CN107058316A - 一种枯草芽孢杆菌自诱导表达系统及其应用 - Google Patents
一种枯草芽孢杆菌自诱导表达系统及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌自诱导表达系统及其应用，属于启动子工程领域。本发明通过对启动子srfA的理性设计，将该启动子的核心区‑35区和‑10区突变为保守区，得到了一些比较强的启动子，以绿色荧光蛋白GFP为报告基因，突变后的启动子的最高表达量较原始启动子提高了150％。随后又进行了氨肽酶AP和纳豆激酶NK的表达，其突变体表达量较原始相比，分别提高了360％和50％。本发明方法与随机突变相比，极大减少工作量而且有效，与此同时将此策略运用于其他启动子改造，改造后的启动子表达目的基因的能力也有很大提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌自诱导表达系统及其应用，属于启动子工程领域。
背景技术
氨肽酶(Amionpeptidases，AP)是一类能从蛋白质和多肽链N端选择性切除氨基酸残基的外切蛋白酶，在食品、医药、化工行业有着广阔的市场前景。目前商品化的氨肽酶主要是利用野生菌进行生产，由于野生菌产酶能力较低，氨肽酶的价格相对较贵，因此提高氨肽酶的产量具有很大意义。
纳豆激酶及其表达状况：纳豆激酶(Nattokinase，NK)是一种由纳豆菌或纳豆枯草杆菌产生的碱性丝氨酸蛋白酶，因具有特殊的溶血栓活性，既能预防也能治疗血管栓塞性疾病，与其它溶栓药物相比，具有安全性能好、无免疫原性、易被人体消化吸收、可静脉注射也可以口服、半衰期长、生产价格低廉等优点，极有可能成为新一代理想的预防和治疗栓塞的新型药物。但因纳豆激酶野生菌的产酶量低，严重限制了其发展，因此提高纳豆激酶的产酶量具有很好的研究价值。
枯草芽孢杆菌作为一类革兰氏阳性菌，由于其良好的生物安全性，较强的分泌能力，无密码子偏好性而被广泛应用与蛋白酶制剂和有价值的蛋白质的生产。枯草芽孢杆菌表达异源蛋白存在多种表达系统，以不同启动子特性来分，主要有自诱导表达系统、组成型表达系统、诱导型表达系统。其中自诱导表达系统由于其不需要添加诱导剂可以节省工业生产成本而具有很好的应用前景，但是自诱导启动子表达异源蛋白存在表达量低的问题，因此无法满足工业生产的需求。
发明内容
本发明首先提供了一种控制基因表达的元件，其核苷酸序列如SEQ ID NO.34～36任一所示，或者如SEQ ID NO.38～44任一所示。
本发明还提供了一种表达载体或枯草芽孢杆菌基因表达系统，其基因表达控制元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.34～36任一所示，或者如SEQ ID NO.38～44任一所示。
本发明将启动子srfA进行了不同长度的截断，得到的四个核苷酸序列如SEQ IDNO.34～36任一所示的截断启动子，报告蛋白表达量均明显提高。将SEQ ID NO.36所示截断效果明显的启动子的核心区进行理性设计，主要是将该启动子的核心区-35区和-10区突变为保守区，得到7种启动子，分别以这些启动子构建了七种重组枯草芽孢杆菌表达绿色荧光蛋白GFP；这七株重组菌表达强度均高于原始菌株，尤其采用SEQ ID NO.39所示启动子时，表达量较原始启动子提高了150％。
采用SEQ ID NO.39所示启动子，分别用于表达氨肽酶AP和纳豆激酶NK时，两者的表达量较原始启动子也有所提高，分别提高了150％和50％。
本方法通过启动子工程手段对自诱导启动子进行理性设计，得到表达能力较强的启动子，用于异源蛋白高效表达，以期满足工业用途。此策略对于枯草芽孢杆菌中启动子的改造具有很大借鉴意义。
附图说明
图1：启动子截断序列示意图及其荧光表达量；A：启动子截断示意图；B：截断启动子表达柱状图；C：SDS-PAGE M：Marker 1-5：BSC01、BSC02、BSC03、BSC04、BSC05。
图2：启动子理性改造示意图及其荧光表达量；A：启动子改造示意图；B：启动子改造后的表达柱状图；C：SDS-PAGE M：Marker 1-9：BS168、BSC10、BSC11、BSC12、BSC13、BSC14、BSC15、BSC16。
图3：高效表达氨肽酶和纳豆激酶；A：氨肽酶表达柱状图；B：SDS-PAGE M：Marker1-2：BSC17、BSC18；C：纳豆激酶表达柱状图DSDS-PAGE M：Marker 1-2：BSC19 BSC20。
具体实施方式
GFP产量的检测方法：样品12000×g离心2min，收集菌体，PSB缓冲液洗3次，用PSB稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μL至96孔酶标板，放入SynergyTM H4荧光酶标仪检测荧光。程序设置为：中度震板1min；600nm检测菌体浓度；激发光495nm，吸收光525nm，增益80，检测荧光。
氨肽酶AP表达量的确定方法：在Tris-HCl缓冲液(50mmol L-1，pH 8.5)中添加4mmol L-1底物(aminoacyl-p-nitroanilines)及待测样品，37℃反应10min，测定吸光值(405nm)。酶活单位(U)的定义：37℃每min催化底物生成1mol对硝基苯胺(pNA，405nm＝9.98L mmol-1cm-1)的酶量。
纳豆激酶NK表达量的确定方法：主要参照日本纳豆激酶协会建立的紫外分光光度计法(http://j-nattokinase.org/jnka_nk_english.html)。反应体系：1.4mL的Tris-HCl(50mmol，pH 8.0)缓冲液，0.4mL(0.72％，w/v)的纤维蛋白原溶液，混匀，37℃放置5min；加入2U的凝血酶并混匀，37℃放置10min；加入0.1mL待测样品混匀，37℃水浴20min和40min时分别混匀10s；60min后加入2mL的三氯乙酸(0.2mol/L)终止反应，37℃水浴中继续放置20min。反应液12000×g，离心10min；测定吸光值(275nm)。酶活单位(FU)的定义：37℃，pH8.0，反应1min，吸光值变化0.01所需的酶量。
培养基：LB培养基(L-1)：胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物5g，pH 7.0，配制固体培养基时添加琼脂粉20g。
TB培养基(g L-1)：酵母提取物24，胰蛋白胨12，甘油4，K2HPO4 12.54，KH2PO42.31，pH 7.0。
培养条件：重组菌种从-80℃冰箱中取出，在含有相应抗性的LB平板上划线，挑取单菌落在含有5mL LB培养基的试管中200rpm，37℃过夜培养。之后按2％接种量转入含有30mL TB培养基的250mL摇瓶中培养。
枯草芽孢杆菌168转化方法：挑单菌落BS168接种至2mL的SPI培养基中，37℃摇床培养过夜；从过夜培养物中取100μL，接种至5mL SPI培养基中，37℃摇床培养4-5h后开始测OD600。当OD600约为1.0时，移取200μL菌液转接至2mL的SPII培养基中，于37℃、100r·min-1摇床孵育1.5h；向管中加入20μL l00×EGTA(乙二醇双(α-氨基乙基醚)四乙酸)溶液，于37℃、100r·min-1摇床中培养10min后分装500μL每l.5mL离心管；向管中加入经过测序验证正确的适量质粒，吹吸混匀放置于37℃、100r·min-1的摇床中培养2h；培养结束，吸取菌液约200μL均匀涂相应的选择性平板，37℃过夜培养。
实施例1构建含启动子srfA和目的蛋白绿色荧光蛋白GFP的穿梭载体pBSG01。
(1)穿梭载体pBSG的构建：以质粒pUC19为模板，以P1/P2为引物，扩增含有抗性基因bla及复制起始位点序列pBR322ori的2.2kb的片段1；以质粒pMA09为模板，以P3/P4为引物，扩增含有复制相关蛋白Rep、抗性基因neor及ble的片段2；将片段1、2通过SLIC的方法连接，转化E.coli，挑取阳性克隆测序，获得E.coli-B.subtilis穿梭克隆载体pBSG。
(2)表达载体pBSG0的构建：以B.subtilis 168基因组为模板，用引物P5/P6扩增启动子PsrfA片段；用引物P7/P8获得线性pBSG；将PsrfA及线性pBSG通过SLIC方法连接，获得载体pBSG0。
(3)GFP表达载体pBSG01的构建：以载体pBS1154为模板，用引物P9/P10扩增基因gfp片段(SEQ ID NO.45)；用引物P9/P2获得线性pBSG0；将gfp片段及线性pBSG0通过SLIC方法连接，获得载体pBSG01.pBSG01、pBS1154的构建方法参见文献C.Guan,W.Cui,J.Cheng,L.Zhou,J.Guo,X.Hu,G.Xiao,Z.Zhou,Construction and development of an auto-regulatory gene expression system in Bacillus subtilis,Microb.Cell Fact.14(2015)150。
表1本实施例中用到的引物
实施例2不同程度删除上游元件获得4种不同强度的启动子
设计四对不同引物(F1-up，PsrfA-down；P2-up，PsrfA-down；P3-up，PsrfA-down；P4-up，PsrfA-down)，对原始载体pBSG01中启动子P01(即PsrfA)进行了不同长度的截断，得到了四个截断启动子P02、P03、P04、P05(SEQ ID NO.34～37)，分别将其转化到枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168中，然后进行摇瓶培养(培养条件见上述“培养条件”)，其截断示意图以及表达情况见图1。其中P02，P03，P04表达GFP产量均高于P01，其中P04提高最为明显，提高了20％；而P05表达GFP产量低于原始P01，其产量降为原来的50％。
实施例3启动子的理性设计
将实施例2中截断效果明显的启动子P04的核心区进行理性设计，设计了7对不同引物(P1-up，P1-down；P2-up，P2-down；P3-up，P3-down；P4-up，P4-down；P5-up，P5-down；P6-up，P6-down；P7-up，P7-down)，主要是将该启动子的核心区-35区、-15区和-10区突变为保守区，构建了七种启动子(P10，P11，P12，P13，P14，P15，P16)(SEQ ID NO.38～44)，构建示意图以及表达情况如图2。以这7种启动子构建的重组枯草芽孢杆菌表达绿色荧光蛋白GFP。所得的七株重组菌GFP表达强度均高于原始菌株(BS168-pBSG01-GFP)，其中P11(-35区变为保守区TTGACA)效果最为明显，其表达量较原始启动子提高了150％。
实施例4异源蛋白的表达
将实施例3中最佳突变启动子P11分别用于氨肽酶AP(SEQ ID NO.46)和纳豆激酶NK(SEQ ID NO.47)的表达，实施过程主要是将原始载体中的报告基因GFP替换成AP和NK，具体引物设计见下表2，两者的表达量较原始启动子也有所提高，分别提高了150％和50％，图3显示是表达两种酶的具体情况。
表2
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种枯草芽孢杆菌自诱导表达系统及其应用
<160> 47
<170> PatentIn version 3.3
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ggataagaaa gagaaaatgc gttgcacatg ttcactgctt ataaagatta ggggaggtat 540
gacaatg 547
<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
agcaataaaa aaagattgaa cgcagcagtt tggtttaaaa atttttattt ttctgtaaat 60
aatgtttagt ggaaatgatt gcggcatccc gcaaaaaata ttgctgtaaa taaactggaa 120
tctttcggca tcccgcatga aacttttcac ccatttttcg gtgataaaaa catttttttc 180
atttaaactg aacggtagaa agataaaaaa tattgaaaac aatgaataaa tagccaaaat 240
tggtttctta ttagggtggg gtcttgcggt ctttatccgc ttatgttaaa cgccgcaatg 300
ctgactgacg gcagcctgct ttaatagcgg ccatctgttt tttgattgga agcactgctt 360
tttaagtgta gtactttggg ctatttcggc tgttagttca taagaattaa aagctgatat 420
ggataagaaa gagaaaatgc gttgcacatg ttcactgctt ataaagatta ggggaggtat 480
gacaatg 487
<210> 36
<211> 427
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
aatgtttagt ggaaatgatt gcggcatccc gcaaaaaata ttgctgtaaa taaactggaa 60
tctttcggca tcccgcatga aacttttcac ccatttttcg gtgataaaaa catttttttc 120
atttaaactg aacggtagaa agataaaaaa tattgaaaac aatgaataaa tagccaaaat 180
tggtttctta ttagggtggg gtcttgcggt ctttatccgc ttatgttaaa cgccgcaatg 240
ctgactgacg gcagcctgct ttaatagcgg ccatctgttt tttgattgga agcactgctt 300
tttaagtgta gtactttggg ctatttcggc tgttagttca taagaattaa aagctgatat 360
ggataagaaa gagaaaatgc gttgcacatg ttcactgctt ataaagatta ggggaggtat 420
gacaatg 427
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tctttcggca tcccgcatga aacttttcac ccatttttcg gtgataaaaa catttttttc 60
atttaaactg aacggtagaa agataaaaaa tattgaaaac aatgaataaa tagccaaaat 120
tggtttctta ttagggtggg gtcttgcggt ctttatccgc ttatgttaaa cgccgcaatg 180
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gacaatg 367
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aatgtttagt ggaaatgatt gcggcatccc gcaaaaaata ttgctgtaaa taaactggaa 60
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aatgtttagt ggaaatgatt gcggcatccc gcaaaaaata ttgctgtaaa taaactggaa 60
tctttcggca tcccgcatga aacttttcac ccatttttcg gtgataaaaa cattttttta 120
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aatgtttagt ggaaatgatt gcggcatccc gcaaaaaata ttgctgtaaa taaactggaa 60
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<211> 717
<212> DNA
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<400> 45
atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60
gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120
aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180
gtcactactt tcacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaagcgg 240
cacgacttct tcaagagcgc catgcctgag ggatacgtgc aggagaggac catctctttc 300
aaggacgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgagggaga caccctcgtc 360
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<213> 人工序列
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atgaaaaagc ttttgactgt catgacgatg gctgttttaa ctgccggcac actgctcttg 60
ccggcacaga gtgtcacccc tgccgcgcac gctgtacaaa tatcaaatag cgagcgcgag 120
cttctattca aagcaaaaca tgcgtactct accatttctc agctaagtga agcaatcggc 180
cccagaatag ccggaactgc agctgaaaaa aagagtgccc tattgatcgc ctcatcaatg 240
agaaaattaa agcttgatgt gaaggttcaa cgattcaaca ttcctgaccg gcttgaggga 300
acactgtctt cagcaggacg cgatattctt ctccaagcgg cgtccggctc agctccgact 360
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accgctgacg ccaagggcaa aatcgcctta atttccagag gagacctgac ttattacgag 480
aaagccaaaa atgccgaagc cgccggagca aaagctgtca tcatttataa caacaaagaa 540
agcctcgtgc ctatgacgcc aaacctgtcg ggaaataaag tcggcattcc ggtcgtcggc 600
attaagaaag aagacggcga agcacttacc cagcaaaaag aagccacctt aaaactaaaa 660
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catccagaca ttgtgtacgt gacggcccat tacgacagtg ttcctttttc gcccggagca 780
aatgacaacg gctcaggtac ctctgttatg ctggagatgg cgcgtgtctt aaaaagcgtt 840
ccatctgata aagaaatccg ctttatcgct ttcggcgccg aagagctcgg cctgctcggc 900
tcctctcact atgtagatca tctatcagaa aaagagctga aacgaagcga agtgaacttc 960
aacttagata tggtaggcac aagctgggaa aaagcgtctg agctgtatgt caacacattg 1020
gacggccaat ctaactatgt ttgggaatcc agccgtacgg ctgctgaaaa aattgggttt 1080
gacagcctgt ctctgacaca gggaggatta tctgatcatg tgccattcca cgaagccggc 1140
attgattccg ccaactttat ttggggagac ccggaaacag aagaagttga gccgtggtat 1200
catacccctg aagactcgat cgaacatatc agcaaagaac gcctccagca agcaggcgat 1260
cttgtgacag ccgctgtcta tgaggctgtg aaaaaagaga agaaaccgaa aaccattaag 1320
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<210> 47
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gtgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60
gcgttcagca acatgtctgc gcaggctgcc ggaaaaagca gtacagaaaa gaaatacatt 120
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gctcttcact ctcaaggcta cacaggctct aacgtaaaag tagctgttat cgacagcgga 420
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acatatcttg gaaactcttt ctactatgga aaagggttaa tcaacgtaca agcagctgca 1140
caataa 1146
Claims (9)
1.一种控制基因表达的元件，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.34～36任一所示，或者如SEQ ID NO.38～44任一所示。
2.一种表达载体，其特征在于，其基因表达控制元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.34～36任一所示，或者如SEQ ID NO.38～44任一所示。
3.一种枯草芽孢杆菌基因表达系统，其特征在于，其基因表达控制元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.34～36任一所示，或者如SEQ ID NO.38～44任一所示。
4.根据权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌基因表达系统，其特征在于，表达宿主为枯草芽孢杆菌。
5.根据权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌基因表达系统，其特征在于，表达载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体。
6.一种重组表达氨肽酶的重组菌，其特征在于，基因表达控制元件的核苷酸序列如SEQID NO.34～36任一所示，或者如SEQ ID NO.38～44任一所示，以携带所述基因表达控制元件的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体为表达载体，以枯草芽孢杆菌168为宿主。
7.一种重组表达纳豆激酶的重组菌，其特征在于，基因表达控制元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.34～36任一所示，或者如SEQ ID NO.38～44任一所示，以携带所述基因表达控制元件的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体为表达载体，以枯草芽孢杆菌168为宿主。
8.一种应用枯草芽孢杆菌表达蛋白的方法，其特征在于，应用权利要求1所述的控制基因表达的元件。
9.一种应用枯草芽孢杆菌表达蛋白的方法，其特征在于，应用权利要求3～5任一所述的枯草芽孢杆菌基因表达系统。
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|---|---|---|---|
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