagtctggaa cagcgcactt acgggttgct 8280
gcgcaaccca agtg 8294
<210> 3
<211> 9515
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan的核苷酸序列
<222>（1）…（9515）
<400> 3
ctaccggcgc ggcagcgtga cccgtgtcgg cggctccaac ggctcgccat cgtccagaaa 60
acacggctca tcgggcatcg gcaggcgctg ctgcccgcgc cgttcccatt cctccgtttc 120
ggtcaaggct ggcaggtctg gttccatgcc cggaatgccg ggctggctgg gcggctcctc 180
gccggggccg gtcggtagtt gctgctcgcc cggatacagg gtcgggatgc ggcgcaggtc 240
gccatgcccc aacagcgatt cgtcctggtc gtcgtgatca accaccacgg cggcactgaa 300
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tgccgccgtg ggtttcctcg caataagccc ggcccacgcc tcatgcgctt tgcgttccgt 600
ttgcacccag tgaccgggct tgttcttggc ttgaatgccg atttctctgg actgcgtggc 660
catgcttatc tccatgcggt agggtgccgc acggttgcgg caccatgcgc aatcagctgc 720
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ggtggcgctg cccccttgga acccccgcac tcgccgccgt gaggctcggg gggcaggcgg 1080
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ggccaagccg ctgcgcggtc gctgcgcgag ccttgacccg ccttccactt ggtgtccaac 1200
cggcaagcga agcgcgcagg ccgcaggccg gaggcttttc cccagagaaa attaaaaaaa 1260
ttgatggggc aaggccgcag gccgcgcagt tggagccggt gggtatgtgg tcgaaggctg 1320
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ttgtccagca gggttgtcca cgggccgagc gaagcgagcc agccggtggc cgctcgcggc 1440
catcgtccac atatccacgg gctggcaagg gagcgcagcg accgcgcagg gcgaagcccg 1500
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tctagtgagt atactcaagc attgagtggc ccgccggagg caccgccttg cgctgccccc 1620
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tgcaagaagc tggcgaaaat gggcaacgtg gcggccagtc tcaagcacgc ctaccgcgag 1740
cgcgagacgc ccaacgctga cgccagcagg acgccagaga acgagcactg ggcggccagc 1800
agcaccgatg aagcgatggg ccgactgcgc gagttgctgc cagagaagcg gcgcaaggac 1860
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gcggatcgca tcgtgacggc cagcatccac cgtgacgaaa ccagcccgca catgaccgcg 2040
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attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg 3720
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cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct 3840
ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc catgggcaaa tattatacgc 3900
aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt tgtgatggct 3960
tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac aacagttttt atgcattaat ctttctgcga 4020
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ggcgccgcgc gagaagcaag ggcaactcga aggcgcgctg gctcactgcg ctgtgctgga 6240
gccgaaggag ttcgagaagc gatacatcgt cggcaaggcg attcaccgcg gcaccaagga 6300
atggaaggaa ttcgttgcgg cgcatcccga gcacacggcc atccagccgg atcagtacga 6360
ggccgcgacg cgccaagcgg tatccgttcg agcactccct gagattggag aagtgctcga 6420
acaaggcgct gccgaggtgt ccgcgttttg ggttgatgaa gagacgggca tggaatgtcg 6480
gtgcaggccg gacttcgtgc atgacgtcga tgcagattcg gtgattttgc tggatctgaa 6540
aaccttctct gatccgagcc cgaacgaatt ctcgcggcaa tgcgctcgaa aggcctatgc 6600
gaaacaggct tccttctata ccgacggata cgagaaagcg agcggcaaga ctgttcgagc 6660
gttcatcttc atagccgtcg gcaatgaatg gccctatgcc gcctcagcaa tgatgctcga 6720
cgaagaaagt cttgaagccg gccgacgcca ttacaaacgc aacctcagaa catacgctga 6780
gtgcatgcgt agcggggaat ggccagggtt ctcgaacgga atcacgctca ttcgtctgcc 6840
gatgtgggcg atggaacgcg ctgaggagga gtgaaggagg cagctatatg gcacaaacca 6900
ccagcattgc aaacctgaaa cagacgtcga agatggtcgc gcgcgacgcg ggcatcggca 6960
gcgtgaagac gttcttcgag tcgcagaaag cgacgctcgc cgcggtgctg ccgaagcatg 7020
tcagcccaga ccgcatgctc aagatcgcgc tcggcgcgct gcgcacgacg ccgaagctga 7080
tggaatgcac ggtcgaatcg ctgatgggtg cggtcgtgca gtgctcgcag cttggcctgg 7140
agccgaatac gccgctcggg cacgcgtacc tgatcccgtt cgagaagaag aaaaagcagg 7200
gcggccagtg ggtgacggac aaggtcgaga ctcaaattgt gatcggctac aaaggcctga 7260
tcgatcttgc tcgccgctcg ggacaagtcg tgagcatcgc agcgcacgcg gtgcacgagc 7320
gcgacgcgtt cgactattcc tacggcctcg acgagaagct cgaacataaa ccggccatga 7380
cgaatcgcgg gcacgtgatc gcgttctatg cggtcgcgaa gctggtcggc ggcggtcatg 7440
cgttcgaggt gatgagcgcc gagcaggtca acgagatccg cgacgcgagc cagaacttca 7500
agttcgcgcg cgacaaggaa aagacagtct ggggccagca ctacgaagag atgggccgca 7560
agacggtgct gcgccggctt ttcaagtact tgccagtcag catcgagctg gcaacggcta 7620
cggcgatcga tgacgtcggc gcgcgcaacg gatcgcaggc gctcgacacg gtgctcgacg 7680
gcgactacat cacgccgagc gacgacaacg acgacggcga cgtgatcgac caagccaccg 7740
gcgagatcac cgaccagcgc gcgcagcagc aggacatgac cgtcgactac aacgaccttc 7800
tgagccagat ggggaaggcg aaggacgttg aaacgctcgc gatggtgctc gacagcggcc 7860
gttctttgcc ggaagaccag tttgtgaagc tctcggcaga gtacgaagac cgtcgtgaaa 7920
agctgatggg agcctgagga tccatatgag gaggtctaga tatgatgctt accgcagatc 7980
gcgttcgtga actcctcgac tacgcgcctg acaccggaat attcacatgg cgaaagactt 8040
ctcgccgtgc agtcgcaggc gctgtagcgg gttcggacaa cggtgagggg tacctgcaga 8100
tatcggtcga tggtcggcgc tacgccgcgc atcgcttggc atggctgcat gtccatggcg 8160
aatggccgga gacggagctt gatcatatcg acggcacgcg ctcccacaac gcgcttgcca 8220
atctgcgcct ggcggatcgg tttctgaata accggaacgt tcatggcgcg agacacaaca 8280
gcaaaaccgg tcttctcggc gcatcgccaa aaggcaatcg gttcgtcgcc caaattacag 8340
caaacggaat taaccactat ctcggccgct tcgatacggc cgaggaagca catgcggctt 8400
atatcgccgc aaagagaatc catcattcaa ccgaggagtg actcgagtgt acaggaggtc 8460
tagatatgat ccagaaacgc gacacccgcc cgcgcatcga acgaatccgc gcggcgctcg 8520
aaaagctcgg cccctcgaca gtctttgcca tcgcgaacga gacgggcatc gacgagcgcg 8580
ccatcggcga gatcatccgc accgcccgca agaaggattt ccccggcacg cggttccgca 8640
aggcaggcaa gacgcgcgag ggctgcgtga atcgaagctg gctttacgag gtaagcgacg 8700
aacctgacgt gattgtcgcg ccggcgcgat atcagccgag ccgcgagaag gccgtcaagc 8760
atcccggcat gacgcgcgaa gaagtcgccg acatgaagcg ccgggcagag cttctgcgtc 8820
aaatgaagcc gtttcgccac tggcaagacg tggcgctctt tggagccgca gcatgactcg 8880
agcatatgag gaggcctagg tatgcgcgtc ctcgtgatcg aaatcaacgg cggaaactca 8940
ttcacgttgc acgagggcga tcgttaccac gacgagctgt gctgggatga actgctcggc 9000
atggttgccg aaatgacgca tccccgtctc ggtgacggcc gctatgggtt gcgcactcgc 9060
gaagagtgga cggcgtggcg ccggtccatg cgtcctacgc agcaccctgt ttataccgaa 9120
ccgccccttc tcaccttcac cccggagaaa tgacctaggt gtacaggatc ccccagcccg 9180
cctaatgagc gggctttttt ttgaacaaag cttaccggtt tattgactac cggaagcagt 9240
gtgaccgtgt gcttctcaaa tgcctgaggc cagtttgctc aggctctccc cgtggaggta 9300
ataattgacg atatgatcat ttattctgcc tcccagagcc tgataaaaac ggtgaatccg 9360
ttagcgaggt gccgccggct tccattcagg tcgaggtggc ccggctccat gcaccgcgac 9420
gcaacgcggg gaggcagaca aggtataggg cggcgaggcg gctacagccg atagtctgga 9480
acagcgcact tacgggttgc tgcgcaaccc aagtg 9515
<210> 4
<211> 5253
<212> DNA
<213> 人工序列
<221>质粒pBBR1-apra-kan的核苷酸序列
<222>（1）…（5253）
<400> 4
ctaccggcgc ggcagcgtga cccgtgtcgg cggctccaac ggctcgccat cgtccagaaa 60
acacggctca tcgggcatcg gcaggcgctg ctgcccgcgc cgttcccatt cctccgtttc 120
ggtcaaggct ggcaggtctg gttccatgcc cggaatgccg ggctggctgg gcggctcctc 180
gccggggccg gtcggtagtt gctgctcgcc cggatacagg gtcgggatgc ggcgcaggtc 240
gccatgcccc aacagcgatt cgtcctggtc gtcgtgatca accaccacgg cggcactgaa 300
caccgacagg cgcaactggt cgcggggctg gccccacgcc acgcggtcat tgaccacgta 360
ggccgacacg gtgccggggc cgttgagctt cacgacggag atccagcgct cggccaccaa 420
gtccttgact gcgtattgga ccgtccgcaa agaacgtccg atgagcttgg aaagtgtctt 480
ctggctgacc accacggcgt tctggtggcc catctgcgcc acgaggtgat gcagcagcat 540
tgccgccgtg ggtttcctcg caataagccc ggcccacgcc tcatgcgctt tgcgttccgt 600
ttgcacccag tgaccgggct tgttcttggc ttgaatgccg atttctctgg actgcgtggc 660
catgcttatc tccatgcggt agggtgccgc acggttgcgg caccatgcgc aatcagctgc 720
aacttttcgg cagcgcgaca acaattatgc gttgcgtaaa agtggcagtc aattacagat 780
tttctttaac ctacgcaatg agctattgcg gggggtgccg caatgagctg ttgcgtaccc 840
ccctttttta agttgttgat ttttaagtct ttcgcatttc gccctatatc tagttctttg 900
gtgcccaaag aagggcaccc ctgcggggtt cccccacgcc ttcggcgcgg ctccccctcc 960
ggcaaaaagt ggcccctccg gggcttgttg atcgactgcg cggccttcgg ccttgcccaa 1020
ggtggcgctg cccccttgga acccccgcac tcgccgccgt gaggctcggg gggcaggcgg 1080
gcgggcttcg ccttcgactg cccccactcg cataggcttg ggtcgttcca ggcgcgtcaa 1140
ggccaagccg ctgcgcggtc gctgcgcgag ccttgacccg ccttccactt ggtgtccaac 1200
cggcaagcga agcgcgcagg ccgcaggccg gaggcttttc cccagagaaa attaaaaaaa 1260
ttgatggggc aaggccgcag gccgcgcagt tggagccggt gggtatgtgg tcgaaggctg 1320
ggtagccggt gggcaatccc tgtggtcaag ctcgtgggca ggcgcagcct gtccatcagc 1380
ttgtccagca gggttgtcca cgggccgagc gaagcgagcc agccggtggc cgctcgcggc 1440
catcgtccac atatccacgg gctggcaagg gagcgcagcg accgcgcagg gcgaagcccg 1500
gagagcaagc ccgtagggcg ccgcagccgc cgtaggcggt cacgactttg cgaagcaaag 1560
tctagtgagt atactcaagc attgagtggc ccgccggagg caccgccttg cgctgccccc 1620
gtcgagccgg ttggacacca aaagggaggg gcaggcatgg cggcatacgc gatcatgcga 1680
tgcaagaagc tggcgaaaat gggcaacgtg gcggccagtc tcaagcacgc ctaccgcgag 1740
cgcgagacgc ccaacgctga cgccagcagg acgccagaga acgagcactg ggcggccagc 1800
agcaccgatg aagcgatggg ccgactgcgc gagttgctgc cagagaagcg gcgcaaggac 1860
gctgtgttgg cggtcgagta cgtcatgacg gccagcccgg aatggtggaa gtcggccagc 1920
caagaacagc aggcggcgtt cttcgagaag gcgcacaagt ggctggcgga caagtacggg 1980
gcggatcgca tcgtgacggc cagcatccac cgtgacgaaa ccagcccgca catgaccgcg 2040
ttcgtggtgc cgctgacgca ggacggcagg ctgtcggcca aggagttcat cggcaacaaa 2100
gcgcagatga cccgcgacca gaccacgttt gcggccgctg tggccgatct agggctgcaa 2160
cggggcatcg agggcagcaa ggcacgtcac acgcgcattc aggcgttcta cgaggccctg 2220
gagcggccac cagtgggcca cgtcaccatc agcccgcaag cggtcgagcc acgcgcctat 2280
gcaccgcagg gattggccga aaagctggga atctcaaagc gcgttgagac gccggaagcc 2340
gtggccgacc ggctgacaaa agcggttcgg caggggtatg agcctgccct acaggccgcc 2400
gcaggagcgc gtgagatgcg caagaaggcc gatcaagccc aagagacggc ccgagacctt 2460
cgggagcgcc tgaagcccgt tctggacgcc ctggggccgt tgaatcggga tatgcaggcc 2520
aaggccgccg cgatcatcaa ggccgtgggc gaaaagctgc tgacggaaca gcgggaagtc 2580
cagcgccaga aacaggccca gcgccagcag gaacgcgggc gcgcacattt ccccgaaaag 2640
tgccacctgg gatgaatgtc agctactggg ctatctggac aagggaaaac gcaagcgcaa 2700
agagaaagca ggtagcttgc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat 2760
ggacagcaag cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct 2820
gcaaagtaaa ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagat 2880
ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag 2940
gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg 3000
gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca 3060
agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc 3120
tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg 3180
actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg 3240
ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta 3300
cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag 3360
ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac 3420
tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg 3480
atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg 3540
gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg 3600
aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg 3660
attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg 3720
gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg attccaccgc 3780
cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct 3840
ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc catgggcaaa tattatacgc 3900
aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt tgtgatggct 3960
tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac aacagttttt atgcattaat ctttctgcga 4020
attgagatga cgccactggc tgggcgtcat cccggtttcc cgggtaaaca ccaccgaaaa 4080
atagttacta tcttcaaagc ctcagccaat cgactggcga gcggcatcgc attcttcgca 4140
tcccgcctct ggcggatgca ggaagatcaa cggatctcgg cccagttgac ccagggctgt 4200
cgccacaatg tcgcgggagc ggatcaaccg agcaaaggca tgaccgactg gaccttcctt 4260
ctgaaggctc ttctccttga gccacctgtc cgccaaggca aagcgctcac agcagtggtc 4320
attctcgaga taatcgacgc gtaccaactt gccatcctga agaatggtgc agtgtctcgg 4380
caccccatag ggaacctttg ccatcaactc ggcaagatgc agcgtcgtgt tggcatcgtg 4440
tcccacgccg aggagaagta cctgcccatc gagttcatgg acacgggcga ccgggcttgc 4500
aggcgagtga ggtggcaggg gcaatggatc agagatgatc tgctctgcct gtggccccgc 4560
tgccgcaaag gcaaatggat gggcgctgcg ctttacattt ggcaggcgcc agaatgtgtc 4620
agagacaact ccaaggtccg gtgtaacggg cgacgtggca ggatcgaacg gctcgtcgtc 4680
cagacctgac cacgagggca tgacgagcgt ccctcccgga cccagcgcag cacgcagggc 4740
ctcgatcagt ccaagtggcc catcttcgag gggccggacg ctacggaagg agctgtggac 4800
cagcagcaca ccgccggggg taaccccaag gttgagaagc tgaccgatga gctcggcttt 4860
tcgccattcg tattgcacga cattgcactc caccgctgat gacatcagtc gatcatagca 4920
cgatcaacgg cactgttgca aatagtcggt ggtgataaac ttatcatccc cttttgctga 4980
tggagctgca catgaacatg cctgaggcca gtttgctcag gctctccccg tggaggtaat 5040
aattgacgat atgatcattt attctgcctc ccagagcctg ataaaaacgg tgaatccgtt 5100
agcgaggtgc cgccggcttc cattcaggtc gaggtggccc ggctccatgc accgcgacgc 5160
aacgcgggga ggcagacaag gtatagggcg gcgaggcggc tacagccgat agtctggaac 5220
agcgcactta cgggttgctg cgcaacccaa gtg 5253

Claims (3)

1.一种伯克氏菌（Burkholderia sp.）同源重组系统，该重组系统由一系列伯克氏菌同源重组系统表达质粒构成，其特征在于：所述重组系统中的系列表达质粒包括pBBR1复制起点、卡那霉素抗性基因、鼠李糖诱导型启动子以及伯克氏菌来源同源重组操纵子；所述系列表达质粒分别命名为pBBR1-Rha-EThe_bdu8-kan、其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；pBBR1-Rha-ETh_tji49-kan、其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan、其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.权利要求1所述伯克氏菌同源重组系统在伯克氏菌中介导短同源臂的同源重组进行基因组DNA遗传修饰中的应用，其中所述短同源臂是指50 bp–150 bp的同源臂。
3.权利要求1所述伯克氏菌同源重组系统在伯克氏菌中进行基因插入以激活伯克氏菌中的沉默基因簇的应用。
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