CN116064357B - 一株有效提高Fcl29产量的改良菌株及改良方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株有效提高Fcl29产量的改良菌株及其改良方法，在出发菌株的基础上，将Fcl29生物合成基因簇的启动子替换为同属细菌的组成型强启动子Promoter15。得到的改良菌株经实验确认其发酵液中Fcl29的含量得到了有效提高，为新型抗菌活性物质研发及工业化生产打下基础。

Description

一株有效提高Fcl29产量的改良菌株及改良方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种有效提高Fcl29产量的改良菌株和改良方法。

背景技术

细菌天然产物，也被称为次级代谢产物，近年来，随着基因组学、代谢组学及生物信息学的快速发展，越来越多的天然产物被鉴定出来，部分天然产物已被证明是有效的抗生素并被广泛应用，如万古霉素、红霉素等。福莱菌肽，英文名fabclavine，是在昆虫病原共生细菌-致病杆菌属(Xenorhabdus spp.)的发酵液中鉴定到的天然产物(Fuchs et al.，2014)。研究发现，福莱菌肽对革兰氏阴阳性细菌、病原真菌、支原体、线虫等生物体具有广谱抗性(Abebew et al.，2022；Fuchs et al.，2014)，在医用及农用领域具有巨大的开发潜力。然而，其复杂的合成途径为菌株改良和工业化生产带来了巨大的挑战，因此，目前针对福莱菌肽的研究大多与其生物活性和合成机制相关，鲜有工业化开发的相关研究及发明。

发明内容

本发明首先提供一株有效提高Fcl29产量的改良菌株，在出发菌株的基础上，将Fcl29生物合成基因簇的启动子替换为同属细菌的组成型强启动子Promoter15。所述组成型强启动子Promoter15的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述出发菌株优选的是布达佩斯致病杆菌(Xenorhabdus budapestensis)XBD102，所述XBD102菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC No：22057。XBD102菌株是本发明实验室自主分离得到的，对多种植物病原真菌和病原细菌具有高效拮抗作用，该菌株的功能及应用均记载在中国发明专利ZL202110766597.0中，已获得专利授权，其公开全文被本申请所引用。

本发明在研究XBD102天然产物的应用时，对其主效活性成分进行了识别和鉴定。经过鉴定发现，其主效抑菌活性天然产物为福莱菌肽的衍生物，Fcl29(Wenski et al.，2020)，如图1所示。Fcl29结构式如图2所示。为了提升XBD102主效活性天然产物Fcl29的产量，给新型抗菌活性物质研发及工业化生产打下基础，本发明使用DNA同源重组方法，将Fcl29生物合成基因簇(Biosynthetic gene clusters，BGCs)的启动子替换为同属细菌的组成型强启动子Promoter15，得到改良菌株ΔXBD102WT-P₁₅-fclC，用超高清液相质谱检测XBD102野生型(WT)和改良菌株ΔXBD102WT-P₁₅-fclC发酵液中Fcl29的含量，积分结果显示，ΔXBD102WT-P₁₅-fclC中Fcl29的积分为323.573，与XBD102野生型(WT)的积分215.329对比，提高了1.5倍。产量得到了有效提高。

附图说明

图1为XBD102发酵产物的UPLC-TQ-S-MS/MS MRM色谱图；

图2为Fcl29结构式；

图3为XBD102野生型(WT)和改良菌株ΔXBD102WT-P₁₅-fclC发酵液中Fcl29的含量色谱图；

图4为Fabclavine合成基因簇；

图5为双交换同源重组突变株ΔXBD102WT-P₁₅-fclC PCR验证核酸胶图。

具体实施方式

下面，结合实施例对本发明做进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护之中。

实施例：改良菌株的构建和验证

本实施例根据嗜线虫治病杆菌CB6的转录组数据筛选到组成型强启动子p15(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)并扩增出片段，然后从XBD102野生型基因组DNA中对fabclavine合成基因簇基因C(如图4所示)启动子的上下游进行扩增以得到同源臂，扩增引物为：

上游同源臂引物：

fclC-upFW：GCTTGATATCGAATTCCTCAGATTTACAAGGGGAGT(如SEQ ID No.2所示)。

fclC-15upReV：GCGCCAGAAAGATCAATATCTTATATTTTTTTGGATAAAAC(如SEQ ID No.3所示)。

下游同源臂引物：

fclC-15dwFW：AATTAAAGAGGAGAAATTAAGCATGTCCAAGACGTATTTTTTGC(如SEQ IDNo.4所示)。

fclC-dwReV：GGCCGCTCTAGAACTAGTCAGCTGAATATCACCCGG(如SEQ ID No.5所示)。

长度设置为1000bp左右，并在上游同源臂3’端和下游同源臂5’端各设置20bp启动子p15 DNA片段的overlap，PCR扩增均使用FastPfu fly DNA聚合酶(TransGen Biotech，中国)。pJQ200SK质粒用PCR扩增的方法将其线性化，然后使用无缝克隆和组装试剂盒(Beijing Zoman Biotechnology，中国)将所有扩增的到的DNA片段与线性化的pJQ200SK质粒连接。然后将连接所得质粒pJQP15-FCL转化到大肠杆菌S17-1λpir中，并通过结合转移到XBD102野生型菌株中。详细步骤如下：分别在37℃和28℃的LB培养基中培养大肠杆菌S17-1λpir和XBD102。当液体培养物生长至OD6000.6-0.8时，收集1毫升培养物并使用新鲜LB培养基洗涤两次。将细胞重悬在50μl LB中。将大肠杆菌S17-1λpir和XBD102菌液混合后在LB琼脂平板上培养。平板在28℃下培养18小时后，用无菌水重悬细菌菌落，并均匀涂布在含有氨苄西林和庆大霉素的LB琼脂平板上。通过选择单克隆菌落筛选单交换同源重组突变株。此后，我们将筛选到的单交换菌落在LB(不含NaCl)中培养12小时，将菌液均匀涂布在含有5％蔗糖(不含NaCl)的LB琼脂平板上。将有蔗糖抗性的菌落挑取到添加氨苄青霉素的LB培养基内并在28℃培养，然后用PCR验证是否得到双交换同源重组突变株。

如图5所示的核酸胶图，验证了双交换同源重组突变株ΔXBD102WT-P₁₅-fclC构建成功。然后采用超高清液相质谱检测XBD102野生型(WT)和改良菌株ΔXBD102WT-P₁₅-fclC发酵液中Fcl29的含量，积分结果显示，ΔXBD102WT-P₁₅-fclC中Fcl29的积分为323.573，与XBD102野生型(WT)的积分215.329对比，提高了1.5倍(如图3所示)，其可以有效提高Fcl29产量，为新型抗菌活性物质研发及工业化生产打下基础。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.一株有效提高Fc1-29产量的改良菌株，其特征在于，在出发菌株的基础上，将Fcl-29生物合成基因簇的启动子替换为同属细菌的组成型强启动子Promoter15；所述组成型强启动子Promoter15的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述出发菌株是布达佩斯致病杆菌(Xenorhabdus budapestensis)XBD102，所述XBD102菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC No.22057；所述Fc1-29结构式如图所示：

2.一种有效提高Fcl-29产量的菌株改良方法，其特征在于，在出发菌株的基础上，将Fc1-29生物合成基因簇的启动子替换为同属细菌的组成型强启动子Promoter15；所述组成型强启动子Promoter15的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述出发菌株是布达佩斯致病杆菌(Xenorhabdus budapestensis)XBD102，所述XBD102菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC No.22057；所述Fc1-29结构式如图所示：

3.权利要求1所述的改良菌株在抗菌活性物质福莱菌肽的衍生物Fc1-29生产中的应用。