CN101402959A - 一种提高枯草芽孢杆菌surfactin产量的启动子置换方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高枯草芽孢杆菌surfactin产量的启动子置换方法，属于生物技术领域。采用DNA同源整合技术使启动子Pspac置换枯草芽孢杆菌fmbR surfactin合成酶基因本身的启动子。通过PCR方法从fmbR菌株基因组中扩增得到1081bp的同源序列，连接到质粒pMUTIN4的HindIII和BamH I酶切位点上，并将构建好的载体转化到野生枯草芽孢杆菌fmbR中，经过抗生素培养基筛选并通过分子生物学方法鉴定获得。本发明方法可以直接从遗传上改良抗菌肽生产菌株，在工业上具潜在的应用价值。菌株surfactin产量提高约4.85倍，在IPTG诱导下，surfactin产量约提高10倍。

Description

一种提高枯草芽孢杆菌surfactin产量的启动子置换方法

一、技术领域

本发明涉及一种提高枯草芽孢杆菌surfactin产量的启动子置换方法，是利用启动子置换技术提高枯草芽孢杆菌的脂肽类抗生素surfactin产量方法，属于生物技术领域。

二、背景技术

Bacillus subtilis在生长代谢过程中能够产生不同种类的抗菌物质，其中抗菌肽占主导地位。【文摘】Bacillus subtilis产生的抗菌肽通常分为两大类：一类是核糖体合成的羊毛硫抗生素(lantibiotics)，主要包括subtilin、Erisin、sublancin、和subtilosin等，(Applied Microbiol Biotechnol，1997，48：80-82.Journal Biotenology，2002，5：1-8.rchiveMicrobiology，1996，165：243-251.J.Biol.Chem.1998，273：23134-23142.Rev Microbiol，1993，47：535-564.)，通常抑制革兰氏阳性菌生长，另一类非核糖体合成的脂肽类抗生素(lipopeptides)，它们是由多个酶催化合成的主要包括surfactin、iturin家族iturin、bacillomycin和mycosubtilin、fengycin等。具有抗细菌、真菌、病毒活性。

【文摘】由于它的广谱的抗菌活性、生物降解和降低表面活性的特点.(MolecularMicrobiology，2005，56：845-857.精细化工，2006，(2)：121-125.生物技术通报，2004，(6)：11-16.化学学报，2004，(21)：2200-2204.)，因此越来越受到人们的重视。【文摘】在植物病害生物防治(Phytichemistry，2002，61：693-698)、食品防腐(食品工业科技)，2006，(4)：91-93.Journal of Food Protection，2000，63：1123-1132.)以及饲料添加剂等方面具有潜在的应用前景。特别是目前农药残留、化学食品和饲料添加剂对于食品安全的严重影响，探索天然的抗菌物质对于农产品安全生产具有重要的现实意义。

国内外针对实验室条件下抗菌肽的发酵工艺和分离技术已经开展大量研究。虽然通过发酵工艺的优化和诱变育种能够提高surfactin的生产水平，但surfactin的发酵产量相对于工业生产还是很低。因此，研究采用分子生物学方法，直接对负责surfactin合成的操纵子进行改造，从而提高surfactin的生产水平。对于surfacin合成机理的研究具有重要的理论意义，同时对于对于提高surfactin产量，应用于工业生产具有重要意义。

同源整合技术就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术。它克服了随机整合的盲目性和危险性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、可诱导性基因同源整合系统的建立，使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确。【文摘】(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，Aug.2005，p.4577-4584.J.Bacteriol.183：6265-6273.)。目前已有通过同源整合技术使强启动子来置换抗菌肽合成酶操纵子的启动子，并提高了该抗菌肽的产量。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是通过分子生物方法提高surfactin合成酶基因簇的表达，获得surfactin产量提高的枯草芽孢杆菌菌株。

技术方案

本发明的实现是通过克隆枯草芽孢杆菌fmbR基因组DNA的surfactin的一个合成酶srfA-A基因(图1所示)5’端带有启动子Psrf的同源片段，其序列为SEQ ID NO.1，大小1081bp，并将该片段连接到pMUTIN4载体上，然后转化枯草芽孢杆菌fmbR，并通过红霉素抗性筛选得到的一株启动子发生置换的菌株。最终通过高效液相检测surfactin产量。获得surfactin产量提高的菌株。

上述方法所获得的枯草芽孢杆菌启动子Pspac置换菌株的DNA序列为SEQ IDNO.2。

枯草芽孢杆菌启动子Pspac置换菌株的鉴定方法，包括，设计引物，

上游引物：5’-TTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTG-3；

下游引物：5’-TGAGTTTCCCAGTATCCC-3，

以启动子Pspac置换的菌株基因组DNA为模板，在100μl体系中，引物终浓度各为1μM，dNTPs终浓度为0.2mM，枯草芽孢杆菌基因组DNA10ng，4U pfu DNA聚合酶；

扩增程序为94℃ 2min；30个循环：94℃ 50s，53℃50s，72℃1，30min；72℃10min；

将回收的PCR产物与TaKaRa公司pMD19-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂于含有IPTG、X-gal、氨苄青霉素的LB平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，测序，如果扩增得到大小约1344bp的DNA片段即SEQ IDNO.2，即启动子Pspac片段和枯草芽孢杆菌fmbR surfactin合成酶基因5’端部分DNA片段连接到一起，并整合到野生枯草芽孢杆菌fmbR的基因组DNA中的DNA片段，则为枯草芽孢杆菌启动子Pspac置换菌株。

有益效果

迄今为止，人们已经采用同源整合技术已经采用强启动子repU置换了iturin和mycosubtilin的启动子，并最终获得该抗菌肽产量提高的菌株。本发明人通过同源整合技术获得的启动子Pspac置换surfactin合成酶原来启动子的枯草芽孢杆菌菌株，在国际中首次报道通过同源整合技术获得surfactin产量提高的菌株。

本发明通过PCR技术从本实验室保存的枯草芽孢杆菌菌株fmbR基因组中扩增得到surfactin合成酶基因的长约1081bp的同源片段，在该同源片段两端分别加上HindIII和BamH I限制酶识别序列，与经相同限制酶消化的pMUTIN4连接并转化枯草芽孢杆菌fmbR，获得了强启动子置换的菌株。通过牛津杯法和高效液相技术检测surfactin产量提高的菌株。在没有IPTG诱导情况下，surfactin产量提高约4.85倍，在300μM IPTG诱导情况下，surfactin产量约提高10倍。

利用本发明获得surfactin产量提高菌株的方法，具有直接的目的性，可以直接从遗传上改良抗菌肽生产菌株，在工业上具潜在的应用价值。

四、附图说明

图1Surfactin合成酶的操纵子结构图

图2启动子Pspac置换surfactin合成酶基因原来启动子的原理图

(Pspac：启动子Pspac，srf’：从枯草芽孢杆菌fmbR中扩增并连接到质粒pMUTIN4上的1081bp的DNA片段，Psrf：surfactin合成酶基因原来的启动子，srf：基因组中srf’的同源序列，lacI：启动子Pspac的抑制基因)。

五、具体实施方式

本发明的实现是通过克隆枯草芽孢杆菌fmbR(别小妹等.Bacillus subtilis fmbR抗菌物质的分离和鉴定.中国农业科学，2006，(11)：2327-2334)基因组DNA的surfactin的一个合成酶srfA-A基因(图1所示)5’端带有启动子Psrf的同源片段(SEQ IDNO.1)，大小为1081bp，并将该片段连接到带有启动子的pMUTIN4载体上，然后转化枯草芽孢杆菌fmbR，并通过红霉素抗性筛选得到启动子发生置换的菌株。最终通过高效液相检测surfactin产量，从而获得surfactin产量提高的置换菌株。

(一)含有启动子Pspac的载体pMUTIN4

选择带有IPTG诱导型的启动子Pspac的载体pMUTIN4(购自BGSC)构建同源整合载体，该载体pMUTIN4上启动子Pspac下游有一个多克隆位点，在这个多克隆位点连接上同源片段(SEQ ID NO.1)，转化枯草芽孢杆菌，载体上的同源片段和枯草芽孢杆菌基因组上相应DNA片段发生单交换，使同源片段以及下游的基因处于启动子Pspac的控制之下，从而可以得到启动子置换菌株。

(二)surfactin合成酶基因同源片段的的克隆

将枯草芽孢杆菌fmbR培养液(别小妹等.Bacillus subtilis fmbR抗菌物质的分离和鉴定.中国农业科学，2006，(11)：2327-2334)离心收集菌体，用上海生物工程公司基因组DNA试剂盒提取基因组DNA。

参考Genbank(编号D13262)中枯草芽孢杆菌168的surfactin基因序列，利用primer primier 5.0软件自行设计枯草芽孢杆菌surfactin合成酶基因引物序列，

上游引物：5’-cccaagctttttcggctgttagttcata-3’HindIII

下游引物：5’-cggatccgtttggtggcgaagtgtct-3’BamHI

由上海生工合成。

在100μl体系中，引物终浓度各为1μM，dNTPs终浓度为0.2mM，枯草芽孢杆菌fmbR基因组DNA10ng，4U pfu DNA聚合酶。扩增程序为94℃2min；30×(94℃50s，53℃ 50s，72℃ 1：30min)；72℃10min。琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用上海生工试剂盒回收，将回收的PCR产物与TaKaRa公司pMD19-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂于含有IPTG、X-gal、氨苄青霉素的LB平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到金斯特公司测序。用计算机分析测序结果，获得一个长1081bp的surfactin合成酶基因同源片段SEQ ID NO.1，即枯草芽孢杆菌surfactin合成酶基因5’端部分片段。

(二)同源整合载体的构建

将PCR产物纯化后，加HindIII、BamHI双酶切，PCR产物重新回收，ddH₂O重溶，与适量的HindIII、BamHI限制酶消化的载体pMUTIN4(购自BGSC)连接，转化大肠杆菌TOP10F’(购自深圳勤宝升公司)，从转化平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到金斯特公司测序，获得同源整合载体转化的大肠杆菌TOP10F’。

(三)同源整合载体转化枯草芽孢杆菌野生菌株fmbR

将同源整合载体转化的大肠杆菌TOP10F’在37℃培养10-11小时后挑取小菌落，接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜，采用质粒提取试剂盒(购自上海生工)提取同源整合载体质粒，作为转化枯草芽孢杆菌fmbR用。枯草芽孢杆菌电转化方法如下：

1、感受态细胞的准备：

过夜培养菌体，稀释16倍置于生长培养基(LB含有0.5M的山梨醇)，37℃培养至OD600为0.85-0.95，将菌体细胞在冰水中冷冻10分钟。4℃5000xG离心5分钟收集菌体细胞，在冰冷的电转化液中洗四次。(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％的甘油)。用培养量的1/40电转化液重新悬浮菌体细胞。使细胞浓度达到1-1.3×1010cfu/ml；

2、转化：

在60μL感受态细胞中加如1μL(50ng克/μL)DNA，转移到电转杯中(1mm的电击杯)，保温1-1.5分钟，加电压25μF、200Ω。时间4.5-5.0ms。释放电压后，立即象转化过的细胞中加入1mL恢复培养基(LB含0.5M山梨醇、0.38M甘露醇)。在37℃培养3h后，置于选择培养基上筛选。37℃过夜培养。获得同源整合载体转化的枯草芽孢杆菌fmbR菌株，即启动子Pspac置换的菌株。

(四)启动子置换菌株的鉴定方法

参考Genbank中枯草芽孢杆菌168的surfactin合成酶操纵子基因序列(编号D13262)(1285bp)和质粒pMUTIN2上启动子Pspac的序列(编号AF072806)(59bp)，利用primer primier 5.0软件自行设计启动子Pspac DNA序列(59bp)和枯草芽孢杆菌surfactin合成酶基因部分DNA序列(1285bp)引物。

上游引物：5’-TTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTG-3；

下游引物：5’-TGAGTTTCCCAGTATCCC-3，

以启动子Pspac置换的菌株基因组DNA为模板，在100μl体系中，引物终浓度各为1μM，dNTPs终浓度为0.2mM，枯草芽孢杆菌基因组DNA10ng，4U pfu DNA聚合酶。扩增程序为94℃ 2min；30×(94℃ 50s，53℃ 50s，72℃ 1：30min)；72℃ 10min。

将回收的PCR产物与TaKaRa公司pMD19-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂于含有IPTG、X-gal、氨苄青霉素的LB平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到金斯特公司测序。用计算机分析测序结果，扩增得到大小约1344bp的DNA片段(SEQ ID NO.2)，即启动子Pspac片段和枯草芽孢杆菌fmbR surfactin合成酶基因5’端部分DNA片段连接到一起，并整合到野生枯草芽孢杆菌fmbR的基因组DNA中的DNA片段。从而使surfactin合成酶基因置于启动子Pspac的控制之下。

(五)启动子置换的菌株fmbR脂肽类抗生素surfactin的发酵和提取

5.1菌株抗菌物质的发酵：将种子液以5％浓度接种于Landy发酵培养基中，在30～33℃和180rpm/min下培养33-35h，得抗菌物质发酵液。

5.2抗菌提取物的制备：发酵液在11.000g下离心15min除去菌体，用HCl将上清夜调节pH至2，然后轻微搅动或静止过夜，离心收集沉淀，再用NaOH中和，加入甲醇抽提几次，获得抗菌提取物。

(六)启动子置换菌株fmbR surfactin产量的提高

按照(五)所述的方法同时对fmbR野生菌和启动子置换菌株发酵并提取抗菌物质，并通过高效液相色谱检测surfactin的产量，最终获得产surfactin的启动子置换菌株在没有IPTG诱导的情况下为：1597.01±3.55mg/L，在300μM IPTG诱导的情况下为：3860.10±88.10mg/L。野生菌为355.91±11.29mg/L。即在没有IPTG诱导情况下，surfactin产量提高约4.85倍，在300μM IPTG诱导情况下，surfactin产量约提高10倍。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种提高枯草芽孢杆菌surfactin产量的启动子置换方法

<130>说明书

<140>00

<141>2008-11-03

<160>6

<170>PatentIn version                                                3.1

<210>1

<211>1081

<212>DNA

<213>PCR扩增

<220>

<221>surfactin合成酶基因同源片段

<222>(1)..(1081)

<223>

<400>1

tttcggctgt tagttcataa gaattaaaag ctgatatgga taagaaagag aaaatgcgtt    60

gcacatgttc actgcttata aagattaggg gaggtatgac aatatggaaa taacttttta    120

ccctttaacg gatgcacaaa aacgaatttg gtacacagaa aaattttatc ctcacacgag    180

catttcaaat cttgcgggga ttggtaagct ggtttcagct gatgcgattg attatgtgct    240

tgttgagcag gcgattcaag agtttattcg cagaaatgac gccatgcgcc ttcggttgcg    300

gctagatgaa aacggggagc ctgttcaata tattagcgag tatcggcctg ttgatataaa    360

acatactgac actactgaag atccgaatgc gatagagttt atttcacaat ggagccggga    420

ggaaacgaag aaacctttgc cgctatacga ttgtgatttg ttccgttttt ccttgttcac    480

cataaaggaa aatgaagtgt ggttttacgc aaatgttcat cacgtgattt ctgatggtat    540

ctccatgaat attctcggga atgcgatcat gcacatttat ttagaattag ccagcgcgtc    600

agagacaaaa gaaggaatct cgcattcatt tatcgatcat gttttatctg aacaggaata    660

tgctcaatcg aagcggtttg aaaaggacaa ggcgttttgg aacaaacaat ttgaatcggt    720

gcctgaactt gtttccttga aacggaatgc atccgcaggg ggaagtttag atgctgagag    780

gttctctaaa gatgtgcctg aagcgcttca tcagcagatt ctgtcgtttt gtgaggcgaa    840

taaagtcagt gttctttcgg tatttcaatc gctgctcgcc gcctatttgt acagggtcag    900

cggccagaat gatgttgtga cgggaacatt tatgggcaac cggacaaatg cgaaagagaa    960

gcagatgctt ggcatgtttg tttctacggt tccgcttcgg acaaacattg acggcgggca    1020

ggcgttttca gaatttgtca aagaccggat gaaggatctg atgaagacac ttcgccacca    1080

a                                                                    1081

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

cccaagcttt ttcggctgtt agttcata                                       28

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

cggatccgtt tggtggcgaa gtgtct                                         26

<210>4

<211>1344

<212>DNA

<213>PCR扩增

<400>4

ttgttgactt tatctacaag gtgtggcata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt    60

tcggctgtta gttcataaga attaaaagct gatatggata agaaagagaa aatgcgttgc    120

acatgttcac tgcttataaa gattagggga ggtatgacaa tatggaaata actttttatc    180

ctttaacgga tgcacaaaaa cgaatttggt acacagaaaa attttatcct cacacgagca    240

tttcaaatct tgcggggatt ggtaagctgg tttcagctga tgcgattgat tatgtgcttg    300

ttgagcaggc gattcaagag tttattcgca gaaatgacgc catgcgcctt cggttgcggc    360

tagatgaaaa cggggagcct gtacaatata ttagcgagta tcggcctgtt gatataaaac    420

atactgacac tactgaagat ccgaatgcga tagagtttat ttcacaatgg agccgggagg    480

aaacgaaaaa acctttgccg ttgtacgatt gtgatttatt ccgtttttcc ttgttcacca    540

taaaggaaaa tgaagtatgg ttttacgcaa atgttcatca cgtgatttct gatggtatct    600

ccatgaatat tctcgggaat gcgatcatgc acatttattt agaattagcc agcggctcag    660

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atcgatggga tactgggaaa ctca                                           1344

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

ttgttgactt tatctacaag gtgtg                                          25

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

tgagtttccc agtatccc                                                  18

Claims (5)

1、一种提高枯草芽孢杆菌surfactin产量的启动子置换方法，是通过克隆野生型枯草芽孢杆菌基因组DNA的surfactin的一个合成酶srfA-A基因5’端带有启动子Psrf的同源片段，其序列为SEQ ID NO.1，大小1081bp，并将该片段连接到带有启动子Pspacp的MUTIN4载体上，然后转化枯草芽孢杆菌，获得surfactin产量提高的菌株。

2、根据权利要求1所述一种提高枯草芽孢杆菌surfactin产量的启动子置换方法，特征在于，所用野生型枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌fmbR。

3、权利要求2所述一种提高枯草芽孢杆菌surfactin产量的启动子置换方法获得的枯草芽孢杆菌启动子置换菌株的同源片段为SEQ ID NO.1。

4、权利要求2所述一种提高枯草芽孢杆菌surfactin产量的启动子置换方法所获得的枯草芽孢杆菌启动子Pspac置换菌株的DNA序列为SEQ ID NO.2。

5、权利要求2所述方法所获得的枯草芽孢杆菌启动子Pspac置换菌株的鉴定方法，包括，设计引物，

上游引物：5’-TTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTG-3；

下游引物：5’-TGAGTTTCCCAGTATCCC-3，

以启动子Pspac置换的菌株基因组DNA为模板，在100μl体系中，引物终浓度各为1μM，dNTPs终浓度为0.2mM，枯草芽孢杆菌基因组DNA10ng，4U pfu DNA聚合酶；

扩增程序为94℃2min；30个循环：94℃50s，53℃50s，72℃1，30min；72℃10min；

将回收的PCR产物与TaKaRa公司pMD19-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂于含有IPTG、X-gal、氨苄青霉素的LB平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，测序，如果扩增得到大小约1344bp的DNA片段即SEQ IDNO.2，即启动子Pspac片段和枯草芽孢杆菌fmbR surfactin合成酶基因5’端部分DNA片段连接到一起，并整合到野生枯草芽孢杆菌fmbR的基因组DNA中的DNA片段，则为枯草芽孢杆菌启动子Pspac置换菌株。

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